ES2296762T3 - Control biologico de enfermedades de plantas. - Google Patents
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Abstract
Una composición de control biológico que comprende, en una forma y cantidad viable de manera reproducible, al menos una cepa de Ulocladium oudemansii efectiva contra una especie de Botrytis y un excipiente, diluente o adyuvante aceptable en agricultura.
Description
Control biológico de enfermedades de
plantas.
Esta invención se relaciona con el uso del
Ulocladium oudemansii como un agente de control biológico.
También se proporcionan, los métodos y composiciones para el control
biológico de enfermedades de la planta, particularmente el
Botrytis cinerea, utilizando Ulocladium
oudemansii.
Las enfermedades de las plantas causadas por
patógenos tales como hongos tienen un costo económico significante
para las industrias basadas en plantas. Las pérdidas pueden surgir a
través de la descomposición de los productos pre- y
pos-cosecha, la pérdida de plantas por si mismas o a
través de la reducción en crecimiento y habilidades para dar
frutos.
Tradicionalmente, el control de patógenos de
plantas se ha llevado a cabo mediante la aplicación de productos
químicos tales como fungicidas. El uso de productos químicos se
somete a un número de desventajas. Los patógenos pueden y han
desarrollado tolerancia a productos químicos en el tiempo,
produciendo poblaciones resistentes a los fungicidas. Los residuos
químicos también pueden presentar peligros ambientales así como
planteando la precaución de la salud.
El problema particularmente se ilustra en la uva
e industrias del vino. La descomposición del racimo de las uvas,
causado por el hongo Botrytis cinerea, se estima que causa
pérdidas de \textdollar18 millones de dólares por año solo en la
industria del vino en Nueva Zelanda. El control de Botrytis
ha sido por medio de fungicidas. La práctica es insostenible porque
la resistencia al fungicida es muy común en muchos viñedos y hay
presión de los consumidores para la reducción de los residuos de
pesticidas.
El control biológico presenta una manera
alternativa de controlar la enfermedad de la planta que es
potencialmente más efectiva y específica que los métodos corrientes,
así como la reducción de la dependencia en los productos químicos.
Tales métodos de control biológico se perciben como una alternativa
"natural" a los fungicidas con la ventaja de aceptación del
gran público, la contaminación ambiental reducida y la
sostenibilidad aumentada.
Los mecanismos de control biológico son
diversos. Un mecanismo que ha sido demostrado efectivo es el uso de
microorganismos antagonistas tal como bacteria, levadura y hongo
para el control de la enfermedad de la planta.
El control biológico del hongo fitopatogénico
tal como el Botrytis cinerea, con agentes de control
biológico seleccionados (BCAs) se reportó por Wood en 1951 y después
por Newhook en 1957 utilizando el hongo Cladosporium
cladosporiodes BCA. La introducción en ese momento de fungicidas
baratos, efectivos y fáciles de aplicar detuvo cualquier otro
desarrollo de los BCAs. Más recientemente, otros microorganismos
antagonistas para utilizar en el control biológico de las
enfermedades de las plantas han sido identificados.
El uso de Ulocladium atrum para controlar
el botrytis en un rango de plantas ha sido propuesto, por ejemplo
por: Botrytis en cebollas (Köhl et al, 1995b),
botrytis en lirios (Köhl et al, 1995a, Elmer & Köhl,
1998), botrytis en ciclamino (Köhl et al, 1998), y botrytis
en uvas (Schoene et al, 1999). Sin embargo, también hay
informes de patogenicidad de alguna especie de planta mostrados por
U. atrum (Butler et al. 1979).
La eficacia de varios Ulocladium spp. tal
como el Ulocladium atrum como agentes de control biológico,
también se han discutido por Elmer et al, 1995; Walter et
al, 1996a,b; Boyd-Wilson et al, 1998;
Reglinski et al, 1999, 2000, Hill et al, 1998,
Vanneste et al, 1999, Michailides & Elmer, 2000.
Por consiguiente será apreciado que las especies
Ulocladium claramente consideradas como las primeras
candidatas para BCAs efectivos han sido extensamente investigadas
durante la década pasada. Sin embargo, hasta hoy ninguno de los
candidatos se ha probado ideal, ya sea debido a la precaución de
patogenicidad de la planta o por el fracaso para establecer
rápidamente en la planta objetivo más supervivencia de la
variabilidad ambiental existente en el
campo.
campo.
Sorprendentemente, los candidatos ahora han
identificado una especie de Ulocladium que no se ha
mencionado en ninguno de los primeros informes como un BCA efectivo.
Los candidatos han determinado que esta especie, Ulocladium
oudemansii, es altamente efectiva en el control del hongo
saprophytic como el botritis y estableciendo exitosamente en tejidos
de plantas en el campo. Por otra parte, hasta hoy no hay registros
de que el U. oudemansii cause una enfermedad en las plantas o
productos de plantas.
Es por consiguiente un propósito de la presente
invención proporcionar una composición de control biológico que
comprende al menos una cepa del Ulocladium oudemansii
efectiva contra una especie Botrytis, o al menos proporcionar
al público una opción útil.
Por consiguiente, en un aspecto, la presente
invención proporciona una composición de control biológico que
comprende, en una forma y cantidad viables de manera reproducible,
al menos una cepa de Ulocladium oudemansii efectiva contra
una especie de Botrytis y un excipiente, diluente o adyuvante
aceptable en agricultura.
Preferiblemente, al menos una cepa esta presente
en la forma de esporas viables de manera reproducible.
Actualmente es más preferido que la cepa es, o
la composición incluya, Ulocladium oudemansii AGAL No. NM
99/06216.
La invención también proporciona un cultivo
biológicamente puro de Ulocladium oudemansii AGAL No. NM
99/06216.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un proceso para controlar una especie de Botrytis
en una planta o producto de planta, el proceso que comprende la
aplicación de una composición de la invención a dicha planta o
producto de planta.
La invención además proporciona un proceso para
controlar una especie de Botrytis en una planta o producto de
planta, el proceso que comprende la aplicación de una cantidad
efectiva de al menos una cepa de Ulocladium oudemansii
efectiva contra una especie de Botrytis.
En otro aspecto, la presente invención se
relaciona con el uso de Ulocladium oudemansii en una
composición o proceso de la invención.
La invención también se extiende al uso de una
composición de la invención para la aplicación a plantas para
controlar la infección de botritis.
Las plantas tratadas con la composición de la
invención también forman otro aspecto de la invención.
Figura 1 es un gráfico de barras que compara la
eficacia del Ulocladium oudemansii aislado (AGAL No. NM
99/06216) en la supresión del desarrollo de botritis con el
fungicida iprodione.
Figura 2 es un gráfico de barras que bosqueja el
nivel de infección de botritis en racimos de uva en la cosecha- El
asterisco (*) indica los racimos que muestran niveles de infección
de botritis significantemente diferentes comparados con el control
sin tratar a P<0.05.
Figura 3 es un gráfico de barras que bosqueja el
nivel de infección de botritis en los mismos racimos de uva después
de dos días de incubación en humedad alta (condiciones que conducen
al desarrollo de la enfermedad). El asterisco (*) indica racimos que
muestran niveles de infección de botritis significantemente
diferentes comparados con el control sin tratar a P<0.05.
Figura 4 es un gráfico de barras que bosqueja el
nivel de infección de botritis en los mismos racimos de uva después
de catorce (14) días de incubación en humedad alta (condiciones que
conducen al desarrollo de la enfermedad).
Figura 5 es un gráfico de barras que bosqueja el
efecto de la frecuencia de aplicaciones del agente de control
biológico NM99/06216 sobre niveles de Botrytis en racimos
Chardonnay en el cierre del racimo durante la temporada en Hawkes
Bay. 10d, 20d, 30d, se refiere al intervalo (en días) entre las
aplicaciones NM99/06216.
Figura 6 es un gráfico de barras que bosqueja el
efecto de la frecuencia de las aplicaciones del agente de control
biológico NM99/06216 en niveles de Botrytis en racimos
Chardonnay en la cosecha en Hawkes Bay y Marlborough en 1999. 10d,
20d, 30d, se refiere al intervalo (en días) entre las aplicaciones
NM99/06216.
Figura 7 es un gráfico de barras que bosqueja
los niveles de Botrytis en racimos Merlot (Gisbome), en la
cosecha en y sobre los racimos Chardonnay (Marlborough) después de
48 horas de incubación en humedad alta después de la cosecha.
La presente invención se dirige a las cepas de
la especie Ulocladium oudemansii que tiene eficacia contra
botritis y el uso de estas en el control de la enfermedad de la
planta.
El U. oudemansii es un hongo saprophytic
que se puede aislar del suelo, madera, hoja, fruta o semillas. Los
aislados tienen las siguientes características de identificación en
comparación con U. atrum (Simmons, 1967):
Las cepas de U. oudemansii efectivas
contra botritis y por consiguiente apropiadas para usar de acuerdo
con la invención se identifican como aquellas que muestran al menos
50% de eficacia antagonista expresada como un porcentaje de
reducción de los conidióforos de la pertinente especie de
Botrytis comparada con el tratamiento control. A manera de
ilustración, la metodología esquematizada después en el Ejemplo 3,
se puede emplear para identificar los aislados de U.
oudemansii de elección contra B. cinerea, mientras que
los procedimientos análogos a aquellos del Ejemplo 3 se pueden
emplear en relación a otras especie Botrytis.
\newpage
Una cepa de U. oudemansii que reúne los
requisitos anteriores se aisló de los desechos de hojarasca de la
fruta de kiwi muestreados de un bloque de investigación de la fruta
de kiwi en Massey University, Palmerston North, Nueva Zelanda,
después de la incubación en cámaras de alta humedad, para inducir la
producción de espora de saprofito. Esto demuestra la alta producción
de esporas típicas del género cuando se cultiva en agar de harina de
avena. Los detalles del proceso de aislamiento y selección empleado
para obtener el aislado, se establecen en los Ejemplos. Este aislado
de Ulocladium. oudemansii ha sido depositado en los
Australian Government Analytical Laboratories, (AGAL), 1 Suakin
Street, Pymble, New South Wales, Australia el 2 de Septiembre 1999
de acuerdo con el Tratado de Budapest para los propósitos del
procedimiento de la patente. Al aislado se le ha otorgado el número
de depósito
NM 99/06216.
NM 99/06216.
Por consiguiente, en un aspecto de la presente
invención se proporciona un cultivo biológicamente puro de U.
oudemansii AGAL No. NM 99/06216. Del mismo modo se proporcionan
las cepas de Ulocladium que tienen las características de
identificación de AGAL NO. NM 99/06216.
AGAL No. NM99/06216 y otros aislados del U.
oudemansii son particularmente agentes de control biológico
efectivos, que son capaces de sobrevivir periodos de humedad
interrumpidos, colonizando tejidos necróticos y suprimiendo el
crecimiento de botritis y la producción de esporas en el campo. El
grado de supresión por estos aislados de U. oudemansii es
generalmente tan bueno como el comúnmente usado fungicida iprodione
(Rovral^{TM}). La resistencia (por el Botrytis cinerea) que
este particular fungicida ha desarrollado; en estas y otras
instancias, los aislados de Ulocladium oudemansii
seleccionados de acuerdo con la invención proporcionan una
alternativa efectiva para el control de botritis. Esta inesperada y
potente actividad en el control de enfermedad de la planta acoplada
con la ausencia de algún informe de patogenicidad de la planta
inducida por el U. oudemansii demuestra que los aislados de
la especie tienen atributos deseables para utilizar como un agente
de control biológico.
El término "agente de control biológico"
(BCA) como se utiliza aquí se refiere a agentes que actúan como
antagonistas de uno o más fitopatógenos. El antagonismo puede tomar
diversas de formas. En una forma, el agente de control biológico
puede simplemente competir externamente con el patógeno por
nutrientes disponibles y/o por espacio en la planta huésped. En otra
forma, el agente de control biológico puede suministrar el ambiente
desfavorable para el patógeno. Por consiguiente, los mecanismos
antagonistas incluyen pero no se limitan a antibiosis,
micoparasitismo, competencia de nutrientes y desplazamiento
físico.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona una composición de control biológico que comprende al
menos una cepa de U. oudemansii efectiva contra una especie
de Botrytis y al menos un excipiente, diluente o adyuvante
aceptable en agricultura. La composición puede incluir múltiples
cepas de U. oudemansii, pero preferiblemente incluye tres
cepas o menos, y más preferiblemente una cepa única. En
consecuencia, la composición comprende AGAL No. NM99/06216 aislado
como una cepa única de agente activo contra al menos el Botrytis
cinerea.
Las concentraciones efectivas de U.
oudemansii como agente de control biológico en la composición
pueden variar dependiendo del uso final, condición fisiológica de la
planta; tipo, concentración y grado de infección del patógeno;
temperatura, temporada, humedad, etapa en la periodo de crecimiento
y la edad de la planta; número y tipo de fungicidas convencionales
que se aplican; y tratamientos de la planta (tal como pelado y poda
de hojas) pueden ser tenidos en cuenta en la formulación de la
composición.
La cepa de U. oudemansii incluida como
agente de control biológico debe estar en una forma viable de manera
reproducible. Para otros propósitos, el U. oudemansii es
deseablemente incorporado en la composición en la forma de esporas.
La concentración de las esporas fúngicas en la composición dependerá
de la utilidad para la cual la composición se va a someter. Un rango
de concentración ejemplar es de aproximadamente 1 x 10^{2} a 1 x
10^{7} esporas por ml, preferiblemente de aproximadamente 1 x
10^{3} a 2 x 10^{6}, y más preferiblemente para U.
oudemansii 1 x 10^{4} a 2 x 10^{6} esporas por ml.
Se anticipa que el uso convencional de
tecnología de fermentación estática seca y líquida, las esporas de
U. oudemansii de cepas seleccionadas se pueden producir a
granel para una aplicación en campo. El crecimiento generalmente se
lleva a cabo bajo condiciones aeróbicas a cualquier temperatura
satisfactoria para el crecimiento del organismo. Un rango de
temperatura a partir de 8 a 30ºC, preferiblemente 15 a 25ºC, y más
preferiblemente, se prefiere a 20ºC. El pH del medio de cultivo es
ligeramente ácido a neutro, que es aproximadamente 5.0 a 7.0, y más
preferiblemente 6.0. El tiempo de incubación es suficiente para que
el aislado alcance una fase de crecimiento estacionaria,
aproximadamente 3 a 4 semanas cuando se incuba a 18ºC, y ocurrirá en
la oscuridad. Las esporas se pueden cosechar por metodología
convencional de filtrado o sedimentaria (por ejemplo centrifugación)
o cosechado en seco utilizando un sistema de ciclón. Las esporas se
pueden utilizar inmediatamente o almacenar, enfriadas entre 1º a
7ºC, preferiblemente a 2ºC, durante el tiempo que permanezcan
viables de manera reproducible. Sin embargo generalmente se prefiere
que se utilicen dentro de las dos semanas de la cosecha.
La composición de la invención también puede
incluir excipientes, diluentes o adyuvantes aceptables en
agricultura. Las composiciones también pueden comprender un amplio
rango de aditivos tal como agentes tensoactivos, mojadores,
humectantes, adhesivos, esparcidores, estabilizantes y penetrantes
utilizados para realzar los ingredientes activos y los así llamados
aditivos que destacan para mejorar el vigor de la espora,
germinación y supervivencia tal como cloruro de potasio, glicerol,
cloruro de sodio y glucosa. Los aditivos también pueden incluir
composiciones que ayuden a mantener la viabilidad del microorganismo
en un largo periodo de almacenamiento, por ejemplo aceite de maíz
sin refinar y las así llamadas emulsiones invertidas que contienen
una mezcla de aceites y ceras en el exterior y del agua, alginato de
sodio y conidio en el interior.
Ejemplos de agentes tensoactivos, esparcidores y
adhesivos incluyen Fortune®, Pulse, C-Daxoil®,
Codacide oil®, D-C. Tate®, Supamet Oil, Bond®
Penetrant, Citowett® y Freeway.
Ejemplos de las composiciones apropiadas que
incluyen excipientes, conservantes, agentes tensoactivos y agentes
de humectación, esparcidores, y nutrientes se proporcionan en US
5780023 incorporada aquí por referencia.
Cuando se seleccionan para la inclusión, los
agentes tensoactivos agrícolas comunes tal como Tween (disponible de
Rohm & Haas) deseablemente se incluyen en la composición de
acuerdo con los protocolos conocidos. Es importante que cualquiera
de los aditivos utilizados esté presente en cantidades que no
interfieran con la efectividad de los agentes de control
biológico.
Los candidatos también han determinado que
muchos fungicidas comúnmente usados no afectan adversamente el U.
oudemansii. Las composiciones de la invención pueden por
consiguiente también incluir dichos fungicidas. Como alternativa,
las composiciones se pueden utilizar individualmente pero en
conjunción con dichos fungicidas en programas control.
Las composiciones se pueden preparar en un
número de formas. Una preparación comprende una forma en polvo de
composición de la invención que puede ser espolvoreado. En otra
forma, la composición se mezcla con un diluente tal como agua para
formar un vaporizador, espuma, gel o baño y aplicar apropiadamente
utilizando protocolos conocidos. En la modalidad preferida
actualmente, la composición U. oudemansii se aplica en 0.1%
v/v de Tween 80 mezclado con agua utilizando un atomizador
presurizado.
Las composiciones formuladas por otros métodos
de aplicación tal como inyección, fricción o cepillado, también se
puede utilizar, como ciertamente cualquier método del oficio
conocido. Aplicaciones indirectas de la composición a la planta en
el medio ambiente tal como suelo, agua, o como recubrimientos de la
semilla son potencialmente
posibles.
posibles.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un proceso para controlar botritis en una planta, el
proceso que comprende la aplicación de al menos una cepa de U.
oudemansii efectiva contra una especie de Botrytis, o una
composición de la invención a dicha planta.
El término "que controla" como se utiliza
aquí generalmente comprende la prevención o reducción de la
infección de botritis o inhibición del índice y extensión de dicha
infección. También se contempla el tratamiento curativo.
Otra vez, mientras que múltiples cepas de U.
ouedemansii con actividad contra una especie Botrytis se
pueden emplear en el proceso de control, preferiblemente tres cepas
o menos, y más preferiblemente una cepa única se utiliza en el
proceso. Actualmente en la modalidad más preferida, se emplea la
cepa única de U. oudemansii AGAL No. NM99/06216.
Las aplicaciones repetidas en el mismo o
diferente momento en un ciclo de la cosecha también se contemplan.
El U. oudemansii se puede aplicar ya sea primero o después en
la temporada. Esto puede ser durante la floración. El U.
oudemansii también se puede aplicar inmediatamente después de la
cosecha para colonizar rápidamente las hojas necróticas o
senescentes y tallos cosechados a máquina (raquis) para prevenir la
colonización de Botrytis, particularmente del Botrytis
cinerea en hojas y tallos de la uva. El U. oudemansii
también se puede aplicar para inactivar los viñedos en invierno
para desacelerar el crecimiento de Botrytis en tejidos
inactivos.
La aplicación puede ser a un tiempo antes o
después de la explosión del brote y antes y después de cosecha. Sin
embargo, el tratamiento preferiblemente sucede entre la floración y
la cosecha. Para incrementar la eficacia, se prefieren, múltiples
aplicaciones (por ejemplo, 2 a 6 aplicaciones durante las etapas
fenológicas de la floración desde dar la fruta, o cierre del racimo
para las uvas) del U. oudemansii o una composición de la
invención.
Al repetir la aplicación del U.
oudemansii o la composición también se debería considerar que
sea después de la lluvia. Utilizando los modelos de predicción de
Botrytis, la aplicación del BCA también se puede regular para
medir los periodos de riesgo del Botrytis.
Actualmente en las modalidades preferidas, el
U. oudemansii se aplica en una solución Tween 80 al 0.1% v/v
utilizando un atomizador presurizado. Las partes de la planta se
deben rociar ligeramente hasta justo antes de correr. Las
aplicaciones se pueden hacer ya sea la planta completa en el dosel
o solo en el área en el dosel donde las flores y desarrollo de la
fruta se concentran (por ejemplo "línea del racimo" en
uvas).
Las composiciones aplicadas control botritis. El
Botrytis spp. es responsable para muchos de los hongos pre- y
pos-cosecha que atacan partes de la planta y causan
el hongo gris en las uvas y la fruta de kiwi, cosechas de
invernadero, tomates de proceso, frutas con pepa, flores de corte,
fresas, y plantas ornamentales así como en un exceso de otras
plantas. En una modalidad, las composiciones de la presente
invención son por consiguiente, deseablemente formuladas para
utilizar contra uno o más de Botrytis cinerea y/o Botrytis
fabae, Botrytis aclada y Botrytis elliptica,
Botrytis squamosa, Botrytis allii. Particularmente se
contemplan, el control de Botrytis cinerea en uva utilizando
las composiciones y el método de la presente invención.
El término "planta" como se utiliza aquí
abarca no solo todas las plantas completas, sino se extiende a las
partes de la planta, los cortes así como productos de plantas que
incluyen raíces, hojas, flores, semillas, tallos, tejido de callo,
nueces y fruta. Las plantas que pueden beneficiarse de la
aplicación de la presente invención cubren un amplio rango de
cultivos agrícolas y hortícolas. Las composiciones de la presente
invención también son especialmente apropiadas para la aplicación en
sistemas de producción orgánicos.
El proceso de la invención tiene particular
aplicación en las plantas y productos de plantas, ya sea pre- o
pos-cosecha. Por ejemplo, la composición de la
invención se puede aplicar para almacenar productos del tipo
enumerado arriba que incluyen frutas, vegetales, flores de corte y
semillas. Las técnicas de aplicación apropiadas abarcan aquellas
identificadas arriba, particularmente vaporización.
La composición potencialmente se puede utilizar
para tratar o pre-tratar suelos o semillas,
contrariamente a la aplicación directa a la planta. La composición
puede encontrar uso en materiales que procesan la planta tal como
revestimiento protector, cajas y sobrecubiertas.
También se abarca por la presente invención las
plantas, productos de plantas, suelos y semillas tratados
directamente con una cepa activa de U. oudemansii o una
composición de la invención.
En otro aspecto, la presente invención se
extiende al Ulocladium oudemansii de la invención para
utilizar en una composición de la invención.
Los siguientes ejemplos
no-limitantes se proporcionan para ilustrar la
presente invención y de ninguna manera limitan el alcance de
esta.
Este originalmente se aisló de los desechos de
la hoja de la fruta kiwi de origen del huerto de investigación de
la fruta kiwi Massey University en Palmerston North. La muestra de
desechos de la hoja se incubó en una cámara de humedad alta para
impulsar la producción de esporas por el hongo saprophytic. El
conidio perteneciente al Ulocladium spp., de muestra de
desechos de la hoja, se cultivaron sobre agar de harina de avena
para la purificación del cultivo y posterior prueba de acuerdo con
el protocolo del Ejemplo 3.
El aislado se identificó como Ulocladium
oudemansii en el Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS),
Delft, The Netherlands utilizando la referencia taxonómica de
Simmons, EG (1967).
El micelio
marrón-verde-oliva pálido, suave o
se pone áspero al detalle.
Las colonias en agar (agar de zanahoria patata,
PCA) crecieron rápidamente, aterciopeladas negras o
verde-oliva carbón-negro con un
borde blanco. Después de 9 días a 20ºC, el diámetro del cultivo es
de 72 mm. En agar de harina de avena (OA) las colonias primero
aparecen marrón (1-2 días) luego aparecen
verde-oliva por los primeros 2-7
días, luego progresivamente se vuelven pardas así que la colonia
total tiene una apariencia de color negro aterciopelado después de
3-4 semanas. El crecimiento de la colonia es rápido,
de tal manera que la caja de petri total (diámetro 90 mm) se cubre
después de 12 días en la oscuridad a 18ºC. En PDA (agar de dextrosa
patata), el crecimiento de la colonia es más lento, y el cultivo
toma una apariencia de color más gris oscuro
verde-oliva-pizarra. En este medio
la caja de petri total (diámetro 90 mm) se cubre después de
14-16 días en la oscuridad a 18ºC. En el agar de
extracto de heno (HEA) el crecimiento fue de 40 mm después de 10
días a 10ºC y luz UV continua. La colonia se caracterizó por que es
más lobular. Las características de crecimiento, colonia y la
morfología conidial de AGAL No. NM 99/06216 en HEA pueden ser una
característica de discriminación útil como se resume abajo.
La colonia y características conoidal de
aislados de Ulocladium spp. relacionados cultivados a 10ºC
con luz UV continua en agar de extracto de heno se esquematizan en
la Tabla 1.
Los conidióforos son abundantes, rectos o
ascendientes, simples o ramificados, marrón dorado, suaves, sedosos,
que llevan un conidio solitario en genicualciones
1-5 uniportantes. Los conidios son inicialmente
estrechamente ovoides, hialinas, suaves, se tornan marrón
amarillento, y discretamente ásperos; finalmente ampliamente ovoides
o elipsoidales, oscuro
verde-oliva-carbón de
21.6-30.8 por 10.8-16.9 micrones con
1 o 3-5 septos transversales y uno o dos
longitudinales u oblicuos, la base es ampliamente cónica a
redondeada, el ápice ampliamente redondeado y a menudo más
vistosamente verrugoso (verrugoso) que el resto del conidio. El
conidio germina con facilidad en sustratos húmedos produciendo uno
o más rápidamente hifas de cultivo por conidio.
Las fórmulas para PCA (Agar de Zanahoria y
Patata), HEA (Agar de extracto de Heno), PDA (Agar de Dextrosa y
Patata) y OA (Agar de Harina de avena) usadas en las pruebas
anteriores se prepararon de acuerdo con Gams et al. 1998.
Los cultivos almacenados de U. oudemansii
(que incluyen AGAL No. NM 99/06216), se preservaron en glicerol
estéril 15% a -70ºC y se almacenaron hasta que se requieran.
Los aislados de U. oudemansii se
cultivaron en cultivos inclinados de agar de harina de avena (OA) en
tubos de prueba de 35-50 ml con un tapón algodón
hidrófilo, durante 2-3 semanas a 18ºC en la
oscuridad. Se adicionaron 10-20 ml de agua estéril
Millipure^{TM} (más 0.01% de Tween 80) a los cultivos inclinados,
que luego se rasparon suavemente con un escalpelo estéril para
desalojar el conidio. Porque una fermentación pequeña ocurre, la
suspensión de espora resultante luego se adicionó a toda la avena
orgánica humedecida (se somete al autoclave dos veces por 45 minutos
a 12ºC, 100 kPa) en bolsas de cultivo estéril (Type MBO3LPP, Van
Leer flexible packaging, Pont-Audemer, France).
Estas bolsas de cultivo luego se sellaron con cinta adhesiva e
incubaron a 18ºC en la oscuridad por 3-4
semanas.
Los aislados de U. oudemansii se
prepararon por experimentos de campo utilizando el siguiente
protocolo. Toda la avena colonizada se quito de las bolsas de
cultivo y se colocó en una bolsa de malla de nylon en un dispositivo
de lavado de esporas (Miniwash 2000SR MW 100, Piraeus, Greece). Se
adicionó agua Chilled Millipure^{TM} (más 0.01% de Tween 80) y la
avena colonizada completamente se lavó en este dispositivo por 30
minutos. La suspensión resultante se pasó a través de un filtro
primario (malla = 4 mm x 4 mm) para extraer toda la avena y luego un
filtro secundario que consiste de una gasa fina de nylon estéril
(malla = 200 \mum) para extraer pequeñas partículas y fragmentos
miceliares. La concentración de esta suspensión se determinó con la
ayuda de un hemocitómetro y se ajustó a 2 x 10^{6} conidios
ml^{-1} con agua fría Millipure^{TM} (más 0.01% de Tween 80) y
se conserva en hielo a 5ºC por un máximo de 2 semanas antes de
utilizar en el campo. Nuestros estudios han mostrado que el
almacenamiento a esta temperatura durante este lapso de tiempo no
resulta en una reducción de viabilidad de espora o posterior germen
tubo vigor. La suspensión aislada se aplicó a los racimos de uva
premarcados (cv Chardonnay) utilizando nebulizadores neumáticos
Yates MaxiSpray
de 4L.
de 4L.
Los agentes de control biológico efectivos se
pueden seleccionar de acuerdo con su capacidad para desplazar o
excluir un microorganismo que causa una enfermedad potencial a
partir de su sustrato o nicho ecológico. Bajo las condiciones que
conducen fitopatógenos tal como Botrytis cinerea pueden
colonizar muerte senescente o tejido necrótico. Saprófitos
competitivos, no-patogénicos se pueden aplicar de
manera que excluyan y/o competición en el exterior del fitopatógeno,
por consiguiente la prevención o limitación de la capacidad para
causar una enfermedad del patógeno. La efectividad de estos
saprófitos en el campo es, a su vez, dependiente de su capacidad de
supervivencia variando las condiciones climáticas, tal como periodos
interrumpidos de humedad y deshidratación. Un método proporcionado
por el cual los saprófitos competitivos con estas características
pueden ser seleccionados. El método a continuación que se diseño
originalmente por Dr Jurgen Kohl for onion and lily leaves (Köhl
et al, 1995a, 1995b).
Los discos (diámetro 21 mm) se cortaron a partir
de la uva sin rociar madura u hojas de fruta kiwi seleccionadas al
azar y se colocaron entre láminas de cartón. Los discos se secaron
suavemente a 40ºC por aproximadamente 9 horas y luego se lavaron
bajo agua corriente por 10 minutos para extraer cualquiera de los
nutrientes solubles. Los discos de la hoja luego se secaron en papel
secante una vez más en toallas de papel estériles, se secaron a 40ºC
por 6 horas, luego se sellaron en jarras plásticas de muestras,
previo a la esterilización por irradiación gamma (4 Mrad).
Los aislados de hongo saprophytic tal como
Ulocladium spp. se pueden aislar con facilidad a partir de la
superficies del suelo, madera, hoja, fruta o semilla como se
describe en el Ejemplo 1.
Los aislados se mantuvieron en agar de harina de
avena (30 g de harina de avena finamente molido más 20 g de agar por
litro de agua) e incubaron durante 2 a 4 semanas a 20ºC iluminados
de acuerdo con un ciclo de 12 horas día/noche. Los propágulos
fúngicos se lavaron de las placas de agar de esporulación utilizando
Tween 80 estéril al 0.01% (v/v) en agua destilada. Las suspensiones
de esporas se filtraron a través de tejido estéril de lentes
(Whatman) para extraer los fragmentos miceliares y se centrifugaron
a 4000 rpm por 2 min. El sobrenadante se decantó con cuidado del
pellet de la espora y las esporas resuspendidas en Tween 80 estéril
al 0.01% (v/v) en agua destilada recién preparado. El procedimiento
de centrifugación y lavado se repitió y la densidad final de esporas
se ajustó a 1 x 10^{6} conidios ml^{-1} con la ayuda de un
hemocitómetro.
Los discos estériles de la hoja (4) se colocaron
en una cámara de humedad alta que consiste de una caja de petri
plástica estéril (diámetro 90 mm) que contiene 2 papeles de filtro
estériles (Whatman), humedecidos con 2 mL de agua destilada estéril
(SDW). Los discos de las hojas se refrigeraron (4ºC) durante la
noche para dejar impregnar el tejido en el agua aplicada.
Continuando la rehidratación, los discos de la hoja se inocularon
con una suspensión conoidial de Botrytis cinerea (1 x
10^{4} esporas/ml^{-1}) e incubaron en las cámaras de alta
humedad por 8 horas a 18ºC en la oscuridad. Después de este periodo
de incubación, los aislados de los candidatos BCAs (saprófitos) se
aplicaron a los discos de la hoja inoculados con B. cinerea,
empañando una suspensión fina (1 x 10^{6} esporas/ ml^{-1})
sobre los discos de la hoja en las cámaras de humedad. Los tejidos
co-inoculados luego se incubaron en las cámaras de
alta humedad por otras 16 horas a 18ºC en la oscuridad.
La incubación a alta humedad se interrumpió por
transferencia de los discos de la hoja a partir de las cámaras de
humedad a las cajas de petri abiertas que contienen 2 capas de
discos de filtro secos estéril (Whatman). Los discos de la hoja
luego se secaron con aire en una cabina de flujo laminar por 6 horas
a 20-22ºC. Después de este periodo de deshidratación
estimulada de los tejidos se vuelven a hidratar, por la aplicación
de 2 mL SDW, luego se sellaron en la cámara de humedad e incubaron
por 10 días a 18ºC en la oscuridad. El área del tejido de disco de
la hoja con esporulación de B. cinerea se evaluó visualmente.
Los controles se emplearon; los discos de la hoja se vuelven a
hidratar con inóculo cero, los discos de la hoja se vuelven a
hidratar con inóculo de B. cinerea solo.
Previo al análisis de varianza, todos los datos
fueron transformados en arcsen utilizando una transformación angular
para estabilizar la varianza y los valores LSD se calcularon para
propósitos de separación media.
Muchos aislados desempeñaron significantemente
mejor la supresión de la esporulación que el fungicida convencional
logrando una supresión del 90-100% de esporulación
de B. cinerea. Los mejores aislados representados se
seleccionaron por un bioensayo de laboratorio repetido para
confirmar la supresión del B. cinerea. Los resultados del
bioensayo repetido para el Ulocladium spp. solo se presentan
en la Tabla 2. Los mejores aislados representados se seleccionaron
por otra evaluación de campo y la confirmación de los bioensayos de
laboratorio repetidos como se esquematiza en el Ejemplo 4.
Para la prueba de campo de U. oudemansii
(AGAL No. NM99/06216) los discos de hoja de fruta de kiwi necrótica
rehidratados se colocaron sobre tiras pequeñas de plástico
Coreflute^{TM} (Waikato Signs, Hamilton, Nueva Zelanda) (5 discos
por tira) e inocularon con B. cinerea como se describe arriba
para las pruebas basadas de laboratorio, luego se transfirieron al
dosel del cultivo sin rehidratación para la incubación por 22 horas
bajo condiciones de campo. Los discos de la hoja inoculados del
patógeno se regresaron al laboratorio, los inoculados con AGAL No.
NM99/06216 como se describe arriba para las pruebas basadas de
laboratorio, luego se regresaron al campo y se suspendieron en el
dosel del cultivo. Todos los tratamientos fueron aleatorios en
consideración a la posición en el dosel. Una vez más los
tratamientos control se incluyeron; discos de la hoja con inóculo
cero, los discos de la hoja con inóculo de B. cinerea solo.
Ninguno de los tratamientos de pesticidas se aplico por el
agricultor durante el periodo de incubación de 10 días. Continuando
la incubación bajo las condiciones de campo discos de la hoja se
recolectaron del dosel del cultivo e incubaron en cámaras de alta
humedad por 10 días como se describe arriba para las pruebas de
laboratorio. Los discos se evaluaron por la producción de esporas de
B. cinerea como se describe antes. Este procedimiento de
detección en campo se repitió 11 veces para asegurar la exposición a
un amplio rango de condiciones ambientales.
El aislado AGAL No. NM99/06216 se desempeña
significantemente mejor que el fungicida convencional, iprodione
(Rovral ®) en hasta 11 pruebas de campo repetidas. El aislado
consistente y repetidamente redujo la esporulación de Botrytis
cinerea por 80-100% (ver la Figura 1), aún
cuando el B. cinerea se aplicó 22 horas antes de que el
aislado se aplicara.
El aislado AGAL No. NM99/06216 efectivamente
suprime el crecimiento y la esporulación del B. cinerea en
todos estos ensayos.
Los estudios de campo comienzan en un bloque de
Chardonnay con una historia de Botrytis cinerea, en el sitio
de Rivers Twin de Montana (Taradale, Napier, Nueva Zelanda). Ocho
tratamientos (ver abajo) se seleccionaron y aplicaron a montajes de
la vid únicos (ocho racimos marcados por vid) en cada uno de 5
replicas por filas (40 racimos por tratamiento en total). Hubo filas
estandarizadas en cada lado del área tratada.
- 1)
- Sin tratar
- 2)
- Pulse (0.1%)
- 3)
- Tween (0.05%)
- 4)
- Algan (0.5%; más Pulse)
- 5)
- AGAL No. NM99/06216 vaporizado (más Tween)
- 6)
- AGAL No. NM99/06216 Sumergido (más Tween)
- 7)
- aceite de hierba de limón (0.1%; más Pulse)
- 8)
- Shirlan (1 ml/L)
AGAL No. NM99/06216 suspensión de esporas
ajustadas a 2 x 10^{6} esporas/ml.
Los tratamientos se aplicaron en el verano y
otoño tempranero en Dic 15, Dic 23, Dic 30, Ene 13, Ene 28, Feb 12,
Feb 24, Marzo 6, Marzo 16, Marzo 26, Abril 9. Los tratamientos se
aplicaron a carrera, utilizando nebulizadores neumáticos portátiles
con la excepción del tratamiento 6 al cual se aplicó sumergiendo los
racimos.
La incidencia del Botrytis en la cosecha
comercial fue muy baja. La cosecha de esta prueba se retrasó por dos
semanas para fomentar el desarrollo de botritis. En Abril 21 los
racimos marcados se cosecharon, se colocaron en bolsas de
polietileno en hielo y luego se transportaron a HortResearch
laboratories at Ruakura Research Centre. Los racimos se quitaron de
las bolsas de polietileno y la descomposición del racimo se estimo
por conteo del número de bayas en cada racimo que fue infectado con
botritis.
Con el fin de promover el desarrollo de
botritis, después de la valoración de la cosecha cada racimo de uva
se colocó en un contenedor de plástico (Plix Packaging, Carter Holt
Harvey, Nueva Zelanda) con toallas de papel humedecidas en la base
de cada contenedor para mantener un ambiente húmedo. Los
contenedores fueron aleatorios y se incubaron a 20ºC +/- 2ºC. La
segunda valoración de la descomposición del racimo se realizó
después de 2 días de incubación. Los racimos se dejaron incubar en
humedad alta por otros 12 días con el fin de probar los tratamientos
bajo condiciones severas. Después de este periodo los niveles de
infección de botritis fueron muy altos y la descomposición del
racimo se midió utilizando la siguiente escala:
- Puntuación de Severidad del Racimo
- % de infección del racimo
- 0
- 0
- 1
- 1-10
- 2
- 11-25
- 3
- 26-50
- 4
- 51-75
- 5
- 76-100
Antes del análisis de la varianza los datos se
transformaron utilizando una transformación angular para estabilizar
la varianza. Un análisis de los datos en bruto dio conclusiones
similares a aquellos del análisis después de la transformación, y
por consiguiente los datos en bruto han sido presentados por
simplicidad.
Ninguno de los tratamientos causó algún daño
visible a los racimos de uva. Las plantas de uva se examinaron a
intervalos regulares para la presencia de botritis y la incidencia
de la enfermedad fue muy baja. Por consiguiente, la cosecha se
retrasó hasta Abril 21 para favorecer el desarrollo de botritis en
el bloque de prueba.
A pesar de que los niveles de botritis fuero
bajos en la cosecha hubo efectos de tratamiento significante. Los
racimos sin tratar y aquellos tratados con Algan, aceite de hierba
de limón, Pulse y Tween tuvieron entre 7-17 bayas
infectadas por racimo (aproximadamente 5-10% de
infección) (Figura 2). Todos los otros tratamientos tuvieron niveles
significantemente más bajos (P<0.05) de botritis (<2% de
infección).
Hubo un incremento general en botritis en los
racimos después de 2 días de incubación en cámaras de alta humedad.
Sin embargo, el nivel de infección en los racimos tratados con AGAL
No. NM 99/06216 (aspersión o sumergido) y Shirlan permaneció
significantemente (P<0.05) menor que el control sin tratar
(Figura 3).
Los niveles de infección del Botrytis
fluctúan entre 75 a 83% en los racimos sin tratar y aquellos
tratados con Pulse, Tween, Algan y aceite de hierba de limón. En los
racimos tratados con AGAL No. NM99/06216 (aspersión y sumergido) el
nivel de infección fue entre 36 - 41%. El tratamiento más efectivo
fue Shirlan® donde la incidencia de botritis fue del 3% (Figura 4).
Sin embargo este nivel de control se logró haciendo 12 aplicaciones
de Shirlan® durante la temporada, algo así, está fuera de la
práctica comercial normal. En el viñedo, el uso de Shirlan® debería
ser restringido cerca de la cosecha para evitar problemas
potenciales de residuos y sería de esperar que se utilicen solo la
mitad de este número de aplicaciones.
Los elicitores, antagonistas y productos
naturales antimicrobianos seleccionados se evaluaron para el control
de botritis en uvas (cv. Chardonnay) en el viñedo Twin Rivers en
Napier. Hubo reducciones significantes del Botrytis cinerea
en los racimos tratados con AGAL No. NM99/06216 aislado y el
fungicida Shirlan cuando se compara con los controles sin tratar en
la cosecha. Los racimos luego se incubaron en condiciones de humedad
alta para favorecer el desarrollo de botritis. Después de 14 días de
incubación, los niveles de botritis no obstante fueron
significantemente más bajos en los racimos tratados con el aislado y
Shirlan comparado con los controles sin tratar. El aceite de hierba
de limón, Algan y los agentes de humectación Pulse y Tween no
controlaron el botritis.
Esto es una demostración práctica del uso de un
agente de control biológico para controlar el botritis en
viticultura en el campo. Este excelente resultado indica el
potencial de control biológico.
El propósito de este estudio, fue confirmar los
hallazgos descritos arriba en el Ejemplo 5 y extender el alcance de
la investigación. Las pruebas de campo se realizaron en dos
principales regiones de cultivo de uva de Nueva Zelanda, Hawkes Bay
y Marlborough, para determinar el impacto potencial de la variación
regional y estacional en la eficacia del tratamiento de control
biológico. Se presentan los resultados y la conclusión de este
estudio.
Las pruebas de campo se establecieron en Hawkes
Bay y Marlborough. Los tratamientos (Tabla 3) se aplicaron a cada
uno de los 10 racimos marcados por vid en montajes de vid sencillos
(cv. Chardonnay) utilizando nebulizadores a presión Yates Plassay
Maxi4. Hubo 5 replicas de viñedos por tratamiento con viñedos
estandarizados sin tratar entre cada una de las filas estandarizadas
de vid tratada y sin tratar en cada lado del área de bloque de
prueba, para proporcionar suficiente inóculo de B. cinerea
para la infección de flores y frutas.
Los primeros tratamientos se aplicaron a inicios
de noviembre en Hawkes Bay y a finales de noviembre en Marlborough.
En lo sucesivo, las aplicaciones, se hicieron cada 10, 20 o 30 días
(excepto los fungicidas que se aplicaron de acuerdo con el programa
de vaporizador BOTRYTIS estándar convencional o industrial).
Los racimos pre-marcados
visualmente se monitorearon en toda la temporada por cualquiera de
las señales de fitotoxicidad y por la incidencia del botritis. Las
valoraciones de la enfermedad se realizaron en Hawkes Bay a finales
de enero y en ambos lugares a mediados de Marzo. En cada fecha, el
número de bayas infectadas de botritis por racimo se registró. La
incidencia de Botrytis fue baja en Marlborough y a tal grado
que los racimos se quitaron de la vid, se incubaron por 48h bajo
condiciones favorables para el desarrollo de botritis, luego se
evaluaron. El análisis estadístico de los resultados se realizó
utilizando ANOVA. Antes del análisis de varianza, los datos se
transformaron utilizando una transformación angular para estabilizar
la varianza. El análisis de los datos en bruto dio conclusiones
similares a aquellas del análisis después de la transformación, y
por simplicidad hemos presentado los datos en
bruto.
bruto.
Ninguno de los tratamientos causó ningún daño
observable a los tejidos de la uva en cualquier etapa de la
temporada en el lugar de Hawkes Bay. La lluvia fuerte durante enero
en Hawkes Bay fue seguida por el desarrollo de botritis en el bloque
de prueba. Se observó abundante esporulación de botritis en los
racimos sin tratar tanto en los viñedos estandarizados sin tratar
como en los racimos sin tratar en los montajes, lo que indica que
hubo abundante inóculo de botritis disponible para la infección en
ese momento.
Los racimos en los viñedos sin tratar tuvieron
el nivel más alto de botritis con aproximadamente 7 bayas infectadas
por racimo (Figura 5). Todos los tratamientos con la excepción del
control remojado en "Pulse", significantemente redujeron la
incidencia de botritis. El tratamiento de U. oudemansii AGAL
No. NM99/06216 del "día 10" redujo el botritis en más de un 80%
y los tratamientos del "día 20" y "día 30" en más del 70%.
Esto comparado favorablemente con el programa convencional de
fungicida que reduce la incidencia de botritis por aproximadamente
el 60%. No hubo evidencia de infecciones de botritis en el lugar de
Marlborough en este momento.
La severidad de Botrytis en Hawkes Bay
fue más alta en los racimos sin tratar con una media de 35 bayas
infectadas por racimo. Los tratamientos con U. oudemansii
AGAL No. NM99/06216 fueron al menos tan efectivos como el fungicida.
Estos resultados confirman nuestros primeros hallazgos descritos
arriba en el ejemplo 5.
La severidad de Botrytis fue más baja
generalmente en Marlborough que en Hawkes Bay (Figura 6). Como el
intervalo de tiempo entre las aplicaciones de U. oudemansii
AGAL No. NM99/06216 se prolongó de cada 10 a cada 20, o cada 30
días, hubo una reducción en la eficacia del tratamiento. Sin
embargo, el nivel de control de la enfermedad en todos los
tratamientos aún comparado favorablemente con el programa
convencional del fungicida en Hawkes Bay. En Marlborough, donde hubo
presión de la enfermedad mínima, los resultados fueron menos claros.
La incidencia de Botrytis en todos los tratamientos de
Marlborough, que incluyen el control sin tratar, fue menor del
8%.
El Ulocladium oudemansii AGAL No.
NM99/06216 se evalúo para el control de botritis en uvas (cv.
Chardonnay) en los viñedos en Hawkes Bay y Marlborough. Todos los
tratamientos U. oudemansii fueron tan efectivos como el
fungicida, y en algunos casos significantemente mejor. Estos
resultados confirman nuestros primeros hallazgos, como se describe
en el ejemplo 5, y el resultado para Hawkes Bay fue especialmente
alentador considerando que se colocó una presión muy alta del
inóculo en los tratamientos (los viñedos estandarizados adyacentes y
la mayoría de racimos en la vid no se trataron).
La aspersión cada 10 días podría añadir hasta
como mucho 15 aplicaciones durante una temporada y esto puede ser
indeseable para los cultivadores. Incrementando el intervalo de
tratamiento a 20 o 30 días resulta en una reducción en la eficacia,
pero no obstante proporcionando un nivel de control de la enfermedad
equivalente a aquel obtenido con un programa convencional del
fungicida. Otra manera de reducción de las aplicaciones del
fungicida podría ser dirigir etapas de crecimiento particular. El
trabajo en otras cosechas y con otros productos químicos ha
demostrado que la supresión en la temporada inicial de botritis es
importante en el control efectivo de la enfermedad (Nair &
Allen, 1993). Exploramos esta estrategia en el Ejemplo 7.
El propósito de este estudio fue el de ampliar
aún más el trabajo emprendido en el Ejemplo 6 y examinar el efecto
de las aplicaciones dirigidas en el control de botritis. Una vez más
las pruebas de campo se realizaron en dos principales regiones de
cultivo de uva de Nueva Zelanda, Gisbome y Marlborough para tener en
cuenta la variación regional y estacional en la eficacia del
tratamiento. Los resultados y la conclusión de este estudio se
presentan.
Las pruebas de campo similares se establecieron
en Gisborne y Marlborough. Los tratamientos (Tabla 4) se aplicaron a
cada montaje del tratamiento de los 3 viñedos (cv. Chardonnay en
Blenheim y cv. Merlot en Gisborne) utilizando nebulizadores backpack
"Solo" de 15 litros. Hubo montajes de 5 replicas por
tratamiento con viñedos estandarizados sin tratar en cualquier lado
de cada grupo de viñedos tratados y filas estandarizadas sin tratar
en cada lado del área del bloque de prueba para proporcionar
suficiente inóculo de B. cinerea.
Excepto para el programa de fungicida estándar
de la industria, los primeros tratamientos se aplicaron justo antes
de la floración: Diciembre 3 en Gisbome y Diciembre 14 en
Marlborough. Dos aplicaciones se hicieron en cada etapa de
crecimiento aproximadamente 2 semanas aparte.
Los racimos pre-marcados
visualmente se monitorearon en toda la temporada para la incidencia
de botritis. Las valoraciones de la enfermedad se realizaron en
ambos lugares a finales de enero / inicios de Febrero y nuevamente a
mediados de Marzo, justo previo a la cosecha. En cada fecha el
número de bayas infectadas de botritis por racimo se registró. La
incidencia de Botrytis fue baja en Marlborough y de modo que
los racimos se quitaron de la vid, se incubaron por 48 horas bajo
condiciones favorables para el desarrollo de botritis, luego se
evaluaron. El análisis estadístico de los resultados se realizó
utilizando ANOVA. Antes del análisis de varianza los datos se
transformaron utilizando una transformación angular para estabilizar
la varianza. El análisis de los datos en bruto dio conclusiones
similares a aquellas de los análisis después de la transformación, y
por simplicidad hemos presentado los datos en bruto.
Ninguno de los tratamientos causada ningún daño
observable a los tejidos de uva en cualquier etapa o de la
temporada. La lluvia frecuente durante finales de enero y Febrero en
Gisborne facilitó el desarrollo de botritis en el bloque de prueba.
Al menos el 70% de los racimos tuvo alguna incidencia de botritis en
la cosecha.
En Marlborough las condiciones permanecieron
extremadamente secas por toda la temporada y la incidencia de
botritis fue como corresponde baja, aún cuando las bayas se
incubaron por 48 horas en condiciones de campo para tratar e inducir
el botritis utilizando la misma técnica como se describe en el
Ejemplo 5.
U. oudemansii AGAL No. NM99/06216
nuevamente se evaluó para el control de botritis en uvas (cv.
Chardonnay) en los viñedos en Gisborne y Marlborough. En Gisborne,
las condiciones fueron favorables para el desarrollo de la
enfermedad pero el tratamiento U. oudemansii fue tan efectivo
como el fungicida. Estos resultados confirman nuestros primeros
hallazgos, como se describe en los ejemplos 5 y 6. En contraste, las
condiciones en Marlborough no condujeron a la infección de botritis
debido a la prolongada sequía en esta región durante la prueba. Sin
embargo, algo de botritis de detectó y NM99/06216 redujo con
severidad la enfermedad. El nivel de control de la enfermedad fue
nuevamente equivalente a aquel del fungicida.
Estos ejemplos ilustran que el agente de control
biológico, U. oudemansii AGAL No. NM99/06216 es capaz de
reducir consistente y repetidamente la descomposición del racimo por
botritis en uvas. Esto se repitió durante un rango de temporadas de
cultivo y regiones de cultivo de uva.
Otros aislados de U. oudemansii han sido
probados por su capacidad para controlar el Botrytis. El
método usado para comparar la eficacia relativa de estos aislados,
el mismo como aquel descrito en el Ejemplo 3.
La preparación de los discos de la hoja,
suspensiones de esporas, aplicación, registro del tiempo, y detalles
de la incubación utilizada para el bioensayo fueron iguales a esos
descritos en Ejemplo 3.
Los datos se sometieron a un análisis utilizando
ANOVA y los valores LSD se calcularon para propósitos de separación
media utilizando el paquete estadístico GENSTAT.
La supresión de la producción de esporas de
Botrytis con diferentes aislados de Ulocladium
oudemansii oscila entre 82-96% (Tabla 5).
Este ejemplo claramente demuestra que hemos
probado otros aislados de U. oudemansii y comprobó que cada
uno de ellos ha reducido significantemente el desarrollo de
Botrytis al menos el 50%. Dos aislados AGAL No. NM99/06216 y
U. oudemansii (código HRU N) redujeron el desarrollo de
Botrytis al menos el 95% en este ensayo.
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del documento de patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran
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York. Plant Disease, 1990, vol. 74,
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Claims (19)
1. Una composición de control biológico que
comprende, en una forma y cantidad viable de manera reproducible, al
menos una cepa de Ulocladium oudemansii efectiva contra una
especie de Botrytis y un excipiente, diluente o adyuvante
aceptable en agricultura.
2. Una composición como se reivindica en la
reivindicación 1 en donde al menos una cepa esta presente en la
forma de esporas viables de manera reproducible.
3. Una composición como se reivindica en la
reivindicación 2 en donde las esporas están presentes en un rango de
concentración a partir de 1 x 10^{2} a 1 x 10^{7} esporas por
ml.
4. Una composición como se reivindica en la
reivindicación 3 en donde las esporas están presentes en un rango de
concentración a partir de 1 x 10^{3} a 2 x 10^{6} esporas por
ml.
5. Una composición como se reivindica en la
reivindicación 4 en donde las esporas están presentes en un rango de
concentración a partir de 1 x 10^{4} a 2 x 10^{6} esporas por
ml.
6. Una composición como se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende al menos dos
cepas de Ulocladium oudemansii efectivas contra una especie
de Botrytis.
7. Una composición como se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde al menos una cepa
es, o la composición incluye, Ulocladium oudemansii AGAL No.
NM99/06216.
8. Una composición como se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde la especie de
Botrytis es el Botrytis cinerea.
9. Una composición como se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que además comprende un
agente tensoactivo.
10. Una composición como se reivindica en la
reivindicación 9 en donde el agente tensoactivo es un Tween.
11. Una composición como se reivindica en la
reivindicación 10 en donde el agente tensoactivo es Tween 80.
12. Una composición como se reivindica in
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la composición
es en la forma de un polvo, vaporizador, espuma, gel o baño.
13. Un cultivo biológicamente puro de
Ulocladium oudemansii AGAL No. NM99/06216.
14. Un proceso para controlar una especie de
Botrytis en una planta o producto de planta, proceso que
comprende la aplicación de una composición como se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 a dicha planta o producto
de planta.
15. Un proceso para controlar una especie de
Botrytis en una planta o producto de planta, proceso que
comprende la aplicación de una cantidad efectiva de al menos una
cepa de Ulocladium oudemansii efectiva contra una especie de
Botrytis.
16. Un proceso como se reivindica en la
reivindicación 15 en donde al menos una cepa de Ulocladium
oudemansii es Ulocladium oudemansii AGAL No.
NM99/06216.
17. Un proceso como se reivindica en cualquiera
de las reivindicaciones 14 a 16 en donde la especie de
Botrytis es el Botrytis cinerea.
18. Un proceso como se reivindica en cualquiera
de las reivindicaciones 14 a 17 en donde la planta es una vid.
19. Una planta o producto de planta cuando se
trata por un proceso como se reivindica en cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 18.
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