ES2219684T3 - Control de enfermedades fungicas posteriores a la recoleccion usando levaduras saprofitas. - Google Patents
Control de enfermedades fungicas posteriores a la recoleccion usando levaduras saprofitas.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA COMPOSICIONES Y METODOS PARA EL CONTROL BIOLOGICO DE LAS ENFERMEDADES FUNGICAS DE PRODUCTOS AGRICOLAS, TALES COMO FRUTAS CON PEPITAS, ESPECIALMENTE UTILIZADO LEVADURAS SAPROFITICAS. LOS AGENTES DE CONTROL MICROBIOLOGICO, TALES COMO LAS CEPAS DE LEVADURA DE LA PRESENTE INVENCION, MUESTRAN UNA EFECTIVIDAD SORPRENDENTE CONTRA UNA SERIE DE SUSTANCIA PATOGENAS FUNGICAS CUANDO SE UTILIZAN EN COMBINACION CON BAJOS NIVELES DE FUNGICIDAS QUIMICOS. LA INVENCION PROPORCIONA, ASIMISMO, METODOS DE AISLAMIENTO DE MICROBIOS QUE SON UTILES PARA CONTROLAR ENFERMEDADES FUNGICAS DE PRODUCTOS AGRICOLAS.
Description
Control de enfermedades fúngicas posteriores a la
recolección usando levaduras saprófitas.
Esta invención se refiere al campo del control
biológico de enfermedades fúngicas de artículos agrícolas por medio
de levaduras saprofitas.
Se ha estimado que el deterioro de artículos
agrícolas después de la recolección, tales como frutas y verduras,
produce pérdidas de aproximadamente un 24% de los cultivos en los
Estados Unidos y de hasta un 50% de los cultivos en todo el mundo.
Las pérdidas previas a la recolección de los artículos agrícolas
también son significativas.
Gran parte de las pérdidas previas y posteriores
a la recolección se deben a enfermedades fúngicas, tales como mohos
y hongos de la podredumbre. A menudo la infección se inicia por
lesiones producidas en el momento de la recolección o por heridas
mecánicas en la superficie del artículo agrícola durante el
procesamiento. Los fungicidas químicos son los medios principales
para controlar las pérdidas posteriores a la recolección debidas a
enfermedades fúngicas. El método tradicional de uso de fungicidas
es el tratamiento de las frutas después de la recolección y antes
del almacenamiento con fungicidas químicos. Sin embargo, en la
mayoría de los almacenes de envasado, están presentes cepas
tolerantes a fungicidas, lo cual hace que los fungicidas químicos
sean menos eficaces o totalmente ineficaces. Por esta razón,
algunas veces se usan simultáneamente múltiples fungicidas para
mejorar el control de hongos patógenos. Hay varios hongos patógenos
importantes, por ejemplo, Mucor spp., para el que
actualmente no hay un fungicida posterior a la recolección
eficaz.
Otro problema relacionado con el uso de
fungicidas químicos es el hecho de que muchos son carcinogénicos o
peligrosos desde el punto de vista medioambiental. En un tiempo en
el que se está restringiendo el uso de pesticidas sintéticos,
claramente existe una urgente necesidad de desarrollar métodos
seguros, nuevos y eficaces para controlar enfermedades posteriores a
la recolección de artículos agrícolas que sean seguros, inocuos
desde el punto de vista medioambiental y eficaces.
Ha habido numerosos informes sobre intentos de
controlar enfermedades fúngicas de artículos agrícolas usando
agentes de control biológico microbianos, como se revisa en
Wisniewski y Wilson, HortScience, 27:94-98, 1992.
Idealmente, tales agentes de control biológico son microorganismos
saprofitos naturales que no producen compuestos antifúngicos, no se
desarrollan a la temperatura corporal humana y son consistentes en
el control de la enfermedad diana. Las patentes y solicitudes de
patente que describen intentos de usar bacterias y levaduras para
el control biológico de enfermedades fúngicas de artículos agrícolas
incluyen las Patentes de Estados Unidos Nº 5.314.691 (Coffey et
al.), 5.270.059 (Janisiwicz et al.), 5.266.316 (Elad
et al.), 5.244.680 (Roberts), 5.238.690 (Elad et al.)
y 5.041.384 (Wilson y Chalutz), y los documentos WO 92/18009
(Shanmuganathan) y WO 91/01641 (Wilson et al.).
Sin embargo, a pesar de las amplias
investigaciones realizadas, en el mercado no está disponible ningún
agente de control biológico que haya resultado sistemáticamente
eficaz en el control de enfermedades fúngicas de artículos
agrícolas. Véase, por ejemplo, Wisniewski y Wilson, HortScience,
27:94-98, 1992, y Wilson et al., Plant Dis.
78:837-844, 1994.
La mayoría de los investigadores han usado una
estrategia de "bala de plata" en la selección de agentes de
control biológico microbianos, identificando un solo microbio para
el control biológico de enfermedades fúngicas en lugar de
documentar la diversa microflora existente en la superficie de las
frutas o de las verduras cultivadas en diferentes localizaciones, y
después ensayar la eficacia de estos colonizadores microbianos en el
control de enfermedades posteriores a la recolección (Spurr, "The
microbial ecology of fruit and vegetable surfaces: Its relationship
to postharvest biocontrol" en: Wilson and Wisniewski (eds.),
Biological Control of Postharvest Diseases: Theory and Practices,
CRC Press, Boca Raton, FL, pág. 11-23, 1994). Existe
la necesidad de un método eficaz para la recuperación de la diversa
microflora, levaduras saprofitas o bacterias colonizadoras que
controlan eficazmente las enfermedades posteriores a la recolección
de las frutas, incluyendo microbios que están presentes en la
superficie de las plantas con una población muy baja.
La presente invención proporciona cepas de
levadura que son muy eficaces para reducir la incidencia y/o
gravedad de enfermedades fúngicas de artículos agrícolas tales como
frutas, producidas por varios patógenos fúngicos importantes.
Por consiguiente, es un objeto de la invención
proporcionar composiciones para el control biológico de una
enfermedad fúngica de un artículo agrícola que comprendan una
cantidad eficaz de una cepa de levadura biológicamente pura de
Cryptococcus infirmo-miniatus
(preferiblemente el aislado YY-6 de Phaff y Fell de
Cryptococcus infirmo-miniatus). Tales
composiciones proporcionan un control biológico sorprendentemente
eficaz de enfermedades fúngicas producidas por una diversidad de
patógenos fúngicos importantes de artículos agrícolas tales como
frutas (por ejemplo, peras, manzanas o cerezas). Estos patógenos
fúngicos incluyen, pero sin limitación, Penicillium spp.,
Botrytis spp., Mucor spp., Pezicula spp.,
Phialophora spp., y Monilinea spp.
También es un objeto de la invención proporcionar
métodos para controlar una enfermedad fúngica de un artículo
agrícola que comprenden aplicar al artículo agrícola una cantidad
eficaz de tal composición.
La presente invención también incluye un método
para controlar la incidencia o gravedad de enfermedades producidas
por Phialophora spp. que comprende aplicar a un artículo
agrícola una cantidad eficaz de una composición que contiene una
cepa biológicamente pura de Rhodotorula spp. o
Cryptococcus infirmo-miniatus.
También se ha descubierto que una combinación de
un agente del control biológico microbiano, incluyendo las cepas de
levadura indicadas anteriormente, en combinación con bajos niveles
de un fungicida químico es sorprendentemente sinérgica en el
control de la incidencia y gravedad de una diversidad de
enfermedades fúngicas. Una cantidad eficaz de tal combinación puede
comprender una cantidad del fungicida químico que sea
aproximadamente un 25% o menos de la cantidad normal del fungicida,
es decir, una cantidad que sería eficaz si el fungicida químico se
aplicara sin el agente de control biológico microbiano,
preferiblemente aproximadamente un 10% menos de la cantidad normal,
más preferiblemente aproximadamente un 5% o menos y aún más
preferiblemente aproximadamente un 3% o menos del fungicida
químico.
La figura 1 muestra el crecimiento y la dinámica
de población de Cryptococcus
infirmo-miniatus y Cryptococcus laurentii
en heridas de manzanas Golden Delicious almacenadas (A) a 0ºC, (B)
a 5ºC, (C) a 10ºC, y (D) a 20ºC. Las barras representan la
desviación típica.
La figura 2 muestra el crecimiento y la dinámica
de población de Cryptococcus laurentii, Rhodotorula
glutinis y Cryptococcus infirmo-miniatus
en heridas en peras almacenadas a -1ºC. Las barras representan
desviaciones típicas de las medias.
La figura 3 muestra el crecimiento y la dinámica
de población de Cryptococcus laurentii, Rhodotorula
glutinis y Cryptococcus infirmo-miniatus
en heridas en peras almacenadas (A) a 5ºC, (B) a 10ºC y (C) a 20ºC.
Las barras representan desviaciones típicas de las medias.
Para el control biológico de patógenos fúngicos
de artículos agrícolas, es decir, para reducir la incidencia y/o
gravedad de enfermedades producidas por tales patógenos fúngicos,
se prefiere la cepa YY-6 de Cryptococcus
infirmo-miniatus. Esta cepa de levadura es
eficaz contra una amplia diversidad de patógenos fúngicos de
artículos agrícolas.
Se ha descubierto que una amplia diversidad de
agentes de control biológico microbianos son sorprendentemente
sinérgicos en el control de patógenos fúngicos de artículos
agrícolas cuando se usan junto con bajas dosis de fungicidas
químicos bien conocidos. Aunque la discusión presentada a
continuación se centra en el uso de cepas de Cryptococcus
solas o en combinación con un fungicida químico, este
descubrimiento se extiende a combinaciones de bajas dosis de
fungicidas químicos con cualquier agente de control biológico
microbiano eficaz contra patógenos fúngicos de artículos
agrícolas.
Este descubrimiento tiene implicaciones prácticas
importantes. Las poblaciones naturales de patógenos fúngicos de
artículos agrícolas comúnmente comprenden una mezcla de cepas
sensibles e insensibles. Las esporas de las cepas sensibles no
germinarán o crecerán más lentamente en presencia de un fungicida
químico. De esta manera, se reducirá la dosis de inóculo del
patógeno y la levadura competirá más eficazmente. Con patógenos
insensibles a fungicidas, no será eficaz incluso una alta
proporción de fungicida, pero la levadura de la combinación
proporcionará un control biológico eficaz.
La presente invención proporciona cepas
"biológicamente puras" de agentes de control biológico
microbianos, incluyendo levaduras saprofitas tales como
Cryptococcus spp. y composiciones que comprenden tales cepas
biológicamente puras. Una capa biológicamente pura de un microbio
es una cepa aislada a partir de su medio natural (por ejemplo, la
superficie de una fruta) y que no está contaminada por otras cepas
microbianas. Preferiblemente, la cepa biológicamente pura procede
de una sola célula del microbio y de esta forma representa una
población clonal.
Control biológico de Penicillium
spp. Se han aislado al menos 11 especies de Penicillium a
partir de frutas pomáceas infectadas naturalmente con moho azul,
pero Penicillium expansum es la especie más común y
económicamente más importante. El moho azul, también conocido como
podredumbre blanda y podredumbre húmeda, es la enfermedad posterior
a la recolección más importante de las manzanas y también es
importante en otras frutas, incluyendo peras, por ejemplo.
La presente invención proporciona cepas de
levaduras saprofitas naturales eficaces para reducir la incidencia
y gravedad de enfermedades fúngicas de artículos agrícolas
producidas por Penicillium spp., incluyendo pero sin
limitación Penicillium expansum. Para reducir la incidencia y
gravedad de las enfermedades producidas por Penicillium
spp., Para reducir la incidencia y la gravedad de la enfermedad
producida por Penicillium spp., particularmente para el
control del moho azul, se prefiere Cryptococcus
infirmo-miniatus (preferiblemente la cepa
YY-6). El más preferido es el aislado
YY-6 de Cryptococcus
infirmo-miniatus.
La enfermedad producida por Penicillium
puede tratarse por medio de la aplicación de una o más de estas
levaduras solas o en combinación con una baja dosis de un fungicida
químico apropiado, como se define más adelante.
Control biológico de Mucor spp. La
presente invención proporciona cepas de levaduras saprofitas
naturales eficaces para reducir la incidencia y gravedad de
enfermedades fúngicas de artículos agrícolas producidas por
Mucor spp., incluyendo pero sin limitación Mucor
piriformis. La podredumbre producida por Mucor, causada
principalmente por Mucor piriformis E. Fischer, se produce
de forma menos consistente que el moho azul y el moho gris, aunque
en situaciones especiales puede producir grandes pérdidas de
manzanas y peras. Todos los fungicidas registrados actualmente para
el tratamiento posterior a la recolección de frutas pomáceas son
ineficaces contra Mucor piriformis.
Para reducir la incidencia y gravedad de
enfermedades de artículos agrícolas producidas por Mucor
spp, se prefiere Cryptococcus infirmo-miniatus
(preferiblemente la cepa YY-6).
Biocontrol de Botrytis spp. La
presente invención proporciona cepas de levaduras saprofitas
naturales eficaces para reducir la incidencia y gravedad de
enfermedades fúngicas de artículos agrícolas producidas por
Botrytis spp., incluyendo pero sin limitación el moho gris,
producido por Botrytis cinerea Pers. El moho gris es la
enfermedad posterior a la recolección más importante de las peras y
es la segunda en importancia después del moho azul en las manzanas.
También conocido como podredumbre de los racimos o podredumbre de
los nidos, el moho gris puede producir grandes pérdidas debido a su
capacidad de extenderse desde las frutas infectadas a frutas sanas
adyacentes durante el almacenamiento. En temperaturas de
almacenamiento frías, la enfermedad se desarrolla más rápidamente
que cualquier otra podredumbre posterior a la recolección excepto la
producida por Mucor.
Para reducir la incidencia y gravedad de
enfermedades de artículos agrícolas producidas por Botrytis
spp., se prefiere Cryptococcus
infirmo-miniatus (preferiblemente la cepa
YY-6), particularmente para el control del moho
gris. Se prefiere que el tratamiento combine una o más cepas de las
levaduras de la invención con una baja dosis de un fungicida químico
que se sepa en la técnica que es eficaz contra Botrytis
spp., por ejemplo tiabendazol, tiram o dicloran.
Biocontrol de Phialophora spp. La
presente invención proporciona cepas de levaduras saprofitas
naturales eficaces para reducir la incidencia y gravedad de
enfermedades fúngicas de artículos agrícolas producidas por
Phialophora spp., incluyendo pero sin limitación
Phialophora malorum, que produce la podredumbre lateral. Los
fungicidas de bencimidazol, tales como el tiabendazol, son
ineficaces para reducir la incidencia y gravedad de la podredumbre
lateral.
Para reducir la incidencia y gravedad de
enfermedades de artículos agrícolas producidas por Phialophora
spp., particularmente para el control de la podredumbre
lateral, se prefiere Cryptococcus
infirmo-miniatus (preferiblemente la cepa
YY-6). El tratamiento puede emplear una o más cepas
de las levaduras de la invención solas o en combinación con una
baja dosis de un fungicida químico.
Biocontrol de Pezicula ssp. La
presente invención proporciona cepas de levaduras saprofitas
naturales eficaces para reducir la incidencia y gravedad de
enfermedades fúngicas de artículos agrícolas producidas por
Pezicula spp., incluyendo pero sin limitación Pezicula
malicorticis, que produce la podredumbre de ojo de buey.
Para reducir la incidencia y gravedad de
enfermedades de artículos agrícolas producidas por Pezicula
spp., particularmente para el control de la podredumbre de ojo
de buey, se prefiere Cryptococcus
infirmo-miniatus (preferiblemente la cepa
YY-6). El tratamiento puede emplear una o más cepas
de las levaduras de la invención solas o en combinación con una
baja dosis de un fungicida químico.
Biocontrol de Monilinea spp. La
presente invención proporciona cepas de levaduras saprofitas
naturales eficaces para reducir la incidencia y gravedad de
enfermedades fúngicas de artículos agrícolas producidas por
Monilinea spp., incluyendo pero sin limitación Monilinea
fructicola, que produce la podredumbre parda de la cerezas.
Para reducir la incidencia y gravedad de
enfermedades de artículos agrícolas producidas por Monilinea
spp., particularmente para el control de la podredumbre parda,
se prefiere Cryptococcus laurentii (preferiblemente la cepa
HRA-5), usado solo o en combinación con
Cryptococcus infirmo-miniatus
(preferiblemente la cepa YY-6). El tratamiento puede
emplear una o más cepas de las levaduras de la invención solas o en
combinación con una baja dosis de un fungicida químico.
Cultivo de levaduras. Las cepas de
levadura de la presente invención se cultivan en condiciones
aerobias a cualquier temperatura satisfactoria para el crecimiento
del organismo, por ejemplo de aproximadamente 10ºC aproximadamente
30ºC. La temperatura preferida es de 20 a 25ºC. El pH de medio
nutriente preferiblemente es aproximadamente neutro; es decir, de
aproximadamente pH 5,8 a 7,2. El tiempo de incubación es el tiempo
necesario para que los organismos alcancen una fase de crecimiento
estacionaria. El tiempo de incubación preferiblemente es de
aproximadamente 48-72 horas.
Las cepas de levadura pueden cultivarse por
cualquiera de los métodos conocidos en la técnica para tales
levaduras. Para la fermentación a pequeña escala, se prefieren
matraces de agitación convencionales. Para la fermentación a gran
escala, se prefieren depósitos de fermentación. Preferiblemente, al
medio líquido inoculado se le suministra agitación y/o aireación.
Después de la incubación, los organismos se recogen por métodos
convencionales, por ejemplo, centrifugación o filtración. Los
cultivos o células recogidas pueden almacenarse por medios
convencionales, por ejemplo, por liofilización después de la adición
de un crioprotector.
Cantidad de levadura en las composiciones de
la invención. Las composiciones de esta invención generalmente
se proporcionan en una cantidad eficaz para tratar y/o prevenir
enfermedades fúngicas de artículos agrícolas. Una "cantidad
eficaz" de una composición de la presente invención es una
cantidad de la composición que reduce la incidencia o gravedad de
una enfermedad fúngica cuando se aplica al artículo agrícola,
preferiblemente en un 50% o más en comparación con los
controles.
Como será evidente para un especialista en la
técnica, las concentraciones eficaces pueden variar dependiendo de
factores que incluyen: la cepa de levadura empleada, el tipo, edad
y madurez del artículo agrícola; y el tipo y concentración de
patógenos fúngicos que afectan al artículo agrícola; temperatura y
humedad. Las concentraciones ilustrativas varían de aproximadamente
1 x 10^{4} a 1 x 10^{12} unidades formadoras de colonias por
mililitro (CFU/ml). Preferiblemente, las composiciones comprenden
más de 1 x 10^{7} CFU/ml.
Modos de aplicación de las composiciones de la
presente invención. Las composiciones de la presente invención
pueden proporcionarse en cualquiera de las formas convencionales
conocidas en la técnica. Estas composiciones de biocontrol fúngico
pueden estar en forma sólida o líquida. Las composiciones sólidas
pueden estar en forma de levaduras liofilizas en forma de polvos,
gránulos o polvos humectables. Los cultivos liofilizados pueden
resuspenderse fácilmente en soluciones acuosas para aplicarse a los
artículos agrícolas. Las composiciones líquidas pueden estar en
forma de medios acuosos o no acuosos, en soluciones, suspensiones,
dispersiones, o formas concentradas, por ejemplo, una suspensión
espesa o pasta.
Las composiciones que comprenden levaduras de la
presente invención pueden aplicarse por cualquier método conocido
en la técnica, incluyendo pero sin limitación pulverización,
inmersión, empapamiento, aplicación por medio de una brocha o
nebulización. Además, los organismos de la invención pueden
incorporarse en ceras, envoltorios u otros recubrimientos
protectores usados en el procesamiento de artículos agrícolas.
Patógenos fúngicos. Las levaduras de la
presente invención son útiles para el control biológico de la
incidencia y gravedad de enfermedades previas y posteriores a la
recolección producidas por una diversidad de patógenos de plantas,
incluyendo los que producen enfermedades en frutas pomáceas tales
como peras y manzanas. Los ejemplos de patógenos de plantas contra
los cuales son útiles las levaduras de la invención incluyen, pero
sin limitación, Penicillium spp. (por ejemplo,
Penicillium expansum), Botrytis spp. (por ejemplo,
Botrytis cinerea), Mucor spp. (por ejemplo, Mucor
piriformis), Pezicula spp. (por ejemplo, Pezicula
malicorticis), Phialophora spp., (por ejemplo,
Phialophora malorum) y Monilinea spp., por ejemplo,
Monilinea fructicola.
Estos hongos afectan a una amplia diversidad de
artículos agrícolas. Como lista de patógenos fúngicos de plantas y
su distribución y serie de hospedadores, véase, por ejemplo, Farr
et al., eds., Fungi on Plants and Plant Products in the
United States, American Phytopathological Society, St. Paul, MN,
1989 (Nº 5 en la serie de aportaciones de las colecciones
nacionales de hongos de los Estados Unidos).
Artículos agrícolas. Las levaduras de la
presente invención son útiles para controlar patógenos de plantas en
una diversidad de artículos agrícolas incluyendo, pero sin
limitación: frutas, verduras, cereales, granos (por ejemplo, trigo,
maíz, sorgo, soja y cebada), frutos secos (por ejemplo, cacahuetes,
almendras y pacanas), semillas, bulbos florales, plántulas de
vivero y en el ensilaje. Los ejemplos de frutas incluyen, pero sin
limitación: frutas pomáceas (manzanas y peras), frutas de hueso
(por ejemplo, melocotones, nectarinas, albaricoques, ciruelas y
cerezas), cítricos (por ejemplo, toronja, naranja, limón, naranja
china, lima, mandarinas y pummelo), uvas tomates, caquis, fresas y
papayas. Las manzanas que pueden tratarse de acuerdo con esta
invención incluyen Granny Smith, Red y Golden Delicious, Jonathan,
Gala, Fuji, Newton, Macintosh, y otras cepas de manzana bien
conocidas. Los ejemplos de peras incluyen d'Anjou, Packham's
Triumph, William's Bon Chretian y Beurre Bosc. Además de en
artículos agrícolas no procesados, la presente invención puede
utilizarse con artículos agrícolas procesados que incluyen, por
ejemplo, uvas pasas, ciruelas pasas, higos, albaricoques secos y
dátiles.
Las frutas tratadas de acuerdo con los métodos de
esta invención pueden almacenarse a las temperaturas convencionales
de almacenamiento de las frutas, tales como a 0ºC, a 4ºC y la
temperatura ambiente, sin los efectos de una infección fúngica o
con una menor incidencia y/o gravedad de la infección. Las frutas
tratadas de acuerdo con esta invención también pueden almacenarse en
una atmósfera controlada (tal como una atmósfera con un 2,5% de
oxígeno y un 2,5% de dióxido de carbono).
El artículo agrícola puede tratarse en cualquier
momento antes o después de la recolección. El momento de
tratamiento preferido es después de la recolección y antes del
almacenamiento o del transporte.
Fungicidas. Los agentes de control
biológico microbianos de la presente invención, tales como las
cepas de levaduras saprofitas descritas en este documento, pueden
usarse para controlar la incidencia y gravedad de enfermedades
fúngicas en artículos agrícolas en combinación con uno o más
fungicidas químicos bien conocidos, incluyendo pero sin limitación:
benzamidazoles (incluyendo benomilo, carbendazim y tiabendazol),
tiram, dicloran, vinclozolina, iprodiona, procimidona,
diclorfluanida, tebuconazol, procloraz, fenetanil, dietefencarb,
metomeclan, clorotalonil y mezclas de estos fungicidas.
Si un agente de control biológico microbiano se
aplica en combinación con un fungicida químico, es preferible usar
"bajos niveles" del fungicida químico. Una "baja dosis"
de un fungicida químico se define como aproximadamente un 25% o
menos de la cantidad o dosificación del fungicida químico usada
comúnmente para el control de una enfermedad fúngica particular
cuando se aplica solo, más preferiblemente aproximadamente un 10% o
menos, incluso más preferiblemente aproximadamente un 5% o menos y
aún más preferiblemente aproximadamente un 3% o menos.
El fungicida químico puede aplicarse en una
composición que comprende la levadura y el fungicida químico o el
fungicida químico puede aplicarse por separado, antes o después de
la aplicación de la levadura, usando cualquier método de aplicación
bien conocido, incluyendo pero sin limitación pulverización,
inmersión, empapamiento, nebulización e incorporación en materiales
de envasado. Los fungicidas de bencimidazol y carboximida, por
ejemplo, comúnmente se aplican como inmersiones posteriores a la
recolección, como agentes de empapamiento o como pulverizaciones en
línea.
Combinación de las levaduras de la invención
entre sí y con otros agentes de control biológico. Las cepas de
levadura de la presente invención pueden usarse individualmente o
en combinación con una o más cepas de levadura distintas de la
invención. Las cepas de levadura de la presente invención también
pueden usarse en combinación con otros microbios usados para el
control biológico de enfermedades fúngicas o de otras enfermedades
de artículos agrícolas en una cantidad compatible con la eficacia
de una cepa de levadura de la presente invención. Las cepas de
levadura de la presente invención y el agente de control biológico
adicional pueden aplicarse al artículo agrícola al mismo tiempo
como parte de una sola combinación o en momentos diferentes, antes
o después de la aplicación de una levadura de la presente
invención.
Tales agentes de control biológico adicionales
incluyen, pero sin limitación: Acremonium breve, Bacillus
subtilis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii (Pichia
guilliermondii), Cryptococcus albidus, Cryptococcus flavus,
Cryptococcus laurentii, Debaryomyces hansenii, Enterobacter
aerogenes, Hansentaspora uvarum, Myrothecium roridum, Pseudomonas
cepacia, Pseudomonas syringae, Pseudomonas gladioli, Rhodotorula
glutinis, Rhodotorula mucilaginosa, Sporobolomyces roseus,
Trichoderma harzianum y Trichoderma pseudokoningii.
Vehículos, excipientes y otros aditivos.
Las cepas de levadura de la presente invención pueden estar
presentes en composiciones que comprenden uno o más vehículos,
excipientes u otros materiales aceptables desde el punto de vista
agrícola conocidos en la técnica, compatibles desde el punto
agrícola y compatibles con la viabilidad, crecimiento y eficacia de
las cepas de levadura de la presente invención en el control
biológico de patógenos fúngicos.
El término "vehículos" incluye, por ejemplo,
(1) un vehículo basado en un gel o goma (por ejemplo, goma xantana)
o (2) un vehículo basado en agua (por ejemplo, agua, soluciones
tampón, soluciones que contienen carbohidratos y soluciones
salinas); (3) un vehículo basado en aceite (por ejemplo, "Fresh
Mark" o "Fresh Wax 58P", que es una pasta de cera para
melocotones, ciruelas y nectarinas, que contiene – aceite blanco,
cera de parafina, vaselina y ácido oleico, ambos de Fresh Mark
(Chemical Corporation, Orlando, FL)); (4) un vehículo basado en
ceras (por ejemplo, incluyendo los recubrimientos de cera usados
típicamente en cítricos y manzanas, por ejemplo "Britex 551" o
"Britex 559", ambos de Broshar (Chemicals) Ltd.,
Kefar-Saba, Israel); (5) un ingrediente de vehículo
en polvo para proporcionar la composición en forma de polvo y en el
que se dispersan los microorganismos y, por lo tanto, se diluyen
hasta la concentración deseada en la composición en polvo (por
ejemplo, almidón y talco); y (6) una mezcla de los anteriores.
El término "excipiente" se refiere a
aditivos convencionales, tales como tensioactivo y agentes
humectantes (por ejemplo, Tween 20 y Triton X-100),
antioxidantes, nutrientes, emulsionantes, agentes de extensión,
agentes de suspensión, agentes adherentes y agentes contra el
escaldado (por ejemplo, difenilamina o etoxiquina), conservantes,
pesticidas químicos y similares. Las composiciones de la invención
también pueden comprender una fuente de calcio, tal como cloruro
cálcico u otra fuente de calcio no tóxica en una cantidad del 0,1
al 50% (v/v). Véase el documento WO 92/18009 (Shanmuganathan). Los
conservantes pueden incluir, por ejemplo: (a) una goma, por ejemplo,
una goma natural tal como goma guar, goma de algarrobilla, goma
karaya, goma de tragacanto o preferiblemente goma xantana; (b)
metilcelulosa; (c) gel de sílice; y (d) mezclas de los
anteriores.
Las superficies de las plantas están colonizadas
por una flora microbiana diversa. En la recolección, la comunidad
microbiana presente en la superficie de las frutas incluye
bacterias, hongos, levaduras y otros microorganismos (Andrews y
Kenerley, Can. J. Microbiol. 24:1058-1072, 1978;
Andrews y Kenerley, Can. J. Microbiol. 25:1331-1344,
1979; Spurr, 1994). Algunos microorganismos casualmente ocupan la
superficie de las plantas y no pueden multiplicarse (Hirano y
Upper, Annu. Rev. Phytopathol. 21:243-269, 1983).
Estos microorganismos pronto desaparecen a menos que se repongan.
Otros microorganismos son residentes epifitos capaces de crecer y
sobrevivir en la superficie de las plantas.
La población microbiana juega un papel importante
en el desarrollo de las podredumbres posteriores a la recolección
de las frutas y verduras (Chalutz y Wilson, Plant Dis.
74:134-137, 1990, Spurr, 1994). La incidencia de la
enfermedad se ha correlacionado positivamente con el tamaño de la
población epifita de las bacterias patógenas de las plantas (Rouse
et al., Phytopathol 75:505-509, 1985).
Las levaduras colonizan las superficies de las
plantas o las heridas durante un largo período de tiempo en
condiciones secas, producen polisacáridos extracelulares que
aumentan su supervivencia, se multiplican rápidamente y usan
nutrientes disponibles, y se ven afectadas mínimamente por los
pesticidas (Wisniewski y Wilson, HortScience
27:94-98, 1992).
Se han descrito varios métodos para retirar
microorganismos saprofitos de las superficies de las plantas. Se ha
publicado que la limpieza con paños es menos eficaz que la
maceración para retirar las levaduras de las superficies de las
manzanas (Marshall y Walkey, Food Res, 16:448-456,
1951) y también es menos eficaz que la agitación o la sonicación
para retirar los conidios de los hongos de la superficie de las
uvas o de las ciruelas. La limpieza con paños introduce el problema
adicional de retirar los organismos de los paños utilizados para
limpiar (Walters, J. Appl. Bacteriol. 30: 56-65,
1967). Otros métodos para retirar microorganismos incluyen: lavar
muestras en agua (Le Roux et al., Phytophylactica
5:51-54, 1973; El-Din et al.,
Zentralbl. Mikrobiol. 141:488-492, 1986; Kamra y
Madan, Microbios. Letters 34:79-85, 1987; Roberts,
Phytopathol, 80:526-530, 1990),
agua-Tween (Guerzoni y Marchetti, Appl. Environ.
Microbiol. 87:571-576, 1986) o tampón fosfato
(Janisiewicz, Phytopathol. 77:481-485, 1987).
Esta etapa de lavado normalmente va seguida de
una agitación vorticial o agitación sencilla de la suspensión, y
después del cultivo de la suspensión en medio con agar. Se ha usado
la mezcla de fresas (Buhagiar y Barnett, J. Appl. Bact.
34:727-739, 1971) y uvas (Singh y Kainsa, Indian
Phytopathol. 36:72-76, 1981) en tampón fosfato para
estudiar la microflora de las frutas. También se han empleado
ultrasonidos para facilitar la recolección y cuantificación de
microorganismos epifitos de plantas (Martini et al., Can. J.
Microbiol. 26:856-859, 1980; Guerzoni y Marchetti,
Appl. Environ. Microbiol. 87:571-576, 1986). Se ha
publicado que la ultrasonicación ocasionaba el desprendimiento de
grandes números de especies de levaduras de la superficie de las
plantas y sistemáticamente daba como resultado un
100-200 por ciento más de especies de levaduras que
otros métodos (Martini et al., Can. J. Microbiol. 26:856-
859, 1980).
Sin embargo, ninguno de estos informes documenta
el tiempo óptimo de sonicación que es necesario para la separación
de la mayoría de los microorganismos de las superficies de las
plantas para el aislamiento de la mayor parte de la diversa flora
microbiana.
Como procedimientos convencionales para el
aislamiento y cultivo de cepas de levadura, véase también Phaff,
Miller y Mrak, The Life of Yeasts, 2ª edición, Harvard University
Press, 1978; y Devenport, Outline Guide to Media and Methods for
Studying Yeasts and Yeast-like Organisms, en Biology
and Activity of Yeasts, A.P. Londres, 1980. Las cepas de levadura
pueden cultivarse en agar nutriente (por ejemplo, agar
patata-dextrosa). Las cepas de levadura pueden
tipificarse fácilmente de acuerdo con procedimientos
convencionales, tales como los descritos en Barnet et al.,
Yeasts: Characteristics and Identification, Cambridge University
Press, 1983.
Los métodos de la presente invención optimizan la
recuperación de una población microbiana diversa, particularmente
los microbios útiles para el biocontrol fúngico, a partir de frutas
u otros artículos agrícolas.
Explicado brevemente, se selecciona
aleatoriamente un artículo agrícola sano y maduro, por ejemplo, una
fruta, preferiblemente sin punciones ni otros tipos de lesiones y
preferiblemente no tratada con un bactericida, fungicida o
insecticida. Se prefiere una fruta que no se haya tratado para el
control de plagas, tal como una procedente de un huerto abandonado,
para asegurar una población microbiana más diversa. Si la fruta
tiene que almacenarse antes del aislamiento de los microbios, se
prefiere el almacenamiento a una baja temperatura, por ejemplo, a
aproximadamente 5ºC, para conservar las poblaciones microbianas
naturales; es de esperar que un almacenamiento a una temperatura
superior favorezca a las bacterias y afecte adversamente a las
levaduras. Es preferible almacenar la fruta durante 24 horas o
menos.
La fruta, junto con su tallo, se sumerge total o
parcialmente en un tampón acuoso, por ejemplo SPBT (tampón fosfato
potásico estéril 0,005 M, pH 7,0, Tween 80 al 0,005%). Un medio con
un bajo contenido de nutrientes estimula el estatus de bajo
contenido de nutrientes de las superficies de las frutas, mientras
que un medio de alto contenido de nutrientes puede ocasionar el
crecimiento rápido de levaduras o bacterias cubriendo las placas o
resultando realmente tóxico para algunas levaduras.
Los microbios en la superficie de las frutas se
desprenden por agitación seguida de sonicación, preferiblemente
durante uno a cinco minutos, más preferiblemente durante cinco
minutos. Se ha determinado que este tratamiento de combinación es
muy eficaz para separar microbios unidos fuertemente y optimiza la
recuperación de una población diversa de bacterias, levaduras y
hongos filamentosos.
Se cultivan poblaciones cultivables de levaduras,
bacterias y hongos filamentosos en un medio apropiado,
preferiblemente un medio de bajo contenido de nutrientes, en
condiciones apropiadas para el crecimiento de los microbios. Las
placas se examinan cuidadosamente por inspección visual de las
diferencias en las características morfológicas y bioquímicas de
las colonias para identificar y seleccionar las poblaciones
microbianas más diversas.
Se prefieren medios de bajo contenido de
nutrientes para cultivar los microbios, por ejemplo, agar YM
diluido y caldo nutriente/agar diluido para el aislamiento de
levaduras y bacterias, respectivamente. En medios de agar con bajo
contenido de nutrientes, las características de las colonias son más
estables y se definen mejor que en medios ricos en nutrientes. A
menudo, diferentes cepas o especies tendrán sutiles diferencias en
la morfología de las colonias que pueden observarse en medios
deficientes en nutrientes, pero no en medios ricos en nutrientes.
Además, es poco probable que las colonias de crecimiento rápido de
algunas levaduras o bacterias cubran placas con medio deficiente en
nutrientes e impidan el desarrollo de aislados de crecimiento más
lento. Se ha descubierto que las características de pigmentación y
macro- y micromorfológicas de las colonias de levaduras y bacterias
son estables siempre que no cambien la composición del medio de
agar y la temperatura de incubación.
Para aislar diversas poblaciones bacterianas, el
medio preferiblemente se suplementa con agentes que previenen del
crecimiento fúngico sin interferir con el crecimiento bacteriano,
por ejemplo, ciclohexamida; para el aislamiento de levaduras y
hongos filamentosos, el medio se suplementa con un agente que
restringe el crecimiento radial de los hongos filamentosos sin
afectar a la germinación de las esporas, por ejemplo, dicloran.
Se ha publicado que además del método de
recuperación, ciertos factores tales como la temperatura, la
lluvia, la madurez de las frutas y la geografía regional y local
influyen sobre la población microbiana epifita de las plantas. Por
lo tanto, las levaduras epifitas y los tamaños de las poblaciones
bacterianas en las frutas de diferentes localizaciones del noroeste
del Pacífico son diferentes.
Este método de recuperación simplificado
proporciona un medio poderoso para aislar bacterias, levaduras y
hongos filamentosos naturales que son agentes eficaces para el
control biológico. Este método también puede usarse para estudiar
la dinámica de población de levaduras y/o bacterias asociadas con la
superficie de un artículo agrícola tal como peras o manzanas.
La invención se entenderá mejor haciendo
referencia a los siguientes ejemplos ilustrativos.
Se seleccionaron aleatoriamente manzanas Golden
Delicious (Malus domestica Borkh) maduras, sanas, sin
punciones ni ningún otro tipo de lesión, en un huerto sin
pulverizar. Se recogieron 20 frutas en cada bolsa de polietileno.
Se pusieron tres bolsas, representando cada una réplica, en hielo
durante el tránsito desde el campo al laboratorio. Las muestras se
mantuvieron en un incubador a 5ºC y se procesaron en el mismo día
de muestreo y después de 4 y 8 semanas de almacenamiento.
Para determinar el tamaño de la población y la
diversidad microbiana en levaduras, bacterias y hongos filamentosos
asociados, se muestrearon tres manzanas, una de cada bolsa. Cada
fruta, junto con su tallo, se sumergió en un vaso de precipitados
de 600 ml que contenía 200 ml de SPBT (tampón fosfato estéril 0,005
M, pH 7,0, Tween 80 al 0,005%). Los vasos de precipitados se
pusieron en un agitador rotatorio (150 rpm) durante 5 minutos,
después de lo cual los vasos de precipitados que contenían las
frutas se pusieron en un baño ultrasónico que tenía una potencia de
salida de 270 vatios y una frecuencia de 43 KHz (modelo Q140, L
& H Manufacturing Company, Kearny, NJ). Durante la sonicación,
las frutas se hicieron girar suavemente cada 30 segundos usando una
espátula de acero inoxidable estéril. Se retiró una muestra de 5,0
ml de tampón de cada vaso de precipitados inmediatamente antes de la
sonicación y 1, 2, 5, 10 y 15 minutos después de la sonicación. Las
muestras se sometieron a una agitación vorticial durante 1 minuto
usando un Vari-Whirlmixer (VWR Scientific, WA) y se
realizaron tres diluciones secuenciales de 10 veces en SPBT
añadiendo 0,5 ml de tampón de lavado a 4,5 ml de SPBT.
Se recuperaron poblaciones cultivables de
levaduras, bacterias y hongos filamentosos extendiendo 0,1 ml de
suspensión de cada réplica en placas duplicadas de medio agar. Para
determinar las poblaciones bacterianas y la diversidad, las
muestras se cultivaron en caldo nutriente/agar diluido (Chand et
al., Appl. Environ. Microbiol, 58:3374-3379,
1992) suplementado con cicloheximida (100 mg/ml) para prevenir el
crecimiento fúngico (Hirano et al., Appl. Environ.
Microbiol. 44:695-700, 1982). Para las levaduras y
los hongos filamentosos, las muestras se cultivaron en agar YM
diluido (DYMA) que constaba de 4,1 g de caldo Bacto YM (Difco
Laboratories, Detroit, MI.), 18 g de Bacto-Agar,
100 mg de cloranfenicol y 2 mg de dicloran por litro de medio. Se
añadió dicloran al medio para restringir el crecimiento radial de
los hongos filamentosos sin afectar a la germinación de las esporas
(Byrde y Willetts, The Brown Rot Fungi of Fruits: Their Biology and
Control, Pergamon Press Ltd., Oxford, England, 1977; Pitt y
Hocking, Fungi in Food Spoilage, Academic Press, New York, 1985).
Las placas inoculadas se incubaron a 20\pm1ºC y se observaron
diariamente. El número de unidades formadoras de colonias
bacterianas (CFU) por ml de tampón de lavado se estimó después de
14 días de incubación (Chand et al., Appl. Environ.
Microbiol. 58:3374-3379, 1992). Las CFU de
levaduras y de hongos filamentosos por ml de tampón de lavado se
estimaron después de 7 días de incubación. El área de superficie de
cada fruta se midió pelándola con un pelador de patatas y
determinando el área de superficie total (cm^{2}) de piel con un
medidor del área (Li-Cor. modelo nº
LI-3000, Lincoln, NE). El número de CFU cm^{-2} de
cada fruta se calculó a partir de los datos de recuentos y de área
de superficie.
Se han descrito características de colonias
(pigmentación, tamaño, opacidad, forma, elevación, margen,
homogeneidad, textura y naturaleza de extensión) de diferentes
tipos de bacterias (Chand et al., Appl. Environ. Microbiol.
58:3374-3379, 1992; Smibert y Krieg, "General
Characterization" pág. 409-443 en Gerhardt et
al. (eds.), Manual of Methods for General Bacteriology,
American Society for Microbiology, Washington, DC, 1981) y se
usaron para caracterizar las colonias. Para caracterizar las
diversas levaduras se usaron características de pigmentación y
macro- y micro-morfológicas de colonias de
levaduras (Guerzone y Marchetti, Appl. Environ. Microbiol.
87:571-576, 1986; Martini et al., Can. J.
Microbiol. 26:856-859, 1980; Sasaki y Yoshida, J.
Facul. Agr. Hokkaido Univ. Sapporo 51:194-220,
1959). El número total de hongos filamentosos se registró sin
caracterizar sus colonias, porque diferentes hongos pueden tener
características de colonias similares.
Para aislar las levaduras epifitas, las frutas se
trataron como se ha descrito en el experimento anterior, con la
excepción de que el volumen de SPBT en cada vaso de precipitados
fue de 200 ml y las frutas se sonicaron durante 5 minutos. Se
combinó el tampón de lavado de cinco frutas, que representaba una
réplica, y se cultivó en placas DYMA como se ha descrito
anteriormente. Después de 7 días de incubación, se caracterizaron y
enumeraron las colonias de levadura que tenían diversas
características de colonias. Se levantaron colonias de levadura que
tenían características de colonias similares y/o diferentes y se
cultivaron en rayas en agar YM. (Difco Laboratories, Detroit, MI)
para la purificación. Los aislados de levadura purificados se
almacenaron a una temperatura de -70 a -75ºC
(El-Din et al., Zentralbl. Mikrobiol.
141:488-492, 1986).
Usando la estrategia descrita anteriormente,
también se estudió la microflora de levaduras epifitas de peras
maduras de tres localizaciones de Oregón (Hood River, Cascade
Locks, Medford) y una localización de Washington (Yakima). Hubo
tres réplicas, constando cada una de cinco frutas seleccionadas
aleatoriamente de cada localización por cultivar (tabla 4).
Las levaduras se identificaron por el Central
Bureau for Fungal Culture (CBS), Baarn, the Netherlands, basándose
en características morfológicas, fermentación de azúcares y
crecimiento en diferentes fuentes de carbono y nitrógeno.
Se recuperaron los menores tamaños de poblaciones
de levaduras, bacterias y hongos filamentosos cuando las muestras
no se sonicaron (tabla 1). Cuando las muestras se sonicaron durante
1 minuto, la recuperación de levaduras y bacterias aumentó
substancialmente. El aumento en el número de células cultivables fue
más lento con un tiempo de sonicación de 1 a 5 minutos. La
sonicación durante 10 o 15 minutos dio como resultando un pequeño
aumento de la recuperación de las CFU cm^{-2} de levaduras o
bacterias en la superficie de las frutas. Sin embargo, la
recuperación de los hongos filamentosos continuó aumentando incluso
con el mayor tiempo de sonicación. Los hongos filamentosos se
adhieren a la superficie de las plantas más fuertemente que las
bacterias saprofitas y las levaduras (Nicholson, "Adhesion of
fungi to plant cuticle", pág. 74-89 en Roberts y
Aist (eds.), Infection Processes in Fungi, Rockefeller Foundation,
Nueva York, 1984; Nicholson y Epstein, "Adhesion of fungi to
plant surface", pág. 3-23 en Cole y Hoch (eds.),
The Fungal Spore and Disease Initiation in Plants and Animals,
Plenum, New York, 1991) y aparentemente se requiere más tiempo para
separarlos de la superficie de las frutas.
Cuando las sondas ultrasónicas se desplazan a
través del SPBT, crean una acción de depuración que es capaz de
limpiar hasta 16 veces más eficazmente que la limpieza manual de
las frutas. El examen microscópico de los lavados de las frutas
sometidas a ultrasonidos reveló la presencia de grupos de levaduras
y células bacterianas. La sonicación durante 5 minutos separó estos
grupos en células individuales. Probablemente por esta razón,
después de 5 minutos de sonicación no aumentaban los números de
aislados morfológicamente distintos de levaduras y bacterias.
En general, la población de levaduras epifitas se
redujo durante dos meses de almacenamiento de las frutas a 5ºC
(tabla 1). El tamaño de la población de bacterias epifitas cambió
muy poco durante el almacenamiento y no se registró ningún modelo
definido de cambio de población para los hongos filamentosos.
Se obtuvieron los números menor y mayor de
colonias morfológicamente distintas de levaduras y bacterias cuando
las muestras no se sonicaron o se sonicaron durante 5 minutos,
respectivamente (tabla 2). El aumento del tiempo de sonicación de 5
a 10 o 15 minutos no produjo ningún aumento adicional en la
diversidad de aislados procedentes de las frutas.
Para el aislamiento de levaduras y bacterias se
usaron respectivamente agar YM diluido y caldo nutriente/agar
diluido, ya que se ha indicado que las características de las
colonias son más estables y se definen mejor en medio agar
deficiente en nutrientes que en medio rico en nutrientes (Chand
et al., Appl. Environ. Microbiol.
58:3374-3379, 1992; Hattori, Rep. Inst. Agric. Res.
Tohoku Univ., 27:23-30, 1976; Waksman, Principles of
Soil Microbiology, The Williams & Wilkins Co., Baltimore,
1932). Ocasionalmente, el lavado con tampón de las frutas también
se cultivó en medio rico en nutrientes (agar YM de concentración
total y agar nutriente para levaduras y bacterias,
respectivamente). En tales casos, se observó que la pigmentación y
otras características de las colonias de levaduras y bacterias
siempre estaban mejor definidas en medio agar deficiente en
nutrientes. Además, las colonias de crecimiento rápido de algunas
levaduras o bacterias cubrieron las placas de medio rico en
nutrientes e impidieron el desarrollo de aislados de crecimiento
lento. También se observó que las características de pigmentación y
macro- y micro-morfológicas de las colonias de
levaduras y bacterias eran estables siempre que no se cambiara la
composición de medio agar y la temperatura de incubación.
Se determinó que la población de levaduras y
bacterias en la superficie de manzanas maduras no pulverizadas en
la recolección era de aproximadamente 8,0 x 10^{3} y 9,5 x
10^{4} CFU cm^{-2}, respectivamente.
Se observó que cuando dos aislados de levadura
mostraban sólo diferencias minoritarias en uno de los caracteres de
la colonia, tales como el tono de pigmentación o el margen de la
colonia, se identificaban como la misma especie; probablemente, tal
variabilidad está relacionada con las diferencias de las cepas. Los
aislados que eran morfológicamente distintos entre sí siempre se
identificaron como especies diferentes del mismo género o como
levaduras de diferentes géneros. De esta manera, pueden usarse
características morfológicas para seleccionar las colonias de
levaduras más diversas de las superficies de las plantas.
Se descubrió que la superficie de las peras
estaba colonizada por al menos 31 cepas morfológicamente diferentes
de 10 levaduras y especies fúngicas parecidas a levaduras.
Este método de recuperación simplificado
proporciona un medio poderoso para aislar levaduras y bacterias que
son agentes de biocontrol eficaces, como se describe más adelante.
Este método también puede usarse para estudiar la dinámica de
población de levaduras y/o bacterias asociadas con la superficie de
frutas tales como peras o manzanas.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Se aislaron e identificaron levaduras saprofitas
colonizadoras de peras maduras como se ha descrito anteriormente y
se ensayó su eficacia para controlar el moho azul, el moho gris, la
podredumbre por Mucor, la podredumbre de ojo de buey y la
podredumbre lateral de las peras.
Frutas. Se recogieron peras, cv. d'Anjou y
Bosc, cultivadas en el Mid- Columbia Agricultural Research and
Extension Center in Hood River, Oregón. En la recolección, la
firmeza de las frutas fue de 60 \pm 2 y 62 \pm 2 Newtons y el
contenido de sólidos solubles fue de 12,0 \pm 2 y 14 \pm 1,5,
respectivamente, como se determina con un penetrómetro de ensayo de
presión UC (Ametek, Bellingham, WA). Los sólidos solubles se
midieron usando un refractómetro manual (VWR Scientific, Los
Angeles, CA).
Las frutas se almacenaron al aire en cajas de
cartón revestidas con bolsas de polietileno perforadas a -1ºC hasta
su uso. Para los diferentes experimentos, las frutas se retiraron
del almacenamiento en frío, su superficie se esterilizó con
hipoclorito sódico al 0,105% (Clorox, Oakland, CA) durante 2
minutos, se aclararon con agua corriente y después se secaron al
aire. Se realizaron dos heridas de perforación (de 6 mm de diámetro
y 3 mm de profundidad) separadas por aproximadamente 3,5 cm en cada
fruta a medio camino a lo largo del eje del
cáliz-extremo del tallo. Después de realizar las
heridas, las frutas se inocularon en 30 minutos. En todos los
experimentos se usaron peras d'Anjou, excepto para el ensayo de la
podredumbre lateral, en el que se usaron peras Bosc. La podredumbre
lateral supone un problema principalmente en peras Bosc (Sugar,
"The disease cycle of side rot of pear, caused by Phialophora
malorum", tesis doctoral, Universidad Estatal de Oregón,
1990).
Levaduras de biocontrol. Se almacenaron
treinta y una cepas morfológicamente distintas de levaduras
aisladas a partir de la superficie de peras por el método descrito
anteriormente a -70ºC. Estas cepas se activaron administrando 70 ml
de suspensión en 70 ml de caldo malta dextrosa de levadura (YMBD;
que constaba de 3,0 g de Bacto extracto de levadura, 3,0 g de
extracto de malta de Difco, 5,0 g de Bacto peptona; y 10,0 g de
Bacto dextrosa por litro) en un matraz de 200 ml. Las suspensiones
de levaduras se incubaron en un agitador rotatorio (125 rpm)
durante 48 horas a 23 \pm 1ºC. La suspensión (0,1 ml por placa
Petri) se extendió en medio agar malta dextrosa de levadura (YMDA)
(la composición era similar a la de YMDB; pero se añadieron 18,0 g
de Bacto agar litro^{-1} para solidificar el medio). Después de
48 h de incubación a 23 \pm 1ºC, se retiraron las levaduras
desarrolladas en una placa Petri de cada cepa con una varilla de
vidrio con punta de caucho estéril, se suspendieron en 50 ml de
agua destilada estéril (SDW) y se agitaron vorticialmente durante 1
a 3 minutos. Las células de levadura se centrifugaron a 1,0 x
10^{4} rpm durante 15 minutos y se desechó el sobrenadante. Las
células se resuspendieron en SDW y la concentración se ajustó a 8,0
a 12,0 x 10^{5} células por ml (transmitancia del 70% a 550 nm
usando un espectrofotómetro Spectronic-20 (Bausch
and Lomb Optical Co., Rochester, NY).
A partir de la selección inicial de 31 cepas de
levadura, se seleccionaron 4 cepas de levadura que proporcionaron
el mejor control del moho azul de las peras: Cryptococcus
laurentii cepa HRA-5; Rhodotorula aurantiaca
cepa YCL5 y Rhodotorula glutinis cepas
HRA-4 y HRB-6. La eficacia de estas
cepas de levadura en el control del moho azul se ensayó
adicionalmente usando de 1,6 a 2,4 x 10^{6} células por ml
(transmitancia del 50% a 550 nm).
De estas cuatro cepas, se seleccionaron dos
cepas, Cryptococcus laurentii cepa HRA-5 y
Rhodotorula glutinis cepa HRB-6, para ensayar
adicionalmente el control del moho azul cuando se usaban solas o
combinadas con una baja dosis del fungicida tiabendazol (Mertect
340F, 15 mg ia ml^{-1}). El ensayo se realizó a 5, 10 y 20ºC,
usando 1,5 - 2,0 x 10^{7} células de levadura por ml
(transmitancia del 6% a 550 nm).
Cryptococcus laurentii cepa
HRA-5, Rhodotorula glutinis cepa
HRB-6 y Cryptococcus
infirmo-miniatus cepa YY-6 se
seleccionaron para el control del moho gris, la podredumbre por
Mucor, la podredumbre de ojo de buey y la podredumbre
lateral de las peras usando de 4,0 a 8,0 x 10^{7} células de
levadura por ml (transmitancia del 2% a 550 nm). Se incluyó
Cryptococcus infirmo-miniatus cepa
YY-6 porque mostró la mayor eficacia en el control
de moho azul en manzanas Golden Delicious.
Patógenos. Se cultivaron Penicillium
expansum (cepa 46), Botrytis cinerea (cepa 62), Mucor
piriformis (cepa 57, ATCC Nº 60988), Phialophora malorum
(cepa 47) y Pezicula malicorticis (cepa 14) en agar
patata-dextrosa a 22 \pm 1ºC. Después de 7 a 8
días de incubación, se realizó una suspensión de esporas de
Penicillium expansum en SDW que contenía
Tween-80 al 0,005%, se filtró a través de una capa
doble de muselina estéril, se sonicó durante 5 minutos (Model T14,
L & R Manufacturing Co., Kearny, NJ) para romper las cadenas de
esporas en esporas individuales, y se agitó vorticialmente durante
1 minuto para asegurar una mezcla uniforme. Para obtener la
suspensión de B. cinerea, se usó el mismo procedimiento con
la excepción de que se usaron cultivos de 14 días de edad. Se
realizaron suspensiones de esporas de Mucor piriformis y
otros dos patógenos en SDW (sin Tween-80 y
sonicación) después de 7 y 14 días de incubación, respectivamente.
Las concentraciones de esporas de determinaron con un hemacitómetro
y las suspensiones se usaron en un período de 2-3
horas. Las concentraciones de Penicillium expansum,
Botrytis cinerea, Mucor piriformis, Phialophora
malorum y Pezicula malicorticis usadas fueron: 5,0 x
10^{3}, 2,0 x 10^{3}, 2,0 x 10^{3}, 4,0 x 10^{3} y 4,0 x
10^{3}, respectivamente.
Tratamiento de las frutas. Se pusieron
frutas sobre las que se habían realizado heridas en bandejas de
cartón y cada herida se inoculó con 50 ml de la suspensión de
esporas fúngicas. La patogenicidad de 31 cepas de levaduras en
peras y su eficacia en el control del moho azul se ensayó inoculando
una mezcla de tratamiento (levadura sola, levadura mezclada con
P. expansum, y P. expansum solo como control) en
heridas en cinco peras por tratamiento. Las frutas inoculadas se
distribuyeron aleatoriamente, se pusieron en cajas de cartón, se
incubaron durante 4 días a 5ºC y después se incubaron durante
6-7 días a 22ºC antes de registrar la incidencia (%
de heridas inoculadas que desarrollaron podredumbre) y la gravedad
(diámetro medio de la podredumbre de las heridas que habían
enfermado) de la enfermedad. Cuatro levaduras que mostraron un buen
potencial en el control del moho azul se estudiaron adicionalmente.
La eficacia de estas levaduras en el control del moho azul se
ensayó adicionalmente usando el método descrito anteriormente, con
la excepción de que cada tratamiento tenía tres réplicas de cinco
frutas cada uno.
Cryptococcus laurentii y Rhodotorula
glutinis se estudiaron adicionalmente en relación con el
control del moho azul a 5, 10 y 20ºC. Se aplicaron mezclas de
tratamiento [es decir, levadura mezclada con un patógeno, levadura
integrada con una baja concentración del fungicida tiabendazol [15
mg ml^{-1}] y mezclada con un patógeno, una mezcla del patógeno y
una baja o alta concentración (525 mg ml^{-1}, como se recomienda
en el mercado) de tiabendazol, y el patógeno solo como control] en
las heridas de las peras. Hubo tres réplicas de diez frutas por
tratamiento. Las bandejas con las frutas inoculadas se
distribuyeron aleatoriamente y se pusieron en cajas de cartón
revestidas con bolsas de polietileno perforadas. La incidencia de la
enfermedad y la gravedad de la enfermedad del moho azul se
registraron después de 6 a 7, de 19 a 20 y de 38 a 40 días de
incubación a 5, 10 y 22ºC de almacenamiento, respectivamente.
Como se ha descrito anteriormente, se obtuvieron
mezclas de tratamiento de levaduras con Botrytis cinerea, Mucor
piriformis, Pezicula malicorticis y Phialophora malorum
y se aplicaron en las heridas de las peras.
Para la putrefacción por Mucor y el moho
gris hubo tres réplicas de tres frutas por tratamiento para las
frutas incubadas durante 6 a 7 días a 22 \pm 1ºC. Hubo 20 frutas
por réplica para las frutas incubadas durante 30 y 60 días a -1ºC.
Los experimentos se repitieron tres veces con tres réplicas de 20
frutas por tratamiento con Cryptococcus
infirmo-miniatus a 22 \pm 1ºC. Para la
podredumbre de ojo de buey y las podredumbres laterales, hubo tres
réplicas de tres frutas por tratamiento, y las frutas tratadas se
incubaron durante 30 días a 10 \pm 1ºC antes de registrar los
datos de la enfermedad.
Análisis estadístico. La incidencia de la
enfermedad se determinó como el porcentaje de heridas inoculadas
que desarrollaron lesiones. Los datos en porcentaje se sometieron a
una transformación a arcoseno raíz cuadrada (Steel y Torrie,
Principles and Procedures of Statistics, McGraw Hill, New York,
1980) antes del análisis de la varianza, y las medias se separaron
por medio de un ensayo de intervalo múltiple de Duncan (P =
0,05).
Resultados. Todas las levaduras y las
cepas fúngicas parecidas a las levaduras redujeron el diámetro de
la podredumbre de las heridas enfermas, pero sólo siete
(aproximadamente un 23%) de las cepas (Cryptococcus albidus
cepa HRB-2, C.
infirmo-miniatus cepa YY-6,
C. laurentii cepa HRA-5, Rhodotorula
aurantiaca cepa YCL-5 y R. glutinis cepas
HRA-3, HRA-4 y
HRB-6) redujeron la incidencia de la enfermedad del
moho azul en peras (tabla 5). C. laurentii cepa
HRA-5, R. aurantiaca cepa YCL5, y R.
glutinis cepas HRA-4 y HRB-6
fueron las más eficaces para reducir la incidencia y la gravedad de
la enfermedad. El control del moho azul de las peras usando C.
infirmo-miniatus, R. aurantiaca y R.
glutinis no se ha notificado previamente (Wisniewski y Wilson,
HortScience 27: 94-98, 1992). Es importante indicar
que la mayoría de las cepas de levadura, particularmente las del
género Cryptococcus, no fueron eficaces como agentes de
biocontrol en este ensayo.
Ninguna de las levaduras produjo ninguna
enfermedad en las frutas inoculadas, aunque las frutas se incubaron
durante 15 días a 22 \pm 2ºC. El diámetro de la lesión casi nunca
excedió de 10 ml, aunque las frutas inoculadas se incubaran durante
13-15 días a 22ºC.
C. laurentii cepa HRA-5 y
R. glutinis cepa HRB-6 fueron los más
eficaces para reducir la incidencia de la enfermedad y redujeron
significativamente la gravedad del moho azul en las frutas
inoculadas (tabla 6). Ninguna de las frutas inoculadas con una
suspensión de levadura sola desarrollo la enfermedad. C.
laurentii y R. glutinis se comportaron mejor para el
control del moho azul de las peras que en los ensayos preliminares
presentados en la tabla 5. Esto puede deberse a la presencia de
mayores números de células de levadura por ml en la mezcla de
inoculación en comparación con los ensayos preliminares. De forma
similar, se ha publicado que la eficacia de una levadura
(Candida sp.) en el control del moho azul y gris de manzanas
Golden Delicious aumenta al aumentar la concentración de las células
de levadura (McLaughlin et al., Phytopathol.
80:456-461, 1990).
Basándose en estos resultados, se ensayaron C.
laurentii cepa HRA-5 y R. glutinis cepa
HRB-6 solos y en combinación con una baja dosis (15
mg ml^{-1}) de tiabendazol para el control del moho azul a 5, 10
y 20ºC. Las levaduras solas o en combinación con tiabendazol
redujeron significativamente la incidencia y la gravedad del moho
azul a todas las temperaturas (tablas 7 y 8).
La combinación de levaduras con una baja dosis de
tiabendazol proporcionó un control de la enfermedad
significativamente mejor a todas las temperaturas que la baja dosis
de tiabendazol solo y fue comparable al control de la enfermedad
conseguido usando una alta dosis de tiabendazol. Usando esta
estrategia, los residuos de tiabendazol pueden reducirse en
aproximadamente un 97% o más, pudiéndose conseguir al mismo tiempo
un control excelente del moho azul. Esta estrategia es
especialmente atractiva para reducir los residuos de tiabendazol en
los alimentos. En las condiciones de los almacenes de envasado, las
poblaciones de P. expansum constan de cepas sensibles e
insensibles al bencimidazol (Spotts y Cervantes, Plant Dis.,
70:106-108, 1986). En estas condiciones, por
ejemplo, la combinación de levadura-tiabendazol
protege contra el moho azul mejor que el tiabendazol solo, incluso
a altas concentraciones.
Se determinó la eficacia de C. laurentii,
R. glutinis y C. infirmo-miniatus
solos y combinados con una baja dosis de tiabendazol contra la
podredumbre por Mucor. Todas estas levaduras solas o en
combinación con una baja dosis de tiabendazol reducían
significativamente la incidencia y la gravedad de la enfermedad a
-1 y 20ºC. El tiabendazol solo (a bajas y a altas concentraciones)
no pudo proporcionar ninguna protección contra la podredumbre por
Mucor (tabla 9). Se ha publicado que los fungicidas de
bencimidazol son eficaces para controlar la podredumbre de
Mucor (Maculates y Spotts, Plant Dis.
74:537-543, 1990). En la mayoría de los casos, una
combinación de una levadura y una baja dosis de tiabendazol no fue
significativamente mejor en el control de la enfermedad que la
levadura sola, probablemente debido a la insensibilidad de Mucor
piriformis ante los fungicidas de bencimidazol. C.
infirmo-miniatus fue significativamente mejor
que todos los demás tratamientos para reducir la incidencia de la
podredumbre por Mucor; la incidencia de la enfermedad se
redujo del 100% al 42% a -1ºC y del 100% al 11% a 20ºC (tabla 10).
La eficacia de estas levaduras contra la podredumbre por
Mucor, especialmente Cryptococcus
infirmo-miniatus, es especialmente
significativa, ya que todos los fungicidas registrados actualmente
para el tratamiento posterior a la recolección de las frutas
pomáceas son ineficaces contra Mucor piriformis (Maculates y
Spotts, Plant Dis. 74:537-543, 1990).
La eficacia de C.
infirmo-miniatus se ensayó en tres ensayos
diferentes para confirmar su eficacia en el control biológico de la
podredumbre por Mucor (tabla 10). En todos los ensayos,
C. infirmo-miniatus redujo significativamente
la incidencia y la gravedad de la enfermedad. La reducción en la
incidencia de la enfermedad varió del 62 al 89 por ciento, mientras
que los diámetros de las heridas enfermas se redujeron de 40,3 a
5,3, de 28,3 a 8,8 y de 31,3 a 8,6 en los ensayos 1, 2 y 3
respectivamente. Este es el primer informe que documenta el control
biológico potencial de C. infirmo- miniatus contra la
podredumbre por Mucor.
Todos los tratamientos redujeron
significativamente la incidencia y la gravedad del moho gris en
peras a -1ºC. Cuando las levaduras se integraron con una baja dosis
de tiabendazol, la reducción de la incidencia en el moho gris no
fue significativamente diferente de la observada en las frutas
tratadas con una alta dosis de tiabendazol solo y almacenadas a -1 y
20ºC (tabla 11). Las frutas con heridas aparentemente sanas después
de 60 días de almacenamiento a -1ºC se dejaron madurar durante 5
días a 20ºC, y más del 95% de las heridas permanecieron sanas.
Normalmente se requieren de 45 a 60 días a -1ºC para que se curen
las heridas de las peras. Probablemente, debido a la curación de las
heridas, la incidencia del moho gris no aumentó. En el caso de la
podredumbre por Mucor, aproximadamente un 50% de las heridas
aparentemente sanas (después de 30 días de almacenamiento de las
frutas a -1ºC) desarrollaron podredumbre cuando se incubaron durante
5 días a 20ºC, lo cual indica la supervivencia del patógeno y la
curación parcial de las heridas. Cuando se integraron con una baja
dosis de tiabendazol, todas las levaduras fueron más eficaces en la
reducción de la gravedad de la enfermedad que cuando se utilizaron
solas. Por primera vez, notificamos el control del moho gris de las
peras usando tres levaduras: C. laurentii, R. glutinis y
C. infirmo-miniatus.
La podredumbre lateral de las peras Bosc se
controló completamente por todas las levaduras solas o cuando se
integraron con una baja dosis de tiabendazol (tabla 12). El
tiabendazol (15 y 525 mg ml^{-1}) fue ineficaz para reducir la
incidencia y la gravedad de la enfermedad debido a la
insensibilidad de P. malorum a los fungicidas de bencimidazol
(Sugar et al., Plant Dis. 78:791-795, 1994).
Éste es el primer informe del control de la podredumbre lateral de
las peras con R. glutinis o C.
infirmo-miniatus.
Todas las levaduras solas o cuando se integraron
con una baja dosis de tiabendazol redujeron significativamente la
incidencia y la gravedad de la podredumbre de ojo de buey (tabla
12). Las levaduras, cuando se integraron con una baja dosis de
tiabendazol, controlaron completamente la podredumbre de ojo de
buey, y el control no fue significativamente diferente del obtenido
usando la alta dosis de tiabendazol (tabla 12). Aparentemente, no
hay informes publicados previamente sobre el control de la
podredumbre de ojo de buey usando agentes de control biológico.
Es importante tener en cuenta que la mayoría de
las cepas de levadura ensayadas, particularmente las del género
Cryptococcus, según se determinó, eran agentes de biocontrol
ineficaces. Hay diferencias significativas entre las cepas de
incluso una sola especie de levadura en su eficacia en el control de
enfermedades fúngicas.
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(Tabla pasa a página
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\begin{minipage}[t]{150mm} ^{y} Las heridas se trataron con
una suspensión de esporas de P. expansum (5,0 x 10 ^{3}
ml ^{-1} ) solo, una mezcla de TBZ (15 y 525 \mu g ml ^{-1} ) y
P. expansum o una suspensión de levadura
(2,0-3,0 x 10 ^{7} células ml ^{-1} ) y P.
expansum con una proporción reducida de TBZ o sin TBZ. Los
datos se registraron después de 35-40,
17-20 y 6-8 días de incubación a 5,
10 y 20ºC, respectivamente.\end{minipage} \cr
\begin{minipage}[t]{150mm} ^{z} Dentro de una columna, los
valores con las mismas letras no son significativamente diferentes
a P = 0,05 de acuerdo con el ensayo de intervalo múltiple de
Duncan.\end{minipage} \cr}
Frutas. Se recogieron manzanas (cv. Golden
Delicious) cultivadas en el Mid-Columbia
Agricultural Research and Extension Center in Hood River, Oregón,
en la segunda semana de septiembre durante 1993 y 1994. En la
recolección, la firmeza de las frutas fue de 55 \pm 2 y 50 \pm
2 Newtons (0,225 libras por Newton) y el porcentaje de sólidos
solubles fue de 12,0 \pm 2 y 13 \pm 1,5 en 1993 y 1995,
respectivamente. La firmeza se determinó con un penetrómetro de
ensayo de presión UC (Ametek, Bellingham, WA) y los sólidos solubles
se determinaron usando un refractómetro manual (VWR Scientific, Los
Angeles, CA). Las frutas se almacenaron a 0ºC en cajas de cartón
revestidas con bolsas de polietileno perforadas hasta el uso.
En cada manzana se realizaron dos heridas de
perforación (de 6 mm de diámetro y 3 mm de profundidad) separadas
por aproximadamente 3,5 cm a medio camino a lo largo del eje del
cáliz-tallo. Después de realizar las heridas, las
manzanas se inocularon dentro de un período de 30 minutos.
Levaduras de biocontrol. Para el estudio
en manzanas se seleccionaron seis cepas de levadura (dos cepas de
Cryptococcus spp. y cuatro cepas de Rhodotorula spp.)
aisladas a partir de la superficie de peras y que se había
demostrado que controlaban el moho azul de las peras como se ha
descrito anteriormente. Las levaduras se almacenaron a -70ºC y se
activaron distribuyendo 70 ml de suspensión en 70 ml de caldo malta
dextrosa de levadura (YMDE; que consta de 3,0 g de Bacto extracto
de levadura, 3,0 g de extracto de malta de Difco, 5,0 g de Bacto
peptona y 10,0 g de Bacto dextrosa litro^{-1} de medio) en un
matraz de 200 ml. Las suspensiones de levadura se incubaron en un
agitador rotatorio a 125 rpm durante 48 horas a 23 \pm 1ºC. La
suspensión (0,1 ml por placa Petri) se extendió en medio de agar
malta dextrosa de levadura (YMDA) (similar a YMDB, con la excepción
de que se añadieron 18,0 g de Bacto agar litro^{-1} para
solidificar el medio). Después de 48 horas de incubación a 23 \pm
1ºC, se retiraron las levaduras desarrolladas con una varilla de
vidrio con punta de caucho estéril, se suspendieron en 50 ml de agua
destilada estéril (SDW) y la suspensión se agitó vorticialmente
durante 1-3 minutos. Las células de levadura se
centrifugaron a 1,0 x 10^{4} rpm durante 15 minutos y el
sobrenadante se desechó. La células se resuspendieron en SDW, y la
concentración se ajustó a 1,6 - 2,4 x 10^{6} células por ml
(transmitancia del 50% a 550 nm usando un espectrofotómetro modelo
Spectronic 20, Bausch and Lomb Optical Co., Rochester, NY).
Entre la selección inicial de seis cepas de
levadura, dos cepas de levadura, Cryptococcus
infirmo-miniatus cepa YY6 y C.
laurentii HRA5, proporcionaron el mejor control del moho azul
de las manzanas. Se ensayó la eficacia de cualquiera de estas
levaduras solas o cuando se integraron con una baja dosis del
fungicida tiabendazol (TBZ, Mertect 340F, 15 mg ia ml^{-1}) con
respecto al control del moho azul a 5, 10 y 20ºC usando 2,0 - 3,0 x
10^{7} células de levadura por ml (transmitancia del 6% a 550
nm).
Patógenos. Se cultivó Penicillium
expansum cepa 46 en agar patata dextrosa a 22 \pm 1ºC.
Después de 7-8 días de incubación, se obtuvo una
suspensión de esporas en SDW que contenía Tween-80
al 0,005% (SDWT), se filtró a través de una doble capa de muselina
estéril, se sonicó durante 5 minutos (Model T14, L&R
Manufacturing Co., Kearny, NJ) para romper las cadenas de esporas en
esporas individuales, y se agitó verticialmente durante 1 minuto
para asegurar una mezcla uniforme. Las concentraciones de esporas
se determinaron con un hemacitómetro y las suspensiones se usaron
dentro de un período de dos a tres horas.
Durante el transcurso de esta investigación, la
concentración de Penicillium expansum usada fue de 5,0 x
10^{3} esporas/ml.
Tratamiento de las frutas. Se ensayó la
eficacia de seis cepas de levadura con respecto al control del moho
azul inoculando manzanas heridas con 50 ml por herida de levadura
sola, levadura mezclada con P. expansum y P. expansum
solo como control. Hubo cinco réplicas de cinco frutas por
tratamiento. Las bandejas con las frutas inoculadas se distribuyeron
aleatoriamente y se pusieron en cajas de cartón revestidas con
bolsas de polietileno perforadas. Las frutas se incubaron durante
7-8 días a 22ºC antes de registrar la incidencia
(porcentaje de heridas inoculadas que desarrollaron podredumbre) y
la gravedad (diámetro medio de la podredumbre de las heridas
enfermas) de la enfermedad.
Dos levaduras, Cryptococcus
infirmo-miniatus y C. laurentii,
mostraron el mayor potencial para el control del moho azul y se
seleccionaron para estudios adicionales. Se ensayó la eficacia de
estas dos levaduras para el control del moho azul a 5, 10 y 20ºC.
En las heridas de las manzanas se aplicaron las siguientes mezclas
de tratamiento: P. expansum solo, una mezcla de TBZ (15 y
252 mg ml^{-1}y P. expansum, o suspensión de levadura y
P. expansum con una baja proporción de TBZ o sin TBZ. Hubo
tres réplicas de cinco frutas por tratamiento. Las bandejas con las
frutas inoculadas se distribuyeron aleatoriamente y se pusieron en
cajas de cartón revestidas con bolsas de polietileno perforadas. La
incidencia y la gravedad del moho azul se registraron después de
6-8, 17-20 y 35-40
de incubación a 5, 10 y 20ºC, respectivamente.
Estudios de población de levadura en
heridas. Se estudió la capacidad de células de levadura de
sobrevivir y multiplicarse en heridas de manzana para determinar si
estas levaduras eran colonizadores eficaces. Se hirieron las
frutas, después se inocularon con 50 ml de una suspensión que
contenía 2 x 10^{7} células de levadura ml^{-1}. Las frutas se
incubaron en cajas de plástico a 0, 5, 10 y 20ºC. Las
concentraciones de células viables del inóculo se determinaron por
una técnica de frecuencia en placa de dilución modificada (Chand
et al., Appl. Environ. Microbiol.
58:3374-3379, 1992). Las frutas individuales
sirvieron como réplica en un diseño de bloque completo aleatorio, y
se muestrearon tres réplicas en cada tiempo y temperatura. En el
caso de las frutas incubadas a 5, 10 y 20ºC, las heridas se
muestrearon 0, 1, 2, 3, 4 y 7 días después de la inoculación,
mientras que a 0ºC, se retiraron muestras 0, 3, 10, 15 y 30 días
después de la inoculación. Las muestras se cogieron usando un
perforador de corcho (con un diámetro interno de 10 mm) y se
maceraron en agua destilada estéril. Se cultivaron diluciones en
serie por duplicado en placas con YMDA usando la técnica de
frecuencia en placa de dilución modificada (Chand et al.,
1992) y se incubaron a 22 \pm 2ºC durante 4 días, después de los
cual se determinaron las poblaciones de levadura y se expresaron
como log_{10} CFU por herida.
Análisis estadístico. La incidencia de la
enfermedad fue el porcentaje de heridas inoculadas que
desarrollaban lesiones. Los datos en porcentaje se sometieron a una
transformación a arcoseno raíz cuadrada (Steel and Torrie,
Principles and Procedures of Statistics, p. 158,
McGrawn-Hill, New York, 1980) antes del análisis de
la varianza, y las medias se separaron por el ensayo de intervalo
múltiple de Duncan (P = 0,05). La gravedad de la enfermedad fue el
diámetro de la podredumbre de las heridas enfermas y su incidencia
se analizó estadísticamente con el método anterior.
Resultados. Las seis levaduras redujeron
significativamente tanto la incidencia como la gravedad del moho
azul en manzanas (tabla 13). Cuando se consideraron estas dos
medidas de la enfermedad, C. infirmo-miniatus
y C. laurentii fueron las más eficaces de las seis
levaduras, y se seleccionaron para un estudio adicional.
El control del moho azul de manzanas con C.
infirmo-miniatus y C. laurentii se
evaluó a 5, 10 y 20ºC. A 5ºC, tantos las levaduras solas como con
TBZ redujeron la incidencia del moho azul, y no hubo diferencias
significativas (P = 0,05) entre los tratamientos de biocontrol
(tabla 14). A 10ºC, C. laurentii solo y TBZ a 15 mg ml^{-1}
fueron menos eficaces que los demás tratamientos; las diferencias
fueron significativas (P = 0,05) en 1993, pero no en 1994. A 20ºC,
un tratamiento con cualquier levadura sola o con cualquier levadura
junto con una baja dosis de TBZ solo fue menos eficaz que un
tratamiento que empleaba una de las levaduras junto con TBZ o una
alta dosis de TBZ solo. Sin embargo, cualquier levadura sola o
cualquier levadura junto con una baja dosis de TBZ proporcionó una
reducción significativa de la incidencia del moho azul en
comparación con el control (P. expansum solo) (tabla 14). La
incidencia de la enfermedad fue mayor en 1993 que en 1994. El efecto
de los tratamientos con levaduras sobre la gravedad del moho azul
fue similar a los efectos sobre la incidencia (tabla 15).
La dinámica de la población de las levaduras en
manzanas se estudió a 0, 5, 10 y 20ºC. A 0ºC, las poblaciones de
C. infirmo-miniatus y C. laurentii
aumentaron en unidades de log_{10} desde aproximadamente 6,6 a un
máximo de aproximadamente 7,8 por herida en 10 días (figura 1A).
Esto se continuó por una reducción gradual a aproximadamente
7,6-7,7 unidades logarítmicas en el día 30. Se
observó un patrón similar a temperaturas comprendidas entre 5 y
20ºC: las poblaciones de las levaduras aumentaron aproximadamente
1,4 unidades logarítmicas hasta un máximo de 7,4 en los dos
primeros días (figuras 1B, 1C y 1D). Las poblaciones de levaduras se
redujeron en los cinco días siguientes a aproximadamente 7,1
unidades logarítmicas por herida.
De esta manera, se demostró que las levaduras
C. infirmo-miniatus y C. laurentii
eran eficaces en el biocontrol del moho azul de las manzanas a 5ºC,
pero eran menos eficaces a 10ºC o 20ºC cuando las levaduras se
usaban solas. Cuando C. infirmo-miniatus o
C. laurentii se combinaron con TBZ a 15 mg ml^{-1}, se
consiguió un control excelente a todas las temperaturas y fue
equivalente a la proporción completa indicada en la etiqueta de TBZ.
Las bajas proporciones de TBZ e iprodiona en este estudio
representan reducciones del 97 y 98%, respectivamente, de las
proporciones totales indicadas en la etiqueta (Willet et
al., Postharvest Pomology Newsletter 7:1-15,
1989). De esta manera, es posible una reducción significativa en
los residuos de fungicida con estos tratamientos de combinación. El
biocontrol en un amplio intervalo de temperaturas es importante con
las manzanas, porque las frutas se almacenan a 0ºC o a temperaturas
ligeramente superiores (U.S. Dept. of Agriculture, Agriculture
Research Service, The commercial storage of fruits, vegetables and
florist and nursery stocks, pág. 23-26, Agric.
Handbook 291, 1968), y después se mantienen a temperaturas
superiores en los mercados finales.
La madurez de las frutas también afecta a la
susceptibilidad a la pudrición (Pierson et al., Market
diseases of apples, pears, and quinces, U.S. Dept. of Agriculture
Handbook 376, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research
Service, 1971, at p. 2). Las manzanas parecían ser
considerablemente más susceptibles en 1993 que en 1994 (tabla 14).
Sin embargo, los tratamientos de combinación de levaduras con la
baja proporción de TBZ controlaron el moho azul en los dos
años.
Además de variar las temperaturas y los niveles
de madurez de las frutas, las manzanas también se infectan en el
medio posterior a la recolección por una diversidad de patógenos
(Pierson et al., 1971). Como se ha descrito anteriormente,
C. infirmo-miniatus y C. laurentii
controlan el moho gris, la podredumbre de ojo de buey, la
podredumbre por Mucor, y la podredumbre lateral de las
peras. Estos patógenos también afectan a las manzanas, y las
manzanas pueden tratarse de forma similar con las cepas de levadura
de la presente invención solas o en combinación con fungicidas
químicos apropiados.
Se ha informado sobre la resistencia de P.
expansum a bencimidazoles (Wicks, Plant Dis. Reptr,
61:447-449, 1977). Como el modo de acción de C.
infirmo-miniatus y C. laurentii no
implica antibiosis, como se ha descrito anteriormente, es poco
probable que se desarrolle resistencia a estas levaduras.
Frutas. Se recogieron cerezas dulces (cv.
Lambert) el 15 de junio de 1994 en la madurez comercial, se
almacenaron a -1ºC y se usaron en los 20 días posteriores a la
recolección. Se retiraron del almacenamiento en frío las manzanas y
la cerezas que parecían sanas para diferentes experimentos, sus
superficies se esterilizaron con hipoclorito sódico al 0,105% (The
Clorox Co., Oakland, CA) durante 2 minutos, se aclararon con agua
corriente y después se secaron al aire. No se realizaron heridas en
las cerezas.
Levaduras de biocontrol. Se ensayó la
eficacia de Cryptococcus infirmo-miniatus
cepa YY6 y C. laurentii cepa HRA5, solos o cuando se
integraron con una baja dosis del fungicida iprodiona (Rovral 50 WP,
20 mg ia ml^{-1}), para el control de la podredumbre parda de las
cerezas dulces usando 2,0 - 3,0 x 10^{7} células de levadura por
mililitro (transmitancia del 6% a 550 nm).
Patógenos. Para Monilinia
fructicola, se recogieron cerezas enfermas con una esporulación
extensiva del patógeno en su superficie de un huerto en el
Mid-Columbia Agricultural Research and Extension
Center. Se retiraron las esporas de M. fructicola
sumergiendo 15 frutas enfermas en 50 ml de SDWT, y la suspensión
resultante se sonicó durante 3 minutos y se sometió a agitación
vorticial durante 1 minuto. Las concentraciones de esporas se
determinaron con un hemacitómetro, y las suspensiones se usaron
dentro de un período de 2-3 horas. La concentración
de Monilinia fructicola usada fue 1,0 x 10^{4}
esporas/ml.
Tratamiento de las frutas. Las cerezas
dulces se trataron como se ha descrito anteriormente con lo
siguiente: M. fructicola solo, una mezcla de iprodiona (20 y
1175 mg ml^{-1}) y M. fructicola, o una suspensión de
levadura y M. fructicola con una baja proporción de iprodiona
o sin ella. Hubo tres réplicas de 50 cerezas cada una. Las frutas
se transfirieron a mallas de nylon y se sumergieron durante 1
minuto en suspensiones de tratamiento. Las frutas se dejaron
escurrir durante 2 minutos y se almacenaron en bolsas de plástico
perforadas a 2,8ºC. La enfermedad se evaluó después de 20 días.
Análisis estadístico. La incidencia de la
enfermedad fue el porcentaje de heridas inoculadas que
desarrollaron lesiones. Los datos en porcentaje se sometieron a una
transformación a arcoseno raíz cuadrada (Steel y Torrie, 1980)
antes del análisis de varianza, y las medias se separaron por el
ensayo de intervalo múltiple de Duncan (P = 0,05). La gravedad de
la enfermedad fue el diámetro de la podredumbre de las heridas
enfermas y se analizó estadísticamente con el método indicado
anteriormente para determinar la incidencia.
Resultados. La reducción de la podredumbre
parda de las cerezas dulces no fue significativa con C.
infirmo-miniatus, C. laurentii o la baja
proporción de iprodiona (tabla 16). Sin embargo, cuando cualquier
levadura se combinó con la baja proporción de iprodiona, se
consiguió un control significativo (P = 0,05), y el nivel de
control fue equivalente al obtenido con la dosis completa de
iprodiona.
Se ha informado sobre la resistencia de M.
fructicola a la iprodiona (Elmer y Gaunt, Crop Protection
12:83-88, 1993). Como el modo de acción de C.
infirmo-miniatus y C. laurentii no
implica antibiosis, como se ha descrito anteriormente, es poco
probable que se desarrolle resistencia a estas levaduras.
Se producen pérdidas posteriores a la recolección
de cerezas dulces por la pudrición fúngica a pesar de la aplicación
de fungicidas y de otras medidas recomendadas (Willett et
al., Postharvest Pomology Newsl. 7:1-15, 1989).
Después de la apertura del mercado japonés en 1978 a las cerezas de
Estados Unidos, el volumen de cerezas exportadas ha aumentado de
forma constante. Al mismo tiempo, también ha aumentado la necesidad
de reducir las pérdidas posteriores a la recolección. Se necesitan
alternativas a los fungicidas porque Japón no ha establecido una
tolerancia reguladora para los restos de fungicidas
post-recolección (Dugan y Roberts, Phytopathol,
84:1031-1036, 1994). Este el primer informe sobre
el control de la podredumbre parda de cerezas dulces con levaduras
saprofitas naturales.
Se estudió la capacidad de las células de
levadura de sobrevivir y multiplicarse en heridas para determinar
si estas levaduras eran colonizadores eficaces de las heridas de
las peras. Se realizaron heridas en las frutas, se inocularon con
células de levadura y se mantuvieron en cajas de plástico a -1, 5,
10 y 20ºC. Se determinaron las concentraciones de células viables
del inóculo por una técnica de frecuencia en placa de dilución
modificada (Chand et al., Appl. Environ. Microbiol.
58:3374-3379, 1992). Las frutas individuales
sirvieron como una réplica en un diseño aleatorio de bloques
completos y se extrajeron muestras de tres réplicas en cada tiempo
de muestreo y a cada temperatura. Para las frutas incubadas a 5,
10 y 20ºC, se tomaron muestras de las heridas 0, 1, 2, 3, 4 y 7
días después de la inoculación, mientras que para las incubadas a
-1ºC, se retiraron muestras de las heridas 0, 3, 10, 15, 30 y 45
días después de la inoculación. Las muestras se tomaron usando un
perforador de corcho (con un diámetro interno de 10 mm) y se
maceraron en agua destilada estéril (Roberts, Phytopathol. 80:1051,
1990). Se cultivaron diluciones en serie por duplicado en placas
con medio YMDA usando la técnica de frecuencia en placa de dilución
modificada (Chand et al., Appl. Environ. Microbiol.,
58:3374-3379, 1992) y se incubaron a 22 \pm 2ºC
durante cuatro días, después de lo cual se contaron las poblaciones
de levadura y se expresaron como log_{10} CFU por herida.
Todas las levaduras colonizaban y se
multiplicaban en las heridas de las peras a -1, 5, 10 o 20ºC
(figuras 2 y 3). Las poblaciones de levadura en las heridas se
incrementaron aproximadamente 1,3 unidades logarítmicas con respecto
a las poblaciones iniciales en 10 días a una temperatura de
almacenamiento de - 1ºC, y después empezaron a reducirse lentamente
(figura 2). Después de 45 días de almacenamiento, la población de
levaduras en las heridas fue aproximadamente 1 unidad logarítmica
mayor que la población en el momento de la inoculación. A las
temperaturas de almacenamiento de 5, 10 y 20ºC, las poblaciones
máximas de levadura, aproximadamente 1,7 unidades logarítmicas por
encima de las poblaciones iniciales, se alcanzaron en los dos días
de almacenamiento posteriores a la inoculación (figura 3). Después
de alcanzar la mayor población en las heridas, hubo una reducción
más rápida según aumentaba la temperatura de almacenamiento de 5 a
20ºC.
Para determinar si los metabolitos extracelulares
en el caldo de cultivo eran responsables del antagonismo de C.
laurentii, R. glutinis y C.
infirmo-miniatus contra P. expansum, se
cultivaron levaduras en YMDB a 22 \pm 1ºC como se ha descrito
anteriormente. Las células de levadura y el caldo de cultivo se
separaron después de dos y siete días de incubación por
centrifugación (8,0 x 10^{3} rpm min^{-1}). El sobrenadante se
decantó y después se esterilizó por filtración usando un filtro de
membrana de policarbonato de 0,2 mm. Los sedimentos de levadura se
lavaron dos veces con 50 ml de SDW (pH 6,8) y se realizó una
suspensión celular en SDW (de 1,5 a 2,0 x 10^{7} ml^{-1}). Al
sobrenadante anterior se le añadieron unos pocos microlitros de
suspensión concentrada de esporas de P. expansum y
suspensiones de células de levadura de forma que la concentración de
esporas de P. expansum en las mezclas de inoculación fuera
de 5,0 x 10^{3} ml^{-1}. En cada perforación de las frutas
perforadas y con la superficie esterilizada se añadieron 50
microlitros de mezcla de inoculación. Hubo tres réplicas de 5
frutas por tratamiento. Los tratamientos se aleatorizaron y se
incubaron durante 6 a 8 días a 20ºC.
Todas las heridas tratadas con P. expansum
en agua o los sobrenadantes de las levaduras desarrollaron
podredumbre, indicando la ausencia de compuestos antifúngicos en
los cultivos de levaduras. Las lesiones que se desarrollaron a
partir de las heridas tratadas con una mezcla de filtrado de cultivo
de las levaduras y P. expansum tenían 43 \pm 3 mm de
diámetro, mientras que el diámetro medio de las lesiones tratadas
con P. expansum en agua era de 33,5 \pm 3,5 mm. Las
heridas tratadas con suspensiones celulares lavadas dos veces de
C. laurentii, R. glutinis y C.
infirmo-miniatus redujeron la incidencia de la
enfermedad a 45 \pm 5, 46 \pm 4 y 50 \pm 6 por ciento,
respectivamente, y el diámetro medio de las heridas enfermas fue
significativamente menor que el de los controles.
Para detectar la producción de metabolitos
antifúngicos por estas levaduras, se cultivaron en rayas en medio
YMDA en placas petri, y las placas se incubaron a 22 \pm 2ºC.
Después de 2, 4 y 7 días de incubación, se atomizó sobre las placas
una suspensión concentrada de esporas de P. expansum (de 5,0
a 7,0 x 10^{7} ml^{-1}). Las placas se incubaron a 22 \pm 2ºC
y se observaron diariamente durante 7 días para comprobar la
presencia de zonas de inhibición.
No se desarrollaron zonas de inhibición alrededor
de las levaduras desarrolladas en placas petri, lo que indica que
no se produjeron compuestos antifúngicos por ninguna de las tres
levaduras.
Debido a su rápida velocidad de crecimiento a
todas las temperaturas y a la falta de compuestos antifúngicos, es
probable que el control antifúngico se debiera a la competición por
nutrientes. Sin embargo, la resistencia inducida (es decir, la
levadura o un metabolito de la levadura activa un mecanismo de
resistencia en el artículo agrícola tratado), la producción in
vivo de algunas enzimas (es decir, la levadura produce
metabolitos en heridas de la fruta que no se producen en cultivo ni
en un medio artificial) y el hiperparasitismo (la levadura parasita
directamente al patógeno atacando las esporas y los micelios)
también pueden participar en el control de las enfermedades
posteriores a la recolección de las peras por estas levaduras
saprofitas.
Ninguna de las tres cepas de levadura usadas se
desarrolló a 37ºC, lo que indica que no pueden producir infecciones
en el cuerpo humano.
En la Mid-Columbia Agricultural
Research and Extension Center, Hood River, Oregón, están
disponibles cepas de levadura útiles en la práctica de la presente
invención. Cryptococcus laurentii cepa HRA-5,
Rhodotorula glutinis cepa HRB-6 y
Cryptococcus infirmo-miniatus cepa YY6 se han
depositado en la Agricultural Research Service Culture Collection
(NRRL), Peoria, Illinois, con los números de acceso NRRL
Y-21411, NRRL Y-21412, y NRRL
Y-21413, respectivamente.
Claims (27)
1. Una composición para el control biológico de
una enfermedad fúngica de un artículo agrícola, que comprende una
cantidad eficaz de una cepa biológicamente pura de la levadura
Cryptococcus infirmo-miniatus, siendo la
cantidad eficaz de 4 a 12 unidades logarítmicas de la cepa de
levadura biológicamente pura.
2. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 1, donde la cepa de levadura es Cryptococcus
infirmo-miniatus Phaff y Fell aislado YY6.
3. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 1 o 2, que comprende además una cantidad eficaz de
una cepa de levadura biológicamente pura seleccionada entre el
grupo compuesto por Cryptococcus albidus aislado
HRB-2, Cryptococcus laurentii (Kufferath)
Skinner aislado HRA-5, Rhodotorula
aurantiaca aislado YCL-5; Rhodotorula
glutinis Harrison aislado HRA-3, Rhodotorula
glutinis Harrison aislado HRA-4, Rhodotorula
glutinis Harrison aislado HRB-6 y mezclas de las
mismas.
4. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 2, que comprende además una cantidad eficaz de una
cepa de levadura biológicamente pura seleccionada entre el grupo
compuesto por Cryptococcus laurentii (Kufferath) Skinner
aislado HRA-5 y Rhodotorula glutinis Harrison
aislado HRB-6, y mezclas de las mismas.
5. Una composición de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además un fungicida
químico.
6. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 5, donde el fungicida químico es un miembro del
grupo compuesto por benomilo, carbendazim, tiabendazol,
vinclozolina, iprodiona, procimidona, diclorfluanida, tebuconazol,
procloraz, fenetanil, dietefencarb, metomeclan y clorotalonil.
7. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 6, donde el fungicida químico es tiabendazol.
8. Una composición de acuerdo con las
reivindicaciones 5 a 7, que comprende un fungicida químico en una
cantidad que es aproximadamente un 25% o menos de una cantidad que
sería eficaz si el fungicida químico se aplicara sin la cepa de
levadura, donde la composición es más eficaz para reducir la
incidencia o gravedad de la enfermedad fúngica que una composición
similar que carece del fungicida químico.
9. Una composición de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 5 a 8, que comprende un fungicida químico en
una cantidad comprendida entre aproximadamente el 1,7% y
aproximadamente el 10% de una cantidad que sería eficaz si el
fungicida químico se aplicara sin la cepa de levadura.
10. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 1, que comprende un agente de control biológico
microbiano adicional.
11. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 1, donde la enfermedad fúngica se produce por un
hongo seleccionado entre el grupo compuesto por Penicillium
spp., Mucor spp., Botrytis spp.,
Phialophora spp., Pezicula spp., y Monilinea
spp.
12. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 1, donde la cepa de levadura aumenta en número en al
menos 1,2 log en diez días a 0ºC en heridas de manzana o en al
menos 1,3 log en diez días a -1ºC en heridas de pera.
13. Una composición de acuerdo con las
reivindicaciones 1 o 2, que comprende además un fungicida químico
en una cantidad que es aproximadamente un 25% o menos de una
cantidad que sería eficaz si el fungicida químico se aplicara sin
la cepa de levadura, donde la composición es más eficaz para reducir
la incidencia o gravedad de la enfermedad fúngica que una
composición similar que carece del fungicida químico.
14. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 13, que comprende un fungicida químico en una
cantidad que es del 1,7% al 10% de una cantidad que sería eficaz si
el fungicida químico se aplicara sin la cepa de levadura.
15. Un método para controlar una enfermedad
fúngica de un artículo agrícola, que comprende aplicar al artículo
agrícola una composición de acuerdo con la reivindicación 1.
16. Un método de acuerdo con la reivindicación
15, donde la cepa de levadura es Cryptococcus
infirmo-miniatus Phaff y Fell, aislado
YY-6.
17. Un método de acuerdo con la reivindicación
16, que comprende además una cantidad eficaz de una cepa de
levadura biológicamente pura seleccionada entre el grupo compuesto
por Cryptococcus laurentii (Kufferath) Skinner aislado
HRA-5 y Rhodotorula glutinis Harrison aislado
HRB-6, y mezclas de las mismas.
18. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 17, que comprende además aplicar al artículo
agrícola un fungicida químico.
19. Un método de acuerdo con la reivindicación
18, donde el fungicida químico es un miembro del grupo compuesto
por benomilo, carbendazim, tiabendazol, vinclozolina, iprodiona,
procimidona, diclorfluanida, tebuconazol, procloraz, fenetanil,
dietefencarb, metomeclan y clorotalonil.
20. Un método de acuerdo con la reivindicación
19, donde la cepa de levadura es Cryptococcus
infirmo-miniatus y el fungicida químico es
tiabendazol.
21. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 6 a 20, donde la composición comprende un
fungicida químico en una cantidad que es aproximadamente un 25% o
menos de una cantidad que sería eficaz si el fungicida químico se
aplicara sin la cepa de levadura, donde la composición es más eficaz
para reducir la incidencia o gravedad de la enfermedad fúngica que
una composición similar que carece del fungicida químico.
22. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 21, donde la composición comprende un
fungicida químico en una cantidad comprendida entre aproximadamente
el 1,7% y aproximadamente el 10% de una cantidad que sería eficaz
si el fungicida químico se aplicara sin la cepa de levadura.
23. Un método de acuerdo con la reivindicación
15, donde la composición comprende además un agente de control
biológico microbiano adicional.
24. Un método de acuerdo con la reivindicación
15, donde la enfermedad fúngica se produce por un hongo
seleccionado entre Penicillium spp., Mucor spp.,
Botrytis spp., Phialophora spp., Pezicula spp.,
y Monilinea spp.
25. Un método de acuerdo con la reivindicación
15, donde la cepa de levadura aumenta en número en al menos 1,2 log
en diez días a 0ºC en heridas de manzana o en al menos 1,3 log en
diez días a -1ºC en heridas de pera.
26. Un método de acuerdo con la reivindicación
25, donde la composición comprende además un fungicida químico en
una cantidad que es aproximadamente un 25% o menos de una cantidad
que sería eficaz si el fungicida químico se aplicara sin la cepa de
levadura, donde la composición es más eficaz para reducir la
incidencia o gravedad de la enfermedad fúngica que una composición
similar que carece del fungicida químico.
27. Un método de acuerdo con la reivindicación
26, donde la composición comprende además un fungicida químico en
una cantidad comprendida entre aproximadamente el 1,7% y
aproximadamente el 10% de una cantidad que sería eficaz si el
fungicida químico se aplicara sin la cepa de levadura.
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