RU2126210C1 - Штамм бактерий для предотвращения грибкового заболевания фруктов или овощей после сбора урожая и получения антибиотиков для ингибирования возбудителей вышеуказанных заболеваний (варианты), штамм бактерий для предотвращения грибкового заболевания фруктов или овощей после сбора урожая (варианты), водная суспензия микроорганизма для ингибирования возбудителей грибковых заболеваний фруктов и овощей после сбора урожая, способ предотвращения грибкового заболевания овощей и/или фруктов после сбора урожая, антибиотик, используемый для ингибирования возбудителя грибкового заболевания фруктов или овощей после сбора урожая - Google Patents
Штамм бактерий для предотвращения грибкового заболевания фруктов или овощей после сбора урожая и получения антибиотиков для ингибирования возбудителей вышеуказанных заболеваний (варианты), штамм бактерий для предотвращения грибкового заболевания фруктов или овощей после сбора урожая (варианты), водная суспензия микроорганизма для ингибирования возбудителей грибковых заболеваний фруктов и овощей после сбора урожая, способ предотвращения грибкового заболевания овощей и/или фруктов после сбора урожая, антибиотик, используемый для ингибирования возбудителя грибкового заболевания фруктов или овощей после сбора урожая Download PDFInfo
- Publication number
- RU2126210C1 RU2126210C1 RU94045827A RU94045827A RU2126210C1 RU 2126210 C1 RU2126210 C1 RU 2126210C1 RU 94045827 A RU94045827 A RU 94045827A RU 94045827 A RU94045827 A RU 94045827A RU 2126210 C1 RU2126210 C1 RU 2126210C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fruits
- vegetables
- harvest
- ncimb
- strain
- Prior art date
Links
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 title claims abstract description 33
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 title claims abstract description 32
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 20
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 title claims abstract description 19
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 235000012055 fruits and vegetables Nutrition 0.000 title claims abstract description 12
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 title claims abstract description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 title claims description 26
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title abstract description 24
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 title abstract description 15
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 title abstract description 8
- 244000052769 pathogen Species 0.000 title abstract description 7
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 title abstract 8
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 title abstract 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 title description 6
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 claims abstract description 88
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 claims abstract description 87
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 claims abstract description 87
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 claims abstract description 87
- 241000123650 Botrytis cinerea Species 0.000 claims abstract description 46
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims abstract description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 claims abstract description 14
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims abstract description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 241001622809 Serratia plymuthica Species 0.000 claims abstract description 9
- 241000223600 Alternaria Species 0.000 claims abstract description 8
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 claims abstract description 8
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims abstract 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims abstract 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims abstract 2
- 241001157812 Alternaria brassicicola Species 0.000 claims description 33
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 30
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 24
- 241000607720 Serratia Species 0.000 claims description 19
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 15
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 claims description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 7
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 claims 4
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims 3
- 238000005507 spraying Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 51
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 abstract description 36
- 241000607717 Serratia liquefaciens Species 0.000 abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 6
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 abstract description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 33
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 29
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 28
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 26
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 26
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 25
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 23
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 20
- 241001465180 Botrytis Species 0.000 description 17
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 14
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 11
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 11
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 239000001965 potato dextrose agar Substances 0.000 description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 9
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 9
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 9
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 8
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 8
- 241000960597 Pseudomonas fluorescens group Species 0.000 description 8
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 101710139119 50S ribosomal protein L27, chloroplastic Proteins 0.000 description 6
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 6
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 6
- 102100032566 Carbonic anhydrase-related protein 10 Human genes 0.000 description 5
- 101000867836 Homo sapiens Carbonic anhydrase-related protein 10 Proteins 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 5
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 5
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 4
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 4
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 3
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 3
- 241001646398 Pseudomonas chlororaphis Species 0.000 description 3
- 241000589615 Pseudomonas syringae Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 241001156002 Anthonomus pomorum Species 0.000 description 2
- 241000589513 Burkholderia cepacia Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 2
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000194105 Paenibacillus polymyxa Species 0.000 description 2
- 244000018633 Prunus armeniaca Species 0.000 description 2
- 235000009827 Prunus armeniaca Nutrition 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 244000039328 opportunistic pathogen Species 0.000 description 2
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000013138 pruning Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- RYAUSSKQMZRMAI-YESZJQIVSA-N (S)-fenpropimorph Chemical compound C([C@@H](C)CC=1C=CC(=CC=1)C(C)(C)C)N1C[C@H](C)O[C@H](C)C1 RYAUSSKQMZRMAI-YESZJQIVSA-N 0.000 description 1
- JNRLEMMIVRBKJE-UHFFFAOYSA-N 4,4'-Methylenebis(N,N-dimethylaniline) Chemical group C1=CC(N(C)C)=CC=C1CC1=CC=C(N(C)C)C=C1 JNRLEMMIVRBKJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 1
- 241001092376 Astilbe Species 0.000 description 1
- 101100328077 Bos taurus CL43 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 235000004221 Brassica oleracea var gemmifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 244000178937 Brassica oleracea var. capitata Species 0.000 description 1
- 244000308368 Brassica oleracea var. gemmifera Species 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235036 Debaryomyces hansenii Species 0.000 description 1
- 235000011511 Diospyros Nutrition 0.000 description 1
- 241000723267 Diospyros Species 0.000 description 1
- 241000588697 Enterobacter cloacae Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 244000141359 Malus pumila Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000758706 Piperaceae Species 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 235000006029 Prunus persica var nucipersica Nutrition 0.000 description 1
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 1
- 244000017714 Prunus persica var. nucipersica Species 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 241000220324 Pyrus Species 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000219094 Vitaceae Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012458 antifungal assay Methods 0.000 description 1
- 235000021016 apples Nutrition 0.000 description 1
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- RIOXQFHNBCKOKP-UHFFFAOYSA-N benomyl Chemical compound C1=CC=C2N(C(=O)NCCCC)C(NC(=O)OC)=NC2=C1 RIOXQFHNBCKOKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MITFXPHMIHQXPI-UHFFFAOYSA-N benzoxaprofen Natural products N=1C2=CC(C(C(O)=O)C)=CC=C2OC=1C1=CC=C(Cl)C=C1 MITFXPHMIHQXPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000853 biopesticidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 1
- 239000007799 cork Substances 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-NGQZWQHPSA-N d-xylitol Chemical compound OC[C@H](O)C(O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-NGQZWQHPSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 229940092559 enterobacter aerogenes Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004362 fungal culture Methods 0.000 description 1
- 235000021021 grapes Nutrition 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- ONUFESLQCSAYKA-UHFFFAOYSA-N iprodione Chemical compound O=C1N(C(=O)NC(C)C)CC(=O)N1C1=CC(Cl)=CC(Cl)=C1 ONUFESLQCSAYKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- -1 mannolate Chemical compound 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- ZQEIXNIJLIKNTD-UHFFFAOYSA-N methyl N-(2,6-dimethylphenyl)-N-(methoxyacetyl)alaninate Chemical compound COCC(=O)N(C(C)C(=O)OC)C1=C(C)C=CC=C1C ZQEIXNIJLIKNTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 235000008935 nutritious Nutrition 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000021017 pears Nutrition 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 229920006255 plastic film Polymers 0.000 description 1
- 235000021018 plums Nutrition 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23B—PRESERVING, e.g. BY CANNING, MEAT, FISH, EGGS, FRUIT, VEGETABLES, EDIBLE SEEDS; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES; THE PRESERVED, RIPENED, OR CANNED PRODUCTS
- A23B7/00—Preservation or chemical ripening of fruit or vegetables
- A23B7/10—Preserving with acids; Acid fermentation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
- A01N63/22—Bacillus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23B—PRESERVING, e.g. BY CANNING, MEAT, FISH, EGGS, FRUIT, VEGETABLES, EDIBLE SEEDS; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES; THE PRESERVED, RIPENED, OR CANNED PRODUCTS
- A23B7/00—Preservation or chemical ripening of fruit or vegetables
- A23B7/14—Preserving or ripening with chemicals not covered by groups A23B7/08 or A23B7/10
- A23B7/153—Preserving or ripening with chemicals not covered by groups A23B7/08 or A23B7/10 in the form of liquids or solids
- A23B7/154—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
- A23B7/155—Microorganisms; Enzymes; Antibiotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/10—Antimycotics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/38—Pseudomonas
- C12R2001/39—Pseudomonas fluorescens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/425—Serratia
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Oncology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- External Artificial Organs (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству средств защиты овощей и фруктов от возбудителей грибковых заболеваний после сбора урожая. Для этой цели получены штаммы бактерий Pseudomonas fluorescens NСIМВ 40490, NСIМВ 40495, NCIМВ 40497, Serratia liquefaciens NСIМВ 40492, Serratia plumuthica NCIМВ 40493. Кроме того, получены штаммы бактерий Bacillus pumilis NCIMB 40489 и Bacillus subtilis NCIМВ 40491, используемые не только для вышеуказанной цели, но и для производства антибиотика, ингибирующего возбудителя вышеуказанных заболеваний. На основе вышеуказанных штаммов получена водная суспензия микроорганизма, содержащая штаммы в концентрации 104-109 кое/мл, предпочтительно 105-108 кое/мл. Способ предотвращения грибкового заболевания овощей и/или фруктов после сбора урожая предусматривает погружение овощей и/или фруктов в водную суспензию, содержащую один из вышеуказанных штаммов бактерий. На основе штаммов бактерий Bacillus 40489 и 40491 получен антибиотик, имеющий Rf около 0,39, или 0,56, или 0,61, проявляющий активность против Botrytis cinerea и Alternaria при рН 3,0 - 9,0. Антибиотик получают путем культивирования штамма бактерии на среде, содержащей капустные листья и воду в пропорции 5 - 100 г листьев на 1 л воды. Выделяют антибиотик из фильтрата культуральной жидкости с использованием силикагелевой колонки или пластины и элюента бутан-1-ол:уксусная кислота:вода в соотношении 3: 1: 1. Антибиотик и предложенные штаммы позволяют сохранить урожай фруктов и овощей в процессе хранения, предотвращая их гниение. 10 с. и 6 з. п.ф-лы, 13 табл., 9 ил.
Description
Изобретение относится к новым бактериальным штаммам и их использованию в качестве средств или источника средств, противодействующих росту микроорганизмов, вызывающих гниль. Конкретно, настоящее изобретение представляет новые изоляты бактерий видов Pseudomonas fluorescens, Serratia liquefaciens, Serratia plimuthica, Bacillus subtilis, Bacillus pumilia, Bacillus polymyxa, которые особенно эффективны для подавления роста микроорганизмов, вызывающих заболевания плодов после сборки урожая, причиной которых являются грибы Botrytis cinerea и Alternaria brassicicola. Кроме того, представлены антибиотики, полученные из видов Bacillus.
Потери после сбора урожая во время хранения сельхозпродуктов растительного происхождения вызываются, между прочим, потерей воды, увяданием (старением) листьев, проростом и гниением, последнее, в частности, вызывается грибами и бактериальными возбудителями. Такие потери после сбора урожая могут быть значительно снижены путем хранения при низких температурах (например 1 - 20oC) и высокой относительной влажности (например, 95%) (Robinson et al., 1975). При этих условиях хранения B. cinerea является преобладающим видом грибов, обнаруживаемым на сохраняемой капусте, и главной причиной потерь (Geeson, 1978, Brown et al., 1975); причем он является условно-патогенным возбудителем для широкого ряда листовых овощей, поражающим ослабленные, пораненные или состарившиеся листовые ткани, и также известно, что он поражает различные фрукты (смотрите патент США 5041384). Здоровые листовые ткани, однако, как описано, высокорезистентны к поражению Botrytis (New-hook, 1951). Исходная устойчивость подвергаемых воздействию наружных листьев также, вероятно, является причиной того, что обнаружение гнили капусты, вызванной Botrytis, обычно начинается через 2 - 3 месяца хранения на холоде и часто ограничивается наружными подсохшими, состарившимися листьями капусты (Wale 1980).
Для предупреждения грибковой порчи обычной практикой во многих странах является опрыскивание капусты на поле системными фунгицидами и погружение собранных кочанов капусты в растворы фунгицидов перед хранением (Brown et al. , 1975). Так как все больше и больше раскрываются онкогенные свойства многих из наиболее часто используемых фунгицидов и из-за того, что устойчивость большинства фунгицидов повышается при хранении при низких температурах, использование фунгицидов приобретает возрастающее значение. К тому же было сообщено об устойчивости к фунгицидам (Spotts & Cervantes 1986), и подавление главного вызывающего порчу микроорганизма B. cinerea фунгицидами, такими как беномил, как было показано, приводит в результате к повышенному обсеменению (размножению) A. brassicicola, который вызывает более глубокую гниль кочанов капусты, чем B.cinerea (Wale & Epton).
Борьба с грибковыми возбудителями после сбора урожая с помощью бактерий и дрожжей-антагонистов, таких как Bacillus subtilis, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas syringae, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae and Debaryomyces hansenii была описана для ряда сохраняемых овощей и фруктов, включая яблоки, абрикосы, вишни, цитрусовые, виноград, нектарины, персики, груши, перец, хурму, сливы, картофель и помидоры (смотрите Wilson & Wisniewski, 1989, по недавнему обзору).
Патент США 4,764,271 (кл. A 01 N 63/00, 1988) описывает отдельный штамм Bacillus subtilis, который, как было обнаружено, может использоваться для ингибирования роста коричневой плесени на фруктах. Свободный от клеток фильтрат, полученный из культуральной ростовой среды, проявил антибиотическую активность.
Аналогичный штамм Bacillus subtilis известен также из документа SU 1,706,504 (кл. A 01 N 63/00, 1992).
Однако в большинстве исследований изучалось антагонистическое действие только при температурах около 20oC, а не при температурах между 1 и 10oC, которые используются при коммерческом хранении большинства фруктов и овощей. К тому же в очень немногих публикаций указывается, что были испытаны персистенция антагонистов на растительных поверхностях или сравниваемых микробных популяций на сохраняемых органах растений с антагонистической микрофлорой.
Настоящее изобретение представляет новые бактериальные изоляты видов, которые обладают свойствами подавления роста видов грибов на продуктах после сбора урожая; этими видами являются виды Pseudomonas, Serratia и Bacillus. Наибольшее преимущество в том, что изоляты Pseudomonas и Serratia данного изобретения обладают свойством возможности подавления роста грибков при температурах сохранения на холоде, например, ниже 10oC, обычно от 0 до 4oC. Кроме того, изоляты Bacillus обладают свойством выделения антибиотически активной фракции, также представленной в изобретении, которую саму по себе можно выделить в чистом или полуочищенном виде и использовать для подавления роста таких видов грибов.
Нужно осознать, что изоляты данного изобретения были выбраны из исходной популяции из многих тысяч подобных штаммов, которые неэффективны. Однако из представляемого доступа к помещенным на хранение штаммам, упомянутым выше, и данных и протоколов, относящихся к этому, представленных ниже, опытным специалистам будет понятно, что возможно будет выделить дополнительные родственные штаммы со сходными антагонистическими свойствами, и поэтому объем данного изобретения охватывает также родственные штаммы, насколько в таком случае может быть выяснено путем сравнивания с представленными штаммами и данными и протоколами, представленными здесь.
Образцы новых бактериальных штаммов данного изобретения были помещены на хранение по Будапештскому договору о международном признании помещения на хранение микроорганизмов в целях патентных процедур в Национальную коллекцию промышленных и морских бактерий (UK National Collection of Industrial and Marine Bacteria) 23 St Machar Drive, Aberden, AB2, IRY, UK, под номерами поступлений, приведенными в конце описания.
Настоящее изобретение представляет выделенные бактерии, имеющие идентифицирующие характеристики изолятов, выбираемых из группы, состоящей из NCIMB 40489, NCIMB 40490, NCIMB 40491, NCIMB 40492, NCIMB 40493, NCIMB 40494, NCIMB 40495 и NCIMB 40497. Такие изоляты обладают общими характеристиками подавления роста грибов видов A. brassicicola и/или B.cinerea на тканях капусты: на агаре: в водных смесях.
Особенно предпочтительный аспект данного изобретения представляет бактериальный изолят, имеющий идентифицирующие характеристики штамма, выбираемого из группы, состоящей из NCIMB 40490, NCIMB 40492, NCIMB 40493, NCIMB 40495 и NCIMB 40497, причем указанный изолят способен подавлять рост A. brassicicola и/или B. cinerea на листьях капусты при температуре от 20oC или менее, более предпочтительно при 10oC или менее, наиболее предпочтительно при 4oC или менее. Более предпочтительно, чтобы изолят относился к видам, выбираемым из группы, состоящей из Pseudomonas fluorescens, Serratia plymuthica, Serratia liquefaciens.
Другой предпочтительный аспект данного изобретения представляет бактериальный изолят, имеющий идентифицирующие характеристики штамма, выбираемого из группы, состоящей из NCIMB 40489 и NCIMB 40491, причем указанный штамм способен подавлять рост A. brassicicola и/или B.cinerea на листьях капусты при температурах около 20oC. Более предпочтительно, что изолят способен к продукции антибиотической фракции при культивировании в бульоне из гомогенизированных листьев капусты с концентрацией 50 г или более на литр воды, причем указанный антибиотик способен подавлять рост указанных A. brassicicola и/или B.cinerea на листьях капусты при температурах около 20oC.
Дополнительный аспект этого изобретения представляет водные суспензии бактерий из одного или более бактериальных штаммов этого изобретения, причем предпочтительные суспензии содержат достаточное количество кое/мл для подавления роста грибов, имеющих отношение к вышеперечисленным фруктам и/или овощам, которые погружались в нее, и, кроме того, биологически чистые культуры таких бактерий при высоком числе кое/мл для приготовления суспензий для такого погружения.
Данное изобретение тем самым дополнительно представляет способ предупреждения грибковых заболеваний после сбора урожая овощей и/или фруктов, включающий погружение указанных продуктов в суспензию бактерий, которые описаны выше. Предпочтительно суспензия будет содержать от 104 и до 109, более предпочтительно между 105 и 108 кое/мл. При использовании группы не-Bacillus предпочтительным выбором является хранение на холоде.
Еще один дополнительный аспект этого изобретения представляет антибиотики, получаемые путем культивирования выделенных бактерий типа NCIMB 40489 и/или NCIMB 40491 в среде, содержащей гомогенизированные капустные листья и воду в соотношении 5 г до 100 г/литр. Кроме того, представлены композиции, отличающиеся тем, что они включают такие антибиотики в качестве активных ингредиентов.
Теперь будут приведены примеры штаммов, их эффективность против роста грибов, способы отбора подобных таким изолятов и способы их использования при применении этого способа в производственном масштабе только для иллюстрации путем обращения к следующим чертежам и примерам.
Фигура 1. Диаметр зоны подавления (мм) вокруг колоний бактерий на капустном агаре, содержащем различные концентрации тканей капусты, засеянном A.brassicicola и B.cinerea. ■ = CL42; 
= CL66; 
= CL82.
Фигура 2. Средний диаметр зоны подавления (мм) (вертикальные линии = стандартное отклонение) вокруг колоний бактерий на капустном агаре, содержащем различные концентрации тканей капусты, засеянном A.brassicicola и B.cinerea (среднее из 3 определений на изолят). ■ = Serratia plymuthica (CL43); 
= Serratia liquefaciens, CL57; изоляты 58, 59, 61, 62 и 80 продемонстрировали сходные результаты.
Фигура 3. Рост штамма CL27 Bacillus subtilis, образование спор и проявление антагонистической активности против A.brassicicola и B.cinerea в капустном бульоне (A: CB5, B: CB10) в серийной культуре. противогрибковая активность определялась на чашках Sens-acute, содержащих засеянную грибком CA5. 
= кое; 
= споры; ■ = активность против B.cinerea; 
= активность против A.brassicicola.
Фигура 4. Рост штамма CL45 Bacillus pumilus, образование спор и проявление антагонистической активности против A.brassicicola и B.cinerea в серийной культуре в капустном бульоне (A: CB5, B:CB10). Противогрибковая активность определялась на чашках Sens-acute, содержащих засеянную грибком CA5. 
= кое, 
= споры; ■ = активность против B.cinerea; 
= активность против A.brassicicola.
Фигура 5. Рост штамма Bacillus subtilis CL27, образование спор и проявление антагонистической активности против A.brassicicola и B.cinerea в серийной культуре в питательном бульоне (A: NB, B:NB + Mg, C:NB + 1% глюкозы). Противогрибковая активность определялась на чашках Sens-acute, содержащих засеянную грибком CA5. 
= кое; 
= споры; ■ = активность против B.cinerea; 
= активность против A.brassicicola.
Фигура 6. Рост штамма Bacillus pumilis CL45, образование спор и проявление активности против A. brassicicola и B.cinerea в серийной культуре в питательном бульоне (A:NB, B:NB + Mg). Противогрибковая активность определялась на чашках Sens-acute, содержащих засеянную грибком CA5. 
= кое; 
= споры; ■ = активность против B.cinerea; 
= Активность против A.brassicicola.
Фигура 7. Рост штамма CL27 Bacillus subtilis, образование спор и проявление активности против A.brassicicola и B.cinerea в серийной культуре в синтетической солевой среде (A:DM, B:DM + 1% глюкозы). Противогрибковую активность определяли на чашках Sens-acute, содержащих засеянную грибком CA5. 
= кое; 
= споры; ■ = активность против B.cinerea; 
= Активность против A.brassicicola.
Фигура 8. Воздействие pH среды на активность антибиотиков, из штаммов Bacillus, CL27 и CL45, культивированных серийно и экстрагированных через 2 дня (A и C) или 4 дня (B и D) после посева. В A, B и D подавление возбудителя определяли на чашках Sens-acute для микроопределения, содержащих среду CA5, засеянную B. cinerea, в C - на PDA. Среда для серийной культуры: 
= CB10; 
= CB5; ■ = NB; 
= NB + M.
Фигура 9. Воздействие типа питательной среды и концентрации в исследуемой среде (бульон с тканями капусты или картофельной декстрозой, уплотненный 10 г/л агара) на размер образуемых зон подавления. Среду засевали спорами B.cinerea. Использованный неочищенный экстракт собирали через 3 дня от серийных культур штамма CL27 B.subtilis в CB5. Различные концентрации антибиотиков получали путем разбавления неочищенного экстракта (канц. 100%) стерильной CB5. Использованные исследуемые среды: 
= 50 мг/мл; 
= 100 мг/мл; 
= 200 мг/мл гомогенизированной ткани капусты; 
= 1/4 концентрации PDB; 
= 1/2 концентрации PDB; ■ = полная концентрация PDB (картофельный декстрозный бульон).
Пример 1. Выделение антагонистических штаммов из тканей капустного листа.
Квадрат 10х10 см асептичсеки вырезался из самого наружного листа качана капусты и помещался в пластиковый мешочек с 25 мл стерильного раствора Рингера. Затем ткань помещали в stomacher на 10 минут для удаления поверхностных микроорганизмов. Соответствующие разведения засевали на чашки с питательным агаром, капустным агаром (гомогенизированная ткань капустного листа или 10 г (CA1), 20 г (CA2), 50 г (CA5) или 100 г (CA10) и 10 г агара на литр воды), с капустным агаром, засеянным спорами Botrytis (как описано ниже), агаром Сабуро (Oxoid) и картофельным декстрозным агаром (Oxoid). Антагонисты обнаруживали с помощью зон подавления, образованных или когда листовые смывы непосредственно высевали на чашках с агаром, засеянным Botrytis, или после репликации колоний на чашки с агаром, засеянным Botrytis.
Идентификация основной микрофлоры на капустных листьях.
Число колоний нитчатых грибов подсчитывали непосредственно на чашках для выделения. Чтобы установить число дрожжей, флюоресцирующих псевдомонад и Enterobacteriaceae, с чашек для выделения по случайной выборке снимали 140 колоний и идентифицировали. Для идентификации дрожжей и излучения подвижности бактерий использовали фазово-контрастную микроскопию. Так как все обнаруженные бактерии были грамотрицательными, изоляты, демонстрирующие подвижность и флюоресценцию на среде Кинга, B, классифицировали как флюоресцирующие псевдомонады, а те, которые росли в анаэробных условиях (High and Leifson, 1953), как Enterobacteriaceae. Другие бактериальные изоляты не были идентифицированы.
Число спор Bacillus устанавливали по числу колоний, образовавшихся после 20-кратного концентрирования промывных вод листа путем центрифугирования при 3600 об/мин и прогревания (80oC в течение 20 мин).
Идентификация бактерий-антагонистов.
Для первоначальной идентификации использовали окрашивание по Граму (модификация Jensen), форму, подвижность (при фазово-контрастной микроскопии), тест на оксидазу (Kovacs, 1956), прогревание (20 мин при 80oC) и тест окисления/ферментации (Hugh and Leifson, 1953). Оксидаза-отрицательные, образующие кислоту грамотрицательные палочки (Enterobacteriaceae) далее испытывали с помощью API 20E, оксидаза-положительные, не образующие кислоту грамотрицательные палочки - с помощью API 20NE, а устойчивые к прогреванию грамполжительные палочки (Bacillus spp.) - с помощью AP1 20E и 50CHB тест-полосок (API-BioMerieux, UK). Результаты анализировали с помощью компьютерной программы идентификации AP1, а идентификация Serratia liguefaciens (Grimes and Hennerty) подтверждалась путем испытания на образование кислоты из раффинозы, маннолята, лактозы и адонита при использовании методов, описанных Brenner (1984).
Приготовление посевного материала грибков.
Все исходные культуры грибков выращивали на капустном агаре 5 (CA5; 50 г гомогенизированной ткани капусты, 10 г агара, 1 литр дистиллированной воды) при 4oC в темноте. Для образования спор использовали агар на солодовом экстракте (MA). Botrytis cinerea выращивали в течение 5 дней при 20oC в темноте с последующим облучением УФ, чтобы вызвать серообразование, и Alternaria brassicicola выращивали в течение 14 дней при 20oC перед использованием в экспериментах. Споры собирали путем заливки 10 мл стерильного раствора Рингера на чашку с выращенным грибком и суспендирования спор с помощью бактериологичекой петли. Суспензии спор фильтровали через двойной слой муслина и доводили до концентрации 4•106 спор/мл, используя гемацитометр.
Приготовление посевного материала бактерий.
Посевной материал готовили путем суспендирования бактериального подроста из 24-часовой культуры на NA в растворе Рингера 1/4 концентрации. Мутность суспензии затем доводили до абсорбции, равной 1,0 при 625 нм при использовании спектрофотометра ULTRO SPEC 4051 (LKB BIOCHROM Ltd., Cambridge, UK), дающей бактериальную концентрацию, равную 7 • 108 кое/мл для Pseudomonas fluorescens и 5 • 108 кое/мл для изолятов Serratia (число кое получали путем высева на чашки с NA серийных разведений суспензии). Более низкие уровни посевной дозы готовили путем соответствующего разведения в растворе Рингера 1/4 концентрации.
Исследование "in vitro" на противогрибковую активность
20 мл жидкой CA5 охлаждали до 40oC (споры Botrytis cinerea очень чувствительны к нагреванию) и засевали 0,2 мл суспензии грибков, содержащей 4 • 105 спор/мл. После того, как агар застывал, чашки высушивали в шкафу с ламинарным потоком в течение 90 мин, затем на них засевали сразу же петлю бактериальной суспензии, содержащей 2 • 108 кое/мл. При испытании антибиотической активности в неочищенных экстрактах (бесклеточные фильтраты культур) из серийных культур Bacillus spp. засеянную грибком среду наливали в платы для микроопределения Sens-acute (острой чувствительности) (Международная патентная заявка N PCT/GB 90/01067; Proteus Molecular Design Ltd., Marple, Cheshire, UK). После того, как агар застывал, в агаре вырезали 4 мм лунки и заполняли 30 мкл неочищенного экстракта. Диаметры зон подавления вокруг колоний или ячеек измеряли через 2 дня после посева бактерий или заполнения лунок бесклеточными экстрактами Botrytis и через 4 дня после внесения засеянной Alternaria среды.
20 мл жидкой CA5 охлаждали до 40oC (споры Botrytis cinerea очень чувствительны к нагреванию) и засевали 0,2 мл суспензии грибков, содержащей 4 • 105 спор/мл. После того, как агар застывал, чашки высушивали в шкафу с ламинарным потоком в течение 90 мин, затем на них засевали сразу же петлю бактериальной суспензии, содержащей 2 • 108 кое/мл. При испытании антибиотической активности в неочищенных экстрактах (бесклеточные фильтраты культур) из серийных культур Bacillus spp. засеянную грибком среду наливали в платы для микроопределения Sens-acute (острой чувствительности) (Международная патентная заявка N PCT/GB 90/01067; Proteus Molecular Design Ltd., Marple, Cheshire, UK). После того, как агар застывал, в агаре вырезали 4 мм лунки и заполняли 30 мкл неочищенного экстракта. Диаметры зон подавления вокруг колоний или ячеек измеряли через 2 дня после посева бактерий или заполнения лунок бесклеточными экстрактами Botrytis и через 4 дня после внесения засеянной Alternaria среды.
Исследования "in vivo" (листовые диски) на противогрибковую активность.
Листовые диски (15 мм диаметром) вырезали из внутренних листьев капусты (5 наружных листьев отбрасывали), используя пробочное сверло. Диски переносили в 25 мл универсальные флаконы и нагревали в течение 20 минут при 50oC. Эта обработка, как было обнаружено, необходима, чтобы разрушить природную устойчивость несостарившихся тканей внутренних листьев капусты, чтобы сделать возможной инфекцию, вызванную спорами B. cinerea и A.brassicicola. Диски оставляли для остывания и затем взбалтывали в бактериальной суспензии, содержащей 7•108, 7•107 или 7•106 кое/мл для P.fluorescens изолятов и 5•108, 5•107 или 5•106 кое/мл для штаммов Serratia. Это давало в результате примерно 107, 106 или 105 кое/диск при определении числа кое на листовых дисках сразу после заражения. Это определение выполнялось путем отмывания (10 мин при 6-й скорости с использованием качалки с цапфами Gallencamp) дисков в 2 мл стерильного раствора Рингера 1/4 концентрации для удаления бактерий с растительных поверхностей и посева соответствующих разведений на чашки с питательным агаром.
После заражения бактериями диски переносили на плату для исследования культур тканей (8,5•13 см) с 24 ячейками диаметром 15 мм. Под засеянный прогретый диск помещали непрогретый диск, чтобы имитировать ситуацию в сохраняемом кочане капусты, где чувствительные состарившиеся наружные листья покрывают устойчивые метаболически активные внутренние листья. Исследуемые чашки затем помещали открытыми в камеру с ламинарным потоком до тех пор, пока поверхности дисков не высыхали. Затем в цент помещали 2,5 мкл грибковой суспензии, содержащей 103, 104 или 105 спор. Исследуемые чашки помещали над водой в семенной поднос (15х20 см), и поднос запечатывали пластиковой пленкой. Влажность в подносах измеряли, используя пробу на влажность Vaisala 100 (Vaisala OY, PL 26, Хельсинки, Финляндия), и было обнаружено, что она составляла от 97 до 99% на протяжении всего эксперимента. Подносы инкубировали при 40oC в темноте в течение 10 недель.
Персистенция вновь засеянных антагонистов на листовых поверхностях.
Чтобы определить персистенцию вновь засеянных антагонистических бактерий на листовых поверхностях, непрогретые листовые диски (диаметром 1,5 см) погружали в бактериальную суспензию и инкубировали в чашках для исследования, которые описаны выше. Перед удалением микроорганизмов с поверхности из диска вырезали квадрат 1х1 см, чтобы избежать попадания в образец бактерий с обрезных краев диска. Квадрат помещали в 2 мл раствор Рингера и взбалтывали в течение 10 минут, используя качалку Gallencamp с цапфами при скорости 6, чтобы удалить качалку м поверхности. Число антагонистических бактерий в смыве листа определяли по их антагонизму in vitro против A.brassicicola путем посева смывов с листьев на чашки с CA5, засеянным A.brassicicola и подсчета колоний с зонами подавления роста.
Основная и антагонистическая микрофлора, обнаруженная на Brassica spp.
При определении числа жизнеспособных микроорганизмов на поверхности капустного листа было обнаружено, что листья несут примерно 103 - 104 кое/см2 (таблица 1). Из них примерно от 1 до 15% дрожжей, 65 - 80% составили флюоресцирующие псевдомонады, 5-20% Enterobacteriaceae. Менее 1% поверхностных микроорганизмов были нитчатыми грибами и Bacillus spp., которые могли быть выделены только с помощью метода селективного обогащения, описанного выше. Число жизнеспособных спор Bacillus находилось между 1 и 20 кое/20 см2. Число поверхностных микроорганизмов было ниже на внутренних листьях капусты, и таблица 1 показывает числа, обнаруженные на 6-ом листе.
61% антагонистических бактериальных штаммов, выделенных с Brassica spp., были оксидаза-положительными флюоресцирующими псевдомонадами, 30% были Bacillus и 9% были видами Serratia. Разные группы описаны в отдельных разделах ниже.
Пример 2. Pseudomonas fluorescens: основные свойства.
Флюоресцентные псевдомонады, по-видимому, являются основной частью природной микрофлоры листьев капусты, так как они повторно выделялись в большом количестве. Все выделенные флюоресцентные псевдомонады принадлежали к видам Pseudomonas fluorescens. Все штаммы выделены с выращенной общепринятым образом и органически капусты сортов "датская белая" или "январская слава", брокколи или розеток брюссельской капусты при использовании ряда различных сред для выделения (таблица 2). Присутствовали две основных группы антагонистических псевдомонад, причем это псевдомонады, продуцирующие флюоресцирующие пигменты на питательном агаре (группа 1: CL 6, 7, 9, 10, 11, 12, 15, 16, 18, 21, 29, 39, 40) и псевдомонады, которые не продуцируют эти пигменты (группа 2: CL 42, 66, 74, 82, 13, 14, 17, 22, 23, 30, 31-37, 39).
Подавление in vitro.
Первая группа псевдомонад давала небольшие зоны подавления (< 4 мм) на агаре CA5, засеянном B.cinerea и A.brassicicola, тогда как группа 2 включала: а) штаммы CL 31 - CL 37 и CL 49, которые вызывали гниение капустных листьев (не испытуемые далее на антагонизм in vitro) и б) все штаммы CL 42, 49, 66, 74, 82, 90), которые давали большие зоны подавления (таблица 2). Зоны подавления, образованные различными штаммами псевдомонад из группы 1 при разных температурах и концентрациях питательных веществ в среде были в основном небольшими, (1-4 мм, отдельные результаты не показаны). Однако при сравнении зон подавления штаммов из группы 2 были обнаружены штаммоспецифические примеры (таблица 2). Размер зон подавления на капустном агаре уменьшался при повышении концентрации питательных веществ в среде (от 5 до 100 г/л капустной ткани) для помещенных на хранение штаммов CL 42 и CL 82. Однако штамм CL 66 продемонстрировал увеличение зоны подавления при снижении концентрации питательных веществ на капустном агаре, засеянном Alternaria, но уменьшение зон подавления на капустном агаре, засеянном Botrytis. Важно, что зоны подавления при 4oC были больше при всех концентрациях питательных веществ с обоими грибами вокруг колоний CL 82, а вокруг колоний CL 42 на агаре, засеянном Alternaria, чем при 10oC.
Подавление in vitro.
Pseudomonas - антагонисты также подавляли инфицирование и развитие заболевания из ткани капусты при использовании для определения антагонизма in vivo испытания с дисками из капустных листьев. Штаммы P.fluorescens CL 42, CL 66 и CL 82 продемонстрировали самое лучшее сдерживание роста обоих грибов на дисках из капустных листьев - предупреждение развития симптомов заболевания на дисках, если они погружались в суспензию 7•106 кое/мл; CL 73 давал только среднее сдерживание.
Конец эксперимента (6 недель после того, как на контрольных дисках появлялся рост гриба).
Пример 3. Serratia spp.
Основные характеристики. 9% антагонистических бактериальных штаммов, выделенных Brassica spp. были Serratia spp. (Enterobacteriaceae), причем восемь штаммов были Serratia liquefaciens и один штамм был Serratia plymuthica. Все штаммы были выделены с естественно и общепринятым способом выращенной капусты "датская белая" или "январская слава" ("Dutch White, January Glory") с использованием ряда различных сред для выделения (таблица 4). Зоны подавления на засеянной Botrytis CA5 были больше при 20oC и 10oC, но меньше при 4oC, чем на засеянной Alternaria CA5. Нужно отметить, что Botrytis росли быстрее при всех температурах (развитие видимого роста на среде), чем Alternaria. Зоны подавления штаммов S. liquefaciens CL 57, 58, 59, 61, 62, 73 и 80, как было обнаружено, имели сходный размер, но меньший, чем у зон S. plymuthica, штамм CL 43.
Смотрите условные обозначения к таблице 2.
Размер зон подавления всех штаммов S.Liquefaciens, как было обнаружено, сходен при всех концентрациях питательных веществ в среде (от 5 до 100 г/л ткани капусты) за исключением того, что зоны подавления, образовавшиеся вокруг колоний CL 43 при 10oC с 10 г/л ткани капусты в среде, имеют больший размер (фигура 2). Зоны подавления штамма S. plymuthica CL 43, однако, были в основном больше и CL 43 был единственным штаммом, проявляющим значительный антагонизм при низких концентрациях питательных веществ (5 и 10 г/л, фигура 2).
Смотрите условные обозначения к таблице 3.
Эксперимент заканчивается через 6 недель после того, как на контрольных дисках появился рост гриба.
Подавление in vivo.
Serratia - антагонисты также подавляли инфицирование и развитие заболевания на ткани капусты, когда для обнаружения антагонизма in vivo использовали испытание с дисками из капустных листьев. Когда капустные диски погружались в бактериальную суспензию с 2•109 (результаты не представлены), 2•108, 2•107 или 2•106 кое, повреждение ткани и развитие видимого роста Botrytis cinerea подавлялось с различной степенью в зависимости от использованного вида бактерий и примененной посевной дозы грибка (таблица 5).
Персистенция Pseudomonas и Serratia на капустных листьях
При изучении персистенции вновь засеянных антагонистов P.fluorescens и Serratia spp. были способны персистировать в большом количестве на поверхности капустных листьев при низких температурах (таблица 6).
При изучении персистенции вновь засеянных антагонистов P.fluorescens и Serratia spp. были способны персистировать в большом количестве на поверхности капустных листьев при низких температурах (таблица 6).
Пример 4. Основные характеристики Bacillus spp.
30% всех бактерий, проявляющих антагонизм против Botrytis cinerea, как было обнаружено, принадлежат в Bacillus spp.
Идентифицировали 40 штаммов Bacillus и обнаружено, что они являлись B. subtilis (8 изолятов), B.pumilus (3 изолята) или B.polymyxa (3 изолята).
Продукция антибиотика in vitro (полуколичественная оценка)
Изоляты Bacillus, выделенные с Brassica spp., не росли при 4oC и 10oC (за исключением штаммов Bacillus CL 47, 52, 64 и 67, которые давали очень слабый рост через 4 недели, на 10 и 6 неделю при 4oC. При 20oC большинство штаммов продуцировали большие зоны подавления на среде CA5 (таблица 7). Однако Bacillus не росли или не давали больших зон подавления при более низких концентрациях питательных веществ в среде (таблица 7).
Изоляты Bacillus, выделенные с Brassica spp., не росли при 4oC и 10oC (за исключением штаммов Bacillus CL 47, 52, 64 и 67, которые давали очень слабый рост через 4 недели, на 10 и 6 неделю при 4oC. При 20oC большинство штаммов продуцировали большие зоны подавления на среде CA5 (таблица 7). Однако Bacillus не росли или не давали больших зон подавления при более низких концентрациях питательных веществ в среде (таблица 7).
Пример 5. Продукция антибиотика в серийной культуре Bacillus spp.
В качестве сред роста использовали капустный бульон (50 г (CB 5) или 100 г (CB10) гомогенизированных капустных листьев, 1 литр дистиллированной воды), питательной бульон (NB; Oxoid), питательный бульон + 0,005 г/л MgSO4(NB+Mg), питательный бульон + 1% глюкозы (NB + 1% глюкозы), синтетическую среду (DM: 2 г NH4Cl, 6 г Na2HPO4, 3 г KH2PO4, 3 г NaCl, 0,05 г MgSO4•7H2O, 5 мг L-метионина, 10 мг глицина, 2,5 мг L-аспарагиновой кислоты, 10 г агара, 1 литр дистиллированной воды) и DM + 1% глюкозы. 100 мл среды переносили в 250 мл конические колбы Эрленмейера и автоклавировали и засевали 3-дневной культурой штаммов Bacillus на питательном агаре. Аминокислоты стерилизовали фильтрованием и добавляли в среду после автоклавирования. Через разные отрезки времени после посева из сред отбирали образцы по 4 мл асептически. Число кое определяли путем посева разведений (раствором Рингера 1/4 концентрации) образцов среды на питательный агар в чашках Петри. Число спор Bacillus определяли путем смешивания 0,1 мл абсолютного спирта с 0,1 мл культуральной среды в ячейках микроячеечных плат (0,3 мл ячейки, Nunc Ltd., UK) в течение 20 минут (чтобы убить вегетативные клетки) перед посевом разведений на чашки с питательным агаром.
Неочищенные экстракты антибиотиков из различных сред получали путем центрифугирования жидкости в течение 30 мин при 3000 с использованием центрифуги Mistral 3000 (Fisons, UK). Супернатант фильтровали через 0,2 мкм нитроцеллюлозный фильтр (Sartorius, Gottingen, Германия) для получения бесклеточных фильтров. Для получения низких концентраций антибиотиков эти неочищенные экстракты затем разводили капустным бульоном. 30 мкл различных разведений неочищенного экстракта помещали в лунки диаметром 4 мм в чашках с CA5, засеянной B.cinerea или A.brassicicola. При определении действия pH на активность антибиотиков в неочищенных экстрактах pH исследуемой среды доводили до значений от 3 до 9 с помощью HCl и NaOH перед помещением неочищенных экстрактов в лунки.
Продукция антибиотиков in vitro (количественное определение).
Зоны подавления образовывались также вокруг бесконечных фильтратов культуры Bacillus spp., выращенных в течение 5 дней в капустном бульоне (CB5) или питательном бульоне (NB) в качестве среды роста (таблица 8). Бесклеточные фильтраты серийных культур штаммов CL27 и CL 41 Bacillus с капустного агара обладали очень высокой активностью против Botrytis cinerea и более низкой активностью против Alternaria brassicicola (таблица 8). Фильтраты питательного бульона обладали активностью только против A.brassicicola, если для выполнения B. cinerea исследований использовали чашки Петри, но демонстрировали сходную активность против B.cinerea и A.brassicicola, если исследование выполняли на более чувствительных чашках для микроопределения Sens-acute: смотрите Hampson et al.
Hampson et al., 1992 г. дает детальное описание различий между чашками Sens-acute для микроопредления и чашками Петри. Фильтраты питательного бульона и капустного бульона (CB5) от штамма CL 45 были активны только против B.cinerea (таблица 8).
Пример 6. Воздействие среды культивирования.
Изучалась продукция антибиотиков в серийной культуре после различных периодов инкубации и на различных жидких средах (NB, NB + M, NB + 1% глюкозы, CA5, CA10, DM и DM + 1% глюкозы). Фильтраты культур CL 27 и CL 45 снова проявили очень сильную активность (зоны подавления около 40 мм) против B.cinerea при выращивании в капустном бульоне (фиг. 3 и 4), но проявили значительно более низкую активность (зоны подавления 15 мм) при выращивании в питательном бульоне (фиг. 5 и 6) или синтетической среде (фиг. 7). В капустном бульоне (CA5 и CA10) как CL 27, так и CL 45 проявили - Botrytis активность через 2 дня, примерно за 24 часа до того, как могли быть обнаружены первые вновь образованные споры Bacillus. На NB и DM антибиотическая активность также развивалась через 2 дня, но увеличение числа спор можно было обнаружить только через 9 дней. Добавление 1% глюкозы подавляло спорообразование у Bacillus, но не проявление антигрибковой активности в NB и DM (фиг. 5 и 7).
Как и перед эти штамм CL 27, но не CL 45 проявлял активность против Alternaria brassicicola. Активность была самой высокой у бесколеточных фильтратов культуры из NB+Mg и серийных культур в CB10 (зоны подавления 20 мм) и сходной во всех других средах (зоны подавления между 15 и 10 мм) (фиг. 3 - 7). Подобно активности против Botrytis, активность против Alternaria предшествовала спорообразованию на 24 часа в CA5 и CA10 и на 7 дней в NB и DM, тогда как добавление 1% глюкозы не останавливало развития противогрибковой активности (фиг. 3 - 6).
Пример 7. Действие pH и питательных веществ на антибиологическую активность.
На активность противогрибковых антибиотиков, образовавшихся в жидкой серийной культуре Bacillus subtilis (определяемую по диметру зоны подавления на среде CA5, засеянной грибом) влияли pH (фиг. 8) и концентрация и тип питательных веществ в исследуемой среде (фиг. 9).
Воздействие pH: антибиотики, продуцируемые в капустном бульоне (CB5 и CB10) через 2 и 4 дня и CL 45 в NB + Mg через 2 дня, проявляли наивысшую активность (формировали наибольшие зоны подавления) против Botrytis при pH между 5,6 и 6,0. Активность слегка сжималась, если pH понижался до 3,1 и снижалась до очень низких значений, если pH повышался до значений выше 6,0 (фиг. 8). Антибиотики, продуцируемые CL 27 на NB + Mg имели сходную активность при pH между 5,6 и 8,9, но сниженную активность, когда pH был ниже 5,6. В NB активность можно было обнаружить, если pH был выше 6,0, и она слегка повышалась при повышении pH. Когда активность антибиотиков испытывали на засеянном Botrytis картофельном агаре, экстракты из питательного бульона и CB5 не проявляли активности, экстракты из CA10 показали низкую активность при значениях pH ниже 6, но сходную активность при более высоком pH, и экстракты из питательного бульона с марганцем проявили повышенную активность по сравнению с тем, когда использовался засеянный Botrytis капустный агар (фиг. 8C).
Уровни питательных веществ: при повышенных концентрациях питательных веществ, в виде капустной ткани или картофельного экстракта и декстрозы, в испытуемой среде активность антибиотиков также снижалась (фиг. 9). На картофельно-декстрозном агаре образовывались или только очень небольшие зоны или они отсутствовали (фиг. 9).
Стабильность антибиотиков при низких температурах.
Образовавшиеся антибиотики, как было обнаружено, очень устойчивы при 4oC, так как невозможно было определить снижение активности в неочищенных бесклеточных фильтрах культур штаммов CL 27, CL 41 и CL 45, сохраняемых стерильными в течение 4 месяцев. Фильтраты анализировали через месячные интервалы во время хранения при 4oC.
Пример 8. Выделение и определение свойств антибиотиков, продуцируемых Bacillus subtilis, штаммом CL 27 и Bacillus pumilis, штаммом CL 45.
Бактерии выращивали в течение 7 дней в серийной культуре или в капустном бульоне (10 г гомогенизированной ткани капустных листьев) или питательном бульоне (+0,005 г Mn на литр). Бесклеточные экстракты культур готовили, как описано выше. 0,04 мл бесклеточного фильтрата культуры помещали на силикагелевые 60 ТСХ пластинки (Art. 5271, Merck) и разделяли, используя систему растворителей, описанную Swinburne et al. (Trans. Br. Mycol. Soc, 65 (2), 211-217), то есть бутан-1-ол:уксусная кислота:H2O, 3:1:1. Пластинки высушивали в камере с ламинарным потоком и затем в сушильном шкафу в течение 5 часов при 70oC, чтобы удалить растворитель и остаток уксусной кислоты.
Суспензии грибов готовили или в питательном бульоне или в капустном бульоне (5 г/л гомогенизированных капустных листьев). Высушенные пластинки ТСХ опрыскивали суспензией спор или B.cinerea или A.brassicicola и инкубировали в течение 3 дней или 4 дней (в зависимости от эксперимента) при 20oC в темноте, чтобы дать возможность роста грибов на пластинках. Зоны подавления роста визуализировали по методам Lund and Lyon (J. Chromatography 100, 192-196 (1975)) и использовали для расчета значений Rf для продуцируемых антибиотиков.
Антибиотики - Значения
Антибиотик против Botrytis, продуцируемый CL 27a на капустном бульоне: Предполагаемый не-пептид (отрицательный TDM): активность при pH < 5,6 - 0,39
Антибиотик против Botrytis/Alternaria, продуцируемый CL 27b на капустном бульоне: Предлагаемый пептид (положительный TDM): активность при PH > 5,6 - 0,56
Антибиотик против Alternaria, продуцируемый CL 27c в питательном бульоне: Предположительно пептидной природы (положительный TDM): активность при pH > 5,6 - 0,61
Антибиотик против Botrytis, продуцируемый CL 45a в капустном бульоне. Предлагаемый не-пептид (отрицательный TDM): активность при pH < 5,6 - 0,39
TDM = 4,4'-тетраметилдиаминодифенилметановый реагент: положительный = синий/зеленый. Антибиотики CL 27 образуются в капустном бульоне (CB5), питательном бульоне и питательном бульоне с марганцем: антибиотики CL 45 - только на капустном бульоне (CB5).
Антибиотик против Botrytis, продуцируемый CL 27a на капустном бульоне: Предполагаемый не-пептид (отрицательный TDM): активность при pH < 5,6 - 0,39
Антибиотик против Botrytis/Alternaria, продуцируемый CL 27b на капустном бульоне: Предлагаемый пептид (положительный TDM): активность при PH > 5,6 - 0,56
Антибиотик против Alternaria, продуцируемый CL 27c в питательном бульоне: Предположительно пептидной природы (положительный TDM): активность при pH > 5,6 - 0,61
Антибиотик против Botrytis, продуцируемый CL 45a в капустном бульоне. Предлагаемый не-пептид (отрицательный TDM): активность при pH < 5,6 - 0,39
TDM = 4,4'-тетраметилдиаминодифенилметановый реагент: положительный = синий/зеленый. Антибиотики CL 27 образуются в капустном бульоне (CB5), питательном бульоне и питательном бульоне с марганцем: антибиотики CL 45 - только на капустном бульоне (CB5).
Спектр активности антибиотиков (испытание на пластинках, как описано выше).
Когда пластинки для ТСХ, на которые наносились бесклеточные фильтры культуры со среды CB5, засеянной или CL 27 или CL 45, покрывали засеянной Botrytis cinerea средой, развивались большие зоны подавления роста (30-40 мм) на Rf, равном от 0,38 до 0,40. При излучении фильтратов из среды CB5, засеянной штаммом CL 27, можно было обнаружить дополнительную небольшую полоску (3 мм) без роста гриба в положении со значением Rf, равным 0,56 (не присутствующую, если испытывалась CB5, засеянная CL 45). Когда при исследовании фильтратов из NB и NB+Mn, засеянных CL 45 производили покрытие таким же образом, можно было обнаружить только небольшую полоску подавления со значением Rf, равным 0,567 (не было зон подавления, когда излучались среды NB и NB+Mn, засеянные CL 45).
Когда покрытие выполнялось средой, засеянной Alternaria brassicicola, были обнаружены 2 зоны подавления (Rf 0,56 и 0,61) из посевов на среды роста NB, NB+Mn и CB5 CL 27. Таким образом видно, что CL 27 продуцирует, по крайней мере, три антибиотика, один, активный против B.cinerea (Rf 0,39), продуцируемый только на капустном экстракте и активный при pH, меньше 6; второй слабо активный против B.cinerea и активный против A. brassicicola (Rf 0,56), продуцируемый на всех испытуемых средах и активный при pH выше 5,6; и третий, активный только против A.brassicicola (Rf 0,61) тоже продуцируемый на всех испытуемых средах. Сходные значения для антибиотиков из CL 45 и CL 27 наводят на мысль, что они представляют собой одно и то же, но характер активности наводит на мысль о противоположном.
Пример 9. Характеристики антагонистических бактериальных штаммов этого изобретения.
Все бактериальные штаммы, выделенные с Brassica spp., демонстрирующие in vitro антагонизм против Botrytis cinerea, как было обнаружено, являются видами Pseudomonas fluorescens (группа I), Bacillus или Serratia. Флюоресцирующие псевдомонады и Enterobacteriaceae, как было обнаружено, являются основными обитателями капустных листьев, тогда как Bacillus spp. были обнаружены лишь в очень небольших количествах на листьях Brassica. Флюоресцирующие псевдомонады и Bacillus spp. были описаны ранее, как потенциальные средства биологической борьбы с заболеваниями фруктов и овощей после уборки урожая, тогда как подобная активность у Serratia plymuthica Serratia liquefaciens ранее не была показана (смотрите Wilson & Wisniewski, 1989 по недавнему обзору по биологической борьбе с грибковыми заболеваниями фруктов и овощей после уборки урожая).
Pseudomonas fluorescens.
Из всех испытанных бактериальных штаммов штаммы флюоресцирующих псевдомонад CL42, CL 66 и CL 82 продемонстрировали самую высокую активность in vivo на дисках из капустных листьев при 4oC, подавляя инфицирование Botrytis при всех испытанных размерах посевных доз гриба. Псевдомонады, такие, как P. сераcia, P. putida и P. syringae были описаны, как средства биологической борьбы с болезнями после сбора урожая для ряда сохраняемых фруктов и овощей, и описывается, что их способ действия состоит или в продукции антибиотика или в создании конкуренции за питательные вещества (Colyer and Mount 1984, James and Gutterson 1986, Gurusiddaiah et al. 1986, Janisiewicz 1987, Janisiewicz and Roitman 1988). Важно отметить, что P.syringae и P.cepacia могут быть патогенными для растений и что некоторые псевдомонады, включая P.Sceptical, были описаны, как условно-патогенные возбудители болезней у человека (Agrios 1988, Bergan 1981).
Некоторые антагонистические псевдомонады, выделенные данными изобретениями, как было также обнаружено, являются патогенными для некоторых овощей, например, капусты. Поэтому антагонистические псевдомонады должны идентифицироваться до уровня вида, чтобы исключить использование возможных человеческих возбудителей болезней, и должны испытываться на воздействие на растения перед использованием в качестве средств борьбы с болезнями после уборки урожая. Так как выделенные антагонистические штаммы были способны персистировать на капустных листьях, они оцениваются как идеальные потенциальные кандидаты для биологической борьбы с болезнями во время хранения Brassica spp.
Serratia spp.
Serratia spp. , выделенные с листьев капусты хорошо росли и проявляли сильный антагонизм in vitro при низких температурах. Однако только штамм CL 42 S. plymuthica продемонстрировал высокий антагонизм in vivo против B.cinerea на дисках из капустных листьев. Все штаммы S.liquefaciens продемонстрировали от среднего до плохого противодействия болезням in vivo. Serratia spp. ранее не были идентифицированы в качестве антагонистов грибкам. Serratia spp. не были описаны как возбудители болезней растений, но S.marcescens была описана как условно-патогенный возбудитель, вызывающий инфекции у человека (Brenner, 1984). Поэтому такие микроорганизмы должны использоваться только, если уже было показано, что они непатогенны для человека. Enterobacteriaceae образуют основную часть естественной микрофлоры капустных листьев, и так как выделенные антагонистические штаммы способны персистировать на листьях капусты, они обладают возможностями служить в качестве средств биологической борьбы с болезнями, конкретно, например, во время хранения Brassica spp.
Bacillus spp.
Bacillus spp. считались непригодными в качестве потенциальных средств биологической борьбы с болезнями для хранения на холоде, так как они не росли или очень плохо росли при низких температурах. Об этом ранее не сообщалось, так как большинство работавших, описывающих использование видов Bacillus для биологической борьбы с грибковыми возбудителями болезней фруктов и овощей испытывали антагонизм in vitro и in vivo при температурах около 20oC (Pusey and Wilson, 1984, Singh and Deverall, 1984, Utkhede and Sholberg, 1986, Gueldner et al., 1988). Их плохой рост при низких температурах мог, однако, служить объяснением различных результатов, описанных в полевых и предварительных испытаниях с целью коммерческого применения Bacillus subtilis в качестве основы биологических средств борьбы с болезнями (Baker et al., 1985, Pusey et al., 1986 and 1988). Известно, что Bacillus spp. продуцируют пептидные антибиотики с антигрибковой активностью во время спорообразования (смотрите Katz and Demain, 1977 для просмотра) и пептидные антибиотики были идентифицированы как активные вещества при использовании Bacillus subtilis в качестве средства биологической борьбы с грибковыми заболеваниями после сбора урожая (McKeen et al., 1986, Gueldner et al., 1988).
Продукция таких антибиотиков путем ферментации и их использование в качестве "биопестицидов" является предпочтительным использованием таких Bacillus, если невозможно выделить устойчивые к холоду антагонистические Bacillus spp. Однако антибиотики и микроорганизмы могли бы также использоваться для продления срока хранения, когда фрукты и овощи изымаются из хладохранилища. Слабая активность неочищенных экстрактов антибиотиков при определении на картофельно-декстрозном агаре (PDA) указывает на то, что обнаруженные антибиотики являются новыми, так как PDA, использовался большинством других авторов для отбора Bacillus spp., которые продуцируют противогрибковые антибиотики (Katz and Demain 1977, Pusey and Wilson, 1984, Singh and Devereal, 1984, McKeen et al., 1986, Utkhede and Sholberg, 1986, Wilson and Wisniewski, 1989).
Подробные характеристики всех штаммов этого изобретения представлены в таблицах 11 и 12.
Пример 10. Активность in vivo всех штаммов против B. cinerea на поверхности молодых листьев растений.
CL 82, CL 80 и CL 27 испытывали на способность сдерживать рост B.cinerea на поверхности листьев in vivo при использовании испытания на молодых растениях в камерах с созданием высокой влажности. Только CL 27 продемонстрировал значительное сдерживание, сходное с результатом, достигаемым с помощью фунгицидов. Применение бесклеточных фильтратов культуры CL 27 в бульоне давало сходное сдерживание с тем, которое обеспечивалось клеточной суспензией, показывая таким образом эффект антибиоза. Этот результат показывает, что CL 27 и его производные могут использоваться в качестве средства биологической борьбы с болезнями, применяемого перед уборкой урожая. Для определения эффективности такого применения после уборки урожая выполняли исследования по персистенции.
Микрорастения астильбы высаживали в компостные горшочки 3х3 см и их опрыскивали через недельные интервалы спорами грибков и антагонистами при влажности от 86 до 95%. В течение первых 6 недель все обработки давали сходный успех, но через 10 недель только фунгицид и обработка с использованием CL 27 или его бульона давали значительное сдерживание. CL 27 давал лучшее сдерживание, чем фунгицид при этих испытаниях.
Пример 11: Действие штаммов Serratia и Pseudomonas на сохраняемые продукты.
Выращивали датскую белую капусту (вар. Морган) и обрабатывали инсектицидом и гербицидами обычным образом, но не обрабатывали фунгицидами. После сбора кочаны погружали или в суспензию фунгицида (1 г/л Роврала и 2 г/л Ридомила) или в бактериальные суспензии 107 - 108 кое/мл. Примерно 14 кг капусты (10 - 12 кочанов) переносили в пластиковые подносы и запечатывали в пластик, чтобы исключить перекрестное обсеменение; на каждую обработку использовали 5 повторностей подносов. Испытания проводились в холодном хранилище при 4-6o и при 1-3oC и влажности, измеряемой через 7-дневные интервалы и, как обнаружено, находившейся на уровне 92-96% во всех случаях. В одном из испытаний после фунгицидов или бактерий наносили 106 спор/мл B.cinerea; на каждый поднос напыляли 5 мл суспензии спор.
Состояние капусты оценивалось следующим образом: 0 = нет видимого роста; 1 = 1 - 10%, 2 = 11 - 25%, 3 = 26 - 50%, 4 = 51 - 75%, 5 = 76 - 90%, 6 = 91 - 99%, 7 = 100% поверхности покрыто ростом гриба и измерялось через 6-недельные интервалы. Когда наблюдалось 80% покрытия ростом грибка у необработанных контролей (когда происходит обрезка при коммерческом хранении), производилась оценка деструкции при потере веса при удалении инфицированных листьев. Кочаны снова хранили в течение 10-14 недель и затем обрезали после 42 недель хранения. Испытание при 1-3oC не дает возможности определения деструкции, поэтому проводилось экстраполирование инфицированной площади листьев на потери при обрезке.
Использование CL 80 и CL 82 обеспечивало защиту, сходную с защитной фунгицидами во всех случаях, причем CL 82 давал лучшее подавление при обработке с добавлением B.cinerea, чем с A.brassicicola, в противоположность результатами in vitro. CL 82 персистировал на капусте в более высоком количестве, чем другие антагонисты, и таким образом является предпочтительным образцом изобретения. Из других штаммов CL 43 был наиболее эффективным в холодном хранилище.
Claims (16)
1. Штамм бактерий Bacillus pumilis NCIMB 40489 для предотвращения грибкового заболевания фруктов или овощей после сбора урожая и получения антибиотиков для ингибирования возбудителей вышеуказанных заболеваний.
2. Штамм бактерий Pseudomonas fluorescens NCIMB 40490 для предотвращения грибкового заболевания фруктов или овощей после сбора урожая.
3. Штамм бактерий Bacillus pumilis NCIMB 40489 для предотвращения грибкового заболевания фруктов или овощей после сбора урожая и получения антибиотиков для ингибирования возбудителей вышеуказанных заболеваний.
4. Штамм бактерий Serratia liguefaciens NCIMB 40492 для предотвращения грибкового заболевания фруктов или овощей после сбора урожая.
5. Штамм бактерий Serratia plymuthica NCIMB 40493 для предотвращения грибкового заболевания фруктов или овощей после сбора урожая.
6. Штамм бактерий Pseudomonas fluorescens NCIMB 40495 для предотвращения грибкового заболевания фруктов или овощей после сбора урожая.
7. Штамм бактерий Pseudomonas fluorescens NCIMB 40497 для предотвращения грибкового заболевания фруктов или овощей после сбора урожая.
8. Водная суспензия микроорганизма для ингибирования возбудителей грибковых заболеваний фруктов и овощей после сбора урожая, отличающаяся тем, что она содержит штамм микроорганизма по любому из пп.1 - 7, в концентрации (кое/мл), достаточной для ингибирования Alternaria brassicicola и/или Botrytis cinerea на фруктах и/или овощах, обработанных этой суспензией.
9. Суспензия по п.8, отличающаяся тем, что она содержит штамм микроорганизма в концентрации 104 - 109 кое/мл.
10. Суспензия по п.9, отличающаяся тем, что она содержит штамм микроорганизма в концентрации 105 - 108 кое/мл.
11. Способ предотвращения грибкового заболевания овощей и/или фруктов после сбора урожая, предусматривающий погружение указанных продуктов в суспензию микроорганизмов или разбрызгивание ее на продукты, отличающийся тем, что используют суспензию по любому из пп.8 - 10.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что обработанные продукты затем подвергают холодному хранению.
13. Антибиотик, используемый для ингибирования возбудителя грибкового заболевания фруктов или овощей после сбора урожая, полученный культивированием штамма микроорганизма, отличающийся тем, что он имеет Rf около 0,39, или 0,56 или 0,61, проявляет активность против Botrytis cinerea или видов Alternaria при pH в диапазоне 3,0 - 9,0, выделен из фильтрата культуральной жидкости штамма микроорганизма по п.1 или 3, выращенного на среде, содержащей капустные листья и воду в пропорции 5 - 100 г листьев на 1 л воды, с использованием силикагелевой колонки или пластины и элюента бутан-1-ол: уксусная кислота : вода в соотношении 3 : 1 : 1.
14. Антибиотик по п.13, отличающийся тем, что среда содержит 10 - 50 г гомогенизированных капустных листьев на 1 л воды.
15. Антибиотик по п.13, отличающийся тем, что он имеет значение Rf около 0,39 или 0,56 при выделении из фильтрата культуральной жидкости штамма Bacillus pumilis NCIMB 40489.
16. Антибиотик по п.13, отличающийся тем, что он имеет значение Rf около 0,61 при выделении из фильтрата культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis NCIMB 40491.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB929206645A GB9206645D0 (en) | 1992-03-26 | 1992-03-26 | Biological control of post harvest pests |
| GB9206645.5 | 1992-03-26 | ||
| PCT/GB1993/000604 WO1993018654A1 (en) | 1992-03-26 | 1993-03-24 | Biological control of post-harvest diseases |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU94045827A RU94045827A (ru) | 1997-03-10 |
| RU2126210C1 true RU2126210C1 (ru) | 1999-02-20 |
Family
ID=10712919
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU94045827A RU2126210C1 (ru) | 1992-03-26 | 1993-03-24 | Штамм бактерий для предотвращения грибкового заболевания фруктов или овощей после сбора урожая и получения антибиотиков для ингибирования возбудителей вышеуказанных заболеваний (варианты), штамм бактерий для предотвращения грибкового заболевания фруктов или овощей после сбора урожая (варианты), водная суспензия микроорганизма для ингибирования возбудителей грибковых заболеваний фруктов и овощей после сбора урожая, способ предотвращения грибкового заболевания овощей и/или фруктов после сбора урожая, антибиотик, используемый для ингибирования возбудителя грибкового заболевания фруктов или овощей после сбора урожая |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5869038A (ru) |
| EP (1) | EP0632693B1 (ru) |
| AT (1) | ATE175841T1 (ru) |
| AU (1) | AU3763793A (ru) |
| BG (1) | BG99064A (ru) |
| CA (1) | CA2132705A1 (ru) |
| CZ (1) | CZ229694A3 (ru) |
| DE (1) | DE69323186T2 (ru) |
| DK (1) | DK0632693T3 (ru) |
| GB (2) | GB9206645D0 (ru) |
| HU (1) | HUT68065A (ru) |
| IL (1) | IL105132A0 (ru) |
| RU (1) | RU2126210C1 (ru) |
| SK (1) | SK115594A3 (ru) |
| WO (1) | WO1993018654A1 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2551968C2 (ru) * | 2013-08-01 | 2015-06-10 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии) | ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus pumilus А 1.5, В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ И ИХ ЗАЩИТЫ ОТ БОЛЕЗНЕЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ФИТОПАТОГЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ |
| RU2553518C1 (ru) * | 2013-11-20 | 2015-06-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт биологической защиты растений Российской академии сельскохозяйственных наук | ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus subtilis ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА ПРОТИВ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ |
| RU2669997C2 (ru) * | 2013-07-08 | 2018-10-17 | Басф Агро Б.В. | Композиции, содержащие триазольное соединение и биопестицид |
Families Citing this family (44)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5374433A (en) * | 1991-11-20 | 1994-12-20 | Monfort, Inc. | Method for preserving food products |
| AU6988894A (en) * | 1993-05-28 | 1994-12-20 | United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture, The | Bacterial control of (fusarium) dry rot of potatoes |
| DE4421504C2 (de) * | 1994-06-20 | 1998-04-16 | Lumos Trading & Investments Co | Verfahren zum Konservieren von wäßrigen Lösungen oder Dispersionen, Anlage zur Durchführung des Verfahrens sowie dessen Anwendung |
| US6103228A (en) * | 1997-05-09 | 2000-08-15 | Agraquest, Inc. | Compositions and methods for controlling plant pests |
| EP0981540B1 (en) * | 1997-05-09 | 2006-07-12 | Agraquest, Inc. | A novel strain of bacillus for controlling plant diseases and corn rootworm |
| EP1021954B1 (de) * | 1998-12-24 | 2002-10-02 | Gabriele Dr. Berg | Rhizobakterienisolate zur Anwendung gegen phytopatogene Bodenpilze und Verfahren zur Anwendung der Rhizobakterienisolate |
| TR200201744T2 (tr) | 1999-03-30 | 2002-10-21 | Agraquest, Inc. | Bitki hastalıklarının kontrol edilmesi için bacillus pumilus soyu |
| US6245551B1 (en) | 1999-03-30 | 2001-06-12 | Agraquest, Inc. | Strain of Bacillus pumilus for controlling plant diseases caused by fungi |
| US6083737A (en) * | 1999-04-14 | 2000-07-04 | Roebic Laboratories, Inc. | Enzyme-producing strain of Bacillus pumilus |
| US6177012B1 (en) | 1999-04-14 | 2001-01-23 | Roebic Laboratories, Inc. | Enzyme-producing strain of bacillus bacteria |
| US6174718B1 (en) | 1999-04-14 | 2001-01-16 | Roebic Laboratories, Inc. | Enzyme-producing strain of Bacillus bacteria |
| US6171848B1 (en) * | 1999-04-14 | 2001-01-09 | Roebic Laboratories, Inc. | Enzyme-producing strain of Bacillus bacteria |
| US6162634A (en) * | 1999-04-14 | 2000-12-19 | Roebic Laboratories, Inc. | Enzyme-producing strain of Bacillus bacteria |
| US6171847B1 (en) * | 1999-04-14 | 2001-01-09 | Roebic Laboratories, Inc. | Enzyme-producing strain of Bacillus bacteria |
| US6162635A (en) * | 1999-04-14 | 2000-12-19 | Roebic Laboratories, Inc. | Enzyme-producing strain of Bacillus bacteria |
| US6140106A (en) * | 1999-04-14 | 2000-10-31 | Roebic Laboratories, Inc. | Enzyme-producing strain of Bacillus subtilis |
| FI107735B (fi) * | 1999-09-13 | 2001-09-28 | Markku Raimo Halonen | Kemiallinen yhdiste, joka estää mikro-organismi/vesisuspension jäätymisen, säilyttää mikro-organismit elinkelpoisina ja lisää niiden kasvua |
| US20030130121A1 (en) * | 1999-11-30 | 2003-07-10 | Berndt Gerhardson | Novel bacterial isolate and the preparation and use of its active metabolites |
| US6660263B2 (en) | 2000-05-18 | 2003-12-09 | Hmv Corporation | Oocydin and methods of use for protection of plants from Oomyocyte pathogens |
| US6926892B2 (en) * | 2000-05-18 | 2005-08-09 | Hmv Corporation | Protecting plants from oomycete pathogens by treatment with compositions containing serratamolide and oocydin a from Serratia marcescens |
| KR100393736B1 (ko) * | 2000-07-07 | 2003-08-06 | 이윤수 | 신규의 슈도모나스 플루오르센스 (Pseudomonas fluorescens) Soil-4 균주 KFCC-11162 및 배추의 생장촉진에 유용한 슈도모나스 플루오르센스 (Pseudomonas fluorescens) Soil-4 균주 |
| KR20020036264A (ko) * | 2000-11-09 | 2002-05-16 | 이재호 | 길항미생물 배양액을 유효성분으로 함유하는 잿빛곰팡이병방제용 도포제, 이의 제조방법 및 이를 사용한 잿빛곰팡이병의 방제방법 |
| EP1241247A1 (en) * | 2001-03-13 | 2002-09-18 | C.C.H. S.A. | Isolated bacteria for the protection of plants against phytopathogenic fungi and bacteria |
| AU2002257272A1 (en) * | 2001-05-17 | 2002-11-25 | Hmv Corporation | Method to protect plants from oomycete pathogens with serratia marcescens |
| KR100430961B1 (ko) * | 2002-02-26 | 2004-05-12 | 김진호 | 대파 흑색썩음균핵병균에 길항하는 쎄라티아 플리무티카 |
| KR100457025B1 (ko) * | 2002-03-15 | 2004-11-12 | 주식회사 엘지생명과학 | 식물병 방제활성을 갖는 항진균 물질을 생성하는 패니바실러스 에스디 17 균주 및 이를 함유하는 항균제 조성물 |
| US9453251B2 (en) * | 2002-10-08 | 2016-09-27 | Pfenex Inc. | Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens |
| US7115756B2 (en) * | 2003-06-23 | 2006-10-03 | Harbor Branch Oceanographic Institution, Inc. | Biologically active lasonolide compounds |
| EP1709170B1 (en) | 2004-01-16 | 2018-02-21 | Pfenex Inc. | Expression of mammalian proteins in pseudomonas fluorescens |
| US8603824B2 (en) | 2004-07-26 | 2013-12-10 | Pfenex, Inc. | Process for improved protein expression by strain engineering |
| CN101078006B (zh) * | 2006-05-26 | 2012-06-06 | 上海凯信生物科技有限公司 | 一株高产四甲基吡嗪的短小芽孢杆菌 |
| US9580719B2 (en) | 2007-04-27 | 2017-02-28 | Pfenex, Inc. | Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins |
| AU2008245696B2 (en) | 2007-04-27 | 2013-11-07 | Pelican Technology Holdings, Inc. | Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins |
| EP2324710A1 (en) | 2007-09-20 | 2011-05-25 | Basf Se | Combinations comprising a fungicidal strain and at least one additional fungicide |
| WO2010036717A1 (en) * | 2008-09-23 | 2010-04-01 | Modular Genetics, Inc. | Growth of microorganisms in media containing soy components |
| CL2009000908A1 (es) | 2009-04-16 | 2009-08-14 | Univ Santiago Chile | Cepa bacteriana de la especie serratia plymuthica ccgg2742; composicion biofungicida que la comprende; metodo para prevenir la podredumbre de los frutos; y su uso para controlar infecciones fungicas producidas por hongos fitopatogenos. |
| ES2402726B1 (es) | 2011-10-28 | 2014-03-13 | Investigaciones Y Aplicaciones Biotecnologicas, S.L. | Nueva cepa de bacillus subtilis destinada a luchar contra las enfermedades de las plantas. |
| CN103122330B (zh) * | 2012-12-31 | 2015-04-08 | 甘肃农业大学 | 高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株gh010及其菌剂的制备方法和应用 |
| MX2015017994A (es) | 2013-06-27 | 2016-03-16 | Starbucks Corp Dba Starbucks Coffee Co | Metodos de conservacion biologica para bebidas y otros alimentos. |
| RU2559685C2 (ru) * | 2013-10-24 | 2015-08-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова Сибирского отделения Российской академии наук (НИОХ СО РАН) | Средство для повышения урожайности картофеля путем обработки семенных клубней перед закладкой на хранение |
| US9877486B2 (en) | 2014-01-31 | 2018-01-30 | AgBiome, Inc. | Methods of growing plants using modified biological control agents |
| PT3099172T (pt) * | 2014-01-31 | 2021-11-08 | Agbiome Inc | Agentes modificados de controlo biológico e seus usos |
| RU2721966C2 (ru) | 2014-12-29 | 2020-05-25 | Фмк Корпорейшн | Микробные композиции и способы применения для улучшения роста растений и лечения болезней растений |
| CN106798236B (zh) * | 2017-01-16 | 2020-06-30 | 江南大学 | 一种菜馅心非冻结包子的联合保鲜方法 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4582704A (en) * | 1983-10-07 | 1986-04-15 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Control of bean rust with Bacillus subtilis |
| US4663162A (en) * | 1984-03-14 | 1987-05-05 | The Regents Of The University Of California | Method of using Bacillus polymyxa 9A to protect plants against verticillium wilt |
| US4764371A (en) * | 1984-05-01 | 1988-08-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Postharvest biological control of stone fruit brown rot by bacillus subtilis |
| US5047239A (en) * | 1984-05-01 | 1991-09-10 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Biological control of fruit rot |
| US4877738A (en) * | 1986-07-25 | 1989-10-31 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Biological control of damping off and root rot and inoculum preparation therefor |
| PT85874B (pt) * | 1986-10-09 | 1990-07-31 | Ciba Geigy Ag | Processo para a preparacao de oligo-peptidos com accao antibiotica |
| GB8701234D0 (en) * | 1987-01-21 | 1987-02-25 | Agricultural Genetics Co | Strain of microorganism |
| US5194269A (en) * | 1988-01-20 | 1993-03-16 | Lee Tung Ching | Production of frozen foods and other products |
| US4975277A (en) * | 1988-08-02 | 1990-12-04 | United States Of America | Biological control of postharvest rots in fruits using Pseudomonas cepacia and pyrrolnitrin produced therefrom |
| US5360606A (en) * | 1988-08-03 | 1994-11-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Biological inoculant effective against alternaria |
| US4996049A (en) * | 1988-12-19 | 1991-02-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Biological control of corn seed rot and seedling blight |
| JPH02275898A (ja) * | 1989-01-10 | 1990-11-09 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | 新規抗生物質ｋｔ―６２９１ａ及びｋｔ―６２９１ｂ、それらを生産する微生物及び製法並びに植物病害防除剤 |
| US5371011A (en) * | 1989-07-10 | 1994-12-06 | Zeneca Corp. | Mold control in forage |
-
1992
- 1992-03-26 GB GB929206645A patent/GB9206645D0/en active Pending
-
1993
- 1993-03-22 IL IL105132A patent/IL105132A0/xx unknown
- 1993-03-24 EP EP93906741A patent/EP0632693B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-03-24 AT AT93906741T patent/ATE175841T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-03-24 GB GB9418831A patent/GB2280113B/en not_active Revoked
- 1993-03-24 DK DK93906741T patent/DK0632693T3/da active
- 1993-03-24 SK SK1155-94A patent/SK115594A3/sk unknown
- 1993-03-24 RU RU94045827A patent/RU2126210C1/ru active
- 1993-03-24 HU HU9402742A patent/HUT68065A/hu unknown
- 1993-03-24 US US08/307,686 patent/US5869038A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-03-24 AU AU37637/93A patent/AU3763793A/en not_active Abandoned
- 1993-03-24 WO PCT/GB1993/000604 patent/WO1993018654A1/en not_active Application Discontinuation
- 1993-03-24 DE DE69323186T patent/DE69323186T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-03-24 CZ CZ942296A patent/CZ229694A3/cs unknown
- 1993-03-24 CA CA002132705A patent/CA2132705A1/en not_active Abandoned
-
1994
- 1994-09-26 BG BG99064A patent/BG99064A/xx unknown
-
1995
- 1995-03-27 US US08/411,280 patent/US5597565A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-03-27 US US08/411,286 patent/US5780080A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Бюллетень ВНИИСХМ, 1970, N 14, вып. 3, стр. 58 - 63. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2669997C2 (ru) * | 2013-07-08 | 2018-10-17 | Басф Агро Б.В. | Композиции, содержащие триазольное соединение и биопестицид |
| RU2551968C2 (ru) * | 2013-08-01 | 2015-06-10 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии) | ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus pumilus А 1.5, В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ И ИХ ЗАЩИТЫ ОТ БОЛЕЗНЕЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ФИТОПАТОГЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ |
| RU2553518C1 (ru) * | 2013-11-20 | 2015-06-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт биологической защиты растений Российской академии сельскохозяйственных наук | ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus subtilis ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА ПРОТИВ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1993018654A1 (en) | 1993-09-30 |
| GB9418831D0 (en) | 1994-11-09 |
| ATE175841T1 (de) | 1999-02-15 |
| EP0632693B1 (en) | 1999-01-20 |
| DE69323186T2 (de) | 1999-07-08 |
| AU3763793A (en) | 1993-10-21 |
| EP0632693A1 (en) | 1995-01-11 |
| DK0632693T3 (da) | 1999-09-13 |
| RU94045827A (ru) | 1997-03-10 |
| US5780080A (en) | 1998-07-14 |
| IL105132A0 (en) | 1993-07-08 |
| HU9402742D0 (en) | 1994-12-28 |
| CZ229694A3 (en) | 1995-12-13 |
| US5597565A (en) | 1997-01-28 |
| CA2132705A1 (en) | 1993-09-30 |
| GB2280113B (en) | 1996-11-13 |
| SK115594A3 (en) | 1995-08-09 |
| HUT68065A (en) | 1995-04-04 |
| US5869038A (en) | 1999-02-09 |
| BG99064A (en) | 1995-07-28 |
| GB9206645D0 (en) | 1992-05-06 |
| GB2280113A (en) | 1995-01-25 |
| DE69323186D1 (de) | 1999-03-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2126210C1 (ru) | Штамм бактерий для предотвращения грибкового заболевания фруктов или овощей после сбора урожая и получения антибиотиков для ингибирования возбудителей вышеуказанных заболеваний (варианты), штамм бактерий для предотвращения грибкового заболевания фруктов или овощей после сбора урожая (варианты), водная суспензия микроорганизма для ингибирования возбудителей грибковых заболеваний фруктов и овощей после сбора урожая, способ предотвращения грибкового заболевания овощей и/или фруктов после сбора урожая, антибиотик, используемый для ингибирования возбудителя грибкового заболевания фруктов или овощей после сбора урожая | |
| ES2401004T3 (es) | Levadura antagonista novedosa útil para controlar el deterioro de productos agrícolas, métodos de uso de la misma y composiciones que la contienen | |
| Mari et al. | Biological control of gray mold in pears by antagonistic bacteria | |
| Chand-Goyal et al. | Postharvest biological control of blue mold of apple and brown rot of sweet cherry by natural saprophytic yeasts alone or in combination with low doses of fungicides | |
| Wilson et al. | Biological control of Rhizopus rot of peach with Enterobacter cloacae. | |
| AU2002255715A1 (en) | A novel antagonistic yeast useful in controlling spoilage of agricultural produce, methods of use thereof and compositions containing same | |
| JP2004528030A5 (ru) | ||
| RU2143199C1 (ru) | Композиция и способ борьбы с болезнями растений | |
| JP2001503642A (ja) | 植物の真菌感染の生物学的コントロール | |
| US5711946A (en) | Control of post-harvest fungal disease using saprophytic yeast | |
| US5405778A (en) | Strains of Cryptococcus used to biologically control postharvest rots in fruit | |
| Moline et al. | Selective isolation of bacterial antagonists of Botrytis cinerea | |
| EP1174030B1 (en) | Novel pantoea agglomerans (erwinia herbicola) bacteria strain and its utilization as biological control agent of fungal diseases in fruits | |
| US5843434A (en) | Strain of the yeast Candida sake (saito and ota) van uden and buckley and its use as a biological control agent for post-harvest funga l diseases in fruits | |
| Cheah et al. | Rapid screening for antagonists against Botrytis storage rots using leaf and fruit tissue | |
| JP3585931B2 (ja) | 酵母カンジダ・サケ（サイトウ・アンド・オータ）・ファン・ユーデン・アンド・バックレイの新しい株、並びに果実の収穫後真菌疾病の生物学的制御物質としてのその使用 | |
| Koomen | Biological control of Colletotrichum gloeosporioides | |
| El-Neshawy | Efficacy of Candida oleophila strain 128 in preventing Penicillium expansum infection on apricot fruit | |
| Qadir | Ethylene production by Botrytis cinerea and infected kiwifruit: a thesis presented in partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in Horticultural Science at Massey University, Palmerston North, New Zealand | |
| Wade | Metabiosis of proteolytic fungi and Salmonellae in sound and chill-injured tomatoes | |
| Abo-Elnaga et al. | BIOLOGICAL CONTROL OF BLACK MOLD OF ONION CAUSED BY Aspergillus niger BY USING Saccharomyces cervisiae |