ITMI20111292A1 - "nuovi ceppi di lievito e loro uso per il controllo di funghi fitopatogeni" - Google Patents

Description

Nuovi ceppi di lievito e loro uso per il controllo di funghi fitopatogeni

------

La presente invenzione riguarda nuovi ceppi di lievito e il loro uso, da soli o in miscela sinergica, per il controllo biologico di funghi fitopatogeni, anche micotossigeni, di colture agricole di rilevante interesse economico, e relative composizioni fungicide.

L’uso di lieviti appartenenti ai generi Aureobasidium, Rhodotorula, Cryptococcus, Metschnikowia, Candida, etc., per il controllo di funghi fitopatogeni, in particolare di quelli responsabili dei marciumi della frutta in post-raccolta, à ̈ già noto ed à ̈ descritto, ad esempio, nelle domande di brevetto WO96/25039 (Rhodotorula, Cryptococcus), US5244680 (Cryptococcus), US5843434 (Candida), WO02/072777 (Metschinikowia), WO2008/114304 (Aureobasidium, Rhodotorula, Cryptococcus), WO2009/040862 (Metschinikowia), nonché nei riferimenti bibliografici citati in detti documenti.

In WO2008/114304 vengono citati, tra gli altri, un ceppo di Rhodotorula glutinis, siglato LS11, ed un ceppo di Cryptococcus laurentii, siglato LS28, che possono essere entrambi utilizzati nel controllo di funghi fitopatogeni, tra cui anche alcuni produttori di micotossine (funghi micotossigeni). Questi due lieviti, tuttavia, quando applicati singolarmente o in combinazione in trattamenti antifungini di campo prima della raccolta, come tali o in opportune formulazioni sperimentali, in condizioni ambientali favorevoli all’insorgenza e allo sviluppo della malattia, non sempre hanno fornito risultati soddisfacenti e comparabili a quelli ottenibili con i formulati di sintesi. Questi risultati non sempre positivi sono attribuibili ai seguenti fattori: a) grado di sopravvivenza dei due microrganismi sulle superfici vegetali non sempre sufficiente a contrastare efficacemente l’azione del patogeno;

b) scarsa compatibilità tra i due ceppi quando applicati in combinazione;

c) limitata attitudine dei due ceppi per lo sviluppo di formulati con una shelf-life sufficientemente lunga. La Richiedente ha ora isolato due nuovi ceppi di lievito, uno appartenente alla specie Rhodosporidium kratochvilovae e l’altro alla specie Cryptococcus laurentii. I ceppi di lievito Rhodosporidium kratochvilovae e Cryptococcus laurentii, sono entrambi stati depositati ai fini brevettuali in accordo con le procedure previste dal Trattato di Budapest, in data 20/12/2009 e 09/05/2011 presso la Industrial Yeasts Collection DBVPG, del Dipartimento di Biologia Applicata, Università di Perugia, Borgo XX Giugno, 74, I-06121 Perugia (Italia) con numero di deposito 26P e 31P, rispettivamente.

Questi due nuovi ceppi di lievito, quando saggiati contro differenti patogeni fungini su differenti colture, oltre a risultare altamente compatibili e sinergici tra loro risultano essere sorprendentemente molto più efficaci rispetto al ceppo Rhodotorula glutinis, siglato LS11, ed al ceppo Cryptococcus laurentii, siglato LS28 precedentemente descritti in WO2008/114304.

Il nuovo ceppo di R. kratochvilovae (DBVPG 26P) Ã ̈ stato isolato da drupe di olivo, mentre il nuovo ceppo di C. laurentii (DBVPG 31P) Ã ̈ stato isolato da frutti di melo.

I due nuovi ceppi di lievito sono stati ottenuti mediante isolamento selettivo in coltura artificiale agarizzata (Nutrient Yeast Extract Dextrose Agar: NYDA) utilizzando la tecnica descritta da Wilson [Wilson et al., Scientia Hort (1993) 53: pag. 183-189]. In breve, questa tecnica prevede l’applicazione di acque di lavaggio ottenute da frutti e/o foglie direttamente in vivo, in ferite artificiali di mele successivamente inoculate con spore di patogeni fungini. Dalle ferite che nei giorni seguenti non sviluppano infezioni evidenti, si procede al re-isolamento e alla purificazione in coltura dei microrganismi a probabile attività antagonistica e potenzialmente responsabili del mancato sviluppo della malattia. I microrganismi potenziali antagonisti selezionati vengono poi ulteriormente saggiati e caratterizzati per l’attività antifungina su diverse specie di piante di interesse agrario e contro differenti patogeni. I ceppi ritenuti potenziali antagonisti sono stati tipizzati dal punto di vista genetico-molecolare.

I due nuovi ceppi DBVPG 26P e DBVPG 31P, utilizzati sia da soli, sia in miscela sinergica, come tali o preferibilmente sotto forma di opportune composizioni fitosanitarie, sono risultati decisamente più efficaci dei ceppi descritti nell’arte nota per il controllo di funghi fitopatogeni (anche micotossigeni) di importanti colture agrarie, non soltanto in applicazioni in postraccolta, ma anche nei tradizionali trattamenti fungicidi di campo durante lo sviluppo delle colture e fino a prima della raccolta.

Inoltre, i due nuovi ceppi di lievito, da soli o in miscela, risultano notevolmente più idonei, rispetto ai ceppi precedenti, per l’ottenimento di nuovi formulati che, oltre a garantire più elevati livelli di efficacia nei riguardi dei patogeni fungini, anche micotossigeni, presentano una non comune e più lunga shelf-life.

Sulla base dei limiti di sopravvivenza sulle superfici vegetali e dell’attività antifungina non sempre soddisfacente manifestata dai ceppi di lievito precedentemente riportati nell’arte nota, i nuovi ceppi DBVPG 26P e DBVPG 31P sopravvivono, e quindi persistono, più efficacemente e più a lungo sulle superfici vegetali, integre o ferite, ed esercitano una maggiore attività antifungina.

Inoltre, visti:

i) l’alta compatibilità e il consistente sinergismo dei due nuovi ceppi in miscela;

ii) l’alta compatibilità dei due ceppi quando impiegati in combinazione con diversi coadiuvanti;

iii) l’alta compatibilità dei due ceppi quando impiegati in combinazione con anticrittogamici comunemente utilizzati in agricoltura biologica o integrata;

iv) la loro più estesa shelf-life quando formulati da soli o in miscela tra loro;

i due nuovi ceppi di lievito sono in grado di fornire assai più elevati livelli di protezione contro gli attacchi fungini in campo e in post-raccolta su diverse e importanti colture agrarie, paragonabili, e talvolta migliori, a quelli ottenibili con la tradizionale difesa chimica.

Più in particolare, la sinergia mostrata dai due nuovi ceppi quando vengono applicati in miscela tra loro à ̈ dovuta alle loro diverse e complementari caratteristiche biologiche. I due nuovi ceppi, infatti, hanno meccanismi d’azione e di adattamento ambientale differenziati tra loro e colonizzano i vegetali in maniera diversa.

Inoltre, i nuovi ceppi DBVPG 26P e DBVPG 31P producono elevate attività enzimatiche in grado di inibire, attraverso la lisi dei polimeri delle pareti cellulari fungine, lo sviluppo dei funghi fitopatogeni, con attività più elevata da parte del ceppo DBVPG 31P.

Quest’ultimo, inoltre, presenta una sorprendente resistenza allo stress ossidativo generato da sostanze prodotte dal tessuto vegetale ferito che rappresenta la corte di infezione per molti funghi fitopatogeni, presentando così una più elevata capacità di colonizzazione di tale tessuto ferito.

Sebbene i due ceppi siano entrambi in grado di svilupparsi in diverse condizioni ambientali, il ceppo DBVPG 26P di R. kratochvilovae, rispetto al ceppo DBVPG 31P di C. laurentii, colonizza meglio le superfici vegetali integre, sviluppa meglio a temperature basse, mostrando maggiore persistenza anche su frutta e vegetali frigoconservati, e presenta una sorprendente capacità di degradare la micotossina patulina, assai maggiore di altri esempi riportati nell’arte nota. Il ceppo DBVPG 26P, inoltre, rappresenta il primo esempio di Rhodosporidium kratochvilovae utilizzabile come biopesticida. Come detto, questi due nuovi ceppi di lievito sono risultati sorprendentemente più efficaci dei ceppi già riportati nell’arte nota nel controllo di funghi fitopatogeni che attaccano le principali colture agrarie. Formano pertanto oggetto della presente invenzione:

- il ceppo di lievito Rhodosporidium kratochvilovae depositato in data 20/12/2009 presso la Industrial Yeasts Collection DBVPG, del Dipartimento di Biologia Applicata, Università di Perugia, Borgo XX Giugno, 74, I-06121 Perugia (Italia) con numero di deposito 26P;

- il ceppo di lievito Cryptococcus laurentii depositato in data 09/05/2011 presso la Industrial Yeasts Collection DBVPG, del Dipartimento di Biologia Applicata, U-niversità di Perugia, Borgo XX Giugno, 74, I-06121 Perugia (Italia) con numero di deposito 31P.

Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione una miscela dei due ceppi di lievito Rhodosporidium kratochvilovae DBVPG 26P e Cryptococcus laurentii DBVPG 31P. Infatti, l’applicazione dei due microorganismi in miscela à ̈ risultata particolarmente vantaggiosa ai fini del controllo di funghi fitopatogeni, anche micotossigeni, di colture agrarie, in quanto si à ̈ constatato un effetto sinergico molto elevato, che si esplica in una efficacia antifungina sorprendentemente elevata, superiore a quella che poteva attendersi sulla base dell’efficacia dei due lieviti usati separatamente e calcolata utilizzando le formule di Colby [Colby, “Weeds†, 15 (1967), pag. 20-22] e di Abbott [Levy et al., “EPPO Bull.†16 (1986), 8, pag. 651-657].

Come detto, ai fini di un impiego pratico à ̈ preferibile utilizzare i due microorganismi, da soli o in miscela tra loro, sotto forma di opportune composizioni fitosanitarie fungicide, le quali costituiscono un ulteriore aspetto della presente invenzione.

Esse possono essere ottenute per essiccamento o liofilizzazione della biomassa derivata dalla fermentazione dei due ceppi di lievito, a loro volta ottenuti per filtrazione, sedimentazione o centrifugazione dei rispettivi brodi di fermentazione.

Pertanto, la presente invenzione si riferisce ulteriormente ad una composizione fungicida caratterizzata dal fatto di comprendere uno dei due ceppi di lievito secondo la presente invenzione o una loro miscela come principio attivo, insieme ad altri adiuvanti e/o eccipienti fitofarmacologicamente accettabili.

In una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, detta composizione fungicida comprende una miscela sinergica ottenute dall’associazione di Rhodosporidium kratochvilovae, siglato DBVPG 26P, con Cryptococcus laurentii, siglato DBVPG 31P, in proporzioni variabili tra 80/20 (4:1) e 20/80 (1:4). Il rapporto percentuale più idoneo tra i due ceppi nella miscela à ̈ funzione del patogeno da combattere, dell’ecosistema in cui la miscela deve essere applicata (specie di pianta della coltura da trattare), dell’ambiente in cui la miscela deve essere utilizzata (pieno campo o frigoconservazione), nonché della fase fenologica della coltura da trattare.

Nelle suddette composizioni, la concentrazione di Rhodosporidium kratochvilovae DBVPG 26P, e/o di Cryptococcus laurentii siglato DBVPG 31P, può variare tra 5x10<6>UFC/ml (unità formanti colonie = numero di cellule per millilitro di sospensione della miscela) e 1x10<8>UFC/ml; in genere essa à ̈ preferibilmente compresa tra 5x10<7>UFC/ml e 1x10<8>UFC/ml.

Secondo un’ulteriore forma di realizzazione detta composizione fungicida à ̈ caratterizzata dal fatto di comprendere almeno un ulteriore principio attivo scelto tra fungicida, fitoregolatore, antibiotico, erbicida, acaricida, insetticida, fertilizzante, additivo alimentare, antiossidante e/o loro miscele.

Esempi di fungicidi che possono essere inclusi nelle composizioni oggetto della presente invenzione sono acibenzolar, ametoctradina, amisulbrom, ampropilfos, anilazina, azaconazolo, azossistrobina, benalaxyl, benalaxyl-M, benomyl, bentiavalicarb, bitertanolo, bixafen, blasticidina-S, boscalid, bromoconazole, bupirimate, butiobate, captafol, captano, carbendazina, carbossina, carpropamide, chinometionato, cloroneb, clorotalonil, clozolinate, ciazofamide, ciflufenamide, cimoxanil, ciproconazolo, ciprodinil, debacarb, diclofluanide, diclone, diclobutrazolo, diclomezine, dicloran, diclocimet, dietofencarb, difenoconazolo, diflumetorim, dimetirimol, dimetomorf, dimossistrobina, diniconazolo, dinocap, dipiritione, ditalimfos, ditianon, dodemorf, dodina, edifenfos, epossiconazolo, etaconazolo, ethaboxam, etirimolo, etossiquin, etridiazolo, famoxadone, fenamidone, fenaminosulf, fenapanil, fenarimol, fenbuconazolo, fenfuram, fenexamide, fenoxanil, fenpiclonil, fenpropidin, fenpropimorf, fentin, ferbam, ferimzone, fluazinam, fludioxonil, flumetover, flumorph, fluopicolide, fluopyram, fluoroimide, fluotrimazolo, fluoxastrobin, fluquinconazolo, flusilazolo, flusulfamide, flutianil, flutolanil, flutriafol, folpet, fosetil alluminio, fuberidazolo, furalaxyl, furametpyr, furconazolo, furconazolo-cis, guazatina, esaconazolo, imexazolo, idrossichinolina solfato, imazalil, imibenconazolo, iminoctadina, ipconazolo, iprobenfos, iprodione, isoprotiolano, iprovalicarb, isopyrazam, isotianil, kasugamicina, kresoxim-methyl, mancopper, mancozeb, mandipropamide, maneb, mebenil, mepanipirim, mepronil, meptyl dinocap, metalaxyl, metalaxyl-M, metconazolo, metfuroxam, metiram, metominostrobin, metrafenone, me tsulfovax, miclobutanil, natamicina, nicobifen, nitrotal isopropile, nuarimol, ofurace, orysastrobin, oxadixyl, oxpoconazole, ossicarbossina, pefurazoato, penconazolo, pencicuron, penflufen, pentaclorofenolo e suoi sali, pentiopirad, phthalide, picossistrobin, piperalin, poltiglia bordolese, poliossine, probenazolo, procloraz, procimidone, propamocarb, propiconazolo, propineb, proquinazid, protiocarb, protioconazolo, piracarbolid, piraclostrobina, pirametostrobina, pyraoxystrobin, pirazofos, piribencarb, pirifenox, pirimetanile, piroquilon, pyroxyfur, quinacetol, quinazamide, quinconazolo, quinoxifen, quintozene, rabenzazolo, rame idrossido, rame ossicloruro, rame (I) ossido, rame solfato, sedaxane, siltiofam, simeconazolo, spiroxamina, streptomicina, tebuconazolo, tetraconazolo, tiabendazolo, thiadifluor, ticyofen, tifluzamide, tiofanato, tiofanato-metile, tiram, tiadinil, tioxymid, tolclofosmetile, tolilfluanide, triadimefon, triadimenol, triarimol, triazbutil, triazoxide, triciclazolo, tridemorf, triflossistrobina, triflumizolo, triforina, triticonazolo, uniconazolo, uniconazolo-P, validamicina, valifenalate, vinclozolina, zineb, ziram, zolfo, zoxamide. Le composizioni fungicide secondo la presente invenzione possono presentarsi in forma di polveri o di soluzioni acquose, che vengono a loro volta diluite con appropriate quantità di acqua in modo da ottenere dispersioni parzialmente o totalmente insolubili in acqua, oppure soluzioni più diluite.

Come detto, le composizioni sopra descritte possono essere utilizzate efficacemente in trattamenti fungicidi sia in pieno campo, fino al momento della raccolta, sia in post-raccolta.

In particolare, le composizioni comprendenti i ceppi di lievito secondo l’invenzione si sono dimostrate notevolmente efficaci nel controllo di Plasmopara viticola su vite, Phytophthora infestans e Botrytis cinerea su pomodoro, Puccinia recondita, Erysiphe (=Blumeria) graminis, Helminthosporium teres, Septoria nodorum e Fusarium spp. su cereali, nel controllo di Phakopsora pachyrhizi su soia, nel controllo di Uromyces appendiculatus su fagiolo, nel controllo di Venturia inaequalis su melo, nel controllo di Sphaeroteca fuliginea su cetriolo.

Forma quindi ulteriore aspetto della presente invenzione l’uso dei singoli ceppi o di una loro miscela o delle composizioni fungicide comprendenti il ceppo Rhodosporidium kratochvilovae siglato DBVPG 26P, e/o il ceppo Cryptococcus laurentii siglato DBVPG 31P, per il controllo di funghi fitopatogeni, anche micotossigeni, di colture agrarie.

La maggiore efficacia raggiunta con la miscela dei due ceppi (impiego dei ceppi in combinazione), come sopra già specificato, deriva dalla complementarietà:

i) dei meccanismi d’azione dei due ceppi;

ii) delle diverse capacità di superare le avverse condizioni ambientali (alte e basse temperature con bassi e alti livelli di umidità;

iii) delle capacità di colonizzare le superfici vegetali integre e ferite.

Esempi di funghi fitopatogeni che possono essere efficacemente controllati con i due ceppi descritti, utilizzati da soli o in miscela sinergica, sono quelli appartenenti alle classi di Basidiomiceti, Ascomiceti, Deuteromiceti o funghi imperfetti, Oomiceti: Puccinia spp., Ustilago spp., Tilletia spp., Uromyces spp., Claviceps purpurea, Phakopsora spp., Rhizoctonia spp., Sclerotium rolfsii, Sclerotium cepivorum, Erysiphe spp., Sphaerotheca spp., Podosphaera spp., Uncinula spp., Helminthosporium spp., Rhynchosporium spp., Pyrenophora spp., Aspergillus spp., Botrytis spp., Monilinia spp., Sclerotinia spp., Rhizopus spp., Mucor spp., Septoria spp. (Mycosphaerella spp.), Phaeosphaeria spp., Venturia spp., Alternaria spp., Fusarium spp., Cercospora spp., Cladosporium spp., Phoma spp., Cercosporella herpotrichoides, Colletotrichum spp., Pyrenochaeta lycopersici, Pyricularia oryzae, Sclerotium spp., Ascochyta spp., Albugo spp., Phytophthora spp., Pythium spp., Plasmopara viticola, Thielaviopsis basicola, Diaporthe spp, Peronospora spp., Pseudoperonospora cubensis, Bremia lactucae, Penicillium spp., Cladosposium spp., Stemphylium spp., Leveillula taurica.

Le principali colture che possono essere protette con i microorganismi della presente invenzione comprendono cereali (grano, orzo, segale, avena, riso, mais, sorgo, ecc.), fruttiferi (olivo, melo, pero, albicocco, nashi, susino, pesco, mandorlo, ciliegio, kaki, banano, vite, fragola, lampone, mora, ecc.), agrumi (arancio, limone, mandarino, clementine, pompelmo, ecc.), leguminose (fagiolo, pisello, lenticchia, soia, ecc.), orticole (spinacio, lattuga, asparago, carciofo, cavolo, carota, cipolla, aglio, pomodoro, patata, melanzana, peperone, finocchio, ecc.), cucurbitacee (zucca, zucchina, cetriolo, melone, anguria, ecc.), piante oleaginose (soia, girasole, colza, arachide, ricino, cocco, ecc.), tabacco, caffà ̈, tà ̈, cacao, barbabietola da zucchero, canna da zucchero, cotone.

In particolare, i ceppi di lievito secondo l’invenzione si sono dimostrati notevolmente efficaci nel controllo di Plasmopara viticola su vite, Phytophthora infestans e Botrytis cinerea su pomodoro, Puccinia recondita, Erysiphe (=Blumeria) graminis, Helminthosporium teres, Septoria nodorum e Fusarium spp. su cereali, nel controllo di Phakopsora pachyrhizi su soia, nel controllo di Uromyces appendiculatus su fagiolo, nel controllo di Venturia inaequalis su melo, nel controllo di Sphaeroteca fuliginea su cetriolo.

In una forma preferita di realizzazione detti ceppi sono impiegati allo stato essiccato, liofilizzato, congelato, liquido.

Preferibilmente, la miscela di lieviti o la composizione fungicida comprendente i lieviti secondo l’invenzione da soli o in associazione à ̈ formulata in forma di polvere secca, polvere bagnabile, soluzione, dispersione o sospensione.

Ulteriore oggetto della presente invenzione à ̈ un metodo per il controllo di funghi fitopatogeni, anche micotossigeni, in colture agricole, che consiste nell’applicazione pre- o post-raccolta di dosi efficaci di Rhodosporidium kratochvilovae siglato DBVPG 26P, e/o di Cryptococcus laurentii siglato DBVPG 31P, utilizzati come tali o formulati in composizioni fungicide come sopra descritte.

Esempi di funghi fitopatogeni che si possono controllare e di colture che si possono proteggere con le suddette composizioni, sono quelli sopra riportati.

L’applicazione dei due nuovi ceppi di lievito, come tali o sotto forma di idonee composizioni, può avvenire su ogni superficie integra o ferita della pianta, per esempio su foglie, fiori, frutti, steli, gemme, rami e radici, oppure sui semi prima della semina (concia), oppure sul terreno in cui cresce la pianta.

I trattamenti in pieno campo, sia su foglie, fiori, frutti, steli e rami, sia su radici e sul terreno possono essere effettuati distribuendo i microorganismi come tali, o le loro composizioni, con i normali mezzi meccanici adibiti alla distribuzione dei prodotti antiparassitari.

I trattamenti su frutti durante la fase post-raccolta in celle di frigoconservazione possono essere effettuati applicando i microorganismi o le loro composizioni con i mezzi di distribuzione che normalmente sono usati dagli esperti del ramo.

Preferibilmente, la dose impiegata nelle applicazioni secondo il metodo di trattamento fungicida delle piante della presente invenzione à ̈ compresa tra 1 e 20 kg per ettaro di composizione contenente il ceppo o i ceppi di lievito.

Tale trattamento può essere di natura preventiva, curativa, eradicante.

La quantità di lievito da applicare per ottenere l’effetto desiderato può variare in funzione di diversi fattori quali, specie della coltura da preservare, stadio fenologico della coltura, tipo di patogeno/malattia, grado di infezione, condizioni climatiche, metodo di applicazione, formulazione adottata.

Le concentrazioni del/dei lievito/i da adottare sono preferibilmente comprese tra 1x10<6>e 1x10<8>UFC/ml. La concentrazione dipende dalla coltura da preservare, dal periodo fenologico, dal tipo di patogeno/malattia da combattere, dal grado di infezione, dalle condizioni climatiche, dal metodo di applicazione, dalla formulazione adottata.

La concentrazione delle cellule da adottare à ̈ più bassa, rispetto all’arte nota, quando i due nuovi lieviti vengono usati in miscela grazie alla complementarietà e alla sinergia che deriva dalla loro combinazione. Inoltre, la concentrazione delle cellule dei due nuovi lieviti da adottare nella miscela à ̈ più bassa, rispetto all’arte nota, quando essi vengono usati in combinazione con additivi e/o sostanze attive di sintesi, producendo così, a parità di efficacia fungicida, un notevole risparmio economico nella produzione della biomassa in fermentatore.

La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo due forme preferite di realizzazione con particolare riferimento ai seguenti esempi:

ESEMPIO 1: Isolamento e fermentazione del ceppo di Rhodosporidium kratochvilovae DBVPG 26P.

Il ceppo Rhodosporidium kratochvilovae DBVPG 26P à ̈ stato isolato da drupe di olive secondo la tecnica descritta da Wilson et al., 1993. Allo scopo, campioni (50 gr) di drupe di olive biologiche della cv Salegna, vengono posti in beute da 1000 ml contenenti 500 ml di acqua distillata sterile su agitatore rotativo a 23°C. Dopo 30 minuti, 100 µl dell’acqua di lavaggio si applicano direttamente in ferite artificiali di frutti che successivamente vengono inoculate con spore di patogeni fungini.

Dalle ferite in cui nei giorni seguenti non si sono sviluppate infezioni evidenti, si procede al reisolamento e alla purificazione in coltura dei microrganismi a probabile attività antagonistica e potenzialmente responsabili del mancato sviluppo della malattia. I microrganismi potenziali antagonisti selezionati vengono poi ulteriormente saggiati e caratterizzati per l’attività antifungina.

Per l’ottenimento della sospensione colturale del ceppo DBVPG 26P di Rhodosporidium kratochvilovae, beute di 5 litri contenenti il terreno colturale NYDB (Nutrient Broth 8 g/l, estratto di lievito 5g/l e Destrosio 10 g/l) sono innestate con 100 ml di una coltura overnight di sospensione del ceppo a concentrazione nota (1 x 10<5>CFU/ml). Le beute, cosi inoculate, vengono poste su un agitatore rotativo a 150 rpm (giri per minuto) e incubate a 23°C per 48 ore. Infine, le colture vengono centrifugate e il pellet dell’antagonista à ̈ risospeso in un’adeguata aliquota di acqua distillata sterile onde ottenere una concentrazione dell’antagonista sufficiente al fine applicativo.

ESEMPIO 2: Isolamento e fermentazione del ceppo di Cryptococcus laurentii siglato DBVPG 31P.

Cryptococcus laurentii siglato DBVPG 31P à ̈ stato isolato da frutti di melo cv Limongella, secondo la tecnica descritta da Wilson et al., 1993 analogamente a quanto descritto nell’Esempio 1.

ESEMPIO 3: Prove di efficacia dei ceppi Rhodosporidium kratochvilovae siglato DBVPG 26P e Cryptococcus laurentii siglato DBVPG 31P nel controllo di Blumeria (Erysiphae) graminis (mal bianco) su frumento duro.

Per l’ottenimento della sospensione colturale dei due ceppi DBVPG 26P di Rhodosporidium kratochvilovae e DBVPG 31P di Cryptococcus laurentii, beute da 5 litri contenenti il terreno colturale NYDB vengono inoculate con 100 ml di una coltura overnight di una sospensione del ceppo a concentrazione nota (1x10<5>CFU/ml) preparata in precedenza. Le beute, così inoculate, vengono poste su agitatore rotativo a 150 rpm (giri per minuto) e incubate a 23°C per 48 ore. Infine, le colture sono centrifugate onde recuperare le cellule dell’antagonista che vengono risospese in un adeguato volume di acqua distillata sterile per ottenere una concentrazione dell’antagonista pari a 1,5-5 x 10<6>CFU/ml.

I due microrganismi sono stati saggiati su coltura di frumento duro contro Blumeria graminis e sono stati applicati sia da soli sia in combinazione, utilizzando come confronto (a parità di concentrazioni) i ceppi LS11 e LS28 descritti nel WO2008/114304.

Le sospensioni degli antagonisti sono state applicate sulla superficie fogliare del frumento con un atomizzatore di precisione (pressione di esercizio 4 bar) irrorando l’equivalente di 400 l/ha. Gli esperimenti sono stati effettuati secondo uno schema a blocchi totalmente randomizzati in cui ogni tesi ha previsto 5 repliche e ogni replica era rappresentata da parcelle di 100 m<2>(10 x 10 m). I risultati di attività riguardanti il contenimento del mal bianco del frumento duro rispetto al testimone non trattato (applicazione di sola acqua) sono riportati in Tabella 1. In questa tabella, à ̈ riportata l’attività dei due ceppi di lievito utilizzati da soli o in combinazione tra loro (DBVPG 26P DBVPG 31P; LS11 LS28).

Per valutare gli effetti sinergici si à ̈ utilizzata: a) la formula di Colby: At= AA+ AB– AAxAB/100, in cui:

Atà ̈ l’attività teoricamente attesa per la miscela dei due componenti A B alla dose DA+ DB;

AAà ̈ l’attività rilevata per il componente A alla dose DA;

ABà ̈ l’attività rilevata per il componente B alla dose DB;

b) l’attività additiva: Aad= AA+ AB.

Se l’attività rilevata per la miscela (AAB) à ̈ superiore sia dell’attività teorica calcolata secondo Colby, sia dell’attività additiva, si à ̈ sicuramente in presenza di un effetto sinergico, tanto più forte quanto maggiore à ̈ il fattore di sinergia FS = AAB:At.

Tabella 1. Attività dei ceppi di lievito DBVPG 26P, DBVPG 31P, LS11, LS28 e loro combinazioni nel controllo di Blumeria graminis

Attività alle Attività Attività dosi: teorica additiva Lievito 5x10<6>CFU/ml At(FS) Aad1,5x10<6>CFU/ml

DBVPG 26P80─ ─

33 ─ ─

LS1150─ ─

15 ─ ─ DBVPG 31P90─ ─

40 ─ ─

LS2865─ ─

22 ─ ─ DBVPG 26P+

DBVPG 31P 90 59,8 (1.50) 73 (1,5+1,5)x10<6>

CFU/ml

LS11+LS28

(1,5+1,5)x10<6>

40 33,7 (1.18) 37

CFU/ml

In breve, i risultati hanno messo in evidenza quanto segue:

-il ceppo DBVPG 26P di Rhodosporidium kratochvilovae à ̈ decisamante più efficace del ceppo di Rhodotorula glutinis siglato LS11;

-il ceppo DBVPG 31P di Cryptococcus laurentii à ̈ più efficace del ceppo siglato LS28;

- la combinazione dei due ceppi DBVPG 26P DBVPG 31P, entrambi alla dose di 1,5x10<6>CFU/ml, à ̈ più efficace e presenta un effetto sinergico sensibilmente più elevato rispetto alla combinazione LS11 LS28 (descritti in WO2008/114304), entrambi alla dose di 1,5x10<6>CFU/ml. Inoltre, i risultati relativi agli esperimenti condotti per verificare il grado di degradazione della micotossina patulina determinato dagli agenti di lotta biologica, hanno sorprendentemente messo in evidenza un livello pari all’incirca al doppio della degradazione operata dal nuovo isolato DBVPG 26P di Rhodosporidium kratochvilovae, rispetto a quanto osservato per l’isolato LS11 di Rhodotorula glutinis riportato in WO2008/114304.

Claims (15)

1. RIVENDICAZIONI 1. Ceppo di lievito appartenente alla specie Rhodosporidium kratochvilovae avente numero di deposito DBVPG 26P.
2. 2. Ceppo di lievito appartenente alla specie Cryptococcus laurentii avente numero di deposito DBVPG 31P.
3. 3. Miscela comprendente o consistente nei ceppi di lievito come definiti secondo le rivendicazioni 1 e 2.
4. 4. Composizione fungicida caratterizzata dal fatto di comprendere un ceppo di lievito secondo la rivendicazione 1 o 2 o una loro miscela come definita nella rivendicazione 3 come principio attivo, insieme ad altri adiuvanti e/o eccipienti fitofarmacologicamente accettabili.
5. 5. Composizione fungicida secondo la rivendicazione 4, in cui detti ceppi quando presenti in miscela sono in un rapporto reciproco compreso tra 4:1 e 1:4.
6. 6. Composizione fungicida secondo ognuna delle rivendicazioni 4-5, in cui detti ceppi sono presenti ad una concentraz<6 8>ione compresa tra 5x10 UFC/ml e 1x10 UFC/ml,<7>preferibilmente compresa tra 5x10 UFC/ml e 1x10<8>UFC/ml.
7. 7. Composizione secondo ognuna delle rivendicazioni 4-6, caratterizzata dal fatto di comprendere almeno un ulteriore principio attivo scelto tra fungicida, fitoregolatore, antibiotico, erbicida, acaricida, insetticida, fertilizzante, additivo alimentare, antiossidante e/o loro miscele.
8. 8. Uso di un ceppo di lievito secondo la rivendicazione 1 o 2 o della miscela secondo la rivendicazione 3, o della composizione secondo ognuna delle rivendicazioni 4-7 come fungicida per il controllo di funghi fitopa togeni, anche micotossigeni, in colture agricole.
9. 9. Uso secondo la rivendicazione 8, in cui detti funghi fitopatogeni anche micotossigeni sono scelti dal gruppo che consiste in Basidiomiceti, Ascomiceti, Deuteromiceti o funghi imperfetti, Oomiceti: Puccinia spp., Ustilago spp., Tilletia spp., Uromyces spp., Claviceps purpurea, Phakopsora spp., Rhizoctonia spp., Sclerotium rolfsii, Sclerotium cepivorum, Erysiphe spp., Sphaerotheca spp., Podosphaera spp., Uncinula spp., Helminthosporium spp., Rhynchosporium spp., Pyrenophora spp., Aspergillus spp., Botrytis spp., Monilinia spp., Sclerotinia spp., Rhizopus spp., Mucor spp., Septoria spp. (Mycosphaerella spp.), Phaeosphaeria spp., Venturia spp., Alternaria spp., Fusarium spp., Cercospora spp., Cladosporium spp., Phoma spp., Cercosporella herpotrichoides, Colletotrichum spp., Pyrenochaeta lycopersici, Pyricularia oryzae, Sclerotium spp., Ascochyta spp., Albugo spp., Phytophthora spp., Pythium spp., Plasmopara viticola, Thielaviopsis basicola, Diaporthe spp, Peronospora spp., Pseudoperonospora cubensis, Bremia lactucae, Penicillium spp., Cladosposium spp., Stemphylium spp., Leveillula taurica.
10. 10. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni 8-9, in cui dette colture sono scelte dal gruppo che consiste in colture di cereali, fruttifere, agrumi, leguminose, orticole, cucurbitacee, piante oleaginose, tabacco, caffà ̈, tà ̈, cacao, barbabietola da zucchero, canna da zucchero, cotone.
11. 11. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni 8-10, caratterizzato dal fatto che i ceppi sono allo stato essiccato, liofilizzato, congelato, liquido.
12. 12. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni 8-11, caratterizzato dal fatto che la miscela o composizione à ̈ formulata in forma di polvere secca, polvere bagnabile, soluzione, dispersione o sospensione.
13. 13. Metodo per il controllo di funghi fitopatogeni in colture agricole mediante l’applicazione pre- o postraccolta di un ceppo di lievito come definito secondo ognuna delle rivendicazioni 1 o 2, o di una loro miscela come definita secondo la rivendicazione 3, o di una composizione come definita secondo ognuna delle rivendicazioni 4-7 come fungicida per il controllo di funghi fitopatogeni, anche micotossigeni, in colture agricole.
14. 14. Metodo secondo la rivendicazione 13, caratterizzato dal fatto che detta applicazione avviene su una superficie integra o ferita della pianta scelta tra frutti, foglie, fiori, steli, gemme, rami e radici, sui semi prima della semina, oppure sul terreno in cui cresce la pianta.
15. 15. Metodo secondo ognuna delle rivendicazioni 13-14, in cui la dose impiegata à ̈ compresa tra 1 e 20 kg per ettaro di composizione contenente il ceppo o i ceppi di lievito.