CN107513503A - 一种隐球酵母的分离纯化培养及鉴定方法 - Google Patents

一种隐球酵母的分离纯化培养及鉴定方法 Download PDF

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CN107513503A CN201710805920.4A CN201710805920A CN107513503A CN 107513503 A CN107513503 A CN 107513503A CN 201710805920 A CN201710805920 A CN 201710805920A CN 107513503 A CN107513503 A CN 107513503A
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汪光义
李清杰
王秋珍
白默涵
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Abstract

本发明公开一种隐球酵母的分离纯化培养及鉴定方法，主要包括制备分离培养基及液体培养基、分离纯化、DNA提取、扩增目的片段及测序以及对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收目的条带中的DNA片段，分析比对鉴定，所述目的片段测序结果与GeneBank中隐球酵母Cryptococcus albidus达到99％相似性。本发明能方便地从潮间带红树林腐败落叶样品中分离出隐球酵母，培养基成本低，分离操作简便。对于目前隐球酵母的分离来源多为陆地土壤、陆生植物及陆生植物果实，鲜见海洋底泥。此方法使其来源更多样化，填补了海洋潮间带红树林地区分离来源的空白。隐球酵母的DNA的提取和目的片段的扩增，未使用T载体连接，操作耗时较短。

Description

一种隐球酵母的分离纯化培养及鉴定方法
技术领域
本发明属于酵母类真菌分离培养技术领域，尤其涉及一种隐球酵母的分离纯化培养及鉴定方法。
背景技术
21世纪人类社会面临“人口剧增，资源匮乏，环境恶化”三大问题的严峻挑战，随着陆地资源的日趋减少，开发海洋，向海洋索取资源，尤其是海洋中蕴藏着巨大的微生物资源越来越受到人们关注，其中海洋真菌的研究日益增加。红树林来源的海洋真菌是目前研究得最多和最系统的海洋真菌。红树林群落在世界上面积不大，但其独特复杂的生态系统和丰富的生物多样性，蕴育了红树林微生物种群、遗传和生态功能的多样性，造就了次级代谢产物和生物活性物质的多样性。
隐球酵母，分类于隐球酵母科，归属于隐球酵母属。最早从陆地土壤、陆生植物以及陆生植物果实中分离得到，被发现具备高产油脂、多糖、辅酶、酶等特性，甚至有些菌株可以抑制致病菌生长作为某些食品保鲜剂。近些年，有研究人员从海洋底泥分离出隐球酵母，但从红树林分离到的菌株数量和种类很少，对海洋隐球酵母资源的开发还任重道远。因此，有必要建立更加便捷简单的从红树林分离鉴定隐球酵母菌株的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术不足，提供一种隐球酵母的分离纯化培养及鉴定方法。
本发明的技术方案是一种隐球酵母的分离纯化培养及鉴定方法，包括以下步骤：
步骤(1)、制备分离培养基：先称取葡萄糖20g、蛋白胨1.5g、酵母提取物1g、磷酸二氢钾0.25g、琼脂20g、人工海盐33g于锥形瓶中，再加入1L超纯水，然后玻璃棒搅拌并超声10-20分钟至完全溶解，115℃灭菌21分钟，待温度降至55±5℃，取至超净台内，加入10ml现配制的经0.22um滤膜过滤的抗生素混合液，摇匀，倒平板；
上述抗生素混合液制备方法是：称取氨苄西林0.5-1g，链霉素林0.5-1.5g，制霉菌素5-20mg，加超纯水10ml溶解，震荡超声10-20分钟至溶液澄清完全溶解；
步骤(2)、制备液体培养基：先称取葡萄糖2g，蛋白胨0.15g，酵母提取物0.1g，磷酸二氢钾0.025g，人工海盐3.3g于锥形瓶中，再加入100ml超纯水，然后用玻璃棒搅拌并超声5-10分钟至完全溶解，分装为2瓶50ml的体系，115℃灭菌21分钟；
步骤(3)、分离纯化：先用灭过菌的剪刀将采集的潮间带红树植物腐败落叶剪成直径0.5-1.5cm碎片,再用灭菌海冲水洗一遍,贴于上述步骤(1)制备分离培养基上,于28±1℃培养,培养3-5天后,显微观察菌株形态,将显微观察其形态为隐球酵母的单菌落，用接种环将其挑至新的分离培养基上划线纯化，培养长出单菌落后显微观察其形态，划线纯化培养2-4次，得到纯培养的隐球酵母单菌落；
步骤(4)、DNA提取：用接种环挑取纯化后的单菌落至上述步骤(2)制备液体培养基中，放入150-200rpm，28-30℃条件下的摇床中培养30-60小时后，在超净台内取5-10ml菌液至无菌的离心管中，4000r常温离心5分钟，去上清液；用10ml灭菌水洗菌体，4000r常温离心2分钟，去上清液，用植物基因组DNA试剂盒提取DNA；
步骤(5)、扩增目的片段及测序：针对18S rRNA序列，设计引物，目的片段为749-761bp，引物信息如下：
进行PCR扩增实验：反应体系：2×Taq PCR Master Mix 13μL、ddH2O 9μL、上游引物(8-10μM)1μL、下游引物(8-10μM)1μL、DNA 1μL；
PCR程序：90-95℃预变性5或10min；90-95℃变性1min，50-55℃退火50-60s，65-75℃延伸40-60s，30-40个循环；65-75℃终延伸15-25min；
步骤(6)、鉴定：对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收目的条带中的DNA片段。
所述目的片段测序结果与GeneBank中隐球酵母Cryptococcus albidus具有99％相似性。
有益效果
利用本发明的分离培养基和分离培养方法(松花粉法)能方便地从潮间带红树林腐败落叶样品中分离出隐球酵母，培养基成本低，分离操作简便。对于目前隐球酵母的分离来源多为陆地土壤、陆生植物及陆生植物果实，鲜见海洋底泥。此方法使其来源更多样化，填补了海洋潮间带红树林地区分离来源的空白。隐球酵母的DNA的提取和目的片段的扩增，未使用T载体连接，操作耗时较短。
附图说明
图1是实施例1琼脂糖凝胶电泳图。
图2是实施例2琼脂糖凝胶电泳图。
图3是实施例3琼脂糖凝胶电泳图。
图4是对比实施例1琼脂糖凝胶电泳图。
图5是对比实施例2琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。本发明的实施例是为了使本领域的技术人员更好地理解本发明，并不对本发明作任何的限制。
本发明为分离纯化和鉴定隐球酵母提供了技术支持。于2015年9月份采集浙江温州红树林地区采集的潮间带红树植物腐败落叶进行分离纯化培养。
实施例1：
一种隐球酵母的分离纯化培养及鉴定方法步骤如下：
A、配制分离培养基：先称取葡萄糖20g、蛋白胨1.5g、酵母提取物1g、磷酸二氢钾0.25g、琼脂20g、人工海盐33g于锥形瓶中，再加入1L超纯水，玻璃棒搅拌并超声20分钟至完全溶解，115℃灭菌21分钟，待温度降至55℃，取至超净台内，加入10ml现配制的经0.22um滤膜过滤的抗生素混合液，摇匀，倒平板，即得隐球酵母的分离培养基。
上述抗生素混合液制成方法：称取氨苄西林0.5g、链霉素林0.75g、制霉菌素10mg，加超纯水10ml溶解，震荡超声10分钟至溶液澄清完全溶解。
B、配制液体培养基：称取葡萄糖2g，蛋白胨0.15g，酵母提取物0.1g，磷酸二氢钾0.025g，人工海盐3.3g于锥形瓶中，加入100ml超纯水，玻璃棒搅拌并超声5分钟至完全溶解，分装为2瓶50ml的体系，115℃灭菌21分钟，即得培养隐球酵母的液体培养基。
C、从浙江温州红树林地区采集的潮间带红树植物腐败落叶，用灭过菌的剪刀将其剪成直径1.0cm碎片,用灭菌海冲水洗一遍,贴于上述的分离培养基上，于27℃培养，培养4天后,显微观察菌株形态,将显微观察其形态为隐球酵母的单菌落,用接种环将其挑至新的分离培养基上划线纯化，培养长出单菌落后显微观察其形态，划线纯化培养3次，得到15个纯培养的隐球酵母单菌落。
D、提取隐球酵母DNA：用接种环挑取纯化后的单菌落至上述液体培养基中，放入170rpm，28℃条件下的摇床中培养48小时后，在超净台内取10ml菌液至无菌的离心管中，4000r常温离心5分钟，去上清液；用10ml灭菌水洗菌体，4000r常温离心2分钟，去上清液，用植物基因组DNA试剂盒提取DNA；
E、扩增目的片段及测序，引物信息(如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示)如下：
上游引物：5'-GGGATCGAAGATGATTAG-3'
下游引物：5'-ccttgttacgacttcaccttcctct-3'
对提取的DNA进行PCR扩增实验：
反应体系：2×Taq PCR Master Mix 13μL、ddH2O 9μL、上游引物(8-10μM)1μL、下游引物(8-10μM)1μL、DNA 1μL；
PCR程序：95℃预变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，34个循环；72℃终延伸20min。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，跑胶结果如图1所示，并切胶后利用薄型琼脂糖DNA回收试剂盒回收目的条带中的DNA片段，碱基长度为754bp。经blast分析，本实施例测序结果与GeneBank中隐球酵母Cryptococcus albidus具有99％相似性，GeneBank中隐球酵母Cryptococcus albidus，如SEQ ID NO:3所示。
实施例2：
一种隐球酵母的分离纯化培养及鉴定方法步骤如下：
A、配制分离培养基：先称取葡萄糖20g、蛋白胨1.5g、酵母提取物1g、磷酸二氢钾0.25g、琼脂20g、人工海盐33g于锥形瓶中，再加入1L超纯水，玻璃棒搅拌并超声15分钟至完全溶解，115℃灭菌21分钟，待温度降至60℃，取至超净台内，加入10ml现配制的经0.22um滤膜过滤的抗生素混合液，摇匀，倒平板，即得隐球酵母的分离培养基。
上述抗生素混合液制成方法：称取氨苄西林1g、链霉素林0.5g、制霉菌素20mg，加超纯水10ml溶解，震荡超声20分钟至溶液澄清完全溶解。
B、配制液体培养基：称取葡萄糖2g，蛋白胨0.15g，酵母提取物0.1g，磷酸二氢钾0.025g，人工海盐3.3g于锥形瓶中，加入100ml超纯水，玻璃棒搅拌并超声10分钟至完全溶解，分装为2瓶50ml的体系，115℃灭菌21分钟，即得培养隐球酵母的液体培养基。
C、从浙江温州红树林地区采集的潮间带红树植物腐败落叶，用灭过菌的剪刀将其剪成直径1.5cm碎片,用灭菌海冲水洗一遍,贴于上述的分离培养基上，于28℃培养，培养3天后,显微观察菌株形态,将显微观察其形态为隐球酵母的单菌落,用接种环将其挑至新的分离培养基上划线纯化，培养长出单菌落后显微观察其形态，划线纯化培养4次，得到9个纯培养的隐球酵母单菌落。
D、提取隐球酵母DNA：用接种环挑取纯化后的单菌落至上述液体培养基中，放入200rpm，30℃条件下的摇床中培养60小时后，在超净台内取8ml菌液至无菌的离心管中，4000r常温离心5分钟，去上清液；用10ml灭菌水洗菌体，4000r常温离心2分钟，去上清液，用植物基因组DNA试剂盒提取DNA；
E、扩增目的片段及测序，引物信息(如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示)如下：
上游引物：5'-GGGATCGAAGATGATTAG-3'
下游引物：5'-CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT-3'
对提取的DNA进行PCR扩增实验：
反应体系：2×Taq PCR Master Mix 13μL、ddH2O 9μL、上游引物(8-10μM)1μL、下游引物(8-10μM)1μL、DNA 1μL；
PCR程序：95℃预变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，34个循环；72℃终延伸20min。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，跑胶结果如图2所示，并切胶后利用薄型琼脂糖DNA回收试剂盒回收目的条带中的DNA片段，碱基长度为761bp。经blast分析，本实施例测序结果与GeneBank中隐球酵母Cryptococcus albidus具有99％相似性，如SEQ ID NO:3所示。
实施例3：
一种隐球酵母的分离纯化培养及鉴定方法步骤如下：
A、配制分离培养基：先称取葡萄糖20g、蛋白胨1.5g、酵母提取物1g、磷酸二氢钾0.25g、琼脂20g、人工海盐33g于锥形瓶中，再加入1L超纯水，玻璃棒搅拌并超声10分钟至完全溶解，115℃灭菌21分钟，待温度降至50℃，取至超净台内，加入10ml现配制的经0.22um滤膜过滤的抗生素混合液，摇匀，倒平板，即得隐球酵母的分离培养基。
上述抗生素混合液制成方法：称取氨苄西林0.75g、链霉素林1.5g、制霉菌素5mg，加超纯水10ml溶解，震荡超声15分钟至溶液澄清完全溶解。
B、配制液体培养基：称取葡萄糖2g，蛋白胨0.15g，酵母提取物0.1g，磷酸二氢钾0.025g，人工海盐3.3g于锥形瓶中，加入100ml超纯水，玻璃棒搅拌并超声10分钟至完全溶解，分装为2瓶50ml的体系，115℃灭菌21分钟，即得培养隐球酵母的液体培养基。
C、从浙江温州红树林地区采集的潮间带红树植物腐败落叶，用灭过菌的剪刀将其剪成直径0.5cm碎片,用灭菌海冲水洗一遍,贴于上述的分离培养基上，于29℃培养，培养5天后,显微观察菌株形态,将显微观察其形态为隐球酵母的单菌落,用接种环将其挑至新的分离培养基上划线纯化，培养长出单菌落后显微观察其形态，划线纯化培养2次，得到8个纯培养的隐球酵母单菌落。
D、提取隐球酵母DNA：用接种环挑取纯化后的单菌落至上述液体培养基中，放入150rpm，30℃条件下的摇床中培养30小时后，在超净台内取5ml菌液至无菌的离心管中，4000r常温离心5分钟，去上清液；用10ml灭菌水洗菌体，4000r常温离心2分钟，去上清液，用植物基因组DNA试剂盒提取DNA。
E、扩增目的片段及测序，引物信息(如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示)如下：
上游引物：5'-GGGATCGAAGATGATTAG-3'
下游引物：5'-CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT-3'
对提取的DNA进行PCR扩增实验：
反应体系：2×Taq PCR Master Mix 13μL、ddH2O 9μL、上游引物(8-10μM)1μL、下游引物(8-10μM)1μL、DNA 1μL；
PCR程序：95℃预变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，34个循环；72℃终延伸20min。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，跑胶结果如图3所示，并切胶后利用薄型琼脂糖DNA回收试剂盒回收目的条带中的DNA片段，碱基长度为749bp。经blast分析，本实施例测序结果与GeneBank中隐球酵母Cryptococcus albidus具有99％相似性，如SEQ ID NO:3所示。
对比实施例1
一种隐球酵母的分离纯化培养及鉴定方法步骤如下：
A、配制分离培养基：先称取葡萄糖20g、蛋白胨1.5g、酵母提取物1g、磷酸二氢钾0.25g、琼脂20g、人工海盐33g于锥形瓶中，再加入1L超纯水，玻璃棒搅拌并超声10分钟至完全溶解，115℃灭菌21分钟，待温度降至50℃，取至超净台内，加入10ml现配制的经0.22um滤膜过滤的抗生素混合液，摇匀，倒平板，即得隐球酵母的分离培养基。
上述抗生素混合液制成方法：称取氨苄西林0.75g、链霉素林1.5g、制霉菌素5mg，加超纯水10ml溶解，震荡超声15分钟至溶液澄清完全溶解。
B、配制液体培养基：称取葡萄糖2g，蛋白胨0.15g，酵母提取物0.1g，磷酸二氢钾0.025g，人工海盐3.3g于锥形瓶中，加入100ml超纯水，玻璃棒搅拌并超声10分钟至完全溶解，分装为2瓶50ml的体系，115℃灭菌21分钟，即得培养隐球酵母的液体培养基。
C、从浙江温州红树林地区采集的潮间带红树植物腐败落叶，用灭过菌的剪刀将其剪成直径0.5cm碎片,用灭菌海冲水洗一遍,贴于上述的分离培养基上，于29℃培养，培养5天后,显微观察菌株形态,将显微观察其形态为隐球酵母的单菌落,用接种环将其挑至新的分离培养基上划线纯化，培养长出单菌落后显微观察其形态，划线纯化培养3次，得到8个纯培养的隐球酵母单菌落。
D、提取隐球酵母DNA：用接种环挑取纯化后的单菌落至上述液体培养基中，放入200rpm，30℃条件下的摇床中培养60小时后，在超净台内取8ml菌液至无菌的离心管中，4000r常温离心5分钟，去上清液；用10ml灭菌水洗菌体，4000r常温离心2分钟，去上清液，用植物基因组DNA试剂盒提取DNA。
E、扩增目的片段及测序，18S通用引物引物信息如下：
上游引物18S001：5'-AACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3'
下游引物18S13：5'-CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT-3'
对提取的DNA进行PCR扩增实验：反应体系：2×Taq PCR Master Mix 13μL、ddH2O9μL、上游引物(8-10μM)1μL、下游引物(8-10μM)1μL、DNA 1μL；PCR程序：95℃预变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，34个循环；72℃终延伸20min。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，跑胶结果如图4所示，未见目的条带，可见18S通用引物不合适。
对比实施例2
一种隐球酵母的分离纯化培养及鉴定方法步骤如下：
A、配制分离培养基：先称取葡萄糖20g、蛋白胨1.5g、酵母提取物1g、磷酸二氢钾0.25g、琼脂20g、人工海盐33g于锥形瓶中，再加入1L超纯水，玻璃棒搅拌并超声10分钟至完全溶解，115℃灭菌21分钟，待温度降至50℃，取至超净台内，加入10ml现配制的经0.22um滤膜过滤的抗生素混合液，摇匀，倒平板，即得隐球酵母的分离培养基。
上述抗生素混合液制成方法：称取氨苄西林0.75g、链霉素林1.5g、制霉菌素5mg，加超纯水10ml溶解，震荡超声15分钟至溶液澄清完全溶解。
B、配制液体培养基：称取葡萄糖2g，蛋白胨0.15g，酵母提取物0.1g，磷酸二氢钾0.025g，人工海盐3.3g于锥形瓶中，加入100ml超纯水，玻璃棒搅拌并超声10分钟至完全溶解，分装为2瓶50ml的体系，115℃灭菌21分钟，即得培养隐球酵母的液体培养基。
C、从浙江温州红树林地区采集的潮间带红树植物腐败落叶，用灭过菌的剪刀将其剪成直径0.5cm碎片,用灭菌海冲水洗一遍,贴于上述的分离培养基上，于29℃培养，培养5天后,显微观察菌株形态,将显微观察其形态为隐球酵母的单菌落,用接种环将其挑至新的分离培养基上划线纯化，培养长出单菌落后显微观察其形态，划线纯化培养3次，得到8个纯培养的隐球酵母单菌落。
D、提取隐球酵母DNA：用接种环挑取纯化后的单菌落至上述液体培养基中，放入200rpm，30℃条件下的摇床中培养60小时后，在超净台内取8ml菌液至无菌的离心管中，4000r常温离心5分钟，去上清液；用10ml灭菌水洗菌体，4000r常温离心2分钟，去上清液，用植物基因组DNA试剂盒提取DNA。
E、扩增目的片段及测序，18S通用引物引物信息如下：
上游引物LABY-A：5'-GGGATCGAAGATGATTAG-3'
下游引物LABY-B：5'-CWCRAACTTCCTTCCGGT-3'
对提取的DNA进行PCR扩增实验：反应体系：2×Taq PCR Master Mix 13μL、ddH2O9μL、上游引物(8-10μM)1μL、下游引物(8-10μM)1μL、DNA 1μL；PCR程序：95℃预变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，34个循环；72℃终延伸20min。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，跑胶结果如图5所示，未见目的条带，可见此引物不合适。
应当理解的是，这里所讨论的实施方案及实例只是为了说明，对本领域技术人员来说，可以加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种隐球酵母的分离纯化培养及鉴定方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical sequence)
<400> 1
gggatcgaag atgattag 18
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical sequence)
<400> 2
ccttgttacg acttcacctt cctct 25
<210> 3
<211> 746
<212> DNA
<213> 浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus )
<400> 3
gggggggtct acgtactatg ccgactaggg acgggccatg ttcaactttt gactggctcg 60
gcaccttacg agaaatcaaa gtctttgggt tctgggggga gtatggtcgc aaggctgaaa 120
cttaaaggaa ttgacggaag ggcaccacca ggcgtggagc ctgcggctta atttgactca 180
acacggggaa actcaccagg tccagacata gtaaggattg acagattgat agctctttct 240
tgattctatg ggtggtggtg catggccgtt cttagttggt ggagtgattt gtctggttaa 300
ttccgataac gaacgagacc ttaacctgct aaatagaccg gtcggctttt gctggccgct 360
gtcttcttag agggactaac agcgtttagc tgttggaagt ttgaggcaat aacaggtctg 420
tgatgccctt agatgttctg ggccgcacgc gcgctacact gactgagcca gcgagtttat 480
aaccttgacc gaaaggcctg ggtaatcttg tgaaactcag tcgtgctggg gatagagcat 540
tgcaattatt gctcttcaac gaggaatgcc tagtaagcgc aagtcatcag cttgcgttga 600
ttacgtccct gccctttgta cacaccgccc gtcgctacta ccgattgaat ggcttagtga 660
gatctccgga ttggctttgg gaagctggca acggctacct attgctgaga agctgatcaa 720
acttggtcat ttagaggaag gtgaag 746

Claims (2)

1.一种隐球酵母的分离纯化培养及鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)、制备分离培养基：先称取葡萄糖20g、蛋白胨1.5g、酵母提取物1g、磷酸二氢钾0.25g、琼脂20g、人工海盐33g于锥形瓶中，再加入1L超纯水，然后玻璃棒搅拌并超声10-20分钟至完全溶解，115℃灭菌21分钟，待温度降至55±5℃，取至超净台内，加入10ml现配制的经0.22um滤膜过滤的抗生素混合液，摇匀，倒平板；
上述抗生素混合液制备方法是：称取氨苄西林0.5-1g，链霉素林0.5-1.5g，制霉菌素5-20mg，加超纯水10ml溶解，震荡超声10-20分钟至溶液澄清完全溶解；
步骤(2)、制备液体培养基：先称取葡萄糖2g，蛋白胨0.15g，酵母提取物0.1g，磷酸二氢钾0.025g，人工海盐3.3g于锥形瓶中，再加入100ml超纯水，然后用玻璃棒搅拌并超声5-10分钟至完全溶解，分装为2瓶50ml的体系，115℃灭菌21分钟；
步骤(3)、分离纯化：先用灭过菌的剪刀将采集的潮间带红树植物腐败落叶剪成直径0.5-1.5cm碎片,再用灭菌海冲水洗一遍,贴于上述步骤(1)制备分离培养基上,于28±1℃培养,培养3-5天后,显微观察菌株形态,将显微观察其形态为隐球酵母的单菌落，用接种环将其挑至新的分离培养基上划线纯化，培养长出单菌落后显微观察其形态，划线纯化培养2-4次，得到纯培养的隐球酵母单菌落；
步骤(4)、DNA提取：用接种环挑取纯化后的单菌落至上述步骤(2)制备液体培养基中，放入150-200rpm，28-30℃条件下的摇床中培养30-60小时后，在超净台内取5-10ml菌液至无菌的离心管中，4000r常温离心5分钟，去上清液；用10ml灭菌水洗菌体，4000r常温离心2分钟，去上清液，用植物基因组DNA试剂盒提取DNA；
步骤(5)、扩增目的片段及测序：针对18S rRNA序列，设计引物，目的片段为749-761bp，引物信息如下：
进行PCR扩增实验：反应体系：2×Taq PCR Master Mix 13μL、ddH2O 9μL、上游引物(8-10μM)1μL、下游引物(8-10μM)1μL、DNA 1μL；
PCR程序：90-95℃预变性5或10min；90-95℃变性1min，50-55℃退火50-60s，65-75℃延伸40-60s，30-40个循环；65-75℃终延伸15-25min；
步骤(6)、鉴定：对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收目的条带中的DNA片段，分析比对。
2.根据权利要求所述的方法，其特征在于，所述目的片段测序结果与GeneBank中隐球酵母Cryptococcus albidus达到99％相似性。
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