WO2020140163A1 - Una formulación para la protección contra la bacteriosis del kiwi, causada por la bacteria pseudomonas syringae pv. actinidiae (psa) - Google Patents

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kiwi
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Ernesto MOYA ELIZONDO
Braulio RUIZ SEPULVEDA
Juan SAN MARTIN MEDINA
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Universidad de Concepción
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas

Definitions

  • the present invention is related to the agro-industry, in particular with the Kiwi cultivation industry, this invention generates protection against Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) during plant development, especially during flowering.
  • Psa Pseudomonas syringae pv. actinidiae
  • antibiotics and chemical resistance inducers such as acibenzolar-S-Metil (Bion ® or Actigard®) allow to cover critical phenological periods of the plant, but they are not recommended for use in organic farms, which in Chile are the ones that show the highest profitability.
  • Antibiotics for use in agriculture are banned in different destination markets for export kiwi, and the use of antibiotics and chemical resistance inducers such as acibenzolar-S-methyl cannot be used in flowering.
  • Patents related to the use of bacteria that produce 2,4-DAPG are associated with the treatment of seeds for the control of fungi that affect the roots of wheat or grass or the biosynthesis of the compounds that these bacteria produce or mechanisms to evaluate the activation of genes associated with the production or expression of genes in this type of bacteria.
  • Patent application WO2013 / 121248 Novel Pseudomonas f ⁇ uorescens strain and uses thereof in the biological control of bacterial or fungal diseases, in which a strain of P. f ⁇ uorescens is disclosed, deposited under registration number DSM 25556, which acts as a control biological versus strains Bacterial and fungal pathogens, the prevention method and a formulation are also disclosed.
  • Novozymes AS (Denmark). A new strain of Pseudomonas deposited under registration number DSM 21663 is presented. It promotes plant growth and produces antibiotics like 2, 4-d iaceti If lorog I uci nol (DAPG); pyrrolnitrin (PRN) and indole-3-acetic acid (IAA). The strain has the ability to suppress the action of pathogens of bacterial and fungal origin.
  • Invention patent KR20100115659 Antibiotics for bacterial canker of citrus from drug resistance Pseudomonas aeruginosa No3 and antibiotics, and its application, from the Industrial Foundation of Chonnam National University, Korea.
  • This application discloses the use of a yeast Aureobasidium pullulans, named YBCA5, as a biocontroller of bacteria of the species Pseudomonas spp. among which Pseudomonas syringae pv actinidiae is mentioned, also indicating its use in Kiwi plants.
  • Patent application CL201603401 Wild bacterial strain Pseudomonas proteos CAO 2 as a bacterial biofungicide for the control of Botrytis cinérea ⁇ other phytopathogenic fungi, from the University of Santiago de Chile.
  • a strain is disclosed with registration number RGM 2342 which is used for the control of fungal infections caused by phytopathogenic fungi in plants. 6.
  • Figure 1 Diagram of the different modes of action of the formulation in kiwi plants.
  • FIG. 4 Area under the disease progress curve (AUDPC) in leaves of Actinidia loving seedlings (green kiwi) after 30 days of being inoculated with PSA and treated with different Chilean isolates of Pseudomonas protegens that possess the phiD + gene. associated with the production of 2,4-DAPG and the antibiotic product Streptoplus®.
  • Figure 6 Actinidia beloved plants after 21 days of being inoculated with Psa. One only treated with water (left) and the other one induced with Pseudomonas protegens strain Ca2 (right).
  • Figure 7 Effect of resistance induction of treatments applied to foliage based on acibenzolar-S-methyl (Bion® 50WG) and two strains of bacteria Pseudomonas protegens in the control of Psa in green kiwi ⁇ Actinidia delicious) expressed as integration in the area under the disease progress curve (AUDPC) after 30 days of evaluation.
  • AUDPC disease progress curve
  • Figure 8 Effect of resistance induction of treatments applied to foliage based on acibenzolar-S-methyl (Bion® 50WG) and two strains of Pseudomonas protegens bacteria in the control of Psa in green kiwi ⁇ Actinidia delicious) expressed as number of necrotic spots on the leaves at three evaluation dates after being inoculated by Psa except for white.
  • Figure 9 Effect of resistance induction of treatments applied to the root based on acibenzolar-S-methyl (Bion® 50WG) and two strains of Pseudomonas protegens bacteria in the control of Psa in green kiwi (Actinidia delicious) expressed as the integration in the area under the disease progress curve (AUDPC) after 30 days of evaluation.
  • Figure 10 Effect of resistance induction of treatments applied to the root based on acibenzolar-S-methyl (Bion® 50WG) and two strains of bacteria Pseudomonas protegens in the control of Psa in green kiwi (Actinidia delicious) expressed as number of necrotic spots on the leaves at three evaluation dates after being inoculated by Psa except for white.
  • Figure 11 Relative expression of 10 defense genes in seedlings of Actinidia delight in plants inoculated with foliage (H) or root (R) with the antagonist bacteria and the chemical inducer Acibenzolar-S-methyl (Bion 50 WP, in doses of 0.2 g L 1 ) after 1 day (ID), 7 days (7D) and 15 days (15D) after spraying, for each gene compared to its non-inoculated control.
  • Figure 12 Relative expression of 4 defense genes in A. chinensis seedlings in plants inoculated with foliage with bacteria Pseudomonas protegens, Pantoea spp. (Strains AB411 and API 13), the chemical inducer Bion® 50 WP, in doses of 0.2 g L_1 , and P. syringae pv. actinidiae (PSA) after 1 (A) and 7 (B) days after spraying, compared to its non-inoculated control.
  • Pseudomonas protegens Pantoea spp.
  • Figure 13 Percentage of severity of damage observed after 7 days on leaves of 2-year-old plants of kiwi cv. Hayward who had been treated to the foliage twice with Pseudomonas protegens and other treatments in San Carlos, ⁇ uble Region, during the 2016-2017 season.
  • Figure 14 Number of necrotic spots observed after 7 days on leaves of adult plants of kiwi cv. Hayward who had been treated to the foliage twice with Pseudomonas protegens other treatments in San Carlos, ⁇ uble Region, during the 2016-2017 season. Disclosure of the invention
  • the present technology corresponds to a formulation based on strains of Pseudomona protegens that allows protection against kiwi bacteriosis, caused by the bacteria Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa).
  • this formulation can directly protect against bacteria, activate defense genes present in plants, which translates into a systemic signal that will protect the entire plant for around 7 to 14 days, and will colonize the interior of it, reducing the systemic damage generated by the Psa, allowing to generate protection during the development of the crop, especially during flowering, which will reduce the damage caused by the disease, and which will ultimately result in higher yields in the garden.
  • the strains used in the formulation correspond to Pseudomona protegens strain ChC7 and Pseudomona protegens strain Ca2, both deposited in the Chilean Collection of Microbial Genetic Resources, with the numbers of deposits RGM 2328 and RGM 2329 respectively. Both deposits were made on September 30, 2016.
  • strains were selected from a group of 48 strains for their characteristics of potential biocontroller on the pathogenic species, this exceptional capacity found in the two strains chosen give a distinctive feature to the formulation presented.
  • the bacteria with which this proposal is being worked are genetically sequenced in the 16S ribosomal RNA gene, and correspond to species of Pseudomonas protegens that have mutations in their genomic sequence that make them different from other species described in the sequence of genes existing worldwide.
  • these strains have demonstrated ability to solubilize immobilized phosphorus, produce indole acetic acid and other biosurfactant properties, which are not common characteristics of isolates of the same species, such as P. protegens strain Pf5 isolated in the United States (Paulsen et al ., 2005; Ramette et al., 2011).
  • the Chilean strains inhibit Psa under in vitro conditions, while the Pf5 strain does not.
  • the formulation comprises a liquid bacterial suspension> 10 7 CFU mL 1 obtained from the fermentation of the bacterial strains in King B (KB) liquid medium for 24 hours at 24 ° C and 150 rpm of agitation.
  • a 10 pL aliquot of the original strain of the bacteria is taken, which is kept in 20% glycerol at -80 ° C, and it is placed to grow in 10 mL of KB medium for 24 hours and then inoculate with 2 mL. of this suspension ( ⁇ 10 7 CFU mL _1 ) per 100 mL.
  • This formulation has a proven effectiveness in the control of Psa when applied in concentrations between 6% and 50% diluted in water. It must be prepared fresh for each application, but it can be kept refrigerated at 4 ° C for 5 to 7 days, in which the bacteria survive.
  • This formulation or bioproduct can be applied alone or in combination with other biocontrollers, whose mode of action is competition for spaces, improving control efficiency and differentiating itself from other products on the market.
  • its application in autumn, prior to leaf fall allows to cover the wounds left by the leaves when they fall and which are a source of entry for Psa and other phytopathogenic bacteria of the genus Pseudomonas, favoring endophytic colonization on twigs and trunk of plants adults during winter.
  • Figure 1 shows the model of action of the formulation when used together with another biocontroller, in A) the formulation is presented in combination with another product; B) spraying this formulation allows: direct antibiosis, induction of resistance, endophytic colonization and competition by tissues; C) the generated signal is transported through the plant; D) this generates an Activated Systemic Resistance (SAR); E) that results in the inhibition of Psa infection; F) there is protection during the flowering period; G) which translates into higher yield and less incidence of PSA in organic and conventional gardens.
  • SAR Systemic Resistance
  • the recommendation of application of this product, due to its protection characteristics, should be according to the following model: a) In autumn: post-harvest application, allows endophytic colonization, and application during leaf fall, allows protection of wounds that have occurred during this process. b) In winter: application of the product that allows the colonization of the vines in the trunk. c) In spring: i) application at the beginning of the outbreak, this allows the colonization of the new tissue; I) alternate applications during vegetative growth, allows antibiosis and resistance induction; i ⁇ ) application in bloom, allows the protection of the flower.
  • Example 1 Selection of beneficial strains for the elaboration of a bioproduct against Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa).
  • SAG authorization was obtained to work with the Psa bacteria and a protocol was established from kiwi seeds A. deliciosa var. Hayward allowed to obtain kiwi plants with 5 non-cotyledon leaves in 3 to 4 months to make evaluation tests with the Psa strain 105743 obtained by the SAG.
  • the seeds were treated with a 2500 ppm solution of gibberellins (Giberplus® SP, Anasac) for 24 h prior to sowing in Petri dishes with water agar, where they were kept at room temperature until germinated. Once germinated, they were transplanted into trays with peat and perlite substrate in a ratio of 2: 1 m / m, to which 4 gL 1 of the Multicote extended-release mono-granule fertilizer (Anasac) was added, remaining in the trays until reaching their third leaf, to be transplanted into 1000 cm 3 pots. The plants during their development were kept in a growth room under controlled conditions of constant temperature of 20 ° C and photoperiod of 14 hours of light: 10 hours of darkness delivered by artificial light LED in wavelength red, blue, yellow and white .
  • gibberellins Gibberplus® SP, Anasac
  • the pathogenic bacteria were inoculated by spraying eight mL of the bacterial suspension at a concentration greater than 10 8 CFU mL 1 over the entire foliage of the plant. Twenty-four hours before and after inoculation of the antagonistic bacteria and PSA, to the foliage, the plants were kept in an environment of 80% relative humidity and 20 ° C, in order to encourage the opening of the stomata in order to facilitate the entry of bacteria into plants.
  • necrotic spot count per leaf was considered and a visual estimation of the percentage of the leaf area affected by the disease was made.
  • the first antibiosis experiment it was evaluated at 8, 20 and 30 days, while in the second trial and in resistance induction it was evaluated at 7, 14 and 21 days.
  • Treatments were arranged in a completely randomized design within the growth room, considering four replications. With the leaf damage percentage values, the area under the disease progress curve (AUDPC) was calculated, which represents the accumulated value of damage achieved by the plants throughout the three evaluations carried out.
  • the data on the number of spots were transformed to Logio (data + 1).
  • the antimicrobial and Psa bacteria were cultured in King B or LB broth medium at 25 ° C for 24 h with stirring at 200 rpm until bacterial suspensions of a concentration greater than 10 8 CFU mL 1 of each were obtained, which were centrifuged by 5 min at 6000 rpm in a centrifuge to remove the supernatant and replace it with a saline solution (0.89 g L_1 ), then each treatment was mixed with Psa in a 1: 1 v / v ratio, to be sprayed with 14 mL of mixture on each floor.
  • control evaluation based on resistance induction was carried out evaluating the capacity of the Ca2, Ca5 and ChC7 strains to protect from Psa infection by inducing resistance when applied to foliage and plant roots. of kiwi.
  • the pre-treatment with sterile distilled water and the application of the commercial acibenzolar-S-methyl elicitor (Bion® 50WG, Syngenta, Chile) in the dose of 15 g hL _1 were considered as control treatment.
  • 5 mL were sprayed on the abaxial side of two fully expanded young leaves on each plant, which was performed in an isolated chamber to avoid drift from bacterial suspensions.
  • 2,4-DAPG which have shown antibiosis activity on Psa, in its ability to induce resistance for Psa control.
  • Bion 50WP and a water control was observed, that applied to the foliage, Bion® 50WP had gene expression patterns similar to those generated by the Ca2 strain, increasing the expression of the prl, PAL, prf, TLP1 and / ox genes.
  • the ChC7 strain had an over-expression in time of the Bion® 50WG-like pr4 gene.
  • the increase in the expression of the tox gene is associated with responses of induced systemic resistance (SAR) and production of peroxidases, being relatively high in kiwi plants treated with the chemical inducer and both bacteria, the same was observed for the pr4 genes, associated with the production of chitinases and prl, associated with the production of antifungal compounds and the ICS1 gene, which is associated with the initial stage in the production of salicylic acid, which is the precursor in SAR responses.
  • SAR systemic resistance
  • Psa had low gene expression, increasing the expression of the TLP1 gene, whose expression was not different from that achieved by the CalO and ChB7 strains.
  • Bion® 50 WG increased the expression of the prl gene by 60 times, with respect to the control, followed by the strain ChC7, Ca6, PSA and API 13.
  • the expression of the PAL and ICS1 gene was low for all bacteria, while that the expression of the TLP1 gene had its highest expression in the ChC7, PSA, Ca2, Ca6 and Bion® 50 WG strain.
  • Example 2 Preparation of formulation from 2,4-DAPG-producing Pseudomonas.
  • the survival rate to lyophilisate of the CalO, ChB7, Ca2 and Ca6 strains was evaluated, for this, the bacteria multiplied in King B broth, they were concentrated, washed in saline solution, and centrifuged prior to a lyophilization process for 48 hours. ° C in vacuo until the samples reached a powdery appearance. After lyophilisate, the sample was suspended in 1 mL of saline and the CFU mL 1 was again determined for each bacterial strain.
  • the lyophilized process reduced the populations of the CalO and ChB7 strains by two thirds exponentially, while there were no bacteria surviving the process for the Ca2 and Ca6 strains, therefore a lyophilized process would not be suitable to formulate P. protegens strains .
  • a 1: 1 mixture of 10% w / v peptone and 10% w / v sodium glutamate was evaluated as a cryoprotectant for bacteria.
  • the use of the cryoprotectant resulted in an increase in the lyophilisate time so that the sample acquired a powder appearance, and in turn, the survival of the bacteria in the lyophilisate was significantly improved after 24 hours, since it only decreased between 100 and 10,000 times. bacterial populations.
  • Table 1 shows the survival rate expressed in colony forming units (ufe) per mL of different strains of Pseudomonas protegens observed before and after a lyophilization process for 48 hours at -65 ° C under vacuum.
  • Table 1 Bacterial survival rate before and after a lyophilization process.
  • ChB7 2.8 x 10 12 2.0 x 10 4
  • Table 2 shows the survival rate expressed in ufe per mL of different strains of Pseudomonas protegens treated with a cryoprotectant (1: 1 mixture of 10% w / v peptone and glutamate of 10% w / v sodium) observed prior to its completion and 24 hours and 15 days after a freeze drying process for 76 hours at -65 ° C under vacuum.
  • a cryoprotectant 1: 1 mixture of 10% w / v peptone and glutamate of 10% w / v sodium
  • Table 2 Bacterial survival rate treated with a cryoprotectant.
  • ChB7 1.1 x 10 10 9.3 x 10 6 0.0
  • Example 3 Evaluation in commercial orchards of control activity of strains or bio-formulations based on Pseudomonas strains producing 2,4-DAPG.
  • the second experiment was carried out using three green and two yellow kiwi plants that had 4 to 5 true leaves, which were in individual pots and were placed in a plastic container (tray) and hung at the height of the canopy of the adult kiwi plants in the same place where the pots of the aforementioned experiment were located.
  • This experiment sought to standardize the micro-climate at this point and increase the possibility of a Psa infection.
  • Each container per treatment had 4 repetitions.
  • the third experiment consisted of treating each adult kiwi plant with the treatments where the pot was placed with the 1 or 2 year old plant or the seedlings contained in the containers.
  • the treatments to be applied to the kiwi plants and seedlings consisted of a control water, a treatment with copper hydroxide (Kocide® 2000, Anasac, Chile SA) in a dose of 250 g hL-1, acibenzolar-S-Methyl (Bion® 50 WG, Syngenta, Chile) in a dose of 20 g hL-1, two treatments with P. protegens bacteria, ChC7 strains and Ca2 strain applied separately, and a 50% mixture of both bacteria.
  • Bacterial suspensions were obtained by cultivation for 48 h at 24 ° C in King B medium until reaching a population> 10 8 ufe mL 1 , and said bacterial fermentation was used in 50% doses diluted in water in the potted soil and seedling tests in the canopy, while in the adult plant applications they were applied to 2% diluted the bacterial suspension in water.
  • Bion® 50WG was replaced by the product Nacillus® WP in doses of 150 g hL-1.
  • the treatments were applied three times in the season, on October 7 and 21 and November 04 for the experiment in San Carlos, and on October 14 and 28 and November 11 in the experiment in Pichingal.
  • the plants used in the potted-to-the-ground experiment and seedlings in the canopy were treated in the greenhouse the day before they were placed in the garden, while the adult plants were treated on the dates mentioned above.
  • the canopy seedling experiment received only two applications since the plants were placed in the orchard on the second application date on October 21 and 28 for San Carlos and Pichingal, respectively.
  • the application of the copper-based products was suspended in the experiment with adult plants.

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Abstract

La tecnología corresponde a una formulación para la protección contra la bacteriosis del kiwi, causada por la bacteria Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa), la cual comprende la biomasa de las cepas de Pseudomona protegens ChC7 (RGM 2328) y CA2 (RGM 2329), más excipientes. Esta formulación permite proteger de forma directa contra la bacteria patógena, activar genes de defensa presentes en las plantas, y colonizar el interior de la misma reduciendo el daño sistémico que genera la Psa, permitiendo generar protección durante el desarrollo del cultivo, especialmente durante la floración.

Description

UNA FORMULACIÓN PARA LA PROTECCIÓN CONTRA LA BACTERIOSIS DEL KIWI, CAUSADA POR LA BACTERIA PSEUDOMONAS SYRINGAE PV.
A CTINIDIAE (PSA)
Sector técnico
La presente invención se relaciona con la agroindustria, en particular con la industria del cultivo del Kiwi, esta invención genera protección contra Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) durante el desarrollo de la planta, especialmente durante la floración.
Técnica Anterior
Hoy en día la problemática de la bacteriosis del kiwi {Actinidia chinensis o A. deliciosa) causada por Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) sigue estando vigente a nivel nacional e internacional. Esta enfermedad genera severas pérdidas en esta industria, ya que causa manchas necróticas en hojas, muerte de ramas, aborto floral y una infección sistémica que conlleva a la muerte del vegetal.
En Chile, de acuerdo a los antecedentes entregados por SAG y el Comité del Kiwi, se pasó de 57 huertos que fueron diagnosticados oficialmente con la enfermedad el año 2012 a 215 huertos al 17 de agosto de 2016, con el 90% de los huertos concentrados en la Región del Maulé y del Biobío, lo que ha implicado pasar de alrededor de 720 ha infectadas con la enfermedad a 2.272 ha, lo cual equivale actualmente alrededor de un 20% de la superficie dedicadas al cultivo de kiwi en Chile. Del mismo modo, desde el año 2012 a la fecha la enfermedad estaba focalizada en la Región del Maulé y de Biobio, pero el 2014 alcanzo la región de O'Higgins y el 2015 se presentó afectando un huerto en la comuna de Melipilla, Región Metropolitana.
Dadas las condiciones climáticas que han prevalecido durante estas últimas primaveras, huertos de kiwi amarillo {Actinidia chinensis) que presentaba un 7% de plantas con síntomas de infección de la enfermedad en otoño, presentan durante la primavera alrededor de un 40% de plantas con síntomas de enfermedad. El año 2015 huertos de kiwis, tanto verdes como amarillos, presentaron una alta incidencia de botones florales con necrosis y daño en hojas, lo cual generó pérdidas de hasta el 60% de la producción en productores orgánicos de kiwi durante la temporada de producción 2015-2016. Durante la temporada 2018-2019, las condiciones para la infección para Psa fueron excesivamente favorables, llevando a productores a pérdidas de producción entre el 60 y 70%, debido a las recurrentes lluvias primaverales que ocurrieron entre los meses de septiembre y noviembre, que favorecieron síntomas como "lloro rojo", necrosis de botones florales y manchas en hojas, y que está llevando a muchos productores a arrancar esta especie. Esta situación tiene a la industria del kiwi en una situación de statu quo, ya que no se registran nuevas plantaciones de este frutal y existe poco interés de plantarlo debido a la problemática que implica su manejo que eleva sus costos, y los riesgos de pérdidas que trae su producción.
La problemática sigue manteniéndose, ya que las estrategias para el control de la bacteriosis del kiwi causada por Psa, están basados en la aplicación de productos en base a sales de cobre, sin embargo, estos productos tiene la limitante que no pueden ser usados en el periodo de floración, por la fitotoxicidad que causan en la flor y el daño que pueden causar a las abejas, por lo cual la planta de kiwi se ve desprotegido en el periodo en que se define el rendimiento del huerto. Además, los distintos productos que contienen cobre no controlan la enfermedad, sino que sólo la mantienen a un límite que asegura una menor pérdida, y adicionalmente el uso reiterativo e indiscriminado de productos cúpricos puede llevar rápidamente a la aparición de cepas bacterianas resistentes al cobre, como ha sido demostrado recientemente (Colombi et al. 2017). Estudios recientes conducidos en Nueva Zelanda muestran que existe una evolución de resistencia a cobre en aislados de Psa a través de adquisición de elementos conjugativos y plásmidos, las que representan un 25% de los aislados obtenidos en un muestreo realizado entre el 2015 y 2016 (Colombi et al., 2017).
Por otra parte, el uso de antibióticos e inductores de resistencia químicos como el acibenzolar-S-Metil (Bion ® o Actigard®) permiten cubrir periodos fenológicos críticos de la planta, pero no son recomendables para ser utilizados en explotaciones orgánicas, que en Chile son las que muestran la mayor rentabilidad. Los antibióticos de uso en agricultura están prohibidos en distintos mercados de destino para el kiwi de exportación, y el uso de antibióticos e inductores de resistencia químicos como el acibenzolar-S-metil no pueden usarse en floración.
Actualmente han ingresado al mercado chileno dos productos biológicos, uno que actúa por competencia de sitios de infección (Nacillus ®, de Bio Insumos Nativa SPA.) y otro que tiene actividad antagonista a base de Bacillus subtilis cepa QST-713 (Serenade, Bayer S.A.), además del inductor de resistencia de naturaleza química en base a acibenzolar-S-methyl (BION® 50WG, Syngenta S.A.).
En este contexto, el desarrollo de inductores de resistencia biológicos que puede cubrir el momento crítico que se genera en las explotaciones de kiwi orgánicas, donde no se puede utilizar antibióticos o un inductor de resistencia químico, es una necesidad en la industria de producción del kiwi a nivel mundial.
Dada esta necesidad por elicitores de resistencia para las explotaciones de kiwi a nivel mundial, es que se han evaluado diferentes cepas bacterianas productoras de 2,4-DAPG, pioluteorin y pirrolnitrin, que son capaces de actuar por antibiosis directa sobre Psa; inducir la expresión de una serie de genes asociados a los mecanismos de defensa de la planta de kiwi y de forma preliminar observar que puede colonizar endofíticamente la planta de kiwi, lo cual se ha asociado con menor expresión de síntomas de la enfermedad, contrarrestando la infección causada por la Psa en periodos o explotaciones donde tratamientos químicos no pueden ser utilizados o causan mermas en los rendimientos.
Las patentes relacionadas al uso de bacterias que producen 2,4-DAPG están asociadas al tratamiento de semillas para el control de hongos que afectan las raíces de trigo o césped o la biosíntesis de los compuestos que estas bacterias producen o a mecanismos para evaluar la activación de genes asociados a la producción o expresión de genes en este tipo de bacterias.
Finalmente, cabe mencionar que las grandes empresas transnacionales de agroquímicos han estado invirtiendo cuantiosas sumas en desarrollar alternativas biológicas para el manejo de enfermedades y plagas en planta, por lo cual el desarrollo de biopesticida se ha transformado en una de las industrias con mayor dinamismo en los últimos años.
Algunas patentes que comprenden el uso de cepas elicitoras de resistencia son:
1. Solicitud de patente WO2013/121248 Novel Pseudomonas fíuorescens strain and uses thereof in the biological control of bacterial or fungal diseases, en la cual se divulga una cepa de P. fíuorescens, depositada bajo el número de registro DSM 25556, que actúa como control biológico frente a cepas patógenas bacterianas y fúngicas, se divulga además el método de prevención y una formulación. Solicitud de patente W02010/037072 Pseudomonas bacterium, de
Novozymes AS (Dinamarca). Se presenta una nueva cepa de Pseudomonas depositada bajo el número de registro DSM 21663. La cual promueve el crecimiento de la planta y produce antibióticos como 2 ,4-d iaceti If lorog I uci nol (DAPG); pirrolnitrina (PRN) y ácido indol-3-acético (IAA). La cepa tiene la capacidad de suprimir la acción de patógenos de origen bacteriano y fúngico. Patente de invención KR20100115659 Antibiotics for bacterial canker of citrus from drug resistance Pseudomonas aeruginosa No3 and antibiotics, and its application, de la Fundación industrial de la Universidad Nacional Chonnam, Corea. En este documento se divulga una cepa de Pseudomonas depositada con el número de registro KFCC11444P la cual produce sustancias antibióticas, como el ácido linoleico, contra los patógenos que producen el cancro como son Xanthomonas citri o Pseudomonas syringae pv actinidiae. Además se presenta una segunda cepa, la cual fue obtenida a través de la hibridación con transposon min¡Tn5, esta cepa depositada con el número KFCC11445P, presenta características mejoradas para el mismo fin. Solicitud de patente W02018/047123 Biological control of plant pathogenic microorganisms, de The New Zealand institute for plant and food research limited. Esta solicitud divulga el uso de una levadura Aureobasidium pullulans, denominada YBCA5, como biocontrolador de bacterias de la especie Pseudomonas spp. entre las cuales se menciona Pseudomonas syringae pv actinidiae, indicando además su uso en plantas de Kiwi. Solicitud de patente CL201603401 Cepa bacteriana silvestre Pseudomonas protegeos CAO 2 como biofungicida bacteriano para el control de Botrytis cinérea ^ otros hongos fitopatógenos, de la Universidad de Santiago de Chile. Se divulga una cepa con número de registro RGM 2342 la cual se utiliza para el control de infecciones fúngicas producidas por hongos fitopatógenos en plantas. 6. Folleto informativo del Bio-Protection Research Centre de Nueva Zelanda Desktop evaluation on commercially available microbial-based products for control or suppression of Pseudomonas syríngae pv. actinidiae (Stewart et al. 2011) y col.). Este artículo es una revisión de los actuales productos para regular el cancro ulceroso del kiwi por biocontrol, utilizando cepas de diferentes géneros y especies. Entre estos se encuentra el producto BlightBan® A506 (NuFarm Inc, USA) que contiene la cepa Pseudomonas fluorescens A506, la cual se ha estudiado para controlar diferentes brotes infecciosos en plantas, entre estos el generado por la cepa Pseudomonas syríngae pv. actinidiae.
En cuanto a cambios en la normativa, dada la alta dispersión de Psa en las Regiones del Maulé y del Biobío, ha llevado al SAG a ir reduciendo las exigencias de contención de la enfermedad que existen al principio, pero sigue existiendo el deseo de mantener la enfermedad fuera de las Regiones de Valparaíso y Metropolitana. Dentro de estos cambios que entrarán a consulta pública, están la autorización de mantener plantas enfermas dentro de los predios, previo un rebaje de las secciones de tejido enfermo presentes en la planta, y la posibilidad de usar polen del mismo predio en un predio positivo. Esto que favorece los costos productivos para el productor, puede aumentar las condiciones de inoculo dentro de huerto, por lo cual el uso de estrategias de manejo y control en kiwi siguen siendo necesarias, por lo que la política que recomienda el SAG y el Comité del kiwi es tratar de convivir con la enfermedad, lo cual implica seguir investigando al respecto y desarrollando nuevas alternativas de control. Del mismo modo, se está estudiando la opción de terminar el control oficial, en las regiones donde la enfermedad está más diseminada por lo cual el manejo será responsabilidad de los productores, quienes deben lograr que sus producciones convivan, siendo económicamente viables con la presencia de la enfermedad.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: Esquema de los distintos modos de acción de la formulación en plantas de kiwi.
Figura 2. Halos de inhibición observados sobre un tapiz bacteriano de Pseudomonas syringae pv. actinidiae cepa 105743 generados por aislados chilenos de Pseudomonas protegeos que poseen el gen ph!D+ asociado a la producción de 2,4-DAPG y el antibiótico estreptomicina (Ant.)· KB: Solución de medio caldo King B.
Figura 3. Radio de inhibición presentado por colonias de bacterias chilenas que poseen genes asociados a la producción de 2,4 DAPG sobre colonias de Pseudomonas syringae v. actinidiae después de 48 horas de co-cultivo.
Figura 4. Área bajo la curva de progreso de la enfermedad (AUDPC) en hojas de plántulas de Actinidia deliciosa (kiwi verde) después de 30 días de haber sido inoculada con PSA y tratada con diferentes aislados chilenos de Pseudomonas protegens que poseen el gen phiD+ asociado a la producción de 2,4-DAPG y el producto antibiótico Streptoplus®. Blanco: Planta no inoculada con PSA. Ambos experimentos se realizaron en igualdad de condiciones, con una diferencia de tres meses entre ellos. Letras diferentes sobre cada barra indica diferencias significativas (a = 0,05) de acuerdo a un aprueba no paramétrica de Kruskal Wallis.
Figura 5. Severidad de daño observado sobre la tercera hoja en plántulas de Actinidia deliciosa inoculadas con Pseudomonas syringae pv. actinidiae (a), y co-inoculadas con Pseudomonas protegens cepa Ca2 (b) y cepa ChC7, después de 8, 20 y 30 días (izquierda a derecha) de la inoculación con la bacteria fitopatógena.
Figura 6. Plantas de Actinidia deliciosa después de 21 días de ser inoculadas con Psa. Una sólo tratada con agua (izquierda) y otra inducida con cepa Pseudomonas protegens cepa Ca2 (derecha).
Figura 7. Efecto de la inducción de resistencia de tratamientos aplicados al follaje en base a acibenzolar-S-metilo (Bion® 50WG) y dos cepas de bacterias Pseudomonas protegens en el control de Psa en kiwi verde {Actinidia deliciosa ) expresado como la integración en el área bajo la curva de progreso de la enfermedad (AUDPC) después de 30 días de evaluación.
Figura 8. Efecto de la inducción de resistencia de tratamientos aplicados al follaje en base a acibenzolar-S-metilo (Bion® 50WG) y dos cepas de bacterias Pseudomonas protegens en el control de Psa en kiwi verde {Actinidia deliciosa ) expresado como número de manchas necróticas sobre las hojas en tres fechas de evaluación después de haber sido inoculadas por Psa a excepción del blanco.
Figura 9. Efecto de la inducción de resistencia de tratamientos aplicados a la raíz en base a acibenzolar-S-metilo (Bion® 50WG) y dos cepas de bacterias Pseudomonas protegens en el control de Psa en kiwi verde (Actinidia deliciosa ) expresado como la integración en el área bajo la curva de progreso de la enfermedad (AUDPC) después de 30 días de evaluación.
Figura 10. Efecto de la inducción de resistencia de tratamientos aplicados a la raíz en base a acibenzolar-S-metilo (Bion® 50WG) y dos cepas de bacterias Pseudomonas protegens en el control de Psa en kiwi verde (Actinidia deliciosa ) expresado como número de manchas necróticas sobre las hojas en tres fechas de evaluación después de haber sido inoculadas por Psa a excepción del blanco.
Figura 11. Expresión relativa de 10 genes de defensa en plántulas de Actinidia deliciosa en plantas inoculadas al follaje (H) o a la raíz (R) con las bacterias antagonistas y el inductor químico Acibenzolar-S-metil (Bion 50 WP, en dosis de 0,2 g L 1) después de 1 día (ID), 7 días (7D) y 15 días (15D) luego de la aspersión, para cada gen comparado con su control no inoculado.
Figura 12. Expresión relativa de 4 genes de defensa en plántulas de A. chinensis en plantas inoculadas al follaje con bacterias Pseudomonas protegens, Pantoea spp. (Cepas AB411 y API 13), el inductor químico Bion® 50 WP, en dosis de 0,2 g L _1, y P. syringae pv. actinidiae (PSA) después de 1 (A) y 7 (B) días después de su aspersión, comparado con su control no inoculado.
Figura 13. Porcentaje de severidad de daño observado después de 7 días sobre hojas de plantas de 2 años de edad de kiwi cv. Hayward que habían sido tratadas al follaje en dos ocasiones con Pseudomonas protegens y otros tratamientos en San Carlos, Región de Ñuble, durante temporada 2016-2017.
Figura 14. Número de manchas necróticas observadas después de 7 días sobre hojas de plantas adultas de kiwi cv. Hayward que habían sido tratadas al follaje en dos ocasiones con Pseudomonas protegens otros tratamientos en San Carlos, Región de Ñuble, durante temporada 2016-2017. Divulgación de la invención
La presente tecnología corresponde a una formulación a base de cepas de Pseudomona protegens que permite la protección contra la bacteriosis del kiwi, causada por la bacteria Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa). Esta formulación al ser asperjada en distintos periodos de desarrollo de la planta, puede proteger de forma directa contra la bacteria, activar genes de defensa presentes en las plantas, lo cual se traduce en una señal sistémica que protegerá a la planta completa por alrededor de 7 a 14 días, y colonizará el interior de la misma reduciendo el daño sistémico que genera la Psa, permitiendo generar protección durante el desarrollo del cultivo, especialmente durante la floración, lo cual reducirá el daño causado por la enfermedad, y que finalmente se traducirá en mayor rendimientos en el huerto.
Las cepas utilizadas en la formulación corresponden a Pseudomona protegens cepa ChC7 y Pseudomona protegens cepa Ca2, ambas depositadas en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos, con los números de depósitos RGM 2328 y RGM 2329 respectivamente. Ambos depósitos fueron efectuados el día 30 de septiembre de 2016.
Estas cepas fueron seleccionadas desde un grupo de 48 cepas por sus características de potencial biocontrolador sobre la especie patógena, esta capacidad excepcional encontrada en las dos cepas elegidas dan una característica distintiva a la formulación que se presenta.
Cabe hacer notar que las bacterias con que se está trabajando en esta propuesta están genéticamente secuenciadas en el gen 16S ARN ribosomal, y corresponden a especies de Pseudomonas protegens que tienen mutaciones en su secuencia genómica que las hacen diferentes de otras especies descritas en los Banco de secuencia de genes existentes a nivel mundial. Por otra parte, estas cepas han demostrado habilidad para solubilizar fósforo inmovilizado, producir ácido indól acético y otras propiedades biosurfactantes, los cuales no son características comunes de aislados de la misma especie, como P. protegens cepa Pf5 aislado en Estados Unidos (Paulsen et al., 2005; Ramette et al., 2011). Del mismo modo, las cepas chilenas inhiben a Psa bajo condiciones in vitro, mientras la cepa Pf5 no lo hace. El formulado comprende a una suspensión bacteriana líquida > 107 UFC mL 1 obtenida de la fermentación de las cepas bacterianas en medio líquido King B (KB) por 24 horas a 24°C y 150 rpm de agitación. Para su preparación se toma una alícuota de 10 pL de la cepa original de la bacteria que se mantiene en 20% glicerol a -80°C, y se coloca a crecer en 10 mL de medio KB por 24 horas para después inocular con 2 mL de esta suspensión (~107 UFC mL _1) por 100 mL.
Esta formulación posee una probada efectividad en el control de Psa al aplicarla en concentraciones entre el 6% y 50% diluida en agua. Se debe preparar de forma fresca para cada aplicación, pero se puede conservar refrigerada a 4°C por 5 a 7 días, en los cuales sobreviven las bacterias.
Los ensayos realizados con la formulación en predios con kiwi verde muestran niveles de control de la bacteriosis cercanos del 50% cuando son aplicados previo al periodo de floración, estos resultados son similares a los obtenidos por el inductor de resistencia acibenzolar-S-metil (ASM), o el uso de hidróxido de cobre.
Esta formulación o bioproducto puede ser aplicado sólo o en combinación con otros biocontroladores, cuyo modo de acción es la competencia por espacios, mejorando la eficacia de control y diferenciándose de otros productos presentes en el mercado. Por ejemplo, su aplicación en otoño, previo a caída de hojas permite cubrir las heridas que dejan las hojas al caer y que son una fuente de ingreso para Psa y otras bacterias fitopatógenas de género Pseudomonas, favoreciendo la colonización endófita en ramillas y tronco de plantas adultas durante el invierno. Al inicio de la brotación, puede volver a ser aplicado para favorecer la colonización endófita del nuevo tejido que se está formando y activar genes de resistencia en la planta que inhiban la infección por Psa, para seguir con aplicaciones de cobre o en alternancia con productos en base a cobre hasta previo floración, para finalizar con aplicaciones durante floración, para reducir los daños que ocurren en ese momento, justo cuando los bactericidas cúpricos, ASM y los antibióticos no pueden ser utilizados, y momento donde se han observado considerables pérdidas en años con condiciones primaverales preponderantes para el desarrollo de la enfermedad. A diferencia de otros productos nuestra formulación se presenta como inductor de resistencia y productor de compuestos antimicrobiales que inhiben el desarrollo de Psa.
En la figura 1 se muestra el modelo de acción de la formulación cuando se utiliza junto a otro biocontrolador, en A) se presenta la formulación en combinación con otro producto; B) el asperjar esta formulación permite: antibiosis directa, inducción de resistencia, colonización endófita y competencia por tejidos; C) la señal generada es transportada a través de la planta; D) esto genera una Resistencia Sistémica Activada (SAR); E) que se traduce en la inhibición de la infección por Psa; F) hay una protección durante el periodo de floración; G) que se traduce en mayor rendimiento y menos incidencia de PSA en huertos orgánicos y convencionales.
La recomendación de aplicación de este producto, debido a sus características de protección, debiera estar de acuerdo al siguiente modelo: a) En otoño: aplicación post cosecha, permite colonización endófita, y aplicación durante la caída de hojas, permite la protección de heridas ocurridas durante este proceso. b) En invierno: aplicación del producto que permite la colonización de las cepas en el tronco. c) En primavera: i) aplicación al inicio del brote, esto permite la colonización del tejido nuevo; ¡i) aplicaciones alternadas durante el crecimiento vegetativo, permite la antibiosis e inducción de resistencia; i¡¡) aplicación en floración, permite la protección de la flor.
EJEMPLOS DE APLICACIÓN
Ejemplo 1: Selección de cepas benéficas para la elaboración de un bioproducto contra Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa).
1.1 Evaluación in vitro de actividad directa de las cepas benéficas sobre Pseudomonas syrinaae py. actinidiae (Psa).
Se utilizaron siembras de tapices o céspedes bacterianos de PSA que se realizaron utilizando 100 y 500 pL de una suspensión bacteriana aplicada y esparcida sobre la placa de Petri con medio agar King B. Sobre el césped se colocaron equidistantes colonias de 2 a 5 pL de las bacterias en estudio y se evaluó el radio del halo de inhibición generado por la bacteria o el área de inhibición generada usando el software de procesamiento de imágenes Image J, después de 48 h de incubación a 24°C. Estos trabajos fueron realizados con 48 cepas bacterianas, fueron repetidos dos veces y se utilizó un diseño completamente al azar. Comparación de grupos de cepas fueron analizados usando el método de agrupamientos de Ward, y análisis de varianza dentro de cada grupo y comparación de medias mediante la prueba de Tukey o LSD. De las 48 cepas evaluadas, 21 presentaron distintos grados de inhibición sobre el crecimiento bacteriano de la Psa en medio King B (ejemplo de placas utilizadas, Figura 2). De estas 18, son bacterias chilenas que presentan el gen phiD, asociado a la producción de 2,4-DAPG, y que desarrollaron halos o áreas de inhibición similares a los generados por un antibiótico como estreptomicina, como se puede observar en el gráfico de radios de inhibición (Figura 3). Las bacterias que presentaron la mayor inhibición in vitro sobre Psa fueron P. protegens Ca2, ChC7, Ca5 y C8BB3, las que fueron seleccionadas para las pruebas de control por antibiosis en plántulas de kiwi. Bacterias del género Pantoea que habían sido propuestas por tener actividad quitinolítica y glucanolítica no presentaron actividad antimicrobial sobre la bacteria.
1.2 Evaluación de control de la Psa en plántulas de kiwi para determinar efecto de control de Pseudomonas productoras de 2,4-DAPG.
Se consiguió autorización del SAG para trabajar con la bacteria Psa y se estableció un protocolo a partir de semillas de kiwi A. deliciosa var. Hayward que permitió obtener plantas de kiwi con 5 hojas no cotiledonares en 3 a 4 meses para hacer pruebas de evaluación con la cepa 105743 de Psa obtenida por el SAG.
Las semillas fueron tratadas con una solución de 2500 ppm de giberelinas (Giberplus® SP, Anasac) por 24 h previo a la siembra en placas de Petri con agar agua, donde se mantuvieron a temperatura ambiente hasta germinar. Una vez germinadas se trasplantaron a bandejas con sustrato de turba y perlita en relación 2: 1 m/m, al que se le agregaba 4 gL 1 del fertilizante mono gránulo de liberación prolongada Multicote (Anasac), manteniéndose en las bandejas hasta alcanzar su tercera hoja, para ser trasplantadas a macetas de 1000 cm3. Las plantas durante su desarrollo se mantenían en una sala de crecimiento bajo condiciones controladas de temperatura constante de 20°C y fotoperiodo de 14 horas de luz: 10 horas de oscuridad entregadas mediante luz artificial LED en longitud de onda rojo, azul, amarillo y blanco.
Se desarrollaron dos grupos de experimentos para determinar el efecto de antibiosis de las bacterias benéficas sobre Psa y otro para determinar el efecto de inducción de resistencia al aplicar las bacterias benéficas para controlar la enfermedad. En el ensayo de antibiosis las plantas fueron co-inoculadas con Psa y se evaluó las cepas de P. protegensCaS, Ca2, ChC7 y P. fluorescens cepa C8BB3.
La evaluación de la capacidad de inducir resistencia de las cepas Ca2 y ChC7 al ser inoculadas en la rizósfera se realizó a través de un tubo Eppendorf de dos mL con siete agujeros que se enterró en el sustrato en el centro de la maceta, donde cada sistema radicular se inoculó con 10 mL de la suspensión bacteriana a una concentración mayor a 108 UFC mL 1, ASM en la dosis descrita o con agua destilada estéril.
En ambos sistemas de inoculación, seis días después del pre-trata miento se inoculó la bacteria patógena mediante la aspersión de ocho mL de la suspensión bacteriana a una concentración mayor a 108 UFC mL 1 sobre todo el follaje de la planta. Veinticuatro horas previas y posteriores a la inoculación de las bacterias antagónicas y de PSA, al follaje, las plantas se mantuvieron en un ambiente de 80% humedad relativa y 20°C, a modo de incitar la apertura de los estomas con el fin de facilitar el ingreso de las bacterias a las plantas.
En los experimentos de antibiosis en plantas e inducción de resistencia se consideró el recuento de manchas necróticas por hoja y se realizó una estimación visual del porcentaje del área de la hoja afectada por la enfermedad. En el primer experimento de antibiosis se evaluó a los 8, 20 y 30 días, mientras en el segundo ensayo y en los de inducción de resistencia se evaluó a los 7, 14 y 21 días.
Los tratamientos se dispusieron en un diseño completamente al azar dentro de la sala de crecimiento, considerando cuatro repeticiones. Con los valores porcentuales de daño en hojas se calculó el área bajo la curva de progreso de la enfermedad (AUDPC), que representa el valor acumulado de daño alcanzado por las plantas a lo largo de las tres evaluaciones realizadas. Los datos de número de manchas fueron transformados a Logio (dato+1). Los datos transformados de número de manchas y los datos de AUDPC fueron analizados en cuanto a la normalidad de su distribución mediante el test de normalidad de Shapiro-Wilk y test de homocedasticidad, para luego aplicar un ANOVA, en caso de cumplir los supuestos, y de existir diferencias significativas (P < 0,05) se realizó una comparación de medias con la prueba de LSD Fisher (a = 0,05). En caso de no cumplir los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianzas se les aplicó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, y de existir diferencias significativas (P < 0,05) se realizó una comparación de medias mediante comparación de a pares. Todas las pruebas estadísticas fueron realizadas con el software estadístico SAS o Infostat y la herramienta análisis estadístico de Microsoft Excel.
Las bacterias antimicrobiales y Psa fueron cultivadas en medio caldo King B o LB a 25°C por 24 h en agitación a 200 rpm hasta lograr suspensiones bacterianas de una concentración mayor a 108 UFC mL 1 de cada una ellas, las que se centrifugaron por 5 min a 6000 rpm en una centrífuga para eliminar el sobrenadante y reemplazarlo por una solución salina (0,89 g L_1), luego cada tratamiento se mezcló con Psa en proporción 1: 1 v/v, para ser asperjardos 14 mL de mezcla sobre cada planta. Además, se consideraron como tratamientos control una mezcla 1: 1 v/v de una suspensión de 108 UFC mL 1 de Psa más una solución del antibiótico comercial en dosis de 50 g hL-1, a base de Sulfato de estreptomicina (25 % p/p) más Clorhidrato de oxitetraciclina (3,2 % p/p) (Strepto-plus ® WP, Anasac S.A., Chile) y una mezcla 1 : 1 v/v de una suspensión de 108 UFC mL 1 de Psa más solución salina. También, se consideró un tratamiento blanco al cual sólo se le asperjó solución salina.
Los resultados mostrados en la figura 4 son interesantes, la cepa Ca2 redujo en promedio entre un 85,4 y 96,6% el nivel de infección de la enfermedad acumulada en el tiempo entre ambos experimentos, y fue seguido de ChC7 (85,4 y 84,7%) y Ca5 (70,6 y 87,6%). La cepa C8BB3 no presentó actividad de control sobre Psa, ya que no fue distinto del control inoculado con esta bacteria patogénica. Estos valores no estadísticamente diferentes del uso del antibiótico comercial Strepto Plus WP (sulfato de estreptomicna 25 + Clorhidrato de oxitetraciclina 3.2) y de lo observado sobre plantas no tratadas ni inoculadas con Psa (P < 0,05). Dado los buenos resultados mostrados por las cepas Ca2 y ChC7 se continuó trabajando con estas dos cepas.
En base a los resultados obtenidos, la evaluación de control en base a inducción de resistencia se realizó evaluando la capacidad de las cepas Ca2, Ca5 y ChC7 de proteger de la infección por Psa al inducir resistencia cuando fueron aplicadas al follaje y a la raíz de plantas de kiwi. Se consideró como tratamiento control el pre-tratamiento con agua destilada estéril y la aplicación del elicitor comercial acibenzolar-S-metil (Bion® 50WG, Syngenta, Chile) en la dosis de 15 g hL _1. En los tratamientos al follaje, se asperjaron 5 mL sobre la cara abaxial de dos hojas jóvenes totalmente expandidas en cada planta, lo que se realizó en una cámara aislada para evitar deriva de las suspensiones bacterianas. Los resultados de estos experimentos muestran que después de 8 días de inoculadas las plantas con las bacterias antagónicas y la Psa, se observó un nivel de infección de 12,8% de severidad de daño en hojas por la Psa, mientras que las tratadas con Ca2, Ca5 y ChC7, alcanzaron niveles de infección del 0,8, 3,8 y 2,3% sobre hojas, respectivamente. (Figura 5).
1.3 Evaluación in planta de cepas de Pseudomonas con el gen , que se asocia
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con la producción de 2,4-DAPG, que hayan presentado actividad de antibiosis sobre Psa, en su habilidad de inducir resistencia para el control de Psa.
Se realizaron dos experimentos para determinar el efecto de control de las cepas de P. protegens Ca2 y ChC7, comparado a un control no tratado y un control tratado con acibenzolar-S-methyl (ASM, producto BION 50WP, Syngenta), que fue usado como un producto inductor de resistencia estándar para el control de Psa. Este experimento se realizó considerando aplicar los tratamientos al follaje y aplicados a la raíz, en la figura 6 se muestran plantas de 21 días después de haber sido inoculadas con Psa, a la izquierda una solo tratada con agua y a la derecha una inducida con cepa Ca2. Considerando el área de la curva de progreso de la enfermedad (AUDPC), en el experimento en el cual los inductores de resistencia se aplicaron al follaje, se observó (figura 7) que hubo diferencias entre Bion 50 WP (0,2 g L 1) y ambas cepas antagonistas con respecto a las plantas que fueron sólo inoculadas con Psa cepa 105743, en el primer experimento, mientras que en el segundo la cepa ChC7 no fue diferente del testigo inoculado ni de los otros tratamientos. Al considerar el número de manchas (figura 8) hubo un mayor severidad en el primer experimento donde se denotaron diferencias entre los tratamientos con inductores y el testigo inoculado, ya que a pesar de no observarse diferencia estadísticas entre la cepa ChC7 y Bion® 50 WG con respecto al testigo, estos tratamientos redujeron en promedio el número de manchas en un 87,5 y 91,0%, respectivamente. La cepa Ca2 fue estadísticamente diferente del testigo, pero no de los otros dos tratamientos y redujo el número de manchas en un 92,1%. El segundo experimento tuvo un bajo número de manchas y no se observaron diferencias entre tratamientos, aunque hubo una tendencia a reducir éstas al utilizar los inductores de resistencia en las plántulas de kiwi.
Considerando que las bacterias de Pseudomonas con el gen phID fueron aisladas desde las raíces de plantas, se evaluó la inducción de resistencia en plántulas considerando inocularlas con una suspensión de ellas en las raíces por intermedio de un tubo con 8 orificio, que fue enterrado en el sustrato al centro de la maceta con la plántula, para después de 7 días realizar la inoculación al follaje con Psa. Al considerar esta metodología de tratamiento a la raíz, se pudo observar (Figura 9) que las bacterias tuvieron un comportamiento variable en la expresión de la enfermedad considerando el valor de AUDPC, ya que en el primer experimento ChC7 no fue diferente del control inoculado con Psa, pero en el segundo experimento si lo fue. Por su parte la cepa Ca2 y Bion® 50 WP en dosis de 0,2 g L 1 fueron en ambos experimentos diferentes del tratamiento sólo tratado con Psa después de 30 y 21 día de la inoculación con la bacteria fltopatógena. Al considerar el número de manchas necróticas no se observaron grandes diferencias entre tratamientos (figura 10), pero la misma tendencia se observó para ambos experimentos reduciendo en promedio la cepa ChC7 en un 88,8% el número de manchas sobre las hojas y la cepa Ca2 un 47,4 y un 73% la expresión de la enfermedad en cada experimento, respectivamente, y no ser estadísticamente diferente del producto Bion® 50 WP en ambos experimentos. Nuevamente la alta variación en la expresión de la enfermedad en el tratamiento sólo tratado con Psa, o el tamaño muestral de sólo 4 plantas (repeticiones) por tratamiento impidió detectar la tendencia a reducir la enfermedad que presenta la cepa Ca2. No obstante lo anterior, al considerar el número de manchas necróticas promedio sobre las hojas evaluadas sugiere que el uso de la cepa Ca2 ayudaría a reducir el nivel de inoculo presente sobre las plantas en un periodo de tiempo de 30 días.
1.4 Evaluación de activación de genes de defensa en plantas de kiwi inoculadas con cepas de Pseudomonas productoras de 2.4-DAPG.
La evaluación de la expresión de genes de defensa en las plántulas de kiwi por parte de bacterias que fueron capaces de reducir la infección por Psa, se realizó considerando evaluar comparativa las cepas antagonistas y Bion® 50WG, en dosis de 0,2 g L 1, en su expresión de transcriptomas (mRNA) mensajeros para los genes prl (Pathogenesis-related protein 1), pr8 (pathogenesis-related protein 8), ICS1 (Isocorismato sintasa), PAL (Fenilalanina amonio Nasa) y /ajr(lipooxigenasa) del trabajo de Cellini et al. (2014), más los partidores específicos para plantas de kiwi para los genes asociados a la defensa de las plantas: pr4 (Pathogenesis related protein 4), TLP1 (Thaumatin-like protein), /^(L-ascorbato peroxidasa), CNP60 (Chaperona-60) y Serpina (Serpin ZX), desarrollados en nuestro laboratorio en base a los trabajos de Petriccione et al. (2013 y 2014) en plántulas de kiwi. Estos genes de defensa conforman una plataforma que permitió evaluar mediante qPCR, a través de método AACt, la expresión relativa de estos genes, utilizando el gen Actina como gen de referencia. En un experimento que se realizó en plántulas de kiwi verde y se evaluó la respuesta de las plantas de kiwi a aspersiones al follaje y aplicaciones a la raíz de las cepas ChC7 y Ca2, Bion 50WP y un control agua pudo observarse, que aplicados al follaje, Bion® 50WP tuvo patrones de expresión de genes parecidos a los generados por la cepa Ca2, incrementando la expresión de los genes prl, PAL, prf, TLP1 y /ox. La cepa ChC7 tuvo una sobreexpresión en el tiempo del gen pr4 parecido a Bion® 50WG. El incremento en la expresión del gen tox se asocia con respuestas de resistencia sistémica inducida (SAR) y producción de peroxidasas, siendo relativamente alta en las plantas de kiwi tratadas con el inductor químico y ambas bacterias, lo mismos fue observado para los genes pr4, asociado a la producción de quitinasas y prl, asociado a la producción de compuestos antifúngicos y del gen ICS1, que está asociado a la etapa inicial en la producción del ácido salicílico, que es el precursor en las respuestas SAR.
La aplicación de los tratamientos a la raíz no se tradujo en una mayor expresión de los 9 genes evaluados en comparación a la aplicación al follaje. Sólo hubo un incremento significativo en la expresión de los genes prl, TLP1 y pr8, donde el producto Bion® 50WG, tuvo los mayores incrementos en la expresión génica. Las cepas de P. protegens tuvieron leves incrementos en la expresión de los genes TLP1 y del ICS1, y la cepa Ca2 incrementó la expresión del gen /?/# (quitinasas tipo III), al día después de la aplicación, siendo similar a lo realizado por el inductor químico. En la expresión del gen TLP1, Bion 50WG incrementó su expresión a medida que transcurrieron los días desde su aplicación a las raíces; mientras ChC7, tuvo un alza al día después de la aplicación para caer a cero expresión después de 7 días, mientras Ca2 mantuvo una expresión constante durante el periodo de evaluación.
En otro experimento se evaluó comparativamente la capacidad de incrementar la expresión o inducir los genes prl, ICS1, PAL y TLP1 por las cepas de P. protegens Cal, Ca6, CalO, ChB7, y ChC7, las cepas de Pantoea spp., AB411 y AP113, Bion 50 WP, en dosis de 0,2 g L_1, y PSA cepa 105743 y un blanco no tratado con bacterias, después de uno y siete días después de la aplicación de estos tratamientos. En la figura 11 podemos observar que los tratamientos fueron capaces de incrementar la expresión de los genes bajo estudio después de 24 horas de aplicados, destacando Bion® 50WP que incremento de forma notoria la expresión del gen prl, mientras que Ca2 incremento notoriamente la expresión del gen PAL. Psa tuvo una baja expresión de los genes, incrementando la expresión del gen TLP1, cuya expresión no fue diferente de lo alcanzado por las cepas CalO y ChB7. Después de 7 días de haber aplicado los tratamientos sobre las plantas, se observó que Bion® 50 WG incremento en 60 veces la expresión del gen prl, con respecto al control, seguido de la cepa ChC7, Ca6, PSA y API 13. La expresión del gen PAL e ICS1 fue bajo para todas las bacterias, mientras que la expresión del gen TLP1 tuvo su mayor expresión en la cepa ChC7, PSA, Ca2, Ca6 y Bion® 50 WG.
En un experimento con plántulas de kiwi amarillo (A. chinensis) tratadas con Psa, Bion® 50WG, las cepas Ca2, Ca6, CalO, y ChC7, y Pantoea spp., AB411 después de uno y siete días después de la aplicación de estos tratamientos se observó (figura 12) un incremento en la expresión de los genes prl y PAL a las 24 horas (A), aunque la expresión de estos genes fue mayor en las plantas tratadas con Psa. A los 7 días (B) hubo un incremento en la expresión de los cuatro genes evaluados por parte de las bacterias en estudio.
Ejemplo 2: Elaboración de formulación a partir de Pseudomonas productoras de 2,4-DAPG.
Todos los ensayos antes descritos fueron realizados con suspensiones líquidas de bacterias que fueron crecidas en medio King B y posterior a 48 horas de crecimiento fueron centrifugadas para separar el sobrenadante.
Se evaluó la tasa de sobrevivencia al liofilizado de las cepas CalO, ChB7, Ca2 y Ca6, para ello, las bacterias se multiplicaron en caldo King B, fueron concentradas, lavadas en solución salina, y centrifugadas previo a un proceso liofilización por 48 h a 65°C al vacío hasta que las muestras alcanzaron un aspecto de polvo. Posterior al liofilizado, la muestra fue suspendida en 1 mL de solución salina y se determinó nuevamente las UFC mL 1 para cada cepa bacteriana.
El proceso de liofilizado redujo en dos tercios exponenciales las poblaciones de las cepas CalO y ChB7, mientras que no hubo bacterias sobrevivientes al proceso para las cepas Ca2 y Ca6, por lo cual un proceso de liofilizado no sería adecuado para formular cepas de P. protegens. Para sobrellevar esta problemática, se evaluó una mezcla 1: 1 de peptona al 10% p/v y glutamato de sodio al 10% p/v como crioprotector de las bacterias. El uso del crioprotector se tradujo en un aumento del tiempo de liofilizado para que la muestra adquiriera un aspecto de polvo, y a su vez mejoró notablemente la sobrevivencia de las bacterias al liofilizado después de 24 horas, dado que sólo se redujo entre 100 y 10.000 veces las poblaciones bacterianas. Sin embargo, la sobrevivencia en tiempo fue afectada, debido a que después de 15 días no fue posible obtener células bacterianas viables. De este modo, se puede concluir que la posibilidad de formulaciones en polvos liofilizados para las cepas de P. protegens no sería una alternativa viable como formulación de biopesticida a desarrollar.
En la tabla 1 se muestra la tasa de sobrevivencia expresada en unidades formadoras de colonias (ufe) por mL de distintas cepas de Pseudomonas protegens observadas previo y después de un proceso de liofilizado por 48 horas a -65°C al vacío.
Tabla 1: Tasa de sobrevivencia bacteriana previo y después de un proceso de liofilizado.
Cepa Población pre-liofilizado Población post-liofilizado bacteriana (ufe mL _1) (ufe mL _1)
CalO 3,0 x 1012 4,3 x 104
ChB7 2.8 x 1012 2,0 x 104
Ca2 1.9 x 1012 0,0
Ca6 2,0 x 1012 0,0 En la tabla 2 se muestra la tasa de sobrevivencia expresada en ufe por mL de distintas cepas de Pseudomonas protegens tratadas con un crioprotector (mezcla 1: 1 de peptona al 10% p/v y glutamato de sodio al 10% p/v) observadas previo a su realización y 24 horas y 15 días después de un proceso de liofilizado por 76 horas a - 65°C al vacío.
Tabla 2: Tasa de sobrevivencia bacteriana tratadas con un crioprotector.
Cepa Población pre-liofilizado Población post- 15 días después bacteriana (ufe mL _1) liofilizado (ufe mL _1) del liofilizado
CalO 3,4 x 1010 2,9 x 108 0^0
ChB7 1,1 x 1010 9,3 x 106 0,0
Ca2 2,1 x lO9 2,0 x 106 0,0
Ca6 5,4 x 109 3,6 x 107 0,0
Debido a estos resultados, se determinó que la mejor forma de aplicar las cepas sobre las plantas, es a través de suspensiones líquidas. Ejemplo 3: Evaluación en huertos comerciales de actividad de control de cepas o bioformulaciones en base cepas de Pseudomonas productoras de 2,4-DAPG.
Durante octubre de 2016 se establecieron tres experimentos para evaluar dos cepas en su capacidad de contrarrestar la infección natural de la Psa en dos predios comerciales que habían sido diagnosticados como positivos a Psa. Los experimentos se establecieron en un huerto orgánico de kiwi cv. Hayward, en el Fundo Roma ubicado en San Carlos, Región del Biobío, y el otro en un huerto convencional de kiwi verde cv. Summer, ubicado el sector de Pichingal, en la comuna de Lontue, Región del Maulé.
Se establecieron tres experimentos en cada huerto, el primer experimento consideró evaluar el efecto de control de los tratamientos a la infección natural por Psa en plantas de uno o dos años de kiwi que se colocaron al pie de las plantas adultas. En San Carlos, se estableció con plantas sanas de kiwi cv. Hayward de 2 años, mientras en Pichingal, se estableció con plantas de un año que fueron obtenidas a partir de semillas de kiwi cv. Hayward. Las plantas fueron asperjadas con los tratamientos y las macetas que las contenían fueron colocadas bajo la canopia de una planta hembra adulta de kiwi sobre la hilera de los huertos. La distancia entre cada maceta fue de una planta sobre la hilera, tomando la precaución de que la maceta quedase bajo la canopia de una planta hembra y junto a un aspersor. Cada tratamiento fue repetido siete veces. El segundo experimento se realizó utilizando tres plantas de kiwi verde y dos de amarilla que tenían 4 a 5 hojas verdaderas, las cuales estaban en macetas, individuales y fueron colocadas en una contenedor plástico (bandeja) y colgadas a la altura de la canopia de la plantas adultas de kiwi en el mismo sitio donde se ubicaban las macetas del experimento mencionado anteriormente. Este experimento buscó homologar el micro-clima que hay a esta altura y aumentar la posibilidad de una infección por Psa. Cada contenedor por tratamiento tuvo 4 repeticiones. El tercer experimento consistió en tratar con los tratamientos a cada planta adulta de kiwi donde se colocó la maceta con la planta de 1 ó 2 años o las plántulas contenidas en los contenedores.
Los tratamientos a aplicar sobre las plantas y plántulas de kiwi consistieron en un testigo agua, un tratamiento con hidróxido de cobre (Kocide® 2000, Anasac, Chile S.A) en dosis de 250 g hL-1, acibenzolar-S-Metil (Bion® 50 WG, Syngenta, Chile) en dosis de 20 g hL-1, dos tratamientos con bacterias P. protegens cepas ChC7 y cepa Ca2 aplicadas de forma separada, y una mezcla de ambas bacterias al 50%. Las suspensiones bacterianas fueron obtenidas mediante el cultivo por 48 h a 24°C en medio King B hasta alcanzar una población > 108 ufe mL 1, y fueron utilizado dicho fermentado bacteriano en dosis al 50% diluida en agua en los ensayos en maceta al piso y plántulas en la canopia, mientras que en las aplicaciones en planta adulta fueron aplicadas al 2% diluida la suspensión bacteriana en agua. En San Carlos, por ser un huerto orgánico, en el experimento con planta adulta, Bion® 50WG fue reemplazado por el producto Nacillus® WP en dosis de 150 g hL-1.
Los tratamientos fueron aplicados tres veces en la temporada, los días 07 y 21 de octubre y 04 de noviembre para el experimento en San Carlos, y los días 14 y 28 de octubre y 11 de noviembre en el experimento en Pichingal. En la primera aplicación, las plantas usadas en el experimento con maceta al piso y con plántulas en la canopia fueron tratadas en el invernadero el día antes a ser colocadas en el huerto, mientras que las plantas adultas fueron tratadas en las fechas que se mencionan arriba. El experimento con plántulas en la canopia recibió sólo dos aplicaciones dado que las plantas fueron colocadas en el huerto en la segunda fecha de aplicación los días 21 y 28 de octubre para San Carlos y Pichingal, respectivamente. También, en la última aplicación realizada, debido a estar en el estado de inicio de floración se suspendieron la aplicación de los productos en base a cobre en el experimento con plantas adultas. En ambos sitios experimentales se ocuparan 3 hileras adultas dejándose la hilera central para colocar las unidades experimentales de cada experimento, distribuyéndose éstas en un diseño de bloques completos al azar a lo largo de la hilera. Las hileras borde en ambos lugares de ensayo fueron tratadas con cobre (Kocide® 2000 WP, 250 g hL_1, Anasac Chile), aplicado en forma focalizada a cada planta de estas hileras, para evitar una posible deriva del producto hacia las macetas o plantas de los tres experimentos.
Las plantas de los tres experimentos en ambos sitios experimentales fueron evaluados previo a la tercera aplicación y después de esta última aplicación, se evaluó el daño en hojas a los 7, 14, 21 y 28 días posteriores, mediante el conteo de manchas necróticas sobre un cierto número de hojas o utilizando una escala de daño o severidad para evaluar la severidad de daño en hojas, donde 0 = sin manchas (sano), 1 = 1 a 3 manchas/hoja (incipiente), 2 = 4-10 manchas/hoja (leve), 3 = 11-25 manchas/hoja (moderado) y 5 = 26 o más manchas/hoja (severo).
Los resultados permitieron observar que en plantas en macetas al pie de plantas adultas de kiwi y considerando infección natural del huerto de PSA, se observó en San Carlos que con dos aplicaciones después de 7 días se observaron diferencias entre tratamientos (P<0,05), presentando los bioinductores bacterianos niveles de control similares a el bioinductor comercial (Bion® 50 WG) y estadísticamente distinto del control no tratado (figura 13). Después de 14 días a pesar de observarse en promedio una menor severidad de daño no hubo diferencias entre tratamientos (P = 0,112). Después de tres aplicaciones, se observaron diferencias entre los tratamientos a los 20 y 28 días después de la última aplicación, teniendo los bioinductores un mejor control de la enfermedad después de 20 días siendo diferentes del control y no diferente del hidróxido de cobre y de Bion 50WG. A los 28 días los bioinductores no fueron diferentes del control, pero tampoco del producto Bion 50WG. En plantas adultas logró una reducción de las manchas necróticas cercanas al 50% con respecto al control (figura 14).

Claims

REIVINDICACIONES
1. Cepa para la protección contra la bacteriosis del kiwi, causada por Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) CARACTERIZADA porque corresponde la cepa de Pseudomona protegens depositada en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos con el número de depósito RGM
2328.
2. Cepa para la protección contra la bacteriosis del kiwi, causada por Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) CARACTERIZADA porque corresponde la cepa de Pseudomona protegens depositada en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos con el número de depósito RGM
2329.
3. Uso de las cepas según reivindicación 1 y 2 CARACTERIZADO porque se utiliza para elaborar una formulación que permite generar protección durante el desarrollo del cultivo, especialmente durante la floración.
4. Una formulación para la protección contra la bacteriosis del kiwi, causada por la bacteria Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa), CARACTERIZADA porque comprende una suspensión bacteriana líquida de biomasas de las cepas Pseudomona protegens RGM 2328 y RGM 2329, en medio King B.
5. Uso de la formulación para la protección contra la bacteriosis del kiwi, según reivindicación 4, CARACTERIZADA porque permite proteger de forma directa contra la bacteria patógena, activar genes de defensa presentes en las plantas, y colonizar el interior de la misma reduciendo el daño sistémico que genera la Psa, permitiendo generar protección durante el desarrollo del cultivo, especialmente durante la floración.
6. Uso de la formulación para la protección contra la bacteriosis del kiwi, según reivindicación 4, CARACTERIZADA porque puede ser aplicado sólo o en combinación con otros biocontroladores, cuyo modo de acción es la competencia por espacios.
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