PT100494B

PT100494B - Vector de expressao dictiostelido e processo de expressao de uma proteina desejada

Info

Publication number: PT100494B
Application number: PT100494A
Authority: PT
Inventors: Nicolas Joseph Fasel; Christophe Dominique Reymond
Original assignee: Chf Dictagene S A
Priority date: 1991-05-17
Filing date: 1992-05-15
Publication date: 1999-06-30
Also published as: CA2087339A1; DE69228168D1; DE69228168T2; AU657966B2; WO1992020806A2; ES2125899T3; PT100494A; ZA923597B; DK0540719T3; NL9100869A; IL101897A; WO1992020806A3; EP0540719B1; ATE175720T1; HU217417B; EP0540719A1; JP3398380B2; HUT69139A; MX9202332A; AU1884492A

Description

invento também proporciona hospedeiros dictiostelido recombinantes bem como processos para a preparação de molécula de ADN recombinante do invento e para a expressão de polipéptidos recombinantes codificados pelas referidas molécula de ADN recombinante em hospedeiro dictiostelido. 0 invento refere-se particularmente à expressão da proteína CS de Plasmodium falciparum.

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MEMÓRIA DESCRITIVA
0 presente invento refere-se a	moléculas de ADN

recombinante e a um processo para a expressão das sequências de ADN desejadas em dictiostelidos. Mais particularmente, refere-se a um plasmídeo recombinante e a um processo para a expressão de uma enzima ou antigénio de parasita desejados em dictiostelidos e mais particularmente à expressão do antigénio circunsporosoito de Plasmodium falciparum e cloranfenicolacetil-transferase em Dictvostelium discoideum.

A produção de polipéptidos recombinantès funcionais ou imunogénicos tem sido obtida em múltiplos organismos. Em geral, isola-se o gene de interesse e expressa-se sob o controlo de elementos de ADN específicos permitindo a expressão no hospedeiro particular. Bactérias, células eucarióticas inferiores e superiores e vectores virais têm estado entre os sistemas mais amplamente utilizados.

Plasmodium falciparum, o parasita causador de malária em seres humanos mais frequente, foi encontrado em diferentes formas em insectos e hospedeiros humanos. A utilização de formas de parasitas inactivados como vacinas em mamíferos tem mostrado resultados promissores. Uma limitação é, no entanto, a pequena quantidade de material disponível devido à dificuldade da cultura de parasitas. Os genes que codificam algumas proteínas da superfície celular de diferentes formas têm sido sequenciados, permitindo identificar antiqénios protectores. do hospedeiro possivelmente úteis como vacinas. A expressão destes antigénios ou de outras proteínas de P. falciparum em sistemas recombinantes heterólogos (p.ex., E. coli, leveduras, vírus da varíola bovina, baculovírus, salmonelas) tem sido difícil, e em muitos casos, apenas se obtiveram pequenas quantidades de proteínas completas.

A superfície da primeira forma de Plasmodium falciparum encontrada em organismos após transmissão por picadas de insectos, está incluída na proteína circunsporozoíto (CS). Esta proteína é sintetizada na forma de um polipéptido precursor que

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é composto por uma sequência de sinal amino-terminal removida com o processamento, por um vasto domínio de repetição central flanqueado de ambos os lados por regiões referidas como a região I e II contendo sequências conservadas entre espécies diferentes de Plasmodia e por um domínio âncora carboxi-terminal. O domínio de repetição, consistindo em (ASN-ALA-ASN-PRO)_n, mostrou ser a região imunodominante da célula B de P. falciparum CS. Os péptidos sintéticos contendo esta repetição têm sido utilizados com sucesso limitado como sub-unidades de vacinas em estudos de protecção. Os elementos de resposta da célula T sobre a proteína CS têm si‘dò mápêãdõs fora dos segmentos de repetição. Estes resultados sugerem que toda a proteína CS possa ser utilizada para obter uma protecção imunológica mais forte e mais duradora. Estes dados experimentais indicam ainda a necessidade de uma proteína com os seus epitopos de célula B e T para obter uma vacina eficiente contra a malária.

As dificuldades na produção de elevadas quantidades de proteína CS foram ultrapassadas expressando apenas segmentos da proteína CS in vivo os quais não inferem no entanto uma resposta imunológica suficiente como vacinas. A expressão da proteína completa foi obtida utilizando sistemas de expressão de varíola bovina e baculovírus. No entanto, a expressão instável de proteínas bem como o elevado custo de produção tornam estes sistemas pouco atractivos.

É portanto um objectivo do presente invento proporionar um sistema de expressão para diferentes tipos de proteínas, tais como as proteínas de Plasmodium falciparum, que seja capaz de expressar proteínas a baixos custos.

Verificou-se que as espécies de fungos do lodo Dictvostelium podem ser utilizadas como um sistema de expressão eucariota eficaz para a produção de proteínas recombinantes.

fungo do lodo celular Dictyostelium discoideum (Dd) é um organismo que vive livremente, fácil de crescer e de manter. As

estirpes de Dd podem crescer sobre tapetes de bactérias com um

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PS/MM/1 Lausanne tempo de duplicação de cerca de 3 horas, em suspensões bacterianas a altas densidades (até IO¹⁰ células por litro) ou em meios semi-sintéticos contendo glucose, peptona e extracto de levedura onde o tempo de duplicação é de cerca de 12 horas, o ciclo de vida do Dictvostelium consiste numa fase de crescimento e numa de desenvolvimento. A fase de desenvolvimento é iniciada por desnutrição e é caracterizada pela agregação das células inicialmente individuais para formar uma organismo multi-celular que depois se diferencia para produzir esporos, os quais podem ser armazenados durante um prolongado período de' tempo. A germinação dos esporos em presença de bactérias ou num meio rico permitirá um novo crescimento. Durante este ciclo de desenvolvimento, são produzidos factores difusíveis e para pelo menos um deles (AMPc) a ligação ao seu receptor induz a transcrição de um conjunto de genes específicos (ver Loomis, The development of Dictvostelium discoideum, Acad. Press, 1982).

As propriedades de crescimento e a capacidade de transformação do Dictvostelium discoideum oferece a possibilidade de expressar proteínas estranhas, uma vez que as células podem crescer a baixos custos sobre bactérias e a expressão de proteínas específicas pode ser fortemente controlada pela desnutrição num meio simples.

Numa concretização deste invento a região do promotor homólogo é o promotor Discoidin I de Dictyostelium discoideum o qual está sob controlo em relação ao desenvolvimento. A transcrição a partir deste promotor é induzida por desnutrição na cultura de células de Dictyostelium.

Adicionalmente proporciona-se uma sequência peptídica de comando no vector de expressão. A fusão deste péptido de comando permite exportar a proteína recombinante para a superfície da célula, facilitando assim a identificação da proteína recombinante.

Noutra concretização o invento proporciona um vector de

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-5- /- expressão indutível. 0 promotor Dd ras de Dictyostelium discoideum é aí utilizado como região promotora homóloga. A expressão de genes sob o controlo do promotor Dd ras é iniciada por adição de AMPc à cultura de células. Durante o crescimento celular o nível da transcrição a partir do promotor Dd ras não é detectável, permitindo assim introduzir genes que codificam proteínas potencialmente tóxicas em Dictyostelium. A produção destas proteínas é iniciada pela adição de AMPc durante o desenvolvimento.

invento é ainda ilustrado pelos exemplos seguintes, os quais não devem ser considerados como limitantes do âmbito do presente invento.

EXEMPLOS

Os exemplos seguintes utilizam muitas técnicas bem conhecidas e acessíveis aos peritos na arte da biologia molecular. Estes processos não estão sempre descritos em detalhe.

As enzimas são obtidas a partir de fontes comerciais e utilizadas de acordo com os protocolos dos fornecedores.

Os meios bacterianos e as técnicas correntes de clonagem estão descritos em Sambrook et al. (Molecular cloning: A laboratory manual, CSH Press, 1989).

Os anticorpos monoclonais e o péptido NANP₅₀ foram obtidos de H. Matile (Hoffman La Roche Ltd.).

EXEMPLO 1

Os exemplos seguintes ensinam a expressar o antigénio circunsporozoíto CS de Plasmodium falciparum em Dictyostelium discoideum sob o controlo do promotor Discoidin I.

1.1. Construção de plasmídeos contendo CS vector de expressão pEDI-CS é constituído pelo vector

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-6- pVEII (Maniak e Nellen, Nucl. Acids Res., 18 . 5375, 1990), o qual contem os elementos importantes para a propagação e manutenção num hospedeiro procariota (origem de replicação e resistência a ampicilina), e por um gene de resistência a neomicina codificado por Tn903 conferindo resistência a geneticina (G418) às células eucariotas sob o controlo de uma unidade de transcrição 15 de actina Dictvostelium. A presença de um promotor Discoidin I permite o controlo em relação ao desenvolvimento da expressão das sequências a jusante e as sequências 8 de actina asseguram a terminação adequada do ARN.

Para a construção do vector de expressão pEDl-CS inseriu-se primeiro o fragmento de restricção HaelII + Rsal com 1161 bp do gene NF54 CS (Caspers et al., Mol. and Biochem. Parasitol 35, 185, 1989) no local Asp718 + BamHI do pVEII inserido por ADN polimerase Klenow.

Subsequentemente sintetizaram-se ambas as cadeias de ADN de uma sequência que codifica o péptido de comando do local de contacto A (CsA) mais 3 aminoácidos, num sisntetizador de ADN Applied Biosystem Model 380 B. Confirmou-se a sequência de nucleotidos do péptido de comando sintético (fig. 1) introduzindo o fragmento de extremidades lisas na forma replicativa de M13mpl8 no local Smal, seguido por sequenciação do ADN.

Isolou-se então o fragmento de restricção Xbal+BamHI contendo o péptido de comando CsA e inseriu-se nos locais Xbal+ BamHI presentes no vector para gerar o vector de expressão pEDIII-CS.

1.2. Transformação de Dictyostelium discoideum

Fez-se a cultura das células de Dictyostelium em suspensões agitadas em meio HL-5 até uma concentração de 2-5xl0^/ml, centrifugou-se a 300g e enxaguou-se com água destilada.

Realizou-se a electroporação de 5 pg do ADN desejado em 10⁷ células em 100 μΐ de água destilada a 670 V e 3 μι utilizando um

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-7aparelho Gene Pulser da BioRad, aplicando portanto um pulso de cerca de 1,5 mseg.

Aplicou-se a selecção de G418 progressiva às células até uma concentração de 50 Mg/ml, assegurando a presença de 100 a 200 cópias de repetições em série de ADN inserido.

1.3. Expressão de CS com desnutrição ao nível do ARN.

Preparou-se ARN de células crescidas em meio HL-5 (fase vegetativa) ou após 4, 8 ou 15 horas de desnutrição em PDF, respectivamente.

Para isso, lisaram-se 10⁷ células em Tris 50mM pH 8,5, SDS a 0,1%, complexo de vanadilo a lmM e extractaram-se 3 vezes com fenol:clorofórmio 1:1.

Trataram-se 15 /xg de ARN com glioxal e submeteram-se a electroforese sobre um gel de agarose a 0,8%. Transferiram-se as amostras para o Genescreen mais filtros, com um dispositivo de vacugene. Geraram-se sondas de ARN anti-sentido inserindo os fragmentos de ADN no vector pGEM-1, e realizaram-se as reacções da Sp6-ARN polimerase. Hibridaram-se os filtros durante 48 horas a 55 °C numa solução contendo formamida a 50%, 5XSSC (lXSSC=NaCl 0,15M, citrato de sódio 15mM), albumina de soro bovino a 0,2%, Ficoll a 0,2%, polivinilpirrolidona a 0,2%, Na₂HPO₄ 25mM, NaH₂PO₄ 25mM, SDS a 0,2%, EDTA lmM, 250 gg/ml de ADN desnaturado e 500 Mg/ml de ARN de leveduras. Lavaram-se os filtros 5x15 min em O,1XSSC, SDS a 0,12% a 65°C.

Nas transferências de Northern, detectou-se uma espécie de ARN de 1,4 kb em células transfectadas com pEDII-CS, enquanto que não se detectou qualquer sinal nas células transfectadas com pVEII. A quantidade de ARN CS em estado estacionário aumenta após 4 horas de desnutrição, seguida por uma diminuição na expressão após 15 horas.

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-81.4. Expressão de CS com desnutrição ao nível das proteínas.

Prepararam-se proteínas a partir das mesmas alíquotas usadas no exemplo 1.3. para a análise da expressão da CS após desnutrição ao nível das proteínas.

Lisaram-se as células em 1 X tampão de Laemmli a 100 °C durante 5 min e separaram-se as proteínas em 10% de SDS-PAGE. Electrotransferiram-se as proteínas para um filtro de nitrocelulose. Adicionou-se 0,2 mg/ml do anticorpo monoclonal anti-NANP para o filtro durante uma noite dé incubação à temperatura ambiente. Utilizou-se ¹²⁵I-proteína A para revelar a reacção do anti-NANP.

As transferências de Western não revelaram expressão de CS em células com pVEII e revelaram uma expressão máxima em células com pEDII-CS após 4 horas de desnutrição. Detectou-se uma única banda com massa molecular de 62 kDA. Não se observaram outras espécies de reacções cruzadas. Esta indução da expressão segue o perfil esperado para a regulação do gene Discoidin I.

1.5. Reconhecimento do epitopo do NANP na proteína CS.

Para confirmar o reconhecimento do epitopo do NANP presente na proteína CS, fez-se competir a ligação de um anticorpo monoclonal anti-NANP para a proteína CS expressa em Dd com um péptido NANP₅q. Lisaram-se as células de expressão do polipéptido CS, separaram-se as proteínas por SDS-PAGE e transferiram-se para um filtro de nitrocelulose. Antes da incubação, incubou-se o anticorpo monoclonal anti-NANP^g com diferentes quantidades de um péptido NANP₅₀ que correspondem ao número de repetições de NABPgg presentes na proteína CS. Um décimo da quantidade equimolar de péptido NANP₅₀ foi suficiente para observar uma redução significativa na ligação do anticorpo monoclonal à proteína CS.

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1.6. Reconhecimento de diferentes epítopos de CS de Plasmodium falciparum por anticorpos monoclonais.

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Utilizaram-se diferentes anticorpos monoclonais contra proteínas CS ou péptidos sintéticos no ensaio de imunotransferência. Lisaram-se as células Dd, separaram-se as proteínas por SDS-PAGE e transferiram-se para um filtro de nitrocelulose. Incubaram-se as tiras de filtros com diferentes anticorpos monoclonais de várias categorias (SP 3B4, SP3.E9, CT3.3, CT3.1, SP3.H3, SP3.E6, SP3.C6). 0 reconhecimento dos epítopos foi visível apenas com os anticorpos esperados'. Em nenhum caso se observou um sinal específico em células que expressão apenas pelo vector pVEII.

1.7. Purificação da proteína CS produzida em Dictyostelium discoideum.

Ao nível dos aminoãcidos, a proteína CS contém um segmento hidrofóbico carboxi-terminal que pode desempenhar um papel como um sinal para a adição de uma âncora de glicosil-fosfatidil-linositol (GPI). Este segmento de péptido C-terminal ou uma âncora GPI adicionada pós-tradução deve conferir uma natureza hidrofóbica à proteína CS permitindo assim a sua partição em Triton X-114.

Extractaram-se as proteínas das células com Triton X-114 a 1% e separaram-se nas fases aquosa e do detergente. Analisaram-se as proteínas solúveis no detergente por transferência de Western. Estavam presentes pelo menos 10 vezes mais proteínas na fase aquosa do que na fase do TX-114, estimada por um ensaio de Biorad Protein e também como constactado pela coloração de Ponceau. Observa-se um forte sinal na fase do TX-114 de células que expressam a CS, mesmo que ainda uma certa quantidade de proteína permaneça na fase aquosa. Não se encontrou qualquer sinal na amostra de pVEII. O tratamento com Triton X-114 permite portanto uma primeira purificação parcial da proteína recombinante.

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De modo a purificar adicionalmente a proteína CS expressa por Dictvostelium, marcaram-se em pulsos as células de CS com [³⁵S]-metionina durante duas horas após um período inicial de desnutrição de duas horas. Removeram-se as células por centrifugação, lisaram-se em tampão de lise Crumpton e pré-limparam-se com Sepharose-proteína A. Carregaram-se as proteínas solúveis em TX-114 numa coluna de afinidade contendo anticorpo anti-NANP reticulado na Sepharose. Após eluição da coluna na presença de glicina 0,1 M(pH 2,5), detectou-se a proteína marcada com metionina com um peso molecular aparente de 62 kDa por SDS-PÀGE e fluorografia. A mesma experiência realizada com células contendo o pVEII revelou apenas bandas menores de diferentes pesos moleculares (Fig.3).

1.8. Expressão na superfície celular.

Se correctamente processada, a proteína CS deve estar presente sobre a superfície celular. Análises de separação por fluorencência de células activadas utilizando um anticorpo anti-NANP mostraram que a proteína CS é expressa à superfície das células de Dictvostelium discoideum.

1.9. Sequenciação terminal.

De modo a determinar quais das proteínas CS expressas estavam completas, isolou-se a proteína CS, utilizando uma separação de fase de Triton X-114 e cromatografia de imunoafinidade, para sequenciar a sua extremidade N.

Não se conseguiu obter nenhuma sequência da proteína completa, indicando um bloqueio provável na extremidade amino. Quando se efectuou a purificação em presença de menos inibidores de proteases, obteve-se uma sequência de aminoácidos em que faltam os primeiros 25 aminoácidos. Quando apenas se utilizou benzamidina estavam ausentes até 33 aminoácidos da extremidade N, sugerindo que a protease endógena pode atacar a proteína CS durante a sua purificação. Como mostrado, este problema pode ser resolvido utilizando inibidores de proteases e está limitado aos

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-11- -ã primeiros 20 aminoácidos.

EXEMPLO 2

O exemplo seguinte ensina a expressar o antigénio circunsporozoíto CS de Plasmodium falciparum em Dictvostelium discoideum fundido num péptido de comando do local de contacto A e sob o controlo de um promotor indutível (Dd ras).

2.1. Sequência de ADN da promotor Dd ras.

A sequência de ADN do promotor Dd ras Utilizado neste exemplo é idêntica aos nucleótidos 1 a 401 da figura 4 (ver também o exemplo 3).

2.2. Construção do vector pERI-CS

Excisou-se a região do promotor Discoidin I de pEDII-CS utilizando digestão de restricção com PacI, deixando 68 nucleótidos da sequência de Discoidin I transcritos mas não traduzidos, o codão AUG, o péptido de comando do local de contacto A e a região que codifica a CS (ver figura 2). Obteve-se um fragmento do promotor Dd ras abrangendo os nucleótidos 1 a 401 da figura 4 por digestão com exonuclease III e adição de ligantes BamHI. Após alisamento das extremidades com T4-polimerase, ligou-se este fragmento no vector de CS digerido com PacI mencionado anteriormente para se obter o pERI-CS.

2.3. Expressão da proteína CS.

Re-introduziu-se a construção pERI-CS do exemplo 2.2. em Dictvostelium e analisaram-se as células quanto à expressão de CS por transferência de Western (ver exemplo 1.4.; resultados não mostrados). A expressão de CS foi muito baixa em células vegetativas desnutridas em suspensão em PDF. Observou-se um aumento de cerca de 100 vezes no nível de proteína CS já após uma hora de adição de AMPc (0,2mM). Duas horas de indução adicional aumentaram a expressão enquanto o nível da proteína CS diminuiu após 16 horas de incubação.

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-12EXEMPLO 3 exemplo seguinte ensina a expressar cloranfenicol acetiltransferase em Dictvostelium discoideum utilizando um vector de expressão indutível.

3.1. Sequência de ADN do promotor Dd ras.

Inseriu-se o fragmento de restricção Rsal do clone genómico do Dd ras no local Smal do pGEMl. Realizou-se a sequenciação utilizando iniciadores específicos sobre o ADN de cadeia dupla.

A fig. 4 mostra a sequência de ADN do fragmento Rsal. As setas indicam os locais de início da transcrição. A seta grossa corresponde ao maior transcrito detectado com adição externa de AMPc. As setas tracejadas indicam ainda locais de início de ARN usados durante o desenvolvimento normal do Dd. Met é o codão de início da proteína Dd ras. A região essencial para a função promotora está sublinhada. * corresponde à interrupção de uma delecção 3' proporcionando um fragmento de ADN compreendendo os nucleótidos 1 a 434; ** indica à interrupção de uma delecção 3' proporcionando um fragmento de ADN compreendendo os nucleótidos 1 a 401; *** corresponde à interrupção de uma delecção 5' proporcionando um fragmento de ADN compreendendo os nucleótidos 418-630.

3.2. Construção do vector contendo CAT.

Colocaram-se partes das sequências do promotor Dd ras no vector pAV-CAT (May et al., Mol. Cell Biol. 9_, 4653, 1989). A construção resultante assemelha-se ao pEDII-CS com a CS e os péptidos de comamdo substituídos por um gene cloranfenicolacetil-transferase (CAT), o promotor Discoidin I pelo promotor Dd ras e o gene de resistência G418 sob o controlo da região promotora e terminadora 15 de actina colocado com orientação oposta.

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3.3. Expressão da cloranfenicolacetil-transferase em

Dictvostelium discoideum ao nível do ARN.

-13Re-introduziram-se as construções do exemplo 2.2. em Dictyostelium e analisaram-se as células quanto à expressão de CAT ao nível do ARN.

Preparou-se ARN de células Dd transformadas com um vector pAV-CAT recombinante contendo partes do fragmento Rsal do promotor Dd ras. Isolou-se o ARN de células desnutridas durante 7 horas. Metade das células receberam AMPc (0,2mM) durante 1 hora antes da preparação do ARN. Após separação sobre gel de agarose (MES-glioxal) e transferência para Genescreen, sondou-se o ARN com o vector completo pAV-CAT marcado por tradução por corte.

Os transcritos de CAT eram detectáveis após a indução de AMPc com fragmentos do promotor Dd ras contendo pelo menos a sequência sublinhada na fig. 4. Delecções adicionais aboliram a acumulação de ARN CAT. A acumulação óptima de transcrito de CAT ocorreu com uma sequência contendo ADN 1 a 401 (** na fig.4).

3.4. Expressão de cloranfenicolacetil-transferase em Dictyostelium discoideum ao nível das enzimas.

Lisaram-se 10⁷ células Dd contendo vectores pAV-CAT com os nucleótidos 1 a 434, 1 a 401 e 418 a 630, respectivamente, em três ciclos de congelação - descongelação. Após centrifugação a 12000 rpm durante 5 min ensaiou-se a actividade da CAT no sobrenadante durante 30 min pelas técnicas descritas (Gorman et al. , Mol. Cell Biol. 2., 1044, 1982). Devido às grandes quantidades de actividade da CAT nos extractos, apenas se utilizou 1 μΐ dos 50 μΐ de sobrenadante para assegurar que se estava na fase linear da reacção.

Os ensaios da actividade da CAT mostraram não apenas a presença de uma enzima funcional nos extractos de Dd, mas também a indução com as construções adequadas.

Claims

REIVINDICACÕES

1 - Molécula de ADN recombinante adequada para a expressão de um polipéptido funcional desejado ou de um seu intermediário num hospedeiro dictiostelido, caracterizado por a molécula de ADN recombinante compreender uma região promotora homóloga Dictvostelium discoideum, uma sequência de ADN heterólogo com uma sequência peptídica homóloga de Dictvostelium discoideum, capaz de funcionar como uma sequência peptidica de comando posicionada a montante de si e na estrutura de leitura adequada a si e uma região de terminação homóloga dé Dictvostelium discoideum, codificando a sequência de ADN heteróloga um polipéptido funcional desejado ou de um seu intermediário, estando a referida sequência de ADN posicionada a jusante da região promotora e estando a referida região de terminação posicionada a jusante da sequência de ADN.
2 - Molécula de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o hospedeiro dictiostelido ser Dictvostelium discoideum.
3 - Molécula de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 1-2, caracterizada por a sequência de terminação homóloga ser a sequência de terminação 8 de actina Dictvostelium discoideum ou uma sua versão mutada.
4 - Molécula de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 1-3, caracterizada por a região promotora ser o promotor Discoidin I de Dictvostelium discoideum ou uma sua versão mutada.
5 - Molécula de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 1-3, caracterizada por a região promotora ser o promotor Dd ras de Dictvostelium discoideum ou uma sua versão mutada.
6 - Molécula de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 1-3, caracterizada por a região promotora ser

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-15composta pelos pares de bases 1 a 401 do promotor Dd ras como apresentado a seguir:

Rsa I Cia 1

I-----------------1 I I

1 GTACATAATATTTTTGTGTTCTTATAATTTGGTTAAATCGATGAATAATA
7 - Molécula de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 1-6, caracterizada por a sequência de ADN

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PS/MM/1 Lausanne heteróloga codificar uma proteína do parasita.
8 - Molécula de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por a proteína do parasita ser uma proteína de um parasita de ser humano ou animal.
9 - Molécula de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por a proteína ser uma proteína de Plasmodium spp.
10 - Molécula de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por a proteína dè Plasmodium spp ser uma proteína de Plasmodium falciparum.
11 - Molécula de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por a proteína de Plasmodium falciparum ser o antigénio circunsporozoíto.

Molécula de ADN recombinante de acordo com qualquer caracteri z ada de uma das reivindicações anteriores, de ADN do péptido de comando homólogo discoideum ser a sequência que se segue por a sequência Dictvostelium

XBal

5'

ATG TCT AGA TTT TTA GTA TTG ATA ATA TTA TAT AAT ATT TAC ACA TCT AAA AAT CAT AAC TAT TAT AAT ATA TTA TAA TTA AAT AGT GCA CAT TCA GCT CCA ACC CAG GAT CCA TG AAT TTA TCA CGT GTA AGT CGA GGT TGG GTC CTA GGT AC

3' j

L

BamHI ou uma sua versão mutada.
13 - Molécula de ADN recombinante de acordo com as reivindicaçõas 1-6, caracterizada por a sequência de ADN heteróloga codificar uma proteína com actividade enzimática.

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PS/MM/1 Lausanne *
14 - Estirpe de dictiostelido caracterizada por compreender uma molécula de ADN recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.
15 - Estirpe de dictiostelido caracterizada por expressar o antigénio circunsporozoíto de Plasmodium falciparum.
16 - Estirpe de dictiostelido caracterizada por expressar uma proteína enzimaticamente activa obtida por uma molécula de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 13.
17 - Dictyostelium discoideum (pEDII-CS) caracterizado por possuir o número de acesso de depósito CBS 238.91.
18 - Processo de produção de uma molécula de ADN recombinante para a expressão de um polipéptido desejado em dictiostelidos caracterizado por compreender:

a) linearizar uma molécula de ADN contendo as sequências promotora e terminadora homólogas de Dictyostelium para obter uma molécula de ADN linear;

b) isolar uma sequência de ADN heterólogo que codifica o polipéptido desejado;

c) ligar a referida molécula de ADN linearizada e a referida sequência de ADN isolada para obter uma primeira molécula de ADN recombinante.

d) sintetizar uma sequência de péptidos de comando como a apresentada na reivindicação 12;

e) linearizar o primeiro plasmídeo recombinante do passo c) para obter o ADN plasmídico linearizado; e

f) ligar o referido plasmídeo recombinante linear e a referida sequência peptídica de comando sintetizada para obter uma segunda molécula de ADN recombinante para transformação de um hospedeiro dictiostelido.
19 - Processo de acordo com a reivindicação 18 para a produção de plasmídeos recombinantes pEDII-CS, caracterizado por a molécula de ADN contendo as sequências promotora e terminadora homólogas de Dictyostelium discoideum ser pVEII, a sequência de

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JfV

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ADN heteróloga ser o gene CS NF54 de Plasmodium falciparum, o primeiro plasmídeo recombinante ser pEDI-CS, e a sequência peptídica de comando ser a sequência apresentada na reivindicação 12 ou uma sua versão mutada.
20 - Processo de produção de polipéptidos recombinantes, caracterizado por compreender:

a) preparar um vector de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13 codificando uma sequência polipeptídica desejada;

b) transformar uma cultura de células hospedeiras dictiostelido com o referido vector de expressão para obter uma célula hospedeira dictiostelido recombinante;

c) fazer uma cultura das referidas células hospedeiras dictiostelido recombinantes sob condições que permitem a expressão da sequência de ADN que codifica o polipéptido recombinante desej ado; e

d) recuperar o referido polipéptido recombinante.
21 - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o polipéptido desejado ser uma proteína de parasita.
22 - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o polipéptido desejado ser uma proteína de parasita de ser humano ou animal.
23 - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o polipéptido de parasita desejado ser uma proteína de Plasmodium spp.
24 - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por a proteína de Plasmodium spp ser uma proteína de Plasmodium falciparum.
25 - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por a proteína de Plasmodium falciparum ser o antigénio circunsporozoíto.

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PS/MM/1 Lausanne
26 - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o polipéptido desejado ser um polipéptido possuindo actividade enzimática.
27 - Processo de acordo com a reivindicação 20-26, caracterizado por a cultura de células hospedeiras dictiostelido ser Dictvostelium discoideum.
28 - Processo de acordo com a reivindicação 20-27, caracterizado por as condições que permitem a expressão da sequência de ADN compreenderem submeter a desnutrição a cultura de células Dictyostelium.
29 - Processo de produção de uma molécula de ADN recombinante para a expressão de um polipéptido desejado possuindo actividade enzimática em dictiostelidos caracterizado por compreender:

a) linearizar o pAV-CAT para obter uma molécula de ADN linear;

b) isolar pelo menos partes do promotor Dd ras de Dictvostelium discoideum;

c) ligar a referida molécula de ADN linearizada e a referida sequência promotora isolada para obter uma molécula de ADN recombinante para transformação de um hospedeiro dictiostelido;
30 - Processo de produção de polipéptidos possuindo actividade enzimática, caracterizado por compreender:

a) preparar um vector de expressão de acordo com o processo da reivindicação 29;

b) transformar uma cultura de células hospedeiras dictiostelido com o referido vector de expressão para obter uma célula hospedeira dictiostelido recombinante;

c) fazer uma cultura das referidas células hospedeiras dictiostelido recombinantes sob condições de desnutrição de modo a permitir a expressão da sequência de ADN que codifica o polipéptido recombinante desejado possuindo actividade enzimática após adição de cAMP; e

d) recuperar o referido polipéptido recombinante possuindo