RS60902B1 - Kompozicije korisne u lečenju nedostatka ornitinske transkarbamilaze (otc) - Google Patents

Kompozicije korisne u lečenju nedostatka ornitinske transkarbamilaze (otc)

Info

Publication number
RS60902B1
RS60902B1 RS20201154A RSP20201154A RS60902B1 RS 60902 B1 RS60902 B1 RS 60902B1 RS 20201154 A RS20201154 A RS 20201154A RS P20201154 A RSP20201154 A RS P20201154A RS 60902 B1 RS60902 B1 RS 60902B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
hotc
sequence
nucleic acid
seq
acid sequence
Prior art date
Application number
RS20201154A
Other languages
English (en)
Inventor
Lili Wang
James M Wilson
Original Assignee
Univ Pennsylvania
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Pennsylvania filed Critical Univ Pennsylvania
Publication of RS60902B1 publication Critical patent/RS60902B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1018—Carboxy- and carbamoyl transferases (2.1.3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12Y201/03—Carboxy- and carbamoyltransferases (2.1.3)
    • C12Y201/03003—Ornithine carbamoyltransferase (2.1.3.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14033—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14071—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Opis
IZJAVA VEZANO ZA ISTRAŽIVANJE ILI RAZVOJ KOJI SPONZORIŠE DRŽAVA
[0001] Ovaj rad su delimično podržali Nacionalni instituti za zdravlje, br. P01-HD057247, P01-HL059407, i P30-DK047757. Vlada SAD može da ima određena prava u ovom pronalasku.
POZADINA OVOG PRONALASKA
[0002] Nedostatak ornitinske transkarbamilaze (OTC) čini gotovo polovinu slučajeva urođenih grešaka sinteze uree, sa procenjenom prevalencom od najmanje 1 u 15,000. Oštećenja ciklusa uree dovode pacijente u rizik od životno ugrožavajućeg povećanja amonijaka što može da dovede do trajnog kognitivnog oštećenja, kome i smrti. Novorođenčad muškog pola sa potpunim nedostatkom razvijaju hiperamonemičnu komu u prva 3 dana života, koja je, ukoliko se ne leči, smrtonosna.
[0003] Kod trenutnih terapija za nedostatak OTC (OTCD) postoje brojni izazovi. Pacijentima se može upravljati ishranom sa niskim sadržajem proteina u kombinaciji sa upotrebom lekova koji aktiviraju alternativne puteve čišćenja azota, ali ovo ne sprečava hiperamonemične krize. Uprkos upotrebi dijalize i terapije alternativnog puta, stopa smrtnosti kod novorođenčadi iznosi gotovo 50%. Transplantacija jetre može da izleči OTCD, ali davalac jetre je ograničavajući, postupak nosi značajan morbiditet i imunosupresivi su neophodni kako bi subjekat nastavio da živi.
[0004] Genska terapija metaboličke bolesti kao što je OTCD predstavlja izazovniji model za terapiju zamene gena od drugih stanja. Budući da gen deluje na ćelijski-autonoman način (tj., može da utiče samo na ćeliju u kojoj je eksprimiran), terapeutski efekti bi trebalo direktno da budu u korelaciji sa određenim brojem ciljanih ćelija koje se prenose, pre nego sa neto nivoom ekspresije u jetri kao što je sa izlučenim proteinom gde visoka ekspresija po ćeliji može da prevaziđe malu transdukciju. Dalje, postoji najmanje jedan objavljeni izveštaj da je mRNK hOTCwt nestabilna. [Wang, L., et al, Molecular Genetics and Metabolism, 105 (2012) 203-211].
[0005] Objavljeni su izveštaji upotrebe virusnih vektora u cilju pokušaja lečenja nedostatka OTC. Na primer, nekoliko grupa je probalo ovo kod mišjih modela nedostatka OTC, pomoću rekombinantnih adenovirusa koji nose cDNK OTC pacova, miša, ili čoveka. Na primer, Wang, L. et al. (Mol Genet Metab.
2012 February; 105(2): 203-211) pokazuje da pretklinička procena AAV8 vektora kliničkog kandidata za nedostatak ornitinske transkarbamilaze (OTC) otkriva funkcionalni enzim iz svakog trajnog genoma vektora. Wang, L. et al. (Molecular Therapy, vol.20, no. Suppl.1, S56) obezbeđuje neonatalnu gensku terapiju za OTC nedostatak. Neke mere uspešne rekonstitucije OTC dejstva u jetri i ispravljanja metaboličkih poremećaja su prijavljene kod životinjskih modela koji nose cDNK OTC pacova ili miša.
Prethodna ispitivanja koja koriste adenovirusne vektore su pokazala poteškoće eksprimiranja dovoljnih nivoa aktivne humane OTC kod miševa sa OTCD.
[0006] Samim tim, postoji potreba za drugim pristupima OTCD terapiji.
KRATAK SADRŽAJ PRONALASKA
[0007] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje rekombinantni virusni vektor koji obuhvata ekspresionu kasetu koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humanu ornitinsku transkarbamilazu (hOTC) i ekspresione kontrolne sekvence koje usmeravaju ekspresiju hOTC u ćeliji jetre, pri čemu je hOTC sekvenca nukleinske kiseline manje od 80% identična hOTC sekvenci divljeg tipa u odnosu na zrelu sekvencu ili hOTC pune dužine SEQ ID NO: 1, i eksprimira funkcionalnu hOTC, pri čemu je pomenuta hOTC sekvenca nukleinske kiseline izabrana od sekvence nukleinske kiseline koja obuhvata SEQ ID NO: 5 ili sekvence nukleinske kiseline koja joj je identična najmanje oko 96 do oko 99 %.
[0008] U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje rekombinantni adeno-asocirani virus (rAAV) sa AAV kapsidom i u njega upakovanom ekspresionom kasetom koja obuhvata najmanje jednu AAV invertnu terminalnu ponovljenu sekvencu (ITR), konstruisanu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira najmanje zrelu humanu ornitinsku transkarbamilazu (hOTC), i ekspresione kontrolne sekvence koje usmeravaju ekspresiju hOTC u ćeliji jetre, pri čemu pomenute ekspresione kontrolne sekvence obuhvataju promoter specifičan za jetru, pri čemu je hOTC sekvenca nukleinske kiseline manje od 80% identična hOTC sekvenci divljeg tipa u odnosu na najmanje zreli hOTC SEQ ID NO: 1 i obuhvata najmanje zreli hOTC SEQ ID NO: 5 ili sekvencu nukleinske kiseline koja joj je najmanje identična oko 96 do oko 99.9 %.
[0009] U jednom aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje rekombinantni virusni vektor koji ima ekspresionu kasetu koja obuhvata konstruisanu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humanu ornitinsku transkarbamilazu (hOTCaza) i ekspresione kontrolne sekvence koje usmeravaju ekspresiju hOTC u ćeliji jetre, pri čemu je hOTC sekvenca nukleinske kiseline manje od 80% identična hOTC sekvenci divljeg tipa preko hOTC pune dužine sekvence divljeg tipa (npr., SEQ ID NO:1), ili njenog fragmenta koji obuhvata zreli hOTC ali kojem nedostaje najmanje nativna liderska sekvenca, ili drugi intermedijer koji obuhvata najmanje zreli hOTC) i eksprimira funkcionalnu hOTCazu. Prigodno, konstruisana sekvenca je poželjno optimizovana kodonom i dalje poboljšana tako da pojačava najmanje jedno od transdukcije, transkripcije i/ili translacije enzima.
[0010] Sekvenca nukleinske kiseline može da obuhvata zreli hOTC SEQ ID NO: 5, ili sekvencu nukleinske kiseline koja joj je identična najmanje oko 96 do oko 99 % ili sekvencu nukleinske kiseline koja obuhvata najmanje zreli hOTC SEQ ID NO: 9, ili sekvencu nukleinske kiseline koja joj je identična najmanje oko 96 do oko 99 %, koja eksprimira funkcionalnu hOTC. U jednom otkrivanju, hOTC predstavlja SEQ ID NO: 5 pune dužine ili sekvencu nukleinske kiseline koja joj je identična najmanje oko 96 do oko 99 % ili sekvencu nukleinske kiseline pune dužine SEQ ID NO: 9, ili sekvencu nukleinske kiseline koja joj je identična najmanje oko 96 do oko 99 %. hOTC sekvenca može biti ona od odgovarajućih nukleotida SEQ ID NO: 3, 4, 8 ili 9. Obimom ovog pronalaska su obuhvaćeni lanci komplementarni sa onima u listi sekvenci. Virusni vektor može biti izabran iz grupe koju čine vektor adeno-asociranog virusa (AAV), adenovirusni vektor, i lentivirusni vektor.
[0011] U daljem aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje rekombinantni adeno-asocirani virus (rAAV) sa AAV kapsidom i u njega upakovanom ekspresionom kasetom koja obuhvata najmanje jednu AAV invertnu terminalnu ponovljenu sekvencu (ITR), konstruisanu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humanu ornitinsku transkarbamilazu (hOTCaza) i ekspresione kontrolne sekvence koje usmeravaju ekspresiju hOTC u ćeliji jetre, pri čemu pomenute ekspresione kontrolne sekvence obuhvataju promoter specifičan za jetru. Konstruisana hOTC sekvenca nukleinske kiseline je manje od 80% identična hOTC sekvenci divljeg tipa u odnosu na zrelu sekvencu ili hOTC sekvencu pune dužine divljeg tipa (npr., SEQ ID NO:1) i eksprimira funkcionalnu hOTCazu. Sintetisana hOTC sekvenca nukleinske kiseline obuhvata najmanje zreli hOTC SEQ ID NO: 5 ili sekvencu nukleinske kiseline koja joj je identična najmanje oko 96 do oko 99.9 % ili sekvencu nukleinske kiseline koja obuhvata najmanje zreli hOTC SEQ ID NO: 9 ili sekvence nukleinske kiseline koja joj je identična najmanje oko 96 do oko 99.9 %.
[0012] Opet u daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje virusni vektor koji obuhvata najmanje hOTC gen koji kodira himernu ornitinsku transkarbamilazu koja obuhvata najmanje zrelu humanu ornitinsku transkarbamilazu sa heterolognim tranzitnim peptidom, pri čemu ta kodirajuća sekvenca iz zrele humane ornitinske transkarbamilaze predstavlja sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO:3, 4, ili 5. Opciono, mogu da budu odabrane sekvence pune dužine od bilo koje od ovih sekvenci, koje uključuju tranzitnu sekvencu. Alternativno, mogu biti odabrani himerni OTC gen uključujući heterolognu tranzitnu sekvencu, kako je ovde opisano, i ove zrele hOTC.
[0013] U drugom aspektu, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja obuhvata nosač i efektivnu količinu vektora, rAAV i/ili virusni vektor ovog pronalaska.
[0014] Opet drugi aspekt predstavlja virusni vektor kako je ovde opisano koji je korišćen u pripremanju leka za isporuku ornitinske transkarbamilaze subjektu kome je to potrebno i/ili za lečenje nedostatka ornitinske transkarbamilaze. U jednom naročito poželjnom načinu ostvarivanja, subjekat je humani subjekat. Ovaj subjekat može biti homozigotni ili heterozigotni za nedostatak ornitinske transkarbamilaze.
[0015] Opet u drugom aspektu, obezbeđena je upotreba virusnog vektora koji obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira funkcionalnu humanu ornitinsku transkarbamilazu u sprečavanju i/ili lečenju fibroze ili ciroze povezane sa nedostatkom ornitinske transkarbamilaze (OTCD) za OTCD kod subjekta. U jednom načinu ostvarivanja, subjekat je humani pacijent. U daljem načinu ostvarivanja, subjekat je heterozigotan i može da ispolji kasni nastanak simptoma.
[0016] Opet u daljem aspektu, upotreba virusnog vektora koji obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira funkcionalnu humanu ornitinsku transkarbamilazu u sprečavanju i/ili lečenju hepatocelularnog karcinoma kod subjekta koji ima OTCD. U jednom načinu ostvarivanja, subjekat je humani pacijent. U daljem načinu ostvarivanja, subjekat je heterozigotan za OTCD i može da ispolji kasniji nastanak simptoma.
[0017] Drugi aspekti i prednosti ovog pronalaska će brzo postati očigledni iz sledećeg detaljnog opisa ovog pronalaska.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0018]
FIG.1A obezbeđuje cDNK hOTC divljeg tipa, koja ima 324 A, 223 C, 246 G, i 269 T [SEQ ID NO: 1]. FIG.1B - 1C obezbeđuje sekvencu humane ornitinske transkarbamilaze koju kodira sekvenca sa FIG.
1A [SEQ ID NO:2].
FIG.2 obezbeđuje konstruisanu cDNK hOTC, sa izmenjenim GC odnosom. Broj baza u sekvenci je 283 A, 285 C, 284 G, i 216 T [SEQ ID NO: 3].
FIG.3 obezbeđuje konstruisanu cDNK hOTC nazvanu LW3 koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline definisanu u SEQ ID NO:4 koja kodira hOTC protein. Broj baza u ovoj sekvenci je 279 A, 303 C, 288 G, i 220 T. Početnom kodonu za hOTC otvoreni ram za čitanje (ORF) je prethodila Kozak sekvenca na ovom crtežu. Kodirajuća sekvenca za vodeću sekvencu počinje na nukleotidu 15 (prvih 96 nukleotida), nakon čega sledi kodirajuća sekvenca za 322 aminokiselinske hOTCaze. Na ovom crtežu zaustavni kodon je praćen NotI restriktivnim mestom (GCGGCCGC) koje predstavlja ostatak vektora.
FIG.4 obezbeđuje konstruisanu cDNK hOTC nazvanu LW4 koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline definisanu u SEQ ID NO:5 koja kodira hOTC protein. Broj baza u ovoj sekvenci je 278 A, 303 C, 289 G, i 220 T. Kodirajuća sekvenca za vodeću počinje na nukleotidu 15 (prvih 96 nukleotida), nakon čega sledi kodirajuća sekvenca za 322 aminokiselinske hOTCaze. Na ovom crtežu zaustavni kodon je praćen NotI restriktivnim mestom (GCGGCCGC) koje predstavlja ostatak vektora.
FIG.5A - 5C obezbeđuju poravnanje cDNK sekvenci hOTC divljeg tipa, i pet konstruisanih sekvenci: GS (koji obuhvata sekvencu nukleinske kiseline definisanu u SEQ ID NO:3), LW3 (koji obuhvata sekvencu nukleinske kiseline definisanu u SEQ ID NO:4), LW4 (koji obuhvata sekvencu nukleinske kiseline definisanu u SEQ ID NO:5), LW5 (koji obuhvata sekvencu nukleinske kiseline definisanu u SEQ ID NO:8) i LW6 (koji obuhvata sekvencu nukleinske kiseline definisanu u SEQ ID NO:9), pri čemu svaka kodira hOTC protein. Poravnane sekvence sadrže Kozak sekvencu (prvih 14 nukleotida LW3 i LW4) i restriktivno enzimsko mesto (nakon terminacionog kodona za LW3 i LW4), koji nisu deo otvorenog okvira čitanja.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0019] Ovde je obezbeđena konstruisana cDNK humane (h) ornitinske transkarbamilaze (OTC), koja je dizajnirana da dovede do maksimuma translaciju i da poboljša stabilnost mRNK u poređenju sa hOTC DNK i/ili mRNK divljeg tipa. Ovde su takođe obezbeđene konstruisane hOTC mRNK sekvence. Ove kompozicije mogu da se koriste kod terapijskih i/ili profilaktičkih postupaka kako je ovde opisano.
Opciono, ove kompozicije su korišćene u kombinaciji sa drugim terapijama koje su u skladu sa standardom brige za stanja koja su dijagnostikovana kod subjekta (npr. humanog subjekta).
[0020] U svrhe poređenja, cDNK sekvenca humanog OTC divljeg tipa je ilustrovana na FIG.1A. Ova sekvenca kodira humanu ornitinsku transkarbamilazu aminokiselinske sekvence sa FIG.1A - 1C. Ova ista aminokiselinska sekvenca je kodirana konstruisanim hOTC genima sa FIG.2A - FIG.5. hOTC enzim, koji može biti označen kao hOTCaza da bi se razlikovao od gena, je eksprimiran iz ove sekvence u obliku prekursora proteina sa vodećim peptidom od 32 aminokiseline na svom N-terminusu (kodiran nt 1-96 sa FIG.1, oko aminokiselina 1 do oko 32 SEQ ID NO: 2) koji je pocepan nakon usmeravanja enzima na celularne mitohondrije, čime se ostavlja „zreo“ protein od 322 aminokiselinska ostataka (oko 33 aminokiseline do oko 354 aminokiseline SEQ ID NO: 2. Ova "takozvana zrela" hOTCaza predstavlja homotrimerni protein sa sekvencom od 322 aminokiselinska ostatka u svakom polipeptidnom lancu. Opciono, kao alternativa sekvenci divljeg tipa SEQ ID NO:2, može se izabrati sekvenca koja uključuje jednu ili više polimorfnih pozicija koje se prirodno javljaju koje nisu obuhvaćene bolešću: F101, L111, WI193-194 SEQ ID NO: 2 (pogledati, npr., http://www.uniprot.org/uniprot/P00480).
[0021] Iako su sve konstruisane cDNK sekvence oko 77% do oko 78% identične wt hOTC sekvenci nukleinske kiseline sa FIG.1A [SEQ ID NO:1], postoje strukturne razlike između ovih sekvenci (pogledati poravnanje na FIG 5 koje ilustruje isto). Određenije, postoji oko 4% razlike u sekvenci nukleinskih kiselina između hOTCco sa FIG.2 [SEQ ID NO: 3] i hOTCcoLW4 sa FIG4 [SEQ ID NO:5]. Postoji samo jedna nt razlika između LW-3 [FIG.3, SEQ ID NO: 4] i LW-4 [FIG 4, SEQ ID NO: 5], tj., razlika od 0.094% (1/1062) razlika (A u LW-3 je promenjeno u G u LW-4 kako je prikazano na FIG 5].
[0022] U jednom načinu ostvarivanja, obezbeđena je modifikovana hOTC kodirajuća sekvenca koja je manje od 80% identična, poželjno oko 77% identična ili manje sa hOTC kodirajućom sekvencom pune dužine divljeg tipa (FIG.1A, SEQ ID NO:1), koja kodira funkcionalnu hOTC. U jednom načinu ostvarivanja, modifikovanu hOTC kodirajuću sekvencu karakteriše poboljšana stabilnost u poređenju sa wt hOTC nakon AAV-posredovane isporuke (npr., rAAV). Pored toga, ili alternativno, obezbeđena je modifikovana hOTC kodirajuća sekvenca kojoj nedostaju alternativni ramovi čitanja za proteine koji u dužini imaju najmanje oko 9 aminokiselina. Pored toga, ili alternativno, obezbeđena je modifikovana hOTC kodirajuća sekvenca koja ima nivoe eksprimiranja hOTCaze najmanje oko 25 puta, najmanje oko 50 puta, ili najmanje oko 100-puta kada se mere nakon ekspresije iz virusnog vektora, u poređenju sa hOTCazom divljeg tipa. Pored toga, ili alternativno, obezbeđena je modifikovana hOTC kodirajuća sekvenca koja ima dejstvo hOTCaze u jetri koje je najmanje 10-struko veće, najmanje oko 20-struko veće, ili najmanje oko 30-struko veće u poređenju sa hOTCazom divljeg tipa eksprimiranom iz virusnog vektora.
[0023] U jednom načinu ostvarivanja, modifikovana hOTC kodirajuća sekvenca je 96% do 99.9% identična sekvenci koja kodira zreli enzim (oko nt 99 do oko 1068) ili pune dužine sa FIG.4 (hOTCco-LW4, SEQ ID NO: 5), ili 96.5% do 99% identična, ili oko 97% , ili oko 98% identična SEQ ID NO:5 (FIG.4).
[0024] U jednom načinu ostvarivanja, modifikovana hOTC kodirajuća sekvenca je 96% do 99.9% identična sekvenci koja kodira zreli enzim (oko nt 99 do oko 1068) sa FIG.3 (hOTCco-LW3, SEQ ID NO:4), ili 96.5% do 99% identična, ili oko 97% , ili oko 98% identična SEQ ID NO: 4 (FIG.3).
[0025] U drugom načinu ostvarivanja, modifikovana hOTC kodirajuća sekvenca je 96% do 99.9% identična sekvenci koja kodira zreli enzim (oko nt 99 do oko 1068) ili pune dužine sa FIG.2 (hOTCco, SEQ ID NO:3), ili 96.5% do 99% identična, ili oko 97%, ili 98% identična SEQ ID NO: 3 (FIG.2).
[0026] Opet u drugom otkrivanju, modifikovana hOTC kodirajuća sekvenca ima sekvencu koja kodira zreli protein (oko nt 99 do oko 1068) ili hOTCco-LW5 [SEQ ID NO: 8] pune dužine ili hOTCco-LW6 [SEQ ID NO:9], ili sekvencu koja joj je 96% do 99.9% identična. hOTCco-LW5 i hOTCco-LW6 su oko 97% identične jedna drugoj, a svaka je oko 78% identična sekvenci divljeg tipa [SEQ ID NO: 1].
[0027] Sekvence sa FIG.2-5 su obezbeđene kao smisaoni lanac cDNK sekvenci. Ovo otkrivanje takođe obuhvata anti-smisaone lance koji odgovaraju onim cDNK sekvencama i odgovarajućim RNK, npr., mRNK, sekvencama. Na primer, konstruisana mRNK SEQ ID NO: 10, odgovara DNK SEQ ID NO:4; konstruisana RNK SEQ ID NO: 11, odgovara DNK SEQ ID NO: 5; konstruisana RNK SEQ ID NO: 12, odgovara DNK SEQ ID NO: 8; i RNK SEQ ID NO: 13 odgovara DNK SEQ ID NO:9. Ove RNK sekvence, i sekvence koje su 95% do 99%, ili oko 97%, ili oko 98% identične jednoj ili više od ovih sekvenci koje su obuhvaćene obimom ovog otkrivanja. Postupci za poravnanje i određivanje RNK identiteta su poznati u tehnici i uključuju objavljene i javno dostupne baze podataka i usluge na internetu ili one komercijalno dostupne. Pogledati, npr., LocARNA, CARNA, kao i druge programe identifikovane bilo gde tamo.
[0028] U jednom načinu ostvarivanja ovog otkrivanja, mRNK sekvenca može biti isporučena upotrebom izabranog sistema isporuke RNK, čiji su primeri dati ovde.
[0029] Ovde su takođe obuhvaćeni fragmenti, npr., sekvence koje kodiraju tranzitni peptid (aminokiseline 1 do oko 32), oko aminokiselina 332 do oko 354, intermedijarni hOTC enzim, ili zreli enzim, ili drugi fragmenti po želji. Referenca može biti upućena na SEQ ID NO:2. Pogledati, npr., Ye et al.
2001, Hum Gene Ther 12: 1035-1046.
[0030] U drugom načinu ostvarivanja, obezbeđena je himerna OTC u kojoj je N-terminalna predsekvenca OTC divljeg tipa zamenjena tranzitnom sekvencom iz drugog izvora koja je kompatibilna sa sistemom subjekta tako da efektivno prenosi zrelu hOTCazu koju kodria himerni OTC gen u željenu
organelu. Pogledati, npr., Ye et al.2001, Hum Gene Ther 12: 1035-1046. Takve tranzitne sekvence kodiraju tranzitni peptid (koji je takođe nazvan signalni peptid, ciljani signal, ili signal lokalizacije) koji je spojen u kodirajuću sekvencu za zreli hOTC SEQ ID NO: 1, 3, 4, i/ili 59. Na primer, hOTC tranzitna sekvenca divljeg tipa odgovara do oko prvih 98 nukleotida SEQ ID NO: 1. Da bi se konstruisala himerna OTC, ove N-terminalne sekvence divljeg tipa mogu biti uklonjene (oko nukleinskih kiselina 1 do oko nt 96 - nt 98) i zamenjene heterolognom tranzitnom sekvencom. Pogodni tranzitni peptidi su poželjno, iako ne nužno humanog porekla. Pogodni tranzitni peptidi mogu biti izabrani sa http://proline.bic.nus.edu./spdb/zhang270.htm, ili mogu biti određeni pomoću različitih kompjuterskih programa za određivanje tranzitnog peptida u izabranom proteinu. Iako nisu ograničene, takve sekvence mogu imati dužinu od oko 15 do oko 50 aminokiselina, ili dužinu od oko 20 do oko 28 aminokiselina, ili mogu biti veće ili manje po potrebi.
[0031] Pojam "procentualni (%) identitet" , " identitet sekvence", "procentualni identitet sekvence", ili "procentualno identična" u kontekstu sekvenci nukleinskih kiselina se odnosi na ostatke kod dve sekvence koje su iste kada se poravnaju radi usklađenosti. Dužina poređenja identiteta sekvenci može biti preko pune dužine genoma, poželjna je puna dužina kodirajuće sekvence gena, ili fragmenta od najmanje oko 500 do 5000 nukleotida. Međutim, identitet među manjim fragmentima, npr. od najmanje oko devet nukleotida, obično najmanje oko 20 do 24 nukleotida, najmanje oko 28 do 32 nukleotida, najmanje oko 36 ili više nukleotida, takođe može biti poželjan.
[0032] Procentualni identitet može odmah da se odredi za aminokiselinske sekvence preko pune dužine proteina, polipeptida, oko 32 aminokiseline, oko 330 aminokiseline, ili njegovog fragmenta peptida ili odgovarajuće sekvence nukleinske kiseline koja kodira sekvence. Pogodni aminokiselinski fragment može da ima dužinu od najmanje 8 aminokiselina, a može da ima do 700 aminokiselina. Generalno, kada se govori o "identitetu", "homologiji", ili "sličnosti" između dve različite sekvence, "identitet", "homologija" ili "sličnost" je određena u kontekstu "poravnane" sekvence. "Poravnane" sekvence ili "poravnanja" se odnose na višestruke sekvence nukleinskih kiselina ili poteinske (aminokiselinske) sekvence, koje često sadrže korekcije za baze koje nedostaju ili su dodate ili za aminokiseline u poređenju sa referentnom sekvencom.
[0033] Poravnanja se izvode pomoću bilo kog od raznih javno ili komercijalno dostupnih programa za višestruko poravnanje sekvenci. Programi za poravnanje sekvenci su dostupni za aminokiselinske sekvence, npr., "Clustal X", "MAP", "PIMA", "MSA", "BLOCKMAKER", "MEME", i "Match-Box" programi. Generalno, bilo koji od ovih programa se koristi sa fabričkim podešavanjima, mada stručnjak u ovoj oblasti može da promeni ova podešavanja po potrebi. Alternativno, stručnjak u ovoj oblasti može da iskoristi drugi algoritam ili kompjuterski program koji obezbeđuje najmanje nivo identiteta ili poravnanje kako je naznačeno u algoritmima i programima. Pogledati, npr., J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., "A comprehensive comparison of multiple sequence alignments", 27(13):2682-2690 (1999).
[0034] Programi za višestruko poravnanje sekvenci su takođe dostupni za sekvence nukleinskih kiselina. Primeri takvih programa uključuju, "Clustal W", "CAP Sequence Assembly", "BLAST", "MAP", i "MEME", koji su dostupni putem servera na internetu. Drugi izvori takvih programa su poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Alternativno se takođe koriste i uslužni programi Vector NTI. Takođe postoje brojni algoritmi poznati u tehnici koji mogu da se koriste za merenje identiteta nukleotidne sekvence, uključujući one koji su sadržani u prethodno opisanim programima. Kao drugi primer, polinukleotidne sekvence mogu biti upoređene pomoću Fasta™, programa u GCG verziji 6.1. Fasta™ obezbeđuje poravnanja i procentualni identitet sekvence regiona najboljeg poklapanja između sekvenci upita i pretraživanja. Na primer, procentualni identitet sekvenci između sekvenci nukleinskih kiselina može da se odredi pomoću Fasta™ sa njegovim zadatim parametrima (dužina reči od 6 i NOPAM faktor za matrice bodovanja) kako je dato u GCG verziji 6.1.
[0035] U jednom načinu ostvarivanja, modifikovani hOTC geni opisani ovde su konstruisani u pogodan genetski element (vektor) koristan za stvaranje virusnih vektora i za isporuku u ćeliju domaćina, koja prenosi na njima nošene hOTC sekvence. Izabrani vektor može biti isporučen bilo kojim pogodnim postupkom, uključujući transfekciju, elektroporaciju, isporuku lipozoma, tehnike spajanja membrana, pelete velike brzine obložene DNK, virusnu infekciju i fuziju protoplasta. Postupci korišćeni da se naprave takvi konstrukti su poznati stručnjacima u manipulaciji nukleinskim kiselinama i uključuju genetski inženjering, rekombinantni inženjering, i tehnike sinteze. Pogledati, npr., Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY.
[0036] Kako se ovde upotrebljava, "ekspresiona kaseta" se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji obuhvata hOTC sekvence, promoter, i može da uključuje druge njegove regulatorne sekvence, pri čemu kaseta može biti upakovana u kapsid virusnog vektora (npr., virusna čestica). Uobičajeno, takva jedna ekspresiona kaseta za stvaranje virusnog vektora sadrži ovde opisane hOTC sekvence flankirane signalima za pakovanje virusnog genoma i druge ekspresione kontrolne sekvence kao što su one opisane ovde. Na primer, za AAV virusni vektor, signali za pakovanje predstavljaju 5' invertnu terminalnu ponovljenu sekvencu (ITR) i 3' ITR.
[0037] U jednom načinu ostvarivanja, ITR sekvence iz AAV2, ili njegova obrisana verzija (ΔITR), su korišćene radi usklađenosti i ubrzanja regulatornog odobrenja. Međutim, mogu biti odabrani ITR od drugih AAV izvora. Tamo gde je izvor ITR-ova od AAV2, a AAV kapsid od drugog AAV izvora, dobijeni vektor može biti nazvan pseudotipizovan.
[0038] Uobičajeno, ekspresiona kaseta za AAV vektor obuhvata AAV 5' ITR, hOTC kodirajuće sekvence i bilo koje regulatorne sekvence, i AAV 3' ITR. Međutim, druge konfiguracije ovih elemenata mogu biti pogodne. Skraćena verzija 5' ITR, nazvana ΔITR, je opisana u kojoj su D-sekvenca i terminalno rezoluciono mesto (trs) izbrisani. U drugim načinima ostvarivanja, koriste se AAV 5' i 3' ITR pune dužine.
[0039] U jednom načinu ostvarivanja, konstrukt predstavlja DNK molekul (npr., plazmid) koristan za stvaranje virusnih vektora. Ilustrativni plazmid koji sadrži poželjne elemente vektora je ilustrovan putem pAAVsc.TBG.hOTCco-LW4, čija je sekvenca SEQ ID NO: 6. Ovaj ilustrativni plazmid sadrži ekspresionu kasetu koja obuhvata: scITR (nt 5 - 109 SEQ ID NO: 6), TATA signal (nt 851-854 SEQ ID NO:6), sintetičku hOTC kodirajuću sekvencu (nt 976-2037 SEQ ID NO: 6), poli A (nt 2182-2046 na komplementu SEQ ID NO: 6), scITR (nt 2378-2211 na komplementu SEQ ID NO: 6), i promoter specifičan za jetru (TBG) (nt 4172-4760) SEQ ID NO: 6). Druge ekspresione kasete mogu da budu generisane pomoću sintetičkih hOTC kodirajućih sekvenci, i drugih ovde opisanih ekspresionih kontrolnih elemenata.
[0040] Skraćenica "sc" u ovom kontekstu se odnosi na samo-komplementarni. "Samo-komplementarni AAV" se odnosi na konstrukt u kojem je kodirajući region koji nosi rekombinantna AAV sekvenca nukleinske kiseline dizajniran da formira intramolekulski dvolančani DNK templat. Nakon infekcije, pre nego čekajući ćelijski posredovanu sintezu drugog lanca, dve komplementarne polovine scAAV će se združiti kako bi nastala dvolančana DNK (dsDNK) jedinica koja je spremna za neposrednu replikaciju i transkripciju. Pogledati, npr., D M McCarty et al, "Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis", Gene Therapy, (August 2001), Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254. Samo-komplementarni AAV su opisani u, npr., U.S. patentu br.6,596,535; 7,125,717; i 7,456,683.
[0041] Ekspresiona kaseta uobičajeno sadrži promotersku sekvencu kao deo ekspresionih kontrolnih sekvenci, npr., koja se nalazi između izabrane 5' ITR sekvence i hOTC kodirajuće sekvence. Ilustrativni ovde opisani plazmid i vektor koriste promoter specifičan za jetru tiroksin vezujući globulin (TBG).
Alternativno mogu da se koriste drugi promoteri specifični za jetru [pogledati, npr., The Liver Specific Gene Promoter Database, Cold Spring Harbor, http://rulai.schl.edu/LSPD/, kao što je, npr., alfa 1 antitripsin (A1AT); humani albumin Miyatake et al., J. Virol., 71:512432 (1997), humAlb; i promoter jezgra virusa hepatitisa B, Sandig et al., Gene Ther., 3:10029 (1996)]. TTR minimalni pojačivač/promoter, promoter alfa-antitripsina, LSP (845 nt)25(potreban je scAAV bez introna); ili LSP1. Mada manje poželjni, drugi promoteri, kao što su konstitutivni promoteri, regulatorni promoteri [pogledati, npr., WO 2011/126808 i WO 2013/04943], ili promoter koji reaguje na fiziološke znakove mogu da se upotrebljavaju mogu da se koriste kod ovde opisanih vektora.
[0042] Pored promotera, ekspresiona kaseta i/ili vektor mogu da sadrže jedan ili više drugih odgovarajućih početaka transkripcije, završetaka, sekvence pojačivača, dovoljno signala za obradu RNK kao što su signali cepanja i signali poliadenilacije (poliA); sekvence koje stabilizuju citoplazmičnu mRNK; sekvence koje pojačavaju efikasnost translacije (tj., Kozak koncenzusna sekvenca); sekvence koje pojačavaju stabilnost proteina; i kada je to poželjno, sekvence koje pojačavaju sekreciju kodiranog proizvoda. Primeri pogodnih poliA sekvenci uključuju, npr., SV40, SV50, goveđi hormon rasta (bGH), humani hormon rasta, i sintetičke poliA. Primeri pogodnih pojačivača uključuju, npr., alfa fetoproteinski pojačivač, TTR minimalni promoter/pojačivač, LSP (promoter TH-vezujućeg globulina/ pojačivač alfa1-mikroglobulina/bikunina), između ostalih. U jednom načinu ostvarivanja, ekspresiona kaseta obuhvata jedan ili više ekspresionih pojačivača. U jednom načinu ostvarivanja, ekspresiona kaseta sadrži dva ili više ekspresionih pojačivača. Ovi pojačivači mogu da budu isti ili mogu međusobno da se razlikuju. Na primer, pojačivač može da uključi Alfa mic/bik pojačivač. Ovaj pojačivač može da bude prisutan u dve kopije koje se nalaze jedna do druge. Alternativno, dvojne kopije pojačivača mogu da budu razdvojene jednom ili više sekvenci. Opet u drugom načinu ostvarivanja, ekspresiona kaseta dalje sadrži intron, npr. Promega intron. Drugi pogodni introni uključuju one koje su poznati u tehnici, npr., kao što su oni opisani u WO 2011/126808. Opciono, može biti izabrana jedna ili više sekvenci kako bi se stabilizovala mRNK. Primer takve jedne sekvence je modifikovana WPRE sekvenca, koja može da bude konstruisana uzvodno od poliA sekvence i nizvodno od kodirajuće sekvence [pogledati, npr., MA Zanta-Boussif, et al, Gene Therapy (2009) 16: 605-619.
[0043] Ove kontrolne sekvence su "operativno povezane" sa hOTC genskim sekvencama. Kako se ovde upotrebljava, pojam "operativno povezane" se odnosi i na ekspresione kontrolne sekvence koje se dodiruju sa genom od značaja i ekspresione kontrolne sekvence koje deluju in trans ili su na distanci da bi kontrolisale gen od značaja.
[0044] Rekombinantni AAV virusni vektori su dobro pogodni za isporuku ovde opisanih hOTC ekspresionih sekvenci. Takvi AAV vektori mogu da sadrže ITR koji su od istog AAV izvora kao kapsid. Alternativno, AAV ITR-ovi mogu biti od različitog AAV izvora za razliku od onog koji snabdeva kapsid.
[0045] Tamo gde bi trebalo da se proizvede pseudotipizovan AAV, ITR-ovi u ekspresiji su izabrani od izvora koji se razlikuje od AAV izvora kapsida. Na primer, ITR AAV2 mogu biti izabrani za upotrebu sa AAV kapsidom sa određenom efikasnošću za ciljanje jetre (npr., hepatociti). AAV kapsidi mogu biti izabrani od AAV8 [US Patent 7790449; US Patent 7282199] i rh10 [WO 2003/042397] za ovde opisane kompozicije. Međutim, drugi AAV, uključujući, npr., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV9, i druge kao što su, npr., oni opisani u WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; US 7588772 B2, ] mogu biti korišćeni kod humanih subjekata.
[0046] U jednom načinu ostvarivanja, obezbeđen je samo-komplementarni AAV. Ovaj virusni vektor može da sadrži Δ5' ITR i AAV 3' ITR. U jednom primeru, virusni vektor je scAAV2/8.TBG.hOTCco. U drugom primeru, virusni vektor je scAAV2/rh10.TBG.hOTCco. Oba ova vektora sadrže 5' ΔITR od AAV2, TBG promoter specifičan za jetru, konstruisanu hOTCco kodirajuću sekvencu ovog pronalaska, SV40 poliA, i 3' AAV2 ITR u AAV8 kapsidu [pogledati, npr., US Patent br.8,318480B2] ili AAV rh10 kapsidu. Sekvenca može biti izabrana od konstruisane hOTC jedne od SEQ ID NO: 3, 4, 5, 8 ili 9. Opciono, tranzitna sekvenca konstruisane hOTC može biti supstituisana heterolognom tranzitnom sekvencom kako bi se obezbedila himerna hOTC, koja zadržava zrelu hOTCazu.
[0047] U drugom načinu ostvarivanja, obezbeđen je jednolančani AAV virusni vektor. Takav vektor može da sadrži 5' AAV ITR i 3' ITR. Jedan primer je AAV2/8.TBG.hOTCco, koji sadrži AAV2 - 5' ITR pune dužine, TBG promoter specifičan za jetru, hOTC kodirajuću sekvencu, goveđi hormon rasta poliA, i AAV2 - 3' ITR. Drugi primer je AAV2/8.TBG.hOTCco-.WPRE.bGH, koji sadrži iste elemente vektora, a dodatno sadrži post-transkripcioni regulatorni element woodchuck virusa hepatitisa (WPRE). U drugim načinima ostvarivanja, WPRE nije prisutan u konstruktima da bi se upotrebljavao in vivo. Konstruisana hOTC sekvenca (ovde skraćena hOTCco) može da bude izabrana od konstruisane hOTC jedne od SEQ ID NO: 3, 4, ili 5. Opciono, tranzitna peptidna sekvenca konstruisane hOTC može da bude supstituisana heterolognom tranzitnom sekvencom da bi se obezbedila himerna hOTC, koja zadržava zrelu hOTCazu.
[0048] Ipak mogu da se izaberu drugi promoteri, uključujući promotere specifične za tkiva. Postupci za stvaranje i izolovanje AAV virusnih vektora pogodnih za isporuku subjektu su poznati u tehnici.
Pogledati, npr. US objavljenu patentnu prijavu br.2007/0036760 (15. februar, 2007.), US Patent 7790449; US Patent 7282199; WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; i US 7588772 B2]. Sekvence AAV8 i postupci stvaranja vektora baziranih na AAV8 kapsidu su opisani u US Patentu 7,282,199 B2, US 7,790,449, i US 8,318,480. U jednom sistemu, ćelijska linija proizvođača je prolazno transfektovana sa konstruktom koji kodira transgen flankiran ITR-ovima i konstruktom(ima) koji kodiraju rep i cap. U drugom sistemu, pakovna ćelijska linija koja stabilno snabdeva rep i cap je prolazno transfektovana sa konstruktom koji kodira transgen flankiran ITR-ovima. U svakom od ovih sistema, AAV virioni su proizvedeni kao odgovor na infekciju sa pomoćnim adenovirusom ili herpesvirusom, koji zahteva razdvajanje rAAV-ova od kontaminirajućeg virusa. U novije vreme, razvijeni su sistemi kojima nije potrebna infekcija pomoćnim virusom da bi se oporavile AAV – potrebne pomoćne funkcije (tj., adenovirus E1, E2a, VA, i E4 ili herpesvirus UL5, UL8, UL52, i UL29, i polimeraza herpesvirusa) se takođe isporučuju, in trans, sistemom. U tim novijim sistemima, pomoćne funkcije mogu biti isporučene prolaznom transfekcijom ćelija sa konstruktima koji kodiraju potrebne pomoćne funkcije, ili ćelije mogu biti konstruisane da stabilno sadrže gene koji kodiraju pomoćne funkcije, čija ekspresija može biti kontrolisana na transkripcionom ili post-transkripcionom nivou. Opet u drugom sistemu, transgen flankiran ITR-ovima i rep/cap geni su uvedeni u ćelije insekata infekcijom vektorima baziranim na bakulovirusima. Radi pregleda ovih proizvodnih sistema, pogledati generalno, npr., Zhang et al., 2009, "Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production," Human Gene Therapy 20:922-929. Postupci pravljenja i upotrebe ovih i drugih AAV sistema proizvodnje su takođe opisani u sledećim U.S. patentima : 5,139,941; 5,741,683; 6,057,152; 6,204,059; 6,268,213; 6,491,907; 6,660,514; 6,951,753; 7,094,604; 7,172,893; 7,201,898; 7,229,823; i 7,439,065.
[0049] Prostor dostupan za pakovanje može biti zatvoren kombinovanjem više od jedne transkripcione jedinice u pojedinačni konstrukt, čime se smanjuje količina prostora potrebne regulatorne sekvence. Na primer, pojedinačni promoter može da usmeri ekspresiju pojedinačne RNK koja kodira dva ili tri ili više gena, a translacijom nizvodnih gena upravljaju IRES sekvence. U drugom primeru, pojedinačan promoter može da usmeri ekspresiju RNK koja sadrži, u pojedinačnom otvorenom okviru čitanja (ORF), dva ili tri ili više gena međusobno odvojenih sekvencama koje kodiraju samo-cepajući peptid (npr., T2A) ili mestom prepoznavanja proteaze (npr., furin). ORF samim tim kodira pojedinačni poliprotein, koji je, ili tokom (u slučaju T2A) ili nakon translacije, pocepan na pojedinačne proteine (kao što su, npr., transgen i dimerizabilni transkrpcioni faktor). Trebalo bi da se ima na umu, međutim, da iako ovi IRES i poliproteinski sistemi mogu da se koriste kako bi uštedeli AAV prostor za pakovanje, oni mogu da se koriste samo za ekspresiju komponenti kojima može da upravlja isti promoter. U drugoj alternativi, transgenski kapacitet AAV može da bude povećan obezbeđivanjem AAV ITR-ova dva genoma koji se podvrgavaju kaljenju kako bi se stvorili konkatameri od glave do repa.
[0050] Opciono, hOTC geni opisani ovde mogu da se koriste kako bi se stvorili virusni vektori koji nisu rAAV. Takvi drugi virusni vektori mogu da uključuju bilo koji virus pogodan za gensku terapiju, uključujući ali bez ograničenja na adenovirus; herpes virus; lentivirus; retrovirus; itd. Prigodno, tamo gde je stvoren jedan od tih vektora, proizvodi se kao virusni vektor bez mogućnosti replikacije.
[0051] "Virus bez mogućnosti replikacije" ili "virusni vektor" se odnosi na sintetičku ili veštačku virusnu česticu u kojoj je ekspresiona kaseta koja sadrži gen od značaja upakovana u virusni kapsid ili omotač, pri čemu bilo kojim virusnim genomskim sekvencama takođe upakovanim unutar virusnog kapsida ili omotača nedostaje replikacija; tj., ne mogu da stvaraju progenijske virone ali zadržavaju mogućnost da inficiraju ciljane ćelije. U jednom načinu ostvarivanja, genom virusnog vektora ne uključuje gene koji kodiraju enzime potrebne za replikaciju (genom može da bude konstruisan kako bi bio "bez trbuha" – koji sadrži samo transgen od značaja flankiran signalima potrebnim za amplifikaciju i pakovanje veštačkog genoma), ali ovi geni mogu da budu obezbeđeni i tokom proizvodnje. Samim tim se smatraju bezbednim za upotrebu u genskoj terapiji jer replikacija i infekcija progenim virionima ne mogu da se jave izuzev u prisustvu virusnog enzima potrebnog za replikaciju. Takvi virusi bez mogućnosti replikacije mogu da budu adeno-asocirani virusi (AAV), adenovirusi, lentivirusi (integrišući ili neintegrišući), ili drugi pogodan izvor virusa.
[0052] Farmaceutske kompozicije opisane ovde su dizajnirane za isporuku subjektima kojima je to potrebno na bilo koji način ili kombinacijom različitih načina. Direktna ili intrahepatička isporuka u jetru je poželjna i opciono može da bude izvedena intravaskularnom isporukom, npr., putem portalne vene, hepatičke vene, žučnim kanalom, ili transplantatom. Alternativno, mogu biti izabrani drugi načini davanja (npr.,oralno, inhalacijom, intranazalno, intratrahealno, intraarterijski, intraokularno, intravenski, intramuskularno, i drugim parentalnim načinima). Konstrukti isporuke hOTC opisani ovde mogu biti isporučeni u pojedinačnoj kompoziciji ili u više kompozicija. Opciono, dva ili više različitih AAV mogu da budu isporučeni [pogledati, npr., WO 2011/126808 i WO 2013/049493]. U drugom načinu ostvarivanja, takvi višestruki virusi mogu da sadrže različite viruse oštećene usled replikacije (npr., AAV, adenovirus, i/ili lentivirus). Alternativno, isporuka može da bude posredovana ne-virusnim konstruktima, npr., "golom DNK", "golom plazmidnom DNK", RNK, i mRNK; kuplovana sa raznim kompozicijama i nanočesticama isporuke, uključujući, npr., miscele, lipozome, kompozicijama katjonskog lipida i nukleinske kiseline, kompozicijama poli-glikana i drugih polimera, lipidima i/ili konjugatima nukleinskih kiselina baziranih na holesterolu, i drugim konstruktima kao što su oni opisani ovde. Pogledati, npr., X. Su et al, Mol. Pharmaceutics, 2011, 8 (3), pp 774-787; objava na internetu: 21. mart, 2011.;
WO2013/182683, WO 2010/053572 i WO 2012/170930. Takvi ne-virusni hOTC konstrukti isporuke mogu da se daju na prethodno opisane načine.
[0053] Virusni vektori, ili ne-virusne DNK ili RNK prenosne grupe, mogu da budu formulisane sa fiziološki prihvatljivim nosačem za upotrebu u genskom prenosu i primenama genske terapije. U slučaju AAV virusnih vektora, kvantifikacija genomskih kopija ("GC") može da bude korišćena kao mera doze koja je sadržana u formulaciji. Bilo koji postupak poznat u tehnici može da se koristi kako bi se odredio broj genomskih kopija (GC) virusa bez mogućnosti replikacije kompozicije ovog pronalaska. Jedan postupak za izvođenje AAV GC titracije broja je sledeći: prečišćeni uzorci vektora AAV su prvo tretirani sa DNazom kako bi se eliminisao ne-kapsulirani DNK genoma AAV ili kontaminirajuća DNK plazmida iz proizvodnog postupka. Čestice otporne na DNazu su zatim podvrgnute tretiranju toplotom kako bi se genom oslobodio iz kapsida. Oslobođeni genomi su zatim kvantifikovani PCR-om u stvarnom vremenu pomoću setova prajmer/proba koji ciljaju specifičan region virusnog genoma (obično poli A signal). Kompozicije virusa bez mogućnosti replikacije mogu da budu formulisane u doznim jedinicama kako bi sadržale količinu virusa bez mogućnosti replikacije koja je u opsegu od oko 1.0 x 10<9>GC do oko 1.0 x 10<15>GC (da bi se lečio prosečan subjekat od 70 kg telesne mase), i poželjno 1.0 x 10<12>GC do 1.0 x 10<14>GC za humanog pacijenta. Poželjno, doza virusa bez mogućnosti replikacije u formulaciji je 1.0 x 10<9>GC, 5.0 X 10<9>GC, 1.0 X 10<10>GC, 5.0 X 10<10>GC, 1.0 X 10<11>GC, 5.0 X 10<11>GC, 1.0 X 10<12>GC, 5.0 X 10<12>GC, ili 1.0 x 10<13>GC, 5.0 X 10<13>GC, 1.0 X 10<14>GC, 5.0 X 10<14>GC, ili 1.0 x 10<15>GC.
[0054] DNK i RNK su generalno izmerene u količinama nukleinskih kiselina u nanogramima (ng) u mikrograme (µg). Generalno, za lečenje kod ljudi poželjne doze RNK su formulisane i daju se u opsegu od 1 ng do 700 µg, 1 ng do 500 µg, 1 ng do 300 µg, 1 ng do 200 µg, ili 1 ng do 100 µg. Slične dozne količine DNK molekula koji sadrži ekspresionu kasetu, a koje nisu isporučene subjektu putem virusnog vektora mogu da se iskoriste za nevirusne konstrukte isporuke hOTC DNK.
[0055] Proizvodnja lentivirusa je izmerena kako je ovde opisano i izražena kao IJ po zapremini (npr., mL). IJ je infektivna jedinica, ili alternativno transdukcione jedinice (TJ); IJ i TJ mogu da se upotrebljavaju naizmenično kao kvantitativna mera titara pripreme čestica virusnog vektora. Lentivirusni vektor se obično ne integriše. Količina virusnih čestica je najmanje oko 3x10<6>IJ, i može da bude najmanje oko 1x10<7>IJ, najmanje oko 3x10<7>IJ, najmanje oko 1x10<8>IJ, najmanje oko 3x10<8>IJ, najmanje oko 1x10<9>IJ, ili najmanje oko 3x10<9>IJ.
[0056] Gore opisani rekombinantni vektori mogu da budu isporučeni u ćelije domaćina prema objavljenim postupcima. rAAV, poželjno suspendovan u fiziološki kompatibilnom nosaču, može da se daje humanom ili nehumanom pacijentu sisaru. Stručnjak u ovoj oblasti lako može da izabere pogodne nosače u smislu indikacije za koju je prenosni virus usmeren. Na primer, jedan pogodan nosač uključuje slani rastvor, koji može da bude formulisan sa raznim rastvorima za puferisanje (npr., fosfatom puferisan slani rastvor). Drugi primeri nosača uključuju sterilni slani rastvor, laktozu, saharozu, kalcijumfosfat, želatin, dekstran, agar, pektin, ulje od kikirikija, ulje od susama i vodu. Izbor nosača ne predstavlja ograničavanje ovog pronalaska.
[0057] Opciono, kompozicije ovog pronalaska mogu da sadrže, pored rAAV i nosača(a), druge konvencionalne farmaceutske sastojke, kao što su konzervansi, ili hemijski stabilizatori. Primeri pogodnih konzervanasa uključuju hlorobutanol, kalijumsorbat, sorbinsku kiselinu, sumpordioksid, propilgalat, parabene, etilvanilin, glicerin, fenol i parahlorofenol. Pogodni hemijski stabilizatori uključuju želatin i albumin.
[0058] Virusni vektori opisani ovde mogu biti korišćeni u pripremi leka za isporuku ornitinske transkarbamilaze subjektu (npr., humanom pacijentu) kome je to potrebno, čime se subjekat snabdeva funkcionalnom hOTCazom, i/ili za lečenje nedostatka ornitinske transkarbamilaze. Tok lečenja može opciono da uključi ponovljeno davanje istog virusnog vektora (npr., AAV8 vektora) ili različitog virusnog vektora (npr., AAV8 i AAVrh10). Opet druge kombinacije mogu biti izabrane pomoću virusnih vektora i ovde opisanih ne-virusnih sistema isporuke.
[0059] U drugom otkrivanju, sekvence nukleinskih kiselina opisane ovde mogu da budu isporučene nevirusnim putem. Na primer, hOTC sekvenca može biti putem sistema nosača za ekspresiju ili isporuku u RNK obliku (npr., mRNK) pomoću jednog broja sistema nosača koji su poznati u tehnici. Takvi sistemi nosača uključuju one koje obezbeđuju komercijalni subjekti, kao što su PhaseRx' takozvana "SMARTT" tehnologija. Ovi sistemi koriste blok-kopolimere za isporuku do ciljane ćelije domaćina. Pogledati, npr., US 2011/0286957 pod nazivom, "Multiblock Polymers", objavljen 24. novembra, 2011.; US 2011/0281354, objavljen 17. novembra, 17, 2011.; EP2620161, objavljen 31. jula, 2013.; i WO 2015/017519, objavljen 5. februara, 2015. Pogledati, takođe, S. Uchida et al, (Feb 2013) PLoS ONE 8(2): e56220. Opet drugi postupci uključuju stvaranje i ubrizgavanje sintetičkih dsRNK [pogledati Soutschek et al. Nature (2004) 432(7014): 173-8; pogledati takođe Morrissey et al. Hepatol. (2005) 41(6): 1349-56], lokalno davanje u jetru je takođe bilo demonstrirano ubrizgavanjem dvolančanog RNK direktno u cirkulaciju koja okružuje jetru pomoću kateterizacije u renalnu venu. [Pogledati Hamar et al. PNAS (2004) 101(41): 14883-8.]. Opet drugi sistemi uključuju isporuku dsRNK i određenije siRNK upotrebom katjonskih kompleksa ili lipozomalnih formulacija [pogledati, npr., Landen et al. Cancer Biol. Ther. (2006) 5(12); pogledati takođe Khoury et al. Arthritis Rheumatol. (2006) 54(6): 1867-77. Druge tehnologije RNK isporuke su takođe dostupne, npr., od Veritas Bio [pogledati, npr., US 2013/0323001, 23. decembra, 2010., "In vivo delivery of double stranded RNA to a target cell" (citostolni sadržaj uključujući RNK, npr., mRNK, eksprimirana siRNK/shRNK/miRNK, kao i ubrizgana/uvedena siRNK/shRNK/miRNK, ili moguće čak i transfektovana DNK prisutna u citostoli upakovanoj unutar egzovezikula i prenesenoj na distalna mesta kao što je jetra)]. Opet drugi sistemi za in vivo isporuku RNK sekvenci su opisani.
Pogledati, npr., US 2012/0195917 (2. avgust, 2012.) (5'-cap analozi RNK za poboljšavanje stabilnosti i povećanje RNK ekspresije), WO 2013/143555A1, 3. oktobar, 2013., i/ili su komercijalno dostupni (BioNTech, Nemačka; Valera (Kembridž, MA); Zata Pharmaceuticals).
[0060] Stoga, u jednom načinu ostvarivanja, ovo otkrivanje obezbeđuje konstruisanu hOTC mRNK zrele sekvence (najmanje oko nt 99 - 1098) ili pune dužine sa SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13, ili sekvence koja joj je najmanje 97% do 99% identična, u kompoziciji za isporuku dvolančane ili jednolančane RNK koja dovodi do ekspresije zrele hOTCaze u ciljanoj ćeliji domaćina, npr., ćeliji jetre.
[0061] Kinetika kompozicije opisane ovde koja sadrži mRNK (isporučenu direktno, u poređenju sa transkribovanom iz DNK molekula isporuke) je naročito dobro pogodna za upotrebu kod subjekata u akutnoj krizi, budući da ekspresija hOTCaze iz mRNK može biti primećena u periodu od nekoliko sati. Kako bi se izbegao brzi klirens RNK, modifikovana je kako je ovde opisano (npr., pomoću cap ili modifikovane baze), tako da njeni efekti mogu da se zadrže preko 24 sata, preko 48 sati, ili do oko 3 dana (oko 72 sata). Može biti poželjno da se zajedno daje mRNk direktno kako je ovde opisano i da se zajedno da u isto vreme ili suštinski isto vreme, DNK ili hOTC kompozicija bazirana na virusnom vektoru kako je ovde definisano. Samim tim, subjekat može da primi neposrednu terapiju, i u vreme kad mRNK-posredovana ekspresija počne da opada, dugoročnija hOTC ekspresija koja se daje ekspresijom posredovanom virusnim vektorom počinje da deluje. Alternativno, subjekat može da primi drugo davanje mRNK-bazirane kompozicije kako je ovde definisano. mRNK kompozicije opisane ovde mogu biti upotrebljene u drugim terapeutskim režimima ili postupcima, uključujući one koji podrazumevaju i OTCD pacijente koji nisu u akutnoj krizi.
[0062] Kompozicije prema ovom pronalasku mogu da obuhvataju farmaceutski prihvatljiv nosač, kako je prethodno definisano. U jednom načinu ostvarivanja, kompozicija obuhvata blok-kopolimer povezan sa hOTC polinukleotidom kako je ovde opisano. Blok-kopolimeri mogu da formiraju micelu, tako da ta micela obuhvata mnoštvo blok-kopolimera.
[0063] Uobičajeno, takva kompozicija sadrži molekul nukleinske kiseline koji obuhvata mRNK sekvencu koja odgovara hOTC sekvenci koja kodira zrelu hOTCazu (najmanje oko nt 99 do 1098). Pored toga, ovaj molekul nukleinske kiseline može da uključuje 5' netranslacioni region (UTR), takođe poznat kao vodeća sekvenca ili vodeća RNK, i jedan ili više opcionih introna(a), opcionih eksona(a), opcionu Kozak sekvencu, opcioni WPRE. i poliA, i 3' UTR flankirajuće kodirajuće sekvence. Pogodne vodeće sekvence uključuju one o kojima je bilo prethodno govora sa hOTC DNK sekvencama. Primeri izvora pogodnih vodećih sekvenci, a da to nisu nativne hOTC vodeće sekvence, ili one koje odgovaraju FIG 2, FIG3 ili FIG4, ili FIG 5, su prethodno opisane. Slično, o izvorima pogodnih introna, poliA i Kozak sekvenci je prethodno bilo reči i primenjuju se za isporuku odgovarajućih RNK sekvenci o kojima je bilo reči u ovom stavu. Dalje, razne modifikacije na RNK mogu biti generisane, npr., modifikovana 5' cap struktura može biti konstruisana u konstrukt kako bi se izbeglo brzo čišćenje mRNK in vivo, ili zbog drugog željenog razloga. Postupci stvaranja takvih 5' cap struktura su poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Pogledati, npr., US 2012/0195917 i WO 2013/143555A1, 3. oktobar, 2013. Pored toga, modifikovani nukleotidi mogu biti korišćeni da bi se napravila mRNK in vitro, kao pseudouridin. Takođe RNK može biti dozirana više puta, ili se subjektu prvo može dozirati mRNK kako bi se upravljalo neonatalnim krizama nakon kojih sledi isporuka posredovana virusnim vektorom (npr., AAV) za dugoročnu terapiju i da bi se sprečila fibroza/ciroza i/ili hepatocelularni karcinom.
[0064] mRNK može da bude sintetisana od ovde opisanih hOTC DNK sekvenci, pomoću tehnika koje su dobro poznate u tehnici. Na primer, Cazenave C, Uhlenbeck OC, RNA template-directed RNA synthesis by T7 RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA.1994 Jul 19;91(15):6972-6, opisuje upotrebu T7 RNK polimeraze za stvaranje RNK od cDNK ili RNK templata. Pogledati takođe, Wichlacz A1, Legiewicz M, Ciesiolka J., Generating in vitro transcripts with homogenous 3’ ends using trans-acting antigenomic delta ribozyme., Nucleic Acids Res.2004 Feb 18;32(3):e39; Krieg PA, Melton DA., Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs, Nucleic Acids Res.1984 Sep 25;12(18):7057-70; i Rio, D. C., et al. RNA: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2011, 205-220. Pored toga, kompleti i protokoli za stvaranje mRNK su dostupni komercijalno uključujući, bez ograničenja, Riboprobe® In Vitro Transcription System (Promega Corp.); RiboMAX™ Large Scale RNA Production Systems (Promega Corp.); MAXIscript Kit (Ambion); MEGIscript Kit (Ambion); MessageAmp™ aRNK Kit (Ambion); mMESSAGE mMACHINE® Kits (Ambion); i HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs® Inc.). Prilagođena RNK može takođe da bude generisana komercijalno od kompanija uključujući, bez ograničenja, TriLink Biotechnologies; bioSYNTHESIS; GE Dharmacon; i IBA Lifesciences.
[0065] Ovde opisane hOTC DNK sekvence mogu da budu generisane in vitro i sintetički, pomoću tehnika dobro poznatih u tehnici. Na primer, postupak PCR-bazirane tačne sinteze (PAS) duge DNK sekvence može da bude korišćen, kako je opisano od strane Xiong et al, PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences, Nature Protocols 1, 791 – 797 (2006). Postupak koji kombinuje dvojni asimetrični PCR i postupke preklapanja PCR ekstenzije je opisan od strane Young and Dong, Two-step total gene synthesis method, Nucleic Acids Res.2004; 32(7): e59. Pogledati takođe, Gordeeva et al, J Microbiol Methods. Improved PCR-based gene synthesis method and its application to the Citrobacter freundii phytase gene codon modification.2010 May;81(2):147-52. Epub 2010 Mar 10; pogledati, takođe, sledeće patente o sintezi oligonukleotida i sintezi gena, Gene Seq.2012 Apr;6(1):10-21; US 8008005; i US 7985565. Pored toga, kompleti i protokoli za stvaranje DNK putem PCR su dostupni komercijalno. Oni uključuju upotrebu polimeraza uključujući, bez ograničenja, Taq polimerazu; OneTaq® (New England Biolabs); Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs); i GoTaq® G2 Polymerase (Promega). DNK takođe može da se formira od ćelija transfektovanih sa plazmidima koji sadrže hOTC sekvence opisane ovde. Kompleti i protokoli su poznati i komercijalno dostupni i uključuju, bez ograničenja, QIAGEN plazmidne komplete; Cliargeswitcli® Pro Filter Plasmid Kits (Invitrogen); i GenElute™ Plazmid Kits (Sigma Aldrich). Druge tehnike korisne ovde uključuju izotermalne amplifikacione postupke specifične za sekvence, koji eliminišu potrebu za termocikliranjem. Umesto toplote, ovi postupci uobičajeno upošljavaju DNK polimerazu koja izmešta lanac, kao Bst DNK polimeraza, Large Fragment (New England Biolabs), kako bi se razdvojile dupleksne DNK. DNK takođe može da se formira od RNK molekula putem amplifikacije upotrebom reverznih transkriptaza (RT), koje su DNK polimeraze zavisne od RNK. RT polimerizuju lanac DNK koji je komplementaran sa originalnim RNK templatom i koji je označen sa cDNK. Ova cDNK dalje može da bude amplifikovana putem PCR ili izotermalnih postupaka kako je prethodno opisano.
Prilagođena DNK takođe može da bude formirana komercijalno od kompanija, uključujući, bez ograničenja na, GenScript; GENEWIZ®; GeneArt® (Life Technologies); i Integrated DNA Technologies.
[0066] Pojam "ekspresija" se ovde upotrebljava u svom najširem značenju i obuhvata proizvodnju RNK ili RNK i proteina. Vezano za RNK, pojam "ekspresija" ili "translacija" se odnosi naročito na proizvodnju peptida ili proteina. Ekspresija može biti prolazna ili može biti stabilna.
[0067] Pojam "translacija" u kontekstu ovog pronalaska se odnosi na postupak na ribozomu, pri čemu mRNK lanac kontroliše sklop aminokiselinske sekvence kako bi se stvorio protein ili peptid.
[0068] Prema ovom pronalasku, "terapeutski efektivna količina" hOTC je isporučena kako je ovde opisano da bi se postigao željeni rezultat, tj., lečenje OTC nedostatka ili jednog ili više njegovih simptoma. Kako je ovde opisano, željeni rezultat uključuje snižene nivoe orotične kiseline, snižavanje hiperamonijanemije i/ili svođenje na minimum ili eliminisanje jednog ili više neurofizičkih komplikacija uključujući zastoj u razvoju, smetnje u učenju, intelektualni nedostatak, poremećaj hiperaktivnosti sa nedostatkom pažnje, i nedostatke izvršnih funkcija. Lečenje može da uključuje subjekte koji imaju ozbiljnu bolest koja nastaje u neonatalnom periodu (muškarci ili, ređe, žene), i bolest koja kasnije nastaje (delimično) kod muškaraca i žena, koje mogu da budu prisutne od najranijeg detinjstva do kasnijeg detinjstva, adolescencije, ili odraslog doba. U određenim načinima ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje virusne vektore rAAV za upotrebu u postupku lečenja nedostatka ornitinske transkarbamilaze (OCTD) kod humanog pacijenta. Ovde su opisani postupci lečenja i/ili sprečavanja fibroze i/ili ciroze kod subjekata, određenije onih kod heterozigotnih subjekata sa kasnim početkom davanjem hOTC. U jednom načinu ostvarivanja, terapeutski ciljevi za nedostatak OTC su da se održe nivoi amonijaka u plazmi manji od <80 µmol/L, glutamina u plazmi <1,000 µmol/L, argininemije 80-150 µmol/L i razgranati aminokiselnski lanac u normalnom opsegu. Međutim, druge terapijske krajnje tačke mogu da budu izabrane od strane nadležnog lekara.
[0069] Opet u drugom aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje virusne vektore ili rAAV za upotrebu u spašavanju i/ili lečenju neonatalnog subjekta sa OTCD koji obuhvata fazu isporuke hOTC gena u jetru novorođenog subjekta (npr., humanog pacijenta). Ovaj postupak može da iskoristi bilo koju sekvencu nukleinske kiseline koja kodira funkcionalnu hOTCazu, bilo sintetisanu hOTC kako je ovde opisano ili hOTC divljeg tipa, ili hOTC drugog izvora, ili njihovu kombinaciju. U jednom načinu ostvarivanja, neonatalno lečenje je definisano kao davanje hOTC kako je ovde opisano u roku od 8 sati, prvih 12 sati, prva 24 sata, ili prvih 48 sati od isporuke. U drugom načinu ostvarivanja, naročito za primata, neonatalna isporuka se dešava u toku perioda od oko 12 sati do oko 1 nedelje, 2 nedelje, 3 nedelje, ili oko 1 meseca, ili nakon oko 24 sata do oko 48 sati. Kako bi se rešilo razblaženje usled brzog prometa ćelija jetre kod sisara koji raste (npr., nehumani ili humani primat), neonatalna terapija je poželjno praćena ponovnim davanjem oko 3 meseca starosti, oko 6 meseci, oko 9 meseci, ili oko 12 meseci. Opciono, dozvoljeno je više od jednog ponovnog davanja. Takvo ponovno davanje može biti sa istim tipom vektora, ili različitim virusnim vektorom.
[0070] U jednom aspektu ovog otkrivanja, sistem isporuke za funkcionalnu hOTC baziran na RNK se koristi kako bi se subjekat stabilizovao (npr., humani pacijent) u krizi, nakon čega sledi isporuka virusnog vektora posredovana isporukom funkcionalne hOTC.
[0071] U drugom aspektu ovog otkrivanja, početak terapije ovog otkrivanja uključuje zajedničko davanje virusno i ne-virusno posredovanih hOTC sistema isporuke.
[0072] U daljem aspektu ovog otkrivanja, DNK i RNK konstrukti hOTC ovog otkrivanja mogu da se koriste sami, ili u kombinaciji sa standardom nege za dijagnozu i stanje pacijenta.
[0073] Kako je opisano u radnim primerima ovde, pronalazači su zaključili da heterozigotni OTCD subjekti, uključujući one sa kasnim nastankom OTCD, imaju povećanu fibrozu i/ili mikrovezikularnu steatozu kroz jetru. Takva fibroza i/ili mikrovezikularna steatoza može da dovede do ciroze povezane sa OTCD. Stoga, u drugom aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje virusne vektore ili rAAV za upotrebu u sprečavanju fibroze jetre i/ili povezanog medicinskog stanja ciroze povezane sa OTCD isporukom hOTC subjektu (npr., humanom pacijentu). Ovaj aspekt ovog otkrivanja može da koristi sistem isporuke virusa. Ekspresiona kaseta nukleinske kiseline može da sadrži sintetisanu hOTC DNK ili RNK kako je ovde obezbeđeno, ili drugu pogodnu sekvencu koja eksprimira funkcionalnu hOTC. U jednom aspektu, obezbeđena je upotreba virusnih vektora ili rAAV za lečenje i/ili sprečavanje fibroze jetre, mikrovezikularne steatoze, i/ili ciroze povezane sa OTCD, koja uključuje isporuku OTCaze subjektu koji ima OTCD. Subjekat može da bude humani pacijent. U jednom načinu ostvarivanja, pacijent je heterozigotan i ima OTCD sa kasnim nastankom. Pacijent možda nije prethodno lečen zbog OTCD, ili je možda primao druge konvencionalne terapije. Trenutno, ne postoji standard brige za OTCD, već se simptomima pre upravlja npr., putem prestanka uzimanja proteina, kompenzovanim povećanjima ugljenih hidrata i masti u ishrani, hemodijalizom za komatozne pacijente sa izuzetno visokim nivoima u krvi; i/ili intravenskim davanjem natrijumbenzoata, arginina, i/ili natrijumfenilacetata. US FDA je odobrila glicerolfenilbutirat (Ravicti®) za dugoročno upravljanje nekim od poremećaja ciklusa uree za pacijente uzrasta 2 godine i starije; ovaj lek pomaže da se organizam očisti od amonijaka i predviđen je za pacijente koji ne mogu da budu na ishrani ograničenoj proteinima ili samo na aminokiselinskim suplementima. U jednom aspektu lečenje pacijenta (npr., prva injekcija) je predviđeno pre prve godine života. U drugom aspektu, lečenje je započeto posle 1. godine, ili posle prve 2 do 3 godine života, nakon 5 godina života, nakon 11 godina života, ili u starijem uzrastu.
[0074] U jednom aspektu, virusni vektori ili rAAV ovog otkrivanja obezbeđuju za upotrebu lečenja i/ili vraćanja fibroze jetre i/ili OTCD-povezane ciroze isporukom funkcionalne OTCaze subjektu koja je kodirana konstruisanom DNK SEQ ID NO: 1, 3, 4, ili 5, ili himernom DNK kako je ovde definisano.
Isporuka DNK može da bude posredovana virusnim vektorom koji sadrži konstruisanu u ekspresionoj kaseti, koji posreduje ekspresiju funkcionalne OTCaze u ćelijama jetre subjekta. U drugom načinu ostvarivanja, subjektu se primenjuje himerna RNK kako je ovde definisano. Isporuka RNK može da bude posredovana virusnim vektorom koji sadrži konstruisanu RNK u ekspresionoj kaseti, koji posreduje ekspresiju funkcionalne OTCaze u ćelijama jetre subjekta.
[0075] Heterozigotni OTCD subjekti imaju povećan rizik od razvoja hepatocelularnog karcinoma (HCC). Pogledati, npr., JM Wilson et al, Molecular Genetics and Metabolism (2012), Mol Genet Metab.2012 Feb; 105(2): 263-265, objavljen na internetu 7. novembra, 2011. Samim tim, u drugom aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje virusne vektore ili rAAV za upotrebu u lečenju i/ili sprečavanju HCC isporukom hOTC, subjektu (npr., humani pacijent). Ovaj aspekt ovog pronalaska koristi sistem isporuke virusa. Ekspresiona kaseta nukleinske kasete može da sadrži sintetisanu hOTC DNK ili RNK kako je ovde obezbeđeno. Možda pacijent prethodno nije lečen od OTCD, ili je možda primao druge konvencionalne terapije tj., standarde brige. U jednom načinu ostvarivanja, lečenje pacijenta (npr., prva injekcija) je započeto pre dijagnoze sa HCC. U drugom načinu ostvarivanja, lečenje pacijenta je započeto nakon HCC dijagnoze. Opciono, lečenje uključuje zajedničko davanje sorafeniba (komercijalno dostupnog kao Nexavar®), ili korišćenje povezano sa hemoembolizacijom, radijacijom, termalnom ablatacijom, prekutanom injekcijom etanola, ciljanom terapijom (npr., anti-angiogenim lekovima), hepatičkom arterijskom infuzijom antikancerogenih lekova, imunoterapijom, ili sa hirurškim opcijama uključujući, npr., reseciju, krijohirurgiju, i transplantat jetre. Kada se koristi za lečenje HCC, može biti poželjno da se izabere neintegrišući sistem isporuke (npr., neintegrišući virusi kao što su adenovirusi ili neintegrišući lentivirusi) za isporuku sintetisane hOTC DNK ili RNK kako je ovde opisano.
[0076] Pod "funkcionalnom OTC", se misli na gen koji kodira OTCazu divljeg tipa kao što je okarakterisano SEQ ID NO: 2 ili drugu OTCazu koja obezbeđuje najmanje oko 50%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, ili oko istog, ili više od 100% nivoa biološkog dejstva enzima humane ornitinske transkarbamilaze divljeg tipa, koja može biti okarakterisana sekvencom SEQ ID NO:2 ili prirodnom varijantom njegovog polimorfa koji nije povezana sa bolešću. Određenije, budući da heterozigotni pacijenti mogu da imaju nizak funkcionalni nivo OTCaze od oko 50% ili niži, efektivno lečenje može da ne zahteva zamenu dejstva OTCaze do nivoa u okviru opsega "normalnih" ili pacijenata koji nemaju OTCD. Slično, pacijenti koji imaju količine OTCaze koje ne mogu da se detektuju mogu biti spašeni isporukom funkcije OTCaze do manje od 100% nivoa dejstva, i opciono mogu da budu naknadno podvrgnuti daljem lečenju. Kako je ovde opisano, genska terapija opisana ovde, bilo virusna ili nevirusna, može da se koristi u vezi sa drugim terapijama, tj., standardnom brige za dijagnozu subjekta (pacijenta).
[0077] U jednom načinu ostvarivanja, takva funkcionalna OTCaza ima sekvencu koja je oko 95% ili više identična zrelom proteinu (tj., oko poslednjih 322 aminokiselina) ili sekvenci pune dužine SEQ ID NO: 2, ili oko 97% identična ili više, ili oko 99% ili više SEQ ID NO: 2 na aminokiselinskom nivou. Takva funkcionalna OTCaza takođe može da obuhvati prirodne polimorfe koji nisu povezani ni sa jednom bolešću (npr., F101, L111, i/ili WI193-194 SEQ ID NO:2). Identitet može biti određen pripremanjem poravnanja sekvenci i upotrebom raznih algoritama i/ili kompjuterskih programa poznatih u tehnici ili komercijalno dostupnih [npr., BLAST, ExPASy; ClustalO; FASTA; pomoću, npr., Needleman-Wunsch algoritma, Smith-Waterman algoritma].
[0078] Postoje razna ispitivanja za merenje OTC ekspresije i nivoa dejstva in vitro. Pogledati, npr., X Ye, et al, 1996 Prolonged metabolic correction in adult ornithine transcarbamylase-deficient mice with adenoviral vectors. J Biol Chem 271:3639-3646) ili in vivo. Na primer, dejstvo OTC enzima može da bude izmereno pomoću postupka razblaženja stabilnog izotopa tečne hromatografije sa masenom spektrometrijom kako bi se detektovalo stvaranje citrulina normalizovanog do [1,2,3,4,5-13C5] citrulina (98% 13C). Ovaj postupak je prilagođen u odnosu na prethodno razvijeno ispitivanje zbog detekcije dejstva sinteze N-acetilglutamata [Morizono H, et al, Mammalian N-acetylglutamate synthase. Mol Genet Metab.2004;81(Suppl 1):S4-11.]. Srebra sveže smrznute jetre su izmerena i kratko homogenizovana u puferu koji sadrži 10 mM HEPES, 0.5 % Triton X-100, 2.0 mM EDTA i 0.5 mM DTT. Zapremina pufera homogenizacije je podešena kako bi moglo da se dobije 50 mg/ml tkiva. Dejstvo enzima je izmereno upotrebom 250 µg tkiva jetre u 50 mM Tris-acetata, 4 mM ornitina, 5 mM karbamilfosfata, pH 8.3. Dejstvo enzima je započeto uz dodavanje sveže pripremljenog 50 mM karbamilfosfata rastvorenog u 50 mM Tris-acetata pH 8.3, ostavljeno da odstoji 5 minuta na 25 °C i ugašeno dodavanjem jednake zapremine od 5 mM13C5-citrulina u 30%TCA. Ostaci su odvojeni mikrocentrifugom od 5 minuta, a supernatanti su prebačeni u bočice za masenu spektroskopiju. Deset µL uzorka je ubrizgano u Agilent 1100 series LC-MS u izokratskim uslovima sa mobilnom fazom 93% rastvarača A (1 ml trifluorosirćetne kiseline u 1 L vode):7% rastvarač B (1ml trifluorosirćetne kiseline u 1L 1:9 voda/acetonitril). Pikovi koji odgovaraju citrulinu [176.1 masa:punjenje odnos (m/z)] i 13C5-citrulinu (181.1 m/z) su kvantifikovani, a njihovi odnosi su upoređeni sa odnosima dobijenim za standardnu krivu ciklusa citrulina za svako ispitivanje. Uzorci su normalizovani ili do ukupnog tkiva jetre ili koncentracije proteina određene pomoću Bio-Rad kompleta za ispitivanje proteina (Bio-Rad, Hercules, CA). Druga ispitivanja, koja ne zahtevaju biopsiju jetre, takođe mogu da se koriste. Jedno takvo ispitivanje predstavljaju ispitivanja aminokiselina u plazmi u kojoj je odnos glutamina i citrulina ocenjen i ukoliko je glutamin visok (>800 mikrolitri/litar) a citriluin nizak (npr., jednocifreni brojevi), sumnja se na nedostatak ciklusa uree. Nivoi amonijaka u plazmi mogu da se izmere a koncentracija od oko 100 mikromolova po litru je pokazatelj OTCD. Gasovi u krvi mogu da budu ocenjeni ukoliko je pacijent na hiperventilaciji; respiratorna alkaloza je učestala kod OTCD. Orotična kiselina u urinu, npr., veća od oko 20 mikromolova po milimolskom kreatinu je pokazatelj OTCD, kao što je i povišeni orotat u urinu nakon ispitivanja izazivanja alopurinola. Dijagnostički kriterijumi za OTCD su definisani u Tuchman et al, 2008, Urea Cycle Disorders Consortium (UCDC) of the Rare Disease Clinical Research Network (RDCRN). Tuchman M, et al., Consortium of the Rare Diseases Clinical Research Network. Cross-sectional multicenter study of patients with urea cycle disorders in the United States. Mol Genet Metab.2008;94:397-402. Pogledati, takođe, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK.154378/, na kojem se nalazi diskusija o trenutnom standardu brige za OTCD.
[0079] Trebalo bi imati u vidu da se pojam "jedan" ili "neki" odnosi na jedno ili više. Kao takvi, pojmovi "jedan" (ili "neki"), "jedan ili više," i "najmanje jedan" se ovde koriste naizmenično.
[0080] Reči "obuhvataju", "obuhvata", i "koji obuhvata" bi trebalo tumačiti pre kao da nešto uključuju nego da isključuju. Reči "sastoji se od", "koji se sastoji", i njihove varijante, bi trebalo tumačiti pre da nešto isključuju nego da uključuju. Dok su razni načini ostvarivanja u ovoj specifikaciji predstavljeni upotrebom jezika "koji obuhvata", pod drugim okolnostima, predviđeno je da povezani način ostvarivanja takođe bude protumačen i opisan upotrebom jezika "koji se sastoji od' ili "koji se suštinski sastoji od".
[0081] Kako se ovde upotrebljava, pojam "oko" označava varijabilnost od 10 % (±10%) od date reference, ukoliko nije drugačije naznačeno.
[0082] Pojam "regulacija" ili njegove varijacije kako se ovde upotrebljava se odnosi na mogućnost jedinjenja formule (I) da inhibira jednu ili više komponenti biološkog puta.
[0083] "Subjekat" je sisar, npr., čovek, miš, pacov, zamorče, pas, mačka, konj, krava, svinja, ili nehumani primat, kao što je majmun, šimpanza, babun ili gorila.
[0084] Kako se ovde upotrebljavaju, "bolest", "poremećaj" i "stanje" se koriste naizmenično, kako bi se ukazalo na abnormalno stanje kod subjekta.
[0085] Ukoliko nije drugačije definisano u ovoj specifikaciji, tehnički i naučni pojmovi koji se ovde koriste imaju isto značenje koje je uobičajeno poznato stručnjaku u ovoj oblasti i uz pozivanje na objavljene tekstove, koji stručnjaku u ovoj oblasti obezbeđuju opštu smernicu za mnoge pojmove koji se koriste u ovoj prijavi.
[0086] Sledeći primeri su dati kao ilustracija.
Primer 1 - scAAV vektori koji sadrže hOTC
[0087] pAAVsc.TBG.hOTCwt i pAAVsc.TBG.hOTCco-LW4 su konstruisani zamenom mOTC kodirajuće sekvence (WT) hOTC (hOTCwt) ili hOTCcoLW cDNK divljeg tipa, redom, u plazmidu deriviranom iz prethodno opisane pAAVsc.TBG.mOTC1.3 sa poremećenim intronom [Moscioni D, et al, "Long-term correction of ammonia metabolism and prolonged survival in ornithine transcarbamylase-deficient mice following liver-directed treatment with adeno-associated viral vectors", Mol Ther.2006;14:25-33; Cunningham SC, et al, "AAV2/8-mediated correction of OTC deficiency is robust in adult but not neonatal Spf(ash) mice", Mol Ther.2009;17:1340-1346; Wang L, et al., "Sustained correction of OTC deficiency in spfashmice using optimized self-complementary AAV2/8 vectors", Gene Ther.2012 Apr; 19(4):404-10, Epub 2011 Aug 18].
[0088] scAAV2/8.TBG.hOTCco-LW4 sadrži AAV23' ITR i 5' ITR uz brisanje u D-sekvenci i trs (terminalno rezoluciono mesto), TBG promoter, hOTCco-LW4 gen, i 137 bp SV40 poliA. Pripreme dva vektora (AAV2/8sc.TBG.hOTCwt i AAV2/8sc.TBG.hOTCco-LW4) korišćenih u početnom ispitivanju poređenja su prečišćene pomoću dva kruga centrifugiranja u gradijentu cezijumhlorida, kako je prethodno opisano [Wang L, et al, Systematic evaluation of AAV vectors for liver directed gene transfer in murine models. Mol Ther.2010;18:118-125]. Vektori koji su korišćeni u ostatku ispitivanja su proizvedeni postupkom industrijske proizvodnje baziranom na transfekciji polietilenimina (PEI) i prečišćeni iz supernatanta ili ukupnog lizata centrifugiranjem u gradijentu jodiksanola kako je opisano [Lock M, et al, Hum Gene Ther.
2010;21:1259-1271]. Titri genoma [kopije genoma (GC)/ml] AAV vektora su određeni pomoću PCR u stvarnom vremenu upotrebom skupova prajmera i ispitivanja koji ciljaju TBG promoter (prednji prajmer 5'-AAACTGCCAATTCCACTGCTG-3' [SEQ ID NO: 14], obrnuti prajmer 5'-CCATAGGCAAAAGCACCAAGA-3' [SEQ ID NO:15], ispitivanje 6FAM-TTGGCCCAATAGTGAGAACTTTTTCCTGC [SEQ ID NO: 16] -TAMRA), i upotrebom linearnog plazmida kao standarda. Prednji prajmer se nalazi 400bp nizvodno od 5' zatvorene ukosnice. Fagone et al [Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of selfcomplementary adeno-associated viral vectors and improved over alternative methods, Hum
Gene Ther Methods.2012 Feb;23(1):1-7.] su skoro zabeležili da bi postupak kvantitativnog PCR (Q-PCR) mogao značajno da potceni titar scAAV vektora, posebno kada su prajmeri PCR blizu zatvorene ukosnice scAAV vektora. Titar jedne serije AAV2/8sc.TBG.hOTCco-LW4 vektora pomoću prajmera i ispitivanja su postavili ciljani poliA region (1900bp nizvodno od 5' zatvorene ukosnice), a titar genoma je bio 1.1-struko od originalnog titra, što je bilo u okviru greške intra-ispitivanja Q-PCR.
[0089] Nivoi ekspresije OTC proteina i dejstvo OTC su procenjeni u jetri spf<ash>miševa 14 dana nakon i.v. injekcije 1×10<11>GC od AAV2/8sc.TBG.hOTCwt ili AAV2/8sc.TBG.hOTCco-LW4 vektora. Spf<ash>miševi predstavljaju model za OTC bolesti sa kasnim nastankom kod ljudi. Svi životinjski postupci su izvedeni u skladu sa protokolima odobrenim od strane Komiteta za institucionalnu brigu i upotrebu životinja (IACUC) Univerziteta u Pensilvaniji. Spf<ash>miševi su održavani u Životinjskoj jedinici translacionih istraživačkih laboratorija Univerziteta u Pensilvaniji kako je prethodno opisano. Spf<ash>miševi i njihovi normalni članovi legla starosti od tri do šest meseci su korišćeni u ispitivanjima. Vektori su davani intravenskom (i.v.) injekcijom u venu u repu. Opseg genskog prenosa baziranog na rezidentnim genomima vektora nije bio statistički različit između dve grupe. Uzorci urina su sakupljeni pre i u različitim vremenskim tačkama posle lečenja vektorom radi analize orotične kiseline kako je prethodno opisano [Moscioni D, et al, Long-term correction of ammonia metabolism and prolonged survival in ornithine transcarbamylase-deficient mice following liver-directed treatment with adeno-associated viral vectors. Mol Ther.2006;14:25-33].
[0090] Vestern blot analiza za detektovanje hOTC ekspresije u lizatu jetre je izvedena kako je prethodno opisano [Wang L, et al, 2012, epub 2011)]. Primarno antitelo za detektovanje hOTC je prilagođeno poliklonalnom antitelu zeca od strane laboratorije Hiroki Morizono u Dečijem nacionalnom medicinskom centru. Lizati jetre (10 µg/traka) su takođe blotovani i ispitivani anti-tubulinskim antitelom (Abcam, Kembridž, MA). Vestern analiza je pokazala 100-struko veću ekspresiju hOTC iz hOTCco-LW4 vektora u poređenju sa hOTCwt vektorom, čime su dostignuti blago prekomerni nivoi od onih koji su primećeni kod WT miševa.
[0091] Dejstvo OTC enzima je izmereno pomoću postupka razblaženja stabilnog izotopa tečne hromatografije sa masenom spektrometrijom kako bi se detektovalo formiranje citrulina normalizovanog do [1,2,3,4,5-13C5] citrulina (98% 13C). Postupak je prilagođen iz prethodno razvijenog ispitivanja za detekciju dejstva sinteze N-acetilglutamata [Morizono H, et al, Mammalian N-acetylglutamate synthase. Mol Genet Metab.2004;81(Suppl 1):S4-11.]. Srebra sveže smrznute jetre su izmerena i kratko homogenizovana u puferu koji sadrži 10 mM HEPES, 0.5 % Triton X-100, 2.0 mM EDTA i 0.5 mM DTT. Zapremina pufera za homogenizaciju je podešena tako da se dobije tkivo od 50 mg/ml. Dejstvo enzima je izmereno pomoću 250 µg tkiva jetre u 50 mM Tris-acetata, 4 mM ornitina, 5 mM karbamilfosfata, pH 8.3. Dejstvo enzima je započeto sa dodatkom sveže pripremljenih 50 mM karbamilfosfata rastvorenog u 50 mM Tris-acetata pH 8.3, ostavljeno da se nastavi 5 minuta na 25 °C i ugašeno dodatkom jednake zapremine od 5 mM13 C5-citrulina u 30%TCA. Ostaci su odvojeni centrifugom u trajanju od 5 minuta, a supernatanti su preneseni u bočice za masenu spektroskopiju. Deset µL uzorka je ubrizgano u Agilent 1100 series LC-MS u izokratskim uslovima sa mobilnom fazom od 93% rastvarača A (1 ml trifluorosirćetna kiselina u 1 L vode): 7% rastvarača B (1ml trifluorosirćetne kiseline u 1L od 1:9 voda/acetonitril). Pikovi koji odgovaraju citrulinu [176.1 odnos masa:punjenje (m/z)] i 13C5-citrulinu (181.1 m/z) su kvantifikovani, a njihovi odnosi su upoređeni sa odnosima dobijenim za standardnu krivu citrulinskog ciklusa za svako ispitivanje. Uzorci su normalizovani ili do ukupnog tkiva jetre ili do koncentracije proteina određene upotrebom kompleta za ispitivanje Bio-Rad proteina (Bio-Rad, Hercules, CA).
[0092] Za vektor koji nosi konstruisanu hOTC cDNK ovde nazvan LW4 (FIG.4) je zaključeno da 100-struko poboljšava eksprimirane nivoe hOTC proteina. Ocena dejstva OTC enzima je generalno u korelaciji sa OTC Vestern blot eksperimentima iako je OTC protein povišeniji od dejstva OTC enzima kada se uporedi sa endogenom OTC. Prilikom oduzimanja nivoa pozadinskog dejstva kod spfash miševa, hOTCco-LW4 je za rezultat imala 33-struko veće dejstvo od hOTCwt. Produžena hOTC ekspresija koja je u korelaciji sa dozom i nivoi dejstva su uočeni kod tretiranih spf<ash>miševa. U poređenju sa prethodno opisanim mišjim OTC vektorom koji se uglavnom razlikuje po cDNK, vektor koji nosi hOTCco-LW4 vektor je bio oko 10-struko potentniji.
[0093] Ilustrativni vektor koji nosi modifikovanu hOTCco-LW4 (FIG.4) je obezbedio visok nivo trandsukcije, mereno po OTC histološkim ispitivanjima, kroz širok opseg doza. Između doza 1×10<11>GC i 3×10<9>GC, efikasnost transdukcije, merena histohemijskim bojenjem, je varirala između 50-70%. Pri najnižoj dozi od 1×10<9>GC, 40% površine jetre je bilo pozitivno OTC histohemijskim bojenjem.
Nedostatak efekta bistre doze histohemijom i imunobojenjem bi mogao biti usled činjenice da optimizacja kodona značajno poboljšava hOTC ekspresiju u transduktovanim hepatocitima. Ovo dovodi do poboljšane osetljivosti za detektovanje transduktovanih ćelija sa niskim kopijama genoma vektora. Transdukcija bi mogla da bude zasićena visokim dozama vektora (1×10<11>- 1×10<10>GC), i samim tim efikasnost transdukcije merena postupcima in situ detekcije ne bi pravila razliku između niskih i visokih doznih grupa naspram dejstva OTC enzima na lizate jetre merenog masenom spektrometrijom.
[0094] Dalje ispitivanje je izvedeno u kojem je neonatalna ekspresija hOTC ocenjena kod spf<ash>kod miševa, kojima je 1. dana života ubrizgana, upotrebom scAAV2/8.TBG.hOTCco u dozi od
5x10<10>GC/mladunac ubrizganom kroz venu slepoočnice. Robusna ekspresija je detektovana na 24 i 48 sati. Dodatna ispitivanja su izvedena upotrebom doza od 1 x 10<11>, 3 x 10<10>, i 1x10<10>, i ocenjena za 12 nedelja. Tokom perioda ispitivanja od 16 nedelja, smanjenje nivoa početne robusne ekspresije je primećeno u svakoj od ovih doza. Veruje se da je ovo usled razblaženja, tj., prirodnog rezultata proliferacije ćelija jetre kod životinja u razvoju. Samim tim, dok je početna restoracija OTC dejstva u jetri primećena nakon neonatalnog prenosa gena kod spf<ash>miševa, ovaj rezultat je privremen, sa OTC dejstvom koje pada sa oko 1000% nivoa divljeg tipa (wt) na oko 1 nedelje, do oko 50 % wt nivoa na 4 nedelje, do oko 10 % wt nivoa na 12 nedelja (1x10<11>GC nivo); ili oko 500 % wt nivoa u 1. nedelji, do oko 20 % wt nivoa, ili oko 10 % wt nivoa nedelje 1 (3 x 10<10>GC doza) ili oko 200 % wt nivoa 1. nedelje, do oko 10 % wt nivoa 4. nedelje (1 x 10<10>GC doza). U jednom ispitivanju, upotreba životinja koje primaju prvu injekciju 3 x 10<10>GC 1. dana, životinjama je ubrizgan drugi AAV vektor koji nosi hOTCco gen (scAAVrh10.hOTCco; 1.8 x 10<10>GC) 4. nedelje. Kao kontrola, jedna grupa životinja nije primala ponovljeno davanje, a jedna grupa je primala samo drugi vektor 4. nedelje. Ponovno davanje AAV.hOTCco je dovelo do obnove OTC dejstva u jetri.
[0095] Dalja ispitivanja su dizajnirana kako bi se ocenila mogućnost da se spasu OTC-KO mladunci neonatalnom genskom terapijom, kako kratkoročnom tako i dugoročnom.
Primer 2 - Proizvodnja scAAV vektora sa sekvencama optimizovanim kodonom
A. scAAV8.TBG.hOTC-co
[0096] Plazmidi koji sadrže hOTC sekvencu optimizovanu kodonom SEQ ID NO: 3, 4, 5, 9 ili 10, redom, su klonirani kako je opisano u primeru 1 zamenom mOTC kodirajuće sekvence sa hOTCco u plazmidu deriviranim iz prethodno opisane pAAVsc.TBG.mOTC1.3 sa intronom. Dobijeni plazmid pAAVsc.TBG.hOTCco je kloniran u AAV8 kapsid [Gao et al, PNAS USA, 2002, 99:11854-11859] pomoću konvencionalnih tehnika.
B. scAAVrh10.TBG.hOTC-co
[0097] Plazmidi koji sadrže hOTC sekvencu optimizovanu kodonom SEQ ID NO: 3, 4, 5, 9 ili 10, redom, su klonirani kako je opisano u primeru 1 zamenom mOTC kodirajuće sekvence sa hOTCco u plazmidu deriviranim iz prethodno opisane pAAVsc.TBG.mOTC1.3 sa intronom. Dobijeni plazmidi pAAVsc.TBG.hOTCco su klonirani u AAVrh10 kapsid [Gao et al, PNAS USA, 2002, 99:11854-11859] pomoću konvencionalnih tehnika.
Primer 3 - Proizvodnja ssAAV vektora sa sekvencama optimizovanim kodonom ssAAV2/8.LSP1.hOTC-co
[0098] Plazmidi koji sadrže hOTCco sekvence optimizovane kodonom su klonirani kako je opisano zamenom mOTC kodirajuće sekvence pLSP1mOTC plazmida [Cunningham et al, Mol Ther, 2009, 17: 1340-1346] odgovarajućom cDNK sekvencom SEQ ID NO:3, 4, 5, 9 ili 10. Dobijeni plazmidi pAAVsc.LSP1.hOTCco su klonirani u AAV8 kapside da bi se formirali odgovarajući ssAAV2/8.LSP1.hOTC-co vektori upotrebom tehnika opisanih u primeru 1.
B. ssAAV2/rh10.LSP1.hOTC-co
[0099] Plazmidi koji sadrže hOTCco sekvence optimizovane kodonom su klonirani kako je opisano zamenom mOTC kodirajuće sekvence pLSP1mOTC plazmida [Cunningham et al, Mol Ther, 2009, 17: 1340-1346] odgovarajućom cDNK sekvencom SEQ ID NO:3, 4, 5, 9 ili 10. Dobijeni plazmidi pAAVsc.LSP1.hOTCco su klonirani u AAV8 kapside da bi se formirali odgovarajući ssAAV2/8.LSP1.hOTC-co vektori upotrebom tehnika opisanih u primeru 1.
[0100] Vektori generisani prema delu A ili B mogu biti prečišćeni putem dva kruga centrifugiranja u gradijentu cezijumhlorida, puferisni-izmenjeni PBS-om, i koncentrovani pomoću Amicon Ultra 15 uređaja centrifugalnog filtera-100K (Millipore, Bedford, MA). Genomski titar (GC/ml) AAV vektora može biti određen PCR u stvarnom vremenom upotrebom seta prajmera/proba koji odgovara TBG promoteru i linearizovanim plazmidnim standardima. Vektori mogu biti podvrgnuti dodatnim ispitivanjima kontrole kvaliteta uključujući ispitivanje elektroforeze sa gelom od natrijumdodecilsulfatpoliakrilamida (SDS-PAGE) za čistoću vektora i Limulus amebocit lizatom (LAL) za detekciju endotoksina (Cambrex Bio Science, Walkersville, MD, USA).
Primer 4 - ssAAV8.TBG.hOTCco kod modela OTCD sa kasnim početkom
[0101] AAV8 vektor je generisan pomoću ovde opisanih postupaka. Vektor ima u sebe upakovan 5' AAV2 ITR, TBG promoter, intron, hOTCco, WPRE element, goveđi hormon rasta poliA, i 3' AAV2 ITR. Ekspresija i kinetika ovog vektora su upoređene sa samo-komplementarnim AAV8 vektorom sa ili bez WPRE elementa. Rezultati pokazuju da jednolančani konstrukti sa WPRE elementom prevazilaze one vektore kojima nedostaje WPRE element; u dozama koje mogu da se uporede i jednolančani vektori (sa i bez WPRE) su bili manje robusni od samo-komplementarnog vektora kome nedostaje WPRE u izmerenim vremenskim tačkama.
[0102] Međutim, jednolančani vektori mogu da imaju druga poželjna svojstva, npr., u smislu kinetike, u zavisnosti od starosti i stanja pacijenta.
Primer 5 - Proizvodnja adenovirusnih vektora sa sekvencama optimizovanim kodonom
[0103] hOTCco cDNK [SEQ ID NO: 3, 4, 5, 9 i 10] sa NotI veznicima je klonirana nizvodno od pacovskog PEPCK promotera kako bi se generisao pPEPCK-hOTC kako je opisano kod A. Mian et al, Molecular Therapy, 2004, 10: 492-499 (2004). Ovaj plazmid je digestiran sa AscI, a dobijeni PEPCK-hOTCco fragment je umetnut u okosni adenovirusni plazmid pC4HSU31 kako bi se generisali parentalni plazmidi pC4HSU-PEPCK-hOTCco. Plazmid pWPRE je digestiran sa ClaI kako bi se oslobodio WPRE, koji je zatim umetnut u MluI mesto pPEPCK-hOTC, da bi se generisao pPEPCK-hOTCco-WPRE plazmid sa njihovim odgovarajućim hOTCco sekvencama. Preostale faze za generisanje adenovirusnog plazmida pC4HSU-PEPCK-hOTCco-WPRE su onakve kako je prethodno opisano. Sva klonirajuća mesta su potvrđena ispitivanjem DNK sekvence. Identitet rekombinantnih adenovirusnih plazmida može biti potvrđen digestijom restriktivnog enzima sa HindIII i BamHI. Adenovirusni plazmidi su linearizovani sa PmeI pre transfekcije u 293Cre4 ćelije. Adenovirusni vektori su spašeni i amplifikovani sa 293Cre4 ćelijama i pomoćnim virusom AdLC8cluc. Suspenzione ćelije 293N3Scre8 se mogu koristiti u završnoj fazi proizvodnje vektora. Prečišćavanje, kvantifikacija OD260 i ekstrakcija virusne DNK se izvode kako je detaljno opisano bilo gde [Brunetti-Pierri, N., et al. (2004). Acute toxicity after high-dose systemic injection of helper-dependent adenoviral vectors into nonhuman primates. Hum. Gene Ther.15: 35-46; Ng, P., Parks, R. J. and Graham, F. L. (2002). Preparation of helper-dependent adenoviral vectors.
Methods Mol. Med.69: 371-388].
Primer 6 - Proizvodnja hOTCco lentivirusnih vektora
[0104]
A. Lentivirusni vektori bez mogućnosti replikacije koji sadrže ovde obezbeđene hOTCco sekvence mogu da budu proizvedeni zamenom umetka pacovske OTC genske sekvence plazmida pLenti-GIII-CMV-GFP-2A-Puro [komercijalno dostupnog od Applied Biological Materials (ABM) Inc.; Kanada] željenom hOTCco sekvencom [SEQ ID NO: 3, 4, 5, 9 i 10]. Virusi su generisani prema uputstvima proizvođača. ABM sistem uključuje brisanje pojačivača u U3 regionu 3'ΔLTR da bi se obezbedila samo-inaktivacija lentivirusnog vektora nakon transdukcije i integrisanja u ciljanu ćelijsku genomsku DNK; sadrži minimalne lentivirusne gene neophodne za pakovanje, replikaciju i transdukciju (Gag/Pol/Rev), derivirane od različitih plazmida kojima svima nedostaju pakovni signali; dalje, ni Gag, Pol, ili Rev geni nisu inkorporisani u upakovani virusni genom, čime je replikacija zrelog virusa postala nekompetentna.
B. Neintegrišući hOTC lentivirusni vektori bez mogućnosti replikacije
DNK konstrukt koji sadrži promoter specifičan za jetru i hOTCco DNK SEQ ID NO: 3, 4, 5, 9 i 10 su konstruisani u lentivirusne vektore koji su pseudotipizovani u umotan sindbis virus E2 proizveden kako je opisano u US2011/0064763. Svi vektori sadrže splajsni donor, signal za pakovanje (psi), element koji reaguje na Rev (RRE), splajsni donor, splajsni akceptor, središnji poli-purinski trakt (cPPT). WPRE element je kod određenih virusa eliminisan.
C. hOTCco DNK SEQ ID NO: 3, 4, 59 i 10, je klonirana u lentivirus pseudotipizovan sa obmotanim genom virusa vezikularnog stomatitisa (VSV), nabavljenim od InvivoGen (SanDiego, CA) pomoću uputstava proizvođača.
Primer 7 - Proizvodnja hOTCco sistema za isporuku RNK
[0105] RNK može biti pripremljena in vitro transkripcijom od DNK templata ili sintetisana. RNK ekspresiona kaseta je pripremljena koja uključuje 5' UTR, opcioni intron sa mestima splajsnog donora i akceptora, opcionu Kozak sekvencu, ovde obezbeđenu hOTC kodirajuću sekvencu, poliA, i 3' UTR pomoću poznatih tehnika.
A. Pogodna količina mRNK je inkorporisana u lipidom obmotane nanočestice polimera koje reaguju na pH napravljene pomoću objavljenih tehnika [X. Su et al, Mol. Pharmaceutics, 2011, 8 (3), pp 774-787; objava na internetu: 21. mart, 2011].
B. Formulacije polimernih nanočestica sa 25 kDa razgranatim polietileniminom (PEI) su pripremljene na sledeći način. Kada je PEI prisutan, može biti razgranat PEI molekulske mase koja je u opsegu od 10 do 40 kDa, npr., 25 kDa razgranati PEI (Sigma #408727). Dodatni primeri polimera pogodni za ovaj pronalazak uključuju one opisane u PCT objavi WO2013182683. Potrebna količina mRNK je razblažena neposredno pre primene u vodi za injekcije (Braun, Melsungen) do ukupne zapremine od 4 ml i dodata je brzo u 4 ml vodenog rastvora razgranatog PEI 25 kDa upotrebom pipete pri N/P odnosu od 10. Rastvor je pomešan pipetiranjem gore i dole.
C. Za lipidno baziranu nanočesticu, kreirana je lipidna formulacija pomoću ekpsresione kasete koja sadrži hOTCco RNK u formulaciji cK - E12:DOPE:Chol:PEG-DMG2K (relativne količine 50:25:20:5 (mg:mg:mg:mg)) kako bi se obezbedio rastvor za isporuku. Katjonski lipid cK -E12 je korišćen (pogledati, npr., WO 2013/063468), i kombinovan je sa dioleoilfosfatidiletanolaminom ili "DOPE", holesterolom (chol), i polietilenglikolom (PEG) ili PEGilisanim lipidom (PEG-DMG2K) pomoću postupaka za formulaciju opisanih u međunarodnim patentnim objavama WO 2010/053572 i WO 2012/170930.
Primer 8 - hOTCco sistemi isporuke DNK
[0106]
A. hOTCco sekvence gole plazmidne DNK - [SEQ ID NO: 3, 4, ili 5] su konstruisane kao goli plazmidni DNK konstrukti koji se isporučuju ciljanoj ćeliji jetre (npr., intravaskularnim davanjem) i eksprimiraju humani OTC protein u ciljanoj ćeliji.
B. Katjonski lipidni-DNK kompleksi – katjonski lipid - DNK kompleksi su pripremljeni pomoću pogodne količine ekspresione kasete koja sadrži najmanje promoter, opcioni intron, opcione Kozak sekvence, hOTCco SEQ ID NO: 3, 4 ili 5, poliA, i druge opcione ekspresione kontrolne sekvence. Promoter može biti promoter specifičan za jetru. Alternativno, može biti izabran drugi promoter koji nije specifičan za tkiva. Na primer, pogodna količina DNK je formulisana katjonskim lipidom cK - E12:DOPE:Chol:PEG-DMG2K (relativne količine 50:25:20:5 (mg:mg:mg:mg)) kako bi se formiralo katjonski lipidni - DNK kompleks pogodan za isporuku subjektu. Katjonski lipid cK -E12 je korišćen (pogledati, npr., WO 2013/063468), i kombinovan je sa dioleoilfosfatidiletanolaminomom ili "DOPE", holesterolom (chol), i polietilenglikolom (PEG) ili PEGilisanim lipidom (PEG-DMG2K) pomoću postupaka za formulisanje opisanih u međunarodnim patentnim objavama WO 2010/053572 i WO 2012/170930.
Primer 9 Dugoročna korekcija neonatalnog letalnog oblika nedostatka OTC višestrukim tretiranjima AAV vektorima različitih serotipova
[0107] U trenutnom ispitivanju, scAAV8.TBG.hOTCcoLW4 pripremljen kako je opisano u primeru 1 je korišćen za spašavanje životinja kod mišjeg modela neonatalnog (ranog) početka OTCD. OTC KO miševi su generisani brisanjem eksona 2-3, i svojstva ovog miša okarakterisana u smislu sličnosti sa humanim pacijentima sa nultim mutacijama OTC. Ukratko, OTC nokaut (KO) model stvoren u laboratoriji brisanjem eksona 2-3 blisko oponaša ozbiljan neonatalni početni oblik OTCD kod ljudi. Novorođeni mladunci muškog roda OTC KO imaju povišene nivoe amonijaka u plazmi zbog odsustva OTC ekspresije u jetri, i oni neminovno uginu u roku od 24 sata od rođenja. Heterozigotne ženke se normalno uzgajaju, imaju normalne nivoe amonijaka u plazmi, smanjenu OTC enzimsku aktivnost u jetri, povišene nivoe orotične kiseline u urinu, i u nekim slučajevima manju telesnu masu u poređenju sa članovima legla divljeg tipa (WT). Pojedinačna injekcija scAAV8-hOTCco vektora pripremljenog kako je opisano u primeru 1 u dozi od 1-3x10e10 GC/mladunac neposredno po rođenju može da spase OTC KO mladunce i da im produži život do 6 nedelja. Da bi se postigla dugoročna korekcija, grupa od OTC-KO miševa starih 4 nedelje je primala drugi vektor scAAVrh10-hOTCco vektor, koji je pripremljen kako je opisano u primeru 1.
[0108] Preko 30 OTC-KO mladunaca izvađenih carskim rezom je uspešno spašeno isporukom gena. Spašeni mladunci su imali manju telesnu masu od njihovih normalnih članova legla i imali su prolazni fenotip retkog krzna i abnormalne kože. Najvažnije, njihovi nivoi amonijaka u plazmi su bili u normalnom opsegu. Međutim, efikasnost ne može da se održava duže od 6 nedelja zbog gubitka genoma vektora tokom brze proliferacije jetre u neonatalnoj fazi. Drugo davanje vektora scAAVrh10-hOTCco vektora kod OTC-KO miševa starih 4 nedelje može dalje da produži njihove živote do odraslog doba. Najstariji miševi navršili su 18 meseci života. Dugoročno spašeni miševi pokazuju bliske do normalne nivoe amonijaka u plazmi, iako su nivoi orotične kiseline u urinu u podskupu ovih miševa bili značajno povišeni. Sirius crvene mrlje na uzorcima jetre od heterozigotnih miševa različite starosne dobi (6, 12, i 18 meseci stari) su pokazale fibrozu jetre kod ostarelih (18 meseci starih) OTC-KO heterozigotnih ženki miševa, slično uzorku jetre od OTCD pacijenta starog 11 godina.
Primer 10 - Lečenje OTC nedostatka sa kasnim nastankom (OTCD)
[0109] OTC-KO heterozigotni miševi stari dva meseca su primili u venu repa pojedinačnu injekciju samokomplementarnog AAV8 vektora koji kodira humani OTC gen optimizovan kodonom (SEQ ID NO: 5) na 1x10<10>, 3x10<10>, i 1x10<11>kopijama genoma vektora po mišu. Jednu nedelju nakon lečenja vektorom, miševi u sve tri grupe koje su primale dozu vektora su imali normalne nivoe orotične kiseline u urinu koji su održavani tokom ispitivanja (16 meseci). Uzorci jetre su sakupljeni od tretiranih miševa starih 18 meseci radi patološke analize i upoređeni su sa netretiranim heterozigotnim miševima iste starosti i WT članovima legla. Svi tretirani miševi su pokazali normalnu histologiju jetre sličnu sa WT, za razliku od netretiranih heterozigotnih životinja koje su imale fibrozu jetre. Može se zaključiti da pojedinačna injekcija AAV8sc-hOTCco vektora može da spreči fibrozu jetre kod OTC-KO heterozigota i ima veliki potencijal za ispravljanje fibroze jetre kod OTCD pacijenata.
[0110] Vektori genske terapije opisani ovde mogu da imaju rapidnu, robusnu i produženu ekspresiju gena čak i kod miševa sa potpunim nedostatkom OTC. Heterozigotne ženke mogu da reprodukuju i isporuče hemizigotnog mladunca muškog roda, ali ti mladunci uginu u danu rođenja ukoliko su netretirani. Netretirane stare heterozigotne ženke miševa su pokazale dokaz povećane fibroze i mikrovezikularne steatoze, nalaz za koji se ispostavlja da je sličan opažanjima kod humanih heterozigotnih pacijenata. Razvijen je režim prenosa gena koji može da spase pogođene mužjake, a tretirani mužjaci su preživeli tokom 72 nedelje.
[0111] Samim tim, ovi podaci pokazuju da genska terapija specifična za jetru sa hOTC može da spreči fibrozu jetre. Ovi podaci su u korelaciji sa lečenjem heterozigotnih humanih pacijenata sa nedostatkom OTC, npr., subjekata sa kasnim nastankom OTCD.
(Slobodan tekst liste sekvenci)
[0112] Sledeće informacije su date za sekvence koje sadrže slobodan tekst ispod numeričke oznake <223>.

Claims (17)

  1. Patentni zahtevi 1. Rekombinantni virusni vektor koji obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein humane ornitinske transkarbamilaze (hOTC) i ekspresione kontrolne sekvence koje usmeravaju ekspresiju hOTC u ćeliji jetre, pri čemu je hOTC sekvenca nukleinske kiseline manje od 80% identična hOTC sekvenci divljeg tipa SEQ ID NO: 1 koja kodira zreli ili hOTC protein pune dužine, i eksprimira funkcionalnu hOTC, pri čemu je pomenuta hOTC sekvenca nukleinske kiseline izabrana između sekvence nukleinske kiseline koja obuhvata SEQ ID NO: 5 ili sekvence nukleinske kiseline koja joj je identična najmanje 96 % do 99 %.
  2. 2. Rekombinantni virusni vektor prema zahtevu 1, pri čemu hOTC sekvenca nukleinske kiseline ima sekvencu SEQ ID NO: 5.
  3. 3. Rekombinantni virusni vektor prema zahtevu 1, pri čemu hOTC sekvenca nukleinske kiseline ima sekvencu SEQ ID NO: 4 ili SEQ ID NO: 3.
  4. 4. Rekombinantni virusni vektor prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu hOTC predstavlja himernu OTC koja obuhvata heterolognu tranzitnu sekvencu supstituisanu nativnom tranzitnom sekvencom SEQ ID NO: 5.
  5. 5. Rekombinantni virusni vektor prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu je taj virusni vektor izabran iz grupe koju čine vektor adeno-asociranog virusa (AAV), adenovirusni vektor, i lentivirusni vektor.
  6. 6. Rekombinantni virusni vektor prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu ekspresione kontrolne sekvence obuhvataju promoter specifičan za jetru, opciono pri čemu taj promoter specifičan za jetru predstavlja promoter tiroksin-vezujućeg globulina (TBG).
  7. 7. Rekombinantni virusni vektor prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu ekspresiona kaseta dalje obuhvata jedan ili više od introna, Kozak sekvence, poli A, i post-transkripcionih regulatornih elemenata.
  8. 8. Rekombinantni virusni vektor prema zahtevu 1, pri čemu taj rekombinantni virusni vektor predstavlja rekombinantni AAV vektor koji obuhvata AAV kapsid koji je u njega upakovao sekvencu nukleinske kiseline koja obuhvata najmanje jednu ITR sekvencu i nukleinsku kiselinu koja kodira hOTC, opciono pri čemu je AAV kapsid izabran iz grupe koju čine AAV8, AAV9 i/ili AAVrh10.
  9. 9. Rekombinantni adeno-asocirani virus (rAAV) koji ima AAV kapsid i u njega upakovanu ekspresionu kasetu koja obuhvata najmanje jednu AAV invertnu terminalnu ponovljenu (ITR) sekvencu, sekvencu nukleinske kiseline koja kodira najmanje zrelu humanu ornitinsku transkarbamilazu (hOTC), i ekspresione kontrolne sekvence koje usmeravaju ekspresiju hOTC u ćeliji jetre, pri čemu pomenute ekspresione kontrolne sekvence obuhvataju promoter specifičan za jetru, pri čemu je hOTC sekvenca nukleinske kiseline manje od 80% identična hOTC sekvenci divljeg tipa SEQ ID NO: 1 koja kodira zreli hOTC protein i obuhvata najmanje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira zreli hOTC protein SEQ ID NO: 5 ili sekvencu nukleinske kiseline koja joj je identična najmanje 96 % do 99.9 %.
  10. 10. rAAV prema zahtevu 9, pri čemu hOTC sekvenca nukleinske kiseline ima sekvencu SEQ ID NO: 5.
  11. 11. rAAV prema bilo kom od zahteva 8 do 10, pri čemu je AAV kapsid izabran iz grupe koju čine AAV8, AAV9, ili AAVrh10.
  12. 12. rAAV prema zahtevu 11, pri čemu ekspresiona kaseta dalje obuhvata 5' AAV invertnu terminalnu ponovljenu (ITR) sekvencu i 3' ITR sekvencu ili pri čemu najmanje jedan AAV ITR obuhvata 5' ITR u kojoj je D-sekvenca i terminalno rezoluciono mesto izbrisano ili pri čemu su 5' i 3' ITR iz AAV2.
  13. 13. rAAV prema bilo kom od zahteva 9 do 12, pri čemu nukleinska kiselina koja kodira hOTC ima kodirajuću sekvencu SEQ ID NO: 3 ili, pri čemu nukleinska kiselina koja kodira hOTC ima kodirajuću sekvencu SEQ ID NO: 4.
  14. 14. Virusni vektor koji obuhvata hOTC gen koji kodira himernu ornitinsku transkarbamilazu koja obuhvata najmanje zrelu humanu ornitinsku transkarbamilazu sa heterolognom tranzitnom sekvencom, pri čemu je ta sekvenca nukleinske kiseline koja kodira zrelu humanu ornitinsku transkarbamilazu izabrana iz grupe koju čine sekvenca nukleinske kiseline SEQ ID NO: 3, 4, ili 5.
  15. 15. Virusni vektor prema zahtevu 14, pri čemu hOTC kodirajuća sekvenca predstavlja sekvencu SEQ ID NO: 5.
  16. 16. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata nosač i efektivnu količinu vektora prema bilo kom od zahteva 1 do 8, rAAV prema bilo kom od zahteva 9 do 13, i/ili virusni vektor prema zahtevu 14 ili 15.
  17. 17. Virusni vektor prema bilo kom od zahteva 1 do 8, rAAV prema bilo kom od zahteva 9 do 13, i/ili vektor prema zahtevu 14 ili 15 za upotrebu u postupku lečenja nedostatka ornitinske transkarbamilaze (OTCD) kod humanog pacijenta.
RS20201154A 2014-03-09 2015-03-09 Kompozicije korisne u lečenju nedostatka ornitinske transkarbamilaze (otc) RS60902B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461950157P 2014-03-09 2014-03-09
EP15712226.8A EP3116900B1 (en) 2014-03-09 2015-03-09 Compositions useful in treatment of ornithine transcarbamylase (otc) deficiency
PCT/US2015/019513 WO2015138348A1 (en) 2014-03-09 2015-03-09 Compositions useful in treatment of ornithine transcarbamylase (otc) deficiency

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60902B1 true RS60902B1 (sr) 2020-11-30

Family

ID=52737408

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201154A RS60902B1 (sr) 2014-03-09 2015-03-09 Kompozicije korisne u lečenju nedostatka ornitinske transkarbamilaze (otc)

Country Status (22)

Country Link
US (6) US10167454B2 (sr)
EP (2) EP3116900B1 (sr)
JP (2) JP6822841B2 (sr)
KR (1) KR102390075B1 (sr)
AU (2) AU2015229750A1 (sr)
BR (2) BR112016020688B1 (sr)
CA (1) CA2939950C (sr)
CL (2) CL2016002235A1 (sr)
CY (1) CY1123378T1 (sr)
DK (1) DK3116900T3 (sr)
ES (1) ES2821938T3 (sr)
HR (1) HRP20201544T1 (sr)
HU (1) HUE051311T2 (sr)
IL (2) IL247329B (sr)
LT (1) LT3116900T (sr)
MX (1) MX377804B (sr)
PL (1) PL3116900T3 (sr)
PT (1) PT3116900T (sr)
RS (1) RS60902B1 (sr)
SI (1) SI3116900T1 (sr)
SM (1) SMT202000531T1 (sr)
WO (2) WO2015138357A2 (sr)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9987354B2 (en) 2011-04-29 2018-06-05 Selecta Biosciences, Inc. Tolerogenic synthetic nanocarriers for antigen-specific deletion of T effector cells
CN110251675A (zh) 2013-05-03 2019-09-20 西莱克塔生物科技公司 降低或预防响应于非变应原性抗原的过敏反应的致耐受性合成纳米载体
EP3027221A1 (en) 2013-07-30 2016-06-08 PhaseRx, Inc. Block copolymers and their conjugates or complexes with oligonucleotides
WO2015138357A2 (en) * 2014-03-09 2015-09-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions useful in treatment of otc deficency
WO2016037161A2 (en) 2014-09-07 2016-03-10 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for attenuating gene editing anti-viral transfer vector immune responses
CN112553229A (zh) 2014-11-05 2021-03-26 沃雅戈治疗公司 用于治疗帕金森病的aadc多核苷酸
JP2018509387A (ja) 2015-01-21 2018-04-05 フェーズアールエックス インコーポレイテッド 細胞に治療および診断剤を送達するための方法、組成物、ならびにシステム
WO2017059902A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh 3' utr sequences for stabilization of rna
US11078247B2 (en) 2016-05-04 2021-08-03 Curevac Ag RNA encoding a therapeutic protein
IL263801B2 (en) 2016-07-26 2024-01-01 Biomarin Pharm Inc Novel adeno-associated virus capsid proteins
AU2017313917B2 (en) 2016-08-18 2023-12-21 The Regents Of The University Of California CRISPR-Cas genome engineering via a modular AAV delivery system
US11400109B2 (en) 2016-11-10 2022-08-02 Translate Bio, Inc. Subcutaneous delivery of messenger RNA
WO2018126084A1 (en) 2016-12-30 2018-07-05 Phaserx, Inc. Branched peg molecules and related compositions and methods
EP3562494A4 (en) * 2016-12-30 2020-08-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania GENE THERAPY FOR THE TREATMENT OF PHENYLKETONURIS
EP3565605A1 (en) * 2017-01-03 2019-11-13 ethris GmbH Ornithine transcarbamylase coding polyribonucleotides and formulations thereof
ES3052719T3 (en) * 2017-01-10 2026-01-13 Childrens Medical Res Institute Polynucleotides and vectors for the expression of transgenes
ES3036482T3 (en) 2017-03-11 2025-09-19 Cartesian Therapeutics Inc Methods and compositions related to combined treatment with anti-inflammatories and synthetic nanocarriers comprising an immunosuppressant
AU2018275549B2 (en) * 2017-05-31 2024-12-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Optimized human clotting factor IX gene expression cassettes and their use
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
TWI904068B (zh) 2017-08-09 2025-11-11 美商生物化學醫療公司 核酸分子及其用途
JP7423522B2 (ja) * 2017-11-22 2024-01-29 モダーナティエックス・インコーポレイテッド 尿素サイクル異常症の治療のためのオルニチントランスカルバミラーゼをコードするポリヌクレオチド
JP2021522811A (ja) 2018-05-09 2021-09-02 ビオマリン プハルマセウトイカル インコーポレイテッド フェニルケトン尿症の治療方法
TW202005978A (zh) 2018-05-14 2020-02-01 美商拜奧馬林製藥公司 新穎肝靶向腺相關病毒載體
EP3793689A1 (en) * 2018-05-15 2021-03-24 Translate Bio, Inc. Subcutaneous delivery of messenger rna
AU2019268330A1 (en) 2018-05-15 2020-11-26 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of Parkinson's disease
CA3106639A1 (en) * 2018-07-16 2020-01-23 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions of otc constructs and vectors
AU2019304569B2 (en) 2018-07-17 2023-07-06 Helixmith Co., Ltd Treatment of neuropathy with DNA constructs expressing IGF-1 isoforms
WO2020033863A1 (en) * 2018-08-09 2020-02-13 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof for non-viral gene therapy
EP3856762A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Voyager Therapeutics, Inc. Frataxin expression constructs having engineered promoters and methods of use thereof
CA3122080A1 (en) * 2018-12-06 2020-06-11 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating ornithine transcarbamylase deficiency
KR20210130158A (ko) 2019-01-31 2021-10-29 오레곤 헬스 앤드 사이언스 유니버시티 Aav 캡시드의 전사 의존적 유도 진화를 사용하는 방법
AU2020287627A1 (en) 2019-06-04 2021-11-18 Selecta Biosciences, Inc. Formulations and doses of PEGylated uricase
WO2021178510A1 (en) * 2020-03-03 2021-09-10 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
JP7817176B2 (ja) 2020-03-04 2026-02-18 ポセイダ セラピューティクス，インコーポレイティド 代謝性肝障害の治療のための組成物と方法
US20230235353A1 (en) * 2020-03-19 2023-07-27 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Compositions and methods for reducing reverse packaging of cap and rep sequences in recombinant aav
EP4162059A1 (en) 2020-05-12 2023-04-12 The Trustees of The University of Pennsylvania Compositions for drg-specific reduction of transgene expression
EP4284335A1 (en) 2021-02-01 2023-12-06 RegenxBio Inc. Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses
JPWO2022224372A1 (sr) * 2021-04-21 2022-10-27
AR126845A1 (es) * 2021-08-23 2023-11-22 Bioverativ Therapeutics Inc Producción de adn de extremo cerrado con secuencias repetidas de terminal invertida
US20250295807A1 (en) 2021-11-15 2025-09-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions for drg-specific reduction of transgene expression
MX2024009027A (es) * 2022-01-21 2024-08-06 Univ Pennsylvania Metodos para el tratamiento de deficiencia de ornitina transcarbamilasa (otc).
JP2025534674A (ja) * 2022-10-11 2025-10-17 パシフィック・ノースウェスト・リサーチ・インスティテュート 遺伝性障害に関する構築物
WO2025229995A1 (ja) * 2024-04-30 2025-11-06 学校法人自治医科大学 核酸導入用ベクター、核酸導入方法、ポリヌクレオチド、及びベクター

Family Cites Families (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1016745A (en) 1911-04-11 1912-02-06 Edwin C Henrikson Table-caster.
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US6268213B1 (en) 1992-06-03 2001-07-31 Richard Jude Samulski Adeno-associated virus vector and cis-acting regulatory and promoter elements capable of expressing at least one gene and method of using same for gene therapy
US5869305A (en) 1992-12-04 1999-02-09 The University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US6204059B1 (en) 1994-06-30 2001-03-20 University Of Pittsburgh AAV capsid vehicles for molecular transfer
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
US5652224A (en) 1995-02-24 1997-07-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for gene therapy for the treatment of defects in lipoprotein metabolism
US6093570A (en) 1995-06-07 2000-07-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Helper virus-free AAV production
US5741683A (en) 1995-06-07 1998-04-21 The Research Foundation Of State University Of New York In vitro packaging of adeno-associated virus DNA
EP0950111A1 (en) 1996-09-06 1999-10-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods using cre-lox for production of recombinant adeno-associated viruses
CN1233291A (zh) 1996-09-06 1999-10-27 宾西法尼亚大学托管会 重组腺伴随病毒定向基因治疗的方法
EP0931158A1 (en) 1996-09-06 1999-07-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing t7 polymerase
US5866552A (en) 1996-09-06 1999-02-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for expressing a gene in the absence of an immune response
US20020037867A1 (en) 1999-02-26 2002-03-28 James M. Wilson Method for recombinant adeno-associated virus-directed gene therapy
EP0932694A2 (en) 1996-09-11 1999-08-04 THE UNITED STATES GOVERNMENT as represented by THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Aav4 vector and uses thereof
EP0938578B1 (en) 1996-12-05 2004-02-04 Crucell Holland B.V. Genetic modification of primate hemopoietic repopulating stem cells
EP2327797B1 (en) 1997-04-01 2015-11-25 Illumina Cambridge Limited Method of nucleic acid sequencing
US6548286B1 (en) 1997-04-14 2003-04-15 Cell Genesys, Inc. Methods for increasing the efficiency of recombinant AAV product
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
US6251677B1 (en) 1997-08-25 2001-06-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
WO1999015677A1 (en) 1997-09-19 1999-04-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for gene transfer using bcl2 and compositions useful therein
EP1015619A1 (en) 1997-09-19 2000-07-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and cell line useful for production of recombinant adeno-associated viruses
CA2303768C (en) 1997-09-19 2009-11-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and vector constructs useful for production of recombinant aav
DE69922934T2 (de) 1998-03-20 2005-12-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Zusammensetzungen und Verfahren zur helfer-freien Herstellung von rekombinanten Adeno-assoziierten Viren
US6953690B1 (en) 1998-03-20 2005-10-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
EP1080218A1 (en) 1998-05-27 2001-03-07 University of Florida Method of preparing recombinant adeno-associated virus compositions by using an iodixanol gradient
DE69939169D1 (de) 1998-05-28 2008-09-04 Us Gov Health & Human Serv Aav5 vektoren und deren verwendung
US6759237B1 (en) 1998-11-05 2004-07-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same
PT1127150E (pt) 1998-11-05 2007-08-22 Univ Pennsylvania ''sequências de ácido nucleico do vírus adeno associado do serotipo 1, vectores e células hospedeiras que as contêm''
ATE454445T1 (de) 1998-11-10 2010-01-15 Univ North Carolina Virusvektoren und verfahren für ihre herstellung und verabreichung.
US6387368B1 (en) 1999-02-08 2002-05-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
JP4693244B2 (ja) 1999-03-18 2011-06-01 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 組換えアデノ随伴ウイルスのヘルパー無しの生産のための組成物および方法
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
AU2409200A (en) 1999-06-02 2000-12-28 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Compositions and methods useful for production of recombinant viruses which require helper viruses
ATE403715T1 (de) 1999-08-09 2008-08-15 Targeted Genetics Corp Erhöhung der expression einer einzelsträngigen, heterologen nukleotidsequenz von einem rekombinanten viralen vektor durch ausgestaltung der sequenz in einer art und weise, dass basenpaarungen innerhalb der sequenz entstehen
EP1218035A2 (en) 1999-09-29 2002-07-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rapid peg-modification of viral vectors
US6365394B1 (en) 1999-09-29 2002-04-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Cell lines and constructs useful in production of E1-deleted adenoviruses in absence of replication competent adenovirus
JP2003511037A (ja) 1999-10-01 2003-03-25 ジェノボ， インコーポレイテッド ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含むアデノウイルスを使用する組換えＡＡＶの産生
US7115391B1 (en) 1999-10-01 2006-10-03 Genovo, Inc. Production of recombinant AAV using adenovirus comprising AAV rep/cap genes
US6821512B1 (en) 1999-12-03 2004-11-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for increasing packaging and yield of recombinant adenoviruses using multiple packaging signals
WO2001040455A2 (en) 1999-12-03 2001-06-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for increasing packaging and yields of recombinant adenoviruses using multiple packaging signals
US6468524B1 (en) 2000-03-22 2002-10-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services AAV4 vector and uses thereof
US6855314B1 (en) 2000-03-22 2005-02-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services AAV5 vector for transducing brain cells and lung cells
JP2004514407A (ja) 2000-04-28 2004-05-20 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 異種キャプシド中にシュードタイピングされたａａｖ５キャプシドおよびａａｖ５ベクターを含む組換えａａｖベクター
WO2001091802A1 (en) * 2000-05-30 2001-12-06 Baylor College Of Medicine Chimeric viral vectors for gene therapy
AU2001268149B2 (en) 2000-06-01 2005-08-18 University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compounds for controlled release of recombinant parvovirus vectors
JP2004520812A (ja) 2000-08-30 2004-07-15 ハプロゲン・エルエルシー 対立遺伝子を決定するための方法
WO2002095073A1 (en) 2001-05-18 2002-11-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for the synthesis of dna sequences
AU2002324700A1 (en) 2001-08-14 2003-03-03 Bayer Ag Nucleic acid and amino acid sequences involved in pain
US20040086485A1 (en) 2001-10-04 2004-05-06 Aguilar-Cordova Carlos Estuardo Chemeric viral vectors for gene therapy
CN103555677B (zh) 2001-11-13 2018-01-30 宾夕法尼亚大学托管会 检测和/或鉴定腺伴随病毒(aav)序列以及分离所鉴定的新型序列的方法
WO2003052051A2 (en) 2001-12-17 2003-06-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (aav) serotype 8 sequences
PT2573170T (pt) 2001-12-17 2018-03-26 Univ Pennsylvania Sequências de um vírus adenoassociado (aav) de serotipo 9, vetor contendo as mesmas, e suas utilizações
AU2002367943A1 (en) 2001-12-18 2003-12-22 University Of North Carolina At Chapel Hill Improved reagents and methods for producing parvoviruses
AU2003274397A1 (en) 2002-06-05 2003-12-22 University Of Florida Production of pseudotyped recombinant aav virions
DK3211085T3 (da) 2003-09-30 2021-06-21 Univ Pennsylvania Klader af adeno-associeret virus (aav), sekvenser, vektorer indeholdende disse og anvendelser deraf
US8999678B2 (en) 2005-04-07 2015-04-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of increasing the function of an AAV vector
US7456683B2 (en) 2005-06-09 2008-11-25 Panasonic Corporation Amplitude error compensating device and quadrature skew error compensating device
US7588772B2 (en) 2006-03-30 2009-09-15 Board Of Trustees Of The Leland Stamford Junior University AAV capsid library and AAV capsid proteins
EP2799547B1 (en) 2006-11-08 2016-12-21 Veritas Bio, LLC In Vivo Delivery of RNA to a Target Cell
EP2058401A1 (en) 2007-10-05 2009-05-13 Genethon Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of AAV vectors
DK2282764T3 (da) 2008-04-22 2019-10-14 Vib Vzw Leverspecifikke nukleinsyreregulerende elementer samt fremgangsmåder og anvendelser heraf
CA2724105C (en) 2008-05-13 2017-09-05 University Of Washington Diblock copolymers and polynucleotide complexes thereof for delivery into cells
EP2352522A4 (en) 2008-11-06 2014-03-05 Univ Washington BISPECIFIC AUXILIARIES FOR INTRA-CELLULAR RELEASE
EP2364330B1 (en) 2008-11-06 2015-03-25 University Of Washington Multiblock copolymers
WO2010053572A2 (en) 2008-11-07 2010-05-14 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
HRP20140327T4 (hr) 2009-07-24 2017-11-03 Immune Design Corp Lentiviralni vektori pseudotipizirani sa glikoproteinom ovojnice virusa sindbis
EP2281579A1 (en) 2009-08-05 2011-02-09 BioNTech AG Vaccine composition comprising 5'-Cap modified RNA
US9315825B2 (en) 2010-03-29 2016-04-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
SG10201908848RA (en) 2010-03-29 2019-10-30 Univ Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
US9181675B2 (en) 2011-05-12 2015-11-10 Hitachi Construction Machinery Co., Ltd. Construction machine
PT2717893T (pt) 2011-06-08 2019-08-20 Translate Bio Inc Composições de nanopartículas lipídicas e métodos para transferência de arnm
FR2977562B1 (fr) 2011-07-06 2016-12-23 Gaztransport Et Technigaz Cuve etanche et thermiquement isolante integree dans une structure porteuse
MX363734B (es) 2011-10-27 2019-03-29 Massachusetts Inst Technology Derivados de aminoacidos funcionalizados en la terminal n capaces de formar microesferas encapsuladoras de farmaco.
WO2013143555A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Biontech Ag Rna formulation for immunotherapy
HK1206612A1 (en) * 2012-04-02 2016-01-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of secreted proteins
EP2834259A4 (en) * 2012-04-02 2016-08-24 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES
US20150126589A1 (en) 2012-06-08 2015-05-07 Ethris Gmbh Pulmonary Delivery of Messenger RNA
EP3027221A1 (en) * 2013-07-30 2016-06-08 PhaseRx, Inc. Block copolymers and their conjugates or complexes with oligonucleotides
WO2015138357A2 (en) 2014-03-09 2015-09-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions useful in treatment of otc deficency

Also Published As

Publication number Publication date
US10626382B2 (en) 2020-04-21
MX2016011686A (es) 2016-11-07
BR112016020688B1 (pt) 2024-01-30
DK3116900T3 (da) 2020-09-28
IL275799B2 (en) 2023-02-01
ES2821938T3 (es) 2021-04-28
JP6920500B2 (ja) 2021-08-18
AU2020201190B2 (en) 2022-04-07
CL2016002235A1 (es) 2017-06-23
PL3116900T3 (pl) 2021-03-08
CL2019002280A1 (es) 2019-11-29
US20180135030A1 (en) 2018-05-17
WO2015138357A3 (en) 2015-12-10
US20190071651A1 (en) 2019-03-07
US20170021037A1 (en) 2017-01-26
CA2939950A1 (en) 2015-09-17
KR102390075B1 (ko) 2022-04-26
IL247329B (en) 2020-07-30
US20230416700A1 (en) 2023-12-28
KR20160124229A (ko) 2016-10-26
JP6822841B2 (ja) 2021-01-27
SI3116900T1 (sl) 2021-02-26
IL275799A (en) 2020-08-31
US11732246B2 (en) 2023-08-22
EP3116900A1 (en) 2017-01-18
BR122023023004A2 (pt) 2023-12-26
CY1123378T1 (el) 2021-12-31
US9890365B2 (en) 2018-02-13
NZ761706A (en) 2024-04-26
JP2017512466A (ja) 2017-05-25
US20200377866A1 (en) 2020-12-03
WO2015138348A1 (en) 2015-09-17
HRP20201544T1 (hr) 2021-02-19
IL247329A0 (en) 2016-09-29
HUE051311T2 (hu) 2021-03-01
PT3116900T (pt) 2020-10-08
AU2015229750A1 (en) 2016-09-15
LT3116900T (lt) 2020-12-10
EP3778627A1 (en) 2021-02-17
EP3116900B1 (en) 2020-07-08
MX377804B (es) 2025-03-11
JP2020114235A (ja) 2020-07-30
WO2015138357A2 (en) 2015-09-17
IL275799B (en) 2022-10-01
US20170051259A1 (en) 2017-02-23
NZ724165A (en) 2024-04-26
CA2939950C (en) 2023-08-22
AU2020201190A1 (en) 2020-03-05
US10781430B2 (en) 2020-09-22
SMT202000531T1 (it) 2020-11-10
US10167454B2 (en) 2019-01-01
BR112016020688A2 (pt) 2017-10-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11732246B2 (en) Compositions useful in treatment of ornithine transcarbamylase (OTC) deficiency
US20220265861A1 (en) Adeno-associated viral vectors useful in treatment of spinal muscular atropy
KR20180091863A (ko) 임상적 사용에 적합한 무혈청 현탁 세포 배양 시스템에서 재조합 아데노-관련 바이러스(aav) 벡터를 생성하기 위한 확장가능한 방법
KR20160033217A (ko) 변종 ａａｖ 및 조성물, 세포, 기관 및 조직으로의 유전자 전이를 위한 방법 및 용도
KR20160026841A (ko) 스터퍼/필러 폴리누클레오티드 서열을 포함하는 벡터 및 사용 방법
JP2022528010A (ja) メープルシロップ尿症（ｍｓｕｄ）のａａｖ媒介遺伝子治療
JP2024515823A (ja) メープルシロップ尿症（ｍｓｕｄ）におけるｂｃａａ修飾のための遺伝子治療
WO2019036484A1 (en) COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF ARGININOSUCCINIC ACIDURIA
US20240269328A1 (en) Recombinant adeno-associated viruses for lesch-nyhan disorders and uses thereof
WO2025217186A1 (en) Compositions and methods for in vivo nuclease-mediated treatment of citrullinemia type 1 (ctln1)
EP3775177A1 (en) Gene therapy for oxidative stress