JP6920500B2 - オルニチントランスカルバミラーゼ（ｏｔｃ）欠損症の処置において有用な組成物 - Google Patents

Description

連邦政府により支援された研究または開発に関する陳述
本研究は、米国立衛生研究所からの助成番号Ｐ０１−ＨＤ０５７２４７、Ｐ０１−ＨＬ０５９４０７、およびＰ３０−ＤＫ０４７７５７によって一部支援を受けた。米国政府は、本発明において特定の権利を有し得る。

電子的形態で提出された材料の参照による援用
本出願人は、本明細書と共に電子的形態で出願した配列表材料を、参照によって本明細書に援用する。このファイルは「ＵＰＮ−１４−７０３７ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられる。

オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症は尿素合成の先天異常の全症例のほぼ半分を占め、有病率は１５，０００人に少なくとも１人であると推定される。尿素サイクル異常症は生命を脅かすアンモニア上昇の危険に患者をさらし、これは、不可逆的な認知機能障害、昏睡および死をもたらし得る。完全欠損症の新生男児は生後３日以内に高アンモニア血症性昏睡を発症し、これは処置しなければ死を招く。

ＯＴＣ欠損症（ＯＴＣＤ）の現在の治療法は多数の課題を有する。患者は、代替の窒素クリアランス経路を活性化する薬物療法と併用して低タンパク質食によって管理され得るが、これは高アンモニア血症の急性発症を防止しない。透析および代替経路療法の使用にもかかわらず、新生児における死亡率はほぼ５０％である。肝臓移植はＯＴＣＤを治癒させることができるが、ドナー肝臓は限られており、この手順により著しい病的状態になり、被験者の生存期間を通して免疫抑制薬が必要である。

ＯＴＣＤなどの代謝疾患の遺伝子療法は、他の状態よりも挑戦的な遺伝子置換療法のモデルを示す。遺伝子は細胞自律的な形で作用する（すなわち、遺伝子は、遺伝子がその中で発現される細胞に対してだけ影響を与えることができる）ので、治療効果は、細胞当たりの高い発現が低い形質導入を圧倒し得る、分泌タンパク質などの肝臓内での正味の発現レベルではなく、形質導入される標的細胞の数と直接相関するはずである。さらに、ｈＯＴＣｗｔ ｍＲＮＡが不安定であるという少なくとも１つ報告が発表されている［Ｗａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，１０５（２０１２）２０３−２１１］。

ウイルスベクターを使用してＯＴＣ欠損症の処置を試みる報告が発表されている。例えば、いくつかのグループは、ラット、マウス、またはヒトＯＴＣ ｃＤＮＡを保有する組換えアデノウイルスを用いて、ＯＴＣ欠損症のマウスモデルにおいてこれを試みた。ラットまたはマウスＯＴＣ ｃＤＮＡを保有するウイルスを用いる動物モデルにおいて、ある程度の成功した肝臓ＯＴＣ活性の再構成および代謝異常の補正が報告されている。アデノウイルスベクターを用いるこれまでの研究では、ＯＴＣＤマウスにおいて十分なレベルの活性ヒトＯＴＣを発現させることの難しさが示されている。

従って、ＯＴＣＤ治療に対する他のアプローチが必要とされている。

１つの態様では、本発明は、ヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（ｈＯＴＣａｓｅ）をコードする改変核酸配列と、肝細胞におけるｈＯＴＣの発現を誘導する発現制御配列とを含む発現カセットを有する組換えウイルスベクターを提供し、ｈＯＴＣ核酸配列は、野生型配列（例えば、配列番号１）の全長ｈＯＴＣ、または成熟ｈＯＴＣを含むが少なくとも天然リーダー配列を欠いているその断片、または少なくとも成熟ｈＯＴＣを含む別の中間体に関して野生型ｈＯＴＣ配列と８０％未満の同一性であり、かつ機能性ｈＯＴＣａｓｅを発現する。適切には、改変配列は好ましくはコドン最適化されており、さらにそれが酵素の形質導入、転写および／または翻訳のうちの少なくとも１つを増強するように改善されている。

核酸配列は、配列番号５の成熟ｈＯＴＣ、またはそれと少なくとも約９６〜約９９％同一である核酸配列、または少なくとも配列番号９の成熟ｈＯＴＣを含む核酸配列、またはそれと少なくとも約９６〜約９９％同一である核酸配列を含むことができ、これは機能性ｈＯＴＣａｓｅを発現する。一実施形態では、ｈＯＴＣは、配列番号５の全長、またはそれと少なくとも約９６〜約９９％同一である核酸配列、または配列番号９の全長の核酸配列、またはそれと少なくとも約９６〜約９９％同一である核酸配列である。ｈＯＴＣ配列は、配列番号３、４、８または９の対応するヌクレオチドのものであってもよい。配列表中のものと相補的な鎖は本発明の範囲内に包含される。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターから選択され得る。

さらなる態様では、本発明は、ＡＡＶカプシドを有し、かつその中に、少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴ）配列と、ヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（ｈＯＴＣａｓｅ）をコードする改変核酸配列と、肝細胞におけるｈＯＴＣの発現を誘導する発現制御配列とを含む発現カセットがパッケージングされた組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供し、前記発現制御配列は、肝臓特異的プロモーターを含む。改変ｈＯＴＣ核酸配列は、野生型配列（例えば、配列番号１）の成熟配列または全長ｈＯＴＣに関して野生型ｈＯＴＣ配列と８０％未満の同一性であり、かつ機能性ｈＯＴＣａｓｅを発現する。合成ｈＯＴＣ核酸配列は、少なくとも配列番号５の成熟ｈＯＴＣ、またはそれと少なくとも約９６〜約９９．９％同一である核酸配列、または少なくとも配列番号９の成熟ｈＯＴＣを含む核酸配列、またはそれと少なくとも約９６〜約９９．９％同一である核酸配列を含む。

またさらなる態様では、本発明は、異種トランジットペプチドを有する成熟ヒトオルニチントランスカルバミラーゼを含むキメラオルニチントランスカルバミラーゼをコードするｈＯＴＣ遺伝子を含むウイルスベクターを提供し、成熟ヒトオルニチントランスカルバミラーゼ由来のコード配列は、少なくとも配列番号３、４、５、８または９の成熟ｈＯＴＣを含む核酸配列から選択される。任意選択で、トランジット配列を含むこれらの配列のいずれかの全長配列が選択されてもよい。あるいは、本明細書に記載されるような異種トランジット配列を含むキメラＯＴＣ遺伝子、およびこれらの成熟ｈＯＴＣが選択されてもよい。

別の態様では、担体と、本明細書に記載される有効量のベクターとを含む医薬組成物が提供される。

さらに別の態様は、オルニチントランスカルバミラーゼを、それを必要としている被験者に送達するための薬剤、および／またはオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症を処置するための薬剤の調製において使用される、本明細書に記載されるウイルスベクターである。１つの特に望ましい実施形態では、被験者はヒト被験者である。被験者は、オルニ
チントランスカルバミラーゼ欠損症についてホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。

さらに別の態様では、ＯＴＣＤの被験者において線維症またはオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症（ＯＴＣＤ）関連の肝硬変を予防および／または処置する際の、機能性ヒトオルニチントランスカルバミラーゼをコードする核酸配列を含むウイルスベクターの使用が提供される。一実施形態では、被験者はヒト患者である。さらなる実施形態では、被験者はヘテロ接合性であり、症状の後期発症を示し得る。

またさらなる態様では、ＯＴＣＤを有する被験者において肝細胞癌を予防および／または処置する際の、機能性ヒトオルニチントランスカルバミラーゼをコードする核酸配列を含むウイルスベクターの使用が提供される。一実施形態では、被験者はヒト患者である。さらなる実施形態では、被験者はＯＴＣＤについてヘテロ接合性であり、症状の後期発症を示し得る。

本発明の他の態様および利点は、以下の本発明の詳細な説明から容易に明らかになるであろう。

３２４Ａ、２２３Ｃ、２４６Ｇ、および２６９Ｔを有する野生型ｈＯＴＣ ｃＤＮＡを提供する［配列番号１］。 図１Ａの配列によりコードされるヒトオルニチントランスカルバミラーゼ配列を提供する［配列番号２］。 変更されたＧＣ比を有する改変ｈＯＴＣ ｃＤＮＡを提供する。配列中の塩基カウントは、２８３Ａ、２８５Ｃ、２８４Ｇ、および２１６Ｔである［配列番号３］。 ＬＷ３と呼ばれる改変ｈＯＴＣ ｃＤＮＡを提供する［配列番号４］。この配列中の塩基カウントは、２７９Ａ、３０３Ｃ、２８８Ｇ、および２２０Ｔである。ｈＯＴＣオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の開始コドンは、この図において、コザック配列に先行される。リーダーのコード配列はヌクレオチド１５で始まり（最初の９６ヌクレオチド）、その後に３２２アミノ酸のｈＯＴＣａｓｅのコード配列がある。この図では、終止コドンの後に、ベクターのレムナントであるＮｏｔＩ制限部位（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）がある。 ＬＷ４と呼ばれる改変ｈＯＴＣ ｃＤＮＡを提供する［配列番号５］。この配列中の塩基カウントは、２７８Ａ、３０３Ｃ、２８９Ｇ、および２２０Ｔである。リーダーのコード配列はヌクレオチド１５で始まり（最初の９６ヌクレオチド）、その後に３２２アミノ酸のｈＯＴＣａｓｅのコード配列がある。この図では、終止コドンの後に、ベクターのレムナントであるＮｏｔＩ制限部位（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）がある。 野生型ｈＯＴＣ、ならびに５つの改変配列、ＧＳ［配列番号３］、ＬＷ３［配列番号４］、ＬＷ４［配列番号５］、ＬＷ５［配列番号８］およびＬＷ６［配列番号９］のｃＤＮＡ配列のアライメントを提供する。アラインされた配列は、オープンリーディングフレームの一部ではない、コザック配列（ＬＷ３およびＬＷ４の最初の１４ヌクレオチド）および制限酵素部位（ＬＷ３およびＬＷ４の終止コドンの後）を含有する。

野生型ｈＯＴＣ ＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡと比較して、翻訳を最大にし、かつｍＲＮＡの安定性を改善するように設計された改変ヒト（ｈ）オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ｃＤＮＡが本明細書において提供される。また、改変ｈＯＴＣｍＲＮＡ配列も本明細書において提供される。これらの組成物は、本明細書に記載される治療および／または予防方法において使用され得る。任意選択で、これらの組成物は、被験者（例えば、ヒト被験者）が診断された状態の標準治療と矛盾しない他の治療法と組み合わせて
使用される。

比較のために、野生型ヒトＯＴＣ ｃＤＮＡ配列が図１Ａに示される。この配列は、図１Ａ〜図１Ｃのアミノ酸配列のヒトオルニチントランスカルバミラーゼをコードする。この同じアミノ酸配列は、図２Ａ〜図５の改変ｈＯＴＣ遺伝子によってコードされる。遺伝子と区別するためにｈＯＴＣａｓｅと称され得るｈＯＴＣ酵素は、３２アミノ酸のリーダーペプチド（図１のｎｔ１〜９６によりコード化、配列番号２の約アミノ酸１〜約３２）をそのＮ末端に有するプレタンパク質の形態でこの配列から発現され、このリーダーペプチドは酵素を細胞ミトコンドリアへ誘導した後に切断され、３２２アミノ酸残基の「成熟」タンパク質（配列番号２の約アミノ酸３３〜約アミノ酸３５４）が残る。この「いわゆる成熟」ｈＯＴＣａｓｅは、各ポリペプチド鎖中に３２２アミノ酸残基配列を有するホモ三量体タンパク質である。任意選択で、配列番号２の野生型配列の代替として、疾患に関与しない天然に存在する多型位置の１つまたは複数を含む配列が選択され得る：配列番号２のＦ１０１、Ｌ１１１、Ｗ１１９３−１９４（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ００４８０を参照）。

改変ｃＤＮＡ配列は全て図１Ａのｗｔ ｈＯＴＣ核酸配列［配列番号１］と約７７％〜約７８％同一であるが、これらの配列の間には構造の違いがある（それを説明する図５のアライメントを参照）。特に、図２のｈＯＴＣｃｏ［配列番号３］と図４のｈＯＴＣｃｏＬＷ４［配列番号５］との間には、約４％の核酸配列の差異がある。ＬＷ−３［図３、配列番号４］とＬＷ−４［図４、配列番号５］との間にはわずか１ｎｔの差異、すなわち０．０９４％（１／１０６２）の差異しかない（図５に示されるように、ＬＷ−３中のＡがＬＷ−４中のＧに変化される）。

一実施形態では、修飾ｈＯＴＣコード配列が提供され、この配列は、全長の野生型ｈＯＴＣコード配列（図１Ａ、配列番号１）に対して約８０％未満の同一性、好ましくは約７７％以下の同一性を有し、これは機能性ｈＯＴＣａｓｅをコードする。一実施形態では、修飾ｈＯＴＣコード配列は、ＡＡＶ媒介の送達（例えば、ｒＡＡＶ）の後、ｗｔ ｈＯＴＣと比べて改善された安定性を特徴とする。付加的または代替的に、少なくとも約９アミノ酸の長さのタンパク質のための代替的なリーディングフレームを欠いた修飾ｈＯＴＣコード配列が提供される。付加的に、あるいは代替的に、ウイルスベクターからの発現の後に測定する場合にｈＯＴＣａｓｅ野生型と比較して少なくとも約２５倍、少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍のｈＯＴＣａｓｅ発現レベルを有する修飾ｈＯＴＣコード配列が提供される。付加的に、あるいは代替的に、ウイルスベクターから発現されたｈＯＴＣａｓｅ野生型と比較して少なくとも約１０倍高い、少なくとも約２０倍高い、または少なくとも約３０倍高いｈＯＴＣａｓｅ肝臓活性を有する修飾ｈＯＴＣコード配列が提供される。

一実施形態では、修飾ｈＯＴＣコード配列は、図４（ｈＯＴＣｃｏ−ＬＷ４、配列番号５）の成熟酵素（約ｎｔ９９〜約１０６８）または全長をコードする配列と９６％〜９９．９％同一であるか、あるいは、配列番号５（図４）と９６．５％〜９９％同一、または約９７％、または約９８％同一である。

一実施形態では、修飾ｈＯＴＣコード配列は、図３（ｈＯＴＣｃｏ−ＬＷ３、配列番号４）の成熟酵素（約ｎｔ９９〜約１０６８）をコードする配列と９６％〜９９．９％同一であるか、あるいは、配列番号４（図３）と９６．５％〜９９％同一、または約９７％、または約９８％同一である。

別の実施形態では、修飾ｈＯＴＣコード配列は、図２（ｈＯＴＣｃｏ、配列番号３）の成熟酵素（約ｎｔ９９〜約１０６８）または全長をコードする配列と９６％〜９９．９％
同一であるか、あるいは、配列番号３（図２）と９６．５％〜９９％同一、または約９７％、または９８％同一である。

さらに別の実施形態では、修飾ｈＯＴＣコード配列は、ｈＯＴＣｃｏ−ＬＷ５［配列番号８］もしくはｈＯＴＣｃｏ−ＬＷ６［配列番号９］の成熟タンパク質（約ｎｔ９９〜約１０６８）もしくは全長をコードする配列、またはそれと９６％〜９９．９％同一である配列を有する。ｈＯＴＣｃｏ−ＬＷ５およびｈＯＴＣｃｏ−ＬＷ６は互いに約９７％同一であり、それぞれ野生型配列［配列番号１］と約７８％同一である。

図２〜５の配列は、ｃＤＮＡ配列のセンス鎖として提供される。また本発明は、これらのｃＤＮＡ配列に相当するアンチセンス鎖および対応するＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）配列も包含する。例えば、配列番号１０の改変ｍＲＮＡは配列番号４のＤＮＡに相当し、配列番号１１の改変ＲＮＡは配列番号５のＤＮＡに相当し、配列番号１２の改変ＲＮＡは配列番号８のＤＮＡに相当し、そして配列番号１３のＲＮＡは配列番号９のＤＮＡに相当する。これらのＲＮＡ配列、およびこれらの配列の１つまたは複数と９５％〜９９％、または約９７％、または約９８％同一である配列は、本発明の範囲内に包含される。ＲＮＡ同一性をアライン及び決定するための方法は当該技術分野において知られており、公開された公的に入手可能なウェブベースまたは市販のデータベースおよびサービスが含まれる。例えば、ＬｏｃＡＲＮＡ、ＣＡＲＮＡ、およびその中の他の部分で特定される他のプログラムを参照されたい。

本発明の一実施形態では、ｍＲＮＡ配列は、選択されたＲＮＡ送達系（その例は本明細書において供給される）を用いて送達され得る。

また、断片、例えば、トランジットペプチド（アミノ酸１〜約３２）、約アミノ酸３３２〜約３５４、中間ｈＯＴＣ酵素、もしくは成熟酵素をコードする配列、または所望され得る他の断片も本明細書に包含される。配列番号２が参照され得る。例えば、Ｙｅ ｅｔ
ａｌ．２００１，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １２：１０３５−１０４６を参照されたい。

別の実施形態では、キメラＯＴＣ遺伝子によりコードされる成熟ｈＯＴＣａｓｅを所望の小器官へ効果的に輸送するように、被験者のシステムと適合性（ｃｏｍｐａｔａｂｌｅ）である別の供給源からのトランジット配列によって野生型ＯＴＣのＮ末端プレ配列が置換されたキメラＯＴＣが提供される。例えば、Ｙｅ ｅｔ ａｌ．２００１，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １２：１０３５−１０４６を参照されたい。このようなトランジット配列はトランジットペプチド（シグナルペプチド、標的シグナル、または局在化シグナルとも呼ばれる）をコードし、これは、配列番号１、３、４、５、８および／または９の成熟ｈＯＴＣのコード配列に融合される。例えば、野生型ｈＯＴＣトランジット配列は、配列番号１の最初の約９８ヌクレオチドに相当する。キメラＯＴＣを構築するために、これらの野生型Ｎ末端配列が除去され（約核酸１から約ｎｔ９６〜ｎｔ９８まで）、異種トランジット配列によって置換され得る。適切なトランジットペプチドが好ましいが、必ずしもヒト由来とは限らない。適切なトランジットペプチドはｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｌｉｎｅ．ｂｉｃ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｓｐｄｂ／ｚｈａｎｇ２７０．ｈｔｍ（参照によって本明細書中に援用される）から選択されてもよいし、あるいは選択されたタンパク質中のランジットペプチドを決定するための様々なコンピュータプログラムを用いて決定されてもよい。限定はしないが、このような配列は約１５〜約５０アミノ酸の長さ、または約２０〜約２８アミノ酸の長さでよく、あるいは必要に応じてこれよりも大きくても小さくてもよい。

核酸配列との関連での「同一性パーセント（％）」、「配列同一性」、「配列同一性パ
ーセント」、または「パーセント同一の」という用語は、対応のためにアラインさせたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長にわたってもよいし、あるいは少なくとも約５００〜５０００ヌクレオチドの断片が所望される。しかしながら、例えば、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０〜２４ヌクレオチド、少なくとも約２８〜３２ヌクレオチド、少なくとも約３６またはそれ以上のヌクレオチドを有する、より小さい断片の間の同一性も所望され得る。

同一性パーセントは、タンパク質の全長、ポリペプチド、約３２アミノ酸、約３３０アミノ酸、またはそのペプチド断片もしくは対応する核酸配列コード配列に関して、アミノ酸配列に対して容易に決定され得る。適切なアミノ酸断片は少なくとも約８アミノ酸の長さでよく、最大約７００アミノ酸までの長さであり得る。一般に、２つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」に言及する場合、「同一性」、「相同性」または「類似性」は、「アラインされた」配列に関連して決定される。「アラインされた」配列または「アライメント」は、基準配列と比べて欠損したまたは付加的な塩基またはアミノ酸に対する補正を含有することが多い、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指す。

アライメントは、様々な公的に入手可能なまたは市販の多重配列アライメントプログラムのいずれかを用いて実施される。配列アライメントプログラム、例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、および「Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ」プログラムはアミノ酸配列に対して利用可能である。一般に、これらのプログラムはどれもデフォルト設定で使用されるが、当業者は必要に応じてこれらの設定を変更することができる。あるいは当業者は、少なくとも言及したアルゴリズムおよびプログラムにより提供されるようなレベルの同一性またはアライメントを提供する別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，”Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２−２６９０（１９９９）を参照されたい。

多重配列アライメントプログラムは核酸配列に対しても利用可能である。このようなプログラムの例としては、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＢＬＡＳＴ」、「ＭＡＰ」、および「ＭＥＭＥ」が挙げられ、これらは、インターネットでウェブサーバーを通してアクセス可能である。このようなプログラムの他の供給源は当業者に知られている。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティも使用される。また、上記のプログラムに含有されるものを含む、ヌクレオチド配列の同一性を測定するために使用され得る当該技術分野において既知のいくつかのアルゴリズムも存在する。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１中のプログラムＦａｓｔａ（商標）を用いて比較され得る。Ｆａｓｔａ（商標）は、クエリー配列と検索配列との間の最良重複の領域のアライメントおよび配列同一性パーセントを提供する。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、参照によって本明細書中に援用されるＧＣＧバージョン６．１中で提供されるようなそのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６およびスコアリングマトリックスのＮＯＰＡＭ因子）と共にＦａｓｔａ（商標）を用いて決定することができる。

一実施形態では、本明細書に記載される修飾ｈＯＴＣ遺伝子は、ウイルスベクターを作製するためおよび／または宿主細胞へ送達するために有用である適切な遺伝子エレメント（ベクター）、例えば、ネイキッドＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソームなどの中へ操作され、これは、その上に保持されたｈＯＴＣ配列を移行させる。選
択されたベクターは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ−被覆ペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を含む任意の適切な方法によって送達され得る。このような構築物を作るために使用される方法は核酸操作における当業者に知られており、遺伝子工学、組換え工学、および合成技術が含まれる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい。

本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、ｈＯＴＣ配列、プロモーターを含み、かつそのための他の制御配列を含み得る核酸分子を指し、このカセットは、ウイルスベクター（例えば、ウイルス粒子）のカプシド内にパッケージングされ得る。通常、ウイルスベクターを作製するためのこのような発現カセットは、ウイルスゲノムおよび他の発現制御配列（例えば、本明細書に記載されるものなど）のパッケージングシグナルと隣接する本明細書に記載されるｈＯＴＣ配列を含有する。例えば、ＡＡＶウイルスベクターの場合、パッケージングシグナルは、５’逆位末端反復（ＩＴＲ）および３’ＩＴＲである。

一実施形態では、便宜上、および規制当局の承認を早めるために、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列、またはその欠失型（ΔＩＴＲ）が使用される。しかしながら、他のＡＡＶ源由来のＩＴＲが選択されてもよい。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２に由来し、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ源に由来する場合、得られるベクターは、偽型と呼ぶことができる。

通常、ＡＡＶベクターのための発現カセットはＡＡＶ５’ＩＴＲ、ｈＯＴＣコード配列および任意の制御配列、ならびにＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。しかしながら、これらのエレメントの他の配置が適切なこともある。Ｄ配列および末端分解部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）（ｔｒｓ）が欠失されたΔＩＴＲと呼ばれる５’ＩＴＲの短縮型が記載されている。他の実施形態では、全長ＡＡＶ５’および３’ＩＴＲが使用される。

一実施形態では、構築物は、ウイルスベクターを作製するために有用なＤＮＡ分子（例えば、プラスミド）である。望ましいベクターエレメントを含有する説明的なプラスミドはｐＡＡＶｓｃ．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏ−ＬＷ４によって示され、その配列は配列番号６であり、これは参照によって援用される。この説明的なプラスミドは、ｓｃＩＴＲ（配列番号６のｎｔ５〜１０９）、ＴＡＴＡシグナル（配列番号６のｎｔ８５１〜８５４）、合成ｈＯＴＣコード配列（配列番号６のｎｔ９７６〜２０３７）、ポリＡ（配列番号６の補体におけるｎｔ２１８２〜２０４６）、ｓｃＩＴＲ（配列番号６の補体におけるｎｔ２３７８〜２２１１）、および肝臓特異的（ＴＢＧ）プロモーター（配列番号６のｎｔ４１７２〜４７６０）を含む発現カセットを含有する。他の発現カセットは、本明細書に記載される他の合成ｈＯＴＣコード配列および他の発現制御エレメントを用いて作製され得る。

これに関連する略語「ｓｃ」は、自己相補的を指す。「自己相補的ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列により保持されるコード領域が、分子内二本鎖鋳型ＤＮＡを形成するように設計された構築物を指す。第２の鎖の細胞媒介合成を待機するのではなく感染の際に、ｓｃＡＡＶの２つの相補的な半分部分が関連して、即時の複製および転写の準備ができた１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成し得る。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ
ｅｔ ａｌ，Ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（２００１年８月），Ｖｏｌ８，第１６号、１２４８−１２５４を参照されたい。自己相補的ＡＡＶは、例えば米国特許第６，５９６，５３５号明細書、同第７，１２５，７１７号明細書、および同
第７，４５６，６８３号明細書（これらはそれぞれ、参照によってその全体が本明細書中に援用される）に記載されている。

発現カセットは、通常、例えば、選択された５’ＩＴＲ配列とｈＯＴＣコード配列との間に位置する、発現制御配列の一部としてのプロモーター配列を含有する。本明細書に記載される説明的なプラスミドおよびベクターは、肝臓特異的プロモーターのチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）を使用する。あるいは、他の肝臓特異的プロモーターが使用されてもよい［例えば以下を参照、Ｔｈｅ Ｌｉｖｅｒ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ｈｔｔｐ：／／ｒｕｌａｉ．ｓｃｈｌ．ｅｄｕ／ＬＳＰＤ／、例えばα１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）など；ヒトアルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４ ３２（１９９７）、ｈｕｍＡｌｂ；およびＢ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２ ９（１９９６）］。ＴＴＲ最小エンハンサー／プロモーター、α−アンチトリプシンプロモーター、ＬＳＰ（８４５ｎｔ）２５（イントロン無しのｓｃＡＡＶを必要とする）；またはＬＳＰ１。あまり望ましくないが、他のプロモーター、例えば、構成的プロモーター、制御的プロモーター［例えば、国際公開第２０１１／１２６８０８号パンフレットおよび国際公開第２０１３／０４９４３号パンフレットを参照］、または生理学的な合図に応答するプロモーターが、本明細書中に記載されるベクターにおいて使用されてもよい。

プロモーターに加えて、発現カセットおよび／またはベクターは、１つまたは複数の他の適切な転写開始、終止、エンハンサー配列、効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなど；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；および所望される場合には、コード化産物の分泌を高める配列を含有し得る。適切なポリＡ配列の例としては、例えば、ＳＶ４０、ＳＶ５０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン、および合成ポリＡが挙げられる。適切なエンハンサーの例としては、例えば、特に、αフェトプロテインエンハンサー、ＴＴＲ最小プロモーター／エンハンサー、ＬＳＰ（ＴＨ結合グロブリンプロモーター／α−ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー）が挙げられる。一実施形態では、発現カセットは、１つまたは複数の発現エンハンサーを含む。一実施形態では、発現カセットは、２つ以上の発現エンハンサーを含有する。これらのエンハンサーは同一であってもよいし、あるいは互いに異なっていてもよい。例えば、エンハンサーは、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサーを含み得る。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピー中に存在し得る。あるいは、エンハンサーのデュアルコピーは、１つまたは複数の配列によって分離され得る。さらに別の実施形態では、発現カセットはさらにイントロン、例えばＰｒｏｍｅｇａイントロンを含有する。他の適切なイントロンには、当該技術分野において既知のもの、例えば、国際公開第２０１１／１２６８０８号パンフレットに記載されるものなどが含まれる。任意選択で、ｍＲＮＡを安定化するために１つまたは複数の配列が選択されてもよい。このような配列の一例は修飾ＷＰＲＥ配列であり、これは、ポリＡ配列の上流およびコード配列の下流で操作され得る［例えば、ＭＡ Ｚａｎｔａ−Ｂｏｕｓｓｉｆ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００９）１６：６０５−６１９を参照。

これらの制御配列はｈＯＴＣ遺伝子配列に「作動的に連結される」。本明細書で使用される場合、「作動的に連結される」という用語は、対象の遺伝子に近接している発現制御配列と、対象の遺伝子を制御するためにトランスまたは離れて作用する発現制御配列との両方を指す。

組換えＡＡＶウイルスベクターは、本明細書に記載されるｈＯＴＣ発現配列の送達によく適している。このようなＡＡＶベクターは、カプシドと同じＡＡＶ源に由来するＩＴＲ
を含有し得る。あるいは、ＡＡＶ ＩＴＲは、カプシドを供給するものとは異なるＡＡＶ源に由来してもよい。

偽型ＡＡＶが生成される場合、発現におけるＩＴＲはカプシドのＡＡＶ源とは異なる供給源から選択される。例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲは、肝臓（例えば、肝細胞）を標的とするために特定の効率を有するＡＡＶカプシドと共に使用するために選択され得る。ＡＡＶカプシドは、本明細書に記載される組成物のために、ＡＡＶ８［米国特許第７７９０４４９号明細書、米国特許第７２８２１９９号明細書］およびｒｈ１０［国際公開第２００３／０４２３９７号パンフレット］から選択され得る。しかしながら、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９などを含む他のＡＡＶ［例えば、本明細書中に参照によって援用される国際公開第２００３／０４２３９７号パンフレット、国際公開第２００５／０３３３２１号パンフレット、国際公開第２００６／１１０６８９号パンフレット、米国特許第７５８８７７２Ｂ２号明細書に記載されるものなど］がヒト被験者において使用されてもよい。

一実施形態では、自己相補的ＡＡＶが提供される。このウイルスベクターは、Δ５’ＩＴＲおよびＡＡＶ３’ＩＴＲを含有し得る。１つの例では、ウイルスベクターはｓｃＡＡＶ２／８．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏである。別の例では、ウイルスベクターはｓｃＡＡＶ２／ｒｈ１０．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏである。これらのベクターは両方とも、ＡＡＶ２由来の５’ΔＩＴＲ、肝臓特異的ＴＢＧプロモーター、本発明の改変ｈＯＴＣｃｏコード配列、ＳＶ４０ポリＡ、および３’ＡＡＶ２ ＩＴＲをＡＡＶ８カプシド［例えば、米国特許第８，３１８４８０Ｂ２号明細書を参照］またはＡＡＶ ｒｈ１０カプシド内に含有する。配列は、配列番号３、４、５、８または９のうちの１つの改変ｈＯＴＣから選択され得る。任意選択で、改変ｈＯＴＣのトランジット配列は異種トランジット配列によって置換されて、キメラｈＯＴＣを提供してもよく、これは成熟ｈＯＴＣａｓｅを保持する。

別の実施形態では、一本鎖ＡＡＶウイルスベクターが提供される。このようなベクターは、５’ＡＡＶ ＩＴＲおよび３’ＩＴＲを含有し得る。１つの例は、全長ＡＡＶ２−５’ＩＴＲ、肝臓特異的ＴＢＧロモーター、ｈＯＴＣコード配列、ウシ成長ホルモンポリＡ、およびＡＡＶ２−３’ＩＴＲを含有するＡＡＶ２／８．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏである。別の例はＡＡＶ２／８．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏ−．ＷＰＲＥ．ｂＧＨであり、これは同じベクターエレメントを含有し、さらにウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含有する。他の実施形態では、ＷＰＲＥは、インビボで使用される構築物に存在しない。改変ｈＯＴＣ配列（本明細書中の略語ｈＯＴＣｃｏ）は、配列番号３、４、５、８または９のうちの１つの改変ｈＯＴＣから選択され得る。任意選択で、改変ｈＯＴＣのトランジットペプチド配列は異種トランジット配列によって置換されて、キメラｈＯＴＣを提供してもよく、これは成熟ｈＯＴＣａｓｅを保持する。

組織特異的プロモーターを含むさらに他のプロモーターが選択されてもよい。被験者への送達に適したＡＡＶウイルスベクターを作製および単離するための方法は、当該技術分野において既知である。例えば、米国特許出願公開第２００７／００３６７６０号明細書（２００７年２月１５日）、米国特許第７７９０４４９号明細書；米国特許第７２８２１９９号明細書；国際公開第２００３／０４２３９７号パンフレット；国際公開第２００５／０３３３２１号パンフレット、国際公開第２００６／１１０６８９号パンフレット；および米国特許第７５８８７７２Ｂ２号明細書を参照されたい。ＡＡＶ８の配列、およびＡＡＶ８カプシドに基づいたベクターの作製方法は、米国特許第７，２８２，１９９Ｂ２号明細書、米国特許第７，７９０，４４９号明細書、および米国特許第８，３１８，４８０号明細書（参照によって本明細書中に援用される）に記載されている。１つのシステムにおいて、産生細胞株は、ＩＴＲに隣接される導入遺伝子をコードする構築物ならびにｒｅｐおよびｃａｐをコードする構築物によって一過性にトランスフェクトされる。第２のシ
ステムにおいて、ｒｅｐおよびｃａｐを安定して供給するパッケージング細胞株は、ＩＴＲに隣接される導入遺伝子をコードする構築物によって一過性にトランスフェクトされる。これらのシステムのそれぞれにおいて、ＡＡＶビリオンは、ｒＡＡＶの汚染ウイルスからの分離を必要として、へルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスによる感染に応答して産生される。最近になって、ＡＡＶを回収するためにヘルパーウイルスによる感染を必要としないシステムが開発された−必要とされるヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ、およびＥ４またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、およびＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼ）もシステムによりトランスで供給される。これらのより新しいシステムでは、ヘルパー機能は、必要とされるヘルパー機能をコードする構築物による細胞の一過性導入により提供することができる。あるいは細胞は、その発現が転写または転写後のレベルにおいて制御され得る、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定的に含有するように操作され得る。さらに別のシステムでは、ＩＴＲに隣接される導入遺伝子およびｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子は、バキュロウイルスベースのベクターによる感染によって昆虫細胞に導入される。これらの産生システムに関する概説については、一般に、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２−９２９（そのそれぞれの内容は参照によってその全体が本明細書中に援用される）を参照されたい。またこれらおよび他のＡＡＶ産生システムの製造および使用方法は、以下の米国特許：米国特許第５，１３９，９４１号明細書、同第５，７４１，６８３号明細書、同第６，０５７，１５２号明細書、同第６，２０４，０５９号明細書、同第６，２６８，２１３号明細書、同第６，４９１，９０７号明細書、同第６，６６０，５１４号明細書、同第６，９５１，７５３号明細書、同第７，０９４，６０４号明細書、同第７，１７２，８９３号明細書、同第７，２０１，８９８号明細書、同第７，２２９，８２３号明細書、および同第７，４３９，０６５号明細書（そのそれぞれの内容は参照によってその全体が本明細書中に援用される）に記載される。

２つ以上の転写単位を単一の構築物に結合し、従って必要とされる制御配列の空間の量を低減することにより、パッケージングのために利用可能な空間が保存され得る。例えば、単一のプロモーターが２つまたは３つまたはそれ以上の遺伝子をコードする単一のＲＮＡの発現を誘導することができ、下流遺伝子の翻訳はＩＲＥＳ配列によって駆動される。別の例では、単一のプロモーターは、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に、自己切断ペプチド（例えば、Ｔ２Ａ）またはプロテアーゼ認識部位（例えば、フーリン）をコードする配列によって互いに隔てられた２つまたは３つまたはそれ以上の遺伝子を含有するＲＮＡの発現を誘導し得る。従って、ＯＲＦは単一のポリタンパク質をコードし、これは翻訳中（Ｔ２Ａの場合）または翻訳後のいずれかに、個々のタンパク質（例えば、導入遺伝子および二量体化可能な転写因子など）に切断される。しかしながら、これらのＩＲＥＳおよびポリタンパク質システムはＡＡＶパッケージング空間を確保するために使用可能であるが、これらは、同じプロモーターにより駆動可能なコンポーネントの発現のためだけに使用可能であることに注意すべきである。別の代替案では、アニーリングしてヘッドトゥーテールのコンカテマーを形成することができる２つのゲノムのＡＡＶ ＩＴＲを提供することによって、ＡＡＶの導入遺伝子容量を増大させることができる。

任意選択で、本明細書に記載されるｈＯＴＣ遺伝子は、ｒＡＡＶ以外のウイルスベクターを作製するために使用され得る。このような他のウイルスベクターは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスなどが含まれるがこれらに限定されない、遺伝子療法に適した任意のウイルスを含むことができる。適切に、これらの他のベクターのうちの１つが作製される場合、複製欠損ウイルスベクターとして産生される。

「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」は、対象の遺伝子を含有する発現カセットがウイルスカプシドまたはエンベロープ内にパッケージングされた合成または人工ウイルス粒子を指し、ここで、ウイルスカプシドまたはエンベロープ内に同様にパッケージングされた任意のウイルスゲノム配列は複製欠損であり、すなわち、これらは子孫ビリオンを作製することができないが、標的細胞を感染させる能力を保持する。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製するために必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まない（ゲノムは、「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように設計することができ、人工ゲノムの増幅およびパッケージングに必要とされるシグナルにより隣接される対象の導入遺伝子のみを含有する）が、これらの遺伝子は産生中に供給され得る。従って、子孫ビリオンによる複製および感染は複製に必要なウイルス酵素の存在下を除いて起こり得ないので、遺伝子療法において使用するのに安全であると考えられる。このような複製欠損ウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス（組込み型または非組込み型）、または別の適切なウイルス源であり得る。

本明細書に記載される医薬組成物は、任意の適切な経路または異なる経路の組み合わせによって、それを必要としている被験者への送達のために設計される。肝臓への直接送達または肝内送達が望ましく、任意選択で、血管内送達、例えば、門脈、肝静脈、胆管によって、または移植によって実施され得る。あるいは、他の投与経路が選択されてもよい（例えば、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、および他の非経口経路）。本明細書に記載されるｈＯＴＣ送達構築物は、単一の組成物または複数の組成物中で送達され得る。任意選択で、２つ以上の異なるＡＡＶが送達され得る［例えば、国際公開第２０１１／１２６８０８号パンフレットおよび国際公開第２０１３／０４９４９３号パンフレットを参照］。別の実施形態では、このような複数のウイルスは、異なる複製欠損ウイルス（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、および／またはレンチウイルス）を含有し得る。あるいは、送達は、非ウイルス構築物、例えば、種々の送達組成物およびナノ粒子（例えば、ミセル、リポソーム、カチオン性脂質−核酸組成物、ポリグリカン組成物および他のポリマー、脂質および／またはコレステロールベースの核酸結合体を含む）と結合された「ネイキッドＤＮＡ」、「ネイキッドプラスミドＤＮＡ」、ＲＮＡ、およびｍＲＮＡ、ならびに本明細書に記載されるような他の構築物によって媒介され得る。例えば、Ｘ．Ｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１１，８（３），ｐｐ７７４−７８７；ウェブ公開：２０１１年３月２１日；国際公開第２０１３／１８２６８３号パンフレット、国際公開第２０１０／０５３５７２号パンフレットおよび国際公開第２０１２／１７０９３０号パンフレット（これらはいずれも参照によって本明細書中に援用される）を参照されたい。このような非ウイルスｈＯＴＣ送達構築物は、既に記載された経路によって投与され得る。

ウイルスベクター、または非ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ転移部分は、遺伝子導入および遺伝子療法用途で使用するために生理学的に許容可能な担体と共に処方することができる。ＡＡＶウイルスベクターの場合、ゲノムコピー（「ＧＣ」）の定量化は、製剤内に含有される用量の尺度として使用され得る。本発明の複製欠損ウイルス組成物のゲノムコピー（ＧＣ）数を決定するために、当該技術分野において既知の任意の方法を使用することができる。ＡＡＶ ＧＣ数のタイトレーションを実施するための１つの方法は次の通りである：カプシド形成されていないＡＡＶゲノムＤＮＡまたは汚染プラスミドＤＮＡを産生プロセスから除去するために、まず精製ＡＡＶベクターサンプルがデオキシリボヌクレアーゼによって処理される。次に、デオキシリボヌクレアーゼ耐性粒子は、ゲノムをカプシドから放出させるために加熱処理を受ける。次に、ウイルスゲノムの特定の領域（通常、ポリＡシグナル）を標的とするプライマー／プローブセットを用いて、放出されたゲノムがリアルタイムＰＣＲにより定量化される。複製欠損ウイルス組成物は、ヒト患者に対して約１．０×１０⁹ＧＣ〜約１．０×１０¹⁵ＧＣ（平均７０ｋｇの体重の被験者を処置す
るため）、好ましくは１．０×１０¹²ＧＣ〜１．０×１０¹⁴ＧＣの範囲である量の複製欠
損ウイルスを含有するように計量装置で処方することができる。好ましくは、製剤中の複製欠損ウイルスの用量は、１．０×１０⁹ＧＣ、５．０×１０⁹ＧＣ、１．０×１０¹⁰ＧＣ、５．０×１０¹⁰ＧＣ、１．０×１０¹¹ＧＣ、５．０×１０¹¹ＧＣ、１．０×１０¹²ＧＣ、５．０×１０¹²ＧＣ、または１．０×１０¹³ＧＣ、５．０×１０¹³ＧＣ、１．０×１０¹⁴ＧＣ、５．０×１０¹⁴ＧＣ、または１．０×１０¹⁵ＧＣである。

ＤＮＡおよびＲＮＡは、一般に、ナノグラム（ｎｇ）〜マイクログラム（μｇ）の核酸量で測定される。一般的に、ヒトにおける処置の場合、好ましくは、１ｎｇ〜７００μｇ、１ｎｇ〜５００μｇ、１ｎｇ〜３００μｇ、１ｎｇ〜２００μｇ、または１ｎｇ〜１００μｇの範囲であるＲＮＡの投薬量が処方および投与される。発現カセットを含有し、ウイルスベクターによって被験者に送達されない同様の投薬量のＤＮＡ分子が、非ウイルスｈＯＴＣ ＤＮＡ送達構築物のために利用されてもよい。

レンチウイルスの産生は本明細書に記載されるように測定され、体積（例えば、ｍＬ）当たりのＩＵとして表される。ＩＵは感染単位であるか、あるいは形質導入単位（ＴＵ）であり、ＩＵおよびＴＵは、ウイルスベクター粒子調製物の力価の定量的尺度として互換的に使用することができる。レンチウイルスベクターは、通常、非組込み型である。ウイルス粒子の量は少なくとも約３×１０⁶ＩＵであり、少なくとも約１×１０⁷ＩＵ、少なくとも約３×１０⁷ＩＵ、少なくとも約１×１０⁸ＩＵ、少なくとも約３×１０⁸ＩＵ、少な
くとも約１×１０⁹ＩＵ、または少なくとも約３×１０⁹ＩＵであり得る。

上記の組換えベクターは、公開された方法に従って宿主細胞へ送達され得る。好ましくは生理学的に適合性の担体中に懸濁されたｒＡＡＶは、ヒトまたは非ヒト哺乳類患者に投与され得る。適切な担体は、トランスファーウイルスが誘導される適応症を考慮して当業者により容易に選択され得る。例えば、１つの適切な担体は、様々な緩衝溶液と処方され得る生理食塩水（例えば、リン酸緩衝食塩水）を含む。他の例示的な担体には、無菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、および水が含まれる。担体の選択は本発明の制限ではない。

任意選択で、本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体に加えて、保存剤または化学安定剤などの他の従来の医薬品成分を含有し得る。適切な例示的な保存剤には、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールが含まれる。適切な化学安定剤には、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。

本明細書に記載されるウイルスベクターは、オルニチントランスカルバミラーゼを、それを必要としている被験者（例えば、ヒト患者）に送達するため、機能性ｈＯＴＣａｓｅを被験者に供給するため、および／またはオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症を処置するための薬剤の調製において使用され得る。処置の過程は、任意選択で、同じウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ８ベクター）または異なるウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０）の反復投与を伴い得る。本明細書に記載されるウイルスベクターおよび非ウイルス送達系を用いて、さらに他の組み合わせが選択されてもよい。

別の実施形態では、本明細書に記載される核酸配列は、非ウイルス経路を通して送達され得る。例えば、ｈＯＴＣ配列は、当該技術分野において既知のいくつかの担体システムの１つを用いる、ＲＮＡ形態（例えば、ｍＲＮＡ）での発現または送達のための担体システム経由であり得る。このような担体システムには、ＰｈａｓｅＲｘのいわゆる「ＳＭＡＲＴＴ」技術などの商業的実体によって提供されるものが含まれる。これらのシステムは、標的宿主細胞への送達のためにブロックコポリマーを利用する。例えば、２０１１年１
１月２４日に公開された「マルチブロックポリマー」という表題の米国特許出願公開第２０１１／０２８６９５７号明細書、２０１１年１１月１７日に公開された米国特許出願公開第２０１１／０２８１３５４号明細書、２０１３年７月３１日に公開されたＥＰ２６２０１６１号明細書、および２０１５年２月５日に公開された国際公開第２０１５／０１７５１９号パンフレットを参照されたい。また、Ｓ．Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ，（Ｆｅｂ
２０１３）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（２）：ｅ５６２２０も参照されたい。さらに他の方法は、合成ｄｓＲＮＡの作製および注入を伴う［Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２００４）４３２（７０１４）：１７３−８を参照、またＭｏｒｒｉｓｓｅｙ
ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（２００５）４１（６）：１３４９−５６も参照］。肝臓への局所投与も、腎臓静脈カテーテル法を用いて二本鎖ＲＮＡを肝臓周囲の循環系に直接注入することによって実証されている［Ｈａｍａｒ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（２００４）１０１（４１）：１４８８３−８を参照］。さらに他のシステムは、カチオン性複合体またはリポソーム製剤を用いた、ｄｓＲＮＡおよび特にｓｉＲＮＡの送達を伴う［例えば、Ｌａｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００６）５（１２）を参照、またＫｈｏｕｒｙ ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．（２００６）５４（６）：１８６７−７７も参照］。例えばＶｅｒｉｔａｓ Ｂｉｏからの他のＲＮＡ送達技術も利用可能である［例えば、米国特許出願公開第２０１３／０３２３００１号明細書、２０１０年１２月２３日、「二本鎖ＲＮＡの標的細胞へのインビボ送達」を参照（サイトゾル内容物は、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、発現されたｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ、および注入／導入されたｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ、または場合によりさらに、エキソベシクル（ｅｘｏｖｅｓｉｃｌｅ）内にパッケージングされたサイトゾル内に存在するトランスフェクトされたＤＮＡを含み、肝臓などの遠位部位へ輸送される）］。ＲＮＡ配列のインビボ送達のためのさらに他のシステムが記載されている。例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１９５９１７号明細書（２０１２年８月２日）（安定性を改善し、ＲＮＡ発現を増大させるためのＲＮＡの５’−ｃａｐ類似体）、国際公開第２０１３／１４３５５５Ａ１号パンフレット（２０１３年１０月３日）を参照されたい。そして／あるいは市販されている（ＢｉｏＮＴｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｖａｌｅｒａ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、Ｚａｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）。

従って、一実施形態では、本発明は、標的宿主細胞、例えば肝細胞において成熟ｈＯＴＣａｓｅの発現をもたらす二本鎖または一本鎖ＲＮＡの送達のための組成物中で、配列番号１０、１１、１２、１３の成熟配列（少なくとも約ｎｔ９９〜１０９８）または全長、またはそれに対して少なくとも９７％〜９９％の同一性を有する配列の改変ｈＯＴＣ ｍＲＮＡを提供する。

ｍＲＮＡを含有する本明細書に記載される組成物の動態学（ＤＮＡ送達分子から転写される場合と比較して、直接送達される）は、ｍＲＮＡからのｈＯＴＣａｓｅの発現が数時間以内に見られるので、急性発症の被験者における使用に特によく適している。ＲＮＡの急速なクリアランスを回避するために、その効果が２４時間にわたって、４８時間にわたって、または最大約３日間（約７２時間）保持され得るように、本明細書に記載される通りに修飾される（例えば、キャップまたは修飾塩基を用いる）。ｍＲＮＡを本明細書に記載されるように直接同時投与し、本明細書中で定義されるようなＤＮＡまたはウイルスベクターベースのｈＯＴＣ組成物を同時または実質的に同時に同時投与することが望ましいこともある。従って、被験者は迅速な処置を受けることができ、ｍＲＮＡ媒介性発現が減弱し始めるときに、ウイルスベクター媒介性発現により付与される、より長期間のｈＯＴＣ発現が効果を生じ始める。あるいは、被験者は、本明細書で定義されるようなｍＲＮＡベースの組成物の２回目の投与を受けることができる。本明細書に記載されるｍＲＮＡ組成物は、急性発症でないＯＴＣＤ患者に関するものを含む他の治療計画または方法において使用されてもよい。

本発明に従う組成物は、本明細書で定義されるような薬学的に許容可能な担体を含み得る。一実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるようなｈＯＴＣポリヌクレオチドと関連されるブロックコポリマーを含む。ブロックコポリマーは、ミセルが複数のブロックコポリマーを含むようにミセルを形成し得る。

通常、このような組成物は、配列番号１０、１１、１２、１３のいずれかの成熟ｈＯＴＣａｓｅ（少なくとも約ｎｔ９９〜１０９８）または全長をコードするｈＯＴＣ配列に相当するｍＲＮＡ配列を含む核酸分子を含有する。さらに、この核酸分子は、リーダー配列またはリーダーＲＮＡとしても知られている５’非翻訳領域（ＵＴＲ）と、任意選択的なイントロン、任意選択的なエクソン、任意選択的なコザック配列、任意選択的なＷＰＲＥ、およびポリＡのうちの１つまたは複数と、コード配列に隣接する３’ＵＴＲとを含み得る。適切なリーダー配列には、ｈＯＴＣ ＤＮＡ配列に関連して上記で議論したものが含まれ、この議論は参照によって本明細書中に援用される。天然ｈＯＴＣリーダー配列以外の適切なリーダー配列、あるいは図２、図３または図４、または図５に相当する配列の供給源の例は上記で議論される。同様に、適切なイントロン、ポリＡ、およびコザック配列の供給源も上記で議論され、本段落で議論される対応するＲＮＡ配列の送達に適用可能である。さらに、ＲＮＡに対する種々の修飾を行うことができ、例えば、インビボのｍＲＮＡの急速なクリアランスを回避するために、または別の所望の理由のために、修飾５’キャップ構造が構築物内に設計され得る。このような５’キャップ構造の作製方法は当業者に知られている。例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１９５９１７号明細書および国際公開第２０１３／１４３５５５Ａ１号パンフレット（２０１３年１０月３日）を参照されたい。さらに、プソイドウリジンのように、修飾ヌクレオチドを使用してインビトロでｍＲＮＡを作製することができる。同様に、ＲＮＡも繰り返し投与することができ、あるいは新生児期危機を管理するために被験者はまずｍＲＮＡが投与され、その後、長期間の治療のため、ならびに線維症／肝硬変および／または肝細胞癌を予防するために、ウイルスベクター媒介性送達（例えば、ＡＡＶ）が行われ得る。

ｍＲＮＡは、当該技術分野において周知である技術を用いて、本明細書に記載されるｈＯＴＣ ＤＮＡ配列から合成することができる。例えば、Ｃａｚｅｎａｖｅ Ｃ，Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ ＯＣ，ｒｎａ ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９４ Ｊｕｌ １９；９１（１５）：６９７２−６は、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型からＲＮＡを作製するためのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの使用について記載している。また、Ｗｉｃｈｌａｃｚ Ａｌ，Ｌｅｇｉｅｗｉｃｚ Ｍ，Ｃｉｅｓｉｏｌｋａ Ｊ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ ３’ｅｎｄｓ ｕｓｉｎｇ ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎｏｍｉｃ ｄｅｌｔａ ｒｉｂｏｚｙｍｅ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００４ Ｆｅｂ １８；３２（３）：ｅ３９、Ｋｒｉｅｇ ＰＡ，Ｍｅｌｔｏｎ ＤＡ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡｓ ａｒｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ＳＰ６ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｃＤＮＡｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８４ Ｓｅｐ ２５；１２（１８）：７０５７−７０、およびＲｉｏ，Ｄ．Ｃ，ｅｔ ａｌ．ＲＮＡ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１１，２０５−２２０も参照されたい。これらの参考文献はそれぞれ、参照によって本明細書中に援用される。さらに、Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ（登録商標）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）；ＲｉｂｏＭＡＸ（商標）Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）；ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）；ＭＥＧＩ
ｓｃｒｉｐｔ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）；ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ（商標）ａＲＮＡ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）；ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）Ｋｉｔｓ（Ａｍｂｉｏｎ）；およびＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）Ｉｎｃ．）を含むがこれらに限定されない、ｍＲＮＡを作製するためのキットおよびプロトコルが市販されている。またカスタムＲＮＡは、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｂｉｏＳＹＮＴＨＥＳＩＳ；ＧＥ Ｄｈａｒｍａｃｏｎ；およびＩＢＡ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓを含むがこれらに限定されない会社から、商業的に作製することもできる。

本明細書に記載されるｈＯＴＣ ＤＮＡ配列は、当該技術分野において周知の技術を用いて、インビトロで合成的に作製することができる。例えば、Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ，ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｏｎｇ ＤＮＡ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １，７９１−７９７（２００６）によって記載されるように、長いＤＮＡ配列のＰＣＲベースの正確な合成（ＰＡＳ）方法が利用され得る。二重非対称ＰＣＲ法および重複伸長ＰＣＲ法を組み合わせた方法は、Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｄｏｎｇ，Ｔｗｏ−ｓｔｅｐ ｔｏｔａｌ ｇｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００４；３２（７）：ｅ５９によって記載される。また、Ｇｏｒｄｅｅｖａ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ｐｈｙｔａｓｅ ｇｅｎｅ ｃｏｄｏｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．２０１０ Ｍａｙ；８１（２）：１４７−５２．Ｅｐｕｂ ２０１０ Ｍａｒ １０も参照されたい。また、オリゴヌクレオチド合成および遺伝子合成に関する以下の特許、Ｇｅｎｅ Ｓｅｑ．２０１２ Ａｐｒ；６（１）：１０−２１；米国特許第８００８００５号明細書；および米国特許第７９８５５６５号明細書も参照されたい。これらの文書はそれぞれ参照によって本明細書中に援用される。さらに、ＰＣＲによりＤＮＡを作製するためのキットおよびプロトコルが市販されている。これらには、Ｔａｑポリメラーゼ；ＯｎｅＴａｑ（登録商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；およびＧｏＴａｑ（登録商標）Ｇ２ポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含むがこれらに限定されないポリメラーゼの使用が含まれる。またＤＮＡは、本明細書に記載されるｈＯＴＣ配列を含有するプラスミドがトランスフェクトされた細胞から作製されてもよい。キットおよびプロトコルは既知であり、市販されており、そしてＱＩＡＧＥＮプラスミドキット；Ｃｈａｒｇｅｓｗｉｔｃｈ（登録商標）Ｐｒｏ Ｆｉｌｔｅｒプラスミドキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；およびＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）プラスミドキット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）が含まれるがこれらに限定されない。本明細書において有用な他の技術には、サーモサイクリングの必要性を除外する配列特異的等温増幅法が含まれる。熱の代わりに、これらの方法は、通常、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のような鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを用いて、二重鎖ＤＮＡを分離する。またＤＮＡは、逆転写酵素（ＲＴ）の使用により増幅によってＲＮＡ分子から作製されてもよく、これは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。ＲＴは、元のＲＮＡ鋳型に相補的であり、ｃＤＮＡと呼ばれるＤＮＡの鎖を重合する。次に、このｃＤＮＡは、ＰＣＲまたは上記で概説した等温法によってさらに増幅させることが可能である。またカスタムＤＮＡは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ；ＧＥＮＥＷＩＺ（登録商標）；ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；およびＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを含むがこれらに限定されない会社から、商業的に作製することもできる。

「発現」という用語はその最も広い意味で本明細書において使用され、ＲＮＡまたはＲＮＡおよびタンパク質の産生を含む。ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、特に、ペプチドまたはタンパク質の産生に関する。発現は一過性であってもよいし、あるいは安定的であってもよい。

本発明との関連での「翻訳」という用語はリボソームにおけるプロセスに関し、ｍＲＮＡ鎖がアミノ酸配列の構築を制御して、タンパク質またはペプチドを生成する。

本発明によると、「治療的に有効な量」のｈＯＴＣが本明細書に記載されるように送達され、所望の結果、すなわちＯＴＣ欠損症またはその１つもしくは複数の症状の処置を達成する。本明細書に記載されるように、所望の結果には、オロト酸レベルの低下、高アンモニア血症の低減、ならびに／または発達遅延、学習障害、知的障害、注意欠陥多動性障害、および実行機能障害を含む神経物理学的（ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｃａｌ）合併症の１つまたは複数の最小化もしくは除去が含まれる。処置は、幼年期から後期幼児期、青年期、または成人期まで存在し得る、重度の新生児期発症疾患（男性またはより稀に女性）、および後期発症（部分）疾患（男性および女性）を有する被験者の処置を含み得る。特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるようなｈＯＴＣを投与することによる、被験者、特に後期発症ヘテロ接合性被験者における線維症および／または肝硬変の処置および／または予防方法を提供する。一実施形態では、ＯＴＣ欠損症の治療目標は、血漿アンモニアを８０μｍｏｌ／Ｌ未満に保持し、血漿グルタミンを１，０００μｍｏｌ／Ｌ未満に保持し、アルギニン血症を８０〜１５０μｍｏｌ／Ｌに保持し、分枝鎖アミノ酸を正常範囲に保持することである。しかしながら、他の治療の終点は、処置を行う医師によって選択され得る。

さらに別の実施形態では、本発明は、新生児被験者のＯＴＣＤの救出および／または処置方法を提供し、本方法は、新生児被験者（例えば、ヒト患者）の肝臓にｈＯＴＣ遺伝子を送達するステップを含む。この方法は、本明細書に記載されるような合成ｈＯＴＣまたは野生型ｈＯＴＣ、または他の供給源からのｈＯＴＣ、またはこれらの組み合わせにかかわらず、機能性ｈＯＴＣａｓｅをコードする任意の核酸配列を利用し得る。一実施形態では、新生児の処置は、出産の８時間以内、最初の１２時間以内、最初の２４時間以内、または最初の４８時間以内に、本明細書に記載されるようなｈＯＴＣが投与されると定義される。別の実施形態では、特に霊長類に対して、新生児期送達は、約１２時間〜約１週間、２週間、３週間、または約１ケ月の期間内、あるいは約２４時間〜約４８時間後である。成長期の哺乳類（例えば、非ヒトまたはヒト霊長類）における肝細胞の急速なターンオーバーによる希釈に対処するために、新生児期治療の後、望ましくは、生後約３カ月、約６カ月、約９カ月、または約１２カ月のときに再投与が行なわれる。任意選択で、複数回の再投与が可能である。このような再投与は、同一タイプのベクター、異なるウイルスベクター、または非ウイルス送達によるものであり得る。一実施形態では、機能性ｈＯＴＣのためのＲＮＡベースの送達系は、急性発症の被験者（例えば、ヒト患者）を安定化するために使用され、その後、機能性ｈＯＴＣのウイルスベクター媒介性送達が送達される。別の実施形態では、初期治療は、ウイルスおよび非ウイルス媒介性ｈＯＴＣ送達系の同時投与を含む。さらなる実施形態では、ｈＯＴＣ ＤＮＡおよびＲＮＡ構築物は単独で使用されてもよいし、あるいは患者の診断および状態に対する標準治療と組み合わせて使用されてもよい。

本明細書中の作業実施例に記載されるように、本発明者らは、後期発症ＯＴＣＤ被験者を含むヘテロ接合性ＯＴＣＤ被験者が、肝臓全体にわたる線維症および／または微小胞脂肪症（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）の増大を有することを見出した。このような肝線維症および／または微小胞脂肪症は、ＯＴＣＤ関連肝硬変をもたらし得る。従って、別の実施形態では、本発明は、ｈＯＴＣを被験者（例えば、ヒト患者）
に送達することによる、肝線維症および／または関連病状のＯＴＣＤ関連肝硬変の予防方法を提供する。本発明のこの態様は、ウイルスまたは非ウイルス送達系を利用し得る。核酸発現カセットは、本明細書中で提供されるような合成ｈＯＴＣ ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または機能性ｈＯＴＣａｓｅを発現する別の適切な配列を含有し得る。一実施形態では、肝線維症、微小胞脂肪症、および／またはＯＴＣＤ関連肝硬変の処置および／または予防方法が提供され、本方法は、ＯＴＣＤを有する被験者にＯＴＣａｓｅを送達することを含む。被験者はヒト患者であってもよい。一実施形態では、患者はヘテロ接合性であり、後期発症ＯＴＣＤを有する。患者はＯＴＣＤについてこれまで未処置であってもよいし、あるいは他の従来の処置を受けていてもよい。現在、ＯＴＣＤの標準治療は存在しておらず、むしろ症状は，例えば、タンパク質摂取の中断、食事性炭水化物および脂質の代償的な増大、極めて高い血液レベルを有する昏睡患者の血液透析；および／または安息香酸ナトリウム、アルギニン、および／またはフェニル酢酸ナトリウムの静脈内投与によって管理される。ＵＳ ＦＤＡは、２歳以上の患者に対するいくつかの尿素サイクル異常症の長期管理のためにグリセロールフェニル酪酸（Ｒａｖｉｃｔｉ（登録商標））を承認しており、この薬物は身体からアンモニアを取り除くのを助け、タンパク質制限食またはアミノ酸サプリメント単独によって管理することができない患者を対象とする。一実施形態では、患者の処置（例えば、最初の注射）は、１歳になる前に開始される。別の実施形態では、処置は、１歳になってから、または２〜３歳になってから、５歳になってから、１１歳になってから、またはそれよりも高い年齢で開始される。

一実施形態では、本発明の方法は、配列番号１、３、４、５、８または９の改変ＤＮＡ、または本明細書で定義されるキメラＤＮＡによりコードされる機能性ＯＴＣａｓｅを被験者に送達することによって、肝線維症および／またはＯＴＣＤ関連肝硬変の処置および／または反転を提供する。ＤＮＡの送達は、発現カセット内の改変を含有するウイルスベクターによって、または非ウイルス送達系によって媒介され得る。これらはいずれも被験者の肝細胞内で機能性ＯＴＣａｓｅの発現を媒介する。別の実施形態では、被験者は、配列番号１０、１１、１２または１３の改変ＲＮＡ、または本明細書で定義されるキメラＲＮＡを投与される。ＲＮＡの送達は、発現カセット内の改変ＲＮＡを含有するウイルスベクターによって、または非ウイルス送達系によって媒介され得る。これらはいずれも被験者の肝細胞内で機能性ＯＴＣａｓｅの発現を媒介する。

ヘテロ接合性ＯＴＣＤ被験者は、肝細胞癌（ＨＣＣ）を発症するリスクが増大している。例えば、ＪＭ Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｕｃｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（２０１２），Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．２０１２ Ｆｅｂ；１０５（２）：２６３−２６５（２０１１年１１月７日にオンラインで公開）を参照されたい。従って、別の実施形態では、本発明は、被験者（例えば、ヒト患者）にｈＯＴＣを送達することによる、ＨＣＣの処置および／または予防方法を提供する。本発明のこの態様は、ウイルスまたは非ウイルス送達系を利用し得る。核酸発現カセットは、本明細書中で提供されるような合成ｈＯＴＣ ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または機能性ｈＯＴＣａｓｅを含有する別の適切な配列を含有し得る。患者はＯＴＣＤについてこれまで未処置であってもよいし、あるいは他の従来の処置、すなわち標準治療を受けていてもよい。一実施形態では、患者の処置（例えば、最初の注射）はＨＣＣによる診断の前に開始される。別の実施形態では、患者の処置はＨＣＣ診断の後に開始される。任意選択で、処置はソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標）として市販されている）との同時投与を伴うか、あるいは化学塞栓術、放射線、サーマルアブレーション、経皮的エタノール注入法、標的療法（例えば、抗血管新生薬）、抗癌薬の肝臓動脈注入、免疫療法、または例えば、切除、凍結手術、および肝移植を含む外科的選択肢と併せて使用される。ＨＣＣの処置に使用される場合、本明細書に記載されるような合成ｈＯＴＣ ＤＮＡまたはＲＮＡの送達のために、非組込み型送達系（例えば、直接ＲＮＡ送達、またはアデノウイルスもしくは非組込み型レンチウイルスなどの非組込み型ウイルス）を選択することが望ましいこ
ともある。

「機能性ＯＴＣ」とは、配列番号２によって特徴付けられるような野生型ＯＴＣａｓｅをコードするか、あるいは配列番号２の配列または疾患に関連しないその天然変異体または多形体によって特徴付けることができる、野生型ヒトオルニチントランスカルバミラーゼ酵素の生物活性レベルの少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または１００％とほぼ同じもしくはそれよりも大きい生物活性レベルを提供する別のＯＴＣａｓｅをコードする遺伝子を意味する。より具体的には、ヘテロ接合性患者は約５０％以下という低いＯＴＣａｓｅ機能性レベルを有し得るので、効果的な処置は、ＯＴＣａｓｅ活性を「正常」または非ＯＴＣＤ患者の範囲内のレベルに置換することを必要としないであろう。同様に、検出可能な量のＯＴＣａｓｅを有さない患者は、ＯＴＣａｓｅ機能を１００％活性レベルよりも低いレベルに送達することによって救出することができ、任意選択で、引き続いてさらなる処置を受けてもよい。本明細書に記載されるように、本明細書に記載される遺伝子療法は、ウイルスまたは非ウイルスに関係なく、被験者（患者）の診断のための他の処置、すなわち標準治療と併せて使用され得る。

一実施形態では、このような機能性ＯＴＣａｓｅは、配列番号２の成熟タンパク質（すなわち、少なくとも約３２２アミノ酸）または全長配列と約９５％以上の同一性を有する、あるいは配列番号２に対してアミノ酸レベルで約９７％以上の同一性、または約９９％以上の同一性を有する配列を有する。このような機能性ＯＴＣａｓｅは、どの疾患にも関連しない天然多形体（例えば、配列番号２のＦ１０１、Ｌ１１１、および／またはＷＩ１９３−１９４）も包含し得る。同一性は、配列のアライメントを作製することにより、そして当該技術分野において既知であるか市販されている様々なアルゴリズムおよび／またはコンピュータプログラムを使用することによって決定され得る［例えば、ＢＬＡＳＴ、ＥｘＰＡＳｙ；ＣｌｕｓｔａｌＯ；ＦＡＳＴＡ；例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用］。

インビトロ（例えば、Ｘ Ｙｅ，ｅｔ ａｌ，１９９６ Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｔｒａｎｓｃａｒｂａｍｙｌａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：３６３９−３６４６を参照）またはインビボでＯＴＣの発現および活性レベルを測定するために様々なアッセイが存在する。例えば、ＯＴＣ酵素活性は、［１，２，３，４，５−１３Ｃ５］シトルリン（９８％１３Ｃ）に対して基準化されたシトルリンの形成を検出するために液体クロマトグラフィ質量分析安定性同位体希釈法を用いて測定することができる。この方法は、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ活性の検出のために以前に開発されたアッセイから適合される［Ｍｏｒｉｚｏｎｏ Ｈ，ｅｔ ａｌ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．２００４；８１（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ４−１１］。新鮮凍結肝臓の破片が秤量され、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２．０ｍＭのＥＤＴＡおよび０．５ｍＭのＤＴＴを含有する緩衝液中で短時間均質化される。均質化緩衝液の容積は、５０ｍｇ／ｍｌの組織が得られるように調整される。酵素活性は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸、４ｍＭのオルニチン、５ｍＭのリン酸カルバミル（ｐＨ８．３）中の２５０μｇの肝臓組織を用いて測定される。酵素活性は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ８．３）中に溶解した５０ｍＭのリン酸カルバミルを新しく調製して添加することによって開始され、２５℃で５分間進行され、３０％ＴＣＡ中の５ｍＭの等量の１３Ｃ５−シトルリンの添加により停止される。５分間の微量遠心分離によりデブリが分離され、上清が質量分析用バイアルに移される。９３％溶媒Ａ（１Ｌの水中１ｍｌのトリフルオロ酢酸）：７％溶媒Ｂ（１Ｌの１：９水／アセトニトリル中１ｍｌのトリフルオロ酢酸）の移動相を用いて、１０μＬのサ
ンプルがアイソクラチック条件下でＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＬＣ−ＭＳに注入される。シトルリンに相当するピーク［質量：電荷比（ｍ／ｚ）１７６．１］および１３Ｃ５−シトルリンに相当するピーク（ｍ／ｚ１８１．１）が定量化され、その比は、各アッセイで実行されたシトルリンの標準曲線に対して得られた比と比較される。サンプルは、全肝臓組織か、またはＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて決定されるタンパク質濃度のいずれかに対して基準化される。肝生検を必要としない他のアッセイも使用され得る。１つのこのようなアッセイは血漿アミノ酸アッセイであり、グルタミンおよびシトルリンの比率が評価され、グルタミンが高く（＞８００マイクロリットル／リットル）、シトルリン（ｃｉｔｒｉｌｌｕｉｎｅ）が低い（例えば、一桁）場合には、尿素サイクル異常が疑わしい。血漿アンモニアレベルを測定することができ、１リットルあたり約１００マイクロモルの濃度がＯＴＣＤを示す。患者が過換気を起こしていれば血液ガスを評価することができる；ＯＴＣＤでは呼吸性アルカローシスが頻繁に起こる。アロプリノール負荷試験の後に尿中オロト酸が上昇するように、例えば１ミリモルのクレアチン当たり約２０マイクロモルよりも多い尿中オロト酸はＯＴＣＤを示す。ＯＴＣＤの診断基準は、Ｔｕｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ，２００８，Ｕｒｅａ Ｃｙｃｌｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＵＣＤＣ）ｏｆ ｔｈｅ Ｒａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ （ＲＤＣＲＮ）．Ｔｕｃｈｍａｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ
ｏｆ ｔｈｅ Ｒａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎａｌ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｕｒｅａ ｃｙｃｌｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．２００８；９４：３９７−４０２に説明されており、これは参照によって本明細書中に援用される。また、ＯＴＣＤの現在の標準治療についての議論を提供するｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓ／ＮＢＫ１５４３７８／も参照されたい。

「ａ」または「ａｎ」という用語が１つまたは複数を指すことに注意すべきである。従って、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数の」、および「少なくとも１つの」という用語は本明細書中では互換的に使用される。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」、およびその変化形は包括的ではなく排他的に解釈されるべきである。本明細書中の種々の実施形態は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」言語を用いて示されるが、他の状況下で、関連の実施形態は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」言語を用いて解釈及び記載されることが意図される。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は他に規定されない限り、所与の基準からの１０％の変動（±１０％）を意味する。

「調節」という用語またはその変化形は、本明細書で使用される場合、式（Ｉ）の化合物が生物学的経路の１つまたは複数のコンポーネントを阻害する能力を指す。

「被験者」は哺乳類、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、雌ウシ、ブタ、またはサル、チンパンジー、ヒヒもしくはゴリラなどの非ヒト霊長類である。

本明細書で使用される場合、「疾患」、「障害」および「状態」は、被験者の異常な状況を示すために互換的に使用される。

本明細書において他に定義されない限り、本明細書中で使用される科学技術用語は、当業者によって、そして本出願で使用される用語の多くの一般的な手引きを当業者に提供する公開テキストを参照して、一般的に理解される意味と同じ意味を有する。

以下の実施例は単に実例であって、本発明を限定することは意図されない。

実施例１−ｈＯＴＣを含有するｓｃＡＡＶベクター
以前に記載されたイントロンが破壊されたｐＡＡＶｓｃ．ＴＢＧ．ｍＯＴＣ１．３に由来するプラスミドにおいて、ｍＯＴＣコードシークエンシング（ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を野生型（ＷＴ）ｈＯＴＣ（ｈＯＴＣｗｔ）またはｈＯＴＣｃｏＬＷ ｃＤＮＡでそれぞれ置換することによって、ｐＡＡＶｓｃ．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｗｔおよびｐＡＡＶｓｃ．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏ−ＬＷ４を構築した［Ｍｏｓｃｉｏｎｉ Ｄ，ｅｔ ａｌ，“Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｍｏｎｉａ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｔｒａｎｓｃａｒｂａｍｙｌａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｌｉｖｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ”，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００６；１４：２５−３３；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＳＣ，ｅｔ ａｌ，“ＡＡＶ２／８−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＯＴＣ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｓ ｒｏｂｕｓｔ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｂｕｔ ｎｏｔ ｎｅｏｎａｔａｌ Ｓｐｆ（ａｓｈ）ｍｉｃｅ”，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００９；１７：１３４０−１３４６；Ｗａｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，”Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＯＴＣ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｓｐｆ^ash ｍｉｃｅ ｕｓｉｎｇ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｓｅｌ
ｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＡＡＶ２／８ ｖｅｃｔｏｒｓ”，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１２ Ａｐｒ；１９（４）：４０４−１０，Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｕｇ １８］。

ｓｃＡＡＶ２／８．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏ−ＬＷ４は、Ｄ配列およびｔｒｓ（末端分解部位）の欠失を有するＡＡＶ２ ３’ＩＴＲおよび５’ＩＴＲ、ＴＢＧプロモーター、ｈＯＴＣｃｏ−ＬＷ４遺伝子、ならびに１３７ｂｐのＳＶ４０ポリＡを含有する。最初の比較研究で使用される２つのベクター調製物（ＡＡＶ２／８ｓｃ．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｗｔおよびＡＡＶ２／８ｓｃ．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏ−ＬＷ４）は、以前に記載されたように、２回の塩化セシウム勾配遠心法により精製した［Ｗａｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｌｉｖｅｒ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０；１８：１１８−１２５］。残りの研究で使用されるベクターを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクションに基づいて、スケーリングされた作製方法によって作製し、記載されるようにイオジキサノール勾配遠心法によって上清または全ライセートから精製した［Ｌｏｃｋ Ｍ，ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．２０１０；２１：１２５９−１２７１］。ＡＡＶベクターのゲノム力価［ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍｌ］は、ＴＢＧプロモーターを標的にするプライマーおよびプローブセット（順方向プライマー５’−ＡＡＡＣＴＧＣＣＡＡＴＴＣＣＡＣＴＧＣＴＧ−３’［配列番号１４］、逆方向プライマー５’−ＣＣＡＴＡＧＧＣＡＡＡＡＧＣＡＣＣＡＡＧＡ−３’［配列番号１５］、プローブ６ＦＡＭ−ＴＴＧＧＣＣＣＡＡＴＡＧＴＧＡＧＡＡＣＴＴＴＴＴＣＣＴＧＣ［配列番号１６］−ＴＡＭＲＡ）を使用し、そして直線化プラスミドを標準として使用して、リアルタイムＰＣＲにより決定した。順方向プライマーは
、５’閉鎖ヘアピンの４００ｂｐ下流に位置する。Ｆａｇｏｎｅ ｅｔ ａｌ［Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｅｒｒｏｒｓ ｉｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ
ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｖｅｒ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１２ Ｆｅｂ；２３（１）：１−７］は、最近、特に、ＰＣＲプライマーがｓｃＡＡＶベクターの閉鎖ヘアピンに近接したときに、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）法がｓｃＡＡＶベクターの力価を著しく過小評価し得ることを報告した。ポリＡ領域（５’閉鎖ヘアピンの１９００ｂｐ下流）を標的にするプライマーおよびプローブセットを用いた１つのロットのＡＡＶ２／８ｓｃ．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏ−ＬＷ４ベクターの力価、およびゲノム力価は元の力価の１．１倍であり、これは、Ｑ−ＰＣＲのアッセイ内誤差の範囲内であった。

ＯＴＣタンパク質の発現レベルおよびＯＴＣ活性を、１×１０¹¹ＧＣのＡＡＶ２／８ｓｃ．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｗｔまたはＡＡＶ２／８ｓｃ．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏ−ＬＷ４ベクターの静脈内注射の１４日後のｓｐｆ^ashマウスの肝臓において評価した。ｓｐｆ^ashマウスは、ヒトにおける後期発症ＯＴＣ疾患のモデルである。全ての動物手順は、ペンシルベニア大学のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ （ＩＡＣＵＣ）によって承認されるプロトコルに従って実施した。ｓｐｆ^ashマウスは、上記のペンシルベニア大学のトランスレーショナルリサーチ研究所の
動物施設に保持した。３〜６月齢のｓｐｆ^ashマウスおよびその正常な同腹子を研究で使
用した。ベクターを静脈内（ｉ．ｖ．）注射により尾静脈経由で投与した。常在（ｒｅｓｉｄｅｎｔ）ベクターゲノムに基づいた遺伝子導入の程度は、２つの群の間に統計的な違いはなかった。以前に記載された［Ｍｏｓｃｉｏｎｉ Ｄ，ｅｔ ａｌ，Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｍｏｎｉａ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｔｒａｎｓｃａｒｂａｍｙｌａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｌｉｖｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００６；１４：２５−３３］ようなオロト酸分析のために、ベクター処置の前および後の種々の時点で尿サンプルを採取した。

肝臓ライセート中のｈＯＴＣ発現を検出するためのウエスタンブロット分析は、以前に記載されたように実施した［Ｗａｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ，２０１２，ｅｐｕｂ ２０１１）］。ｈＯＴＣを検出するための一次抗体は、国立小児医療センター（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）のＨｉｒｏｋｉ Ｍｏｒｉｚｏｎｏ研究室によって提供された特注のウサギポリクローナル抗体であった。肝臓ライセート（１０μｇ／レーン）もブロットし、抗チューブリン抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）により探索した。ウェスタン分析は、ｈＯＴＣｃｏ−ＬＷ４ベクターからのｈＯＴＣの発現がｈＯＴＣｗｔベクターと比べて１００倍高く、ＷＴマウスにおいて見られるレベルをわずかに超えるレベルまで達することを実証した。

ＯＴＣ酵素活性は、［１，２，３，４，５−１３Ｃ５］シトルリン（９８％１３Ｃ）に対して基準化されたシトルリンの形成を検出するために液体クロマトグラフィ質量分析安定性同位体希釈法を用いて測定した。この方法は、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ活性の検出のために以前に開発されたアッセイから適合される［Ｍｏｒｉｚｏｎｏ Ｈ，ｅｔ ａｌ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．２００４；８１（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ４−１１］。新鮮凍結肝臓の破片を秤量し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２．０ｍＭのＥＤＴＡおよび０．５ｍＭのＤＴＴを含有する緩衝液中で短時
間均質化した。均質化緩衝液の容積を、５０ｍｇ／ｍｌの組織が得られるように調整した。酵素活性は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸、４ｍＭのオルニチン、５ｍＭのリン酸カルバミル（ｐＨ８．３）中の２５０μｇの肝臓組織を用いて測定した。酵素活性を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ８．３）中に溶解した５０ｍＭのリン酸カルバミルを新しく調製して添加することにより開始させ、２５℃で５分間進行させ、３０％ＴＣＡ中の５ｍＭの等量の５ｍＭの等量の１３Ｃ５−シトルリンの添加により停止させた。５分間の微量遠心分離によりデブリを分離させ、上清を質量分析用バイアルに移した。９３％溶媒Ａ（１Ｌの水中１ｍｌのトリフルオロ酢酸）：７％溶媒Ｂ（１Ｌの１：９水／アセトニトリル中１ｍｌのトリフルオロ酢酸）の移動相を用いて、１０μＬのサンプルをアイソクラチック条件下でＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＬＣ−ＭＳに注入した。シトルリンに相当するピーク［質量：電荷比（ｍ／ｚ）１７６．１］および１３Ｃ５−シトルリンに相当するピーク（ｍ／ｚ１８１．１）を定量化し、その比を、各アッセイで実行されたシトルリンの標準曲線に対して得られた比と比較した。サンプルは、全肝臓組織か、またはＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて決定されるタンパク質濃度のいずれかに対して基準化した。

本明細書ではＬＷ４と呼ばれる改変ｈＯＴＣ ｃＤＮＡを保有するベクター（図４）は、発現されるｈＯＴＣタンパク質のレベルを１００倍改善することが見出された。ＯＴＣタンパク質は内在性ＯＴＣと比較したときのＯＴＣ酵素活性よりも上昇したが、ＯＴＣ酵素活性の評価は、一般に、ＯＴＣウエスタンブロット実験と相関関係があった。ｓｐｆａｓｈマウスにおけるバックグラウンド活性レベルを差し引くと、ｈＯＴＣｃｏ−ＬＷ４は、ｈＯＴＣｗｔよりも３３倍を超えて高い活性を生じた。処置したｓｐｆ^ashマウスにお
いて、持続性で用量に相関するｈＯＴＣ発現および活性レベルが観察された。主にｃＤＮＡにおいて異なるこれまでに記載されたマウスＯＴＣベクターと比較して、ｈＯＴＣｃｏ−ＬＷ４ベクターを保有するベクターは、約１０倍の効力があった。

修飾ｈＯＴＣｃｏ−ＬＷ４を保有する説明的なベクター（図４）は、ＯＴＣ組織学的アッセイで測定したときに、広範囲の用量にわたって高レベルの形質導入を提供した。１×１０¹¹ＧＣと３×１０⁹ＧＣの用量の間で、組織化学的染色により測定したときの形質導
入効率は５０〜７０％の間で異なった。１×１０⁹ＧＣの最低用量では、肝臓面積の４０
％がＯＴＣ組織化学的染色により陽性であった。組織化学および免疫染色により明白な用量効果がないのは、コドン最適化が形質導入された肝細胞内のｈＯＴＣ発現を著しく改善したという事実のためであり得る。これは、低ベクターゲノムコピーを有する形質導入細胞を検出するための感受性の改善に通じる。高いベクター用量（１×１０¹¹〜１×１０¹⁰ＧＣ）では形質導入は飽和される可能性があり、従って、ｉｎ ｓｉｔｕ検出方法で測定される形質導入効率は、質量分析により測定される肝臓ライセートにおけるＯＴＣ酵素活性とは対照的に、低用量群と高用量群との区別がないであろう。

ｓｃＡＡＶ２／８．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏを用いて５×１０¹⁰ＧＣ／子（ｐｕｐ）の用量で生後１日目に注射（側頭静脈を介して注射）したｓｐｆ^ashマウスにおいてｈＯＴＣ
の新生児期発現を評価するさらなる研究を実施した。２４および４８時間においてロバストな発現が検出された。１×１０¹¹、３×１０¹⁰、および１×１０¹⁰の用量を用いて付加的な研究を実施し、１２週間評価した。１６週間の研究期間を超えると、用量のそれぞれにおいて最初のロバストな発現レベルの低下が観察された。これは希釈のためである、すなわち成長期の動物における肝細胞の増殖の当然の結果であると考えられる。従って、ｓｐｆ^ashマウスにおける新生児期遺伝子導入の後にＯＴＣ肝臓活性の最初の回復が観察さ
れるが、この結果は一時的であり、ＯＴＣ活性は、約１週間の野生型（ｗｔ）レベルの約１０００％から、４週間のｗｔレベルの約５０％まで、１２週間のｗｔレベルの約１０％（１×１０¹¹ＧＣレベル）まで低下する；あるいは１週目のｗｔレベルの約５００％から、ｗｔレベルの約２０％まで、または１週目のｗｔレベルの約１０％（３×１０¹⁰ＧＣ用
量）まで低下する、あるいは１週目のｗｔレベルの約２００％から４週目のｗｔレベルの約１０％（１×１０¹⁰ＧＣ用量）まで低下する。１つの研究では、１日目に３×１０¹⁰Ｇの１回目の注射を受けた動物を用いて、２回目のｈＯＴＣｃｏ遺伝子を保有するＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶｒｈ１０．ｈＯＴＣｃｏ；１．８×１０¹⁰ＧＣ）を４週目に動物に注射した。対照として、１つの動物群は投与を全く受けず、１つの群は４週間で２回目のベクターのみを受けた。ＡＡＶ．ｈＯＴＣｃｏの再投与は、肝臓ＯＴＣ活性の回復をもたらした。

さらなる研究は、新生児期遺伝子療法により短期および長期の両方でＯＴＣ−ＫＯ子を救出する能力を評価するように設計した。

実施例２−コドン最適化配列を有するｓｃＡＡＶベクターの作製
Ａ．ｓｃＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＯＴＣ−ｃｏ
以前に記載されたイントロンを有するｐＡＡＶｓｃ．ＴＢＧ．ｍＯＴＣ１．３に由来するプラスミドにおいてｍＯＴＣコードシークエンシングをｈＯＴＣｃｏで置換することによって、実施例１に記載されるように、配列番号３、４、５、９または１０のコドン最適化ｈＯＴＣ配列をそれぞれ含有するプラスミドをクローン化する。得られたプラスミドｐＡＡＶｓｃ．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏを、従来の技術を用いてＡＡＶ８カプシド［Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，２００２，９９：１１８５４−１１８５９］内にクローン化する。

Ｂ．ｓｃＡＡＶｒｈ１０．ＴＢＧ．ｈＯＴＣ−ｃｏ
以前に記載されたイントロンを有するｐＡＡＶｓｃ．ＴＢＧ．ｍＯＴＣ１．３に由来するプラスミドにおいてｍＯＴＣコードシークエンシングをｈＯＴＣｃｏで置換することによって、実施例１に記載されるように、配列番号３、４、５、９または１０のコドン最適化ｈＯＴＣ配列をそれぞれ含有するプラスミドをクローン化する。得られたプラスミドｐＡＡＶｓｃ．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏを、従来の技術を用いてＡＡＶｒｈ１０カプシド［Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，２００２，９９：１１８５４−１１８５９］内にクローン化する。

実施例３−コドン最適化配列を有するｓｓＡＡＶベクターの作製
ｓｓＡＡＶ２／８．ＬＳＰ１．ｈＯＴＣ−ｃｏ
ｐＬＳＰ１ｍＯＴＣプラスミド［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２００９，１７：１３４０−１３４６］のｍＯＴＣコードシークエンシングを配列番号３、４、５、９または１０の対応するｃＤＮＡ配列で置換することによって、コドン最適化ｈＯＴＣｃｏ配列を含有するプラスミドを記載されるようにクローン化する。実施例１に記載される技術を用いて、得られたプラスミドｐＡＡＶｓｃ．ＬＳＰ１．ｈＯＴＣｃｏをＡＡＶ８カプシド内にクローン化して、対応するｓｓＡＡＶ２／８．ＬＳＰ１．ｈＯＴＣ−ｃｏベクターを形成する。

Ｂ．ｓｓＡＡＶ２／ｒｈ１０．ＬＳＰ１．ｈＯＴＣ−ｃｏ
ｐＬＳＰ１ｍＯＴＣプラスミド［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２００９，１７：１３４０−１３４６］のｍＯＴＣコードシークエンシングを配列番号３、４、５、９または１０の対応するｃＤＮＡ配列で置換することによって、コドン最適化ｈＯＴＣｃｏ配列を含有するプラスミドを記載されるようにクローン化する。実施例１に記載される技術を用いて、得られたプラスミドｐＡＡＶｓｃ．ＬＳＰ１．ｈＯＴＣｃｏをＡＡＶ８カプシド内にクローン化して、対応するｓｓＡＡＶ２／８．ＬＳＰ１．ｈＯＴＣ−ｃｏベクターを形成する。

パートＡまたはＢに従って作製したベクターは、２回の塩化セシウム勾配遠心法によっ
て精製され、ＰＢＳにより緩衝交換され、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １５遠心フィルタデバイス１００Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて濃縮され得る。ＡＡＶベクターのゲノム力価（ＧＣ／ｍｌ）は、ＴＢＧプロモーターおよび直線化プラスミド標準に相当するプライマー／プローブセットを用いてリアルタイムＰＣＲにより決定することができる。ベクター純度のためのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析およびエンドトキシン検出のためのリムルス・アメボサイト・ライセート（Ｌｉｍｕｌｕｓ ａｍｅｂｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ、ＬＡＬ）（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を含む付加的な品質管理試験をベクターに行うことができる。

実施例４−ＯＴＣＤの後期発症のモデルにおけるｓｓＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏ
本明細書に記載される方法を用いてＡＡＶ８ベクターを作製した。ベクターは、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＴＢＧプロモーター、イントロン、ｈＯＴＣｃｏ、ＷＰＲＥエレメント、ウシ成長ホルモンポリＡ、および３’ＡＡＶ２ ＩＴＲをその中にパッケージングしている。このベクターの発現および動態学を、ＷＰＲＥエレメントを有するかまたは有さない自己相補的ＡＡＶ８ベクターと比較した。結果は、ＷＰＲＥエレメントを有する一本鎖構築物が、ＷＰＲＥエレメントを欠いたベクターよりも優れており；同等の用量では、両方の一本鎖ベクター（ＷＰＲＥの有るものおよび無いもの）が、測定した時点でＷＰＲＥを欠いた自己相補的ベクターよりもロバスト性が低いことを示す。

しかしながら、一本鎖ベクターは、患者の年齢および状態に応じて、例えば動態学の観点から他の望ましい特性を有し得る。

実施例５−コドン最適化配列を有するアデノウイルスベクターの作成
ＮｏｔＩリンカーを有するｈＯＴＣｃｏ ｃＤＮＡ［配列番号３、４、５、９および１０］をラットＰＥＰＣＫプロモーターの下流にクローン化して、Ａ．Ｍｉａｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００４，１０：４９２−４９９（２００４）に記載されるようにｐＰＥＰＣＫ−ｈＯＴＣを作製する。このプラスミドをＡｓｃＩにより消化させ、得られたＰＥＰＣＫ−ｈＯＴＣｃｏ断片をアデノウイルス骨格プラスミドｐｃ４ＨＳＵ３１に挿入して、親プラスミドｐＣ４ＨＳＵ−ＰＥＰＣＫ−ｈＯＴＣｃｏを作製する。プラスミドｐＷＰＲＥをＣｌａＩで消化させて、ＷＰＲＥを放出させ、次にこれをｐＰＥＰＣＫ−ｈＯＴＣのＭｌｕＩ部位に挿入し、そのそれぞれのｈＯＴＣｃｏ配列を有するｐＰＥＰＣＫ−ｈＯＴＣｃｏ−ＷＰＲＥプラスミドを作製する。アデノウイルスプラスミドｐＣ４ＨＳＵ−ＰＥＰＣＫ−ｈＯＴＣｃｏ−ＷＰＲＥを作製するための残りのステップは既に記載された通りである。全てのクローニング部位は、ＤＮＡ配列分析により確認される。組換えアデノウイルスプラスミドの同一性は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩによる制限酵素消化によって確認することができる。アデノウイルスプラスミドは、２９３Ｃｒｅ４細胞へのトランスフェクションの前に、ＰｍｅＩにより直線化される。アデノウイルスベクターを救出し、２９３Ｃｒｅ４細胞およびヘルパーウイルスＡｄＬＣ８ｃｌｕｃにより増幅する。ベクター作製の最終ステップにおいて懸濁２９３Ｎ３Ｓｃｒｅ８細胞が使用され得る。精製、ＯＤ２６０による定量化およびウイルスＤＮＡ抽出は、他で詳細に記載されるように実施される［Ｂｒｕｎｅｔｔｉ−Ｐｉｅｒｒｉ，Ｎ．，ｅｔ
ａｌ．（２００４）．Ａｃｕｔｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｆｔｅｒ ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎｔｏ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：３５−１６；Ｎｇ，Ｐ．，Ｐａｒｋｓ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．（２００２）．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６９：３７１−３８８］。

実施例６−ｈＯＴＣｃｏレンチウイルスベクターの作製
Ａ．本明細書に記載されるｈＯＴＣｃｏ配列を含有する複製欠損レンチウイルスベクターは、プラスミドｐＬｅｎｔｉ−ＧＩＩＩ−ＣＭＶ−ＧＦＰ−２Ａ−ＰｕｒｏのラットＯＴＣ遺伝子配列インサート［Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（ＡＢＭ）Ｉｎｃ．；Ｃａｎａｄａから市販される］を、所望のｈＯＴＣｃｏ配列［配列番号３、４、５、９および１０］で置換することによって作製することができる。ウイルスは製造業者の説明書に従って作製される。ＡＢＭシステムは、形質導入および標的細胞のゲノムＤＮＡへの組み込みの後にレンチウイルスベクターの自己不活性化を保証するために３’ＡＬＴＲのＵ３領域におけるエンハンサー欠失を含み；パッケージングシグナルを全てが欠いている異なるプラスミドに由来する、パッケージング、複製および形質導入（Ｇａｇ／ＰｏＩ／Ｒｅｖ）に必要な最少のレンチウイルス遺伝子を含有し；さらに、Ｇａｇ、ＰｏＩ、またはＲｅｖ遺伝子はどれもパッケージングされたウイルスゲノムに組み込まれず、従って、成熟ウイルスには複製能力がない。

Ｂ．複製欠損、非組込み型ｈＯＴＣレンチウイルスベクター
肝臓特異的プロモーターならびに配列番号３、４、５、９および１０のｈＯＴＣｃｏ ＤＮＡを含有するＤＮＡ構築物は、米国特許出願公開第２０１１／００６４７６３号明細書（参照によって本明細書中に援用される）に記載されるように作製されたエンベロープ化シンドビスウイルスＥ２に偽型化されたレンチウイルスベクター内に設計される。全てのベクターは、スプライスドナー、パッケージングシグナル（ｐｓｉ）、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、スプライスドナー、スプライスアクセプター、セントラルポリプリントラクト（ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｌｙ−ｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔ）（ｃＰＰＴ）を含有する。ＷＰＲＥエレメントは特定のウイルスでは除去される。

Ｃ．配列番号３、４、５、９および１０のｈＯＴＣｃｏ ＤＮＡは、製造業者の説明書を用いて、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入された水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）エンベロープ遺伝子で偽型化されたレンチウイルスにクローン化される。

実施例７−ｈＯＴＣｃｏ ＲＮＡ送達系の作製
ＲＮＡは鋳型ＤＮＡからのインビトロ転写によって作製されるか、または合成され得る。既知の技術を用いて、５’ＵＴＲ、スプライスドナーおよびアクセプター部位を有する任意選択的なイントロン、任意選択的なコザック配列、本明細書で提供されるｈＯＴＣコード配列、ポリＡ、および３’ＵＴＲを含むＲＮＡ発現カセットが作成される。

Ａ．適切な量のｍＲＮＡは、公開された技術を用いて生成された脂質エンベロープ化ｐＨ応答性ポリマーナノ粒子に組み込まれる［Ｘ．Ｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１１，８（３），ｐｐ７７４−７８７；ウェブ公開：２０１１年３月２１日］。

Ｂ．２５ｋＤａの分枝状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を有する高分子ナノ粒子製剤は、以下のように作製される。ＰＥＩが存在する場合、それは、１０〜４０ｋＤａの範囲の分子量の分枝状ＰＥＩ、例えば２５ｋＤａの分枝状ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ ＃４０８７２７）であり得る。本発明に適した付加的な例示的ポリマーには、ＰＣＴ公報国際公開第２０１３１８２６８３号パンフレット（その内容は参照によって本明細書に援用される）に記載されるものが含まれる。必要量のｍＲＮＡを、注射用水（Ｂｒａｕｎ，Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ）中に適用する直前に全容積が４ｍｌになるように希釈し、Ｎ／Ｐ比１０でピペットを用いて４ｍｌの分枝状ＰＥＩ２５ｋＤａの水溶液に迅速に添加する。溶液は、ピペットで上下させて混合する。

Ｃ．脂質ベースのナノ粒子の場合、脂質製剤は、送達用の溶液を提供するためにｃＫ−Ｅ１２：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧ−ＤＭＧ２Ｋ（相対量５０：２５：２０：５（ｍｇ：ｍｇ：ｍｇ：ｍｇ））の製剤中にｈＯＴＣｃｏ ＲＮＡを含有する発現カセットを用いて作られる。カチオン性脂質ｃＫ−Ｅ１２が使用され（例えば、国際公開第２０１３／０６３４６８号パンフレットを参照）、国際公開第２０１０／０５３５７２号パンフレットおよび国際公開第２０１２／１７０９３０号パンフレット（これらはいずれも参照によって本明細書中に援用される）に記載される製剤方法を用いて、ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミンまたは「ＤＯＰＥ」、コレステロール（ｃｈｏｌ）、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはペグ化脂質（ＰＥＧ−ＤＭＧ２Ｋ）と混ぜ合わせられる。

実施例８−ｈＯＴＣｃｏ ＤＮＡ送達系
Ａ．ネイキッドプラスミドＤＮＡ−ｈＯＴＣｃｏ配列［配列番号３、４、または５］は、標的肝細胞（例えば、血管内投与による）へ送達されて標的細胞内でヒトＯＴＣタンパク質を発現するネイキッドプラスミドＤＮＡ構築物として設計される。

Ｂ．少なくともプロモーター、任意選択的なイントロン、任意選択的なコザック配列、配列番号３、４または５のｈＯＴＣｃｏ、ポリＡ、および他の任意選択的な発現制御配列を含有する適切な量の発現カセットを用いて、カチオン性脂質−ＤＮＡ複合体−カチオン性脂質−ＤＮＡ複合体が作製される。プロモーターは肝臓特異的プロモーターであり得る。あるいは、別の非組織特異的プロモーターが選択され得る。例えば、適切な量のＤＮＡは、ｃＫ−Ｅ１２：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧ−ＤＭＧ２Ｋ（相対量５０：２５：２０：５（ｍｇ：ｍｇ：ｍｇ：ｍｇ））のカチオン性脂質と共に処方され、被験者への送達に適したカチオン性脂質−ＤＮＡ複合体を形成する。カチオン性脂質ｃＫ−Ｅ１２が使用され（例えば、国際公開第２０１３／０６３４６８号パンフレットを参照）、国際公開第２０１０／０５３５７２号パンフレットおよび国際公開第２０１２／１７０９３０号パンフレット（これらはいずれも参照によって本明細書中に援用される）に記載される製剤方法を用いて、ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミンまたは「ＤＯＰＥ」、コレステロール（ｃｈｏｌ）、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはペグ化脂質（ＰＥＧ−ＤＭＧ２Ｋ）と混ぜ合わせられる。

実施例９ 異なる血清型のＡＡＶベクターを用いる多重処置によるＯＴＣ欠損症の新生児期致死型の長期間の補正
この研究では、実施例１に記載したように作製されたｓｃＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏＬＷ４を、新生児期（早期）発症ＯＴＣＤのマウスモデルにおいて動物を救出するために使用した。エクソン２−３の欠失によりＯＴＣ ＫＯマウスを作製し、このマウスの特性を、ＯＴＣのヌル変異を有するヒト患者に対する類似性に関して特徴付けた。要約すると、我々の研究室でエクソン２−３の欠失により作製したＯＴＣノックアウト（ＫＯ）モデルは、ヒトにおける重篤なＯＴＣＤの新生児期発症型を厳密に模倣する。新生オスＯＴＣ ＫＯ子は、肝臓内のＯＴＣ発現が存在しないために血漿アンモニアレベルが上昇しており、生後２４時間以内に必然的に死亡する。正常に繁殖するヘテロ接合性のメスは、正常な血漿アンモニアレベル、低下した肝臓ＯＴＣ酵素活性、上昇した尿オロト酸レベル、および場合により野生型（ＷＴ）同腹子と比べてより低い体重を有する。出生直後に１〜３×１０ｅ１０ＧＣ／子の用量で、実施例１に記載されるように作製されたｓｃＡＡＶ８−ｈＯＴＣｃｏベクターを単回注射すると、ＯＴＣ ＫＯ子を救出し、６週間まで延命させることができる。長期間の補正を達成するために、４週齢のＯＴＣ−ＫＯマウス群に、実施例１に記載されたように作製したｓｃＡＡＶｒｈ１０−ｈＯＴＣｃｏベクターの２回目のベクター投与を受けさせた。

帝王切開により回収した３０匹を超えるＯＴＣ−ＫＯ子が遺伝子送達により救出された
。救出された子はその正常な同腹子よりも低い体重を有し、被毛疎および皮膚異常の一過性の表現型を有した。最も重要なことに、その血漿アンモニアレベルが正常範囲であった。しかしながら、効力は、新生児期の高速の肝臓増殖中のベクターゲノムの喪失のために６週間を超えて維持することができない。４週齢ＯＴＣ−ＫＯマウスにおけるｓｃＡＡＶｒｈ１０−ｈＯＴＣｃｏベクターの２回目のベクター投与は、さらに成人期まで延命させることができる。最高齢マウスは１８月齢に達した。長期間救出マウスは、正常に近い血漿アンモニアレベルを示すが、これらのマウスの一部では尿オロト酸レベルが著しく上昇した。異なる年齢（６、１２、および１８月齢）のヘテロ接合性マウスからの肝臓サンプルにおけるシリウスレッド染色は、１１歳のＯＴＣＤ患者からの肝臓サンプルと類似して、高齢（１８月齢）ＯＴＣ−ＫＯヘテロ接合性メスマウスにおいて肝線維症を示した。

実施例１０−後期発症ＯＴＣ欠損症（ＯＴＣＤ）の処置
２月齢のＯＴＣ−ＫＯヘテロ接合性マウスに、１×１０¹⁰、３×１０¹⁰、および１×１０¹¹ベクターゲノムコピー／マウスにおいて、コドン最適化ヒトＯＴＣ遺伝子（配列番号５）をコードする自己相補的ＡＡＶ８ベクターの単回の尾静脈注射を受けさせた。ベクター処置の１週間後に、３つのベクター用量群の全てのマウスは正常な尿オロト酸レベルを有し、これは研究の間中（１６カ月間）保持された。病理分析のために肝臓サンプルを１８月齢の処置マウスから採取し、年齢を適合させた未処置のヘテロ接合性マウスおよびＷＴ同腹子と比較した。全ての処置マウスは、肝臓全体に線維症を有した未処置のヘテロ接合性動物とは対照的に、ＷＴと同様の正常な肝臓組織像を示した。結論として、ＡＡＶ８ｓｃ−ｈＯＴＣｃｏベクターの単回注射は、ＯＴＣ−ＫＯヘテロ接合における肝線維症を予防し、ＯＴＣＤ患者における肝線維症の補正のために大きな可能性を有することができる。

本明細書に記載される遺伝子療法ベクターは、ＯＴＣの完全な欠如を有するマウスにおいても、急速、ロバストかつ長期間の遺伝子発現の能力がある。ヘテロ接合性メスは、ヘミ接合性のオス子孫を繁殖および出産することができるが、これらの子は、処置しなければ出生日に死亡する。未処置の歳をとったヘテロ接合性メスマウスは、ヒトヘテロ接合性患者における観察と同様と思われる知見である、線維症および微小胞脂肪症の増大の証拠を示す。罹患したオスを救出することができる遺伝子導入の治療計画が開発され、処置したオスは７２週間を超えて生存した。

従って、これらのデータは、ｈＯＴＣによる肝臓特異的遺伝子療法が肝線維症を予防できることを実証する。これらのデータは、ヘテロ接合性ＯＴＣ欠損のヒト、例えばＯＴＣＤの後期発症を有する被験者の処置において相関がある。

以下の情報は、数字識別子＜２２３＞におけるフリーテキストを含有する配列のために提供される。

２０１４年３月９日に出願された優先権の米国仮特許出願第６１／９５０，１５７号明細書、および本明細書中で引用される全ての公開文書は参照によって本明細書中に援用される。同様に、本明細書中で言及され、添付の配列表に見られる配列番号は参照によって援用される。本発明は特定の実施形態に関連して説明されたが、本発明の趣旨から逸脱することなく変更がなされ得ることは認識されるであろう。このような変更は、特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。

Claims (16)

1. 機能的ヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（ｈＯＴＣ）タンパク質をコードする配列を含んでなる核酸分子であって、配列番号１の野生型ｈＯＴＣ配列と８０％未満の同一性であり、かつ、前記配列が配列番号５を含む核酸配列及び前記核酸配列と少なくとも９６％の同一性の核酸配列から選択される、核酸分子。
2. 請求項１に記載の核酸分子であって、前記機能的ｈＯＴＣタンパク質が、前記配列番号５の配列を有する、核酸分子。
3. 請求項１に記載の核酸分子であって、前記機能的ｈＯＴＣタンパク質をコードする配列が配列番号３又は配列番号４の配列を有する、核酸分子。
4. 発現カセットを含有するプラスミドであって、ＡＡＶ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列と、ｈＯＴＣ核酸配列と、発現制御配列と、ＡＡＶ３’ＩＴＲ配列を含んでなり、ここで、
   前記ｈＯＴＣ核酸配列が機能的ｈＯＴＣタンパク質をコードし、配列番号１の野生型ｈＯＴＣ配列と８０％未満の同一性であり、かつ、前記ｈＯＴＣ核酸配列が配列番号５を含む核酸配列及び前記核酸配列と少なくとも９６％の同一性の核酸配列から選択される、プラスミド。
5. 請求項４に記載のプラスミドであって、前記ｈＯＴＣ核酸配列が配列番号５の配列を有する、プラスミド。
6. 請求項４に記載のプラスミドであって、前記ｈＯＴＣ核酸配列が配列番号３又は配列番号４の配列を有する、プラスミド。
7. 請求項４に記載のプラスミドであって、前記ｈＯＴＣ核酸配列が配列番号５の天然のトランジット配列を置換する異種トランジット配列を含むキメラｈＯＴＣ核酸配列である、プラスミド。
8. 請求項４に記載のプラスミドであって、前記発現制御配列が肝臓特異的プロモーターを含む、プラスミド。
9. 請求項８に記載のプラスミドであって、前記肝臓特異的プロモーターがチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターである、プラスミド。
10. 請求項４に記載のプラスミドであって、 前記発現カセットがイントロン、コザック配列、ポリＡ、および転写後調節エレメントのうちの１種以上をさらに含む、プラスミド。
11. 請求項４に記載のプラスミドであって、ＡＡＶ５’ＩＴＲ及びＡＡＶ’３ ＩＴＲがＡＡＶ２からのものである、プラスミド。
12. 請求項４に記載のプラスミドであって、前記発現カセットが１種以上のエンハンサーを含む、プラスミド。
13. 請求項１２に記載のプラスミドであって、前記エンハンサーがアルファ１ミクログロブリン／ビクニン (アルファｍｉｃ／ｂｉｋ）エンハンサーを含む、プラスミド。
14. 請求項４に記載のプラスミドを含む産生細胞株又はパッケージング細胞株。
15. ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲおよびＡＡＶ２ ５’ＩＴＲを含むベクターゲノムを含んでなるプラスミドであって、前記ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲがＤ−配列と末端分解部位を欠失しており、チロキシン結合グロブリン(ＴＢＧ)プロモーター配列と配列番号５の核酸配列とＳＶ４０ポリＡ配列を含む、プラスミド。
16. 請求項１５に記載のプラスミドを含む産生細胞株又はパッケージング細胞株。

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