ES2740248T3 - Composiciones de nanopartículas lipídicas y métodos para la administración ARNm - Google Patents

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Abstract

Una composición que comprende (a) al menos una molécula de ARNm al menos una porción de la cual codifica un polipéptido secretado funcional; y (b) un vehículo de transferencia liposomal que comprende una nanopartícula lipídica que comprende uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos no catiónicos y uno o más lípidos modificados con PEG para usar un método de tratamiento de un sujeto que tiene un defecto o deficiencia en dicho polipéptido secretado, en que el ARNm está encapsulado en el vehículo de transferencia y en la composición se administra mediante la administración pulmonar mediante nebulización.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones de nanopartículas lipídicas y métodos para la administración ARNm
[0001] Los nuevos conocimientos y terapias están todavía necesarios para el tratamiento de proteínas y enzimas deficiencias. Por ejemplo, las enfermedades de almacenamiento son un grupo de aproximadamente 50 trastornos metabólicos hereditarios raros que en su función lisosomal, generalmente debido a una deficiencia de una enzima requerida para el metabolismo. La enfermedad de Fabry es una enfermedad de almacenamiento lisosomal que resulta de la búsqueda de una deficiencia de la enzima alfa galactosidasa (GLA), que causa que un glicolípido conocido como globotriaosilceramida se acumule en los vasos sanguíneos y otros tejidos, lo que lleva a varias manifestaciones dolorosas. Para ciertas enfermedades, como la enfermedad de Fabry, existe la necesidad de reemplazar una proteína o enzima que normalmente es la secretada de las células al torrente sanguíneo. Las terapias, como la terapia génica, aumentan el nivel de la producción de una proteína o enzima. Sin embargo, ha habido varias limitaciones para usar la terapia génica convencional para este propósito.
[0002] La terapia génica convencional implica el uso de ADN para la inserción de la información genética deseada en las células huésped. El ADN en la célula generalmente se integra en cierta medida en el genoma de una o más células transfectadas, lo que permite una acción duradera del material genético en el huésped. Si bien tiene beneficios sustanciales para dicha acción sostenida, la integración de ADN exógeno en el genoma del huésped también puede tener muchos efectos perjudiciales. Por ejemplo, es posible que el ADN se inserte en un intacto de gen, que resulte en una mutación que impida que se elimine totalmente la función del gen endógeno. Por lo tanto, la terapia génica con el ADN puede resultar en el desempeño de una función genética vital en el trato tratado, como por ejemplo, la función de una enzima esencial delimitada o la interrupción de un gen crítico para la regulación del crecimiento celular, lo que resulta en una regulación no regulada o proliferación de células cancerosas. Además, con la terapia génica basada en el ADN también es posible que el material genético basado en el ADN dé lugar a la inducción de los anticuerpos anti-ADN no deseados, que a su vez, pueden desencadenar una respuesta inmune posiblemente fatal. Los efectos de la terapia génica que los empleados virales también son útiles en una respuesta inmune adversa. En algunas circunstancias, el vector viral puede incluso integrarse en el genoma del huésped. Además, la producción de vectores virales de grado clínico también es costosa y consume mucho tiempo. También puede ser difícil controlar la distribución del material genético. Por lo tanto, aunque la terapia génica basada en el ADN se ha evaluado para el suministro de las proteínas secretadas utilizando los vectores virales (Patente de EE.UU. N° 6.066.626; US2004/0110709), estos han sido limitados por estas razones.
[0003] Otro obstáculo aparente en estos principios anteriores en la entrega de ácidos nucleicos que codifican proteínas secretadas, es decir, en los niveles de proteína que se producen en última instancia. Es difícil lograr niveles significativos de la proteína deseada en la sangre y las cantidades no se mantienen con el tiempo. Por ejemplo, la cantidad de proteína producida por el suministro de ácido nucleico no alcanza niveles fisiológicos normales. Véase por ejemplo, US2004/0110709.
[0004] En contraste con el ADN, el uso de ARN como agente de terapia genética es sustancialmente más seguro porque (1) ARN no implica el riesgo de ser integrado de forma estable en el genoma de la célula transfectada, eliminando así la preocupación de que el lanzamiento genético, el material, el funcionamiento normal de un gen esencial, causó una mutación que resulta en efectos nocivos u oncogénicos; (2) no se requieren secuencias promotoras extrañas para la traducción de la proteína codificada, evitando nuevos posibles efectos nocivos; (3) una diferencia del ADN plasmídico (ADNp), el ARN mensajero (ARNm) carece de motivos inmunogénicos CpG, por lo que no han sido generados los anticuerpos anti-ARN; y (4) cualquier efecto perjudicial que resulte del ARN basado en la terapia génica se limitaría a una vida media relativamente corta. Además, no es necesario que el ARN ingrese al núcleo para realizar su función, mientras que el ADN debe superar esta barrera principal.
[0005] Una razón por la que la terapia basada en ARNm no se ha utilizado más que en el pasado es que el ARN es mucho menos estable que el ADN, especialmente cuando se alcanza el citoplasma de una célula y se expone una enzima degradante. La presencia de un grupo de hidroxilo en el segundo carbono de la porción de azúcar en el ARN es un impedimento para que el ARNm forme la estructura de la hélice doble más estable en el ADN y, por lo tanto, hace que el ARNm sea más propenso A la degradación hidrolítica. Como resultado, hasta hace poco, se cree que el ARNm es demasiado importante para los protocolos de transfección. Los avances en las modificaciones de estabilización del ARN han despertado más interés en el uso del ARNm en el lugar del ADN plasmídico en la terapia génica. Ciertos vehículos de administración, como los lípidos catiónicos o los vehículos de administración de polímeros también pueden ayudar a proteger el ARNm transfectado de RNasas endógenas. Sin embargo, a pesar del aumento de la estabilidad del ARNm modificado, el suministro de ARNm a células en vivo de una manera que permita niveles terapéuticos de producción de proteínas sigue siendo un desafío, particularmente para el ARNm que codifica las proteínas de longitud completa. Si bien se ha contemplado el suministro de ARNm que codifica las proteínas secretadas (documento US2009/0286852), los niveles de una proteína secretada de longitud completa que realmente se producirán a través del suministro de ARNm en vivo no se conocen y no hay ninguna razón para esperar que los niveles excedan los niveles observados con terapia génica basada en el ADN.
[0006] Hasta la fecha, sólo se ha hecho un progreso significativo usando la terapia génica de ARNm en aplicaciones para los bajos niveles de traducción no ha sido un factor limitante, tales como la inmunización con ARNm que codifican antígenos. Los ensayos clínicos que implican la vacunación contra los antígenos tumorales mediante la inyección intradérmica de ARNm desnudo o con el complejo de protamina han demostrado viabilidad, falta de toxicidad y resultados prometedores. X. Su et al., Mol. Pharmaceutics 8: 774-787 (2011). Desafortunadamente, los bajos niveles de traducción han restringido enormemente la explotación de la terapia génica basada en ARNm en otras aplicaciones que requieren niveles más altos de expresión sostenida de la proteína codificada en ARNm para ejercer un efecto biológico o terapéutico.
[0007] En el documento WO 2007/024708 se describen las moléculas de ARN, oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos que comprenden pseudofirina o un nucleósido modificado.
[0008] Su et al. (Mol Pharm, 6 de junio de 2011; 8 (3): 774-87) describe nanopartículas estructurados de núcleocáscara biodegradables con un núcleo de poli(p-amino éster) (PBAE) envuelto por una cáscara de bicapa de fosfolípidos para el suministro de vacunas basadas en ARNm.
[0009] Kormann et al. (Nat Biotechnol. 2011 feb; 29 (2): 154-7) investiga la utilidad terapéutica del ARN modificado químicamente como alternativa a la terapia génica basada en el ADN.
[0010] El documento WO 2011/068810 describe las composiciones y los métodos para modular la expresión de un gen o la producción de una proteína transfectando las células diana con ácidos nucleicos.
[0011] El documento US 2012/0195936 describe un polirribonucleótido con una secuencia que codifica una proteína o fragmento de proteína, y el polirribonucleótido una combinación de nucleótidos no modificados y modificados.
[0012] La invención de una composición que comprende (a) al menos una molécula de ARNm al menos una parte de la cual codifica un polipéptido secretado funcional; y (b) un vehículo de transferencia liposomal que comprende una nanopartícula lipídica que comprende uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos no catiónicos y uno o más lípidos modificados con PEG para usar un método de tratamiento de un sujeto que tiene un defecto o deficiencia en dicho polipéptido secretado, en que el ARNm está encapsulado en el vehículo de transferencia y en la composición se administra mediante la administración pulmonar mediante nebulización.
[0013] Administración de agentes terapéuticos génicos ARNm de acuerdo con la invención lleva a la producción de niveles terapéuticos eficaces de las proteínas secretadas a través de un "efecto de depósito". El ARNm que codifica una proteína secreta se carga en nanopartículas lipídicas y se administra a las células diana en vivo. Las células diana actúan entonces como una fuente de depósito para la producción de proteínas solubles y secretadas en el sistema circulatorio a niveles terapéuticos. En algunos lugares, los niveles de la proteína.
[0014] Las composiciones de la invención son útiles en la gestión y el tratamiento de una gran cantidad de enfermedades, en particular las enfermedades de la proteína y/o deficiencias de la enzima, en la que la proteína o la enzima es secretada normalmente. Los individuos que padecen las enfermedades pueden tener defectos genéticos subyacentes que conducen a la expresión comprometida de una proteína o enzima, incluyendo, por ejemplo, la no síntesis de la proteína secretada, la síntesis de la proteína secretada o la síntesis de una proteína secretada que carece de actividad biológica o la tiene en un grado menor.
[0015] El ARNm puede codificar una proteína secretada clínicamente útil. Por ejemplo, el ARNm puede codificar una enzima del ciclo de la urea secretada funcional o una enzima secretada implicada en trastornos de almacenamiento lisosomal. El ARNm puede codificar, por ejemplo, eritropoyetina (por ejemplo, EPO humana) o o a-galactosidasa (por ejemplo, a-galactosidasa humana (GLA humano).
[0016] En algunas realizaciones de la invención, el ARNm puede comprender una o más modificaciones que otorgan estabilidad al ARNm (por ejemplo, en comparación con un tipo silvestre o una versión nativa del ARNm) y también puede comprender una o más modificaciones relativas al tipo silvestre que corrigen un defecto implícito en la expresión aberrante asociada a la proteína. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser modificaciones en una o en ambas regiones no traducidas 5' y 3'. Dichas modificaciones pueden incluir una secuencia parcial de un gen de citomegalovirus (CMV) inmediato-temprano 1 (IE1), una cola poli A, una estructura de Cap1 o una secuencia que codifica la hormona del crecimiento humano (hGH)). En algunas partes, el ARNm se modifica para disminuir la inmunogenecidad del ARNm.
[0017] También se contemplan los métodos de tratamiento de un sujeto que comprende una composición de la invención. Por ejemplo, los métodos para tratar y prevenir las afecciones en la producción de una proteína secretada en particular y/o la utilización de una proteína en secreto es inadecuada o comprometida. Los métodos que se incluyen en este documento pueden ser utilizados para tratar a un sujeto que tiene una deficiencia en una o más enzimas del ciclo de la urea o en una o más enzimas deficientes en un trastorno de almacenamiento lisosomal.
[0018] El ARNm en las composiciones de la invención se formula en un vehículo de transferencia liposomal para facilitar el suministro a la célula diana. Los vehículos de transferencia de uno o más lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos y lípidos modificados con PEG. Por ejemplo, el vehículo de transferencia puede comprender menos uno de los siguientes artículos catiónicos: C12-200, DLin-KC2-DMA, DODAP, HGT4003, ICE, HGT5000 o HGT5001. En el lugar, el vehículo de transferencia comprende colesterol (col) y/o un lípido modificado con PEG. En algunas ocasiones, los vehículos de transferencia de DMG-PEG2K. En ciertas partes, el vehículo de transferencia comprende una de las siguientes formulaciones de lípidos: C12-200, DOPE, col, DMG-PEG2K; DODAP, DOPE, colesterol, DMG-PEG2K; HGT5000, DOPE, col, DMG-PEG2K, HGT5001, DOPE, col, DMG-PEG2K.
[0019] En realizaciones de la invención, la proteína secretada es producida por la célula diana para las cantidades de tiempo sostenido. Por ejemplo, la proteína secretada puede producirse durante más de una hora, más de cuatro, más de seis, más de 24, más de 48 horas o más de 72 horas después de la administración. En algunas partes, el polipéptido se expresa a un nivel máximo aproximadamente seis horas después de la administración. En algunas partes, la expresión del polipéptido se mantiene en al menos un nivel terapéutico. En algunas respuestas, el polipéptido se expresa en menos un nivel terapéutico en más de una, más de cuatro, más de 12, más de 24, más de 48 horas o más de 72 horas después de la administración. En algunas partes, el polipéptido es detectable a nivel de suero o tejido del paciente (por ejemplo, hígado o pulmón). En algunas respuestas, el nivel de polipéptido detectable es el resultado de la expresión continua de la composición de ARNm durante períodos de tiempo de más de una, más de cuatro, más de 12, más de 24, más de 48 horas o más de 72 horas después de la administración.
[0020] En ciertas partes, la proteína secretada produce niveles superiores a los niveles fisiológicos normales. El nivel de proteína secretada puede aumentar en comparación con un control.
[0021] En algunas partes, el control es el nivel fisiológico basal del polipéptido en un individuo normal o en una población de individuos normales. En otras partes, el control es el nivel fisiológico de la referencia del polipéptido en un individuo que tiene una deficiencia en la proteína o polipéptido relevante o en una población de individuos que tiene una deficiencia en la proteína o polipéptido relevante. En algunas partes, el control puede ser el nivel normal de la proteína o polipéptido relevante en el individuo al que se administra la composición. En otras partes, el control es el nivel de expresión del polipéptido en otra intervención terapéutica, por ejemplo, en la inyección directa del polipéptido correspondiente, en uno o más puntos de tiempo comparables.
[0022] En ciertas partes, el polipéptido se expresa por la célula diana a un nivel que es al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, 30 veces, al menos 100 veces, al menos 500 veces, al menos 5000 veces, al menos 50,000 veces o al menos 100,000 veces mayor que un control. Más adelante, más de 12, más de 24, o más de 48 horas, o más de 72 horas después de la administración. Por ejemplo, en una realización, los niveles de proteína se detectan en el suero al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, 30 veces, al menos 100 veces, al menos 500 veces, al menos 5000 veces, al menos 50.000 veces o al menos 100.000 veces más que un control durante al menos 48 horas o 2 días. En ciertos nombres, los niveles de la proteína son detectables a los 3 días, 4 días, 5 días, o 1 semana o más después de la administración. Se pueden observar niveles aumentados de proteína secretada en el suero y/o en un tejido (por ejemplo, hígado, pulmón).
[0023] En algunas realizaciones, el método descrito produce una vida media de circulación sostenida de la proteína secretada deseada. Por ejemplo, la proteína secretada puede ser detectada durante horas o días más que la vida media observada a través de la inyección subcutánea de la proteína secretada. En el lugar, la vida media de la proteína se mantiene durante más de 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, o 1 semana o más.
[0024] En algunas de las partes de la invención, la administración se aplica a las repetidas.
[0025] El polipéptido puede ser, por ejemplo, uno o más de eritropoyetina, a-galactosidasa, el receptor de LDL, factor VIII, factor IX, a-L-iduronidasa (para MPS I), iduronato sulfatasa (para MPS II), heparina-N-sulfatasa (para MPS IIIA), a-N-acetilglucosaminidasa (para MPS IIIB), galactosa 6-sultatasa (para MPS IVA), lipasa ácida lisosomal, arilsulfatasa-A.
[0026] La invención se refiere a una composiciones que proporcionan ARNm a una célula o sujeto, al menos parte del cual codifica una proteína funcional, en una cantidad que es sustancialmente menor que la cantidad de la proteína funcional correspondiente generada de ese ARNm. Dicho de otro modo, en ciertas realizaciones el ARNm administrado a la célula puede producir una cantidad de proteína que es sustancialmente mayor que la cantidad de ARNm administrada a la célula. Por ejemplo, en una cantidad de tiempo dada, por ejemplo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20 o 24 horas desde la administración del ARN a una célula o sujeto, la cantidad de proteína correspondiente generada por ese ARNm puede ser al menos 1,5, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 o más veces mayor que la cantidad de ARNm realmente administrada a la célula o al sujeto. Esto se puede medir en una base de masa por masa, en una base de mol por mol, y/o en una base de molécula por molécula. La proteína se puede medir de varias maneras. Por ejemplo, para una célula, la proteína medida puede medirse como proteína intracelular, proteína extracelular o una combinación de las dos. Para un sujeto, la proteína medida puede ser proteína medida en suero; en un tejido específico o en tejidos como el hígado, riñón, corazón o cerebro; en un tipo de célula específica, como uno de los diversos tipos de células del hígado o del cerebro; o en cualquier combinación de suero, tejido y/o tipo de célula. Además, puede medirse una cantidad de referencia de la proteína endógena en la célula o una persona antes de la administración del ARNm y luego se resta de la proteína medida después de la administración del ARNm. De esta manera, el ARN puede proporcionar una fuente de depósito o una gran cantidad de material terapéutico a la célula o al sujeto, por ejemplo, en comparación con la cantidad de ARN administrado a la célula o al sujeto. La fuente de depósito puede actuar como una fuente continua para la expresión de polipéptidos del ARNm durante períodos sostenidos de tiempo.
[0027] Las otras características se trataron y las ventajas y ventajas concomitantes de la presente invención se entenderán mejor por la siguiente descripción detallada de la invención cuando se toma en conjunto con los ejemplos que se acompañan. Las diversas publicaciones en el presente documento son complementarias y se pueden combinar o utilizar las juntas de una manera entendida por el experto en la materia en vista de las enseñanzas contenidas en este documento.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0028]
FIG. 1 Muestra de la secuencia de nucleótidos de una secuencia de 5’ CMV (SEQ ID NO: 1), en la que X, si está presente, es GGA.
FIG. 2 Muestra la secuencia de nucleótidos de una secuencia de hGH 3’ (SEQ ID NO: 2).
FIG. 3 Muestra la secuencia de nucleótidos del ARNm eritropoyético humano (EPO) (SEQ ID NO: 3). Esta secuencia puede estar flanqueada en el extremo 5’ con la SEQ ID NO: 1 y en el extremo 3' con la SEQ ID NO: 2.
FIG. 4 Muestra la secuencia de nucleótidos del ARNm de la alfa-galactosidasa (GLA) humana (SEQ ID NO: 4) . Esta secuencia puede estar flanqueada en el extremo 5’ con la SEQ ID NO: 1 y en el extremo 3' con la SEQ ID NO: 2.
FIG. 5 Muestra la secuencia de nucleótidos del ARNm de la alfa-1 antitripsina (A1AT) humana (SEQ ID NO: 5) . Esta secuencia puede estar flanqueada en el extremo 5’ con la SEQ ID NO: 1 y en el extremo 3' con la SEQ ID NO: 2.
FIG. 6 Muestra de la secuencia de nucleótidos del ARNm del factor IX humano (FIX) (SEQ ID NO: 6). Esta secuencia puede estar flanqueada en el extremo 5’ con la SEQ ID NO: 1 y en el extremo 3' con la SEQ ID NO: 2.
FIG. 7 muestra la cuantificación de los niveles de proteína hEPO secretada medida a través de ELISA. La proteína detectada es el resultado de su producción a partir de ARNm de hEPO administrado por vía intravenosa a través de una dosis única de diversas formulaciones de nanopartículas lipídicas. Las formulaciones C12-200 (30 ug), HGT4003 (150 ug), ICE (100 ug), DODAP (200 ug) se consideran como el componente lipídico catiónico/ionizable de cada artículo de prueba (Formulaciones 1-4). Los valores se basan en una muestra de sangre cuatro horas después de la administración.
FIG. 8 Muestra la medición del hematocrito de ratones con una sola dosis IV de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de EPO humana (Formulaciones 1-4). Se tomaron muestras de sangre completa a las 4 horas (día 1), 24 horas (día 2), 4 días, 7 días y 10 días después de la administración.
FIG. 9 Muestra las mediciones de hematocrito de ratones con nanopartículas lipídicas cargadas con EPO-ARNm humano, ya sea con una sola dosis IV o tres inyecciones (día 1, día 3, día 5). Se tomaron muestras de sangre antes de la inyección (día -4), día 7 y día 15. Se administró la formulación 1: (30 ug, dosis única) o (3 x 10 ug, dosis día 1, día 3, día 5); Se administró la formulación 2: (3 x 50 ug, dosis día 1, día 3, día 5). FIG. 10 muestra la cuantificación de niveles de proteína de a-galactosidasa humana secretada (hGLA), medida a través de ELISA. La proteína detectada es el resultado de la producción de ARNm de hGLA administrado a través de nanopartículas lipídicas (Formulación 1; 30 ug dosis intravenosa única, basada en ARNm encapsulado). La proteína hGLA se detecta a través de 48 horas.
FIG. 11 Muestra la actividad de hGLA en suero. La actividad de hGLA se midió utilizando el sustrato 4-metilumberliferil-a-D-galactopiranósido (4-MU-a-gal) a 37°C. Los datos son un promedio de 6 a 9 mediciones individuales.
FIG. 12 muestra la cuantificación de los niveles de proteína hGLA en suero medido a través de ELISA. La proteína se produce a partir de ARNm de hGLA administrado a través de nanopartículas lipídicas basadas en C12-200-(C12-200: DOPE: Chol: DMGPEG2K, 40:30:25:5 (formulación 1); 30 gg de ARNm basado en ARNm encapsulado, dosis IV única). La proteína hGLA se controla durante 72 horas. Por dosis intravenosa única, basada en ARNm encapsulado). La proteína hGLA se controla durante 72 horas.
FIG. 13 muestra la cuantificación de los niveles de proteína hGLA en hígado, riñón y bazo, medida a través de ELISA. La proteína se produce a partir de ARNm de hGLA administrado a través de nanopartículas lipídicas basadas en C12-200 (Formulación 1; 30 gg de ARNm basado en ARNm encapsulado, dosis IV única). La proteína hGLA se controla durante 72 horas.
FIG. 14 muestra un estudio de respuesta a la dosis que monitoriza la producción de proteínas de hGLA como proteína GLA humana derivada de MRT secretada en suero (A) e hígado (B). Las muestras se midieron 24 horas después de la administración (Formulación 1; dosis IV única, N = 4 ratones/grupo) y se cuantificaron mediante ELISA.
FIG. 15 muestra los perfiles farmacocinéticos de alfa-galactosidasa basada en ERT en ratones atímicos (dosis de 40 ug/kg) y proteína hGLA producida a partir de MRT (Formulación 1; 1,0 mg/kg de dosis de ARNm).
FIG. 16 muestra la cuantificación de los niveles de proteína hGLA secretada en ratones. La proteína hGLA se produce a partir de ARNm de hGLA administrado a través de nanopartículas lipídicas basadas en C12-200 (Formulación 1; 10 pg de ARNm por dosis intravenosa única, según el ARNm encapsulado). El suero se controla durante 72 horas.
FIG. 17 muestra la cuantificación de los niveles de proteína hGLA en hígado, riñón, bazo y corazón de ratones Fabry KO tratados con MRT, medidos a través de ELISA. La proteína se produce a partir de ARNm de hGLA administrado a través de nanopartículas lipídicas basadas en C12-200 (Formulación 1; 30 pg de ARNm basado en ARNm encapsulado, dosis IV única). La proteína hGLA se controla durante 72 horas. Los valores de la literatura que representan los niveles fisiológicos normales se grafican como líneas discontinuas. FIG. 18 Muestra la cuantificación de los niveles de proteína hGLA secretada en MRT y en ratones Fabry tratados con alfa-galactosidasa, según el método de ELISA. Ambas terapias se administraron como una sola dosis intravenosa de 1,0 mg/kg.
FIG. 19 muestra la cuantificación de los niveles de proteína hGLA en hígado, riñón, bazo y corazón de los ratones Fabry KO tratados con MRT y ERT (alfa-galactosidasa) según se midió mediante ELISA. Proteína producida a partir de ARNm de hGLA administrada a través de nanopartículas lipídicas (Formulación 1; 1,0 mg/kg de ARNm basado en ARNm encapsulado, dosis IV única).
FIG. 20 Muestra la cuantificación relativa de globotrioasilceramida (Gb3) y liso-Gb3 en los riñones de ratones tratados y no tratados. Los ratones machos Fabry KO se trataron con una dosis única de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de GLA o alfa-galactosidasa a 1,0 mg/kg. La cantidad de Gb3/liso-Gb3 una semana después de la administración.
FIG. 21 Muestra la cuantificación relativa de globotrioasilceramida (Gb3) y liso-Gb3 en el corazón de los ratones tratados y no tratados. Los ratones machos Fabry KO se trataron con una dosis única de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de GLA o alfa-galactosidasa a 1,0 mg/kg. La cantidad de Gb3/liso-Gb3 una semana después de la administración.
FIG. 22 Muestra un estudio de respuesta a la dosis que monitoriza la producción de la proteína de GLA como proteína GLA humana derivada de MRT secretada en suero. Las muestras se midieron 24 horas después de la administración (dosis única, IV, N = 4 ratones/grupo) de HGT4003 (Formulación 3) o de nanopartículas lipídicas basadas en HGT5000 (Formulación 5) y se cuantificaron mediante ELISA.
FIG. 23 muestra de producción de proteína hGLA medida en suero (A) o en hígado, riñón y bazo (B). Las muestras se midieron 6 horas y 24 horas después de la administración (dosis única, IV, N = 4 ratones/grupo) de nanopartículas lipídicas basadas en HGT5001 (Formulación 6) y se cuantificó mediante ELISA.
FIG.24 muestra la cuantificación de los niveles de proteína del factor IX humano secretados medidos usando ELISA (desviación estándar media ng/mL ±). La proteína FIX se produce a partir de ARNm de FIX administrado a través de nanopartículas lipídicas basadas en C12-200 (C12-200: DOPE: Chol: DMGPEG2K, 40: 30: 25: 5 (Formulación 1); 30 pg de ARNm por dosis intravenosa única, basado en ARNm encapsulado). La proteína FIX se controla a través de 72 horas. (n = 24 ratones)
FIG.25 muestra la cuantificación de los niveles de proteína a-1 -antitripsina humana secretada (A1AT) medida mediante ELISA. La proteína A1AT se produce a partir de ARNm A1AT administrado a través de nanopartículas lipídicas basadas en C12-200 (C12-200: DOPE: Chol: DMGPEG2K, 40:30:25:5 (Formulación 1); 30 pg de ARNm por dosis intravenosa única, basado en ARNm encapsulado). La proteína A1AT se controla durante 24 horas.
FIG. 26 muestra una cuantificación basada en ELISA de la proteína hEPO detectada en los pulmones y el suero de los ratones después de la administración intratraqueal de nanopartículas cargadas de ARNm de hEPO (mIU medida) (C12-200, HGT5000 o nanopartículas lipídicas y en HGT5001; Formulaciones 1, 5, 6, respectivamente). Los animales se sacrificaron 6 horas después de la administración (n = 4 ratones por grupo).
DESCRIPCIÓN DE REALIZACIONES EJEMPLARES
[0029] La descripción de las funciones y los métodos para la administración intracelular de ARNm en un vehículo de transferencia liposomal a una o más células diana para la producción de niveles terapéuticos de la proteína funcional secretada.
[0030] El término "funcional", como se usa aquí para calificar una proteína o enzima, significa que la proteína o la enzima tiene actividad biológica, o, alternativamente, es capaz de realizar la misma, o una función similar a la proteína o enzima nativa o de funcionamiento normal. Las composiciones de ARNm de la invención son útiles para el tratamiento de diversos trastornos metabólicos o genéticos, y en particular aquellos genéticos o metabólicos que implican la no expresión, la expresión errónea o la deficiencia de una proteína o enzima. El término "niveles terapéuticos" se refiere a los niveles de la proteína detectados en la sangre o los tejidos que se encuentran en la parte superior de los niveles de control, en donde el control puede ser niveles fisiológicos normales, o los niveles en el sujeto antes de la administración de la composición del ARNm. El término "secretado" se refiere a la proteína que se detecta fuera de la célula diana, en el espacio extracelular. La proteína puede ser detectada en la sangre o en los tejidos. En el contexto de la presente invención, el término "producido" se usa en su sentido más amplio para la traducción de menos a un ARNm a una proteína o enzima. Como se observa en el presente documento, las partes incluyen un vehículo de transferencia. Tal como se usa en el presente documento, el término "vehículo de transferencia" incluye cualquiera de los vehículos farmacéuticos, diluyentes, excipientes y similares que se encuentran en la relación con la administración de agentes biológicamente activos, incluidos los ácidos nucleicos. Las composiciones y, en particular, los vehículos de transferencia en el presente documento son capaces de proporcionar ARNm a la célula diana.
ARNm
[0031] El ARNm en las composiciones de la invención puede codificar, por ejemplo, una hormona secretada, enzima, receptor, polipéptido, péptido u otra proteína de interés que normalmente se secreta. En una realización de la invención, el ARN puede tener la funcionalidad de las técnicas biológicas que, por ejemplo, mejoran la estabilidad y/o la vida media de dicho ARNm que la mejoran en la producción de proteínas.
[0032] Uno o mas ARNm únicos pueden ser co-administrados a células diana, por ejemplo, mediante la combinación de dos ARNm únicos es un solo vehículo de transferencia. En una realización de la presente invención, un cebador ARNm terapéutico, y un segundo ARNm terapéutico, pueden formularse en un único vehículo de transferencia y administración. La presente invención también contempla la administración conjunta y/o la administración conjunta de un cebador ARNm terapéutico y un segundo ácido nucleico para facilitar y/o mejorar la función o el suministro del cebador ARNm terapéutico. Por ejemplo, dicho segundo ácido nucleico (por ejemplo, ARNm exógeno o sintético) puede codificar una proteína transportadora de membrana que, al expresarse (por ejemplo, la traducción del ARNm exógeno o sintético) facilita el suministro o mejora de la actividad biológica del cebador ARNm. Alternativamente, el cebador ARNm terapéutico puede administrarse con un segundo ácido nucleico que funciona como una "chaperona", por ejemplo, para dirigir el plegamiento de cualquiera de los primeros ARNm terapéuticos.
[0033] También se contemplan métodos que permiten la administración de uno o mas ácidos nucléicos terapéuticos para el tratamiento de un único trastorno o deficiencia, es donde cada ácido nucleico terapéutico funciona como un mecanismo de acción diferente. Por ejemplo, las composiciones de la presente invención pueden comprender un cebador ARNm terapéutico que, por ejemplo, se administra para corregir una deficiencia de enzimas o proteínas endógenas, y que está acompañado por un segundo ácido nucleico, que se puede administrar para desactivar o “knock-down" un ácido nucleico endógeno que funciona mal y su producto proteico o enzimático. Tales "segundos" ácidos nucleicos pueden codificar, por ejemplo, ARNm o ARNip.
[0034] T ras la transfección, un ARNm natural en las composiciones de la invención puede decaer con una vida media de entre 30 minutos y varios días. El ARNm en las composiciones de la invención se traduce en una menor cantidad de capacidad para ser traducida, produciendo así una proteína o enzima secretada funcional. Por tanto, la invención se ha estabilizado. En algunas actividades de la invención, la actividad del ARNm se prolonga durante un período de tiempo prolongado. Por ejemplo, la actividad del ARNm puede prolongarse de tal manera que las composiciones de la presente publicación se administra de forma semanal o quincenal, o más preferiblemente mensual, bimensual, trimestral o anual. La actividad se prolonga durante el tiempo. De manera similar, la actividad de las composiciones de la presente invención puede extenderse o prolongarse adicionalmente mediante la modificación de la potencia del sistema de traducción. Además, la cantidad de proteína o enzima funcional producida por la célula diana es una función de la cantidad de ARNm administrada a las células diana y la estabilidad de dicho ARNm. En la medida en que la estabilidad del ARNm de la presente invención puede mejorar o aumentar la vida media, la actividad de la proteína o enzima secretada producida y la frecuencia de dosificación de la composición pueden extenderse adicionalmente.
[0035] En consecuencia, en algunas realizaciones, el ARNm en las composiciones de la invención comprenden al menos una modificación que otorga estabilidad aumentada o mejorada al ácido nucleico, incluyendo, por ejemplo, resistencia mejorada a la digestión de nucleasa in vivo. Como se usa en este documento, los términos "modificación" y "modificado" como tales términos se relacionan con los ácidos nucleicos proporcionados en este documento, incluyen al menos una alteración que mejoran la estabilidad y hace que el ARNm sea más estable (por ejemplo, resistente a la digestión con nucleasas. Como se usa en el presente documento, los términos "estable" y "estabilidad" se refieren a los ácidos nucleicos de la presente invención, y, en particular, con respecto a ARNm, se refieren a una resistencia aumentada o mejorada a la degradación por, por ejemplo, nucleasas (es decir, endonucleasas o exonucleasas) que normalmente son capaces de degradar dicho ARNm. El aumento de la estabilidad puede incluir, por ejemplo, menos sensibilidad a la hidrólisis u otra destrucción por parte de las enzimas endógenas (por ejemplo, endonucleasas o exonucleasas) o condiciones dentro de la célula o tejido diana, aumentar o mejorar la resistencia de dicho ARNm en la célula, tejido, sujeto y/o citoplasma diana. Las variables de ARNm están mejoradas en este documento. También contemplados por los términos "modificación" y "modificado", en la medida en que tales términos se relacionan con el ARNm de la presente invención, hay alteraciones que aumentan o mejoran la traducción de los ácidos nucleicos del ARNm, incluida, por ejemplo, la inclusión de secuencias que funcionan en el inicio de la traducción de proteína (por ejemplo, la secuencia de consenso de Kozac). (Kozak, M., Nucleic Acids Res 15 (20): 8125-48 (1987)).
[0036] En algunas partes, los ARNm de la invención han sido una forma química o biológica para hacerlos más estables. Las modificaciones de un ARN incluyen el agotamiento de una base o la modificación de una base, por ejemplo, la modificación química de una base. La frase "modificaciones químicas", como se usa en el presente documento, incluye modificaciones que se presentan en el ARNm natural, por ejemplo, modificaciones covalentes, como la introducción de nucleótidos modificados (por ejemplo, análogos de nucleótidos o la inclusión de grupos pendientes) que no se encuentran naturalmente en tales moléculas de ARNm).
[0037] Además, las modificaciones se adaptan a uno o más nucleótidos de un código de manera que el código codifica el mismo aminoácido pero es más estable que el código encontrado en la versión de tipo silvestre del ARNm. Por ejemplo, se ha demostrado una relación inversa entre la estabilidad del ARN y un mayor número de citidinas (C) y/o restos de uridinas (U), y se ha encontrado que el ARN sin residuos de C y U es estable para la mayoría de las RNasas (Heidenreich, et al., J Biol Chem 269, 2131-8 (1994)). En algunas ocasiones, se reduce el número de residuos C y/o U en una secuencia de ARNm. En otra realización, el número de residuos C y/o U se reduce mediante la sustitución de un código que codifica un aminoácido en particular otro código que codifica el mismo aminoácido o un aminoácido relacionado. Las modificaciones contempladas en los ácidos nucleicos del ARNm de la presente invención también incluyen la incorporación de pseudouridinas. La incorporación de las pseudouridinas en los ácidos nucleicos de la presente invención puede mejorar la estabilidad y la capacidad de traducción, así como disminuir la inmunogenicidad. en vivo. Ver, por ejemplo, Karikó, K., et al., Molecular Therapy 16 (11): 1833-1840 (2008). Las sustituciones y las modificaciones en el presente documento se pueden realizar mediante métodos fácilmente conocidos por un experto en la técnica.
[0038] Las limitaciones en la reducción del número de residuos de C y U en una secuencia probablemente será mayor en la región de codificación de un ARNm, en la comparación con una región no traducida, (es decir, es probable que no sea posible eliminar todos los residuos C y U presentes en el mensaje mientras que se conserva la capacidad del mensaje para codificar la secuencia de aminoácidos deseada). Sin embargo, la degeneración del código genético presenta una oportunidad para permitir que se reduzca el número de residuos C y/o que están presentes en la secuencia, mientras que se mantiene la misma capacidad de codificación (es decir, dependiendo del aminoácido que se codifica por un codón, pueden ser posibles varias posibilidades diferentes para la modificación de secuencias de ARN). Por ejemplo, los codones para Gly pueden modificarse a GGA o GGG en lugar de GGU o GGC.
[0039] El término modificación también incluye, por ejemplo, la incorporación de enlaces no nucleótidos o nucleótidos modificados en las secuencias de ARNm de la presente invención (por ejemplo, las modificaciones de uno o ambos extremos 3' y 5' de una molécula de ARNm que codifica una proteína o enzima secretada funcional). Tales modificaciones incluyen la adición de bases a una secuencia de ARNm (p. ej., la inclusión de una cola poli A o una cola poliA más larga), la alteración de la 3’ UTR o la 5' UTR, complejando el ARNm con un agente (por ejemplo, una proteína o una molécula de ácido nucleico complementario), e inclusión de elementos que cambian la estructura de una molécula de ARNm (por ejemplo, que forman estructuras secundarias).
[0040] Se piensa que la cola poli A estabiliza mensajeros naturales. Por lo tanto, en una realización, se puede agregar una larga cola de poli A a una molécula de ARNm, lo que hace que el ARNm sea más estable. Las colas de poli A se pueden agregar usando una variedad de técnicas reconocidas en la técnica. Por ejemplo, las cola de poli A largas se pueden contactar con ARNm transcritos sintéticos o in vitro utilizando polimerasa poli A (Yokoe, et al. Nature Biotechnology. 1996; 14: 1252-1256). Un vector de transcripción también puede codificar colas de poli A largas. Además, las colas de poli A se pueden agregar mediante transcripción directamente de los productos de PCR. En una realización, la longitud de la cola de poli A es de al menos aproximadamente 90, 200, 300, 400 al menos 500 nucleótidos. En una realización, la longitud de la cola de poli A se ajusta para controlar la estabilidad de una molécula de ARN modificada de la invención y, por lo tanto, la transcripción de la proteína. Por ejemplo, dado que la longitud de la cola de poli A puede influir en la vida media de una molécula de ARNm, la longitud de la cola de poli A se puede ajustar para modificar el nivel de la resistencia del ARNm a la hora de controlar el curso del tiempo de expresión de proteínas en una célula. En una realización, las moléculas de ARNm estabilizadas son suficientemente resistentes a la degradación in vivo (por ejemplo, por nucleasas), de modo que puedan administrarse a la célula diana sin un vehículo de transferencia.
[0041] En una realización, un ARNm puede modificarse mediante la incorporación de secuencias 3’ y/o 5' no traducidas (UTR) que no se encuentran naturalmente en el ARNm de tipo silvestre. En una realización, la secuencia flanqueante 3’ y/o 5' que flanquea naturalmente un ARNm y codifica una segunda proteína no se puede incorporar la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm que codifica una proteína terapéutica o funcional para modificarla. Por ejemplo, las secuencias 3’ o 5' de las moléculas de ARNm que son estables (por ejemplo, globina, actina, GAPDH, tubulina, histona o enzimas del ciclo del ácido cítrico) pueden incorporarse en la región 3’ y/o 5’ de una molécula de ácido nucleico de ARNm sentido para aumentar la estabilidad de la molécula de ARNm sentido. Véase, por ejemplo, US2003/0083272.
[0042] En algunas realizaciones, el ARNm en las composiciones de la invención incluye la modificación del extremo 5’ del ARNm para incluir una secuencia parcial del gen 1 (IE1) 1 (IE1) inmediato-temprano de CMV, o un fragmento del mismo (por ejemplo, SEQ ID NO: 1) para mejorar la resistencia a las nucleasas y/o mejorar la vida media del ARNm. Además de aumentar la estabilidad de la secuencia del ácido nucleico del ARNm, se ha descubierto y sorprendido la inclusión de una secuencia parcial del gen 1 (IE1) temprano de CMV y la expresión de la proteína o la enzima funcional. También se incluye la inclusión de una secuencia del gen de crecimiento humano (hGH), o un fragmento de la misma (por ejemplo, SEQ ID NO: 2) en los extremos 3’ del ácido nucleico (por ejemplo, el ARNm) para estabilizar aún más el ARNm. Generalmente, las modificaciones preferidas mejoran la estabilidad y/o las propiedades farmacocinéticas (por ejemplo, la vida media) del ARNm en relación con sus contrapartes no modificadas, e incluyen, por ejemplo, las modificaciones para mejorar la resistencia de dicho ARNm a digestión de nucleasas in vivo.
[0043] Además, se pueden ver las variantes de la secuencia del ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2, en las que se encuentran las funciones de los ácidos nucleicos que incluyen la estabilización del ARNm y/o propiedades farmacocinéticas (por ejemplo, vida media). Las variantes pueden tener más del 90%, más del 95%, más del 98% o más del 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2.
[0044] En algunas realizaciones, la composición puede comprender un reactivo estabilizador. Las composiciones pueden incluirse en uno o más reactivos de formulación que se enlazan de forma directa o indirecta, y estabilizan el ARNm, mejorando así el tiempo de residencia en la célula diana. Tales reactivos conducen preferiblemente a una vida mejorada del ARNm en las células diana. Por ejemplo, la estabilidad de un ARN y la eficiencia de la traducción se incrementan mediante la incorporación de "reactivos estabilizadores" que forman complejos con el ARN que se mantienen naturalmente dentro de una célula (ver, por ejemplo, la patente de EE.UU N° 5.677.124). La incorporación de un reactivo estabilizante se puede lograr, por ejemplo, combinando poli A y una proteína con el ARNm para estabilización in vitro antes de cargar o encapsular el ARNm dentro de un vehículo de transferencia. Los reactivos de estabilización se integran en una o más proteínas, péptidos, aptámeros, proteína accesoria de traducción, proteínas de unión a ARNm y/o factores de iniciación de la traducción.
[0045] La estabilización de las funciones también puede mejorarse mediante el uso de los restos inhibidores de la operación, que son adecuados, por ejemplo, mediante la interconexión de un anclaje soluble en lípidos en la membrana en sí, o por medio de la unión directa a grupos de lípidos de membrana). Estos polímeros hidrófilos que inhiben la opsonización forman una capa protectora que disminuye la captación de los liposomas del sistema de macrófagosmonocitos, monocitos y el sistema retículo endotelial (por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 4.920.016). Los vehículos de transferencia modificados con restos de inhibición de operación permanecen en la circulación mucho más tiempo que sus homólogos no modificados.
[0046] Cuando ARN se hibrida a una molécula de ácido nucleico complementaria (p. ej. ADN o ARN), se puede proteger de las nucleasas. (Krieg, et al. Melton. Methods in Enzymology. 1987; 155, 397-415). La estabilidad del ARN hibridado se debe probablemente a la especificidad inherente de una sola hebra de la mayoría de las RNasas. En algunas ocasiones, el reactivo de estabilización seleccionado para complejar un ARNm es una proteína eucariota (por ejemplo, una proteína de mamífero). En otra realización más, el ARNm puede modificarse por hibridación con una segunda molécula de ácido nucleico. Si una molécula de ARNm se hibridara con una molécula de ácido nucleico complementaria, la iniciación de la traducción se puede reducir. En algunas partes, la región no traducida 5’ y la región de inicio AUG de la molécula de ARNm pueden dejarse opcionalmente sin hibridar. T ras la iniciación de la traducción, la actividad de desarrollo del complejo ribosoma puede funcionar incluso en el dúplex de alta afinidad para que la traducción pueda continuar. (Liebhaber. J. Mol. Biol. 1992; 226: 2-13; Monia, et al. J Biol Chem. 1993; 268: 14514-22.)
[0047] Se entenderá que cualquiera de los métodos se ha utilizado en combinación con uno o más de los otros métodos y/o se pueden utilizar.
[0048] El ARNm de la presente invención puede combinarse opcionalmente con un gen reportero (por ejemplo, aguas arriba o hacia abajo de la región codificante del ARNm) que, por ejemplo, facilita la determinación de la administración del ARNm a las células o tejidos diana. Los genes se pueden incluir, por ejemplo, ARNm de proteína fluorescente verde, ARNm de luciferasa de Renilla (ARNm de luciferasa), ARNm de luciferasa de luciérnaga, o combinaciones de los mismosd. Por ejemplo, el ARNm de GFP se puede fusionar con un ARNm que codifica una proteína secretada para facilitar la confirmación de la localización del ARNm en las células diana que actúa como un depósito para la producción de proteínas.
[0049] Los términos "transfectar" o "transfección" se refieren a la introducción intracelular de un ARNm en una célula, o preferiblemente en una célula diana. El ARNm puede convertirse en una forma estable o transitoria en la célula diana. El término "eficiencia de transfección" se refiere a la cantidad relativa de ARNm captada por la célula diana que está sujeta a una transfección. En la práctica, la eficiencia de la transfección se estima por la cantidad de un producto de ácido nucleico informador expresado por las células diana después de la transfección. Las características preferidas se utilizan con las mismas eficacias de transfección y, en particular, se minimizan los efectos adversos que se producen mediante la transfección de células no diana. Las respuestas de la célula de diana, mientras que se minimizan los posibles efectos adversos sistémicos. En una realización de la presente invención, los vehículos de transferencia de la presente invención son los mismos que ARNm grandes (por ejemplo, ARNm de al menos 1 kDa, 1,5 kDa, 2 kDa, 2,5 kDa, 5kDa, 10kDa, 12kDa, 15kDa, 20kDa, 25kDa, 30kDa, o más). Liposomas como vehículos de transferencia de la invención encapsulan el ARNm sin comprometer la actividad biológica. En algunas realizaciones, el vehículo de transferencia demuestra una unión preferencial y/o sustancial a una célula diana con respecto a las células no diana. El vehículo de transferencia administra su contenido a la célula diana de manera que el ARNm se envía al compartimento subcelular apropiado, como el citoplasma.
Vehículo de transferencia
[0050] El vehículo de transferencia en las composiciones de la invención es un vehículo de transferencia liposomal que comprende una nanopartícula de lípidos. El vehículo de transferencia se puede seleccionar y/o preparar para optimizar el suministro del ARNm a una célula diana.
[0051] Los vehículos de transferencia liposomal se utilizan para facilitar la administración de ácidos nucleicos a células diana. Los liposomas (es decir, las nanopartículas lipídicas liposomales) son generalmente útiles en una variedad de aplicaciones en investigación, industria y medicina, en particular por su uso como vehículos de transferencia de compuestos diagnósticos o terapéuticos in vivo (Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998; Drummond et al., Pharmacol. Rev., 51: 691-743, 1999) y se caracteriza como vesículas microscópicas que tienen un espacio acuático interior de un medio exterior. Por una membrana de una o más bicapas. Las membranas bicapa de los liposomas están formadas de una manera específica, como los lípidos de origen sintético o natural que tienen dominios hidrófilos e hidrófobos separados espacialmente (Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998). Las membranas de las capas de los liposomas también pueden formarse por polímeros anfifílicos y surfactantes (por ejemplo, polimerosos, niosomas, etc.).
[0052] En el contexto de la presente invención, un vehículo de transferencia liposomal sirve para transportar el ARNm a la célula diana. Para los fines de la presente invención, los vehículos de transferencia liposomal se preparan para contener los ácidos nucleicos deseados. El proceso de incorporación de una entidad deseada (por ejemplo, un ácido nucleico) en un liposoma a menudo se denomina "carga" (Lasic, et al., FEBS Lett., 312: 255-258, 1992). La incorporación de un ácido nucleico en liposomas también se denomina en el presente documento "encapsulación" en la que el ácido nucleico está completamente dentro del espacio interior del liposoma. El propósito de incorporar un ARNm en un vehículo de transferencia, tal como un liposoma, a menudo es para proteger el ácido nucleico o un entorno que puede tener enzimas o sustancias químicas que degradan los ácidos nucleicos y/o los sistemas o receptores que causan la rápida excreción de los ácidos nucleicos. Por tanto, el vehículo de transferencia seleccionado es capaz de mejorar la estabilidad del ARNm contenido en el mismo. El liposoma puede permitir que el ARNm encapsulado alcance la célula diana y/o puede permitir preferiblemente que el ARNm encapsulado alcance la célula diana o, alternativamente, limitar el suministro de dicho ARNm a otros sitios o células donde la presencia del ARNm administrado puede ser inútil o indeseable. Además, la incorporación del ARNm en un liposoma catiónico también facilita el suministro de dicho ARNm en una célula diana.
[0053] De manera ideal, los vehículos de transferencia liposómica se preparan para encapsular uno o más ARNm deseados de manera que las composiciones demuestren una alta eficacia de transfección y una estabilidad mejorada. Si bien los liposomas pueden facilitar la introducción de los ácidos nucleicos en las células diana, la adición de policationes (por ejemplo, poli L-lisina y protamina), como un copolímero puede facilitar, y en algunos casos notablemente potencia la eficiencia de la transfección de varios tipos de liposomas catiónicos. por 2-28 veces en varias líneas celulares tanto in vitro como in vivo. (Ver NJ Caplen, y col., Gene Ther. 1995; 2: 603; S. Li, y col., Gene Ther.
1997; 4, 891.)
Nanopartículas lipídicas
[0054] En la presente invención, el vehículo de transferencia se formula como una nanopartícula de lípidos. Como se usa en el presente documento, la frase "nanopartícula lipídica" se refiere a un vehículo de transferencia que comprende uno o más lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos y lípidos modificados con PEG. Preferiblemente, las nanopartículas lipídicas se formulan para el suministro de uno o más ARNm a una o más células diana. Los ejemplos de lípidos adecuados incluyen, por ejemplo, los compuestos de fosfatidilo (por ejemplo, fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrosidos y gangliósidos). En una realización, el vehículo de la transferencia se selecciona en base a la capacidad para facilitar la transferencia de una célula diana.
[0055] La Invención contempla el uso de nanopartículas lipídicas como vehículos de transferencia que comprenden un lípido catiónico para encapsular y/o mejorar la administración de ARNm en la célula diana que actuará como un depósito para la producción de proteínas. Como se usa en este documento, la frase "lípido catiónico" se refiere a cualquiera de una serie de especies de lípidos que llevan una carga neta positiva y un pH seleccionado, como el pH fisiológico. Las nanopartículas lipídicas contempladas se preparan con mezclas de lípidos de múltiples componentes de proporciones variables empleando uno o más lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos y lípidos modificados con PEG. Se han descrito varios lípidos catiónicos en la literatura, muchos de los cuales están disponibles comercialmente.
[0056] Lípidos catiónicos particularmente adecuados para uso en las composiciones de la invención incluyen los descritos en la publicación de patentes internacional WO 2010/053572, y más particularmente, C12-200 descritos en el párrafo [00225] del documento WO 2010/053572. En ciertas respuestas, las composiciones de la invención emplean nanopartículas lipídicas que proporcionan un lípido catiónico ionizable se describen en la solicitud de patente provisional de eE.UU. 61/617,468, publicada el 29 de marzo de 2012, por ejemplo, (15Z, 18Z)-N,N-dimetilo-6-(9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-1-il)tetracosa-15,18-dien-1-amina (HGT5000), (15Z, 18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z, 12z)-octadeca-9, 12-dien-1-il)tetracosa-4,15,18-trien-1-amina (HGT5001) y (15Z, 18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)tetracosa-5,15,18-trien-1-amina (HGT5002).
[0057] En algunas partes, se usa el cloruro de lípido catiónico N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio o "DOTMA". (Felgner et al. (Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987); Patente de Estados Unidos N° 4.897.355). DOTMA puede formularse solo o puede combinarse con el lípido neutro, dioleoilfosfatidil-etanolamina o “DOPE” u otros lípidos catiónicos o no catiónicos en un vehículo de transferencia liposomal o una nanopartícula lipídica, y tales liposomas se pueden usar para mejorar el suministro de ácidos nucleicos a las células diana. Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen, por ejemplo, 5-carboxi-espermilglicinadioctadecilamida o "DOGS", 2,3-dioleiloxi-N-[2 (esperminacarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio o "DOSPA" (Behr et al. Proc. Nat.'1 Acad. Sci 86, 6982 (1989); Patente de Estados Unidos N° 5.171.678; Patente de Estados Unidos N° 5.334.761), 1,2-dioleoil-3-dimetilamonio-propano o "DODAP", 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano o "DOTAP". Los lípidos catiónicos contemplados también incluyen 1,2-diesteariloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DSDMA", 1,2-dioleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DODMA", 1,2- dilinoleiloxi -N,N-dimetil-3-aminopropano o "DLinDMA", 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DLenDMA", N-dioleil-N,N-dimetilamonio cloruro o "DODAC", N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio bromuro o "DDAB", N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietil amonio bromuro o "DMRIE", 3-dimetilamino-2-(colest-5-en-3-beta-oxibutan-4-oxi)-1-(cis,cis-9,12-octadecadienoxi)propano o "CLinDMA”, 2-[5'-(colest-5-en-3-betaoxi)-3’-oxapentoxi)-3-dimetil 1-1-(cis,cis-9', 1-2'-octadecadienoxi)propano o "CpLinDMA", N,N-dimetil-3,4-dioleiloxibencilamina o "DMOBA", 1,2-N,N’-dioleilcarbamil-3-dimetilaminopropano o "DOcarbDAP", 2,3-Dilinoleoiloxi-N,N-dimetilpropilamina o "DLinDAP", 1,2-N,N’-Dilinoleilcarbamil-3-dimetilaminopropano o "DLincarbDAP", 1,2-Dilinoleoycarbamil-3-dimetilaminopropano o "DLinCDAP", 2,2-Dilinoleil-4-dimetila-[1,3]-dioxolano o "DLin-K-DMA", 2.2- dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano o "DLin-K-XTC2-DMA", y 2-(2, 2-di((9z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)-1.3- dioxolan-4-il)-N,N-dimetiletanamina (DLin-KC2-DMA)) (Ver, WO 2010/042877; Semple et al., Nature Biotech.
28:172-176 (2010)), o mezclas de los mismos. (Heyes, J., et al., J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissey, DV, et al., Nat. Biotecnol. 23 (8): 1003-1007 (2005); Publicación PCT WO2005/121348A1).
[0058] El uso de lípidos catiónicos basados en colesterol también se contempla por la presente invención. Tales lípidos catiónicos en el colesterol pueden usarse solos o en la combinación con otros lípidos catiónicos o no catiónicos. Los lípidos catiónicos se basaron en el colesterol se incluyeron, por ejemplo, DC-Chol (N,N-dimetil-N-etilcarboxamidocolesterol), 1,4-bis(3-N-oleilamino-propil)piperazina (Gao, et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991); Wolf et al. BioTechiques 23, 139 (1997); Patente de los Estados Unidos N° 5.744.335), o ICE.
[0059] También se contemplan los lípidos catiónicos, tales como los lípidos basados en el dialquilamino, en el imántico y el guanidinio. Por ejemplo, ciertas partes están dirigidas a una composición que comprende uno o más lípidos catiónicos basados en imidazol, por ejemplo, el éster de colesterol imidazol o el lípido "ICE" (3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-dimetil-17-((R)-6-metilheptan-2-il)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo 3-(1 H-imidazol-4-il)propanoato, como se representa en la estructura (I) a continuación. En una realización preferida, un vehículo de transferencia para la administración de ARNm puede comprender uno o más lípidos catiónicos basados en imidazol, por ejemplo, el éster de colesterol imidazol o lípido "ICE" (3S, 10R, 13R,17R)-10, 13-dimetilo-17-((R)-6-metilheptan-2-il)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo 3-(1 H-imidazol-4-il)propanoato, como se representa por la estructura (I).
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Sin querer limitarse por ninguna teoría en particular, se creará la fusogenicidad del ICE lipídico catiónico basado en imidazol, se relacionará con la ruptura endosomal que se facilitará en el grupo imidazol, que tiene un pKa más bajo en relación con los lípidos catiónicos. La rotura endosómica a su vez promueve la inflamación osmótica y la rotura de la membrana liposomal, así como la transferencia intracelular de los contenidos de ácido nucleico(s) cargados en la célula diana.
[0060] Los lípidos catiónicos basados en imidazol también se caracterizan por su toxicidad reducida en relación con otros lípidos catiónicos. Los lípidos catiónicos basados en imidazol (por ejemplo, ICE) se pueden combinar con los lípidos catiónicos tradicionales, los lípidos no catiónicos y los lípidos modificados con PEG. El lípido catiónico puede comprender una relación molar de aproximadamente 1% a aproximadamente 90%, aproximadamente 2% a aproximadamente 70%, aproximadamente 5% a aproximadamente 50%, aproximadamente 10% a aproximadamente 40% del total de lípidos presentes en el vehículo de transferencia, o preferiblemente de aproximadamente 20% a aproximadamente 70% del total de lípidos presentes en el vehículo de transferencia.
[0061] Del mismo modo, ciertas formas de realización están dirigidas a nanopartículas lipídicas que comprenden el lípido catiónico HGT4003 2-((2,3-bis((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)propil)disulfanil)-N,N-dimetiletanamina, como se representa en la estructura (II) a continuación, y como se describe en la Solicitud Provisional de EE.UU. N°: 61/494,745, presentada el 8 de junio de 2011:
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[0062] En otras realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento están dirigidas a nanopartículas lipídicas que comprenden uno o más escindibles lípidos, tales como, por ejemplo, uno o más lípidos catiónicos o compuestos que comprenden un grupo funcional de disulfuro escindible (S-S) (por ejemplo, HGT4001, HGT4002, HGT4003, HGT4004 y HGT4005), como se describe en la Solicitud Provisional de EE.UU. N°: 61/494,745.
[0063] Los fosfolípidos modificados de polietilenglicol (PEG) y lípidos derivatizados tales como ceramidas derivatizadas (PEG-CER), incluyendo N-octanoil esfingosina-1-[succinil(metoxi polietilenglicol)-2000] (C8 PEG-2000 ceramida) se utilizaron de acuerdo con la invención, es decir, una nanopartícula lipídica. Lípidos modificados por PEG contemplados incluyen, pero no se limitan a una cadena de polietilenglicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido con cadena(s) alquilo de longitud de C6-C20. La adición de dichos componentes puede prevenir la agregación y también puede ser un medio para aumentar la vida útil de la circulación y aumentar el suministro de la composición del ácido lipídico-nucleico a la célula diana, (Klibanov y otros (1990) FEBS Cartas, 268 (1): 235-237), o pueden seleccionarse para intercambiar rápidamente fuera de la formulación in vivo (ver la patente de EE.UU. N° 5.885.613). Lípidos intercambiables para su uso son PEG-ceramidas que tienen cadenas de acilo más cortas (por ejemplo, C14 o C18). El fosfolípido modificado con PEG y los lípidos se derivan de la presente invención pueden ser una relación molar de aproximadamente 0% a aproximadamente 20%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 20%, aproximadamente 1% a aproximadamente 15%, aproximadamente 4% a aproximadamente 10%, aproximadamente el 2% del total de lípidos presentes en el vehículo de transferencia liposomal.
[0064] La presente invención también utiliza lípidos no catiónicos. Como se usa en el presente documento, la frase "lípido no catiónico" se refiere a cualquier lípido neutro, zwitteriónico o aniónico. Como se usa en el presente documento, la frase "lípido aniónico" se refiere a cualquiera de una serie de especies de lípidos que llevan una carga neta negativa a un pH seleccionado, como el pH fisiológico. Los lípidos no catiónicos incluyen, pero no se limitan a distearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina (POPE), dioleoilfosfatidiletanolamina 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (DOPE-mal), dipalmitoilfosfatidil etanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), distearoil-fosfatidietanolamina (SOPE), colesterol, o una mezcla de los mismos. Tales lípidos no catiónicos se utilizan en combinación con los otros excipientes, incluidos los lípidos catiónicos. Utilizado en combinación con un lípido catiónico, el lípido no catiónico puede comprender una relación molar de 5% a aproximadamente 90%, o preferiblemente aproximadamente 10% a aproximadamente 70% del total de lípidos presentes en el vehículo de transferencia.
[0065] Preferiblemente, el vehículo de transferencia (es decir, una nanopartícula lipídica) se prepara combinando múltiples componentes lipídicos (y opcionalmente polímeros). Por ejemplo, un vehículo de transferencia puede prepararse utilizando C12-200, dOpE, chol, DMG-PEG2K en una relación molar de 40:30:25:5, o DODAP, DoPE, colesterol, DMG-PEG2K en una relación molar de 18:56:20:6, o HGT5000, DOPE, chol, DMG-PEG2K en una relación molar de 40:20:35:5, o HGT5001, DOPE, chol, DMG-PEG2K en una relación molar de 40:20:35:5. La selección de lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos y lípidos modificados con PEG que mantiene la nanopartícula lipídica, así como la relación molar relativa de dichos lípidos entre sí, se basa en las características de los lípidos seleccionados, la naturaleza de las células diana deseadas, y las características del ARNm que debe administrarse. Consideraciones adicionales incluyen, por ejemplo, la saturación de la cadena de alquilo, así como el tamaño, la carga, el pH, pKa, la fusogenicidad y la toxicidad de los lípidos seleccionados. Por lo tanto, las relaciones molares se pueden ajustar en función. Por ejemplo, en decir, el porcentaje de lípido catiónico en la nanopartícula lipídica puede ser mayor que 10%, mayor que 20%, mayor que 30%, mayor que 40%, mayor que 50%, mayor que 60% o mayor que 70 %. El porcentaje de lípidos no catiónicos en la nanopartícula lipídica puede ser mayor que 5%, mayor que 10%, mayor que 20%, mayor que 30% o mayor que 40%. El porcentaje de colesterol en la nanopartícula lipídica puede ser superior al 10%, superior al 20%, superior al 30% o superior al 40%. El porcentaje de lípidos modificados con PEG en la nanopartícula lipídica puede ser mayor que 1%, mayor que 2%, mayor que 5%, mayor que 10%, o superior al 20%.
[0066] En ciertas partes preferidas, las nanopartículas lipídicas de la misma manera se reducen a los futuros lípidos catiónicos: C12-200, Dlin-KC2-DMA, DODAP, HGT4003, ICE, HGT5000, o HGT5001. En las realizaciones, el vehículo de transferencia comprende colesterol y un lípido modificado con PEG. En algunas ocasiones, los vehículos de transferencia comprenden DMG-PEG2K. En ciertas realizaciones, el vehículo de transferencia comprende una de las siguientes formulaciones de lípidos: C12-200, DOPE, col, DMG-PEG2K; DODAP, DOPE, colesterol, DMG-PEG2K; HGT5000, DOPE, col, DMG-PEG2K, HGT5001, DOPE, col, DMG-PEG2K.
[0067] Los vehículos de transferencia liposomal para uso en las composiciones de la invención pueden prepararse mediante diversas técnicas que se conocen actualmente en la técnica. Las vesículas multilamelares (MLV) pueden prepararse mediante técnicas, por ejemplo, depositar un lípido seleccionado en el muro interior de un recipiente adecuado o contenedor al disolver el lípido en un solvente adecuado, y luego evaporar el solvente para dejar una película fina del interior del recipiente o por secado por pulverización. Luego, se puede agregar una fase para el recipiente con un movimiento de video que resulta en la formación de MLV. Las vesículas unilamelares (ULV) pueden entonces formarse por homogeneización, sonicación o extrusión de las vesículas multilamelares. Además, las vesículas unilamelares pueden formarse mediante técnicas de eliminación de detergentes.
[0068] En ciertas realizaciones de esta descripción, las composiciones de la presente invención comprenden un vehículo de transferencia en el que el ARNm está asociado tanto en la superficie del vehículo de transferencia y encapsulado dentro del mismo vehículo de transferencia. Por ejemplo, durante la preparación de las composiciones, los vehículos de transferencia liposomal catiónicos pueden asociarse con el ARNm a través de interacciones electrostáticas.
[0069] En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden cargarse con radionúclidos de diagnóstico, materiales fluoroescentes u otros materiales que son detectables en aplicaciones tanto in vitrovcomo in vivo. Por ejemplo, los materiales de diagnóstico adecuados para su uso en la presente invención pueden incluir rodaminadioleoilfosfatidiletanolamina (Rh-PE), ARNm de proteína fluorescente verde (ARNm de GFP), ARNm de luciferasa de Renilla y ARNm de luciferasa de luciérnaga.
[0070] La selección del tamaño apropiado de un vehículo de transferencia liposomal debe tener en cuenta el sitio de la célula o tejido diana y, en cierta medida, la aplicación para la cual se está realizando el liposoma. En algunas realizaciones, puede ser deseable limitar la transfección del ARNm a ciertas células o tejidos. Un vehículo de transferencia liposomal puede dimensionarse de modo que las dimensiones del liposoma tengan un diámetro suficiente para limitar o evitar expresamente la distribución en ciertas células o tejidos. En general, el tamaño del vehículo de transferencia está dentro del rango de aproximadamente 25 a 250 nm, preferiblemente menos de aproximadamente 250 nm, 175 nm, 150 nm, 125 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm, 25 nm o 10 nm.
[0071] Una variedad de métodos alternativos conocidos en la técnica están disponibles para dimensionar una población de vehículos de transferencia liposomal. Uno de tales métodos de dimensionamiento se describe en la patente de EE.UU. N° 4.737.323. La sonicación de una suspensión de liposomas, ya sea por baño o sonda, produce una reducción progresiva del tamaño hasta un ULV pequeño de menos de aproximadamente 0,05 micrones de diámetro. La homogeneización es otro método que se basa en la energía de cizallamiento para fragmentar los liposomas grandes en otros más pequeños. En un procedimiento de homogeneización típico, los MLV se recirculan a través de un homogeneizador de emulsión estándar hasta que se observan tamaños de liposomas seleccionados, típicamente entre aproximadamente 0,1 y 0,5 micrones. El tamaño de las vesículas liposómicas se puede determinar mediante dispersión de luz casi eléctrica (QELS) como se describe en Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10: 421-450 (1981). El diámetro promedio de los liposomas puede reducirse por sonicación de los liposomas formados. Los ciclos de ultrasonidos intermitentes se pueden alternar con la evaluación QELS para guiar la síntesis eficiente de liposomas.
Células diana
[0072] Tal como se utiliza aquí, el término "célula diana" se refiere a una célula o tejido al que se dirige una composición de la invención. En algunas realizaciones, las células diana son deficientes en una proteína o enzima de interés.
[0073] En una realización, las composiciones de la invención facilitan la producción endógena de un sujeto de una o más proteínas y/o enzimas funcionales, y en particular la producción de proteínas y/o enzimas que demuestran menos inmunogenicidad en relación con sus contrapartes preparadas de forma recombinante. Los vehículos de transferencia comprenden ARNm que codifica una proteína o enzima deficiente. Tras la distribución de dichas composiciones a los tejidos diana y la posterior transfección de dichas células diana, el ARNm exógeno cargado en el vehículo de transferencia liposomal (es decir, una nanopartícula lipídica) puede traducirse in vivo para producir una proteína o enzima funcional codificada por el ARNm administrado de forma exógena (por ejemplo, una proteína o enzima en la que el sujeto es deficiente). Por lo tanto, las composiciones de la presente invención explotarán la capacidad de un sujeto para el uso de ARNm preparado de forma exógena o recombinante para producir una proteína o enzima traducida de una forma endógena, y de este modo producir (y cuando sea aplicable excretar) una proteína o enzima funcional. Las proteínas o enzimas se traducen también se pueden caracterizar por la inclusión in vivo de modificaciones post-traductoras nativas que a menudo se encuentran ausentes en proteínas o enzimas preparadas de forma recombinante, lo que reduce aún más la inmunogenicidad de la proteína o enzima traducida.
[0074] La administración de ARNm que codifica una proteína o enzima deficiente evita la necesidad de administrar los ácidos nucléicos a orgánulos específicos dentro de una célula diana (por ejemplo, las mitocondrias). Más bien, la transferencia de una célula diana y el suministro de los ácidos nucleicos al citoplasma de la célula diana, los contenidos del ARNm de un vehículo de transferencia pueden traducirse y expresarse una proteína o enzima funcional.
[0075] Según se proporciona aquí, la composición puede comprender también la capacidad de mejorar la composición de la célula diana. Los ligandos dirigidos pueden unirse a la bicapa externa de la partícula lipídica durante la formulación o postformulación. Estos métodos son bien conocidos en la técnica. Además, algunas formulaciones departículas lipídicas pueden emplear polímeros fusogénicos como PEAA, hemagluttinina, otros lipopéptidos (ver los Números de Solicitud de Patente de EE.UU. 08/835.281 y 60/083.294) y otras características útiles para la administración in vivo y/o intracelular. En otras realizaciones, las composiciones de la presente invención demuestran eficacias de transfección mejoradas, y/o demuestran selectividad mejorada hacia las células diana o tejidos de interés. Por lo tanto, se pueden ver en qué consiste uno o más ligandos (p. ej., péptidos, aptámeros, oligonucleótidos, una vitamina u otra) que son capaces de mejorar la afinidad de las mismas y los contenidos del ácido nucleico para las células o tejidos diana. Los ligandos pueden unirse o enlazarse opcionalmente a la superficie del vehículo de transferencia. En algunas realizaciones, el ligando diana puede abarcar la superficie de un vehículo de transferencia o estar encapsulado dentro del vehículo de transferencia. Los ligandos se adaptan y se seleccionan en función de sus propiedades físicas, químicas y biológicas (por ejemplo, la afinidad selectiva y/o el reconocimiento de los marcadores de las características de la superficie celular diana). Los sitios diana específicos a las células y su correspondiente ligando diana pueden variar ampliamente. Los ligandos de dirección se seleccionan de manera que se explotan las características de una célula diana, lo que permite que la composición diferencie entre las células diana y no diana. La presentación de dichos ligandos dirigidos que se han conjugado a los restos presentes en el vehículo de transferencia (es decir, una nanopartícula lipídica) facilitan, por lo tanto, el reconocimiento y la captación de las características de la presente invención en las células y los tejidos diana. Los ejemplos de ligandos dirigidos se convierten en uno o más péptidos, proteínas, aptámeros, vitaminas y oligonucleótidos.
Aplicación y Administración
[0076] Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamífero), incluyendo, pero no limitado a, seres humanos, primates no humanos, roedores, y similares, a los que se administran las composiciones de la invención. Típicamente, los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en el presente documento en referencia a un sujeto humano.
[0077] Las composiciones de la invención proporcionan la administración de ARNm para tratar una serie de trastornos. Las composiciones de la presente invención son adecuadas para el tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con la deficiencia de proteínas y/o enzimas que son excretadas o secretadas por la célula diana al líquido extracelular circundante (p. ej., ARNm que codifica hormonas y neurotransmisores). En el caso, la enfermedad puede implicar un defecto o deficiencia en una proteína secretada (por ejemplo, enfermedad de Fabry, o ALS). Los síntomas de una enfermedad pueden mejorarse en las composiciones de la invención (por ejemplo, fibrosis quística). Los trastornos para la salud de Huntington; Enfermedad de Parkinson; distrofias musculares (como, por ejemplo, Duchenne y Becker); enfermedades hemofélicas (tales como, por ejemplo, hemofilia B (FIX), hemofilia A (FVIII), atrofia del músculo espinal relacionada con SMN1 (SMA), esclerosis lateral amiotrófica (ALS), galactosemia con GALT, fibrosis quística (FQ); trastornos relacionados con SLC3A1 que incluyen cistinuria; los trastornos relacionados con el cáncer; deficiencias de galactocerebrosidasa; adrenoleucodistrofia y adrenomieloneuropatía ligadas al X; la ataxia de Friedreich; Enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher; TSC1 y esclerosis tuberosa relacionada con TSC2; Síndrome de Sanfilippo B (MPS IIIB); Cistinosis relacionada con CTNS; los trastornos relacionados con la FMR1 que incluyen el síndrome de X frágil, el síndrome de temblor/ataxia asociado con X frágil y el síndrome de insuficiencia ovárica prematura de X frágil; Síndrome de Prader-Willi; telangiectasia hemorrágica hereditaria (AT); Enfermedad de Niemann-Pick tipo C1; Las enfermedades relacionadas con la lipofuscinosis ceroide neuronal, incluyendo la lipofuscinosis ceroide neuronal juvenil (JNCL),la enfermedad de Batten juvenil, la enfermedad de Santavuori-Haltia, la enfermedad de Jansky-Bielschowsky y las deficiencias de PTT-1 y TPP1; EIF2B1, EIF2B2, EIF2B3, Ataxia infantil relacionada con EIF2B4 y EIF2B5 con hipomielinización/desaparición de la sustancia blanca del sistema nervioso central; Ataxia Episódica Tipo 2 se relaciona con CACNA1A y CACNB4; los trastornos relacionados con MECP2, incluido el síndrome de Rett clásico, la encefalopatía neonatal grave relacionada con MECP2 y el síndrome PPM-X; síndrome de Rett atípico relacionado con CDKL5; Enfermedad de Kennedy (SBMA); Arteriopatía autosómica dominante cerebral relacionada con Notch-3 con infartos subcorticales y leucoencefalopatía (CADASIL); trastornos de las convulsiones relacionadas con SCN1A y SCN1B; los trastornos relacionados con la Polimerasa G, que incluyen el síndrome de Alpers-Huttenlocher, la neuropatía atáxica sensorial relacionada con la POLG, la disartria y la oftalmoparesia, y la oftalmopoplejía externa progresiva autosómica dominante y recesiva con deleciones mitocondriales de ADN; Hipoplasia suprarrenal ligada a X; Agammaglobulinemia ligada al X; Enfermedad de Wilson; y la enfermedad de Fabry. El ARNm de la invención puede codificar proteínas o enzimas funcionales que se secretan en el espacio extracelular. Por ejemplo, las proteínas secretadas incluyen factores de coagulación, componentes de la vía del complemento, citoquinas, quimiocinas, quimioatrayentes ,hormonas proteicas (p. ej., EGF, PDF), componentes proteicos del suero, anticuerpos, receptores secretables, y otros. En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención pueden incluir ARNm que codifica eritropoyetina, a1-antitripsina, carboxipeptidasa N u hormona de crecimiento humana.
[0078] En realizaciones, la invención codifica una proteína secretada que está formada por subunidades que están codificadas por más de un gen. Por ejemplo, la proteína secretada puede ser un heterodímero, en donde cada cadena o subunidad está codificada por un gen separado. Es posible que más de una molécula de ARNm se administre en el vehículo de transferencia y el ARNm codifique una subunidad separada de la proteína secretada. Alternativamente, un solo ARNm puede diseñarse para codificar más de una subunidad (por ejemplo, en el caso de un anticuerpo Fv de cadena única). En ciertas realizaciones, las moléculas de ARNm separadas que codifican las subunidades individuales pueden administrarse en vehículos de transferencia separados. En una realización, el ARNm puede codificar anticuerpos de longitud completa (tanto cadenas pesadas como ligeras de las regiones variables y constantes) o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, Fv, o una cadena única Fv (scFv) para conferir inmunidad a un sujeto. En otras realizaciones, la proteína secretada es una citoquina u otra proteína secretada que comprende más de una subunidad (por ejemplo, IL-12 o IL-23).
[0079] Las composiciones de la invención se pueden administrar a un sujeto. En algunas realizaciones, la composición se formula en combinación con uno o más ácidos nucleicos, portadores, ligandos dirigidos o reactivos estabilizantes adicionales, o en composiciones farmacológicas donde se mezcla con excipientes adecuados. Por ejemplo, en una realización, las composiciones de la invención pueden prepararse para suministrar ARNm que codifica dos o más proteínas o enzimas distintas. Las técnicas para la formulación y administración de medicamentos se pueden encontrar en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pensilvania, última edición. Las composiciones de la presente invención pueden administrarse y dosificarse de acuerdo con la práctica médica actual, teniendo en cuenta el estado clínico del sujeto, el sitio y el método de administración, la programación de la administración, la edad del sujeto, el sexo, el peso corporal y otros factores relevantes para los médicos de experiencia ordinaria en la técnica. La "cantidad efectiva" para los fines de este documento puede determinarse por las consideraciones relevantes que conocen los expertos en práctica clínica experimental, técnicas de investigación, farmacológica, clínica y médica. En algunas realizaciones, la cantidad administrada es efectiva para lograr al menos cierta estabilización, mejoría o eliminación de los síntomas y otros indicadores que se seleccionan como medidas apropiadas de progreso, regresión o mejora de la enfermedad por los expertos en la técnica. Por ejemplo, una cantidad adecuada y un régimen de dosificación es uno que causa al menos la producción de proteínas transitorias. Los aerosoles que contienen composiciones de la presente invención se pueden inhalar (para administración nasal, traqueal o bronquial).
[0080] En una realización, las composiciones de la invención se formulan de manera que sean adecuadas para la liberación prolongada del ARNm contenido en las mismas. Dichas composiciones de liberación prolongada pueden administrarse convenientemente a un sujeto a intervalos de dosificación prolongados. Por ejemplo, en una realización, las composiciones de la presente invención se administran a un sujeto dos veces al día, diariamente o cada dos días. En una realización preferida, las composiciones de la presente invención se administran a un sujeto dos veces a la semana, una vez a la semana, cada diez días, cada dos semanas, cada tres semanas, o más preferiblemente cada cuatro semanas, una vez al mes, cada seis semanas, cada ocho semanas, cada dos meses, cada tres meses, cada cuatro meses, cada seis meses, cada ocho meses, cada nueve meses o anualmente. Preferiblemente, los medios de liberación prolongada empleados se combinan con las modificaciones realizadas en el ARNm para mejorar la estabilidad.
[0081] También se contemplan en esta invención composiciones farmacéuticas liofilizadas que comprenden una o más de las nanopartículas liposomales descritas en este documento y métodos relacionados para el uso de tales composiciones liofilizadas tal como se describe por ejemplo en la Solicitud Provisional de EE.UU. N° 61/494.882, presentada el junio 8, 2011. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas liofilizadas de acuerdo con la invención se pueden reconstituir antes de la administración o se pueden reconstituir in vivo. Por ejemplo, una composición farmacéutica liofilizada de la divulgación puede formularse en una forma de dosificación apropiada y administrarse de manera que la forma de dosificación se rehidrate con el tiempo in vivo por los fluidos corporales del individuo.
[0082] Mientras que ciertos compuestos y composiciones de la presente invención se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven solamente para ilustrar los compuestos de la invención y no están destinados a limitar la misma.
[0083] Los artículos "un" y "una", tal como se utilizan en la presente memoria descriptiva, a menos que se indique claramente lo contrario, deben entenderse como los referentes plurales. Las descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran cumplidas si uno, más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes, empleados o de otro modo relevantes para un producto o proceso dado, a menos que se indique lo contrario o sea de otro modo evidente desde el contexto. Cuando los elementos se presentan como listas (por ejemplo, en el grupo de Markush o en un formato similar), debe entenderse que cada subgrupo de los elementos también se revela, y cualquier elemento puede ser eliminado del grupo. Debe entenderse que, en general, cuando se hace referencia a la invención, o aspectos de la invención, que comprenden particulares elementos, características, etc., ciertas realizaciones de la invención o los aspectos de la invención consisten, o consisten esencialmente de tales elementos, carácterísticas, etc. Con fines de simplicidad, estas realizaciones no se han expuesto específicamente en cada caso en tantas palabras en este documento.
EJEMPLOS
Ejemplo comparativo 1: Depósito de producción de proteínas mediante administración intravenosa de composiciones polinucleotídicas
ARN mensajero
[0084] La eritropoyetina humana (EPO) (SEQ ID NO: 3; FIG. 3), alfa-galactosidasa humana (GLA) (SEQ ID NO: 4;
FIG. 4), antitripsina alfa-1 humana (A1AT) (SEQ ID NO: 5; la FlG. 5) y el factor IX humano (FIX) (SEQ ID NO: 6; FIG.
6) se sintetizaron mediante transcripción in vitro de una plantilla de ADN plasmídica que codifica el gen, que fue seguida de la adición de una estructura de la tapa 5’ (Cap1) (Fechter & Brownlee, J. Gen. Virology 86: 1239-1249 (2005)) y una cola 3’ poli (A) de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud, según lo determinado por electroforesis en gel. Las regiones no traducidas de 5’ y 3' están presentes en cada producto de ARNm en los siguientes ejemplos y están definidas por las SEQ ID NO: 1 y 2 (FlG. 1 y la FlG. 2) respectivamente.
Formulaciones de nanopartículas lipídicas.
[0085] Formulación 1: alícuotas de 50 mg/ml de soluciones etanólicas de C12-200, DOPE, Col y DMG-PEG2K (40: 30: 25: 5) se mezclaron y se diluyeron con etanol para un volumen final de 3 ml. Por separado, se preparó una solución acuosa tamponada (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm a partir de una reserva de 1 mg/ml. La solución lipídica se inyectó rápidamente en la solución de ARNm para que no se produzca una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de las nanopartículas se filtró, se diafiltró con 1x PBS (pH 7,4), se concentó y se almacenó a 2-8°C.
[0086] Formulación 2: alícuotas de 50 mg/ml de soluciones etanólicas de DODAP, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K (18:56:20:6) se mezclaron y se diluyeron con etanol para volumen final de 3 ml. Por separado, se preparó una solución tamponada (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm de EPO a partir de una reserva de 1 mg/ml. La solución lipídica se inyectó rápidamente en la solución de ARNm para que no se produzca una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de las nanopartículas se filtra, se diafiltró con 1x PBS (pH 7,4), se concentó y se almacenó a 2-8°C. Concentración final = 1,35 mg/ml de ARNm de EPO (encapsulado). Z ave — 75,9 nm (Dv(50) — 57,3 n^ n> Dv(90) — 92,1 nm).
[0087] Formulación 3: alícuotas de 50 mg/ml de soluciones etanólicas de HGT4003, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K (50:25:20:5) se mezclaron y se diluyeron con etanol para volumen final de 3 ml. Por separado, se preparó una solución acuosa tamponada (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm a partir de una reserva de 1 mg/ml. La solución lipídica se inyectó rápidamente en la solución de ARNm para que no se produzca una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de las nanopartículas se filtra, se diafiltró con 1x PBS (pH 7,4), se concentó y se almacenó a 2-8°C.
[0088] Formulación 4: alícuotas de 50 mg/ml de soluciones etanólicas de ICE, DOPE y DMG-PEG2K (70:25:5) se mezclaron y se diluyeron con etanol para volumen final de 3 ml. Por separado, se preparó una solución acuosa tamponada (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm a partir de una reserva de 1 mg/ml. La solución lipídica se inyectó rápidamente en la solución de ARNm para que no se produzca una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de las nanopartículas se filtró, se diafiltró con 1x PBS (pH 7,4), se concentó y se almacenó a 2-8°C.
[0089] Formulación 5: alícuotas de 50 mg/ml de soluciones etanólicas de HGT5000, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K (40:20:35:5) se mezclaron y se diluyeron con etanol para volumen final de 3 ml. Por separado, se preparó una solución de tamponada (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm de EPO a partir de una reserva de 1 mg/ml. La solución lipídica se inyectó rápidamente en la solución de ARNm para que no se produzca una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de las nanopartículas se filtró, se diafiltró con 1x PBS (pH 7,4), se concentó y se almacenó a 2-8°C. Concentración final — 1,82 mg/ml de ARNm de EPO (encapsulado). Zave — 105,6 nm (Dv (50) — 53,7 nm; Dv(90) — 157 nm).
[0090] Formulación 6: Se mezclaron alícuotas de soluciones etanólicas de 50 mg/ml de HGT5001, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K (40:20:35:5) y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, se preparó una solución tamponada (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm de EPO a partir de una reserva de 1 mg/ml. La solución lipídica se inyectó rápidamente en la solución de ARNm para que no se produzca una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de las nanopartículas se filtró, se diafiltró con 1x PBS (pH 7,4), se concentó y se almacenó a 2-8°C.
Análisis de la proteína producida a través de un protocolo de inyección de nanopartículas cargadas de ARNm administradas por vía intravenosa
[0091] Los estudios se realizaron utilizando ratones CD-1 machos de aproximadamente 6-8 semanas de edad al comienzo de cada experimento, a menos que se indique lo contrario. Las muestras se introdujeron mediante una sola inyección en la vena de la cola de una dosis total equivalente a 30-200 microgramos de ARNm encapsulado. Los ratones se sacrificaron y se perfundieron con la solución salina en los puntos de tiempo designados.
Aislamiento de tejidos orgánicos para análisis.
[0092] El hígado y el bazo de cada ratón se cosechó, se repartió en tres partes, y se almacenó en cualquiera de 10% de formalina tamponada neutra o complemento congelados y almacenados a -80°C para el análisis.
Aislamiento de suero para análisis.
[0093] Todos los animales fueron sacrificados por asfixia de CO2 a 48 horas después de la administración post dosis (± 5%) seguida por toracotomía y recogida de sangre cardíaca terminal. Se recogió la sangre completa (volumen máximo obtenible) por medio de la punción cardíaca en animales sacrificados en tubos separadores de suero, que se permiten coagular a temperatura ambiente durante menos de 30 minutos, se centró a 22°C ± 5°C a 9300 g por 10 minutos, y suero extraido. Para las recogidas de sangre provisionales, se reconocen aproximadamente 40-50 gl de sangre completa mediante punción de la vena facial o corte de cola. Las muestras de animales sin tratamiento se utilizan como referencia para la comparación con los animales de estudio.
Análisis de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
[0094] EPO ELISA: se realizó la cuantificación de la proteína EPO siguiendo los procedimientos reportados para el kit de ELISA de EPO humana (Quantikine IVD, R&D Systems, n° de catálogo Dep-00). Los controles positivos empleados consistieron en proteína eritropoyetina humana recombinante y grado de cultivo tisular (R&D Systems, número de catálogo 286-EP y 287-TC, respectivamente). La detección se controla mediante la absorción (450 nm) en un instrumento Molecular Device Flex Station.
[0095] GLA ELISA: se emplearon los procedimientos ELISA estándar utilizando anti-alfa-galactosidasa de oveja G-188 IgG de como anticuerpo de captura con anti-alfa-galactosidasa de conejo TK-88 IgG como el anticuerpo secundario (de detection) (Shire Human Genetic Therapies). Se utilizó IgG anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) para la activación de la solución de sustrato 3,3’,5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). La reacción se inactivó usando 2N H2SO4 después de 20 minutos. La detección se controla mediante la absorción (450 nm) en un instrumento Molecular Device Flex Station. Se utilizaron los medios de comunicación negativos y positivos, respectivamente.
[0096] FIX ELISA: se realizó la cuantificación de la proteína FIX siguiendo los procedimientos reportados para el kit FIX ELISA humano (AssayMax, Ensayo Pro, Catalog # EF1009-1). A1ATELISA: La cuantificación de la proteína A1AT se realizó siguiendo los procedimientos informados para el kit ELISA A1AT humano (Innovative Research, Catálogo N2 IRAPKT015).
Análisis de la transferencia Western
[0097] (EPO): análisis de transferencia Western se realizaron utilizando un anticuerpo anti-hEPO (R&D Systems N° MAB2871) y proteína EPO humana ultrapura (R&D Systems N° 286-EP) como control.
Resultados
[0098] El trabajo descrito en este ejemplo demuestra el uso de nanopartículas lipídicas encapsuladas con ARNm como una fuente de depósito para la producción de proteína. Dicho efecto de depósito puede lograrse en múltiples sitios dentro del cuerpo (es decir, hígado, riñón, bazo y músculo). La medición de la proteína exógena deseada derivada del ARN mensajero administrado a través de nanopartículas liposomales se logró y cuantificó, y la secreción de proteína de un depósito con eritropoyetina humana (hEPO), alfa-galactosidasa humana (hGLA), antitripsina alfa-1 humana (hA1AT), y se demostró el ARNm del factor iX humano (hFIX).
1A. Resultados de la producción de proteínas in vivo de la EPO humana
[0099] La producción de la proteína hEPO se demostró con diversas formulaciones de nanopartículas lipídicas. De cuatro sistemas lipídicos catiónicos diferentes, las nanopartículas lipídicas basadas en C12-200 produjeron la mayor cantidad de proteína hEPO después de cuatro horas después de la administración intravenosa según lo medido por ELISA (la FIG. 7). Esta formulación (Formulación 1) resultó en 18,3 ug/mL de proteína hEPO secretada en el torrente sanguíneo. Los niveles normales de proteína hEPO en suero para humanos son 3,3-16,6 mlU/ml (Documento NCCLS C28-P; Vol. 12, No. 2). Basado en una actividad específica de 120.000 Ul/mg de proteína EPO, que produce una cantidad de 27,5-138 pg/mL de proteína hEPO en individuos humanos normales. Por lo tanto, una dosis única de 30 gg de una formulación lipídica catiónica basada en C12-200- que encapsula el ARNm de hEPO produjo un aumento en la proteína respectiva de niveles fisiológicos de más de 100.000 veces.
[0100] De los sistemas lipídicos ensayadas, la formulación de nanopartículas de lípidos basados en DODAP fue el menos eficaz. Sin embargo, la cantidad observada de la proteína EPO humana derivada del suministro a través de una nanopartícula lipídica basada en DODAP que encapsula el ARNm de EPO fue de 4,1 ng/ml, que aún es más de 30 veces superior a los niveles fisiológicos normales de la proteína EPO (Tabla 1).
Tabla 1. Valores crudos de proteína HEPO secretada para varios sistemas de nanopartículas catiónicas basadas en lípidos según lo medido mediante análisis ELISA (como se muestra en la FIG. 8). Las dosis se basan en el ARNm de hEPO encapsulado. Los valores de la proteína se representan como nanogramos de la proteína EPO humana por mililitro de suero. Los cambios en el hematocrito se basan en la comparación del sangrado previo (Día -1) y el Día
10.
Figure imgf000018_0001
[0101] Además, la proteína resultante se ensayó para determinar si estaba activa y funcionó correctamente. En el caso de la terapia de reemplazo de ARNm (MRT) que emplea ARNm de hEPO, los cambios en el hematocrito se controlan durante un período de diez días para cinco formulaciones de nanopartículas de lípidos diferentes (Figura 8, Tabla 1) para evaluar la actividad de la proteína. Durante este período de tiempo, dos de las cinco formulaciones demostraron el aumento del hematocrito (>15%), lo que es indicativo de la producción de la proteína hEPO activa a partir de dichos sistemas.
[0102] En otro experimento, los cambios del hematocrito fueron monitorizados durante un período de 15 días (FIG. 9, Tabla 2). La formulación de nanopartículas de lípidos (Formulación 1) se administró como una sola dosis de 30 pg, o como tres pequeñas dosis de 10 pg inyectadas en el día 1, día 3 y día 5. Del mismo modo, la Formulación 2 se administró como 3 dosis de 50 (pg en el día 1, día 3 y el día 5. C12-200 produjó un aumento significativo en el hematocrito. en general, se observó un aumento de cambio de hasta ~25%, que es indicativo de la proteína activa EPO humana que se produce a partir de tales sistemas.
Tabla 2 Niveles de hematocrito de cada grupo durante un período de observación de 15 días (FIG. 9). A los ratones se les administró una inyección única o tres inyecciones, cada dos días. N = 4 ratones por grupo.
Figure imgf000018_0002
1B. Resultados de la producción de proteína GLA humana in vivo
[0103] Un segundo sistema de la proteína basada en exógeno se exploró para demostrar el "efecto de depósito" cuando se emplean nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm. Los animales se inyectaron por vía intravenosa con una dosis única de 30 microgramos de ARNm de alfa-galactosidasa humana encapsulada (hGLA) utilizando un sistema de nanopartículas lipídicas basado en C12-200 y se sacrificaron después de seis horas (Formulación 1). La cuantificación de la proteína hGLA secretada se realizó mediante ELISA. Se utilizaron suero de ratón no tratado y proteína alfa-galactosidasa humana como controles. La detección de la proteína alfa-galactosidasa humana se supervisó durante un período de 48 horas.
[0104] Se observaron niveles medibles de proteína hGLA durante todo el curso de tiempo del experimento con un nivel máximo de 2,0 ug/ml de proteína hGLA a las seis horas (FIG. 10). La Tabla 3 enumera las cantidades específicas de hGLA encontradas en el suero. Se ha informado que la actividad normal en hombres humanos sanos es de aproximadamente 3,05 nanomol/h/mL. La actividad de la alfa-galactosidasa, una proteína recombinante de la alfagalactosidasa humana, 3,56 x 106 nanomol/h/mg. El análisis de estos valores arroja una cantidad de aproximadamente 856 pg/ml de proteína hGLA en individuos masculinos sanos normales. La cantidad de 2,0 ug/ml de proteína hGLA observada después de seis horas cuando se administra una nanopartícula de lípidos cargada con ARNm de hGLA es más de 2.300 veces mayor que los niveles fisiológicos normales. Además, después de 48 horas, todavía se pueden detectar niveles apreciables de proteína hGLA (86,2 ng/mL). Este nivel es representativo de cantidades casi 100 veces mayores de proteína hGLA sobre cantidades fisiológicas aún presentes a las 48 horas.
Tabla 3. Valores crudos de proteína hGLA secretada durante el tiempo como se midió a través de ELISA (como se muestra en la FIG. 10). Los valores se representan como nanogramos de proteína hGLA por mililitro de suero. N = 4 ratones por grupo.
Figure imgf000019_0002
[0105] Además, la vida media de la alfa-galactosidasa cuando se administra a 0,2 mg/kg es de aproximadamente 108 minutos. La producción de proteína GLA a través d e "efecto de depósito" cuando se administran nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de GLA muestra un aumento sustancial en el tiempo de residencia en la sangre en comparación con la inyección directa de la proteína recombinante desnuda. Como se ha descrito anteriormente, cantidades significativas de proteína están presentes después de 48 horas.
[0106] El Perfil de Actividad de la proteína de a-galactosidasa producida a partir de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm GLA se midió como una función del metabolismo de 4-metilumbeliferil-a-D-galactopiranósido (4-MU-a-gal). Como se muestra en la FIG. 11, la proteína producida a partir de estos sistemas de nanopartículas es bastante activa y refleja los niveles de proteína disponibles (FIG. 12, Tabla 3). Las comparaciones de AUC de la producción de hGLA se basan en la terapia con ARNm versus la terapia de reemplazo enzimático (ERT) en ratones y humanos en un aumento de 182 y 30 veces, respectivamente (Tabla 4).
Tabla 4. Comparacion de los Valores de Cmax y AUCinf en pacientes con Fabry despues de la Administración de IV 0,2 mg/kg de alfa-galactosidasa (dosis farmacológica) con los de ratones despues de la administración IV alfagalactosidasa y ARNm de GLA. 8 Los datos fueron publicados en un artículo publicado (Gregory M. Pastores et al. Safety and Pharmacokinetics of hGLA in patients with Fabry disease and end-stage renal disease. Nephrol Dial T ransplant (2007) 22: 1920-1925. b Enfermedad renal no terminal. c Actividad de a-galactosidasa a las 6 horas después de la administración.
Figure imgf000019_0001
[0107] Se ha demostrado la capacidad de nanopartículas lipídicas encapsuladas por ARNm para dirigirse a los órganos que pueden actuar como un depósito para la producción de una proteína desead. Los niveles de proteína secretada observados han sido varias órdenes de magnitud por encima de los niveles fisiológicos normales. Este "efecto de depósito" es repetible. FIG. 12 muestra nuevamente que se observa una producción robusta de proteínas en la dosificación de ratones de tipo silvestre (CD-1) con una dosis única de 30 ug de hGLA cargado con ARNm en nanopartículas lipídicas basadas en C12-200 (Formulación 1). En este experimento, los niveles de hGLA se evalúan durante un período de 72 horas. Se detectó un promedio máximo de 4,0 ug de suero de proteína hGLA humana/ml de suero seis horas después de la administración. Con base en un valor de ~1 ng/ml de proteína hGLA para niveles fisiológicos normales, hGLA MRT proporciona niveles de proteína aproximadamente 4.000 Veces más altos. Como anteriormente, la proteína hGLA se pudo detectar hasta 48 horas después de la administración (FIG. 12).
[0108] Un análisis de los tejidos aislados de este mismo experimento proporcionan información sobre la distribución de la proteína hGLA en los ratones tratados con MRT hGLA (FIG. 13). Los niveles suprafisiológicos de la proteína hGLA se detectaron en el hígado, el bazo y los riñones de todos los ratones con un máximo de entre 12 y 24 horas después de la administración. Se observan niveles detectables de proteína derivada de MRT tres días después de una inyección única de nanopartículas lipídicas cargadas con hGLA.
[0109] Además, la producción de hGLA tras la administración de nanopartículas C12-200 cargadas con hGLA ARNm muestra una repuesta de dosis en el suero (FIG. 14A), así como en el hígado (FIG. 14B).
[0110] Una característica inherente de la terapia de reemplazo de ARN de nanopartículas mediada por lípidos sería el perfil farmacocinético de la proteína respectiva producida. Por ejemplo, el tratamiento basado en ERT de ratones que emplean alfa-galactosidasa como resultado una vida media en plasma de aproximadamente 100 minutos. En contraste, la alfa-galactosidasa derivada de MRT tiene un tiempo de residencia en la sangre de aproximadamente 72 horas con un tiempo máximo de 6 horas. Esto significa una exposición mucho mayor para que los órganos participen en una posible captación continua de la proteína deseada. Una comparación de los perfiles PK se muestra en la FIG.
15 y demuestra la gran diferencia en las tasas de limpieza y, en última instancia, se puede lograr un cambio importante en el área bajo la curva (AUC) a través del tratamiento basado en MRT.
[0111] En un experimento separado, hGLA MRT se aplicó a un modelo de enfermedad de ratón, los ratones KO hGLA (ratones Fabry). Se administró una dosis de 0,33 mg/kg de nanopartículas lipídicas basadas en C12-200 cargadas con ARNm de hGLA (Formulación 1) a ratones KO hembra como una inyección intravenosa única. Se produjeron cantidades sustanciales de proteína hGLA derivada de MRT con pico a las 6 horas (~560 ng/ml de suero) que es aproximadamente 600 veces más alto que los niveles fisiológicos normales. Además, la proteína hGLA todavía era detectable 72 h después de la administración (FIG. 16).
[0112] La cuantificación de la proteína GLA derivada de MRT en órganos vitales demostró una acumulación sustancial como se muestra en la FIG. 17. Se muestra una comparación de la proteína hGLA derivada de MRT observada con los niveles fisiológicos normales que se encuentran en los órganos clave (los niveles normales se representan como líneas discontinuas). Mientras que los niveles de proteína a las 24 horas son más altos que a las 72 horas posteriores a la administración, los niveles de proteína hGLA detectados en el hígado, el riñón, el bazo y los corazones de los ratones Fabry tratados son equivalentes a los niveles de tipo silvestre. Por ejemplo, se han encontrado 3,1 ng de proteína hGLA/mg de tejido en los riñones de ratones tratados 3 días después de un solo tratamiento MRT.
[0113] En un experimento posterior, se realizo una comparacion del tratamiento de alfa-galactosidasa basado en ERT frente al tratamiento basado en hGLA MRT de ratones Fabry KO machos. Se administró una dosis intravenosa única de 1,0 mg/kg para cada terapia y los ratones se sacrificaron una semana después de la administración. Los niveles séricos de proteína hGLA se monitorizan a las 6 horas y 1 semana después de la inyección. El hígado, el riñón, el bazo y el corazón se analizarán para determinar la acumulación de proteína hGLA una semana después de la administración. Además de los análisis de biodistribución, se determinó una medida de la eficacia a través de la medición de las reducciones de globotrioasilceramida (Gb3) y liso-Gb3 en el riñón y el corazón. FIG. 18 muestra los niveles séricos de proteína hGLA después del tratamiento de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de alfagalactosidasa o GLA (Formulación 1) en ratones Fabry machos. Las muestras de suero se analizarán a las 6 horas y 1 semana después de la administración. Se detectó una señal robusta para los ratones tratados con MRT despues de 6 horas, con niveles séricos de proteína hGLA de ~4,0 ug/ml. Por el contrario, no había alfa-galactosidasa detectable en el torrente sanguíneo en este momento.
[0114] Los ratones de Fabry en este experimento fueron sacrificados una semana después de la inyección inicial y los órganos se reconocieron y se analizaron (hígado, riñón, bazo, corazón). FIG. 19 muestra una comparación de la proteína GLA humana encontrada en cada órgano respectivo después del tratamiento con hGLA MRT o alfagalactosidasa ERT. Los niveles corresponden a un hGLA presente una semana después de la administración. La proteína hGLA fue detectada en todos los órganos analizados. Por ejemplo, los ratones con MRT dieron como resultado una acumulación de proteína hGLA en el riñón de 2,42 ng de proteína hGLA/mg de proteína, mientras que los ratones con alfa-galactosidasa tienen solo niveles residuales (0,37 ng/mg de proteína). Esto corresponde a un nivel ~6,5 veces mayor de proteína hGLA cuando se trata a través de MRT hGLA. Tras el análisis del corazón, se encontraron 11,5 ng de proteína hGLA/mg de proteína para la cohorte tratada con MRT en comparación con solo 1,0 ng/mg de proteína alfa-galactosidasa. Esto corresponde una acumulación ~11 veces más alta en el corazón para los ratones tratados con hGLA MRT sobre las terapias basadas en ERT.
[0115] Además de los análisis de biodistribución realizados, las evaluaciones de la eficacia se determinan mediante la medición de los niveles de globotrioasilceramida (Gb3) y liso-Gb3 en los órganos clave. Una comparación directa de la reducción de Gb3 después de un solo tratamiento intravenoso de 1,0 mg/kg. GLA MRT es una diferencia considerable en los niveles de Gb3 en los riñones y en el corazón. Por ejemplo, los niveles de Gb3 para GLA MRT frente a alfa-galactosidasa produjeron reducciones del 60,2% frente al 26,8%, respectivamente (FIG. 20). Además, los niveles de Gb3 en el corazón se redujeron en un 92,1% frente a un 66,9% para MRT y alfa-galactosidasa, respectivamente (FIG. 21).
[0116] Un segundo biomarcador relevante para la medición de la eficacia es liso-Gb3. GLA MRT redujo el liso-Gb3 más eficazmente que la alfa-galactosidasa también en los riñones y el corazón (FIG. 20 y FIG. 21, respectivamente). En particular, los ratones Fabry tratados con MRT demostraron reducciones de liso-Gb3 de 86,1% y 87,9% en los riñones y el corazón en comparación con los ratones con alfa-galactosidasa, lo que arrojará una disminución de 47,8% y 61,3%, respectivamente.
[0117] Los resultados con nanopartículas lipídicas para hGLA en C12-200 se basan en otras formulaciones de nanopartículas lipídicas. Por ejemplo, el ARNm de hGLA cargado en HGT4003 (Formulación 3) o las nanopartículas lipídicas basadas en HGT5000 (Formulación 5) administradas como una dosis única IV como resultado de la producción de hGLA a las 24 horas después de la administración (FIG. 22). La producción de hGLA exhibió una respuesta a la dosis. De manera similar, la producción de hGLA se refiere a las 6 horas y 24 horas después de la

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende (a) al menos una molécula de ARNm al menos una porción de la cual codifica un polipéptido secretado funcional; y (b) un vehículo de transferencia liposomal que comprende una nanopartícula lipídica que comprende uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos no catiónicos y uno o más lípidos modificados con PEG para usar un método de tratamiento de un sujeto que tiene un defecto o deficiencia en dicho polipéptido secretado, en que el ARNm está encapsulado en el vehículo de transferencia y en la composición se administra mediante la administración pulmonar mediante nebulización.
2. La composición para su uso con la reivindicación 1, en la que el defecto o la deficiencia se refiere a una enfermedad o un trastorno que comprende una de la enfermedad de Huntington; Enfermedad de Parkinson; distrofias musculares (como, por ejemplo, Duchenne y Becker); enfermedades de la hemofilia (como, por ejemplo, hemofilia B (FIX), hemofilia A (FVIII); atrofia muscular espinal relacionada con SMN1 (SMA); esclerosis lateral amiotrófica (ALS); galactosemia con GALT; fibrosis quística (CFC); trastornos relacionados con SLC3A1 incluyendo la cistinuria, trastornos relacionados con COL4A5 incluyendo síndrome de Alport; deficiencias de galactocerebrosidasa; adrenoleucodistrofia y adrenomieloneuropatía ligadas al cromosoma X, ataxia de Friedreich, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher; esclerosis tuberosa relacionada con TSC1 y TSC2; síndrome de Sanfilippo B (MPS IIIB), cistinosis relacionada con CTNS; trastornos relacionados con la FMR1 que incluyen el síndrome de X frágil, el síndrome de temblor/ataxia asociado con X frágil y el síndrome de insuficiencia ovárica prematura de X frágil; Síndrome de Prader-Willi; telangiectasia hemorrágica hereditaria (AT); Enfermedad de Niemann-Pick tipo C1; Las enfermedades relacionadas con la lipofuscinosis ceroides neuronales incluyen la lipofuscinosis neuronal ceroide juvenil (JNCL), la enfermedad de Batten juvenil, la enfermedad de Santavuori-Haltia, la enfermedad de Jansky-Biels-chowsky y las deficiencias de PTT-1 y TPP1; Ataxia infantil relacionada con EIF2B1, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B4 y EIF2B5 con hipomielinización/desaparición de la sustancia blanca del sistema nervioso central; Ataxia Episódica Tipo 2 se relaciona con CACNA1A y CACNB4; Los trastornos relacionados con MECP2, incluido el síndrome de Rett clásico, la encefalopatía neonatal grave relacionada con MECP2 y el síndrome PPM-X; Síndrome de Rett atípico relacionado con CDKL5; enfermedad de Kennedy (SB-MA); Arteriopatía autosómica dominante cerebral relacionada con Notch-3 con infartos subcorticales y leucoencefalopatía (CADASIL); trastornos de las convulsiones relacionadas con SCN1A y SCN1B; Los trastornos relacionados con la Polimerasa; el síndrome de Alpers-Huttenlocher, la neuropatía atáxica sensorial relacionada con la POLG, la disartria y la oftalmoparesia, y la oftalmoplejía externa progresiva autosómica dominante y recesiva con deleciones mitocondriales de ADN; hipoplasia suprarrenal ligada a X; agammaglobulinemia ligada al X; Enfermedad de Wilson; y la enfermedad de Fabry.
3. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el ARNm codifica una enzima que es anormalmente deficiente en un individuo con un trastorno de almacenamiento lisosomal.
4. La Composición para su uso de Acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el polipéptido codificado por el ARNm es eritropoyetina, polipéptido de la a-galactosidasa, receptor de LDL, factor VIII, factor IX, a-L-iduronidasa, iduronato sulfatasa, heparina-N-sulfatasa, a-N-acetilglucosaminidasa, galactosa 6-sulfatasa, pgalactosidasa, lipasa lisosomal ácídica o polipéptido de arilsulfatasa-A.
5. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las respuestas 1-4, en la que la molécula de ARN comprende:
Al menos una modificación que confiere estabilidad a la molécula de ARN;
una modificación de la región no traducida 5’ de dicha molécula de ARN, opcionalmente en la que dicha modificación comprende la inclusión de una estructura Cap1; o
una modificación de la región no traducida 3’ de dicha molécula de ARN, opcionalmente en donde dicha modificación comprende la inclusión de una cola poliA.
6. La composición para el uso de acuerdo con una cualquiera de las respuestas 1 - 5, que comprende también un agente para facilitar la transferencia de la molécula de ARN y un compartimento intracelular de una célula diana, opcionalmente en donde dicha célula diana se selecciona del grupo que consiste en hepatocitos, células epiteliales, células hematopoyéticas, células epiteliales, células endoteliales, células pulmonares, células óseas, células madre mesenquimales, células neurales, células cardíacas, adipocitos, células musculares lisas vasculares, cardiomiocitos, células musculares esqueléticas, células beta, células hipofisarias, células del revestimiento sinovial, células ováricas, células testiculares, fibroblastos, células B, células T, reticulocitos, leucocitos, granulocitos y células tumorales.
7. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las respuestas 1-6, en la que la nanopartícula lipídica comprende
C12-200;
DLinKC2DMA, CHOL, DOPE y DMG-PEG-2000; o
C12-200, DOPE, CHOL y DMGPEG2K.
8. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las respuestas 1-7, en la que la nanopartícula lipídica comprende un lípido escindible.
9. La composición para el uso de acuerdo con una cualquiera de las respuestas 1 -8, en la que dicha composición está liofilizada.
10. La composición para el uso de acuerdo con una cualquiera de las respuestas 1-9, en la que dicha composición es una composición liofilizada reconstituida.
11. La composición para el uso de acuerdo con una cualquiera de las respuestas 1-10, en la que la composición es para la administración al sujeto dos veces a la semana, una vez a la semana, cada diez días, cada dos semanas o cada tres semanas.
12. La composición para el uso de acuerdo con una cualquiera de las respuestas 1-11, en la que se encuentra el tamaño del vehículo de transferencia dentro del intervalo de aproximadamente 25 a 250 nm.
13. La composición para el uso de acuerdo con una cualquiera de las respuestas 1-11, en la que el tamaño del vehículo de transferencia es menor que 250 nm, 175 nm, 150 nm, 125 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm, 25 nm o 10 nm.
14. La composición para el uso de acuerdo con una cualquiera de las respuestas 1-13, en la que el polipéptido se expresa en al menos un nivel terapéutico durante más de uno, más de cuatro, más de seis, más de 12, más de 24, más de 48 horas, o más de 72 horas después de la administración, opcionalmente, en donde el nivel de la proteína es detectable a los 3 días, 4 días, 5 días o 1 semana o más después de la administración.
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