ES2968649T3 - Nanopartículas lipídicas para la administración de ARNm en los pulmones - Google Patents

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Abstract

En el presente documento se describen composiciones para usar en un método para tratar una enfermedad en un sujeto, en el que la enfermedad se debe a una deficiencia de una proteína pulmonar asociada a un surfactante. La composición comprende ARNm que codifican la proteína asociada al surfactante pulmonar y una nanopartícula lipídica que comprende lípidos catiónicos, lípidos aniónicos y lípidos modificados con PEG. La composición debe administrarse por vía pulmonar. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Nanopartículas lipídicas para la administración de ARNm en los pulmones
ANTECEDENTES
Todavía se necesitan nuevos enfoques y terapias para el tratamiento de las deficiencias de proteínas. Las terapias, como la terapia génica, que aumentan el nivel o la producción de una proteína o enzima afectada podrían proporcionar un tratamiento o incluso una cura para tales enfermedades. Sin embargo, ha habido varias limitaciones para el uso de la terapia génica convencional para este propósito.
La terapia génica convencional implica el uso de ADN para la inserción de la información genética deseada en las células hospedadora. El ADN introducido en la célula generalmente se integra hasta cierto punto en el genoma de una o más células transfectadas, lo que permite una acción duradera del material genético introducido en el huésped. Si bien puede haber beneficios sustanciales para tal acción sostenida, la integración del ADN exógeno en un genoma del huésped también puede tener muchos efectos nocivos. Por ejemplo, es posible que el ADN introducido se inserte en un gen intacto, lo que resulta en una mutación que impide o incluso elimina totalmente la función del gen endógeno. Así, la terapia génica con ADN puede provocar la alteración de una función genética vital en el huésped tratado, como por ejemplo, la eliminación o la reducción deletérea de la producción de una enzima esencial o la interrupción de un gen crítico para la regulación del crecimiento celular, dando lugar a una proliferación celular no regulada o cancerosa. Además, con la terapia génica convencional basada en ADN es necesario, para la expresión efectiva del producto génico deseado, incluir una secuencia promotora fuerte, lo que de nuevo puede conducir a cambios indeseables en la regulación de la expresión génica normal en la célula. También es posible que el material genético basado en el ADN provoque la inducción de anticuerpos antiADN no deseados, que a su vez pueden desencadenar una respuesta inmunitaria posiblemente mortal. Los enfoques de terapia génica que utilizan vectores virales también pueden dar lugar a una respuesta inmunitaria adversa. En algunas circunstancias, el vector viral puede incluso integrarse en el genoma del huésped. Además, la producción de vectores virales de calidad clínica también es cara y requiere mucho tiempo. La administración selectiva del material genético introducido mediante vectores virales también puede ser difícil de controlar. Así, mientras que la terapia génica basada en el ADN se ha evaluado para la administración de proteínas secretadas utilizando vectores víricos (Patente estadounidense n°. 6.066.626; US2004/0110709; Amalfitano, A., et al., PNAS (1999) vol. 96, págs. 8861 a 66), estos enfoques pueden ser limitados por estas diversas razones.
Otro obstáculo aparente en estos enfoques previos a la entrega de ácidos nucleicos que codifican proteínas secretadas, está en los niveles de proteína que se producen finalmente. Es difícil alcanzar niveles significativos de la proteína deseada en la sangre, y las cantidades no se mantienen a lo largo del tiempo. Por ejemplo, la cantidad de proteína producida por la administración de ácido nucleico no alcanza los niveles fisiológicos normales. Ver por ejemplo, US2004/0110709.
En contraste con el ADN, el uso del ARN como agente de terapia génica es sustancialmente más seguro porque (1) el ARN no implica el riesgo de integrarse de forma estable en el genoma de la célula transfectada, eliminando así la preocupación de que el material genético introducido altere el funcionamiento normal de un gen esencial o provoque una mutación que dé lugar a efectos deletéreos u oncogénicos; (2) no se requieren secuencias promotoras extrañas para la traducción efectiva de la proteína codificada, evitando de nuevo posibles efectos secundarios deletéreos; (3) a diferencia del ADN plasmídico (ADNp), el ARN mensajero (ARNm) está desprovisto de motivos CpG inmunogénicos, por lo que no se generan anticuerpos anti-ARN; y (4) cualquier efecto deletéreo que resulte del ARNm basado en la terapia génica sería de duración limitada debido a la vida media relativamente corta del ARN. Además, no es necesario que el ARNm entre en el núcleo para realizar su función, mientras que el ADN debe superar esta importante barrera.
Una de las razones por las que la terapia génica basada en el ARNm no se ha utilizado más en el pasado es que el ARNm es mucho menos estable que el ADN, especialmente cuando llega al citoplasma de una célula y se expone a enzimas degradantes. La presencia de un grupo hidroxilo en el segundo carbono de la molécula de azúcar en el ARNm provoca un impedimento estérico que impide que el ARNm forme la estructura de doble hélice más estable del ADN y, por tanto, hace que el ARNm sea más propenso a la degradación hidrolítica. Por ello, hasta hace poco se creía que el ARNm era demasiado lábil para resistir los protocolos de transfección. Los avances en las modificaciones estabilizadoras del ARN han despertado un mayor interés por el uso del ARNm en lugar del ADN plasmídico en la terapia génica. Ciertos vehículos de administración, como los de lípidos catiónicos o polímeros, también pueden ayudar a proteger el ARNm transfectado de las RNasas endógenas. Sin embargo, a pesar de la mayor estabilidad del ARNm modificado, la entrega del ARNm a las células in vivo de forma que permita niveles terapéuticos de producción de proteínas sigue siendo un reto, sobre todo para el ARNm que codifica proteínas de longitud completa. Aunque se ha contemplado la administración de ARNm que codifica proteínas secretadas (US2009/0286852), se desconocen los niveles de una proteína secretada de longitud completa que se producirían realmente mediante la administración in vivo de ARNm y no hay motivo para esperar que los niveles superen los observados con la terapia génica basada en ADN.
Hasta la fecha, sólo se han logrado avances significativos mediante la terapia génica con ARNm en aplicaciones para las que los bajos niveles de traducción no han sido un factor limitante, como la inmunización con ARNm que codifican antígenos. Los ensayos clínicos de vacunación contra antígenos tumorales mediante inyección intradérmica de ARNm desnudo o complejado con protamina han demostrado su viabilidad, ausencia de toxicidad y resultados prometedores. X.
Su et al., Mol. Pharmaceutics 8:774-787 (2011). Desgraciadamente, los bajos niveles de traducción han restringido en gran medida la explotación de la terapia génica basada en el ARNm en otras aplicaciones que requieren mayores niveles de expresión sostenida de la proteína codificada por el ARNm para ejercer un efecto biológico o terapéutico.
El documento WO 2011/068810 divulga composiciones y métodos para modular la expresión de un gen o la producción de una proteína mediante la transfección de células diana con ácidos nucleicos. Las composiciones divulgadas demuestran una elevada eficacia de transfección y son capaces de mejorar enfermedades asociadas a deficiencias proteínicas o enzimáticas. El documento WO 2013/185069 divulga composiciones que comprenden ARNm formulado para la administración pulmonar y métodos relacionados para la administración del ARNm y/o la proteína codificada por el ARNm a una célula o tejido no pulmonar. Las composiciones y los métodos pueden utilizarse para prevenir o mejorar los síntomas de enfermedades asociadas a la proteína codificada por el ARNm.
Las consecuencias patológicas de las deficiencias de proteínas tensioactivas se describen, entre otros, en George (2008) Infl. Immun. 76(l):380-390; Hamvas (2007) Neonatology 91:311-317; Zin (2012) Exp. Ther. Med. 4:815-819.
RESUMEN
La invención según se define en las reivindicaciones anexas proporciona una composición para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad en un sujeto que se debe a una deficiencia de una proteína asociada al surfactante pulmonar, en el que la proteína asociada al surfactante pulmonar se selecciona entre SFTPA1, SFTPA2, SFTPB, SFTPC y SFTPD, en el que dicho método comprende la administración pulmonar de la composición al sujeto, comprendiendo dicha composición (a) al menos una molécula de ARNm al menos una parte de la cual codifica la proteína asociada al surfactante pulmonar; y (b) un vehículo de transferencia que comprende una nanopartícula lipídica, en la que la nanopartícula lipídica comprende uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos no catiónicos y uno o más lípidos modificados con PEG.
En algunas realizaciones, el ARNm puede comprender una o más modificaciones que confieran estabilidad al ARNm (por ejemplo, en comparación con una versión de tipo salvaje o nativa del ARNm) y también puede comprender una o más modificaciones relativas al tipo salvaje que corrijan un defecto implicado en la expresión aberrante asociada de la proteína. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de la presente invención pueden comprender modificaciones en una o ambas de las regiones no traducidas 5' y 3'. Dichas modificaciones pueden incluir, entre otras, la inclusión de una secuencia parcial de un gen de citomegalovirus (CMV) inmediato-temprano 1 (IE1), una cola poli A, una estructura Capl o una secuencia que codifique la hormona de crecimiento humana (hGH)). En algunas realizaciones, el ARNm se modifica para disminuir la inmunogenicidad del ARNm.
El vehículo de transferencia puede comprender al menos uno de los siguientes lípidos catiónicos: XTC (2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[l,3]-dioxolano) y MC3 (((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4-(dimetilamino)butanoato), AlNy -100 ((3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2- di((9Z,12Z)-octadeca-9, 12-dienil)tetrahidro-3aH-ciclopenta[d] [1 ,3]dioxol-5- amina), NC98-5 (4,7,13-tris(3-oxo-3-(undecilamino)propil)-Nl,N16-diundecil- 4, 7,10,13-tetraazahexadecano-l,16-diamida), C12-200, DLin-KC2-DMA, DODAP, HGT4003, ICE, HGT5000 o HGT5001(czs o trans). En algunas realizaciones, el vehículo de transferencia comprende colesterol (chol). En algunas realizaciones, los vehículos de transferencia comprenden DMG-PEG2K. En ciertas realizaciones, el vehículo de transferencia comprende una de las siguientes formulaciones lipídicas:
Cl2-200, DOPE, chol, DMG-PEG2K;
DODAP, DOPE, colesterol, DMG-PEG2K;
HGT5000, DOPE, chol, DMG-PEG2K;
HGT5001, DOPE, chol, DMG-PEG2K;
XTC, DSPC, chol, PEG-DMG;
MC3, DSPC, chol, PEG-DMG;
ALNY-100, DSPC, chol, PEG-DSG
En algunas realizaciones, la proteína asociada al surfactante pulmonar es producida por la célula diana durante cantidades sostenidas de tiempo. Por ejemplo, la proteína asociada al surfactante pulmonar puede producirse durante más de una hora, más de cuatro, más de seis, más de 12, más de 24, más de 48 horas o más de 72 horas después de la administración. En algunas realizaciones, la proteína asociada al surfactante pulmonar se expresa a un nivel máximo unas seis horas después de la administración. En algunas realizaciones, la expresión de la proteína asociada al surfactante pulmonar se mantiene al menos a un nivel terapéutico. En algunas realizaciones, la proteína asociada al surfactante pulmonar se expresa al menos a un nivel terapéutico durante más de una, más de cuatro, más de seis, más de 12, más de 24, más de 48 horas o más de 72 horas tras la administración. En algunas realizaciones, la proteína asociada al surfactante pulmonar es detectable a nivel en el tejido pulmonar del paciente. En algunas realizaciones, el nivel de proteína asociada a surfactante pulmonar detectable es de expresión continua a partir de la composición de ARNm durante periodos de tiempo de más de una, más de cuatro, más de seis, más de 12, más de 24, más de 48 horas o más de 72 horas tras la administración.
En ciertas realizaciones, la proteína asociada al surfactante pulmonar se produce a niveles superiores a los niveles fisiológicos normales. El nivel de proteína asociada al surfactante pulmonar puede aumentar en comparación con un control. En algunas realizaciones, el control es el nivel fisiológico basal de la proteína asociada al surfactante pulmonar en un individuo normal o en una población de individuos normales. En otras realizaciones, el control es el nivel fisiológico basal de la proteína asociada al surfactante pulmonar en un individuo que tiene una deficiencia en la proteína asociada al surfactante pulmonar o en una población de individuos que tienen una deficiencia en la proteína asociada al surfactante pulmonar. En algunas realizaciones, el control puede ser el nivel normal de la proteína asociada al surfactante pulmonar pertinente en el individuo al que se administra la composición.
En ciertas realizaciones, la proteína asociada al surfactante pulmonar es expresada por la célula diana a un nivel que es al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, 30 veces, al menos 100 veces, al menos 500 veces, al menos 5000 veces, al menos 50.000 veces o al menos 100.000 veces mayor que un control. En algunas realizaciones, el aumento del pliegue de expresión superior al control se mantiene durante más de una, más de cuatro, más de seis, más de 12, más de 24 o más de 48 horas, o más de 72 horas tras la administración. En ciertas realizaciones, los niveles de proteína asociada al surfactante pulmonar son detectables a los 3 días, 4 días, 5 días o 1 semana o más tras la administración.
En algunas realizaciones, la administración comprende una dosis única o repetidas.
Ciertas realizaciones se refieren a composiciones que proporcionan a una célula o sujeto ARNm, al menos una parte del cual codifica una proteína funcional asociada al surfactante pulmonar, en una cantidad que es sustancialmente inferior a la cantidad de proteína funcional correspondiente generada a partir de ese ARNm. Dicho de otra manera, en ciertas realizaciones, en ciertas realizaciones el ARNm administrado a la célula puede producir una cantidad de proteína asociada al surfactante pulmonar sustancialmente mayor que la cantidad de ARNm administrado a la célula. Por ejemplo, en un tiempo determinado, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20 o 24 horas desde la administración del ARNm a una célula o sujeto, la cantidad de la correspondiente proteína asociada al surfactante pulmonar generada por ese ARNm puede ser al menos 1. 5, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, o más veces mayor que la cantidad de ARNm realmente administrada a la célula o al sujeto. Esto puede medirse masa por masa, mol por mol y/o molécula por molécula. La proteína asociada al surfactante pulmonar puede medirse de varias maneras. Para un sujeto, la proteína medida puede ser la proteína medida en el pulmón. Además, se puede medir una cantidad de referencia de proteína endógena en el sujeto antes de la administración del ARNm y luego restarla de la proteína medida tras la administración del ARNm para obtener la cantidad de proteína correspondiente generada a partir del ARNm. De esta manera, el ARNm puede proporcionar una fuente de reserva o depósito de una gran cantidad de material terapéutico a la célula o al sujeto, por ejemplo, en comparación con la cantidad de ARNm suministrada a la célula o al sujeto. La fuente de depósito puede actuar como una fuente continua para la expresión de polipéptidos a partir del ARNm durante periodos de tiempo sostenidos.
Lo anteriormente expuesto y muchas otras características y ventajas concomitantes de la presente invención se comprenderán mejor por referencia a la siguiente descripción detallada de la invención cuando se tome en conjunción con los ejemplos que la acompañan. Las diversas realizaciones descritas en el presente documento son complementarias y pueden combinarse o utilizarse juntas de una manera comprendida por el experto a la vista de las enseñanzas contenidas en el presente documento.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 muestra la secuencia de nucleótidos de una secuencia 5' CMV (NÚMERO DE ID DE SECUENCIA: 1), donde X, si está presente es GGA.
La FIG. 2 muestra la secuencia de nucleótidos de una secuencia de 3' hGH (NÚMERO DE ID DE SECUENCIA:2).
La FIG. 3 muestra la secuencia de nucleótidos del ARNm de eritropoyetina humana (EPO) (N.° ID DE SECUENCIA ID DE SECUENCIA :3). Esta secuencia se puede flanquear en el extremo 5' con el número ID DE SECUENCIA :1 y en el extremo 3' con el número ID DE SECUENCIA :2.
La FIG. 4 muestra la secuencia de nucleótidos del ARNm de la alfa-galactosidasa (GLA) humana (número ID DE SECUENCIA :4). Esta secuencia puede estar flanqueada en el extremo 5' con el número ID DE SECUENCIA: 1 y en el extremo 3' con el número ID DE SECUENCIA :2.
La FIG. 5 muestra la secuencia de nucleótidos del ARNm de la alfa-1 antitripsina humana (Al AT) (número ID DE SECUENCIA :5). Esta secuencia puede estar flanqueada en el extremo 5' con el número ID DE SECUENCIA: 1 y en el extremo 3' con el número ID DE SECUENCIA :2.
La FIG. 6 muestra la secuencia de nucleótidos del factor IX humano (FIX) mRNA (número ID DE SECUENCIA :6). Esta secuencia se puede flanquear en el extremo 5' con el número ID DE SECUENCIA :1 y en el extremo 3' con el número ID DE SECUENCIA :2.
La FIG. 7 muestra la cuantificación de los niveles de proteína hEPO secretados medidos a través de ELISA. La proteína detectada es el resultado de su producción a partir del ARNm de la hEPO administrado por vía intravenosa mediante una dosis única de varias formulaciones de nanopartículas lipídicas. Las formulaciones C12-200 (30 ug), HGT4003 (150 ug), ICE (100 ug), DODAP (200 ug) se representan como el componente lipídico catiónico/ionizable de cada artículo de prueba (Formulaciones 1-4). Los valores se basan en la muestra de sangre cuatro horas después de la administración.
La FIG. 8 muestra la medición del hematocrito de ratones tratados con una dosis intravenosa única de nanopartículas lipídicas cargadas de ARNm de EPO humano (Formulaciones 1-4). Se tomaron muestras de sangre total a las 4 horas (Día 1), 24 horas (Día 2), 4 días, 7 días y 10 días después de la administración.
La FIG. 9 muestra las mediciones del hematocrito de ratones tratados con nanopartículas lipídicas cargadas de ARNm de EPO humana con una sola dosis intravenosa o con tres inyecciones (día 1, día 3, día 5). Se tomaron muestras de sangre total antes de la inyección (día -4), día 7 y día 15. Se administró laFormulación 1:(30 ug, dosis única) o (3 x 10 ug, dosis día 1, día 3, día 5); Se administró laFormulación 2: (3 x 50 ug, dosis día 1, día 3, día 5).
La FIG.10 muestra la cuantificación de los niveles de proteína a-galactosidasa humana secretada (hGLA) medidos mediante ELISA. La proteína detectada es el resultado de la producción a partir del ARNm de hGLA administrado a través de nanopartículas lipídicas(Formulación 1;dosis intravenosa única de 30 ug, basada en ARNm encapsulado). La proteína hGLA se detecta durante 48 horas.
La FIG. 11 muestra la actividad de la hGLA en suero. La actividad de la hGLA se midió utilizando el sustrato 4-metilumbeliferil-a-D-galactopiranósido (4-MU-a-gal) a 37 °C. Los datos son la media de 6 a 9 mediciones individuales.
La FIG. 12 muestra la cuantificación de los niveles de proteína hGLA en suero medidos mediante ELISA. La proteína se produce a partir de ARNm de hGLA administrado a través de nanopartículas lipídicas basadas en C12-200 (C12-200:DOPE:Chol:DMGPEG2K, 40:30:25:5(Formulación1); 30 ug de ARNm basado en ARNm encapsulado, dosis única IV). La proteína de hGLA se monitoriza durante 72 horas.
La FIG. 13 muestra la cuantificación de los niveles de proteína hGLA en hígado, riñón y bazo medidos mediante ELISA. La proteína se produce a partir del ARNm hGLA administrado mediante nanopartículas lipídicas a base de C12-200(Formulación 1;30 ug de ARNm a base de ARNm encapsulado, dosis única IV). La proteína hGLA se controla durante 72 horas.
La FIG. 14 muestra un estudio dosis-respuesta que monitoriza la producción proteica de hGLA como proteína humana GLA secretada derivada de MRT en suero (A) e hígado (B). Las muestras se midieron 24 horas después de la administración(Formulación 1;dosis única, IV, N=4 ratones/grupo) y se cuantificaron mediante ELISA.
La FIG. 15 muestra los perfiles farmacocinéticos de la alfa galactosidasa a base de TRM en ratones atímicos desnudos (dosis de 40 ug/kg) y de la proteína hGLA producida a partir de TRM(Formulación 1;dosis de 1,0 mg/kg de ARNm).
La FIG. 16 muestra la cuantificación de los niveles de proteína hGLA secretada en ratones Fabry tratados con MRT, medidos mediante ELISA. La proteína hGLA se produce a partir de ARNm de hGLA administrado mediante nanopartículas lipídicas a base de C12-200(Formulación 1;10 ug ARNm por dosis intravenosa única, basado en ARNm encapsulado). El suero se monitoriza durante 72 horas.
La FIG. 17 muestra la cuantificación de los niveles de proteína hGLA en hígado, riñón, bazo y corazón de ratones Fabry KO tratados con MRT, medidos mediante ELISA. La proteína se produce a partir del ARNm hGLA administrado mediante nanopartículas lipídicas a base de C12-200(Formulación 1;30 ug de ARNm a base de ARNm encapsulado, dosis única IV). La proteína hGLA se controla durante 72 horas. Los valores de la literatura que representan los niveles fisiológicos normales se grafican como líneas discontinuas.
La FIG. 18 muestra la cuantificación de los niveles de proteína hGLA secretada en ratones MRT y ratones Fabry tratados con Alfa-galactosidasa, medidos mediante ELISA. Ambas terapias se dosificaron en una única dosis intravenosa de 1,0 mg/kg.
La FIG. 19 muestra la cuantificación de los niveles de proteína hGLA en hígado, riñón, bazo y corazón de ratones KO de Fabry tratados con MRT y ERT (Alfa-galactosidasa), medidos mediante ELISA. Proteína producida a partir de ARNm de hGLA administrado mediante nanopartículas lipídicas(Formulación 1;1,0 mg/kg de ARNm basado en ARNm encapsulado, dosis única IV).
La FIG. 20 muestra la cuantificación relativa de globotrioasilceramida (Gb3) e Iyso-Gb3 en los riñones de ratones tratados y no tratados. Los ratones Fabry KO machos fueron tratados con una dosis única de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de GLA o de Alfa-galactosidasa a 1,0 mg/kg. Las cantidades reflejan la cantidad de Gb3/lyso-Gb3 una semana después de la administración.
La FIG. 21 muestra la cuantificación relativa de globotrioasilceramida (Gb3) e Iyso-Gb3 en el corazón de ratones tratados y no tratados. Los ratones Fabry KO machos fueron tratados con una dosis única de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de GLA o de Alfa-galactosidasa a 1,0 mg/kg. Las cantidades reflejan la cantidad de Gb3/lyso-Gb3 una semana después de la administración.
La FIG. 22 muestra un estudio dosis-respuesta que monitoriza la producción de proteína de GLA como proteína humana de GLA secretada derivada de MRT en suero. Las muestras se midieron 24 horas después de la administración (dosis única, IV, N = 4 ratones/grupo) de nanopartículas lipídicas basadas en HGT4003(Formulación3) o HGT5000(Formulación 5)y se cuantificaron mediante ELISA.
La FIG. 23 muestra la producción de proteína hGLA medida en suero (A) o en hígado, riñón y bazo (B). Las muestras se midieron 6 horas y 24 horas después de la administración (dosis única, IV, N = 4 ratones/grupo) de nanopartículas lipídicas basadas en HGT5001(Formulación 6)y se cuantificaron mediante ELISA.
La FIG. 24 muestra la cuantificación de los niveles de proteína secretada del factor IX humano medidos mediante ELISA (ng / ml promedio ± desviación estándar). La proteína FIX se produce a partir del ARNm FIX administrado a través de nanopartículas lipídicas basadas en Cl 2-200 (<c>12- 200:DOPE:Chol:DMGPEG2K, 40:30:25:5(Formulación1); 30 ug de ARNm por dosis intravenosa única, basada en ARNm encapsulado). La proteína FIX se monitorea durante 72 horas. (n=24 ratones).
La FIG. 25 muestra la cuantificación de los niveles secretados de proteína humana a-1-antitripsina (Al AT) medidos mediante ELISA. La proteína Al AT se produce a partir del ARNm de Al AT administrado a través de nanopartículas lipídicas basadas en Cl 2-200 (C12- 200:DOPE:Chol:DMGPEG2K, 40:30:25:5(Formulación 1);30 ug de ARNm por dosis intravenosa única, basada en ARNm encapsulado). La proteína A1AT se monitorea durante 24 horas.
La FIG. 26 muestra una cuantificación basada en ELISA de la proteína hEPO detectada en los pulmones y el suero de ratones tratados después de la administración intratraqueal de nanopartículas cargadas con ARNm de hEPO (mIU medida) (C12-200, HGT5000 o nanopartículas lipídicas basadas en HGT5001;Formulaciones 1, 5, 6 respectivamente).Los animales fueron sacrificados 6 horas después de la administración (n = 4 ratones por grupo).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención definida en las reivindicaciones adjuntas proporciona una composición para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad en un sujeto que se debe a una deficiencia de una proteína asociada a surfactante pulmonar, en la que la proteína asociada al surfactante pulmonar se selecciona de SFTPA1, SFTPA2, SFTPB, SFTPC y SFTPD, en la que dicho método comprende la administración pulmonar de la composición al sujeto, dicha composición comprende: (a) al menos una molécula de ARNm al menos una porción de la cual codifica la proteína asociada al surfactante pulmonar; y (b) un vehículo de transferencia que comprende una nanopartícula lipídica, en el que la nanopartícula lipídica comprende uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos no catiónicos y uno o más lípidos modificados con PEG.
El término "funcional", tal y como se utiliza aquí para calificar una proteína, significa que la proteína tiene actividad biológica o, alternativamente, que es capaz de realizar la misma función, o una función similar, que la proteína nativa o que funciona normalmente. El término "niveles terapéuticos" se refiere a los niveles de la proteína asociada al surfactante pulmonar detectados en los tejidos que están por encima de los niveles de control, en los que el control pueden ser los niveles fisiológicos normales, o los niveles en el sujeto antes de la administración de la composición de ARNm. El término "secretada" se refiere a la proteína asociada al surfactante pulmonar que se detecta fuera de la célula diana, en el espacio extracelular. En el contexto de la presente invención, el término "producido" se utiliza en su sentido más amplio para referirse a la traducción de al menos un ARNm en una proteína asociada al surfactante pulmonar. Según lo previsto en el presente documento, las composiciones incluyen un vehículo de transferencia. Los vehículos de transferencia aquí descritos son capaces de hacer llegar el ARNm a la célula diana.
ARNm
El ARNm en las composiciones para el uso según la invención codifica una proteína asociada a surfactante pulmonar. En algunas realizaciones de la invención, el ARNm puede tener opcionalmente modificaciones químicas o biológicas que, por ejemplo, mejoren la estabilidad y/o la vida media de dicho ARNm o que mejoren o faciliten de otro modo la producción de proteínas. La invención prevé la codistribución opcional de más de un ARNm único a las células diana, por ejemplo, combinando dos ARNm únicos en un único vehículo de transferencia. En una realización de la presente invención, un primer ARNm terapéutico y un segundo ARNm terapéutico pueden formularse en un único vehículo de transferencia y administrarse. La presente invención también contempla la entrega conjunta y/o la administración conjunta de un primer ARNm terapéutico y un segundo ácido nucleico para facilitar y/o mejorar la función o la entrega del primer ARNm terapéutico. Por ejemplo, el primer ARNm terapéutico puede administrarse con un segundo ácido nucleico que funcione como "acompañante", por ejemplo, para dirigir el plegamiento del primer ARNm terapéutico.
La invención también prevé la administración de uno o más ácidos nucleicos terapéuticos para tratar un único trastorno o deficiencia, en el que cada uno de dichos ácidos nucleicos terapéuticos funciona mediante un mecanismo de acción diferente. Por ejemplo, las composiciones para el uso según la presente invención pueden comprender un primer ARNm terapéutico que, por ejemplo, se administra para corregir una deficiencia proteica asociada a surfactante pulmonar endógeno, y que se acompaña de un segundo ácido nucleico, que se administra para desactivar o "derribar" un ácido nucleico endógeno que funciona mal y su producto proteico o enzimático. Estos "segundos" ácidos nucleicos pueden codificar, por ejemplo, ARNm o ARNsi.
Tras la transfección, un ARNm natural en las composiciones puede decaer con una vida media de entre 30 minutos y varios días. Es preferible que el ARNm conserve al menos cierta capacidad de ser traducido, produciendo así una proteína funcional asociada al surfactante pulmonar. En consecuencia, se prevé administrar un ARNm estabilizado. En algunas realizaciones de la invención, la actividad del ARNm se prolonga durante un período prolongado de tiempo. Por ejemplo, la actividad del ARNm puede prolongarse de tal forma que las composiciones se administren a un sujeto de forma quincenal o bisemanal, o más preferiblemente de forma mensual, bimensual, trimestral o anual. La actividad extendida o prolongada del ARNm está directamente relacionada con la cantidad de proteína asociada al surfactante pulmonar producida a partir de dicho ARNm. Del mismo modo, la actividad de las composiciones puede ampliarse o prolongarse aún más mediante modificaciones realizadas para mejorar o potenciar la traducción del ARNm. Además, la cantidad de proteína funcional producida por la célula diana es función de la cantidad de ARNm suministrado a las células diana y de la estabilidad de dicho ARNm. En la medida en que la estabilidad del ARNm pueda mejorarse o aumentarse, la semivida, la actividad de la proteína o enzima producida y la frecuencia de dosificación de la composición podrán ampliarse aún más.
En consecuencia, en algunas realizaciones, el ARNm en las composiciones para el uso de acuerdo con la invención comprende al menos una modificación que confiere una mayor o mayor estabilidad al ácido nucleico, incluyendo, por ejemplo, una mayor resistencia a la digestión de nucleasas in vivo. Tal y como se utilizan en el presente documento, los términos "modificación" y "modificado", tal y como se relacionan con los ácidos nucleicos proporcionados en el presente documento, incluyen al menos una alteración que, preferiblemente, mejora la estabilidad y hace que el ARNm sea más estable (por ejemplo, resistente a la digestión por nucleasas) que la versión de tipo salvaje o natural del ARNm. Tal y como se utilizan en el presente documento, los términos "estable" y "estabilidad", tal y como tales términos se relacionan con los ácidos nucleicos de la presente invención, y en particular con respecto al ARNm, se refieren a una mayor o mejor resistencia a la degradación por, por ejemplo, nucleasas (es decir, endonucleasas o exonucleasas) que normalmente son capaces de degradar dicho ARNm. El aumento de la estabilidad puede incluir, por ejemplo, una menor sensibilidad a la hidrólisis u otro tipo de destrucción por enzimas endógenas (por ejemplo, endonucleasas o exonucleasas) o condiciones dentro de la célula o tejido diana, aumentando o mejorando así la residencia de dicho ARNm en la célula, tejido, sujeto y/o citoplasma diana. Las moléculas de ARNm estabilizadas proporcionadas en el presente documento demuestran vidas medias más largas en relación con sus homólogas naturales no modificadas (por ejemplo, la versión de tipo salvaje del ARNm). También se contemplan los términos "modificación" y "modificado" como tales términos relacionados con el ARNm son alteraciones que mejoran o mejorar la traducción de los ácidos nucleicos ARNm, incluyendo, por ejemplo, la inclusión de secuencias que funcionan en la iniciación de la traducción de proteínas (por ejemplo, la secuencia consenso de Kozak; véase Kozak, M., Nucleic Acids Res 15 (20): 8125-48 (1987)).
En algunas realizaciones, el ARNm ha sufrido un modificación química o biológica para hacerlos más estables. Las modificaciones ejemplares de un ARNm incluyen la eliminación de una base (por ejemplo, por supresión o por sustitución de un nucleótido por otro) o la modificación de una base, por ejemplo, la modificación química de una base. La frase "modificaciones químicas", tal y como se utiliza aquí, incluye modificaciones que introducen químicas que difieren de las que se observan en el ARNm natural, por ejemplo, modificaciones covalentes como la introducción de nucleótidos modificados, (por ejemplo, análogos de nucleótidos, o la inclusión de grupos colgantes que no se encuentran de forma natural en dichas moléculas de ARNm.
Además, las modificaciones adecuadas incluyen alteraciones en uno o más nucleótidos de un codón de forma que el codón codifique el mismo aminoácido, pero sea más estable que el codón que se encuentra en la versión de tipo salvaje del ARNm. Por ejemplo, se ha demostrado una relación inversa entre la estabilidad del ARN y un mayor número de residuos de citidinas (C's) y/o uridinas (U's), y se ha descubierto que el ARN desprovisto de residuos de C y U es estable a la mayoría de las RNasas (Heidenreich, et al. J Biol Chern 269, 2131-8 (1994)). En algunas realizaciones, se reduce el número de residuos C y/o U en una secuencia de ARNm. En otra realización, el número de residuos C y/o U se reduce mediante la sustitución de un codón que codifica un aminoácido particular por otro codón que codifica el mismo aminoácido o un aminoácido relacionado. Las modificaciones contempladas de los ácidos nucleicos del ARNm también incluyen la incorporación de pseudouridinas. La incorporación de pseudouridinas en los ácidos nucleicos de ARNm puede mejorar la estabilidad y capacidad traslacional, así como disminución de la inmunogenicidad in vivo. Ver, por ejemplo, Kariko, K., et al., Molecular Therapy 16 (11): 1833-1840 (2008). Las sustituciones y modificaciones del ARNm pueden realizarse por métodos fácilmente conocidos por un experto en la materia.
Las limitaciones para reducir el número de residuos C y U en una secuencia serán probablemente mayores dentro de la región codificante de un ARNm, en comparación con una región no traducida, (es decir, probablemente no será posible eliminar todos los residuos C y U presentes en el mensaje conservando la capacidad del mensaje para codificar la secuencia de aminoácidos deseada). Sin embargo, la degeneración del código genético ofrece la posibilidad de reducir el número de residuos C y/o U presentes en la secuencia, manteniendo la misma capacidad de codificación (es decir, dependiendo del aminoácido codificado por un codón, pueden existir varias posibilidades de modificación de las secuencias de ARN). Por ejemplo, los codones para Gly pueden alterarse a GGA o GGG en lugar de GGU o GGC.
El término modificación también incluye, por ejemplo, la incorporación de enlaces no nucleotídicos o nucleótidos modificados en las secuencias de ARNm (por ejemplo, modificaciones en uno o ambos extremos 3' y 5' de una molécula de ARNm que codifica una proteína funcional asociada al surfactante pulmonar). Dichas modificaciones incluyen la adición de bases a una secuencia de ARNm (por ejemplo, la inclusión de una cola poli A o una cola poli A más larga), la alteración de la UTR 3' o la UTR 5', la complejación del ARNm con un agente (por ejemplo, una proteína o una molécula de ácido nucleico complementaria) y la inclusión de elementos que cambien la estructura de una molécula de ARNm (por ejemplo, que formen estructuras secundarias).
Se cree que la cola poli A estabiliza los mensajeros naturales. Por lo tanto, en una realización se puede añadir una cola larga de poli A a una molécula de ARNm, haciendo así que el ARNm sea más estable. Las colas Poly A pueden añadirse utilizando una variedad de técnicas reconocidas por el arte. Por ejemplo, se pueden añadir colas largas de poli A al ARNm sintético o transcrito in vitro utilizando poli A polimerasa (Yokoe, et al. Nature Biotechnology. 1996; 14: 1252 1256). Un vector de transcripción también puede codificar colas largas de poli A. Además, las colas poli A se pueden agregar por transcripción directamente de productos PCR. En una realización, la longitud de la cola poli A es de al menos unos 90, 200, 300, 400 al menos 500 nucleótidos. En una realización, la longitud de la cola poli A se ajusta para controlar la estabilidad de una molécula de ARNm modificada y, por tanto, la transcripción de la proteína asociada al surfactante pulmonar. Por ejemplo, dado que la longitud de la cola poli A puede influir en la vida media de una molécula de ARNm, la longitud de la cola poli A se puede ajustar para modificar el nivel de resistencia del ARNm a las nucleasas y, por lo tanto, controlar el curso temporal de la expresión de proteínas en una célula.
En una realización, un ARNm puede modificarse mediante la incorporación de secuencias 3' y/o 5' no traducidas (UTR) que no se encuentran de forma natural en el ARNm de tipo salvaje. En una realización, la secuencia flanqueante 3' y/o 5' que flanquea de forma natural un ARNm y codifica una segunda proteína no relacionada puede incorporarse a la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm que codifica una proteína terapéutica o funcional para modificarla. Por ejemplo, las secuencias 3' o 5' de moléculas de ARNm que son estables (por ejemplo, globina, actina, GAPDH, tubulina, histona o enzimas del ciclo del ácido cítrico) pueden incorporarse a la región 3' y/o 5' de una molécula de ácido nucleico de ARNm sentido para aumentar la estabilidad de la molécula de ARNm sentido. Ver, por ejemplo, US2003/0083272.
En algunas realizaciones, el ARNm en las composiciones para el uso según la invención incluyen la modificación del extremo 5' del ARNm para incluir una secuencia parcial de un gen CMV inmediato-temprano 1 (IE 1), o un fragmento del mismo (por ejemplo, número de ID DE SECUENCIA: 1) para mejorar la resistencia a las nucleasas y/o mejorar la vida media del ARNm. Además de aumentar la estabilidad de la secuencia de ácido nucleico del ARNm, se ha descubierto sorprendentemente que la inclusión de una secuencia parcial de un gen CMV immediate-early 1 (IE1) mejora la traducción del ARNm y la expresión de la proteína o enzima funcional. También se contempla la inclusión de una secuencia del gen de la hormona del crecimiento humano (hGH), o un fragmento del mismo (por ejemplo, NÚMERO DE ID DE SECUENCIA:2) en los extremos 3' del ácido nucleico (por ejemplo, ARNm) para estabilizar aún más el ARNm. Generalmente, las modificaciones preferidas mejoran la estabilidad y/o las propiedades farmacocinéticas (por ejemplo, la vida media) del ARNm en relación con sus homólogos no modificados, e incluyen, por ejemplo, modificaciones realizadas para mejorar la resistencia de dicho ARNm a la digestión in vivo por nucleasas.
Se contemplan además variantes de la secuencia de ácido nucleico de NÚMERO DE ID DE SECUENCIA: 1 y/o NÚMERO DE ID DE SECUENCIA:2, caracterizado porque las variantes mantienen las propiedades funcionales de los ácidos nucleicos, incluida la estabilización del ARNm y/o las propiedades farmacocinéticas (por ejemplo, vida media). Las variantes pueden tener una identidad de secuencia superior al 90%, superior al 95%, superior al 98% o superior al 99% según el número de ID de SEQ: 1 o número de ID de SEQ:2.
Cuando el ARN se hibrida con una molécula de ácido nucleico complementario (por ejemplo, ADN o ARN), se puede proteger de las nucleasas. (Krieg, et al. Melton. Methods in Enzymology. 1987; 155, 397-415). La estabilidad del ARNm hibridado se debe probablemente a la especificidad inherente de cadena única de la mayoría de las RNasas. En algunas realizaciones, el reactivo estabilizador seleccionado para complejar un ARNm es una proteína eucariota, (por ejemplo, una proteína de mamífero). En otra realización, el ARNm puede modificarse por hibridación con una segunda molécula de ácido nucleico. Si toda una molécula de ARNm se hibridara con una molécula de ácido nucleico complementaria, podría reducirse la iniciación de la traducción. En algunas realizaciones, la región 5' no traducida y la región de inicio AUG de la molécula de ARNm pueden dejarse opcionalmente sin hibridar. Tras el inicio de la traducción, la actividad desenrolladora del complejo ribosómico puede funcionar incluso en dúplex de alta afinidad para que la traducción pueda continuar. (Liebhaber. J. Mol. Biol. 1992; 226: 2-13; Monia,et al.J Biol Chern. 1993; 268: 14514-22.)
Se entenderá que cualquiera de los métodos descritos anteriormente para aumentar la estabilidad del ARNm puede utilizarse solo o en combinación con uno o más de cualquiera de los otros métodos y/o composiciones descritas anteriormente.
El ARNm que se incluya en la composición para el uso según la invención puede combinarse opcionalmente con un gen informador (por ejemplo, aguas arriba o aguas abajo de la región codificante del ARNm) que, por ejemplo, facilite la determinación de la entrega del ARNm a las células o tejidos diana. Los genes informadores adecuados pueden incluir, por ejemplo, el ARNm de la proteína fluorescente verde (ARNm de GFP), el ARNm de la luciferasa de Renilla (ARNm de luciferasa), el ARNm de la luciferasa de luciérnaga o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, el ARNm de GFP puede fusionarse con un ARNm que codifica una proteína secretable para facilitar la confirmación de la localización del ARNm en las células diana que actuarán como un depósito para la producción de proteínas.
Tal y como se utilizan en el presente documento, los términos "transfectar" o "transfección" se refieren a la introducción intracelular de un ARNm en una célula, o preferiblemente en una célula diana. El ARNm introducido puede mantenerse de forma estable o transitoria en la célula diana. El término "eficacia de transfección" se refiere a la cantidad relativa de ARNm captada por la célula diana sometida a transfección. En la práctica, la eficacia de la transfección se estima por la cantidad de un producto de ácido nucleico informador expresado por las células diana tras la transfección. Las realizaciones preferidas incluyen composiciones con altas eficacias de transfección y, en particular, aquellas composiciones que minimizan los efectos adversos mediados por la transfección de células no diana. Las composiciones que demuestran altas eficacias de transfección mejoran la probabilidad de que las dosis apropiadas del arco de ARNm sean particularmente adecuadas para su administración a la célula diana, minimizando al mismo tiempo los posibles efectos adversos sistémicos. En una realización de la presente invención, los vehículos de transferencia son capaces de Entregar secuencias de ARNm de gran tamaño (por ejemplo, ARNm de al menos 1kDa, 1,5kDa, 2 kDa, 2,5kDa, 5kDa, lOkDa, 12kDa, 15kDa, 20kDa, 25kDa, 30kDa, o más, o alternativamente ARNm de un tamaño comprendido entre 0,2 kilobases (kb) y 10 kb o más, por ejemplo, ARNm de un tamaño mayor o igual a 0,2 kb, 0,5 kb, 1 kb, 1,5 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb o 4,5 kb, y/o que tenga un tamaño de hasta 5 kb, 5,5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb o 10 kb). El ARNm puede formularse con uno o más reactivos aceptables, que proporcionan un vehículo para administrar dicho ARNm a las células diana. Los reactivos apropiados se seleccionan generalmente teniendo en cuenta una serie de factores, que incluyen, entre otros, las propiedades biológicas o químicas del ARNm, la vía de administración prevista, el entorno biológico previsto al que se expondrá dicho ARNm y las propiedades específicas de las células diana previstas. En algunas realizaciones, el vehículo de transferencia demuestra una unión preferente y/o sustancial a una célula diana en relación con las células no diana. En una realización preferida, el vehículo de transferencia entrega su contenido a la célula diana de forma que el ARNm se entrega al compartimento subcelular apropiado, como el citoplasma.
Vehículo de transferencia
El vehículo de transferencia en las composiciones de la invención es un vehículo de transferencia liposomal, por ejemplo, una nanopartícula lipídica o una nanopartícula lipidoide. En una realización, el vehículo de transferencia puede seleccionarse y/o prepararse para optimizar la entrega del ARNm a una célula diana.
Los liposomas (por ejemplo, las nanopartículas lipídicas liposomales) suelen ser útiles en diversas aplicaciones de la investigación, la industria y la medicina, sobre todo por su uso como vehículos de transferencia de compuestos diagnósticos o terapéuticos in vivo (Lasic, Trends Biotechnol: 307-321, 1998; Drummond et al., Pharmacol. Rev., 51: 691 743, 1999) y suelen caracterizarse como vesículas microscópicas que tienen un espacio acuoso interior secuestrado de un medio exterior por una membrana de una o más bicapas. Las membranas bicapa de los liposomas suelen estar formadas por moléculas anfifílicas, como lípidos de origen sintético o natural que comprenden dominios hidrófilos e hidrófobos separados espacialmente (Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998).
En el contexto de la presente invención, un vehículo de transferencia liposomal suele servir para transportar el ARNm a la célula diana. Para los fines de la presente invención, los vehículos de transferencia liposomal se preparan para contener el ARNm. El proceso de incorporación de un ARNm a un liposoma suele denominarse "carga" (Lasic, et al., FEBS Lett., 312: 255-258, 1992). El ARNm incorporado al liposoma puede estar total o parcialmente localizado en el espacio interior del liposoma, dentro de la membrana bicapa del liposoma o asociado a la superficie exterior de la membrana del liposoma. La incorporación de un ácido nucleico en liposomas también se denomina aquí "encapsulación", en la que el ácido nucleico queda totalmente contenido en el espacio interior del liposoma. El propósito de incorporar un ARNm en un vehículo de transferencia, como un liposoma, suele ser proteger el ácido nucleico de un entorno que puede contener enzimas o sustancias químicas que degraden los ácidos nucleicos y/o sistemas o receptores que provoquen la excreción rápida de los ácidos nucleicos. Por consiguiente, en una realización preferida de la presente invención, el vehículo de transferencia seleccionado es capaz de aumentar la estabilidad del ARNm contenido en él. El liposoma puede permitir que el ARNm encapsulado llegue a la célula diana y/o puede permitir preferentemente que el ARNm encapsulado llegue a la célula diana, o alternativamente limitar la entrega de dicho ARNm a otros sitios o células donde la presencia del ARNm administrado puede ser inútil o indeseable. Además, la incorporación del ARNm en un vehículo de transferencia también facilita la entrega de dicho ARNm en una célula diana.
Idealmente, los vehículos liposomales de transferencia se preparan para encapsular uno o más ARNm deseados de forma que las composiciones demuestren una alta eficacia de transfección y una estabilidad mejorada.
Nanopartículas lipídicas
En la presente invención, el vehículo de transferencia se formula como una nanopartícula lipídica. Tal y como se utiliza aquí, la frase "nanopartícula lipídica" se refiere a un vehículo de transferencia que comprende uno o más lípidos (por ejemplo, lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos y lípidos modificados con PEG). La nanopartícula lipídica está formulada para administrar uno o más ARNm a una o más células diana. Algunos ejemplos de lípidos adecuados son, por ejemplo, los compuestos fosfatidílicos (como el fosfatidilglicerol, la fosfatidilcolina, la fosfatidilserina, la fosfatidiletanolamina, los esfingolípidos, los cerebrósidos y los gangliósidos). El vehículo de transferencia se selecciona en función de su capacidad para facilitar la transfección de un ARNm a una célula diana.
En la presente invención, la composición utiliza nanopartículas lipídicas como vehículos de transferencia que comprenden un lípido catiónico para encapsular y/o mejorar la entrega de ARNm a la célula diana que actuará como depósito para la producción de proteínas. Tal como se utiliza aquí, la frase "lípido catiónico" se refiere a cualquiera de una serie de especies lipídicas que llevan una carga neta positiva a un pH seleccionado, como el pH fisiológico. Las nanopartículas lipídicas se preparan incluyendo mezclas de lípidos multicomponentes de proporciones variables que emplean uno o más lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos y lípidos modificados con PEG. En la literatura se han descrito varios lípidos catiónicos, muchos de los cuales están disponibles comercialmente.
Entre los lípidos catiónicos especialmente adecuados para llevar a cabo la invención se encuentran los descritos en la publicación de patente internacional WO 2010/053572, y más concretamente, los C12-200,
que se describe en el párrafo [00225] del documento WO 2010/053572.
En ciertas realizaciones, las composiciones emplear nanopartículas lipídicas que comprendan un lípido catiónico ionizable descrito en la solicitud de patente provisional de EE.UU. 61/617,468, presentada el 29 de marzo de 2012, como, por ejemplo, (15Z, 18Z)-N,N-dimetil-6-(9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1 -il)tetracosa-15,18-dien-1 - amina (HGT5000), (15Z,18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-l- il)tetracosa-4,15,18-trien-l-amina (HGT5001), y (15Z,18Z)-N,N-dimetil-6- ((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1 -il)tetracosa-5,15,18-trien-1 -amina (HGT5002).
En algunas realizaciones, el lípido o lípidos catiónicos son biodegradables y son compuestos de fórmula (I):
o una sal de la misma,
en la que
(i) R1 y R2 son alquilo, alquenil, alquinilo, alquililo, cicloalquilo, cicloalquilo o heterociclos sustituidos independientemente opcionalmente;
(ii) R1 y R2, junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un anillo heterocílico opcionalmente sustituido;
(iii) uno de R1 y R2 es opcionalmente alquilo, alquenil, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquilo o heterociclo, y el otro forma un anillo heterocíclico de 4-10 miembros o heteroarilo con (a) el átomo de nitrógeno adyacente y (b) el grupo (R)un grupo adyacente al átomo de nitrógeno;
cada aparición de R es, independientemente, _(CR3R4);
cada aparición de R3 y R4 son, independientemente H, OH, alquilo, alcoxi, -NH2, alquilamina o dialquilamina; o R3 y R4, junto con el átomo de carbono al que están directamente unidos, forman un grupo cicloalquilo, en el que
no más de tres grupos R en cada cadena unida al carbono C* son cicloalquilo (por ejemplo, ciclopropilo); la línea discontinua a Q está ausente o es un vínculo; ;cuando la línea discontinua a Q está ausente, entonces Q está ausente o es ;-0-, -S-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R4)-, -N(R5)C(0)-, -S-S-, -OC(O)O-, ;-O-N=C(R5)-, -C(R5) N-O-, -OC(O)N(R5)-, -N(R5)C(0)N(R5), -N(R5)C(0)0-, -C(O)S-, -C(S)O- o -C(R5) N-O-C(O)- ;o ;cuando la línea discontinua a Q es un enlace, entonces b es °y Q y el carbono terciario adyacente a él (C*) forman un grupo heterocíclico sustituido o no sustituido, mono o bicíclico que tiene de 5 a 10 átomos de anillo;
QI y Q2 están cada uno, independientemente, ausentes, -0-, -S-, -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -S-S-, -C(0)(NR5)-, -N(R5)C(0)-, -C(S)(NR5)-,
-N(R5)C(0)-, -N(R5)C(0)N(R5)-, o -OC(O)O-;
Q3 y Q4 son cada uno, independientemente, H, -(CR3R4)-, arilo, o una fracción de colesterol;
cada aparición de Al, A2, A3 y A4 es, independientemente, -(CR5R5-CR5=CR5)-;
cada aparición de R5 es, independientemente, H o alquilo;
M1 y M2 son, independientemente, un grupo biodegradable;
Z está ausente, alquileno o -O-P(O)(OH)-O-;
cada unido a Z es un enlace opcional, tal que cuando Z está ausente, Q3 y Q4
no están directamente unidos covalentemente;
a es 1,2,3,4,5 ó 6;
b es 0, 1,2 o 3;
c, d, e, f, i, j, m, n, q y r son cada uno, independientemente, 0, 1, 2, 3,4,5,6,7,8,9 o 10;
g y h son cada uno, independientemente, 0, 1 o 2;
k y l son cada uno, independientemente, ° o I, donde al menos uno de
k y l soy l; y
o y p son cada uno, independientemente, 0, 1 o 2.
Los lípidos biodegradables específicos adecuados para su uso en las composiciones para los fines de la invención incluyen:
y sus sales. Otros lípidos catiónicos biodegradables específicos incluidos en la fórmula I, como los compuestos de cualquiera de las fórmulas I-XXIII, incluidos los compuestos de fórmula IA-1, IA-2, IB, IC o ID, descritos en el documento US 2012/0027803.
Otros lípidos catiónicos adecuados para los fines de la invención se describen en US 20100267806. Por ejemplo, los lípidos de fórmula II:
donde R1 y R2 son independientemente alquilo, alquenilo o alquinilo, cada uno puede estar opcionalmente sustituido, y R3 y R4 son independientemente alquilo inferior o R3 y R4 pueden tomarse juntos para formar un anillo heterocíclico opcionalmente sustituido. Los lípidos catiónicos específicos adecuados para los fines de la invención son XTC (2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[l,3]-dioxolano) y, MC3 (((6Z,9Z,28Z,3IZ)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4-(dimetilamino) butanoato):
Otro lípido catiónico que puede utilizarse para los fines de la invención es NC98-5 (4,7,13-tris(3-oxo-3-(undecilamino)propil)-Nl,N16-diundecil-4,7,10,13 -tetraazahexadecano-1,16-diamida):
que se describe en WO06138380A2.
En algunas realizaciones, se utiliza el lípido catiónico N-[l-(2,3-dioleyloxi)propil] - N,N,N-cloruro de trimetilamonio o "DOTMA". (Feigner et al. (Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987); patente estadounidense n.° 4.897.355). El DOTMA puede formularse solo o puede combinarse con el lípido neutro, dioleoilfosfatidil-etanolamina o "DOPE" u otros lípidos catiónicos o no catiónicos en un vehículo de transferencia liposomal (una nanopartícula lipídica en el contexto de la invención), y dichos liposomas pueden utilizarse para potenciar la entrega de ácidos nucleicos en las células diana. Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen, por ejemplo, 5- carboxispermylglycinedioctadecylamida o "DOGS," 2,3-dioleyloxy-N-[2(espermina- carboxamido)etilo]-N,N-dimetilo-l-propanamina o "Do SpA" (Behr et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. 86, 6982 (1989); Patente estadounidense n.° 5,171,678 (patente estadounidense n.° 5,334,761), l,2-dioleoyl-3-dimetiloamoniopropano o "DODAP", l,2-dioleoyl-3- trimetilamonio-propano o "DOTAP". Los lípidos catiónicos contemplados también incluyen l,2-disteariloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DSDMA", 1,2-dioleyloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DODMA", 1.2- dilinoleyloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DLinDMA", l,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DLenDMA", N-dioleyl-N,N-dimetilamonio cloruro o "DODAC", N,N-distearil-N,N-dimetilamonio bromuro o "DDAB", N-(l,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietil bromuro de amonio o "DMRIE", 3-dimetilamino-2-(cholest-5-en-3-betaoxibutan-4-oxi)-l-(cis,cis-9,12- octadecadienoxi)propano o "CLinDMA", 2-[5'-(cholest-5-en-3-beta-oxy)-3'- oxapentoxy)-3-dimethy l-l-(cis,cis-9', l-2'-octadecadienoxy)propane o "CpLinDMA", N,N-dimethyl-3,4-dioleyloxybencilamine o "DMOBA", 1.2- N,N'- dioleylcarbamyl-3-dimethylaminopropane o "DOcarbDAP", 2,3-Dilinoleoyloxy- N,N-dimethylpropylamine o "DLinDAP", l,2-N,N'-Dilinoleylcarbamyl-3-dimethylaminopropane o "DLincarbDAP", l, 2-dilinoleoylcarbamyl-3-dimethylaminopropane o "DLinCDAP", 2,2-dilinoleyl-4-dimethylaminomethyl- [l,3]-dioxolane o "DLin-K-DMA", 2,2-dilinoleyl-4-dimethylaminoethyl-[l,3]- dioxolane o "DLin-K-XTC2-DMA", y 2-(2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-l- yl)-l,3-dioxolan-4-yl)-N,N-dimetiletanamina(DLin-KC2-DMA)) (Ver WO 2010/042877; Semple et al., Nature Biotech. 28:172-176 (2010)), o mezclas de los mismos. (Heyes, J., etal., J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissey, DV., etal., Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005); Publicación del PCT WO2005/121348A1).
Los lípidos catiónicos a base de colesterol también son adecuados para la realización de la presente invención. Estos lípidos catiónicos a base de colesterol pueden utilizarse solos o en combinación con otros lípidos catiónicos o no catiónicos. Los lípidos catiónicos adecuados a base de colesterol incluyen, por ejemplo, DC-Chol (N,N-dimetil-N-etilcarboxamidocolesterol), l,4-bis(3-N-oleilamino-propil)piperazina (Gao, etal. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991); Wolf et al. BioTechniques 23, 139 (1997); Patente estadounidense n.° 5.744.335), o Ic e .
También se contemplan los lípidos catiónicos, como los lípidos a base de dialquilamina, imidazol y guanidinio. Por ejemplo, ciertas realizaciones se dirigen a una composición que comprende uno o más lípidos catiónicos a base de imidazol, por ejemplo, el éster de colesterol imidazol o el lípido "ICE" (3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-dimetil-17-((R)-6-metilheptan-2-il)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro-lH-ciclopenta[a]fenantren-3-il 3-(lH-imidazol-4-il)propanoato, tal y como se representa en la estructura (I) a continuación. En una realización preferida, un vehículo de transferencia para la administración de ARNm puede comprender uno o más lípidos catiónicos a base de imidazol, por ejemplo, el éster de colesterol imidazol o el lípido "ICE" (3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-dimetil-17-((R)-6-metilheptan-2-il)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro-lH-ciclopenta[a]fenantren-3-il 3-(lH-imidazol-4-il)propanoato:
Sin querer estar limitado por una teoría en particular, se cree que la fusogenicidad del lípido catiónico ICE basado en imidazol está relacionada con la alteración endosomal facilitada por el grupo imidazol, que tiene un pKa más bajo en relación con los lípidos catiónicos tradicionales. La alteración endosomal a su vez promueve la hinchazón osmótica y la interrupción de la membrana liposomal, seguida de la transfección o liberación intracelular del contenido de ácidos nucleicos cargados en la célula diana.
Los lípidos catiónicos a base de imidazol también se caracterizan por su toxicidad reducida en relación con otros lípidos catiónicos. Los lípidos catiónicos a base de imidazol (por ejemplo, ICE) se pueden usar como el único lípido catiónico en la nanopartícula lipídica, o alternativamente se pueden combinar con lípidos catiónicos tradicionales, lípidos no catiónicos y lípidos modificados con PEG. Los lípidos catiónicos pueden comprender una relación molar de aproximadamente 1% a aproximadamente 90%, aproximadamente 2% a aproximadamente 70%, aproximadamente 5% a aproximadamente 50%, aproximadamente 10% a aproximadamente 40% del lípido total presente en el vehículo de transferencia, o preferiblemente alrededor del 20% a aproximadamente el 70% del lípido total presente en el vehículo de transferencia.
De manera similar, ciertas realizaciones se dirigen a nanopartículas lipídicas que comprenden el lípido catiónico HGT4003 2-((2,3-Bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-l- iloxi)propil)disulfanilo)-N,N-dimetiletanamina, representado por la estructura (IV) a continuación, y como se describe más adelante en EE. Solicitud Provisional estadounidense n.°:61/494.745, presentada el 8 de junio de 2011.
En otras realizaciones, las composiciones y métodos descritos en este documento se dirigen a nanopartículas lipídicas que comprenden uno o más lípidos escindibles, como, por ejemplo, uno o más lípidos catiónicos o compuestos que comprenden un grupo funcional disulfuro (S-S) escindible (por ejemplo, HGT4001, h Gt 4002, HGT4003, HGT4004 y HGT4005), como se describe más adelante en Solicitud provisional de EE.UU. n°: 61/494.745.
Fosfolípidos modificados con polietilenglicol (PEG) y lípidos derivados como ceramidas derivatizadas (PEG-CER), incluida la N-octanoil-esfingosina-l-[Succinil(metoxipolietilenglicol)-2000] (C8 PEG-2000 ceramida) puede también puede utilizarse para la presente invención, ya sea sola o preferiblemente en combinación con otros lípidos juntos que comprenden el vehículo de transferencia (por ejemplo, una nanopartícula lipídica). Los lípidos modificados con PEG contemplados incluyen, pero no se limitan a, una cadena de polietilenglicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido con cadenas alquilo de longitud C6-C20. La adición de tales componentes puede prevenir la agregación compleja y también puede proporcionar un medio para aumentar la vida útil de la circulación y aumentar la entrega de la composición de ácido lipídico-nucleico a la célula diana, (Klibanov et al. (1990) FEBS Letters, 268 (1): 235 237), o pueden ser seleccionados para intercambiar rápidamente fuera de la formulación in vivo (ver Patente estadounidense n.° 5.885.613). Los lípidos intercambiables particularmente útiles son las CERAMIDAS PEG que tienen cadenas de acilo más cortas (por ejemplo, C14 o C18). Los fosfolípidos modificados con PEG y los lípidos derivados pueden comprender una relación molar de aproximadamente 0% a aproximadamente 20%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 20%, alrededor del 1% a aproximadamente 15%, alrededor del 4% a aproximadamente el 10%, o aproximadamente el 2% del lípido total presente en el vehículo de transferencia liposomal.
La presente invención también contempla el uso de lípidos no catiónicos. Tal como se usa aquí, la frase "lípido no catiónico" se refiere a cualquier lípido neutro, zwitteriónico o aniónico. Tal como se usa aquí, la frase "lípido aniónico" se refiere a cualquiera de una serie de especies de lípidos que llevan una carga negativa neta a un pH seleccionado, como el pH fisiológico. Los lípidos no catiónicos incluyen, pero no se limitan a, distearoilolfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilofosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoiloosfatidilcolina (DPPC), dioleoilo fosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilo fosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilofosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilofosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE), dioleoilofosfatidiletanolamina 4-(N- maleimidometilo)-ciclohexano-l-carboxilato (DOPE-mal), dipalmitoil fosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), distearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE), 16-0-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1-trans PE, l-estearoil-2-oleoil-fosfatidianolamina (SOPE), colesterol, o una mezcla de los mismos. El lípido no catiónico puede comprender una relación molar del 5% a aproximadamente el 90%, o preferiblemente alrededor del 10% a aproximadamente el 70% del lípido total presente en el vehículo de transferencia.
Preferiblemente, el vehículo de transferencia (es decir, una nanopartícula lipídica) se prepara combinando múltiples componentes lipídicos. Por ejemplo, un vehículo de transferencia puede comprender OTC, DSPC, chol y DMG-PEG o MC3, DSPC, chol y DMG-PEG o C12-200, DOPE, chol y DMG-PEG2K. La selección de los lípidos catiónicos, los lípidos no catiónicos y los lípidos modificados con PEG que componen la nanopartícula lipídica, así como la proporción molar relativa de dichos lípidos entre sí, se basa en las características de los lípidos seleccionados, la naturaleza de las células diana previstas y las características del ARNm que debe administrarse. Por ejemplo, puede prepararse un vehículo de transferencia utilizando Cl2-200, DOPE, col, DMG-PEG2K en una proporción molar de 40:30:25:5; o DODAP, DOPE, col, DMG-PEG2K en una proporción molar de 18:56:20: 6; o HGT5000, dOpE, colesterol, DMG-PEG2K en una proporción molar de 40:20:35:5; o hGt 5001, DOPE, colesterol, DMG- PEG2K en una proporción molar de 40:20:35:5; o x Tc , DSPC, colesterol, PEG-DMG en una proporción molar de 575:7,5:31,5:3,5 o una relación amolar de 60:7,5:31:1,5; oMC3, DSPC, col, PEG-DMG en una relación molar de 50:10:38.5:1.5 o una relación molar de 40:15:40:5; o MC3, DSPC, chol, PEG-DSG/GalNAc-PEGDSG en una relación molar de 50:10:35:4.5:0.5.
Otras consideraciones incluyen, por ejemplo, la saturación de la cadena alquilo, así como el tamaño, la carga, el pH, el pKa, la fusogenicidad y la toxicidad de los lípidos seleccionados. Así, las proporciones molares pueden ajustarse en consecuencia. Por ejemplo, el porcentaje de lípido(s) catiónico(s) en la nanopartícula lipídica puede ser superior al 10%, superior al 20%, superior al 30%, superior al 40%, superior al 50%, superior al 60% o superior al 70%. El porcentaje de lípido(s) no catiónico(s) en la nanopartícula lipídica puede ser superior al 5%, superior al 10%, superior al 20%, superior al 30% o superior al 40%. El porcentaje de colesterol en la nanopartícula lipídica puede ser superior al 10%, superior al 20%, superior al 30% o superior al 40%. El porcentaje de lípido(s) modificado(s) con PEG en la nanopartícula lipídica puede ser superior al 1%, superior al 2%, superior al 5%, superior al 10% o superior al 20%.
En ciertas realizaciones preferidas, las nanopartículas lipídicas para los fines de la invención comprenden al menos uno de los siguientes lípidos catiónicos: C12-200, DLin-KC2- DMA, Do DAP, HGT4003, ICE, HGT5000 o HGT5001. En algunas realizaciones, el vehículo de transferencia comprende colesterol. En algunas realizaciones, los vehículos de transferencia comprenden DMG-PEG2K. En ciertas realizaciones, el vehículo de transferencia comprende una de las siguientes formulaciones lipídicas: C12-200, DOPE, chol, DMG-PEG2K; DODAP, DOPE, colesterol, DMG-PEG2K; HGT5000, DOPE, chol, DMG-PEG2K, HGT5001, DOPE, col, DMG-PEG2K.
Los vehículos de transferencia liposomal adecuados para los fines de la invención pueden prepararse mediante diversas técnicas conocidas actualmente en la técnica. Las vesículas multilamelares (MLV) pueden prepararse mediante técnicas convencionales, por ejemplo, depositando un lípido seleccionado en la pared interior de un recipiente o contenedor adecuado, disolviendo el lípido en un disolvente apropiado y evaporando después el disolvente para dejar una fina película en el interior del recipiente o mediante secado por pulverización. A continuación, se puede añadir una fase acuosa al recipiente con un movimiento de vórtice que da lugar a la formación de MLV. A continuación, pueden formarse vesículas unilamelares (ULV) mediante homogeneización, sonicación o extrusión de las vesículas multilamelares. Además, pueden formarse vesículas unilamelares mediante técnicas de eliminación de detergentes.
En ciertas realizaciones de esta invención, las composiciones comprenden un vehículo de transferencia en el que el ARNm está asociado tanto en la superficie del vehículo de transferencia como encapsulado dentro del mismo vehículo de transferencia. Por ejemplo, durante la preparación de dichas composiciones, los vehículos de transferencia liposomales catiónicos pueden asociarse con el ARNm mediante interacciones electrostáticas.
En ciertas realizaciones, las composiciones pueden estar cargadas con radionucleidos de diagnóstico, materiales fluorescentes u otros materiales detectables tanto en aplicacionesin vitrocomo in vivo. Por ejemplo, los materiales de diagnóstico adecuados pueden incluir rodamina-dioleoilfosfa- tidiletanolamina (Rh-PE), ARNm de proteína fluorescente verde (ARNm de GFP), ARNm de la luciferasa de Renilla y ARNm de luciferasa Firefly.
La selección del tamaño adecuado de un vehículo de transferencia liposomal debe tener en cuenta el lugar de la célula o tejido diana y, en cierta medida, la aplicación para la que se fabrica el liposoma. En algunas realizaciones, puede ser deseable limitar la transfección del ARNm a determinadas células o tejidos. Alternativamente, un vehículo de transferencia liposomal puede tener un tamaño tal que las dimensiones del liposoma tengan un diámetro suficiente para limitar o evitar expresamente su distribución en determinadas células o tejidos. Generalmente, el tamaño del vehículo de transferencia está dentro del intervalo de unos 25 a 250 nm, preferiblemente menos de unos 250 nm, 175 nm, 150 nm, 125 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm, 25 nm o 10 nm.
Existen diversos métodos alternativos conocidos en la técnica para dimensionar una población de vehículos de transferencia liposomal. Uno de estos métodos de dimensionamiento se describe en la Pat. estadounidense n.° 4.737.323. La sonicación de una suspensión de liposomas, ya sea por sonicación en baño o por sonicación con sonda, produce una reducción progresiva del tamaño hasta alcanzar pequeñas ULV de menos de 0,05 micras de diámetro aproximadamente. La homogeneización es otro método que se basa en la energía de cizallamiento para fragmentar los liposomas grandes en otros más pequeños. En un procedimiento típico de homogeneización, los MLV se recirculan a través de un homogeneizador de emulsión estándar hasta que se observan los tamaños de liposomas seleccionados, normalmente entre 0,1 y 0,5 micras aproximadamente. El tamaño de las vesículas liposomales puede determinarse mediante dispersión de luz cuasieléctrica (QELS), como se describe en Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10:421-450 (1981). El diámetro medio de los liposomas puede reducirse por sonicación de los liposomas formados. Los ciclos intermitentes de sonicación pueden alternarse con la evaluación QEL<s>para orientar la síntesis eficaz de liposomas.
Células diana
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "célula diana" se refiere a una célula o tejido al que se va a dirigir o apuntar una composición de la invención. Las células diana son deficientes en una proteína asociada al surfactante pulmonar.
En una realización, las composiciones para uso según la invención facilitan la producción endógena de un sujeto de una o más proteínas funcionales asociadas al surfactante pulmonar, y en particular la producción de proteínas asociadas al surfactante pulmonar que demuestran una menor inmunogenicidad en relación con sus homólogas preparadas recombinantemente. Tras la distribución de dichas composiciones en los tejidos diana y la posterior transfección de dichas células diana, el ARNm exógeno cargado en el vehículo de transferencia liposomal (z.e., una nanopartícula lipídica) se traduce in vivo para producir una proteína funcional asociada al surfactante pulmonar codificada por el ARNm administrado exógenamente. En consecuencia, las composiciones para uso según la presente invención explotan la capacidad de un sujeto para traducir ARNm preparado de forma exógena o recombinante para producir una proteína asociada al surfactante pulmonar traducida de forma endógena, y así producir y excretar una proteína asociada al surfactante pulmonar funcional. Las proteínas asociadas al surfactante pulmonar expresadas o traducidas también pueden caracterizarse por la inclusión in vivo de modificaciones postraduccionales nativas que a menudo pueden estar ausentes en las proteínas asociadas al surfactante pulmonar preparadas de forma recombinante, reduciendo así aún más la inmunogenicidad de la proteína asociada al surfactante pulmonar traducida.
La administración de ARNm que codifica una proteína o enzima de la que el sujeto es deficiente evita la necesidad de administrar los ácidos nucleicos a orgánulos específicos dentro de una célula diana. Más bien, tras la transfección de una célula diana y la entrega de los ácidos nucleicos al citoplasma de la célula diana, el contenido de ARNm de un vehículo de transferencia puede traducirse y expresarse una proteína o enzima funcional.
La presente invención también permite la focalización discriminatoria de células y tejidos diana por medios de focalización tanto pasivos como activos. El fenómeno de la orientación pasiva explota los patrones de distribución naturales de un vehículo de transferenciain vivosin depender del uso de excipientes adicionales o medios para mejorar el reconocimiento del vehículo de transferencia por las células diana.
Alternativamente, la presente invención permite una orientación activa, que implica el uso de excipientes adicionales, denominados en el presente documento "ligandos de orientación", que pueden unirse (de forma covalente o no covalente) al vehículo de transferencia para favorecer la localización de dicho vehículo de transferencia en determinadas células o tejidos diana. Por ejemplo, la focalización puede estar mediada por la inclusión de uno o más ligandos dirigidos endógenos (por ejemplo, apolipoproteína E) en o sobre el vehículo de transferencia para estimular la distribución a las células o tejidos diana. El reconocimiento del ligando diana por los tejidos diana facilita activamente la distribución tisular y la captación celular del vehículo de transferencia y/o su contenido en las células y tejidos diana. Como se proporciona en este documento, la composición puede comprender un ligando capaz de mejorar la afinidad de la composición con la célula diana. Los ligandos dirigidos pueden estar vinculados a la bicapa externa de la partícula lipídica durante la formulación o después de la formulación. Estos métodos son bien conocidos en la técnica. Además, algunas formulaciones de partículas lipídicas pueden emplear polímeros fusogénicos como PEAA, hemagluttinina, otros lipopéptidos (ver EE. Ser. Solicitud de Patente n.°. 08/835.281 y 60/083,294) y otras características útiles para la administración in vivo y/o intracelular. En otras algunas realizaciones, las composiciones demuestran eficacias de transfección mejoradas, y/o demuestran una selectividad mejorada hacia las células o tejidos diana de interés. Por lo tanto, se contemplan composiciones que comprenden uno o más ligandos (por ejemplo, péptidos, aptámeros, oligonucleótidos, una vitamina u otras moléculas) capaces de aumentar la afinidad de las composiciones y su contenido en ácidos nucleicos por las células o tejidos diana. Los ligandos adecuados pueden unirse o enlazarse opcionalmente a la superficie del vehículo de transferencia. En algunas realizaciones, el ligando diana puede abarcar la superficie de un vehículo de transferencia o estar encapsulado dentro del vehículo de transferencia. Los ligandos adecuados y se seleccionan en función de sus propiedades físicas, químicas o biológicas (por ejemplo, afinidad selectiva y/o reconocimiento de marcadores o características de la superficie de la célula diana). Los sitios diana específicos de la célula y su correspondiente ligando diana pueden variar ampliamente. Los ligandos diana adecuados se seleccionan de forma que se aprovechen las características únicas de una célula diana, permitiendo así que la composición discrimine entre células diana y no diana. Por ejemplo, las composiciones de la invención pueden incluir marcadores de superficie (Ver Hillery AM, et al. “Drug Delivery and Targeting: For Pharmacists and Pharmaceutical Scientists” (2002) Taylor & Francis, Inc.) La presentación de dichos ligandos de focalización que se han conjugado con elementos presentes en el vehículo de transferencia (z.e., una nanopartícula lipídica) facilita por tanto el reconocimiento y la captación de las composiciones de la presente invención en las células y tejidos diana. Algunos ejemplos de ligandos diana adecuados son uno o varios péptidos, proteínas, aptámeros, vitaminas y oligonucleótidos.
Aplicación y Administración
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamífero), incluidos, entre otros, los seres humanos, los primates no humanos, los roedores y similares, al que se administran las composiciones y los métodos de la presente invención. Normalmente, los términos "sujeto" y "paciente" se utilizan indistintamente en el presente documento en referencia a un sujeto humano.
Las composiciones aquí proporcionadas son adecuadas para el tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con la deficiencia de proteínas asociadas al surfactante pulmonar que son excretadas o secretadas por la célula diana al fluido extracelular circundante - véase la Tabla 1).
Tabla 1. Proteínas secretadas
En algunas realizaciones, la composición se formula en combinación con uno o más ácidos nucleicos adicionales, portadores, ligandos diana o reactivos estabilizadores, o en composiciones farmacológicas en las que se mezcla con excipientes adecuados. Por ejemplo, en una realización, las composiciones de la invención pueden prepararse para administrar ARNm que codifique dos o más proteínas distintas. Técnicas para formulación y administración de medicamentos se puede encontrar en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa., última edición.
Una amplia gama de moléculas que pueden ejercer efectos farmacéuticos o terapéuticos pueden administrarse en células diana utilizando composiciones y métodos de la invención. Las moléculas pueden ser orgánicas o inorgánicas. Las moléculas orgánicas pueden ser péptidos, proteínas, hidratos de carbono, lípidos, esteroles, ácidos nucleicos (incluidos los ácidos nucleicos peptídicos) o cualquier combinación de los mismos. Una formulación para su administración en células diana puede comprender más de un tipo de molécula, por ejemplo, dos secuencias de nucleótidos diferentes, o una proteína, una enzima o un esteroide.
Las composiciones para el uso según la presente invención pueden administrarse y dosificarse de acuerdo con la práctica médica actual, teniendo en cuenta el estado clínico del sujeto, el lugar y el método de administración, la programación de la administración, la edad, el sexo, el peso corporal del sujeto y otros factores relevantes para los médicos con conocimientos ordinarios en la materia. La "cantidad efectiva" a los efectos del presente documento puede determinarse mediante las consideraciones pertinentes que conozcan las personas con conocimientos ordinarios en investigación clínica experimental y en las artes farmacológica, clínica y médica. En algunas realizaciones, la cantidad a administrar es eficaz para lograr al menos cierta estabilización, mejora o eliminación de los síntomas y otros indicadores seleccionados como medidas apropiadas de progreso, regresión o mejora de la enfermedad por los expertos en la materia. Por ejemplo, una cantidad y un régimen de dosificación adecuados son aquellos que provocan al menos una producción transitoria de proteínas.
Las vías adecuadas de administración pulmonar incluyen la administración intratraqueal o inhalada. Los aerosoles que contienen composiciones de la presente invención pueden ser inhalados (para administración nasal, traqueal o bronquial).
También se divulgan en el presente documento las composiciones farmacéuticas liofilizadas que comprenden una o más de las nanopartículas liposomales divulgadas en el presente documento; el uso de dichas composiciones liofilizadas como se divulga, por ejemplo, en el documento WO2012/170889. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas liofilizadas según la invención pueden reconstituirse antes de su administración o pueden reconstituirse in vivo. Por ejemplo, una composición farmacéutica liofilizada puede formularse en una forma farmacéutica adecuada administrada de tal modo que la forma farmacéutica se rehidrate con el tiempo in vivo por los fluidos corporales del individuo.
Cada una de las publicaciones, materiales de referencia, números de acceso y similares aquí referenciados describen los antecedentes de la presente divulgación.
EJEMPLOS
Ejemplo comparativo 1: Depósito de producción de proteínas mediante la administración intravenosa de composiciones de polinucleótidos
ARN mensajero
Eritropoyetina humana (EPO) (NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN SEQ: 3; FIG. 3), alfa-galactosidasa humana (GLA) (NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN SEQ: {B>[4] <B}FIG. 4), alfa-1 antitripsina humana (Al AT) (NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN SEQ: 5; FIG. 5), y factor humano IX (FIX) (NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN SEQ: 6; FIG. se sintetizaron mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN plasmídico que codificaba el gen, a la que siguió la adición de una estructura de casquete 5' (Capl) (Fechter & Brownlee, J. Gen. Virology 56:1239-1249 (2005)) y una cola poli(A) 3' de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud, según se determinó mediante electroforesis en gel. Las regiones no traducidas 5' y 3' estaban presentes en cada producto de ARNm en los ejemplos siguientes y están definidas por los NÚMEROS DE IDENTIFICACIÓN SEQ: 1 y 2 (FIG. 1 y FIG. 2) respectivamente.
Formulaciones de nanopartículas lipídicas
Formulación 1:Se mezclaron alícuotas de soluciones etanólicas de 50 mg/mL de C12-200, DOPE, Chol y DMG-PEG2K (40:30:25:5) y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 mL. Por separado, se preparó una solución acuosa tamponada (10 mM citrato/150 mM NaCl, pH 4,5) de ARNm a partir de una cepa de 1 mg/mL. La solución lipídica se inyectó rápidamente en la solución acuosa de ARNm y se agitó para obtener una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, se diafiltró con lx PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8°C.
Formulación 2:Se mezclaron alícuotas de soluciones etanólicas de 50 mg/mL de DODAP, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K (18:56:20:6) y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 mL. Por separado, una solución acuosa tamponada (10 mM citrato/150 mM NaCl, pH 4,5) de ARNm de EPO a partir de un stock de 1 mg/mL. La solución lipídica se inyectó rápidamente en la solución acuosa de ARNm y se agitó para obtener una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, se diafiltró con lx PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8°C. Concentración final =1,35 mg/ml de ARNm de EPO (encapsulado). Zave = 75,9 nm (Dv(50) = 57,3 nm; Dv(90) = 92,1 nm).
Formulación 3:Se mezclaron alícuotas de soluciones etanólicas de 50 mg/mL de HGT4003, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K (50:25:20:5) y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 mL. Por separado, se preparó una solución acuosa tamponada (10 mM citrato/150 mM NaCl, pH 4,5) de ARNm a partir de una cepa de 1 mg/mL. La solución lipídica se inyectó rápidamente en la solución acuosa de ARNm y se agitó para obtener una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, se diafiltró con lx PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8°C.
Formulación 4:Alícuotas de 50 mg/ml de soluciones etanólicas de ICE, DOPE y DMG-PEG2K (70:25:5) se mezclaron y diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, se preparó una solución acuosa tamponada (10 mM citrato/150 mM NaCl, pH 4,5) de ARNm a partir de una cepa de 1 mg/mL. La solución lipídica se inyectó rápidamente en la solución acuosa de ARNm y se agitó para obtener una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, se diafiltró con lx PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8°C.
Formulación 5:Se mezclaron alícuotas de soluciones etanólicas de 50 mg/mL de HGT5000, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K (40:20:35:5) y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 mL. Por separado, se preparó una solución acuosa tamponada (10 mM citrato/150 mM NaCl, pH 4,5) de ARNm de EPO a partir de un stock de 1 mg/mL. La solución lipídica se inyectó rápidamente en la solución acuosa de ARNm y se agitó para obtener una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, se diafiltró con lx PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8°C. Concentración final = 1,82 mg/mL de ARNm de EPO (encapsulado). Zave = 105,6 nm (Dv(50) = 53,7 nm ; DV(90) = 157 NM).
Formulación 6:Alícuotas de soluciones etanólicas de 50 mg/mL de HGT5001, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K (40:20:35:5) se mezclaron y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 mL. Por separado, se preparó una solución acuosa tamponada (10 mM citrato/150 mM NaCl, pH 4,5) de ARNm de EPO a partir de un stock de 1 mg/mL. La solución lipídica se inyectó rápidamente en la solución acuosa de ARNm y se agitó para obtener una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, se diafiltró con lx PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8°C.
Análisis de la proteína producida mediante nanopartículas cargadas de ARNm administradas por vía intravenosa Protocolo de inyección
Los estudios se realizaron con ratones CD-I macho de aproximadamente 6-8 semanas de edad al inicio de cada experimento, a menos que se indique lo contrario. Las muestras se introdujeron mediante una única inyección en bolo en la vena de la cola de una dosis total equivalente de 30-200 microgramos de ARNm encapsulado. Los ratones fueron sacrificados y perfundidos con solución salina en los puntos temporales designados.
Aislamiento de tejidos orgánicos para análisis
El hígado y el bazo de cada ratón se recolectaron, se dividieron en tres partes y se almacenaron en formalina tamponada neutra al 10% o se congelaron y almacenaron a -80°C para su análisis.
Aislamiento del suero para análisis
Todos los animales fueron eutanasiados por asfixia con CO248 horas después de la administración de la dosis (± 5%) seguida de toracotomía y extracción de sangre cardiaca terminal. Se recogió sangre entera (volumen máximo obtenible) mediante punción cardíaca en animales eutanasiados en tubos separadores de suero, se dejó coagular a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos, se centrifugó a 22°C ± 5°C a 9300 g durante 10 minutos y se extrajo el suero. Para las extracciones de sangre provisionales, se recogieron aproximadamente 40-50pL de sangre total mediante punción de la vena facial o recorte de la cola. Las muestras recogidas de los animales no sometidos a tratamiento se utilizaron como base de comparación con los animales del estudio.
Análisis del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
EPO ELISA: La cuantificación de la proteína EPO se realizó siguiendo los procedimientos descritos para el kit ELISA de EPO humana (Quantikine IVD, R&D Systems, Catálogo # Dep-00). Los controles positivos empleados consistieron en proteína de eritropoyetina humana recombinante de grado ultrapuro y de cultivo tisular (R&D Systems, Catálogo n° 286-EP y 287-TC, respectivamente). La detección se controló mediante absorción (450 nm) en un instrumento Molecular Device Flex Station.
GLA ELISA: Se siguieron los procedimientos estándar de ELISA empleando la anti-Alfa-galactosidasa G-188 IgG de ovejas como anticuerpo de captura con la anti-Alfa-galactosidasa TK-88 IgG de conejo como el anticuerpo secundario (detección) (Shire Human Genetic Therapies). Se utilizó IgG anti-conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) para la activación de la solución sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB). La reacción se apagó usando 2N H2SO4 después de 20 minutos. La detección se controló mediante absorción (450 nm) en un instrumento Molecular Device Flex Station. El suero de ratón sin tratar y la proteína alfa-galactosidasa humana se utilizaron como controles negativo y positivo, respectivamente.
FIX ELISA: La cuantificación de la proteína FIX se realizó siguiendo los procedimientos descritos para el kit ELISA FIX humano (AssayMax, Assay Pro, Catálogo # EF1009-1).
A1AT ELISA: Se realizó la cuantificación de la proteína Al AT siguiendo los procedimientos informados para el kit ELISA Al AT humano (Investigación innovadora, Catálogo #IRAPKT015).
Análisis de Inmunoblot
(EPO):Los análisis de Inmunoblot se realizaron utilizando un anticuerpo anti-hEPO (R&D Systems &MAB2871) y una proteína EPO humana ultrapura (R&D Systems &286-EP) como control.
Resultados
El trabajo descrito en este ejemplo demuestra el uso de nanopartículas lipídicas encapsuladas con ARNm como fuente de depósito para la producción de proteínas. Este efecto de depósito puede conseguirse en múltiples lugares del organismo (es decir, hígado, riñón, bazo y músculo). Se logró medir y cuantificar la proteína de base exógena deseada derivada del ARN mensajero administrado a través de nanopartículas liposomales, y se demostró la secreción de proteína de un depósito con ARNm de eritropoyetina humana (hEPO), alfa-galactosidasa humana (hGLA), alfa-1 antitripsina humana (hAlAT) y factor IX humano (hFIX).
1A. Resultados de producción de proteína EPO humana in vivo
Se demostró la producción de proteína hEPO con varias formulaciones de nanopartículas lipídicas. De cuatro sistemas lipídicos catiónicos diferentes, las nanopartículas lipídicas basadas en C12-200 produjeron la mayor cantidad de proteína hEPO tras cuatro horas después de la administración intravenosa, medida por ELISA (FIG. 7). Esta formulación(Formulación 1)dio lugar a 18,3 ug/mL de proteína hEPO secretada en el torrente sanguíneo.Los niveles normales de proteína hEPO en el suero humano son de 3,3-16,6 mUI/mL (Documento C28-P del NCCLS; Vol. 12, n° 2). Partiendo de una actividad específica de 120.000 lU/mg de proteína EPO, eso arroja una cantidad de 27,5-138 pg/mL de proteína hEPO en individuos humanos normales. Por lo tanto, una sola dosis de 30 ug de una formulación de lípidos catiónicos basada en C12-200 que encapsula el ARNm de hEPO produjo un aumento en la proteína respectiva de más de 100.000 niveles fisiológicos de veces.
De los sistemas lipídicos probados, la formulación de nanopartículas lipídicas basada en DOD AP fue la menos eficaz. Sin embargo, la cantidad observada de proteína EPO humana derivada de la administración mediante una nanopartícula lipídica basada en DODAP que encapsulaba ARNm de EPO fue de 4,1 ng/mL, lo que sigue siendo más de 30 veces superior a los niveles fisiológicos normales de proteína EPO (Tabla 2).
Tabla 2. Valores brutos de proteína hEPO secretada para varios sistemas de nanopartículas basadas en lípidos catiónicos medidos mediante análisis ELISA (como se representa en la FIG. 8). Las dosis se basan en el ARNm de hEPO encapsulado. Los valores de proteína se representan como nanogramos de proteína EPO humana por mililitro de suero. Los cambios en el hematocrito se basan en la comparación entre antes del sangrado (Día -1) y el Día 10.
Además, se probó la proteína resultante para determinar si era activa y funcionaba correctamente. En el caso de la terapia de sustitución con ARNm (MRT) que emplea ARNm de hEPO, se monitorizaron los cambios en el hematocrito durante un periodo de diez días para cinco formulaciones diferentes de nanopartículas lipídicas (FIG. 8, Tabla 2) para evaluar la actividad proteica. Durante este periodo de tiempo, dos de las cinco formulaciones demostraron un aumento del hematocrito (>15%), lo que es indicativo de que se está produciendo proteína hEPO activa a partir de dichos sistemas.
En otro experimento, se controlaron los cambios del hematocrito durante un período de 15 días (FIG. 9, Tabla 3). La formulación de nanopartículas lipídicas(Formulación 1)se administró como una dosis única de 30 |jg, o como tres dosis más pequeñas de 10 jg inyectadas el día 1, el día 3 y el día 5. Del mismo modo, laFormulación 2se administró en 3 dosis de 50 jg el día 1, el día 3 y el día 5. C12-200 produjo un aumento significativo en el hematocrito. En general, se observó un aumento de hasta un -25% de cambio, lo que es indicativo de que la proteína EPO humana activa se produce a partir de dichos sistemas.
Tabla 3Niveles de hematocrito de cada grupo durante un período de observación de 15 días (FIG. 9). Los ratones fueron dosificados como una sola inyección, o tres inyecciones, cada dos días. N=4 ratones por grupo.
IB. Resultados de producción de proteína GLA humana in vivo
Se exploró un segundo sistema proteínico de base exógena para demostrar el "efecto depósito" cuando se emplean nanopartículas lipídicas cargadas de ARNm. A los animales se les inyectó por vía intravenosa una dosis única de 30 microgramos de ARNm de alfa galactosidasa humana (hGLA) encapsulado mediante un sistema de nanopartículas lipídicas basado en Cl 2-200 y sacrificado después de seis horas(Formulación1). La cuantificación de la proteína hGLA secretada se realizó mediante ELISA. Se utilizó como controles suero de ratón no tratado y proteína alfa-galactosidasa humana. La detección de la proteína alfa-galactosidasa humana se monitorizó durante un período de 48 horas.
Se observaron niveles medibles de proteína hGLA a lo largo del experimento con un nivel máximo de 2,0 ug/ml de proteína hGLA a las seis horas (FIG. 10). La Tabla 4 enumera las cantidades específicas de hGLA encontradas en el suero. Se ha informado que la actividad normal en hombres humanos sanos es de aproximadamente 3.05 nanomoles / h / ml. La actividad de la alfa-galactosidasa, una proteína alfa-galactosidasa humana recombinante, 3,56 x 106 nanomol/hr/mg. El análisis de estos valores arroja una cantidad de aproximadamente 856 pg/mL de proteína hGLA en individuos varones sanos normales. La cantidad de proteína hGLA de 2,0 ug/ml observada después de seis horas al dosificar una nanopartícula lipídica cargada de ARNm de hGLA es más de 2300 veces mayor que los niveles fisiológicos normales. Además, después de 48 horas, todavía se pueden detectar niveles apreciables de proteína hGLA (86,2 ng/ml). Este nivel es representativo de cantidades casi 100 veces mayores de proteína hGLA sobre cantidades fisiológicas aún presentes a las 48 horas.
Tabla 4.Los valores brutos de la proteína hGLA secretada a lo largo del tiempo medidos mediante análisis ELISA (como se muestra en la FIG. 10). Los valores se representan como nanogramos de proteína hGLA por mililitro de suero. N=4 ratones por grupo.
Además, la vida media de la alfa-galactosidasa cuando se administra a 0,2 mg/kg es de aproximadamente 108 minutos. La producción de proteína GLA a través del "efecto depósito" cuando se administran nanopartículas lipídicas cargadas de ARNm de GLA muestra un aumento sustancial en el tiempo de residencia de la sangre en comparación con la inyección directa de la proteína recombinante desnuda. Como se describió anteriormente, cantidades significativas de proteína están presentes después de 48 horas.
El perfil de actividad de la proteína a-galactosidasa producida a partir de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de GLA se midió en función del metabolismo del 4-metilumbeliferil-a-D-galactopiranósido (4-MU-a-gal). Como se muestra en la FIG. 11, la proteína producida a partir de estos sistemas de nanopartículas es bastante activa y refleja los niveles de proteína disponibles (FIG. 12, Tabla 4). Las comparaciones del AUC de la producción de hGLA basada en la terapia de ARNm versus la terapia de reemplazo enzimático (ERT) en ratones y humanos muestran un aumento de 182 y 30 veces, respectivamente (Tabla 5).
Tabla 5.Comparación de los valores de Cmax y AUCinf en pacientes con Fabry después de la dosis IV de 0,2 mg/kg de alfa-galactosidasa (dosis farmacológica) con los de ratones post-IV con dosis de alfa-galactosidasa y ARNm de GLA. a Los datos procedían de un artículo publicado (Gregory M. Pastores et al. Seguridad y farmacocinética de hGLA en pacientes con enfermedad de Fabry y enfermedad renal terminal. Nephrol Dial Transplant (2007) 22:1920- 1925. b Enfermedad renal no terminal. c actividad de la a-galactosidasa a las 6 horas después de la administración (el punto de tiempo más temprano probado en el estudio).
Se ha demostrado la capacidad de las nanopartículas lipídicas encapsuladas en ARNm para dirigirse a órganos que pueden actuar como depósito para la producción de una proteína deseada. Los niveles de proteína secretada observados han sido varios órdenes de magnitud por encima de los niveles fisiológicos normales. Este "efecto depósito" es repetible. LA FIG. 12 muestra una vez más que se observa una producción robusta de proteínas al dosificar ratones de tipo salvaje (CD-1) con una dosis única de 30 ug de ARNm de hGLA cargada en nanopartículas lipídicas basadas en Cl 2-200(Formulación 1).En este experimento, los niveles de hGLA se evaluaron durante un período de 72 horas. Se detecta un promedio máximo de 4,0 ug de proteína hGLA humana/ml de suero seis horas después de la administración. Basado en un valor de ~1 ng/ml de proteína hGLA para niveles fisiológicos normales, hGLA MRT proporciona aproximadamente 4000 veces más niveles de proteína. Como antes, la proteína hGLA podía detectarse hasta 48 horas después de la administración (FIG. 12).
Un análisis de tejidos aislados de este mismo experimento proporcionó información sobre la distribución de la proteína hGLA en ratones tratados con hGLA MRT (FIG. 13). Se detectaron niveles suprafisiológicos de proteína hGLA en el hígado, bazo y riñones de todos los ratones tratados con un máximo observado entre 12 y 24 horas después de la administración. Se pudieron observar niveles detectables de proteína derivada de MRT tres días después de una sola inyección de nanopartículas lipídicas cargadas con hGLA.
Además, se demostró que la producción de hGLA tras la administración de nanopartículas de Cl2-200 cargadas con ARNm de hGLA exhibe una respuesta de dosis en el suero (FIG. 14A), así como en el hígado (FIG. 14B). Una característica inherente de la terapia de reemplazo de ARNm mediada por nanopartículas lipídicas sería el perfil farmacocinético de la proteína respectiva producida. Por ejemplo, el tratamiento basado en ERT de ratones que emplean alfa-galactosidasa da como resultado una vida media plasmática de aproximadamente 100 minutos. En contraste, la alfagalactosidasa derivada de MRT tiene un tiempo de residencia en sangre de aproximadamente 72 horas con un tiempo pico de 6 horas. Esto permite una exposición mucho mayor para que los órganos participen en la posible absorción continua de la proteína deseada. Una comparación de los perfiles PK se muestra en la FIG. 15 y demuestra la marcada diferencia en las tasas de aclaramiento y, en última instancia, se puede lograr un cambio importante en el área bajo la curva (AUC) a través del tratamiento basado en MRT.
En un experimento separado, se aplicó hGLA MRT a un modelo de enfermedad de ratón, ratones hGLA KO (ratones Fabry). Se administró una dosis de 0,33 mg/kg de nanopartículas lipídicas basadas en C12-200 cargadas de ARNm de hGLA(Formulación 1)a ratones KO hembra como una única inyección intravenosa. Se produjeron cantidades sustanciales de proteína hGLA derivada de MRT con un pico a las 6 horas (-560 ng / ml de suero) que es aproximadamente 600 veces más alto que los niveles fisiológicos normales. Además, la proteína hGLA todavía era detectable 72 horas después de la administración (FIG. 16).
La cuantificación de la proteína GLA derivada de MRT en órganos vitales demostró una acumulación sustancial como se muestra en la FIG. 17. Se traza una comparación de la proteína hGLA derivada de MRT observada con los niveles fisiológicos normales informados que se encuentran en órganos clave (niveles normales trazados como líneas discontinuas). Mientras que los niveles de proteína a las 24 horas son más altos que a las 72 horas posteriores a la administración, los niveles de proteína hGLA detectados en el hígado, riñón, bazo y corazones de los ratones Fabry tratados son equivalentes a los niveles de tipo salvaje. Por ejemplo, se encontraron 3,1 ng de proteína hGLA / tejido mg en los riñones de ratones tratados 3 días después de un solo tratamiento MRT.
En un experimento posterior, se realizó una comparación del tratamiento con alfa-galactosidasa basado en ERT versus el tratamiento con hGLA MRT de ratones machos Fabry KO. Se administró una dosis única intravenosa de 1,0 mg/kg para cada terapia y los ratones fueron sacrificados una semana después de la administración. Los niveles séricos de proteína hGLA se monitorizaron a las 6 horas y 1 semana después de la inyección. El hígado, el riñón, el bazo y el corazón se analizaron para detectar la acumulación de proteína hGLA una semana después de la administración. Además de los análisis de biodistribución, se determinó una medida de eficacia mediante la medición de las reducciones de globotrioasilceramida (Gb3) e Iyso-Gb3 en el riñón y el corazón. LA FIG. 18 muestra los niveles séricos de proteína hGLA después del tratamiento de nanopartículas lipídicas cargadas con alfa-galactosidasa o ARNm de GLA(Formulación 1)en ratones Fabry machos. Las muestras de suero se analizaron a las 6 horas y 1 semana después de la administración. Se detectó una señal robusta para ratones tratados con MRT después de 6 horas, con niveles séricos de proteína hGLA de ~ 4.0 ug / ml. En contraste, no había alfa-galactosidasa detectable restante en el torrente sanguíneo en este momento.
Los ratones Fabry en este experimento fueron sacrificados una semana después de la inyección inicial y los órganos fueron cosechados y analizados (hígado, riñón, bazo, corazón). LA FIG. 19 muestra una comparación de la proteína GLA humana encontrada en cada órgano respectivo después del tratamiento con hGLA MRT o Alphagalactosídasa ERT. Los niveles corresponden a hGLA presente una semana después de la administración. Se detectó proteína hGLA en todos los órganos analizados. Por ejemplo, los ratones tratados con MRT dieron como resultado la acumulación de proteína hGLA en el riñón de 2,42 ng de proteína hGLA / proteína mg, mientras que los ratones tratados con alfa-galactosidasa solo tenían niveles residuales (0,37 ng/mg de proteína). Esto corresponde a un nivel ~ 6,5 veces mayor de proteína hGLA cuando se trata a través de hGLA MRT. Tras el análisis del corazón, se encontraron 11,5 ng de proteína hGLA / proteína mg para la cohorte tratada con MRT en comparación con solo 1,0 ng / mg de proteína alfagalactosidasa. Esto corresponde a una acumulación ~ 11 veces mayor en el corazón para los ratones tratados con hGLA MRT en comparación con las terapias basadas en ERT.
Además de los análisis de biodistribución realizados, se determinaron las evaluaciones de la eficacia mediante la medición de las concentraciones de globotrioasilceramida (Gb3) y liso-Gb3 en órganos clave. Una comparación directa de la reducción de Gb3 después de un único tratamiento intravenoso de 1,0 mg/kg de GLA MRT en comparación con un tratamiento basado en la ERT con alfa-galactosidasa de una dosis equivalente produjo una diferencia considerable en los niveles de Gb3 en los riñones y el corazón. Por ejemplo, los niveles de Gb3 para GLA MRT versus alfa-galactosidasa produjeron reducciones del 60,2% frente a 26,8%, respectivamente (FIG. 20). Además, los niveles de Gb3 en el corazón se redujeron en un 92,1% frente a 66,9% para MRT y Alfa-galactosidasa, respectivamente (FIG. 21).
Un segundo biomarcador relevante para la medición de la eficacia es Iyso-Gb3. GLA MRT redujo Iyso-Gb3 más eficientemente que la alfa-galactosidasa también en los riñones y el corazón (FIG. 20 y FIG. 21, respectivamente). En particular, los ratones Fabry tratados con MRT demostraron reducciones de Iyso-Gb3 del 86,1% y 87,9% en los riñones y el corazón en comparación con los ratones tratados con alfa-galactosidasa, produciendo una disminución del 47,8% y 61,3%, respectivamente.
Los resultados con para hGLA en nanopartículas lipídicas basadas en Cl2-200 se extienden a otras formulaciones de nanopartículas lipídicas. Por ejemplo, el ARNm de hGLA cargado en nanopartículas lipídicas de HGT4003(Formulación3) o basadas en HGT5000(Formulación 5)administradas como dosis única IV dan como resultado la producción de hGLA a las 24 horas posteriores a la administración (FIG. 22). La producción de hGLA exhibió una respuesta a la dosis. Del mismo modo, la producción de hGLA se observó a las 6 horas y 24 horas después de la administración del ARNm de hGLA cargado en nanopartículas lipídicas basadas en HGT5001(Formulación 6)administradas como dosis única IV. Se observó producción de hGLA en el suero (FIG. 23A), así como en órganos (FIG.
23B).
En general, la terapia de reemplazo de ARNm aplicada como depósito para la producción de proteínas produce grandes cantidades de proteína activa y funcionalmente terapéutica a niveles suprafisiológicos. Se ha demostrado que este método produce una vida media de circulación sostenida de la proteína deseada y esta proteína derivada de MRT es altamente eficaz para la terapia, como se demostró con la enzima alfa-galactosidasa en ratones Fabry.
IC. Resultados de producción de proteína FIX humana in vivo
Se realizaron estudios en los que se administraron nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm del factor IX (FIX) en ratones de tipo salvaje (CD-I) y se determinó la proteína FIX que se secreta en el torrente sanguíneo. Tras la inyección intravenosa de una dosis única de 30 ug C12-200 (C12-200:DOPE:Chol:PEG a una proporción de 40:30:25:5) de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm FIX (dosis basada en ARNm encapsulado)(Formulación1), se observó una producción robusta de proteínas (FIG. 24).
En un análisis farmacocinético realizado durante 72 horas, se observó que la proteína FIX derivada de MRT podía detectarse en todos los puntos temporales probados (FIG. 24). La concentración sérica máxima se observó a las 24 horas después de la inyección con un valor de ~3 ug (2995±738 ng/mL) de proteína FIX/ml de suero. Esto representa otro ejemplo exitoso del efecto depósito.
ID. Resultados de la producción de proteína Al AThumana in vivo
Se realizaron estudios en los que se administraron nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de alfa-1-antitripsina (A1AT) en ratones de tipo salvaje (CD-I) y se determinó la proteína Al AT que se secreta en el torrente sanguíneo. Tras la inyección intravenosa de una dosis única de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de Al AT basadas en 30 ug C12-200 (dosis basada en ARNm encapsulado)(Formulación 1),se observó una producción robusta de proteínas (FIG. 25).
Como se muestra en la FIG. 25, se pudieron observar niveles detectables de proteína Al AT humana derivada de Al AT MRT durante un período de tiempo de 24 horas después de la administración. Se detectó un nivel sérico máximo de ~48 ug de proteína A1AT/ml de suero 12 horas después de la inyección.
Ejemplo comparativo 2: Depósito de producción de proteínas a través de la administración pulmonar de composiciones de polinucleótidos
Protocolo de inyecciones
Todos los estudios se realizaron con ratones hembra CD-I o BALB/C de aproximadamente 7 a 10 semanas de edad al comienzo de cada experimento. Los artículos de prueba se introdujeron a través de una sola administración intratraqueal en aerosol. Los ratones fueron sacrificados y perfundidos con solución salina en los puntos temporales designados. Los pulmones de cada ratón fueron cosechados, distribuidos en dos partes, y almacenados en un 10% neutro formalina tamponada o congelada a presión y almacenada a -80 °C para su análisis. El suero se aisló como se describe en el ejemplo 1. EPO ELISA: como se describe en el ejemplo 1.
Resultados
El efecto depósito se puede lograr mediante administración pulmonar (por ejemplo, intranasal, intratraqueal, nebulización). Se logró y cuantificó la medición de la proteína de base exógena deseada derivada del ARN mensajero entregado a través de sistemas de nanopartículas.
La producción de proteína EPO humana a través de nanopartículas lipídicas cargadas de ARNm de hEPO se probó en ratones CD-I a través de una sola administración intratraqueal (MicroSpray®). Se probaron varias formulaciones utilizando varios lípidos catiónicos(Formulaciones 1, 5,6). Todas las formulaciones dieron como resultado una alta encapsulación de ARNm de EPO humano. Tras la administración, los animales fueron sacrificados seis horas después de la administración y los pulmones, así como el suero fueron cosechados.
Se detectó proteína EPO humana en el lugar de administración (pulmones) tras el tratamiento mediante la administración de aerosoles. El análisis del suero seis horas después de la administración mostró cantidades detectables de proteína hEPO en circulación. Estos datos (mostrados en la FIG. 26) demuestran la capacidad del pulmón para actuar como un "depósito" para la producción (y secreción) de proteína hEPO.

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES 1. Una composición para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad en un sujeto que se debe a una deficiencia de una proteína asociada a surfactante pulmonar, en la que la proteína asociada al surfactante pulmonar se selecciona de SFTPA1, SFTPA2, SFTPB, SFTPC y SFTPD, en la que dicho método comprende la administración pulmonar de la composición al sujeto, dicha composición comprende: (a) al menos una molécula de ARNm, al menos una parte de la cual codifica la proteína asociada al surfactante pulmonar; y (b) un vehículo de transferencia que comprende una nanopartícula lipídica, en el que la nanopartícula lipídica comprende uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos no catiónicos y uno o más lípidos modificados con PEG.
  2. 2. La composición para uso según la reivindicación 1, en la que la molécula de ARN comprende: (a) una modificación de la región 5' no traducida de dicha molécula de ARN, opcionalmente en la que dicha modificación comprende la inclusión de una estructura Cap1; y/o (b) una modificación de la región 3' no traducida de dicha molécula de ARN, opcionalmente en la que dicha modificación de la región 3' no traducida comprende la inclusión de una cola poli A.
  3. 3. La composición para uso según la reivindicación 1 ó 2, en la que la nanopartícula lipídica comprende un lípido catiónico seleccionado entre:
    (C12-200), 2,2-Dilinoley1-4-dimetilaminoetilo1-[1,3]-dioxolano (XTC), ((6Z,9Z,28Z,3IZ)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4-(dimetilamino) butanoato (MC3), 4,7,13-tris(3-oxo-3-(undecilamino)propil)-N1,N16-diundecil-4,7,10,13-tetraazahexadecano- 1,16-diamida (NC98-5),
    (Compuesto 2),
    (Compuesto 3), 1,2-dilinoleyloxy-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLinDMA), (15Z,18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yl)tetracosa-4,15,18-trien-1-amina (HGT5001), cis o trans, (15Z,18Z)-N,N-dimetil-6-(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1 -il)tetracosa-15,18-dien-1 -amina (HGT5000), 2-((2,3-Bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)propil)disulfanil)-N,N-dimetiletanomina (hGt 4003), 2-(2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)-1,3-dioxolan-4-il)-N,N-dimetiletanamina (DLinKC2DMA), (3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienil)tetrahidro-3aH-ciclopenta[d] [1,3]dioxol-5-amina) (ALNY100), y (3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-dimetil-17-((R)-6-metilheptán-2-il)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-il 3-(1H-imidazol-4-il)propanoato (ICE).
  4. 4. La composición para uso según la reivindicación 1 o 2, en la que la nanopartícula lipídica comprende DLinKC2DMA, colesterol (CHOL), dioleoliofosfatidiletanolamina (DOPE), y DMG-PEG-2000.
  5. 5. La composición para uso según las reivindicaciones 1 o 2, en la que la nanopartícula lipídica comprende C12-200, DOPE, CHOL, y DMG-PEG-2000.
  6. 6. La composición de uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la nanopartícula lipídica comprende un lípido escindible.
  7. 7. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el al menos un ARNm está (a) asociado tanto en la superficie de la nanopartícula lipídica como encapsulado dentro de la misma nanopartícula lipídica, o (b) está encapsulado dentro de la nanopartícula lipídica.
  8. 8. La composición de uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que el vehículo de transferencia comprende un lípido catiónico a base de colesterol, opcionalmente en la que el lípido catiónico a base de colesterol es ICE.
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