JP6752299B2 - ｍＲＮＡ送達のための脂質ナノ粒子組成物および方法 - Google Patents

Description

新規のアプローチおよび治療法が、タンパク質および酵素欠乏の治療に依然として必要
とされている。例えば、リソソーム貯蔵疾患は、通常、代謝に必要な酵素の欠乏によるリ
ソソーム機能の欠陥に起因する約５０のまれな遺伝性代謝疾患の一群である。ファブリー
病は、酵素α−ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）の欠乏に起因するリソソーム貯蔵疾患であり
、グロボトリアオシルセラミドとして知られている糖脂質を血管および他の組織内に蓄積
させ、様々な痛みを伴う兆候につながる。ファブリー病等のある疾患において、正常に細
胞によって分泌されて血流に入るタンパク質または酵素の置換の必要性が存在する。罹患
タンパク質または酵素のレベルまたは産生を増加させる遺伝子治療等の治療は、そのよう
な障害に治療またはさらには治癒を提供し得る。しかしながら、この目的のための従来の
遺伝子治療の使用に対していくつかの制限が存在している。

従来の遺伝子治療は、宿主細胞への所望の遺伝情報の挿入のためにＤＮＡを用いる。細
胞に導入されるＤＮＡは、通常、１つ以上のトランスフェクト細胞のゲノムにある程度組
み込まれ、宿主における導入遺伝物質の長期にわたる作用を可能にする。そのような持続
的作用に対して多くの利点が存在し得るが、宿主ゲノムへの外来性ＤＮＡの組み込みも多
くの悪影響を有し得る。例えば、導入されたＤＮＡが無傷の遺伝子に挿入され、内在性遺
伝子の機能を妨害するか、またはさらには完全に排除する変異をもたらす可能性がある。
したがって、ＤＮＡでの遺伝子治療は、例えば、必須酵素の排除もしくはその産生の有害
な減少、または細胞増殖の調整にとって不可欠な遺伝子の妨害等の治療された宿主におい
て不可欠な遺伝機能の障害をもたらし、未制御増殖または癌性細胞増殖をもたらし得る。
加えて、従来のＤＮＡベースの遺伝子治療の際、所望の遺伝子産物の効果的な発現のため
に強力なプロモーター配列を含むことが必要であり、この場合もやはり、細胞内での正常
な遺伝子発現の調整の望ましくない変化につながる場合がある。ＤＮＡベースの遺伝物質
が望ましくない抗ＤＮＡ抗体の誘導をもたらし、次いで、恐らく致命的な免疫応答を誘発
し得る可能性もある。ウイルスベクターを用いた遺伝子治療アプローチは、有害な免疫応
答ももたらし得る。ある状況において、ウイルスベクターは、宿主ゲノムにさえも組み込
まれ得る。加えて、臨床グレードのウイルスベクターの産生は高価であり、多大な時間も
必要とする。ウイルスベクターを用いた導入遺伝物質の標的化送達も、制御困難であり得
る。したがって、ＤＮＡベースの遺伝子治療が、ウイルスベクターを用いた分泌性タンパ
ク質の送達について評価されているが（特許文献１（米国特許第６，０６６，６２６号）
、特許文献２（米国特許出願公開第２００４／０１１０７０９号））、これらのアプロー
チは、これらの様々な理由により制限され得る。

分泌性タンパク質をコードする核酸の送達におけるこれらの先行アプローチにおいて明
らかなもう１つの障害は、最終的に産生されるタンパク質のレベルにある。血液中の有意
なレベルの所望のタンパク質を得ることは困難であり、その量は、長期にわたって維持さ
れない。例えば、核酸送達によって産生されたタンパク質の量は、正常な生理学的レベル
に達しない。例えば、特許文献２（米国特許出願公開第２００４／０１１０７０９号）を
参照されたい。

ＤＮＡとは対照的に、遺伝子治療剤としてＲＮＡを用いることは、（１）ＲＮＡがトラ
ンスフェクト細胞のゲノムに安定的に組み込まれる危険性を伴わず、したがって、導入遺
伝物質が必須遺伝子の正常機能を妨害するか、または有害な影響もしくは発癌作用をもた
らす変異を引き起こすといった懸念を排除し、（２）外来性プロモーター配列がコードさ
れたタンパク質の効果的な翻訳に必要でなく、この場合もやはり、可能性のある有害な副
作用を回避し、（３）プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）とは対照的に、メッセンジャーＲＮ
Ａ（ｍＲＮＡ）が、抗ＲＮＡ抗体が生成されないように、免疫原性ＣｐＧモチーフを欠き
、かつ（４）ＲＮＡの比較的短い半減期のため、遺伝子治療に基づいたｍＲＮＡに起因す
る任意の悪影響が限られた期間のみであるという理由から、実質的により安全である。加
えて、ＤＮＡがこの大きな障壁を克服しなければならない一方で、ｍＲＮＡが核に進入し
てその機能を果たす必要はない。

ｍＲＮＡベースの遺伝子治療が過去にそれほど使用されていない理由の１つとして、ｍ
ＲＮＡの安定性が、特に細胞の細胞質に達し、かつ分解酵素に曝露されるときに、ＤＮＡ
よりもはるかに低いことが挙げられる。ｍＲＮＡ中の糖部分の第２の炭素上のヒドロキシ
ル基の存在は、ｍＲＮＡがより安定したＤＮＡ二重らせん構造を形成することを阻止する
立体障害を引き起こし、したがって、ｍＲＮＡが加水分解する傾向を高める。結果として
、最近まで、ｍＲＮＡが不安定すぎてトランスフェクションプロトコルに耐えることがで
きないと広く考えられていた。ＲＮＡ安定化修飾の進歩は、遺伝子治療において、プラス
ミドＤＮＡの代わりにｍＲＮＡを用いることへの関心を高める火付け役となっている。カ
チオン性脂質またはポリマー送達担体等のある送達担体も、トランスフェクトｍＲＮＡを
内因性ＲＮａｓｅから保護する助けとなり得る。さらに、修飾されたｍＲＮＡの安定性増
加にもかかわらず、治療レベルのタンパク質産生を可能にする様式での生体内における細
胞へのｍＲＮＡ、特に、全長タンパク質をコードするｍＲＮＡの送達は、依然として課題
となっている。分泌性タンパク質をコードするｍＲＮＡの送達が企図されているが（特許
文献３（米国特許出願公開第２００９／０２８６８５２号））、実際に生体内ｍＲＮＡ送
達を介して産生される全長分泌性タンパク質のレベルは知られておらず、そのレベルがＤ
ＮＡベースの遺伝子治療で観察されたレベルを上回ると予想する理由がない。
これまでに、ｍＲＮＡコード抗原での免疫化等の低レベルの翻訳が制限要素ではなかっ
た適用においてのみ、ｍＲＮＡ遺伝子治療を用いて著しい進歩がもたらされている。ネイ
キッドまたはプロタミン複合体ｍＲＮＡの皮内注入による腫瘍抗原に対するワクチン接種
を含む臨床試験は、実行可能性、毒性欠如、および有望な結果を実証した。Ｘ．Ｓｕ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ８：７７４−７８７（２０１１）。
残念ながら、低レベルの翻訳は、生物学的影響または治療的影響を与えるためにより高い
レベルのｍＲＮＡコードタンパク質の持続発現を必要とする他の適用におけるｍＲＮＡベ
ースの遺伝子治療の活用を大いに制限している。

米国特許第６，０６６，６２６号明細書 米国特許出願公開第２００４／０１１０７０９号明細書 米国特許出願公開第２００９／０２８６８５２号明細書

本発明は、「デポー効果」を介した治療的に効果的なレベルの分泌性タンパク質の産生
につながるｍＲＮＡ遺伝子治療薬の送達方法を提供する。本発明の実施形態において、分
泌性タンパク質をコードするｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子中に装填され、生体内で標的細胞
に送達される。その後、標的細胞は、治療レベルでの循環系への可溶性の分泌性タンパク
質の産生のためにデポー源の機能を果たす。いくつかの実施形態において、産生される分
泌性タンパク質のレベルは、正常な生理学的レベルを上回る。

本発明は、治療レベルの機能的分泌性タンパク質の産生のために１つ以上の標的細胞に
リポソーム移送ビヒクル中のｍＲＮＡを細胞内送達するための組成物および方法を提供す
る。

本発明の組成物および方法は、多くの疾患、具体的には、タンパク質および／または酵
素欠乏に起因する疾患の管理および治療において有用であり、タンパク質または酵素は、
正常に分泌される。そのような疾患に罹患する個体は、例えば、分泌性タンパク質の不合
成、分泌性タンパク質合成の減少、または生物学的活性を欠くか、もしくは低下した生物
学的活性を有する分泌性タンパク質の合成を含む、タンパク質または酵素の発現不全につ
ながる根本的な遺伝子欠陥を有し得る。具体的には、本発明の方法および組成物は、リソ
ソーム貯蔵障害および／または尿素サイクルに関与する分泌性酵素の生合成における１つ
以上の欠陥の結果として生じる尿素サイクル代謝異常の治療に有用である。

本発明の組成物は、ｍＲＮＡ、移送ビヒクル、および任意で、標的細胞との接触および
その後のトランスフェクションを促進する作用物質を含む。ｍＲＮＡは、臨床的に有用な
分泌性タンパク質をコードし得る。例えば、ｍＲＮＡは、リソソーム貯蔵障害に関与する
機能的分泌性尿素サイクル酵素または分泌性酵素をコードし得る。ｍＲＮＡは、例えば、
エリスロポエチン（例えば、ヒトＥＰＯ）またはα−ガラクトシダーゼ（例えば、ヒトα
−ガラクトシダーゼ（ヒトＧＬＡ）をコードし得る。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡに安定性を付与する（例えば、野
生型または天然バージョンのｍＲＮＡと比較して）１つ以上の修飾を含み得、タンパク質
の関連した異常発現に関与する欠陥を修正する野生型に対して１つ以上の修飾も含み得る
。例えば、本発明の核酸は、５’非翻訳領域もしくは３’非翻訳領域のうちの１つまたは
それら両方の修飾を含み得る。そのような修飾は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初
期１（ＩＥ１）遺伝子の部分配列、ポリＡ尾部、Ｃａｐ１構造、またはヒト成長ホルモン
（ｈＧＨ））をコードする配列の包含を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの
実施形態において、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ免疫原性を低下させるように修飾される。

本発明の組成物を投与することを含む対象を治療する方法も企図される。例えば、特定
の分泌性タンパク質の産生および／または特定の分泌性タンパク質の利用が不適切である
か、もしくは損なわれた状態を治療または予防する方法が提供される。一実施形態におい
て、本明細書に提供される方法を用いて、１つ以上の尿素サイクル酵素が欠乏しているか
、またはリソソーム貯蔵障害において１つ以上の酵素が欠乏している対象を治療すること
ができる。

好ましい実施形態において、本発明の組成物中のｍＲＮＡは、リポソーム移送ビヒクル
中に製剤化されて、標的細胞への送達を促進する。企図される移送ビヒクルは、１つ以上
のカチオン性脂質、非カチオン性脂質、および／またはＰＥＧ修飾脂質を含み得る。例え
ば、移送ビヒクルは、以下のカチオン性脂質：Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭ
Ａ、ＤＯＤＡＰ、ＨＧＴ４００３、ＩＣＥ、ＨＧＴ５０００、またはＨＧＴ５００１のう
ちの少なくとも１つを含み得る。実施形態において、移送ビヒクルは、コレステロール（
ｃｈｏｌ）および／またはＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態において、移送ビ
ヒクルは、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを含む。ある実施形態において、移送ビヒクルは、以下の
脂質製剤：Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、ｃｈｏｌ、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；ＤＯＤＡＰ、Ｄ
ＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５０００、ＤＯＰＥ、ｃｈｏｌ、
ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ、ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、ｃｈｏｌ、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋのうち
の１つを含む。

本発明は、「デポー効果」を呈することができる標的細胞のトランスフェクションおよ
びその細胞への１つ以上のｍＲＮＡ分子の送達を促進するのに有用な組成物および方法も
提供する。例えば、本発明の組成物および方法は、１つ以上の標的細胞への組成物の親和
性を高めることができる標的化リガンドの使用を企図する。一実施形態において、標的化
リガンドは、アポリポタンパク質Ｂまたはアポリポタンパク質Ｅであり、対応する標的細
胞は、低密度のリポタンパク質受容体を発現し、したがって、標的化リガンドの認識を促
進する。本発明の方法および組成物を用いて、膨大な数の標的細胞を優先的に標的化する
ことができる。例えば、企図される標的細胞には、肝細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細
胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞、心臓細胞、含脂肪細胞、
血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、β細胞、下垂体細胞、滑膜ライニング細胞、卵
巣細胞、精巣細胞、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、および
腫瘍細胞が含まれるが、これらに限定されない。

実施形態において、分泌性タンパク質は、継続した期間、標的細胞によって産生される
。例えば、分泌性タンパク質は、投与後１時間を超えて、４時間を超えて、６時間を超え
て、１２時間を超えて、２４時間を超えて、４８時間を超えて、または７２時間を超えて
産生され得る。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、投与から約６時間後にピ
ークレベルで発現される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドの発現は、少なく
とも治療レベルで維持される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、少なくと
も治療レベルで、投与後１時間を超えて、４時間を超えて、６時間を超えて、１２時間を
超えて、２４時間を超えて、４８時間を超えて、または７２時間を超えて発現される。い
くつかの実施形態において、ポリペプチドは、患者の血清または組織（例えば、肝臓また
は肺）において治療レベルで検出可能である。いくつかの実施形態において、検出可能な
レベルのポリペプチドは、投与後１時間を超える、４時間を超える、６時間を超える、１
２時間を超える、２４時間を超える、４８時間を超える、または７２時間を超えるｍＲＮ
Ａ組成物からの連続発現に由来する。

ある実施形態において、分泌性タンパク質は、正常な生理学的レベルを上回るレベルで
産生される。分泌性タンパク質のレベルは、対照と比較して増加し得る。

いくつかの実施形態において、対照は、正常な個体または正常な個体の集団におけるベ
ースラインの生理学的レベルのポリペプチドである。他の実施形態において、対照は、関
連タンパク質もしくはポリペプチドが欠乏している個体または関連タンパク質もしくはポ
リペプチドが欠乏している個体の集団におけるベースラインの生理学的レベルのポリペプ
チドである。いくつかの実施形態において、対照は、組成物が投与される個体における正
常なレベルの関連タンパク質またはポリペプチドであり得る。他の実施形態において、対
照は、他の治療的介入時、例えば、対応するポリペプチドの直接注入時の１つ以上の同等
の時点での発現レベルのポリペプチドである。

ある実施形態において、ポリペプチドは、対照よりも少なくとも１．５倍、少なくとも
２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、３０倍、少なくとも１０
０倍、少なくとも５００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも５０，０００倍、または
少なくとも１００，０００倍高いレベルで標的細胞によって発現される。いくつかの実施
形態において、対照よりも高い発現の倍増は、投与後１時間を超えて、４時間を超えて、
６時間を超えて、１２時間を超えて、２４時間を超えて、または４８時間を超えて、また
は７２時間を超えて維持される。例えば、一実施形態において、分泌性タンパク質のレベ
ルは、血清において、少なくとも４８時間または２日間、対照よりも少なくとも１．５倍
、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、３０倍、少
なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも５０，００
０倍、または少なくとも１００，０００倍多く検出される。ある実施形態において、分泌
性タンパク質のレベルは、投与後３日目、４日目、５日目、または１週間目以上で検出可
能である。分泌性タンパク質の増加レベルは、血清および／または組織（例えば、肝臓、
肺）において観察され得る。

いくつかの実施形態において、本方法は、所望の分泌性タンパク質の循環半減期の持続
をもたらす。例えば、分泌性タンパク質は、分泌性タンパク質の皮下注入を介して観察さ
れる半減期よりも数時間または数日間長く検出され得る。実施形態において、分泌性タン
パク質の半減期は、１日間を超えて、２日間を超えて、３日間を超えて、４日間を超えて
、５日間を超えて、または１週間以上を超えて持続される。

いくつかの実施形態において、投与は、単回投与または反復投与を含む。ある実施形態
において、投与量は、静脈内に投与されるか、または肺送達によって投与される。

ポリペプチドは、例えば、エリスロポエチン、α−ガラクトシダーゼ、ＬＤＬ受容体、
第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＭＰＳ Ｉ用）、イズロン酸ス
ルファターゼ（ＭＰＳ ＩＩ用）、ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＭＰＳ ＩＩＩＡ用
）、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＭＰＳ ＩＩＩＢ用）、ガラクトース６−ス
ルファターゼ（ＭＰＳ ＩＶＡ用）、リソソーム酸リパーゼ、アリールスルファターゼ−
Ａのうちの１つ以上であり得る。

ある実施形態は、ｍＲＮＡから生成される対応する機能的タンパク質の量よりも実質的
に少ない量で、細胞または対象ｍＲＮＡに、機能的タンパク質をコードする少なくとも一
部を提供する組成物および方法に関する。言い換えると、ある実施形態において、細胞に
送達されるｍＲＮＡは、細胞に送達されるｍＲＮＡの量よりも実質的に多いタンパク質を
産生し得る。例えば、所与の時間後、例えば、細胞または対象へのｍＲＮＡの投与から１
、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、または２４時間後、その
ｍＲＮＡによって生成される対応するタンパク質の量は、細胞または対象に実際に投与さ
れるｍＲＮＡの量よりも少なくとも１．５、２、３、５、１０、１５、２０、２５、５０
、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００倍、またはそれ以上多くあ
り得る。これは、質量対質量ベースで、モル対モルベースで、および／または分子対分子
ベースで測定され得る。タンパク質は、様々な方法で測定される。例えば、細胞の場合、
測定されたタンパク質は、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、またはこれら２つの組
み合わせとして測定され得る。対象の場合、測定されたタンパク質は、血清；特定の組織
もしくは組織、例えば、肝臓、腎臓、心臓、もしくは脳；特定の細胞型、例えば、肝臓も
しくは脳の様々な細胞型のうちの１つ；または血清、組織、および／もしくは細胞型の任
意の組み合わせにおいて測定されるタンパク質であり得る。さらに、ベースラインの量の
内因性タンパク質は、ｍＲＮＡの投与前に細胞または対象において測定され、その後、ｍ
ＲＮＡの投与後に測定されるタンパク質から差し引かれ、ｍＲＮＡから生成される対応す
るタンパク質の量を得ることができる。このような方法で、ｍＲＮＡは、例えば、細胞ま
たは対象に送達されるｍＲＮＡの量と比較して、大量の治療用物質のリザーバまたはデポ
ー源を細胞または対象に提供することができる。デポー源は、継続期間にわたって、ｍＲ
ＮＡからのポリペプチド発現のために連続源の機能を果たし得る。

特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
（ａ）少なくとも一部が機能的分泌性ポリペプチドをコードする少なくとも１つのｍＲ
ＮＡ分子と、（ｂ）脂質ナノ粒子を含む移送ビヒクルと、を含む、組成物。
（項目２）
前記ｍＲＮＡは、リソソーム貯蔵障害を有する個体において異常に欠乏している酵素を
コードする、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記ｍＲＮＡは、機能的エリスロポエチンまたは機能的α−ガラクトシダーゼポリペプ
チドをコードする、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記ＲＮＡ分子は、前記ＲＮＡ分子に安定性を付与する少なくとも１つの修飾を含む、
項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記ＲＮＡ分子は、前記ＲＮＡ分子の５’非翻訳領域の修飾を含む、項目１に記載の組
成物。
（項目６）
前記修飾は、Ｃａｐ１構造の包含を含む、項目５に記載の組成物。
（項目７）
前記ＲＮＡ分子は、前記ＲＮＡ分子の３’非翻訳領域の修飾を含む、項目１に記載の組
成物。
（項目８）
前記修飾は、ポリＡ尾部の包含を含む、項目７に記載の組成物。
（項目９）
標的細胞の細胞内コンパートメントへの前記ＲＮＡ分子の移動を促進するための作用物
質をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目１０）
前記脂質ナノ粒子は、１つ以上のカチオン性脂質を含む、項目１に記載の組成物。
（項目１１）
前記脂質ナノ粒子は、１つ以上の非カチオン性脂質を含む、項目１に記載の組成物。
（項目１２）
前記脂質ナノ粒子は、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む、項目１に記載の組成物。
（項目１３）
前記脂質ナノ粒子は、Ｃ１２−２００を含む、項目１に記載の組成物。
（項目１４）
前記脂質ナノ粒子は、ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ、ＣＨＯＬ、ＤＯＰＥ、およびＤＭＧ−Ｐ
ＥＧ−２０００を含む、項目１に記載の組成物。
（項目１５）
前記脂質ナノ粒子は、Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、ＣＨＯＬ、およびＤＭＧＰＥＧ２Ｋ
を含む、項目１に記載の組成物。
（項目１６）
前記脂質ナノ粒子は、切断可能な脂質を含む、項目１に記載の組成物。
（項目１７）
前記組成物は、凍結乾燥される、項目１に記載の組成物。
（項目１８）
前記組成物は、凍結乾燥された再構成組成物である、項目１に記載の組成物。
（項目１９）
前記標的細胞は、肝細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞
、幹細胞、間葉細胞、神経細胞、心臓細胞、含脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨
格筋細胞、β細胞、下垂体細胞、滑膜ライニング細胞、卵巣細胞、精巣細胞、線維芽細胞
、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、および腫瘍細胞からなる群から選択さ
れる、項目１０に記載の組成物。
（項目２０）
機能的ポリペプチドが欠乏している対象を治療する方法であって、（ａ）少なくとも一
部が前記機能的分泌性ポリペプチドをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡと、（ｂ）脂
質ナノ粒子を含む移送ビヒクルと、を含む組成物を投与することを含み、前記組成物の投
与後、前記ｍＲＮＡは、標的細胞内で発現されて、前記機能的分泌性ポリペプチドを産生
する、方法。
（項目２１）
前記ｍＲＮＡは、機能的エリスロポエチン、α−ガラクトシダーゼ、ＬＤＬ受容体、第
ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、ヘパ
リン−Ｎ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、ガラクトース６−ス
ルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、リソソーム酸リパーゼまたはアリールスルファタ
ーゼ−Ａポリペプチド、および（ｂ）移送ビヒクルをコードし、前記組成物の投与後、前
記ｍＲＮＡは、標的細胞内で発現されて、機能的分泌性ポリペプチドを産生する、項目２
１に記載の方法。
（項目２２）
前記機能的分泌性ポリペプチドは、リソソーム貯蔵障害を有する個体において異常に欠
乏している酵素である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記ｍＲＮＡ分子は、前記ｍＲＮＡ分子に安定性を付与する少なくとも１つの修飾を含
む、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記ｍＲＮＡ分子は、前記ｍＲＮＡ分子の５’非翻訳領域の修飾を含む、項目２１に記
載の方法。
（項目２５）
前記修飾は、Ｃａｐ１構造の包含を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２６）
前記ｍＲＮＡ分子は、前記ｍＲＮＡ分子の３’非翻訳領域の修飾を含む、項目２１に記
載の方法。
（項目２７）
前記修飾は、ポリＡ尾部の包含を含む、項目２７に記載の方法。
（項目２８）
前記標的細胞の細胞内コンパートメントへの前記ｍＲＮＡ分子の移動を促進するための
作用物質をさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目２９）
前記脂質ナノ粒子は、１つ以上のカチオン性脂質を含む、項目２１に記載の方法。
（項目３０）
前記脂質ナノ粒子は、１つ以上の非カチオン性脂質を含む、項目２１に記載の方法。
（項目３１）
前記脂質ナノ粒子は、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む、項目２１に記載の方法。
（項目３２）
前記脂質ナノ粒子は、Ｃ１２−２００を含む、項目２１に記載の方法。
（項目３３）
前記脂質ナノ粒子は、ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ、ＣＨＯＬ、ＤＯＰＥ、およびＤＭＧ−Ｐ
ＥＧ−２０００を含む、項目２１に記載の方法。
（項目３４）
前記脂質ナノ粒子は、Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、ＣＨＯＬ、およびＤＭＧＰＥＧ２Ｋ
を含む、項目２１に記載の方法。
（項目３５）
前記脂質ナノ粒子は、切断可能な脂質を含む、項目２１に記載の方法。
（項目３６）
前記組成物は、凍結乾燥される、項目２１に記載の方法。
（項目３７）
前記組成物は、凍結乾燥された再構成組成物である、項目２１に記載の方法。
（項目３８）
前記標的細胞は、肝細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞
、幹細胞、間葉細胞、神経細胞、心臓細胞、含脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨
格筋細胞、β細胞、下垂体細胞、滑膜ライニング細胞、卵巣細胞、精巣細胞、線維芽細胞
、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、および腫瘍細胞からなる群から選択さ
れる、項目２１に記載の方法。
（項目３９）
機能的分泌性ポリペプチドが欠乏している対象を治療する方法であって、（ａ）少なく
とも一部が前記機能的分泌性ポリペプチドをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡと、（
ｂ）脂質ナノ粒子を含む移送ビヒクルと、を含む組成物を投与することを含み、前記組成
物の投与後、前記ｍＲＮＡは、標的細胞内で翻訳されて、投与の１時間を超えた後に少な
くとも最小治療レベルで前記標的細胞内に前記機能的ポリペプチドを産生する、方法。
（項目４０）
標的細胞内で機能的分泌性ポリペプチドを産生する方法であって、（ａ）少なくとも一
部が前記機能的分泌性ポリペプチドをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡと、（ｂ）脂
質ナノ粒子を含む移送ビヒクルと、を含む組成物を投与することを含み、前記組成物の投
与後、前記ｍＲＮＡは、標的細胞内で翻訳されて、投与の１時間を超えた後に少なくとも
最小治療レベルで機能的分泌性ポリペプチドを産生する、方法。
上で論じられる特徴および多くの他の特徴ならびに本発明の付随する利点は、添付の実
施例と併せて、本発明の以下の詳細な説明を参照することにより、より良好に理解される
であろう。本明細書に記載の様々な実施形態は相補的であり、本明細書に包含される教示
を考慮して、当業者によって理解される様式でともに合わせられるか、または使用されて
もよい。

５’ＣＭＶ配列（配列番号１）のヌクレオチド配列を示し、Ｘは、存在する場合、ＧＧＡである。 ３’ｈＧＨ配列（配列番号２）のヌクレオチド配列を示す。 ヒト赤血球生成（ＥＰＯ）ｍＲＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。この配列は、配列番号１の５’末端および配列番号２の３’末端に隣接し得る。 ヒトα−ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）ｍＲＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４）を示す。この配列は、配列番号１の５’末端および配列番号２の３’末端に隣接し得る。 ヒトα−１抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）ｍＲＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。この配列は、配列番号１の５’末端および配列番号２の３’末端に隣接し得る。 ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ｍＲＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６）を示す。この配列は、配列番号１の５’末端および配列番号２の３’末端に隣接し得る。 ＥＬＩＳＡを用いて測定された分泌性ｈＥＰＯタンパク質レベルの定量化を示す。検出されたタンパク質は、様々な脂質ナノ粒子製剤の単回投与によって静脈内送達されたｈＥＰＯ ｍＲＮＡからのその産生の結果である。製剤Ｃ１２−２００（３０ｕｇ）、ＨＧＴ４００３（１５０ｕｇ）、ＩＣＥ（１００ｕｇ）、ＤＯＤＡＰ（２００ｕｇ）を、それぞれの試験物質（製剤１〜４）のカチオン性／イオン性脂質成分で表す。値は、投与から４時間後の血液試料に基づく。 ヒトＥＰＯ ｍＲＮＡ装填脂質ナノ粒子（製剤１〜４）の単回静脈内投与で処理されたマウスのヘマトクリット測定結果を示す。全血試料を、投与から４時間（１日目）、２４時間（２日目）、４日、７日、および１０日後に採取した。 単回静脈内投与または３回注入（１日目、３日目、５日目）のいずれかでヒトＥＰＯ−ｍＲＮＡ装填脂質ナノ粒子で処理されたマウスのヘマトクリット測定結果を示す。全血試料を、注入前（−４日目）、７日目、および１５日目に採取した。製剤１の投与：（３０ｕｇを単回投与）または（３×１０ｕｇを１日目、３日目、５日目に投与）、製剤２の投与：（３×５０ｕｇを１日目、３日目、５日目に投与）。 ＥＬＩＳＡを用いて測定された分泌性ヒトα−ガラクトシダーゼ（ｈＧＬＡ）タンパク質レベルの定量化を示す。検出されるタンパク質は、脂質ナノ粒子を介して送達されるｈＧＬＡ ｍＲＮＡからの産生の結果である（製剤１：カプセル化ｍＲＮＡに基づいて３０ｕｇの単回静脈内投与）。ｈＧＬＡタンパク質を４８時間にわたって検出する。 血清中のｈＧＬＡ活性を示す。ｈＧＬＡ活性を、基質４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（４−ＭＵ−α−ｇａｌ）を用いて３７℃で測定した。データは、６〜９名の個体の測定結果の平均である。 ＥＬＩＳＡを用いて測定された血清におけるｈＧＬＡタンパク質レベルの定量化を示す。タンパク質を、Ｃ１２−２００ベースの脂質ナノ粒子（Ｃ１２−２００：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧＰＥＧ２Ｋ、４０：３０：２５：５（製剤１）；カプセル化ｍＲＮＡに基づいて３０ｕｇのｍＲＮＡ、単回静脈内投与）を介して送達されるｈＧＬＡ ｍＲＮＡから産生する。ｈＧＬＡタンパク質を７２時間にわたって監視する（カプセル化ｍＲＮＡに基づいて、単回静脈内投与毎に）。ｈＧＬＡタンパク質を７２時間にわたって監視する。 ＥＬＩＳＡを用いて測定された肝臓、腎臓、および脾臓におけるｈＧＬＡタンパク質レベルの定量化を示す。タンパク質を、Ｃ１２−２００ベースの脂質ナノ粒子（製剤１：カプセル化ｍＲＮＡに基づいて３０ｕｇのｍＲＮＡを単回静脈内投与）を介して送達されるｈＧＬＡ ｍＲＮＡから産生する。ｈＧＬＡタンパク質を７２時間にわたって監視する。 血清（Ａ）および肝臓（Ｂ）における分泌性ＭＲＴ由来ヒトＧＬＡタンパク質としてｈＧＬＡのタンパク質産生を監視する用量応答研究を示す。試料を投与から２４時間後に測定し（製剤１：単回静脈内投与、Ｎ＝４匹のマウス／群）、ＥＬＩＳＡを用いて定量化した。 血清（Ａ）および肝臓（Ｂ）における分泌性ＭＲＴ由来ヒトＧＬＡタンパク質としてｈＧＬＡのタンパク質産生を監視する用量応答研究を示す。試料を投与から２４時間後に測定し（製剤１：単回静脈内投与、Ｎ＝４匹のマウス／群）、ＥＬＩＳＡを用いて定量化した。 無胸腺ヌードマウスにおけるＥＲＴベースのα−ガラクトシダーゼ（４０ｕｇ／ｋｇの投与量）およびＭＲＴから産生されるｈＧＬＡタンパク質（製剤１：１．０ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡ投与量）の薬物動態プロファイルを示す。 ＥＬＩＳＡを用いて測定されたＭＲＴで処理されたファブリーマウスにおける分泌性ｈＧＬＡタンパク質レベルの定量化を示す。ｈＧＬＡタンパク質を、Ｃ１２−２００ベースの脂質ナノ粒子（製剤１：カプセル化ｍＲＮＡに基づいて単回静脈内投与毎に１０ｕｇのｍＲＮＡ）を介して送達されるｈＧＬＡ ｍＲＮＡから産生する。血清を７２時間にわたって監視する。 ＥＬＩＳＡを用いて測定されたＭＲＴで処理されたファブリーノックアウトマウスの肝臓、腎臓、脾臓、および心臓におけるｈＧＬＡタンパク質レベルの定量化を示す。タンパク質を、Ｃ１２−２００ベースの脂質ナノ粒子（製剤１：カプセル化ｍＲＮＡに基づいて３０ｕｇのｍＲＮＡを単回静脈内投与）を介して送達されるｈＧＬＡ ｍＲＮＡから産生する。ｈＧＬＡタンパク質を７２時間にわたって監視する。正常な生理学的レベルを表す文献上の値を点線でグラフ表示する。 ＥＬＩＳＡを用いて測定されたＭＲＴおよびα−ガラクトシダーゼで処理されたファブリーマウスにおける分泌性ｈＧＬＡタンパク質レベルの定量化を示す。これら両方の治療薬を１．０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投与量として投与した。 ＥＬＩＳＡを用いて測定されたＭＲＴおよびＥＲＴ（α−ガラクトシダーゼ）で処理されたファブリーノックアウトマウスの肝臓、腎臓、脾臓、および心臓におけるｈＧＬＡタンパク質レベルの定量化を示す。タンパク質を、脂質ナノ粒子（製剤１：カプセル化ｍＲＮＡに基づいて１．０ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡを単回静脈内投与）を介して送達されるｈＧＬＡ ｍＲＮＡから産生した。 処理されたマウスおよび未処理のマウスの腎臓におけるグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）およびＬｙｓｏ−Ｇｂ３の相対的な定量化を示す。雄ファブリーノックアウトマウスを、ＧＬＡ ｍＲＮＡ装填脂質ナノ粒子またはα−ガラクトシダーゼのいずれかの１．０ｍｇ／ｋｇ単回投与で処理した。量は、投与から１週間後のＧｂ３／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量を反映した。 処理されたマウスおよび未処理のマウスの心臓におけるグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）およびＬｙｓｏ−Ｇｂ３の相対的な定量化を示す。雄ファブリーノックアウトマウスをＧＬＡ ｍＲＮＡ装填脂質ナノ粒子またはα−ガラクトシダーゼのいずれかの１．０ｍｇ／ｋｇでの単回投与で処理した。量は、投与から１週間後のＧｂ３／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３を反映する。 血清中の分泌性ＭＲＴ由来ヒトＧＬＡタンパク質としてＧＬＡのタンパク質産生を監視する用量応答研究を示す。試料をＨＧＴ４００３（製剤３）またはＨＧＴ５０００ベースの脂質ナノ粒子（製剤５）のいずれかの投与から２４時間後に測定し（単回静脈内投与、Ｎ＝４匹のマウス／群）、ＥＬＩＳＡを用いて定量化した。 血清（Ａ）または肝臓、腎臓、および脾臓（Ｂ）において測定されたｈＧＬＡタンパク質産生を示す。試料をＨＧＴ５００１ベースの脂質ナノ粒子（製剤６）の投与から６時間後および２４時間後に測定し（単回静脈内投与、Ｎ＝４マウス／群）、ＥＬＩＳＡを用いて定量化した。 血清（Ａ）または肝臓、腎臓、および脾臓（Ｂ）において測定されたｈＧＬＡタンパク質産生を示す。試料をＨＧＴ５００１ベースの脂質ナノ粒子（製剤６）の投与から６時間後および２４時間後に測定し（単回静脈内投与、Ｎ＝４マウス／群）、ＥＬＩＳＡを用いて定量化した。 ＥＬＩＳＡを用いて測定された分泌性ヒト第ＩＸ因子タンパク質レベルの定量化を示す（平均ｎｇ／ｍＬ±標準偏差）。ＦＩＸタンパク質を、Ｃ１２−２００ベースの脂質ナノ粒子（４０：３０：２５：５のＣ１２−２００：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧＰＥＧ２Ｋ（製剤１）、カプセル化ｍＲＮＡに基づいて単回静脈内投与毎に３０ｕｇのｍＲＮＡ）を介して送達されるＦＩＸ ｍＲＮＡから産生する。ＦＩＸタンパク質を７２時間にわたって監視する。（ｎ＝２４匹のマウス） ＥＬＩＳＡを用いて測定された分泌性ヒトα−１−抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）タンパク質レベルの定量化を示す。Ａ１ＡＴタンパク質を、Ｃ１２−２００ベースの脂質ナノ粒子（４０：３０：２５：５のＣ１２−２００：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧＰＥＧ２Ｋ（製剤１）、カプセル化ｍＲＮＡに基づいて単回静脈内投与毎の３０ｕｇのｍＲＮＡ）を介して送達されるＡ１ＡＴ ｍＲＮＡから産生する。Ａ１ＡＴタンパク質を２４時間にわたって監視する。 ｈＥＰＯ ｍＲＮＡ装填ナノ粒子の気管内投与後の処理されたマウスの肺および血清中に検出されたｈＥＰＯタンパク質のＥＬＩＳＡベースの定量化を示す（ｍＩＵ単位で測定）（Ｃ１２−２００、ＨＧＴ５０００、またはＨＧＴ５００１ベースの脂質ナノ粒子、それぞれ、製剤１、５、６）。動物を投与から６時間後に屠殺した（ｎ＝１群当たり４匹のマウス）。

（例示的な実施形態の説明）
本発明は、治療レベルの機能的分泌タンパク質の産生のために１つ以上の標的細胞にリ
ポソーム移送ビヒクル中のｍＲＮＡを細胞内送達するための組成物および方法を提供する
。

タンパク質または酵素を限定するために本明細書で使用される「機能的」という用語は
、タンパク質または酵素が生物学的活性を有するか、またはあるいは天然もしくは正常に
機能するタンパク質または酵素と同一もしくは同様の機能を果たすことができることを意
味する。本発明のｍＲＮＡ組成物は、様々な代謝的または遺伝的障害、具体的には、タン
パク質または酵素の非発現、誤発現、または欠乏を伴う遺伝的または代謝的障害の治療に
有用である。「治療レベル」という用語は、対照レベルを上回る血液または組織中に検出
されるタンパク質のレベルを指し、対照は、正常な生理学的レベル、またはレベルｍＲＮ
Ａ組成物の投与前の対象におけるレベルであり得る。「分泌性」という用語は、標的細胞
外（細胞外空間）で検出されるタンパク質を指す。タンパク質は、血液または組織におい
て検出され得る。本発明の文脈において、「産生される」という用語は、タンパク質また
は酵素への少なくとも１つのｍＲＮＡの翻訳を指すために広義に使用される。本明細書に
提供されるように、組成物は、移送ビヒクルを含む。本明細書で使用される「移送ビヒク
ル」という用語は、標準の薬学的担体、希釈剤、賦形剤等のうちのいずれかを含み、これ
らは、概して、核酸を含む生理学的活性剤の投与に関連して使用するためのものである。
本明細書に記載の組成物、具体的には、移送ビヒクルは、ｍＲＮＡを標的細胞に送達する
ことができる。実施形態において、移送ビヒクルは、脂質ナノ粒子である。
ｍＲＮＡ

本発明の組成物中のｍＲＮＡは、例えば、正常に分泌される分泌性ホルモン、酵素、受
容体、ポリペプチド、ペプチド、または他の目的とするタンパク質をコードし得る。本発
明の一実施形態において、ｍＲＮＡは、例えば、そのようなｍＲＮＡの安定性および／も
しくは半減期を改善するか、あるいはタンパク質の産生を改善するか、またはさもなけれ
ば促進する化学的もしくは生物学的修飾を任意に有し得る。

本発明の方法は、例えば、２つの一意のｍＲＮＡを合わせて単一の移送ビヒクルに入れ
ることによって、標的細胞への１つ以上の一意のｍＲＮＡの任意の同時送達を提供する。
本発明の一実施形態において、第１の治療的ｍＲＮＡおよび第２の治療的ｍＲＮＡは、単
一の移送ビヒクル中に製剤化され、投与され得る。本発明は、第１の治療的ｍＲＮＡの機
能または送達を促進および／もしくは強化するために、第１の治療的ｍＲＮＡおよび第２
の核酸の同時送達および／または同時投与も企図する。例えば、そのような第２の核酸（
例えば、外因性または合成ｍＲＮＡ）は、発現時（例えば、外因性または合成ｍＲＮＡの
翻訳時）に、第１のｍＲＮＡの送達を促進するか、またはその生物学的活性を強化する膜
トランスポータータンパク質をコードし得る。あるいは、第１の治療的ｍＲＮＡは、例え
ば、第１の治療的ｍＲＮＡのいずれかの折り畳みを指向するために、「シャペロン」の機
能を果たす第２の核酸とともに投与され得る。

本発明の方法は、単一の障害または欠乏を治療する１つ以上の治療的核酸の送達も提供
し、それぞれのそのような治療的核酸は、異なる作用機構によって機能する。例えば、本
発明の組成物は、例えば、内因性タンパク質または酵素欠乏を修正するために投与され、
かつ第２の核酸を伴う第１の治療的ｍＲＮＡを含み得、第２の核酸は、正常に機能しない
内因性核酸およびそのタンパク質または酵素産物を非活性化または「ノックダウン」する
ために投与される。そのような「第２の」核酸は、例えば、ｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを
コードし得る。

トランスフェクションの際に、本発明の組成物中の天然のｍＲＮＡは、３０分間〜数日
間の半減期に伴って減衰し得る。本発明の組成物中のｍＲＮＡは、好ましくは、翻訳され
る少なくともいくらかの能力を保持し、したがって、機能的分泌タンパク質または酵素を
産生する。したがって、本発明は、安定化したｍＲＮＡを含む組成物およびそれを投与す
る方法を提供する。本発明のいくつかの実施形態において、ｍＲＮＡの活性は、長期間に
わたって延長される。例えば、ｍＲＮＡの活性を、本発明の組成物が週２回もしくは隔週
で、またはより好ましくは、月１回、隔月、年４回、もしくは年１回、対象に投与される
ように長引かせることができる。延長されたか、または長引いた本発明のｍＲＮＡの活性
は、そのようなｍＲＮＡから産生される機能的分泌タンパク質または酵素の量に直接関連
している。同様に、本発明の組成物の活性を、ｍＲＮＡの翻訳を改善または強化させる修
飾によってさらに延長または長引かせることができる。さらに、標的細胞によって産生さ
れる機能的タンパク質または酵素の量は、標的細胞に送達されるｍＲＮＡの量およびその
ようなｍＲＮＡの安定性の関数である。本発明のｍＲＮＡの安定性が改善または強化され
得る程度まで、半減期、産生された分泌タンパク質または酵素の活性、および組成物の投
与頻度がさらに延長され得る。

したがって、本発明のいくつかの実施形態において、組成物中のｍＲＮＡは、例えば、
生体内でのヌクレアーゼ消化への耐性の改善を含む、核酸に安定性の増加または強化を付
与する少なくとも１つの修飾を含む。本明細書に提供される核酸に関連する、本明細書で
使用される「修飾」および「修飾される」という用語は、好ましくは、安定性を強化し、
野生型または自然発生バージョンのｍＲＮＡよりも高い安定性をｍＲＮＡに与える（例え
ば、ヌクレアーゼ消化に耐性を示す）少なくとも１つの変更を含む。本発明の核酸に関連
し、特にｍＲＮＡに関する、本明細書で使用される「安定した」および「安定性」という
用語は、例えば、そのようなｍＲＮＡを正常に分解することができるヌクレアーゼ（すな
わち、エンドヌクレアーゼまたはエクソヌクレアーゼ）による分解への耐性の増加または
強化を指す。増加した安定性には、例えば、内因性酵素（例えば、エンドヌクレアーゼま
たはエクソヌクレアーゼ）による加水分解もしくは他の破壊、または標的細胞もしくは組
織内の状態への感受性の低下が含まれ得、したがって、標的細胞、組織、対象、および／
または細胞質中でのそのようなｍＲＮＡの滞留を増加させるか、もしくは強化する。本明
細書に提供される安定化されたｍＲＮＡ分子は、それらの自然発生の未修飾対応物（例え
ば、野生型バージョンのｍＲＮＡ）と比較して、より長い半減期を示す。本発明のｍＲＮ
Ａに関連する「修飾」および「修飾された」という用語によって、例えば、タンパク質の
翻訳開始の際に機能する配列（例えば、コザックコンセンサス配列）の包含を含む、ｍＲ
ＮＡ核酸の翻訳を改善または強化する変更も企図される（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５（２０）：８１２５−４８（１９８７））。

いくつかの実施形態において、本発明のｍＲＮＡは、それらにより高い安定性を与える
ために、化学的または生物学的修飾を経験している。ｍＲＮＡに対する例示的な修飾には
、塩基の欠乏（例えば、欠失、もしくはあるヌクレオチドの別のヌクレオチドへの置換に
よる）または塩基の修飾、例えば、塩基の化学的修飾が含まれる。本明細書で使用される
「化学的修飾」という語句には、自然発生ｍＲＮＡにおいて見られる化学的性質とは異な
る化学的性質を導入する修飾、例えば、修飾されたヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド
類似体）の導入、またはそのようなｍＲＮＡ分子において自然界では見られないペンダン
ト基の包含等の共有結合修飾が含まれる。

加えて、好適な修飾には、コドンが同一のアミノ酸をコードするが、野生型バージョン
のｍＲＮＡにおいて見られるコドンよりも安定性が高くなるようなコドンの１つ以上のヌ
クレオチドの変更が含まれる。例えば、ＲＮＡの安定性とより多くのシチジン（Ｃ）およ
び／またはウリジン（Ｕ）残基との間の逆相関が実証されており、ＣおよびＵ残基を欠く
ＲＮＡが大半のＲＮａｓｅに対して安定していることが見出されている（Ｈｅｉｄｅｎｒ
ｅｉｃｈ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９，２１３１−８（１９９４））
。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ配列中のＣおよび／またはＵ残基の数が減少す
る。別の実施形態では、Ｃおよび／またはＵ残基の数は、特定のアミノ酸をコードするあ
るコドンを同一または関連アミノ酸をコードする別のコドンに置換することによって減少
する。本発明のｍＲＮＡ核酸に対する企図される修飾には、偽ウリジンの組み込みも含ま
れる。偽ウリジンの本発明のｍＲＮＡ核酸への組み込みは、安定性および翻訳能力を高め
、かつ生体内における免疫原性を低下させ得る。例えば、Ｋａｒｉｋo，Ｋ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １６（１１）：１８３３−１８４０（２０
０８）を参照されたい。本発明のｍＲＮＡの置換および修飾は、当業者に容易に既知の方
法によって行われ得る。

配列中のＣおよびＵ残基の数を減少させることに対する制約は、非翻訳領域よりもｍＲ
ＮＡのコーディング領域内で大きい可能性がある（すなわち、所望のアミノ酸配列をコー
ドするメッセージの能力を引き続き保持しながら、メッセージ中に存在するＣおよびＵ残
基のすべてを排除することは恐らく不可能である）。しかしながら、遺伝子コードの縮重
は、同一のコーディング能力を維持しながら、配列中に存在するＣおよび／またはＵ残基
の数を減少させる機会を提示する（すなわち、どのアミノ酸がコドンによってコードされ
るかに応じて、ＲＮＡ配列の修飾のいくつかの異なる可能性が考えられ得る）。例えば、
Ｇｌｙのコドンは、ＧＧＵまたはＧＧＣの代わりに、ＧＧＡまたはＧＧＧに変更され得る
。

修飾という用語は、例えば、本発明のｍＲＮＡ配列への非ヌクレオチド結合または修飾
ヌクレオチドの組み込み（例えば、機能的分泌タンパク質または酵素をコードするｍＲＮ
Ａ分子の３’および５’末端のうちの１つまたは両方への修飾）も含む。そのような修飾
は、ｍＲＮＡ配列への塩基の付加（例えば、ポリＡ尾部またはより長いポリＡ尾部の包含
）、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲの変更、ｍＲＮＡと作用物質との複合（例えば、タンパ
ク質または相補的核酸分子）、およびｍＲＮＡ分子の構造を変更させる（例えば、二次構
造を形成する）要素の包含を含む。

ポリＡ尾部は、天然のメッセンジャーを安定化させると考えられている。したがって、
一実施形態において、長いポリＡ尾部はｍＲＮＡ分子に付加され、したがって、ｍＲＮＡ
により高い安定性を付与し得る。ポリＡ尾部は、様々な当技術分野で認識される技法を用
いて付加され得る。例えば、長いポリＡ尾部は、ポリＡポリメラーゼを用いて、合成ｍＲ
ＮＡまたは生体外転写ｍＲＮＡに付加され得る（Ｙｏｋｏｅ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９６；１４：１２５２−１２５６）。転写ベクター
は、長いポリＡ尾部もコードし得る。加えて、ポリＡ尾部は、ＰＣＲ産物からの直接転写
によって付加され得る。一実施形態において、ポリＡ尾部は、少なくとも約９０、２００
、３００、４００、少なくとも５００ヌクレオチド長である。一実施形態において、ポリ
Ａ尾部の長さは、本発明の修飾ｍＲＮＡ分子の安定性、ひいてはタンパク質の転写を制御
するように調整される。例えば、ポリＡ尾部の長さがｍＲＮＡ分子の半減期に影響を与え
得るため、ポリＡ尾部の長さは、ヌクレアーゼに対するｍＲＮＡの耐性レベルを修正し、
ゆえに、細胞におけるタンパク質発現の時間経過を制御するように調整され得る。一実施
形態において、安定化したｍＲＮＡ分子は、移送ビヒクルなしで標的細胞に送達され得る
ように、十分に生体内分解に耐性を示す（例えば、ヌクレアーゼによって）。

一実施形態において、ｍＲＮＡは、野生型ｍＲＮＡにおいて自然界では見られない３’
および／または５’非翻訳（ＵＴＲ）配列の組み込みによって修飾され得る。一実施形態
において、自然界でｍＲＮＡに隣接し、かつ第２の非連関タンパク質をコードする３’お
よび／または５’フランキング配列は、治療的または機能的タンパク質をコードするｍＲ
ＮＡ分子のヌクレオチド配列に組み込まれ、それを修飾し得る。例えば、安定したｍＲＮ
Ａ分子由来の３’または５’配列（例えば、グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブ
リン、ヒストン、またはクエン酸サイクル酵素）は、センスｍＲＮＡ核酸分子の３’およ
び／または５’領域に組み込まれて、センスｍＲＮＡ分子の安定性を増加させ得る。例え
ば、米国第２００３／００８３２７２号を参照されたい。

いくつかの実施形態において、本発明の組成物中のｍＲＮＡは、ＣＭＶ前初期１（ＩＥ
１）遺伝子またはその断片（例えば、配列番号１）の部分配列を含ませるｍＲＮＡの５’
末端の修飾を含み、ヌクレアーゼ耐性を改善し、かつ／またはｍＲＮＡの半減期を改善す
る。ｍＲＮＡ核酸配列の安定性の増加に加えて、ＣＭＶ前初期１（ＩＥ１）遺伝子の部分
配列の包含が、ｍＲＮＡの翻訳および機能的タンパク質または酵素の発現を強化すること
が意外にも見出された。ｍＲＮＡをさらに安定化させるために、核酸（例えば、ｍＲＮＡ
）の３’末端へのヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子配列またはその断片（例えば、配列
番号２）の包含も企図される。概して、好ましい修飾は、それらの未修飾対応物と比較し
て、ｍＲＮＡの安定性および／または薬物動態学的特性（例えば、半減期）を改善し、例
えば、そのようなｍＲＮＡの生体内ヌクレアーゼ消化への耐性を改善させる修飾を含む。

配列番号１および／または配列番号２の核酸配列の変異体がさらに企図され、これらの
変異体は、ｍＲＮＡの安定化を含む核酸の機能的特性および／または薬物動態学的特性（
例えば、半減期）を維持する。変異体は、配列番号１または配列番号２に対して９０％を
超えるか、９５％を超えるか、９８％を超えるか、または９９％を超える配列同一性を有
し得る。

いくつかの実施形態において、組成物は、安定化試薬を含み得る。組成物は、直接的ま
たは間接的に結合する１つ以上の製剤試薬を含み、ｍＲＮＡを安定化させ、したがって、
標的細胞内での滞留時間を増加させ得る。そのような試薬は、好ましくは、標的細胞にお
けるｍＲＮＡの半減期の改善につながる。例えば、ｍＲＮＡの安定性および翻訳の効率は
、細胞内で天然に存在するｍＲＮＡとの複合体を形成する「安定化試薬」の組み込みによ
って増加し得る（例えば、米国特許第５，６７７，１２４号を参照のこと）。安定化試薬
の組み込みは、例えば、ポリＡおよびタンパク質をｍＲＮＡと合わせて、ｍＲＮＡを移送
ビヒクル内に装填またはカプセル化する前に生体外で安定化させることによって達成され
得る。例示的な安定化試薬は、１つ以上のタンパク質、ペプチド、アプタマー、翻訳アク
セサリータンパク質、ｍＲＮＡ結合タンパク質、および／または翻訳開始因子を含む。

組成物の安定化も、移送ビヒクルに化学的または物理的に結合される（例えば、脂溶性
アンカーの自らの膜へのインターカレーションにより、または膜脂質の活性基への直接結
合によって）、典型的には大きい親水性ポリマーであるオプソニン化阻害部分の使用によ
って改善され得る。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、マクロファージ単球系
および細網内皮系によるリポソームの摂取を著しく減少させる保護表面層を形成する（例
えば、全開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９２０，０１６号に
記載されている）。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾された移送担体は、それら
の未修飾対応物よりもはるかに長く循環内に留まる。

ＲＮＡが相補的核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）にハイブリダイズするとき、
それは、ヌクレアーゼによって保護され得る（Ｋｒｉｅｇ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｌｔｏｎ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．１９８７；１５５，３９７−４１５）。
ハイブリダイズされたｍＲＮＡの安定性は、大半のＲｎａｓｅの固有の一本鎖特異性によ
る可能性が高い。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡを複合するために選択される安
定化試薬は、真核生物タンパク質（例えば、哺乳動物タンパク質）である。さらに別の実
施形態では、ｍＲＮＡは、第２の核酸分子へのハイブリダイゼーションによって修飾され
得る。全ｍＲＮＡ分子が相補的核酸分子にハイブリダイズされた場合、翻訳開始は減少さ
れ得る。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ分子の５’非翻訳領域およびＡＵＧ開始
領域は、任意にハイブリダイズされないままであり得る。翻訳開始後、リボソーム複合体
の巻き戻し活性は、翻訳が開始し得るように、高親和性の二本鎖上でさえも機能し得る（
Ｌｉｅｂｈａｂｅｒ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９２；２２６：２−１３、Ｍｏｎｉ，
ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：１４５１４−２２）。

上述のｍＲＮＡの安定性を強化するための方法のうちのいずれかが、単独で、または他
の上述の方法および／もしくは組成物のうちの１つ以上またはそれらのうちのいずれかと
組み合わせてのいずれかで用いられ得ることが理解される。

本発明のｍＲＮＡは、例えば、標的細胞または組織へのｍＲＮＡ送達の決定を促進する
レポーター遺伝子（例えば、ｍＲＮＡのコーディング領域の上流または下流）と任意に合
わせられ得る。好適なレポーター遺伝子は、例えば、緑色蛍光タンパク質ｍＲＮＡ（ＧＦ
Ｐ ｍＲＮＡ）、レニラルシフェラーゼｍＲＮＡ（ルシフェラーゼｍＲＮＡ）、ホタルル
シフェラーゼｍＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。例えば、ＧＦＰ
ｍＲＮＡは、分泌性タンパク質をコードするｍＲＮＡと融合されて、タンパク質産生のた
めにデポーの機能を果たす標的細胞におけるｍＲＮＡの局在化の確認を促進し得る。

本明細書で使用される「トランスフェクト」または「トランスフェクション」という用
語は、ｍＲＮＡの細胞への細胞内導入、または好ましくは、標的細胞への細胞内導入を意
味する。導入されたｍＲＮＡは、標的細胞内で安定的または一時的に維持され得る。「ト
ランスフェクション効率」という用語は、トランスフェクションの対象となる標的細胞に
よって吸収されるｍＲＮＡの相対量を指す。実際には、トランスフェクション効率は、ト
ランスフェクション後に標的細胞によって発現されるレポーター核酸産物の量により推定
される。好ましい実施形態は、高いトランスフェクション有効性を有する組成物、具体的
には、非標的細胞のトランスフェクションによって媒介される副作用を最小限に抑える組
成物を含む。高いトランスフェクション有効性を示す本発明の組成物は、潜在的な全身的
副作用を最小限に抑えながら、適切な用量のｍＲＮＡが標的細胞に送達される可能性を高
める。本発明の一実施形態において、本発明の移送ビヒクルは、大きいｍＲＮＡ配列（例
えば、少なくとも１ｋＤａ、１．５ｋＤａ、２ｋＤａ、２．５ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋ
Ｄａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、またはそれ以上
のｍＲＮＡ）を送達することができる。ｍＲＮＡは、１つ以上の許容できる試薬とともに
製剤化され得、それは、そのようなｍＲＮＡを標的細胞に送達するための担体を提供する
。適切な試薬は、概して、とりわけ、ｍＲＮＡの生物学的または化学的特性、対象とする
投与ルート、そのようなｍＲＮＡが曝露される予測される生物学的環境、および対象とす
る標的細胞の特異性を含む、いくつかの要因に関して選択される。いくつかの実施形態に
おいて、リポソーム等の移送ビヒクルは、生物学的活性を損なうことなくｍＲＮＡをカプ
セル化する。いくつかの実施形態において、移送ビヒクルは、非標的細胞と比較して、標
的細胞への選択的および／または実質的結合を示す。好ましい実施形態において、移送ビ
ヒクルは、ｍＲＮＡが細胞質等の適切な細胞内コンパートメントに送達されるように、そ
の含有物を標的細胞に送達する。
移送担体

実施形態において、本発明の組成物中の移送ビヒクルは、リポソーム移送ビヒクル、例
えば、脂質ナノ粒子である。一実施形態において、移送ビヒクルは、標的細胞へのｍＲＮ
Ａの送達を最適化するように選択および／または調製される。例えば、標的細胞が肝細胞
である場合、移送ビヒクルの特性（例えば、寸法、電荷、および／もしくはｐＨ）は、そ
のような移送ビヒクルを標的細胞に効果的に送達して免疫クリアランスを減少させ、かつ
／またはその標的細胞内での保持を促進するように最適化され得る。あるいは、標的細胞
が中枢神経系である（例えば、神経変性疾患治療のために投与されるｍＲＮＡが脳または
脊髄組織を特異的に標的化し得る）場合、移送ビヒクルの選択および調製は、血液脳関門
の浸透および血液脳関門内での保持、ならびに／またはそのような移送ビヒクルをそのよ
うな標的細胞に直接送達する代替手段の使用を考慮しなければならない。本発明の一実施
形態において、組成物は、外来性ｍＲＮＡの移動を促進する作用物質（例えば、血液脳関
門の浸透性を低下または改善し、したがって、標的細胞への外来性ｍＲＮＡの移動を強化
する作用物質）と合わせられ得る。

標的細胞への核酸の送達を促進するリポソーム移送ビヒクルの使用が、本発明によって
企図される。リポソーム（例えば、リポソーム脂質ナノ粒子）は、概して、研究、産業、
および医学における様々な適用に、特に生体内における診断的または治療的化合物の移送
ビヒクルとしてのそれらの使用に有用であり（Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．，１６：３０７−３２１，１９９８；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈ
ａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．，５１：６９１−７４３，１９９９）、通常、１つ以上の二分
子膜によって外部媒介物から隔離される内部水空間を有する微細小胞と見なされる。リポ
ソームの二分子膜は、典型的には、空間的に分離された親水性および疎水性ドメインを含
む合成起源または天然起源の脂質等の両親媒性分子によって形成される（Ｌａｓｉｃ，Ｔ
ｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：３０７−３２１，１９９８）。リポソーム
の二分子膜は、両親媒性ポリマーおよび界面活性剤（例えば、ポリマーソーム、ニオソー
ム等）によっても形成され得る。

本発明の文脈において、リポソーム移送ビヒクルは、典型的には、ｍＲＮＡを標的細胞
に移送する働きをする。本発明の目的のために、リポソーム移送ビヒクルは、所望の核酸
を含有するように調製される。所望の実体（例えば、核酸）をリポソームに組み込むプロ
セスは、多くの場合、「充填」と称される（Ｌａｓｉｃ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅ
ｔｔ．，３１２：２５５−２５８，１９９２）。リポソームが組み込まれた核酸は、リポ
ソームの二分子膜内のリポソームの内部空間に完全にもしくは部分的に位置するか、また
はリポソーム膜の外面と関連し得る。リポソームへの核酸の組み込みは、本明細書におい
て「カプセル化」とも称され、核酸は、リポソームの内部空間内に完全に含有される。ｍ
ＲＮＡをリポソーム等の移送ビヒクルに組み込む目的は、多くの場合、核酸および／もし
くは系を分解する酵素または化学物質あるいは核酸の急速な排出を引き起こす受容体を含
有し得る環境から核酸を保護することである。したがって、本発明の好ましい実施形態に
おいて、選択される移送ビヒクルは、その中に含有されるｍＲＮＡの安定性を強化するこ
とができる。リポソームは、カプセル化ｍＲＮＡが標的細胞に到達することを可能にし得
、かつ／もしくはカプセル化ｍＲＮＡが標的細胞に到達することを優先的に可能にし得る
か、またはあるいは投与されるｍＲＮＡの存在が役に立たないか、または望ましくない場
合のある他の部位または細胞へのそのようなｍＲＮＡの送達を制限し得る。さらに、例え
ばカチオン性リポソーム等の移送ビヒクルへのｍＲＮＡの組み込みは、そのようなｍＲＮ
Ａの標的細胞への送達も促進する。

理想的には、リポソーム移送ビヒクルは、組成物が高効率のトランスフェクションおよ
び安定性の強化を示すように、１つ以上の所望のｍＲＮＡをカプセル化するように調製さ
れる。リポソームが標的細胞への核酸の導入を促進し得る一方で、コポリマーとしてポリ
カチオン（例えば、ポリＬ−リジンおよびプロタミン）を添加することは、生体外および
生体内の両方において、いくつかの細胞株中のいくつかの種類のカチオン性リポソームの
トランスフェクション効率を促進し、場合によってはそれを２〜２８倍に著しく強化し得
る（Ｎ．Ｊ．Ｃａｐｌｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９５；２：６０３
、Ｓ．Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９７；４，８９１を参照のこと）
。
脂質ナノ粒子

本発明の好ましい実施形態において、移送ビヒクルは、脂質ナノ粒子として製剤化され
る。本明細書で使用される「脂質ナノ粒子」という語句は、１つ以上の脂質（例えば、カ
チオン性脂質、非カチオン性脂質、およびＰＥＧ修飾脂質）を含む移送ビヒクルを指す。
好ましくは、脂質ナノ粒子は、１つ以上のｍＲＮＡを１つ以上の標的細胞に送達するよう
に製剤化される。好適な脂質の例には、例えば、ホスファチジル化合物（例えば、ホスフ
ァチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジル
エタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシド）が挙げられ
る。単独または他の移送ビヒクルとの組み合わせにかかわらず、移送ビヒクルとしてのポ
リマーの使用も企図される。好適なポリマーには、例えば、ポリアクリル酸塩、ポリアル
キルシアノアクリル酸塩、ポリラクチド、ポリラクチド−ポリグリコリドコポリマー、ポ
リカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギン酸塩、コラーゲン、
キトサン、シクロデキストリン、デンドリマー、およびポリエチレンイミンが含まれ得る
。一実施形態において、移送ビヒクルは、その標的細胞へのｍＲＮＡのトランスフェクシ
ョンを促進する能力に基づいて選択される。

本発明は、ｍＲＮＡをカプセル化し、かつ／またはタンパク質産生のためにデポーの機
能を果たす標的細胞へのｍＲＮＡの送達を促進するために、カチオン性脂質を含む移行ビ
ヒクルとしての脂質ナノ粒子の使用を企図する。本明細書で使用される「カチオン性脂質
」という語句は、生理学的ｐＨ等の選択されたｐＨで正味正電荷を担持するいくつかの脂
質種のうちのいずれかを指す。企図される脂質ナノ粒子は、１つ以上のカチオン性脂質、
非カチオン性脂質、およびＰＥＧ修飾脂質を用いて様々な比率の多成分脂質混合物を包含
することによって調製され得る。いくつかのカチオン性脂質が文献に記載されており、そ
れらの多くは市販されている。

本発明の組成物および方法での使用に特に好適なカチオン性脂質は、参照により本明細
書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１０／０５３５７２号に記載されるもの、およ
び最も具体的には、国際公開第ＷＯ２０１０／０５３５７２号の段落［００２２５］に記
載のＣ１２−２００を含む。ある実施形態において、本発明の組成物および方法は、例え
ば、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，
１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−１５，１８−ジエン−１−アミン（ＨＧＴ５００
０）、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−
９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−４，１５，１８−トリエン−１−アミン（Ｈ
ＧＴ５００１）、および（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ
）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−５，１５，１８−トリエン
−１−アミン（ＨＧＴ５００２）等の２０１２年３月２９日出願の米国仮特許出願第６１
／６１７，４６８号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のイオン性カチオン性
脂質を含む脂質ナノ粒子を用いる。

いくつかの実施形態において、カチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ
）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリドまたは「ＤＯＴＭＡ」が使
用される（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
８４，７４１３（１９８７）、米国特許第４，８９７，３５５号）。ＤＯＴＭＡは、単独
で製剤化され得るか、またはリポソーム移送ビヒクルまたは脂質ナノ粒子への中性脂質、
ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン、もしくは「ＤＯＰＥ」、または他のカ
チオン性もしくは非カチオン性脂質と組み合わせられ得、そのようなリポソームを用いて
、標的細胞への核酸の送達を促進することができる。他の好適なカチオン性脂質には、例
えば、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミドまたは「ＤＯＧＳ」、２
，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ
−ジメチル−１−プロパンアミニウムまたは「ＤＯＳＰＡ」（Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）、米国特許第５
，１７１，６７８号、米国特許第５，３３４，７６１号）、１，２−ジオールエオイル−
３−ジメチルアンモニウム−プロパンまたは「ＤＯＤＡＰ」、１，２−ジオールエオイル
−３−トリメチルアンモニウム−プロパンまたは「ＤＯＴＡＰ」が含まれる。企図される
カチオン性脂質には、１，２−ジステアリールオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプ
ロパンもしくは「ＤＳＤＭＡ」、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ア
ミノプロパンもしくは「ＤＯＤＭＡ」、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル
−３−アミノプロパンもしくは「ＤＬｉｎＤＭＡ」、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，
Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンもしくは「ＤＬｅｎＤＭＡ」、Ｎ−ジオレイル−Ｎ，
Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリドもしくは「ＤＯＤＡＣ」、Ｎ，Ｎ−ジステアリール−
Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミドもしくは「ＤＤＡＢ」、Ｎ−（１，２−ジミリス
チルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウム
ブロミドもしくは「ＤＭＲＩＥ」、３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３
−β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエ
ンオキシ）プロパンもしくは「ＣＬｉｎＤＭＡ」、２−［５’−（コレスト−５−エン−
３−β−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチル−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−
９’，１−２’−オクタデカジエンオキシ）プロパンもしくは「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」、Ｎ
，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミンもしくは「ＤＭＯＢＡ」、１
，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンもしくは「ＤＯｃ
ａｒｂＤＡＰ」、２，３−ジリノレオイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピルアミンもし
くは「ＤＬｉｎＤＡＰ」、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジリノレイルカルバミル−３−ジメチルア
ミノプロパンもしくは「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」、１，２−ジリノレオイルカルバミル
−３−ジメチルアミノプロパンもしくは「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」、２，２−ジリノレイル−
４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソランもしくは「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ
」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランもし
くは「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ」、および２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）
−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）−Ｎ
，Ｎ−ジメチルエタンアミン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ））（国際公開第ＷＯ２０１０
／０４２８７７号、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８
：１７２−１７６（２０１０）を参照のこと）、またはそれらの混合物（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ
．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ１０７：２７６−２８７
（２００５）、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．２３（８）：１００３−１００７（２００５）、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／１２
１３４８Ａ１号）も含まれる。

コレステロールベースのカチオン性脂質の使用も本発明によって企図される。そのよう
なコレステロールベースのカチオン性脂質は、単独で、または他のカチオン性もしくは非
カチオン性脂質と組み合わせてのいずれかで用いられ得る。好適なコレステロールベース
のカチオン性脂質には、例えば、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−エチルカルボ
キシアミドコレステロール）、１，４−ビス（３−Ｎ−オレイルアミノ−プロピル）ピペ
ラジン（Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１
７９，２８０（１９９１）、Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３
，１３９（１９９７）、米国特許第５，７４４，３３５号）、またはＩＣＥが含まれる。

加えて、トランスフェクション有効性を強化するためのいくつかの試薬が市販されてい
る。好適な例には、リポフェクチン（ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，
Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、リポフェクタミン（ＤＯＳＰＡ：ＤＯＰＥ）（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ）、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＵＧＥＮ
Ｅ、トランスフェクタム（ＤＯＧＳ）、およびエフェクテンが挙げられる。

ジアルキルアミノベース、イミダゾールベース、およびグアニジニウムベースの脂質等
のカチオン性脂質も企図される。例えば、ある実施形態は、以下の構造（Ｉ）で表される
、１つ以上のイミダゾールベースのカチオン性脂質、例えば、イミダゾールコレステロー
ルエステルまたは「ＩＣＥ」脂質（３Ｓ、１０Ｒ、１３Ｒ、１７Ｒ）−１０、１３−ジメ
チル−１７−（（Ｒ）−６−メチルヘプタン−２−イル）−２、３、４、７、８、９、１
０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペン
タ［ａ］フェナントレン−３−イル３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロパノエー
トを含む組成物を対象とする。好ましい実施形態において、ｍＲＮＡの送達用の移送ビヒ
クルは、構造（Ｉ）で表される、１つ以上のイミダゾールベースのカチオン性脂質、例え
ば、イミダゾールコレステロールエステルまたは「ＩＣＥ」脂質（３Ｓ、１０Ｒ、１３Ｒ
、１７Ｒ）−１０、１３−ジメチル−１７−（（Ｒ）−６−メチルヘプタン−２−イル）
−２、３、４、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７−テトラ
デカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル３−（１Ｈ−イミダゾ
ール−４−イル）プロパノエートを含み得る。

特定の理論によって束縛されることを望むことなく、イミダゾールベースのカチオン性脂
質ＩＣＥの融合性が、従来のカチオン性脂質と比較してより低いｐＫａを有するイミダゾ
ール基によって促進されるエンドソーム破壊に関連していることが考えられる。次いで、
エンドソーム破壊は、リポソーム膜の浸透圧膨張および破壊を促進し、その後、その中に
装填される核酸（複数を含む）含有物の標的細胞へのトランスフェクションまたは細胞内
放出が続く。

イミダゾールベースのカチオン性脂質は、他のカチオン性脂質と比較して毒性の低下も
特徴とする。イミダゾールベースのカチオン性脂質（例えば、ＩＣＥ）は、脂質ナノ粒子
中の単独のカチオン性脂質として使用され得るか、またはあるいは従来のカチオン性脂質
、非カチオン性脂質、およびＰＥＧ修飾脂質と合わせられ得る。カチオン性脂質は、移送
ビヒクル中に存在する総脂質の約１％〜約９０％、約２％〜約７０％、約５％〜約５０％
、約１０％〜約４０％、または好ましくは、移送ビヒクル中に存在する総脂質の約２０％
〜約７０％のモル比を含み得る。

同様に、ある実施形態は、以下の構造（ＩＩ）で表され、かつその全教示が参照により
全体として本明細書に組み込まれる、２０１１年６月８日出願の米国仮出願第６１／４９
４，７４５号においてさらに説明される、ＨＧＴ４００３カチオン性脂質２−（（２，３
−ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ）プロピル
）ジスルファニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミンを含む脂質ナノ粒子を対象とする。

他の実施形態において、本明細書に記載の組成物および方法は、その全教示が参照によ
り全体として本明細書に組み込まれる、米国仮出願第６１／４９４，７４５号においてさ
らに説明される、例えば、切断可能なジスルフィド（Ｓ−Ｓ）官能基（例えば、ＨＧＴ４
００１、ＨＧＴ４００２、ＨＧＴ４００３、ＨＧＴ４００４、およびＨＧＴ４００５）を
含む１つ以上のカチオン性脂質または化合物等の１つ以上の切断可能な脂質を含む脂質ナ
ノ粒子を対象とする。

単独で、または好ましくは、移送ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）を含む他の脂質と
組み合わせてのいずれかでの、Ｎ−オクタノイル−スフィンゴシン−１−［スクシニル（
メトキシポリエチレングリコール）−２０００］（Ｃ８ ＰＥＧ−２０００セラミド）を
含む誘導体化セラミド（ＰＥＧ−ＣＥＲ）等のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リ
ン脂質および誘導体化脂質の使用も本発明によって企図される。企図されるＰＥＧ修飾脂
質には、Ｃ_６−Ｃ_２０長のアルキル鎖（複数を含む）を有する脂質に共有結合した最大５
ｋＤａのポリエチレングリコール鎖が含まれるが、これに限定されない。そのような成分
の添加は、複雑な凝集を阻止し得、循環存続期間を増加させ、かつ標的細胞への脂質核酸
組成物の送達を増加させるための手段も提供し得る（Ｋｌｉｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（
１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６８（１）：２３５−２３７）か、またはそれ
らは、生体内で製剤から迅速に交換されるよう選択され得る（米国特許第５，８８５，６
１３号を参照のこと）。特に有用な交換性脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４ま
たはＣ１８）を有するＰＥＧ−セラミドである。本発明のＰＥＧ修飾リン脂質および誘導
体化脂質は、リポソーム移送ビヒクル中に存在する総脂質の約０％〜約２０％、約０．５
％〜約２０％、約１％〜約１５％、約４％〜約１０％、または約２％のモル比を含み得る
。

本発明は、非カチオン性脂質の使用も企図する。本明細書で使用される「非カチオン性
脂質」という語句は、任意の中性、両性イオン性、またはアニオン性脂質を指す。本明細
書で使用される「アニオン性脂質」という語句は、生理学的ｐＨ等の選択されたｐＨで正
味の負電荷を担持するいくつかの脂質種のうちのいずれかを指す。非カチオン性脂質には
、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオールエオイルホスファチジル
コリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオールエオ
イルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロ
ール（ＤＰＰＧ）、ジオールエオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パ
ルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホ
スファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオールエオイル−ホスファチジルエタノ
ールアミン４−（Ｎ−メレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｄ
ＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミ
リストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エ
タノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１
８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノール
アミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはそれらの混合物が含まれるが、これらに限
定されない。そのような非カチオン性脂質は単独で使用され得るが、好ましくは、他の賦
形剤、例えば、カチオン性脂質と組み合わせて使用される。カチオン性脂質と組み合わせ
て使用される場合、非カチオン性脂質は、移送ビヒクル中に存在する総脂質の５％〜約９
０％、または好ましくは、約１０％〜約７０％のモル比を含み得る。

好ましくは、移送ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）は、複数の脂質および／またはポ
リマー成分を合わせることによって調製される。例えば、移送ビヒクルは、モル比４０：
３０：２５：５のＣ１２−２００、ＤＯＰＥ、ｃｈｏｌ、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ、またはモ
ル比１８：５６：２０：６のＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ−ＰＥＧ２
Ｋ、またはモル比４０：２０：３５：５のＨＧＴ５０００、ＤＯＰＥ、ｃｈｏｌ、ＤＭＧ
−ＰＥＧ２Ｋ、またはモル比４０：２０：３５：５のＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、ｃｈｏ
ｌ、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを用いることによって調製され得る。カチオン性脂質、非カチオ
ン性脂質、および／または脂質ナノ粒子を含むＰＥＧ修飾脂質の選択、ならびに相互に対
するそのような脂質の相対モル比は、選択される脂質（複数を含む）の特性、対象とする
標的細胞の性質、送達されるｍＲＮＡの特性に基づく。さらに考慮すべき事柄には、例え
ば、アルキル鎖の飽和、ならびに選択される脂質（複数を含む）の大きさ、電荷、ｐＨ、
ｐＫａ、融合性、および毒性が含まれる。したがって、モル比は、それらに応じて調整さ
れ得る。例えば、実施形態において、脂質ナノ粒子中のカチオン性脂質の割合は、１０％
を超えるか、２０％を超えるか、３０％を超えるか、４０％を超えるか、５０％を超える
か、６０％を超えるか、または７０％を超え得る。脂質ナノ粒子中の非カチオン性脂質の
割合は、５％を超えるか、１０％を超えるか、２０％を超えるか、３０％を超えるか、ま
たは４０％を超え得る。脂質ナノ粒子中のコレステロールの割合は、１０％を超えるか、
２０％を超えるか、３０％を超えるか、または４０％を超え得る。脂質ナノ粒子中のＰＥ
Ｇ修飾脂質の割合は、１％を超えるか、２％を超えるか、５％を超えるか、１０％を超え
るか、または２０％を超え得る。

ある好ましい実施形態において、本発明の脂質ナノ粒子は、以下のカチオン性脂質：Ｃ
１２−２００、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＡＰ、ＨＧＴ４００３、ＩＣＥ、ＨＧ
Ｔ５０００、またはＨＧＴ５００１のうちの少なくとも１つを含む。実施形態において、
移送ビヒクルは、コレステロールおよび／またはＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施
形態において、移送ビヒクルは、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを含む。ある実施形態において、移
送ビヒクルは、以下の脂質製剤：Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、ｃｈｏｌ、ＤＭＧ−ＰＥＧ
２Ｋ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ、ＨＧＴ５０００、
ＤＯＰＥ、ｃｈｏｌ、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ、ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、ｃｈｏｌ、ＤＭ
Ｇ−ＰＥＧ２Ｋのうちの１つを含む。

本発明の組成物で用いるリポソーム移送ビヒクルは、当技術分野で現在知られている様
々な技法によって調製され得る。多層状小胞（ＭＬＶ）は、従来の技法で、例えば、脂質
を適切な溶媒中に溶解して好適な入れ物または容器の内壁に選択される脂質を沈着させ、
その後、溶媒を蒸発させて薄膜を容器の内側に残すか、または噴霧乾燥させることによっ
て調製され得る。その後、水相は、ＭＬＶの形成をもたらすボルテックス運動で容器に添
加され得る。その後、単層状小胞（ＵＬＶ）は、多層状小胞の均質化、超音波処理、また
は押出によって形成され得る。加えて、単層状小胞は、界面活性剤除去技法によって形成
され得る。

本発明のある実施形態において、本発明の組成物は、移送ビヒクルを含み、ｍＲＮＡは
、移送ビヒクルの両表面上に会合され、同一の移送ビヒクル内にカプセル化される。例え
ば、本発明の組成物の調製中、カチオン性リポソーム移送ビヒクルは、静電相互作用を介
してｍＲＮＡと会合し得る。

ある実施形態において、本発明の組成物は、生体外および生体内適用の両方において検
出可能な診断的放射性核種、蛍光物質、または他の物質が装填され得る。例えば、本発明
における使用に好適な診断的物質には、Ｒｈｏｄアミン−ジオールエオイルホスファ−チ
ジルエタノールアミン（Ｒｈ−ＰＥ）、緑色蛍光タンパク質ｍＲＮＡ（ＧＦＰ ｍＲＮＡ
）、レニラルシフェラーゼｍＲＮＡ、およびホタルルシフェラーゼｍＲＮＡが含まれ得る
。

適切な寸法のリポソーム移送ビヒクルの選択は、標的細胞または組織の部位、およびあ
る程度、リポソームが作製される適用を考慮すべきである。いくつかの実施形態において
、ある細胞または組織へのｍＲＮＡのトランスフェクションを制限することが望ましくあ
り得る。例えば、標的肝細胞に対して、リポソーム移送ビヒクルは、その寸法が肝臓中の
内皮層ライニング肝類洞の開窓よりも小さくなるように寸法決定され得、したがって、リ
ポソーム移送ビヒクルは、そのような内皮開窓を容易に貫通して、標的肝細胞に到達し得
る。あるいは、リポソーム移送ビヒクルは、リポソームの寸法がある細胞もしくは組織へ
の分布を制限するか、または明白に回避するのに十分な直径となるように寸法決定され得
る。例えば、リポソーム移送ビヒクルは、その寸法が内皮層ライニング肝類洞の開窓より
も大きくなるように寸法決定され、したがって、肝細胞へのリポソーム移送ビヒクルの分
布を制限し得る。概して、移送ビヒクルの寸法は、約２５〜２５０ｎｍの範囲内、好まし
くは、約２５０ｎｍ未満、１７５ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満、１２５ｎｍ未満、１００ｎ
ｍ未満、７５ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、２５ｎｍ未満、または１０ｎｍ未満である。

リポソーム移送ビヒクル集団の寸法決定のための当技術分野で既知の様々な代替方法が
利用可能である。１つのそのような寸法決定方法は、参照により本明細書に組み込まれる
米国特許第４，７３７，３２３号に記載されている。浴超音波処理またはプローブ超音波
処理のいずれかでのリポソーム懸濁液の超音波処理は、寸法を直径約０．０５ミクロン未
満の小さいＵＬＶにまで漸減する。均質化は、大きいリポソームをより小さいリポソーム
に断片化する剪断エネルギーに依存する別の方法である。典型的な均質化手順において、
ＭＬＶは、選択されたリポソーム寸法、典型的には、約０．１〜０．５ミクロンが観察さ
れるまで、標準のエマルジョンホモジナイザーを用いて再循環される。リポソーム小胞の
寸法は、参照により本明細書に組み込まれるＢｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０：４２１−４５０（１９８１）に記載の疑似電気光
散乱（ＱＥＬＳ）によって決定され得る。平均リポソーム直径は、形成されたリポソーム
の超音波処理によって低減し得る。断続的な超音波処理サイクルは、ＱＥＬＳ評価と交互
に起こり、効率的なリポソーム合成を誘導し得る。
標的細胞

本明細書で使用される「標的細胞」という用語は、本発明の組成物が対象とするか、ま
たは標的とする細胞もしくは組織を指す。いくつかの実施形態において、標的細胞は、目
的とするタンパク質または酵素を欠乏している。例えば、核酸を肝細胞に送達することが
所望される場合、肝細胞は、標的細胞を表す。いくつかの実施形態において、本発明の組
成物は、標的細胞を識別してトランスフェクトする（すなわち、非標的細胞をトランスフ
ェクトしない）。本発明の組成物は、肝細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞
、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞（例えば、髄膜、星状膠細胞、運動ニュ
ーロン、後根神経節細胞、および前角運動ニューロン）、光受容体細胞（例えば、杆体お
よび錐体）、網膜色素上皮細胞、分泌細胞、心臓細胞、含脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心
筋細胞、骨格筋細胞、β細胞、下垂体細胞、滑膜ライニング細胞、卵巣細胞、精巣細胞、
線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、ならびに腫瘍細胞を含むが
、これらに限定されない様々な標的細胞を優先的に標的化するようにも調製され得る。

本発明の組成物は、例えば、心臓、肺、腎臓、肝臓、および脾臓内の標的細胞に優先的
に分布するように調製され得る。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、肝臓
の細胞に分布して、その肝臓の細胞（例えば、肝細胞）によってそこに含まれるｍＲＮＡ
の送達およびその後の発現を促進する。標的化された肝細胞は、機能的タンパク質または
酵素を産生し、かつ全身的に排出することができる生物学的「リザーバ」または「デポー
」として機能し得る。したがって、本発明の一実施形態において、リポソーム移送ビヒク
ルは、肝細胞を標的化し、かつ／または送達時に肝臓の細胞に優先的に分布する。標的肝
細胞のトランスフェクション後、リポソーム担体中に装填されたｍＲＮＡは翻訳され、機
能的タンパク質産物が産生され、排出され、全身的に分布される。他の実施形態において
、肝細胞以外の細胞（例えば、肺、脾臓、心臓、眼、または中枢神経系の細胞）は、タン
パク質産生のためにデポー位置としての機能を果たし得る。

本発明の一実施形態において、組成物は、対象の１つ以上の機能的タンパク質および／
または酵素の内因性産生、具体的には、それらの組換え調製された対応物と比較してより
低い免疫原性を示すタンパク質および／または酵素の産生を促進する。本発明の好ましい
実施形態において、移送ビヒクルは、欠損したタンパク質または酵素をコードするｍＲＮ
Ａを含む。標的組織へのそのような組成物の分布時、およびそのような標的細胞のその後
のトランスフェクション時、リポソーム移送ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）に装填さ
れた外来性ｍＲＮＡは、生体内で翻訳されて、体外から投与されたｍＲＮＡによってコー
ドされる機能的タンパク質または酵素（例えば、対象が欠乏するタンパク質または酵素）
を産生し得る。したがって、本発明の組成物は、体外または組換え調製されたｍＲＮＡを
翻訳する対象の能力を利用して、体内で翻訳されたタンパク質または酵素を産生し、した
がって、機能的タンパク質または酵素を産生する（かつ必要に応じて排出する）。発現ま
たは翻訳されたタンパク質または酵素は、組換え調製されたタンパク質または酵素中で不
在し得る場合の多い天然翻訳後修飾の生体内包含も特徴とし得、したがって、翻訳された
タンパク質または酵素の免疫原性をさらに低下させる。

欠損したタンパク質または酵素をコードするｍＲＮＡの投与は、核酸を標的細胞内の特
定の小器官（例えば、ミトコンドリア）に送達する必要性を回避する。むしろ、標的細胞
のトランスフェクションおよび標的細胞の細胞質への核酸の送達時、移送ビヒクルのｍＲ
ＮＡ含有物が翻訳され、機能的タンパク質または酵素が発現され得る。

本発明は、受動的標的化手段および能動的標的化手段の両方を用いた標的細胞および組
織の識別的標的化も企図する。受動的標的化現象は、さらなる賦形剤または標的細胞によ
る移送ビヒクルの認識を強化する手段の使用に依存することなく、生体内での移送ビヒク
ルの天然の分布パターンを利用する。例えば、細網内皮系細胞によって食作用にさらされ
る移送ビヒクルは、肝臓または脾臓内に蓄積する可能性が高く、したがって、そのような
標的細胞への組成物の送達を受動的に指向する手段を提供し得る。

あるいは、本発明は、移送ビヒクルに（共有的または非共有的のいずれかで）結合され
て、ある標的細胞または標的組織におけるそのような移送ビヒクルの局在化を促進し得る
、本明細書において「標的化リガンド」と称されるさらなる賦形剤の使用を伴う能動的標
的化を企図する。例えば、標的化は、移送ビヒクル中または移送ビヒクル上での１つ以上
の内因性標的化リガンド（例えば、アポリポタンパク質Ｅ）の包含によって媒介され、標
的細胞または組織への分布を促進し得る。標的組織による標的化リガンドの認識は、標的
細胞および組織における移送ビヒクルおよび／またはその含有物の組織分布および細胞取
り込みを積極的に促進する（例えば、移送ビヒクル中または移送ビヒクル上でのアポリポ
タンパク質Ｅ標的化リガンドの包含は、移送ビヒクルの認識および肝細胞によって発現さ
れる内因性低密度リポタンパク質受容体への移送ビヒクルの結合を促進する）。本明細書
に提供される組成物は、標的細胞に対する組成物の親和性を高めることができるリガンド
を含み得る。標的化リガンドは、製剤化中または製剤化後に脂質粒子の外二層に結合され
得る。これらの方法は、当技術分野で周知である。加えて、いくつかの脂質粒子製剤は、
ＰＥＡＡ等の融合ポリマー、ヘマグルチニン、他のリポペプチド（参照により本明細書に
組み込まれる、米国特許出願第０８／８３５，２８１号および同第６０／０８３，２９４
号を参照のこと）、ならびに生体内および／または細胞内送達に有用な他の特徴を用い得
る。他のいくつかの実施形態において、本発明の組成物は、トランスフェクション有効性
の改善を示し、かつ／または目的とする標的細胞または組織に対する選択性の強化を示す
。したがって、標的細胞または組織に対する組成物およびそれらの核酸含有物の親和性を
高めることができる１つ以上のリガンド（例えば、ペプチド、アプタマー、オリゴヌクレ
オチド、ビタミン、または他の分子）を含む組成物が企図される。好適なリガンドは、移
送ビヒクルの表面に任意に結合または連結され得る。いくつかの実施形態において、標的
化リガンドは、移送ビヒクルの表面に広がるか、または移送ビヒクル内にカプセル化され
得る。好適なリガンドは、それらの物理的、化学的、または生物学的特性（例えば、標的
細胞表面マーカーまたは特徴の選択的親和性および／または認識）に基づいて選択される
。細胞特異的標的部位およびそれらの対応する標的化リガンドは、大きく異なり得る。好
適な標的化リガンドは、標的細胞の一意の特性が利用され、したがって、組成物が標的細
胞と非標的細胞を識別することを可能にするように選択される。例えば、本発明の組成物
は、肝細胞の認識または肝細胞への親和性を選択的に高める（例えば、そのような表面マ
ーカーの受容体媒介認識およびそのような表面マーカーへの結合によって）表面マーカー
（例えば、アポリポタンパク質Ｂまたはアポリポタンパク質Ｅ）を含み得る。さらに、標
的化リガンドとしてのガラクトースの使用は、本発明の組成物を実質肝細胞に指向すると
予測されるか、またはあるいは標的化リガンドとしてのマンノース含有糖残基の使用は、
本発明の組成物を肝臓内皮細胞に指向すると予測される（例えば、肝細胞内に存在するア
シアロ糖タンパク質受容体に優先的に結合し得るマンノース含有糖残基）（Ｈｉｌｌｅｒ
ｙ ＡＭ，ｅｔ ａｌ．「Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：
Ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｓｔｓ」（２００２）Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）
。したがって、移送ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）中に存在する部分に共役されたそ
のような標的化リガンドの提示は、標的細胞および組織中の本発明の組成物の認識および
取り込みを促進する。好適な標的化リガンドの例には、１つ以上のペプチド、タンパク質
、アプタマー、ビタミン、およびオリゴヌクレオチドが挙げられる。
適用および投与

本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類等を含むが
、これらに限定されない、本発明の組成物および方法が投与される任意の動物（例えば、
哺乳動物）を指す。典型的には、「対象」および「患者」という用語は、ヒト対象に関連
して、本明細書において同義に使用される。

本発明の組成物および方法は、いくつかの障害を治療するために、ｍＲＮＡの送達を提
供する。具体的には、本発明の組成物および方法は、標的細胞によって周囲の細胞外液中
に排出または分泌される欠損したタンパク質および／または酵素（例えば、ホルモンおよ
び神経伝達物質をコードするｍＲＮＡ）に関連する疾患または障害の治療に好適である。
実施形態において、疾患は、分泌性タンパク質の欠陥または欠乏を伴い得る（例えば、フ
ァブリー病、またはＡＬＳ）。ある実施形態において、疾患は、分泌性タンパク質の欠陥
または欠損によって引き起こされ得ないが、分泌性タンパク質の提供から恩恵を受け得る
。例えば、疾患の症状は、本発明の組成物を提供することによって改善され得る（例えば
、嚢胞性線維症）。本発明が有用となる障害には、ハンチントン病；パーキンソン病；筋
ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ型およびベッカー型等）；血友病（例えば、Ｂ型
血友病（ＦＩＸ）、Ａ型血友病（ＦＶＩＩＩ）等）；ＳＭＮ１関連脊髄性筋萎縮症（ＳＭ
Ａ）；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；ＧＡＬＴ関連ガラクトース血症；嚢胞性線維症（
ＣＦ）；シスチン尿症を含むＳＬＣ３Ａ１関連障害；アルポート症候群を含むＣＯＬ４Ａ
５関連障害；ガラクトセレブロシダーゼ欠乏；Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィーおよび副腎
脊髄ニューロパチー；フリードライヒ失調症；ペリツェウス・メルツバッハー病；ＴＳＣ
１およびＴＳＣ２関連結節硬化症；サンフィリポＢ症候群（ＭＰＳ ＩＩＩＢ）；ＣＴＮ
Ｓ関連シスチン蓄積症；脆弱Ｘ症候群、脆弱Ｘ関連身震い／運動失調症候群、および脆弱
Ｘ早期閉経症候群を含むＦＭＲ１関連障害；プラダーウィリ症候群；遺伝性出血性毛細管
拡張症（ＡＴ）；ニーマンピック疾患Ｃ１型；若年型神経セロイドリポフスチン症（ＪＮ
ＣＬ）、若年性バッテン病、ハルティア・サンタヴオリ病、ヤンスキー・ビールショース
キー疾患、ならびにＰＴＴ１およびＴＰＰ１欠乏を含む神経セロイドリポフスチン症関連
疾患；中枢神経系低髄鞘形成／白質消失を伴うＥＩＦ２Ｂ１、ＥＩＦ２Ｂ２、ＥＩＦ２Ｂ
３、ＥＩＦ２Ｂ４、およびＥＩＦ２Ｂ５関連小児運動失調；ＣＡＣＮＡ１ＡおよびＣＡＣ
ＮＢ４関連一過性運動失調２型；クラシックレット症候群、ＭＥＣＰ２関連重度新生児脳
症、およびＰＰＭ−Ｘ症候群を含むＭＥＣＰ２関連障害；ＣＤＫＬ５関連Ａ非定型レット
症候群；ケネディ病（ＳＢＭＡ）；皮質下梗塞および白質脳症を伴うノッチ３関連脳常染
色体優性動脈症（ＣＡＤＡＳＩＬ）；ＳＣＮ１ＡおよびＳＣＮ１Ｂ関連発作性疾患；アル
パーズ・フッテンロッハー症候群、ＰＯＬＧ関連感覚失調ニューロパチー、構音障害、お
よび眼麻痺、ならびにミトコンドリアＤＮＡ欠失を伴う常染色体優性および劣性進行性外
眼筋麻痺を含むポリメラーゼＧ関連障害；Ｘ連鎖副腎低形成；Ｘ連鎖無ガンマグロブリン
血症；ウィルソン病；ならびにファブリー病等の障害が含まれるが、これらに限定されな
い。一実施形態において、本発明の核酸、および具体的には、ｍＲＮＡは、細胞外空間に
分泌される機能的タンパク質または酵素をコードし得る。例えば、分泌性タンパク質は、
凝固因子、補体経路成分、サイトカイン、ケモカイン、化学誘引物質、タンパク質ホルモ
ン（例えば、ＥＧＦ、ＰＤＦ）、血清タンパク質成分、抗体、分泌性トール様受容体等を
含む。本発明のいくつかの実施形態において組成物は、エリスロポエチン、α１−抗トリ
プシン、カルボキシペプチダーゼＮ、またはヒト成長ホルモンをコードするｍＲＮＡを含
み得る。

実施形態において、本発明は、２つ以上の遺伝子によってコードされるサブユニットか
ら構成される分泌性タンパク質をコードする。例えば、分泌性タンパク質は、ヘテロ二量
体であり得、そのそれぞれの鎖またはサブユニットは、個々の遺伝子によってコードされ
る。２つ以上のｍＲＮＡ分子が移送ビヒクルで送達され、かつｍＲＮＡが分泌性タンパク
質の個々のサブユニットをコードする可能性がある。あるいは、単一ｍＲＮＡは、２つ以
上のサブユニットをコードするように操作され得る（例えば、一本鎖Ｆｖ抗体の場合）。
ある実施形態において、個別のサブユニットをコードする個々のｍＲＮＡ分子は、個々の
移送ビヒクルに投与され得る。一実施形態において、ｍＲＮＡは、全長抗体（可変および
定常領域の重鎖および軽鎖の両方）または抗体の断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、もしくは
一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））をコードして、対象に免疫を付与し得る。本発明の一実施形態
が（例えば、機能的抗体をコードするｍＲＮＡの翻訳を介して）対象に免疫を付与するの
に有用な方法および組成物に関するが、本明細書に開示され、かつ本発明によって企図さ
れる本発明は、広範囲に適用可能である。代替の実施形態において、本発明の組成物は、
対象における機能的応答に一時的または長期間影響を与えるために用いられる抗体をコー
ドする。例えば、本発明のｍＲＮＡは、標的細胞からの翻訳および分泌時に、生物学的標
的（例えば、腫瘍壊死因子等の刺激性サイトカイン）の標的化および／または不活性化に
有用であり得る機能的モノクローナルもしくはポリクローナル抗体をコードし得る。同様
に、本発明のｍＲＮＡ核酸は、例えば、膜性増殖性糸球体腎炎ＩＩ型もしくは急性溶血性
尿毒症症候群の治療に有用な機能的抗腎炎因子抗体をコードし得るか、またはあるいは、
癌等のＶＥＧＦ媒介疾患の治療に有用な抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）抗体をコードし
得る。他の実施形態において、分泌性タンパク質は、２つ以上のサブユニット（例えば、
ＩＬ−１２もしくはＩＬ−２３）から成るサイトカインまたは他の分泌性タンパク質であ
る。

本発明の組成物は、対象に投与され得る。いくつかの実施形態において、組成物は、１
つ以上のさらなる核酸、担体、標的化リガンド、もしくは安定化試薬と組み合わせて製剤
化されるか、または好適な賦形剤と混合される薬理学的組成物中に製剤化される。例えば
、本発明の一実施形態において、組成物は、２つ以上のはっきりと異なるタンパク質また
は酵素をコードするｍＲＮＡを送達するように調製され得る。薬物の製剤化および投与の
技法は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．、最新版）で見出
され得る。

薬学的または治療的影響を与え得る様々な分子は、本発明の組成物および方法を用いて
標的細胞に送達され得る。分子は、有機または無機であり得る。有機分子は、ペプチド、
タンパク質、炭水化物、脂質、ステロール、核酸（ペプチド核酸を含む）、またはそれら
の任意の組み合わせであり得る。標的細胞への送達用の製剤は、１つ以上の種類の分子、
例えば、２つの異なるヌクレオチド配列、またはタンパク質、酵素、もしくはステロイド
を含み得る。

本発明の組成物は、対象の臨床状態、投与部位および方法、投与スケジュール、対象の
年齢、性別、体重、ならびに当技術分野の臨床医にとって適切な他の要素を考慮して、現
在の医療実践に従って投与および投薬され得る。本明細書の目的のための「有効量」は、
実験的臨床研究分野、薬理学分野、臨床分野、および医学分野における当業者に既知のそ
のような関連した考慮すべき事柄によって決定され得る。いくつかの実施形態において、
投与量は、症状の少なくともある程度の安定化、改善、または排除を達成するのに有効量
であり、他の指標は、疾患進行、退行、または改善の適切な評価基準として当業者によっ
て選択される。例えば、好適な量および投薬レジメンは、少なくとも一過性のタンパク質
産生を引き起こすものである。

好適な投与ルートには、例えば、経口投与、直腸投与、膣内投与、経粘膜投与、気管内
もしくは吸入を含む肺投与、または腸内投与；筋肉内注入、皮下注入、髄内注入、ならび
に鞘内注入、直接脳室内注入、静脈内注入、腹腔内注入、鼻腔内注入、または眼内注入を
含む非経口送達が含まれる。

あるいは、本発明の組成物は、例えば、標的化された組織への薬学的組成物の直接注入
を介して、好ましくは、持続放出製剤で、全身ではなく局所投与され得る。局所送達は、
標的化される組織に応じて様々な方法で作用し得る。例えば、本発明の組成物を含有する
エアロゾルは、経鼻、気管、もしくは気管支送達のために吸入され得るか、本発明の組成
物は、例えば、損傷、疾患兆候、もしくは痛みの部位に注入され得るか、組成物は、経口
、気管、もしくは食道適用のためにトローチ剤で提供され得るか、胃または腸への投与の
ために液体、錠剤、もしくはカプセル形態で供給され得るか、直腸または膣内適用のため
に坐薬形態で供給され得るか、またはさらにはクリーム、液滴の使用によって、もしくは
さらには注入によって眼に送達され得る。治療的分子またはリガンドと複合される本発明
の組成物を含有する製剤は、例えば、組成物が注入部位から周囲の細胞まで拡散すること
を可能にし得るポリマーまたは他の構造もしくは物質によってさらには外科的に投与され
る。あるいは、それらは、ポリマーまたは支持体を用いることなく外科的に適用され得る
。

本発明の一実施形態において、組成物は、それらがその中に含有されるｍＲＮＡの持続
放出に好適であるように製剤化される。そのような持続放出組成物は、延長された投与間
隔で対象に好都合に投与され得る。例えば、本発明の一実施形態において、組成物は、対
象に１日２回、１日１回、または２日に１回投与される。本発明の好ましい実施形態にお
いて、組成物は、対象に、週２回、週１回、１０日毎に、２週間毎に、３週間毎に、また
はより好ましくは、４週間毎に、月１回、６週間毎に、８週間毎に、２ヶ月に１回、３ヶ
月毎に、４ヶ月毎に、６ヶ月毎に、８ヶ月毎に、９ヶ月毎に、または年に１回投与される
。デポー投与（例えば、筋肉内、皮下、硝子体内）のために製剤化され、長期間にわたる
ｍＲＮＡの送達または放出のいずれかを行う組成物およびリポソーム担体も企図される。
好ましくは、用いられる持続放出手段は、ｍＲＮＡの安定性を向上させる修飾と合わせら
れる。

本明細書に開示のリポソームナノ粒子のうちの１つ以上を含む凍結乾燥された薬学的組
成物、および例えば、その教示が参照により全体として本明細書に組み込まれる、２０１
１年６月８日出願の米国仮出願第６１／４９４，８８２号に開示のそのような凍結乾燥さ
れた組成物の使用の関連方法も本明細書において企図される。例えば、本発明に従って凍
結乾燥された薬学的組成物は、投与前に再構成され得るか、または生体内で再構成され得
る。例えば、凍結乾燥された薬学的組成物は、適切な剤形（例えば、椎間板、杆体、また
は膜等の皮内剤形）で製剤化され、剤形が時間とともに個体の体液によって生体内で再水
和されるように投与され得る。

本発明のある化合物、組成物、および方法が、ある実施形態に従って明確に説明されて
いるが、以下の実施例は、本発明の化合物を説明するためのものにすぎず、本発明の化合
物を限定するよう意図されていない。本発明の背景を説明し、かつその実践に関してさら
なる詳細を提供するために本明細書に参照される出版物、参考資料質、受託番号等はそれ
ぞれ、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

明細書および特許請求の範囲において使用される「ａ」および「ａｎ」という冠詞は、
それとは反対に明確に示されない限り、複数指示対象を含むと理解されるべきである。群
の１つ以上の構成員間に「または」を含む特許請求の範囲もしくは記述は、それとは反対
に明確に示されない限り、またはさもなければ文脈から明らかでない限り、群の構成員の
うちの１つ、２つ以上、もしくはすべてが、所与の産物もしくはプロセスにおいて存在す
るか、用いられるか、またはさもなれけばそれに関連する場合に満たされると見なされる
。本発明は、群の１つのみの構成員が、所与の産物もしくはプロセスにおいて存在するか
、用いられるか、またはさもなければそれに関連する実施形態を含む。本発明は、群の２
つ以上の構成員、または群内のすべての構成員が、所与の産物もしくはプロセスにおいて
存在するか、用いられるか、またはさもなければそれに関連する実施形態も含む。さらに
、本発明が、矛盾もしくは不一致が生じることが別途示されない限り、または当業者に明
らかでない限り、列記された特許請求の範囲のうちの１つ以上に由来する１つ以上の制限
、要素、付記、記述用語等が、同一の基礎となる特許請求の範囲に依存する別の特許請求
の範囲（または、関連した任意の他の特許請求の範囲）に導入される、すべての変形、組
み合わせ、および並び替えを包含することを理解されたい。要素がリストで（例えば、マ
ーカッシュ群または同様の書式で）提示される場合、それらの要素のそれぞれの下位群も
開示され、任意の要素（複数を含む）がその群から取り除かれ得ることを理解されたい。
概して、本発明もしくは本発明の態様が、特定の要素、特徴等を含むと見なされる場合、
本発明のある実施形態もしくは本発明の態様が、そのような要素、特徴等から構成される
か、または部分的に構成されることを理解されたい。単純化のために、それらの実施形態
は、あらゆる場合において、本明細書において非常に多くの単語で具体的に説明されてい
ない。具体的な除外が本明細書において列挙されるかにかかわらず、本発明の任意の実施
形態または態様が特許請求の範囲から明確に除外され得ることも理解されたい。本発明の
背景を説明し、かつは、その実践に関するさらなる詳細を提供するために本明細書に参照
される出版物および他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。
実施例
実施例１：ポリヌクレオチド組成物の静脈内送達を介するタンパク質産生デポー

メッセンジャーＲＮＡ
ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）（配列番号３、図３）、ヒトα−ガラクトシダーゼ（
ＧＬＡ）（配列番号４、図４）、ヒトα−１抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）（配列番号５、図
５）、およびヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）（配列番号６、図６）を、遺伝子をコードするプ
ラスミドＤＮＡ鋳型からの生体外転写によって合成し、その後、５’キャップ構造（Ｃａ
ｐ１）（Ｆｅｃｈｔｅｒ＆Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８６：１
２３９−１２４９（２００５））およびゲル電気泳動によって決定された約２００ヌクレ
オチド長の３’ポリ（Ａ）尾部を付加した。５’および３’非翻訳領域は、以下の実施例
におけるそれぞれのｍＲＮＡ産物において存在し、それぞれ、配列番号：１および２（図
１および図２）によって定義される。
脂質ナノ粒子製剤

製剤１：Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、Ｃｈｏｌ、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ（４０：３０
：２５：５）の５０ｍｇ／ｍＬエタノール溶液の一定分量を混合し、エタノールで希釈し
て、３ｍＬの最終容積にした。個別に、ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭのクエン酸塩／
１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を１ｍｇ／ｍＬの原液から調製した。脂質溶液をｍ
ＲＮＡ水溶液に迅速に注入し、振盪して、２０％エタノールの最終懸濁液を得た。結果と
して得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、１回のＰＢＳ（ｐＨ７．４）でダイア濾過し、濃
縮し、２〜８℃で保管した。

製剤２：ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ（１８：５
６：２０：６）の５０ｍｇ／ｍＬのエタノール溶液の一定分量を混合し、エタノールで希
釈して、３ｍＬの最終容積にした。個別に、ＥＰＯ ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭの
クエン酸塩／１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を１ｍｇ／ｍＬの原液から調製した。
脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液に迅速に注入し、振盪して、２０％エタノールの最終懸濁液を
得た。結果として得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、１回のＰＢＳ（ｐＨ７．４）でダイ
ア濾過し、濃縮し、２〜８℃で保管した。最終濃度＝１．３５ｍｇ／ｍＬのＥＰＯ ｍＲ
ＮＡ（カプセル化したもの）。Ｚ_ａｖｅ＝７５．９ｎｍ（Ｄｖ_（５０）＝５７．３ｎｍ；
Ｄｖ_（９０）＝９２．１ｎｍ）。

製剤３：ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ（５０
：２５：２０：５）の５０ｍｇ／ｍＬのエタノール溶液の一定分量を混合し、エタノール
で希釈して、３ｍＬの最終容積にした。個別に、ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭのクエ
ン酸塩／１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を１ｍｇ／ｍＬの原液から調製した。脂質
溶液をｍＲＮＡ水溶液に迅速に注入し、振盪して、２０％エタノールの最終懸濁液を得た
。結果として得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、１回のＰＢＳ（ｐＨ７．４）でダイア濾
過し、濃縮し、２〜８℃で保管した。

製剤４：ＩＣＥ、ＤＯＰＥおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ（７０：２５：５）の５０ｍｇ／ｍ
Ｌのエタノール溶液の一定分量を混合し、エタノールで希釈して、３ｍＬの最終容積にし
た。個別に、ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭのクエン酸塩／１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐ
Ｈ４．５）を１ｍｇ／ｍＬの原液から調製した。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液に迅速に注入
し、振盪して、２０％エタノールの最終懸濁液を得た。結果として得られたナノ粒子懸濁
液を濾過し、１回のＰＢＳ（ｐＨ７．４）でダイア濾過し、濃縮し、２〜８℃で保管した
。

製剤５：ＨＧＴ５０００、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ（４０
：２０：３５：５）の５０ｍｇ／ｍＬのエタノール溶液の一定分量を混合し、エタノール
で希釈して、３ｍＬの最終容積にした。個別に、ＥＰＯ ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍ
Ｍのクエン酸塩／１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を１ｍｇ／ｍＬの原液から調製し
た。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液に迅速に注入し、振盪して、２０％エタノールの最終懸濁
液を得た。結果として得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、１回のＰＢＳ（ｐＨ７．４）で
ダイア濾過し、濃縮し、２〜８℃で保管した。最終濃度＝１．８２ｍｇ／ｍＬのＥＰＯ
ｍＲＮＡ（カプセル化したもの）。Ｚ_ａｖｅ＝１０５．６ｎｍ（Ｄｖ_（５０）＝５３．７
ｎｍ、Ｄｖ_（９０）＝１５７ｎｍ）。

製剤６：ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ（４０
：２０：３５：５）の５０ｍｇ／ｍＬのエタノール溶液の一定分量を混合し、エタノール
で希釈して、３ｍＬの最終容積にした。個別に、ＥＰＯ ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍ
Ｍのクエン酸塩／１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を１ｍｇ／ｍＬの原液から調製し
た。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液に迅速に注入し、振盪して、２０％エタノールの最終懸濁
液を得た。結果として得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、１回のＰＢＳ（ｐＨ７．４）で
ダイア濾過し、濃縮し、２〜８℃で保管した。
静脈内送達されたｍＲＮＡ装填ナノ粒子を介して産生されたタンパク質の分析
注入プロトコル

別途示されない限り、それぞれの実験の初めに約６〜８週齢の雄ＣＤ−１マウスを用い
て研究を行った。試料を、総等価線量３０〜２００マイクログラムのカプセル化ｍＲＮＡ
の単回ボーラス尾静脈注入によって導入した。マウスを屠殺し、指定された時点で、生理
食塩水で灌流した。
分析のための臓器組織の単離

それぞれのマウスの肝臓および脾臓を採取し、３つに分配し、１０％の中性緩衝ホルマ
リン中に保存するか、またはスナップ凍結させるかのいずれかを行い、分析のために−８
０℃で保管した。
分析のための血清の単離

すべての動物を投与量投与（±５％）の４８時間後にＣＯ_２窒息で安楽死させ、その後
、開胸術を行い、最終的に心臓血液を収集した。全血（入手可能な最大量）を、楽死させ
た動物の心穿刺を介して収集して血清分離管に入れ、室温で少なくとも３０分間凝固させ
、９３００ｇを２２℃±５℃で１０分間遠心分離し、血清を抽出した。暫定的な血液収集
の場合、約４０〜５０μＬの全血を、顔面静脈穿刺または尾部切断を介して収集した。未
処理の動物から収集された試料を、動物研究における比較のためにベースラインとして使
用した。
酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）分析

ＥＰＯ ＥＬＩＳＡ：ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＩＶＤ，
Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ｄｅｐ−００）に関して報告された手順に従って
、ＥＰＯタンパク質の定量化を行った。用いた陽性対照は、超高純度および組織培養グレ
ードの組換えヒトエリスロポエチンタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、それぞれ、カ
タログ番号２８６−ＥＰおよび２８７−ＴＣ）から構成された。検出を、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｄｅｖｉｃｅ Ｆｌｅｘ Ｓｔａｔｉｏｎ機器上での吸収（４５０ｎｍ）を介して
監視した。

ＧＬＡ ＥＬＩＳＡ：捕捉抗体としてヒツジ抗α−ガラクトシダーゼＧ−１８８ ＩｇＧ
を用いて、二次（検出）抗体としてウサギ抗α−ガラクトシダーゼＴＫ−８８ ＩｇＧを
用いて（Ｓｈｉｒｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）、標準ＥＬＩ
ＳＡ手順に従った。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役ヤギ抗ウサギＩｇＧを用
いて、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液を活性化させた
。２０分後に２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を用いて反応停止処理した。検出を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｄｅｖｉｃｅ Ｆｌｅｘ Ｓｔａｔｉｏｎ機器上での吸収（４５０ｎｍ）を介して監視
した。未処理のマウス血清およびヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質を、それぞれ、陰
性対照および陽性対照として用いた。

ＦＩＸ ＥＬＩＳＡ：ヒトＦＩＸ ＥＬＩＳＡキット（ＡｓｓａｙＭａｘ、Ａｓｓａｙ
Ｐｒｏ、カタログ番号ＥＦ１００９−１）に関して報告された手順に従って、ＦＩＸタン
パク質の定量化を行った。

Ａ１ＡＴ ＥＬＩＳＡ：ヒトＡ１ＡＴ ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ、カタログ番号ＩＲＡＰＫＴ０１５）に関して報告された手順に従って、Ａ
１ＡＴタンパク質の定量化を行った。
ウエスタンブロット分析

（ＥＰＯ）：抗ｈＥＰＯ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、番号ＭＡＢ２８７１）および
超高純度のヒトＥＰＯタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、番号２８６−ＥＰ）を対照
として用いて、ウエスタンブロット分析を行った。
結果

本実施例に記載の研究は、タンパク質産生のためのデポー源としてのｍＲＮＡカプセル
化脂質ナノ粒子の使用を実証する。そのようなデポー効果を身体内の複数の部位（すなわ
ち、肝臓、腎臓、脾臓、および筋肉）において達成することができる。リポソームナノ粒
子を介して送達されるメッセンジャーＲＮＡに由来する所望の外因性タンパク質の測定結
果を取得および定量化し、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）、ヒトα−ガラクトシダー
ゼ（ｈＧＬＡ）、ヒトα−１抗トリプシン（ｈＡ１ＡＴ）、およびヒト第ＩＸ因子（ｈＦ
ＩＸ）ｍＲＮＡを用いたデポーからのタンパク質の分泌を実証した。
１Ａ．生体内ヒトＥＰＯタンパク質産生結果

様々な脂質ナノ粒子製剤を用いてｈＥＰＯタンパク質の産生を実証した。４つの異なる
カチオン性脂質系のうち、Ｃ１２−２００ベースの脂質ナノ粒子が、ＥＬＩＳＡによって
測定されたように、静脈内投与から４時間後に最も豊富な量のｈＥＰＯタンパク質を産生
した（図７）。この製剤（製剤１）は、１８．３ｕｇ／ｍＬのｈＥＰＯタンパク質をもた
らし、血流に分泌された。ヒト血清における正常なｈＥＰＯタンパク質レベルは、３．３
〜１６．６ｍＩＵ／ｍＬである（ＮＣＣＬＳ文書Ｃ２８−Ｐ、第１２巻２番）。１２０，
０００ＩＵ／ｍｇのＥＰＯタンパク質の比活性度に基づいて、この製剤は、正常なヒト個
体において２７．５〜１３８ｐｇ／ｍＬのｈＥＰＯタンパク質を産生する。したがって、
ｈＥＰＯ ｍＲＮＡをカプセル化したＣ１２−２００ベースのカチオン性脂質製剤の３０
ｕｇの単回投与は、１００，０００倍を超える生理学的レベルのそれぞれのタンパク質の
増加をもたらした。

試験した脂質系のうち、ＤＯＤＡＰベースの脂質ナノ粒子製剤の効果が一番低かった。
しかしながら、ＥＰＯ ｍＲＮＡをカプセル化したＤＯＤＡＰベースの脂質ナノ粒子を介
した送達に由来するヒトＥＰＯタンパク質の観察された量は、４．１ｎｇ／ｍＬであり、
これは、依然として、正常な生理学的レベルのＥＰＯタンパク質よりも３０倍高い（表１
）。

加えて、得られたタンパク質を試験して、それが活性であり、かつ適切に機能したかを
決定した。ｈＥＰＯ ｍＲＮＡを用いたｍＲＮＡ置換療法（ＭＲＴ）の場合、５つの異な
る脂質ナノ粒子製剤（図８、表１）のヘマトクリット値の変化を１０日間にわたって監視
し、タンパク質活性を評価した。この期間中、５つの製剤のうち２つがヘマトクリット値
の増加を示し（１５％以上）、そのような系から産生されるｈＥＰＯタンパク質の活性を
示す。

別の実験において、ヘマトクリット値の変化を１５日間にわたって監視した（図９、表
２）。脂質ナノ粒子製剤（製剤１）を、３０μｇの単回投与量、またはより少ない１０μ
ｇの３回投与（１日目、３日目、および５日目に注入）のいずれかで投与した。同様に、
製剤２を、５０μｇの３回投与（１日目、３日目、および５日目）で投与した。Ｃ１２−
２００は、ヘマトクリット値の著しい増加をもたらした。全体として、最大約２５％増加
の変化が観察され、そのような系から産生されるヒトＥＰＯタンパク質の活性を示す。

１Ｂ．生体内ヒトＧＬＡタンパク質産生結果

第２の外因性タンパク質系を研究して、ｍＲＮＡ装填脂質ナノ粒子を用いたときの「デ
ポー効果」を実証した。動物に、Ｃ１２−２００ベースの脂質ナノ粒子系を用いたカプセ
ル化ヒトα−ガラクトシダーゼ（ｈＧＬＡ）ｍＲＮＡの３０マイクログラムの単回投与量
を静脈内注入し、６時間後に屠殺した（製剤１）。ＥＬＩＳＡを用いて分泌性ｈＧＬＡタ
ンパク質の定量化を行った。未処理のマウス血清およびヒトα−ガラクトシダーゼタンパ
ク質を対照として用いた。ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質の検出を４８時間にわた
って監視した。

測定可能なレベルのｈＧＬＡタンパク質を、実験の時間経過を通して観察し、６時間時
点での２．０ｕｇ／ｍＬのｈＧＬＡタンパク質が最大レベルであった（図１０）。表３は
、血清中に見られたｈＧＬＡの具体的な量を列記する。健常なヒト男性における正常な活
性が、約３．０５ナノモル／時間／ｍＬであると報告されている。α−ガラクトシダーゼ
の活性において、組換えヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、３．５６×１０^６ナノ
モル／時間／ｍｇである。これらの値の分析は、正常かつ健常な男性個体において約８５
６ｐｇ／ｍＬのｈＧＬＡタンパク質の量をもたらす。ｈＧＬＡ ｍＲＮＡ装填脂質ナノ粒
子の投与の６時間後に観察された２．０ｕｇ／ｍＬのｈＧＬＡタンパク質の量は、正常な
生理学的レベルよりも２３００倍以上高い。さらに、４８時間後、依然としてかなりのレ
ベルのｈＧＬＡタンパク質（８６．２ｎｇ／ｍＬ）を検出することができる。このレベル
は、ｈＧＬＡタンパク質が４８時間時点で引き続き存在する生理学的量よりもほぼ１００
倍多いことを表す。

加えて、０．２ｍｇ／ｋｇを投与したときのα−ガラクトシダーゼの半減期は、約１０
８分間である。ＧＬＡ ｍＲＮＡ装填脂質ナノ粒子を投与したときの「デポー効果」を介
したＧＬＡタンパク質の産生は、ネイキッド組換えタンパク質の直接注入と比較して、血
液滞留時間の著しい増加を示す。上述のように、かなりの量のタンパク質が４８時間後に
存在する。

ＧＬＡ ｍＲＮＡ装填脂質ナノ粒子から産生されたα−ガラクトシダーゼタンパク質の
活性プロファイルを、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（４−
ＭＵ−α−ｇａｌ）代謝の機能として測定した。図１１に示されるように、これらのナノ
粒子系から産生されるタンパク質は、かなり活性であり、利用可能なタンパク質のレベル
を反映する（図１２、表３）。マウスおよびヒトにおける酵素置換療法（ＥＲＴ）に対す
るｍＲＮＡ療法ベースのｈＧＬＡ産生のＡＵＣ比較は、それぞれ、１８２倍および３０倍
の増加を示す（表４）。

所望のタンパク質産生のためにデポーの機能を果たし得る臓器を標的化するｍＲＮＡカ
プセル化脂質ナノ粒子の能力が実証されている。観察された分泌性タンパク質のレベルは
、正常な生理学的レベルよりも数桁大きかった。この「デポー効果」は繰り返し可能であ
る。図１２は、ロバストなタンパク質産生が、ｈＧＬＡ ｍＲＮＡ装填Ｃ１２−２００ベ
ースの脂質ナノ粒子（製剤１）の３０ｕｇの単回投与量を野生型（ＣＤ−１）マウスに投
与したときに観察されることを重ねて示す。この実験において、ｈＧＬＡレベルを７２時
間にわたって評価した。最大平均４．０ｕｇのヒトｈＧＬＡタンパク質／ｍＬの血清が、
投与から６時間後に検出される。正常な生理学的レベルにおける約１ｎｇ／ｍＬのｈＧＬ
Ａタンパク質の値に基づいて、ｈＧＬＡ ＭＲＴは、約４０００倍高いタンパク質レベル
を提供する。前述同様に、ｈＧＬＡタンパク質を投与から４８時間後まで検出することが
できた（図１２）。

この同一の実験から単離された組織の分析は、ｈＧＬＡ ＭＲＴで処理されたマウスに
おけるｈＧＬＡタンパク質の分布に関する識見を提供した（図１３）。超生理学的レベル
のｈＧＬＡタンパク質が処理されたすべてのマウスの肝臓、脾臓、および腎臓において検
出され、最大レベルが投与から１２〜２４時間後に観察された。検出可能なレベルのＭＲ
Ｔ由来タンパク質をｈＧＬＡ装填脂質ナノ粒子の単回注入の３日後に観察することができ
た。

加えて、ｈＧＬＡ ｍＲＮＡ装填Ｃ１２−２００ナノ粒子の投与時のｈＧＬＡの産生が
、血清に（図１４Ａ）ならびに肝臓において（図１４Ｂ）用量応答を呈することが示され
た。

脂質ナノ粒子媒介ｍＲＮＡ置換療法の固有の特性の１つとして、産生されるそれぞれの
タンパク質の薬物動態プロファイルが挙げられる。例えば、α−ガラクトシダーゼを用い
たＥＲＴで処理されたマウスは、約１００分間の血漿半減期をもたらす。対照的に、ＭＲ
Ｔ由来α−ガラクトシダーゼは、約７２時間の血液滞留時間を有し、６時間がピーク時で
ある。これは、所望のタンパク質の見込まれる連続的な取り込みに関与する臓器に対する
はるかにより高い暴露を可能にする。ＰＫプロファイルの比較が図１５に示されており、
クリアランス率における明確な差異を示し、最終的に、曲線下面積（ＡＵＣ）の大きな変
化は、ＭＲＴベースの治療を介して達成され得る。

個々の実験において、ｈＧＬＡ ＭＲＴを、マウス疾患モデルのｈＧＬＡノックアウト
マウス（ファブリーマウス）に適用した。０．３３ｍｇ／ｋｇの投与量のｈＧＬＡ ｍＲ
ＮＡ装填Ｃ１２−２００ベースの脂質ナノ粒子（製剤１）を、単回静脈内注入で雌ノック
アウトマウスに投与した。かなりの量のＭＲＴ由来ｈＧＬＡタンパク質が産生され、６時
間時点でピークになり（約５６０ｎｇ／ｍＬの血清）、これは、正常な生理学的レベルよ
りも約６００倍高い。さらに、ｈＧＬＡタンパク質は、投与から７２時間後に依然として
検出可能であった（図１６）。

重要臓器におけるＭＲＴ由来ＧＬＡタンパク質の定量化は、図１７に示されるように、
著しい蓄積を示した。観察された主要臓器において見られるＭＲＴ由来ｈＧＬＡタンパク
質と報告された正常な生理学的レベルとの比較をプロットする（正常なレベルを点線でプ
ロットした）。２４時間時点でのタンパク質のレベルが投与後７２時間時点よりも高い一
方で、処理されたファブリーマウスの肝臓、腎臓、脾臓、および心臓中に検出されたｈＧ
ＬＡタンパク質のレベルは、野生型レベルと同等である。例えば、１ｍｇの組織当たり３
．１ｎｇのｈＧＬＡタンパク質が、単回ＭＲＴ処理の３日後に処理されたマウスの腎臓に
おいて見られた。

その後の実験において、雄ファブリーノックアウトマウスのＥＲＴベースのα−ガラク
トシダーゼ処理とｈＧＬＡ ＭＲＴベースの処理の比較を行った。それぞれの療法におい
て１．０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投与量を投与し、投与から１週間後にマウスを屠殺した
。注入後６時間および１週間時点のｈＧＬＡタンパク質の血清レベルを監視した。投与か
ら１週間後に、ｈＧＬＡタンパク質蓄積について、肝臓、腎臓、脾臓、および心臓を分析
した。生体内分布分析に加えて、有効性の評価基準を、腎臓および心臓におけるグロボト
リアオシルセラミド（Ｇｂ３）およびＬｙｓｏ−Ｇｂ３減少の測定結果を用いて決定した
。図１８は、雄ファブリーマウスにおけるα−ガラクトシダーゼまたはＧＬＡ ｍＲＮＡ
装填脂質ナノ粒子（製剤１）のいずれかでの処理後のｈＧＬＡタンパク質の血清レベルを
示す。投与後６時間および１週間時点の血清試料を分析した。ロバストなシグナルがＭＲ
Ｔで処理されたマウスにおいて６時間後に検出され、ｈＧＬＡタンパク質血清レベルは、
約４．０ｕｇ／ｍＬであった。対照的に、血流中に検出可能なα−ガラクトシダーゼはこ
の時点で残っていなかった。

この実験におけるファブリーマウスを最初の注入から１週間後に屠殺し、臓器を採取お
よび分析した（肝臓、腎臓、脾臓、心臓）。図１９は、ｈＧＬＡ ＭＲＴ処理またはα−
ガラクトシダーゼＥＲＴ処理のいずれかの後にそれぞれの各臓器において見られたヒトＧ
ＬＡタンパク質の比較を示す。レベルは、投与から１週間後に存在したｈＧＬＡに相当す
る。ｈＧＬＡタンパク質は、分析したすべての臓器において検出された。例えば、ＭＲＴ
で処理されたマウスが、腎臓において２．４２ｎｇのｈＧＬＡタンパク質／ｍｇタンパク
質のｈＧＬＡタンパク質蓄積をもたらした一方で、α−ガラクトシダーゼで処理されたマ
ウスは、残留レベル（０．３７ｎｇ／ｍｇタンパク質）しか有しなかった。これは、ｈＧ
ＬＡ ＭＲＴで処理されたときの約６．５倍高いレベルのｈＧＬＡタンパク質に相当する
。心臓の分析において、１．０ｎｇのみのα−ガラクトシダーゼ／ｍｇタンパク質と比較
して、１１．５ｎｇのｈＧＬＡタンパク質／ｍｇタンパク質がＭＲＴで処理されたコホー
トにおいて見られた。これは、ｈＧＬＡ ＭＲＴで処理されたマウスの心臓において、Ｅ
ＲＴベースの療法よりも約１１倍高い蓄積に相当する。

行われた体内分布分析に加えて、有効性の評価を、主要臓器におけるグロボトリアオシ
ルセラミド（Ｇｂ３）およびＬｙｓｏ−Ｇｂ３レベルの測定結果用いて決定した。単回静
脈内投与量１．０ｍｇ／ｋｇでのＧＬＡ ＭＲＴ処理後と、同等の投与量でのα−ガラク
トシダーゼＥＲＴベースの療法後とのＧｂ３減少の直接比較は、腎臓ならびに心臓におい
てＧｂ３レベルのかなりの差をもたらした。例えば、ＧＬＡ ＭＲＴおよびα−ガラクト
シダーゼのＧｂ３レベルは、それぞれ、６０．２％および２６．８％の減少をもたらした
（図２０）。さらに、心臓におけるＧｂ３レベルは、ＭＲＴおよびα−ガラクトシダーゼ
において、それぞれ、９２．１％および６６．９％減少した（図２１）。

有効性測定用の第２の関連バイオマーカーは、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３である。ＧＬＡ ＭＲ
Ｔは、腎臓および心臓においても同様に、α−ガラクトシダーゼよりもＬｙｓｏ−Ｇｂ３
を効率的に減少させた（それぞれ、図２０および図２１）。具体的には、ＭＲＴで処理さ
れたファブリーマウスは、腎臓および心臓において、それぞれ、８６．１％および８７．
９％のＬｙｓｏ−Ｇｂ３減少を示し、対して、α−ガラクトシダーゼで処理されたマウス
は、４７．８％および６１．３％の減少をもたらした。

Ｃ１２−２００ベースの脂質ナノ粒子におけるｈＧＬＡでの結果は、他の脂質ナノ粒子
製剤にまで及ぶ。例えば、単回静脈内投与で投与されたＨＧＴ４００３（製剤３）に装填
されたｈＧＬＡ ｍＲＮＡまたはＨＧＴ５０００ベース（製剤５）の脂質ナノ粒子は、投
与後２４時間時点でｈＧＬＡの産生をもたらす（図２２）。ｈＧＬＡの産生は、用量応答
を示した。同様に、ｈＧＬＡ産生が、単回静脈内投与で投与されたＨＧＴ５００１ベース
（製剤６）の脂質ナノ粒子に装填されたｈＧＬＡ ｍＲＮＡの投与後６時間および２４時
間時点で観察された。ｈＧＬＡ産生が血清（図２３Ａ）において、同様に臓器（図２３Ｂ
）において観察された。

全体として、タンパク質産生のためにデポーとして適用されるｍＲＮＡ置換療法は、超
生理学的レベルの機能的に治療的な活性タンパク質を大量に産生する。この方法が所望の
タンパク質の持続的な循環半減期をもたらすことが実証されており、このＭＲＴ由来タン
パク質は、ファブリーマウスにおけるα−ガラクトシダーゼ酵素で実証された療法に非常
に有効である。
１Ｃ．生体内ヒトＦＩＸタンパク質産生結果

野生型マウス（ＣＤ−１）に第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ｍＲＮＡ装填脂質ナノ粒子を投与し
、血流に分泌されるＦＩＸタンパク質を決定する研究を行った。３０ｕｇのＣ１２−２０
０ベース（４０：３０：２５：５の比率のＣ１２−２００：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧ
）のＦＩＸ ｍＲＮＡ装填脂質ナノ粒子（カプセル化ｍＲＮＡに基づいた投与量）（製剤
１）の単回投与で静脈内注入した際に、ロバストなタンパク質産生が観察された（図２４
）。

７２時間にわたる薬物動態学的分析は、ＭＲＴ由来ＦＩＸタンパク質が試験されたすべ
ての時点で検出され得ることを示した（図２４）。ピーク血清濃度は、注入後２４時間時
点で観察され、その値は、約３ｕｇ（２９９５±７３８ｎｇ／ｍＬ）のＦＩＸタンパク質
／ｍＬ血清であった。これは、デポー効果の別の成功例を示す。
１Ｄ．生体内ヒトＡ１ＡＴタンパク質産生結果

野生型マウス（ＣＤ−１）にα−１−抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）ｍＲＮＡ装填脂質ナノ
粒子を投与し、血流に分泌されるＡ１ＡＴタンパク質を決定する研究を行った。３０ｕｇ
のＣ１２−２００ベースのＡ１ＡＴ ｍＲＮＡ装填脂質ナノ粒子（カプセル化ｍＲＮＡに
基づいた投与量）（製剤１）の単回投与で静脈内注入した際に、ロバストなタンパク質産
生が観察された（図２５）。

図２５に示されるように、検出可能なレベルのＡ１ＡＴ ＭＲＴに由来するヒトＡ１Ａ
Ｔタンパク質が投与後に２４時間にわたって観察された。最大血清レベルの約４８ｕｇの
Ａ１ＡＴタンパク質／ｍＬ血清が、注入から１２時間後に検出された。
実施例２：ポリヌクレオチド組成物の肺送達を介するタンパク質産生デポー
注入プロトコル

それぞれの実験の初めに約７〜１０週齢の雌ＣＤ−１またはＢＡＬＢ／Ｃマウスを用い
てすべての研究を行った。単一気管内エアロゾル化投与を介して試験物質を導入した。マ
ウスを屠殺し、指定された時点で、生理食塩水で灌流した。それぞれのマウスの肺を採取
し、２つに分配し、１０％の中性緩衝ホルマリン中に保存するか、またはスナップ凍結さ
せるかのいずれかを行い、分析のために−８０℃で保管した。血清を実施例１に記載され
るように単離した。ＥＰＯ ＥＬＩＳＡ：実施例１に記載される通りである。
結果

デポー効果を肺送達（例えば、鼻腔内、気管内噴霧）を介して得ることができる。ナノ
粒子系を介して送達されるメッセンジャーＲＮＡに由来する所望の外因性タンパク質の測
定結果を取得および定量化した。

ＣＤ−１マウスにおけるｈＥＰＯ ｍＲＮＡ装填脂質ナノ粒子を介したヒトＥＰＯタン
パク質の産生を、単一気管内投与（ＭｉｃｒｏＳｐｒａｙｅｒ（登録商標））を介して試
験した。様々なカチオン性脂質（製剤１、５、６）を用いていくつかの製剤を試験した。
すべての製剤は、高度にカプセル化されたヒトＥＰＯ ｍＲＮＡをもたらした。投与の際
、動物を投与から６時間後に屠殺し、肺ならびに血清を採取した。

エアロゾル送達を介した処理の際に、投与部位（肺）におけるヒトＥＰＯタンパク質を
検出した。投与から６時間後の血清の分析は、血中で検出可能な量のｈＥＰＯタンパク質
を示した。これらのデータ（図２６に示される）は、ｈＥＰＯタンパク質の産生（および
分泌）のために「デポー」の機能を果たす肺の能力を実証する。

Claims (29)

1. 肺疾患において欠乏しているタンパク質またはペプチドの送達のための組成物であって、
   前記組成物は脂質ナノ粒子内にカプセル化された、前記タンパク質またはペプチドをコードするｍＲＮＡを含み、
   ここで、前記ｍＲＮＡは、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む脂質ナノ粒子内にカプセル化されており、
   前記組成物は、前記送達を必要とする対象に肺送達を介して投与されることを特徴とし、
   前記組成物の投与は、前記対象の肺における単回投与後少なくとも７２時間検出可能なレベルの前記タンパク質またはペプチドをもたらす、組成物。
2. １つ以上のカチオン性脂質を含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記１つ以上のカチオン性脂質が、総脂質の２％〜７０％のモル比を構成する、請求項２に記載の組成物。
4. 前記１つ以上のカチオン性脂質が、総脂質の５％〜５０％のモル比を構成する、請求項３に記載の組成物。
5. 前記１つ以上のＰＥＧ修飾脂質が、総脂質の０．５％〜２０％のモル比を構成する、請求項２に記載の組成物。
6. 前記１つ以上のＰＥＧ修飾脂質が、総脂質の４％〜１０％のモル比を構成する、請求項５に記載の組成物。
7. 前記１つ以上のカチオン性脂質が、Ｃ１２−２００を含む、請求項５に記載の組成物。
8. 前記１つ以上のカチオン性脂質が、ＩＣＥを含む、請求項５に記載の組成物。
9. 前記１つ以上のカチオン性脂質が、ＨＧＴ４００３を含む、請求項５に記載の組成物。
10. １つ以上の非カチオン性脂質を含む、請求項７に記載の組成物。
11. １つ以上の非カチオン性脂質を含む、請求項８に記載の組成物。
12. 前記１つ以上の非カチオン性脂質が、総脂質の５％〜９０％のモル比を構成する、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記１つ以上の非カチオン性脂質が、総脂質の１０％〜７０％のモル比を構成する、請求項１２に記載の組成物。
14. 前記ｍＲＮＡが、５’非翻訳領域を含む、請求項１３に記載の組成物。
15. 前記ｍＲＮＡが、キャップ構造を含む、請求項１４に記載の組成物。
16. 前記ｍＲＮＡが、３’非翻訳領域を含む、請求項１５に記載の組成物。
17. 前記ｍＲＮＡが、ポリＡ尾部を含む、請求項１６に記載の組成物。
18. 前記ポリＡ尾部が、少なくとも２００のヌクレオチドを含む、請求項１７に記載の組成物。
19. 前記ｍＲＮＡが、修飾されている、請求項１８に記載の組成物。
20. 前記ｍＲＮＡが、未修飾である、請求項１に記載の組成物。
21. 前記ｍＲＮＡが、未修飾である、請求項１０に記載の組成物。
22. 前記ｍＲＮＡが、未修飾である、請求項１１に記載の組成物。
23. 再構成された凍結乾燥組成物である、請求項１に記載の組成物。
24. 前記脂質ナノ粒子が、約８０ｎｍ未満の平均寸法を有する、請求項１９に記載の組成物。
25. 前記脂質ナノ粒子が、約６０ｎｍ未満の平均寸法を有する、請求項２４に記載の組成物。
26. 前記脂質ナノ粒子が、約８０ｎｍ未満の平均寸法を有する、請求項１０に記載の組成物。
27. 噴霧によって投与されることを特徴とする、請求項２４に記載の組成物。
28. 噴霧によって投与されることを特徴とする、請求項２６に記載の組成物。
29. 噴霧によって投与されることを特徴とする、請求項２２に記載の組成物。

Images