CN112739327A - 修饰的植物信使包及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文披露了包括多个植物信使包(例如，包括植物细胞外囊泡(EV)或其节段、部分或提取物)的组合物，这些组合物经修饰以具有增强的细胞摄取(例如，动物植物细胞摄取、细菌细胞摄取或真菌细胞摄取)，例如用于各种农业方法或治疗方法。

Description

修饰的植物信使包及其用途
序列表
本申请包含序列表，该序列表已以ASCII格式电子提交，并通过引用以其全文特此并入。所述ASCII副本创建于2019年8月23日，名为51296-005WO2_Sequence_Listing_08.23.19_ST25，并且大小为10,171字节。
背景技术
农业药剂或治疗剂的递送可能受药剂可渗透细胞屏障从而有效地作用于生物体的程度的限制。例如，由植物细胞壁、细菌细胞壁或真菌细胞壁或由动物细胞的细胞膜和/或细胞外基质形成的屏障对农业应用或治疗应用中可用的药剂的细胞摄取是一项挑战。因此，本领域需要用于促进细胞摄取药剂的方法和组合物。
发明内容
本文披露了修饰的植物信使包(PMP)，其具有增强的细胞(例如，植物细胞、真菌细胞、或细菌细胞)摄取。本文中修饰的PMP可用于多种农业或治疗组合物或方法中。
在第一方面，本文提供了一种用于将植物信使包(PMP)递送至靶细胞的方法，该方法包括将包含外源性阳离子脂质的PMP引入该靶细胞中，其中相对于未修饰的PMP，该包含外源性阳离子脂质的PMP具有增加的靶细胞摄取。在一些实施例中，修饰的PMP包含至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或多于90％的阳离子脂质。在一些实施例中，修饰的PMP包含至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或多于90％的源自植物细胞外囊泡(EV)的脂质。
在一些实施例中，增加的细胞摄取是相对于未修饰的PMP增加至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的细胞摄取。
在一些实施例中，修饰的PMP包含异源功能剂。在一些实施例中，异源功能剂被多个PMP中的每一个包封、包埋在多PMP中的每一个的表面上、或与多个PMP中的每一个的表面缀合。
在一些实施例中，细胞是哺乳动物细胞(例如，人细胞)、植物细胞、细菌细胞或真菌细胞。
在另一个方面，本文提供了一种PMP组合物，其包含相对于未修饰的PMP具有增加的细胞摄取的多个修饰的PMP。在一些情况下，细胞是植物细胞。在一些情况下，细胞是真菌细胞。在一些情况下，细胞是细菌细胞。
在一些实施例中，增加的细胞摄取是相对于未修饰的PMP增加至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的细胞摄取。在一些实施例中，增加的细胞摄取是相对于未修饰的PMP增加至少2x倍、4x倍、5x倍、10x倍、100x倍、或1000x倍的细胞摄取。
在一些实施例中，修饰的PMP包括细胞渗透剂。
在一些实施例中，细胞渗透剂是酶或其功能结构域(例如，植物细胞壁降解结构域、细菌细胞壁降解结构域或真菌细胞壁降解结构域)。
在一些实施例中，酶是能够降解植物细胞壁的细菌酶。在一些实施例中，酶与能够降解植物细胞壁的细菌酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。在一些实施例中，酶是能够降解植物细胞壁的真菌酶。在一些实施例中，酶与能够降解植物细胞壁的真菌酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。在一些实施例中，酶是能够降解植物细胞壁的植物酶。在一些实施例中，细胞壁降解酶与能够降解植物细胞壁的植物酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。在一些实施例中，酶是能够降解植物细胞壁的原生动物酶。在一些实施例中，细胞壁降解酶与能够降解植物细胞壁的原生动物酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。
在一些实施例中，酶是能够降解细菌细胞壁的细菌酶。在一些实施例中，酶与能够降解细菌细胞壁的细菌酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。在一些实施例中，酶是能够降解细菌细胞壁的真菌酶。在一些实施例中，酶与能够降解细菌细胞壁的真菌酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。在一些实施例中，酶是能够降解细菌细胞壁的植物酶。在一些实施例中，细胞壁降解酶与能够降解细菌细胞壁的植物酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。在一些实施例中，酶是能够降解细菌细胞壁的原生动物酶。在一些实施例中，细胞壁降解酶与能够降解细菌细胞壁的原生动物酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。
在一些实施例中，酶是能够降解真菌细胞壁的细菌酶。在一些实施例中，酶与能够降解真菌细胞壁的细菌酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。在一些实施例中，酶是能够降解真菌细胞壁的真菌酶。在一些实施例中，酶与能够降解真菌细胞壁的真菌酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。在一些实施例中，酶是能够降解真菌细胞壁的植物酶。在一些实施例中，细胞壁降解酶与能够降解真菌细胞壁的植物酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。在一些实施例中，酶是能够降解真菌细胞壁的原生动物酶。在一些实施例中，细胞壁降解酶与能够降解真菌细胞壁的原生动物酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。
在一些实施例中，酶是纤维素酶。在一些实施例中，纤维素酶与细菌纤维素酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。在一些实施例中，纤维素酶与真菌纤维素酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。在一些实施例中，纤维素酶与原生动物纤维素酶的全部或部分具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。
在一些实施例中，细胞渗透剂是洗涤剂。在一些实施例中，洗涤剂是皂苷。
在一些实施例中，细胞渗透剂包括阳离子脂质。在一些实施例中，阳离子脂质是1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)。在一些实施例中，阳离子脂质是1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DEPC)。
在一些实施例中，组合物稳定至少24小时(例如，至少24小时、30小时、或40小时)、至少48小时(例如，至少48小时(＝2天)、3天、4天、5天、或6天)、至少七天(例如，至少七天(＝1周)、至少2周、至少3周、或至少4周)、或至少30天(例如，至少30天、至少60天、或至少90天)。在一些实施例中，组合物在至少24℃(例如，至少24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、37℃、42℃、或大于42℃)、至少20℃(例如，至少20℃、21℃、22℃、或23℃)、至少4℃(例如，至少5℃、10℃、或15℃)、至少-20℃(例如，至少-20℃、-15℃、-10℃、-5℃、或0℃)、或至少-80℃(例如，至少-80℃、-70℃、-60℃、-50℃、-40℃、或-30℃)的温度下稳定。在一些实施例中，PMP在液氮(约-195.8℃)中稳定。在一些实施例中，组合物在室温下稳定至少一天和/或在4℃下稳定至少一周。在一些实施例中，组合物在UV辐射下稳定。在一些实施例中，组合物在植物自然栖息地的温度下在本文定义的时间段内稳定。
在本文描述的任何组合物的一些实施例中，PMP可包括多个蛋白质(即PMP蛋白)，并且PMP的浓度可测量为其中PMP蛋白的浓度。在一些实施例中，组合物中的多个PMP的浓度是至少0.025μg PMP蛋白/ml(例如，至少0.025、0.05、0.1、或0.5μg PMP蛋白/ml)、至少1μgPMP蛋白/ml(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、或9μg PMP蛋白/ml)、至少10μg PMP蛋白/ml(例如，至少10、15、20、25、30、35、40、或45μg PMP蛋白/ml)、至少50μg PMP蛋白/ml(例如，至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、或95μg PMP蛋白/ml)、至少100μg PMP蛋白/ml(例如，至少100、125、150、175、200、或225μg PMP蛋白/ml)、至少250μg PMP蛋白/ml(例如，至少250、300、350、400、450、或500μg PMP蛋白/ml)、或至少500μg PMP蛋白/ml(例如，至少500、600、700、800、或900μg PMP蛋白/ml)。在一些实施例中，组合物中的多个PMP的浓度是至少1mgPMP蛋白/ml(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、或9PMP蛋白/ml)或至少10mg PMP蛋白/ml(例如，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100mg PMP蛋白/ml)。
在本文组合物的一些实施例中，PMP包括纯化的植物细胞外囊泡(EV)或其节段或提取物。在一些实施例中，植物EV是修饰的植物细胞外囊泡(EV)。在某些实施例中，植物EV是植物外泌体或植物微囊泡。在一些实施例中，PMP包括植物EV标记物，例如附录中概述的那些。
在本文组合物的一些实施例中，多个PMP可以是纯的。例如，组合物可以基本上不含(例如，具有少于25％、20％、15％、10％、5％、2％的)细胞器(例如，植物叶绿体、线粒体或核)。
在一些实施例中，修饰的PMP包括异源功能剂。在一些实施例中，修饰的PMP包括两个或多个不同的异源功能剂。在一些实施例中，异源功能剂被多个PMP中的每一个包封。在一些实施例中，异源功能剂包埋在多个PMP中的每一个的表面上。在一些实施例中，异源功能剂与多个PMP中的每一个的表面缀合。
在一些实施例中，异源功能剂是异源农业药剂。在一些实施例中，异源农业药剂是杀有害生物剂。在一些实施例中，异源功能剂是肥料剂。在一些实施例中，异源功能剂是杀有害生物剂。在一些实施例中，杀有害生物剂是抗真菌剂、抗细菌剂、杀昆虫剂、杀软体动物剂、杀线虫剂、或除草剂。在一些实施例中，异源功能剂是驱避剂。在一些实施例中，异源功能剂是植物修饰剂。
在一些实施例中，异源功能剂是异源治疗剂。在一些实施例中，异源治疗剂包括抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂、或昆虫驱避剂。
在一些实施例中，异源功能剂是异源多肽、异源核酸或异源小分子。在一些实施例中，异源核酸是DNA、RNA、PNA、或杂交DNA-RNA分子。在一些实施例中，RNA是信使RNA(mRNA)、指导RNA(gRNA)、或抑制性RNA。在一些实施例中，抑制性RNA是RNAi、shRNA、或miRNA。在一些实施例中，抑制性RNA抑制植物中的基因表达。在一些实施例中，抑制性RNA抑制植物共生体中的基因表达。
在一些实施例中，核酸是mRNA、修饰的mRNA或DNA分子，其增加植物中以下的表达：酶、成孔蛋白、信号传导配体、细胞渗透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白、核糖蛋白、蛋白适配体或伴侣蛋白。
在一些实施例中，核酸是反义RNA、siRNA、shRNA、miRNA、aiRNA、PNA、吗啉基(morpholino)、LNA、piRNA、核糖酶、DNAzyme、适配体、circRNA、gRNA、或DNA分子，其减少植物中以下的表达：酶、转录因子、分泌蛋白、结构因子、核糖蛋白、蛋白适配体、伴侣蛋白、受体、信号传导配体、或转运蛋白。
在一些实施例中，多肽是酶、成孔蛋白、信号传导配体、细胞渗透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白、核糖蛋白、蛋白适配体、或伴侣蛋白。
在一些实施例中，组合物被配制用于递送至植物。在一些实施例中，组合物包括农业上可接受的载体。
在一些实施例中，组合物被配制用于递送至动物(例如，人)。在一些实施例中，组合物包括药学上可接受的载体。
在一些实施例中，组合物被配制为液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体组合物。
在一些实施例中，植物是农业植物或园艺植物。在一些实施例中，农业植物是大豆植物、小麦植物、或玉米植物。
在一些实施例中，组合物中的PMP的浓度有效于增加植物(例如，农业植物或园艺植物)的适应度。
在一些实施例中，农业植物是杂草。
在一些实施例中，组合物中的PMP的浓度有效于降低植物(例如，杂草)的适应度。
在另一个方面，本文提供了一种PMP组合物，其包含具有增加的动物细胞摄取的多个修饰的PMP，其中这些PMP通过包括以下步骤的方法产生：(a)提供来自植物或其一部分的初始样品，其中该植物或其一部分包含EV；(b)从该初始样品中分离出粗PMP级分，其中相对于在该初始样品中的水平，该粗PMP级分具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分；(c)纯化该粗PMP级分，从而产生多个纯PMP，其中相对于在粗EV级分中的水平，该多个纯PMP具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分；(d)向这些纯PMP负载细胞渗透剂，从而产生相对于未修饰的PMP具有增加的动物细胞摄取的修饰的PMP；以及(e)将步骤(d)的这些PMP配制用于递送至动物。
在另一个方面，本文提供了一种PMP组合物，其包含具有增加的植物细胞摄取的多个修饰的PMP，其中这些PMP通过包括以下步骤的方法产生：(a)提供植物或其一部分；(b)释放来自该植物或其一部分的多个细胞外囊泡(EV)，并收集初始样品中的EV；(c)将该多个EV分离到粗EV级分中，其中相对于该初始样品中的水平，该粗EV级分具有降低水平的植物细胞或细胞碎片；(d)纯化该粗EV级分，从而产生多个纯PMP，其中相对于在该粗EV级分中的水平，该多个纯PMP具有降低水平的植物细胞器、细胞壁组分、或植物分子聚集体(例如，蛋白质聚集体、蛋白质-核酸聚集体、脂蛋白聚集体、或脂质-蛋白质结构)；以及(e)向这些PMP负载增加植物细胞摄取的异源功能剂，从而产生相对于未修饰的PMP具有增加的植物细胞摄取的修饰的PMP。
在另一个方面，本文提供了一种PMP组合物，其包含具有增加的细菌细胞摄取的多个修饰的PMP，其中这些PMP通过包括以下步骤的方法产生：(a)提供植物或其一部分；(b)释放来自该植物或其一部分的多个细胞外囊泡(EV)，并收集初始样品中的EV；(c)将该多个EV分离到粗EV级分中，其中相对于该初始样品中的水平，该粗EV级分具有降低水平的植物细胞或细胞碎片；(d)纯化该粗EV级分，从而产生多个纯PMP，其中相对于在该粗EV级分中的水平，该多个纯PMP具有降低水平的植物细胞器、细胞壁组分、或植物分子聚集体(例如，蛋白质聚集体、蛋白质-核酸聚集体、脂蛋白聚集体、或脂质-蛋白质结构)；以及(e)向这些PMP负载增加细菌细胞摄取的异源功能剂，从而产生相对于未修饰的PMP具有增加的细菌细胞摄取的修饰的PMP。
在另一个方面，本文提供了一种PMP组合物，其包含具有增加的真菌细胞摄取的多个修饰的PMP，其中这些PMP通过包括以下步骤的方法产生：(a)提供来自植物或其一部分的初始样品，其中该植物或其一部分包含EV；(b)从该初始样品中分离出粗PMP级分，其中相对于在该初始样品中的水平，该粗PMP级分具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分；(c)纯化该粗PMP级分，从而产生多个纯PMP，其中相对于在粗EV级分中的水平，该多个纯PMP具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分；(d)向这些纯PMP负载植物细胞渗透剂，从而产生相对于未修饰的PMP具有增加的植物细胞摄取的修饰的PMP；以及(e)将步骤(d)的这些PMP配制用于递送至植物。
在另一个方面，本文提供了包括本文的任何PMP组合物的植物。
在另一个方面，本文提供了包括本文的任何PMP组合物的细菌。
在另一个方面，本文提供了包括本文的任何PMP组合物的真菌。
在另一个方面，本文提供了一种将PMP组合物递送至植物的方法，该方法包括使该植物与本文的任何PMP组合物接触。
在另一个方面，本文提供了一种增加哺乳动物的适应度的方法，该方法包括向该哺乳动物递送有效量的本文的任何PMP组合物的组合物，其中相对于未处理的哺乳动物，该方法增加了该哺乳动物的适应度。在一些实施例中，PMP包含异源治疗剂。在一些实施例中，哺乳动物是人。
在又另一个方面，本文提供了一种增加植物的适应度的方法，该方法包括向该植物递送有效量的本文的任何PMP组合物，其中相对于未处理的植物，该方法增加该植物的适应度。在一些实施例中，PMP包括异源肥料剂。在一些实施例中，PMP包括异源植物修饰剂。在一些实施例中，PMP包括异源杀有害生物剂。在一些实施例中，植物是农业植物或园艺植物。在一些实施例中，植物是大豆植物、小麦植物、或玉米植物。
在另一个方面，本文提供了一种降低植物的适应度的方法，该方法包括向该植物递送有效量的本文描述的任何PMP组合物，其中相对于未处理的植物，该方法降低该植物的适应度。在一些实施例中，PMP包括异源除草剂。在一些实施例中，植物是杂草。
在本文方法的一些实施例中，将PMP组合物递送至植物的叶、种子、根、果实、芽或花中。
在另一个方面，本文提供了一种将PMP组合物递送至细菌的方法，该方法包括使该细菌与本文的任何PMP组合物接触。
在又另一个方面，本文提供了一种降低细菌的适应度的方法，该方法包括向该细菌递送有效量的本文的任何PMP组合物，其中相对于未处理的细菌，该方法降低该细菌的适应度。在一些实施例中，PMP包括异源抗细菌剂。在一些实施例中，细菌是植物病原体。在一些实施例中，细菌是动物(例如，人)病原体。
在另一个方面，本文提供了一种将PMP组合物递送至真菌的方法，该方法包括使该真菌与本文的任何PMP组合物接触。
在又另一个方面，本文提供了一种降低真菌的适应度的方法，该方法包括向该真菌递送有效量的本文的任何PMP组合物，其中相对于未处理的真菌，该方法降低该真菌的适应度。在一些实施例中，PMP包括异源抗真菌剂。在一些实施例中，真菌是植物病原体。在一些实施例中，真菌是动物(例如，人)病原体。在本文方法的一些实施例中，将PMP组合物以液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体的形式递送。
在另一个方面，本文提供了一种农业对照配制品，其包含本文描述的任何PMP组合物和适用于农业用途的载体或赋形剂。配制品可以呈液体、固体(例如，颗粒剂、丸剂、粉剂、干燥可流动剂、或可湿性粉剂)、气雾剂、糊剂、凝胶、或气体的形式。配制品可以被配置为(和/或与说明书组合)稀释(例如，组合物为可溶性固体、或水可分散固体)、喷洒、喷涂、注射、或应用于植物、土壤或种子上。
在另一个方面，本文提供了试剂盒，其包含本文描述的任何PMP组合物和用于在农业组合物(例如，杂草防治组合物、施肥组合物或植物修饰组合物)中使用的说明书。
在另一个方面，本文提供了一种用于将植物信使包(PMP)递送至靶细胞的方法，该方法包括将包含外源性可离子化的脂质的PMP引入该靶细胞中，其中相对于未修饰的PMP，该包含外源性可离子化的脂质的PMP具有增加的靶细胞摄取。在一些实施例中，修饰的PMP包含至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或多于90％的可离子化的脂质。在一些实施例中，修饰的PMP包含至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或多于90％的源自植物细胞外囊泡(EV)的脂质。在一些实施例中，外源性可离子化的脂质是1,1‘-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)。
在另一个方面，本文提供了一种用于将植物信使包(PMP)递送至靶细胞的方法，该方法包括将包含外源性两性离子脂质的PMP引入该靶细胞中，其中相对于未修饰的PMP，该包含外源性两性离子脂质的PMP具有增加的靶细胞摄取。在一些实施例中，修饰的PMP包含至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或多于90％的两性离子脂质。在一些实施例中，修饰的PMP包含至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或多于90％的源自植物细胞外囊泡(EV)的脂质。在一些实施例中，外源性两性离子脂质是1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DEPC)或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)。
在另一个方面，本文提供了一种PMP组合物，其包含含有外源性阳离子脂质的多个修饰的PMP。在一些实施例中，修饰的PMP中的每一个包含至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或多于90％的阳离子脂质。
在另一个方面，本文提供了一种PMP组合物，其包含含有外源性可离子化的脂质的多个修饰的PMP。在一些实施例中，修饰的PMP中的每一个包含至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或多于90％的可离子化的脂质。在一些实施例中，可离子化的脂质是C12-200。
在另一个方面，本文提供了一种PMP组合物，其包含含有外源性两性离子脂质的多个修饰的PMP。在一些实施例中，修饰的PMP中的每一个包含至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或多于90％的两性离子脂质。在一些实施例中，两性离子脂质是DEPC或DOPC。
在另一个方面，本文提供了一种PMP组合物，其包含具有增加的植物细胞摄取的多个修饰的PMP，其中这些PMP通过包括以下步骤的方法产生：(a)提供多个纯化的PMP；(b)加工该多个PMP以产生脂质膜；以及(c)在外源性阳离子脂质的存在下重构该脂质膜，其中重构的PMP包含至少1％的外源性阳离子脂质，从而产生具有增加的细胞摄取的修饰的PMP。
在另一个方面，本文提供了一种PMP组合物，其包含具有增加的植物细胞摄取的多个修饰的PMP，其中这些PMP通过包括以下步骤的方法产生：(a)提供多个纯化的PMP；(b)加工该多个PMP以产生脂质膜；以及(c)在外源性可离子化的脂质的存在下重构该脂质膜，其中重构的PMP包含至少1％的外源性可离子化的脂质，从而产生具有增加的细胞摄取的修饰的PMP。
在另一个方面，本文提供了一种PMP组合物，其包含具有增加的植物细胞摄取的多个修饰的PMP，其中这些PMP通过包括以下步骤的方法产生：(a)提供多个纯化的PMP；(b)加工该多个PMP以产生脂质膜；以及(c)在外源性两性离子脂质的存在下重构该脂质膜，其中重构的PMP包含至少1％的外源性两性离子脂质，从而产生具有增加的细胞摄取的修饰的PMP。
从以下详细说明以及权利要求中，本发明的其他特征和优点将会是显而易见的。
定义
如本文所用，“农业上可接受的”载体或赋形剂是适用于在农业中使用(例如，用于植物)的载体或赋形剂。在某些实施例中，农业上可接受的载体或赋形剂与合理的益处/风险比相称，不会对植物、环境或食用由其衍生所得的农产品的人或动物具有过度的不利副作用。
如本文所用，“递送”或“接触”是指向植物、动物、真菌、或细菌应用PMP组合物，在其中该组合物有效改变该植物、动物、真菌、或细菌的适应度的区域中直接在该植物、动物、真菌、或细菌上或邻近该植物、动物、真菌、或细菌。在其中使组合物与植物、动物、真菌、或细菌直接接触的方法中，可以使组合物与整个植物、动物、真菌、或细菌接触或仅与植物、动物、真菌、或细菌的部分接触。
如本文所用，“降低植物的适应度”是指由于施用本文描述的组合物(例如，包括修饰的PMP、任选地包括异源功能剂的PMP组合物)而导致植物(例如杂草)的生理学的任何破坏，包括但不限于，将植物(例如，杂草)群体降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多。相比于未施用组合物的植物，可以确定植物的适应度降低。
如本文所用，术语“有效量”、“有效浓度”或“有效于……的浓度”是指修饰的PMP或其中的异源功能剂的量，该量足以在靶生物体中或靶生物体上影响所述结果或达到目标水平(例如，预定或阈值水平)。
如本文所用，“增加植物的适应度”是指由于施用本文描述的组合物(例如，包括修饰的PMP、任选地包括异源功能剂的PMP组合物)而导致植物的生产更好，例如产率提高、植物活力改善、或从植物收获的产品的品质改善。改善的植物产率涉及相对于在相同条件下但不应用本发明组合物而生产的植物的相同产品的产率或与应用常规农业药剂相比，按可测量量计植物的产品的产率的增加(例如，如通过植物生物质、谷粒、种子或果实产率、蛋白质含量、碳水化合物或油含量或叶面积测量的)。例如，产率可以增加至少约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、或大于100％。产率可以以在某种基础上植物或植物的产品的按重量或体积计量来表示。基础可以以时间、生长面积、生产的植物的重量、或所用原料的量来表示。植物适应度的增加也可以通过其他手段来测量，诸如相对于在相同条件下但不施用本发明组合物或施用常规农业药剂而生产的植物的相同因素，以活力等级的增加或改善、植株密度(stand)(植物数量/单位面积)增加、植物高度增加、秆围增加、植物冠层增加、外观(例如，如视觉测量的更绿的叶颜色)改善、根等级改善、出苗增加、蛋白质含量、叶尺寸增大、叶数量增加、更少的死的基生叶、分蘖强度增加、营养或需肥量减少、种子萌发增加、分蘖生产率增加、开花增加、种子或谷粒成熟或种子成熟度增加、更少的植物节(verse)(倒伏)、芽生长的增加、或这些因素的任何组合，按可测量或可察觉的量来测量。
如本文所用，术语“异源”是指(1)对植物是外源的(例如，来源于不是产生PMP的植物的源)或(2)对产生PMP的植物是内源的，但以高于在自然界中发现的浓度(例如，如在天然存在的植物细胞外囊泡中发现的)存在于PMP中(例如，使用负载、遗传工程、体外或体内方法)的药剂。
如本文所用，术语“功能剂”是指使用体内或体外方法与PMP或可以与PMP缔合(例如，负载到PMP中或负载到PMP上(例如，被PMP包封、包埋在PMP中或与其缀合)，并且能够根据本发明的组合物或方法影响所述的结果(例如，增加或降低植物、植物有害生物、植物共生体、动物(例如，人)病原体或动物病原体媒介的适应度)的药剂(例如，农业药剂(例如，杀有害生物剂、肥料剂、除草剂、植物修饰剂)或治疗剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂或昆虫驱避剂))。
如本文所用，术语“农业药剂”是指可以作用于植物、植物有害生物或植物共生体的药剂，例如杀有害生物剂、有害生物驱避剂、肥料剂、植物修饰剂或植物共生体修饰剂。
如本文所用，术语“肥料剂”是指能够增加植物(例如，植物营养素或植物生长调节剂)或植物共生体(例如，核酸或肽)的适应度的药剂。
如本文所用，术语“杀有害生物剂”是指防治或降低农业、环境、或家内/家庭(domestic/household)害虫(诸如昆虫、软体动物、线虫、真菌、细菌、杂草、或病毒)的适应度(例如，杀死或抑制生长、增殖、分裂、繁殖或扩散)的药剂、组合物或其中的物质。杀有害生物剂应理解为包括天然存在的或合成的杀昆虫剂(杀幼虫剂或杀成虫剂)、昆虫生长调节剂、杀蜱螨亚纲动物剂(杀螨剂)、杀软体动物剂、杀线虫剂、杀外寄生物剂、杀细菌剂、杀真菌剂、或除草剂。术语“杀有害生物剂”可以进一步涵盖其他生物活性分子，诸如抗生素、抗病毒剂、杀有害生物剂、抗真菌剂、抗蠕虫剂、营养物、和/或使昆虫运动停止或减缓的药剂。
如本文所用，术语“植物修饰剂”是指可以以导致植物适应度增加的方式改变植物的遗传特性(例如，增加基因表达、减少基因表达或在其他方面改变DNA或RNA的核苷酸序列)或生化特性的药剂。
如本文所用，术语“治疗剂”是指可作用于动物(例如，哺乳动物，例如人)、动物病原体或病原体媒介的药剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂、或昆虫驱避剂)。
如本文所用，术语“被配制用于递送至植物”是指包含农业上可接受的载体的PMP组合物。如本文所用，“农业上可接受的”载体或赋形剂是适用于在农业中使用，与合理的益处/风险比相称，而不会对植物、环境或食用由其衍生所得的农产品的人或动物具有过度的不利副作用的载体或赋形剂。
如本文所定义，术语“核酸”和“多核苷酸”是可互换的并且是指线性或支链的、单链或双链的RNA或DNA，或其杂交体，无论长度(例如，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、100个、150个、200个、250个、500个、1000个、或更多个核酸)。该术语还涵盖RNA/DNA杂交体。核苷酸典型地通过磷酸二酯键连接在核酸中，尽管该术语“核酸”还涵盖具有其他类型的连接或主链的核酸类似物(例如，磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基氨基磷酸酯、吗啉代、锁核酸(LNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、和肽核酸(PNA)连接或主链，等)。核酸可以是单链、双链的，或含有单链和双链序列二者的部分。核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何组合，以及碱基(包括，例如，腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、和修饰的或非典型碱基(包括，例如，次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、和5羟基甲基胞嘧啶))的任何组合。
如本文所用，术语“有害生物”是指对植物或其他生物体造成损害，存在于不希望它们的地方，或在其他方面例如通过影响人类农业方法或产品而对人不利的生物体。有害生物可以包括例如无脊椎动物(例如，昆虫、线虫、或软体动物)；微生物(例如，植物病原体、内生植物、专性寄生生物、兼性寄生生物、或兼性腐生植物)，诸如细菌、真菌、或病毒；或杂草。
如本文所用，术语“杀有害生物剂(pesticidal agent或pesticide)”是指防治或降低农业、环境、或家内/家庭(domestic/household)害虫(诸如昆虫、软体动物、线虫、真菌、细菌、杂草、或病毒)的适应度(例如，杀死或抑制生长、增殖、分裂、繁殖或扩散)的药剂、组合物或其中的物质。杀有害生物剂应理解为涵盖天然存在的或合成的杀昆虫剂(杀幼虫剂或杀成虫剂)、昆虫生长调节剂、杀蜱螨亚纲动物剂(杀螨剂)、杀软体动物剂、杀线虫剂、杀外寄生物剂、杀细菌剂、杀真菌剂、或除草剂。术语“杀有害生物剂”可以进一步涵盖其他生物活性分子，诸如抗生素、抗病毒剂、杀有害生物剂、抗真菌剂、抗蠕虫剂、营养物、和/或使昆虫运动停止或减缓的药剂。
杀有害生物剂可以是异源的。如本文所用，术语“异源的”是指(1)对植物是外源的(例如，来源于不是产生PMP的植物或植物部分的源)(例如，使用本文描述的负载方法添加PMP)或(2)对产生PMP的植物细胞或组织是内源的，但以高于在自然界中发现的浓度(例如，高于在天然存在的植物细胞外囊泡中发现的浓度)的浓度存在于PMP中(例如，使用本文描述的负载方法、遗传工程、体外或体内方法添加PMP)的药剂(例如，杀有害生物剂)。
如本文所用，术语“驱避剂”是指阻止有害生物接近或保留在植物上的药剂、组合物或其中的物质。驱避剂可以例如降低植物上或附近的有害生物的数量，但不一定杀死或降低该有害生物的适应度。
如本文所用的，术语“肽”、“蛋白质”或“多肽”涵盖天然或非天然存在的氨基酸(D-或L-氨基酸)的任何链，无论长度(例如，至少2、3、4、5、6、7、10、12、14、16、18、20、25、30、40、50、100或更多个氨基酸)、存在或不存在翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)、或存在例如与肽共价连接的一个或多个非氨基酰基基团(例如，糖、脂质等)，并且包括例如天然蛋白、合成的或重组的多肽和肽、杂交分子、类肽或模拟肽。
如本文所用的，两个序列之间的“百分比同一性”通过BLAST 2.0算法(描述于Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410)确定。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开获得。
如本文所用的，术语“植物”是指整株植物、植物器官、植物组织、种子、植物细胞、种子、以及它们的子代。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、枝、配子体、孢子体、花粉、以及小孢子的细胞。植物部分包括分化的和未分化的组织，包括但不限于以下：根、茎、芽、叶、花粉、种子、果实、收获的产品、肿瘤组织、汁液(例如，木质部汁液和韧皮部汁液)、以及各种形式的细胞和培养物(例如，单细胞、原生质体、胚、和愈伤组织)。植物组织可以在植物中或在植物器官、组织或细胞培养物中。
如本文所用，术语“植物信使包”或“PMP”是指直径为约5-2000nm的脂质结构(例如，脂质双层、单层或多层结构)(例如，囊泡状脂质结构)，该脂质结构包括或源自植物细胞外囊泡或其节段、部分或提取物，包括与其缔合的脂质或非脂质组分(例如肽、核酸或小分子0。PMP可以任选地包括另外的药剂，诸如异源功能剂(例如，异源农业药剂(例如，杀有害生物剂、肥料剂、除草剂、植物修饰剂)或异源治疗剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂或昆虫驱避剂))，包括多核苷酸、多肽、或小分子。PMP可以携带另外的药剂或与其缔合，该另外的药剂是诸如异源功能剂(例如，异源农业药剂(例如，杀有害生物剂、肥料剂、除草剂、植物修饰剂)或异源治疗剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂或昆虫驱避剂))。通过多种手段以使该另外的药剂能够递送至靶植物，例如通过包封该另外的药剂、将组分结合在脂质双层结构中、或将组分(例如，通过缀合)与脂质双层结构的表面缔合。另外的药剂可以体内(例如，在植物体内)或体外(例如，在组织培养物中、在细胞培养物中、或合成地结合)掺入PMP中。
如本文所用，术语“修饰的PMP”是指包括多个PMP的组合物，其中相对于未修饰的PMP，这些PMP包括能够增加PMP的细胞摄取(例如，植物细胞摄取、细菌细胞摄取或真菌细胞摄取)或其部分或组分(例如，PMP携带的异源功能剂)的异源剂(heterologous agent)。可以体外或体内修饰PMP。
如本文所用，术语“未修饰的PMP”是指包括缺少能够增加PMP的细胞摄取(例如，动物细胞摄取、植物细胞摄取、细菌细胞摄取或真菌细胞摄取)的异源细胞摄取剂的多个PMP的组合物。
如本文所用，术语“细胞摄取”是指细胞(例如，动物细胞、植物细胞、细菌细胞或真菌细胞)对PMP或其部分或组分(例如，PMP携带的异源功能剂)的摄取。例如，摄取可以涉及将PMP或其组分的部分从细胞外环境转移到或穿过细胞膜、细胞壁、细胞外基质，或转移到细胞的细胞内环境。细胞摄取PMP可以经由主动或被动的细胞机制发生。
如本文所用，术语“细胞渗透剂”是指以促进细胞摄取相对于未与药剂接触的细胞增加的方式改变细胞(例如，动物细胞、植物细胞、细菌细胞或真菌细胞)的细胞壁、细胞外基质或细胞膜的特性(例如，渗透率)的药剂。
如本文所用，术语“植物细胞外囊泡”、“植物EV”、或“EV”是指植物中天然存在的封闭的脂质双层结构。任选地，植物EV包含一种或多种植物EV标记物。如本文所用，术语“植物EV标记物”是指与植物天然缔合的组分，诸如植物蛋白、植物核酸、植物小分子、植物脂质、或其组合，包括但不限于附录中列出的任何植物EV标记物。在一些情况下，植物EV标记物是植物EV的鉴定标记物，但不是杀有害生物剂。在一些情况下，植物EV标记物是植物EV的鉴定标记物，而且还是杀有害生物剂(例如，与多个PMP缔合或被其包封的、或不直接与多个PMP缔合或被其包封的)。
如本文所用，术语“植物信使包”或“PMP”是指直径为约5-2000nm(例如，至少5-1000nm、至少5-500nm、至少400-500nm、至少25-250nm、至少50-150nm、或至少70-120nm)的脂质结构(例如，脂质双层，单层、多层结构；例如，囊泡状脂质结构)，该脂质结构源自(例如，富集、分离或纯化自)植物源或其节段、部分或提取物，包括与其缔合的脂质或非脂质组分(例如，肽、核酸、或小分子)，并且已从植物、植物部分或植物细胞中富集、分离或纯化，该富集或分离从源植物中除去一种或多种污染物或不希望的组分。PMP可以是天然存在的EV的高度纯化制剂。优选地，除去来自源植物的一种或多种污染物或不希望的组分的至少1％的来自源植物的污染物或不希望的组分(例如，至少2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、98％、99％、或100％)，例如植物细胞壁组分；果胶；植物细胞器(例如，线粒体；质体，诸如叶绿体、白色体或淀粉质体；和核)；植物染色质(例如，植物染色体)；或植物分子聚集体(例如，蛋白质聚集体、蛋白质-核酸聚集体、脂蛋白聚集体、或脂质-蛋白质结构)。优选地，PMP是相对于来自源植物的该一种或多种污染物或不希望的组分至少30％纯的(例如，至少40％纯的、至少50％纯的、至少60％纯的、至少70％纯的、至少80％纯的、至少90％纯的、至少99％纯的、或100％纯的)，如通过重量(w/w)、光谱成像(透射率％)、或电导率(S/m)测量。
在一些情况下，PMP是脂质提取的PMP(LPMP)。如本文所用，术语“脂质提取的PMP”和“LPMP”是指源自脂质结构(例如，脂质双层、单层、多层结构；例如，囊泡状脂质结构)的PMP，该脂质结构源自(例如，富集、分离或纯化自)植物源，其中该脂质结构在液相(例如，含有货物的液相)中被破坏(例如，通过脂质提取破坏)和重新组合或重构(使用标准方法，例如通过包括脂质膜水合和/或溶剂注射的方法重构)，以产生LPMP，如本文描述。如果需要，该方法可进一步包括超声处理、冷冻/冻融处理和/或脂质挤出，例如，以减小重构的PMP的尺寸。PMP(例如，LPMP)可包含10％与100％之间的脂质(源自来自植物源的脂质结构)，例如，可含有至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或100％的脂质(源自来自植物源的脂质结构)。PMP(例如，LPMP)可包含来自植物源的脂质结构中存在的脂质种类的全部或部分，例如，其可含有来自植物源的脂质结构中存在的脂质种类的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。PMP(例如，LPMP)可不包含来自植物源的脂质结构中存在的蛋白质种类、包含来自植物源的脂质结构中存在的蛋白质物种的部分或全部，例如，可含有来自植物源的脂质结构中存在的蛋白质种类的0％、小于1％、小于5％、小于10％、小于15％、小于20％、小于30％、小于40％、小于50％、小于60％、小于70％、小于80％、小于90％，小于100％，或100％。在一些情况下，PMP的脂质双层(例如，LPMP)不含蛋白质。在一些情况下，相对于来自植物源的脂质结构，PMP(例如，LPMP)的脂质结构含有减少量的蛋白质。
PMP(例如，LPMP)可以任选地包括外源性脂质，例如，(1)对植物是外源的(例如，来源于不是产生PMP的植物或植物部分的源)(例如，使用本文描述的方法添加PMP)或(2)对产生PMP的植物细胞或组织是内源的，但以高于在自然界中发现的浓度(例如，高于在天然存在的植物细胞外囊泡中发现的浓度)存在于PMP(例如，使用本文描述的方法、遗传工程、体外或体内方法添加PMP)中的脂质。PMP的脂质组合物可包括0％、小于1％或至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或大于95％的外源性脂质。示例性外源性脂质包括阳离子脂质、可离子化的脂质和两性离子脂质。外源性脂质可以是细胞渗透剂。
PMP可以任选地包含另外的药剂，诸如异源功能剂，例如，细胞渗透剂、杀有害生物剂、肥料剂、植物修饰剂、治疗剂、多核苷酸、多肽、或小分子。PMP可以以多种方式携带另外的药剂(例如，异源功能剂)或与其缔合，以使该药剂能够递送至靶植物，例如通过包封该药剂、将该药剂结合在脂质双层结构中、或将该药剂(例如，通过缀合)与脂质双层结构的表面缔合。异源功能剂可以体内(例如，在植物体内)或体外(例如，在组织培养物中、在细胞培养物中、或合成地结合)掺入PMP中。
如本文所用，术语“阳离子脂质”是指含有阳离子基团(例如，阳离子头基)的两亲分子(例如，脂质或类脂质)。
如本文所用，术语“类脂质”是指具有脂质的一个或多个特征的分子。
如本文所用，术语“可离子化的脂质”是指含有在给定条件下(例如，pH)可被电离(例如，解离以产生一种或多种带电荷粒种)的基团(例如，头基)的两亲分子(例如，脂质或类脂质)。
如本文所用，术语“两性离子脂质”是指含有具有至少一个带正电荷的粒种和至少一个带负电荷的粒种的基团(例如头基)的两亲分子(例如脂质或类脂质)，其中该基团的净电荷为零。
如本文所用，术语“稳定的PMP组合物”(例如，包含负载或未负载的PMP的组合物)是指在一定时间段(例如，至少24小时、至少48小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少30天、至少60天、或至少90天)内任选地在限定的温度范围下(例如，至少24℃(例如，至少24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、或30℃)、至少20℃(例如，至少20℃、21℃、22℃、或23℃)、至少4℃(例如，至少5℃、10℃、或15℃)、至少-20℃(例如，至少-20℃、-15℃、-10℃、-5℃、或0℃)、或-80℃(例如，至少-80℃、-70℃、-60℃、-50℃、-40℃、或-30℃)的温度)相对于PMP组合物中PMP的数量(例如，在生产或配制时)保留初始PMP数量(例如，PMP/mL溶液)的至少5％(例如，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％)的PMP组合物；或任选地在限定的温度范围下(例如，至少24℃(例如，至少24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、或30℃)、至少20℃(例如，至少20℃、21℃、22℃、或23℃)、至少4℃(例如，至少5℃、10℃、或15℃)、至少-20℃(例如，至少-20℃、-15℃、-10℃、-5℃、或0℃)、或-80℃(例如，至少-80℃、-70℃、-60℃、-50℃、-40℃、或-30℃)的温度)相对于PMP的初始活性(例如，在生产或配制时)保留其活性(例如，细胞壁渗透活性和/或杀有害生物和/或驱避剂活性)的至少5％(例如，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％)。
如本文所用，术语“被配制用于递送至动物”是指包含药学上可接受的载体的PMP组合物。如本文所用，“药学上可接受的”载体或赋形剂是适用于施用至动物(例如，人)的载体或赋形剂并且例如对动物(例如，人)无过度的不利副作用的载体或赋形剂。
如本文所用，术语“未处理的”是指未接触或递送本文的PMP组合物的植物、动物、真菌、或细菌，包括未递送PMP组合物的单独的植物、动物、真菌、或细菌、经受在递送PMP组合物之前的时间点评价的处理的相同植物、动物、真菌、或细菌、或经受在植物、动物、真菌、或细菌的未处理部分评价的处理的相同植物、动物、真菌、或细菌。
附图说明
图1是示意图，其示出了从葡萄柚和柠檬PMP制备脂质重构的PMP(LPMP)的工作流程。
图2是示出了LPMP、添加DC-胆固醇(DC-Chol)的LPMP、以及添加DOTAP(DOTAP)的LPMP中给定尺寸(nm)的颗粒的相对频率的图。通过NanoFCM，使用制造商提供的浓度和尺寸标准获取数据。
图3A是低温电子显微照片(cryo-electron micrograph)，其示出了从提取的柠檬PMP脂质重构的LPMP。比例尺：500nm。
图3B是示出了从提取的柠檬脂质重构的LPMP中给定等效球直径(nm)的颗粒的相对频率(如使用低温电子显微术所测量)的图。
图4A是示出了不含添加的脂质的LPMP(LPMP)和包含25％或40％DOTAP或DC-胆固醇的LPMP的ζ电位(mV)(如使用动态光散射(DLS)所测量)的图。数据表示为平均值±SD。
图4B是柱状图，其示出了在负载来自不含添加的脂质的葡萄柚脂质的LPMP(LPMP)和来自包含20％DOTAP的葡萄柚脂质的LPMP之后，从LPMP回收的Alexa Fluor 555标记的siRNA输入的百分比。
图4C是柱状图，其示出了在负载来自不含添加的脂质的柠檬脂质的LPMP(LPMP)和来自包含40％DC-胆固醇(DC-Chol)的柠檬脂质的LPMP之后，从LPMP回收的ATTO标记的TracrRNA输入的百分比。
图4D是柱状图，其示出了在尚未处理或已使用Triton-X100和肝素(+TX+肝素)裂解的包含40％DC-胆固醇的LPMP中的TracrRNA浓度(μg/mL)，如使用Quant-iTTM
Figure BDA0002947982740000211
分析所测量的。
图5是一组显微照片，其示出了COLO697细胞中DAPI(顶行)和PKH67(中间行)荧光，这些细胞用来自不含添加的脂质的葡萄柚脂质的PKH67标记的LPMP(中间列)和含有20％DOTAP的LPMP(右列)处理。底行的分图中示出了包含DAPI和PKH67信号的合并的图像。用PKH67染料处理的细胞显示为对照。比例尺：50μm。
图6是一组显微照片，其示出了黑墨西哥甜(Black Mexican Sweet，BMS)玉米细胞的相位衬度(左列)、ATTO 550荧光(中间列)、和合并的视图，这些细胞用不含添加的脂质的LPMP(中间行)和包含40％DC-胆固醇(DC-Chol)的LPMP处理。仅用H2O处理的细胞作为阴性对照提供(顶部分图)。细胞中TracrRNA ATTO 550信号的存在指示细胞对LPMP或用DC-胆固醇修饰的LPMP的摄取。比例尺：100μm。
图7是示出了未修饰的LPMP、添加MC3的LPMP、和添加C12-200的LPMP中给定尺寸(nm)的颗粒的相对频率的图。通过NanoFCM，使用制造商提供的浓度和尺寸标准获取数据。
图8A是示出了不含添加的脂质的LPMP(LPMP)(pH 7)、包含40％MC3的LPMP(pH 4和pH 7)、和包含25％C12-200的LPMP(pH 4和pH 7)的ζ电位(mV)的图。数据表示为平均值±SD。
图8B是柱状图，其示出了在负载来自不含添加的脂质的柠檬脂质的LPMP(LPMP)(pH 7)、包含40％MC3的LPMP(pH 4和pH 9)、和包含25％C12-200的LPMP(pH 4和pH 9)后，从LPMP回收的ATTO 550标记的TracrRNA输入的百分比。数据表示为平均值±SD。
图8C是柱状图，其示出了在尚未处理或已使用Triton-X100和肝素(+TX+肝素)裂解的包含25％C12-200的LPMP中的sgRNA浓度(μg/mL)，如使用Quant-iTTM
Figure BDA0002947982740000212
分析所测量的。
图9是一组显微照片，其示出了黑墨西哥甜(BMS)玉米细胞的相位衬度(左列)、ATTO 550荧光(中间列)、和合并的视图，这些细胞用来自不含添加的脂质的柠檬脂质的LPMP(中间行)和包含25％C12-200的LPMP(底行)处理。仅用H2O处理的细胞作为阴性对照提供(顶行)。细胞中TracrRNA ATTO 550信号的存在指示细胞对LPMP或用C12-200修饰的LPMP的摄取。比例尺：100μm。
图10是一组显微照片，其示出了黑墨西哥甜(BMS)玉米细胞的相位衬度(顶行)、指示标记的纤维素酶的Alexa Fluor 488荧光(第二行)、指示标记的PMP膜的PKH26荧光(第三行)和合并的视图(底行)，这些细胞用来自不含添加的纤维素酶的葡萄柚脂质的LPMP(第四列)处理。LPMP或使用以下修饰方案用纤维素酶修饰的LPMP的摄取：c.1(使用EDC交联接头，通过碳二亚胺化学，将PMP与AlexaFluor488纤维素酶缀合)、b.3(使用NH2-DBCO接头，将PMP与AlexaFluor488-纤维素酶-叠氮(cellulase-azed)缀合)、b.2(使用NH2-DBCO接头，将PMP与AlexaFluor488-纤维素酶-叠氮缀合)、或b.1(使用NHS-膦，将PMP与AlexaFluor488-纤维素酶-叠氮缀合)。细胞中PKH26荧光信号的存在指示纤维素酶修饰的PMP的摄取。比例尺：100μm。
具体实施方式
本文的特征是具有增强的细胞摄取(例如，动物细胞(例如，哺乳动物细胞(例如，人细胞))、植物细胞、细菌细胞或真菌细胞摄取)的修饰的植物信使包(PMP)。PMP是全部或部分地从植物细胞外囊泡(EV)或其节段、部分或提取物产生的脂质组件。PMP可以任选地包含另外的药剂(例如，异源功能剂，(例如，异源农业药剂(例如，杀有害生物剂、肥料剂、除草剂、植物修饰剂)或异源治疗剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂或昆虫驱避剂))。本文描述的修饰的PMP和相关组合物及方法可用于多种农业方法和治疗方法。
I.修饰的植物信使包组合物
本文描述的PMP组合物包含多个修饰的植物信使包(PMP)。PMP是包含植物EV或其节段、部分或提取物(例如，脂质提取物)的脂质(例如，脂质双层，单层或多层结构)结构。植物EV是指一种封闭的脂质双层结构，其天然存在于植物中，并且直径为约5-2000nm。植物EV可以来源于多种植物生物合成途径。在自然界中，植物EV可以发现于植物的细胞内隔室和细胞外隔室，诸如植物质外体(位于质膜外部并且由连续的细胞壁和细胞外空间形成的隔室)。可替代地，PMP可以是在从植物细胞分泌后在细胞培养基中发现的富集的植物EV。可以通过本文进一步描述的多种方法从植物中分离出植物EV，从而提供PMP。此外，PMP可以任选地包括可体内或体外引入的异源功能剂(例如，异源农业药剂(例如，杀有害生物剂、肥料剂、除草剂、植物修饰剂)或异源治疗剂(例如，细胞渗透剂、抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂或昆虫驱避剂))。
PMP可以包括植物EV或其节段、部分或提取物。任选地，除源自植物EV的脂质外，PMP还可以包括外源性脂质(例如，固醇(例如，胆固醇)、阳离子脂质、两性离子脂质或可离子化的脂质)。在一些实施例中，植物EV的直径为约5-1000nm。例如，PMP可以包含平均直径为约5-50nm、约50-100nm、约100-150nm、约150-200nm、约200-250nm、约250-300nm、约300-350nm、约350-400nm、约400-450nm、约450-500nm、约500-550nm、约550-600nm、约600-650nm、约650-700nm、约700-750nm、约750-800nm、约800-850nm、约850-900nm、约900-950nm、约950-1000nm、约1000-1250nm、约1250-1500nm、约1500-1750nm、或约1750-2000nm的植物EV或其节段、部分或提取物。在一些情况下，PMP包含平均直径为约5-950nm、约5-900nm、约5-850nm、约5-800nm、约5-750nm、约5-700nm、约5-650nm、约5-600nm、约5-550nm、约5-500nm、约5-450nm、约5-400nm、约5-350nm、约5-300nm、约5-250nm、约5-200nm、约5-150nm、约5-100nm、约5-50nm、或约5-25nm的植物EV或其节段、部分或提取物。在某些情况下，植物EV或其节段、部分或提取物的平均直径为约50-200nm。在某些情况下，植物EV或其节段、部分或提取物的平均直径为约50-300nm。在某些情况下，植物EV或其节段、部分或提取物的平均直径为约200-500nm。在某些情况下，植物EV或其节段、部分或提取物的平均直径为约30-150nm。
在一些情况下，PMP可以包含平均直径为至少5nm、至少50nm、至少100nm、至少150nm、至少200nm、至少250nm、至少300nm、至少350nm、至少400nm、至少450nm、至少500nm、至少550nm、至少600nm、至少650nm、至少700nm、至少750nm、至少800nm、至少850nm、至少900nm、至少950nm、或至少1000nm的植物EV或其节段、部分或提取物。在一些情况下，PMP包含平均直径小于1000nm、小于950nm、小于900nm、小于850nm、小于800nm、小于750nm、小于700nm、小于650nm、小于600nm、小于550nm、小于500nm、小于450nm、小于400nm、小于350nm、小于300nm、小于250nm、小于200nm、小于150nm、小于100nm、或小于50nm的植物EV或其节段、部分或提取物。可以使用本领域中多种标准方法(例如，动态光散射方法)来测量该植物EV或其节段、部分或提取物的粒径。
在一些情况下，PMP可以包含平均表面积为77nm2至3.2x 106nm2(例如，77-100nm2、100-1000nm2、1000-1x 104nm2、1x 104-1x 105nm2、1x 105-1x 106nm2、或1x 106-3.2x106nm2)的植物EV或其节段、部分或提取物。在一些情况下，PMP可以包含平均体积为65nm3至5.3x 108nm3(例如，65-100nm3、100-1000nm3、1000-1x104nm3、1x 104-1x 105nm3、1x 105-1x106nm3、1x 106-1x 107nm3、1x 107-1x 108nm3、1x 108-5.3x 108nm3)的植物EV或其节段、部分或提取物。在一些情况下，PMP可以包含平均表面积为至少77nm2(例如，至少77nm2、至少100nm2、至少1000nm2、至少1x 104nm2、至少1x 105nm2、至少1x 106nm2、或至少2x 106nm2)的植物EV或其节段、部分或提取物。在一些情况下，PMP可以包含平均体积为至少65nm3(例如，至少65nm3、至少100nm3、至少1000nm3、至少1x 104nm3、至少1x 105nm3、至少1x 106nm3、至少1x 107nm3、至少1x 108nm3、至少2x 108nm3、至少3x 108nm3、至少4x 108nm3、或至少5x 108nm3的植物EV或其节段、部分或提取物。
在一些情况下，PMP的尺寸可以与植物EV或其节段、提取物或部分相同。可替代地，PMP的尺寸可以与产生PMP的初始植物EV不同。例如，PMP的直径可以是约5-2000nm的直径。例如，PMP的平均直径可以是约5-50nm、约50-100nm、约100-150nm、约150-200nm、约200-250nm、约250-300nm、约300-350nm、约350-400nm、约400-450nm、约450-500nm、约500-550nm、约550-600nm、约600-650nm、约650-700nm、约700-750nm、约750-800nm、约800-850nm、约850-900nm、约900-950nm、约950-1000nm,约1000-1200nm、约1200-1400nm、约1400-1600nm、约1600-1800nm、或约1800-2000nm。在一些情况下，PMP的平均直径可以是至少5nm、至少50nm、至少100nm、至少150nm、至少200nm、至少250nm、至少300nm、至少350nm、至少400nm、至少450nm、至少500nm、至少550nm、至少600nm、至少650nm、至少700nm、至少750nm、至少800nm、至少850nm、至少900nm、至少950nm、至少1000nm、至少1200nm、至少1400nm、至少1600nm、至少1800nm、或约2000nm。可以使用本领域中多种标准方法(例如，动态光散射方法)来测量PMP的粒径。在一些情况下，在负载异源功能剂之后或在PMP的其他修饰之后确定PMP的尺寸。
在一些情况下，PMP的平均表面积可以是77nm2至1.3x 107nm2(例如，77-100nm2、100-1000nm2、1000-1x 104nm2、1x 104-1x 105nm2、1x 105-1x 106nm2、或1x 106-1.3x107nm2)。在一些情况下，PMP的平均体积可以是65nm3至4.2x 109nm3(例如，65-100nm3、100-1000nm3、1000-1x 104nm3、1x 104-1x 105nm3、1x 105-1x 106nm3、1x 106-1x 107nm3、1x 107-1x 108nm3、1x 108-1x 109nm3、或1x 109-4.2x 109nm3)。在一些情况下，PMP的平均表面积是至少77nm2(例如，至少77nm2、至少100nm2、至少1000nm2、至少1x 104nm2、至少1x 105nm2、至少1x 106nm2、或至少1x 107nm2)。在一些情况下，PMP的平均体积是至少65nm3(例如，至少65nm3、至少100nm3、至少1000nm3、至少1x 104nm3、至少1x 105nm3、至少1x 106nm3、至少1x107nm3、至少1x 108nm3、至少1x 109nm3、至少2x 109nm3、至少3x 109nm3、或至少4x 109nm3)。
在一些情况下，PMP可以包含完整的植物EV。可替代地，PMP可以包括植物EV的囊泡的整个表面积的节段、部分或提取物(例如，包括囊泡的整个表面积的小于100％(例如，小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于10％、小于5％、或小于1％)的节段、部分或提取物)。节段、部分或提取物可以是任何形状，诸如圆周节段、球形节段(例如，半球)、曲线节段、线性节段、或平坦节段。在节段是囊泡的球形节段的情况下，球形节段可以表示通过将球形囊泡沿一对平行线分裂而产生的球形节段或者通过将球形囊泡沿一对非平行线分裂而产生的球形节段。因此，多个PMP可以包括多个完整的植物EV，多个植物EV节段、部分或提取物，或完整的植物EV和植物EV节段的混合物。本领域技术人员应当理解，完整的植物EV与节段的植物EV的比率将取决于所使用的特定分离方法。例如，与诸如真空渗透的非破坏性提取方法相比，将植物或其一部分研磨或共混可以产生含有更高百分比的植物EV节段、部分或提取物的PMP。
在其中PMP包含植物EV的节段、部分或提取物的情况下，EV节段、部分或提取物可以具有小于完整的囊泡的平均表面积的平均表面积，例如小于77nm2、100nm2、1000nm2、1x104nm2、1x 105nm2、1x 106nm2、或3.2x 106nm2的平均表面积)。在一些情况下，EV节段、部分或提取物的表面积小于70nm2、60nm2、50nm2、40nm2、30nm2、20nm2、或10nm2)。在一些情况下，PMP可以包含具有小于完整的囊泡的平均体积的平均体积(例如，小于65nm3、100nm3、1000nm3、1x 104nm3、1x 105nm3、1x 106nm3、1x 107nm3、1x 108nm3、或5.3x 108nm3的平均体积)的植物EV或其节段、部分或提取物)。
在其中PMP包含植物EV的提取物的情况下，例如在PMP包含从植物EV中提取(例如，用氯仿)的脂质的情况下，PMP可以包含至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、或大于99％的从植物EV提取(例如，用氯仿)的脂质。多个中的PMP可以包含植物EV节段和/或植物EV提取的脂质或其混合物。
本文进一步概述了关于生产修饰的PMP、可与PMP缔合的植物EV标记物、和用于包含PMP的组合物的配制品的方法的细节。
A.生产方法
可以从植物EV或其节段、部分或提取物(例如，脂质提取物)中生产PMP，PMP天然存在于植物或其部分(包括植物组织或植物细胞)中。用于生产PMP的示例性方法包括(a)提供来自植物或其一部分的初始样品，其中该植物或其一部分包含EV；和(b)从该初始样品中分离出粗PMP级分，其中相对于在该初始样品中的水平，该粗PMP级分具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分。方法可以进一步包括另外的步骤(c)纯化该粗PMP级分，从而产生多个纯PMP，其中相对于在该粗EV级分中的水平，该多个纯PMP具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分。每个生产步骤将在下面进一步详细讨论。关于PMP的分离和纯化的示例性方法例如在以下中找到：Rutter和Innes,Plant Physiol.[植物生理学]173(1):728-741,2017；Rutter等人,Bio.Protoc.[生物方案]7(17):e2533,2017；Regente等人,J of Exp.Biol.[实验生物学杂志]68(20):5485-5496,2017；Mu等人,Mol.Nutr.Food Res.[分子营养与食品研究],58,1561-1573,2014,和Regente等人,FEBS Letters.[欧洲生化学会联合会快报]583:3363-3366,2009，将其中每个通过引用并入本文。
在一些情况下，可以通过包括以下步骤的方法从植物中分离出多个PMP：(a)提供来自植物或其一部分的初始样品，其中该植物或其一部分包含EV；(b)从该初始样品中分离出粗PMP级分，其中相对于在该初始样品中的水平，该粗PMP级分具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分(例如，降低至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、98％、99％、或100％的水平)；以及(c)纯化该粗PMP级分，从而产生多个纯PMP，其中相对于在该粗EV级分中的水平，该多个纯PMP具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分(例如，降低至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、98％、99％、或100％的水平)。
本文提供的PMP可以包含从多种植物中产生的植物EV或其节段、部分或提取物。可以从任何属植物(维管或非维管)中产生PMP，该任何属植物包括但不限于被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类、卷柏、木贼类植物、裸蕨植物、石松类植物、藻类(例如，单细胞或多细胞的，例如原始色素体生物)或苔藓植物。在某些情况下，PMP可以使用维管植物产生，该维管植物例如单子叶植物或双子叶植物或裸子植物。例如，PMP可以使用如下产生：苜蓿、苹果、拟南芥属、香蕉、大麦、芸苔属物种(例如，拟南芥(Arabidopsis thaliana)或欧洲油菜(Brassica napus))、卡诺拉油菜、蓖麻籽、菊苣、菊花、三叶草、可可、咖啡、棉花、棉籽、玉米、海甘蓝、蔓越莓、黄瓜、石斛兰、薯蓣、桉树、羊茅草、亚麻、唐菖蒲、百合科、亚麻籽、粟、甜瓜、芥菜、燕麦、油棕、油菜、番木瓜、花生、菠萝、观赏植物、菜豆、马铃薯、油菜籽、水稻、黑麦、黑麦草、红花、芝麻、高粱、大豆、甜菜、甘蔗、向日葵、草莓、烟草、番茄、草皮草、小麦或蔬菜作物(诸如莴苣、芹菜、西兰花、花椰菜、葫芦)；水果树和坚果树，诸如苹果、梨、桃、橙子、葡萄柚、柠檬、酸橙、扁桃、山核桃、胡桃、榛子；藤本植物，诸如葡萄、猕猴桃、蛇麻子；水果灌木和悬钩子，诸如覆盆子、黑莓、醋栗；林木，诸如水曲柳、松树、冷杉、枫树、橡树、栗树、杨树(popular)；与苜蓿、卡诺拉油菜、蓖麻籽、玉米、棉花、海甘蓝、亚麻、亚麻籽、芥菜、油棕、油菜、花生、马铃薯、水稻、红花、芝麻、大豆、甜菜、向日葵、烟草、番茄、或小麦。
PMP可以使用如下产生：整株植物(例如，整个莲座丛或幼苗)或可替代地产自一种或多种植物部分(例如，叶、种子、根、果实、营养部分、花粉、韧皮部汁液、或木质部汁液)。例如，PMP可以使用如下产生：芽营养器官/结构(例如，叶、茎、或块茎)、根、花和花器官/结构(例如，花粉、苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药、或胚珠)、种子(包括胚、胚乳、或胚胎)、果实(成熟的子房)、汁液(例如，韧皮部或木质部汁液)、植物组织(例如，维管组织、基本组织、肿瘤组织等)、和细胞(例如，单细胞、原生质体、胚、愈伤组织、保卫细胞、卵细胞等)、或其子代。例如，分离步骤可以涉及(a)提供植物或其一部分。在一些实例中，植物部分是拟南芥属叶。植物可以处在任何发育阶段。例如，PMP可以使用幼苗产生，例如1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、或8周龄幼苗(例如，拟南芥属幼苗)。其他示例性PMP可以包括使用根(例如，姜根)、果汁(例如，葡萄柚汁)、蔬菜(例如，西兰花)、花粉(例如，橄榄花粉)、韧皮部汁液(例如，拟南芥属韧皮部汁液)、或木质部汁液(例如，番茄植物木质部汁液)产生的PMP。
PMP可以通过多种方法使用植物或其一部分产生。允许释放植物的含有EV的质外体级分、或含有包含分泌的EV的PMP的其他细胞外级分(例如，细胞培养基)的任何方法适用于本发明的方法。EV可以通过破坏性(例如，研磨或共混植物或任何植物部分)或非破坏性(洗涤或真空渗透植物或任何植物部分)方法从植物或植物部分中分离。例如，可以将该植物或其一部分真空渗透、研磨、共混或其组合，以从该植物或植物部分中分离EV，从而产生PMP。例如，分离步骤可涉及真空渗透植物(例如，用囊泡分离缓冲液)以释放和收集质外体级分。可替代地，分离步骤可以涉及将植物研磨或共混以释放EV，从而产生PMP。
在分离植物EV(从而产生PMP)后，可以将PMP分离或收集到粗PMP级分(例如，质外体级分)中。例如，分离步骤可以涉及使用离心(例如，差异离心或超速离心)和/或过滤将多个PMP分离到粗PMP级分中，以从大污染物(包括植物组织碎片或植物细胞)中分离含有植物PMP的级分。因此，与来自植物或植物部分的初始样品相比，该粗PMP级分将具有降低数量的大污染物，包括植物组织碎片或植物细胞。取决于所使用的方法，与来自植物或植物部分的初始样品相比，该粗PMP级分可另外地包含降低水平的植物细胞器(例如，核、线粒体或叶绿体)。
在一些情况下，分离步骤可以涉及使用离心(例如，差异离心或超速离心)和/或过滤将多个PMP分离到粗PMP级分中，以从植物细胞或细胞碎片中分离含有PMP的级分。在此类情况下，与来自源植物或植物部分的初始样品相比，该粗PMP级分将具有降低数量的植物细胞或细胞碎片。
可以通过另外的纯化方法进一步纯化该粗PMP级分，以产生多个纯PMP。例如，可以通过超速离心，例如使用密度梯度(碘克沙醇或蔗糖)和/或使用除去聚集的组分的其他方法(例如，沉淀或尺寸排阻色谱法)，将粗PMP级分与其他植物组分分离。相对于在较早分离步骤中产生的一个或多个级分、或相对于预先确定的阈值水平(例如，商业释放规格)，所得的纯PMP可以具有降低水平的来自源植物的污染物或其他不希望的组分(例如，一种或多种非PMP组分，诸如蛋白质聚集体、核酸聚集体、蛋白质-核酸聚集体、游离脂蛋白、脂质-蛋白质结构)、核、细胞壁组分、细胞的细胞器、或其组合)。例如，相对于在初始样品中的水平，纯PMP可以具有降低水平(例如，降低约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％；或降低约2x倍、4x倍、5x倍、10x倍、20x倍、25x倍、50x倍、75x倍、100x倍、或大于100x倍)的植物细胞器或细胞壁组分。在一些情况下，纯PMP基本上不含(例如，具有不可检测水平的)一种或多种非PMP组分，诸如蛋白质聚集体、核酸聚集体、蛋白质-核酸聚集体、游离脂蛋白、脂质-蛋白质结构)、核、细胞壁组分、细胞的细胞器、或其组合。释放和分离步骤的进一步实例可以在实例1中发现。PMP的浓度可以是例如1x 109、5x109、1x 1010、5x 1010、5x 1010、1x 1011、2x 1011、3x 1011、4x 1011、5x 1011、6x 1011、7x 1011、8x 1011、9x 1011、1x 1012、2x 1012、3x 1012、4x 1012、5x 1012、6x 1012、7x 1012、8x 1012、9x1012、1x 1013、或大于1x 1013PMP/mL。
例如，可以从PMP中除去蛋白质聚集体。例如，可以使PMP经受一定范围的pH(例如，如使用pH探针所测量的)，以沉淀出溶液中的蛋白质聚集体。可以通过添加例如氢氧化钠或盐酸将pH调节至例如pH 3、pH 5、pH 7、pH 9或pH 11。一旦溶液处在指定的pH，就可以将其过滤以除去微粒。可替代地，可以使用诸如Polymin-P或Praestol 2640的带电聚合物的添加将PMP絮凝。简而言之，将Polymin-P或Praestol2640添加到溶液中并且与叶轮混合。然后可以将溶液过滤以除去微粒。可替代地，可以通过增加盐浓度来增溶聚集体。例如，可以将NaCl添加到PMP中，直到其处于例如1mol/L。然后可以将溶液过滤以分离PMP。可替代地，通过增加温度来增溶聚集体。例如，可以将PMP在混合下加热直到溶液达到例如50℃的均匀温度持续5分钟。然后可以将PMP混合物过滤以分离PMP。可替代地，可溶性污染物可以通过尺寸排阻色谱柱根据标准程序从PMP溶液中分离，其中PMP洗脱在第一级分中，而蛋白质和核糖核蛋白以及一些脂蛋白则随后洗脱。蛋白质聚集体去除的效率可以通过在除去蛋白质聚集体之前和之后经由BCA/Bradford蛋白质定量测量和比较蛋白质浓度来确定。
本文描述的任何生产方法可以补充有本领域已知的任何定量或定性方法，以在生产过程的任何步骤中表征或鉴定PMP。可以通过估计PMP产率、PMP浓度、PMP纯度、PMP组成、或PMP尺寸的多种分析方法来表征PMP。可以通过本领域中已知的能够进行PMP的可视化、定量、或定性表征(例如，组成鉴定)的许多方法，诸如显微术(例如，透射电子显微术)、动态光散射、纳米颗粒跟踪、光谱法(例如，傅立叶变换红外分析)、或质谱法(蛋白质和脂质分析)，来评估PMP。在某些情况下，可以使用方法(例如，质谱法)来鉴定PMP上存在的植物EV标记物，诸如附录中披露的标记物。为了帮助分析和表征PMP级分，可以另外对PMP进行标记或染色。例如，可以将PMP用3,3’-二己基氧杂羰花青碘化物(DIOC6)(荧光亲脂性染料，PKH67(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))；Alexa
Figure BDA0002947982740000301
488(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))、或DyLightTM800(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))染色。在没有复杂形式的纳米颗粒追踪的情况下，这种相对简单的方法定量总膜含量并且可以用于间接测量PMP的浓度(Rutter和Innes,Plant Physiol.[植物生理学]173(1):728-741,2017；Rutter等人,Bio.Protoc.[生物方案]7(17):e2533,2017)。为了更精确的测量以及为了评价PMP的尺寸分布，可以使用纳米颗粒跟踪。
在生产过程中，可以任选地制备PMP，使得相对于对照或初始样品中的EV水平，PMP具有增加的浓度(例如，增加约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％；或增加约2x倍、4x倍、5x倍、10x倍、20x倍、25x倍、50x倍、75x倍、100x倍、或大于100x倍)。PMP可以占PMP组合物的约0.1％至约100％，诸如约0.01％至约100％、约1％至约99.9％、约0.1％至约10％、约1％至约25％、约10％至约50％、约50％至约99％、或约75％至约100％中的任一者。在一些情况下，组合物包含至少0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或更多中的任一者的PMP，例如，如通过wt/vol百分比PMP蛋白组成和/或百分比脂质组成(例如，通过测量荧光标记的脂质)测量；参见例如实例3)。在一些情况下，浓缩的药剂用作商业产品，例如最终使用者可以使用稀释的药剂，该稀释的药剂具有显著较低浓度的活性成分。在一些实施例中，将组合物配制成农业浓缩物配制品，例如超低体积浓缩物配制品。
如实例1所展示，PMP可以使用多种植物或其部分(例如，叶质外体、种子质外体、根、果实、营养部分、花粉、韧皮部、或木质部汁液)产生。例如，PMP可以从植物的质外体级分，诸如叶的质外体(例如，拟南芥叶的质外体)或种子的质外体(例如，向日葵种子的质外体)释放。其他示例性PMP使用根(例如，姜根)、果汁(例如，葡萄柚汁)、蔬菜(例如，西兰花)、花粉(例如，橄榄花粉)、韧皮部汁液(例如，拟南芥属韧皮部汁液)、木质部汁液(例如，番茄植物木质部汁液)、或细胞培养物上清液(例如，BY2烟草细胞培养物上清液)产生。此实例进一步证明了从这些不同的植物源中生产PMP。
如实例2所展示，可以通过多种方法(例如通过使用密度梯度(碘克沙醇或蔗糖)结合超速离心和/或除去聚集的污染物的方法(例如，沉淀或尺寸排阻色谱法))纯化PMP。例如，实例2展示了通过实例1中概述的分离步骤获得的PMP的纯化。此外，PMP可以根据实例3中展示的方法来表征。
可以在使用之前修饰PMP，如本文进一步概述。
B.修饰的PMP和PMP组合物
生产PMP后，可以通过负载异源剂(例如，植物细胞渗透剂)或与其一起配制来修饰PMP，相对于未修饰的PMP，该异源剂能够增加细胞摄取(例如，动物细胞摄取(例如，哺乳动物细胞摄取，如人细胞摄取))、植物细胞摄取、细菌细胞摄取或真菌细胞摄取)。例如，修饰的PMP可以包括(例如，负载，例如包封或缀合至)以下或与以下一起配制(例如，悬浮或重悬于包含以下的溶液中)：细胞渗透剂，例如酶、洗涤剂、离子、氟液体或两性离子液体或脂质。
在一些情况下，细胞渗透剂是酶。例如，酶可以是能够降解细胞壁(例如，动物细胞壁、植物细胞壁、细菌细胞壁或真菌细胞壁)的动物、细菌、真菌、原生动物、哺乳动物或植物酶。
在一些情况下，酶是能够降解植物细胞壁的细菌酶。在一些情况下，酶与能够降解植物细胞壁的细菌酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。在一些情况下，酶是能够降解植物细胞壁的真菌酶。在一些情况下，酶与能够降解植物细胞壁的真菌酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。在一些情况下，酶是能够降解植物细胞壁的植物酶。在一些情况下，细胞壁降解酶与能够降解植物细胞壁的植物酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。在一些情况下，酶是能够降解植物细胞壁的原生动物酶。在一些情况下，细胞壁降解酶与能够降解植物细胞壁的原生动物酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。
在一些情况下，酶是能够降解细菌细胞壁的细菌酶。在一些情况下，酶与能够降解细菌细胞壁的细菌酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。在一些情况下，酶是能够降解细菌细胞壁的真菌酶。在一些情况下，酶与能够降解细菌细胞壁的真菌酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。在一些情况下，酶是能够降解细菌细胞壁的植物酶。在一些情况下，细胞壁降解酶与能够降解细菌细胞壁的植物酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。在一些情况下，酶是能够降解细菌细胞壁的原生动物酶。在一些情况下，细胞壁降解酶与能够降解细菌细胞壁的原生动物酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。
在一些情况下，酶是能够降解真菌细胞壁的细菌酶。在一些情况下，酶与能够降解真菌细胞壁的细菌酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。在一些情况下，酶是能够降解真菌细胞壁的真菌酶。在一些情况下，酶与能够降解真菌细胞壁的真菌酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。在一些情况下，酶是能够降解真菌细胞壁的植物酶。在一些情况下，细胞壁降解酶与能够降解真菌细胞壁的植物酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。在一些情况下，酶是能够降解真菌细胞壁的原生动物酶。在一些情况下，细胞壁降解酶与能够降解真菌细胞壁的原生动物酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。
在一些情况下，酶是能够降解动物细胞外基质(例如，哺乳动物细胞外基质，例如人细胞外基质)的动物酶。
在一些情况下，酶是纤维素酶。例如，纤维素酶可以与细菌纤维素酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。在一些情况下，纤维素酶与真菌纤维素酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。在一些情况下，纤维素酶与原生动物纤维素酶的全部或部分具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。
在一些情况下，细胞渗透剂是洗涤剂。在一些实施例中，洗涤剂是皂苷或3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)。
在一些情况下，细胞壁渗透剂是离子液体。在一些实施例中，离子液体是1-乙基-3-甲基咪唑鎓乙酸酯(EMIM乙酸酯)。在其他实施例中，离子液体是BMIM乙酸盐、HMIM乙酸盐、MMIM乙酸盐或烯丙基MIM乙酸盐。
在一些情况下，细胞渗透剂是氟液体。在一些实施例中，氟液体是全氟辛烷。在其他实施例中，氟液体是全氟辛烷或全氟(甲基十氢化萘)。
在一些情况下，细胞渗透剂是阳离子脂质。在一些实施例中，阳离子脂质是DC-胆固醇或二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)。
在一些情况下，细胞渗透剂是可离子化的脂质。在一些实施例中，可离子化的脂质是1,1‘-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)或(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯，DLin-MC3-DMA(MC3)。在一些情况下，PMP包含至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或多于90％的可离子化的脂质(例如，C12-200或MC3)。
在一些情况下，细胞渗透剂是两性离子脂质。在一些实施例中，两性离子脂质是1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)或1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DEPC)。在一些情况下，PMP包含至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或多于90％的两性离子脂质(例如，DOPC或DEPC)。
药剂可以增加PMP的整体摄取或可以增加PMP的部分或组分(诸如由PMP携带的异源功能剂(例如，异源农业药剂(例如，杀有害生物剂、肥料剂、除草剂、植物修饰剂)或异源治疗剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂或昆虫驱避剂))的摄取。细胞摄取(例如，植物细胞摄取、细菌细胞摄取或真菌细胞摄取)程度的增加可以取决于将组合物递送至的植物或植物部分、PMP配制品、和对PMP进行的其他修饰。例如，相对于未修饰的PMP，修饰的PMP可以具有至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％增加的细胞摄取(例如，动物细胞摄取、植物细胞摄取、细菌细胞摄取、或真菌细胞摄取)。在一些情况下，增加的细胞摄取(例如，动物细胞摄取、植物细胞摄取、细菌细胞摄取、或真菌细胞摄取)是相对于未修饰的PMP增加至少2x倍、4x倍、5x倍、10x倍、100x倍、或1000x倍的细胞摄取。
在另一个方面，这些PMP可以将PMP用其他组分(例如脂质，例如固醇，如胆固醇；或小分子)进一步修饰，以进一步改变PMP的功能和结构特征。例如，可以将PMP用稳定分子进一步修饰，这些稳定分子增加PMP的稳定性(例如，在室温下持续至少一天和/或在4℃下稳定至少一周)。
可以通过本领域已知的多种方法来测量修饰的PMP的细胞摄取。例如，可以用能在分离的细胞中检测到的标记物(例如，荧光标记物)对PMP或其组分进行标记，以确认摄取。例如，可以基于适应度(例如包含处理的细胞的动物、植物、细菌或真菌的适应度)的测量来检测细胞摄取。例如，本发明组合物和方法的功效可以通过比较用本发明修饰的PMP进行治疗相对于用缺少修饰的PMP的组合物进行治疗的生物体适应度变化来确定。
C.植物EV标记物
本发明的组合物和方法的PMP可以具有一系列标记物，这些标记物将PMP鉴定为是使用植物EV产生的和/或包括其节段、部分或提取物。如本文所用，术语“植物EV标记物”是指与植物天然缔合并且在植物体内掺入植物EV中或上的组分，诸如植物蛋白、植物核酸、植物小分子、植物脂质、或其组合。植物EV标记物的实例可以在例如以下中发现：Rutter和Innes,Plant Physiol.[植物生理学]173(1):728-741,2017；Raimondo等人,Oncotarget.[肿瘤靶标]6(23):19514,2015；Ju等人,Mol.Therapy[分子疗法]21(7):1345-1357,2013；Wang等人,Molecular Therapy[分子疗法]22(3):522-534,2014；和Regente等人,J ofExp.Biol.[实验生物学杂志]68(20):5485-5496,2017；将其中每个通过引用并入本文。植物EV标记物的另外实例在附录中列出并且在本文中进一步概述。
在一些情况下，植物EV标记物可以包括植物脂质。可以在PMP中发现的植物脂质标记物的实例包括植物固醇、菜油固醇、β-谷固醇、豆固醇、燕麦固醇(avenasterol)、糖基肌醇磷酰基神经酰胺(GIPC)、糖脂(例如，单半乳糖基二酰基甘油(MGDG)或二半乳糖基二酰基甘油(DGDG))、或其组合。例如，PMP可以包括GIPC，GIPC表示植物中的主要鞘脂并且是植物中最丰富的膜脂质之一。其他植物EV标记物可以包括响应于非生物胁迫原或生物胁迫原(例如，细菌感染或真菌感染)而在植物中积累的脂质，诸如磷脂酸(PA)或磷脂酰肌醇-4-磷酸酯(PI4P)。
可替代地，植物EV标记物可以包括植物蛋白。在一些情况下，蛋白质植物EV标记物可以是植物天然产生的抗微生物蛋白，包括植物响应于非生物胁迫原或生物胁迫原(例如，细菌感染或真菌感染)而分泌的防御蛋白。植物病原体防御蛋白包括可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感性因子缔合蛋白受体蛋白(SNARE)的蛋白质(例如，突触融合蛋白-121(SYP121；GenBank登录号：NP_187788.1或NP_974288.1)、渗透(Penetration)1(PEN1；GenBank登录号：NP_567462.1))或ABC转运蛋白渗透3(PEN3；GenBank登录号：NP_191283.2)。植物EV标记物的其他实例包括促进在植物中长距离转运RNA的蛋白质，包括韧皮部蛋白(例如，韧皮部蛋白2-A1(PP2-A1)，GenBank登录号：NP_193719.1)、钙依赖性脂质结合蛋白、或凝集素(例如，木菠萝相关凝集素，例如向日葵(Helianthus annuus)木菠萝(Helja；GenBank：AHZ86978.1)。例如，RNA结合蛋白可以是富含甘氨酸的RNA结合蛋白-7(GRP7；GenBank登录号：NP_179760.1)。另外，在一些情况下，调节胞间连丝功能的蛋白质可以在植物EV(包括蛋白质，诸如Synap-Totgamin AA(GenBank登录号：NP_565495.1))中发现。在一些情况下，植物EV标记物可以包括参与脂质代谢的蛋白质，诸如磷脂酶C或磷脂酶D。在一些情况下，植物蛋白EV标记物是植物中的细胞运输蛋白。在植物EV标记物是蛋白质的某些情况下，蛋白质标记物可以缺少典型地与分泌的蛋白质相关的信号肽。非常规的分泌蛋白似乎共有若干个共同特征，如(i)缺少前导序列，(ii)缺少对ER或高尔基体具有特异性的翻译后修饰(PTM)，和/或(iii)不受布雷菲德菌素A影响的分泌，布雷菲德菌素A阻断经典的ER/高尔基体依赖性分泌途径。本领域技术人员可以使用公众可免费获取的多种工具(例如，SecretomeP数据库；SUBA3(拟南芥属蛋白的亚细胞定位数据库(SUBcellular localization database forArabidopsis proteins)))来评估信号序列的蛋白质或其缺少。
在植物EV标记物是蛋白质的某些情况下，蛋白质可以具有与植物EV标记物(诸如附录中列出的植物EV标记物)具有至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。例如，蛋白质可以具有与来自拟南芥的PEN1(GenBank登录号：NP_567462.1)具有至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，植物EV标记物包括在植物中编码的核酸，例如植物RNA、植物DNA、或植物PNA。例如，PMP可以包括由植物编码的dsRNA、mRNA、病毒RNA、微小RNA(miRNA)、或小干扰RNA(siRNA)。在一些情况下，核酸可以是与促进在植物中长距离转运RNA的蛋白质相关的核酸，如本文所讨论。在一些情况下，核酸植物EV标记物可以是参与宿主诱导的基因沉默(HIGS)的核酸植物EV标记物，HIGS是植物沉默植物有害生物(例如，病原体，诸如真菌)的外来转录物的过程。例如，核酸可以是使细菌基因或真菌基因沉默的核酸。在一些情况下，核酸可以是微小RNA，诸如miR159或miR166，该微小RNA靶向真菌病原体(例如，大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae))中的基因。在一些情况下，蛋白质可以是参与携带植物防御化合物的蛋白质，诸如参与芥子油苷(GSL)转运和代谢的蛋白质，包括芥子油苷转运蛋白-1-1(GTR1；GenBank登录号：NP_566896.2)、芥子油苷转运蛋白-2(GTR2；NP_201074.1)、或环硫特异性(Epithiospecific)修饰子1(ESM1；NP_188037.1)。
在植物EV标记物是核酸的情况下，核酸可以具有与植物EV标记物具有至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、或100％序列同一性的核苷酸序列，例如诸如编码附录中列出的植物EV标记物的那些。例如，核酸可以具有与miR159或miR166具有至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、或100％序列同一性的多核苷酸序列。
在一些情况下，植物EV标记物包括由植物产生的化合物。例如，化合物可以是响应于非生物胁迫原或生物胁迫原而产生的防御化合物，诸如次生代谢物。在PMP中发现的一种此类次生代谢物是芥子油苷(GSL)，GSL是主要在十字花科(Brassicaceae)植物中发现的含有氮和硫的次生代谢物。其他次生代谢物可以包括化感物质。
在一些情况下，基于典型地不是由植物产生的但通常与其他生物体相关的(例如，动物EV、细菌EV、或真菌EV的标记物)某些标记物(例如，脂质、多肽、或多核苷酸)的缺少，PMP也可以被鉴定为是使用植物EV产生的。例如，在一些情况下，PMP缺少典型地在动物EV、细菌EV或真菌EV中发现的脂质。在一些情况下，PMP缺少作为动物EV的典型特征的脂质(例如，鞘磷脂)。在一些情况下，PMP不含作为细菌EV或细菌膜的典型特征的脂质(例如，LPS)。在一些情况下，PMP缺少作为真菌膜的典型特征的脂质(例如，麦角固醇)。
可以使用本领域已知的能够鉴定小分子(例如，质谱法、质谱分析法)、脂质(例如，质谱法、质谱分析法)、蛋白质(例如，质谱法、免疫印迹法)、或核酸(例如，PCR分析)的任何方法来鉴定植物EV标记物。在一些情况下，本文描述的PMP组合物包含可检测量(例如，预定阈值量)的本文描述的植物EV标记物。
D.药剂的负载
PMP可以被修饰为包含异源功能剂，例如，细胞渗透剂和/或异源农业药剂(例如，杀有害生物剂、肥料剂、除草剂、植物修饰剂)、异源治疗剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂或昆虫驱避剂))，诸如本文描述的那些。PMP可以通过多种手段携带此类药剂或与其缔合，以使这些药剂能够递送至靶生物体(例如，靶动物、靶植物、靶细菌、或靶真菌)，例如通过包封该药剂、将组分结合在脂质双层结构中、或将组分(例如，通过缀合)与PMP的脂质双层结构的表面缔合。在一些情况下，PMP配制品包含异源功能剂(例如，细胞渗透剂)，如在本文部分IB中描述的。
可以通过本领域已知的允许直接或间接在PMP与药剂之间缔合的任何方法将异源功能剂结合或负载到PMP中或上。可以通过体内方法(例如，在植物体内，例如通过从包含异源剂的转基因植物中生产PMP)、或体外(例如，在组织培养物中或在细胞培养物中)、或体内和体外方法两者，将异源功能剂掺入PMP中。
在体内向PMP负载异源功能剂(例如，异源农业药剂(例如，杀有害生物剂、肥料剂、除草剂、植物修饰剂)或异源治疗剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂或昆虫驱避剂))的情况下，可使用已在植物体内负载的EV或其节段或部分、或含有EV的提取物产生PMP。植物体内方法包括在已遗传修饰为表达用于负载到EV中的异源功能剂的植物中表达异源功能剂(例如，异源农业药剂(例如，杀有害生物剂、肥料剂、除草剂、植物修饰剂)或异源治疗剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂或昆虫驱避剂))。在一些情况下，异源功能剂对植物是外源的。可替代地，异源功能剂可以天然发现于植物中，但被工程化为以相对于在非遗传修饰的植物中发现的其水平升高的水平表达。
在一些情况下，PMP可以体外负载。物质可以使用但不限于物理、化学和/或生物学方法(例如，在组织培养物中或在细胞培养物中)负载到PMP上或中(例如，可以被PMP包封)。例如，可以通过电穿孔、超声处理、被动扩散、搅拌、脂质提取、或挤出中的一种或多种将异源功能剂引入到PMP中。可以使用多种方法来评价负载的PMP，以确认负载的药剂的存在或水平，这些方法诸如HPLC(例如，用于评价小分子)、免疫印迹法(例如，用于评价蛋白质)；和/或定量PCR(例如，用于评价核苷酸)。然而，本领域技术人员应当认识到，将感兴趣的物质负载到PMP中不限于以上展示的方法。
在一些情况下，可以将异源功能剂与PMP缀合，其中异源功能剂间接或直接地连接或接连至PMP。例如，可以将一种或多种异源功能剂化学连接至PMP，使得该一种或多种异源功能剂直接接连(例如，通过共价键或离子键)至PMP的脂质双层。在一些情况下，各种异源功能剂与PMP的缀合可以通过首先将一种或多种异源功能剂与适当的交联剂(例如，N-乙基碳二亚胺(“EDC”)，其通常用作与伯胺进行酰胺键合的羧基活化剂并且还与磷酸酯基团反应)在合适的溶剂中混合来实现。在足以允许异源功能剂附接至交联剂的孵育时间段后，然后可以将交联剂/异源功能剂混合物与PMP键合，并且在另一个孵育时间段后，经受蔗糖梯度(例如，和8％、30％、45％、和60％蔗糖梯度)以将游离的异源功能剂和游离的PMP与缀合至PMP的异源功能剂分离。作为将混合物与蔗糖梯度混合以及伴随的离心步骤的一部分，与异源功能剂缀合的PMP然后在蔗糖梯度中作为条带被看见，使得然后可以将缀合的PMP收集、洗涤并且溶解于如本文描述使用的合适溶液中。
在一些情况下，在将PMP递送至例如植物之前和之后，PMP与异源功能剂稳定缔合。在其他情况下，PMP与异源功能剂缔合，使得在将PMP递送至例如植物之后，该异源功能剂变成与PMP解离的。
PMP可以负载各种浓度的异源功能剂或可以将PMP组合物与各种浓度的异源功能剂一起配制，取决于特定的药剂或用途。例如，在一些情况下，负载PMP或配制PMP组合物，使得本文披露的PMP组合物包含约0.001、0.01、0.1、1.0、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、或95(或在约0.001与95之间的任何范围)或更大wt％的异源功能剂。在一些情况下，负载PMP或配制PMP组合物，使得PMP组合物包含约95、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1.0、0.1、0.01、0.001(或在约95与0.001之间的任何范围)或更小wt％的异源功能剂。例如，PMP组合物可以包含约0.001至约0.01wt％、约0.01至约0.1wt％、约0.1至约1wt％、约1至约5wt％、或约5至约10wt％、约10至约20wt％的异源功能剂。在一些情况下，PMP可以负载约1、5、10、50、100、200、或500、1,000、2,000(或在约1与2,000之间的任何范围)或更大μg/ml的异源功能剂，或将PMP组合物与其一起配制。本发明的PMP可以负载约2,000、1,000、500、200、100、50、10、5、1(或在约2,000与1之间的任何范围)或更小μg/ml的异源功能剂，或可以将PMP组合物与其一起配制。
在一些情况下，负载PMP或配制PMP组合物，使得本文披露的PMP组合物包含至少0.001wt％、至少0.01wt％、至少0.1wt％、至少1.0wt％、至少2wt％、至少3wt％、至少4wt％、至少5wt％、至少6wt％、至少7wt％、至少8wt％、至少9wt％、至少10wt％、至少15wt％、至少20wt％、至少30wt％、至少40wt％、至少50wt％、至少60wt％、至少70wt％、至少80wt％、至少90wt％、或至少95wt％的异源功能剂。在一些情况下，PMP可以负载至少1μg/ml、至少5μg/ml、至少10μg/ml、至少50μg/ml、至少100μg/ml、至少200μg/ml、至少500μg/ml、至少1,000μg/ml、至少2,000μg/ml的异源功能剂，或可以将PMP组合物与其一起配制。
在一些情况下，通过将PMP悬浮在包含异源功能剂或由其组成的溶液中，例如，通过剧烈混合悬浮或重悬PMP，将PMP组合物与异源功能剂一起配制。异源功能剂(例如，细胞渗透剂，例如酶、洗涤剂、离子、氟液体或两性离子液体或脂质)可包含，例如，少于1％或至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的溶液。
可以负载到PMP中的特定异源功能剂的实例在标题为“异源功能剂”的部分中进一步概述。
E.ζ电位
例如，PMP组合物可具有例如大于-30mV(在没有货物的情况下)、大于-20mV、大于-5mV、大于0mV、或约30mV(在没有货物的情况下)的ζ电位。在一些实例中，PMP组合物具有负ζ电位，例如小于0mV、小于-10mV、小于-20mV、小于-30mV、小于-40mV或小于-50mV的ζ电位(在没有货物的情况下)。在一些实例中，PMP组合物具有正ζ电位，例如大于0mV、大于10mV、大于20mV、大于30mV、大于40mV或大于50mV的ζ电位(在没有货物的情况下)。在一些实例中，PMP组合物具有约0的ζ电位。
可使用本领域已知的任何方法测量PMP组合物的ζ电位。ζ电位通常是间接测量的，例如，使用本领域已知的方法和技术获得的数据(例如，电泳迁移率或动态电泳迁移率)，使用理论模型计算。电泳迁移率典型地使用微量电泳、电泳光散射或可调电阻式脉冲传感(tunable resistive pulse sensing)来测量。电泳光散射是基于动态光散射。典型地，ζ电位可从动态光散射(DLS)测量、也称为光子相关光谱法或准弹性光散射获取。
F.配制品
i.农业配制品
为了允许易于应用、处理、转运、储存和有效活性，可以将PMP(例如，如本文描述的修饰的PMP)与其他物质一起配制。可以将PMP配制成例如诱饵、浓缩乳液、粉剂、可乳化浓缩物、熏剂、凝胶、颗粒剂、微胶囊、种子处理剂、悬浮液浓缩物、悬乳剂、片剂、水溶性液体、水可分散颗粒剂或干燥可流动剂、可湿性粉剂、和超低容量溶液。关于配制品类型的进一步信息，参见“Catalogue of Pesticide Formulation Types and International CodingSystem[杀有害生物剂配制品类型目录和国际编码系统]”Technical Monograph[技术专论]n°2,第5版,CropLife International[国际作物生命协会](2002)。
PMP组合物可以以从此类药剂的浓缩制配制品制备的水性悬浮液或乳液的形式应用。此类水溶性、水可悬浮性、或可乳化配制品是固体，通常称为可湿性粉剂或水可分散颗粒剂；或液体，通常称为可乳化浓缩物或水性悬浮液。可压实形成水可分散颗粒剂的可湿性粉剂包含PMP组合物、载体和表面活性剂的紧密混合物。载体通常选自绿坡缕石(attapulgite)粘土、蒙脱石(montmorillonite)粘土、硅藻土、或纯化硅酸盐。占可湿性粉剂的约0.5％至约10％的有效表面活性剂经发现于磺化木质素、缩合萘磺酸盐、萘磺酸盐、烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、和诸如烷基苯酚的环氧乙烷加合物的非离子表面活性剂。
可乳化浓缩物可以包含合适浓度的溶解于载体中的PMP(诸如从约50至约500克/升液体)，该载剂是水混溶性溶剂或水不可混溶性有机溶剂和乳化剂的混合物。可用的有机溶剂包括芳族化合物(尤其是二甲苯)和石油馏分(尤其是石油的高沸点萘和烯部分，诸如重芳族石脑油)。也可以使用其他有机溶剂，诸如包括松香衍生物的萜烯溶剂、诸如环己酮的脂族酮、和诸如2-乙氧基乙醇的复杂醇。用于可乳化浓缩物的合适乳化剂选自常规的阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂。
水性悬浮液包括水不溶性PMP组合物以按重量计从约5％至约50％的浓度分散在水性载体中的悬浮液。悬浮液通过以下方式制备：精细研磨组合物并且将其剧烈混合到由水和表面活性剂构成的载体中。还可以添加诸如无机盐和合成胶或天然胶的成分以增加水性载体的密度和粘度。
PMP组合物也可以以颗粒组合物的形式应用，这些颗粒组合物特别可用于应用于土壤。颗粒组合物通常含有按重量计从约0.5％至约10％的PMP组合物，该PMP组合物分散于包含粘土或类似物质的载体中。通常通过将配制品溶解于合适的溶剂中并且将其应用到已预先形成为在从约0.5mm至约3mm的适当粒度的颗粒载体中来制备此类组合物。也可以通过制造载体和化合物的粘团或糊剂并且挤压和干燥以获得所希望的颗粒粒度来配制此类组合物。
通过将呈粉末形式的PMP与合适的粉尘状农业载体(诸如高岭土、研磨的火山岩等)紧密混合来制备含有本发明的PMP配制品的粉剂。粉剂可以适当地含有从约1％至约10％的小包。它们可以以拌种的形式或以用喷粉机的叶面应用的形式来应用。
同样实用的是以在适当的有机溶剂(通常为石油，诸如广泛用于农业化学的喷淋油)中的溶液的形式应用本发明的配制品。
PMP也可以以气雾剂组合物的形式应用。在此类组合物中，小包溶解或分散于作为产生压力的推进剂混合物的载体中。将气雾剂组合物包装在通过雾化阀分配混合物的容器中。
另一个实施例是水包油乳液，其中该乳液包含各自具备层状液晶包衣并且分散在水相中的油性小珠，其中每个油性小珠包含至少一种具有农业活性的化合物并且单独地被单层状层或寡层状层包覆，该单层状层或寡层状层包含：(1)至少一种非离子亲脂性表面活性剂，(2)至少一种非离子亲水性表面活性剂，和(3)至少一种离子表面活性剂，其中这些小珠具有小于800纳米的平均粒径。在2007年2月1日披露的美国专利公开20070027034中披露了有关该实施例的更多信息。为了易于使用，此实施例将被称为“OIWE”。
另外，通常，当以上披露的分子用于配制品时，此类配制品还可以含有其他组分。这些组分包括但不限于(这是非详尽且非互相排他性列表)润湿剂、铺展剂、粘着剂、渗透剂、缓冲剂、螯合剂、减漂剂、相容剂、消泡剂、清洁剂、和乳化剂。接着描述数种组分。
润湿剂是当被添加到液体中时通过减小液体与它在上面铺展的表面之间的界面张力而增加液体的铺展或渗透能力的物质。润湿剂因两个主要功能而用于农业化学配制品：在加工和制造期间，增加粉末在水中润湿的速率以制造可溶性液体的浓缩物或悬浮液浓缩物；以及在将产品与水在喷洒罐中混合期间，减少可湿性粉剂的润湿时间并且改善水到水可分散颗粒剂中的渗透。用于可湿性粉剂、悬浮液浓缩物和水可分散颗粒剂配制品的润湿剂的实例是：月桂基硫酸钠；磺基琥珀酸二辛酯钠；烷基酚乙氧基化物；和脂族醇乙氧基化物。
分散剂是吸附于颗粒表面上并且有助于保持颗粒的分散状态并且防止其再聚集的物质。将分散剂添加到农业化学配制品中以促进在制造期间的分散和悬浮并且确保颗粒再分散于喷洒罐中的水中。它们广泛用于可湿性粉剂、悬浮液浓缩物、和水可分散颗粒剂。用作分散剂的表面活性剂具有强烈吸附于颗粒表面上并且对颗粒再聚集提供带电荷的壁垒或空间壁垒的能力。最常用的表面活性剂是阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、或两种类型的混合物。对于可湿性粉剂配制品，最常见的分散剂是木质素磺酸钠。对于悬浮液浓缩物，使用聚电解质(诸如萘磺酸钠甲醛缩合物)获得非常好的吸附和稳定。也使用三苯乙烯基酚乙氧基化物磷酸酯。诸如烷基芳基环氧乙烷缩合物和EO-PO嵌段共聚物的非离子表面活性剂有时与作为分散剂的阴离子表面活性剂组合用于悬浮液浓缩物。近年来，已开发出新型的非常高分子量的聚合物表面活性剂作为分散剂。它们具有非常长的疏水性“主链”和大量环氧乙烷链，这些环氧乙烷链形成“梳型”表面活性剂的“齿”。这些高分子量聚合物可以赋予悬浮液浓缩物非常好的长期稳定性，因为疏水性主链具有到颗粒表面上的许多锚点。用于农业化学配制品的分散剂的实例是：木质素磺酸钠；萘磺酸钠甲醛缩合物；三苯乙烯基酚乙氧基化物磷酸酯；脂族醇乙氧基化物；烷基乙氧基化物；EO-PO(环氧乙烷-环氧丙烷)嵌段共聚物；和接枝共聚物。
乳化剂是使一种液相的液滴在另一个液相中的悬浮液稳定的物质。在无乳化剂的情况下，可以将两种液体分成两种不可混溶性液相。最常用的乳化剂共混物含有具有十二个或更多个环氧乙烷单元的烷基酚或脂族醇和油溶性的十二烷基苯磺酸钙盐。从8至18的亲水亲油平衡(“HLB”)值将通常提供良好的稳定乳液。乳液稳定性有时可以通过添加少量EO-PO嵌段共聚物表面活性剂来改善。
增溶剂是将以高于临界胶束浓度的浓度在水中形成胶束的表面活性剂。这些胶束然后能够溶解或增溶胶束的疏水性部分内的水不溶性材料。通常用于增溶的表面活性剂的类型是非离子表面活性剂、脱水山梨糖醇单油酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯乙氧基化物、和油酸甲酯。
表面活性剂有时单独使用或与作为用于喷洒罐混合料的佐剂的其他添加剂(诸如矿物油或植物油)一起使用，以改善PMP组合物对于靶标的生物性能。用于生物增强的表面活性剂的类型通常取决于PMP组合物的性质和作用方式。然而，它们通常是非离子表面活性剂，诸如：烷基乙氧基化物；线性脂族醇乙氧基化物；脂族胺乙氧基化物。
农业配制品中的载体或稀释剂是添加到PMP组合物中以给出所希望的强度的产品的材料。载体通常是具有高吸收能力的材料，而稀释剂通常是具有低吸收能力的材料。载体和稀释剂用于粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂、和水可分散颗粒剂的配制。
有机溶剂主要用于配制可乳化浓缩物、水包油乳液、悬乳剂、和超低容量配制品，并且在较小程度上用于配制颗粒配制品。有时使用溶剂混合物。第一主组的溶剂是脂族石蜡油，诸如煤油或精制石蜡。第二主组(并且最常用的)包括芳族溶剂，诸如二甲苯和较高分子量的C9和C10芳族溶剂馏分。氯化烃可用作助溶剂以便当配制品乳化在水中时防止PMP组合物结晶。醇有时用作助溶剂以增加溶解能力。其他溶剂可以包括植物油、种子油、和植物油和种子油的酯。
增稠剂或胶凝剂主要用于配制悬浮液浓缩物、乳液和悬乳剂，以改变液体的流变学或流动特性以及防止分散的颗粒或液滴的分离和沉降。增稠剂、胶凝剂和防沉剂通常分成两个类别，即水不溶性微粒和水溶性聚合物。可以使用粘土和二氧化硅来生产悬浮液浓缩物配制品。这些类型的材料的实例包括但不限于蒙脱石、膨润土、硅酸镁铝、和绿坡缕石。水溶性多糖已被用作增稠胶凝剂多年。最常用的多醣类型是种子和海草的天然提取物或是纤维素的合成衍生物。这些类型的材料的实例包括但不限于瓜尔胶；刺槐豆胶；卡拉胶；藻酸酯；甲基纤维素；羧甲基纤维素钠(SCMC)；羟乙基纤维素(HEC)。其他类型的防沉剂基于改性淀粉、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇、和聚环氧乙烷。另一种良好的防沉剂是黄原胶。
微生物可以导致配制产品的腐败。因此，使用防腐剂来消除或减小其作用。此类药剂的实例包括但不限于：丙酸及其钠盐；山梨酸及其钠盐或钾盐；苯甲酸及其钠盐；对羟基苯甲酸钠盐；对羟基苯甲酸甲酯；和1,2-苯并噻唑啉-3-酮(BIT)。
表面活性剂的存在通常在生产中和在通过喷洒罐进行的应用中的混合操作期间导致基于水的配制品起泡。为了减少起泡的倾向，通常在生产阶段期间或在填充至瓶中之前添加消泡剂。通常，存在两种类型的消泡剂，即硅酮和非硅酮。硅酮通常是二甲基聚硅氧烷的水性乳液，而非硅酮消泡剂是水不溶性油(诸如辛醇和壬醇)或二氧化硅。在两种情况下，消泡剂的功能是使表面活性剂从空气-水界面移位。
“绿色”剂(例如，佐剂、表面活性剂、溶剂)可以减少作物保护配制品的整体环境足迹。绿色剂是可生物降解的并且通常源自天然和/或可持续源，例如植物源和动物源。具体实例是：植物油、种子油、及其酯，以及烷氧基化烷基聚葡萄糖苷。
在一些情况下，可以将PMP冷冻干燥或冻干。参见美国专利号4,311,712。PMP可以随后在与水或另一种液体接触后重构。可以将其他组分添加到冻干或重构的PMP中，例如其他异源功能剂、农业上可接受的载体、或根据本文描述的配制品的其他材料。
组合物的其他任选特征包括保护PMP组合物免受UV和/或酸性条件的载体或递送媒介物。在一些情况下，递送媒介物含有pH缓冲剂。在一些情况下，将组合物配制为具有在约4.5至约9.0的范围内的pH，包括例如范围在5.0至约8.0、约6.5至约7.5、或约6.5至约7.0中的任一者的pH。
关于农业配制品的进一步信息，参见D.A.Knowles编辑的“Chemistry andTechnology of Agrochemical Formulations[农业化学配制品的化学和技术]”,版权1998归属于Kluwer Academic Publishers[克鲁维尔学术出版社]。还参见A.S.Perry,I.Yamamoto,I.Ishaaya,和R.Perry的“Insecticides in Agriculture and Environment-Retrospects and Prospects[农业杀昆虫剂与环境-回顾与展望]”,版权1998归属于Springer-Verlag[施普林格出版社]。
ii.药物配制品
本文描述的修饰的PMP可配制成药物组合物，例如用于施用至动物(例如，人)。可以用药学上可接受的稀释剂、载体和/或赋形剂将药物组合物施用于动物(例如，人)。根据施用方式和剂量，将本文描述的方法的药物组合物配制成合适的药物组合物以允许容易的递送。根据需要，单剂量可以是单位剂量形式。
PMP组合物可以被配制用于例如口服施用、静脉内施用(例如，注射或输注)、或皮下施用于动物。对于可注射配制品，本领域已知各种有效的药物载体(参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践],第22版,(2012)和ASHP Handbook on Injectable Drugs[可注射药物的ASHP手册],第18版,(2014))。
本发明组合物中的药学上可接受的载体和赋形剂在使用的剂量和浓度下对受体无毒。可接受的载体和赋形剂可以包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、HEPES、和TAE；抗氧化剂，诸如抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂，诸如氯化六甲双铵、十八烷基二甲基苄基氯化铵、间苯二酚、和氯化苯甲烃铵；蛋白质，诸如人血清白蛋白、明胶、葡聚糖、和免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、和赖氨酸；以及碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、和山梨糖醇。可以根据常规药学实践来配制组合物。配制品中化合物的浓度将取决于许多因素而变化，这些因素包括待施用的活性剂(例如，PMP)的剂量以及施用途径。
为了口服施用于动物，PMP组合物可以以口服配制品的形式制备。口服使用的配制品可以包括片剂、囊片、胶囊、糖浆、或口服液体剂型，其含有与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的一种或多种活性成分。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂或填充剂(例如，蔗糖、山梨糖醇、糖、甘露醇、微晶纤维素、淀粉(包括马铃薯淀粉)、碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙、或磷酸钠)；制粒剂和崩解剂(例如，包括微晶纤维素的纤维素衍生物、包括马铃薯淀粉的淀粉、交联羧甲基纤维素钠、藻酸盐、或藻酸)；粘合剂(例如，蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、阿拉伯胶、海藻酸、海藻酸钠、明胶、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、硅酸铝镁、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、或聚乙二醇)；以及润滑剂、助流剂和抗粘剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油、或滑石)。其他药学上可接受的赋形剂可以是着色剂、调味剂、增塑剂、保湿剂、缓冲剂等。口服使用的配制品也可以提供在单位剂型中，作为可咀嚼片剂、非咀嚼片剂、囊片、胶囊(例如，作为硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂混合；或作为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质混合)。本文披露的组合物还可以进一步包含立即释放配制品、延长释放配制品、或延迟释放配制品。
对于肠胃外施用于动物，PMP组合物可以以液体溶液或悬浮液的形式配制，并且通过肠胃外途径(例如，皮下、静脉内、或肌内)施用。药物组合物可以配制用于注射或输注。用于肠胃外施用的药物组合物可以使用无菌溶液或任何药学上可接受的液体作为媒介物来配制。药学上可接受的媒介物包括但不限于无菌水、生理盐水、或细胞培养基(例如，杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(DMEM)、α-改良的伊格尔培养基(α-MEM)、F-12培养基)。配制方法是本领域已知的，参见例如Gibson(编辑)Pharmaceutical Preformulation and Formulation[药物预配制和配制](第2版)Taylor&Francis Group[泰勒弗朗西斯集团],CRC Press[CRC出版社](2009)。
II.异源功能剂
本文制造的PMP可以进一步包含异源功能剂，诸如，异源功能剂(例如，异源农业药剂(例如，杀有害生物剂、肥料剂、除草剂、植物修饰剂)或异源治疗剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂或昆虫驱避剂))。例如，PMP可以包封异源功能剂。可替代地，异源功能剂可以包埋在PMP的表面上或与其缀合。在一些情况下，PMP包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的异源功能剂。可在制造期间的任何步骤添加异源功能剂，以有效地将药剂引入制造的PMP中。
在某些情况下，可以修饰异源功能剂(例如，异源农业药剂(例如，杀有害生物剂、肥料剂、除草剂、植物修饰剂、异源核酸、异源多肽或异源小分子)或异源治疗剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂或昆虫驱避剂))。例如，修饰可以是化学修饰，例如缀合至标记，例如荧光标记物或放射性标记物。在其他实例中，修饰可以包括与如下部分缀合或操作性连接，该部分增强药剂(例如脂质、聚糖、聚合物(例如PEG)、阳离子部分)的稳定性、递送、靶向、生物利用度、或半衰期。
可负载到本文制造的PMP中的异源功能剂的实例概述在以下。
A.异源农业药剂
本文制造的PMP可包含异源农业药剂(例如，影响植物或与植物缔合的生物体并可负载到PMP中的药剂)，例如，杀有害生物剂、除草剂、肥料剂、或植物修饰剂。
例如，在一些情况下，PMP可包含杀有害生物剂。杀有害生物剂可以是抗真菌剂、抗细菌剂、杀昆虫剂、杀软体动物剂、杀线虫剂、杀病毒剂、或其组合。杀有害生物剂可以是化学剂，诸如本领域中熟知的那些。可替代地或另外地，杀有害生物剂可以是肽、多肽、核酸、多核苷酸、或小分子。杀有害生物剂可以是可以降低各种植物有害生物的适应度的药剂，或者可以是一种或多种特定靶植物有害生物(例如，特定物种或属的植物有害生物)的药剂。
在一些情况下，PMP可包含一种或多种异源肥料剂。异源肥料剂的实例包括植物营养素或植物生长调节剂，诸如本领域中熟知的那些。可替代地或另外地，肥料剂可以是可增加植物共生体适应度的肽、多肽、核酸或多核苷酸。肥料剂可以是可以增加各种植物或植物共生体的适应度的药剂，或者可以是一种或多种特定靶植物或植物共生体(例如，特定物种或属的植物或植物共生体)的药剂。
在其他情况下，PMP可包含一种或多种异源植物修饰剂。在一些情况下，植物修饰剂可包含肽或核酸。
i.抗细菌剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含抗细菌剂。在一些情况下，PMP组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的抗细菌剂。例如，抗细菌剂可以降低(例如，降低生长或杀死)细菌植物有害生物(例如，细菌植物病原体)的适应度。可以使包含如本文描述的抗生素的PMP组合物以一定量和一定时间与靶有害生物或其侵染的植物接触，该量和时间足以：(a)达到靶有害生物内或上抗生素浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和(b)降低靶有害生物的适应度。本文描述的抗细菌剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。
如本文所用，术语“抗细菌剂”是指杀死或抑制细菌(诸如植物病原体细菌)的生长、增殖、分裂、繁殖或扩散的材料，并且包括杀细菌剂(例如，消毒化合物、抗菌化合物、或抗生素)或抑细菌剂(例如，化合物或抗生素)。杀细菌抗生素杀死细菌，而抑细菌抗生素仅减缓其生长或繁殖。
杀细菌剂可以包括消毒剂、抗菌剂、或抗生素。最多使用的消毒剂可以包括：活性氯(即，次氯酸盐(例如，次氯酸钠)、氯胺、二氯异氰脲酸酯和三氯异氰脲酸酯、湿氯、二氧化氯等)；活性氧(过氧化物，诸如乙酸、过硫酸钾、过硼酸钠、过碳酸钠和尿素过水合物)；碘(碘聚维酮(聚维酮-碘、必妥碘(Betadine))；鲁哥氏溶液(Lugol’s solution)、碘酊、碘化非离子型表面活性剂)；浓缩醇(主要是乙醇、1-丙醇(也称为正丙醇)和2-丙醇(称为异丙醇)及其混合物；此外，使用2-苯氧基乙醇以及1-和2-苯氧基丙醇)；酚类物质(诸如苯酚(也称为石炭酸)，甲酚(与液体钾皂组合称为Lysole)，卤化(氯化、溴化)苯酚，诸如六氯酚、三氯生、三氯苯酚、三溴苯酚、五氯苯酚、Dibromol及其盐)；阳离子表面活性剂，诸如一些季铵阳离子(诸如氯化苯甲烃铵、十六烷基三甲基溴化铵或十六烷基三甲基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵、十六烷基吡啶鎓氯化物、苯乙铵氯化物)以及其他；非季铵盐化合物，诸如双氯苯双胍己烷(chlorhexidine)、glucoprotamine、奥替尼啶二盐酸盐等)；强氧化剂，诸如臭氧和高锰酸盐溶液；重金属及其盐，诸如胶质银、硝酸银、氯化汞、苯基汞盐、硫酸铜、氧化-氯化铜、氢氧化铜、辛酸铜、硫酸氯氧化铜、硫酸铜、五水硫酸铜等。重金属及其盐是最大毒性的且对环境有害的杀细菌剂，并且因此，其使用被强烈压制或取消；此外，还有适当浓缩的强酸(磷酸、硝酸、硫酸、氨基磺酸、甲苯磺酸)和碱(氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙)。
作为抗菌剂(即，可以在人体或动物体、皮肤、粘膜、伤口等上使用的杀菌剂)，可以在适当的条件(主要是浓度、pH、温度和对人/动物的毒性)下使用上述几种消毒剂。其中重要的是：适当稀释的氯制剂(即，达康氏溶液(Daquin’s solution)、0.5％次氯酸钠或次氯酸钾溶液(pH调节至pH 7-8)、或0.5％-1％苯磺酰氯胺钠盐溶液(氯胺B))；一些碘制剂，诸如呈各种盖仑制剂(软膏、溶液、伤口膏药)的碘聚维酮、在过去还有鲁哥氏溶液；作为尿素过水合物溶液和pH缓冲的0.1％-0.25％过乙酸溶液的过氧化物；主要用于皮肤抗菌的具有或不具有抗菌添加剂的醇；弱有机酸，诸如山梨酸、苯甲酸、乳酸和水杨酸；一些酚类化合物，诸如六氯酚、三氯生和Dibromol；以及阳离子活性化合物，诸如0.05％-0.5％苯甲烃铵、0.5％-4％双氯苯双胍己烷、0.1％-2％奥替尼啶溶液。
本文描述的PMP组合物可以包含抗生素。可以使用本领域已知的任何抗生素。抗生素通常根据其作用机制、化学结构或活性谱进行分类。
本文描述的抗生素可以靶向任何细菌的功能或生长过程，并且可以是抑细菌的(例如，减缓或阻止细菌生长)或杀细菌的(例如，杀死细菌)。在一些情况下，抗生素是杀细菌抗生素。在一些情况下，杀细菌抗生素是靶向细菌细胞壁的杀细菌抗生素(例如，青霉素和头孢菌素)；靶向细胞膜的杀细菌抗生素(例如，多粘菌素)；或者抑制必需细菌酶的杀细菌抗生素(例如，利福霉素、闰年霉素(lipiarmycins)、喹诺酮类和磺胺类)。在一些情况下，杀细菌抗生素是氨基糖苷类(例如，春雷霉素)。在一些情况下，抗生素是抑细菌抗生素。在一些情况下，抑细菌抗生素靶向蛋白质合成(例如，大环内酯类、林可胺类和四环素类)。本文可以使用的另外类的抗生素包括环脂肽(诸如达托霉素)、甘氨酰环素(如替加环素)、噁唑烷酮类(如利奈唑胺)、或闰年霉素(lipiarmycins)(如非达霉素)。抗生素的实例包括利福平、环丙沙星、强力霉素、氨比西林、和多粘菌素B。本文描述的抗生素可以具有任何水平的靶特异性(例如，窄谱或广谱)。在一些情况下，抗生素是窄谱抗生素，并且因此靶向特异性类型的细菌，诸如革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。可替代地，抗生素可以是靶向宽范围的细菌的广谱抗生素。
抗生素的其他非限制性实例发现于表1中。本领域技术人员应当认识到，组合物中每种抗生素的合适的浓度取决于诸如功效、抗生素的稳定性、不同抗生素的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
表1.抗生素的实例
Figure BDA0002947982740000511
ii.抗真菌剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含抗真菌剂。在一些情况下，PMP组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的抗真菌剂。例如，抗真菌剂可以降低(例如，降低生长或杀死)真菌植物有害生物的适应度。可以使包含如本文描述的抗真菌剂的PMP组合物以一定量和一定时间与靶真菌有害生物或被其侵染的植物接触，该量和时间足以：(a)达到靶真菌内或上抗生素浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和(b)降低靶真菌的适应度。本文描述的抗真菌剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。
如本文所用，术语“杀真菌剂(fungicide)”或“抗真菌剂(antifungal agent)”是指杀死或抑制真菌(诸如植物病原体真菌)的生长、增殖、分裂、繁殖或扩散的物质。商业上已生产了许多不同类型的抗真菌剂。抗真菌剂的非限制性实例包括：嘧菌酯、代森锰、丙硫菌唑、灭菌丹、戊唑醇、苯醚甲环唑、克菌丹、乙嘧酚磺酸酯、或乙膦酸-Al。其他示例性杀真菌剂包括但不限于嗜球果伞素、嘧菌酯、甲氧菌平、烯肟菌酯、氟嘧菌酯、醚菌酯-甲基、苯氧菌胺、啶氧菌酯、唑菌胺酯、三氟敏、肟醚菌胺、甲酰胺、甲酰苯胺、苯霜灵、精苯霜灵、麦锈灵、萎锈灵、灭锈胺、灭普宁、甲呋酰胺、环酰菌胺、福多宁、呋霜灵(furalaxyl)、二甲呋酰胺、呋吡菌胺、甲霜灵、精甲霜灵(metalaxyl-M)(mefenoxam)、呋菌胺、噻菌胺、呋酰胺(ofurace)、恶霜灵、氧化萎锈灵、吡噻菌胺、吡喃灵(pyracarbolid)、水杨酰苯胺、叶枯酞、噻呋酰胺、噻酰菌胺、N-联苯基酰胺、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、N-酰基吗啉(carboxylic acidmorpholide)、烯酰吗啉、氟吗啉、苯甲酰胺、氟联苯菌(flumetover)、氟啶酰菌胺(fluopicolid)(氟吡菌胺(picobenzamid))、苯酰菌胺、甲酰胺、环丙酰菌胺、双氯氰菌胺、双炔酰菌胺、硫硅菌胺、唑类、三唑、双苯三唑醇、溴菌唑、环丙唑醇、苯醚甲环唑、达克利、恩康唑、氟环唑、芬克座、氟硅唑、氟喹唑、粉唑醇、己唑醇、亚胺唑、环戊唑醇、叶菌唑、腈菌唑、戊菌唑、丙环唑、丙硫菌唑、硅氟唑、戊唑醇、四氟醚唑、唑菌醇、三唑酮、灭菌唑、咪唑、氰霜唑、抑霉唑、净种灵(pefurazoate)、咪鲜胺、氟菌唑、苯并咪唑、苯菌灵、多菌灵、呋喃基苯并咪唑(fuberidazole)、噻苯咪唑、噻唑菌胺、土菌灵(etridiazole)、恶霉灵、含氮杂环基化合物、吡啶、氟啶胺(fuazinam)、比芬诺、嘧啶、乙嘧酚磺酸酯、环丙嘧啶、嘧菌腙(ferimzone)、氯苯嘧啶醇、嘧菌胺(mepanipyrim)、氟苯嘧啶醇、嘧霉胺、哌嗪、嗪胺灵、吡咯、咯菌腈、拌种咯(fenpiclonil)、吗啉、aldimorph、吗菌灵(dodemorph)、丁苯吗啉、十三吗啉、二甲酰亚胺、异菌脲、速克灵、乙烯菌核利、活化酯-S-甲基、敌菌灵、克菌丹、敌菌丹、棉隆、哒菌清、稻瘟酰胺、灭菌丹、苯锈啶、噁唑酮菌、咪唑菌酮(fenamidon)、辛基异噻唑酮(octhilinone)、噻菌灵、丙氧喹啉、咯喹酮(pyroquilon)、喹氧灵、三环唑、氨基甲酸酯、二硫代氨基甲酸酯、福美铁、代森锰、代森锰、代森联、威百亩、甲基代森锌、福美双、代森锌、福美锌、乙霉威、苯噻菌胺(flubenthiavalicarb)、丙森锌(iprovalicarb)、霜霉威、胍、多果定、双胍辛胺、双胍盐、春雷霉素、多氧霉素、链霉素、有效霉素A、有机金属化合物、三苯锡盐、含硫杂环基化合物、稻瘟灵、二噻农、有机磷化合物、克瘟散、乙膦酸、乙膦酸铝、异稻瘟净、吡嘧磷、甲基立枯磷、有机氯化合物、甲基托布津、百菌清、抑菌灵、对甲抑菌灵、氟硫灭、四氯苯酞、六氯苯、戊菌隆、五氯硝基苯、硝基苯基衍生物、乐杀螨、敌螨普、消螨通、螺环菌胺、环氟菌胺、霜脲氰、苯菌酮(metrafenon)、N-2-氰基苯基-3,4-二氯异噻唑-5-甲酰胺(异噻菌胺(isotianil))、N-(3′,4′,5′-三氟联苯-2-基)-3-二氟甲基-1-甲基吡唑-4-甲酰胺、3-[5-(4-氯苯基)-2,3-二甲基异噁唑烷-3-基]-吡啶、N-(3′,4′-二氯-4-氟联苯-2-基)-3-二氟甲基-1-甲基吡唑-4-甲酰胺、5-氯-7-(4-甲基哌啶-1-基)-6-(2,4,6-三氟苯基)-[1,2,4]三-唑并[1,5-a]嘧啶、2-丁氧基-6-碘-3-丙基色烯-4-酮、N,N-二甲基-3-(3-溴-6-氟-2-甲基吲哚-1-磺酰基)-[1,2,4]三唑-1-磺胺、甲基-(2-氯-5-[1-(3-甲基苄氧基亚氨基)-乙基]苄基)氨基甲酸酯、甲基-(2-氯-5-[1-(6-甲基吡啶-2-基甲氧基-亚氨基)乙基]苄基)氨基甲酸酯、3-(4-氯苯基)-3-(2-异丙氧基羰基氨基-3-甲基丁酰基-氨基)丙酸甲酯、N-(1-(1-(4-氰基苯基)乙磺酰基)丁-2-基)氨基甲酸4-氟苯酯、N-(2-(4-[3-(4-氯苯基)丙-2-炔基氧基]-3-甲氧基苯基)乙基)-2-甲磺酰基氨基-3-甲基丁酰胺、N-(2-(4-[3-(4-氯苯基)丙-2-炔基氧基]-3-甲氧基苯基)乙基)-2-乙磺酰基氨基-3-甲基丁酰胺、N-(4′-溴联苯-2-基)-4-二氟甲基-2-甲基噻唑-5-甲酰胺、N-(4′-三氟甲基联苯-2-基)-4-二氟甲基-2-甲基噻唑-5-甲酰胺、N-(4′-氯-3′-氟联苯-2-基)-4-二氟甲基-2-甲基噻唑-5-甲酰胺、或2-(邻-((2,5-二甲基苯氧基-亚甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸甲脂。本领域技术人员应当认识到，组合物中每种抗真菌剂的合适的浓度取决于诸如功效、抗真菌剂的稳定性、不同抗真菌剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
iii.杀昆虫剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含杀昆虫剂。在一些情况下，PMP组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的杀昆虫剂。例如，杀昆虫剂可以降低(例如，降低生长或杀死)昆虫植物有害生物的适应度。可以使包含如本文描述的杀昆虫剂的PMP组合物以一定量和一定时间与靶昆虫有害生物或被其侵染的植物接触，该量和时间足以：(a)达到靶昆虫内或上杀昆虫剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和(b)降低靶昆虫的适应度。本文描述的杀昆虫剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。
如本文所用，术语“杀昆虫剂(insecticide或insecticidal agent)”是指杀死或抑制昆虫(诸如农业昆虫有害生物)的生长、增殖、繁殖、或扩散的物质。杀昆虫剂的非限制性实例在表2中示出。合适的杀昆虫剂的另外的非限制性实例包括生物制剂、激素或信息素(诸如印楝素)、芽孢杆菌属(Bacillus)物种、白僵菌属(Beauveria)物种、可得蒙(codlemone)、绿僵菌属(Metarrhizium)物种、拟青霉属(Paecilomyces)物种、thuringiensis、和轮枝孢属(Verticillium)物种；以及具有未知或非特定的作用机理的活性化合物，诸如熏剂(诸如磷化铝、甲基溴和硫酰氟)，和选择性进食抑制剂(诸如冰晶石、氟啶虫酰胺和吡蚜酮)。本领域技术人员应当认识到，组合物中每种杀昆虫剂的合适的浓度取决于诸如功效、杀昆虫剂的稳定性、不同杀昆虫剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
表2.杀昆虫剂的实例
Figure BDA0002947982740000541
Figure BDA0002947982740000551
iv.杀线虫剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含杀线虫剂。在一些情况下，PMP组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的杀线虫剂。例如，杀线虫剂可以降低(例如，降低生长或杀死)线虫植物有害生物的适应度。可以使包含如本文描述的杀线虫剂的PMP组合物以一定量和一定时间与靶线虫有害生物或被其侵染的植物接触，该量和时间足以：(a)达到靶线虫内或上杀线虫剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和(b)降低靶线虫的适应度。本文描述的杀线虫剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。
如本文所用，术语“杀线虫剂(nematicide或nematicidal agent)”是指杀死或抑制线虫(诸如农业线虫有害生物)的生长、增殖、繁殖、或扩散的物质。杀线虫剂的非限制性实例在表3中示出。本领域技术人员应当认识到，组合物中每种杀线虫剂的合适的浓度取决于诸如功效、杀线虫剂的稳定性、不同杀线虫剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
表3.杀线虫剂的实例
Figure BDA0002947982740000561
v.杀软体动物剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含杀软体动物剂。在一些情况下，PMP组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的杀软体动物剂。例如，杀软体动物剂可以降低(例如，降低生长或杀死)软体动物植物有害生物的适应度。可以使包含如本文描述的杀软体动物剂的PMP组合物以一定量和一定时间与靶软体动物有害生物或被其侵染的植物接触，该量和时间足以：(a)达到靶软体动物内或上杀软体动物剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和(b)降低靶软体动物的适应度。本文描述的杀软体动物剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。
如本文所用，术语“杀软体动物剂”或“杀软体动物剂”是指杀死或抑制软体动物(诸如农业软体动物有害生物)的生长、增殖、繁殖、或扩散的物质。许多化学物可以用作杀软体动物剂，包括金属盐，诸如磷酸铁(III)、硫酸铝、和EDTA铁钠、[3][4]、聚乙醛、甲硫威、或乙酰胆碱酯酶抑制剂。本领域技术人员应当认识到，组合物中每种杀软体动物剂的合适的浓度取决于诸如功效、杀软体动物剂的稳定性、不同杀软体动物剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
vi.杀病毒剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含杀病毒剂。在一些情况下，PMP组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的杀病毒剂。例如，杀病毒剂可以降低(例如，降低或消除)病毒植物病原体的适应度。可以使包含如本文描述的杀病毒剂的PMP组合物以一定量和一定时间与靶病毒或被其侵染的植物接触，该量和时间足以：(a)达到杀病毒剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和(b)降低或消除靶病毒。本文描述的杀病毒剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。
如本文所用，术语“杀病毒剂”或“抗病毒剂”是指杀死或抑制病毒(诸如农业病毒病原体)的生长、增殖、繁殖、发育、或扩散的物质。需要药剂可以用作杀病毒剂，包括化学物或生物药剂(例如核酸，例如dsRNA)。本领域技术人员应当认识到，组合物中每种杀病毒剂的合适的浓度取决于诸如功效、杀病毒剂的稳定性、不同杀病毒剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
vii.除草剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)除草剂。例如，除草剂可以降低(例如，降低或消除)杂草的适应度。可以使包含如本文描述的除草剂的PMP组合物以一定量和一定时间与靶杂草接触，该量和时间足以：(a)达到植物上除草剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)，和(b)降低杂草的适应度。本文描述的除草剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。
如本文所用，术语“除草剂”是指杀死或抑制杂草的生长、增殖、繁殖、或扩散的物质。许多化学物可以用作除草剂，包括草铵膦、喔草酯、苯嗪草酮、吡草胺、二甲戊乐灵、氟噻草胺、吡氟酰草胺、异噁草酮、烟嘧磺隆、硝磺草酮、唑啉草酯、磺草酮、苄草丹、甲磺草胺、治草醚、喹草酸、野麦畏、特丁津、莠去津、乙氧氟草醚、敌草隆、氟乐灵、或绿麦隆。除草剂的进一步实例包括但不限于苯甲酸除草剂，诸如麦草畏酯；苯氧基烷酸除草剂，诸如2,4-D、MCPA和2,4-DB酯；芳氧基苯氧基丙酸除草剂，诸如炔草酯(clodinafop)、氰氟草酯(cyhalofop)、噁唑禾草灵(fenoxaprop)、吡氟禾草灵、吡氟氯禾灵、和喹禾灵酯；吡啶羧酸除草剂，诸如氯氨吡啶酸、毒莠定、和二氯吡啶酸酯；嘧啶羧酸除草剂，诸如环丙嘧啶酸酯；吡啶基氧基烷酸除草剂，诸如氯氟吡氧乙酸(fluoroxypyr)和绿草定(triclopyr)酯；以及羟基苄腈除草剂，诸如溴草腈和碘苯腈(ioxynil)酯；芳基吡啶羧酸的酯；以及美国专利号7,314,849、美国专利号7,300,907和美国专利号7,642,220中披露的通用结构的芳基嘧啶羧酸，将各专利通过引用以其全文并入本文。在某些实施例中，除草剂可以选自由以下组成的组：2,4-D、2,4-DB、乙草胺、氟锁草醚、甲草胺、莠灭净、杀草强、黄草灵、莠去津、唑啶草酮、氟草氨、苄嘧磺隆、地散灵、苯达松、除草定、溴草腈、丁草敌、唑草酮、草灭畏、氯嘧磺隆、chlorproham、氯磺隆、烯草酮、异噁草酮、二氯吡啶酸、氯酯磺草胺酸(cloransulam)、草净津、环草敌、DCPA、甜菜安、敌草腈、禾草灵、双氯磺草胺、乙酰甲草胺、燕麦枯、二氟吡隆、精二甲吩草胺、敌草快、敌草隆、DSMA、草多索、EPTC、丁氟消草、胺苯磺隆、乙氧呋草黄、噁唑禾草灵、精吡氟禾草灵(fluazifop-P)、氟酮磺隆、氟噻草胺、唑嘧磺草胺、氟烯草酸、丙炔氟草胺、伏草隆、氟草烟、嗪草酸(fluthiacet)、氟磺胺草醚、甲酰胺磺隆、草铵膦、草甘膦、氯吡嘧磺隆、吡氟氯禾灵(haloxyfop)、环嗪酮、咪草酯(imazamethabenz)、甲氧咪草烟、甲基咪草烟、咪唑喹啉酸、咪唑乙烟酸、异噁酰草胺、异噁唑草酮、乳氟禾草灵、利谷隆、MCPA、MCPB、硝磺草酮、灭草唑、异丙甲草胺-s、赛克津、甲磺隆、草达灭、MSMA、敌草胺、抑草生、烟嘧磺隆、达草灭、黄草消、恶草灵、环氧嘧磺隆、乙氧氟草醚、百草枯、克草猛(pebulate)、壬酸、二甲戊乐灵、苯敌草、毒莠定、氟嘧磺隆、氨氟乐灵、扑草净、拿草特、毒草安、敌稗、氟磺隆、杀草敏(pyrazon)、哒草特、嘧硫草醚、快杀稗(quinclorac)、喹禾灵、砜嘧磺隆(rimsulfuron)、稀禾定、环草隆、西玛津、甲磺草胺、甲嘧磺隆、磺酰磺隆、特丁噻草隆、特草定、噻草啶、噻吩磺隆、禾草丹、肟草酮(tralkoxydim)、野麦畏、醚苯磺隆、苯磺隆、绿草定、氟乐灵、氟胺磺隆、灭草猛。本领域技术人员应当认识到，组合物中每种除草剂的合适的浓度取决于诸如功效、除草剂的稳定性、不同除草剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
viii.驱避剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含驱避剂。在一些情况下，PMP组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的驱避剂。例如，驱避剂可以趋避本文描述的任何有害生物(例如，昆虫、线虫、或软体动物)；微生物(例如，植物病原体或内生植物，诸如细菌、真菌、或病毒)；或杂草。可以使包含如本文描述的驱避剂的PMP组合物以一定量和一定时间与靶植物或被其侵染的植物接触，该量和时间足以：(a)达到驱避剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和(b)相对于未处理的植物降低植物上有害生物的水平。本文描述的驱避剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。
在一些情况下，驱避剂是昆虫驱避剂。熟知的昆虫驱避剂的一些实例包括：苯偶酰；苯甲酸苄酯；2,3,4,5-双(丁-2-烯)四氢糠醛(MGK驱避剂11)；丁氧基聚丙二醇；N-丁基乙酰苯胺；正丁基-6,6-二甲基-5,6-二氢-1,4-吡喃酮-2-甲酸酯(避虫酮)；己二酸二丁酯；邻苯二甲酸二丁酯；琥珀酸二正丁酯(驱虫特)；N,N-二乙基-间甲苯酰胺(DEET)；驱蚊灵(内型,内型)-二甲基二环[2.2.1]庚-5-烯-2,3-二甲酸酯)；邻苯二甲酸二甲酯；2-乙基-2-丁基-1,3-丙二醇；2-乙基-1,3-己二醇(Rutgers 612)；异辛可部酸二正丙酯(MGK驱避剂326)；2-苯基环己醇；对甲烷-3,8-二醇，和N,N-二乙基琥珀酰胺酸正丙酯。其他驱避剂包括香茅油、邻苯二甲酸二甲酯、正丁基均三甲苯基氧化物草酸酯和2-乙基己二醇-1,3(参见Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology[柯克-奥瑟默化学技术百科全书],第2版,第11卷:724-728；和The Condensed Chemical Dictionary[简明化学词典],第8版,第756页)。
昆虫驱避剂可以是合成或非合成昆虫驱避剂。合成昆虫驱避剂的实例包括邻氨基苯甲酸甲酯以及其他基于邻氨基苯甲酸酯的昆虫驱避剂、苯甲醛、DEET(N,N-二乙基-间甲苯酰胺)、驱蚊灵、邻苯二甲酸二甲酯、埃卡瑞丁(icaridin)(即，派卡瑞丁(picaridin)、羟哌酯(Bayrepel)、和KBR 3023)、避虫酮(例如，如用于“6-2-2”混合物(60％邻苯二甲酸二甲酯、20％避虫酮、20％乙基己二醇)、IR3535(3-[N-丁基-N-乙酰基]-氨基丙酸，乙酯)、甲氧苄氟菊酯、扑灭司林、SS220、或三环癸烯基烯丙基醚。天然昆虫驱避剂的实例包括紫珠(紫珠属(Callicarpa))叶、桦树树皮、香杨梅(bog myrtle)(Myrica Gale)、猫薄荷油(例如，荆芥内酯)、香茅油、柠檬桉(Corymbia citriodora；例如p-薄荷烷-3,8-二醇(PMD))的精油、苦楝油、柠檬草、来自互生叶白千层(Melaleuca alternifolia)叶的茶树油、烟草、或其提取物。
ix.肥料剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含异源肥料剂。在一些情况下，异源肥料剂与PMP缔合。例如，PMP可以包封异源肥料剂。另外地，或可替代地，异源肥料剂可以包埋在PMP的表面上或与其缀合。
异源肥料剂的实例包括植物营养素或植物生长调节剂，诸如本领域中熟知的那些。可替代地或另外地，肥料剂可以是可增加植物共生体适应度的肽、多肽、核酸或多核苷酸。肥料剂可以是可以增加各种植物或植物共生体的适应度的药剂，或者可以是一种或多种特定靶植物或植物共生体(例如，特定物种或属的植物或植物共生体)的药剂。
在一些情况下，可以修饰异源肥料剂。例如，修饰可以是化学修饰，例如缀合至标记，例如荧光标记物或放射性标记物。在其他实例中，修饰可以包括与如下部分缀合或操作性连接，该部分增强药剂(例如脂质、聚糖、聚合物(例如PEG)、阳离子部分)的稳定性、递送、靶向、生物利用度、或半衰期。
可以用于本发明披露的PMP组合物和方法的异源肥料剂的实例概述在以下。
在一些情况下，异源肥料剂包括天然或合成来源的任何材料，其被应用于土壤或植物组织上以提供一种或多种植物生长所必需的植物营养素。植物营养素可以包含常量营养素、微量营养素或其组合。植物常量营养素包括氮、磷、钾、钙、镁和/或硫。植物微量营养素包括铜、铁、锰、钼、锌、硼、硅、钴和/或钒。植物营养素肥料的实例包括氮肥，包括但不限于尿素、硝酸铵、硫酸铵、常压氮溶液、氨水、无水氨、硫代硫酸铵、涂硫尿素、脲醛、IBDU、聚合物涂覆的尿素、硝酸钙、脲甲醛或亚甲脲、磷肥(例如磷酸二铵、磷酸一铵、聚磷酸铵、重过磷酸钙和三过磷酸钙)、或钾肥(例如氯化钾、硫酸钾、硫酸钾镁、硝酸钾)。此类组合物可以在组合物中以游离盐或离子的形式存在。肥料可以通过其一种或多种组分(诸如氮、磷或钾)的含量来指定。肥料中这些元素的含量可以由N-P-K值指示(其中N＝按重量百分比计的氮含量，P＝按重量百分比计的磷含量，以及K＝按重量百分比计的钾含量)。
另一方面，无机肥料由非活体材料制成，并且包括例如硝酸铵、硫酸铵、尿素、氯化钾、钾碱、磷酸铵、无水氨和其他磷酸盐。无机肥料可很容易的商购，并且含有可溶形式的可立即用于植物的营养素。无机肥料通常价格便宜，所希望元素的单位成本低。本领域技术人员将理解，肥料剂中给定元素的精确量可以计算出，并施用于植物或土壤。
肥料可进一步分类为有机肥料或无机肥料。有机肥料包括具有含碳主链的分子主链的肥料，诸如在源自生活物质的组合物中。有机肥料是由源自生物的材料制成的。动物性杂肥、堆肥、骨粉、羽毛粉和血粉是常见的有机肥料的实例。另一方面，有机肥料典型地不可立即用于植物，并且在被植物使用之前需要土壤微生物将肥料组分分解为更简单的结构。此外，有机肥料不仅可以如普通无机肥料所观察到的引起植物的生长反应，而且天然有机肥料还可以刺激土壤微生物群体的生长和活性。土壤微生物群体(例如，植物共生体)的增加可能对土壤的物理和化学特性具有显著的有益作用，以及增加了对病害和有害生物的抗性。
在一个方面，可以使包含如本文描述的植物营养素的PMP组合物以一定量和一定时间与植物接触，该量和时间足以：(a)达到植物内或上植物营养素浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)，和(b)相对于未处理的植物增加植物的适应度。
在另一个方面，可以使包含如本文描述的植物营养素的PMP组合物以一定量和一定时间与植物共生体接触，该量和时间足以：(a)达到植物共生体(例如，细菌或真菌内共生体)内或上植物营养素浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)，和(b)相对于未处理的植物共生体增加植物共生体的适应度。
异源肥料剂可以包括植物生长调节剂。示例性植物生长调节剂包括植物生长素、细胞分裂素、赤霉素和脱落酸。在一些情况下，植物生长调节剂是脱落酸、乙酰胺、嘧啶醇、6-苄基氨基嘌呤、油菜素内酯、仲丁灵、矮壮素(chlormequat)(氯化氯代胆碱(chlormequatchloride))、氯化胆碱、环丙酰草胺、丁酰肼、调呋酸、噻节因、2,6-二甲基吡啶、乙烯磷、氟节胺、呋嘧醇、嗪草酸、氯吡脲、赤霉酸、抗倒胺、吲哚-3-乙酸、马来酰肼、氟磺酰草胺、甲哌鎓(mepiquat)(氯化二甲基哌啶嗡(mepiquat chloride))、萘乙酸、N-6-苄基腺嘌呤、多效唑、调环酸(prohexadione)(调环酸-钙(prohexadione-calcium))、茉莉酸诱导体(prohydrojasmon)、噻苯隆、抑芽唑、三丁基三硫磷酸酯、2,3,5-三-碘苯甲酸、抗倒酯(trinexapac-ethyl)和烯效唑。可掺入种子包衣组合物的其他植物生长调节剂描述于US2012/0108431中，其通过引用以其全文并入本文。
x.植物修饰剂
本文描述的PMP组合物包含一种或多种异源植物修饰剂。例如，PMP可以包封异源植物修饰剂。可替代地或另外地，异源植物修饰剂可以包埋在PMP的表面上或与其缀合。
在一些情况下，植物修饰剂可包含肽或核酸。植物修饰剂可以是增加各种植物的适应度的药剂，或者可以是靶向一种或多种特定植物(例如，特定物种或属的植物)的药剂。另外地，在一些情况下，PMP组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的植物修饰剂。
此外，在一些情况下，可以修饰异源植物修饰剂(例如，包含核酸分子或肽的药剂)。例如，修饰可以是化学修饰，例如缀合至标记，例如荧光标记物或放射性标记物。在其他实例中，修饰可以包括与如下部分缀合或操作性连接，该部分增强药剂(例如脂质、聚糖、聚合物(例如PEG)、阳离子部分)的稳定性、递送、靶向、生物利用度、或半衰期。
可以用于本发明披露的PMP组合物和方法的异源植物修饰剂(例如，肽或核酸)的实例概述在以下。
A.多肽
本文描述的PMP组合物(例如，PMP)可以包含异源多肽。在一些情况下，本文描述的PMP组合物包含修饰植物(例如，例如增加植物的适应度)的多肽或其功能片段或衍生物。例如，多肽可以增加植物的适应度。可以使包含如本文描述的多肽的PMP组合物以一定量和一定时间与植物接触，该量和时间足以：(a)达到多肽浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和(b)修饰植物(例如，增加植物的适应度)。
本文可用的多肽的实例可以包括酶(例如，代谢重组酶、解旋酶、整合酶、RNA酶、DNA酶、或泛素化蛋白)、成孔蛋白、信号传导配体、细胞渗透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白(例如，CRISPR-Cas系统、TALEN、或锌指)、核糖蛋白、蛋白适配体、或伴侣蛋白。
本文包括的多肽可以包括天然存在的多肽或重组产生的变体。在一些情况下，多肽可以是其功能片段或变体(例如，其酶活性片段或变体)。例如，多肽可以是本文描述的任何多肽的功能活性变体，例如在指定区域或整个序列上与本文描述的多肽或天然存在的多肽的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性。在一些情况下，多肽可以与感兴趣的蛋白质具有至少50％(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％、或更大)同一性。
可以在用于本文描述的任何用途的组合物中配制本文描述的多肽。本文披露的组合物可以包含任何数量或类型(例如，类别)的多肽，诸如至少约1种多肽、2、3、4、5、10、15、20、或更多种多肽中的任一者。组合物中每种多肽的合适的浓度取决于诸如功效、多肽的稳定性、组合物中不同多肽的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。在一些情况下，液体组合物中每种多肽是从约0.1ng/mL至约100mg/mL。在一些情况下，固体组合物中每种多肽是从约0.1ng/g至约100mg/g。
制造多肽的方法在本领域是常规的。通常，参见Smales和James(编辑)，Therapeutic Proteins:Methods and Protocols[治疗性蛋白：方法和方案](Methods inMolecular Biology[分子生物学方法]),Humana Press[胡玛纳出版社](2005)；以及Crommelin,Sindelar和Meibohm(编辑)，Pharmaceutical Biotechnology:Fundamentalsand Applications[药物生物技术：基础与应用],Springer[斯普林格出版社](2013)。
用于产生多肽的方法涉及在植物细胞中表达，尽管也可以使用昆虫细胞、酵母、细菌、哺乳动物细胞、或其他细胞，在适当的启动子控制下，产生重组蛋白。哺乳动物表达载体可以包含非转录元件，诸如复制起点、合适的启动子和增强子、以及其他5’或3’侧翼非转录序列；以及5’或3’非翻译序列，诸如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和接受位点；以及终止序列。源自SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期启动子、增强子、剪接和聚腺苷酸化位点可以用于提供异源DNA序列表达所需的其他遗传元件。在以下文献中描述了用于与细菌、真菌、酵母、和哺乳动物细胞宿主一起使用的适当的克隆和表达载体：Green&Sambrook,Molecular Cloning:ALaboratory Manual[分子克隆-实验室手册](第四版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社](2012)。
不同哺乳动物细胞培养系统可以用于表达和制造重组多肽药剂。哺乳动物表达系统的实例包括但不限于CHO细胞、COS细胞、HeLA和BHK细胞系。在以下文献中描述了用于生产蛋白治疗剂的宿主细胞培养的过程：例如，Zhou和Kantardjieff(编辑)，Mammalian CellCultures for Biologics Manufacturing[用于生物制品制造的哺乳动物细胞培养](Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology[生物化学工程/生物科技的进展]),Springer[斯普林格出版社](2014)。在以下文献中描述了蛋白质的纯化：Franks,Protein Biotechnology:Isolation,Characterization,and Stabilization[蛋白生物技术：分离、表征、和稳定化],Humana Press[胡玛纳出版社](2013)；以及Cutler,ProteinPurification Protocols[蛋白纯化方案](Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]),Humana Press[胡玛纳出版社](2010)。以下文献中描述了蛋白治疗剂的配制品：Meyer(编辑),Therapeutic Protein Drug Products:Practical Approaches toformulation in the Laboratory,Manufacturing,and the Clinic[治疗性蛋白药物产品：实验室、制造和临床中配制品的实践方法],Woodhead Publishing Series[伍德海德出版系列](2012)。
在一些情况下，PMP组合物包含抗体或其抗原结合片段。例如，本文描述的药剂可以是阻断或增强植物的组分的活性和/或功能的抗体。抗体可以充当植物中多肽(例如，酶或细胞受体)的拮抗剂或激动剂。针对靶抗原的抗体的制造和使用是本领域已知的。参见例如Zhiqiang An(编辑),Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic[治疗性单克隆抗体，从实验室到临床],第1版,Wiley[威利出版社],2009，以及还有Greenfield(编辑),Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],2013获得制造重组抗体的方法，包括抗体工程、简并寡核苷酸的使用、5’-RACE、噬菌体展示、以及诱变；抗体测试和表征；抗体药代动力学和药效动力学；抗体纯化和储存；以及筛选和标记技术。
B.核酸
在一些情况下，本文描述的PMP包括异源核酸。许多核酸在本文描述的PMP组合物和方法中是有用的。本文披露的PMP可以包括任何数量或类型(例如，类别)的异源核酸(例如，DNA分子或RNA分子，例如，mRNA、指导RNA(gRNA)、或抑制性RNA分子(例如，siRNA、shRNA、或miRNA)，或杂交DNA-RNA分子)，诸如至少约1个核酸类别或变体，2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个或更多个核酸类别或变体。组合物中每种核酸的合适浓度取决于多种因素，诸如功效、核酸的稳定性、不同核酸的数量、配制品、以及该组合物的施用方法。可用于本文的核酸的实例包括Dicer底物小干扰RNA(dsiRNA)、反义RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹(shRNA)、微小RNA(miRNA)、(不对称干扰RNA)aiRNA、肽核酸(PNA)、吗啉基、锁核酸(LNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、核糖酶、脱氧核酶(DNAzyme)、适配体(DNA、RNA)、环状RNA(circRNA)、指导RNA(gRNA)、或DNA分子
可以使包含如本文描述的核酸的PMP组合物以一定量和一定时间与植物接触，该量和时间足以：(a)达到核酸浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和(b)修饰植物(例如，增加植物的适应度)。
(a)编码肽的核酸
在一些情况下，PMP包含编码多肽的异源核酸。编码多肽的核酸可以具有以下长度：从约10至约50,000个核苷酸(nts)、约25至约100nts、约50至约150nts、约100至约200nts、约150至约250nts、约200至约300nts、约250至约350nts、约300至约500nts、约10至约1000nts、约50至约1000nts、约100至约1000nts、约1000至约2000nts、约2000至约3000nts、约3000至约4000nts、约4000至约5000nts、约5000至约6000nts、约6000至约7000nts、约7000至约8000nts、约8000至约9000nts、约9000至约10,000nts、约10,000至约15,000nts、约10,000至约20,000nts、约10,000至约25,000nts、约10,000至约30,000nts、约10,000至约40,000nts、约10,000至约45,000nts、约10,000至约50,000nts、或介于其间的任何范围。
PMP组合物还可以包含感兴趣的核酸序列的功能活性变体。在一些情况下，核酸的变体与感兴趣的核酸的序列，例如在指定区域上或在整个序列上，具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性。在一些情况下，本发明包括由如本文描述的核酸变体编码的功能活性多肽。在一些情况下，由核酸变体编码的功能活性多肽与感兴趣的多肽的序列或天然来源的多肽序列，例如在指定区域上或在整个氨基酸序列上，具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性。
某些用于表达编码蛋白的核酸的方法可以涉及在适当的启动子控制下，在细胞中表达，这些细胞包括昆虫、酵母细胞、植物细胞、细菌细胞、或其他细胞。表达载体可以包括非转录元件，诸如复制起点、合适的启动子和增强子、以及其他5’或3’侧翼非转录序列；以及5’或3’非翻译序列，诸如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点；以及终止序列。源自SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期启动子、增强子、剪接和聚腺苷酸化位点可以用于提供异源DNA序列表达所需的其他遗传元件。在以下文献中描述了用于与细菌、真菌、酵母、和哺乳动物细胞宿主一起使用的适当的克隆和表达载体：Green等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆-实验室手册],第四版,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],2012。
使用重组方法的遗传修饰通常是本领域已知的。可以使用本领域已知的重组方法获得编码希望的基因的核酸序列，例如像使用标准技术，通过从表达该基因的细胞中筛选文库、通过从已知包括该基因的载体获得该基因、或通过从包含该基因的细胞和组织直接分离。可替代地，感兴趣的基因可以是以合成方式产生的，而不是克隆的。
天然的或合成的核酸的表达典型地通过以下实现：将编码感兴趣的基因的核酸可操作地连接至启动子，并且将构建体并入表达载体。表达载体可以适用于在细菌中复制和表达。表达载体还可以适用于在真核生物中复制和整合。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列、和启动子，可用于希望的核酸序列的表达。
另外的启动子元件，例如，增强子，调节转录起始的频率。典型地，这些元件位于起始位点上游30-110个碱基对(bp)的区域中，尽管最近已经显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，使得当反转元件或使元件相对彼此移动时能够保留启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隔可以增加至50bp。取决于启动子，似乎单个元件可以共同地或独立地发挥功能，以激活转录。
合适的启动子的一个实例是即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这一启动子序列是能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个实例是延伸生长因子-1α(Elongation Growth Factor-1α，EF-1α)。然而，还可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、艾普斯登－巴尔病毒(Epstein-Barr virus)即时早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、连同人类基因启动子(诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子、以及肌酸激酶启动子)。
可替代地，启动子可以是诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，当希望这种表达时，该分子开关能够开启与该启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达，或当不希望表达时，则能够关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子、和四环素启动子。
待引入的表达载体还可以含有选择性标记基因或报告基因或二者，从而便于从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞的群体中，鉴定和选择表达性细胞。在其他方面，选择性标记物可以在一段单独的DNA上进行，并且用于共转染程序。选择性标记物和报告基因二者侧翼可以是适当的调节序列，以使得能够在宿主细胞中表达。有用的选择性标记物包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。
报告基因可以用于鉴定潜在转化的细胞并且用于评估调节序列的功能性。通常，报告基因是不存在于受体来源或不由受者来源表达，并且编码其表达由一些易于检测特性(例如酶活性)所证明的多肽的基因。在将DNA引入受体细胞后，在适当的时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因，或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人,FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]479:79-82,2000)。合适的表达系统是熟知的，可以使用已知技术制备或商业获得。通常，具有显示报告基因最高表达水平的最小5’侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以连接至报告基因，并且用于评估药剂调节启动子驱动的转录的能力。
在一些情况下，生物体可以被遗传修饰从而改变一种或多种蛋白的表达。一种或多种蛋白的表达可以被修饰用于具体时间，例如生物体的发育或分化状态。在一种情况下，本发明包括用来改变一种或多种蛋白(例如影响活性、结构、或功能的蛋白)的表达的组合物。一种或多种蛋白的表达可以限制在一个或多个具体位置，或遍布整个生物体中。
(b)合成mRNA
PMP组合物可以包含合成mRNA分子，例如编码多肽的合成mRNA分子。合成mRNA分子可以被修饰，例如被化学修饰。mRNA分子可以是化学合成的，或在体外转录。mRNA分子可以设置在质粒上，例如，病毒载体、细菌载体、或真核表达载体。在一些实例中，可以通过转染、电穿孔、或转导(例如，腺病毒或慢病毒转导)，将mRNA分子递送至细胞。
在一些情况下，本文描述的修饰的感兴趣的RNA药剂具有修饰的核苷或核苷酸。此类修饰是已知的，并且描述于以下文献中：例如WO 2012/019168。在以下文献中描述了另外的修饰：例如WO 2015/038892；WO 2015/038892；WO 2015/089511；WO 2015/196130；WO2015/196118和WO 2015/196128A2。
在一些情况下，编码感兴趣的多肽的修饰的RNA具有一个或多个末端修饰，例如5’帽结构和/或多聚A尾(例如，长度在100-200个核苷酸之间)。5’帽结构可以选自由以下组成的组：CapO、Capl、ARCA、肌苷、Nl-甲基-鸟苷、2’氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷、和2-叠氮-鸟苷。在一些情况下，修饰的RNA还含有5‘UTR(其包括至少一个Kozak序列)和3‘UTR。此类修饰是已知的，并且描述于以下文献中：例如，WO 2012/135805和WO 2013/052523。以下文献中描述了另外的末端修饰，例如，WO 2014/164253和WO 2016/011306、WO2012/045075、以及WO 2014/093924。用于合成加帽RNA分子(例如，修饰的mRNA)(其可以包括至少一个化学修饰)的嵌合酶描述于WO 2014/028429中。
在一些情况下，修饰的mRNA可以环化或串联，从而产生具有翻译能力的分子，进而辅助多聚A结合蛋白和5‘-端结合蛋白之间的相互作用。可以通过至少3种不同途径发生环化或串联机制：1)化学途径，2)酶途径，以及3)核酶催化途径。新形成的5’-/3’-键可以是分子内或分子间的。描述了此类修饰，例如在WO 2013/151736中。
制造和纯化修饰的RNA的方法是本领域已知的，并且已在本领域披露。例如，仅使用体外转录(IVT)酶合成制造修饰的RNA。制造IVT多核苷酸的方法是本领域已知的，并且描述于以下文献中：WO 2013/151666、WO 2013/151668、WO2013/151663、WO 2013/151669、WO2013/151670、WO 2013/151664、WO 2013/151665、WO 2013/151671、WO 2013/151672、WO2013/151667和WO 2013/151736。纯化方法包括通过以下纯化RNA转录物(包括多聚A尾)：在使得RNA转录物结合至与多个胸苷或其衍生物和/或多个尿嘧啶或其衍生物(多聚T/U)连接的表面的条件下使样品与该表面接触，并且从该表面洗脱纯化的RNA转录物(WO 2014/152031)；经由可扩展的方法，使用允许长度高达10,000个核苷酸的较长RNA分离的离子(例如阴离子)交换色谱法(WO 2014/144767)；并且使修饰的mRNA样品经受DNA酶处理(WO2014/152030)。
修饰的RNA的配制品是已知的并且描述于例如，WO 2013/090648中。例如，配制品可以是但不限于纳米颗粒、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微球、类脂质、脂复合物、脂质体、聚合物、碳水化合物(包括简单糖)、阳离子脂质、纤维蛋白凝胶、纤维蛋白水凝胶、纤维蛋白胶、纤维蛋白封闭剂、纤维蛋白原、凝血酶、快速消除的脂质纳米颗粒(reLNP)及其组合。
在人类疾病、抗体、病毒和多种体内环境的领域中，编码多肽的修饰的RNA是已知的，并且披露于例如国际公开号WO 2013/151666、WO 2013/151668、WO2013/151663、WO2013/151669、WO 2013/151670、WO 2013/151664、WO 2013/151665、WO 2013/151736的表6中；国际公开号WO 2013/151672的表6和表7中；国际公开号WO 2013/151671的表6、表178和表179中；国际公开号WO 2013/151667的表6、185和186中。可以将以上项中的任一种合成为IVT多核苷酸、嵌合多核苷酸或环状多核苷酸，并且各自可以包括一种或多种修饰的核苷酸或末端修饰。
(c)抑制性RNA
在一些情况下，PMP组合物包含抑制性RNA分子，例如，抑制性RNA分子经由RNA干扰(RNAi)途径发挥作用。在一些情况下，抑制性RNA分子降低植物中的基因表达水平和/或降低植物中的蛋白质水平。在一些情况下，抑制性RNA分子抑制植物基因的表达。例如，抑制性RNA分子可以包括短干扰RNA、短发夹RNA、和/或微小RNA，其靶向植物中的基因。某些RNA分子可以通过RNA干扰(RNAi)的生物过程抑制基因表达。RNAi分子包括RNA或RNA样结构，这些结构典型地含有15-50个碱基对(如约18-25个碱基对)，并且具有与细胞内的表达的靶基因中的编码序列同一的(互补的)或接近同一的(基本上互补的)核碱基序列。RNAi分子包括但不限于：短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)、部分双链体(meroduplex)、dicer酶底物、和多价RNA干扰(美国专利号8,084,599、8,349,809、8,513,207和9,200,276)。shRNA是包含经由RNAi降低靶基因表达的发夹弯(发夹弯)的RNA分子。可以按质粒的形式，例如，病毒或细菌载体，例如通过转染、电穿孔、或转导，将shRNA递送至细胞。微小RNA是典型地具有约22个核苷酸的长度的非编码RNA分子。MiRNA结合mRNA分子上的靶位点，并且使该mRNA沉默，例如，通过引起该mRNA的切割，使该mRNA去稳定，或抑制该mRNA的翻译。在一些情况下，抑制性RNA分子降低负功能调节因子的水平和/或活性。在其他情况下，抑制性RNA分子降低正功能调节因子的抑制剂的水平和/或活性。抑制性RNA分子可以是化学合成的或在体外转录。
在一些情况下，核酸是DNA、RNA、或PNA。在一些情况下，RNA是抑制性RNA。在一些情况下，抑制性RNA抑制植物中的基因表达。在一些情况下，核酸是mRNA、修饰的mRNA、或DNA分子，其增加植物中以下的表达：酶(例如，代谢重组酶、解旋酶、整合酶、RNA酶、DNA酶、或泛素化蛋白)、成孔蛋白、信号传导配体、细胞渗透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白(例如，CRISPR-Cas系统、TALEN、或锌指)、核糖蛋白、蛋白适配体、或伴侣蛋白。在一些情况下，核酸是mRNA、修饰的mRNA、或DNA分子，其增加以下的表达：酶(例如，代谢酶、重组酶、解旋酶、整合酶、RNA酶、DNA酶、或泛素化蛋白)、成孔蛋白、信号传导配体、细胞渗透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白(例如，CRISPR-Cas系统、TALEN、或锌指)、核糖蛋白、蛋白适配体、或伴侣蛋白。在一些情况下，植物中表达的增加是相对于参考水平(例如，未处理的植物中的表达)约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％的表达增加。在一些情况下，植物中表达的增加是相对于参考水平(例如，未处理的植物中的表达)约2x倍、约4x倍、约5x倍、约10x倍、约20x倍、约25x倍、约50x倍、约75x倍、或约100x倍或更大的表达增加。
在一些情况下，核酸是反义RNA、dsiRNA、siRNA、shRNA、miRNA、aiRNA、PNA、吗啉基、LNA、piRNA、核糖酶、DNAzyme、适配体(DNA、RNA)、circRNA、gRNA、或DNA分子(例如，反义多核苷酸)，其作用是减少植物中以下的表达：例如酶(代谢酶、重组酶、解旋酶、整合酶、RNA酶、DNA酶、聚合酶、泛素化蛋白、超氧化物管理酶、或能量生产酶)、转录因子、分泌蛋白、结构因子(肌动蛋白、驱动蛋白、或微管蛋白)、核糖蛋白、蛋白适配体、伴侣蛋白、受体、信号传导配体、或转运蛋白。在一些情况下，植物中表达的降低是相对于参考水平(例如，未处理的植物中的表达)约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％的表达降低。在一些情况下，植物中表达的降低是相对于参考水平(例如，未处理的植物中的表达)约2x倍、约4x倍、约5x倍、约10x倍、约20x倍、约25x倍、约50x倍、约75x倍、或约100x倍或更大的表达降低。
RNAi分子包括与靶基因的全部或片段基本上互补、或完全互补的序列。RNAi分子可以与内含子和外显子之间的边界处的序列互补，从而防止特异性基因的新产生的核RNA转录物成熟为用于转录的mRNA。与特异性基因互补的RNAi分子可以与靶基因的mRNA杂交，并且防止其翻译。反义分子可以是DNA、RNA、或其衍生物或杂交体。此类衍生物分子的实例包括但不限于，肽核酸(PNA)和硫代磷酸酯基分子，诸如脱氧核糖核酸胍(DNG)或核糖核酸胍(RNG)。
RNAi分子可以作为体外合成的“即用型”RNA提供，或作为转染到细胞中的反义基因提供，当转录时，这些细胞将产生RNAi分子。与mRNA杂交导致杂交的分子被RNA酶H降解，和/或翻译复合物的形成的抑制。二者都导致不能产生原始基因的产物。
与感兴趣的转录物杂交的RNAi分子的长度可以是约10个核苷酸，约15或30个核苷酸之间，或约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个核苷酸。反义序列与靶向的转录物的同一性程度可以是至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％。
RNAi分子还可以包括突出端，即典型地不成对的、悬突核苷酸，其不直接参与正常情况下由本文限定的正义链和反义链对的核心序列形成的双螺旋结构。RNAi分子可以含有独立地位于每条正义链和反义链上的约1-5个碱基的3’和/或5’突出端。在一些情况下，正义链和反义链二者都含有3’和5’突出端。在一些情况下，一条链的一个或多个3’突出端核苷酸与另一条链的一个或多个5’突出端核苷酸碱基配对。在其他情况下，一条链的一个或多个3’突出端核苷酸不与另一条链的一个或多个5’突出端核苷酸碱基配对。RNAi分子的正义和反义链可以含有或可以不含有相同数量的核苷酸碱基。反义和正义链可以形成双链体，其中仅5’端具有钝端，仅3’端具有钝端，5’和3’端都是钝端，或5’端和3’端都不是钝端。在另一个情况下，突出端中的一个或多个核苷酸含有硫代磷酸、硫代磷酸酯、反转的脱氧核苷酸(3’至3’连接的)核苷酸，或是修饰的核糖核苷酸或脱氧核苷酸。
小干扰RNA(siRNA)分子包括与靶mRNA的约15至约25个连续核苷酸同一的核苷酸序列。在一些情况下，siRNA序列以二核苷酸AA开始，包括含量为30％-70％(约30％-60％、约40％-60％、或约45％-55％)的GC，并且与除了待引入其中的基因组中的靶标之外的任何核苷酸序列不具有高同一性百分比，例如，如通过标准BLAST检索确定的。
siRNA和shRNA类似于内源性微小RNA(miRNA)基因的加工途径中的中间体(Bartel,Cell[细胞]116:281-297,2004)。在一些情况下，siRNA可以用作miRNA，反之亦然(Zeng等人,Mol.Cell[分子细胞学]9:1327-1333,2002；Doench等人,Genes Dev.[基因与发育]17:438-442,2003)。外源性siRNA下调与siRNA具有种子互补性的mRNA(Birmingham等人,Nat.Methods[自然方法]3:199-204,2006)。3’UTR内的多个靶位点给出了更强的下调(Doench等人,Genes Dev.[基因和发育]17:438-442,2003)。
已知的有效的siRNA序列和同源结合位点也很好地呈现在相关文献中。通过本领域已知的技术，RNAi分子易于设计和生产的。此外，存在增加发现有效且特异性的序列基序的机会的计算工具(Pei等人,Nat.Methods[自然方法]3(9):670-676,2006；Reynolds等人,Nat.Biotechnol.[自然生物技术]22(3):326-330,2004；Khvorova等人,Nat.Struct.Biol.[自然结构生物学]10(9):708-712,2003；Schwarz等人,Cell[细胞]115(2):199-208,2003；Ui-Tei等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]32(3):936-948,2004；Heale等人,NucleicAcids Res.[核酸研究]33(3):e30,2005；Chalk等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.[生化及生物物理研究通讯]319(1):264-274,2004；以及Amarzguioui等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.[生化及生物物理研究通讯]316(4):1050-1058,2004)。
RNAi分子调节由基因编码的RNA的表达。因为多个基因可能彼此共享一定程度的序列同源性，所以在一些情况下，可以设计RNAi分子以靶向具有充分序列同源性的一类基因。在一些情况下，RNAi分子可以含有与在不同基因靶标中共享的序列或对于特异性基因靶标而言是独特的序列具有互补性的序列。在一些情况下，可以设计RNAi分子以靶向在若干基因之间具有同源性的RNA序列的保守区，由此靶向一个基因家族中的若干基因(例如，不同基因同种型、剪接变体、突变基因等)。在一些情况下，可以设计RNAi分子以靶向对于单个基因的特异性RNA序列而言是独特的序列。
抑制性RNA分子可以被修饰，例如，从而含有修饰的核苷酸，例如，2’-氟、2’-邻甲基、2’-脱氧、解锁核酸、2’-羟基、硫代磷酸酯、2’-硫尿核苷、4’-硫尿核苷、2’-脱氧尿苷。不希望受理论约束，据信此类修饰可以增加核酸酶抗性和/或血清稳定性，或降低免疫原性。
在一些情况下，经由生理上不稳定的键或接头将RNAi分子连接至递送聚合物。选择生理上不稳定的接头，使得存在于某些生理条件下时，经历化学转化(例如，切割)(例如，在细胞质的还原性环境下，经二硫键切割)。通过切割生理上不稳定的连接，从聚合物释放分子，促进了分子与对于活性而言适当的细胞组分的相互作用。
可以通过将分子与聚合物共价连接，形成RNAi分子-聚合物缀合物。聚合物是聚合的或修饰的，使得它含有反应性基团A。RNAi分子也是聚合的或修饰的，使得它含有反应性基团B。选择反应性基团A和B，使得可以使用本领域已知的方法，经由可逆的共价键，连接它们。
在过量的聚合物存在下，可以进行RNAi分子与聚合物的缀合。因为在缀合期间，RNAi分子和聚合物可以具有相反的电荷，所以过量聚合物的存在可以减少或消除缀合物的聚集。可替代地，可以使用过量的载体聚合物，诸如聚阳离子。可以在施用缀合物之前，从缀合的聚合物去除过量聚合物。可替代地，可以与缀合物一起共施用过量聚合物。
基于非编码RNA，诸如核酶、RNA酶P、siRNA、和miRNA的抑制剂的制备和使用也是本领域已知的，例如，如在以下文献中描述的：Sioud,RNA Therapeutics:Function,Design,and Delivery[RNA治疗剂：功能、涉及、和递送](Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]).Humana Press[胡玛纳出版社](2010)。
(d)基因编辑
本文描述的PMP组合物可以包含基因编辑系统的组分。例如，药剂可以在植物中的基因中引入改变(例如，插入、缺失(例如，敲除)、易位、倒位、单点突变或其他突变)。示例性基因编辑系统包括锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应因子基核酸酶(TALEN)、和规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)系统。以下文献中描述了基于ZFN、TALEN、和CRISPR的方法：例如Gaj等人,Trends Biotechnol.[生物技术趋势]31(7):397-405,2013。
在典型的CRISPR/Cas系统中，通过靶向单链或双链DNA序列的序列特异性的、非编码“指导RNA”，将内切核酸酶导向靶核苷酸序列(例如，待进行序列编辑的基因组中的位点)。已经鉴定了三类(I-III)CRISPR系统。II类CRISPR系统使用单个Cas内切核酸酶(而不是多个Cas蛋白)。一种II类CRISPR系统包括II类Cas内切核酸酶，诸如Cas9、CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。crRNA含有指导RNA，即典型地，对应于靶DNA序列的一个约20个核苷酸的RNA序列。crRNA还包含与tracrRNA结合的区域，以形成被RNA酶III切割的部分双链结构，产生crRNA/tracrRNA杂交体。RNA作为指导物以指导Cas蛋白使特异性DNA/RNA序列沉默，这取决于间隔子序列。参见例如，Horvath等人,Science[科学]327:167-170,2010；Makarova等人,Biology Direct[生物学指导]1:7,2006；Pennisi,Science[科学]341:833-836,2013。靶DNA序列必须总体上邻近针对给定Cas内切核酸酶来说是特异性的原间隔子邻近基序(PAM)；然而，PAM序列似乎遍布整个给定基因组。从不同原核物种鉴定的CRISPR内切核酸酶具有独特的PAM序列要求；PAM序列的实例包括5’-NGG(SEQ ID NO:1)(酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes))、5’-NNAGAA(SEQ ID NO:2)(嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CRISPR1)、5’-NGGNG(SEQ ID NO:3)(嗜热链球菌CRISPR3)、和5’-NNNGATT(SEQ ID NO:4)(奈瑟氏脑膜炎双球菌(Neisseriameningiditis))。一些内切核酸酶，例如，Cas9内切核酸酶，与富含G的PAM位点(例如，5’-NGG(SEQ ID NO:1))相关，并且在距离PAM位点上游(距离PAM位点的5’)3个核苷酸的位置处，进行靶DNA的钝端切割。另一个II类CRISPR系统包括小于Cas9的V型内切核酸酶Cpf1；实例包括AsCpf1(来自氨基酸球菌属物种(Acidaminococcus sp.))和LbCpf1(来自毛螺旋菌属物种(Lachnospiraceae sp.))。Cpf1相关CRISPR阵列被加工成成熟crRNA，而不需要tracrRNA；换言之，Cpf1系统仅需要Cpf1核酸酶和crRNA来切割靶DNA序列。Cpf1内切核酸酶与富含T的PAM位点，例如，5’-TTN(SEQ ID NO:5)相关。Cpf1也可以识别5’-CTA(SEQ ID NO:6)PAM基序。Cpf1通过引入具有4或5个核苷酸的5’突出端的错位或交错的双链断裂来切割靶DNA，例如切割如下靶DNA，该靶DNA中的5个核苷酸的错位或交错的切割位于距离编码链上的PAM位点下游(3’)18个核苷酸的位置处和距离互补链上的PAM位点下游23个核苷酸的位置处；由这种错位切割产生的5个核苷酸突出端使得通过同源重组的DNA插入比在平末端切割的DNA的插入更精确地进行基因组编辑。参见例如，Zetsche等人,Cell[细胞]163:759-771,2015。
出于基因编辑的目的，可以设计CRISPR阵列以含有对应于希望的靶DNA序列的一个或多个指导RNA序列；参加例如，Cong等人,Science[科学]339:819-823,2013；Ran等人,Nature Protocols[自然实验手册]8:2281-2308,2013。用于进行DNA切割，Cas9需要gRNA序列的至少约16或17个核苷酸；对于Cpf1，需要gRNA序列的至少约16个核苷酸，从而实现可检测的DNA切割。在实践中，指导RNA序列通常被设计为具有17-24个核苷酸之间(例如，19、20、或21个核苷酸)的长度，并且与靶向的基因或核酸序列互补性。定制的gRNA生成器和算法可从商业上获得，用于设计有效的指导RNA。还使用嵌合的单指导RNA(sgRNA)，一种模拟天然存在的crRNA-tracrRNA复合物并包含tracrRNA(用于结合核酸酶)和至少一个crRNA(以将核酸酶指导至编辑目标序列)的工程化(合成)单RNA分子，实现了基因编辑。也已经证明，在基因组编辑中，化学修饰的sgRNA是有效的；参见例如，Hendel等人,Nature Biotechnol.[自然生物技术]985-991,2015。
而在由gRNA靶向的特异性DNA序列上，野生型Cas9产生双链断裂(DSB)，具有修饰的功能性的许多CRISPR内切核酸酶是可得的，例如：Cas9的切口酶形式仅产生单链断裂；无催化活性的Cas9(dCas9)不切割靶DNA，但是通过位阻干扰转录。dCas9可以进一步与效应因子融合，从而阻遏(CRISPRi)或激活(CRISPRa)靶基因的表达。例如，Cas9可以与转录阻遏因子(例如，KRAB结构域)或转录激活因子融合(例如，dCas9-VP64融合物)。融合至FokI核酸酶(dCas9-FokI)的无催化活性的Cas9(dCas9)可以用于在与两个gRNA同源的靶序列上产生DSB。参见例如，许多CRISPR/Cas9质粒披露于并且可公开获得自阿德基因质粒库(Addgenerepository)(阿德基因公司(Addgene),西德尼大街75号(Sidney St.),550A单元,剑桥郡,马萨诸塞州02139；addgene.org/crispr/)。引入两个单独的双链断裂(各自由单独的指导RNA指导)的双切口酶Cas9被以下文献描述为实现了更精确的基因组编辑：Ran等人,Cell[细胞]154:1380-1389,2013。
用于编辑真核生物的基因的CRISPR技术披露于以下文献中：美国专利申请公开US2016/0138008 A1和US 2015/0344912 A1，以及美国专利8,697,359、8,771,945、8,945,839、8,999,641、8,993,233、8,895,308、8,865,406、8,889,418、8,871,445、8,889,356、8,932,814、8,795,965、和8,906,616。Cpf1内切核酸酶和相应的指导RNA和PAM位点在美国专利申请公开2016/0208243 A1中披露。
在一些情况下，希望的基因组修饰涉及同源重组，其中由RNA指导的核酸酶和一种或多种指导RNA产生靶核苷酸序列中的一个或多个双链DNA断裂，随后使用同源重组机制(同源定向修复)，修复该一个或多个断裂。在这样的情况下，将编码待在双链断裂处插入或敲入的希望的核苷酸序列的供体模板提供至细胞或受试者；合适的模板的实例包括单链DNA模板和双链DNA模板(例如，与本文描述的多肽连接)。通常，以单链DNA的形式，提供编码小于约50个核苷酸的区域内的核苷酸变化的供体模板；更大的供体模板(例如，多于100个核苷酸)通常作为双链DNA质粒提供。在一些情况下，以足以实现希望的同源定向修复，但是在给定时间段后(例如在一个或多个细胞分裂周期后)不存留于细胞或受试者中的量，将供体模板提供至细胞或受试者。在一些情况下，供体模板具有与靶核苷酸序列(例如同源内源基因组区)相差至少1、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、或更多个核苷酸的核心核苷酸序列。此核心序列侧翼是同源性臂或与靶向的核苷酸序列具有高度序列同一性的区域；在一些情况下，具有高度同一性的区域包括在核心序列的每一侧上的至少10、至少50、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少750、或至少1000个核苷酸。在一些情况下，其中供体模板处于单链DNA的形式，核心序列侧翼是同源性臂，该同源性臂包括在核心序列的每一侧上的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、或至少100个核苷酸。在多种情况下，其中供体模板处于双链DNA的形式，核心序列侧翼是同源性臂，该同源性臂包括在核心序列的每一侧上的至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、或至少1000个核苷酸。在一种情况下，用双切口酶Cas9，将两个单独的双链断裂引入细胞或受试者的靶核苷酸序列(参见Ran等人,Cell[细胞]154:1380-1389,2013)，随后是供体模板的递送。
在一些情况下，组合物包括gRNA和靶向的核酸酶，例如，Cas9，例如，野生型Cas9、切口酶Cas9(例如，Cas9 D10A)、失活Cas9(dCas9)、eSpCas9、Cpf1、C2C1、或C2C3，或编码这样的核酸酶的核酸。通过靶向的突变是否是核苷酸的缺失、取代、或添加，例如靶向的序列的核苷酸缺失、取代、或添加，确定核酸酶和一种或多种gRNA的选择。无催化活性的内切核酸酶，例如，失活Cas9(dCas9，例如，D10A、H840A)与(一个或多个)效应因子结构域的全部或一部分(例如生物活性部分)链连的融合物产生可以与多肽连接的嵌合蛋白，从而通过一个或多个RNA序列(sgRNA)指导该组合物至特定的DNA位点，进而调节一个或多个靶核酸序列的活性和/或表达。
在多种情况下，药剂包括指导RNA(gRNA)，用于进行基因编辑的CRISPR系统。在一些情况下，药剂包括锌指核酸酶(ZFN)或编码ZFN的mRNA，其靶向(例如，切割)植物中基因的核酸序列(例如，DNA序列)。在一些情况下，药剂包括TALEN或编码TALEN的mRNA，其靶向(例如，切割)植物的基因的核酸序列(例如，DNA序列)。
例如，gRNA可以用于CRISPR系统以工程化植物中的基因的改变。在其他实例中，ZFN和/或TALEN可以用于工程化植物中的基因的改变。示例性改变包括插入、缺失(例如，敲除)、易位、反转、单点突变、或其他突变。可以将改变引入细胞中的基因中，例如体外、离体、或体内进行。在一些实例中，改变增加植物中的基因的水平和/或活性。在其他实例中，改变降低植物中的基因的水平和/或活性(例如，敲低或敲除)。在又另一个实例中，改变纠正植物中的基因中的缺陷(例如，引起缺陷的突变)。
在一些情况下，CRISPR系统用于编辑(例如，添加或缺失碱基对)植物中的靶基因。在其他情况下，将CRISPR系统用于引入提前终止密码子，例如由此降低靶基因的表达。仍在其他情况下，将CRISPR系统用于以可逆的方式，例如类似于RNA干扰，关闭靶基因。在一些情况下，将CRISPR系统用于将Cas指导至基因的启动子，由此以位阻方式阻断RNA聚合酶。
在一些情况下，可以生成CRISPR系统以使用以下中描述的技术编辑植物中的基因：例如美国公开号20140068797,Cong,Science[科学]339:819-823,2013；Tsai,NatureBiotechnol.[自然生物技术]32:6 569-576,2014；美国专利号：8,871,445；8,865,406；8,795,965；8,771,945；和8,697,359。
在一些情况下，CRISPR干扰(CRISPRi)技术可以用于转录阻遏植物中的特定基因。在CRISPRi中，工程化的Cas9蛋白(例如，无核酸酶的dCas9、或dCas9融合蛋白，例如，dCas9-KRAB或dCas9-SID4X融合物)可以与序列特异性指导RNA(sgRNA)配对。Cas9-gRNA复合物可以阻断RNA聚合酶，由此干扰转录延伸。复合物还可以通过干扰转录因子结合，阻断转录起始。CRISPRi方法是特异性的，具有最小的脱靶效应并且是可多路共用的，例如可以同时阻遏多于一个基因(例如，使用多个gRNAs)。而且，CRISPRi方法允许可逆的基因抑制。
在一些情况下，CRISPR介导的基因激活(CRISPRa)可以用于植物中的基因的转录激活。在CRISPRa技术中，dCas9融合蛋白募集了转录激活因子。例如，dCas9可以与多肽(例如，激活结构域)(诸如VP64或p65激活结构域(p65D))融合，并且与sgRNA(例如，单个sgRNA或多个sgRNA)一起使用，以激活植物中的一个或多个基因。可以使用多种sgRNA募集多种激活剂-这可以增加激活功效。可以使用多种激活结构域和单个或多个激活结构域。除了将dCas9工程化来募集激活剂，还可以将sgRNA工程化来募集激活剂。例如，可以将RNA适配体并入sgRNA来募集蛋白(例如，激活结构域)，诸如VP64。在一些实例中，协同激活介导因(SAM)系统可以用于转录激活。在SAM中，将MS2适配体添加至sgRNA。MS2募集融合至p65AD和热休克因子1(HSF1)的MS2包被蛋白(MCP)。
以下文献更详细地描述了CRISPRi和CRISPRa技术，例如，Dominguez等人,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.[自然综述分子细胞生物学]17:5-15,2016，将其通过引用并入本文。另外，dCas9介导的表观遗传修饰以及使用CRISPR系统的同时激活和阻遏(如Dominguez等人所描述)可以用于调节植物中的基因。
B.异源治疗剂
本文制造的PMP可包括异源治疗剂(例如，影响动物(例如，哺乳动物，例如人)、动物病原体或其病原体媒介，并且可负载到PMP中的药剂)，例如治疗性肽、治疗性核酸(例如，治疗性RNA)、治疗性小分子、或病原体防治剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂或昆虫驱避剂)。负载此类药剂的PMP可与药学上可接受的载体一起配制，以递送至动物、动物病原体或其病原体媒介中。
i.抗细菌剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含抗细菌剂。例如，可以将包含如本文描述的抗生素的PMP组合物以一定量和一定时间施用于动物，该量和时间足以：达到动物内或上抗生素浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和/或处理或预防动物的细菌感染。本文描述的抗细菌剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。在一些情况下，PMP组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的抗细菌剂。
如本文所用，术语“抗细菌剂”是指杀死或抑制细菌(诸如植物病原体细菌)的生长、增殖、分裂、繁殖或扩散的材料，并且包括杀细菌剂(例如，消毒化合物、抗菌化合物、或抗生素)或抑细菌剂(例如，化合物或抗生素)。杀细菌抗生素杀死细菌，而抑细菌抗生素仅减缓其生长或繁殖。
杀细菌剂可以包括消毒剂、抗菌剂、或抗生素。最多使用的消毒剂可以包括：活性氯(即，次氯酸盐(例如，次氯酸钠)、氯胺、二氯异氰脲酸酯和三氯异氰脲酸酯、湿氯、二氧化氯等)；活性氧(过氧化物，诸如乙酸、过硫酸钾、过硼酸钠、过碳酸钠和尿素过水合物)；碘(碘聚维酮(聚维酮-碘、必妥碘(Betadine))；鲁哥氏溶液(Lugol’s solution)、碘酊、碘化非离子型表面活性剂)；浓缩醇(主要是乙醇、1-丙醇(也称为正丙醇)和2-丙醇(称为异丙醇)及其混合物；此外，使用2-苯氧基乙醇以及1-和2-苯氧基丙醇)；酚类物质(诸如苯酚(也称为石炭酸)，甲酚(与液体钾皂组合称为Lysole)，卤化(氯化、溴化)苯酚，诸如六氯酚、三氯生、三氯苯酚、三溴苯酚、五氯苯酚、Dibromol及其盐)；阳离子表面活性剂，诸如一些季铵阳离子(诸如氯化苯甲烃铵、十六烷基三甲基溴化铵或十六烷基三甲基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵、十六烷基吡啶鎓氯化物、苯乙铵氯化物)以及其他；非季铵盐化合物，诸如双氯苯双胍己烷(chlorhexidine)、glucoprotamine、奥替尼啶二盐酸盐等)；强氧化剂，诸如臭氧和高锰酸盐溶液；重金属及其盐，诸如胶质银、硝酸银、氯化汞、苯基汞盐、硫酸铜、氧化-氯化铜、氢氧化铜、辛酸铜、硫酸氯氧化铜、硫酸铜、五水硫酸铜等。重金属及其盐是最大毒性的且对环境有害的杀细菌剂，并且因此，其使用被强烈压制或取消；此外，还有适当浓缩的强酸(磷酸、硝酸、硫酸、氨基磺酸、甲苯磺酸)和碱(氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙)。
作为抗菌剂(即，可以在人体或动物体、皮肤、粘膜、伤口等上使用的杀菌剂)，可以在适当的条件(主要是浓度、pH、温度和对人/动物的毒性)下使用上述几种消毒剂。其中重要的是：适当稀释的氯制剂(即，达康氏溶液(Daquin’s solution)、0.5％次氯酸钠或次氯酸钾溶液(pH调节至pH 7-8)、或0.5％-1％苯磺酰氯胺钠盐溶液(氯胺B))；一些碘制剂，诸如呈各种盖仑制剂(软膏、溶液、伤口膏药)的碘聚维酮、在过去还有鲁哥氏溶液；作为尿素过水合物溶液和pH缓冲的0.1％-0.25％过乙酸溶液的过氧化物；主要用于皮肤抗菌的具有或不具有抗菌添加剂的醇；弱有机酸，诸如山梨酸、苯甲酸、乳酸和水杨酸；一些酚类化合物，诸如六氯酚、三氯生和Dibromol；以及阳离子活性化合物，诸如0.05％-0.5％苯甲烃铵、0.5％-4％双氯苯双胍己烷、0.1％-2％奥替尼啶溶液。
本文描述的PMP组合物可以包含抗生素。可以使用本领域已知的任何抗生素。抗生素通常根据其作用机制、化学结构或活性谱进行分类。
本文描述的抗生素可以靶向任何细菌的功能或生长过程，并且可以是抑细菌的(例如，减缓或阻止细菌生长)或杀细菌的(例如，杀死细菌)。在一些情况下，抗生素是杀细菌抗生素。在一些情况下，杀细菌抗生素是靶向细菌细胞壁的杀细菌抗生素(例如，青霉素和头孢菌素)；靶向细胞膜的杀细菌抗生素(例如，多粘菌素)；或者抑制必需细菌酶的杀细菌抗生素(例如，利福霉素、闰年霉素(lipiarmycins)、喹诺酮类和磺胺类)。在一些情况下，杀细菌抗生素是氨基糖苷类(例如，春雷霉素)。在一些情况下，抗生素是抑细菌抗生素。在一些情况下，抑细菌抗生素靶向蛋白质合成(例如，大环内酯类、林可胺类和四环素类)。本文可以使用的另外类的抗生素包括环脂肽(诸如达托霉素)、甘氨酰环素(如替加环素)、噁唑烷酮类(如利奈唑胺)、或闰年霉素(lipiarmycins)(如非达霉素)。抗生素的实例包括利福平、环丙沙星、强力霉素、氨比西林、和多粘菌素B。本文描述的抗生素可以具有任何水平的靶特异性(例如，窄谱或广谱)。在一些情况下，抗生素是窄谱抗生素，并且因此靶向特异性类型的细菌，诸如革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。可替代地，抗生素可以是靶向宽范围的细菌的广谱抗生素。
适用于处理动物的抗细菌剂的实例包括青霉素(阿莫西林、氨比西林、巴氨西林、羧苄西林、邻氯青霉素、双氯西林、氟氯西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、普鲁卡因青霉素300A.S.、青霉素G钾制剂(Pentids)、Permapen、Pfizerpen、Pfizerpen-AS、威西林(Wycillin)、青霉素V、哌拉西林、匹氨西林、匹美西林、替卡西林)、头孢菌素(头孢乙腈(Cefacetrile)(头孢乙腈(cephacetrile)))、头孢羟氨苄(Cefadroxil)(头孢羟氨苄(cefadroxyl))、头孢氨苄(Cefalexin)(头孢氨苄(cephalexin))、头孢来星(Cefaloglycin)(头孢来星(cephaloglycin))、头孢洛宁(Cefalonium)(头孢洛宁(cephalonium))、头孢噻啶(Cefaloridine)(头孢噻啶(cephaloradine))、头孢噻吩(Cefalotin)(头孢噻吩(cephalothin))、头孢匹林(Cefapirin)(头孢匹林(cephapirin))、头孢曲嗪、头孢氮氟、头孢西酮、头孢唑啉(Cefazolin)(头孢唑啉(cephazolin))、头孢拉定(Cefradine)(头孢拉定(cephradine))、头孢沙定、头孢替唑、头孢克洛、头孢羟唑、头孢美唑、头孢尼西、头孢替坦、头孢西丁、头孢罗齐(Cefprozil)(头孢罗齐(cefproxil))、头孢呋辛、头孢唑南、头孢卡品、头孢达肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢他美、头孢克肟、头孢甲肟、头孢地嗪、头孢噻肟、头孢咪唑、头孢泊肟、头孢特仑、头孢布坦、头孢噻呋、头孢噻林、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢克定、头孢吡肟、头孢瑞南、头孢噻利、头孢唑兰、头孢匹罗、头孢喹肟、头孢吡普、头孢洛林、头孢氯嗪、头孢罗兰、头孢帕罗、头孢卡奈、头孢屈洛、头孢吡酮、头孢三唑、头孢维曲、头孢马替林(Cefmatilen)、Cefmepidium、头孢维星、头孢噁唑、头孢罗替、头孢舒米、头孢呋汀、头孢噻氧、组合(头孢他啶/阿维巴坦、Ceftolozane/他唑巴坦))、单菌霉素(氨曲南)、碳青霉烯(亚胺培南、亚胺培南/西司他丁、多利培南、厄他培南、美洛培南、美洛培南/法硼巴坦)、大环内酯(阿奇霉素、红霉素、克拉霉素、地红霉素、罗红霉素、泰利霉素)、林可酰胺(克林霉素、林可霉素)、链阳菌素(原始霉素、奎奴普丁/达福普丁)、氨基糖苷(阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、链霉素、妥布霉素)、喹诺酮(氟甲喹、萘啶酸、噁喹酸、吡咯米酸、吡哌酸、罗索沙星(第二代)、环丙沙星、依诺沙星、洛美沙星、那氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、芦氟沙星、巴洛沙星、加替沙星、格雷沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、帕珠沙星、司帕沙星、替马沙星、妥舒沙星、贝西沙星、德拉沙星、克林沙星、吉米沙星、普卢利沙星、西他沙星、曲伐沙星)、磺酰胺(磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑)、四环素(地美环素、强力霉素、米诺环素、氧四环素、四环素、替加环素)、其他(脂肽、氟喹诺酮、脂糖肽、头孢菌素、大环物、氯霉素、甲硝唑、磺甲硝咪唑、呋喃妥因、糖肽、万古霉素、替考拉宁、脂糖肽、替拉万星、噁唑烷酮、利奈唑胺、环丝氨酸2、利福霉素、利福平、利福布丁、利福喷丁、利福拉齐、多肽、杆菌肽、多粘菌素B、结核放线菌素、紫霉素、卷曲霉素)。
本领域技术人员应当认识到，组合物中每种抗生素的合适的浓度取决于诸如功效、抗生素的稳定性、不同抗生素的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
ii.抗真菌剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含抗真菌剂。例如，包含如本文描述的抗真菌剂的PMP组合物可以以一定量和一定时间施用于动物，该量和时间足以在动物内或上达到抗真菌剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和/或处理或预防动物的真菌感染。本文描述的抗真菌剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。在一些情况下，PMP组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的抗真菌剂。
如本文所用，术语“杀真菌剂”或“抗真菌剂”是指杀死或抑制真菌(诸如作为针对动物的病原体的真菌)的生长、增殖、分裂、繁殖或扩散的物质。商业上已生产了许多不同类型的抗真菌剂。抗真菌剂的非限制性实例包括：烯丙胺(阿莫罗芬(Amorolfin)、布替萘芬、萘替芳、特比萘芬)、咪唑((联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、酮康唑、异康唑、卢立康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫益康唑、噻康唑、特康唑)；三唑(阿巴康唑、艾氟康唑、氟康唑、艾沙康唑、依曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑(Ravuconazole)、特康唑、伏立康唑)、噻唑(阿巴芬净)、多烯(两性霉素B、制霉菌素、纳他霉素、曲古霉素)、棘白菌素(阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净)、其他(托萘酯、氟胞嘧啶、布替萘芬、灰黄霉素、环匹罗司、硫化硒、他伐硼罗(Tavaborole))。本领域技术人员应当认识到，组合物中每种抗真菌剂的合适的浓度取决于诸如功效、抗真菌剂的稳定性、不同抗真菌剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
iii.杀昆虫剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含杀昆虫剂。例如，杀昆虫剂可以降低(例如，降低生长或杀死)动物病原体的昆虫媒介的适应度。可以使包含如本文描述的杀昆虫剂的PMP组合物以一定量和一定时间与昆虫接触，该量和时间足以：(a)达到昆虫内或上杀昆虫剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和(b)降低昆虫的适应度。在一些情况下，杀昆虫剂可以降低(例如，降低生长或杀死)寄生昆虫的适应度。可以使包含如本文描述的杀昆虫剂的PMP组合物以一定量和一定时间与寄生昆虫或被其感染的动物接触，该量和时间足以：(a)达到寄生昆虫内或上杀昆虫剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和(b)降低寄生昆虫的适应度。本文描述的杀昆虫剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。在一些情况下，PMP组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的杀昆虫剂。
如本文所用，术语“杀昆虫剂(insecticide或insecticidal agent)”是指杀死或抑制昆虫(诸如动物病原体或寄生昆虫的昆虫媒介)的生长、增殖、繁殖、或扩散的物质。杀昆虫剂的非限制性实例在表4中示出。合适的杀昆虫剂的另外的非限制性实例包括生物制剂、激素或信息素(诸如印楝素)、芽孢杆菌属(Bacillus)物种、白僵菌属(Beauveria)物种、可得蒙(codlemone)、绿僵菌属(Metarrhizium)物种、拟青霉属(Paecilomyces)物种、thuringiensis、和轮枝孢属(Verticillium)物种；以及具有未知或非特定的作用机理的活性化合物，诸如熏剂(诸如磷化铝、甲基溴和硫酰氟)，和选择性进食抑制剂(诸如冰晶石、氟啶虫酰胺和吡蚜酮)。本领域技术人员应当认识到，组合物中每种杀昆虫剂的合适的浓度取决于诸如功效、杀昆虫剂的稳定性、不同杀昆虫剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
表4.杀昆虫剂的实例
Figure BDA0002947982740000851
Figure BDA0002947982740000861
iv.杀线虫剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含杀线虫剂。在一些情况下，PMP组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的杀线虫剂。例如，杀线虫剂可以降低(例如，降低生长或杀死)寄生线虫的适应度。可以使包含如本文描述的杀线虫剂的PMP组合物以一定量和一定时间与寄生线虫或被其感染的动物接触，该量和时间足以：(a)达到靶线虫内或上杀线虫剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和(b)降低寄生线虫的适应度。本文描述的杀线虫剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。
如本文所用，术语“杀线虫剂(nematicide或nematicidal agent)”是指杀死或抑制线虫(诸如寄生线虫)的生长、增殖、繁殖、或扩散的物质。杀线虫剂的非限制性实例在表5中示出。本领域技术人员应当认识到，组合物中每种杀线虫剂的合适的浓度取决于诸如功效、杀线虫剂的稳定性、不同杀线虫剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
表5.杀线虫剂的实例
Figure BDA0002947982740000871
v.抗寄生生物剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含抗寄生生物剂。例如，抗寄生生物剂可以降低(例如，降低生长或杀死)寄生原生动物的适应度。可以使包含如本文描述的抗寄生生物剂的PMP组合物以一定量和一定时间与原生动物接触，该量和时间足以：(a)达到原生动物或被其感染的动物内或上抗寄生生物剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和(b)降低原生动物的适应度。这可以用于处理或预防动物的寄生生物。例如，可以将包含如本文描述的抗寄生生物剂的PMP组合物以一定量和一定时间施用于动物，该量和时间足以：达到动物内或上抗寄生生物剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和/或处理或预防动物的寄生生物(例如，寄生线虫、寄生昆虫、或原生动物)感染。本文描述的抗寄生生物剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。在一些情况下，PMP组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的抗寄生生物剂。
如本文所用，术语“抗寄生生物剂(antiparasitic或antiparasitic agent)”是指杀死或抑制寄生生物(诸如寄生原生动物、寄生线虫、或寄生昆虫)的生长、增殖、繁殖、或扩散的物质。抗寄生生物剂的实例包括抗蠕虫剂(苄酚宁、乙胺嗪、伊维菌素、氯硝柳胺、哌嗪、吡喹酮、噻嘧啶、扑蛲灵(Pyrvinium)、苯并咪唑、阿苯达唑、氟苯达唑、甲苯咪唑、噻苯咪唑、左旋咪唑、硝唑尼特、蒙内庞特(Monopantel)、艾莫德斯(Emodepside)、螺吲哚(Spiroindole))、杀疥螨剂(苯甲酸苄酯、苯甲酸苄酯/双硫仑、林丹、马拉松、扑灭司林)、杀虱剂(胡椒基丁醚/除虫菊精、多杀菌素、莫昔克丁)、杀疥螨剂(克罗米通)、抗绦虫剂(氯硝柳胺、Pranziquantel、阿苯达唑)、抗阿米巴剂(利福平、两性霉素B)；或抗原生动物剂(美拉胂醇、依洛尼塞、甲硝唑、磺甲硝咪唑、米替福新、青蒿素)。在某些情况下，抗寄生生物剂可以用于处理或预防牲畜动物的感染，例如左旋咪唑、芬苯达唑、奥芬达唑、阿苯达唑、莫昔克丁、依立诺克丁、多拉菌素、依维菌素、或氯舒隆。本领域技术人员应当认识到，组合物中每种抗寄生生物剂的合适的浓度取决于诸如功效、抗寄生生物剂的稳定性、不同抗寄生生物剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
vi.抗病毒剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含抗病毒剂。包含如本文描述的抗病毒剂的PMP组合物可以以一定量和一定时间施用于动物，该量和时间足以达到动物内或上抗病毒浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和/或处理或预防动物的病毒感染。本文描述的抗病毒剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。在一些情况下，PMP组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的抗病毒剂。
如本文所用，术语“抗病毒剂”或“杀病毒剂”是指杀死或抑制病毒(诸如感染动物的病毒病原体)的生长、增殖、繁殖、发育、或扩散的物质。许多药剂可以用作抗病毒剂，包括化学物或生物药剂(例如核酸，例如dsRNA)。可用于本文的抗病毒剂的实例包括阿巴卡韦、阿昔洛韦(Acyclovir)(阿昔洛韦(Aciclovir))、阿德福韦、金刚烷胺、安普那韦(Amprenavir)(安普那韦(Agenerase))、安普利近、阿比多尔、阿扎那韦、立普妥、巴拉维尔(Balavir)、西多福韦、可比韦、度鲁特韦、地瑞那韦、地拉夫定、地达诺新、二十二醇、依度尿苷、依法韦仑、恩曲他滨、恩夫韦地、恩替卡韦、艾柯立韦(Ecoliever)、泛昔洛韦、福米韦生、膦沙那韦、膦甲酸、膦乙醇(Fosfonet)、融合抑制剂、更昔洛韦、伊巴他滨、Imunovir、疱疹净、咪喹莫特、茚地那韦、肌苷、整合酶抑制剂、III型干扰素、II型干扰素、I型干扰素、干扰素、拉米夫定、洛匹那韦、洛韦胺、马拉韦罗(Maraviroc)、吗啉胍、甲吲噻腙、奈非那韦、奈韦拉平、索拉非尼(Nexavir)、硝唑尼特、核苷类似物、诺韦、奥司他韦(特敏福)、聚乙二醇化干扰素α-2a、喷昔洛韦、帕拉米韦、普可那利、足叶草毒素、雷特格韦、利巴韦林、金刚烷乙胺、利托那韦、Pyramidine、沙奎那韦、索非布韦、司他夫定、协同增强剂(抗逆转录病毒剂)、特拉匹韦、替诺福韦、替诺福韦酯(Tenofovir disoproxil)、替拉那韦、三氟尿苷、三协维(Trizivir)、曲金刚胺、特鲁瓦达、伐昔洛韦(维德思(Valtrex))、缬更昔洛韦、维克韦罗(Vicriviroc)、阿糖腺苷、Viramidine、扎西他滨、扎那米韦(瑞乐沙(Relenza))、或齐多夫定。本领域技术人员应当认识到，组合物中每种抗病毒剂的合适的浓度取决于诸如功效、抗病毒剂的稳定性、不同抗病毒剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
vii.驱避剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含驱避剂。例如，驱避剂可以驱避动物病原体的媒介，诸如昆虫。本文描述的驱避剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。在一些情况下，PMP组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的驱避剂。
例如，可以使包含如本文描述的驱避剂的PMP组合物以一定量和一定时间与昆虫媒介或媒介的生境接触，该量和时间足以：(a)达到驱避剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和/或(b)相对于对照，降低动物附近或近旁的昆虫的水平。可替代地，可以使包含如本文描述的驱避剂的PMP组合物以一定量和一定时间与动物接触，该量和时间足以：(a)达到驱避剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和/或(b)相对于未处理的动物，降低动物附近或上的昆虫的水平。
熟知的昆虫驱避剂的一些实例包括：苯偶酰；苯甲酸苄酯；2,3,4,5-双(丁-2-烯)四氢糠醛(MGK驱避剂11)；丁氧基聚丙二醇；N-丁基乙酰苯胺；正丁基-6,6-二甲基-5,6-二氢-1,4-吡喃酮-2-甲酸酯(避虫酮)；己二酸二丁酯；邻苯二甲酸二丁酯；琥珀酸二正丁酯(驱虫特)；N,N-二乙基-间甲苯酰胺(DEET)；驱蚊灵(内型,内型)-二甲基二环[2.2.1]庚-5-烯-2,3-二甲酸酯)；邻苯二甲酸二甲酯；2-乙基-2-丁基-1,3-丙二醇；2-乙基-1,3-己二醇(Rutgers 612)；异辛可部酸二正丙酯(MGK驱避剂326)；2-苯基环己醇；对甲烷-3,8-二醇，和N,N-二乙基琥珀酰胺酸正丙酯。其他驱避剂包括香茅油、邻苯二甲酸二甲酯、正丁基均三甲苯基氧化物草酸酯和2-乙基己二醇-1,3(参见Kirk-Othmer Encyclopedia of ChemicalTechnology[柯克-奥瑟默化学技术百科全书],第2版,第11卷:724-728；和The CondensedChemical Dictionary[简明化学词典],第8版,第756页)。
在一些情况下，驱避剂是昆虫驱避剂，包括合成或非合成昆虫驱避剂。合成昆虫驱避剂的实例包括邻氨基苯甲酸甲酯以及其他基于邻氨基苯甲酸酯的昆虫驱避剂、苯甲醛、DEET(N,N-二乙基-间甲苯酰胺)、驱蚊灵、邻苯二甲酸二甲酯、埃卡瑞丁(icaridin)(即，派卡瑞丁(picaridin)、羟哌酯(Bayrepel)、和KBR 3023)、避虫酮(例如，如用于“6-2-2”混合物(60％邻苯二甲酸二甲酯、20％避虫酮、20％乙基己二醇)、IR3535(3-[N-丁基-N-乙酰基]-氨基丙酸，乙酯)、甲氧苄氟菊酯、扑灭司林、SS220、或三环癸烯基烯丙基醚。天然昆虫驱避剂的实例包括紫珠(紫珠属(Callicarpa))叶、桦树树皮、香杨梅(bog myrtle)(MyricaGale)、猫薄荷油(例如，荆芥内酯)、香茅油、柠檬桉(Corymbia citriodora；例如p-薄荷烷-3,8-二醇(PMD))的精油、苦楝油、柠檬草、来自互生叶白千层(Melaleuca alternifolia)叶的茶树油、烟草、或其提取物。
III.使用方法
本文中的PMP可用于多种农业或治疗方法中。PMP(例如，包括本文描述的修饰的PMP)的使用方法的实例在下面进一步描述。
A.向植物的递送
本文提供了将PMP组合物(例如，包括本文描述的修饰的PMP)递送至植物的方法，例如，通过使植物或其部分与PMP组合物接触。在一些情况下，可使用不含异源功能剂的PMP处理植物。在其他情况下，PMP包括异源功能剂(例如杀有害生物剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀病毒剂、除草剂))、有害生物防治剂(例如，驱避剂)、肥料剂或植物修饰剂。
在一个方面，本文提供了一种增加植物的适应度的方法，该方法包括向该植物递送本文描述的PMP组合物(例如，以有效的量和持续时间)以相对于未处理的植物(例如，未递送该PMP组合物的植物)增加该植物的适应度。
由于递送PMP组合物而导致的植物适应度的增加可以以许多种方式表现，例如从而导致植物的生产更好，例如产率提高、植物活力改善、或从植物收获的产品的品质改善。改善的植物产率涉及相对于在相同条件下但不应用本发明组合物而生产的植物的相同产品的产率或与应用常规农业药剂相比，按可测量量计植物的产品的产率的增加(例如，如通过植物生物质、谷粒、种子或果实产率、蛋白质含量、碳水化合物或油含量或叶面积测量的)。例如，产率可以增加至少约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、或大于100％。产率可以以在某种基础上植物或植物的产品的按重量或体积计量来表示。基础可以以时间、生长面积、生产的植物的重量、或所用原料的量来表示。例如，此类方法可以增加植物组织的产率，这些植物组织包括但不限于：种子、果实、仁、圆荚、块茎、根和叶。
由于递送PMP组合物而导致的植物适应度的增加也可以通过其他方法来测量，诸如相对于在相同条件下但不施用本发明组合物或施用常规农业药剂而生产的植物的相同因素，以活力等级的增加或改善、植株密度(stand)(植物数量/单位面积)、植物高度、秆围、秆长、叶数量、叶尺寸、植物冠层、视觉外观(诸如更绿的叶颜色)、根等级、出苗、蛋白质含量、分蘖的增加、更大的叶、更多的叶、更少的死的基生叶、分蘖更强、所需肥料更少、所需种子更少、分蘖更多产、开花更早、提早的谷粒或种子成熟度、更少的植物节(verse)(倒伏)、芽生长的增加、更早萌发、或这些因素的任何组合，按可测量或可察觉的量来测量。
本文提供了修饰或增加植物的适应度的方法，该方法包括向植物递送有效量的本文提供的PMP组合物，其中该方法修饰该植物并由此相对于未处理的植物引入或增加该植物中的有益性状(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％，70％、80％、90％、100％或大于100％)。特别地，相对于未处理的植物，该方法可增加植物的适应度(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％)。
在一些情况下，植物适应度的增加是抗病性、耐旱性、耐热性、耐冷性、耐盐性、金属耐性、除草剂耐性、化学耐性、水分利用效率，氮利用、氮胁迫抗性、固氮作用、有害生物抗性、食草动物抗性、病原抗性、产率、限水条件下产率、活力、生长、光合能力、营养、蛋白质含量、碳水化合物含量、含油量、生物质、芽长度、根长度、根构型、种子重量，或可收获产品的量的增加(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％)。
在一些情况下，适应度的增加是发育、生长、产率、对非生物胁迫原的抗性或对生物胁迫原的抗性的增加(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％)。非生物胁迫是指植物或植物部分遭受的如下环境胁迫条件，包括例如干旱胁迫、盐胁迫、热胁迫、冷胁迫和低养分胁迫。生物胁迫是指植物或植物部分遭受的如下环境胁迫条件，包括例如线虫胁迫、昆虫取食胁迫、真菌病原体胁迫、细菌病原体胁迫或病毒病原体胁迫。胁迫可能是暂时的，例如几个小时、几天、几个月，或是永久的，例如持续植物的生命。
在一些情况下，植物适应度的增加是从植物收获的产品质量的增加(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％)。例如，植物适应度的增加可以是从植物收获的产品的商业上有利的特征(例如，味道或外观)的改善。在其他情况下，植物适应度的增加是从植物收获的产品的保质期的增加(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％)。
可替代地，适应度的增加可能是对人或动物健康有益的性状的改变，例如过敏原产生的减少。例如，适应度的增加可能是刺激动物(例如，人)免疫应答的过敏原(例如，花粉)的产生降低(例如，降低约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％)。
植物的修饰(例如，适应度的增加)可能产生自一个或多个植物部分的修饰。例如，可以通过接触植物的叶、种子、花粉、根、果实、芽、花、细胞、原生质体或组织(例如，分生组织)来修饰植物。因此，在另一个方面，本文提供了一种增加植物的适应度的方法，该方法包括使植物的花粉与有效量的本文的PMP组合物接触，其中相对于未处理的植物，该方法增加植物的适应度(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％)。
在又另一个方面，本文提供了一种增加植物的适应度的方法，该方法包括使植物的种子与有效量的本文披露的PMP组合物接触，其中相对于未处理的植物，该方法增加植物的适应度(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％)。
在另一个方面，本文提供了一种包括使植物的原生质体与有效量的本文的PMP组合物接触的方法，其中相对于未处理的植物，该方法增加植物的适应度(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或大于100％)。
在另外的方面，本文提供了一种增加植物的适应度的方法，该方法包括使植物的植物细胞与有效量的本文的PMP组合物接触，其中相对于未处理的植物，该方法增加植物的适应度(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或大于100％)。
在另一个方面，本文提供了一种增加植物的适应度的方法，该方法包括使植物的分生组织与有效量的本文的PMP组合物接触，其中相对于未处理的植物，该方法增加植物的适应度(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或大于100％)。
在另一个方面，本文提供了一种增加植物的适应度的方法，该方法包括使植物的胚胎与有效量的本文的PMP组合物接触，其中相对于未处理的植物，该方法增加植物的适应度(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或大于100％)。
在PMP或其组合物中包含除草剂的情况下，方法可以进一步用于降低杂草的适应度或杀死杂草。在此类情况下，与未处理的杂草(例如，未施用PMP组合物的杂草)相比，该方法可以有效地将杂草的适应度降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或更大。例如，方法可以有效地杀死杂草，从而与未处理的植物相比，将杂草群体降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或更大。在一些情况下，方法显著消除杂草。本文进一步描述了可以根据本发明的方法处理的杂草的实例。
i.植物
可以将多种植物递送至本文描述的PMP组合物或用其处理。可以根据本发明方法递送PMP组合物的(即，“处理的”)植物包括整株植物及其部分，包括但不限于芽营养器官/结构(例如，叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳、子叶、和胚胎)和果实(成熟的子房)、植物组织(例如，维管组织、基本组织等)和细胞(例如，保卫细胞、卵细胞等)及其子代。植物部分可以进一步指诸如以下的植物部分：芽、根、茎、种子、托叶、叶、花瓣、花、胚珠、苞片、枝、叶柄、节间、树皮、短柔毛、分蘖、根茎、叶状体(frond)、叶片、花粉、雄蕊等。
可以在本文披露的方法中处理的植物的类别包括高等植物和低等植物类别，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨类、木贼类植物、裸蕨植物、石松类植物、苔藓植物、和藻类(例如，多细胞藻类或单细胞藻类)。可以根据本发明方法处理的植物进一步包括任何维管植物，例如单子叶或双子叶植物或裸子植物，包括但不限于苜蓿、苹果、拟南芥属物种、香蕉、大麦、卡诺拉油菜、蓖麻籽、菊花、三叶草、可可、咖啡、棉花、棉籽、玉米、海甘蓝、蔓越莓、十字花科植物、黄瓜、石斛兰、薯蓣、桉树、羊茅草、亚麻、唐菖蒲、百合科、亚麻籽、粟、甜瓜、芥菜、燕麦、油棕、油菜、番木瓜、花生、菠萝、观赏植物、菜豆、马铃薯、油菜籽、水稻、黑麦、黑麦草、红花、芝麻、高粱、大豆、甜菜、甘蔗、向日葵、草莓、烟草、番茄、草皮草、小麦和蔬菜作物(诸如莴苣、芹菜、西兰花、花椰菜、葫芦)；水果树和坚果树，诸如苹果、梨、桃、橙子、葡萄柚、柠檬、酸橙、扁桃、山核桃、胡桃、榛子；藤本植物，诸如葡萄(例如，葡萄园)、猕猴桃、蛇麻子(hop)；水果灌木和悬钩子，诸如覆盆子、黑莓、醋栗；林木，诸如水曲柳、松树、冷杉、枫树、橡树、栗树、杨树(popular)；与苜蓿、卡诺拉油菜、蓖麻籽、玉米、棉花、海甘蓝、亚麻、亚麻籽、芥菜、油棕、油菜、花生、马铃薯、水稻、红花、芝麻、大豆、甜菜、向日葵、烟草、番茄、和小麦。可以根据本发明的方法处理的植物包括任何作物植物，例如，草料作物、油籽作物、谷物作物、水果作物、蔬菜作物、纤维作物、香料作物、香料作物、草皮作物、糖作物、饮料作物、和森林作物。在某些情况下，在该方法中处理的作物植物是大豆植物。在其他某些情况下，作物植物是小麦。在某些情况下，作物植物是玉米。在某些情况下，作物植物是棉花。在某些情况下，作物植物是苜蓿。在某些情况下，作物植物是甜菜。在某些情况下，作物植物是水稻。在某些情况下，作物植物是马铃薯。在某些情况下，作物植物是番茄。
在某些情况下，植物是作物。此类作物植物的实例包括但不限于单子叶植物和双子叶植物，包括但不限于饲养料或草料豆类、观赏植物、食物作物、树木、或灌木，选自枫属物种(Acer spp)、葱属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、凤梨(Ananascomosus)、旱芹(Apium graveolens)、花生属物种(Arachis spp)、石刁柏(Asparagusofficinalis)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(例如，欧洲油菜(Brassica napus)、芜菁(Brassica rapa ssp.)(卡诺拉油菜、油菜、白菜型油菜(turniprape))、野茶树(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、栗属物种(Castanea spp.)、栽培菊苣(Cichoriumendivia)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑橘属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocosspp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylusspp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、黄瓜属物种(Cucumis spp.)、胡萝卜(Daucus carota)、水青冈属物种(Fagus spp.)、无花果(Ficuscarica)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属违章(Glycinespp.)(例如，大豆(Glycine max)、黄豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵属物种(Helianthus spp.)(例如，向日葵)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属物种(Hordeum spp.)(例如，大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、胡桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、亚麻(Linumusitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、莲属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffaacutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、蕃茄属物种(Lycopersicon spp.)(例如，番茄(Lycopersicon esculenturn))、圣女果(Lycopersicon lycopersicum)、梨形番茄(Lycopersicon pyriforme)、苹果属物种(Malus spp.)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、薄荷属物种(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、稻属物种(Oryzaspp.)(例如，稻(Oryza sativa))、宽叶野生稻(Oryza latifolia)、黍稷(Panicummiliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、西番莲(Passiflora edulis)、欧芹(Petroselinum crispum)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、李属物种(Prunus spp.)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercusspp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribesspp.)、蓖麻(Ricinus communis)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharumspp.)、柳属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis spp.)、茄属物种(Solanum spp.)(例如，马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanum integrifolium)或番茄(Solanumlycopersicum))、双色高粱(Sorghum bicolor)、石茅(Sorghum halepense)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、罗晃子(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、三叶草属物种(Trifolium spp.)、小黑麦(Triticosecale rimpaui)、小麦属物种(Triticum spp.)(例如，普通小麦(Triticum aestivum))、硬粒小麦(Triticum durum)、圆锥小麦(Triticumturgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、Triticum sativum或Triticum vulgare)、越橘属物种(Vaccinium spp.)、蚕豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇菜(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、和玉米(Zea mays)。在某些实施例中，作物植物是水稻、油菜、卡诺拉油菜、大豆、玉米(玉蜀黍(maize))、棉花、甘蔗、苜蓿、高粱、或小麦。
在某些情况下，组合物和方法可以用于处理收获后的植物或植物部分、食物或饲料产品。在一些情况下，食物或饲料产品是非植物性食物或饲料产品(例如，人、兽医动物、或牲畜可食用的产品(例如，蘑菇))。
用于本发明的植物或植物部分包括任何植物发育阶段的植物。在某些情况下，可以在萌发、幼苗生长、营养生长、和繁殖生长的阶段进行递送。在某些情况下，向植物的递送在营养生长和繁殖生长阶段期间进行。可替代地，可以进行向种子的递送。营养生长和繁殖生长阶段在本文中也称为“成株”或“成熟”植物。
ii.杂草
在PMP或其组合物中包含除草剂的情况下，方法可以进一步用于降低杂草的适应度或杀死杂草。在此类情况下，与未处理的杂草(例如，未施用PMP组合物的杂草)相比，该方法可以有效地将杂草的适应度降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或更大。例如，方法可以有效地杀死杂草，从而与未处理的植物相比，将杂草群体降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或更大。在一些情况下，方法显著消除杂草。本文进一步描述了可以根据本发明的方法处理的杂草的实例。
如本文所用，术语“杂草”是指在不希望其生长的地方生长的植物。此类植物典型地是侵入性的，并且有时是有害的或具有变得有害的风险。可以用本发明的PMP组合物处理杂草来减小或消除植物的存在、生存力、或繁殖。例如并且不限于此，这些方法可以用于靶向已知损害植物的杂草。例如并且不限于此，杂草可以是以下科的组的任何成员：禾本科(Gramineae)、伞形花科(Umbelliferae)、蝶形花科(Papilionaceae)、十宇花科(Cruciferae)、锦葵科(Malvaceae)、大戟科(Eufhorbiaceae)、菊科(Compositae)、藜科(Chenopodiaceae)、紫堇科(Fumariaceae)、Charyophyllaceae、报春花科(Primulaceae)、牻牛儿苗科(Geraniaceae)、蓼科(Polygonaceae)、灯芯草科(Juncaceae)、莎草科(Cyperaceae)、番杏科(Aizoaceae)、菊科(Asteraceae)、旋花科(Convolvulaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、蓼科(Polygonaceae)、马齿苋科(Portulaceae)、茄科(Solanaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、苦木科(Simaroubaceae)、木通科(Lardizabalaceae)、百合科(Liliaceae)、苋科(Amaranthaceae)、葡萄科(Vitaceae)、豆科(Fabaceae)、报春花科(Primulaceae)、夹竹桃科(Apocynaceae)、五加科(Araliaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、萝摩科(Asclepiadaceae)、卫矛科(Celastraceae)、罂粟科(Papaveraceae)、柳叶菜科(Onagraceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、唇形科(Lamiaceae)、鸭跖草科(Commelinaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、川续断科(Dipsacaceae)、紫草科(Boraginaceae)、木賊科(Equisetaceae)、牛儿苗科(Geraniaceae)、茜草科(Rubiaceae)、大麻科(Cannabaceae)、金丝桃科(Hyperiacaceae)、凤仙花科(Balsaminaceae)、半边莲科(Lobeliaceae)、忍冬科(Caprifoliaceae)、紫茉莉科(Nyctaginaceae)、酢浆草料(Oxalidaceae)、葡萄科(Vitaceae)、荨麻科(Urticaceae)、水龙骨科(Polypodiaceae)、漆树科(Anacardiaceae)、菝葜科(Smilacaceae)、天南星科(Araceae)、桔梗科(Campanulaceae)、香蒲科(Typhaceae)、败酱科(Valerianaceae)、马鞭草科(Verbenaceae)、堇菜科(Violaceae)。例如并且不限于此，杂草可以是由以下组成的组的任何成员：硬直黑麦草(Lolium Rigidum)、Amaramthus palmeri、苘麻(Abutilontheopratsi)、假高粱(Sorghum halepense)、加拿大蓬(Conyza Canadensis)、倒刺狗尾草(Setaria verticillata)、荠(Capsella pastoris)、和Cyperus rotundas。另外的杂草包括例如刺轴含羞草(Mimosapigra)、槐叶苹属(salvinia)、香苦草属(hyptis)、决明属(senna)、noogoora、毛刺草(burr)、棉叶麻风树(Jatropha gossypifolia)、扁轴木(Parkinsonia aculeate)、香泽兰(Chromolaena odorata)、橡胶紫茉莉(Cryptoslegiagrandiflora)、或须芒草(Andropogon gayanus)。杂草可以包括单子叶植物(例如，剪股颖属(Agrostis)、看麦娘属(Alopecurus)、燕麦属(Avena)、雀麦属(Bromus)、莎草属(Cyperus)、马唐属(Digitaria)、稗属(Echinochloa)、黑麦草属(Lolium)、雨久花属(Monochoria)、筒轴茅属(Rottboellia)、慈姑属(Sagittaria)、藨草属(Scirpus)、狗尾草属(Setaria)、黄花稔属(Sida)或蜀黍(Sorghum))或双子叶植物(苘麻属(Abutilon))、苋属(Amaranthus)、藜属(Chenopodium)、菊属(Chrysanthemum)、假蓬属(Conyza)、猪殃殃属(Galium)、番薯属(Ipomoea)、旱金莲属(Nasturtium)、白芥属(Sinapis)、茄属(Solanum)、繁缕属(Stellaria)、婆婆纳属(Veronica)、堇菜属(Viola)或苍耳属(Xanthium))。
组合物和相关方法可以用于预防病原体或病原体媒介的侵染或减少病原体或病原体媒介在它们住居的任何生境中(例如，动物的外部，例如在植物、植物部分(例如，roots,fruits and seeds)上；在土壤、水中或上；或在另一种病原体或病原体媒介生境上的数量。因此，这些组合物和方法可以通过例如杀死、伤害或减慢媒介的活动来减少病原体媒介的损害作用，并且可以从而控制病原体向动物的扩散。本文披露的组合物可以用于防治、杀死、伤害、麻痹处于任何发育阶段(例如，它们的卵、若虫、龄虫、幼虫(larvae)、成虫、幼龄虫(juvenile)、或干燥形式)的任何病原体或病原体媒介中的任何一种或多种，或减少其活动。这些方法中的每一种的细节将在下面进一步描述。
B.向植物有害生物的递送
本文提供了将PMP组合物(例如，包括本文描述的修饰的PMP)递送至植物有害生物的方法，例如，通过使植物有害生物与PMP组合物接触。在一些情况下，可使用不含异源功能剂的PMP处理植物有害生物。在其他情况下，PMP包括异源功能剂(例如杀有害生物剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀病毒剂、或除草剂))、有害生物防治剂(例如，驱避剂)。例如，方法可以用于降低有害生物的适应度，例如以作为递送PMP组合物的结果而预防或处理有害生物侵染。
在一个方面，本文提供了一种降低有害生物的适应度的方法，该方法包括向该有害生物递送本文描述的PMP组合物(例如，以有效量和有效持续时间)以相对于未处理的有害生物(例如，未递送该PMP组合物的有害生物)降低该有害生物的适应度。
在一个方面，本文提供了一种降低(例如，处理)具有真菌感染的植物中的真菌感染的方法，其中该方法包括向该植物有害生物递送包含多个PMP的PMP组合物(例如，本文描述的PMP组合物)。
在另一个方面，本文提供了一种降低(例如，处理)具有真菌感染的植物中的真菌感染的方法，其中该方法包括向该植物有害生物递送包含多个PMP的PMP组合物(例如，本文描述的PMP组合物)，并且其中该多个PMP包含抗真菌剂。在一些情况下，抗真菌剂是核酸，该核酸抑制引起真菌感染的真菌中基因(例如，dcl1和dcl2(即，dcl1/2)的表达。在一些情况下，真菌感染是由真菌引起的，该真菌属于核盘霉属物种(Sclerotinia spp.)(例如，核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum))、葡萄孢属物种(Botrytis spp.)(例如，灰葡萄孢菌)、曲霉属物种(Aspergillus spp.)、镰孢属物种(Fusarium spp.)、或青霉属物种(Penicilliumspp.)。在一些情况下，组合物包含从拟南芥属质外体EV产生的PMP。在一些情况下，方法降低或显著消除真菌感染。
在另一个方面，本文提供了一种降低(例如，处理)具有细菌感染的植物中的细菌感染的方法，其中该方法包括向该植物有害生物递送包含多个PMP的PMP组合物(例如，本文描述的PMP组合物)。
在另一个方面，本文提供了一种降低(例如，处理)具有细菌感染的植物中的细菌感染的方法，其中该方法包括向该植物有害生物递送包含多个PMP的PMP组合物，并且其中该多个PMP包含抗细菌剂。在一些情况下，抗细菌剂是链霉素。在一些情况下，细菌感染是由细菌引起的，该细菌属于假单胞菌属物种(Pseudomonas spp)(例如，丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae))。在一些情况下，组合物包含从拟南芥属质外体EV产生的PMP。在一些情况下，方法降低或显著消除细菌感染。
在另一个方面，本文提供了一种降低昆虫植物有害生物的适应度的方法，其中该方法包括向该昆虫植物有害生物递送包含多个PMP的PMP组合物(例如，本文描述的PMP组合物)。
在另一个方面，本文提供了一种降低昆虫植物有害生物的适应度的方法，其中该方法包括向该植物有害生物递送包含多个PMP的PMP组合物(例如，本文描述的PMP组合物)，并且其中该多个PMP包含杀昆虫剂。在一些情况下，杀昆虫剂是肽核酸。在一些情况下，昆虫植物有害生物是蚜虫。在一些情况下，昆虫植物有害生物是鳞翅目昆虫(例如，草地贪夜蛾)。在一些情况下，相对于未处理的昆虫植物有害生物，该方法降低昆虫植物有害生物的适应度
在另一个方面，本文提供了一种降低线虫植物有害生物的适应度的方法，其中该方法包括向该线虫植物有害生物递送包含多个PMP的PMP组合物(例如，本文描述的PMP组合物)。
在另一个方面，本文提供了一种降低线虫植物有害生物的适应度的方法，其中该方法包括向该线虫植物有害生物递送包含多个PMP的PMP组合物(例如，本文描述的PMP组合物)，并且其中该多个PMP包含杀线虫剂。在一些情况下，杀线虫剂是神经肽(例如，Mi-NLP-15b)。在一些情况下，线虫植物有害生物是玉米根结线虫。在一些情况下，相对于未处理的线虫植物有害生物，该方法降低该线虫植物有害生物的适应度。
在另一个方面，本文提供了一种降低杂草的适应度的方法，其中该方法包括向该杂草递送包含多个PMP的PMP组合物(例如，本文描述的PMP组合物)。
在另一个方面，本文提供了一种降低杂草的适应度的方法，其中该方法包括向该杂草递送包含多个PMP的PMP组合物(例如，本文描述的PMP组合物)，并且其中该多个PMP包含除草剂(例如，草铵膦)。在一些情况下，杂草是印度牛筋草(Indian goosegrass)(蟋蟀草(Eleusine indica))。在一些情况下，相对于未处理的杂草，该方法降低杂草的适应度。
作为递送PMP组合物的结果的有害生物适应度的降低可以以许多种方式表现。在一些情况下，作为递送PMP组合物的结果，有害生物适应度的降低可表现为有害生物的生理学的劣化或下降(例如，健康或存活降低)。在一些情况下，与未施用PMP组合物的有害生物相比，生物体的适应度可以通过一种或多种参数来测量，该一种或多种参数包括但不限于繁殖速率、生育力、寿限、生存力、移动性、繁殖力、有害生物发育、体重、代谢速率或活动、或存活。例如，本文提供的方法或组合物可以有效地降低有害生物的总体健康或降低有害生物的总体存活。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受PMP组合物的有害生物中发现的水平)，有害生物的存活降低大约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。在一些情况下，与未施用PMP组合物的有害生物相比，这些方法和组合物有效降低有害生物繁殖(例如，繁殖速率、生育力)。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受PMP组合物的有害生物中发现的水平)，这些方法和组合物有效地将其他生理参数(诸如移动性、体重、寿限、繁殖力、或代谢速率)降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
在一些情况下，与未施用PMP组合物的有害生物相比，有害生物适应度的降低可表现为有害生物中的一种或多种营养物(例如，维生素、碳水化合物、氨基酸、或多肽)的生产的降低。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受PMP组合物的有害生物中发现的水平)，本文提供的方法或组合物可以有效地将有害生物中的营养物(例如，维生素、碳水化合物、氨基酸、或多肽)的生产降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
在一些情况下，与未施用PMP组合物的有害生物相比，有害生物适应度的降低可表现为有害生物对杀有害生物剂的敏感性的增加和/或有害生物对杀有害生物剂的抗性的降低。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受PMP组合物的有害生物中发现的水平)，本文提供的方法或组合物可以有效地将有害生物对杀有害生物剂的敏感性增加约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。杀有害生物剂可以是本领域已知的任何杀有害生物剂，包括杀昆虫剂。在一些情况下，与未施用PMP组合物的有害生物相比，本文提供的方法或组合物可以通过降低有害生物的将杀有害生物剂代谢或降解成可用底物的能力来增加有害生物对杀有害生物剂的敏感性。
在一些情况下，与未施用PMP组合物的有害生物相比，有害生物适应度的降低可表现为有害生物对化感剂的敏感性的增加和/或有害生物对化感剂的抗性的降低。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受PMP组合物的有害生物中发现的水平)，本文提供的方法或组合物可以有效地将有害生物对化感剂的抗性降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。在一些情况下，化感剂是咖啡因、大豆半胱氨酸蛋白酶抑制剂(soyacystatin)、杀螟松、单萜、二萜酸、或酚类化合物(例如，丹宁酸、类黄酮)。在一些情况下，与未施用PMP组合物的有害生物相比，本文提供的方法或组合物可以通过降低有害生物的将化感剂代谢或降解成可用底物的能力来增加有害生物对化感剂的敏感性。
在一些情况下，与未施用PMP组合物的有害生物相比，本文提供的方法或组合物可以有效地降低有害生物对寄生生物或病原体(例如，真菌的、细菌的、或病毒的病原体或寄生生物)的抗性。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受PMP组合物的有害生物中发现的水平)，本文提供的方法或组合物可以有效地将有害生物对病原体或寄生生物(例如，真菌的、细菌的、或病毒的病原体；或寄生螨)的抗性降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
在一些情况下，与未施用PMP组合物的有害生物相比，本文提供的方法或组合物可以有效地降低有害生物的携带或传播植物病原体(例如，植物病毒(例如，TYLCV)或植物细菌(例如，农杆菌属物种(Agrobacterium spp))的能力。例如，相对于参考水平(例如，在未接受PMP组合物的有害生物中发现的水平)，本文提供的方法或组合物可以有效地将有害生物的携带或传播植物病原体(例如，植物病毒(例如，TYLCV)或植物细菌(例如，农杆菌属物种))的能力降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
另外地或可替代地，在PMP或其组合物中包含除草剂的情况下，方法可以进一步用于降低杂草的适应度或杀死杂草。在此类情况下，与未处理的杂草(例如，未施用PMP组合物的杂草)相比，该方法可以有效地将杂草的适应度降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或更大。例如，方法可以有效地杀死杂草，从而与未处理的植物相比，将杂草群体降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或更大。在一些情况下，方法显著消除杂草。本文进一步描述了可以根据本发明的方法处理的杂草的实例。
在一些情况下，与未施用PMP组合物的有害生物相比，有害生物适应度的降低可表现为其他适应度劣势，诸如对某些环境因素的耐受性(例如，高温或低温耐受性)降低、在某些生境中存活的能力降低、或维持某种饮食的能力降低。在一些情况下，本文提供的方法或组合物可以以本文描述的任何多种方式有效地降低有害生物适应度。此外，PMP组合物可以降低任何数量的有害生物纲、目、科、属、或物种(例如，1个有害生物物种、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、200、250、500、或更多个有害生物物种)中的有害生物适应度。在一些情况下，PMP组合物作用于单一有害生物纲、目、科、属、或物种。
可以使用本领域的任何标准方法来评估有害生物适应度。在一些情况下，可以通过评价单独的有害生物来评估有害生物适应度。可替代地，可以通过评价有害生物群体来评估有害生物适应度。例如，有害生物适应度的降低可表现为与其他昆虫的成功竞争的降低，从而导致有害生物群体规模的减小。
i.真菌
PMP组合物和相关方法可以用于降低真菌的适应度，例如以预防或处理植物中的真菌感染。包括用于将通过使真菌与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至真菌的方法。另外地或可替代地，方法包括通过使植物与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至处于真菌感染的风险或具有真菌感染的植物。
PMP组合物和相关方法适用于递送至真菌，这些真菌引起植物中的真菌疾病，包括由以下引起的疾病：白粉病病原体，例如白粉菌属(Blumeria)物种，例如小麦白粉菌(Blumeria graminis)；叉丝单囊壳属(Podosphaera)物种，例如白叉丝单囊壳(Podosphaera leucotricha)；单丝壳属(Sphaerotheca)物种，例如单丝壳菌(Sphaerotheca fuliginea)；钩丝壳属(Uncinula)物种，例如葡萄钩丝壳(Uncinulanecator)；由以下引起的疾病：锈病病原体，例如胶锈菌属(Gymnosporangium)物种，例如褐色胶锈菌(Gymnosporangium sabinae)；驼孢锈菌属(Hemileia)物种，例如咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)；层锈菌属(Phakopsora)物种，例如豆薯层锈菌(Phakopsorapachyrhizi)和山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae)；柄锈菌属(Puccinia)物种，例如隐匿柄锈菌(Puccinia recondite)、小麦叶锈菌(P.triticina)、禾柄锈菌(P.graminis)或条形柄锈菌(P.striiformis)或大麦柄锈菌(P.hordei)；单胞锈菌属(Uromyces)物种，例如疣顶单胞锈菌(Uromyces appendiculatus)；由来自以下各项的组的病原体引起的疾病：卵菌纲(Oomycetes)，例如白锈菌属(Albugo)物种，例如白锈菌(Algubo candida)；盘梗霉属(Bremia)物种，例如莴苣盘梗霉(Bremia lactucae)；霜霉属(Peronospora)物种，例如豌豆霜霉(Peronospora pisi)、寄生霜霉(P.parasitica)或芸苔霜霉(P.brassicae)；疫霉属(Phytophthora)物种，例如致病疫霉(Phytophthora infestans)；单轴霉属(Plasmopara)物种，例如葡萄单轴霉(Plasmopara viticola)；假霜霉属(Pseudoperonospora)物种，例如葎草假霜霉(Pseudoperonospora humuli)或古巴假霜霉菌(Pseudoperonosporacubensis)；腐霉属(Pythium)物种，例如极腐霉(Pythium ultimum)；例如由以下引起的叶疱病和叶萎蔫病：链格孢属(Alternaria)物种，例如茄链格孢(Alternaria solani)；尾孢属(Cercospora)物种，例如甜菜生尾孢(Cercospora beticola)；枝孢属(Cladiosporium)物种，例如黄瓜枝孢(Cladiosporium cucumerinum)；旋孢腔菌属(Cochliobolus)物种，例如禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus)(分生孢子形式：内脐蠕孢属(Drechslera)，同义：长蠕孢属(Helminthosporium)、宫部旋孢腔菌(Cochliobolus miyabeanus)；炭疽菌属(Colletotrichum)物种，例如莱豆炭疽菌(Colletotrichum lindemuthanium)；锈斑病菌属(Cycloconium)物种，例如油橄榄孔雀斑病菌(Cycloconium oleaginum)；间座壳属(Diaporthe)物种，例如柑桔间座壳(Diaporthe citri)；痂囊腔菌属(Elsinoe)物种，例如柑橘痂囊腔菌(Elsinoe fawcettii)；盘长孢属(Gloeosporium)物种，例如悦色盘长孢(Gloeosporium laeticolor)；小丛壳属(Glomerella)物种，例如于围小丛壳(Glomerellacingulata)；球座菌属(Guignardia)物种，例如葡萄球座菌(Guignardia bidwelli)；小球腔菌属(Leptosphaeria)物种，例如斑点小球腔菌(Leptosphaeria maculans)、颖枯壳小球腔菌(Leptosphaeria nodorum)；稻瘟菌属(Magnaporthe)物种，例如稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)；微座孢属(Microdochium)物种，例如雪霉微座孢(Microdochiumnivale)；球腔菌属(Mycosphaerella)物种，例如禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)、落花生球腔菌(M.arachidicola)和香蕉叶斑病(M.fifiensis)；暗球腔菌属(Phaeosphaeria)物种，例如颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)；核腔菌属(Pyrenophora)物种，例如圆核腔菌(Pyrenophora teres)、偃麦草核腔菌(Pyrenophoratritici repentis)；柱隔孢属(Ramularia)物种，例如柱隔孢叶斑病菌(Ramularia collo-cygni)、白斑柱隔孢(Ramularia areola)；喙孢属(Rhynchosporium)物种，例如大麦云纹病菌(Rhynchosporium secalis)；壳针孢属(Septoria)物种，例如芹菜壳针孢菌(Septoriaapii)、茄壳针孢菌(Septoria lycopersii)；核瑚菌属(Typhula)物种，例如肉孢核瑚菌(Typhula incarnata)；黑星菌属(Venturia)物种，例如苹果黑星病菌(Venturiainaequalis)；例如由以下引起的根病和茎病：伏革菌属(Corticium)物种，例如禾伏革菌(Corticium graminearum)；镰孢属(Fusarium)物种，例如尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)；顶囊壳属(Gaeumannomyces)物种，例如禾顶囊壳(Gaeumannomycesgraminis)；丝核菌属(Rhizoctonia)物种，例如像立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；例如由稻帚枝霉(Sarocladium oryzae)引起的帚枝霉(Sarocladium)病；例如由以下引起的小核菌(Sclerotium)病：小球菌核菌(Sclerotium oryzae)；Tapesia属物种，例如Tapesiaacuformis；根串珠霉属(Thielaviopsis)物种，例如烟草根黑腐病菌(Thielaviopsisbasicola)；例如由以下引起的穗和圆锥花序疾病(包括玉米穗轴)：链格孢属(Alternaria)物种，例如链格孢属物种(Alternaria spp.)；曲霉属(Aspergillus)物种，例如黄曲霉菌(Aspergillus flavus)；枝孢属(Cladosporium)物种，例如芽枝状枝孢(Cladosporiumcladosporioides)；麦角菌属(Claviceps)物种，例如黑麦麦角菌(Claviceps purpurea)；镰孢属物种，例如黄色镰孢(Fusarium culmorum)；赤霉属(Gibberella)物种，例如玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)；明梭孢属(Monographella)物种，例如雪腐明梭孢(Monographella nivalis)；壳针孢属物种，例如颖枯壳针孢(Septoria nodorum)；由以下引起的疾病：黑穗病真菌，例如轴黑粉菌属(Sphacelotheca)物种，例如丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana)；腥黑粉菌属(Tilletia)物种，例如小麦网腥黑粉菌(Tilletiacaries)、小麦矮腥黑穗病菌(T.controversa)；条黑粉菌属(Urocystis)物种，例如隐条黑粉菌(Urocystis occulta)；黑粉菌属(Ustilago)物种，例如裸黑粉菌(Ustilago nuda)、U.nuda tritici；例如由以下引起的果腐病：曲霉属物种，例如黄曲霉菌；葡萄孢属(Botrytis)物种，例如灰葡萄孢菌；青霉属(Penicillium)物种，例如扩展青霉(Penicillium expansum)和产紫青霉(P.purpurogenum)；核盘霉属物种，例如核盘菌；轮枝孢属(Verticilium)物种，例如黑白轮枝孢(Verticilium alboatrum)；种子和土壤传播的腐烂、霉、萎蔫、腐烂和猝倒病，这些疾病例如是由以下引起的：链格孢属(Alternaria)物种，例如由甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)引起；丝囊霉属(Aphanomyces)物种，例如由根腐丝囊霉(Aphanomyces euteiches)引起；壳二孢属(Ascochyta)物种，例如由兵豆壳二孢(Ascochyta lentis)引起；曲霉属物种，例如由黄曲霉菌引起；枝孢属(Cladosporium)物种，例如由多主枝孢(Cladosporium herbarum)引起；旋孢腔菌属(Cochliobolus)物种，例如由禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus)；(分生孢子形式：内脐蠕孢属(Drechslera)、平脐蠕孢属(Bipolaris)，同义：长蠕孢属(Helminthosporium)引起；炭疽菌属(Colletotrichum)物种，例如由球状炭疽菌(Colletotrichum coccodes)引起；镰孢物种，例如由黄色镰孢引起；赤霉属物种，例如由玉蜀黍赤霉引起；壳球孢属(Macrophomina)物种，例如由菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)引起；明梭孢属物种，例如由雪腐明梭孢引起；青霉属物种，例如由扩展青霉引起；茎点霉属(Phoma)物种，例如由黑胫茎点霉(Phoma lingam)引起；拟茎点霉属(Phomopsis)物种，例如由大豆拟茎点菌(Phomopsis sojae)引起；疫霉属(Phytophthora)物种，例如由恶疫霉菌(Phytophthoracactorum)引起；核腔菌属(Pyrenophora)物种，例如由麦类核腔菌(Pyrenophoragraminea)引起；梨孢属(Pyricularia)物种，例如由稻梨孢菌(Pyricularia oryzae)引起；腐霉属物种，例如由极腐霉引起；丝核菌属(Rhizoctonia)物种，例如由立枯丝核菌引起；根霉属(Rhizopus)物种，例如由稻根霉菌(Rhizopus oryzae)引起；小菌核属(Sclerotium)物种，例如由齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)引起；壳针孢属物种，例如由颖枯壳针孢引起；核瑚菌属物种，例如由肉孢核瑚菌引起；轮枝孢属(Verticillium)物种，例如由大丽花轮枝孢引起；例如由以下引起的癌、瘿瘤和鬼帚病(witches’broom)：丛赤壳属(Nectria)物种，例如仁果干癌丛赤壳菌(Nectria galligena)；例如由以下引起的萎蔫病：链核盘菌属(Monilinia)物种，例如核果链核盘菌(Monilinia laxa)；例如由以下引起的叶疱病或叶卷缩病：外担菌属(Exobasidium)物种，例如坏损外担菌(Exobasidium vexans)；外囊菌属(Taphrina)物种，例如畸形外囊菌(Taphrina deformans)；木质植物的衰退病，其例如由以下引起：埃斯卡病(Esca disease)，例如由根霉格孢菌(Phaemoniella clamydospora)、Phaeoacremonium aleophilum和地中海嗜蓝孢孔菌(Fomitiporia mediterranea)；葡萄顶枯病(Eutypa dyeback)，例如由葡萄弯孢壳(Eutypa lata)引起；例如由岛灵芝(Ganodermaboninense)引起的灵芝(Ganoderma)病；例如由木硬孔菌(Rigidoporus lignosus)引起的硬孔菌(Rigidoporus)病；例如由以下引起的花和种子的疾病：葡萄孢属(Botrytis)物种，例如灰葡萄孢菌；例如由以下引起的植物块茎的疾病：丝核菌属物种，例如立枯丝核菌；长蠕孢属(Helminthosporium)物种，例如茄长蠕孢(Helminthosporium solani)；例如由以下引起的根肿病：根肿菌属(Plasmodiophora)物种，例如芸苔根肿菌(Plamodiophorabrassicae)；由以下引起的疾病：细菌病原体，例如黄单胞菌属(Xanthomonas)物种，例如野油菜黄单胞菌稻致病变体(Xanthomonas campestris pv.oryzae)；假单胞菌属(Pseudomonas)物种，例如丁香假单胞菌黄瓜致病变种(Pseudomonas syringaepv.lachrymans)；欧文氏菌属(Erwinia)物种，例如解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)。
例如由以下引起的叶、茎、荚和种子上的真菌疾病：链格孢属叶斑病(Alternarialeaf spot)(链格孢属种细极链格孢(Alternaria spec.atrans tenuissima)、炭疽病(Anthracnose)(Colletotrichum gloeosporoides dematium var.truncatum)、褐斑病(brown spot)(大豆壳针孢菌(Septoria glycines))、尾孢属(cercospora)叶斑病和枯萎病(菊池尾孢菌(Cercospora kikuchii))、笄霉属(choanephora)叶枯病(Choanephorainfundibulifera trispora(同义))、dactuliophora叶枯病(Dactuliophora glycines)、霜霉病(大豆霜霉病(Peronospora manshurica))、内脐蠕孢属枯萎病(Drechsleraglycini)、蛙眼叶斑病(frogeye leaf spot)(大豆尾孢菌(Cercospora sojina))、小光壳属(leptosphaerulina)叶斑病(三叶草小光壳(Leptosphaerulina trifolii))、叶点霉属(phyllostica)叶斑病(大豆生叶点霉(Phyllosticta sojaecola))、荚和茎枯萎病(大豆拟茎点菌(Phomopsis sojae))、白粉病(扩散叉丝壳(Microsphaera diffusa))、棘壳孢属(pyrenochaeta)叶斑病(大豆棘壳孢(Pyrenochaeta glycines))、丝核菌空气枯萎病、叶子枯萎病和网枯萎病(立枯丝核菌)、锈病(豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)、山马蝗层锈菌)、疮痂病(大豆痂圆孢(Sphaceloma glycines))、匍柄霉属(stemphylium)叶枯萎病(葱叶枯匍柄霉Stemphylium botryosum))、靶斑病(target spot)(多主棒孢霉(Corynespora cassiicola))。
例如由以下引起的根和茎基部上的真菌疾病：黑根腐病(猪屎豆丽赤壳菌(Calonectria crotalariae))、木炭腐病(charcoal rot)(菜豆壳球孢菌(Macrophominaphaseolina))、镰孢枯萎病或萎蔫病、根腐病、以及荚和颈腐病(尖孢镰孢、直啄镰孢(Fusarium orthoceras)、半裸镰孢(Fusarium semitectum)、木贼镰孢(Fusariumequiseti))、mycoleptodiscus根腐病(Mycoleptodiscus terrestris)、新赤壳属(neocosmospora)(侵管新赤壳菌(Neocosmospora vasinfecta))、荚和颈枯萎病(菜豆间座壳(Diaporthe phaseolorum))、茎溃疡病(菜豆间座壳北方大豆变种(Diaporthephaseolorum var.caulivora))、疫霉属(phytophthora)腐病(大雄疫霉(Phytophthoramegasperma))、褐茎腐病(brown stem rot)(大豆茎褐腐病菌(Phialophora gregata))、腐霉属(pythium)腐病(瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、畸雌腐霉(Pythiumirregulare)、德巴利腐霉(Pythium debaryanum)、群结腐霉(Pythium myriotylum)、极腐霉(Pythium ultimum))、丝核菌属(rhizoctonia)根腐病、茎腐烂、和猝倒病(立枯丝核菌)、核盘菌属(sclerotinia)茎腐烂(核盘菌)、核盘菌属南方枯萎病(齐整小核菌(Sclerotiniarolfsii))、根串珠霉属(thielaviopsis)根腐病(基生根串珠霉(Thielaviopsisbasicola))。
在某些情况下，真菌是核盘霉属物种(Sclerotinia spp)(核盘菌(Scelrotiniasclerotiorum))。在某些情况下，真菌是葡萄孢属物种(例如，灰葡萄孢菌)。在某些情况下，真菌是曲霉属物种。在某些情况下，真菌是镰孢属物种。在某些情况下，真菌是青霉属物种。
本发明的组合物可用于各种真菌防治应用中。以上描述的组合物可以用于在真菌病原体收获前或收获后防治真菌植物病原体。在一个实施例中，以上描述的任何组合物用于通过将组合物应用于植物、植物周围的区域、或可食用的栽培蘑菇、蘑菇菌柱、或蘑菇堆肥来防治靶病原体，诸如镰孢属物种、葡萄孢属物种、轮枝孢属物种、丝核菌属物种、木霉属物种、或腐霉属物种。在另一个实施例中，本发明的组合物用于防治收获后病原体，诸如青霉属、地丝菌属(Geotrichum)、黑曲霉(Aspergillus niger)或炭疽菌属物种。
表6提供了可以使用本文描述的PMP组合物和相关方法处理或预防的真菌和与其相关的植物疾病的进一步实例。
表6.真菌有害生物
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ii.细菌
PMP组合物和相关方法可以用于降低细菌的适应度，例如以预防或处理植物中的细菌感染。包括用于将通过使细菌与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至细菌的方法。另外地或可替代地，方法包括通过使植物与PMP组合物接触而将生物型杀有害生物剂(biopesticide)递送至处于细菌感染的风险或具有细菌感染的植物。
PMP组合物和相关方法适用于递送至细菌或被其感染的植物，包括以下进一步描述的任何细菌。例如，细菌可以是属于放线菌门(Actinobacteria)或变形菌门(Proteobacteria)的细菌，诸如伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、和根瘤菌科(Rhizobiaceae)中的细菌。
在一些情况下，细菌是燕麦食酸菌亚种(Acidovorax avenae subsp.)，包括例如燕麦食酸菌燕麦亚种(Acidovorax avenae subsp.avenae)(＝燕麦假单胞菌燕麦亚种(Pseudomonas avenae subsp.avenae))、燕麦食酸菌卡特来兰亚种(Acidovorax avenaesubsp.cattleyae)(＝卡特来兰假单胞菌(Pseudomonas cattleyae))、或燕麦食酸菌瓜类亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli)(＝假产碱假单胞菌瓜类亚种(Pseudomonaspseudoalcaligenes subsp.citrulli))、(Pseudomonas avenae subsp.citrulli))。
在一些情况下，细菌是伯克霍尔德氏菌属物种(Burkholderia spp.)，包括例如须芒草伯克霍尔德氏菌(Burkholderia andropogonis)(＝须芒草假单胞菌(Pseudomonasandropogonis)、伍氏假单胞菌(Pseudomonas woodsii))、石竹伯克霍尔德氏菌(Burkholderia caryophylli)(＝石竹假单胞菌(Pseudomonas caryophylli))、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)(＝洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia))、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)(＝唐菖蒲假单胞菌(Pseudomonasgladioli))、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌栖伞菌致病变种(Burkholderia gladiolipv.agaricicola)(＝唐菖蒲假单胞菌栖伞菌致病变种(Pseudomnas gladiolipv.agaricicola))、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌葱生致病变种(Burkholderia gladiolipv.alliicola)(即，唐菖蒲假单胞菌葱生致病变种(Pseusomonas gladiolipv.alliicola))、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌唐菖蒲致病变种(Burkholderia gladiolipv.gladioli)(即，唐菖蒲假单胞菌(Pseudomonas gladioli)、唐菖蒲假单胞菌唐菖蒲致病变种(Pseudomonas gladioli pv.gladioli))、荚壳伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaglumae)(即，荚壳假单胞菌(Pseudomonas glumae))、植物伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaplantarii)(即，植物假单胞菌(Pseudomonas plantarii))、茄伯克霍尔德氏菌(Burkholderia solanacearum)(即，茄科青枯菌(Ralstonia solanacearum))、或青枯菌属物种(Ralstonia spp.)。
在一些情况下，细菌是韧皮部杆菌属物种(Liberibacter spp.)，包括暂定韧皮部杆菌属物种(Candidatus Liberibacter spec.)，包括例如暂定亚洲韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)、非洲韧皮部杆菌(Liberibacter africanus)(Laf)、美洲韧皮部杆菌(Liberibacter americanus)(Lam)、亚洲韧皮部杆菌(Liberibacter asiaticus)(Las)、欧洲韧皮部杆菌(Liberibacter europaeus)(Leu)、Liberibacter psyllaurous、或茄韧皮部杆菌(Liberibacter solanacearum)(Lso)。
在一些情况下，细菌是棒杆菌属物种(Corynebacterium spp.)，包括例如带状棒杆菌(Corynebacterium fascians)、萎蔫棒杆菌萎蔫致病变种(Corynebacteriumflaccumfaciens pv.flaccumfaciens)、密执安棒杆菌(Corynebacteriummichiganensis)、密执安棒杆菌小麦致病变种(Corynebacterium michiganensepv.tritici)、密执安棒杆菌尼布拉斯加致病变种(Corynebacterium michiganensepv.nebraskense)、或腐败棒杆菌(Corynebacterium sepedonicum)。
在一些情况下，细菌是欧文氏菌属物种(Erwinia spp.)，包括例如解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、菠萝欧文氏菌(Erwinia ananas)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)(即，胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum))、胡萝卜软腐欧文氏菌黑腐亚种(Erwinia carotovora subsp.atroseptica)、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种(Erwinia carotovora subsp.carotovora)、菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)、菊欧文氏菌玉米致病变种(Erwinia chrysanthemi pv.zeae)、溶解欧文氏菌(Erwiniadissolvens)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontic)、斯氏欧文氏菌(Erwinia stewartiii)、嗜管欧文嗜菌(Erwinia tracheiphila)、或噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)。
在一些情况下，细菌是丁香假单胞菌亚种(Pseudomonas syringae subsp.)，包括例如丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)(Psa)、丁香假单胞菌致黑致病变种(Pseudomonas syringae pv.atrofaciens)、丁香假单胞菌晕斑致病变种(Pseudomonas syringae pv.coronafaciens)、丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)、丁香假单胞菌黄瓜致病变种(Pseudomonassyringae pv.lachrymans)、丁香假单胞菌斑生致病变种(Pseudomonas syringaepv.maculicola)、丁香假单胞菌疱疹致病变种(Pseudomonas syringae pv.papulans)、丁香假单胞菌条纹致病变种(Pseudomonas syringae pv.striafaciens)、丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv.syringae)、丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)、或丁香假单胞菌烟草致病变种(Pseudomonassyringae pv.tabaci)。
在一些情况下，细菌是链霉菌属物种(Streptomyces ssp.)，包括例如酸疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)、微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)、纯白链霉菌(Streptomyces candidus)(即，闪白放线菌(Actinomyces candidus))、晶体链霉菌(Streptomyces caviscabies)、山丘链霉菌(Streptomyces collinus)、Streptomyceseuropaeiscabiei、中间型链霉菌(Streptomyces intermedius)、番薯链霉菌(Streptomyces ipomoeae)、Streptomyces luridiscabiei、Streptomyces niveiscabiei、Streptomyces puniciscabiei、Streptomyces retuculiscabiei、Streptomyces scabiei、疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)、西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)、Streptomyces steliiscabiei、Streptomyces turgidiscabies、或Streptomyceswedmorensis。
在一些情况下，细菌是地毯草黄单胞菌亚种(Xanthomonas axonopodis subsp.)，包括例如地毯草黄单胞菌苜蓿致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.alfalfae)(＝苜蓿黄单胞菌(Xanthomonas alfalfae))、地毯草黄单胞菌莱檬致病变种(Xanthomonasaxonopodis pv.aurantifolii)(＝褐色黄单胞菌莱檬亚种(Xanthomonas fuscanssubsp.aurantifolii))、Xanthomonas axonopodis pv.allii(＝Xanthomonas campestrispv.allii)、地毯草黄单胞菌地毯草致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.axonopodis)、地毯草黄单胞菌羊蹄甲致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.bauhiniae)(＝野油菜黄单胞菌羊蹄甲致病变种(Xanthomonas campestris pv.bauhiniae))、地毯草黄单胞菌秋海棠致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.begoniae)(＝野油菜黄单胞菌秋海棠致病变种(Xanthomonas campestris pv.begoniae))、地毯草黄单胞菌萎叶致病变种(Xanthomonasaxonopodis pv.betlicola)(＝野油菜黄单胞菌萎叶致病变种(Xanthomonas campestrispv.betlicola))、地毯草黄单胞菌感应草致病变种(Xanthomonas axonopodispv.biophyti)(＝野油菜黄单胞菌感应草致病变种(Xanthomonas campestrispv.biophyti))、地毯草黄单胞菌木豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.cajani)(＝野油菜黄单胞菌木豆致病变种(Xanthomonas campestris pv.cajani))、地毯草黄单胞菌木薯致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.cassavae)(＝木薯黄单胞菌(Xanthomonascassavae)、野油菜黄单胞菌木薯致病变种(Xanthomonas campestris pv.cassavae))、地毯草黄单胞菌山扁豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.cassiae)(＝野油菜黄单胞菌山扁豆致病变种(Xanthomonas campestris pv.cassiae))、地毯草黄单胞菌柑橘致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.citri)(＝柑橘黄单胞菌(Xanthomonas citri))、地毯草黄单胞菌柑蜜致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.citrumelo)(＝苜蓿黄单胞菌柑蜜亚种(Xanthomonas alfalfae subsp.citrumelonis))、地毯草黄单胞菌蝶豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.clitoriae)(＝野油菜黄单胞菌蝶豆致病变种(Xanthomonas campestris pv.clitoriae))、地毯草黄单胞菌糁子致病变种(Xanthomonasaxonopodis pv.coracanae)(＝野油菜黄单胞菌糁子致病变种((Xanthomonas campestrispv.coracanae)))、地毯草黄单胞菌瓜尔豆致病变种(Xanthomonas axonopodispv.cyamopsidis)(＝野油菜黄单胞菌瓜尔豆致病变种(Xanthomonas campestrispv.cyamopsidis))、地毯草黄单胞菌山马蝗致病变种(Xanthomonas axonopodispv.desmodii)(＝野油菜黄单胞菌山马蝗致病变种(Xanthomonas campestrispv.desmodii))、地毯草黄单胞菌恒河山马蝗致病变种(Xanthomonas axonopodispv.desmodiigangetici)(＝野油菜黄单胞菌恒河山马蝗致病变种(Xanthomonascampestris pv.desmodiigangetici))、地毯草黄单胞菌疏花山马蝗致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.desmodiilaxiflori)(＝野油菜黄单胞菌疏花山马蝗致病变种(Xanthomonas campestris pv.desmodiilaxiflori))、地毯草黄单胞菌园叶山马蝗致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.desmodiirotundifolii)(＝野油菜黄单胞菌园叶山马蝗致病变种(Xanthomonas campestris pv.desmodiirotundifolii))、地毯草黄单胞菌花叶万年青致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.dieffenbachiae)(＝野油菜黄单胞菌花叶万年青致病变种(Xanthomonas campestris pv.dieffenbachiae))、地毯草黄单胞菌印度刺桐致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.erythrinae)(＝野油菜黄单胞菌印度刺桐致病变种(Xanthomonas campestris pv.erythrinae))、地毯草黄单胞菌簇生致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.fascicularis)(＝野油菜黄单胞菌簇生致病变种(Xanthomonas campestris pv.fasciculari))、地毯草黄单胞菌大豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.glycines)(＝野油菜黄单胞菌大豆致病变种(Xanthomonascampestris pv.glycines))、地毯草黄单胞菌红木致病变种(Xanthomonas axonopodispv.khayae)(＝野油菜黄单胞菌红木致病变种(Xanthomonas campestris pv.khayae))、地毯草黄单胞菌胡枝子致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.lespedezae)(＝野油菜黄单胞菌胡枝子致病变种(Xanthomonas campestris pv.lespedezae))、地毯草黄单胞菌栀子致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.maculifoliigardeniae)(＝野油菜黄单胞菌栀子致病变种(Xanthomonas campestris pv.maculifoliigardeniae))、地毯草黄单胞菌锦葵致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.malvacearum)(＝柑橘黄单胞菌锦葵亚种(Xanthomonas citri subsp.malvacearum))、地毯草黄单胞菌木薯致病变种(Xanthomonasaxonopodis pv.manihotis)(＝野油菜黄单胞菌木薯致病变种(Xanthomonas campestrispv.manihotis))、地毯草黄单胞菌栖角胡麻致病变种(Xanthomonas axonopodispv.martyniicola)(＝野油菜黄单胞菌栖角胡麻致病变种(Xanthomonas campestrispv.martyniicola))、地毯草黄单胞菌梅氏致病变种(Xanthomonas axonopodispv.melhusii)(＝野油菜黄单胞菌梅氏致病变种(Xanthomonas campestrispv.melhusii))、地毯草黄单胞菌中田氏黄麻致病变种(Xanthomonas axonopodispv.nakataecorchori)(＝野油菜黄单胞菌中田氏黄麻致病变种(Xanthomonas campestrispv.nakataecorchori))、地毯草黄单胞菌西番莲致病变种(Xanthomonas axonopodispv.passiflorae)(＝野油菜黄单胞菌西番莲致病变种(Xanthomonas campestrispv.passiflorae))、地毯草黄单胞菌印度麻致病变种(Xanthomonas axonopodispv.patelii)(＝野油菜黄单胞菌印度麻致病变种(Xanthomonas campestrispv.patelii))、Xanthomonas axonopodis pv.pedalii(＝Xanthomonas campestrispv.pedalii)、地毯草黄单胞菌菜豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.phaseoli)(＝野油菜黄单胞菌菜豆致病变种(Xanthomonas campestris pv.phaseoli)、菜豆黄单胞菌(Xanthomonas phaseoli))、地毯草黄单胞菌菜豆致病变种褐色变种(Xanthomonasaxonopodis pv.phaseoli var.fuscans)(＝褐色黄单胞菌(Xanthomonas fuscans))、地毯草黄单胞菌叶下珠致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.phyllanthi)(＝野油菜黄单胞菌叶下珠致病变种(Xanthomonas campestris pv.phyllanthi))、地毯草黄单胞菌栖酸浆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.physalidicola)(＝野油菜黄单胞菌栖酸浆致病变种(Xanthomonas campestris pv.physalidicola))、地毯草黄单胞菌栖猩猩木致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.poinsettiicola)(＝野油菜黄单胞菌栖猩猩木致病变种(Xanthomonas campestris pv.poinsettiicola))、地毯草黄单胞菌安石榴致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.punicae)(＝野油菜黄单胞菌安石榴致病变种(Xanthomonas campestris pv.punicae))、地毯草黄单胞菌鹿藿致病变种(Xanthomonasaxonopodis pv.rhynchosiae)(＝野油菜黄单胞菌鹿藿致病变种(Xanthomonascampestris pv.rhynchosiae))、地毯草黄单胞菌蓖麻致病变种(Xanthomonas axonopodispv.ricini)(＝野油菜黄单胞菌蓖麻致病变种(Xanthomonas campestris pv.ricini))、地毯草黄单胞菌田菁致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.sesbaniae)(＝野油菜黄单胞菌田菁致病变种(Xanthomonas campestris pv.sesbaniae))、地毯草黄单胞菌罗望子致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.tamarindi)(＝野油菜黄单胞菌罗望子致病变种(Xanthomonas campestris pv.tamarindi))、地毯草黄单胞菌维管束致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.vasculorum)(＝野油菜黄单胞菌维管束致病变种(Xanthomonas campestris pv.vasculorum)、地毯草黄单胞菌辣椒斑点病致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.vesicatoria)(＝野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria)、辣椒斑点病黄单胞菌(Xanthomonasvesicatoria))、地毯草黄单胞菌绿豆致病变种(Xanthomonas axonopodispv.vignaeradiatae)(＝野油菜黄单胞菌绿豆致病变种(Xanthomonas campestrispv.vignaeradiatae))、地毯草黄单胞菌栖豇豆致病变种(Xanthomonas axonopodispv.vignicola)(＝野油菜黄单胞菌栖豇豆致病变种(Xanthomonas campestrispv.vignicola))、或地毯草黄单胞菌葡萄蔓致病变种(Xanthomonas axonopodispv.vitians)(＝野油菜黄单胞菌葡萄蔓致病变种(Xanthomonas campestrispv.vitians))。
在一些情况下，细菌是野油菜黄单胞菌香蕉致病变种(Xanthomonas campestrispv.musacearum)、野油菜黄单胞菌桃李致病变种(Xanthomonas campestris pv.pruni)(＝树生黄单胞菌桃李致病变种(Xanthomonas arboricola pv.pruni))、或草莓黄单胞菌(Xanthomonas fragariae)。
在一些情况下，细菌是半透明黄单胞菌(Xanthomonas translucens supsp.)(＝野油菜黄单胞菌大麦致病变种(Xanthomonas campestris pv.hordei))，包括例如半透明黄单胞菌燕麦草致病变种(Xanthomonas translucens pv.arrhenatheri)(＝野油菜黄单胞菌燕麦草致病变种(Xanthomonas campestris pv.arrhenatheri))、半透明黄单胞菌谷物致病变种(Xanthomonas translucens pv.cerealis)(＝野油菜黄单胞菌谷物致病变种(Xanthomonas campestris pv.cerealis))、半透明黄单胞菌禾谷致病变种(Xanthomonastranslucens pv.graminis)(＝野油菜黄单胞菌禾谷致病变种(Xanthomonas campestrispv.graminis))、半透明黄单胞菌梯牧草属致病变种(Xanthomonas translucenspv.phlei)(＝野油菜黄单胞菌梯牧草属致病变种(Xanthomonas campestris pv.phlei))、半透明黄单胞菌梯牧草致病变种(Xanthomonas translucens pv.phleipratensis)(＝野油菜黄单胞菌梯牧草致病变种(Xanthomonas campestris pv.phleipratensis))、半透明黄单胞菌早熟禾致病变种(Xanthomonas translucens pv.poae)(＝野油菜黄单胞菌早熟禾致病变种(Xanthomonas campestris pv.poae))、半透明黄单胞菌黑麦致病变种(Xanthomonas translucens pv.secalis)(＝野油菜黄单胞菌黑麦致病变种(Xanthomonascampestris pv.secalis))、半透明黄单胞菌小麦致病变种(Xanthomonas translucenspv.translucens)(＝野油菜黄单胞菌小麦致病变种(Xanthomonas campestrispv.translucens))、或半透明黄单胞菌波形致病变种(Xanthomonas translucenspv.undulosa)(＝野油菜黄单胞菌波形致病变种(Xanthomonas campestrispv.undulosa))。
在一些情况下，细菌是稻黄单胞菌亚种(Xanthomonas oryzae supsp.)、稻黄单胞菌稻亚种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)(＝野油菜黄单胞菌稻致病变种(Xanthomonascampestris pv.oryzae))、或野油菜黄单胞菌oryzicola致病变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola)(＝野油菜黄单胞菌oryzicola致病变种(Xanthomonas campestrispv.oryzicola))。
在一些情况下，细菌是来自黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)的苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)。
表7示出了可以使用本文描述的PMP组合物和相关方法处理或预防的细菌和与其相关的疾病的进一步实例。
表7.细菌性有害生物
Figure BDA0002947982740001251
Figure BDA0002947982740001261
iii.昆虫
PMP组合物和相关方法可以用于降低昆虫的适应度，例如以预防或处理植物中的昆虫侵染。术语“昆虫”包括在任何发育阶段(即，未成熟昆虫和成虫昆虫)的属于节肢动物门以及属于昆虫纲(Insecta)或蛛形纲(Arachnida)的任何生物体。包括用于将通过使昆虫与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至昆虫的方法。另外地或可替代地，方法包括通过使植物与PMP组合物接触而将生物型杀有害生物剂递送至处于昆虫侵染的风险或具有昆虫侵染的植物。
PMP组合物和相关方法适用于预防或处理昆虫侵染或被其侵染的植物，包括属于以下目的昆虫：蜱螨目(Acari)、蜘蛛目(Araneae)、虱目(Anoplura)、鞘翅目(Coleoptera)、弹尾目(Collembola)、革翅目(Dermaptera)、网翅目(Dictyoptera)、双尾目(Diplura)、双翅目(Diptera)(例如，斑翅果蝇(spotted-wing Drosophila))、纺足目(Embioptera)、蜉蝣目(Ephemeroptera)、蛩蠊目(Grylloblatodea)、半翅目(Hemiptera)(例如，蚜虫、温室白粉虱)、同翅目(Homoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、等翅目(Isoptera)、鳞翅目、食毛目(Mallophaga)、长翅目(Mecoptera)、脉翅目(Neuroptera)、蜻蜓目(Odonata)、直翅目(Orthoptera)、竹节虫目(Phasmida)、襀翅目(Plecoptera)、原尾目(Protura)、啮虫目(Psocoptera)、蚤目(Siphonaptera)、虱目(Siphunculata)、缨尾目(Thysanura)、捻翅目(Strepsiptera)、缨翅目(Thysanoptera)、毛翅目(Trichoptera)、或缺翅目。
在一些情况下，昆虫来自蛛形纲(Arachnida)，例如粉螨属物种(Acarus spp.)、柑橘瘤瘿螨(Aceria sheldoni)、刺皮瘿螨属物种(Aculops spp.)、刺瘿螨属物种(Aculusspp.)、花蜱属物种(Amblyomma spp.)、山楂叶螨(Amphitetranychus viennensis)、锐缘蜱属物种(Argas spp.)、牛蜱属物种(Boophilus spp.)、短须螨属物种(Brevipalpus spp.)、麦苔螨(Bryobia graminum)、苜蓿苔螨(Bryobia praetiosa)、刺尾蝎属物种(Centruroides spp.)、皮螨属物种(Chorioptes spp.)、鸡皮刺螨(Dermanyssusgallinae)、屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)、粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)、革蜱属物种(Dermacentor spp.)、始叶螨属物种(Eotetranychus spp.)、梨上瘿螨(Epitrimerus pyri)、真叶螨属物种(Eutetranychus spp.)、瘿螨属物种(Eriophyesspp.)、家食甜螨(Glycyphagus domesticus)、Halotydeus destructor、Hemitarsonemus属物种、璃眼蜱属物种(Hyalomma spp.)、硬蜱属物种(Ixodes spp.)、蛛属物种(Latrodectusspp.)、Loxosceles属物种、Metatetranychus属物种、Neutrombicula autumnalis、奴合撒属物种(Nuphersa spp.)、小爪螨属物种(Oligonychus spp.)、钝缘蜱属物种(Ornithodorus spp.)、禽刺螨属物种(Ornithonyssus spp.)、全爪螨属物种(Panonychusspp.)、柑桔锈螨(Phyllocoptruta oleivora)、侧多食跗线螨(Polyphagotarsonemuslatus)、痒螨(Psoroptes spp.)、扇头蜱属物种(Rhipicephalus spp.)、根螨属物种(Rhizoglyphus spp.)、疥螨属物种(Sarcoptes spp.)、中东金蝎(Scorpio maurus)、狭跗线螨属物种(Steneotarsonemus spp.)、斯氏狭跗线螨(Steneotarsonemus spinki)、跗线螨属物种(Tarsonemus spp.)、叶螨属物种(Tetranychus spp.)、阿氏真恙螨(Trombiculaalfreddugesi)、愈神蝎属物种(Vaejovis spp.)、或柑橘瘤瘿螨(Vasates lycopersici)。
在一些情况下，昆虫来自唇足纲(Chilopoda)，例如地蜈蚣属物种(Geophilusspp.)或蚰蜒属物种(Scutigera spp.)。
在一些情况下，昆虫来自弹尾目(Collembola)，例如武装棘跳虫(Onychiurusarmatus)。
在一些情况下，昆虫来自倍足纲(Diplopoda)，例如Blaniulus guttulatus；
来自昆虫纲(Insecta)，例如来自蜚蠊目(Blattodea)，例如亚洲小蠊(Blattellaasahinai)、德国小蠊(Blattella germanica)、东方蜚蠊(Blatta orientalis)、马德拉蜚蠊(Leucophaea maderae)、古巴蠊属物种(Panchlora spp.)、木蠊属物种(Parcoblattaspp.)、大蠊属物种(Periplaneta spp.)、或棕带蜚蠊(Supella longipalpa)。
在一些情况下，昆虫来自鞘翅目(Coleoptera)，例如Acalymma vittatum、菜豆象(Acanthoscelides obtectus)、喙丽金龟属物种(Adoretus spp.)、Agelastica alni、叩甲属物种(Agriotes spp.)、小粉虫(Alphitobius diaperinus)、粉吹金龟子(Amphimallonsolstitialis)、家具窃蠹(Anobium punctatum)、星天牛属物种(Anoplophora spp.)、花象属物种(Anthonomus spp.)、圆皮蠹属物种(Anthrenus spp.)、长喙小象属物种(Apionspp.)、甘蔗金龟属物种(Apogonia spp.)、Atomaria属物种、毛皮蠹属物种(Attagenusspp.)、Bruchidius obtectus、豆象属物种(Bruchus spp.)、龟金花虫属物种(Cassidaspp.)、Cerotoma trifurcata、象甲(Ceutorrhynchus spp.)、凹胫跳甲属物种(Chaetocnema spp.)、宽胸口口头虫属物种(Cleonus mendicus、宽胸金针虫(Conoderusspp.)、象甲属物种(Cosmopolites spp.)、褐新西兰肋翅鳃角金龟(Costelytrazealandica)、金针虫属物种(Ctenicera spp.)、象虫属物种(Curculio spp.)、锈赤扁谷盗(Cryptolestes ferrugineus)、杨干隐喙象(Cryptorhynchus lapathi)、细枝象属物种(Cylindrocopturus spp.)、皮蠹属物种(Dermestes spp.)、条叶甲属物种(Diabroticaspp.)(例如，玉米根虫)、蛀野螟属物种(Dichocrocis spp.)、铁甲虫(Dicladispaarmigera)、阿根廷小兜属物种(Diloboderus spp.)、食植瓢虫属物种(Epilachna spp.)、毛跳甲属物种(Epitrix spp.)、Faustinus属物种、裸蛛甲(Gibbium psylloides)、阔角谷盗(Gnathocerus cornutus)、菜心螟(Hellula undalis)、黑异爪庶金龟(Heteronychusarator)、寡节鲍金龟属物种(Heteronyx spp.)、Hylamorpha elegans、北美家天牛(Hylotrupes bajulus)、紫苜蓿叶象(Hypera postica)、蓝绿象(Hypomeces squamosus)、咪小蠢属物种(Hypothenemus spp.)、甘蔗大褐齿爪鳃金龟(Lachnosternaconsanguinea)、烟草甲(Lasioderma serricorne)、长头谷盗(Latheticus oryzae)、Lathridius属物种、负泥虫属物种(Lema spp.)、马铃薯甲虫(Leptinotarsadecemlineata)、银潜蛾属物种(Leucoptera spp.)、稻水象(Lissorhoptrusoryzophilus)、筒喙象属物种(Lixus spp.)、萤叶甲属物种(Luperodes spp.)、粉蠹属物种(Lyctus spp.)、美洲叶甲属物种(Megascelis spp.)、梳爪叩头虫属物种(Melanotusspp.)、油菜花露尾甲(Meligethes aeneus)、鳃金龟属物种(Melolontha spp.)、Migdolus属物种、墨天牛属物种(Monochamus spp.)、象甲(Naupactus xanthographus)、隐跗郭公虫属物种(Necrobia spp.)、褐蛛甲(Niptus hololeucus)、椰蛀犀金龟(Oryctesrhinoceros)、锯胸粉扁虫(Oryzaephilus surinamensis)、Oryzaphagus oryzae、耳喙象属物种(Otiorrhynchus spp.)、小青花金龟(Oxycetonia jucunda)、辣根猿叶虫(Phaedoncochleariae)、食叶鳃金龟属物种(Phyllophaga spp.)、Phyllophaga helleri、黄条跳甲属物种(Phyllotreta spp.)、日本弧丽金龟(Popillia japonica)、象甲属物种(Premnotrypes spp.)、大谷蠹(Prostephanus truncatus)、油菜金头跳甲属物种(Psylliodes spp.)、蛛甲属物种(Ptinus spp.)、暗色瓢虫(Rhizobius ventralis)、谷蠹(Rhizopertha dominica)、谷象属物种(Sitophilus spp.)、米象(Sitophilus oryzae)、尖隐喙象属物种(Sphenophorus spp.)、药材甲(Stegobium paniceum)、茎干象属物种(Sternechus spp.)、Symphyletes属物种、纤毛象属物种(Tanymecus spp.)、黄粉虫(Tenebrio molitor)、大谷盗(Tenebrioides mauretanicus)、拟谷盗属物种(Triboliumspp.)、斑皮蠹属物种(Trogoderma spp.)、籽象属物种(Tychius spp.)、脊虎天牛属物种(Xylotrechus spp.)、或距步甲属物种(Zabrus spp.)。
在一些情况下，昆虫来自双翅目，例如伊蚊属物种(Aedes spp.)、潜蝇属物种(Agromyza spp.)、按实蝇属物种(Anastrepha spp.)、按蚊属物种(Anopheles spp.)、瘿蚊属物种(Asphondylia spp.)、实蝇属物种(Bactrocera spp.)、花园毛蚊(Bibiohortulanus)、天青丽蝇(Calliphora erythrocephala)、红头丽蝇(Calliphora vicina)、地中海实蝇(Ceratitis capitata)、摇蚊属物种(Chironomus spp.)、金蝇属物种(Chrysomyia spp.)、斑虻属物种(Chrysops spp.)、高额麻虻(Chrysozona pluvialis)、锥蝇属物种(Cochliomyia spp.)、康瘿蚊属物种(Contarinia spp.)、人皮蝇(Cordylobiaanthropophaga)、稻环摇蚊(Cricotopus sylvestris)、库蚊属物种(Culex spp.)、库蠓属物种(Culicoides spp.)、脉毛蚊属物种(Culiseta spp.)、黄蝇属物种(Cuterebra spp.)、橄榄大实蝇(Dacus oleae)、叶瘿蚊属物种(Dasyneura spp.)、地种蝇属物种(Deliaspp.)、人肤蝇(Dermatobia hominis)、果蝇属物种(Drosophila spp.)、果蝇属物种(Echinocnemus spp.)、厕蝇属物种(Fannia spp.)、胃蝇属物种(Gasterophilus spp.)、舌蝇属物种(Glossina spp.)、麻虻属物种(Haematopota spp.)、毛眼水蝇属物种(Hydrelliaspp.)、大麦毛眼水蝇(Hydrellia griseola)、黑蝇属物种(Hylemya spp.)、虱蝇属物种(Hippobosca spp.)、皮蝇属物种(Hypoderma spp.)、斑潜蝇属物种(Liriomyza spp.)、绿蝇属物种(Lucilia spp.)、Lutzomyia属物种、曼蚊属物种(Mansonia spp.)、家蝇属物种(Musca spp.)(例如，Musca domestica)、狂蝇属物种(Oestrus spp.)、瑞典麦秆蝇(Oscinella frit)、Paratanytarsus属物种、Paralauterborniella subcincta、泉蝇属物种(Pegomyia spp.)、白蛉属物种(Phlebotomus spp.)、草种蝇属物种(Phorbia spp.)、草种蝇属物种(Phormia spp.)、酪蝇(Piophila casei)、Prodiplosis属物种、胡萝卜茎蝇(Psila rosae)、绕实蝇属物种(Rhagoletis spp.)、麻蝇属物种(Sarcophaga spp.)、蚋属物种(Simulium spp.)、螫蝇属物种(Stomoxys spp.)、虻属物种(Tabanus spp.)、根斑蝇属物种(Tetanops spp.)、或大蚊属物种(Tipula spp.)。
在一些情况下，昆虫来自异翅亚目(Heteroptera)，例如，南瓜缘蝽(Anasatristis)、拟丽蝽属物种(Antestiopsis spp.)、Boisea属物种、土长蝽属物种(Blissusspp.)、俊盲蝽属物种(Calocoris spp.)、斑腿微刺盲蝽(Campylomma livida)、异背长蝽属物种(Cavelerius spp.)、臭虫属物种(Cimex spp.)、白辧麦寄蝇属物种(Collaria spp.)、Creontiades dilutus、胡椒缘蝽(Dasynus piperis)、Dichelops furcatus、厚氏长棒网蝽(Diconocoris hewetti)、棉红蝽属物种(Dysdercus spp.)、美洲蝽属物种(Euschistusspp.)、扁盾蝽属物种(Eurygaster spp.)、刺盲蝽属物种(Heliopeltis spp.)、棉红蝽(Horcias nobilellus)、稻缘蝽属物种(Leptocorisa spp.)、稻缘椿象(Leptocorisavaricornis)、北美叶足缘蝽(Leptoglossus phyllopus)、草盲蝽属物种(Lygus spp.)、蔗黑长蝽(Macropes excavatus)、盲蝽科(Miridae)、金光绿盲蝽(Monalonion atratum)、绿蝽属物种(Nezara spp.)、稻蝽属物种(Oebalus spp.)、蝽科(Pentomidae)、方背皮蝽(Piesma quadrata)、壁蝽属物种(Piezodorus spp.)、杂盲蝽属物种(Psallus spp.)、Pseudacysta persea、红猎蝽属物种(Rhodnius spp.)、可可褐盲蝽(Sahlbergellasingularis)、Scaptocoris castanea、黑蝽属物种(Scotinophora spp.)、梨冠网蝽(Stephanitis nashi)、Tibraca属物种、或锥猎蝽属物种(Triatoma spp.)。
在一些情况下，昆虫来自同翅目(Homiptera)、例如Acizzia acaciaebaileyanae、Acizzia dodonaeae、Acizzia uncatoides、长头蝗(Acrida turrita)、无网长管蚜属物种(Acyrthosipon spp.)、Acrogonia属物种、Aeneolamia属物种、隆脉木虱属物种(Agonoscena spp.)、甘蓝粉虱(Aleyrodes proletella)、甘蔗穴粉虱(Aleurolobusbarodensis)、丝绒粉虱(Aleurothrixus floccosus)、植莲木虱(Allocaridaramalayensis)、杧果叶蝉属物种(Amrasca spp.)、飞廉短尾蚜(Anuraphis cardui)、肾圆盾蚧属物种(Aonidiella spp.)、苏联黄粉蚜(Aphanostigma pini)、蚜属物种(Aphis spp.)(例如，Apis gossypii)、葡萄叶蝉(Arboridia apicalis)、Arytainilla属物种、小圆盾蚧属物种(Aspidiella spp.)、圆盾蚧属物种(Aspidiotus spp.)、Atanus属物种、茄沟无网蚜(Aulacorthum solani)、烟草粉虱(Bemisia tabaci)、Blastopsylla occidentalis、Boreioglycaspis melaleucae、李短尾蚜(Brachycaudus helichrysi)、Brachycolus属物种、甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)、Cacopsylla属物种、小褐稻虱(Calligyponamarginata)、黄头大叶蝉(Carneocephala fulgida)、甘蔗粉角蚜(Ceratovacunalanigera)、沫蝉科(Cercopidae)、蜡蚧属物种(Ceroplastes spp.)、草莓钉蚜(Chaetosiphon fragaefolii)、蔗黄雪盾蚧(Chionaspis tegalensis)、茶绿叶蝉(Chlorita onukii)、棉蝗(Chondracris rosea)、核桃黑斑蚜(Chromaphisjuglandicola)、黑褐圆盾蚧(Chrysomphalus ficus)、玉米叶蝉(Cicadulina mbila)、Coccomytilus halli、软蚧属物种(Coccus spp.)、茶藨隐瘤蚜(Cryptomyzus ribis)、Cryptoneossa属物种、Ctenarytaina属物种、Dalbulus属物种、柑橘粉虱(Dialeurodescitri)、柑桔木虱(Diaphorina citri)、白背盾蚧属物种(Diaspis spp.)、履绵蚧属物种(Drosicha spp.)、西圆尾蚜属物种(Dysaphis spp.)、灰粉蚧属物种(Dysmicoccus spp.)、小绿叶蝉属物种(Empoasca spp.)、绵蚜属物种(Eriosoma spp.)、斑叶蝉属物种(Erythroneura spp.)、Eucalyptolyma属物种、褐木虱属物种(Euphyllura spp.)、殃叶蝉(Euscelis bilobatus)、拂粉蚧属物种(Ferrisia spp.)、咖啡地粉蚧(Geococcuscoffeae)、Glycaspis属物种、银合欢木虱(Heteropsylla cubana)、棘状异木虱(Heteropsylla spinulosa)、假桃病毒叶蝉(Homalodisca coagulata)、翅尖头叶蝉(Homalodisca vitripennis)、梅大尾蚜(Hyalopterus arundinis)、吹绵蚧属物种(Iceryaspp.)、片角叶蝉属物种(Idiocerus spp.)、扁喙叶蝉属物种(Idioscopus spp.)、灰飞虱(Laodelphax striatellus)、Lecanium属物种、蛎盾蚧属物种(Lepidosaphes spp.)、萝卜蚜(Lipaphis erysimi)、长管蚜属物种(Macrosiphum spp.)、二点叶蜂(Macrostelesfacifrons)、Mahanarva属物种、高粱蚜(Melanaphis sacchari)、Metcalfiella属物种、麦无网蚜(Metopolophium dirhodum)、黑缘平翅斑蚜(Monellia costalis)、Monelliopsispecanis、瘤蚜属物种(Myzus spp.)、莴苣衲长管蚜(Nasonovia ribisnigri)、黑尾叶蝉属物种(Nephotettix spp.)、Nettigoniclla spectra、褐飞虱(Nilaparvata lugens)、Oncometopia属物种、普来隆旌蚧(Orthezia praelonga)、中华稻蝗(Oxya chinensis)、Pachypsylla属物种、杨梅缘粉虱(Parabemisia myricae)、Paratrioza属物种、片盾蚧属物种(Parlatoria spp.)、天疱疮属物种(Pemphigus spp.)、及蝽科物种(Pentatomidae)(例如，褐翅椿象(Halyomorpha halys))、玉米蜡蝉(Peregrinus maidis)、绵粉蚧属物种(Phenacoccus spp.)、杨平翅绵蚜(Phloeomyzus passerinii)、忽布疣蚜(Phorodonhumuli)、葡萄根瘤蚜属物种(Phylloxera spp.)、苏铁褐点并盾蚧(Pinnaspisaspidistrae)、臀纹粉蚧属物种(Planococcus spp.)、Prosopidopsylla flava、梨形原绵蚧(Protopulvinaria pyriformis)、桑白盾蚧(Pseudaulacaspis pentagona)、粉蚧属物种(Pseudococcus spp.)、Psyllopsis属物种、木虱属物种(Psylla spp.)、金小蜂属物种(Pteromalus spp.)、Pyrilla属物种、笠圆盾蚧属物种(Quadraspidiotus spp.)、Quesadagigas、平刺粉蚧属物种(Rastrococcus spp.)、缢管蚜属物种(Rhopalosiphum spp.)、黑盔蚧属物种(Saissetia spp.)、葡萄带叶蝉(Scaphoideus titanus)、麦二叉蚜(Schizaphisgraminum)、苏铁刺圆盾蚧(Selenaspidus articulatus)、长唇基飞虱属物种(Sogataspp.)、白背飞虱(Sogatella furcifera)、Sogatodes属物种、三角蝶(Stictocephalafestina)、梣粉虱(Siphoninus phillyreae)、Tenalaphara malayensis、台诺非拉属物种(Tetragonocephela spp.)、美国核桃黑蚜(Tinocallis caryaefoliae)、广胸沫蝉属物种(Tomaspis spp.)、声蚜属物种(Toxoptera spp.)、温室白粉虱(Trialeurodesvaporariorum)、木虱属物种(Trioza spp.)、小叶蝉属物种(Typhlocyba spp.)、尖盾蚧属物种(Unaspis spp.)、葡萄根瘤虱(Viteus vitifolii)、么叶蝉属物种(Zygina spp.)；来自膜翅目，例如顶切叶蚁属物种(Acromyrmex spp.)、菜叶蜂属物种(Athalia spp.)、切叶蚁属物种(Atta spp.)、松叶蜂属物种(Diprion spp.)、实叶蜂属物种(Hoplocampa spp.)、毛蚁属物种(Lasius spp.)、小黄家蚁(Monomorium pharaonis spp.)、树蜂属物种(Sirexspp.)、入侵红火蚁(Solenopsis invicta)、酸臭蚁属物种(Tapinoma spp.)、大树蜂属物种(Urocerus spp.)、胡蜂属物种(Vespa spp.)、或黑树蜂属物种(Xeris spp.)。
在一些情况下，昆虫来自等足目(Isopoda)，例如，鼠妇(Armadillidiumvulgare)、栉水虱潮虫(Oniscus asellus)、或球鼠妇(Porcellio scaber)。
在一些情况下，昆虫来自等翅目(Isoptera)，例如，乳白蚁属物种(Contariniaspp.)、Cornitermes cumulans、堆砂白蚁属物种(Cryptotermes spp.)、楹白蚁属物种(Incisitermes spp.)、稻麦小白蚁(Microtermes obesi)、土白蚁属物种(Odontotermesspp.)、或散白蚁属物种(Reticulitermes spp)。
在一些情况下，昆虫来自鳞翅目(Lepidoptera)，例如小蜡螟(Achroiagrisella)、桑剑纹夜蛾(Acronicta major)、褐带卷蛾属物种(Adoxophyes spp.)、白纹伊蚊(Aedia leucomelas)、地夜蛾属物种(Agrotis spp.)、阿拉巴马属物种(Alabama spp.)、脐橙螟(Amyelois transitella)、条麦蛾属物种(Anarsia spp.)、干煞夜蛾属物种(Anticarsia spp.)、Argyroploce属物种、甘蓝夜蛾(Barathra brassicae)、禾弄蝶(Borbocinnara)、棉潜蛾(Bucculatrix thurberiella)、松尺蠖(Bupalus piniarius)、干夜蛾属物种(Busseola spp.)、Cacoecia属物种、茶细蛾(Caloptilia theivora)、烟卷蛾(Capuareticulana)、苹果蠹蛾(Carpocapsa pomonella)、桃小食心虫(Carposina niponensis)、冬尺蛾(Cheimatobia brumata)、禾草螟属物种(Chilo spp.)、卷蛾属物种(Choristoneuraspp.)、葡萄果蠹蛾(Clysia ambiguella)、Cnaphalocerus属物种、稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)、云卷蛾属物种(Cnephasia spp.)、蒂蛀虫属物种(Conopomorpha spp.)、球颈象属物种(Conotrachelus spp.)、Copitarsia属物种、小卷蛾属物种(Cydia spp.)、Dalaca noctuides、绢野螟属物种(Diaphania spp.)、蔗螟(Diatraea saccharalis)、钻夜蛾属物种(Earias spp.)、Ecdytolopha aurantium、Elasmopalpus lignosellus、甘薯杆螟(Eldana saccharina)、粉斑螟属物种(Ephestiaspp.)、叶小卷蛾属物种(Epinotia spp.)、苹果褐卷蛾(Epiphyas postvittana)、荚斑螟属物种(Etiella spp.)、Eulia属物种、女贞细卷蛾(Eupoecilia ambiguella)、毒蛾属物种(Euproctis spp.)、切夜蛾属物种(Euxoa spp.)、脏切叶蛾属物种(Feltia spp.)、大蜡螟(Galleria mellonella)、细蛾属物种(Gracillaria spp.)、小食心虫属物种(Grapholithaspp.)、甘蔗螟属物种(Hedylepta spp.)、铃夜蛾属物种(Helicoverpa spp.)、实夜蛾属物种(Heliothis spp.)、褐家蛾(Hofmannophila pseudospretella)、同斑螟属物种(Homoeosoma spp.)、长卷蛾属物种(Homona spp.)、苹果巢蛾(Hyponomeuta padella)、柿举肢蛾(Kakivoria flavofasciata)、夜蛾属物种(Laphygma spp.)、梨小食心虫(Laspeyresia molesta)、茄黄斑螟(Leucinodes orbonalis)、银潜蛾属物种(Leucopteraspp.)、紫藤潜叶细蛾属物种(Lithocolletis spp.)、绿果冬夜蛾(Lithophaneantennata)、花翅小蛾属物种(Lobesia spp.)、豆白隆切根虫(Loxagrotis albicosta)、毒蛾属物种(Lymantria spp.)、潜蛾属物种(Lyonetia spp.)、天幕毛虫(Malacosomaneustria)、豆荚野螟(Maruca testulalis)、甘蓝夜蛾(Mamstra brassicae)、稻暮眼蝶(Melanitis leda)、毛胫夜蛾属物种(Mocis spp.)、Monopis obviella、粘虫(Mythimnaseparata)、橡长角蛾(Nemapogon cloacellus)、水螟属物种(Nymphula spp.)、Oiketicus属物种、Oria属物种、瘤丛螟属物种(Orthaga spp.)、秆野螟属物种(Ostrinia spp.)、负泥虫(Oulema oryzae)、小眼夜蛾(Panolis flammea)、稻弄蝶属物种(Parnara spp.)、红铃虫属物种(Pectinophora spp.)、潜叶蛾属物种(Perileucoptera spp.)、茄麦蛾属物种(Phthorimaea spp.)、柑橘潜叶蛾(Phyllocnistis citrella)、小潜细蛾属物种(Phyllonorycter spp.)、粉蝶属物种(Pieris spp.)、荷兰石竹小卷蛾(Platynotastultana)、印度谷螟(Plodia interpunctella)、金翅夜蛾属物种(Plusia spp.)、小菜蛾(Plutella xylostella)、小白巢蛾属物种(Prays spp.)、斜纹夜蛾属物种(Prodeniaspp.)、烟草天蛾属物种(Protoparce spp.)、拟粘液蛾属物种(Pseudaletia spp.)、一星黏虫(Pseudaletia unipuncta)、大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)、玉米螟(Pyraustanubilalis)、Rachiplusia nu、禾螟属物种(Schoenobius spp.)、白禾螟属物种(Scirpophaga spp.)、稻白螟(Scirpophaga innotata)、Scotia segetum、蛀茎夜蛾属物种(Sesamia spp.)、大螟(Sesamia inferens)、长须卷蛾属物种(Sparganothis spp.)、夜蛾属物种(Spodoptera spp.)、Spodoptera praefica、展足蛾属物种(Stathmopoda spp.)、花生麦蛾(Stomopteryx subsecivella)、透翅蛾属物种(Synanthedon spp.)、安第斯马铃薯块茎蛾(Tecia solanivora)、Thermesia gemmatalis、木塞谷蛾(Tinea cloacella)、袋谷蛾(Tinea pellionella)、幕谷蛾(Tineola bisselliella)、卷叶蛾属物种(Tortrixspp.)、毛毡衣蛾(Trichophaga tapetzella)、粉夜蛾属物种(Trichoplusia spp.)、三化螟(Tryporyza incertulas)、番茄斑潜蝇(Tuta absoluta)、或灰蝶属物种(Viracholaspp.)。
在一些情况下，昆虫来自以下目：直翅目(Orthoptera)或跳跃目(Saltatoria)，例如，家蟋蟀(Acheta domesticus)、Dichroplus属物种、蝼蛄属物种(Gryllotalpa spp.)、蔗蝗属物种(Hieroglyphus spp.)、飞蝗属物种(Locusta spp.)、黑蝗属物种(Melanoplusspp.)、或Schistocerca gregaria。
在一些情况下，昆虫来自虱目(Phthiraptera)，例如，毛虱属物种(Damaliniaspp.)、血虱属物种(Haematopinus spp.)、毛虱属物种(Linognathus spp.)、虱属物种(Pediculus spp.)、阴虱(Ptirus pubis)、毛虱属物种(Trichodectes spp.)。
在一些情况下，昆虫来自啮虫目(Psocoptera)，例如，Lepinatus属物种、或书虱属物种(Liposcelis spp)。
在一些情况下，昆虫来自蚤目(Siphonaptera)，例如，角叶蚤属物种(Ceratophyllus spp.)、栉首蚤属物种(Ctenocephalides spp.)、致痒蚤(Pulexirritans)、穿皮潜蚤(Tunga penetrans)、或Xenopsylla cheopsis。
在一些情况下，昆虫来自缨翅目(Thysanoptera)，例如玉米黄呆蓟马(Anaphothrips obscurus)、稻蓟马(Baliothrips biformis)、鲜食葡萄镰蓟马(Drepanothrips reuteri)、Enneothrips flavens、花蓟马属物种(Frankliniella spp.)、阳蓟马属物种(Heliothrips spp.)、温室条蓟马(Hercinothrips femoralis)、腹钩蓟马(Rhipiphorothrips cruentatus)、硬蓟马属物种(Scirtothrips spp.)、Taeniothripscardamomi、或蓟马属物种(Thrips spp)。
在一些情况下，昆虫来自衣鱼目(Zygentoma)(＝缨尾目(Thysanura))，例如毛衣鱼属物种(Ctenolepisma spp.)、家衣鱼(Lepisma saccharina)、盗火虫(Lepismodesinquilinus)、或小灶衣鱼(Thermobia domestica)。
在一些情况下，昆虫来自综合纲(Symphyla)，例如小幺蚰属物种(Scutigerellaspp)。
在一些情况下，昆虫是螨，包括但不限于跗线螨，诸如Phytonemus pallidus、侧多食跗线螨(Polyphagotarsonemus latus)、Tarsonemus bilobatus等；真足螨，诸如白菜螨(Penthaleus erythrocephalus)、叶爪螨(Penthaleus major)等；叶螨，诸如真梶小爪螨(Oligonychus shinkaji)、桔全爪螨(Panonychus citri)、桑全爪螨(Panonychus mori)、苹果全爪螨(Panonychus ulmi)、神泽氏叶螨(Tetranychus kanzawai)、二斑叶螨(Tetranychus urticae)等；瘿螨，诸如茶尖叶节蜱(Acaphylla theavagrans)、曲瘿螨(Aceria tulipae)、番茄刺皮瘿螨(Aculops lycopersici)、皮氏刺皮瘿螨(Aculopspelekassi)、苹果刺锈螨(Aculus schlechtendali)、Eriophyes chibaensis、柑橘锈螨(Phyllocoptruta oleivora)等；粉螨，诸如罗宾根螨(Rhizoglyphus robini)、腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae)、三叶螨(Tyrophagus similis)等；蜂窝螨，诸如大蜂螨(Varroa jacobsoni)、狄斯瓦螨(Varroa destructor)等；蜱亚目，诸如微小牛蜱(Boophilus microplus)、血红扇头蜱(Rhipicephalus sanguineus)、长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)、褐黄血蜱(Haemophysalis flava)、铃头血蜱(Haemophysalis campanulata)、卵形硬蜱(Ixodes ovatus)、全沟硬蜱(Ixodespersulcatus)、花蜱属物种(Amblyomma spp.)、革蜱属物种(Dermacentor spp.)等；肉食螨科(Cheyletidae)，诸如Cheyletiella yasguri、布氏姬螯螨(Cheyletiella blakei)等；蠕形螨科(Demodicidae)，诸如犬蠕形螨(Demodex canis)、猫蠕形螨(Demodex cati)等；痒螨科(Psoroptidae)，诸如羊痒螨(Psoroptes ovis)等；Scarcoptidae，诸如人疥螨(Sarcoptes scabiei)、猫耳螨(Notoedres cati)、膝螨属物种(Knemidocoptes spp.)等。
表8示出了可以使用本文描述的PMP组合物和相关方法处理或预防的引起侵染的昆虫的进一步实例。
表8.昆虫有害生物
Figure BDA0002947982740001371
Figure BDA0002947982740001381
Figure BDA0002947982740001391
iv.软体动物
PMP组合物和相关方法可以用于降低软体动物的适应度，例如以预防或处理植物中的软体动物侵染。术语“软体动物”包括属于软体动物门的任何生物体。包括用于将通过使软体动物与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至软体动物的方法。另外地或可替代地，方法包括通过使植物与PMP组合物接触而将生物型杀有害生物剂递送至处于软体动物侵染的风险或具有软体动物侵染的植物。
PMP组合物和相关方法适用于预防或处理农业和园艺中陆生腹足类(例如，蛞蝓和蜗牛)的侵染。它们包括主要作为杂食性有害生物出现在农业和园艺作物上的所有陆生蛞蝓和蜗牛。例如，软体动物可以属于以下科：玛瑙螺科(Achatinidae)、野蛞蝓科(Agriolimacidae)、瓶螺科(Ampullariidae)、阿勇蛞蝓科(Arionidae)、巴蜗牛科(Bradybaenidae)、大蜗牛科(Helicidae)、Hydromiidae、椎实螺科(Lymnaeidae)、小蛞蝓科(Milacidae)、尾环蜗牛科(Urocyclidae)、或蛞蝓科(Veronicellidae)。
例如，在一些情况下，软体动物是玛瑙螺属物种(Achatina spp.)、Archachatina属物种(例如，Archachatina marginata)、野蛞蝓属物种(Agriolimax spp.)、Arion属物种(例如，A.ater、A.circumscriptus、A.distinctus、A.fasciatus、A.hortensis、A.intermedius、红色蛞蝓(A.rufus)、A.subfuscus、A.silvaticus、A.lusitanicus)、Arliomax属物种(例如，Ariolimax columbianus)、双脐螺属物种(Biomphalaria spp)、缓行螺属物种(Bradybaena spp.)(例如，B.fruticum)、小泡螺属物种(Bulinus spp.)、蜗牛属物种(Cantareus spp.)(例如，棕色庭园蜗牛(C.asperses))、葱蜗牛属物种(Cepaeaspp.)(例如，花园葱蜗牛(C.hortensis)、森林蜗牛(C.nemoralis)、花园葱蜗牛(C.hortensis))、白蜗牛属物种(Cernuella spp.)、螺蜗牛属物种(Cochlicella spp.)、Cochlodina属物种(例如，C.laminata)、颈蛞蝓属物种(Deroceras spp.)(例如，田地颈蛞蝓(D.agrestis)、D.empiricorum、光滑颈蛞蝓(D.laeve)、D.panornimatum、网纹颈蛞蝓(D.reticulatum))、圆盘蜗牛属物种(Discus spp.)(例如，圆形圆盘蜗牛(D.rotundatus))、Euomphalia属物种、土蜗属物种(Galba spp.)(例如，截形土蜗(G.trunculata))、大蜗牛属物种(Helicella spp.)(例如，H.itala、H.obvia)、Helicigona属物种(例如，H.arbustorum)、Helicodiscus属物种、Helix属物种(例如，H.aperta、H.aspersa、H.pomatia)、Limax属物种(例如，L.cinereoniger、L.flavus、L.marginatus、L.maximus、L.tenellus)、Limicolaria属物种(例如，Limicolaria aurora)、椎实螺属物种(Lymnaea spp.)(例如，静水椎实螺(L.stagnalis))、Mesodon属物种(例如，Mesonthyroidus)、蒙纳螺属物种(Monadenia spp.)(例如，信念蒙纳螺(Monadenia fidelis))、Milax属物种(例如，M.gagates、M.marginatus、M.sowerbyi、M.budapestensis)、钉螺属物种(Oncomelania spp.)、Neohelix属物种(例如，Neohelix albolabris)、钻螺属物种(Opeas spp.)、Otala属物种(例如，Otala lacteal)、Oxyloma属物种(例如，O.pfeifferi)、福寿螺属物种(Pomacea spp.)(例如，小管福寿螺(P.canaliculata))、琥珀螺属物种(Succinea spp.)、Tandonia属物种(例如，T.budapestensis、T.sowerbyi)、Theba属物种、瓦娄蜗牛属物种(Vallonia spp.)、或琥珀蜗牛属物种(Zonitoides spp.)(例如，光洁琥珀蜗牛(Z.nitidus))。
v.线虫
PMP组合物和相关方法可以用于降低线虫的适应度，例如以预防或处理植物中的线虫侵染。术语“线虫”包括属于线虫动物门的任何生物体。包括用于将通过使线虫与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至线虫的方法。另外地或可替代地，方法包括通过使植物与PMP组合物接触而将生物型杀有害生物剂递送至处于线虫侵染的风险或具有线虫侵染的植物。
PMP组合物和相关方法适用于预防或处理引起损害植物的线虫的侵染，这些线虫包括例如，根结线虫属物种(Meloidogyne spp.)(根结)、异皮线虫属物种(Heteroderaspp.)、球异皮线虫属物种(Globodera spp.)、短体线虫属物种(Pratylenchus spp.)、螺旋线虫属物种(Helicotylenchus spp.)、相似穿孔线虫(Radopholus similis)、鳞球茎茎线虫(Ditylenchus dipsaci)、肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis)、剑线虫属物种(Xiphinema spp.)、滑刃线虫属物种(Aphelenchoides spp.)和芹刺线虫(Belonolaimuslongicaudatus)。在一些情况下，线虫是植物寄生线虫或生活在土壤中的线虫。植物寄生线虫包括但不限于，体外寄生物，诸如剑线虫属物种(Xiphinema spp.)、长针线虫属物种(Longidorus spp.)、和毛刺线虫属物种(Trichodorus spp.)；半寄生物，诸如垫刃线虫属物种(Tylenchulus spp.)；移栖体内寄生物，如短体线虫属物种(Pratylenchus spp.)、穿孔线虫属物种(Radopholus spp.)、和盾线虫属物种(Scutellonema spp.)；定栖寄生物，诸如异皮线虫属物种(Heterodera spp.)、球异皮线虫属物种(Globodera spp.)、和根结线虫属物种(Meloidogyne spp.)；以及茎叶体内寄生物，诸如茎线虫属物种(Ditylenchusspp.)、滑刃线虫属物种(Aphelenchoides spp.)、和潜根线虫属物种(Hirschmaniellaspp.)。特别有害的根寄生土壤线虫是诸如异皮线虫属(Heterodera)或球异皮线虫属(Globodera)的囊肿形成线虫、和/或根结线虫属(Meloidogyne)的根结线虫。这些属的有害物种是例如，南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、大豆孢囊线虫(Heteroderaglycines，soybean cyst nematode)、马铃薯白线虫(Globodera pallida)和马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)，用本文描述的PMP组合物有效地控制这些物种。然而，本文描述的PMP组合物的使用决不限于这些属或物种，而且也以相同的方式延伸至其他线虫。
可以通过本文描述的方法和组合物靶向的线虫的其他实例包括但不限于例如居农粗纹膜垫刃线虫(Aglenchus agricola)、小麦粒线虫(Anguina tritici)、花生滑刃线虫(Aphelenchoides arachidis)、草莓滑刃线虫(Aphelenchoides fragaria)以及一般的滑刃线虫属物种(Aphelenchoides spp.)类茎和叶体内寄生虫、细小刺线虫(Belonolaimusgracilis)、长尾剌线虫(Belonolaimus longicaudatus)、诺顿刺线虫(Belonolaimusnortoni)、椰子伞滑刃线虫(Bursaphelenchus cocophilus)、Bursaphelenchus eremus、松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)以及一般的伞滑刃属物种(Bursaphelenchus spp.)、胡桃线虫(Cacopaurus pestis)、弯曲小环线虫(Criconemella curvata)、刻线小环线虫(Criconemella onoensis)、装饰小环线虫(Criconemella ornata)、Criconemella rusium、薄叶小环线虫(Criconemella xenoplax)(＝Mesocriconema xenoplax)和一般的小环线虫属物种(Criconemella spp.)、Criconemoides femiae、Criconemoides onoense、Criconemoides ornatum和一般的轮线虫属物种(Criconemoides spp.)、腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)、鳞球茎茎线虫(Ditylenchus dipsaci)、食菌茎线虫(Ditylenchus myceliophagus)和一般的茎线虫属物种(Ditylenchus spp.)类茎和叶体内寄生虫、Dolichodorus heterocephalus、马铃薯白线虫(Globodera pallida)(＝Heterodera pallida)、马铃薯金线虫(Globoderarostochiensis)(马铃薯胞囊线虫(potato cyst nematode))、茄球异皮线虫(Globoderasolanacearum)、烟草球异皮线虫(Globodera tabacum)、弗吉尼亚球异皮线虫(Globoderavirginia)和一般的球异皮线虫属物种(Globodera spp.)类固着性胞囊形成寄生虫、双角螺旋线虫(Helicotylenchus digonicus)、双宫双角螺旋线虫(Helicotylenchusdihystera)、刺桐双角螺旋线虫(Helicotylenchus erythrine)、多带双角螺旋线虫(Helicotylenchus multicinctus)、短小双角螺旋线虫(Helicotylenchus nannus)、假强壮双角螺旋线虫(Helicotylenchus pseudorobustus)和一般的螺旋线虫属物种(Helicotylenchus spp.)、半轮线虫(Hemicriconemoides)、蚤缀鞘线虫(Hemicycliophoraarenaria)、Hemicycliophora nudata、微细鞘线虫(Hemicycliophora parvana)、Heterodera avenae、十字花科异皮线虫(Heterodera cruciferae)、大豆异皮线虫(Heterodera glycines)(大豆胞囊线虫)、水稻异皮线虫(Heterodera oryzae)、甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii)、玉米异皮线虫(Heterodera zeae)和一般的异皮线虫属物种(Heterodera spp.)类固着性囊孢形成寄生虫、纤细潜根线虫(Hirschmaniellagracilis)、水稻潜根线虫(Hirschmaniella oryzae)、刺尾潜根线虫(Hirschmaniellaspinicaudata)和一般的潜根线虫属物种(Hirschmaniella spp.)类茎和叶的内寄生虫、埃及纽带线虫(Hoplolaimus aegyptii)、加州纽带线虫(Hoplolaimus califomicus)、哥伦比亚纽带线虫(Hoplolaimus columbus)、帽状纽带线虫(Hoplolaimus galeatus)、印度纽带线虫(Hoplolaimus indicus)、大针纽带线虫(Hoplolaimus magnistylus)、不强纽带线虫(Hoplolaimus pararobustus)、非洲长针线虫(Longidorus africanus)、短环长针线虫(Longidorus breviannulatus)、逸去长针线虫(Longidorus elongatus)、光头长针线虫(Longidorus laevicapitatus)、藤蔓长针线虫(Longidorus vineacola)和一般的长针线虫属物种(Longidorus spp.)类外寄生虫、高粱根结线虫(Meloidogyne acronea)、非洲根结线虫(Meloidogyne africana)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)、泰晤士花生根结线虫(Meloidogyne arenaria thamesi)、Meloidogyne artiella、哥伦比亚根结线虫(Meloidogyne chitwoodi)、咖啡根结线虫(Meloidogyne coffeicola)、埃塞俄比亚根结线虫(Meloidogyne ethiopica)、短小根结线虫(Meloidogyne exigua)、伪哥伦比亚根结线虫(Meloidogyne fallax)、禾草根结线虫(Meloidogyne graminicola)、禾本科根结线虫(Meloidogyne graminis)、北方根结线虫(Meloidogyne hapla)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、Meloidogyne incognita acrita、爪哇根结线虫(Meloidogynejavanica)、吉库尤根结线虫(Meloidogyne kikuyensis)、微小根结线虫(Meloidogyneminor)、纳西根结线虫(Meloidogyne naasi)、巴拉那根结线虫(Meloidogyneparanaensis)、泰晤士根结线虫(Meloidogyne thamesi)和一般的根结线虫属物种(Meloidogyne spp.)类固着性囊孢形成寄生虫、瓢线虫属物种(Meloinema spp.)、异常珍珠线虫(Nacobbus aberrans)、Neotylenchus vigissi、Paraphelenchuspseudoparietinus、葱副毛刺线虫(Paratrichodorus allius)、裂片副毛刺线虫(Paratrichodorus lobatus)、微小拟毛刺线虫(Paratrichodorus minor)、矮小拟毛刺(Paratrichodorus nanus)、胼胝副毛刺线虫(Paratrichodorus porosus)、光滑副毛刺线虫(Paratrichodorus teres)和一般的副毛刺线虫属物种(Paratrichodorus spp.)、弯钩针线虫(Paratylenchus hamatus)、微小针线虫(Paratylenchus minutus)、突出针线虫(Paratylenchus projectus)和一般的针线虫属物种(Paratylenchus spp.)、敏捷短体线虫(Pratylenchus agilis)、艾氏短体线虫(Pratylenchus alleni)、安第斯短体线虫(Pratylenchus andinus)、最短尾短体线虫(Pratylenchus brachyurus)、谷类短体线虫(Pratylenchus cerealis)、咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)、刻痕短体线虫(Pratylenchus crenatus)、德式短体线虫(Pratylenchus delattrei)、圆尾短体线虫(Pratylenchus giibbicaudatus)、古氏短体线虫(Pratylenchus goodeyi)、钩状短体线虫(Pratylenchus hamatus)、六纹短体线虫(Pratylenchus hexincisus)、卢斯短体线虫(Pratylenchus loosi)、落选短体线虫(Pratylenchus neglectus)、穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)、草地短体线虫(Pratylenchus pratensis)、Pratylenchusscribneri、精美短体线虫(Pratylenchus teres)、索氏短体线虫(Pratylenchusthornei)、伤残短体线虫(Pratylenchus vulnus)、玉米短体线虫(Pratylenchus zeae)和一般的短体线虫属物种(Pratylenchus spp.)类迁移性内寄生虫、Pseudohalenchusminutus、大齿平滑垫刃线虫(Psilenchus magnidens)、肿大平滑垫刃线虫(Psilenchustumidus)、查尔斑皮线虫(Punctodera chalcoensis)、锐利五沟线虫(Quinisulciusacutus)、柑橘穿孔线虫(Radopholus citrophilus)、相似穿孔线虫(Radopholussimilis)、一般的穿孔线虫属物种(Radopholus spp.)类迁移性内寄生虫、北方小盘旋线虫(Rotylenchulus borealis)、小肾状线虫(Rotylenchulus parvus)、肾形小盘旋线虫(Rotylenchulus reniformis)和一般的小盘旋线虫属物种(Rotylenchulus spp.)、直沟盘旋线虫(Rotylenchus laurentinus)、Rotylenchus macrodoratus、强壮盘旋线虫(Rotylenchus robustus)、单型盘旋线虫(Rotylenchus uniformis)和一般的盘旋线虫属物种(Rotylenchus spp.)、小班盾线虫(Scutellonema brachyurum)、缓慢盾线虫(Scutellonema bradys)、格尾盾线虫(Scutellonema clathricaudatum)和一般的盾线虫属物种(Scutellonema spp.)类迁移性内寄生虫、根瘿亚蟃线虫(Subanguina radiciola)、烟草头线虫(Tetylenchus nicotianae)、圆筒毛刺线虫(Trichodorus cylindricus)、微小毛刺线虫(Trichodorus minor)、原始毛刺线虫(Trichodorus primitivus)、最近毛刺线虫(Trichodorus proximus)、相似毛刺线虫(Trichodorus similis)、少见毛刺线虫(Trichodorus sparsus)和一般的毛刺线虫属物种(Trichodorus spp.)类体外寄生虫、农田矮化线虫(Tylenchorhynchus agri)、甘蓝矮化线虫(Tylenchorhynchus brassicae)、清亮矮化线虫(Tylenchorhynchus clarus)、克莱顿矮化线虫(Tylenchorhynchusclaytoni)、指状矮化线虫(Tylenchorhynchus digitatus)、伊布里矮化线虫(Tylenchorhynchus ebriensis)、最大矮化线虫(Tylenchorhynchus maximus)、裸矮化线虫(Tylenchorhynchus nudus)、普通矮化线虫(Tylenchorhynchus vulgaris)和一般的矮化线虫属物种(Tylenchorhynchus spp.)、半穿刺线虫(Tylenchulus semipenetrans)和一般的小垫刃属物种(Tylenchulus spp.)类半寄生虫、美洲剑线虫(Xiphinemaamericanum)、短颈剑线虫(Xiphinema brevicolle)、裂尾剑线虫(Xiphinemadimorphicaudatum)、标准剑线虫(Xiphinema index)和一般的剑线虫属物种(Xiphinema)类外寄生物。
线虫有害生物的其他实例包括属于以下科的物种：环线虫科(Criconematidae)、刺线虫科(Belonolaimidae)、枪形科(Hoploaimidae)、异皮线虫科(Heteroderidae)、长针线虫科(Longidoridae)、短体线虫科(Pratylenchidae)、毛刺线虫科(Trichodoridae)、或粒线虫科(Anguinidae)。
表9示出了可以使用本文描述的PMP组合物和相关方法处理或预防的线虫和与其相关的疾病的进一步实例。
表9.线虫有害生物
Figure BDA0002947982740001451
Figure BDA0002947982740001461
Figure BDA0002947982740001471
vi.病毒
PMP组合物和相关方法可以用于降低病毒的适应度，例如以预防或处理植物中的病毒感染。包括用于将通过使病毒与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至病毒的方法。另外地或可替代地，方法包括通过使植物与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至处于病毒感染的风险或具有病毒感染的植物。
PMP组合物和相关方法适用于递送至引起植物中的病毒疾病的病毒，包括表10中列出的病毒和疾病。
表10.病毒性植物病原体
Figure BDA0002947982740001472
Figure BDA0002947982740001481
Figure BDA0002947982740001491
Figure BDA0002947982740001501
Figure BDA0002947982740001511
Figure BDA0002947982740001521
Figure BDA0002947982740001531
Figure BDA0002947982740001541
Figure BDA0002947982740001551
Figure BDA0002947982740001561
Figure BDA0002947982740001571
Figure BDA0002947982740001581
Figure BDA0002947982740001591
Figure BDA0002947982740001601
Figure BDA0002947982740001611
Figure BDA0002947982740001621
C.向植物共生体的递送
本文提供了向植物共生体递送本文披露的PMP组合物(例如，包括本文描述的修饰的PMP)的方法。包括用于将通过使共生体与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至共生体(例如，细菌内共生体、真菌内共生体、或昆虫)的方法。方法可以用于增加植物共生体(例如，对植物的适应度有益的共生体)的适应度。在一些情况下，可使用不含异源功能剂的PMP处理植物共生体。在其他情况下，PMP包括异源功能剂，例如肥料剂。
因此，这些方法可以用于增加植物共生体的适应度。在一个方面，本文提供了一种增加共生体的适应度的方法，该方法包括向该共生体递送本文描述的PMP组合物(例如，以有效量和有效持续时间)以相对于未处理的共生体(例如，未递送该PMP组合物的共生体)增加该共生体的适应度。
在一个方面，本文提供了一种增加真菌(例如，植物的真菌内共生体)的适应度的方法，其中该方法包括向该内共生体递送包含多个PMP的PMP组合物(例如，本文描述的PMP组合物)。例如，植物共生体可以是内共生真菌，诸如以下属的真菌：曲霉科(Aspergillaceae)、角担菌科(Ceratobasidiaceae)、Coniochaetaceae、虫草菌科(Cordycipitaceae)、伏革菌科(Corticiaceae)、Cystofilobasidiaceae、小戴卫霉科(Davidiellaceae)、德巴利酵母科(Debaryomycetaceae)、排腔科(Dothioraceae)、白粉菌科(Erysiphaceae)、线黑粉菌科(Filobasidiaceae)、小丛壳科(Glomerellaceae)、齿菌科(Hydnaceae)、肉座菌科(Hypocreaceae)、小球腔菌科(Leptosphaeriaceae)、蒙塔腔菌科(Montagnulaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)、小球腔菌科(Mycosphaerellaceae)、丛赤壳科(Nectriaceae)、圆盘菌科(Orbiliaceae)、暗球腔菌科(Phaeosphaeriaceae)、孢菌科(Pleosporaceae)、假散囊菌科(Pseudeurotiaceae)、根霉科(Rhizopodaceae)、核盘菌科(Sclerotiniaceae)、韧革菌科(Stereaceae)、或发菌科(Trichocomacea)。
在另一个方面，本文提供了一种增加细菌(例如，植物的细菌内共生体)的适应度的方法，其中该方法包括向该细菌递送包含多个PMP的PMP组合物(例如，本文描述的PMP组合物)。例如，植物共生体可以是内共生细菌，诸如以下属的细菌：醋杆菌科(Acetobacteraceae)、酸杆菌科(Acidobacteriaceae)、热酸菌科(Acidothermaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、产碱菌科(Alcaligenaceae)、第二节脂环酸芽胞杆菌科(Alicyclobacillaceae)、交替单胞菌科(Alteromonadaceae)、厌氧绳菌科(Anaerolineaceae)、橙单胞菌科(Aurantimonadaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、噬菌弧菌科(Bacteriovoracaceae)、蛭弧菌科(Bdellovibrionaceae)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、布鲁氏菌科(Brucellaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、Carboxydocellaceae、柄杆菌科(Caulobacteraceae)、纤维素单胞菌科(Cellulomonadaceae)、噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)、着色菌科(Chromatiaceae)、西索恩氏菌科(Chthoniobacteraceae)、Chthonomonadaceae、梭菌科(Clostridiaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、克斯体科(Coxiellaceae)、蟑螂杆状体科(Cryomorphaceae)、圆杆菌科(Cyclobacteriaceae)、噬纤维菌科(Cytophagaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、皮杆菌科(Dermabacteraceae)、皮生球菌科(Dermacoccaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)、赤杆菌科(Erythrobacteraceae)、纤维杆菌科(Fibrobacteraceae)、火色杆菌科(Flammeovirgaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、弗兰克氏菌科(Frankiaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、盖勒氏菌科(Gaiellaceae)、芽单胞菌科(Gemmatimonadaceae)、地嗜皮菌科(Geodermatophilaceae)、糖霉菌科(Gly corny cetaceae)、Haliangiaceae、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、全孢菌科(Holosporaceae)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、Iamiaceae、间孢囊菌科(Intrasporangiaceae)、动孢囊菌科(Kineosporiaceae)、科里氏菌科(Koribacteraceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、乳酸细菌科(Lactobacillaceae)、军团菌科(Legionellaceae)、钩端螺旋体科(Leptospiraceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、甲基孢囊菌科(Methylocystaceae)、嗜甲基菌科(Methylophilaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、小单孢菌科(Micromonosporaceae)、莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、支原体科(Mycoplasmataceae)、粘液球菌科(Myxococcaceae)、中村氏菌科(Nakamurellaceae)、奈瑟氏菌科(Neisseriaceae)、亚硝化单胞菌科(Nitrosomonadaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、海洋螺菌科(Oceanospirillaceae)、丰佑菌科(Opitutaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、第三节类芽胞杆菌科(Paenibacillaceae)、副衣原体科(Parachlamydiaceae)、巴斯德菌科(Pasteurellaceae)、扩展杆菌科(Patulibacteraceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、叶杆菌科(Phyllobacteriaceae)、鱼立克次体科(Piscirickettsiaceae)、浮霉菌科(Planctomycetaceae)、动性球菌科(Planococcaceae)、多囊菌科(Polyangiaceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、原孢子科(Promicromonosporaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、假诺卡氏科(Pseudonocardiaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)、玫瑰弯菌科(Roseiflexaceae)、红色杆菌科(Rubrobacteriaceae)、Sandaracinaceae、血杆菌科(Sanguibacteraceae)、腐螺旋菌科(Saprospiraceae)、慢反应脂肪酸菌科(Segniliparaceae)、希瓦氏菌科(Shewanellaceae)、华杆菌科(Sinobacteraceae)、索利氏菌科(Solibacteraceae)、Solimonadaceae、土壤红杆菌科(Solirubrobacteraceae)、鞘脂杆菌科(Sphingobacteriaceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、螺原体科(Spiroplasmataceae)、鱼孢菌科(Sporichthyaceae)、第五节芽胞乳杆菌科(Sporolactobacillaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)、互营杆菌科(Syntrophobacteraceae)、韦荣氏菌科(Veillonellaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、周蝶菌科(Weeksellaceae)、黄色杆菌科(Xanthobacteraceae)或黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)。
在又另一个方面，本文提供了一种增加昆虫(例如，植物的昆虫共生体)的适应度的方法，其中该方法包括向该昆虫递送包含多个PMP的PMP组合物(例如，本文描述的PMP组合物)。在一些情况下，昆虫是植物授粉者。例如，昆虫可以是膜翅目属或双翅目属。在一些情况下，膜翅目属的昆虫是蜜蜂。在其他情况下，双翅目属的昆虫是蝇。
在一些情况下，由于施用PMP组合物，共生体适应度的增加可表现为共生体生理学的改善(例如，健康或存活改善)。在一些情况下，与未递送PMP组合物的共生体相比，生物体的适应度可以通过一种或多种参数来测量，该一种或多种参数包括但不限于繁殖速率、寿限、移动性、繁殖力、体重、代谢速率或活动、或存活。例如，相比于未施用PMP组合物的共生体生物体，本文提供的方法或组合物可有效改善共生体的总体健康或改善共生体的总体存活。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受PMP组合物的共生体中发现的水平)，共生体的存活增加大约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。在一些情况下，与未施用PMP组合物的共生体生物体相比，这些方法和组合物有效增加共生体繁殖(例如，繁殖速率)。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受PMP组合物的共生体中发现的水平)，这些方法和组合物有效地将其他生理参数(诸如移动性、体重、寿限、繁殖力、或代谢速率)增加约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
在一些情况下，与未施用PMP组合物的共生体生物体相比，生物体适应度的增加可表现为该生物体进行的所希望的活动(例如，授粉、捕食有害生物、种子传播、或废物或有机材料分解)的频率或功效的增加。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受PMP组合物的共生体中发现的水平)，本文提供的方法和组合物可以有效地将该共生体进行所希望的活动(例如，授粉、捕食有害生物、种子传播、或废物或有机材料分解)的频率或功效增加约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
在一些情况下，与未施用PMP组合物的共生体生物体相比，该共生体适应度增加可表现为在该共生体中一种或多种营养物(例如，维生素、碳水化合物、氨基酸、或多肽)生产的增加。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受PMP组合物的共生体中发现的水平)，本文提供的方法或组合物可以有效地将共生体中的营养物(例如，维生素、碳水化合物、氨基酸、或多肽)的生产增加约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。在一些情况下，本文提供的方法或组合物可通过增加共生体中一种或多种微生物(例如，内共生体)产生或代谢的营养物来增加相关植物中的营养物。
在一些情况下，与未施用PMP组合物的共生体生物体相比，共生体适应度的增加可以表现为共生体对杀有害生物剂的敏感性的降低和/或共生体对杀有害生物剂的抗性的增加。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受PMP组合物的共生体中发现的水平)，本文提供的方法或组合物可以有效地将共生体对杀有害生物剂的敏感性降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
在一些情况下，与未施用PMP组合物的共生体生物体相比，共生体适应度的增加可表现为该共生体对化感剂的敏感性的降低和/或该共生体对化感剂的抗性的增加。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受PMP组合物的共生体中发现的水平)，本文提供的方法或组合物可以有效地将共生体对化感剂的抗性增加约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。在一些情况下，化感剂是咖啡因、大豆半胱氨酸蛋白酶抑制剂N、单萜类、二萜酸、或酚类化合物。在一些情况下，本文提供的方法和组合物可通过增加共生体将化感剂代谢或降解为可用底物的能力来降低共生体对化感剂的敏感性。
在一些情况下，与未施用PMP组合物的共生体生物体相比，本文提供的方法或组合物可以有效地增加共生体对寄生生物或病原体(例如，真菌的、细菌的、或病毒的病原体或寄生螨(例如，蜜蜂中的狄斯瓦螨(Varroa destructor))的抗性。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受PMP组合物的共生体中发现的水平)，本文提供的方法或组合物可以有效地将共生体对病原体或寄生生物(例如，真菌病原体、细菌病原体或病毒病原体；或者寄生螨(例如，蜜蜂中的狄斯瓦螨(Varroa destructor))的抗性增加约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
在一些情况下，与未施用PMP组合物的共生体生物体相比，共生体适应度增加可表现为其他适应度优点，如对某些环境因素(例如，高温或低温耐受性)的耐受性提高、在某些生境中的存活能力提高、或维持某种饲料的能力提高(例如，代谢大豆和玉米的能力提高)。在一些情况下，本文提供的方法和组合物可以以本文描述的多种方式中的任一种来有效增加共生体适应度。此外，PMP组合物可以增加任何数量的共生体纲、目、科、属、或物种(例如，1个共生体物种、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、200、250、500、或更多个共生体物种)中的共生体适应度。在一些情况下，PMP组合物作用于单一共生体纲、目、科、属、或物种。
可以使用本领域的任何标准方法来评估共生体适应度。在一些情况下，可以通过评价单独的共生体来评估共生体适应度。可替代地，可以通过评价共生体群体来评估共生体适应度。例如，共生体适应度增加可表现为与其他昆虫的成功竞争的增加，从而导致该共生体群体的规模增加。
本文进一步描述了可以用本发明的组合物或相关方法处理的植物共生体的实例。
i.真菌
PMP组合物和相关方法可以用于增加真菌(例如，植物的内共生体的真菌(例如，菌根真菌))的适应度。
在一些情况下，真菌属于以下科：曲霉科、角担菌科、Coniochaetaceae、虫草菌科、伏革菌科、Cystofilobasidiaceae、小戴卫霉科、德巴利酵母科、排腔科、白粉菌科、线黑粉菌科、小丛壳科、齿菌科、肉座菌科、小球腔菌科、蒙塔腔菌科、被孢霉科、小球腔菌科、丛赤壳科、圆盘菌科、暗球腔菌科、孢菌科、假散囊菌科、根霉科、核盘菌科、韧革菌科、或发菌科。
在一些情况下，真菌是具有与植物的根缔合的菌根(例如，外生菌根或内生菌根)的真菌，包括属于球囊菌门(Glomeromycota)、担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)或接合菌门(Zygomycota)的真菌。
i.细菌
PMP组合物和相关方法可以用于增加细菌(例如，植物的内共生体的细菌(例如，固氮细菌))的适应度。
例如，细菌可以是食酸菌属(Acidovorax)、农杆菌属、芽孢杆菌属、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、短小杆菌属(Curtobacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、青枯菌属(Ralstonia)、根瘤菌属(Rhizobium)、糖杆菌属(Saccharibacillus)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)或寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)。
在一些情况下，细菌属于以下科：醋杆菌科、酸杆菌科、热酸菌科、气球菌科、产碱菌科、第二节脂环酸芽胞杆菌科、交替单胞菌科、厌氧绳菌科、橙单胞菌科、芽孢杆菌科、噬菌弧菌科、蛭弧菌科、慢生根瘤菌科、短杆菌科、布鲁氏菌科、伯克氏菌科、Carboxydocellaceae、柄杆菌科、纤维素单胞菌科、噬几丁质菌科、着色菌科、西索恩氏菌科、Chthonomonadaceae、梭菌科、丛毛单胞菌科、棒状杆菌科、克斯体科、蟑螂杆状体科、圆杆菌科、噬纤维菌科、异常球菌科、皮杆菌科、皮生球菌科、肠杆菌科、肠球菌科、赤杆菌科、纤维杆菌科、火色杆菌科、黄杆菌科、弗兰克氏菌科、梭杆菌科、盖勒氏菌科、芽单胞菌科、地嗜皮菌科、糖霉菌科、Haliangiaceae、盐单胞菌科、全孢菌科、生丝微菌科、Iamiaceae、间孢囊菌科、动孢囊菌科、科里氏菌科、毛螺菌科、乳酸细菌科、军团菌科、钩端螺旋体科、明串珠菌科、甲基杆菌科、甲基孢囊菌科、嗜甲基菌科、微杆菌科、微球菌科、小单孢菌科、莫拉氏菌科、分枝杆菌科、支原体科、粘液球菌科、中村氏菌科、奈瑟氏菌科、亚硝化单胞菌科、诺卡氏菌科、类诺卡氏菌科、海洋螺菌科、丰佑菌科、草酸杆菌科、第三节类芽胞杆菌科、副衣原体科、巴斯德菌科、扩展杆菌科、消化链球菌科、叶杆菌科、鱼立克次体科、浮霉菌科、动性球菌科、多囊菌科、紫单胞菌科、普雷沃氏菌科、原孢子科、假单胞菌科、假诺卡氏科、根瘤菌科、红杆菌科、红螺菌科、玫瑰弯菌科、红色杆菌科、Sandaracinaceae、血杆菌科、腐螺旋菌科、慢反应脂肪酸菌科、希瓦氏菌科、华杆菌科、索利氏菌科、Solimonadaceae、土壤红杆菌科、鞘脂杆菌科、鞘脂单胞菌科、螺原体科、鱼孢菌科、第五节芽胞乳杆菌科、葡萄球菌科、链球菌科、链霉菌科、互营杆菌科、韦荣氏菌科、疣微菌科、周蝶菌科、黄色杆菌科或黄单胞菌科。
在一些情况下，内共生细菌属于选自由以下组成的组的科：芽孢杆菌科、伯克氏菌科、丛毛单胞菌科、肠杆菌科、黄杆菌科、甲基杆菌科、微杆菌科、类芽孢杆菌科、假单胞菌科、根瘤菌科、鞘脂单胞菌科和黄单胞菌科。
在一些情况下，内共生细菌属于选自由以下组成的组的属：食酸菌属、农杆菌属、芽孢杆菌属、伯克霍尔德氏菌属、金黄杆菌属、短小杆菌属、肠杆菌属、埃希氏杆菌属、甲基杆菌属、类芽孢杆菌属、泛菌属、假单胞菌属、青枯菌属、糖杆菌属、鞘氨醇单胞菌属和寡养单胞菌属。
ii.昆虫
PMP组合物和相关方法可以用于增加昆虫(例如，对植物有益的昆虫)的适应度。术语“昆虫”包括在任何发育阶段(即，未成熟昆虫和成虫昆虫)的属于节肢动物门以及属于昆虫纲(Insecta)或蛛形纲(Arachnida)的任何生物体。例如，宿主可以包括在农业应用中使用的昆虫(包括有助于作物的授粉、传播种子或有害生物控制的昆虫)。
在一些情况下，宿主有助于植物授粉(例如，蜂、甲虫、黄蜂、蝇、蝴蝶或蛾)。在一些情况下，有助于植物授粉的宿主是蜂。在一些情况下，蜂属于以下科：地花蜂科(Andrenidae)、蜜蜂科(Apidae)、分舌花蜂科(Colletidae)、隧蜂科(Halictidae)、或切叶蜂科(Megachilidae)。在一些实例中，有助于植物授粉的宿主是甲虫。在具体情况下，PMP组合物可以用于增加蜜蜂的适应度。
在一些情况下，有助于植物授粉的宿主是甲虫，例如，吉丁虫科(Buprestidae)、花萤科(Cantharidae)、天牛科(Cerambycidae)、叶甲科(Chrysomelidae)、郭公虫科(Cleridae)、瓢虫科(Coccinellidae)、叩甲科(Elateridae)、长朽木甲科(Melandryidae)、芫菁科(Meloidae)、拟花萤科(Melyridae)、花蚤科(Mordellidae)、露尾甲科(Nitidulidae)、拟天牛科(Oedemeridae)、金龟子科(Scarabaeidae)、或隐翅虫科(Staphyllinidae)。
在一些情况下，有助于植物授粉的宿主是蝴蝶或蛾(例如，鳞翅目)。在一些情况下，蝴蝶或蛾是以下科中的物种：尺蛾科(Geometridae)、蝶科(Hesperiidae)、灰蝶科(Lycaenidae)、夜蛾科(Noctuidae)、蛱蝶科(Nymphalidae)、凤蝶科(Papilionidae)、粉蝶科(Pieridae)、或天蛾科(Sphingidae)。
在一些情况下，有助于植物授粉的宿主是蝇(例如，双翅目)。在一些情况下，蝇属于以下科：花蝇科(Anthomyiidae)、毛蚊科(Bibionidae)、蜂虻科(Bombyliidae)、丽蝇科(Calliphoridae)、瘿蚊科(Cecidomiidae)、Certopogonidae、Chrionomidae、眼蝇科(Conopidae)、蚊科(Culicidae)、长足虻科(Dolichopodidae)、舞虻科(Empididae)、水蝇科(Ephydridae)、尖翅蝇科(Lonchopteridae)、蝇科(Muscidae)、菌蚊科(Mycetophilidae)、蚤蝇科(Phoridae)、蚋科(Simuliidae)、水虻科(Stratiomyidae)、或食蚜蝇科(Syrphidae)。
在一些情况下，有助于授粉的宿主是蚂蚁(例如，蚁科(Formicidae))、叶蜂(例如，叶蜂科(Tenthredinidae))、或黄蜂(wasp)(例如，泥蜂科(Sphecidae)或胡蜂科(Vespidae))。
D.递送至动物病原体
本文提供了通过使病原体与PMP组合物接触而将PMP组合物(例如，包括本文描述的修饰的PMP)递送至动物(例如，人)病原体(例如，本文披露的病原体)的方法。如本文所用，术语“病原体”是指通过以下方式引起动物的疾病或疾病症状的生物体，诸如微生物或无脊椎动物：例如(i)直接感染动物，(ii)产生引起动物的疾病或疾病症状的因子(例如，产生病原体毒素等的细菌)，和/或(iii)引发动物的免疫(例如，炎症反应)(例如，咬昆虫(biting insect)，例如臭虫)。如本文所用，病原体包括但不限于细菌、原生动物、寄生生物、真菌、线虫、昆虫、类病毒和病毒、或其任何组合，其中每种病原体能够(自身或与另一种病原体共同)引发动物(例如，人)的疾病或症状。
在一些情况下，可使用不含异源功能剂的PMP处理动物(例如，人)病原体。在其他情况下，PMP包括异源功能剂，例如，异源治疗剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂、抗病毒剂或驱避剂)。方法可以用于降低动物病原体的适应度，例如作为递送PMP组合物的结果以预防或处理病原体感染或控制病原体的扩散。
可以根据本文描述的方法靶向的病原体的实例包括细菌(例如，链球菌属物种、肺炎球菌属物种、假单胞菌属物种、志贺氏菌属物种、沙门氏菌属物种、弯曲杆菌属物种或埃希氏杆菌属物种)、真菌(酵母属物种或念珠菌属物种)、寄生昆虫(例如，臭虫属物种)、寄生线虫(例如，Heligmosomoides属物种)、或寄生原生动物(例如，滴虫病(Trichomoniasis)物种)。
例如，本文提供了一种降低病原体的适应度的方法，该方法包括向该病原体递送本文描述的PMP组合物，其中相对于未处理的病原体，该方法降低该病原体的适应度。在一些实施例中，方法包括将组合物递送至其中病原体生长、生活、繁殖、进食或侵染的至少一个生境。在本文描述的方法的一些情况下，将组合物作为病原体可食用组合物递送，以被该病原体摄食。在本文描述的方法的一些情况下，将组合物以液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体的形式递送(例如，至病原体)。
本文还提供了一种降低寄生昆虫的适应度的方法，其中该方法包括向该寄生昆虫递送包含多个PMP的PMP组合物。在一些情况下，该方法包括向该寄生昆虫递送包含多个PMP的PMP组合物，其中该多个PMP包含杀昆虫剂。例如，寄生昆虫可以是臭虫。本文提供了寄生昆虫的其他非限制性实例。在一些情况下，相对于未处理的寄生昆虫，该方法降低该寄生昆虫的适应度
本文另外提供了一种降低寄生线虫的适应度的方法，其中该方法包括向该寄生线虫递送包含多个PMP的PMP组合物。在一些情况下，该方法包括向该寄生线虫递送包含多个PMP的PMP组合物，其中该多个PMP包含杀线虫剂。例如，寄生线虫是多形螺旋线虫(Heligmosomoides polygyrus)。本文提供了寄生线虫的其他非限制性实例。在一些情况下，相对于未处理的寄生线虫，该方法降低该寄生线虫的适应度。
本文进一步提供了一种降低寄生原生动物的适应度的方法，其中该方法包括向该寄生原生动物递送包含多个PMP的PMP组合物。在一些情况下，该方法包括向该寄生原生动物递送包含多个PMP的PMP组合物，其中该多个PMP包含抗寄生生物剂。例如，寄生原生动物可以是阴道毛滴虫(T.vaginalis)。本文提供了寄生原生动物的其他非限制性实例。在一些情况下，相对于未处理的寄生原生动物，该方法降低该寄生原生动物的适应度。
作为递送PMP组合物的结果的病原体适应度的降低可以以许多种方式表现。在一些情况下，作为递送PMP组合物的结果，病原体适应度的降低可以表现为病原体的生理学的劣化或下降(例如，健康或存活降低)。在一些情况下，与未施用PMP组合物的病原体相比，生物体的适应度可以通过一种或多种参数来测量，该一种或多种参数包括但不限于繁殖速率、生育力、寿限、生存力、移动性、繁殖力、病原体发育、体重、代谢速率或活动、或存活。例如，本文提供的方法或组合物可以有效降低病原体的总体健康或降低病原体的总体存活。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受PMP组合物的病原体中发现的水平)，病原体的存活降低大约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。在一些情况下，与未施用PMP组合物的病原体相比，这些方法和组合物有效降低病原体繁殖(例如，繁殖速率、生育力)。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受PMP组合物的病原体中发现的水平)，这些方法和组合物有效地将其他生理参数(诸如移动性、体重、寿限、繁殖力、或代谢速率)降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
在一些情况下，与未递送PMP组合物的病原体相比，有害生物适应度的降低可以表现为病原体对抗病原体剂的敏感性的增加和/或病原体对抗病原体剂的抗性的降低。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受PMP组合物的有害生物中发现的水平)，本文提供的方法或组合物可以有效地将病原体对杀有害生物剂的敏感性增加约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
在一些情况下，与未递送PMP组合物的病原体相比，病原体适应度的降低可表现为其他适应度劣势，诸如对某些环境因素的耐受性(例如，高温或低温耐受性)降低、在某些生境中存活的能力降低、或维持某种饮食的能力降低。在一些情况下，本文提供的方法或组合物可以以本文描述的任何多种方式有效降低病原体适应度。此外，PMP组合物可以降低任何数量的病原体纲、目、科、属、或物种(例如，1个病原体物种、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、200、250、500、或更多个病原体物种)中的病原体适应度。在一些情况下，PMP组合物作用于单一有害生物纲、目、科、属、或物种。
可以使用本领域的任何标准方法来评估病原体适应度。在一些情况下，可以通过评价单独的病原体来评估有害生物适应度。可替代地，可以通过评价病原体群体来评估有害生物适应度。例如，病原体适应度的降低可表现为与其他病原体的成功竞争的降低，从而导致病原体群体规模的减小。
本文描述的PMP组合物和相关方法可用于降低动物病原体的适应度并且从而处理或预防动物的感染。本文进一步描述了可以用本发明的组合物或相关方法处理的动物病原体或其媒介的实例。
i.真菌
PMP组合物和相关方法可以用于降低真菌的适应度，例如以预防或处理动物中的真菌感染。包括用于将通过使真菌与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至真菌的方法。另外地或可替代地，该方法包括通过向该动物施用PMP组合物来预防或处理处于真菌感染(例如，由本文描述的真菌引起的)风险的动物或有需要的动物的真菌感染。
PMP组合物和相关方法适用于处理或预防动物的真菌感染，包括由真菌引起的感染，该真菌属于子囊菌门(尖孢镰孢、杰氏肺囊虫(Pneumocystis jirovecii)、曲霉属物种、粗球孢子菌/波萨达斯球孢子菌(Coccidioides immitis/posadasii)、白色念珠菌(Candida albicans))、担子菌门(新型线黑粉菌(Filobasidiella neoformans)、毛孢子菌属(Trichosporon))、微孢子门(Microsporidia)(家兔脑胞内原虫(Encephalitozooncuniculi)、肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi))、毛霉亚门(Mucoromycotina)(卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、稻根霉菌(Rhizopus oryzae)、伞状毛霉菌(Lichtheimiacorymbifera))。
在一些情况下，真菌感染是由属于以下的引起的：子囊菌门、担子菌门、壶菌门(Chytridiomycota)、微孢子门、或接合菌门。真菌感染或过度生长可以包括一种或多种真菌物种，例如白色念珠菌、热带念珠菌(C.tropicalis)、近平滑念珠菌(C.parapsilosis)、光滑念珠菌(C.glabrata)、耳念珠菌(C.auris)、克鲁斯念珠菌(C.krusei)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、球形马拉色菌(Malassezia globose)、限制马拉色菌(M.restricta)、或汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、串珠状赤霉(Gibberellamoniliformis)、甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、杰氏肺囊虫(P.jirovecii)、鼠源肺囊虫(P.murina)、兔源肺囊虫(P.oryctolagi)、大鼠源肺囊虫(P.wakefieldiae)、和棒曲霉(Aspergillus clavatus)。真菌物种可以被认为是病原体或机会病原体。
在一些情况下，真菌感染是由念珠菌属真菌引起的(即，念珠菌属感染)。例如，念珠菌属感染可以是由念珠菌属真菌引起的，该念珠菌属真菌选自由以下组成的组：人白色念珠菌(C.albicans)、光滑念珠菌、都柏林念珠菌(C.dubliniensis)、克鲁斯念珠菌、耳念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、拟平滑念珠菌(C.orthopsilosis)、吉利蒙念珠菌(C.guilliermondii)、多皱念珠菌(C.rugose)、和葡萄牙念珠菌(C.lusitaniae)。可以通过本文披露的方法处理的念珠菌属感染包括但不限于念珠菌血症、口咽念珠菌病、食管念珠菌病、粘膜念珠菌病、生殖器念珠菌病、外阴阴道念珠菌病、直肠念珠菌病、肝念珠菌病、肾念珠菌病、肺念珠菌病、脾念珠菌病、耳霉菌病、骨髓炎、化脓性关节炎、心血管念珠菌病(例如，心内膜炎)、和侵入性念珠菌病。
ii.细菌
PMP组合物和相关方法可以用于降低细菌的适应度，例如以预防或处理动物中的细菌感染。包括用于将通过使细菌与PMP组合物接触而将PMP组合物施用于细菌的方法。另外地或可替代地，该方法包括通过向该动物施用PMP组合物来预防或处理处于细菌感染(例如，由本文描述的细菌引起的)风险的动物或有需要的动物的细菌感染。
PMP组合物和相关方法适用于预防或处理由下文进一步描述的任何细菌引起的动物的细菌感染。例如，细菌可以是属于以下的细菌：芽孢杆菌目(Bacillales)(炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、金色葡萄球菌(S.aureus)、产单核细胞李斯特菌(L.monocytogenes))、乳酸杆菌目(Lactobacillales)(肺炎链球菌(S.pneumoniae)、酿脓链球菌(S.pyogenes))、梭菌目(Clostridiales)(肉毒棱菌(C.botulinum)、艰难梭菌(C.difficile)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、破伤风梭菌(C.tetani))、螺旋体目(Spirochaetales)(伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、苍白密螺旋体(Treponemapallidum))、衣原体目(Chlamydiales)(沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci))、放线菌目(Actinomycetales)(白喉棒状杆菌(C.diphtheriae)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、鸟分支杆菌(M.avium))、立克次氏体目(Rickettsiales)(普氏立克次氏体(R.prowazekii)、立氏立克次氏体(R.rickettsii)、斑疹伤寒立克次氏体(R.typhi)、嗜吞噬细胞无形体(A.phagocytophilum)、查菲埃立克体(E.chaffeensis))、根瘤菌目(Rhizobiales)(羊布鲁氏杆菌(Brucella melitensis))、伯克霍尔德氏菌目(Burkholderiales)(百日咳博代氏杆菌(Bordetella pertussis)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(B.pseudomallei))、奈瑟氏菌目(Neisseriales)(淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis))、弯曲菌目(Campylobacterales)(空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori))、军团菌目(Legionellales)(嗜肺军团杆菌(Legionella pneumophila))、假单胞菌目(Pseudomonadales)(鲍曼不动杆菌(A.baumannii)、卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))、气单胞菌目(Aeromonadales)(气单胞菌属物种(Aeromonas sp.))、弧菌目(Vibrionales)(霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus))、硫发菌目(Thiotrichales)、巴斯德氏菌目(Pasteurellales)(流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae))、肠杆菌目(Enterobacteriales)(肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)、小肠结肠炎耶尔森菌(Y.enterocolitica)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、大肠杆菌(E.coli))。
iii.寄生昆虫
PMP组合物和相关方法可以用于降低寄生昆虫的适应度，例如以预防或处理动物中的寄生昆虫感染。术语“昆虫”包括在任何发育阶段(即，未成熟昆虫和成虫昆虫)的属于节肢动物门以及属于昆虫纲(Insecta)或蛛形纲(Arachnida)的任何生物体。包括用于将通过使昆虫与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至昆虫的方法。另外地或可替代地，该方法包括通过向该动物施用PMP组合物来预防或处理处于寄生昆虫感染(例如，由本文描述的寄生昆虫引起的)风险的动物或有需要的动物的寄生昆虫感染。
PMP组合物和相关方法适用于预防或处理由寄生昆虫导致的动物感染，包括由属于以下的昆虫导致的感染：虱毛目(Phthiraptera)：虱目(Anoplura)(吸虱(Suckinglice))、丝角亚目(Ischnocera)(咀虱(Chewing lice))、钝角亚目(Amblycera)(咀虱)。蚤目(Siphonaptera)：蚤科(Pulicidae)(猫蚤(Cat flea))、角叶蚤科(Ceratophyllidae)(鸡蚤(Chicken-flea))。双翅目(Diptera)：蚊科(Culicidae)(蚊子)、蠓科(Ceratopogonidae)(蠓(Midge))、毛蠓科(Psychodidae)(蚋(Sandfly))、蚋科(Simuliidae)(黑蝇(Blackfly))、虻科(Tabanidae)(马蝇(Horse-fly))、蝇科(Muscidae)(马蝇等)、丽蝇科(Calliphoridae)(丽蝇(Blowfly))、舌蝇科(Glossinidae)(采采蝇(Tsetse-fly))、狂蝇科(Oestridae)(肤蝇(Bot-fly))、虱蝇科(Hippoboscidae)(虱蝇)。半翅目(Hemiptera)：猎蝽科(Reduviidae)(猎蝽(Assassin-bug))、臭虫科(Cimicidae)(臭虫)。蛛形纲(Arachnida)：疥螨科(Sarcoptidae)(疥螨(Sarcoptic mite))、痒螨科(Psoroptidae)(痒螨(Psoropticmite))、胞螨科(Cytoditidae)(气囊螨(Air-sac mite))、鸡雏螨属(Laminosioptes)(囊螨(Cyst-mite))、羽螨科(Analgidae)(羽螨(Feather-mite))、粉螨科(Acaridae)(谷螨(Grain-mite))、蠕形螨科(Demodicidae)(毛囊螨(Hair-follicle mite))、姬肉食螨科(Cheyletiellidae)(毛螨(Fur-mite))、恙螨科(Trombiculidae)(恙螨(Trombiculid))、皮刺螨科(Dermanyssidae)(鸟螨(Bird mite))、巨刺螨科(Macronyssidae)(鸟螨)、隐喙蜱科(Argasidae)(软蜱(Soft-tick))、硬蜱科(Ixodidae)(硬蜱(Hard-tick))。
iv.原生动物
PMP组合物和相关方法可以用于降低寄生原生动物的适应度，例如以预防或处理动物中的寄生原生动物感染。术语“原生动物”包括属于原生动物门的任何生物体。包括用于将通过使寄生原生动物与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至寄生原生动物的方法。另外地或可替代地，该方法包括通过向该动物施用PMP组合物来预防或处理处于原生动物感染(例如，由本文描述的原生动物引起的)风险的动物或有需要的动物的原生动物感染。
PMP组合物和相关方法适用于预防或处理由动物中的寄生原生动物导致的感染，这些寄生原生动物包括属于以下的原生动物：眼虫门(Euglenozoa)(克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、利什曼原虫属物种(Leishmaniaspp.))、异叶足纲(Heterolobosea)(福氏纳格里阿米巴原虫(Naegleria fowleri))、双滴虫目(Diplomonadida)(肠贾第虫(Giardia intestinalis))、变形虫门(Amoebozoa)(卡氏棘阿米巴(Acanthamoeba castellanii)、狒狒巴拉姆希阿米巴(Balamuthiamandrillaris)、痢疾变形虫(Entamoeba histolytica))、芽囊原虫属(Blastocystis)(人芽囊原虫(Blastocystis hominis))、顶复亚门(Apicomplexa)(微小巴贝虫(Babesiamicroti)、微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、卡耶塔环孢子虫(Cyclosporacayetanensis)、疟原虫属物种(Plasmodium spp.)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii))。
v.线虫
PMP组合物和相关方法可以用于降低寄生线虫的适应度，例如以预防或处理动物中的寄生线虫感染。包括用于将通过使寄生线虫与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至寄生线虫的方法。另外地或可替代地，该方法包括通过向该动物施用PMP组合物来预防或处理处于寄生线虫感染(例如，由本文描述的寄生线虫引起的)风险的动物或有需要的动物的寄生线虫感染。
PMP组合物和相关方法适用于预防或处理由动物中的寄生线虫导致的感染，这些寄生线虫包括属于以下的线虫：线虫纲(Nematoda)(蛔虫(roundworm))：广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)(鼠肺虫(rat lungworm))、人蛔虫(Ascarislumbricoides)(人类蛔虫(human roundworm))、浣熊贝蛔虫(Baylisascaris procyonis)(浣熊蛔虫(raccoon roundworm))、毛首鞭虫(Trichuris trichiura)(人类鞭虫(humanwhipworm))、螺旋状旋毛形线虫(Trichinella spiralis)、粪类圆线虫(Strongyloidesstercoralis)、班氏吴策线虫(Wuchereria bancrofti)、马来布鲁线虫(Brugia malayi)、十二指肠钩口线虫(Ancylostoma duodenale)和美洲板口线虫(Necator americanus)(人类钩虫(human hookworm))、多节绦虫亚纲(Cestoda)(绦虫(tapeworm))：细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)、多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)、猪带绦虫(Taenia solium)(猪肉绦虫(pork tapeworm))。
vi.病毒
PMP组合物和相关方法可以用于降低病毒的适应度，例如以预防或处理动物中的病毒感染。包括用于将通过使病毒与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至病毒的方法。另外地或可替代地，该方法包括通过向该动物施用PMP组合物来预防或处理处于病毒感染(例如，由本文描述的病毒引起的)风险的动物或有需要的动物的病毒感染。
PMP组合物和相关方法适用于预防或处理动物的病毒感染，包括由属于以下的病毒导致的感染：DNA病毒：细小病毒科(Parvoviridae)、乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)、多瘤病毒科(Polyomaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)；单链负链RNA病毒：沙粒病毒科(Arenaviridae)、副粘液病毒科(Paramyxoviridae)(腮腺炎病毒(Rubulavirus)、呼吸道病毒(Respirovirus)、肺炎病毒(Pneumovirus)、麻疹病毒(Moribillivirus))、纤丝病毒科(Filoviridae)(马尔堡病毒(Marburgvirus)、埃博拉病毒(Ebolavirus))、波纳病毒科(Bornaoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、内罗病毒(Nairovirus)、汉坦病毒(Hantaviruses)、正本雅病毒(Orthobunyavirus)、白蛉病毒(Phlebovirus)。单链正链RNA病毒：星状病毒科(Astroviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)(风疹病毒(Rubivirus)、甲病毒(Alphavirus))、黄病毒科(Flaviviridae)(肝炎病毒(Hepacivirus)、黄病毒(Flavivirus))、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(肝病毒(Hepatovirus)、鼻病毒(Rhinovirus)、肠病毒(Enterovirus))；或dsRNA和逆转录病毒：呼肠孤病毒科(Reoviridae)(轮状病毒(Rotavirus)、科罗拉多蜱传热病毒(Coltivirus)、东南亚十二节段RNA病毒(Seadornavirus))、逆转录病毒科(Retroviridae)(δ逆转录病毒(Deltaretrovirus)、慢病毒(Lentivirus))、肝脱氧核糖核酸病毒科(Hepadnaviridae)(正嗜肝DNA病毒(Orthohepadnavirus))。
E.向病原体媒介的递送
本文提供了通过使病原体媒介与PMP组合物接触而将PMP组合物(例如，包括本文描述的修饰的PMP)递送至病原体媒介(例如，本文披露的病原体媒介)的方法。如本文所用，术语“媒介”是指可以将动物病原体从贮存器(reservoir)携带或传播给动物的昆虫。示例性媒介包括昆虫，诸如具有刺吸式口器的那些昆虫，如在半翅目(Hemiptera)和一些膜翅目以及双翅目(Diptera)中发现的昆虫，如蚊子、蜜蜂、黄蜂(wasp)、蠓、虱子、采采蝇、跳蚤以及蚁，连同蛛形纲动物(如蜱和螨)的成员。
在一些情况下，可使用不含异源功能剂的PMP处理动物(例如，人)病原体的媒介。在其他情况下，PMP包括异源功能剂，例如，异源治疗剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂、抗病毒剂或驱避剂)。方法可以用于降低病原体媒介的适应度，例如作为递送PMP组合物的结果以控制病原体的扩散。可以根据本发明方法靶向的病原体媒介的实例包括昆虫，诸如本文描述的那些。
例如，本文提供了一种降低动物病原体媒介的适应度的方法，该方法包括向该媒介递送有效量的本文描述的PMP组合物，其中相对于未处理的媒介，该方法降低该媒介的适应度。在一些情况下，方法包括将组合物递送至其中媒介生长、生活、繁殖、进食或侵染的至少一个生境。在一些情况下，将组合物作为可食用组合物递送，以被该媒介摄食。在一些情况下，媒介是昆虫。在一些情况下，昆虫是蚊子、蜱、螨、或虱子。在一些情况下，将组合物以液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体的形式递送(例如，至病原体媒介)。
例如，本文提供了一种降低动物病原体的昆虫媒介的适应度的方法，其中该方法包括向该媒介递送包含多个PMP的PMP组合物。在一些情况下，该方法包括向该媒介递送包含多个PMP的PMP组合物，其中该多个PMP包含杀昆虫剂。例如，昆虫媒介可以是蚊子、蜱、螨、或虱子。本文提供了病原体媒介的其他非限制性实例。在一些情况下，相对于未处理的媒介，该方法降低该媒介的适应度。
在一些情况下，作为施用组合物的结果，媒介适应度的降低可表现为媒介的生理学的劣化或下降(例如，健康或存活降低)。在一些情况下，与未递送组合物的媒介生物体相比，生物体的适应度可以通过一种或多种参数来测量，该一种或多种参数包括但不限于繁殖速率、寿限、移动性、繁殖力、体重、代谢速率或活动、或存活。例如，本文提供的方法或组合物可以有效地降低媒介的总体健康或降低媒介的总体存活。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受组合物的媒介中发现的水平)，媒介的存活降低大约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。在一些情况下，与未递送组合物的媒介生物体相比，这些方法和组合物有效降低媒介繁殖(例如，繁殖速率)。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未递送组合物的媒介中发现的水平)，这些方法和组合物有效地将其他生理参数(诸如移动性、体重、寿限、繁殖力、或代谢速率)降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
在一些情况下，与未递送组合物的媒介生物体相比，媒介适应度的降低可表现为媒介对杀有害生物剂的敏感性的增加和/或媒介对杀有害生物剂的抗性的降低。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受组合物的媒介中发现的水平)，本文提供的方法或组合物可以有效地将媒介对杀有害生物剂的敏感性增加约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。杀有害生物剂可以是本领域已知的任何杀有害生物剂，包括杀昆虫剂。在一些情况下，与未递送组合物的媒介相比，本文提供的方法或组合物可以通过降低媒介的将杀有害生物剂代谢或降解成可用底物的能力来增加媒介对杀有害生物剂的敏感性。
在一些情况下，与未递送组合物的媒介生物体相比，媒介适应度的降低可表现为其他适应度劣势，诸如对某些环境因素的耐受性(例如，高温或低温耐受性)降低、在某些生境中存活的能力降低、或维持某种饮食的能力降低。在一些情况下，本文提供的方法或组合物可以以本文描述的任何多种方式有效地降低媒介适应度。此外，组合物可以降低任何数量的媒介纲、目、科、属、或物种(例如，1个媒介物种、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、200、250、500、或更多个媒介物种)中的媒介适应度。在一些情况下，组合物作用于单一媒介纲、目、科、属、或物种。
可以使用本领域的任何标准方法来评估媒介适应度。在一些情况下，可以通过评价单独的媒介来评估媒介适应度。可替代地，可以通过评价媒介群体来评估媒介适应度。例如，媒介适应度的降低可表现为与其他媒介的成功竞争的降低，从而导致媒介群体规模的减小。
通过降低携带动物病原体的媒介的适应度，本文提供的组合物有效减少传播媒介扩散的疾病。可以使用本文描述的任何配制品和递送方法以一定量和持续时间将组合物递送至昆虫，该量和持续时间有效地减少疾病传播(例如，减少媒介之间的垂直或水平传播和/或减少向动物的传播)。例如，与未递送组合物的媒介生物体相比，本文描述的组合物可以使媒介传播的病原体的垂直或水平传播减少约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或更多。作为另一个实例，与未递送组合物的媒介生物体相比，本文描述的组合物可以使昆虫媒介的媒介效能减少约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或更多。
可通过本文提供的组合物和方法控制的疾病的非限制性实例包括：由披膜病毒科(Togaviridae)病毒(例如，基孔肯雅病、罗斯河热(Ross River fever)、马亚罗病毒、奥绒绒热(Onyon-nyong fever)、辛德毕斯热(Sindbis fever)、东部脑脊髓炎、西方马脑脊髓炎(Wesetern equine encephalomyelitis)、委内瑞拉马脑脊髓炎(Venezualan equineencephalomyelitis)、或巴尔马森林病毒(Barmah forest))引起的疾病；由黄病毒科病毒(例如，登革热、黄热病、凯萨努森林病、鄂木斯克出血热、日本脑炎、墨累山谷脑炎、罗氏(Rocio)、圣路易脑炎(St.Louis encephalitis)、西尼罗河脑炎(West Nileencephalitis)、或蜱传播的脑炎)引起的疾病；由布尼亚病毒科(Bunyaviridae)病毒(例如，白蛉热(Sandly fever)、裂谷热、拉克罗斯脑炎(La Crosse encephalitis)、加州脑炎(California encephalitis)、克里米亚-刚果出血热、或奥罗普切热(Oropouche fever))引起的疾病；由弹状病毒科(Rhabdoviridae)病毒(例如，水泡性口炎)引起的疾病；由Orbiviridae(例如，蓝舌病(Bluetongue))引起的疾病；由细菌(例如，鼠疫、土拉菌病、Q热(Q fever)、落基山斑疹热(Rocky Mountain spotted fever)、鼠型斑疹伤寒、南欧斑疹热(Boutonneuse fever)、昆士兰壁虱斑疹伤寒(Queensland tick typhus)、西伯利亚斑疹伤寒(Siberian tick typhus)、恙虫病、回归热(Relapsing fever)、或莱姆病)引起的疾病；或由原生动物(例如，疟疾、非洲锥虫病、那加那病、查加斯病、利什曼病、梨浆虫病、班氏丝虫病(Bancroftian filariasis)、或布鲁格丝虫病(Brugian filariasis))引起的疾病。
i.病原体媒介
本文提供的方法和组合物可以用于降低动物病原体的媒介的适应度。在一些情况下，媒介可以是昆虫。例如，昆虫媒介可以包括但不限于：具有刺吸式口器的那些昆虫，如在半翅目(Hemiptera)和一些膜翅目(Hymenoptera)以及双翅目(Diptera)中发现的昆虫，如蚊子、蜜蜂、黄蜂、蠓、虱子、采采蝇、跳蚤以及蚁，连同蛛形纲动物(如蜱和螨)的成员；以下的目、纲或科：蜱螨目(蜱和螨)，例如隐喙蜱科(Argasidae)、皮刺螨科(Dermanyssidae)、硬蜱科(Ixodidae)、痒螨科(Psoroptidae)或疥螨科(Sarcoptidae)的代表，以及花蜱属物种(Amblyomma spp.)、Anocenton属物种(Anocenton spp.)、锐缘蜱属物种(Argas spp.)、牛蜱属物种(Boophilus spp.)、姬螯螨属物种(Cheyletiella spp.)、足螨属物种(Chorioptes spp.)、蠕形螨属物种(Demodex spp.)、革蜱属物种(Dermacentor spp.)、Denmanyssus属物种(Denmanyssus spp.)、血蜱属物种(Haemophysalis spp.)、璃眼蜱属物种(Hyalomma spp.)、硬蜱属物种(Ixodes spp.)、Lynxacarus属物种(Lynxacarus spp.)、中气门目属物种(Mesostigmata spp.)、耳螨属物种(Notoednes spp.)、钝缘蜱属物种(Ornithodoros spp.)、禽刺螨属物种(Ornithonyssus spp.)、残喙蜱属物种(Otobiusspp.)、耳痒螨属物种(otodectes spp.)、肺刺螨属物种(Pneumonyssus spp.)、螨属物种(Psoroptes spp.)、扇头蜱属物种(Rhipicephalus spp.)、疥螨科疥螨属物种(Sancoptesspp.)、或恙螨属物种(Trombicula spp.)的代表；虱目(Anoplura)(吸虱(sucking lice)和咬虱(biting lice))，例如牛虱属物种(Bovicola spp.)、血虱属物种(Haematopinusspp.)、毛虱属物种(Linognathus spp.)、禽羽虱属物种(Menopon spp.)、虱属物种(Pediculus spp.)、天疱疮属物种(Pemphigus spp.)、根瘤蚜属物种(Phylloxera spp.)、或管虱属物种(Solenopotes spp.)的代表；双翅目(Diptera)(蝇)，例如伊蚊属物种(Aedesspp.)、按蚊属物种(Anopheles spp.)、丽蝇属物种(Calliphora spp.)、金蝇属物种(Chrysomyia spp.)、斑虻属物种(Chrysops spp.)、锥蝇属物种(Cochliomyia spp.)、Cw/ex属物种(Cw/ex spp.)、库蠓属物种(Culicoides spp.)、黄蝇属物种(Cuterebra spp.)、皮蝇属物种(Dermatobia spp.)、胃蝇属物种(Gastrophilus spp.)、舌蝇属物种(Glossinaspp.)、血蝇属物种(Haematobia spp.)、麻虻属物种(Haematopota spp.)、虱蝇属物种(Hippobosca spp.)、牛皮蝇属物种(Hypoderma spp.)、绿蝇属物种(Lucilia spp.)、角蝇属物种(Lyperosia spp.)、蜱蝇属物种(Melophagus spp.)、狂蝇属物种(Oestrus spp.)、绿蝇属物种(Phaenicia spp.)、白蛉属物种(Phlebotomus spp.)、伏蝇属物种(Phormiaspp.)、壁虱(Acari)(犬疥螨(sarcoptic mange)，例如，疥螨科属物种(Sarcoptidaespp.)、麻蝇属物种(Sarcophaga spp.)、蚋属物种(Simulium spp.)、螫蝇属物种(Stomoxysspp.)、虻属物种(Tabanus spp.)、螗蜩属物种(Tannia spp.)、或Zzpu/alpha属物种(Zzpu/alpha spp.)的代表；食毛目(Mallophaga)(咬虱(biting lice)，例如，Damalina属物种(Damalina spp.)、猫羽虱属物种(Felicola spp.)、袋鼠虱属物种(Heterodoxus spp.)、或毛虱属物种(Trichodectes spp.)的代表；或者蚤目(Siphonaptera)(无翅昆虫)，例如，角叶蚤属物种(Ceratophyllus spp.)、客蚤属物种(Xenopsylla spp)的代表；臭虫科(Cimicidae)(椿象)，例如，臭虫属物种(Cimex spp.)、Tritominae属物种(Tritominaespp.)、Rhodinius属物种(Rhodinius spp.)、或锥蝽属物种(Triatoma spp.)的代表。
在一些情况下，昆虫是来自双翅目(例如，长角亚目(Nematocera)，例如，Colicidae科)的吸血昆虫(blood-sucking insect)。在一些情况下，昆虫来自蚊亚科(Culicinae)、短咀蚊亚科(Corethrinae)、蠓科(Ceratopogonidae)、或蚋科(Simuliidae)。在一些情况下，昆虫属于库蚊属物种(Culex spp.)、赛保蚊属物种(Theobaldia spp.)、伊蚊属物种(Aedes spp.)、按蚊属物种(Anopheles spp.)、伊蚊属物种(Aedes spp.)、Forciponiyia属物种(Forciponiyia spp.)、库蠓属物种(Culicoides spp.)、或Helea属物种(Helea spp.)。
在某些情况下，昆虫是蚊子。在某些情况下，昆虫是蜱。在某些情况下，昆虫是螨。在某些情况下，昆虫是咬虱(biting louse)。
F.递送至动物
本文提供了将PMP组合物(例如，包括本文描述的修饰的PMP)递送至动物细胞、组织或受试者(例如，哺乳动物，例如人)的方法，例如，通过使动物细胞、组织、受试者或其部分与PMP组合物接触。在一些情况下，可使用不含异源功能剂的PMP处理动物。在其他情况下，PMP包括异源功能剂，例如，异源治疗剂(例如，治疗性蛋白质或肽核酸、或小分子、抗细菌剂、抗真菌剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂、抗病毒剂或驱避剂)。
在一个方面，本文提供了一种增加动物的适应度的方法，该方法包括向该动物递送本文描述的PMP组合物(例如，以有效的量和持续时间)以相对于未处理的动物(例如，未递送该PMP组合物的动物)增加该动物的适应度。
可以通过任何评估动物的适应度(例如，哺乳动物的适应度，例如，人的适应度(例如，健康))的方法来确定由于递送PMP组合物而导致的动物适应度的增加。
本文提供了修饰或增加动物适应度的方法，该方法包括向动物递送有效量的本文提供的PMP组合物，其中该方法修饰该动物并由此相对于未处理的动物引入或增加该动物中的有益性状(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％，70％、80％、90％、100％或大于100％)。特别地，相对于未处理的动物，该方法可增加动物(例如，哺乳动物，例如人)的适应度(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％)。
在另外的方面，本文提供了一种增加动物适应度的方法，该方法包括使动物的细胞与有效量的本文的PMP组合物接触，其中相对于未处理的动物，该方法增加动物(例如，哺乳动物，例如人)的适应度(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或大于100％)。
在某些情况下，动物是哺乳动物，例如，人。在某些情况下，动物是牲畜动物或兽医动物。在某些情况下，动物是小鼠。
G.应用方法
本文描述的植物可以以允许将组合物递送或施用于植物的任何合适方式暴露于PMP组合物(例如，包括本文描述的修饰的PMP)。PMP组合物可以单独递送或与其他活性(例如，肥料剂)或非活性物质组合递送，并且可以通过例如喷雾、注射(例如，显微注射)、通过植物、倾倒、浸渍，以浓缩液体、凝胶、溶液、悬浮液、喷雾、粉剂、丸剂、块剂、砖剂等(配制成递送有效浓度的PMP组合物)的形式来应用。施用本文描述的组合物的量和位置通常由以下确定：植物的生境、植物可以被PMP组合物靶向的生命周期阶段、进行应用的位点、以及PMP组合物的物理和功能特征。
在一些情况下，通过例如背包喷雾、空中喷雾、作物喷雾/尘剂等将组合物直接喷雾到植物(例如作物)上。在将PMP组合物递送至植物的情况下，接受PMP组合物的植物可以处于植物生长的任何阶段。例如，配制的PMP组合物可以在植物生长的早期阶段以种子包衣或根处理剂的形式或在作物周期的后期阶段以总植物处理剂的形式来应用。在一些情况下，PMP组合物可以以外用剂的形式应用于植物。
此外，可以将PMP组合物(例如，在植物生长的土壤中，或在用于浇灌植物的水中)作为通过植物组织而吸收和分布的内吸剂(systemic agent)应用。在一些情况下，植物或食物生物体可以经遗传转化以表达PMP组合物。
延迟释放或持续释放也可以通过以下方式完成：向PMP组合物或具有一种或多种PMP组合物的组合物包覆可溶解或生物可侵蚀的包衣层(诸如明胶)，该包衣层在使用环境中溶解或侵蚀，从而然后使PMP组合物可用，或者通过将药剂分散在可溶解或可侵蚀的基质中。此类持续释放和/或分配装置可以有利地用于始终维持本文描述的一种或多种PMP组合物的有效浓度。
在一些情况下，将PMP组合物递送至植物的部分(例如，叶、种子、花粉、根、果实、芽或花)或组织、细胞、或其原生质体。在一些情况下，将PMP组合物递送至植物的细胞。在一些情况下，将PMP组合物递送至植物的原生质体。在一些情况下，将PMP组合物递送至植物的组织。例如，可以将组合物递送至植物的分生组织(例如，顶端分生组织、侧生分生组织、或居间分生组织)。在一些情况下，将组合物递送至植物的永久组织(例如，简单组织(例如，薄壁组织、厚角组织、或厚壁组织)或复杂的永久组织(例如，木质部或韧皮部))。在一些情况下，将组合物递送至植物胚胎。
在一些情况下，可以建议将PMP组合物以PMP/公顷(g/ha或kg/ha)的量或活性成分(例如，含有或不含异源功能剂的PMP)或酸等效物/公顷(kg a.i./ha或g a.i./ha)的量用于田地应用。在一些情况下，可能需要将在本发明组合物中的较低量的异源功能剂应用于土壤、植物培养基、种子植物组织、或植物以达到与在缺少PMP的组合物中应用异源功能剂的情况下相同的结果。例如，异源功能剂的量可以以比在非PMP组合物中应用的相同异源功能剂(例如直接应用相同异源功能剂而没有PMP)小约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、50、或100倍(或在约2与约100倍之间的任何范围，例如约2至10倍；约5至15倍、约10至20倍；约10至50倍)的水平应用。本发明的PMP组合物可以以各种量/公顷(例如以约0.0001、0.001、0.005、0.01、0.1、1、2、10、100、1,000、2,000、5,000(或在约0.0001与5,000之间的任何范围)kg/ha)来应用。例如，约0.0001至约0.01、约0.01至约10、约10至约1,000、约1,000至约5,000kg/ha。
H.治疗方法
PMP组合物(例如，包括本文描述的修饰的PMP)还可用于多种治疗方法。例如，方法和组合物可用于预防或治疗动物(例如，人)中的病原体感染。如本文所用，术语“处理”是指为了预防和/或治疗目的而向动物施用药物组合物。“预防感染”是指对尚未患病但易感于特定疾病或在其他方面处于特定疾病风险的动物的预防性处理。“处理感染”是指向已经患有疾病的动物施用处理剂以改善或稳定动物的病症。本发明方法涉及将本文描述的PMP组合物递送至动物，例如人。
例如，本文提供了一种处理具有真菌感染的动物的方法，其中该方法包括向该动物施用有效量的包含多个PMP的PMP组合物。在一些情况下，该方法包括向该动物施用有效量的包含多个PMP的PMP组合物，其中该多个PMP包含抗真菌剂。在一些情况下，抗真菌剂是核酸，该核酸抑制引起该真菌感染的真菌中基因(例如，增强丝状生长蛋白(EFG1))的表达。在一些情况下，真菌感染是由白色念珠菌引起的。在一些情况下，组合物包含从拟南芥属质外体EV产生的PMP。在一些情况下，方法降低或显著消除真菌感染。
在另一个方面，本文提供了一种处理具有细菌感染的动物的方法，其中该方法包括向该动物施用有效量的包含多个PMP的PMP组合物。在一些情况下，该方法包括向该动物施用有效量的包含多个PMP的PMP组合物，并且其中该多个PMP包含抗细菌剂(例如，两性霉素B)。在一些情况下，细菌是链球菌属物种(Streptococcus spp.)、肺炎球菌属物种(Pneumococcus spp.)、假单孢菌属物种(Pseudomonas spp.)、志贺氏菌属物种(Shigellaspp)、沙门氏菌属物种(Salmonella spp.)、弯曲菌属物种(Campylobacter spp.)、或埃希氏杆菌属物种(Escherichia spp.)。在一些情况下，组合物包含从拟南芥属质外体EV产生的PMP。在一些情况下，方法降低或显著消除细菌感染。在一些情况下，动物是人、兽医动物、或牲畜动物。
本发明方法可用于处理动物的感染(例如，如由动物病原体引起的)，这是指将处理剂施用于已经患有疾病的动物以改善或稳定动物的病症。这可以涉及使一种或多种病原体在动物中、上或周围的病原体定殖相对于起始量减少(例如，减少约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％)和/或允许个体受益(例如，以足以消释症状的量减少定殖)。在这种情况下，处理的感染可表现为症状的减轻(例如，减轻约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％)。在一些情况下，处理的感染可以有效增加个体存活的可能性(例如，使存活的可能性增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％)或增加群体的总体存活(例如，使存活的可能性增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％)。例如，组合物和方法可以有效地“基本上消除”感染，这是指感染的减少量足以可持续地消释动物的症状(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月)。
本发明方法可用于预防感染(例如，如由动物病原体引起的)，这是指以足以维持初始病原体群体(例如，近似地在健康个体中发现的量)、预防感染开始和/或预防与感染相关的症状或病症的量预防一种或多种病原体在动物中、上或周围的定殖增加(例如，相对于未处理的动物，约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或多于100％)。例如，在准备进行侵入性医疗程序(例如，准备手术，诸如接受移植、干细胞疗法、移植物、假体、接受长期或频繁的静脉内导管插入、或接受在重症监护病房(intensive care unit)中的处理)时、在免疫功能低下的个体(例如，患有癌症、HIV/AIDS、或正在服用免疫抑制剂的个体)中、或在经受长期抗生素疗法的个体中，个体可以接受预防性治疗以预防真菌感染。
PMP组合物可以被配制用于施用或通过合适的方法施用，该合适的方法包括例如，静脉内、肌内、皮下、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鞘内、鼻内、阴道内、直肠内、外用、瘤内、经腹膜、结膜下、囊内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、眼眶内、口服、外用、透皮、玻璃体内(例如，通过玻璃体内注射)、通过滴眼液、通过吸入、通过注射、通过植入、通过输注、通过连续输注、通过直接局部灌注浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、在霜剂中、或在脂质组合物中。在本文描述的方法中使用的组合物也可以全身或局部施用。施用方法可以根据不同因素(例如，所施用的化合物或组合物，以及所治疗的病症、疾病或障碍的严重性)而变化。在一些情况下，静脉内、肌内、皮下、外用、口服、透皮、腹膜内、眼眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内、或鼻内施用PMP组合物。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了各种给药方案，包括但不限于在各个时间点上的单次或多次施用、推注施用、和脉冲输注。
对于本文描述的感染的预防或处理(当单独使用或与一种或多种另外的其他治疗剂组合使用时)，将取决于待处理的疾病的类型、疾病的严重性和病程、是否为预防或治疗目的而施用、先前的疗法、患者的临床病史以及对PMP组合物的反应。PMP组合物可以例如一次或经一系列处理施用于患者。对于经若干天或更长的重复施用，取决于病症，通常将持续处理直到出现所希望的对疾病症状的抑制或不再可检测到感染。这样的剂量可以例如每周或每两周间歇地施用(例如，使得患者接受例如约两剂至约二十剂的PMP组合物。可以施用初始较高的负载剂量，然后施用一个或多个较低的剂量。然而，其他剂量方案可能是有用的。通过常规技术和测定容易监测此疗法的进展。
在一些情况下，施用于个体(例如，人)的PMP组合物的量可以在个体的体重的约0.01mg/kg至约5g/kg(例如，约0.01mg/kg-0.1mg/kg、约0.1mg/kg-1mg/kg、约1mg/kg-10mg/kg、约10mg/kg-100mg/kg、约100mg/kg-1g/kg、或约1g/kg-5g/kg)的范围内。在一些情况下，施用于个体(例如，人)的PMP组合物的量是个体的体重的至少0.01mg/kg(例如，至少0.01mg/kg、至少0.1mg/kg、至少1mg/kg、至少10mg/kg、至少100mg/kg、至少1g/kg、或至少5g/kg)。剂量可以以单剂量或以多剂量(例如，2、3、4、5、6、7或多于7剂)施用。在一些情况下，施用于动物的PMP组合物可以单独施用或与另外的治疗剂组合施用。与单一处理相比，可以减少在组合处理中施用的抗体的剂量。通过常规技术容易监测此疗法的进展。
IV.试剂盒
本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包含具有本文描述的PMP组合物的容器。该试剂盒可进一步包括用于根据本发明的方法将PMP组合物应用于或递送至植物的说明材料。本领域技术人员应认识到，用于在本发明的方法中应用PMP组合物的说明书可以是任何形式的说明书。此类说明书包括但不限于书面说明书材料(诸如标签、小册子、手册)、口述说明书材料(诸如在录音带或CD上)或视频说明书(诸如在录像带或DVD上)。
实例
以下是本发明的方法的实例。应理解，鉴于以上提供的一般性描述，可以实践各种其他的实施例。
目录(实例)：
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实例1：从植物中分离植物信使包
此实例描述了各种植物源(包括叶质外体、种子质外体、根、果实、营养部分、花粉、韧皮部、木质部汁液和植物细胞培养基)分离粗植物信使包(PMP)。
实验设计：
a)从拟南芥叶的质外体分离PMP
将拟南芥属(拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col-0)种子用50％漂白剂进行表面灭菌并且铺板在含有0.8％琼脂的0.53Murashige和Skoog培养基。将种子在4℃下春化处理2d，然后移至短日条件(9-h天，22℃，150μEm-2)。1周后，将幼苗转移至Pro-Mix PGX。使植物生长4-6周，然后收获。
从4-6周龄拟南芥属莲座丛的质外体洗涤液分离PMP，如Rutter和Innes,PlantPhysiol.[植物生理学]173(1):728-741,2017所描述。简而言之，在根处收获整个莲座丛，并且用囊泡分离缓冲剂(20mM MES，2mM CaCl2和0.1M NaCl，pH 6)真空渗透。将经渗透的植物小心地吸干以除去多余的液体，置于30mL注射器中，并且在50mL锥形管中在2℃下以700g离心20min，以收集含有EV的质外体细胞外液。接下来，将质外体细胞外液通过0.85μm过滤器过滤以除去大颗粒，并且如实例2所描述的纯化PMP。
b)向日葵种子的质外体分离PMP
将完整的向日葵种子(向日葵(H.annuus L.))在水中吸胀2小时，剥皮以除去种皮，并且将质外体细胞外液通过修改的真空渗透-离心程序进行萃取，该程序改编自Regente等人,FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]583:3363-3366,2009。简而言之，将种子浸入囊泡分离缓冲剂(20mM MES，2mM CaCl2和0.1M NaCl，pH 6)中，并且经受三个10s真空脉冲，在45kPa的压力下间隔30s。将经渗透的种子回收，在滤纸上干燥，置于烧结玻璃过滤器中，并且在4℃下以400g离心20min。将质外体细胞外液回收，通过0.85μm过滤器过滤以除去大颗粒，并且如实例2所描述的纯化PMP。
c)从姜根分离PMP
从当地供应商购买新鲜姜(姜(Zingiber officinale)根茎根，并且用PBS洗涤3x。将总共200克的经洗涤的根在混合器(Osterizer 12速共混器)中以最高速度研磨10min(每共混1min暂停1min)，并且分离PMP，如Zhuang等人,J Extracellular Vesicles.[细胞外囊泡杂志]4(1):28713,2015所描述。简而言之，将姜汁顺序地在1,000g 10min、3,000g 20min和10,000g 40min下离心，以从含有PMP的上清液中除去大颗粒。如实例2所描述的纯化PMP。
d)从葡萄柚汁分离PMP
从当地供应商购买新鲜的葡萄柚(Citrus×paradisi)，除去它们的皮，并且将果实手动压制或在混合器(Osterizer 12速共混器)中以最高速度研磨10min(每共混1分钟暂停1min)以收集汁，如Wang等人,Molecular Therapy.[分子疗法]22(3):522-534,2014(有少量修改)所描述。简而言之，将汁/汁浆夜顺序地在1,000g 10min、3,000g 20min和10,000g 40min下离心，以从含有PMP的上清液中除去大颗粒。如实例2所描述的纯化PMP。
e)从西兰花头分离PMP
分离西兰花(羽衣甘蓝意大利变种(Brassica oleracea var.italica))PMP，如前所描述(Deng等人,Molecular Therapy[分子疗法],25(7):1641-1654,2017)。简而言之，从当地供应商购买新鲜的西兰花，用PBS洗涤三次，并且在混合器(Osterizer 12速共混器)中以最高速度研磨10min(每共混1分钟暂停1min)。将西兰花汁顺序地在1,000g 10min、3,000g 20min和10,000g 40min下离心，以从含有PMP的上清液中除去大颗粒。如实例2所描述的纯化PMP。
f)从橄榄花粉分离PMP
分离橄榄(欧洲橄榄(Olea europaea))花粉PMP，如前在Prado等人,MolecularPlant.[分子植物]7(3):573-577,2014所描述。简而言之，将橄榄花粉(0.1g)在潮湿的室中于室温水化30min，然后转移到培养皿(直径15cm)中，该培养皿含有20ml萌发培养基：10％蔗糖、0.03％Ca(NO3)2、0.01％KNO3、0.02％MgSO4和0.03％H3BO3。花粉在黑暗中于30℃萌发16h。仅当管长于花粉粒的直径时，才认为花粉粒萌发。收集含有PMP的培养基，并且通过离心在0.85um过滤器上进行两次连续过滤，清除花粉碎片。如实例2所描述的纯化PMP。
g)从拟南芥属韧皮部汁液分离PMP
将拟南芥属(拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col-0)种子用50％漂白剂进行表面灭菌并且铺板在含有0.8％琼脂的0.53Murashige和Skoog培养基。将种子在4℃下春化处理2d，然后移至短日条件(9-h天，22℃，150μEm-2)。1周后，将幼苗转移至Pro-Mix PGX。使植物生长4-6周，然后收获。
从4-6周龄拟南芥属莲座叶收集韧皮汁液，如Tetyuk等人,JoVE.[视觉实验杂志]80,2013所描述。简而言之，在叶柄的基部切下叶，堆叠，并且置于含有20mM K2-EDTA的反应管中在黑暗中一小时以防止伤口封合。将叶轻轻地从容器中取出，用蒸馏水彻底洗涤以除去全部EDTA，放入干净的管中，并且在黑暗中收集5-8小时韧皮部汁液。弃去叶，将韧皮部汁液通过0.85μm过滤器过滤以除去大颗粒，并且如实例2所描述的纯化PMP。
h)从番茄植物木质部汁液分离PMP
将番茄(Solanum lycopersicum)种子种植在单个盆中的富含有机物的土壤(诸如阳光混合物(Sunshine Mix)(Sun Gro园艺公司(Sun Gro Horticulture)，阿格瓦姆，马萨诸塞州))中，并且维持在22℃与28℃之间的温室中。萌发后约两周，在两个真叶阶段，将幼苗单独地移植到填充有含有90％沙和10％有机混合物的无菌沙质土壤的盆(直径10cm并且深17cm)中。将植物在22℃-28℃的温室中维持四周。
从4周龄番茄植物收集木质部汁液，如Kohlen等人,Plant Physiology.[植物生理学]155(2):721-734,2011所描述。简而言之，将番茄植物在下胚轴上方断头，并且在茎周围放置塑料环。断头后在90min内收集积累的木质部汁液。将木质部汁液通过0.85μm过滤器过滤以除去大颗粒，并且如实例2所描述的纯化PMP。
i)从烟草BY-2细胞培养基分离PMP
将烟草BY-2(Nicotiana tabacum L cv.Bright Yellow 2)细胞在黑暗中于26℃，在振荡器上以180rpm，在包含补充有30g/L蔗糖、2.0mg/L磷酸二氢钾、0.1g/L myo肌醇、0.2mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸、和1mg/L硫胺素HCl的MS盐(Duchefa，哈勒姆，荷兰，#M0221)的MS(Murashige和Skoog，1962)BY-2培养基(pH 5.8)中进行培养。将BY-2细胞每周通过将5％(v/v)7日龄细胞培养物转移到100mL新鲜液体培养基中进行传代培养。72-96小时后，收集BY-2培养基并且在4℃下以300g离心10分钟以除去细胞。收集含有PMP的上清液，并且通过在0.85um过滤器上过滤来清除碎片。如实例2所描述的纯化PMP。
实例2：纯化的植物信使包(PMP)的生产
此实例描述了使用超滤与尺寸排阻色谱法(密度梯度(碘克沙醇或蔗糖))的组合并且通过沉淀或尺寸排阻色谱法除去聚集体如实例1所描述从粗PMP级分生产纯化的PMP。
实验设计：
a)使用超滤与尺寸排阻色谱法的组合生产纯化的葡萄柚PMP
使用100-kDA截留分子量(MWCO)Amicon旋转过滤器(默克密理博公司(MerckMillipore))浓缩来自实例1a的粗葡萄柚PMP级分。随后，将浓缩的粗PMP溶液负载到PURE-EV尺寸排阻色谱柱(HansaBioMed生命科学公司(HansaBioMed Life Sciences Ltd))上，并且根据制造商的说明进行分离。洗脱后合并纯化的含有PMP的级分。任选地，可以使用100kDa MWCO Amicon旋转过滤器或通过切向流过滤(TFF)进一步浓缩PMP。如实例3所描述的分析纯化的PMP。
b)使用碘克沙醇梯度生产纯化的拟南芥属质外体PMP
如实例1a所描述的分离粗拟南芥属叶质外体PMP，并且通过使用碘克沙醇梯度生产纯化的PMP，如Rutter和Innes,Plant Physiol.[植物生理学]173(1):728-741,2017所描述。为了制备不连续的碘克沙醇梯度(OptiPrep；西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))，通过将60％OptiPrep储备水溶液稀释在囊泡分离缓冲剂(VIB；20mM MES、2mM CaCl2和0.1MNaCl，pH 6)中来产生40％(v/v)、20％(v/v)、10％(v/v)和5％(v/v)碘克沙醇的溶液。通过使3ml 40％溶液、3mL 20％溶液、3mL 10％溶液和2mL 5％溶液分层形成梯度。将来自实例1a的粗质外体PMP溶液在4℃下以40,000g离心60min。将沉淀物重悬于0.5ml VIB中并且在梯度顶部上分层。在4℃下以100,000g进行离心17h。弃去梯度的顶部的前4.5ml，并且随后收集3体积的含有质外体PMP的0.7ml，用VIB补足至3.5mL，并且在4℃下以100,000g离心60min。将沉淀物用3.5ml VIB洗涤，并且在相同的离心条件下再沉淀。将纯化的PMP沉淀物合并用于后续分析，如实例3所描述。
c)使用蔗糖梯度生产纯化的葡萄柚PMP
如实例1d所描述的分离粗葡萄柚汁PMP，以150,000g离心90min，并且然后将含有PMP的沉淀物重悬于1ml PBS中，如(Mu等人,Molecular Nutrition&Food Research.[分子营养与食物研究]58(7):1561-1573,2014)所描述。将重悬的沉淀物转移至蔗糖步进梯度(8％/15％/30％/45％/60％)并且以150,000g离心120min以产生纯化的PMP。从30％/45％界面收获纯化的葡萄柚PMP，并且随后分析，如实例3所描述。
d)从葡萄柚PMP中除去聚集体
为了从如实例1d所描述的产生的葡萄柚PMP中除去蛋白质聚集体或从实例2a-c中除去纯化的PMP，可以包括另外的纯化步骤。使产生的PMP溶液经过一系列pH值，以使蛋白质聚集体沉淀在溶液中。通过添加氢氧化钠或盐酸将pH调节至3、5、7、9或11。使用校准的pH探针测量pH。一旦溶液处在指定的pH，就将其过滤以除去微粒。可替代地，可以使用诸如Polymin-P或Praestol 2640的带电聚合物的添加将分离的PMP溶液絮凝。简而言之，将2-5g/L Polymin-P或Praestol 2640添加到溶液中并且与叶轮混合。然后将溶液过滤以除去微粒。可替代地，通过增加盐浓度来增溶聚集体。将NaCl添加到PMP溶液中，直到它处于1mol/L。然后将溶液过滤以纯化PMP。可替代地，通过增加温度来增溶聚集体。将分离的PMP混合物在混合下加热，直到它达到50℃的均匀温度持续5分钟。然后将PMP混合物过滤以分离PMP。可替代地，可溶性污染物通过尺寸排阻色谱柱根据标准程序从PMP溶液中分离，其中PMP洗脱在第一级分中，而蛋白质和核糖核蛋白以及一些脂蛋白则随后洗脱。蛋白质聚集体去除的效率通过在除去蛋白质聚集体之前和之后经由BCA/Bradford蛋白质定量测量和比较蛋白质浓度来确定。如实例3所描述的分析产生的PMP
实例3：植物信使包表征
此实例描述了如实例1或实例2所描述产生的PMP的表征。
实验设计：
a)确定PMP浓度
根据制造商的说明，通过使用Malvern NanoSight的纳米颗粒跟踪分析(NTA)或使用iZon qNano的可调电阻式脉冲传感(TRPS)确定PMP颗粒浓度。通过使用DC蛋白质测定(Bio-Rad)确定纯化的PMP的蛋白质浓度。使用荧光亲脂性染料(诸如DiOC6(ICN生物医学公司(ICN Biomedicals)))确定纯化的PMP的脂质浓度，如Rutter和Innes,Plant Physiol.[植物生理学]173(1):728-741,2017所描述。简而言之，将来自实例2的纯化的PMP沉淀物重悬于100ml用MES缓冲剂(20mM MES，pH 6)加1％植物蛋白酶抑制剂混合物(西格玛奥德里奇公司)和2mM 2,29-联吡啶二硫化物稀释的10mM DiOC6(ICN生物医学公司)。将重悬的PMP在37℃下孵育10min，用3mL MES缓冲剂洗涤，再沉淀(40,000g，60min，在4℃下)，并且然后重悬于新鲜的MES缓冲剂中。在485nm激发和535nm发射下测量DiOC6荧光强度。
b)PMP的生物物理学和分子表征
根据来自以下文献的方案，在JEOL 1010透射电子显微上通过电子和低温电子显微镜术表征PMP：Wu等人,Analyst.[分析者]140(2):386-406,2015。还根据制造商的说明，使用Malvern Zetasizer或iZon qNano测量PMP的尺寸和ζ电位。使用氯仿萃取从PMP中分离脂质，并且用LC-MS/MS进行表征，如Xiao等人Plant Cell.[植物细胞]22(10):3193-3205,2010所证实。萃取和纯化糖基肌醇磷酰基神经酰胺(GIPC)脂质，如Cacas等人,PlantPhysiology.[植物生理学]170:367-384,2016所描述，并且通过LC-MS/MS分析，如上所描述。根据说明，使用来自赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)的Quant-It试剂盒对总RNA、DNA和蛋白质进行表征。根据以下文献中的方案，通过LC-MS/MS对PMP上的蛋白质进行表征：Rutter和Innes,Plant Physiol.[植物生理学]173(1):728-741,2017所描述。使用Trizol提取RNA和DNA，用来自依诺米那公司(Illumina)的具有Ribo-Zero植物试剂盒和Nextera配对文库制备型试剂盒(Nextera Mate Pair Library Prep Kit)的TruSeq总RNA制备成文库，并且根据制造商的说明在Illumina MiSeq上测序。
实例4：植物信使包稳定性的表征
此实例描述了在许多种储存和生理条件下测量PMP的稳定性。
实验设计：
使如实例1和2所描述产生的PMP经受各种条件。将PMP悬浮在水、5％蔗糖或PBS中，并且在-20℃、4℃、20℃、和37℃下放置1、7、30和180天。也将PMP悬浮在水中，并且使用旋转蒸发仪系统干燥，并且分别在4℃、20℃、和37℃下放置1、7、30和180天。也将PMP悬浮在水或5％蔗糖溶液中，在液氮中速冻并且冻干。在1、7、30和180天后，然后将干燥且冻干的PMP重悬于水中。还将在温度高于0℃的条件下进行的前三个实验暴露在人造阳光模拟器中，以便确定模拟室外紫外线条件下的含量稳定性。还使PMP经受在添加或不添加1单位胰蛋白酶的pH为1、3、5、7和9缓冲溶液中或在其他模拟胃液中在37℃、40℃、45℃、50℃、和55℃的温度下持续1、6和24小时。
在这些处理的每个之后，使PMP回到20℃，中和至pH 7.4，并且使用实例3中描述的一些或全部方法进行表征。
实例5.向PMP负载货物
此实施例描述了向PMP负载小分子、蛋白质和核酸(以用作确定植物中PMP摄取效率的探针)的方法。
a)将小分子负载到PMP中
如实例1和实例2所描述的产生PMP。为了将小分子负载到PMP中，将PMP置于具有呈固体形式或溶解的小分子的PBS溶液中。根据Sun,Mol.Ther.[分子疗法],2010中的方案，将溶液在22℃下放置1小时。可替代地，根据来自Wang等人,Nature Comm.[自然通讯],2013的方案，将溶液进行超声处理以诱导穿孔并且扩散到外泌体中。可替代地，根据来自以下文献的方案，将PMP电穿孔：Wahlgren等人,Nucl.Acids.Res.[核酸研究]2012。
可替代地，通过将3.75ml 2:1(v/v)MeOH:CHCl3添加至1ml在PBS中的PMP中来分离PMP脂质并且涡旋。顺序地添加CHCl3(1.25ml)和ddH2O(1.25ml)并且涡旋。然后将混合物在玻璃管中于22℃下以2,000 r.p.m.离心10 min，以将混合物分为两相(水相和有机相)。将含有PMP脂质的有机相样品在氮气下(2psi)通过加热干燥。为了产生负载小分子的PMP，根据来自以下文献的方案，将分离的PMP脂质与小分子溶液混合并通过脂质挤出机：Haney等人,J Contr.Rel.[控制释放期刊],2015。
在使用前，将负载的PMP使用如实例2所描述的方法进行纯化，以除去未结合的小分子。如实例3所描述的表征负载的PMP，并且如实例4所描述的测试其稳定性。
b)将蛋白质或肽负载到PMP中
如实例1和实例2所描述的产生PMP。为了将蛋白质或肽负载到PMP中，将PMP置于蛋白质或肽在PBS中的溶液中。如果蛋白质或肽不可溶，则调节pH，直到它不可溶。如果蛋白质或肽仍不可溶，则使用不可溶的蛋白质或肽。然后根据来自Wang等人,Nature Comm.[自然通讯],2013的方案，将溶液进行超声处理以诱导穿孔并且扩散到PMP中。可替代地，根据来自以下文献的方案，将PMP电穿孔：Wahlgren等人,Nucl.Acids.Res.[核酸研究]2012。
可替代地，通过将3.75ml 2:1(v/v)MeOH:CHCl3添加至1ml在PBS中的PMP中来分离PMP脂质并且涡旋。顺序地添加CHCl3(1.25ml)和ddH2O(1.25ml)并且涡旋。然后将混合物在玻璃管中于22℃下以2,000r.p.m.离心10min，以将混合物分为两相(水相和有机相)。将含有PMP脂质的有机相样品在氮气下(2psi)通过加热干燥。为了产生负载小分子的PMP，根据来自以下文献的方案，将分离的PMP脂质与小分子溶液混合并通过脂质挤出机：Haney等人,J Contr.Rel.[控制释放期刊],2015。
在使用前，将负载的PMP使用如实例2所描述的方法进行纯化以除去未结合的肽和蛋白质。如实例3所描述的表征负载的PMP，并且如实例4所描述的测试其稳定性。为了测量蛋白质或肽的负载量，对负载的PMP和未负载的PMP的少量样品使用Pierce定量比色肽测定。
c)将核酸负载到PMP中
如实例1和实例2所描述的产生PMP。为了将核酸负载到PMP中，将PMP置于核酸在PBS中的溶液中。然后根据来自Wang等人,Nature Comm.[自然通讯],2013的方案，将溶液进行超声处理以诱导穿孔并且扩散到PMP中。可替代地，根据来自以下文献的方案，将PMP电穿孔：Wahlgren等人,Nucl.Acids.Res.[核酸研究]2012。
可替代地，通过将3.75ml 2:1(v/v)MeOH:CHCl3添加至1ml在PBS中的PMP中来分离PMP脂质并且涡旋。顺序地添加CHCl3(1.25ml)和ddH2O(1.25ml)并且涡旋。然后将混合物在玻璃管中于22℃下以2,000r.p.m.离心10min，以将混合物分为两相(水相和有机相)。将含有PMP脂质的有机相样品在氮气下(2psi)通过加热干燥。为了产生负载小分子的PMP，根据来自以下文献的方案，将分离的PMP脂质与小分子溶液混合并通过脂质挤出机：Haney等人,J Contr.Rel.[控制释放期刊],2015。
在使用前，将PMP使用如实例2所描述的方法进行纯化以除去未结合的核酸。如实例3所描述的表征负载的PMP，并且如实例4所描述的测试其稳定性。根据制造商的说明，使用来自赛默飞世尔公司的Quant-It测定对PMP中负载的核酸进行定量，或者，如果核酸是荧光标记的，则使用读板器对荧光进行定量。
实例6.通过用细胞壁渗透蛋白修饰PMP来增加PMP细胞摄取
此实例描述了通过用纤维素酶修饰PMP以促进细胞壁组分的降解来增加植物、真菌或细菌细胞对PMP的细胞摄取。在此实例中，纤维素酶用作模型细胞壁降解酶，葡萄柚PMP用作模型PMP，棉花用作模型植物，酿酒酵母用作模型酵母，核盘菌用作模型真菌，以及丁香假单胞菌用作模型细菌。
实验方案：
a)纤维素酶-PEG4-叠氮化物的合成
根据制造商的说明，将纤维素酶(西格玛奥德里奇公司)与NHS-PEG4-叠氮化物(赛默飞世尔科技公司)反应。简而言之，将蛋白质以>5mg/mL的浓度溶解于PBS中，并且将NHS-PEG4-叠氮化物溶解于一定体积的DMF中，该体积等于蛋白质体积的10％，对蛋白质而言10x摩尔过量。然后将两种溶液混合并在冰上保持2小时。然后通过添加1M Tris-HCl至最终浓度为100mM来终止反应。将管放置在冰上持续15分钟以完全淬灭，然后使用Zeba旋转脱盐柱进行缓冲液交换。
b)用纤维素酶修饰PMP
将DSPE-PEG2000-DBCO溶解于氯仿中，倾倒入试管中，并真空干燥以形成薄膜。然后将其以1％、5％、10％、20％和50％的溶液w/v重悬于PBS中以产生小胶束。将等摩尔量的纤维素酶-PEG4-叠氮化物添加到溶液中。允许溶液在4℃下反应16小时。接下来，将溶液与实例1和2中产生的PMP合并，并根据来自以下文献的方案混合并通过脂质挤出机：Haney等人,J Contr.Rel.[控制释放期刊],2015。以这种方式将足够量的纤维素酶附接至PMP，以增加细胞壁的渗透而不增加毒性。可替代地，使用其他修饰PMP外部的方法，如Spanedda等人,Methods Mol Bio[分子生物学方法],2016所描述。
如实例2所描述，使用超速离心或尺寸排阻色谱法纯化所得的PMP，并使用实例3和实例4中的方法进行表征和稳定性测试。根据制造商的方案，使用荧光纤维素酶活性测定试剂盒(艾博抗公司(Abcam))测量纤维素酶活性。
c)通过用负载GFP蛋白的纤维素酶修饰的葡萄柚PMP来增加酿酒酵母的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP，并如实例5所描述的向其负载GFP蛋白。将一些PMP留作对照，并且如实例6b所描述，将其余的用纤维素酶进行修饰。通过蛋白质印迹或荧光测量PMP的GFP包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在PKH26标记试剂盒的1mL稀C(dilute C)中的50mg PMP与2ml的1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。通过实例2中描述的方法将所有未标记的染料洗掉，并且将标记的PMP沉淀物重悬于PBS中。为了确定负载GFP的PKH26标记的PMP相对于负载GFP的纤维素酶修饰的PKH26标记的PMP的PMP摄取效率，对酿酒酵母真菌细胞进行了处理。
酿酒酵母获自ATCC(#9763)，并且如制造商所指示，在酵母提取物蛋白胨右旋糖肉汤(YPD)中维持在30℃。为了确定酿酒酵母的PMP摄取，使酵母细胞在选择培养基中生长到0.4-0.6的OD600，并且与0(阴性对照)、1、10、或50、100、和250μg/ml的PKH26标记的负载GFP的修饰的PMP、或未修饰的PMP直接在载玻片上一起孵育。除了PBS对照外，还将酿酒酵母细胞在PKH26染料(最终浓度5μg/ml)的存在下孵育。在室温下孵育5min、30min和1h后，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。与PKH26染料对细胞膜的专门染色相比，当在细胞质中观察到红膜和绿色负载GFP的PMP时或如果酵母细胞的细胞质变红和/或绿时，则酵母细胞吸收了PMP。为了评价与未修饰的负载GFP的PMP相比，负载GFP的纤维素酶修饰的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质/在细胞质中的绿色PMP的酵母细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将负载GFP的纤维素酶修饰的PMP与未修饰的负载GFP的PMP的摄取效率进行比较。
d)通过用负载GFP蛋白的纤维素酶修饰的葡萄柚PMP来增加核盘菌的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP，并如实例5所描述的向其负载GFP蛋白。将一些PMP留作对照，并且如实例6b所描述，将其余的用纤维素酶进行修饰。通过蛋白质印迹或荧光测量PMP的GFP包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在1mL稀C中的50mg PMP与2ml的1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。通过实例2中描述的方法将所有未标记的染料洗掉，并且将标记的PMP沉淀物重悬于PBS中。为了确定负载GFP的PKH26标记的PMP相对于负载GFP的纤维素酶修饰的PKH26标记的PMP的PMP摄取效率，对核盘菌真菌细胞进行了处理。
为了确定核盘菌(ATCC，#18687)子囊孢子的PMP摄取，将10,000个子囊孢子与0(阴性对照)、1、10、或50、100和250μg/ml的PKH26标记的负载GFP的修饰的PMP、或未修饰的PMP直接在载玻片上一起孵育。除了PBS对照外，还将核盘菌细胞在PKH26染料(最终浓度5μg/mL)的存在下孵育。在室温下孵育5min、30min和1h后，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。与PKH26染料对细胞膜的专门染色相比，当在细胞质中观察到红膜和绿色负载GFP的PMP时或如果酵母细胞的细胞质变红和/或绿时，则酵母细胞吸收了PMP。为了评价与未修饰的负载GFP的PMP相比，负载GFP的纤维素酶修饰的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质/在细胞质中的绿色PMP的核盘菌细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将负载GFP的纤维素酶修饰的PMP与未修饰的负载GFP的PMP的摄取效率进行比较。
e)通过用负载钙黄绿素AM的纤维素酶修饰的葡萄柚PMP来增加丁香假单胞菌的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP。将一些PMP留作对照，并且如实例6b所描述，将其余的用纤维素酶进行修饰。如实例5和Gray等人,MethodsX[方法X]2015所描述，向修饰的和未修饰的PMP负载钙黄绿素AM(西格玛奥德里奇公司)。钙黄绿素AM仅在被PMP包封时才呈荧光，并且通过荧光来测量包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在1mL稀C中的50mg负载钙黄绿素AM的PMP与2mL的1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。如实例2所描述，将所有未标记的染料洗掉，并使用100kDa Amicon过滤器浓缩PMP。为了确定负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP相对于负载钙黄绿素AM的PKH26标记的纤维素酶修饰的PMP的PMP摄取效率，对丁香假单胞菌细菌细胞进行了处理。
从ATCC(BAA-871)获得丁香假单胞菌细菌，并且根据制造商的说明在金氏培养基(King’s Medium)B琼脂上生长。为了确定丁香假单胞菌的PMP摄取，将1mL过夜细菌悬浮液的10uL与0(阴性对照)、1、10、或50、100、和250μg/mL的PKH26标记的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的未修饰的和纤维素酶修饰的PMP直接在载玻片上一起孵育。除了水对照外，还将丁香假单胞菌细菌在钙黄绿素AM(最终浓度5μg/mL)、PKH26染料(最终浓度5μg/mL)、和未修饰的PMP的存在下孵育。在室温下孵育5min、30min和1h后，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。为了评价与未修饰的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP相比，负载钙黄绿素AM的PKH26标记的纤维素酶修饰的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质或在细胞质中的绿色和红色PMP的细菌细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将负载钙黄绿素AM的PKH26标记的纤维素酶修饰的PMP与未修饰的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP的摄取效率进行比较。与未修饰的PMP相比，PMP的纤维素酶修饰有效地改善了细胞摄取。
f)棉花植物中负载靶向CLA1的dsRNA的、纤维素酶修饰的葡萄柚PMP对PMP的摄取增加
为了证明纤维素酶修饰的PMP增加细胞摄取，向葡萄柚PMP负载人工miRNA(amiRNA，使用植物小RNA标记位点(P-SAMS；Fahlgren等人,Bioinformatics.[生物信息学]32(1):157-158,2016)设计)或靶向棉花光合作用基因GrCLA1(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶)的定制dicer底物siRNA(DsiRNA，由IDT设计)。GrCLA1是拟南芥Cloroplastosalterados 1基因(AtCLA1)(其功能丧失导致真叶上的白化表型，为沉默效率提供了可视标记物)的同源基因。寡核苷酸获得自IDT。
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP。为了确定纤维素酶修饰的PMP相对于未修饰的PMP的PMP摄取效率，如实施例5所描述，向葡萄柚PMP负载GrCLA1-amiRNA或GrCLA1-DsiRNA双链体(表12)。使用Quant-It RiboGreen RNA测定试剂盒或使用标记amiRNA或DsiRNA(IDT)的对照荧光染料来测量PMP的amiRNA或DsiRNA包封。接下来，将负载的PMP的一部分留作对照，并且如实例6b所描述，将其余的用纤维素酶进行修饰。为了确定负载CLA1-amiRNA/DsiRNA的PMP相对于负载CLA1-amiRNA/DsiRNA的纤维素酶修饰的PMP的PMP摄取效率，对棉花幼苗进行处理并进行CLA1基因沉默分析。将负载amiRNA或DsiRNA(统称为dsRNA)的PMP在水中配制为递送在无菌水中0、1、5、10和20ng/μl的有效dsRNA剂量的等效物的浓度。
棉花种子(陆地棉和雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii))通过美国国家植物种质系统获得。将灭菌的种子包裹在湿润的脱脂棉中，放置在培养皿中，并置于25℃、150μE m- 2S-1光强度的生长室中，在14小时光照/10小时黑暗光周期下持续3天以萌发。在具有26℃/20℃日/夜温度的长日条件(16/8h光/黑暗的光周期)下，幼苗在具有荷格伦特(Hoagland)营养液(西格玛奥德里奇公司)的无菌培养容器中生长。4天后，将子叶完全展开(在第一片真叶出现之前)的幼苗用于PMP处理。
将七日龄的棉花幼苗转移到含有1x MS维生素(西格玛奥德里奇公司)pH5.6-5.8、含0.8％(w/v)琼脂糖的0.5x MS(Murashige and Skoog)矿物盐(西格玛奥德里奇公司)上，并通过将整个幼苗用有效剂量为0(ddH2O)、1、5、10和20ng/μl负载GrCLA1 dsRNA的纤维素酶修饰的PMP，以及0(ddH2O)、1、5、10和20ng/μl负载GrCLA1 dsRNA的未修饰的PMP以3株植物/组、1ml溶液/株植物进行喷雾来处理。可替代地，在进行PMP处理之前，用25G的针将棉花植物子叶的下侧打孔而不刺穿子叶。使用1mL无针注射器将PMP溶液从子叶的下侧通过伤口部位手动渗透。将植物转移到生长室中，并在具有光强度为90μmol m-2s-1和26℃/20℃日/夜温度的长日条件(16h/8h光/黑暗的光周期)下保持。
2、5、8和14天后，使用定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)通过内源性CLA1mRNA的表达水平检查CLA1 dsRNA的基因沉默效率。根据制造商的说明(英杰公司(Invitrogen))，使用Trizol试剂从100mg新鲜棉花叶中提取总RNA，并用无RNA酶的DNA酶I(普洛麦格公司(Promega))广泛地处理。用SuperScriptTM第一链合成系统(英杰公司)从2μg总RNA合成第一链cDNA。为了评估CLA1转录物的水平，使用SYBR Green Real-Time PCRMaster Mix(赛默科技公司(Thermo Scientific))进行qRT-PCR，其中使用引物：GrCLA1q1_F5’-CCAGGTGGGGCTTATGCATC-3’(SEQ ID NO:7)、GrCLA1q1_R5’-CCACACCAAGGCTTGAACCC-3’(SEQ ID NO:8)、和GrCLA1q2_F5’-GGCCGGATTCACGAAACGGT-3’(SEQ ID NO:9)、GrCLA1q2_R5’-CGTCGAGATTGGCAGTTGGC-3’(SEQ ID NO:10)、和18s RNA_F5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’(SEQ ID NO:11)、18s RNA_R5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3(SEQ ID NO:12)，使用以下程序：(a)95℃持续5min；(b)40个循环的94℃持续30s，55℃持续30s；和72℃持续30s。18S rRNA基因用作内部对照，以将结果归一化。通过以下方式确定用负载CLA1-dsRNA的纤维素酶修饰的和负载CLA1-dsRNA的未修饰的PMP处理后，棉花中的CLA1敲低效率：将用纤维素酶修饰的PMP处理后的归一化的CLA1表达与用未修饰的PMP处理后的归一化的CLA1表达进行比较，计算ΔΔCt值。
另外地，通过表型光漂白分析检查了CLA1 dsRNA的基因沉默效率。对已处理和未处理的棉花植物的叶进行拍照，并使用ImageJ软件确定基因沉默百分比，该百分比由叶上的白色光漂白相对于对照叶的绿色来反映。测定了每株植物的三片叶以定量光漂白的效果，并评价了纤维素酶修饰的相对于未修饰的负载CLA1-dsRNA的PMP的基因沉默效率。
与未修饰的PMP相比，植物细胞更有效地摄取纤维素酶修饰的PMP，并诱导更多的CLA1基因沉默。
表12.GrCLA1-amiRNA和GrCLA1-DsiRNA
Figure BDA0002947982740002041
Figure BDA0002947982740002051
Figure BDA0002947982740002061
实例7：通过用离子液体配制PMP来增加PMP细胞摄取
此实施例描述了用离子液体配制PMP，以通过改善细胞渗透来提高PMP摄取。离子液体已经被描述为用于增溶纤维素(植物细胞壁的主要组分)的潜在药剂，并且还可以改善真菌或细菌的细胞壁和/或动物细胞的细胞膜或细胞外基质的渗透。在此实例中，EMIM乙酸酯用作模型离子液体，葡萄柚PMP用作模型PMP，棉花用作模型植物，酿酒酵母用作模型酵母，MDA-MB-231用作模型人细胞系，核盘菌用作模型真菌，以及丁香假单胞菌用作模型细菌。
实验方案：
a)离子液体中PMP的配制
如实例1和实例2所描述的分离葡萄柚PMP的浓缩溶液。通过在1％、5％、10％、20％、50％或100％的EMIM乙酸酯溶液中进行剧烈混合来重悬PMP。可替代地，使用BMIM乙酸酯、HMIM乙酸酯、MMIM乙酸酯、烯丙基MIM乙酸酯。假设从悬浮液中100％回收，并且将配制前的浓度乘以体积比，从而确定PMP的浓度。如实施例3和实施例4所描述的评价离子液体中的PMP特征和稳定性。
b)通过用负载GFP蛋白的EMIM乙酸酯配制的葡萄柚PMP来增加酿酒酵母的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP，并如实例5所描述的向其负载GFP蛋白。通过蛋白质印迹或荧光测量PMP的GFP包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在PKH26标记试剂盒的1mL稀C中的50mg PMP与2ml的1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。通过实例2中描述的方法将所有未标记的染料洗掉，并且如实例8a所描述，将标记的PMP沉淀物重悬于PBS(对照)或EMIM乙酸酯溶液中。为了确定PBS中负载GFP的PKH26标记的PMP相对于负载GFP的EMIM乙酸酯配制的PKH26标记的PMP的PMP摄取效率，对酿酒酵母真菌细胞进行了处理。
酿酒酵母获自ATCC(#9763)，并且如制造商所指示，在酵母提取物蛋白胨右旋糖肉汤(YPD)中维持在30℃。为了确定酿酒酵母的PMP摄取，使酵母细胞在选择培养基中生长到0.4-0.6的OD600，并且与PBS或EMIM乙酸酯中0(阴性对照)、1、10、或50、100、和250μg/ml的PKH26标记的负载GFP的修饰的PMP直接在载玻片上一起孵育。除了PBS对照外，还将酿酒酵母细胞在PKH26染料(最终浓度5μg/ml)的存在下孵育。在室温下孵育5min、30min和1h后，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。与PKH26染料对细胞膜的专门染色相比，当在细胞质中观察到红膜和绿色负载GFP的PMP时或如果酵母细胞的细胞质变红和/或绿时，则酵母细胞吸收了PMP。为了评价与PBS配制的负载GFP的PMP相比，负载GFP的EMIM乙酸酯配制的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质/在细胞质中的绿色PMP的酵母细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将负载GFP的EMIM乙酸酯配制的PMP与PBS配制的负载GFP的PMP的摄取效率进行比较。
c)通过用负载GFP蛋白的EMIM乙酸酯配制的葡萄柚PMP来增加核盘菌的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP，并如实例5所描述的向其负载GFP蛋白。将一些PMP留作对照，并且如实例6b所描述，将其余的用纤维素酶进行修饰。通过蛋白质印迹或荧光测量PMP的GFP包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在1mL稀C中的50mg PMP与2ml的1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。通过实例2中描述的方法将所有未标记的染料洗掉，并且将标记的PMP沉淀物重悬于PBS中。为了确定负载GFP的PKH26标记的PMP相对于负载GFP的EMIM乙酸酯配制的PKH26标记的PMP的PMP摄取效率，对核盘菌真菌细胞进行了处理。
为了确定核盘菌(ATCC，#18687)子囊孢子的PMP摄取，将10,000个子囊孢子与0(阴性对照)、1、10、或50、100和250μg/mL的PKH26标记的负载GFP的EMIM乙酸酯中配制的PMP、或PBS中配制的PMP直接在载玻片上一起孵育。除了PBS对照外，还将核盘菌细胞在PKH26染料(最终浓度5μg/mL)的存在下孵育。在室温下孵育5min、30min和1h后，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。与PKH26染料对细胞膜的专门染色相比，当在细胞质中观察到红膜和绿色负载GFP的PMP时或如果酵母细胞的细胞质变红和/或绿时，则酵母细胞吸收了PMP。为了评价与PBS中配制的负载GFP的PMP相比，负载GFP的EMIM乙酸酯配制的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质/在细胞质中的绿色PMP的核盘菌细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将在EMIM乙酸酯中配制的负载GFP的PMP-配制的PMP与PBS中配制的负载GFP的PMP的摄取效率进行比较。
d)通过用负载钙黄绿素AM的EMIM乙酸酯配制的葡萄柚PMP来增加MDA-MB-231细胞的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP。如实例5和Gray等人,MethodsX[方法 X]2015所描述，向修饰的和未修饰的PMP负载钙黄绿素AM(西格玛奥德里奇公司)。钙黄绿素AM仅在被PMP包封时才呈荧光，并且通过荧光来测量包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在1mL稀C中的50mg负载钙黄绿素AM的PMP与2mL的1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。如实例2所描述，将所有未标记的染料洗掉，并使用100kDa Amicon过滤器浓缩PMP。为了确定PBS中配制的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP相对于负载钙黄绿素AM的PKH26标记的EMIM乙酸酯配制的PMP的PMP摄取效率，对人乳腺癌细胞进行了处理。
MDA-MB-231乳腺癌细胞系获得自ATCC(HTB-26)，并根据供应商的说明生长和维持。收获在70％-80％汇合时的细胞，计数并以200uL细胞培养基中每孔10,000个细胞的接种密度接种到96孔培养处理的孔板中。允许细胞粘附3小时，然后除去培养基，用达尔伯克氏(Dulbecco)PBS洗涤细胞一次，并将不含FCS的培养基添加至血清(处理前使细胞饥饿3小时)。为了确定乳腺癌细胞的PMP摄取，将细胞与0(阴性对照)、1、10或50、100和250μg/mL的PKH26标记的负载钙黄绿素AM的、在PBS中配制和在EMIM乙酸酯中配制的PMP直接在孔中一起孵育。除了PBS对照外，还将细胞在钙黄绿素AM(最终浓度5μg/mL)、PKH26染料(最终浓度5μg/mL)、和未修饰的PMP的存在下孵育。在37C孵育30min、1h、2h和4h后，将细胞用PBS洗涤4x10’，以除去培养基中的PMP。接下来，在高分辨率荧光显微镜(EVOS2FL)上以40x获取图像，以确定摄取效率。与PKH26染料对细胞膜的专门染色相比，当在细胞质中观察到红膜和绿色负载钙黄绿素AM的PMP时或如果细胞的细胞质变红和/或绿时，则乳腺癌细胞吸收了PMP。为了评价与PBS配制的负载钙黄绿素AM的PMP相比，负载钙黄绿素AM的EMIM乙酸酯配制的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质/在细胞质中的绿色PMP的细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将负载GFP的EMIM乙酸酯配制的PMP与负载GFP的PBS配制的PMP的摄取效率进行比较。
e)通过用负载钙黄绿素AM的EMIM乙酸酯配制的葡萄柚PMP来增加丁香假单胞菌的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP。如实例5和Gray等人,MethodsX[方法X]2015所描述，向修饰的和PBS配制的PMP负载钙黄绿素AM(西格玛奥德里奇公司)。钙黄绿素AM仅在被PMP包封时才呈荧光，并且通过荧光来测量包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在PKH26标记试剂盒的1mL稀C中的50mg负载钙黄绿素AM的PMP与2ml的1mMPKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。通过实例2中描述的方法将所有未标记的染料洗掉，并且如实例8a所描述，将标记的PMP沉淀物重悬于PBS(对照)或EMIM乙酸酯溶液中。为了确定PBS中配制的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP相对于负载钙黄绿素AM的PKH26标记的EMIM乙酸酯配制的PMP的PMP摄取效率，对丁香假单胞菌细菌细胞进行了处理。
从ATCC(BAA-871)获得丁香假单胞菌细菌，并且根据制造商的说明在金氏培养基(King’s Medium)B琼脂上生长。为了确定丁香假单胞菌的PMP摄取，将1ml过夜细菌悬浮液的10μl与0(阴性对照)、1、10、或50、100、和250μg/ml的PBS配制的PKH26标记的负载钙黄绿素AM的PMP和PKH26标记的负载钙黄绿素AM的EMIM乙酸酯配制的PMP直接在载玻片上一起孵育。除了PBS对照外，还将丁香假单胞菌细菌在钙黄绿素AM(最终浓度5μg/ml)、PKH26染料(最终浓度5μg/ml)的存在下孵育。在室温下孵育5min、30min和1h后，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。为了评价与PBS配制的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP相比，负载钙黄绿素AM的PKH26标记的EMIM乙酸酯配制的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质或在细胞质中的绿色和红色PMP的细菌细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将负载钙黄绿素AM的PKH26标记的EMIM乙酸酯配制的PMP与PBS配制的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP的摄取效率进行比较。与PBS配制的PMP相比，EMIM乙酸酯配制的PMP有效地改善了细胞摄取。
f)棉花植物中负载靶向CLA1的dsRNA的、EMIM乙酸酯配制的葡萄柚PMP对PMP的摄取增加
为了证明EMIM乙酸酯配制的PMP增加细胞摄取，向葡萄柚PMP负载人工miRNA(amiRNA，使用植物小RNA标记位点(P-SAMS；Fahlgren等人,Bioinformatics.[生物信息学]32(1):157-158,2016)设计)或靶向棉花光合作用基因GrCLA1(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶)的定制dicer底物siRNA(DsiRNA，由IDT设计)。GrCLA1是拟南芥Cloroplastosalterados 1基因(AtCLA1)(其功能丧失导致真叶上的白化表型，为沉默效率提供了可视标记物)的同源基因。寡核苷酸获得自IDT。
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP。如实例5所描述，向葡萄柚PMP负载GrCLA1-amiRNA或GrCLA1-DsiRNA双链体(表12)。使用Quant-It RiboGreen RNA测定试剂盒或使用标记amiRNA或DsiRNA(IDT)的对照荧光染料来测量PMP的amiRNA或DsiRNA包封。如实例8b所描述，将负载的PMP的一部分配制在PBS中，并且将其余的部分用纤维素酶进行修饰。
将负载amiRNA或DsiRNA(统称为dsRNA)的PMP在水(ddH2O)中配制为递送在无菌水中0、1、5、10和20ng/μl的有效dsRNA剂量的等效物的浓度。
为了确定负载CLA1-amiRNA/DsiRNA的PMP相对于负载CLA1-amiRNA/DsiRNA的EMIM乙酸酯配制的PMP的PMP摄取效率，对棉花幼苗进行处理并进行CLA1基因沉默分析。
棉花种子(陆地棉和雷蒙德氏棉)通过美国国家植物种质系统获得。将灭菌的种子包裹在湿润的脱脂棉中，放置在培养皿中，并置于25℃、150μE m-2S-1光强度的生长室中，在14小时光照/10小时黑暗光周期下持续3天以萌发。在具有26℃/20℃日/夜温度的长日条件(16/8h光/黑暗的光周期)下，幼苗在具有荷格伦特(Hoagland)营养液(西格玛奥德里奇公司)的无菌培养容器中生长。4天后，将子叶完全展开(在第一片真叶出现之前)的幼苗用于PMP处理。
将七日龄的棉花幼苗转移到含有1x MS维生素(西格玛奥德里奇公司)pH5.6-5.8、含0.8％(w/v)琼脂糖的0.5x MS(Murashige and Skoog)矿物盐(西格玛奥德里奇公司)上，并通过将整个幼苗用有效剂量为0(ddH2O)、1、5、10和20ng/μl负载GrCLA1 dsRNA的EMIM乙酸酯配制的PMP，以及0(ddH2O)、1、5、10和20ng/μl负载GrCLA1 dsRNA的PBS配制的PMP以3株植物/组、1ml溶液/株植物进行喷雾来处理。可替代地，在进行PMP处理之前，用25G的针将棉花植物子叶的下侧打孔而不刺穿子叶。使用1mL无针注射器将具有有效剂量为0(ddH2O)、1、5、10和20ng/μl的负载GrCLA1 dsRNA的EMIM乙酸酯配制的PMP，以及0(ddH2O)、1、5、10和20ng/μl的负载GrCLA1 dsRNA的VIB(实例1)配制的PMP的PMP溶液从子叶的下侧通过伤口部位手动渗透。将植物转移到生长室中，并在具有光强度为90μmol m-2s-1和26℃/20℃日/夜温度的长日条件(16h/8h光/黑暗的光周期)下保持。
2、5、8和14天后，使用定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)通过内源性CLA1mRNA的表达水平检查CLA1 dsRNA的基因沉默效率。根据制造商的说明(英杰公司(Invitrogen))，使用Trizol试剂从100mg新鲜棉花叶中提取总RNA，并用无RNA酶的DNA酶I(普洛麦格公司(Promega))广泛地处理。用SuperScriptTM第一链合成系统(英杰公司)从2μg总RNA合成第一链cDNA。为了评估CLA1转录物的水平，使用SYBR Green Real-Time PCRMaster Mix(赛默科技公司(Thermo Scientific))进行qRT-PCR，其中使用引物：GrCLA1q1_F5’-CCAGGTGGGGCTTATGCATC-3’(SEQ ID NO:7)、GrCLA1q1_R5’-CCACACCAAGGCTTGAACCC-3’(SEQ ID NO:8)、和GrCLA1q2_F5’-GGCCGGATTCACGAAACGGT-3’(SEQ ID NO:9)、GrCLA1q2_R5’-CGTCGAGATTGGCAGTTGGC-3’(SEQ ID NO:10)、和18s RNA_F5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’(SEQ ID NO:11)、18s RNA_R5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3(SEQ ID NO:12)，使用以下程序：(a)95℃持续5min；(b)40个循环的94℃持续30s，55℃持续30s；和72℃持续30s。18S rRNA基因用作内部对照，以将结果归一化。通过以下方式确定用负载CLA1-dsRNA的EMIM乙酸酯配制的和负载CLA1-dsRNA的PBS配制的PMP处理后，棉花中的CLA1敲低效率：将用EMIM乙酸酯配制的PMP处理后的归一化的CLA1表达与用PBS配制的PMP处理后的归一化的CLA1表达进行比较，计算ΔΔCt值。
另外地，通过表型光漂白分析检查了CLA1 dsRNA的基因沉默效率。对用EMIM乙酸酯配制的PMP和PBS配制的PMP处理的植物叶进行拍照，并使用ImageJ软件确定基因沉默的百分比，该百分比由叶上的白色光漂白相对于对照叶的绿色来反映。测定了每株植物的三片叶以定量光漂白的效果，并评价了EMIM乙酸酯配制的相对于PBS配制的负载CLA1-dsRNA的PMP的基因沉默效率。
与PBS配制的PMP相比，植物细胞更有效地摄取EMIM乙酸酯配制的PMP，并诱导更多的CLA1基因沉默。
实例8：通过用氟液体配制PMP来增加PMP细胞摄取
此实施例描述了用氟液体配制PMP，以通过改善细胞渗透来提高PMP摄取。氟液体已经被描述为增溶纤维素(细胞壁的主要组分)的潜在药剂，并且还可以改善真菌或细菌的细胞壁和/或动物细胞的细胞膜或细胞外基质的渗透。在此实例中，全氟辛烷用作模型氟液体，葡萄柚PMP用作模型PMP，棉花用作模型植物，酿酒酵母用作模型酵母，MDA-MB-231用作模型人细胞系，核盘菌用作模型真菌，以及丁香假单胞菌用作模型细菌。
实验方案：
a)氟液体中PMP的配制
如实例1和实例2所描述的分离葡萄柚PMP的浓缩溶液。通过在1％、5％、10％、20％、50％或100％的全氟辛烷(西格玛奥德里奇公司)溶液中进行剧烈混合来重悬PMP。可替代地，使用全氟己烷、或全氟(甲基十氢化萘)。假设从悬浮液中100％回收，并且将配制前的浓度乘以体积比，从而确定PMP的浓度。如实施例3和实施例4所描述的评价氟液体中的PMP特征和稳定性。
b)通过用负载GFP蛋白的全氟辛烷配制的葡萄柚PMP来增加酿酒酵母的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP，并如实例5所描述的向其负载GFP蛋白。通过蛋白质印迹或荧光测量PMP的GFP包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在PKH26标记试剂盒的1mL稀C中的50mg PMP与2ml的1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。通过实例2中描述的方法将所有未标记的染料洗掉，并且如实例8a所描述，将标记的PMP沉淀物重悬于PBS(对照)或全氟辛烷溶液中。为了确定PBS中负载GFP的PKH26标记的PMP相对于负载GFP的全氟辛烷配制的PKH26标记的PMP的PMP摄取效率，对酿酒酵母真菌细胞进行了处理。
酿酒酵母获自ATCC(#9763)，并且如制造商所指示，在酵母提取物蛋白胨右旋糖肉汤(YPD)中维持在30℃。为了确定酿酒酵母的PMP摄取，使酵母细胞在选择培养基中生长到0.4-0.6的OD600，并且与PBS或全氟辛烷中0(阴性对照)、1、10、或50、100、和250μg/ml的PKH26标记的负载GFP的修饰的PMP直接在载玻片上一起孵育。除了PBS对照外，还将酿酒酵母细胞在PKH26染料(最终浓度5μg/ml)的存在下孵育。在室温下孵育5min、30min和1h后，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。与PKH26染料对细胞膜的专门染色相比，当在细胞质中观察到红膜和绿色负载GFP的PMP时或如果酵母细胞的细胞质变红和/或绿时，则酵母细胞吸收了PMP。为了评价与PBS配制的负载GFP的PMP相比，负载GFP的全氟辛烷配制的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质/在细胞质中的绿色PMP的酵母细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将负载GFP的全氟辛烷配制的PMP与PBS配制的负载GFP的PMP的摄取效率进行比较。
c)通过用负载GFP蛋白的全氟辛烷配制的葡萄柚PMP来增加核盘菌的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP，并如实例5所描述的向其负载GFP蛋白。将一些PMP留作对照，并且如实例6b所描述，将其余的用纤维素酶进行修饰。通过蛋白质印迹或荧光测量PMP的GFP包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在1mL稀C中的50mg PMP与2mL的1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。通过实例2中描述的方法将所有未标记的染料洗掉，并且将标记的PMP沉淀物重悬于PBS中。为了确定负载GFP的PKH26标记的PMP相对于负载GFP的全氟辛烷配制的PKH26标记的PMP的PMP摄取效率，对核盘菌真菌细胞进行了处理。
为了确定核盘菌(ATCC，#18687)子囊孢子的PMP摄取，将10,000个子囊孢子与0(阴性对照)、1、10、或50、100和250μg/mL的PKH26标记的负载GFP的全氟辛烷中配制的PMP、或PBS中配制的PMP直接在载玻片上一起孵育。除了PBS对照外，还将核盘菌细胞在PKH26染料(最终浓度5μg/mL)的存在下孵育。在室温下孵育5min、30min和1h后，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。与PKH26染料对细胞膜的专门染色相比，当在细胞质中观察到红膜和绿色负载GFP的PMP时或如果酵母细胞的细胞质变红和/或绿时，则酵母细胞吸收了PMP。为了评价与PBS中配制的负载GFP的PMP相比，负载GFP的全氟辛烷配制的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质/在细胞质中的绿色PMP的核盘菌细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将在全氟辛烷中配制的负载GFP的PMP-配制的PMP与PBS中配制的负载GFP的PMP的摄取效率进行比较。
d)通过用负载钙黄绿素AM的全氟辛烷配制的葡萄柚PMP来增加MDA-MB-231细胞的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP。如实例5和Gray等人,MethodsX[方法 X]2015所描述，向修饰的和未修饰的PMP负载钙黄绿素AM(西格玛奥德里奇公司)。钙黄绿素AM仅在被PMP包封时才呈荧光，并且通过荧光来测量包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在1mL稀C中的50mg负载钙黄绿素AM的PMP与2mL的1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。如实例2所描述，将所有未标记的染料洗掉，并使用100kDa Amicon过滤器浓缩PMP。为了确定PBS中配制的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP相对于负载钙黄绿素AM的PKH26标记的全氟辛烷配制的PMP的PMP摄取效率，对人乳腺癌细胞进行了处理。
MDA-MB-231乳腺癌细胞系获得自ATCC(HTB-26)，并根据供应商的说明生长和维持。收获在70％-80％汇合时的细胞，计数并以200uL细胞培养基中每孔10,000个细胞的接种密度接种到96孔培养处理的孔板中。允许细胞粘附3小时，然后除去培养基，用达尔伯克氏(Dulbecco)PBS洗涤细胞一次，并将不含FCS的培养基添加至血清(处理前使细胞饥饿3小时)。为了确定乳腺癌细胞对PMP的摄取，将细胞与0(阴性对照)、1、10或50、100和250μg/mL的PKH26标记的负载钙黄绿素AM的、在PBS中配制和在全氟辛烷中配制的PMP直接在孔中一起孵育。除了PBS对照外，还将细胞在钙黄绿素AM(最终浓度5μg/mL)、PKH26染料(最终浓度5μg/mL)、和未修饰的PMP的存在下孵育。在37C孵育30min、1h、2h和4h后，将细胞用PBS洗涤4x10’，以除去培养基中的PMP。接下来，在高分辨率荧光显微镜(EVOS2FL)上以40x获取图像，以确定摄取效率。与PKH26染料对细胞膜的专门染色相比，当在细胞质中观察到红膜和绿色负载钙黄绿素AM的PMP时或如果细胞的细胞质变红和/或绿时，则乳腺癌细胞吸收了PMP。为了评价与PBS配制的负载钙黄绿素AM的PMP相比，负载钙黄绿素AM的全氟辛烷配制的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质/在细胞质中的绿色PMP的细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将负载GFP的全氟辛烷配制的PMP与负载GFP的PBS配制的PMP的摄取效率进行比较。
e)通过用负载钙黄绿素AM的全氟辛烷配制的葡萄柚PMP来增加丁香假单胞菌的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP。如实例5和Gray等人,MethodsX[方法X]2015所描述，向修饰的和PBS配制的PMP负载钙黄绿素AM(西格玛奥德里奇公司)。钙黄绿素AM仅在被PMP包封时才呈荧光，并且通过荧光来测量包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在PKH26标记试剂盒的1mL稀C中的50mg负载钙黄绿素AM的PMP与2ml的1mMPKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。通过实例2中描述的方法将所有未标记的染料洗掉，并且如实例8a所描述，将标记的PMP沉淀物重悬于PBS(对照)或全氟辛烷溶液中。为了确定PBS中配制的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP相对于负载钙黄绿素AM的PKH26标记的全氟辛烷配制的PMP的PMP摄取效率，对丁香假单胞菌细菌细胞进行了处理。
从ATCC(BAA-871)获得丁香假单胞菌细菌，并且根据制造商的说明在金氏培养基(King’s Medium)B琼脂上生长。为了确定丁香假单胞菌的PMP摄取，将1ml过夜细菌悬浮液的10ul与0(阴性对照)、1、10、或50、100、和250μg/ml的PBS配制的PKH26标记的负载钙黄绿素AM的PMP和PKH26标记的负载钙黄绿素AM的全氟辛烷配制的PMP直接在载玻片上一起孵育。除了PBS对照外，还将丁香假单胞菌细菌在钙黄绿素AM(最终浓度5μg/ml)、PKH26染料(最终浓度5μg/ml)的存在下孵育。在室温下孵育5min、30min和1h后，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。为了评价与PBS配制的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP相比，负载钙黄绿素AM的PKH26标记的全氟辛烷配制的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质或在细胞质中的绿色和红色PMP的细菌细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将负载钙黄绿素AM的PKH26标记的全氟辛烷配制的PMP与PBS配制的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP的摄取效率进行比较。与PBS配制的PMP相比，全氟辛烷配制的PMP有效地改善了细胞摄取。
f)棉花植物中负载靶向CLA1的dsRNA的、全氟辛烷配制的葡萄柚PMP对PMP的摄取增加
为了证明全氟辛烷配制的PMP增加细胞摄取，向葡萄柚PMP负载人工miRNA(amiRNA，使用植物小RNA标记位点(P-SAMS；Fahlgren等人,Bioinformatics.[生物信息学]32(1):157-158,2016)设计)或靶向棉花光合作用基因GrCLA1(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶)的定制dicer底物siRNA(DsiRNA，由IDT设计)。GrCLA1是拟南芥Cloroplastosalterados 1基因(AtCLA1)(其功能丧失导致真叶上的白化表型，为沉默效率提供了可视标记物)的同源基因。寡核苷酸获得自IDT。
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP。如实例5所描述，向葡萄柚PMP负载GrCLA1-amiRNA或GrCLA1-DsiRNA双链体(表12)。使用Quant-It RiboGreen RNA测定试剂盒或使用标记amiRNA或DsiRNA(IDT)的对照荧光染料来测量PMP的amiRNA或DsiRNA包封。如实例8b所描述，将负载的PMP的一部分配制在PBS中，并且将其余的部分用纤维素酶进行修饰。
将负载amiRNA或DsiRNA(统称为dsRNA)的PMP在水(ddH2O)中配制为递送在无菌水中0、1、5、10和20ng/μl的有效dsRNA剂量的等效物的浓度。
为了确定负载CLA1-amiRNA/DsiRNA的PMP相对于负载CLA1-amiRNA/DsiRNA的全氟辛烷配制的PMP的PMP摄取效率，对棉花幼苗进行处理并进行CLA1基因沉默分析。
棉花种子(陆地棉和雷蒙德氏棉)通过美国国家植物种质系统获得。将灭菌的种子包裹在湿润的脱脂棉中，放置在培养皿中，并置于25℃、150μE m-2S-1光强度的生长室中，在14小时光照/10小时黑暗光周期下持续3天以萌发。在具有26℃/20℃日/夜温度的长日条件(16/8h光/黑暗的光周期)下，幼苗在具有荷格伦特(Hoagland)营养液(西格玛奥德里奇公司)的无菌培养容器中生长。4天后，将子叶完全展开(在第一片真叶出现之前)的幼苗用于PMP处理。
将七日龄的棉花幼苗转移到含有1x MS维生素(西格玛奥德里奇公司)pH5.6-5.8、含0.8％(w/v)琼脂糖的0.5x MS(Murashige and Skoog)矿物盐(西格玛奥德里奇公司)上，并通过将整个幼苗用有效剂量为0(ddH2O)、1、5、10和20ng/μl负载GrCLA1 dsRNA的全氟辛烷配制的PMP，以及0(ddH2O)、1、5、10和20ng/μl负载GrCLA1 dsRNA的PBS配制的PMP以3株植物/组、1ml溶液/株植物进行喷雾来处理。可替代地，在进行PMP处理之前，用25G的针将棉花植物子叶的下侧打孔而不刺穿子叶。使用1mL无针注射器将具有有效剂量为0(ddH2O)、1、5、10和20ng/μl的负载GrCLA1 dsRNA的全氟辛烷配制的PMP，以及0(ddH2O)、1、5、10和20ng/μl的负载GrCLA1 dsRNA的VIB(实例1)配制的PMP的PMP溶液从子叶的下侧通过伤口部位手动渗透。将植物转移到生长室中，并在具有光强度为90μmol m-2s-1和26℃/20℃日/夜温度的长日条件(16h/8h光/黑暗的光周期)下保持。
2、5、8和14天后，使用定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)通过内源性CLA1mRNA的表达水平检查CLA1 dsRNA的基因沉默效率。根据制造商的说明(英杰公司(Invitrogen))，使用Trizol试剂从100mg新鲜棉花叶中提取总RNA，并用无RNA酶的DNA酶I(普洛麦格公司(Promega))广泛地处理。用SuperScriptTM第一链合成系统(英杰公司)从2μg总RNA合成第一链cDNA。为了评估CLA1转录物的水平，使用SYBR Green Real-Time PCRMaster Mix(赛默科技公司(Thermo Scientific))进行qRT-PCR，其中使用引物：GrCLA1q1_F5’-CCAGGTGGGGCTTATGCATC-3’(SEQ ID NO:7)、GrCLA1q1_R5’-CCACACCAAGGCTTGAACCC-3’(SEQ ID NO:8)、和GrCLA1q2_F5’-GGCCGGATTCACGAAACGGT-3’(SEQ ID NO:9)、GrCLA1q2_R5’-CGTCGAGATTGGCAGTTGGC-3’(SEQ ID NO:10)、和18s RNA_F5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’(SEQ ID NO:11)、18s RNA_R5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3(SEQ ID NO:12)，使用以下程序：(a)95℃持续5min；(b)40个循环的94℃持续30s，55℃持续30s；和72℃持续30s。18S rRNA基因用作内部对照，以将结果归一化。通过以下方式确定用负载CLA1-dsRNA的全氟辛烷配制的和负载CLA1-dsRNA的PBS配制的PMP处理后，棉花中的CLA1敲低效率：将用全氟辛烷配制的PMP处理后的归一化的CLA1表达与用PBS配制的PMP处理后的归一化的CLA1表达进行比较，计算ΔΔCt值。
另外地，通过表型光漂白分析检查了CLA1 dsRNA的基因沉默效率。对用全氟辛烷配制的PMP和PBS配制的PMP处理的植物叶进行拍照，并使用ImageJ软件确定基因沉默的百分比，该百分比由叶上的白色光漂白相对于对照叶的绿色来反映。测定了每株植物的三片叶以定量光漂白的效果，并评价了全氟辛烷配制的相对于PBS配制的负载CLA1-dsRNA的PMP的基因沉默效率。
与PBS配制的PMP相比，植物细胞更有效地摄取全氟辛烷配制的PMP，并诱导更多的CLA1基因沉默。
实例9：通过用洗涤剂配制PMP以改善细胞渗透来增加PMP摄取
此实例描述了通过用洗涤剂修饰PMP以促进细胞膜的渗透来增加动物、植物、真菌或细菌细胞对PMP的细胞摄取。在此实例中，皂苷用作模型洗涤剂，葡萄柚PMP用作模型PMP，棉花用作模型植物，酿酒酵母用作模型酵母，MDA-MB-231用作模型人细胞系、核盘菌用作模型真菌，以及丁香假单胞菌用作模型细菌。
实验方案：
a)用皂苷修饰PMP
如实例1和实例2所描述的分离葡萄柚PMP的浓缩溶液。通过在0.001％、0.01％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％w/v的皂苷(阿文蒂极性脂质公司(Avanti Polar Lipids))溶液中进行剧烈混合来重悬PMP。可替代地，使用CHAPS。假设从悬浮液中100％回收，并且将配制前的浓度乘以体积比，从而确定PMP的浓度。如实施例3和实施例4所描述的评价皂苷修饰的PMP特征和稳定性。
b)通过用负载GFP蛋白的皂苷修饰的葡萄柚PMP来增加酿酒酵母的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP，并如实例5所描述的向其负载GFP蛋白。将一些PMP留作对照，并且如实例9a所描述，将其余的用皂苷进行修饰。通过蛋白质印迹或荧光测量PMP的GFP包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在PKH26标记试剂盒的1mL稀C中的50mg PMP与2ml的1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。通过实例2中描述的方法将所有未标记的染料洗掉，并且将标记的PMP沉淀物重悬于PBS中。为了确定负载GFP的PKH26标记的PMP相对于负载GFP的皂苷修饰的PKH26标记的PMP的PMP摄取效率，对酿酒酵母真菌细胞进行了处理。
酿酒酵母获自ATCC(#9763)，并且如制造商所指示，在酵母提取物蛋白胨右旋糖肉汤(YPD)中维持在30℃。为了确定酿酒酵母的PMP摄取，使酵母细胞在选择培养基中生长到0.4-0.6的OD600，并且与0(阴性对照)、1、10、或50、100、和250μg/ml的PKH26标记的负载GFP的修饰的PMP、或未修饰的PMP直接在载玻片上一起孵育。除了PBS对照外，还将酿酒酵母细胞在PKH26染料(最终浓度5μg/ml)的存在下孵育。在室温下孵育5min、30min和1h后，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。与PKH26染料对细胞膜的专门染色相比，当在细胞质中观察到红膜和绿色负载GFP的PMP时或如果酵母细胞的细胞质变红和/或绿时，则酵母细胞吸收了PMP。为了评价与未修饰的负载GFP的PMP相比，负载GFP的皂苷修饰的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质/在细胞质中的绿色PMP的酵母细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将负载GFP的皂苷修饰的PMP与未修饰的负载GFP的PMP的摄取效率进行比较。
c)通过用负载GFP蛋白的皂苷修饰的葡萄柚PMP来增加核盘菌的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP，并如实例5所描述的向其负载GFP蛋白。将一些PMP留作对照，并且如实例6b所描述，将其余的用皂苷进行修饰。通过蛋白质印迹或荧光测量PMP的GFP包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在1mL稀C中的50mg PMP与2mL的1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。通过实例2中描述的方法将所有未标记的染料洗掉，并且将标记的PMP沉淀物重悬于PBS中。为了确定负载GFP的PKH26标记的PMP相对于负载GFP的皂苷修饰的PKH26标记的PMP的PMP摄取效率，对核盘菌真菌细胞进行了处理。
为了确定核盘菌(ATCC，#18687)子囊孢子的PMP摄取，将10,000个子囊孢子与0(阴性对照)、1、10、或50、100和250μg/ml的PKH26标记的负载GFP的修饰的PMP、或未修饰的PMP直接在载玻片上一起孵育。除了PBS对照外，还将核盘菌细胞在PKH26染料(最终浓度5μg/mL)的存在下孵育。在室温下孵育5min、30min和1h后，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。与PKH26染料对细胞膜的专门染色相比，当在细胞质中观察到红膜和绿色负载GFP的PMP时或如果酵母细胞的细胞质变红和/或绿时，则酵母细胞吸收了PMP。为了评价与未修饰的负载GFP的PMP相比，负载GFP的皂苷修饰的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质/在细胞质中的绿色PMP的核盘菌细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将负载GFP的皂苷修饰的PMP与未修饰的负载GFP的PMP的摄取效率进行比较。
d)通过用负载钙黄绿素AM的皂苷修饰的葡萄柚PMP来增加MDA-MB-231细胞的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP。将一些PMP留作对照，并且如实例6b所描述，将其余的用皂苷进行修饰。如实例5和Gray等人,MethodsX[方法X]2015所描述，向修饰的和未修饰的PMP负载钙黄绿素AM(西格玛奥德里奇公司)。钙黄绿素AM仅在被PMP包封时才呈荧光，并且通过荧光来测量包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在1mL稀C中的50mg负载钙黄绿素AM的PMP与2mL的1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。如实例2所描述，将所有未标记的染料洗掉，并使用100kDaAmicon过滤器浓缩PMP。为了确定负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP相对于负载钙黄绿素AM的PKH26标记的皂苷修饰的PMP的PMP摄取效率，对人乳腺癌细胞进行了处理。
MDA-MB-231乳腺癌细胞系获得自ATCC(HTB-26)，并根据供应商的说明生长和维持。收获在70％-80％汇合时的细胞，计数并以200ul细胞培养基中每孔10,000个细胞的接种密度接种到96孔培养处理的孔板中。允许细胞粘附3小时，然后除去培养基，用达尔伯克氏(Dulbecco)PBS洗涤细胞一次，并将不含FCS的培养基添加至血清(处理前使细胞饥饿3小时)。为了确定乳腺癌细胞的PMP摄取，将细胞与0(阴性对照)、1、10或50、100和250μg/mL的PKH26标记的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的未修饰的和皂苷修饰的PMP直接在孔中一起孵育。除了PBS对照外，还将细胞在钙黄绿素AM(最终浓度5μg/mL)、PKH26染料(最终浓度5μg/ml)、和未修饰的PMP的存在下孵育。在37C孵育30min、1h、2h和4h后，将细胞用PBS洗涤4x10’，以除去培养基中的PMP。接下来，在高分辨率荧光显微镜(EVOS2 FL)上以40x获取图像，以确定摄取效率。与PKH26染料对细胞膜的专门染色相比，当在细胞质中观察到红膜和绿色负载钙黄绿素AM的PMP时或如果细胞的细胞质变红和/或绿时，则乳腺癌细胞吸收了PMP。为了评价与未修饰的负载钙黄绿素AM的PMP相比，负载钙黄绿素AM的皂苷修饰的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质/在细胞质中的绿色PMP的细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将负载GFP的皂苷修饰的PMP与未修饰的负载GFP的PMP的摄取效率进行比较。
e)通过用负载钙黄绿素AM的皂苷修饰的葡萄柚PMP来增加丁香假单胞菌的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP。将一些PMP留作对照，并且如实例9b所描述，将其余的用皂苷进行修饰。如实例5和Gray等人,MethodsX[方法X]2015所描述，向修饰的和未修饰的PMP负载钙黄绿素AM(西格玛奥德里奇公司)。钙黄绿素AM仅在被PMP包封时才呈荧光，并且通过荧光来测量包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在PKH26标记试剂盒的1mL稀C中的50mg负载钙黄绿素AM的PMP与2ml的1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。如实例2所描述，将所有未标记的染料洗掉，并使用100kDa Amicon过滤器浓缩PMP。为了确定负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP相对于负载钙黄绿素AM的PKH26标记的皂苷修饰的PMP的PMP摄取效率，对丁香假单胞菌细菌细胞进行了处理。
从ATCC(BAA-871)获得丁香假单胞菌细菌，并且根据制造商的说明在金氏培养基(King’s Medium)B琼脂上生长。为了确定丁香假单胞菌的PMP摄取，将1ml过夜细菌悬浮液的10μl与0(阴性对照)、1、10、或50、100、和250μg/ml的PKH26标记的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的未修饰的和皂苷修饰的PMP直接在载玻片上一起孵育。除了水对照外，还将丁香假单胞菌细菌在钙黄绿素AM(最终浓度5μg/ml)、PKH26染料(最终浓度5μg/ml)、和未修饰的PMP的存在下孵育。在室温下孵育5min、30min和1h后，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。为了评价与未修饰的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP相比，负载钙黄绿素AM的PKH26标记的皂苷修饰的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质或在细胞质中的绿色和红色PMP的细菌细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将负载钙黄绿素AM的PKH26标记的皂苷修饰的PMP与未修饰的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP的摄取效率进行比较。与未修饰的PMP相比，PMP的皂苷修饰有效地改善了细胞摄取。
f)棉花植物中负载靶向CLA1的dsRNA的、皂苷修饰的葡萄柚PMP对PMP的摄取增加
为了证明皂苷修饰的PMP增加细胞摄取，向葡萄柚PMP负载人工miRNA(amiRNA，使用植物小RNA标记位点(P-SAMS；Fahlgren等人,Bioinformatics.[生物信息学]32(1):157-158,2016)设计)或靶向棉花光合作用基因GrCLA1(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶)的定制dicer底物siRNA(DsiRNA，由IDT设计)。GrCLA1是拟南芥Cloroplastos alterados 1基因(AtCLA1)(其功能丧失导致真叶上的白化表型，为沉默效率提供了可视标记物)的同源基因。寡核苷酸获得自IDT。
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP。为了确定皂苷修饰的PMP相对于未修饰的PMP的PMP摄取效率，如实例5所描述，向葡萄柚PMP负载GrCLA1-amiRNA或GrCLA1-DsiRNA双链体(表12)。使用Quant-It RiboGreen RNA测定试剂盒或使用标记amiRNA或DsiRNA(IDT)的对照荧光染料来测量PMP的amiRNA或DsiRNA包封。接下来，将负载的PMP的一部分留作对照，并且如实例9b所描述，将其余的用皂苷进行修饰。为了确定负载CLA1-amiRNA/DsiRNA的PMP相对于负载CLA1-amiRNA/DsiRNA的皂苷修饰的PMP的PMP摄取效率，对棉花幼苗进行处理并进行CLA1基因沉默分析。将负载amiRNA或DsiRNA(统称为dsRNA)的PMP在水中配制为递送在无菌水中0、1、5、10和20ng/μl的有效dsRNA剂量的等效物的浓度。
棉花种子(陆地棉和雷蒙德氏棉)通过美国国家植物种质系统获得。将灭菌的种子包裹在湿润的脱脂棉中，放置在培养皿中，并置于25℃、150μE m-2S-1光强度的生长室中，在14小时光照/10小时黑暗光周期下持续3天以萌发。在具有26℃/20℃日/夜温度的长日条件(16/8h光/黑暗的光周期)下，幼苗在具有荷格伦特(Hoagland)营养液(西格玛奥德里奇公司)的无菌培养容器中生长。4天后，将子叶完全展开(在第一片真叶出现之前)的幼苗用于PMP处理。
将七日龄的棉花幼苗转移到含有1x MS维生素(西格玛奥德里奇公司)pH5.6-5.8、含0.8％(w/v)琼脂糖的0.5x MS(Murashige and Skoog)矿物盐(西格玛奥德里奇公司)上，并通过将整个幼苗用有效剂量为0(ddH2O)、1、5、10和20ng/μl负载GrCLA1 dsRNA的皂苷修饰的PMP，以及0(ddH2O)、1、5、10和20ng/μl负载GrCLA1 dsRNA的未修饰的PMP以3株植物/组、1ml溶液/株植物进行喷雾来处理。可替代地，在进行PMP处理之前，用25G的针将棉花植物子叶的下侧打孔而不刺穿子叶。使用1mL无针注射器将PMP溶液从子叶的下侧通过伤口部位手动渗透。将植物转移到生长室中，并在具有光强度为90μmol m-2s-1和26℃/20℃日/夜温度的长日条件(16h/8h光/黑暗的光周期)下保持。
2、5、8和14天后，使用定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)通过内源性CLA1mRNA的表达水平检查CLA1 dsRNA的基因沉默效率。根据制造商的说明(英杰公司(Invitrogen))，使用Trizol试剂从100mg新鲜棉花叶中提取总RNA，并用无RNA酶的DNA酶I(普洛麦格公司(Promega))广泛地处理。用SuperScriptTM第一链合成系统(英杰公司)从2μg总RNA合成第一链cDNA。为了评估CLA1转录物的水平，使用SYBR Green Real-Time PCRMaster Mix(赛默科技公司(Thermo Scientific))进行qRT-PCR，其中使用引物：GrCLA1q1_F5’-CCAGGTGGGGCTTATGCATC-3’(SEQ ID NO:7)、GrCLA1q1_R5’-CCACACCAAGGCTTGAACCC-3’(SEQ ID NO:8)、和GrCLA1q2_F5’-GGCCGGATTCACGAAACGGT-3’(SEQ ID NO:9)、GrCLA1q2_R5’-CGTCGAGATTGGCAGTTGGC-3’(SEQ ID NO:10)、和18s RNA_F5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’(SEQ ID NO:11)、18s RNA_R5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3(SEQ ID NO:12)，使用以下程序：(a)95℃持续5min；(b)40个循环的94℃持续30s，55℃持续30s；和72℃持续30s。18S rRNA基因用作内部对照，以将结果归一化。通过以下方式确定用负载CLA1-dsRNA的皂苷修饰的和负载CLA1-dsRNA的未修饰的PMP处理后，棉花中的CLA1敲低效率：将用皂苷修饰的PMP处理后的归一化的CLA1表达与用未修饰的PMP处理后的归一化的CLA1表达进行比较，计算ΔΔCt值。
另外地，通过表型光漂白分析检查了CLA1 dsRNA的基因沉默效率。对已处理和未处理的棉花植物的叶进行拍照，并使用ImageJ软件确定基因沉默百分比，该百分比由叶上的白色光漂白相对于对照叶的绿色来反映。测定了每株植物的三片叶以定量光漂白的效果，并评价了皂苷修饰的相对于未修饰的负载CLA1-dsRNA的PMP的基因沉默效率。
与未修饰的PMP相比，植物细胞更有效地摄取皂苷修饰的PMP，并诱导更多的CLA1基因沉默。
实例10：通过用两性离子脂质配制PMP来增加PMP细胞摄取
此实例描述了通过用两性离子脂质修饰PMP以促进细胞壁和/或细胞膜的渗透来增加动物、植物、真菌或细菌细胞对PMP的细胞摄取。在此实例中，1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)用作模型两性离子脂质，葡萄柚PMP用作模型PMP，棉花用作模型植物，酿酒酵母用作模型酵母，MDA-MB-231用作模型人细胞系、核盘菌用作模型真菌，以及丁香假单胞菌用作模型细菌。
实验方案：
a)用DOPC修饰PMP
如实例1和实例2所描述的分离葡萄柚PMP的浓缩溶液。通过在0.001％、0.01％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％w/v的DOPC(阿文蒂极性脂质公司)的溶液中进行剧烈混合来重悬PMP。可替代地，使用DEPC。假设从悬浮液中100％回收，并且将配制前的浓度乘以体积比，从而确定PMP的浓度。如实施例3和实施例4所描述的评价DOPC修饰的PMP特征和稳定性。
b)通过用负载GFP蛋白的DOPC修饰的葡萄柚PMP来增加酿酒酵母的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP，并如实例5所描述的向其负载GFP蛋白。将一些PMP留作对照，并且如实例10b所描述，将其余的用DOPC进行修饰。通过蛋白质印迹或荧光测量PMP的GFP包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在PKH26标记试剂盒的1mL稀C中的50mg PMP与2ml的1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。通过实例2中描述的方法将所有未标记的染料洗掉，并且将标记的PMP沉淀物重悬于PBS中。为了确定负载GFP的PKH26标记的PMP相对于负载GFP的DOPC修饰的PKH26标记的PMP的PMP摄取效率，对酿酒酵母真菌细胞进行了处理。
酿酒酵母获自ATCC(#9763)，并且如制造商所指示，在酵母提取物蛋白胨右旋糖肉汤(YPD)中维持在30℃。为了确定酿酒酵母的PMP摄取，使酵母细胞在选择培养基中生长到0.4-0.6的OD600，并且与0(阴性对照)、1、10、或50、100、和250μg/ml的PKH26标记的负载GFP的修饰的PMP、或未修饰的PMP直接在载玻片上一起孵育。除了PBS对照外，还将酿酒酵母细胞在PKH26染料(最终浓度5μg/ml)的存在下孵育。在室温下孵育5min、30min和1h后，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。与PKH26染料对细胞膜的专门染色相比，当在细胞质中观察到红膜和绿色负载GFP的PMP时或如果酵母细胞的细胞质变红和/或绿时，则酵母细胞吸收了PMP。为了评价与未修饰的负载GFP的PMP相比，负载GFP的DOPC修饰的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质/在细胞质中的绿色PMP的酵母细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将负载GFP的DOPC修饰的PMP与未修饰的负载GFP的PMP的摄取效率进行比较。
c)通过用负载GFP蛋白的DOPC修饰的葡萄柚PMP来增加核盘菌的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP，并如实例5所描述的向其负载GFP蛋白。将一些PMP留作对照，并且如实例6b所描述，将其余的用DOPC进行修饰。通过蛋白质印迹或荧光测量PMP的GFP包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在1mL稀C中的50mg PMP与2mL的1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。通过实例2中描述的方法将所有未标记的染料洗掉，并且将标记的PMP沉淀物重悬于PBS中。为了确定负载GFP的PKH26标记的PMP相对于负载GFP的DOPC修饰的PKH26标记的PMP的PMP摄取效率，对核盘菌真菌细胞进行了处理。
为了确定核盘菌(ATCC，#18687)子囊孢子的PMP摄取，将10,000个子囊孢子与0(阴性对照)、1、10、或50、100和250μg/mL的PKH26标记的负载GFP的修饰的PMP、或未修饰的PMP直接在载玻片上一起孵育。除了PBS对照外，还将核盘菌细胞在PKH26染料(最终浓度5μg/mL)的存在下孵育。在室温下孵育5min、30min和1h后，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。与PKH26染料对细胞膜的专门染色相比，当在细胞质中观察到红膜和绿色负载GFP的PMP时或如果酵母细胞的细胞质变红和/或绿时，则酵母细胞吸收了PMP。为了评价与未修饰的负载GFP的PMP相比，负载GFP的DOPC修饰的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质/在细胞质中的绿色PMP的核盘菌细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将负载GFP的DOPC修饰的PMP与未修饰的负载GFP的PMP的摄取效率进行比较。
d)通过用负载钙黄绿素AM的DOPC修饰的葡萄柚PMP来增加MDA-MB-231细胞的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP。将一些PMP留作对照，并且如实例6b所描述，将其余的用DOPC进行修饰。如实例5和Gray等人,MethodsX[方法X]2015所描述，向修饰的和未修饰的PMP负载钙黄绿素AM(西格玛奥德里奇公司)。钙黄绿素AM仅在被PMP包封时才呈荧光，并且通过荧光来测量包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在1mL稀C中的50mg负载钙黄绿素AM的PMP与2ml的1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。如实例2所描述，将所有未标记的染料洗掉，并使用100kDaAmicon过滤器浓缩PMP。为了确定的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP相对于负载钙黄绿素AM的PKH26标记的DOPC修饰的PMP的PMP摄取效率，对人乳腺癌细胞进行了处理。
MDA-MB-231乳腺癌细胞系获得自ATCC(HTB-26)，并根据供应商的说明生长和维持。收获在70％-80％汇合时的细胞，计数并以200ul细胞培养基中每孔10,000个细胞的接种密度接种到96孔培养处理的孔板中。允许细胞粘附3小时，然后除去培养基，用达尔伯克氏(Dulbecco)PBS洗涤细胞一次，并将不含FCS的培养基添加至血清(处理前使细胞饥饿3小时)。为了确定乳腺癌细胞的PMP摄取，将细胞与0(阴性对照)、1、10或50、100和250μg/ml的PKH26标记的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的未修饰的和DOPC修饰的PMP直接在孔中一起孵育。除了PBS对照外，还将细胞在钙黄绿素AM(最终浓度5μg/mL)、PKH26染料(最终浓度5μg/mL)、和未修饰的PMP的存在下孵育。在37C孵育30min、1h、2h和4h后，将细胞用PBS洗涤4x10’，以除去培养基中的PMP。接下来，在高分辨率荧光显微镜(EVOS2FL)上以40x获取图像，以确定摄取效率。与PKH26染料对细胞膜的专门染色相比，当在细胞质中观察到红膜和绿色负载钙黄绿素AM的PMP时或如果细胞的细胞质变红和/或绿时，则乳腺癌细胞吸收了PMP。为了评价与未修饰的负载钙黄绿素AM的PMP相比，负载钙黄绿素AM的DAB修饰的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质/在细胞质中的绿色PMP的细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将负载GFP的DOPC修饰的PMP与未修饰的负载GFP的PMP的摄取效率进行比较。
e)通过用负载钙黄绿素AM的DOPC修饰的葡萄柚PMP来增加丁香假单胞菌的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP。将一些PMP留作对照，并且如实例10b所描述，将其余的用DOPC进行修饰。如实例5和Gray等人,MethodsX[方法X]2015所描述，向修饰的和未修饰的PMP负载钙黄绿素AM(西格玛奥德里奇公司)。钙黄绿素AM仅在被PMP包封时才呈荧光，并且通过荧光来测量包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在PKH26标记试剂盒的1mL稀C中的50mg负载钙黄绿素AM的PMP与2ml的1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。如实例2所描述，将所有未标记的染料洗掉，并使用100kDa Amicon过滤器浓缩PMP。为了确定负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP相对于负载钙黄绿素AM的PKH26标记的DOPC修饰的PMP的PMP摄取效率，对丁香假单胞菌细菌细胞进行了处理。
从ATCC(BAA-871)获得丁香假单胞菌细菌，并且根据制造商的说明在金氏培养基(King’s Medium)B琼脂上生长。为了确定丁香假单胞菌的PMP摄取，将1ml过夜细菌悬浮液的10ul与0(阴性对照)、1、10、或50、100、和250μg/ml的PKH26标记的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的未修饰的和DOPC修饰的PMP直接在载玻片上一起孵育。除了水对照外，还将丁香假单胞菌细菌在钙黄绿素AM(最终浓度5μg/ml)、PKH26染料(最终浓度5μg/ml)、和未修饰的PMP的存在下孵育。在室温下孵育5min、30min和1h后，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。为了评价与未修饰的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP相比，负载钙黄绿素AM的PKH26标记的DOPC修饰的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质或在细胞质中的绿色和红色PMP的细菌细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将负载钙黄绿素AM的PKH26标记的DOPC修饰的PMP与未修饰的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP的摄取效率进行比较。与未修饰的PMP相比，PMP的DOPC修饰有效地改善了细胞摄取。
f)棉花植物中负载靶向CLA1的dsRNA的、DOPC修饰的葡萄柚PMP对PMP的摄取增加
为了证明DOPC修饰的PMP增加细胞摄取，向葡萄柚PMP负载人工miRNA(amiRNA，使用植物小RNA标记位点(P-SAMS；Fahlgren等人,Bioinformatics.[生物信息学]32(1):157-158,2016)设计)或靶向棉花光合作用基因GrCLA1(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶)的定制dicer底物siRNA(DsiRNA，由IDT设计)。GrCLA1是拟南芥Cloroplastos alterados 1基因(AtCLA1)(其功能丧失导致真叶上的白化表型，为沉默效率提供了可视标记物)的同源基因。寡核苷酸获得自IDT。
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP。为了确定DOPC修饰的PMP相对于未修饰的PMP的PMP摄取效率，如实施例5所描述，向葡萄柚PMP负载GrCLA1-amiRNA或GrCLA1-DsiRNA双链体(表12)。使用Quant-It RiboGreen RNA测定试剂盒或使用标记amiRNA或DsiRNA(IDT)的对照荧光染料来测量PMP的amiRNA或DsiRNA包封。接下来，将负载的PMP的一部分留作对照，并且如实例10b所描述，将其余的用DOPC进行修饰。为了确定负载CLA1-amiRNA/DsiRNA的PMP相对于负载CLA1-amiRNA/DsiRNA的DOPC修饰的PMP的PMP摄取效率，对棉花幼苗进行处理并进行CLA1基因沉默分析。将负载amiRNA或DsiRNA(统称为dsRNA)的PMP在水中配制为递送在无菌水中0、1、5、10、和20ng/μl的有效dsRNA剂量的等效物的浓度。
棉花种子(陆地棉和雷蒙德氏棉)通过美国国家植物种质系统获得。将灭菌的种子包裹在湿润的脱脂棉中，放置在培养皿中，并置于25℃、150μE m-2S-1光强度的生长室中，在14小时光照/10小时黑暗光周期下持续3天以萌发。在具有26℃/20℃日/夜温度的长日条件(16/8h光/黑暗的光周期)下，幼苗在具有荷格伦特(Hoagland)营养液(西格玛奥德里奇公司)的无菌培养容器中生长。4天后，将子叶完全展开(在第一片真叶出现之前)的幼苗用于PMP处理。
将七日龄的棉花幼苗转移到含有1x MS维生素(西格玛奥德里奇公司)pH5.6-5.8、含0.8％(w/v)琼脂糖的0.5x MS(Murashige and Skoog)矿物盐(西格玛奥德里奇公司)上，并通过将整个幼苗用有效剂量为0(ddH2O)、1、5、10和20ng/μl负载GrCLA1 dsRNA的DOPC修饰的PMP，以及0(ddH2O)、1、5、10和20ng/μl负载GrCLA1 dsRNA的未修饰的PMP以3株植物/组、1ml溶液/株植物进行喷雾来处理。可替代地，在进行PMP处理之前，用25G的针将棉花植物子叶的下侧打孔而不刺穿子叶。使用1mL无针注射器将PMP溶液从子叶的下侧通过伤口部位手动渗透。将植物转移到生长室中，并在具有光强度为90μmol m-2s-1和26℃/20℃日/夜温度的长日条件(16h/8h光/黑暗的光周期)下保持。
2、5、8和14天后，使用定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)通过内源性CLA1mRNA的表达水平检查CLA1 dsRNA的基因沉默效率。根据制造商的说明(英杰公司(Invitrogen))，使用Trizol试剂从100mg新鲜棉花叶中提取总RNA，并用无RNA酶的DNA酶I(普洛麦格公司(Promega))广泛地处理。用SuperScriptTM第一链合成系统(英杰公司)从2μg总RNA合成第一链cDNA。为了评估CLA1转录物的水平，使用SYBR Green Real-Time PCRMaster Mix(赛默科技公司(Thermo Scientific))进行qRT-PCR，其中使用引物：GrCLA1q1_F5’-CCAGGTGGGGCTTATGCATC-3’(SEQ ID NO:7)、GrCLA1q1_R5’-CCACACCAAGGCTTGAACCC-3’(SEQ ID NO:8)、和GrCLA1q2_F5’-GGCCGGATTCACGAAACGGT-3’(SEQ ID NO:9)、GrCLA1q2_R5’-CGTCGAGATTGGCAGTTGGC-3’(SEQ ID NO:10)、和18s RNA_F5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’(SEQ ID NO:11)、18s RNA_R5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3(SEQ ID NO:12)，使用以下程序：(a)95℃持续5min；(b)40个循环的94℃持续30s，55℃持续30s；和72℃持续30s。18S rRNA基因用作内部对照，以将结果归一化。通过以下方式确定用负载CLA1-dsRNA的DOPC修饰的和负载CLA1-dsRNA的未修饰的PMP处理后，棉花中的CLA1敲低效率：将用DOPC修饰的PMP处理后的归一化的CLA1表达与用未修饰的PMP处理后的归一化的CLA1表达进行比较，计算ΔΔCt值。
另外地，通过表型光漂白分析检查了CLA1 dsRNA的基因沉默效率。对已处理和未处理的棉花植物的叶进行拍照，并使用ImageJ软件确定基因沉默百分比，该百分比由叶上的白色光漂白相对于对照叶的绿色来反映。测定了每株植物的三片叶以定量光漂白的效果，并评价了DOPC修饰的相对于未修饰的负载CLA1-dsRNA的PMP的基因沉默效率。
与未修饰的PMP相比，植物细胞更有效地摄取DOPC修饰的PMP，并诱导更多的CLA1基因沉默。
实例11：通过用可离子化的脂质配制PMP来增加PMP细胞摄取
此实例描述了通过用可离子化的脂质修饰PMP以促进细胞壁和/或细胞膜的渗透来增加动物、植物、真菌或细菌细胞对PMP的细胞摄取。在此实例中，1,1‘-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)用作模型可离子化的脂质，葡萄柚PMP用作模型PMP，棉花用作模型植物，酿酒酵母用作模型酵母，MDA-MB-231用作模型人细胞系、核盘菌用作模型真菌，以及丁香假单胞菌用作模型细菌。
实验方案：
a)用C12-200修饰PMP
如实例1和实例2所描述的分离葡萄柚PMP的浓缩溶液。C12-200(可离子化的脂质)通过Love PNAS[美国国家科学院院刊]2010中的以下合成方案获得。通过在0.001％、0.01％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％w/v的C12-200(阿文蒂极性脂质公司)的溶液中进行剧烈混合来重悬PMP。假设从悬浮液中100％回收，并且将配制前的浓度乘以体积比，从而确定PMP的浓度。如实施例3和实施例4所描述的评价C12-200修饰的PMP特征和稳定性。
b)通过用负载GFP蛋白的C12-200修饰的葡萄柚PMP来增加酿酒酵母的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP，并如实例5所描述的向其负载GFP蛋白。将一些PMP留作对照，并且如实例11b所描述，将其余的用C12-200进行修饰。通过蛋白质印迹或荧光测量PMP的GFP包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在PKH26标记试剂盒的1mL稀C中的50mg PMP与2ml的1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。通过实例2中描述的方法将所有未标记的染料洗掉，并且将标记的PMP沉淀物重悬于PBS中。为了确定负载GFP的PKH26标记的PMP相对于负载GFP的C12-200修饰的PKH26标记的PMP的PMP摄取效率，对酿酒酵母真菌细胞进行了处理。
酿酒酵母获自ATCC(#9763)，并且如制造商所指示，在酵母提取物蛋白胨右旋糖肉汤(YPD)中维持在30℃。为了确定酿酒酵母的PMP摄取，使酵母细胞在选择培养基中生长到0.4-0.6的OD600，并且与0(阴性对照)、1、10、或50、100、和250μg/ml的PKH26标记的负载GFP的修饰的PMP、或未修饰的PMP直接在载玻片上一起孵育。除了PBS对照外，还将酿酒酵母细胞在PKH26染料(最终浓度5μg/ml)的存在下孵育。在室温下孵育5min、30min和1h后，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。与PKH26染料对细胞膜的专门染色相比，当在细胞质中观察到红膜和绿色负载GFP的PMP时或如果酵母细胞的细胞质变红和/或绿时，则酵母细胞吸收了PMP。为了评价与未修饰的负载GFP的PMP相比，负载GFP的C12-200修饰的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质/在细胞质中的绿色PMP的酵母细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将负载GFP的C12-200修饰的PMP与未修饰的负载GFP的PMP的摄取效率进行比较。
c)通过用负载GFP蛋白的C12-200修饰的葡萄柚PMP来增加核盘菌的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP，并如实例5所描述的向其负载GFP蛋白。将一些PMP留作对照，并且如实例6b所描述，将其余的用C12-200进行修饰。通过蛋白质印迹或荧光测量PMP的GFP包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在1mL稀C中的50mg PMP与2ml的1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。通过实例2中描述的方法将所有未标记的染料洗掉，并且将标记的PMP沉淀物重悬于PBS中。为了确定负载GFP的PKH26标记的PMP相对于负载GFP的C12-200修饰的PKH26标记的PMP的PMP摄取效率，对核盘菌真菌细胞进行了处理。
为了确定核盘菌(ATCC，#18687)子囊孢子的PMP摄取，将10,000个子囊孢子与0(阴性对照)、1、10、或50、100和250μg/mL的PKH26标记的负载GFP的修饰的PMP、或未修饰的PMP直接在载玻片上一起孵育。除了PBS对照外，还将核盘菌细胞在PKH26染料(最终浓度5μg/mL)的存在下孵育。在室温下孵育5min、30min和1h后，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。与PKH26染料对细胞膜的专门染色相比，当在细胞质中观察到红膜和绿色负载GFP的PMP时或如果酵母细胞的细胞质变红和/或绿时，则酵母细胞吸收了PMP。为了评价与未修饰的负载GFP的PMP相比，负载GFP的C12-200修饰的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质/在细胞质中的绿色PMP的核盘菌细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将负载GFP的C12-200修饰的PMP与未修饰的负载GFP的PMP的摄取效率进行比较。
d)通过用负载钙黄绿素AM的C12-200修饰的葡萄柚PMP来增加MDA-MB-231细胞的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP。将一些PMP留作对照，并且如实例6b所描述，将其余的用C12-200进行修饰。如实例5和Gray等人,MethodsX[方法X]2015所描述，向修饰的和未修饰的PMP负载钙黄绿素AM(西格玛奥德里奇公司)。钙黄绿素AM仅在被PMP包封时才呈荧光，并且通过荧光来测量包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在1mL稀C中的50mg负载钙黄绿素AM的PMP与2mL的1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。如实例2所描述，将所有未标记的染料洗掉，并使用100kDaAmicon过滤器浓缩PMP。为了确定负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP相对于负载钙黄绿素AM的PKH26标记的C12-200修饰的PMP的PMP摄取效率，对人乳腺癌细胞进行了处理。
MDA-MB-231乳腺癌细胞系获得自ATCC(HTB-26)，并根据供应商的说明生长和维持。收获在70％-80％汇合时的细胞，计数并以200ul细胞培养基中每孔10,000个细胞的接种密度接种到96孔培养处理的孔板中。允许细胞粘附3小时，然后除去培养基，用达尔伯克氏(Dulbecco)PBS洗涤细胞一次，并将不含FCS的培养基添加至血清(处理前使细胞饥饿3小时)。为了确定乳腺癌细胞的PMP摄取，将细胞与0(阴性对照)、1、10或50、100和250μg/mL的PKH26标记的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的未修饰的和C12-200修饰的PMP直接在孔中一起孵育。除了PBS对照外，还将细胞在钙黄绿素AM(最终浓度5μg/mL)、PKH26染料(最终浓度5μg/mL)、和未修饰的PMP的存在下孵育。在37C孵育30min、1h、2h和4h后，将细胞用PBS洗涤4x10’，以除去培养基中的PMP。接下来，在高分辨率荧光显微镜(EVOS2FL)上以40x获取图像，以确定摄取效率。与PKH26染料对细胞膜的专门染色相比，当在细胞质中观察到红膜和绿色负载钙黄绿素AM的PMP时或如果细胞的细胞质变红和/或绿时，则乳腺癌细胞吸收了PMP。为了评价与未修饰的负载钙黄绿素AM的PMP相比，负载钙黄绿素AM的C12-200修饰的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质/在细胞质中的绿色PMP的细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将负载GFP的C12-200修饰的PMP与未修饰的负载GFP的PMP的摄取效率进行比较。
e)通过用负载钙黄绿素AM的C12-200修饰的葡萄柚PMP来增加丁香假单胞菌的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP。将一些PMP留作对照，并且如实例11b所描述，将其余的用C12-200进行修饰。如实例5和Gray等人,MethodsX[方法X]2015所描述，向修饰的和未修饰的PMP负载钙黄绿素AM(西格玛奥德里奇公司)。钙黄绿素AM仅在被PMP包封时才呈荧光，并且通过荧光来测量包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在PKH26标记试剂盒的1mL稀C中的50mg负载钙黄绿素AM的PMP与2ml的1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。如实例2所描述，将所有未标记的染料洗掉，并使用100kDa Amicon过滤器浓缩PMP。为了确定负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP相对于负载钙黄绿素AM的PKH26标记的C12-200修饰的PMP的PMP摄取效率，对丁香假单胞菌细菌细胞进行了处理。
从ATCC(BAA-871)获得丁香假单胞菌细菌，并且根据制造商的说明在金氏培养基(King’s Medium)B琼脂上生长。为了确定丁香假单胞菌的PMP摄取，将1ml过夜细菌悬浮液的10ul与0(阴性对照)、1、10、或50、100、和250μg/ml的PKH26标记的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的未修饰的和C12-200修饰的PMP直接在载玻片上一起孵育。除了水对照外，还将丁香假单胞菌细菌在钙黄绿素AM(最终浓度5μg/ml)、PKH26染料(最终浓度5μg/ml)、和未修饰的PMP的存在下孵育。在室温下孵育5min、30min和1h后，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。为了评价与未修饰的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP相比，负载钙黄绿素AM的PKH26标记的C12-200修饰的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质或在细胞质中的绿色和红色PMP的细菌细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将负载钙黄绿素AM的PKH26标记的C12-200修饰的PMP与未修饰的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP的摄取效率进行比较。与未修饰的PMP相比，PMP的C12-200修饰有效地改善了细胞摄取。
f)棉花植物中负载靶向CLA1的dsRNA的、C12-200修饰的葡萄柚PMP对PMP的摄取增加
为了证明C12-200修饰的PMP增加细胞摄取，向葡萄柚PMP负载人工miRNA(amiRNA，使用植物小RNA标记位点(P-SAMS；Fahlgren等人,Bioinformatics.[生物信息学]32(1):157-158,2016)设计)或靶向棉花光合作用基因GrCLA1(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶)的定制dicer底物siRNA(DsiRNA，由IDT设计)。GrCLA1是拟南芥Cloroplastos alterados 1基因(AtCLA1)(其功能丧失导致真叶上的白化表型，为沉默效率提供了可视标记物)的同源基因。寡核苷酸获得自IDT。
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP。为了确定C12-200修饰的PMP相对于未修饰的PMP的PMP摄取效率，如实施例5所描述，向葡萄柚PMP负载GrCLA1-amiRNA或GrCLA1-DsiRNA双链体(表12)。使用Quant-It RiboGreen RNA测定试剂盒或使用标记amiRNA或DsiRNA(IDT)的对照荧光染料来测量PMP的amiRNA或DsiRNA包封。接下来，将负载的PMP的一部分留作对照，并且如实例11b所描述，将其余的用C12-200进行修饰。为了确定负载CLA1-amiRNA/DsiRNA的PMP相对于负载CLA1-amiRNA/DsiRNA的C12-200修饰的PMP的PMP摄取效率，对棉花幼苗进行处理并进行CLA1基因沉默分析。将负载amiRNA或DsiRNA(统称为dsRNA)的PMP在水中配制为递送在无菌水中0、1、5、10和20ng/μl的有效dsRNA剂量的等效物的浓度。
棉花种子(陆地棉和雷蒙德氏棉)通过美国国家植物种质系统获得。将灭菌的种子包裹在湿润的脱脂棉中，放置在培养皿中，并置于25℃、150μE m-2S-1光强度的生长室中，在14小时光照/10小时黑暗光周期下持续3天以萌发。在具有26℃/20℃日/夜温度的长日条件(16/8h光/黑暗的光周期)下，幼苗在具有荷格伦特(Hoagland)营养液(西格玛奥德里奇公司)的无菌培养容器中生长。4天后，将子叶完全展开(在第一片真叶出现之前)的幼苗用于PMP处理。
将七日龄的棉花幼苗转移到含有1x MS维生素(西格玛奥德里奇公司)pH5.6-5.8、含0.8％(w/v)琼脂糖的0.5x MS(Murashige and Skoog)矿物盐(西格玛奥德里奇公司)上，并通过将整个幼苗用有效剂量为0(ddH2O)、1、5、10和20ng/μl负载GrCLA1 dsRNA的C12-200修饰的PMP，以及0(ddH2O)、1、5、10和20ng/μl负载GrCLA1 dsRNA的未修饰的PMP以3株植物/组、1ml溶液/株植物进行喷雾来处理。可替代地，在进行PMP处理之前，用25G的针将棉花植物子叶的下侧打孔而不刺穿子叶。使用1mL无针注射器将PMP溶液从子叶的下侧通过伤口部位手动渗透。将植物转移到生长室中，并在具有光强度为90μmol m-2s-1和26℃/20℃日/夜温度的长日条件(16h/8h光/黑暗的光周期)下保持。
2、5、8和14天后，使用定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)通过内源性CLA1mRNA的表达水平检查CLA1 dsRNA的基因沉默效率。根据制造商的说明(英杰公司(Invitrogen))，使用Trizol试剂从100mg新鲜棉花叶中提取总RNA，并用无RNA酶的DNA酶I(普洛麦格公司(Promega))广泛地处理。用SuperScriptTM第一链合成系统(英杰公司)从2μg总RNA合成第一链cDNA。为了评估CLA1转录物的水平，使用SYBR Green Real-Time PCRMaster Mix(赛默科技公司(Thermo Scientific))进行qRT-PCR，其中使用引物：GrCLA1q1_F5’-CCAGGTGGGGCTTATGCATC-3’(SEQ ID NO:7)、GrCLA1q1_R5’-CCACACCAAGGCTTGAACCC-3’(SEQ ID NO:8)、和GrCLA1q2_F5’-GGCCGGATTCACGAAACGGT-3’(SEQ ID NO:9)、GrCLA1q2_R5’-CGTCGAGATTGGCAGTTGGC-3’(SEQ ID NO:10)、和18s RNA_F5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’(SEQ ID NO:11)、18s RNA_R5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3(SEQ ID NO:12)，使用以下程序：(a)95℃持续5min；(b)40个循环的94℃持续30s，55℃持续30s；和72℃持续30s。18S rRNA基因用作内部对照，以将结果归一化。通过以下方式确定用负载CLA1-dsRNA的C12-200修饰的和负载CLA1-dsRNA的未修饰的PMP处理后，棉花中的CLA1敲低效率：将用C12-200修饰的PMP处理后的归一化的CLA1表达与用未修饰的PMP处理后的归一化的CLA1表达进行比较，计算ΔΔCt值。
另外地，通过表型光漂白分析检查了CLA1 dsRNA的基因沉默效率。对已处理和未处理的棉花植物的叶进行拍照，并使用ImageJ软件确定基因沉默百分比，该百分比由叶上的白色光漂白相对于对照叶的绿色来反映。测定了每株植物的三片叶以定量光漂白的效果，并评价了C12-200修饰的相对于未修饰的负载CLA1-dsRNA的PMP的基因沉默效率。
与未修饰的PMP相比，植物细胞更有效地摄取C12-200修饰的PMP，并诱导更多的CLA1基因沉默。
实例12：通过用阳离子脂质配制PMP来增加PMP细胞摄取
此实例描述了通过用阳离子脂质修饰PMP以促进细胞壁和/或细胞膜的渗透来增加动物、植物、真菌或细菌细胞对PMP的细胞摄取。在此实例中，葡萄柚PMP用作模型PMP，棉花用作模型植物，酿酒酵母用作模型酵母，MDA-MB-231用作模型人细胞系，核盘菌用作模型真菌，以及丁香假单胞菌用作模型细菌。
实验方案：
a)用阳离子脂质修饰PMP
如实例1和实例2所描述的分离葡萄柚PMP的浓缩溶液。通过在0.001％、0.01％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％w/v的阳离子脂质(阿文蒂极性脂质公司)的溶液中进行剧烈混合来重悬PMP。假设从悬浮液中100％回收，并且将配制前的浓度乘以体积比，从而确定PMP的浓度。如实施例3和实施例4所描述的评价阳离子脂质修饰的PMP特征和稳定性。
b)通过用负载GFP蛋白的阳离子脂质修饰的葡萄柚PMP来增加酿酒酵母的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP，并如实例5所描述的向其负载GFP蛋白。将一些PMP留作对照，并且如实例12b所描述，将其余的用阳离子脂质进行修饰。通过蛋白质印迹或荧光测量PMP的GFP包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在PKH26标记试剂盒的1mL稀C中的50mg PMP与2ml的1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。通过实例2中描述的方法将所有未标记的染料洗掉，并且将标记的PMP沉淀物重悬于PBS中。为了确定负载GFP的PKH26标记的PMP相对于负载GFP的阳离子脂质修饰的PKH26标记的PMP的PMP摄取效率，对酿酒酵母真菌细胞进行了处理。
酿酒酵母获自ATCC(#9763)，并且如制造商所指示，在酵母提取物蛋白胨右旋糖肉汤(YPD)中维持在30℃。为了确定酿酒酵母的PMP摄取，使酵母细胞在选择培养基中生长到0.4-0.6的OD600，并且与0(阴性对照)、1、10、或50、100、和250μg/ml的PKH26标记的负载GFP的修饰的PMP、或未修饰的PMP直接在载玻片上一起孵育。除了PBS对照外，还将酿酒酵母细胞在PKH26染料(最终浓度5μg/ml)的存在下孵育。在室温下孵育5min、30min和1h后，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。与PKH26染料对细胞膜的专门染色相比，当在细胞质中观察到红膜和绿色负载GFP的PMP时或如果酵母细胞的细胞质变红和/或绿时，则酵母细胞吸收了PMP。为了评价与未修饰的负载GFP的PMP相比，负载GFP的阳离子脂质修饰的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质/在细胞质中的绿色PMP的酵母细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将负载GFP的阳离子脂质修饰的PMP与未修饰的负载GFP的PMP的摄取效率进行比较。
c)通过用负载GFP蛋白的阳离子脂质修饰的葡萄柚PMP来增加核盘菌的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP，并如实例5所描述的向其负载GFP蛋白。将一些PMP留作对照，并且如实例6b所描述，将其余的用阳离子脂质进行修饰。通过蛋白质印迹或荧光测量PMP的GFP包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在1mL稀C中的50mg PMP与2mL的1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。通过实例2中描述的方法将所有未标记的染料洗掉，并且将标记的PMP沉淀物重悬于PBS中。为了确定负载GFP的PKH26标记的PMP相对于负载GFP的阳离子脂质修饰的PKH26标记的PMP的PMP摄取效率，对核盘菌真菌细胞进行了处理。
为了确定核盘菌(ATCC，#18687)子囊孢子的PMP摄取，将10,000个子囊孢子与0(阴性对照)、1、10、或50、100和250μg/mL的PKH26标记的负载GFP的修饰的PMP、或未修饰的PMP直接在载玻片上一起孵育。除了PBS对照外，还将核盘菌细胞在PKH26染料(最终浓度5μg/ml)的存在下孵育。在室温下孵育5min、30min和1h后，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。与PKH26染料对细胞膜的专门染色相比，当在细胞质中观察到红膜和绿色负载GFP的PMP时或如果酵母细胞的细胞质变红和/或绿时，则酵母细胞吸收了PMP。为了评价与未修饰的负载GFP的PMP相比，负载GFP的阳离子脂质修饰的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质/在细胞质中的绿色PMP的核盘菌细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将负载GFP的阳离子脂质修饰的PMP与未修饰的负载GFP的PMP的摄取效率进行比较。
d)通过用负载钙黄绿素AM的阳离子脂质修饰的葡萄柚PMP来增加MDA-MB-231细胞增加PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP。将一些PMP留作对照，并且如实例6b所描述，将其余的用阳离子脂质进行修饰。如实例5和Gray等人,MethodsX[方法X]2015所描述，向修饰的和未修饰的PMP负载钙黄绿素AM(西格玛奥德里奇公司)。钙黄绿素AM仅在被PMP包封时才呈荧光，并且通过荧光来测量包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在1mL稀C中的50mg负载钙黄绿素AM的PMP与2ml的1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。如实例2所描述，将所有未标记的染料洗掉，并使用100kDa Amicon过滤器浓缩PMP。为了确定负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP相对于负载钙黄绿素AM的PKH26标记的阳离子脂质修饰的PMP的PMP摄取效率，对人乳腺癌细胞进行了处理。
MDA-MB-231乳腺癌细胞系获得自ATCC(HTB-26)，并根据供应商的说明生长和维持。收获在70％-80％汇合时的细胞，计数并以200μl细胞培养基中每孔10,000个细胞的接种密度接种到96孔培养处理的孔板中。允许细胞粘附3小时，然后除去培养基，用达尔伯克氏(Dulbecco)PBS洗涤细胞一次，并将不含FCS的培养基添加至血清(处理前使细胞饥饿3小时)。为了确定乳腺癌细胞的PMP摄取，将细胞与0(阴性对照)、1、10或50、100和250μg/ml的PKH26标记的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的未修饰的和阳离子脂质修饰的PMP直接在孔中一起孵育。除了PBS对照外，还将细胞在钙黄绿素AM(最终浓度5μg/ml)、PKH26染料(最终浓度5μg/ml)、和未修饰的PMP的存在下孵育。在37C孵育30min、1h、2h和4h后，将细胞用PBS洗涤4x 10’，以除去培养基中的PMP。接下来，在高分辨率荧光显微镜(EVOS2FL)上以40x获取图像，以确定摄取效率。与PKH26染料对细胞膜的专门染色相比，当在细胞质中观察到红膜和绿色负载钙黄绿素AM的PMP时或如果细胞的细胞质变红和/或绿时，则乳腺癌细胞吸收了PMP。为了评价与未修饰的负载钙黄绿素AM的PMP相比，负载钙黄绿素AM的阳离子脂质修饰的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质/在细胞质中的绿色PMP的细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将负载GFP的阳离子脂质修饰的PMP与未修饰的负载GFP的PMP的摄取效率进行比较。
e)通过用负载钙黄绿素AM的阳离子脂质修饰的葡萄柚PMP来增加丁香假单胞菌的PMP摄取
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP。将一些PMP留作对照，并且如实例12b所描述，将其余的用阳离子脂质进行修饰。如实例5和Gray等人,MethodsX[方法X]2015所描述，向修饰的和未修饰的PMP负载钙黄绿素AM(西格玛奥德里奇公司)。钙黄绿素AM仅在被PMP包封时才呈荧光，并且通过荧光来测量包封。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将所有PMP配制品用红色PKH26(西格玛公司(Sigma))亲脂性膜染料进行标记。简而言之，将在PKH26标记试剂盒的1mL稀C中的50mg负载钙黄绿素AM的PMP与2ml的1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL的1％BSA停止标记。如实例2所描述，将所有未标记的染料洗掉，并使用100kDa Amicon过滤器浓缩PMP。为了确定负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP相对于负载钙黄绿素AM的PKH26标记的阳离子脂质修饰的PMP的PMP摄取效率，对丁香假单胞菌细菌细胞进行了处理。
从ATCC(BAA-871)获得丁香假单胞菌细菌，并且根据制造商的说明在金氏培养基(King’s Medium)B琼脂上生长。为了确定丁香假单胞菌的PMP摄取，将1ml过夜细菌悬浮液的10ul与0(阴性对照)、1、10、或50、100、和250μg/ml的PKH26标记的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的未修饰的和阳离子脂质修饰的PMP直接在载玻片上一起孵育。除了水对照外，还将丁香假单胞菌细菌在钙黄绿素AM(最终浓度5μg/ml)、PKH26染料(最终浓度5μg/ml)、和未修饰的PMP的存在下孵育。在室温下孵育5min、30min和1h后，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。为了评价与未修饰的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP相比，负载钙黄绿素AM的PKH26标记的阳离子脂质修饰的PMP的摄取效率，在PMP处理的细胞与PBS和仅PKH26染料染色的对照之间比较具有绿色细胞质或在细胞质中的绿色和红色PMP的细菌细胞相对于与仅膜染色的百分比。通过使用ImageJ软件测量来自细胞的中值红色和绿色荧光信号，以定量每个细胞中的摄取量，并将负载钙黄绿素AM的PKH26标记的阳离子脂质修饰的PMP与未修饰的负载钙黄绿素AM的PKH26标记的PMP的摄取效率进行比较。与未修饰的PMP相比，PMP的阳离子脂质修饰有效地改善了细胞摄取。
f)棉花植物中负载靶向CLA1的dsRNA的、阳离子脂质修饰的葡萄柚PMP对PMP的摄取增加
为了证明阳离子脂质修饰的PMP增加细胞摄取，向葡萄柚PMP负载人工miRNA(amiRNA，使用植物小RNA标记位点(P-SAMS；Fahlgren等人,Bioinformatics.[生物信息学]32(1):157-158,2016)设计)或靶向棉花光合作用基因GrCLA1(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶)的定制dicer底物siRNA(DsiRNA，由IDT设计)。GrCLA1是拟南芥Cloroplastosalterados 1基因(AtCLA1)(其功能丧失导致真叶上的白化表型，为沉默效率提供了可视标记物)的同源基因。寡核苷酸获得自IDT。
如实例1和实例2所描述的由葡萄柚产生PMP。为了确定阳离子脂质修饰的PMP相对于未修饰的PMP的PMP摄取效率，如实施例5所描述，向葡萄柚PMP负载GrCLA1-amiRNA或GrCLA1-DsiRNA双链体(表12)。使用Quant-It RiboGreen RNA测定试剂盒或使用标记amiRNA或DsiRNA(IDT)的对照荧光染料来测量PMP的amiRNA或DsiRNA包封。接下来，将负载的PMP的一部分留作对照，并且如实例12b所描述，将其余的用阳离子脂质进行修饰。为了确定负载CLA1-amiRNA/DsiRNA的PMP相对于负载CLA1-amiRNA/DsiRNA的阳离子脂质修饰的PMP的PMP摄取效率，对棉花幼苗进行处理并进行CLA1基因沉默分析。将负载amiRNA或DsiRNA(统称为dsRNA)的PMP在水中配制为递送在无菌水中0、1、5、10和20ng/μl的有效dsRNA剂量的等效物的浓度。
棉花种子(陆地棉和雷蒙德氏棉)通过美国国家植物种质系统获得。将灭菌的种子包裹在湿润的脱脂棉中，放置在培养皿中，并置于25℃、150μE m-2S-1光强度的生长室中，在14小时光照/10小时黑暗光周期下持续3天以萌发。在具有26℃/20℃日/夜温度的长日条件(16/8h光/黑暗的光周期)下，幼苗在具有荷格伦特(Hoagland)营养液(西格玛奥德里奇公司)的无菌培养容器中生长。4天后，将子叶完全展开(在第一片真叶出现之前)的幼苗用于PMP处理。
将七日龄的棉花幼苗转移到含有1x MS维生素(西格玛奥德里奇公司)pH5.6-5.8、含0.8％(w/v)琼脂糖的0.5x MS(Murashige and Skoog)矿物盐(西格玛奥德里奇公司)上，并通过将整个幼苗用有效剂量为0(ddH2O)、1、5、10和20ng/μl负载GrCLA1 dsRNA的阳离子脂质修饰的PMP，以及0(ddH2O)、1、5、10和20ng/μl负载GrCLA1 dsRNA的未修饰的PMP以3株植物/组、1ml溶液/株植物进行喷雾来处理。可替代地，在进行PMP处理之前，用25G的针将棉花植物子叶的下侧打孔而不刺穿子叶。使用1mL无针注射器将PMP溶液从子叶的下侧通过伤口部位手动渗透。将植物转移到生长室中，并在具有光强度为90μmol m-2s-1和26℃/20℃日/夜温度的长日条件(16h/8h光/黑暗的光周期)下保持。
2、5、8和14天后，使用定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)通过内源性CLA1mRNA的表达水平检查CLA1 dsRNA的基因沉默效率。根据制造商的说明(英杰公司(Invitrogen))，使用Trizol试剂从100mg新鲜棉花叶中提取总RNA，并用无RNA酶的DNA酶I(普洛麦格公司(Promega))广泛地处理。用SuperScriptTM第一链合成系统(英杰公司)从2μg总RNA合成第一链cDNA。为了评估CLA1转录物的水平，使用SYBR Green Real-Time PCRMaster Mix(赛默科技公司(Thermo Scientific))进行qRT-PCR，其中使用引物：GrCLA1q1_F5’-CCAGGTGGGGCTTATGCATC-3’(SEQ ID NO:7)、GrCLA1q1_R5’-CCACACCAAGGCTTGAACCC-3’(SEQ ID NO:8)、和GrCLA1q2_F5’-GGCCGGATTCACGAAACGGT-3’(SEQ ID NO:9)、GrCLA1q2_R5’-CGTCGAGATTGGCAGTTGGC-3’(SEQ ID NO:10)、和18s RNA_F5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’(SEQ ID NO:11)、18s RNA_R5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3(SEQ ID NO:12)，使用以下程序：(a)95℃持续5min；(b)40个循环的94℃持续30s，55℃持续30s；和72℃持续30s。18S rRNA基因用作内部对照，以将结果归一化。通过以下方式确定用负载CLA1-dsRNA的阳离子脂质修饰的和负载CLA1-dsRNA的未修饰的PMP处理后，棉花中的CLA1敲低效率：将用阳离子脂质修饰的PMP处理后的归一化的CLA1表达与用未修饰的PMP处理后的归一化的CLA1表达进行比较，计算ΔΔCt值。
另外地，通过表型光漂白分析检查了CLA1 dsRNA的基因沉默效率。对已处理和未处理的棉花植物的叶进行拍照，并使用ImageJ软件确定基因沉默百分比，该百分比由叶上的白色光漂白相对于对照叶的绿色来反映。测定了每株植物的三片叶以定量光漂白的效果，并评价了阳离子脂质修饰的相对于未修饰的负载CLA1-dsRNA的PMP的基因沉默效率。
与未修饰的PMP相比，植物细胞更有效地摄取阳离子脂质修饰的PMP，并诱导更多的CLA1基因沉默。
实例13：使用阳离子脂质修饰PMP
此实例证实了用阳离子脂质修饰PMP在人和植物细胞中具有修饰表面电荷、增加了货物负载容量以及增加PMP的细胞摄取的能力。在此实例中，DOTAP(1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷)和DC-胆固醇(3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基]胆固醇)用作模型阳离子脂质，葡萄柚和柠檬PMP用作模型PMP，siRNA/反式激活CRISPR RNA(TracrRNA)用作模型负电荷有效负载，COLO679用作模型人细胞系，以及黑墨西哥甜(BMS)玉米用作模型植物细胞系。
实验方案：
a)柠檬/葡萄柚PMP的生产
红色有机葡萄柚或黄色有机柠檬是从当地杂货店获得的。用榨汁机收集六升葡萄柚汁，用NaOH将pH调节至pH 4，与1U/mL果胶酶(西格玛公司，17389)一起孵育以除去果胶污染物，并且随后以3,000g离心20分钟，然后以10,000g离心40分钟以除去大碎片。接下来，在30分钟内将经加工的汁与500mM EDTA(pH 8.6)一起孵育至最终浓度为50mM EDTA(pH7.7)，以螯合钙并且防止果胶大分子的形成。随后，使EDTA处理的汁通过11μm、1μm和0.45μm过滤器，以除去大颗粒。将过滤的汁洗涤，并且使用300kDa TFF通过切向流过滤(TFF)进行浓缩。将汁浓缩10x，然后渗滤到10个透析体积(diavolume)的PBS中，并且进一步浓缩至最终浓度为120mL(50x)。接下来，我们使用尺寸排阻色谱法(SEC)洗脱含有PMP的级分，通过在280处的吸光度
Figure BDA0002947982740002461
和蛋白质浓度(PierceTM BCA蛋白质测定)分析这些级分，以验证含有PMP的级分和含有污染物的晚期级分。SEC级分3-7含有纯化的PMP(级分9-12含有污染物)，并且将这些级分合并在一起，使用0.8μm、0.45μm和0.22μm注射器式过滤器进行顺序过滤从而过滤灭菌，并且进一步通过以40,000x g沉淀PMP 1.5h进行浓缩，并且将沉淀物重悬于4mL UltraPureTM不含DNA酶/RNA酶的蒸馏水(赛默飞世尔公司，10977023)中。使用由制造商提供的浓度和尺寸标准通过NanoFCM来确定最终PMP浓度(7.56x 1012PMP/mL)和PMP尺寸(70.3nm+/-12.4nm SD)。如下所述，使用Bligh-Dyer法将产生的葡萄柚(GF)或柠檬(LM)PMP用于脂质提取。
b)使用阳离子脂质修饰PMP
为了制备脂质重构的PMP(LPMP)，使用Bligh-Dyer法(Bligh和Dyer,J BiolchemPhysiol[生物化学生理学杂志],37:911-917,1959)从葡萄柚或柠檬PMP的浓缩溶液中进行总脂质提取。简而言之，将1mL浓缩的PMP(1012-1013PMP/mL)与3.5mL氯仿:甲醇混合物(1:2，v/v)混合并充分涡旋。然后添加1.25mL氯仿并涡旋，然后与1.25mL无菌水搅拌。最后，将混合物在RT下以300g离心5分钟。回收含有脂质的底部有机相，并使用
Figure BDA0002947982740002471
系统
Figure BDA0002947982740002472
进行干燥。为修饰天然LPMP的脂质组合物，将合成的阳离子脂质(DOTAP，DC-胆固醇)溶解于氯仿:甲醇(9:1)中并添加到PMP提取的脂质中，以达到总脂质的25％或40％(w/w)，然后剧烈混合。通过用惰性气体流(例如氮气)蒸发溶剂或使用
Figure BDA0002947982740002473
系统蒸发来制备干燥的脂质膜(图1)。为了从提取的脂质制备重构的PMP，将水或缓冲液(例如PBS)添加到干燥的脂质膜中，并在RT下放置1h以水合。对形成的脂质颗粒进行10次冻融循环或超声处理(Branson 2800超声处理浴，10min，RT)。然后，为了减少脂质双层的数量和总体粒度，使用Mini Extruder(
Figure BDA0002947982740002474
极性脂质公司)将脂质PMP通过0.8μm、0.4μm和0.2μm聚碳酸酯过滤器挤出(图1)。如果需要浓缩的LPMP，则将样品在4℃下以100,000x g超速离心30分钟来进行浓缩。将最终沉淀物重悬于无菌超纯水或PBS中，并且保持在4℃直到进一步使用。使用由制造商提供的浓度和尺寸标准，通过NanoFCM来确定最终LPMP浓度和中值LPMP尺寸(范围从89-104nm)。使用Zetasizer(马尔文帕纳科公司(Malvern Panalytical))，通过动态光散射测量表面电荷(ζ电位)(图4A)。LM LPMP的LPMP尺寸和浓度的范围为83±19nm和1.7x 1012LPMP/mL，DOTAP修饰的LPMP为106±25nm和6.54x 1010LPMP/mL，并且DC-胆固醇修饰的PMP为91±17nm和3.08x 1011LPMP/mL(图2)。阳离子脂质DOTAP和DC-胆固醇对LPMP的修饰改变了LPMP的表面电荷：随着阳离子脂质含量的增加，LPMP的表面电荷增加(图4A)。从提取的柠檬脂质重构的LPMP的低温EM(Cryo-EM)图像的分析证实了LPMP的球形度和粒度分布(68.7±23nm(SD))(图3A和3B)。
c)向阳离子脂质修饰的PMP负载带负电荷的货物
为了负载siRNA/TracrRNA，向GF或LM提取的脂质补充阳离子脂质，并如上所述进行干燥。将溶解于无核酸酶的水或Duplex Buffer
Figure BDA0002947982740002475
中的siRNA/TracrRNA以1.5nmol/1mg的PMP脂质添加到干燥的脂质膜中，并在RT下放置1h以水合。对形成的脂质颗粒进行10次冻融循环，并使用Mini Extruder(
Figure BDA0002947982740002476
极性脂质公司)通过0.8μm、0.4μm和0.2μm聚碳酸酯过滤器挤出(图1)。将负载的PMP在具有100kDa MWCO膜的透析装置
Figure BDA0002947982740002481
中经PBS透析过夜，并且然后使用0.2μm聚醚砜(PES)过滤器灭菌。另外地，将样品纯化并使用超速离心浓缩。将负载的PMP在4℃下以100,000x g离心30min，除去上清液，并将沉淀物重悬于1mL PBS中，并以100,000x g浓缩30min。将所得沉淀物重悬于PBS(用于通过人细胞进行细胞摄取)或水(用于通过植物细胞进行细胞摄取)中。通过NanoFCM评价负载RNA的LPMP的尺寸和颗粒数：未修饰的LPMP的平均尺寸和颗粒浓度为89±15nm和1.54x 1012LPMP/mL，DC-Chol为104±25nm和2.54x 1011LPMPs/mL，以及DOTAP为100±30nm和9.7x 1011LPMP/mL。通过Quant-iTTM RiboGreenTM测定或通过测量标记的货物(用Alexa Fluor 555标记的siRNA或用ATTO 550标记的TracrRNA)的荧光强度来确定RNA负载。根据制造商的方案，在肝素(5mg/mL)和1％Triton-X100的存在下进行RiboGreenTM测定，以裂解PMP并释放包封的货物。与不含阳离子脂质的LPMP相比，用阳离子脂质DOTAP和DC-胆固醇修饰LPMP改变了LPMP的表面电荷并增加了带负电荷的货物(例如RNA)的负载(图4A-4D)。
d)增加人细胞(COLO679)对DOTAP修饰的PMP的摄取
如上所述制备来自补充有DOTAP(20％，w/w)的葡萄柚的脂质修饰的PMP(LPMP)。接下来，根据制造商的方案(具有一些修改)，将PMP配制品用绿色PKH67亲脂性膜染料(西格玛公司)进行标记。简而言之，将300μL的LPMP(约1x 1012PMP/mL)与稀释剂C以1:1混合，然后与在稀释剂C中稀释的PKH67染料混合(染料:样品的最终比率为1:500，v/v)，并以100rpm在摇动下在RT孵育1h。通过在用PBS平衡的ZebaTM旋转脱盐柱(40kDa MWCO，赛默飞世尔科技公司)上纯化LPMP来除去游离染料。使用0.2μm无菌过滤器对标记的LPMP进行灭菌，通过超速离心(30min，100,000g，4℃)进行浓缩，并重悬于无菌PBS中。通过NanoFCM确定最终LPMP浓度和平均尺寸(LPMP为1.1x 1012LPMP/mL和83±19nm；DOTAP为8.95x 1011和100±30nm)。使用分光光度计
Figure BDA0002947982740002482
在Ex/Em＝485/510nm处确定荧光强度。使用相同的方法纯化相同浓度(1:500，v/v)的游离PKH67染料。
将COLO679细胞在具有10％热灭活的FBS(吉博科公司(Gibco))和1％青霉素-链霉素(吉博科公司)的RPMI 1640培养基(赛默飞世尔科技公司)中培养。实验前一天，将细胞以6000个细胞/孔接种到96孔板中。为了确定PKH67标记的LPMP的摄取，将COLO679细胞与LPMP以2x 1010颗粒/孔的浓度在37℃下孵育3h。使用游离PKH67染料作为对照。在孵育时间结束时，将细胞用冰冷的PBS 1x洗涤两次，并用100μL的PBS中的4％甲醛固定15-30min。将细胞核用DAPI(赛默飞世尔科技公司)进行染色。使用具有40x物镜的荧光显微镜(OlympusIX83)获取图像。与不含阳离子脂质的LPMP相比，用DOTAP修饰增加了LPMP与COLO679细胞的摄取/缔合(图5)。我们的数据表明，与不含另外的阳离子脂质的LPMP相比，DOTAP修饰的LPMP增强了媒介物与COLO679细胞的摄取和/或缔合。
e)DC-胆固醇修饰的PMP增加了RNA向植物细胞的递送
黑墨西哥甜(BMS)玉米细胞购自拟南芥生物资源中心(Arabidopsis BiologicalResource Center，ABRC)。使BMS细胞在含有4.3g/L Murashige和Skoog基础盐混合物(西格玛公司M5524)、2％蔗糖(S0389，密理博西格玛公司(Millipore Sigma))、2mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸(D7299，密理博西格玛公司)、250μg/L硫胺素HCL(V-014，密理博西格玛公司)和1x MS维生素混合ddH2O溶液的Murashige和Skoog基础培养基(pH 5.8)中生长。1x维生素混合溶液含有最终浓度分别是1.3mg/L、250μg/L、250μg/L、130mg/L和200mg/L的烟酸(N0761-100G，密理博西格玛公司)、比哆醇盐酸盐(Pyroxidine hydrochloride)(P6280-25G，密理博西格玛公司)、D-泛酸半钙盐(P5155-100G，密理博西格玛公司)、L-天冬酰胺(A4159-25G，密理博西格玛公司)和肌醇(I7508-100G，密理博西格玛公司)。在黑暗条件在24℃下，在搅拌(110rpm)下，细胞生长在1L通气的锥形无菌烧瓶中。
对于BMS细胞处理，取10mL细胞悬浮液以确定细胞压积(PCV)百分比。PCV定义为细胞体积除以细胞培养物等分试样的总体积，并且表示为百分比。将细胞以3900rpm离心5min，并且确定细胞沉淀物的体积。BMS的PCV％为20％。对于摄取实验，通过将细胞稀释在如上所述的培养基中，将培养物的PCV％调节至4％。向LPMP和用DC-胆固醇修饰的LPMP负载如上所述的用ATTO 550标记的TracrRNA，灭菌，并重悬在无菌水中。通过NanoFCM分析了颗粒的平均尺寸和浓度，并且对于DC-Chol为104±25nm和2.54x 1011LPMP/mL，并且对于未修饰的LPMP为89±15nm和1.54x 1012LPMP/mL。通过Quant-iTTM
Figure BDA0002947982740002501
定量样品中TracrRNA ATTO 550(IDT)的量。将50μL的LPMP和用含有433ng TracrRNA的DC-胆固醇修饰的LPMP一式两份地添加至24孔板中450μL植物细胞悬浮液的等分试样中。向细胞中添加50μl的超纯无菌水，并用作阴性对照。将细胞在黑暗中在24℃下孵育3小时，并用1mL超纯无菌水洗涤三次，以除去未被细胞吸收的颗粒。将细胞重悬于500μL的超纯无菌水中，用于在辐射荧光显微镜(Olympus IX83)上成像。与没有可检测荧光的阴性对照(超纯无菌水)相比，在用LPMP和DC-胆固醇修饰的LPMP处理的植物细胞中可以检测到可变的荧光信号(图6)。用DC-胆固醇修饰的LPMP显示最强的荧光信号，表明此PMP修饰向植物细胞递送的TracrRNA最多。我们的数据显示，用阳离子脂质DC-胆固醇修饰LPMP改善了植物细胞在体外对柠檬LPMP的摄取。
实例14：使用可离子化的脂质修饰PMP
此实例证实了用可离子化的脂质修饰PMP具有以pH依赖性方式修饰表面电荷、增加货物负载容量和植物细胞对PMP的细胞摄取的能力。在此实例中，C12-200(1,1‘-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)
(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇))和MC3((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯，DLin-MC3-DMA)用作模型可离子化的脂质，柠檬PMP用作模型PMP，以及反式激活CRISPR RNA(TracrRNA)、单指导RNA(gRNA)用作模型负电荷有效负载。黑墨西哥甜(BMS)玉米细胞用作模型植物细胞系。
a)使用可离子化的脂质修饰PMP
为了制备脂质修饰的PMP(LPMP)，使用Bligh-Dyer法(Bligh和Dyer,1959,JBiolchem Physiol[生物化学生理学杂志]37:911-917)从柠檬PMP的浓缩溶液中提取脂质，如实施例13所描述进行分离。将可离子化的脂质添加到氯仿:甲醇(9:1)中PMP提取的脂质储备溶液中，以达到总脂质的25％或40％(w/w)，并通过剧烈混合重悬脂质。如实施例13所描述的制备干燥的脂质膜和从提取的脂质重构PMP。通过NanoFCM评价LPMP的尺寸和颗粒数。LM LPMP的LPMP尺寸和浓度的范围为83±19nm和1.7x 1012LPMP/mL，MC3修饰的LPMP为88±22nm和1.35x 1012LPMP/mL，并且C12-200修饰的PMP为86±16nm和1.19x 1012LPMP/mL(图7)。使用Zetasizer(马尔文帕纳科公司)，通过动态光散射测量表面电荷(ζ电位)。用可离子化的脂质C12-200和MC3修饰脂质重构的PMP可以使LPMP的表面电荷具有pH-依赖性变化：随着pH的降低，LPMP的表面电荷增加(图8A)。
b)向可离子化的脂质修饰的PMP负载带负电荷的货物
将溶解于无核酸酶的水或Duplex Buffer
Figure BDA0002947982740002511
中的TracrRNA/gRNA以1.5nmol/1mg的PMP脂质添加到干燥的脂质膜中，并在RT下放置1h以水合。使用0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 3.2，泰克诺瓦公司(Teknova))将重悬的脂质溶液的pH调节至4.5，以促进RNA捕获(entrapment)。然后对脂质溶液进行5次冻融循环。随后，使用0.1M碳酸氢盐缓冲液(pH10)将脂质溶液的pH升至pH 9，然后对脂质再进行5次冻融循环。将形成的脂质颗粒使用Mini Extruder(
Figure BDA0002947982740002512
极性脂质公司)通过0.8μm、0.4μm，和0.2μm聚碳酸酯过滤器挤出。将负载的PMP在具有100kDa MWCO膜的透析装置
Figure BDA0002947982740002513
中经PBS透析过夜，并且然后使用0.2μm聚醚砜(PES)过滤器灭菌。另外地，将样品纯化并使用超速离心浓缩。将负载的PMP在4℃下以100,000x g离心30min，除去上清液，并将沉淀物重悬于1mL PBS中，并以100,000x g浓缩30min。将所得沉淀物重悬于水中(用于通过植物细胞进行细胞摄取)。通过NanoFCM评价负载RNA的LPMP的尺寸和颗粒数。未修饰的LPMP的平均尺寸和颗粒浓度为89±15nm和1.54x 1012LPMP/mL；C12-200修饰的LPMP为87±16nm和7.15x 1011LPMP/mL；并且MC3修饰的LPMP为93±27nm和2.4x1011LPMP/mL。通过RiboGreenTM测定或通过测量标记货物的荧光强度(TracrRNA ATTO 550)来确定RNA负载。根据制造商的方案，在肝素(5mg/mL)和1％Triton-X100的存在下进行RiboGreenTM测定，以裂解PMP并释放包封的货物。与不含可离子化的脂质的LPMP相比，用可离子化的脂质MC3和C12-200修饰脂质重构的PMP可使LPMP表面电荷具有pH-依赖性变化，并增加酸性pH中带负电荷的货物(例如RNA)的负载(图8B和8C)。
c)增加植物细胞(BMS)对C12-200修饰的PMP的摄取
如实例13(e)所描述的培养黑墨西哥甜(BMS)玉米细胞。对于BMS细胞处理，取10mL细胞悬浮液以确定细胞压积(PCV)百分比。PCV定义为细胞体积除以细胞培养物等分试样的总体积，并且表示为百分比。将细胞以3900rpm离心5min，并且确定细胞沉淀物的体积。BMS的PCV％为20％。对于摄取实验，通过将细胞稀释在如上所述的培养基中，将培养物的PCV％调节至4％。向LPMP和用C12-200修饰的LPMP负载如上所述的TracrRNA ATTO 550，灭菌，并重悬在无菌水中。通过NanoFCM分析颗粒的平均尺寸和浓度，对于C12-200-LPMP为87±16nm和7.15x1011LPMP/mL，并且对于未修饰的LPMP为89±15nm和7.15E x 1012LPMP/mL。通过Quant-iTTM RiboGreenTM定量样品中TracrRNA ATTO 550(IDT)的量。将50μL的LPMP或用含有433ng TracrRNA的C12-200修饰的LPMP一式两份地添加至24孔板中450μL植物细胞悬浮液的等分试样中。向细胞中添加50μl的超纯无菌水，并用作阴性对照。将细胞在黑暗中在24℃下孵育3小时，并用1mL超纯无菌水洗涤三次，以除去未被细胞吸收的颗粒。将细胞重悬于500μL的超纯无菌水中，用于在辐射荧光显微镜(Olympus IX83)上成像。与没有可检测荧光的阴性对照(超纯无菌水)相比，在用LPMP和C12-200修饰的LPMP处理的植物细胞中可以检测到可变的荧光信号(图9)。用C12-200修饰的LPMP显示最强的荧光信号，表明此PMP修饰具有最高的TracrRNA与植物细胞的递送/缔合。我们的数据显示，用C12-200可离子化的脂质修饰LPMP改善了植物细胞在体外对柠檬LPMP的摄取。
实例15：用细胞壁渗透蛋白纤维素酶修饰PMP
此实例证实了用纤维素酶修饰PMP以促进细胞壁组分的降解具有增加植物、真菌或细菌细胞对PMP的细胞摄取的能力。在此实例中，纤维素酶用作模型细胞壁降解酶，葡萄柚PMP用作模型PMP，并且黑墨西哥甜玉米细胞用作模型植物细胞。
实验方案：
a)纤维素酶-PEG4-叠氮化物的合成
为了追踪此酶，根据制造商的说明，将纤维素酶(西格玛奥德里奇公司)用Alexa
Figure BDA0002947982740002531
488荧光标记(赛默飞世尔科技公司)进行标记。简而言之，将20mg纤维素酶溶解于2mL的碳酸氢钠缓冲液(pH 8.3)至最终浓度为10mg/mL。将Alexa
Figure BDA0002947982740002532
488(AF488)溶解于无水DMSO(10mg/mL)中，并且将30μL的AF488添加至溶解的纤维素酶中。在室温(RT)、150rpm、黑暗中孵育1h后，将混合物在4℃保持过夜。通过用PBS平衡的PD-10脱盐柱(通用医疗(GE Healthcare))除去游离染料。根据制造商的说明，将收集到的在PBS中的AF488-标记的纤维素酶(通过BCA测定检测为0.45mg/mL)与NHS-PEG4-叠氮化物(赛默飞世尔科技公司)反应。简而言之，将NHS-PEG4-叠氮化物溶解于无水DMSO中至最终浓度为100mM，并添加到2mL的AF488-标记的纤维素酶至最终浓度为10mM。将两种溶液混合并在RT、150rpm、黑暗中孵育30min。通过添加Tris-HCl至最终浓度为100mM来终止反应。将管在4℃下放置2h以完全淬灭该反应，并且然后使用以PBS平衡的Zeba旋转脱盐柱(MWCO 7kDa)进行纯化。使用
Figure BDA0002947982740002533
Ultra 10K装置(MWCO 10kDa，4mL)浓缩AF488-标记的纤维素酶-PEG4-叠氮化物。修饰的纤维素酶的蛋白浓度为0.38mg/mL(如通过BCA测定检测的)，并且保留了32％的初始酶活性(如通过荧光纤维素酶活性测定试剂盒(艾博抗公司)检测的)。
b)用纤维素酶-PEG4-叠氮化物修饰PMP
采用几种策略用纤维素酶修饰葡萄柚PMP的表面。
修饰方案b.1
根据制造商的说明，将PMP的氨基基团与NHS-膦(赛默飞世尔科技公司)反应，然后通过膦和叠氮基团之间的无铜反应将PMP-膦与AF488-标记的纤维素酶-PEG4-叠氮化物(如实例15(a)所描述)缀合。简而言之，将NHS-膦溶解于无水DMSO至最终浓度为10mM，并添加至重悬于PBS中的PMP(8.4x 1012PMP/mL)中至最终NHS-膦浓度为1mM。将两种溶液混合并在RT、150rpm下孵育30min。通过添加Tris-HCl至最终浓度为150mM来终止反应。将管在4℃下放置2h以完全淬灭该反应，并且然后使用
Figure BDA0002947982740002541
Ultra 100K装置(MWCO 100kDa，0.5mL)然后用PBS平衡的Zeba旋转脱盐柱(MWCO 7kDa)进行纯化。然后将PMP-膦与700μL的AF488标记的纤维素酶-PEG4-叠氮化物混合并在37℃在黑暗中孵育3小时。使用
Figure BDA0002947982740002542
生物技术等级透析管300kDa MWCO(仕必纯公司(Spectrum Laboratories Inc.))在4℃下将混合物经PBS透析2天，以除去未结合的纤维素酶以及另外的化学物和副产物。透析后，使用
Figure BDA0002947982740002543
Ultra 100K装置(MWCO 100kDa)浓缩纤维素酶修饰的PMP。最终产物的蛋白质浓度为0.8mg/mL(如通过BCA测定检测的)，并且颗粒浓度为5.3x 1012PMP/mL，其中荧光门控群体为4％(如通过NanoFCM检测的)。剩余的初始酶活性为9.3％。
修饰方案b.2
根据制造商的说明，将PMP的羧基基团与NH2-DBCO(密理博西格玛公司(MilliporeSigma))反应，并且然后通过DBCO和叠氮基团之间的无铜化学反应将PMP-DBCO与AF488-标记的纤维素酶-PEG4-叠氮化物(实例15(a))缀合。首先，根据制造商的说明，使用EDC盐酸盐(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，赛默飞世尔科技公司)激活PMP的羧基基团。简而言之，将0.2mL的葡萄柚PMP(3.8x 1013PMP/mL)与1mg的新鲜溶解于乙酸盐缓冲液中的EDC(最终pH为约5-5.5)混合。将混合物在RT下孵育15min，然后与溶解的DBCO-NH2(10mM，无水DMSO)合并至最终浓度为1mM。将反应混合物在RT、150rpm下孵育30min。通过添加1M Tris-HCl至最终浓度为150mM来终止反应。将管在4℃下放置2h以完全淬灭该反应，并且然后使用
Figure BDA0002947982740002544
Ultra 100K装置(MWCO 100kDa，0.5mL)然后用PBS平衡的Zeba旋转脱盐柱(MWCO 7kDa)进行纯化。其次，将PMP-DBCO与700μL的AF488-标记的纤维素酶-PEG4-叠氮化物混合并在37℃下在黑暗中孵育3h。为除去未结合的纤维素酶和副产物，使用
Figure BDA0002947982740002545
生物技术等级透析管300kDa MWCO(仕必纯公司)在4℃下将混合物经PBS透析2天。透析后，使用
Figure BDA0002947982740002546
Ultra 100K装置(MWCO 100kDa)浓缩纤维素酶修饰的PMP。最终产物的蛋白质浓度为0.9mg/mL(如通过BCA测定检测的)，并且颗粒浓度为5.2x1012PMP/mL，其中荧光门控群体为7％(如通过NanoFCM检测的)。如通过荧光纤维素酶活性测定试剂盒(艾博抗公司)检测的，剩余的初始酶活性为8.4％。
修饰方案b.3
根据制造商的说明，将PMP的氨基基团与NHS-PEG4-DBCO(密理博西格玛公司)反应，然后通过DBCO和叠氮基团之间的无铜反应将PMP-PEG4-DBCO与AF488-标记的纤维素酶-PEG4-叠氮化物(实例15(a))缀合。简而言之，将NHS-PEG4-DBCO溶解于无水DMSO至最终浓度为10mM，并添加至重悬于PBS中的PMP(8.4x 1012PMP/mL)中至最终NHS-PEG4-DBCO浓度为1mM。将两种溶液混合并在RT、150rpm下孵育30min。通过添加1M Tris-HCl至最终浓度为150mM来终止反应。将管在4℃下放置2h以完全淬灭该反应，并且然后使用
Figure BDA0002947982740002551
Ultra100K装置(MWCO 100kDa，0.5mL)然后用PBS平衡的Zeba旋转脱盐柱(MWCO 7kDa)进行纯化。然后将PMP-PEG4-DBCO与700μL的AF488标记的纤维素酶-PEG4-叠氮化物混合并在37℃在黑暗中孵育3小时。使用
Figure BDA0002947982740002552
生物技术等级透析管300kDa MWCO(仕必纯公司)在4℃下将混合物经PBS透析2天。透析后，使用
Figure BDA0002947982740002553
Ultra 100K装置(MWCO 100kDa)浓缩纤维素酶修饰的PMP。最终产物的蛋白质浓度为1.3mg/mL(如通过BCA测定检测的)，并且颗粒浓度为2x 1012PMP/mL，其中荧光门控群体为17％(如通过NanoFCM检测的)。如通过荧光纤维素酶活性测定试剂盒(艾博抗公司)检测的，剩余的初始酶活性为17％。
c)用纤维素酶修饰PMP(c.1)
使用碳二亚胺化学法将葡萄柚PMP的羧基基团与AF488标记的纤维素酶的氨基基团反应。首先，根据制造商的说明，使用EDC盐酸盐(赛默飞世尔科技公司)激活PMP的羧基基团。简而言之，将0.2mL的葡萄柚PMP(3.8x 1013PMP/mL)与1mg的新鲜溶解于乙酸盐缓冲液中的EDC(最终pH为约5-5.5)混合并在RT下孵育15min。然后，将AF488-标记的纤维素酶与活化的PMP在RT、150rpm、黑暗下孵育2h。使用以PBS平衡的Zeba旋转脱盐柱(MWCO 7kDa)进行纯化，然后使用
Figure BDA0002947982740002554
生物技术等级透析管300kDa MWCO(仕必纯公司)在4℃下经PBS透析2天。透析后，使用
Figure BDA0002947982740002561
Ultra 100K装置(MWCO 100kDa)浓缩纤维素酶修饰的PMP。最终产物的蛋白质浓度为1.1mg/mL(如通过BCA测定检测的)，并且颗粒浓度为1.6x1012PMP/mL，其中荧光门控群体为27％(如通过NanoFCM检测的)。如通过荧光纤维素酶活性测定试剂盒(艾博抗公司)检测的，剩余的初始酶活性为9.2％。
d)用亲脂性染料标记纤维素酶修饰的PMP
用亲脂性PKH26染料(密理博西格玛公司)标记所得的AlexaFluor488标记的纤维素酶修饰的葡萄柚PMP，以进行双重标记(绿色-AF488和红色-PKH26)。将修饰的PMP(2x1012PMP/mL于PBS中)与稀释剂C(密理博西格玛公司)以1:1v/v的比率混合。将PKH26染料溶解于稀释剂C中，并以等于1:500(染料:稀释剂C，v/v)的最终比率与预稀释的PMP混合。将反应混合物在37℃下孵育30min，然后使用以PBS平衡的Zeba旋转脱盐柱(MWCO 7kDa)进行纯化以除去游离染料。然后，使用
Figure BDA0002947982740002562
Ultra 100K装置(MWCO 100kDa，10min，4,000g，3次)浓缩PKH26标记的纤维素酶修饰的PMP。使用NanoFCM分析最终的PMP(约7x 1012PMP/mL)，并基于PKH26标记的荧光强度(Ex/Em＝550/570nm)进行归一化。将与稀释剂C一起孵育并以上述相同方式纯化的游离染料用作对照。
e)用纤维素酶修饰的葡萄柚PMP来增加BMS玉米植物细胞的PMP摄取
如实例13(e)所描述的生长黑墨西哥甜(BMS)玉米细胞。对于BMS细胞处理，取10mL细胞悬浮液以确定细胞压积(PCV)百分比。将细胞以3900rpm离心5min，并且确定细胞沉淀物的体积。BMS的PCV％为20％。对于摄取实验，通过将细胞稀释在如上所述的培养基中，将培养物的PCV％调节至4％。
如实例15(b)所描述，使用不同的交联将葡萄柚PMP与AlexaFluor488-标记的纤维素酶缀合，产生纤维素酶缀合的PMP，随后对PMP脂质膜进行PKH26标记。还制备了标记有PKH26但未进行纤维素酶修饰的葡萄柚PMP(GF-PMP)的对照组。将所有样品灭菌，重悬于无菌水中，并如上所述通过NanoFCM、蛋白质测定和纤维素酶活性测定进行分析。然后，将250μL的每种纤维素酶修饰的PMP和含等量PMP(2.65x 1012PMP/mL)的GF-PMP一式两份地添加到24孔板中的250μL的BMS细胞悬浮液中。向细胞中添加250μl的超纯无菌水和游离PKH26染料标记对照，并用作阴性对照。将细胞在黑暗中在24℃下孵育30min，并用1mL超纯无菌水洗涤三次，以除去未被细胞吸收的颗粒。将细胞重悬于500μL的超纯无菌水中，用于在辐射荧光显微镜(Olympus IX83)上成像。用超纯无菌水和PKH26标记对照孵育的细胞没有可检测的荧光水平。与来自用纤维素酶修饰的PMP处理的植物细胞的荧光信号相比，来自用PKH26标记的GF-PMP孵育的细胞的荧光信号非常低/检测不到(图10)。通过NH2-DBCO(修饰方案b.2)或NHS-PEG4-DBCO(修饰方案b.3)接头用纤维素酶-叠氮化物修饰的PMP显示最强的荧光信号，表明这些纤维素酶修饰的PMP在植物细胞中具有最高的摄取。我们的数据显示，用纤维素酶修饰PMP改善了植物细胞在体外对葡萄柚PMP的摄取。
其他实施例
本发明的一些实施例在以下编号的段落内。
1.一种植物信使包(PMP)组合物，其包含相对于未修饰的PMP具有增加的细胞摄取的多个修饰的PMP。
2.如段落1所述的PMP组合物，其中该增加的细胞摄取是相对于未修饰的PMP增加至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的细胞摄取。
3.如段落1所述的PMP组合物，其中该增加的细胞摄取是相对于未修饰的PMP增加至少2x倍、4x倍、5x倍、10x倍、100x倍、或1000x倍的细胞摄取。
4.如段落1-3中任一项所述的PMP组合物，其中该细胞是植物细胞。
5.如段落1-3中任一项所述的PMP组合物，其中该细胞是细菌细胞。
6.如段落1-3中任一项所述的PMP组合物，其中该细胞是真菌细胞。
7.如段落1-6中任一项所述的PMP组合物，其中这些修饰的PMP包含细胞渗透剂。
8.如段落1-7中任一项所述的PMP组合物，其中这些修饰的PMP包含植物细胞渗透剂。
9.如段落1-7中任一项所述的PMP组合物，其中这些修饰的PMP包含细菌细胞渗透剂。
10.如段落1-7中任一项所述的PMP组合物，其中这些修饰的PMP包含真菌细胞渗透剂。
11.如段落1-10中任一项所述的PMP组合物，其中该细胞渗透剂包含酶或其功能结构域。
12.如段落11所述的PMP组合物，其中该酶是细菌酶、真菌酶、植物酶或原生动物酶。
13.如段落12所述的PMP组合物，其中该酶与能够降解细胞壁的细菌酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。
14.如段落12所述的PMP组合物，其中该酶与能够降解细胞壁的真菌酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。
15.如段落12所述的PMP组合物，其中该酶与能够降解细胞壁的植物酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。
16.如段落12所述的PMP组合物，其中该酶与能够降解细胞壁的原生动物酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。
17.如段落12所述的PMP组合物，其中该酶是纤维素酶。
18.如段落17所述的PMP组合物，其中该纤维素酶与细菌纤维素酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。
19.如段落17所述的PMP组合物，其中该纤维素酶与真菌纤维素酶的全部或部分序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。
20.如段落17所述的PMP组合物，其中该纤维素酶与原生动物纤维素酶的全部或部分具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性。
21.如段落8所述的PMP组合物，其中该细胞渗透剂包含洗涤剂。
22.如段落21所述的PMP组合物，其中该洗涤剂是皂苷。
23.如段落8所述的PMP组合物，其中该细胞渗透剂包含阳离子脂质。
24.如段落23所述的PMP组合物，其中该阳离子脂质是1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DEPC)。
25.如段落23所述的PMP组合物，其中该阳离子脂质是1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)。
26.如段落1-25中任一项所述的PMP组合物，其中该组合物在室温下稳定至少一天和/或在4℃下稳定至少一周。
27.如段落26所述的PMP组合物，其中这些PMP稳定至少24小时、48小时、7天、或30天。
28.如段落27所述的PMP组合物，其中这些PMP在至少4℃、20℃、24℃、或37℃的温度下稳定。
29.如段落1-28中任一项所述的PMP组合物，其中该组合物中的PMP的浓度有效于降低真菌的适应度。
30.如段落1-28中任一项所述的PMP组合物，其中该组合物中的PMP的浓度有效于降低细菌的适应度。
31.如段落1-28中任一项所述的PMP组合物，其中该组合物中的PMP的浓度有效于增加植物的适应度。
32.如段落1-28中任一项所述的PMP组合物，其中该组合物中的PMP的浓度有效于降低植物的适应度。
33.如段落1-32中任一项所述的PMP组合物，其中该组合物中的多个修饰的PMP的浓度是至少1、10、50、100、或250μg PMP蛋白/ml。
34.如段落1-33中任一项所述的PMP组合物，其中这些修饰的PMP包含异源功能剂。
35.如段落34所述的PMP组合物，其中这些修饰的PMP包含两个或多个不同的异源功能剂。
36.如段落34或35所述的PMP组合物，其中该异源功能剂被该多个PMP中的每一个包封。
37.如段落34或35所述的PMP组合物，其中该异源功能剂包埋在多个PMP中的每一个的表面上。
38.如段落34或35所述的PMP组合物，其中该异源功能剂与多个PMP中的每一个的表面缀合。
39.如段落34-38中任一项所述的PMP组合物，其中该异源功能剂是肥料剂。
40.如段落39所述的PMP组合物，其中该肥料剂是植物营养素。
41.如段落34-38中任一项所述的PMP组合物，其中该异源功能剂是除草剂。
42.如段落34-39和41中任一项所述的PMP组合物，其中该异源功能剂是异源多肽、异源核酸或异源小分子。
43.如段落42所述的PMP组合物，其中该异源核酸是DNA、RNA、PNA、或杂交DNA-RNA分子。
44.如段落43所述的PMP组合物，其中该RNA是信使RNA(mRNA)、指导RNA(gRNA)、或抑制性RNA。
45.如段落44所述的PMP组合物，其中该抑制性RNA是RNAi、shRNA、或miRNA。
46.如段落44或45所述的PMP组合物，其中该抑制性RNA抑制植物中的基因表达。
47.如段落44或45所述的PMP组合物，其中该抑制性RNA抑制植物共生体中的基因表达。
48.如段落42或43所述的PMP组合物，其中该核酸是mRNA、修饰的mRNA或DNA分子，其增加植物中以下的表达：酶、成孔蛋白、信号传导配体、细胞渗透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白、核糖蛋白、蛋白适配体或伴侣蛋白。
49.如段落42或43所述的PMP组合物，其中该核酸是反义RNA、siRNA、shRNA、miRNA、aiRNA、PNA、吗啉基、LNA、piRNA、核糖酶、DNAzyme、适配体、circRNA、gRNA、或DNA分子，其降低植物中以下的表达：酶、转录因子、分泌蛋白、结构因子、核糖蛋白、蛋白适配体、伴侣蛋白、受体、信号传导配体、或转运蛋白。
50.如段落42所述的PMP组合物，其中该多肽是酶、成孔蛋白、信号传导配体、细胞渗透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白、核糖蛋白、蛋白适配体、或伴侣蛋白。
51.如段落1-50中任一项所述的PMP组合物，其中该植物是农业植物或园艺植物。
52.如段落51所述的PMP组合物，其中该农业植物是大豆植物、小麦植物、或玉米植物。
53.如段落1-50中任一项所述的PMP组合物，其中该植物是杂草。
54.如段落1-53中任一项所述的PMP组合物，其中该组合物被配制用于递送至植物。
55.如段落1-54中任一项所述的PMP组合物，其中该组合物包含农业上可接受的载体。
56.如段落1-55中任一项所述的PMP组合物，其中该组合物被配制成液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体组合物。
57.一种PMP组合物，其包含具有增加的植物细胞摄取的多个修饰的PMP，其中这些PMP通过包括以下步骤的方法产生：
(a)提供来自植物或其一部分的初始样品，其中该植物或其一部分包含EV；
(b)从该初始样品中分离出粗PMP级分，其中相对于在该初始样品中的水平，该粗PMP级分具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分；
(c)纯化该粗PMP级分，从而产生多个纯PMP，其中相对于在粗EV级分中的水平，该多个纯PMP具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分；
(d)向这些纯PMP负载植物细胞渗透剂，从而产生相对于未修饰的PMP具有增加的植物细胞摄取的修饰的PMP；以及
(e)将步骤(d)的这些PMP配制用于递送至植物。
58.一种细菌，其包含如段落1-57中任一项所述的PMP组合物。
59.一种真菌，其包含如段落1-57中任一项所述的PMP组合物。
60.一种植物，其包含如段落1-57中任一项所述的PMP组合物。
61.一种将PMP组合物递送至植物的方法，该方法包括使该植物与如段落1-57中任一项所述的PMP组合物接触。
62.一种增加植物的适应度的方法，该方法包括向该植物递送有效量的如段落1-57中任一项所述的组合物，其中相对于未处理的植物，该方法增加该植物的适应度。
63.如段落61或62所述的方法，其中该PMP包含异源肥料剂。
64.如段落61-63中任一项所述的方法，其中该植物是农业植物或园艺植物。
65.如段落64所述的方法，其中该植物是大豆植物、小麦植物、或玉米植物。
66.一种降低植物的适应度的方法，该方法包括向该植物递送有效量的如段落1-57中任一项所述的组合物，其中相对于未处理的植物，该方法降低该植物的适应度。
67.如段落61或66所述的方法，其中该PMP包含异源杀有害生物剂。
68.如段落61、66、和67中任一项所述的方法，其中该植物是杂草。
69.如段落61-68中任一项所述的方法，其中将该PMP组合物递送至植物的叶、种子、根、果实、芽、花粉或花中。
70.如段落61-69中任一项所述的方法，其中将该PMP组合物以液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体的形式递送。
71.如段落1-3中任一项所述的PMP组合物，其中该细胞是哺乳动物细胞。
72.如段落1-3中任一项所述的PMP组合物，其中该细胞是人细胞。
73.一种增加哺乳动物的适应度的方法，该方法包括向该哺乳动物递送有效量的如段落1-57中任一项所述的组合物，其中相对于未处理的哺乳动物，该方法增加该哺乳动物的适应度。
74.如段落73所述的方法，其中该PMP包含异源治疗剂。
75.如段落73或74所述的方法，其中该哺乳动物是人。
76.一种PMP组合物，其包含具有增加的动物细胞摄取的多个修饰的PMP，其中这些PMP通过包括以下步骤的方法产生：
(a)提供来自植物或其一部分的初始样品，其中该植物或其一部分包含EV；
(b)从该初始样品中分离出粗PMP级分，其中相对于在该初始样品中的水平，该粗PMP级分具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分；
(c)纯化该粗PMP级分，从而产生多个纯PMP，其中相对于在粗EV级分中的水平，该多个纯PMP具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分；
(d)向这些纯PMP负载细胞渗透剂，从而产生相对于未修饰的PMP具有增加的动物细胞摄取的修饰的PMP；以及
(e)将步骤(d)的这些PMP配制用于递送至动物。
77.一种用于将植物信使包(PMP)递送至靶细胞的方法，该方法包括将包含外源性可离子化的脂质的PMP引入到该靶细胞，其中相对于未修饰的PMP，该包含外源性可离子化的脂质的PMP具有增加的靶细胞摄取。
78.如段落77所述的方法，其中该修饰的PMP包含至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或多于90％的可离子化的脂质。
79.如段落77所述的方法，其中该修饰的PMP包含至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或多于90％的源自植物细胞外囊泡(EV)的脂质。
80.如段落77所述的方法，其中该外源性可离子化的脂质是1,1‘-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)。
81.一种用于将植物信使包(PMP)递送至靶细胞的方法，该方法包括将包含外源性两性离子脂质的PMP引入到该靶细胞，其中相对于未修饰的PMP，该包含外源性两性离子脂质的PMP具有增加的靶细胞摄取。
82.如段落81所述的方法，其中该修饰的PMP包含至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或多于90％的两性离子脂质。
83.如段落81所述的方法，其中该修饰的PMP包含至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或多于90％的源自植物细胞外囊泡(EV)的脂质。
84.如段落81所述的方法，其中该外源性两性离子脂质是1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DEPC)或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)。
85.一种PMP组合物，其包含含有外源性阳离子脂质的多个修饰的PMP。
86.如段落85所述的PMP组合物，其中这些修饰的PMP中的每一个包含至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或多于90％的阳离子脂质。
87.一种PMP组合物，其包含含有外源性可离子化的脂质的多个修饰的PMP。
88.如段落87所述的PMP组合物，其中这些修饰的PMP中的每一个包含至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或多于90％的可离子化的脂质。
89.如段落87所述的PMP组合物，其中该可离子化的脂质是C12-200。
90.一种PMP组合物，其包含含有外源性两性离子脂质的多个修饰的PMP。
91.如段落90所述的PMP组合物，其中这些修饰的PMP中的每一个包含至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或多于90％的两性离子脂质。
92.如段落90所述的PMP组合物，其中该两性离子脂质是DEPC或DOPC。
93.一种PMP组合物，其包含具有增加的植物细胞摄取的多个修饰的PMP，其中这些PMP通过包括以下步骤的方法产生：
(a)提供多个纯化的PMP；
(b)加工该多个PMP以产生脂质膜；以及
(c)在外源性阳离子脂质的存在下重构该脂质膜，其中重构的PMP包含至少1％的外源性阳离子脂质，从而产生具有增加的细胞摄取的修饰的PMP。
94.一种PMP组合物，其包含具有增加的植物细胞摄取的多个修饰的PMP，其中这些PMP通过包括以下步骤的方法产生：
(a)提供多个纯化的PMP；
(b)加工该多个PMP以产生脂质膜；以及
(c)在外源性可离子化的脂质的存在下重构该脂质膜，其中重构的PMP包含至少1％的外源性可离子化的脂质，从而产生具有增加的细胞摄取的修饰的PMP。
95.一种PMP组合物，其包含具有增加的植物细胞摄取的多个修饰的PMP，其中这些PMP通过包括以下步骤的方法产生：
(a)提供多个纯化的PMP；
(b)加工该多个PMP以产生脂质膜；以及
(c)在外源性两性离子脂质的存在下重构该脂质膜，其中重构的PMP包含至少1％的外源性两性离子脂质，从而产生具有增加的细胞摄取的修饰的PMP。
尽管出于清楚理解的目的，已经通过说明和实例详细地描述了前述发明，但是描述和实例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的披露都明确地通过引用以其全文并入。
其他实施例在权利要求中。
附录
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Figure BDA0002947982740002901
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Figure BDA0002947982740002951
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Figure BDA0002947982740002991
Figure BDA0002947982740003001
Figure BDA0002947982740003011
Figure BDA0002947982740003021
序列表
<110> 旗舰创业创新六公司（Flagship Pioneering Innovations VI, LLC. ）
<120> 修饰的植物信使包及其用途
<130> 51296-005WO2
<150> US 62/722,576
<151> 2018-08-24
<160> 50
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 3
<212> DNA
<213> 酿脓链球菌
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> n是a, c, g,或t
<400> 1
ngg 3
<210> 2
<211> 6
<212> DNA
<213> 嗜热链球菌
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(2)
<223> n是a, c, g,或t
<400> 2
nnagaa 6
<210> 3
<211> 5
<212> DNA
<213> 嗜热链球菌
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> n是a, c, g,或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> n是a, c, g,或t
<400> 3
nggng 5
<210> 4
<211> 7
<212> DNA
<213> 脑膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(3)
<223> n是a, c, g,或t
<400> 4
nnngatt 7
<210> 5
<211> 3
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (3)..(3)
<223> n是a, c, g,或t
<400> 5
ttn 3
<210> 6
<211> 3
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
cta 3
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
ccaggtgggg cttatgcatc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
ccacaccaag gcttgaaccc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
ggccggattc acgaaacggt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
cgtcgagatt ggcagttggc 20
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
tctgccctat caactttcga tggta 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
aatttgcgcg cctgctgcct tcctt 25
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
uggcaacaau auuuuugucu c 21
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
gacaaaaaga uuguugccac a 21
<210> 15
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
uuaguacccu gccuuugcca u 21
<210> 16
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
ggcaaaggaa ggguacuaac a 21
<210> 17
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
uacuucgugu gacuuugcca c 21
<210> 18
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
ggcaaaguaa cacgaaguac a 21
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<212> RNA
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
uggcaacaau auuuuugucu c 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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gacaaaaaga uuguugccac a 21
<210> 21
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
ucaguacccu gccuuugcca u 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
ggcaaaggaa ggguacugac a 21
<210> 23
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
uacuucgugu gacuuugcca c 21
<210> 24
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
ggcaaaguaa cacgaaguac a 21
<210> 25
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
uuaguggcca ucaacaggcc g 21
<210> 26
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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gccuguugcu ggccacuaac a 21
<210> 27
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
uaucgauguu aguggccacc u 21
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<212> RNA
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<220>
<223> 合成构建体
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guggccacga acaucgauac a 21
<210> 29
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
uaccgguacc cguuguuuca c 21
<210> 30
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
gaaacaacug guaccgguac a 21
<210> 31
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
caguccacuu aguaucauca ucaag 25
<210> 32
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
cuugaugaug auacuaagug gacugug 27
<210> 33
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
guccacuuag uaucaucauc aagca 25
<210> 34
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
ugcuugauga ugauacuaag uggacug 27
<210> 35
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
aguccacuua guaucaucau caagc 25
<210> 36
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
gcuugaugau gauacuaagu ggacugu 27
<210> 37
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
aaucuuucau ugauuggaua gcctt 25
<210> 38
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
aaggcuaucc aaucaaugaa agauuua 27
<210> 39
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
caacaaccuu acgaguaaua ucaca 25
<210> 40
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
ugugauauua cucguaaggu uguuggg 27
<210> 41
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
caucgaugau uuaguuucua uuctc 25
<210> 42
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
gagaauagaa acuaaaucau cgauguu 27
<210> 43
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
ucgaugauuu aguuucuauu cucaa 25
<210> 44
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
uugagaauag aaacuaaauc aucgaug 27
<210> 45
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
aucgaugauu uaguuucuau ucuca 25
<210> 46
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
ugagaauaga aacuaaauca ucgaugu 27
<210> 47
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
cgaugauuua guuucuauuc ucaaa 25
<210> 48
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
uuugagaaua gaaacuaaau caucgau 27
<210> 49
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
gauaugauug uuauucuuaa ugaca 25
<210> 50
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
ugucauuaag aauaacaauc auaucag 27

Claims (14)

1.一种用于将植物信使包(PMP)递送至靶细胞的方法，该方法包括将包含外源性阳离子脂质的PMP引入该靶细胞中，其中相对于未修饰的PMP，该包含外源性阳离子脂质的PMP具有增加的靶细胞摄取。
2.如权利要求1所述的方法，其中修饰的PMP包含至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或多于90％的阳离子脂质。
3.如权利要求1所述的方法，其中修饰的PMP包含至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或多于90％的源自植物细胞外囊泡(EV)的脂质。
4.如权利要求1所述的方法，其中增加的细胞摄取是相对于未修饰的PMP增加至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的细胞摄取。
5.如权利要求1所述的方法，其中这些修饰的PMP包含异源功能剂。
6.如权利要求5所述的方法，其中该异源功能剂被多个PMP中的每一个包封。
7.如权利要求5所述的方法，其中该异源功能剂包埋在多个PMP中的每一个的表面上。
8.如权利要求5所述的方法，其中该异源功能剂与多个PMP中的每一个的表面缀合。
9.如权利要求1所述的方法，其中该细胞是植物细胞。
10.如权利要求1所述的方法，其中该细胞是细菌细胞。
11.如权利要求1所述的方法，其中该细胞是真菌细胞。
12.一种植物信使包(PMP)组合物，其包含相对于未修饰的PMP具有增加的细胞摄取的多个修饰的PMP。
13.一种PMP组合物，其包含具有增加的植物细胞摄取的多个修饰的PMP，其中这些PMP通过包括以下步骤的方法产生：
(a)提供来自植物或其一部分的初始样品，其中该植物或其一部分包含EV；
(b)从该初始样品中分离出粗PMP级分，其中相对于在该初始样品中的水平，该粗PMP级分具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分；
(c)纯化该粗PMP级分，从而产生多个纯PMP，其中相对于在粗EV级分中的水平，该多个纯PMP具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分；
(d)向这些纯PMP负载植物细胞渗透剂，从而产生相对于未修饰的PMP具有增加的植物细胞摄取的修饰的PMP；以及
(e)将步骤(d)的这些PMP配制用于递送至植物。
14.一种PMP组合物，其包含具有增加的动物细胞摄取的多个修饰的PMP，其中这些PMP通过包括以下步骤的方法产生：
(a)提供来自植物或其一部分的初始样品，其中该植物或其一部分包含EV；
(b)从该初始样品中分离出粗PMP级分，其中相对于在该初始样品中的水平，该粗PMP级分具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分；
(c)纯化该粗PMP级分，从而产生多个纯PMP，其中相对于在粗EV级分中的水平，该多个纯PMP具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分；
(d)向这些纯PMP负载细胞渗透剂，从而产生相对于未修饰的PMP具有增加的动物细胞摄取的修饰的PMP；以及
(e)将步骤(d)的这些PMP配制用于递送至动物。
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