KR20210049138A - 변형된 식물 메신저 팩 및 그의 용도 - Google Patents

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마리아 헬레나 크리스틴 반 루이젠
호크 헤이 탐
마이어 스티브 아벤다노 아마도
배리 앤드류 마틴
이그나시오 마르티네즈
피오트르 스타니슬로우 코왈스키
나탈리야 블라디미로브나 누콜로바
존 패트릭 주니어 케이시
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플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨
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Abstract

예를 들어, 다양한 농업 또는 치료 방법에 사용하기 위한, 향상된 세포 흡수(예를 들어, 동물 식물 세포 흡수, 박테리아 세포 흡수 또는 진균 세포 흡수)를 갖도록 변형된 복수의 식물 메신저 팩(예를 들어, 식물 세포외 소포(EV), 또는 그의 세그먼트, 부분 또는 추출물)을 포함하는 조성물이 본원에 개시된다.

Description

변형된 식물 메신저 팩 및 그의 용도
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2019년 8월 23일자 생성된 상기 ASCII 카피는 명칭이 51296-005WO2_Sequence_Listing_08.23.19_ST25이며, 크기가 10,171 바이트이다.
농업용제 또는 치료제의 운반은 제제가 세포 장벽을 투과함으로써 유기체 상에서 효율적으로 작용할 수 있는 정도로 제한될 수 있다. 예를 들어, 식물 세포벽, 박테리아 세포벽 또는 진균 세포벽에 의해 또는 동물 세포의 세포막 및/또는 세포외 매트릭스에 의해 형성되는 장벽은 농업 또는 치료적 응용에 유용한 제제의 세포 흡수에 난제를 제기한다. 따라서, 제제의 세포 흡수를 촉진하는 새로운 방법 및 조성물이 해당 분야에 필요하다.
향상된 세포(예를 들어, 식물 세포, 진균 세포 또는 박테리아 세포) 흡수를 갖는 변형된 식물 메신저 팩(PMP)이 본원에 개시된다. 본원에서 변형 PMP는 다양한 농업 또는 치료적 조성물 또는 방법에 유용하다.
제1 양태에서, 표적 세포로의 식물 메신저 팩(PMP)의 운반 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 외인성 양이온성 지질을 포함하는 PMP를 표적 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 외인성 양이온성 지질을 포함하는 PMP는 비변형 PMP에 비하여 증가된 표적 세포에 의한 흡수를 갖는다. 일부 구현예에서, 변형 PMP는 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 90% 초과의 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형 PMP는 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 90% 초과의 식물 세포외 소포(EV)로부터 유래된 지질을 포함한다.
일부 구현예에서, 증가된 세포 흡수는 미처리 PMP에 비하여 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%의 증가된 세포 흡수이다.
일부 구현예에서, 변형 PMP는 이종 기능성 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 기능성 제제는 복수의 PMP의 각각에 의해 캡슐화되거나; 복수의 PMP의 각각의 표면 상에 매립되거나; 복수의 PMP의 각각의 표면에 컨쥬게이트된다.
일부 구현예에서, 세포는 포유동물 세포(예를 들어, 인간 세포), 식물 세포, 박테리아 세포 또는 진균 세포이다.
또 다른 양태에서, 미변형 PMP에 비해 증가된 세포 흡수를 갖는 복수의 변형 PMP를 포함하는 PMP 조성물이 본원에 제공된다. 일부 경우에, 세포는 식물 세포이다. 일부 경우에, 세포는 진균 세포이다. 일부 경우에, 세포는 박테리아 세포이다.
일부 구현예에서, 증가된 세포 흡수는 미처리 PMP에 비하여 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%의 증가된 세포 흡수이다. 일부 구현예에서, 증가된 세포 흡수는 비변형 PMP에 비하여 적어도 2배, 4배, 5배, 10배, 100배 또는 1000배의 증가된 세포 흡수이다.
일부 구현예에서, 변형 PMP는 세포 투과제를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 투과제는 효소 또는 그의 기능성 도메인(예를 들어, 식물 세포벽 분해 도메인, 박테리아 세포벽 분해 도메인 또는 진균 세포벽 분해 도메인)이다.
일부 구현예에서, 효소는 식물 세포벽 분해 능력이 있는 박테리아 효소이다. 일부 구현예에서, 효소는 식물 세포벽 분해 능력이 있는 박테리아 효소의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 효소는 식물 세포벽 분해 능력이 있는 진균 효소이다. 일부 구현예에서, 효소는 식물 세포벽 분해 능력이 있는 진균 효소의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 효소는 식물 세포벽 분해 능력이 있는 식물 효소이다. 일부 구현예에서, 세포벽 분해 효소는 식물 세포벽 분해 능력이 있는 식물 효소의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 효소는 식물 세포벽 분해 능력이 있는 원생동물 효소이다. 일부 구현예에서, 세포벽 분해 효소는 식물 세포벽 분해 능력이 있는 원생동물 효소의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 효소는 박테리아 세포벽 분해 능력이 있는 박테리아 효소이다. 일부 구현예에서, 효소는 박테리아 세포벽 분해 능력이 있는 박테리아 효소의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 효소는 박테리아 세포벽 분해 능력이 있는 진균 효소이다. 일부 구현예에서, 효소는 박테리아 세포벽 분해 능력이 있는 진균 효소의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 효소는 박테리아 세포벽 분해 능력이 있는 식물 효소이다. 일부 구현예에서, 세포벽 분해 효소는 박테리아 세포벽 분해 능력이 있는 식물 효소의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 효소는 박테리아 세포벽 분해 능력이 있는 원생동물 효소이다. 일부 구현예에서, 세포벽 분해 효소는 박테리아 세포벽 분해 능력이 있는 원생동물 효소의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 효소는 진균 세포벽 분해 능력이 있는 박테리아 효소이다. 일부 구현예에서, 효소는 진균 세포벽 분해 능력이 있는 박테리아 효소의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 효소는 진균 세포벽 분해 능력이 있는 진균 효소이다. 일부 구현예에서, 효소는 진균 세포벽 분해 능력이 있는 진균 효소의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 효소는 진균 세포벽 분해 능력이 있는 식물 효소이다. 일부 구현예에서, 세포벽 분해 효소는 진균 세포벽 분해 능력이 있는 식물 효소의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 효소는 진균 세포벽 분해 능력이 있는 원생동물 효소이다. 일부 구현예에서, 세포벽 분해 효소는 진균 세포벽 분해 능력이 있는 원생동물 효소의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 효소는 셀룰라제이다. 일부 구현예에서, 셀룰라제는 박테리아 셀룰라제의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 셀룰라제는 진균 셀룰라제의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 셀룰라제는 원생동물 셀룰라제의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 투과제는 세제이다. 일부 구현예에서, 세제는 사포닌이다.
일부 구현예에서, 세포 투과제는 이종 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(DOPC)이다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC)이다.
일부 구현예에서, 조성물은 적어도 24시간(예를 들어, 적어도 24시간, 30시간 또는 40시간), 적어도 48시간(예를 들어, 적어도 48시간(= 2일), 3일, 4일, 5일 또는 6일), 적어도 7일(예를 들어, 적어도 7일(= 1주), 적어도 2주, 적어도 3주 또는 적어도 4주) 또는 적어도 30일(예를 들어, 적어도 30일, 적어도 60일 또는 적어도 90일) 동안 안정하다. 일부 구현예에서, 조성물은 적어도 24°C(예를 들어, 적어도 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 37°C, 42°C 또는 42°C 초과), 적어도 20°C(예를 들어, 적어도 20°C, 21°C, 22°C 또는 23°C), 적어도 4°C(예를 들어, 적어도 5°C, 10°C 또는 15°C), 적어도 -20°C(예를 들어, 적어도 -20°C, -15°C, -10°C, -5°C 또는 0°C) 또는 적어도 -80°C(예를 들어, 적어도 -80°C, -70°C, -60°C, -50°C, -40°C 또는 -30°C)의 온도에서 안정하다. 일부 구현예에서, PMP는 액체 질소(약 -195.8°C) 중에서 안정하다. 일부 구현예에서, 조성물은 실온에서 적어도 1일 동안 안정하고/안정하거나 4℃에서 적어도 1주 동안 안정하다. 일부 구현예에서, 조성물은 UV 방사선 하에서 안정하다. 일부 구현예에서, 조성물은 식물의 천연 서식지에서의 온도 하에서 본원에 정의된 기간 동안 안정하다.
본원에 기술된 조성물 중 임의의 것의 일부 구현예에서, PMP는 복수의 단백질(즉, PMP 단백질)을 포함할 수 있으며, PMP의 농도는 내부의 PMP 단백질의 농도도로서 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물 중 복수의 PMP는 적어도 0.025 μg PMP 단백질/ml(예를 들어, 적어도 0.025, 0.05, 0.1 또는 0.5 μg PMP 단백질/ml), 적어도 1 μg PMP 단백질/ml(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 μg PMP 단백질/ml), 적어도 10 μg PMP 단백질/ml(예를 들어, 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 또는 45 μg PMP 단백질/ml), 적어도 50 μg PMP 단백질/ml(예를 들어, 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95 μg PMP 단백질/ml), 적어도 100 μg PMP 단백질/ml(예를 들어, 적어도 100, 125, 150, 175, 200 또는 225 μg PMP 단백질/ml), 적어도 250 μg PMP 단백질/ml(예를 들어, 적어도 250, 300, 350, 400, 450 또는 500 μg PMP 단백질/ml) 또는 적어도 500 μg PMP 단백질/ml(예를 들어, 적어도 500, 600, 700, 800 또는 900 μg PMP 단백질/ml)의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 조성물 중 복수의 PMP는 적어도 1 mg PMP 단백질/ml(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 PMP 단백질/ml) 또는 적어도 10 mg PMP 단백질/ml(예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg PMP 단백질/ml)의 농도로 존재한다.
본원의 조성물의 일부 구현예에서, PMP는 정제된 식물 세포외 소포(EV) 또는 그의 세그먼트 또는 추출물을 포함한다. 일부 구현예에서, 식물 EV는 변형된 식물 세포외 소포(EV)이다. 특정 구현예에서, 식물 EV는 식물 엑소좀 또는 식물 미세소포이다. 일부 구현예에서, PMP는 부록에 약술된 것들과 같은 식물 EV 마커를 포함한다.
본원의 조성물의 일부 구현예에서, 복수의 PMP는 순수할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 세포소기관, 예컨대 식물 엽록체, 미토콘드리아 또는 핵이 실질적으로 없을 수 있다(예를 들어, 이를 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2% 미만으로 갖는다).
일부 구현예에서, 변형 PMP는 이종 기능성 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형 PMP는 2종 이상의 상이한 이종 기능성 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 기능성 제제가 복수의 PMP의 각각에 의해 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 이종 기능성 제제가 복수의 PMP의 각각의 표면 상에 매립된다. 일부 구현예에서, 이종 기능성 제제가 복수의 PMP의 각각의 표면에 컨쥬게이트된다.
일부 구현예에서, 이종 기능성 제제는 이종 농업용제이다. 일부 구현예에서, 이종 농업용제는 농약 제제이다. 일부 구현예에서, 이종 기능성 제제는 시비제이다. 일부 구현예에서, 이종 기능성 제제는 농약 제제이다. 일부 구현예에서, 농약 제제는 항진균제, 항박테리아제, 살충제, 살연체동물제, 살선충제, 또는 제초제이다. 일부 구현예에서, 이종 기능성 제제는 기피제이다. 일부 구현예에서, 이종 기능성 제제는 식물 개질제이다.
일부 구현예에서, 이종 기능성 제제는 이종 치료제이다. 일부 구현예에서, 이종 치료제는 항진균제, 항박테리아제, 살바이러스제, 항바이러스제, 살충제, 살선충제, 항기생충제, 또는 곤충 기피제를 포함한다.
일부 구현예에서, 이종 기능성 제제는 이종 폴리펩티드, 이종 핵산, 또는 이종 소분자이다. 일부 구현예에서, 이종 핵산은 DNA, RNA, PNA, 또는 하이브리드 DNA-RNA 분자이다. 일부 구현예에서, RNA는 메신저 RNA(mRNA), 가이드 RNA(gRNA), 또는 저해성 RNA이다. 일부 구현예에서, 저해성 RNA는 RNAi, shRNA, 또는 miRNA이다. 일부 구현예에서, 저해성 RNA는 식물에서 유전자 발현을 저해한다. 일부 구현예에서, 저해성 RNA는 식물 공생생물에서 유전자 발현을 저해한다.
일부 구현예에서, 핵산은, 식물에서, 효소, 포어-형성 단백질, 신호전달 리간드, 세포 투과성 펩티드, 전사 인자, 수용체, 항체, 나노바디, 유전자 편집 단백질, 리보단백질, 단백질 압타머 또는 샤페론의 발현을 증가시키는 mRNA, 변형된 mRNA 또는 DNA 분자이다.
일부 구현예에서, 핵산은 안티센스 RNA, siRNA, shRNA, miRNA, aiRNA, PNA, 모르폴리노, LNA, piRNA, 리보자임, DNAzyme, 압타머, circRNA, gRNA 또는 DNA 분자이며, 이는 예를 들어, 식물에서, 효소, 전사 인자, 분비 단백질, 구조적 인자, 리보단백질, 단백질 압타머, 샤페론, 수용체, 신호전달 리간드 또는 수송체의 발현을 감소시킨다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는, 효소, 포어-형성 단백질, 신호전달 리간드, 세포 투과성 펩티드, 전사 인자, 수용체, 항체, 나노바디, 유전자 편집 단백질, 리보단백질, 단백질 압타머 또는 샤페론이다.
일부 구현예에서, 조성물은 식물로의 운반을 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 조성물은 농업적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 동물(예를 들어, 인간)로의 운반을 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 액체, 고체, 에어로졸, 페이스트, 겔 또는 기체 조성물로서 제형화된다.
일부 구현예에서, 식물은 농업 또는 원예 식물이다. 일부 구현예에서, 농업 식물이 대두 식물, 밀 식물, 또는 옥수수 식물이다.
일부 구현예에서, 조성물 중 PMP는 식물(예를 들어, 농업 또는 원예 식물)의 건강을 증가시키기에 유효한 농도로 존재한다.
일부 구현예에서, 농업 식물은 잡초이다.
일부 구현예에서, 조성물 중 PMP는 식물(예를 들어, 잡초)의 건강을 감소시키기에 유효한 농도로 존재한다.
또 다른 양태에서, 증가된 동물 세포 흡수를 갖는 복수의 변형된 PMP를 포함하는 PMP 조성물이 본원에 제공되며, PMP는 (a) 식물 또는 그의 부분으로부터 초기 시료를 제공하는 단계로서, 식물 또는 그의 부분이 EV를 포함하는 단계; (b) 초기 시료로부터 미정제 PMP 분획을 단리하는 단계로서, 미정제 PMP 분획이 초기 시료 내에서의 수준에 비하여 감소된 수준의 식물 또는 그의 부분 유래의 적어도 하나의 오염물질 또는 원하지 않는 성분을 갖는 단계; (c) 미정제 PMP 분획을 정제함으로써, 복수의 순수한 PMP를 생산하는 단계로서, 복수의 순수한 PMP가 미정제 EV 분획에서의 수준에 비하여 감소된 수준의 식물 또는 그의 부분 유래의 적어도 하나의 오염물질 또는 원하지 않는 성분을 갖는 단계; (d) 순수한 PMP에 세포 투과제를 로딩함으로써, 미변형 PMP에 비하여 증가된 동물 세포 흡수를 갖는 변형 PMP를 생성하는 단계; 및 (e) 단계 (d)의 PMP를 동물로의 운반을 위하여 제형화하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된다.
또 다른 양태에서, 증가된 식물 세포 흡수를 갖는 복수의 변형 PMP를 포함하는 PMP 조성물이 본원에 제공되며, PMP는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된다: (a) 식물 또는 그의 부분을 제공하는 단계; (b) 복수의 세포외 소포(EV)를 식물, 또는 그의 부분으로부터 방출시키고, 초기 시료에서 EV를 수집하는 단계; (c) 복수의 EV를 미정제 EV 분획으로 분리시키는 단계로서, 미정제 EV 분획은 초기 시료에서의 수준에 비해 감소된 수준의 식물 세포 또는 세포 데브리스를 갖는 단계; (d) 미정제 EV 분획을 정제함으로써, 복수의 순수한 PMP를 생산하는 단계로서, 복수의 순수한 PMP가 미정제 EV 분획 내의 수준에 비하여 감소된 수준의 식물 세포소기관, 세포벽 성분, 또는 식물 분자 응집물(예를 들어, 단백질 응집물, 단백질-핵산 응집물, 지단백질 응집물, 또는 지질-단백질 구조)을 갖는 단계; 및 (e) PMP에 식물 세포 흡수를 증가시키는 이종 기능성 제제를 로딩함으로써, 미변형 PMP에 비하여 증가된 식물 세포 흡수를 갖는 변형 PMP를 생성하는 단계.
또 다른 양태에서, 증가된 박테리아 세포 흡수를 갖는 복수의 변형 PMP를 포함하는 PMP 조성물이 본원에 제공되며, PMP는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된다: (a) 식물 또는 그의 부분을 제공하는 단계; (b) 복수의 세포외 소포(EV)를 식물, 또는 그의 부분으로부터 방출시키고, 초기 시료에서 EV를 수집하는 단계; (c) 복수의 EV를 미정제 EV 분획으로 분리시키는 단계로서, 미정제 EV 분획은 초기 시료에서의 수준에 비해 감소된 수준의 식물 세포 또는 세포 데브리스를 갖는 단계; (d) 미정제 EV 분획을 정제함으로써, 복수의 순수한 PMP를 생산하는 단계로서, 복수의 순수한 PMP가 미정제 EV 분획 내의 수준에 비하여 감소된 수준의 식물 세포소기관, 세포벽 성분, 또는 식물 분자 응집물(예를 들어, 단백질 응집물, 단백질-핵산 응집물, 지단백질 응집물, 또는 지질-단백질 구조)을 갖는 단계; 및 (e) PMP에 박테리아 세포 흡수를 증가시키는 이종 기능성 제제를 로딩함으로써, 미변형 PMP에 비하여 증가된 박테리아 세포 흡수를 갖는 변형 PMP를 생성하는 단계.
또 다른 양태에서, 증가된 진균 세포 흡수를 갖는 복수의 변형된 PMP를 포함하는 PMP 조성물이 본원에 제공되며, PMP는 (a) 식물 또는 그의 부분으로부터 초기 시료를 제공하는 단계로서, 식물 또는 그의 부분이 EV를 포함하는 단계; (b) 초기 시료로부터 미정제 PMP 분획을 단리하는 단계로서, 미정제 PMP 분획이 초기 시료 내에서의 수준에 비하여 감소된 수준의 식물 또는 그의 부분 유래의 적어도 하나의 오염물질 또는 원하지 않는 성분을 갖는 단계; (c) 미정제 PMP 분획을 정제함으로써, 복수의 순수한 PMP를 생산하는 단계로서, 복수의 순수한 PMP가 미정제 EV 분획에서의 수준에 비하여 감소된 수준의 식물 또는 그의 부분 유래의 적어도 하나의 오염물질 또는 원하지 않는 성분을 갖는 단계; (d) 순수한 PMP에 식물 세포 투과제를 로딩함으로써, 미변형 PMP에 비하여 증가된 식물 세포 흡수를 갖는 변형 PMP를 생성하는 단계; 및 (e) 단계 (d)의 PMP를 식물로의 운반을 위하여 제형화하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된다.
또 다른 양태에서, 본원의 임의의 PMP 조성물을 포함하는 식물이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 본원의 임의의 PMP 조성물을 포함하는 박테리아가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 본원의 임의의 PMP 조성물을 포함하는 진균이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 식물을 본원의 PMP 조성물 중 임의의 것과 접촉시키는 단계를 포함하는 식물로의 PMP 조성물의 운반 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 포유류의 건강의 증가 방법으로서, 방법이 유효량의 본원의 PMP 조성물 중 임의의 것을 포유류에 운반하는 단계를 포함하며, 방법이 미처리 포유류에 비하여 포유류의 건강을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, PMP는 이종 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 포유류는 인간이다.
또 다른 양태에서, 식물의 건강의 증가 방법으로서, 방법이 유효량의 본원의 PMP 조성물 중 임의의 것을 식물에 운반하는 단계를 포함하며, 방법이 미처리 식물에 비하여 식물의 건강을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, PMP는 이종 시비제를 포함한다. 일부 구현예에서, PMP는 이종 식물 변형제를 포함한다. 일부 구현예에서, PMP는 이종 농약 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 식물은 농업 또는 원예 식물이다. 일부 구현예에서, 식물이 대두 식물, 밀 식물, 또는 옥수수 식물이다.
또 다른 양태에서, 식물의 건강의 감소 방법으로서, 방법이 유효량의 본원에 기재된 임의의 PMP 조성물을 식물에 운반하는 단계를 포함하며, 방법이 미처리 식물에 비하여 식물의 건강을 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, PMP는 이종 제초제를 포함한다. 일부 구현예에서, 식물은 잡초이다.
본원의 방법의 일부 구현예에서, PMP 조성물은 식물의 잎, 종자, 뿌리, 과실, 슈트(shoot) 또는 꽃으로 운반된다.
또 다른 양태에서, 박테리아를 본원의 PMP 조성물 중 임의의 것과 접촉시키는 단계를 포함하는 박테리아로의 PMP 조성물의 운반 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 박테리아의 건강의 감소 방법으로서, 방법이 유효량의 본원의 PMP 조성물 중 임의의 것을 박테리아에 운반하는 단계를 포함하며, 방법이 미처리 박테리아에 비하여 박테리아의 건강을 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, PMP는 이종 항박테리아제를 포함한다. 일부 구현예에서, 박테리아는 식물 병원체이다. 일부 구현예에서, 박테리아는 동물(예를 들어, 인간) 병원체이다.
또 다른 양태에서, 진균을 본원의 PMP 조성물 중 임의의 것과 접촉시키는 단계를 포함하는 진균으로의 PMP 조성물의 운반 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 진균의 건강의 감소 방법으로서, 방법이 유효량의 본원의 PMP 조성물 중 임의의 것을 진균에 운반하는 단계를 포함하며, 방법이 미처리 진균에 비하여 진균의 건강을 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, PMP는 이종 항진균제를 포함한다. 일부 구현예에서, 진균은 식물 병원체이다. 일부 구현예에서, 진균은 동물(예를 들어, 인간) 병원체이다. 본원의 방법의 일부 구현예에서, PMP 조성물은 액체, 고체, 에어로졸, 페이스트, 겔 또는 기체로서 운반된다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 임의의 PMP 조성물 및 농업적 이용에 적합한 담체 또는 부형제를 포함하는 농업용 방제 제형이 본원에 제공된다. 제형은 액체, 고체(예를 들어, 과립, 펠렛, 분말, 입상수화제(dry flowable) 또는 수화 분말(wettable powder)), 에어로졸, 페이스트, 겔 또는 기체 형태로 존재할 수 있다. 제형은 희석되거나(예를 들어, 조성물은 가용성 고체 또는 수 분산성 고체임), 식물, 토양 또는 종자 상에 분무되거나, 도포되거나, 주입되거나, 적용되도록 구성될 수 있다(및/또는 설명서와 조합될 수 있다).
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 임의의 PMP 조성물 및 농업 조성물(예를 들어, 잡초 방제 조성물, 비료 조성물 또는 식물 변형 조성물)에서와 같이 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 표적 세포로의 식물 메신저 팩(PMP)의 운반 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 외인성 이온화 가능한 지질을 포함하는 PMP를 표적 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 외인성 이온화 가능한 지질을 포함하는 PMP는 비변형 PMP에 비하여 증가된 표적 세포에 의한 흡수를 갖는다. 일부 구현예에서, 변형 PMP는 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 90% 초과의 이온화 가능한 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형 PMP는 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 90% 초과의 식물 세포외 소포(EV)로부터 유래된 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 이온화 가능한 지질은 1,1‘-((2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸) (2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아자네디일)비스(도데칸-2-올) (C12-200)이다.
또 다른 양태에서, 표적 세포로의 식물 메신저 팩(PMP)의 운반 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 외인성 쯔비터이온성(zwitterionic) 지질을 포함하는 PMP를 표적 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 외인성 쯔비터이온성 지질을 포함하는 PMP는 비변형 PMP에 비하여 증가된 표적 세포에 의한 흡수를 갖는다. 일부 구현예에서, 변형 PMP는 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 90% 초과의 쯔비터이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형 PMP는 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 90% 초과의 식물 세포외 소포(EV)로부터 유래된 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 쯔비터이온성 지질은 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC) 또는 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(DOPC)이다.
또 다른 양태에서, 외인성 양이온성 지질을 포함하는 복수의 변형 PMP를 포함하는 PMP 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 변형 PMP의 각각은 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 90% 초과의 양이온성 지질을 포함한다.
또 다른 양태에서, 외인성 이온화 가능한 지질을 포함하는 복수의 변형 PMP를 포함하는 PMP 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 변형 PMP의 각각은 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 90% 초과의 이온화 가능한 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 C12-200이다.
또 다른 양태에서, 외인성 쯔비터이온성 지질을 포함하는 복수의 변형 PMP를 포함하는 PMP 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 변형 PMP의 각각은 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 90% 초과의 쯔비터이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 쯔비터이온성 지질은 DEPC 또는 DOPC이다.
또 다른 양태에서, 증가된 식물 세포 흡수를 갖는 복수의 변형 PMP를 포함하는 PMP 조성물이 본원에 제공되며, PMP는 (a) 복수의 정제된 PMP를 제공하는 단계; (b) 복수의 PMP를 처리하여 지질 막을 생성하는 단계; 및 (c) 외인성 양이온성 지질의 존재 하에 지질 막을 재구성함으로써 증가된 세포 흡수를 갖는 변형 PMP를 생성하는 단계로서, 재구성된 PMP가 적어도 1%의 외인성 양이온성 지질을 포함하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다.
또 다른 양태에서, 증가된 식물 세포 흡수를 갖는 복수의 변형 PMP를 포함하는 PMP 조성물이 본원에 제공되며, PMP는 (a) 복수의 정제된 PMP를 제공하는 단계; (b) 복수의 PMP를 처리하여 지질 막을 생성하는 단계; 및 (c) 외인성 이온화 가능한 지질의 존재 하에 지질 막을 재구성함으로써 증가된 세포 흡수를 갖는 변형 PMP를 생성하는 단계로서, 재구성된 PMP가 적어도 1%의 외인성 이온화 가능한 지질을 포함하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다.
또 다른 양태에서, 증가된 식물 세포 흡수를 갖는 복수의 변형 PMP를 포함하는 PMP 조성물이 본원에 제공되며, PMP는 (a) 복수의 정제된 PMP를 제공하는 단계; (b) 복수의 PMP를 처리하여 지질 막을 생성하는 단계; 및 (c) 외인성 쯔비터이온성 지질의 존재 하에 지질 막을 재구성함으로써 증가된 세포 흡수를 갖는 변형 PMP를 생성하는 단계로서, 재구성된 PMP가 적어도 1%의 외인성 쯔비터이온성 지질을 포함하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
정의
본원에 사용되는 바와 같이, "농업적으로 허용 가능한" 담체 또는 부형제는 농업에서 사용하기 위해, 예를 들어, 식물 상에 사용하기 위해 적합한 것이다. 특정 구현예에서, 농업적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 식물, 환경, 또는 그로부터 유래되는 생성된 농산물을 소비하는 인간 또는 동물에게 합당한 이익/위험 비에 상응하는 과도한 유해한 부작용을 갖지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이, "운반하는" 또는 "접촉시키는"은 조성물이 식물, 동물, 진균, 또는 박테리아의 건강을 변경시키기에 유효한 영역에서, 식물, 동물, 진균, 또는 박테리아 상에 직접적으로, 또는 식물, 동물, 진균, 또는 박테리아에 인접하게, PMP 조성물을 식물, 동물, 진균, 또는 박테리아에 적용하는 것을 지칭한다. 조성물을 식물, 동물, 진균, 또는 박테리아와 직접 접촉시키는 방법에서, 조성물은 전체 식물, 동물, 진균, 또는 박테리아 혹은 식물, 동물, 진균, 또는 박테리아와의 오직 일부만과 접촉될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, “식물의 건강을 감소시키는 것”은 본원에 기재된 조성물(예를 들어, 변형 PMP를 포함하며, 선택적으로 이종 기능성 제제를 포함하는 PMP 조성물)의 투여의 결과로서 식물(예를 들어, 잡초)의 생리기능의 임의의 붕괴를 지칭하며, 이는 식물(예를 들어, 잡초)의 집단을 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% 또는 그 이상 감소시키는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 식물 건강의 감소는 조성물을 투여하지 않은 식물에 비하여 결정될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “유효량”, “유효 농도” 또는 “~에 유효한 농도”는 표적 유기체 내에서 또는 그 상에서 열거된 결과를 달성하거나, 표적 수준(예를 들어, 미리 결정된 또는 역치 수준)에 도달하기에 충분한, 변형 PMP 또는 그 안의 이종 기능성 제제의 양을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "식물의 건강을 증가시키는"은 조성물(예를 들어, 선택적으로는 이종 기능성 제제를 포함하는, 변형된 PMP를 포함하는 PMP 조성물)의 투여의 결과로서 식물의 생산의 증가, 예를 들어, 개선된 수확량, 개선된 식물의 활력 또는 식물로부터 수확된 생산물의 품질을 지칭한다. 개선된 식물의 수확량은 동일한 조건 하에서, 그러나 본 발명의 조성물의 적용 없이 생산된 식물의 동일한 생산물의 수확량에 비하여, 또는 통상적인 농업용제의 적용과 비교하여, (예를 들어, 식물 바이오매스, 곡물(grain), 종자 또는 과실 수확량, 단백질 함량, 탄수화물 또는 오일 함량 또는 엽면적에 의해 측정되는 바와 같은) 측정 가능한 양에 의한 식물의 생산물의 수확량의 증가에 관한 것이다. 예를 들어, 수확량은 적어도 약 0.5%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100% 또는 100%를 초과하여 증가될 수 있다. 수확량은 일부 기준으로 식물 또는 식물의 생산물의 중량 또는 부피에 따른 양에 관하여 표현될 수 있다. 기준은 시간, 성장 면적, 생산되는 식물의 중량 또는 사용되는 원재료의 양에 관하여 표현될 수 있다. 식물의 건강의 증가는 또한 다른 수단, 예컨대 동일한 조건 하에서 그러나 본 발명의 조성물의 투여 없이 또는 종래의 농업용제의 적용과 함께 생산된 식물의 동일한 인자에 비하여 측정 가능한 또는 인지 가능한 양에 의한 활력 등급의 증가 또는 개선, 수목(단위 면적당 식물의 수) 증가, 식물 높이 증가, 줄기 둘레 증가, 식물 수관 증가, 외양(예컨대 시각적으로 측정했을 때 더 녹색의 잎색) 증가, 뿌리 등급 증가, 묘목 모상체(emergence) 증가, 단백질 함량, 잎 크기 증가, 죽은 기부엽 감소, 분얼지 강도 증가, 영양제 또는 비료 요구량 감소, 종자 발아 증가, 분얼지 생산성 증가, 개화량 증가, 종자 또는 곡물 성숙 또는 종자 성숙도 증가, 식물 버스(verse)(도복(lodging)) 수 감소, 슈트(shoot) 성장 증가, 또는 이들 인자의 임의의 조합에 의해 측정될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "이종"은 (1) 식물에 대하여 외인성(예를 들어, PMP가 생산되는 식물이 아닌 공급원으로부터 기원)이거나, 또는 (2) PMP가 생산되는 식물에 대하여 내인성이지만, 자연에서 관찰되는(예를 들어, 자연-발생 식물 세포외 소포에서 관찰되는) 것보다 더 높은 농도로 PMP(예를 들어, 로딩, 유전학적 조작, 시험관내 또는 생체내 접근법을 사용한)에 존재하는 제제를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “기능성 제제”는 본 발명의 조성물 또는 방법에 따라 PMP이거나, 이와 회합될 수 있는(예를 들어, 생체내 또는 시험관내 방법을 사용하여 PMP 내로 또는 그 상으로 로딩되고(예를 들어, PMP에 의해 캡슐화되거나, 그 내에 매립되거나, 그에 컨쥬게이트되고), 열거된 결과를 달성할 수 있는(예를 들어, 식물, 식물 유해물, 식물 공생생물, 동물(예를 들어, 인간) 병원체 또는 동물 병원체 벡터의 건강을 증가시키거나 감소시키는)) 제제(예를 들어, 농업용제(예를 들어, 농약 제제, 시비제, 제초제, 식물 변형 제제) 또는 치료제(예를 들어, 항진균제, 항박테리아제, 살바이러스제, 항바이러스제, 살충제, 살선충제, 항기생충제 또는 곤충 기피제))를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “농업용제”는 식물, 식물 유해물 또는 식물 공생생물에 작용할 수 있는 제제, 예컨대 농약 제제, 유해물 기피제, 시비제, 식물 변형 제제 또는 식물-공생생물 변형제를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “시비제”는 식물(예를 들어, 식물 영양소 또는 식물 성장 조절제) 또는 식물 공생생물(예를 들어, 핵산 또는 펩티드)의 건강을 증가시킬 수 있는 제제를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "농약 제제"는 농업, 환경 또는 집안/가정 유해물, 예컨대 곤충, 연체동물, 선충, 진균, 박테리아 또는 바이러스의 건강을 조절하거나 감소시키는(예를 들어, 그를 사멸시키거나, 그의 성장, 증식, 분열, 번식 또는 확산을 저해하는) 제제, 조성물 또는 그 안의 물질을 지칭한다. 농약은 자연 발생 또는 합성 살충제(살유충제(larvicide) 또는 살성충제(adulticide)), 곤충 성장 조절제, 살비제(acaricide)(살진드기제(miticide)), 살연체동물제(molluscicide), 살선충제, 살체외기생충제(ectoparasiticide), 살박테리아제, 살진균제 또는 제초제를 포함하는 것으로 이해된다. 용어 "농약 제제"는 추가로 다른 생물활성 분자, 예컨대, 항생제, 항바이러스제, 농약, 항진균제, 항기생충제, 영양소 및/또는 곤충 움직임을 둔화시키거나 기절시키는 제제를 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “식물 변형 제제”는 식물 건강의 증가를 초래하는 방식으로 식물의 유전학적 특성(예를 들어, 유전자 발현을 증가시키거나, 유전자 발현을 감소시키거나, 다르게는 DNA 또는 RNA의 뉴클레오티드 서열을 변경시킴) 또는 생화학적 특성을 변경시킬 수 있는 제제를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료제"는 동물, 예를 들어, 포유동물(예를 들어, 인간), 동물 병원체, 또는 병원체 벡터에 작용할 수 있는 제제, 예를 들어 항진균제, 항박테리아제, 살바이러스제, 항바이러스제, 살충제, 살선충제, 항기생충제, 또는 곤충 기피제를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "식물로의 운반을 위해 제형화된"은 농업적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 PMP 조성물을 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "농업적으로 허용 가능한" 담체 또는 부형제는 식물, 환경, 또는 그로부터 유래되는 생성된 농산물을 소비하는 인간 또는 동물에게 합당한 이익/위험 비에 상응하는 과도한 유해한 부작용 없이 농업에 사용하기에 적합한 것이다.
본원에 정의된 바와 같이, 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호교환 가능하며, 길이와 관계 없이(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 500, 1000개 또는 그 이상의 핵산), 선형 또는 분지형, 단일 또는 이중 가닥 또는 그의 혼성물인 RNA 또는 DNA를 지칭한다. 당해 용어는 또한 RNA/DNA 혼성물을 포함한다. 용어 "핵산"이 또한 다른 유형의 연결기 또는 백본(예를 들어, 다른 것들 중 특히, 포스포르아미드, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, O-메틸포스포로아미데이트, 모르폴리노, 잠금 핵산(LNA), 글리세롤 핵산(GNA), 트레오스 핵산(TNA) 및 펩티드 핵산(PNA) 연결기 또는 백본)을 갖는 핵산 유사체를 포함하지만, 뉴클레오티드는 전형적으로 핵산에서 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된다. 핵산은 단일-가닥, 이중-가닥이거나, 단일-가닥 및 이중-가닥 서열 둘 모두의 부분을 함유할 수 있다. 핵산은 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드의 임의의 조합 및 예를 들어, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 우라실 및 변형된 또는 비-정규 염기(예를 들어, 하이포잔틴, 잔틴, 7-메틸구아닌, 5,6-디하이드로우라실, 5-메틸시토신 및 5 하이드록시메틸시토신 포함)를 포함하는 염기의 임의의 조합을 함유할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "유해물"은 식물 또는 다른 유기체에 손상을 야기하거나, 그들을 원하지 않는 곳에 존재하거나, 또는 다르게는 예를 들어, 인간 농업 방법 또는 생산물에 영향을 미침으로써 인간에게 불리한 유기체를 지칭한다. 유해물은 예를 들어, 무척추동물(예를 들어, 곤충, 선충 또는 연체동물), 미생물(예를 들어, 식물병원체, 내생식물, 절대 기생체, 조건 기생체 또는 조건 부생체), 예컨대 박테리아, 진균 또는 바이러스; 또는 잡초를 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "농약 제제" 또는 "농약"은 농업, 환경 또는 집안/가정 유해물, 예컨대 곤충, 연체동물, 선충, 진균, 박테리아, 잡초, 또는 바이러스의 건강을 조절하거나 감소시키는(예를 들어, 그를 사멸시키거나, 그의 성장, 증식, 분열, 번식 또는 확산을 저해하는) 제제, 조성물 또는 그 안의 물질을 지칭한다. 농약은 자연 발생 또는 합성 살충제(살유충제(larvicide) 또는 살성충제(adulticide)), 곤충 성장 조절제, 살비제(acaricide)(살진드기제(miticide)), 살연체동물제(molluscicide), 살선충제, 살체외기생충제(ectoparasiticide), 살박테리아제, 살진균제 또는 제초제를 포함하는 것으로 이해된다. 용어 "농약 제제"는 추가로 다른 생물활성 분자, 예컨대, 항생제, 항바이러스제, 농약, 항진균제, 항기생충제, 영양소 및/또는 곤충 움직임을 둔화시키거나 기절시키는 제제를 포함할 수 있다.
농약 제제는 이종일 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "이종"은 (1) 식물에 대하여 외인성(예를 들어, PMP가 생산되는 식물 또는 식물 부분이 아닌 공급원으로부터 기원)(예를 들어, 본원에 기재된 로딩 접근법을 사용하여 PMP에 부가)이거나, 또는 (2) PMP가 생산되는 식물 세포 또는 조직에 대하여 내인성이지만, 자연에서 관찰되는 것보다 더 높은(예를 들어, 자연-발생 식물 세포외 소포에서 관찰되는 농도보다 더 높은) 농도로 PMP에 존재하는(예를 들어, 본원에 기재된 로딩 접근법, 유전학적 조작, 시험관내 또는 생체내 접근법을 사용하여 PMP에 부가) 제제(예를 들어, 농약 제제)를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "기피제"는 유해물이 식물에 접근하거나 식물에 남아 있는 것을 방지하는 제제, 조성물 또는 그 안의 물질을 지칭한다. 기피제는 예를 들어, 식물 상의 또는 식물 부근의 유해물의 수를 감소시킬 수 있지만, 반드시 유해물을 사멸시키거나, 그의 건강을 감소시키는 것은 아닐 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "펩티드", "단백질" 또는 "폴리펩티드"는 길이(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 40, 50, 100개 또는 그 이상의 아미노산), 번역후 변형(예를 들어, 글리코실화 또는 인산화)의 존재 또는 부재, 또는 펩티드에 공유적으로 연결된 하나 이상의 비-아미노 아실기(예를 들어, 당, 지질 등)의 존재와 관계 없이, 자연 또는 비-자연 발생 아미노산(D- 또는 L-아미노산 중 어느 하나)의 임의의 쇄를 포함하며, 예를 들어, 천연 단백질, 합성 또는 재조합 폴리펩티드 및 펩티드, 혼성물 분자, 펩토이드 또는 펩티드모방체를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 2개의 서열 간의 "동일성 백분율"은 문헌[Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 기재된 BLAST 2.0 알고리즘에 의해 결정된다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물공학 정보센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 이용 가능하다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "식물"은 전체 식물, 식물 기관, 식물 조직, 종자, 식물 세포, 종자 및 이의 자손을 지칭한다. 식물 세포는 제한 없이, 종자, 현탁 배양물, 배아, 분열(meristematic) 영역, 캘러스 조직, 잎, 뿌리, 슈트, 배우체, 포자체, 화분 및 소포자로부터의 세포를 포함한다. 식물 부분은 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 분화된 및 비분화된 조직을 포함한다: 뿌리, 줄기, 슈트, 잎, 화분, 종자, 과실, 수확된 생산물, 종양 조직, 수액(예를 들어, 목부수액(xylem sap) 및 사부수액(phloem sap)), 및 다양한 형태의 세포 및 배양물(예를 들어, 단일 세포, 원형질체, 배아 및 캘러스 조직). 식물 조직은 식물에 또는 식물 기관, 조직 또는 세포 배양물에 존재할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "식물 메신저 팩" 또는 "PMP"는 그와 회합된 지질 또는 비-지질 성분(예를 들어, 펩티드, 핵산 또는 소분자0)을 포함하는, 식물 세포외 소포 또는 그의 절편, 부분 또는 추출물로부터 유래되거나 그를 포함하는, 직경이 약 5 내지 2000 ㎚인 지질 구조(예를 들어, 지질 이중층, 단층, 다층 구조)(예를 들어, 소포 지질 구조)를 지칭한다. PMP는 추가의 제제, 예를 들어, 이종 기능성 제제(예를 들어, 이종 농업용제(예를 들어, 농약 제제, 시비제, 제초제, 식물 변형제) 또는 이종 치료제(예를 들어, 항진균제, 항박테리아제, 살바이러스제, 항바이러스제, 살충제, 살선충제, 항기생충제, 또는 곤충 기피제))(폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 소분자를 포함)를 추가로 선택적으로 포함할 수 있다. PMP는 표적 식물로 추가의 제제의 운반을 가능하게 하는 다양한 수단에 의해, 예를 들어, 추가의 제제의 캡슐화, 지질 이중층 구조 내의 성분의 혼입, 또는 (예를 들어, 컨쥬게이션에 의한) 성분과 지질 이중층 구조의 표면의 회합에 의해 추가의 제제, 예를 들어, 이종 기능성 제제(예를 들어, 이종 농업용제(예를 들어, 농약 제제, 시비제, 제초제, 식물 변형제) 또는 이종 치료제(예를 들어, 항진균제, 항박테리아제, 살바이러스제, 항바이러스제, 살충제, 살선충제, 항기생충제, 또는 곤충 기피제))를 운반하거나, 그와 회합될 수 있다. 추가의 제제는 생체 내에서(예를 들어, 식물체 내에서) 또는 시험관 내에서(예를 들어, 조직 배양물 내에서, 세포 배양물 내에서 또는 합성에 의한 혼입에 의해) PMP 내로 혼입될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “변형 PMP”는 복수의 PMP를 포함하는 조성물을 지칭하며, PMP는 미변형 PMP에 비하여, PMP 또는, 그의 부분 또는 성분(예를 들어, PMP에 의해 운반되는 이종 기능성 제제)의 세포 흡수(예를 들어, 식물 세포 흡수, 박테리아 세포 흡수 또는 진균 세포 흡수)를 증가시킬 수 있는 이종 제제(예를 들어, 세포 투과제)를 포함한다. PMP는 시험관 내에서 또는 생체내에서 변형될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “미변형 PMP”는 PMP의 세포 흡수(예를 들어, 동물 세포 흡수, 식물 세포 흡수, 박테리아 세포 흡수 또는 진균 세포 흡수)를 증가시킬 수 있는 이종 세포 흡수 제제가 결여된 복수의 PMP를 포함하는 조성물을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “세포 흡수”는 세포, 예컨대 동물 세포, 식물 세포, 박테리아 세포 또는 진균 세포에 의한 PMP, 또는 그의 부분 또는 성분(예를 들어, PMP에 의해 운반되는 이종 기능성 제제)의 흡수를 지칭한다. 예를 들어, 흡수는 세포외 환경으로부터 세포막, 세포벽, 세포외 매트릭스 내로의 또는 그에 걸친, 또는 세포의 세포내 환경 내로의 PMP, 또는 그의 부분 또는 성분의 전달을 포함할 수 있다. PMP의 세포 흡수는 능동 또는 수동 세포 메커니즘을 통해 발생할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “세포 투과제”는 제제와 접촉되지 않은 세포에 비하여 증가된 세포 흡수를 촉진시키는 방식으로 세포(예를 들어, 동물 세포, 식물 세포, 박테리아 세포 또는 진균 세포)의 세포벽, 세포외 매트릭스 또는 세포막의 특성(예를 들어, 투과성)을 변경시키는 제제를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "식물 세포외 소포", "식물 EV" 또는 "EV"는 식물에서 자연 발생하는 봉입된 지질-이중층 구조를 지칭한다. 선택적으로, 식물 EV는 하나 이상의 식물 EV 마커를 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "식물 EV 마커"는 식물과 천연적으로 회합된 성분, 예컨대 부록에 열거된 식물 EV 마커 중 임의의 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 식물 단백질, 식물 핵산, 식물 소분자, 식물 지질 또는 그의 조합을 지칭한다. 일부 경우에, 식물 EV 마커는 식물 EV의 식별 마커이지만, 농약 제제가 아니다. 일부 경우에, 식물 EV 마커는 식물 EV의 식별 마커이며, 또한, (예를 들어, 복수의 PMP와 회합되거나 그에 의해 캡슐화되거나, 복수의 PMP와 바로 회합되거나 그에 의해 캡슐화되지 않는) 농약 제제이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "식물 메신저 팩" 또는 "PMP"는 그와 회합된 지질 또는 비-지질 성분(예를 들어, 펩티드, 핵산 또는 소분자)을 포함하는, 식물 공급원 또는 그의 세그먼트, 부분 또는 추출물로부터 유래된(예를 들어, 그로부터 농축된, 단리된 또는 정제된), 및 식물, 식물 부분 또는 식물 세포로부터 농축되거나, 단리되거나 또는 정제된, 직경이 약 5 내지 2000 ㎚(예를 들어, 적어도 5 내지 1000 ㎚, 적어도 5 내지 500 ㎚, 적어도 400 내지 500 ㎚, 적어도 25 내지 250 ㎚, 적어도 50 내지 150 ㎚ 또는 적어도 70 내지 120 ㎚)인 지질 구조(예를 들어, 지질 이중층, 단층, 다층 구조; 예를 들어, 소포 지질 구조)를 지칭하며, 상기 농축 또는 단리는 공급원 식물로부터 하나 이상의 오염물질 또는 원하지 않는 성분을 제거한다. PMP는 자연 발생 EV의 고도로 정제된 제제일 수 있다. 바람직하게는, 공급원 식물 유래의 오염물질 또는 원하지 않는 성분의, 공급원 식물 유래의 하나 이상의 오염물질 또는 원하지 않는 성분, 예를 들어, 식물 세포 벽 성분; 펙틴; 식물 세포소기관(예를 들어, 미토콘드리아; 색소체, 예컨대 엽록체, 백색체 또는 녹말체; 및 핵); 식물 염색질(예를 들어, 식물 염색체); 또는 식물 분자 응집물(예를 들어, 단백질 응집물, 단백질-핵산 응집물, 지질단백질 응집물 또는 지질-단백질 구조)의 적어도 1%(예를 들어, 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% 또는 100%)가 제거된다. 바람직하게는, PMP는 중량(w/w), 스펙트럼 영상화(투과도%) 또는 전도도(S/m)에 의해 측정시 공급원 식물 유래의 하나 이상의 오염물질 또는 원하지 않는 성분에 비하여 적어도 30% 순수하다(예를 들어, 적어도 40% 순수하거나, 적어도 50% 순수하거나, 적어도 60% 순수하거나, 적어도 70% 순수하거나, 적어도 80% 순수하거나, 적어도 90% 순수하거나, 적어도 99% 순수하거나 또는 100% 순수하다).
일부 경우에, PMP는 지질 추출된 PMP(LPMP)이다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “지질 추출된 PMP” 및 “LPMP”는 식물 공급원으로부터 유래된(예를 들어, 그로부터 농축되거나, 단리되거나, 정제된) 지질 구조(예를 들어, 지질 이중층, 단층, 다층 구조; 예를 들어, 소낭 지질 구조)로부터 유래된 PMP를 지칭하며, 지질 구조는 파괴되고(예를 들어, 지질 추출에 의해 파괴되고), 표준 방법을 사용하여 액체 상(예를 들어, 카고(cargo)를 함유하는 액체상)에서 재조립되거나 재구성되어, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 지질막 수화 및/또는 용매 주입을 포함하는 방법에 의해 재구성되어 LPMP를 생성한다. 방법은 필요에 따라, 추가로 음파처리, 동결/해동 처리 및/또는 지질 압출을 포함하여, 예를 들어, 재구성된 PMP의 크기를 감소시킬 수 있다. PMP(예를 들어, LPMP)는 10% 내지 100%의 식물 공급원 유래의 지질 구조로부터 유래된 지질을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 식물 공급원 유래의 지질 구조로부터 유래된 지질을 함유할 수 있다. PMP(예를 들어, LPMP)는 식물 공급원 유래의 지질 구조에 존재하는 지질 종의 전부 또는 일정 분율을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 이는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 식물 공급원 유래의 지질 구조에 존재하는 지질 종을 함유할 수 있다. PMP(예를 들어, LPMP)는 식물 공급원 유래의 지질 구조에 존재하는 단백질 종을 포함하지 않거나, 그의 소정의 분율 또는 전부를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 0%, 1% 미만, 5% 미만, 10% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 30% 미만, 40% 미만, 50% 미만, 60% 미만, 70% 미만, 80% 미만, 90% 미만, 100% 미만 또는 100%의 식물 공급원 유래의 지질 구조에 존재하는 단백질 종을 함유할 수 있다. 일부 경우에, PMP(예를 들어, LPMP)의 지질 이중층은 단백질을 함유하지 않는다. 일부 경우에, PMP(예를 들어, LPMP)의 지질 구조는 식물 공급원 유래의 지질 구조에 비하여 감소된 양의 단백질을 함유한다.
PMP(예를 들어, LPMP)는 외인성 지질, 예를 들어 (1) 식물에 대하여 외인성(예를 들어, PMP가 생산되는 식물 또는 식물 부분이 아닌 공급원으로부터 기원)(예를 들어, 본원에 기재된 방법을 사용하여 PMP에 부가)이거나, 또는 (2) PMP가 생산되는 식물 세포 또는 조직에 대하여 내인성이지만, 자연에서 관찰되는 것보다 더 높은(예를 들어, 자연-발생 식물 세포외 소포에서 관찰되는 농도보다 더 높은) 농도로 PMP에 존재하는(예를 들어, 본원에 기재된 방법, 유전학적 조작, 시험관내 또는 생체내 접근법을 사용하여 PMP에 부가) 지질을 선택적으로 포함할 수 있다. PMP의 지질 조성은 적어도 0%, 1% 미만, 또는 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 95% 초과의 외인성 지질을 포함할 수 있다. 예시적인 외인성 지질은 양이온성 지질, 이온화 가능한 지질 및 쯔비터이온성 지질을 포함한다. 외인성 지질은 세포 투과제일 수 있다.
PMP는 선택적으로 추가의 제제, 예컨대 이종 기능성 제제, 예를 들어, 세포 투과제, 농약 제제, 시비제, 식물-변형제, 치료제, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 소분자를 포함할 수 있다. PMP는 예를 들어, 제제의 캡슐화, 지질 이중층 구조 내의 제제의 혼입 또는 (예를 들어, 컨쥬게이션에 의한) 제제와 지질 이중층 구조의 표면의 회합에 의해, 표적 식물로의 제제의 운반을 가능하게 하는 다양한 방식으로 추가의 제제(예를 들어, 이종 기능성 제제)를 운반하거나, 그와 회합될 수 있다. 이종 기능성 제제는 생체 내에서(예를 들어, 식물체 내에서) 또는 시험관 내에서(예를 들어, 조직 배양물 내에서, 세포 배양물 내에서 또는 합성에 의한 혼입에 의해) PMP 내로 혼입될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “양이온성 지질”은 양이온성 기(예를 들어, 양이온성 헤드 기)를 함유하는 양친매성 분자(예를 들어, 지질 또는 리피도이드(lipidoid))를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “리피도이드”는 지질의 하나 이상의 특징을 갖는 분자를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “이온화 가능한 지질”은 주어진 조건(예를 들어, pH) 하에서 이온화될 수 있는, 예를 들어, 하나 이상의 전기적으로 하전된 종을 생성하도록 해리될 수 있는 기(예를 들어, 헤드 기)를 함유하는 양친매성 분자(예를 들어, 지질 또는 리피도이드)를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “쯔비터이온성 지질”은 양전하를 갖는 적어도 하나의 종 및 음전하를 갖는 적어도 하나의 종을 갖는 기(예를 들어, 헤드 기)를 함유하는 양친매성 분자(예를 들어, 지질 또는 리피도이드)를 지칭하며, 기의 순전하는 0이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "안정한 PMP 조성물"(예를 들어, 로딩된 또는 비-로딩된 PMP를 포함하는 조성물)은 소정의 기간(예를 들어, 적어도 24시간, 적어도 48시간, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 30일, 적어도 60일 또는 적어도 90일)에 걸쳐, 선택적으로 정의된 온도 범위(예를 들어, 적어도 24℃(예를 들어, 적어도 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃ 또는 30℃), 적어도 20℃(예를 들어, 적어도 20℃, 21℃, 22℃ 또는 23℃), 적어도 4℃(예를 들어, 적어도 5℃, 10℃ 또는 15℃), 적어도 -20℃(예를 들어, 적어도 -20℃, -15℃, -10℃, -5℃ 또는 0℃) 또는 -80℃(예를 들어, 적어도 -80℃, -70℃, -60℃, -50℃, -40℃ 또는 -30℃)의 온도)에서 (예를 들어, 생산 또는 제형화 시의) PMP 조성물 내의 PMP의 수에 비하여 PMP의 초기 수(용액 ㎖당 PMP)의 적어도 5%(예를 들어, 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%)를 유지하거나; 또는 선택적으로 정의된 온도 범위(예를 들어, 적어도 24℃(예를 들어, 적어도 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃ 또는 30℃), 적어도 20℃(예를 들어, 적어도 20℃, 21℃, 22℃ 또는 23℃), 적어도 4℃(예를 들어, 적어도 5℃, 10℃ 또는 15℃), 적어도 -20℃(예를 들어, 적어도 -20℃, -15℃, -10℃, -5℃ 또는 0℃) 또는 -80℃(예를 들어, 적어도 -80℃, -70℃, -60℃, -50℃, -40℃ 또는 -30℃)의 온도)에서 (예를 들어, 생산 또는 제형화 시의) PMP의 초기 활성에 비하여 그의 활성(예를 들어, 세포벽 투과 및/또는 살충 및/또는 기피제 활성)의 적어도 5%(예를 들어, 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%)를 유지하는 PMP 조성물을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "동물로의 운반을 위해 제형화된"은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 PMP 조성물을 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용 가능한" 담체 또는 부형제는 예를 들어, 동물(예를 들어, 인간)에게 과도한 유해한 부작용 없이 동물(예를 들어, 인간)으로의 투여에 적합한 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "미처리"는 PMP 조성물을 운반하지 않은 개별 식물, 동물, 진균, 또는 박테리아, PMP 조성물의 운반 이전의 시점에 평가된 처리를 겪고 있는 동일한 식물, 동물, 진균, 또는 박테리아, 혹은 식물, 동물, 진균, 또는 박테리아의 미처리 부분에서 평가된 처리를 겪고 있는 동일한 식물, 동물, 진균, 또는 박테리아를 포함하여, 본원의 PMP 조성물과 접촉되지 않았거나, 이것이 운반되지 않은 식물, 동물, 진균, 또는 박테리아를 지칭한다.
도 1은 자몽 및 레몬 PMP로부터 지질 재구성된 PMP(LPMP)의 제조를 위한 작업흐름을 보여주는 개략도이다.
도 2는 LPMP; 첨가된 DC-콜레스테롤을 갖는 LPMP(DC-Chol); 및 첨가된 DOTAP를 갖는 LPMP(DOTAP)에서 주어진 크기(nm)의 입자의 상대 빈도를 보여주는 그래프이다. 데이터를 제조처에 의해 제공되는 농도 및 크기 표준을 사용하여 NanoFCM에 의해 획득하였다.
도 3a는 추출된 레몬 PMP 지질로부터 재구성된 LPMP를 보여주는 초저온-전자 현미경사진이다. 기준자: 500 nm.
도 3b는 초저온-전자 현미경법을 사용하여 측정되는 바와 같은, 추출된 레몬 지질로부터 재구성된 LPMP에서 주어진 등가의 구형 직경(nm)의 입자의 상대 빈도를 보여주는 그래프이다.
도 4a는 동적 광 산란(DLS)을 사용하여 측정되는 바와 같은 첨가되는 지질을 포함하지 않는 LPMP(LPMP) 및 25% 또는 40% DOTAP 또는 DC-콜레스테롤을 포함하는 LPMP의 제타 전위(mV)를 보여주는 그래프이다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시되어 있다.
도 4b는 첨가되는 지질을 포함하지 않는 자몽 지질 유래의 LPMP(LPMP) 및 20% DOTAP를 포함하는 자몽 지질 유래의 LPMP의 로딩 후에 LPMP로부터 회수된 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 555-표지된 siRNA 투입물의 백분율을 보여주는 막대 그래프이다.
도 4c는 첨가되는 지질을 포함하지 않는 레몬 지질 유래의 LPMP(LPMP) 및 40% DC-콜레스테롤을 포함하는 레몬 지질 유래의 LPMP(DC-Chol)의 로딩 후에 LPMP로부터 회수된 ATTO-표지된 TracrRNA 투입물의 백분율을 보여주는 막대 그래프이다.
도 4d는 퀀트(Quant)-iTTM 리보그린(RiboGreen)® 분석을 사용하여 측정되는 바와 같은, 처리되지 않거나, 트리톤(Triton)-X100 및 헤파린(+TX +헤파린)을 사용하여 용해된 40% DC-콜레스테롤을 포함하는 LPMP 내의 TracrRNA 농도(μg/mL)를 보여주는 막대 그래프이다.
도 5는 첨가되는 지질을 포함하지 않는 자몽 지질 유래의 PKH67-표지된 LPMP(가운데 열) 및 20% DOTAP를 함유하는 LPMP(우측 열)로 처리된 COLO697 세포에서 DAPI(윗줄) 및 PKH67(가운데 줄) 형광을 보여주는 일련의 현미경사진이다. DAPI 및 PKH67 신호를 포함하는 병합된 이미지는 패널의 아랫줄에 나타나 있다. PKH67 염료로 처리된 세포는 대조군으로서 나타나 있다. 기준자: 50 ㎛.
도 6은 첨가되는 지질을 포함하지 않는 LPMP(가운데 줄) 및 40% DC-콜레스테롤을 포함하는 LPMP(DC-Chol)로 처리된 옥수수 블랙 멕시칸 스위트(Black Mexican Sweet; BMS) 세포의 위상차(좌측 열), ATTO 550 형광(가운데 열) 및 병합된 도면을 보여주는 일련의 현미경사진이다. 오직 H2O로만 처리된 세포는 음성 대조군으로서 제공된다(상측 패널). 세포에 의한 LPMP 또는 DC-콜레스테롤로 변형된 LPMP의 흡수는 세포 내의 TracrRNA ATTO 550 신호의 존재에 의해 나타난다. 기준자: 100 ㎛.
도 7은 미변형 LPMP; 첨가된 MC3을 갖는 LPMP; 및 첨가된 C12-200을 갖는 LPMP에서 주어진 크기(nm)의 입자의 상대 빈도를 보여주는 그래프이다. 데이터를 제조처에 의해 제공되는 농도 및 크기 표준을 사용하여 NanoFCM에 의해 획득하였다.
도 8a는 pH 7의 첨가되는 지질을 포함하지 않는 LPMP, pH 4 및 pH 7의 40% MC3을 포함하는 LPMP, 및 pH 4 및 pH 7의 25% C12-200을 포함하는 LPMP의 제타 전위(mV)를 보여주는 그래프이다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시되어 있다.
도 8b는 pH 7의 첨가되는 지질을 포함하지 않는 레몬 지질 유래의 LPMP(LPMP), pH 4 및 pH 9의 40% MC3을 포함하는 LPMP, 및 pH 4 및 pH 9의 25% C12-200을 포함하는 LPMP의 로딩 후에 LPMP로부터 회수된 ATTO 550-표지된 TracrRNA 투입물의 백분율을 보여주는 막대 그래프이다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시되어 있다.
도 8c는 퀀트-iTTM 리보그린® 분석을 사용하여 측정되는 바와 같은, 처리되지 않거나, 트리톤-X100 및 헤파린을 사용하여 용해된(+TX +헤파린) 25% C12-200을 포함하는 LPMP 내의 sgRNA 농도(μg/mL)를 보여주는 막대 그래프이다.
도 9는 첨가되는 지질을 포함하지 않는 레몬 지질 유래의 LPMP(가운데 줄) 및 25% C12-200을 포함하는 LPMP(아랫줄)로 처리된 옥수수 블랙 멕시칸 스위트(BMS) 세포의 위상차(좌측 열), ATTO 550 형광(가운데 열) 및 병합된 도면을 보여주는 일련의 현미경사진이다. 오직 H2O로만 처리된 세포는 음성 대조군으로서 제공된다(윗줄). 세포에 의한 LPMP 또는 C12-200으로 변형된 LPMP의 흡수는 세포 내의 TracrRNA ATTO 550 신호의 존재에 의해 나타난다. 기준자: 100 ㎛.
도 10은 첨가되는 셀룰라제를 포함하지 않는 자몽 지질 유래의 LPMP(4번째 열)로 처리된 옥수수 블랙 멕시칸 스위트(BMS) 세포의 위상차(윗줄), 표지된 셀룰라제를 나타내는 알렉사 플루오르 488 형광(두번째 줄), 표지된 PMP 막을 나타내는 PKH26 형광(세번째 줄), 및 병합된 도면(아랫줄)을 보여주는 일련의 현미경사진이다. LPMP, 또는 변형 프로토콜 c.1(EDC 가교제를 사용하여 카보디이미드 화학을 통해 알렉사플루오르488-셀룰라제와 컨쥬게이트된 PMP), b.3(NH2-DBCO 링커를 사용하여 알렉사플루오르488-셀룰라제-아지드와 컨쥬게이트된 PMP), b.2(NH2-DBCO 링커를 사용하여 알렉사플루오르488-셀룰라제-아지드와 컨쥬게이트된 PMP) 또는 b.1(NHS-포스핀을 사용하여 알렉사플루오르488-셀룰라제-아지드와 컨쥬게이트된 PMP)을 사용하여 셀룰라제로 변형된 LPMP의 흡수. 셀룰라제-변형 PMP의 흡수는 세포 내의 PKH26 형광 신호의 존재에 의해 나타난다. 기준자: 100 ㎛.
예를 들어, 동물 세포(예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포), 식물 세포, 박테리아 세포 또는 진균 세포에 의한 향상된 세포 흡수를 갖는 변형된 식물 메신저 팩(PMP)이 본원에서 특성화된다. PMP는 식물 세포외 소포(EV) 또는 그의 세그먼트, 부분 또는 추출물로부터 전체적으로 또는 부분적으로 생산된 지질 어셈블리이다. PMP는 추가의 제제(예를 들어, 이종 기능성 제제(예를 들어, 이종 농업용제(예를 들어, 농약 제제, 시비제, 제초제, 식물 변형제) 또는 이종 치료제(예를 들어, 항진균제, 항박테리아제, 살바이러스제, 항바이러스제, 살충제, 살선충제, 항기생충제, 또는 곤충 기피제)))를 추가로 선택적으로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 변형 PMP, 및 관련 조성물 및 방법은 다양한 농업 및 치료적 방법에서 사용될 수 있다.
I. 변형된 식물 메신저 팩 조성물
본원에 기재된 PMP 조성물은 복수의 변형 식물 메신저 팩(PMP)을 포함한다. PMP는 식물 EV, 또는 그의 세그먼트, 부분 또는 추출물(예를 들어, 지질 추출물)을 포함하는 지질(예를 들어, 지질 이중층, 단층 또는 다층 구조) 구조이다. 식물 EV는 식물에서 자연 발생하며 직경이 약 5 내지 2000 nm인 봉입된 지질-이중층 구조를 지칭한다. 식물 EV는 다양한 식물 생발생 경로로부터 기원할 수 있다. 자연에서, 식물 EV는 식물의 세포내 및 세포외 구획, 예컨대 원형질막 외측에 위치하고 연속적인 세포벽 및 세포외 공간에 의해 형성된 구획인 식물 아포플라스트(apoplast)에서 관찰될 수 있다. 대안적으로, PMP는 식물 세포로부터의 분비 시에 세포 배양 배지에서 관찰되는 농축된 식물 EV일 수 있다. 식물 EV를 본원에 추가로 기재된 다양한 방법에 의해 식물로부터 분리함으로써, PMP를 제공할 수 있다. 또한, PMP는 생체내 또는 시험관내로 도입될 수 있는 이종 기능성 제제(예를 들어, 이종 농업용제(예를 들어, 농약 제제, 시비제, 제초제, 식물 변형제) 또는 이종 치료제(예를 들어, 세포 투과제, 항진균제, 항박테리아제, 살바이러스제, 항바이러스제, 살충제, 살선충제, 항기생충제, 또는 곤충 기피제))를 추가로 선택적으로 포함할 수 있다.
PMP는 식물 EV, 그의 세그먼트, 부분 또는 추출물을 포함할 수 있다. 선택적으로, PMP는 또한, 식물 EV로부터 유래된 지질에 더하여, 외인성 지질(예를 들어, 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤)), 양이온성 지질, 쯔비터이온성 지질 또는 이온화 가능한 지질)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 식물 EV는 직경이 약 5 내지 1000 ㎚이다. 예를 들어, PMP는 식물 EV, 또는 그의 세그먼트, 부분 또는 추출물을 포함할 수 있으며, 이는 약 5 내지 50 ㎚, 약 50 내지 100 ㎚, 약 100 내지 150 ㎚, 약 150 내지 200 ㎚, 약 200 내지 250 ㎚, 약 250 내지 300 ㎚, 약 300 내지 350 ㎚, 약 350 내지 400 ㎚, 약 400 내지 450 ㎚, 약 450 내지 500 ㎚, 약 500 내지 550 ㎚, 약 550 내지 600 ㎚, 약 600 내지 650 ㎚, 약 650 내지 700 ㎚, 약 700 내지 750 ㎚, 약 750 내지 800 ㎚, 약 800 내지 850 ㎚, 약 850 내지 900 ㎚, 약 900 내지 950 ㎚, 약 950 내지 1000 ㎚, 약 1000 내지 1250㎚, 약 1250 내지 1500㎚, 약 1500 내지 1750㎚ 또는 약 1750 내지 2000㎚의 평균 직경을 갖는다. 일부 경우에, PMP는 식물 EV, 또는 그의 세그먼트, 부분 또는 추출물을 포함하며, 이는 약 5 내지 950 ㎚, 약 5 내지 900 ㎚, 약 5 내지 850 ㎚, 약 5 내지 800 ㎚, 약 5 내지 750 ㎚, 약 5 내지 700 ㎚, 약 5 내지 650 ㎚, 약 5 내지 600 ㎚, 약 5 내지 550 ㎚, 약 5 내지 500 ㎚, 약 5 내지 450 ㎚, 약 5 내지 400 ㎚, 약 5 내지 350 ㎚, 약 5 내지 300 ㎚, 약 5 내지 250 ㎚, 약 5 내지 200 ㎚, 약 5 내지 150 ㎚, 약 5 내지 100 ㎚, 약 5 내지 50 ㎚ 또는 약 5 내지 25 ㎚의 평균 직경을 갖는다. 특정 경우에, 식물 EV, 또는 그의 세그먼트, 부분 또는 추출물은 약 50 내지 200 ㎚의 평균 직경을 갖는다. 특정 경우에, 식물 EV, 또는 그의 세그먼트, 부분 또는 추출물은 약 50 내지 300 ㎚의 평균 직경을 갖는다. 특정 경우에, 식물 EV, 또는 그의 세그먼트, 부분 또는 추출물은 약 200 내지 500 ㎚의 평균 직경을 갖는다. 특정 경우에, 식물 EV, 또는 그의 세그먼트, 부분 또는 추출물은 약 30 내지 150 ㎚의 평균 직경을 갖는다.
일부 경우에, PMP는 식물 EV, 또는 그의 세그먼트, 부분 또는 추출물을 포함할 수 있으며, 이는 적어도 5 ㎚, 적어도 50 ㎚, 적어도 100 ㎚, 적어도 150 ㎚, 적어도 200 ㎚, 적어도 250 ㎚, 적어도 300 ㎚, 적어도 350 ㎚, 적어도 400 ㎚, 적어도 450 ㎚, 적어도 500 ㎚, 적어도 550 ㎚, 적어도 600 ㎚, 적어도 650 ㎚, 적어도 700 ㎚, 적어도 750 ㎚, 적어도 800 ㎚, 적어도 850 ㎚, 적어도 900 ㎚, 적어도 950 ㎚ 또는 적어도 1000 ㎚의 평균 직경을 갖는다. 일부 경우에, PMP는 식물 EV, 또는 그의 세그먼트, 부분 또는 추출물을 포함하며, 이는 1000 ㎚ 미만, 950 ㎚ 미만, 900 ㎚ 미만, 850 ㎚ 미만, 800 ㎚ 미만, 750 ㎚ 미만, 700 ㎚ 미만, 650 ㎚ 미만, 600 ㎚ 미만, 550 ㎚ 미만, 500 ㎚ 미만, 450 ㎚ 미만, 400 ㎚ 미만, 350 ㎚ 미만, 300 ㎚ 미만, 250 ㎚ 미만, 200 ㎚ 미만, 150 ㎚ 미만, 100 ㎚ 미만 또는 50 ㎚ 미만의 평균 직경을 갖는다. 해당 분야의 다양한 표준 방법(예를 들어, 동적 광산란 방법)을 사용하여 식물 EV, 또는 그의 세그먼트, 부분 또는 추출물의 입자 직경을 측정할 수 있다.
일부 경우에, PMP는 식물 EV, 또는 그의 세그먼트, 부분 또는 추출물을 포함할 수 있으며, 이는 77 ㎚2 내지 3.2 x106 ㎚2(예를 들어, 77 내지 100 ㎚2, 100 내지 1000 ㎚2, 1000 내지 1x104 ㎚2, 1x104 내지 1x105 ㎚2, 1x105 내지 1x106 ㎚2 또는 1x106 내지 3.2x106 ㎚2)의 평균 표면적을 갖는다. 일부 경우에, PMP는 식물 EV, 또는 그의 세그먼트, 부분 또는 추출물을 포함할 수 있으며, 이는 65 ㎚3 내지 5.3x108 ㎚3(예를 들어, 65 내지 100 ㎚3, 100 내지 1000 ㎚3, 1000 내지 1x104 ㎚3, 1x104 내지 1x105 ㎚3, 1x105 내지 1x106 ㎚3, 1x106 내지 1x107 ㎚3, 1x107 내지 1x108 ㎚3, 1x108 내지 5.3x108 ㎚3)의 평균 부피를 갖는다. 일부 경우에, PMP는 식물 EV, 또는 그의 세그먼트, 부분 또는 추출물을 포함할 수 있으며, 이는 적어도 77 ㎚2(예를 들어, 적어도 77 ㎚2, 적어도 100 ㎚2, 적어도 1000 ㎚2, 적어도 1x104 ㎚2, 적어도 1x105 ㎚2, 적어도 1x106 ㎚2 또는 적어도 2x106 ㎚2)의 평균 표면적을 갖는다. 일부 경우에, PMP는 식물 EV, 또는 그의 세그먼트, 부분 또는 추출물을 포함할 수 있으며, 이는 적어도 65 ㎚3(예를 들어, 적어도 65 ㎚3, 적어도 100 ㎚3, 적어도 1000 ㎚3, 적어도 1x104 ㎚3, 적어도 1x105 ㎚3, 적어도 1x106 ㎚3, 적어도 1x107 ㎚3, 적어도 1x108 ㎚3, 적어도 2x108 ㎚3, 적어도 3x108 ㎚3, 적어도 4x108 ㎚3 또는 적어도 5x108 ㎚3의 평균 부피를 갖는다.
일부 경우에, PMP는 식물 EV, 또는 그의 세그먼트, 추출물 또는 부분과 동일한 크기를 가질 수 있다. 대안적으로, PMP는 PMP가 생산되는 초기 식물 EV와 상이한 크기를 가질 수 있다. 예를 들어, PMP는 약 5 내지 2000 ㎚ 직경의 직경을 가질 수 있다. 예를 들어, PMP는 약 5 내지 50 ㎚, 약 50 내지 100 ㎚, 약 100 내지 150 ㎚, 약 150 내지 200 ㎚, 약 200 내지 250 ㎚, 약 250 내지 300 ㎚, 약 300 내지 350 ㎚, 약 350 내지 400 ㎚, 약 400 내지 450 ㎚, 약 450 내지 500 ㎚, 약 500 내지 550 ㎚, 약 550 내지 600 ㎚, 약 600 내지 650 ㎚, 약 650 내지 700 ㎚, 약 700 내지 750 ㎚, 약 750 내지 800 ㎚, 약 800 내지 850 ㎚, 약 850 내지 900 ㎚, 약 900 내지 950 ㎚, 약 950 내지 1000㎚, 약 1000 내지 1200 ㎚, 약 1200 내지 1400 ㎚, 약 1400 내지 1600 ㎚, 약 1600 내지 1800 ㎚ 또는 약 1800 내지 2000 ㎚의 평균 직경을 가질 수 있다. 일부 경우에, PMP는 적어도 5 ㎚, 적어도 50 ㎚, 적어도 100 ㎚, 적어도 150 ㎚, 적어도 200 ㎚, 적어도 250 ㎚, 적어도 300 ㎚, 적어도 350 ㎚, 적어도 400 ㎚, 적어도 450 ㎚, 적어도 500 ㎚, 적어도 550 ㎚, 적어도 600 ㎚, 적어도 650 ㎚, 적어도 700 ㎚, 적어도 750 ㎚, 적어도 800 ㎚, 적어도 850 ㎚, 적어도 900 ㎚, 적어도 950 ㎚, 적어도 1000 ㎚, 적어도 1200 ㎚, 적어도 1400 ㎚, 적어도 1600 ㎚, 적어도 1800 ㎚ 또는 약 2000 ㎚의 평균 직경을 가질 수 있다. 해당 분야의 다양한 표준 방법(예를 들어, 동적 광산란 방법)을 사용하여 PMP의 입자 직경을 측정할 수 있다. 일부 경우에, PMP의 크기는 이종 기능성 제제의 로딩 후에 또는 PMP에 대한 다른 변형 후에 결정된다.
일부 경우에, PMP는 77 ㎚2 내지 1.3 x107 ㎚2(예를 들어, 77 내지 100 ㎚2, 100 내지 1000 ㎚2, 1000 내지 1x104 ㎚2, 1x104 내지 1x105 ㎚2, 1x105 내지 1x106 ㎚2 또는 1x106 내지 1.3x107 ㎚2)의 평균 표면적을 가질 수 있다. 일부 경우에, PMP는 65 ㎚3 내지 4.2 x109 ㎚3(예를 들어, 65 내지 100 ㎚3, 100 내지 1000 ㎚3, 1000 내지 1x104 ㎚3, 1x104 내지 1x105 ㎚3, 1x105 내지 1x106 ㎚3, 1x106 내지 1x107 ㎚3, 1x107 내지 1x108 ㎚3, 1x108 내지 1x109 ㎚3 또는 1x109 내지 4.2 x109 ㎚3)의 평균 부피를 가질 수 있다. 일부 경우에, PMP는 적어도 77 ㎚2(예를 들어, 적어도 77 ㎚2, 적어도 100 ㎚2, 적어도 1000 ㎚2, 적어도 1x104 ㎚2, 적어도 1x105 ㎚2, 적어도 1x106 ㎚2 또는 적어도 1x107 ㎚2)의 평균 표면적을 갖는다. 일부 경우에, PMP는 적어도 65 ㎚3(예를 들어, 적어도 65 ㎚3, 적어도 100 ㎚3, 적어도 1000 ㎚3, 적어도 1x104 ㎚3, 적어도 1x105 ㎚3, 적어도 1x106 ㎚3, 적어도 1x107 ㎚3, 적어도 1x108 ㎚3, 적어도 1x109 ㎚3, 적어도 2x109 ㎚3, 적어도 3x109 ㎚3 또는 적어도 4x109 ㎚3)의 평균 부피를 갖는다.
일부 경우에, PMP는 무손상 식물 EV를 포함할 수 있다. 대안적으로, PMP는 식물 EV의 소포의 총 표면적의 세그먼트, 부분 또는 추출물(예를 들어, 소포의 총 표면적의 100% 미만(예를 들어, 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만)을 포함하는 세그먼트, 부분 또는 추출물)을 포함할 수 있다. 세그먼트, 부분 또는 추출물은 임의의 형상, 예컨대 원주 세그먼트, 구형 세그먼트(예를 들어, 반구형), 곡선 세그먼트, 선형 세그먼트 또는 편평한 세그먼트일 수 있다. 세그먼트가 소포의 구형 세그먼트인 경우에, 구형 세그먼트는 한 쌍의 평행선을 따른 구형 소낭의 분할로부터 야기되는 것, 또는 한 쌍의 비-평행 선을 따른 구형 소낭의 분할로부터 야기되는 것을 나타낼 수 있다. 따라서, 복수의 PMP는 복수의 무손상 식물 EV, 복수의 식물 EV 세그먼트, 부분 또는 추출물, 또는 식물 EV의 무손상 및 세그먼트의 혼합물을 포함할 수 있다. 당업자는 무손상 대 세그먼트화된 식물 EV의 비가 사용되는 특정 단리 방법에 좌우될 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 식물 또는 그의 부분의 분쇄(grinding) 또는 블렌딩은, 비-파괴적 추출 방법, 예컨대 진공-침투보다 더 높은 백분율의 식물 EV 세그먼트, 부분 또는 추출물을 함유하는 PMP를 생산할 수 있다.
PMP가 식물 EV의 세그먼트, 부분 또는 추출물을 포함하는 경우에, EV 세그먼트, 부분 또는 추출물은 무손상 소포의 것보다 더 낮은 평균 표면적, 예를 들어, 77 ㎚2, 100 ㎚2, 1000 ㎚2, 1x104 ㎚2, 1x105 ㎚2, 1x106 ㎚2 또는 3.2x106 ㎚2 미만의 평균 표면적을 가질 수 있다. 일부 경우에, EV 세그먼트, 부분 또는 추출물은 70 ㎚2, 60 ㎚2, 50 ㎚2, 40 ㎚2, 30 ㎚2, 20 ㎚2 또는 10 ㎚2 미만의 표면적을 갖는다. 일부 경우에, PMP는 식물 EV, 또는 그의 세그먼트, 부분 또는 추출물을 포함할 수 있으며, 이는 무손상 소포의 것보다 더 낮은 평균 부피, 예를 들어, 65 ㎚3, 100 ㎚3, 1000 ㎚3, 1x104 ㎚3, 1x105 ㎚3, 1x106 ㎚3, 1x107 ㎚3, 1x108 ㎚3 또는 5.3x108 ㎚3 미만의 평균 부피를 갖는다.
PMP가 식물 EV의 추출물을 포함하는 경우에, 예를 들어, PMP가 식물 EV로부터 (예를 들어, 클로로포름을 사용하여) 추출된 지질을 포함하는 경우에, PMP는 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 99% 초과의 식물 EV로부터 (예를 들어, 클로로포름을 사용하여) 추출된 지질을 포함할 수 있다. 복수의 PMP 중 PMP는 식물 EV 세그먼트 및/또는 EV-추출된 지질 또는 그의 혼합물을 포함할 수 있다.
변형된 PMP의 생산 방법, PMP와 회합될 수 있는 식물 EV 마커 및 PMP를 포함하는 조성물에 대한 제형에 관한 상세사항이 본원에 추가로 약술된다.
A. 생산 방법
PMP는 식물 조직 또는 식물 세포를 포함하는 식물 또는 그의 부분에 자연적으로 존재하는 식물 EV, 또는 그의 세그먼트, 부분 또는 추출물(예를 들어, 지질 추출물)로부터 생산될 수 있다. 예시적인 PMP의 생산 방법은 (a) 식물 또는 그의 부분으로부터 초기 시료를 제공하는 단계로서, 식물 또는 그의 부분이 EV를 포함하는 단계; 및 (b) 초기 시료로부터 미정제 PMP 분획을 단리하는 단계로서, 미정제 PMP 분획이 초기 시료 내의 수준에 비하여 감소된 수준의 식물 또는 그의 부분 유래의 적어도 하나의 오염물질 또는 원하지 않는 성분을 갖는 단계를 포함한다. 당해 방법은 (c) 미정제 PMP 분획을 정제함으로써, 복수의 순수한 PMP를 생산하는 단계로서, 복수의 순수한 PMP가 미정제 EV 분획 내의 수준에 비하여 감소된 수준의 식물 또는 그의 부분 유래의 적어도 하나의 오염물질 또는 원하지 않는 성분을 갖는 단계를 포함하는 추가의 단계를 추가로 포함할 수 있다. 각각의 생산 단계는 하기에 추가로 상세히 논의되어 있다. PMP의 단리 및 정제에 관한 예시적인 방법은 예를 들어, 문헌[Rutter and Innes, Plant Physiol. 173(1): 728-741, 2017]; 문헌[Rutter et al, Bio. Protoc. 7(17): e2533, 2017]; 문헌[Regente et al, J of Exp. Biol. 68(20): 5485-5496, 2017]; 문헌[Mu et al, Mol. Nutr. Food Res., 58, 1561-1573, 2014] 및 문헌[Regente et al, FEBS Letters. 583: 3363-3366, 2009]에 밝혀져 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
일부 경우에, 복수의 PMP는 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 식물로부터 단리될 수 있다: (a) 식물 또는 그의 부분으로부터 초기 시료를 제공하는 단계로서, 식물 또는 그의 부분이 EV를 포함하는 단계; (b) 초기 시료로부터 미정제 PMP 분획을 단리하는 단계로서, 미정제 PMP 분획이 초기 시료 내의 수준에 비하여 감소된 수준(예를 들어, 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% 또는 100% 감소된 수준)의 식물 또는 그의 부분 유래의 적어도 하나의 오염물질 또는 원하지 않는 성분을 갖는 단계; 및 (c) 미정제 PMP 분획을 정제함으로써, 복수의 순수한 PMP를 생산하는 단계로서, 복수의 순수한 PMP가 미정제 EV 분획 내의 수준에 비하여 감소된 수준(예를 들어, 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% 또는 100% 감소된 수준)의 식물 또는 그의 부분 유래의 적어도 하나의 오염물질 또는 원하지 않는 성분을 갖는 단계.
본원에 제공된 PMP는 다양한 식물로부터 생산된 식물 EV, 또는 그의 세그먼트, 부분 또는 추출물을 포함할 수 있다. PMP는 속씨식물(단자엽 및 쌍자엽 식물), 겉씨식물, 양치식물, 셀라기넬라(selaginella), 쇠뜨기(horsetail), 솔잎란(psilophyte), 석송류(lycophyte), 조류(예를 들어, 단세포 또는 다세포, 예를 들어, 원시색소체생물) 또는 선태류(bryophyte)를 포함하나 이들에 한정되지 않는 임의의 속의 식물(유관속 또는 무관속)로부터 생산될 수 있다. 특정 경우에, PMP는 유관속 식물, 예를 들어, 단자엽식물 또는 쌍자엽식물 또는 겉씨식물을 이용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, PMP는 알팔파, 사과, 아라비돕시스, 바나나, 보리, 브라시카 종(예를 들어, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 또는 브라시카 나푸스(Brassica napus)),캐놀라, 피마자, 치커리, 국화, 클로버, 코코아, 커피, 목화, 목화씨, 옥수수, 크람베(crambe), 크랜베리, 오이, 덴드로비움(dendrobium), 마속(dioscorea), 유칼립투스, 페스큐(fescue), 아마, 글라디올러스(gladiolus), 백합과(liliacea), 아마씨, 기장, 머스크 멜론, 겨자, 귀리, 기름 야자, 종유 평지(oilseed rape), 파파야, 땅콩, 파인애플, 관상용 식물, 강낭콩, 감자, 유채, 쌀, 호밀, 호밀풀, 홍화, 참깨, 수수, 대두, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 딸기, 담배, 토마토, 잔디, 밀 또는 채소 작물, 예컨대 상추, 셀러리, 브로콜리, 콜리플라워, 박과; 과실 및 견과류 나무, 예컨대 사과, 배, 복숭아, 오렌지, 자몽, 레몬, 라임, 아몬드, 피칸, 호두, 헤이즐; 덩굴식물, 예컨대 포도, 키위, 홉(hop); 과실 관목 및 브램블(bramble), 예컨대 라즈베리, 블랙베리, 구스베리; 임목, 예컨대 물푸레나무, 소나무, 전나무, 단풍나무, 참나무, 밤나무, 포플러를 이용하여; 알팔파, 캐놀라, 피마자, 옥수수, 목화, 크람베, 아마, 아마씨, 겨자, 기름 야자, 종유 평지, 땅콩, 감자, 쌀, 홍화, 참깨, 대두, 사탕무, 해바라기, 담배, 토마토 또는 밀을 사용하여 생산될 수 있다.
PMP는 전체 식물(예를 들어, 전체 로제트(rosette) 또는 묘목)로부터 또는 대안적으로 하나 이상의 식물 부분(예를 들어, 잎, 종자, 뿌리, 과실, 채소, 화분, 사부수액 또는 목부수액)을 이용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, PMP는 슈트(shoot) 식물 기관/구조(예를 들어, 잎, 줄기 또는 덩이줄기), 뿌리, 꽃 및 꽃 기관/구조(예를 들어, 화분, 포엽, 꽃받침, 꽃잎, 수술, 심피, 꽃밥 또는 밑씨), 종자(배아, 배유 또는 종피 포함), 과실(성숙 씨방), 수액(예를 들어, 사부수액 또는 목부수액), 식물 조직(예를 들어, 관다발 조직, 지상 조직, 종양 조직 등) 및 세포(예를 들어, 단일 세포, 원형질체, 배아, 캘러스 조직, 공변 세포, 난세포 등) 또는 이의 자손을 이용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 단리 단계는 (a) 식물 또는 그의 부분을 제공하는 것을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 식물 부분은 아라비돕시스 잎이다. 식물은 임의의 발생 단계에 있을 수 있다. 예를 들어, PMP는 묘목, 예를 들어, 1주령, 2주령, 3주령, 4주령, 5주령, 6주령, 7주령 또는 8주령 묘목(예를 들어, 아라비돕시스 묘목)을 이용하여 생산될 수 있다. 다른 예시적인 PMP는 뿌리(예를 들어, 생강 뿌리), 과실즙(예를 들어, 자몽 즙), 채소(예를 들어, 브로콜리), 화분(예를 들어, 올리브 화분), 사부수액(예를 들어, 아라비돕시스 사부수액) 또는 목부수액(예를 들어, 토마토 식물 목부수액)을 이용하여 생산된 PMP를 포함할 수 있다.
PMP는 다양한 방법에 의해 식물 또는 그의 부분을 이용하여 생산될 수 있다. 식물의 EV-함유 아포플라스트 분획 또는 다르게는 분비된 EV를 포함하는 PMP를 함유하는 세포외 분획(예를 들어, 세포 배양 배지)의 방출을 가능하게 하는 임의의 방법이 본 발명의 방법에서 적합하다. EV는 파괴적(예를 들어, 식물 또는 임의의 식물 부분의 분쇄 또는 블렌딩) 또는 비-파괴적(식물 또는 임의의 식물 부분의 세척 또는 진공 침투) 방법에 의해 식물 또는 식물 부분으로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 식물 또는 그의 부분을 진공-침투하거나, 분쇄하거나, 블렌딩하거나, 그의 조합에 의해, 식물 또는 식물 부분으로부터 EV를 단리함으로써 PMP를 생산할 수 있다. 예를 들어, 단리 단계는 식물을 (예를 들어, 소포 단리 완충액으로) 진공 침투시켜, 아포플라스트 분획을 방출하고 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 단리 단계는 식물을 분쇄하거나 블렌딩하여 EV를 방출시킴으로써, PMP를 생산하는 것을 포함할 수 있다.
식물 EV의 단리에 의한 PMP의 생산 시에, PMP는 미정제 PMP 분획(예를 들어, 아포플라스트 분획) 내로 분리되거나 수집될 수 있다. 예를 들어, 분리 단계는 복수의 PMP를 원심분리(예를 들어, 분별 원심분리 또는 초원심분리) 및/또는 여과를 사용하여 미정제 PMP 분획 내로 분리하여, 식물 조직 데브리스 또는 식물 세포를 포함하는 쿤 오염물질로부터 PMP-함유 분획을 분리하는 것을 포함할 수 있다. 이와 같이, 미정제 PMP 분획은 식물 또는 식물 부분 유래의 초기 시료에 비하여, 식물 조직 데브리스, 또는 식물 세포를 포함하는 큰 오염물질의 수가 감소될 것이다. 사용하는 방법에 따라, 미정제 PMP 분획은 식물 또는 식물 부분 유래의 초기 시료에 비하여, 감소된 수준의 식물 세포 세포소기관(예를 들어, 핵, 미토콘드리아 또는 엽록체)을 추가적으로 포함할 수 있다.
일부 경우에, 단리 단계는 복수의 PMP를 원심분리(예를 들어, 분별 원심분리 또는 초원심분리) 및/또는 여과를 사용하여 미정제 PMP 분획 내로 분리하여, PMP-함유 분획을 식물 세포 또는 세포 데브리스로부터 분리하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 미정제 PMP 분획은 공급원 식물 또는 식물 부분 유래의 초기 시료에 비하여, 식물 세포 또는 세포 데브리스의 수가 감소될 것이다.
미정제 PMP 분획을 추가의 정제 방법에 의해 추가로 정제하여, 복수의 순수한 PMP를 생산할 수 있다. 예를 들어, 미정제 PMP 분획은 예를 들어, 밀도 기울기(이오딕사놀 또는 수크로스)를 사용하는 초원심분리 및/또는 응집된 성분을 제거하기 위한 다른 접근법(예를 들어, 침전 또는 크기-배제 크로마토그래피)의 이용에 의해 다른 식물 성분으로부터 분리될 수 있다. 생성된 순수한 PMP는 조기의 분리 단계 동안 생성된 하나 이상의 분획에 비하여, 또는 사전-확립된 임계값 수준, 예를 들어, 상업적 출시 사양에 비하여, 감소된 수준의 공급원 식물 유래의 오염물질 또는 다른 원하지 않는 성분(예를 들어, 하나 이상의 비-PMP 성분, 예컨대 단백질 응집물, 핵산 응집물, 단백질-핵산 응집물, 유리 지질단백질, 지질-단백질 구조), 핵, 세포벽 성분, 세포 세포소기관 또는 그의 조합)을 가질 수 있다. 예를 들어, 순수한 PMP는 초기 시료 내의 수준에 비하여 감소된 수준(예를 들어, 약 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과; 또는 약 2배, 4배, 5배, 10배, 20배, 25배, 50배, 75배, 100배 또는 100배 초과)의 식물 세포소기관 또는 세포벽 성분을 가질 수 있다. 일부 경우에, 순수한 PMP는 하나 이상의 비-PMP 성분, 예컨대 단백질 응집물, 핵산 응집물, 단백질-핵산 응집물, 유리 지질단백질, 지질-단백질 구조), 핵, 세포벽 성분, 세포 세포소기관 또는 그의 조합이 실질적으로 없다(예를 들어, 그의 검출 불가능한 수준을 갖는다). 방출 및 분리 단계의 추가의 예는 실시예 1에서 찾을 수 있다. PMP는 예를 들어, 1x109개, 5x109개, 1x1010개, 5x1010개, 5x1010개, 1x1011개, 2x1011개, 3x1011개, 4x1011개, 5x1011개, 6x1011개, 7x1011개, 8x1011개, 9x1011개, 1x1012개, 2x1012개, 3x1012개, 4x1012개, 5x1012개, 6x1012개, 7x1012개, 8x1012개, 9x1012개, 1x1013개, 또는 1x1013개 초과의 PMP/㎖의 농도로 존재할 수 있다.
예를 들어, 단백질 응집물은 PMP로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, PMP를 (예를 들어, pH 프로브를 사용하여 측정되는 바와 같은) 다양한 pH에서 취하여, 단백질 응집물을 용액 중에 침전시킬 수 있다. pH를 예를 들어, 수산화나트륨 또는 염산의 첨가를 사용하여 예를 들어, pH 3, pH 5, pH 7, pH 9 또는 pH 11로 조정할 수 있다. 용액이 특정 pH로 존재하면, 그것을 여과하여, 미립자를 제거할 수 있다. 대안적으로, PMP를 하전된 중합체, 예컨대 폴리민(Polymin)-P 또는 프라에스톨(Praestol) 2640의 첨가를 사용하여 응집시킬 수 있다. 약술하여, Polymin-P 또는 Praestol 2640을 용액에 첨가하고, 임펠러를 사용하여 혼합한다. 그 다음, 용액을 여과하여, 미립자를 제거할 수 있다. 대안적으로, 염 농도를 증가시킴으로써 응집물을 가용화시킬 수 있다. 예를 들어, NaCl이 예를 들어, 1 mol/ℓ로 존재할 때까지, 그것을 PMP에 첨가할 수 있다. 그 다음, 용액을 여과하여 PMP를 단리할 수 있다. 대안적으로, 온도를 증가시킴으로써 응집물을 가용화시킨다. 예를 들어, 용액이 예를 들어, 5분 동안 50℃의 균일한 온도에 도달할 때까지 PMP를 혼합 하에 가열할 수 있다. 그 다음, PMP 혼합물을 여과하여, PMP를 단리할 수 있다. 대안적으로, PMP 용액으로부터의 가용성 오염물질을 표준 절차에 따라 크기-배제 크로마토그래피에 의해 분리할 수 있으며, 여기서, PMP는 제1 분획 내에 용리되는 한편, 단백질 및 리보핵단백질 및 일부 지질단백질은 이후에 용리된다. BCA/브래드포드(Bradford) 단백질 정량화를 통한 단백질 응집물의 제거 이전 및 이후에 단백질 농도를 측정하고 비교함으로써 단백질 응집물 제거의 효율을 결정할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 생산 방법을 해당 분야에 알려져 있는 임의의 정량적 또는 정성적 방법으로 보완하여, 생산 방법의 임의의 단계에서 PMP를 특성화하거나 확인할 수 있다. PMP를 다양한 분석 방법에 의해 특성화하여, PMP 수율, PMP 농도, PMP 순도, PMP 조성 또는 PMP 크기를 추정할 수 있다. PMP는 PMP의 가시화, 정량화 또는 정성적 특성화(예를 들어, 조성의 확인)를 가능하게 하는 해당 분야에 알려져 있는 다수의 방법, 예컨대 현미경법(예를 들어, 투과 전자 현미경법), 동적 광산란, 나노입자 추적, 분광법(예를 들어, 푸리에 변환 적외선 분석) 또는 질량 분광광도법(단백질 및 지질 분석)에 의해 평가될 수 있다. 특정 경우에, 방법(예를 들어, 질량 분석법)을 사용하여, PMP 상에 존재하는 식물 EV 마커, 예컨대 부록에 개시된 마커를 확인할 수 있다. PMP 분획의 분석 및 특성화를 보조하기 위하여, PMP를 추가로 표지하거나 염색할 수 있다. 예를 들어, PMP를 3,3'-디헥실옥사카보시아닌 아이오다이드(DIOC6), 형광 친지성 염료, PKH67(시그마 알드리치(Sigma Aldrich); 알렉사 플루오르® 488(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)) 또는 DyLightTM 800(써모 피셔)으로 염색할 수 있다. 정교한 형태의 나노입자 추적의 부재 하에서, 상대적으로 간단한 이 접근법은 총 멤브레인 함량을 정량화하며, 이를 사용하여 PMP의 농도를 간접적으로 측정할 수 있다(문헌[Rutter and Innes, Plant Physiol. 173(1): 728-741, 2017]; 문헌[Rutter et al, Bio. Protoc. 7(17): e2533, 2017]). 더욱 정밀한 측정을 위하여, 그리고 PMP의 크기 분포를 평가하기 위하여, 나노입자 추적을 사용할 수 있다.
생산 과정 동안, PMP가 대조군 또는 초기 시료 내의 EV 수준에 비하여 증가된 농도(예를 들어, 약 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과; 또는 약 2배, 4배, 5배, 10배, 20배, 25배, 50배, 75배, 100배 또는 100배 초과)로 존재하도록 PMP를 선택적으로 제조할 수 있다. PMP는 PMP 조성물의 약 0.1% 내지 약 100%, 예컨대 약 0.01% 내지 약 100%, 약 1% 내지 약 99.9%, 약 0.1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 99% 또는 약 75% 내지 약 100% 중 어느 하나를 구성할 수 있다. 일부 경우에, 조성물은 (예를 들어, 형광 표지된 지질을 측정함으로써; 예를 들어, 실시예 3 참조) 예를 들어, wt/vol, PMP 단백질 조성 백분율 및/또는 지질 조성 백분율에 의해 측정시, 적어도 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상 중 어느 하나의 PMP를 포함한다. 일부 경우에, 농축된 제제는 상업적 제품으로서 사용되며, 예를 들어, 최종 사용자는 실질적으로 더 낮은 농도의 활성 성분을 갖는 희석된 제제를 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 농업용 농축 제형, 예를 들어, 초-저-부피 농축물 제형으로서 제형화된다.
실시예 1에 예시된 바와 같이, PMP는 다양한 식물 또는 그의 부분(예를 들어, 잎 아포플라스트, 종자 아포플라스트, 뿌리, 과실, 채소, 화분, 사부수액 또는 목부수액)을 이용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, PMP는 식물의 아포플라스트 분획, 예컨대 잎의 아포플라스트(예를 들어, 아포플라스트 아라비돕시스 탈리아나 잎) 또는 종자의 아포플라스트(예를 들어, 해바라기씨의 아포플라스트)로부터 방출될 수 있다. 다른 예시적인 PMP는 뿌리(예를 들어, 생강 뿌리), 과실즙(예를 들어, 자몽 즙), 채소(예를 들어, 브로콜리), 화분(예를 들어, 올리브 화분), 사부수액(예를 들어, 아라비돕시스 사부수액), 목부수액(예를 들어, 토마토 식물 목부수액) 또는 세포 배양 상청액(예를 들어, BY2 담배 세포 배양 상청액)을 이용하여 생산된다. 이 실시예에는 이들 다양한 식물 공급원으로부터의 PMP의 생산이 추가로 나타나 있다.
실시예 2에 예시된 바와 같이, PMP는 다양한 방법에 의해, 예를 들어, 초원심분리 및/또는 응집된 오염물질을 제거하기 위한 방법, 예를 들어, 침전 또는 크기-배제 크로마토그래피와 결합하여 밀도 기울기(이오딕사놀 또는 수크로스)를 사용함으로써 정제될 수 있다. 예를 들어, 실시예 2에는 실시예 1에 요약된 분리 단계를 통해 수득된 PMP의 정제가 예시되어 있다. 추가로, PMP는 실시예 3에 예시된 방법에 따라 특성화될 수 있다.
PMP는 본원에 추가로 약술된 바와 같이, 이용 전에 변형될 수 있다.
B. 변형 PMP 및 PMP 조성물
PMP의 생성 후에, PMP는 미변형 PMP에 비하여 세포 흡수(예를 들어, 동물 세포 흡수(예를 들어, 포유동물 세포 흡수, 예를 들어, 인간 세포 흡수), 식물 세포 흡수, 박테리아 세포 흡수 또는 진균 세포 흡수)를 증가시킬 수 있는 이종 제제(예를 들어, 식물 세포 투과제)를 로딩함으로써 또는 그를 사용하여 제형화시킴으로써 변형될 수 있다. 예를 들어, 변형 PMP는 세포 투과제, 예컨대 효소, 세제, 이온성, 불소 또는 쯔비터이온성 액체 또는 지질을 포함하거나(예를 들어, 로딩되거나, 예를 들어, 캡슐화되거나 컨쥬게이트되거나), 그를 사용하여 제형화(예를 들어, 이를 포함하는 용액 중에 현탁화되거나 재현탁화)될 수 있다.
일부 경우에, 세포 투과제는 효소이다. 예를 들어, 효소는 세포벽(예를 들어, 동물 세포벽, 식물 세포벽, 박테리아 세포벽 또는 진균 세포벽)을 분해할 수 있는 동물, 박테리아, 진균, 원생동물, 포유동물 또는 식물 효소일 수 있다.
일부 경우에, 효소는 식물 세포벽 분해 능력이 있는 박테리아 효소이다. 일부 경우에, 효소는 식물 세포벽 분해 능력이 있는 박테리아 효소의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 일부 경우에, 효소는 식물 세포벽 분해 능력이 있는 진균 효소이다. 일부 경우에, 효소는 식물 세포벽 분해 능력이 있는 진균 효소의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 일부 경우에, 효소는 식물 세포벽 분해 능력이 있는 식물 효소이다. 일부 경우에, 세포벽 분해 효소는 식물 세포벽 분해 능력이 있는 식물 효소의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 일부 경우에, 효소는 식물 세포벽을 분해할 수 있는 원생동물 효소이다. 일부 경우에, 세포벽 분해 효소는 식물 세포벽 분해 능력이 있는 원생동물 효소의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다.
일부 경우에, 효소는 박테리아 세포벽 분해 능력이 있는 박테리아 효소이다. 일부 경우에, 효소는 박테리아 세포벽 분해 능력이 있는 박테리아 효소의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 일부 경우에, 효소는 박테리아 세포벽 분해 능력이 있는 진균 효소이다. 일부 경우에, 효소는 박테리아 세포벽 분해 능력이 있는 진균 효소의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 일부 경우에, 효소는 박테리아 세포벽 분해 능력이 있는 식물 효소이다. 일부 경우에, 세포벽 분해 효소는 박테리아 세포벽 분해 능력이 있는 식물 효소의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 일부 경우에, 효소는 박테리아 세포벽을 분해할 수 있는 원생동물 효소이다. 일부 경우에, 세포벽 분해 효소는 박테리아 세포벽 분해 능력이 있는 원생동물 효소의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다.
일부 경우에, 효소는 진균 세포벽 분해 능력이 있는 박테리아 효소이다. 일부 경우에, 효소는 진균 세포벽 분해 능력이 있는 박테리아 효소의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 일부 경우에, 효소는 진균 세포벽 분해 능력이 있는 진균 효소이다. 일부 경우에, 효소는 진균 세포벽 분해 능력이 있는 진균 효소의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 일부 경우에, 효소는 진균 세포벽 분해 능력이 있는 식물 효소이다. 일부 경우에, 세포벽 분해 효소는 진균 세포벽 분해 능력이 있는 식물 효소의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 일부 경우에, 효소는 진균 세포벽 분해 능력이 있는 원생동물 효소이다. 일부 경우에, 세포벽 분해 효소는 진균 세포벽 분해 능력이 있는 원생동물 효소의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다.
일부 경우에, 효소는 동물 세포외 매트릭스(예를 들어, 포유동물 세포외 매트릭스, 예를 들어, 인간 세포외 매트릭스)를 분해할 수 있는 동물 효소이다.
일부 경우에, 효소는 셀룰라제이다. 예를 들어, 셀룰라제는 박테리아 셀룰라제의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 일부 경우에, 셀룰라제는 진균 셀룰라제의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 일부 경우에, 셀룰라제는 원생동물 셀룰라제의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다.
일부 경우에, 세포 투과제는 세제이다. 일부 구현예에서, 세제는 사포닌 또는 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트(CHAPS)이다.
일부 경우에, 세포벽 투과제는 이온성 액체이다. 일부 구현예에서, 이온성 액체는 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 아세테이트(EMIM 아세테이트)이다. 다른 구현예에서, 이온성 액체는 BMIM 아세테이트, HMIM 아세테이트, MMIM 아세테이트 또는 AllylMIM 아세테이트이다.
일부 경우에, 세포 투과제는 불소 액체이다. 일부 구현예에서, 불소 액체는 퍼플루오로옥탄이다. 다른 구현예에서, 불소 액체는 퍼플루오로헥산 또는 퍼플루오로(메틸데칼린)이다.
일부 경우에, 세포 투과제는 양이온성 지질이다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 DC-콜레스테롤 또는 디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판(DOTAP)이다.
일부 경우에, 세포 투과제는 이온화 가능한 지질이다. 일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 1,1‘-((2-(4-(2-((2-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)에틸) (2-하이드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200) 또는 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헤파트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트, DLin-MC3-DMA(MC3)이다. 일부 경우에, PMP는 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 90% 초과의 이온화 가능한 지질(예를 들어, C12-200 또는 MC3)을 포함한다.
일부 경우에, 세포 투과제는 쯔비터이온성 지질이다. 일부 구현예에서, 쯔비터이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(DOPC) 또는 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC)이다. 일부 경우에, PMP는 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 90% 초과의 쯔비터이온성 지질(예를 들어, DOPC 또는 DEPC)을 포함한다.
제제는 PMP의 흡수를 전체로서 증가시키거나 PMP의 일부 또는 PMP의 성분, 예를 들어, PMP에 의해 담지되는 이종 기능성 제제(예를 들어, 이종 농업용제(예를 들어, 농약 제제, 시비제, 제초제, 식물 변형제) 또는 이종 치료제(예를 들어, 항진균제, 항박테리아제, 살바이러스제, 항바이러스제, 살충제, 살선충제, 항기생충제, 또는 곤충 기피제))의 흡수를 증가시킬 수 있다. 세포 흡수(예를 들어, 식물 세포 흡수, 박테리아 세포 흡수 또는 진균 세포 흡수)가 증가되는 정도는 조성물이 운반되는 식물 또는 식물 부분, PMP 제형 및 PMP에 이루어지는 다른 변형에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 변형 PMP는 미변형 PMP에 비하여 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 증가된 세포 흡수(예를 들어, 동물 세포 흡수, 식물 세포 흡수, 박테리아 세포 흡수 또는 진균 세포 흡수)를 가질 수 있다. 일부 경우에, 증가된 세포 흡수(예를 들어, 동물 세포 흡수, 식물 세포 흡수, 박테리아 세포 흡수 또는 진균 세포 흡수)는 미변형 PMP에 비하여 적어도 2배, 4배, 5배, 10배, 100배 또는 1000배의 증가된 세포 흡수이다.
또 다른 양태에서, PMP를 추가로 다른 성분(예를 들어, 지질, 예를 들어, 스테롤, 예를 들어, 콜레스테롤; 또는 소분자)으로 변형시켜, PMP의 기능적 및 구조적 특징을 변경시킬 수 있다. 예를 들어, PMP를 PMP의 안정성을 증가시키는 안정화 분자로 추가로 변형시킬 수 있다(예를 들어, 실온에서 적어도 1일 동안 및/또는 4℃에서 적어도 1주 동안 안정함).
변형 PMP의 세포 흡수는 해당 분야에 알려져 있는 다양한 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, PMP 또는 그의 성분은 흡수를 확인하기 위하여 단리된 세포에서 검출될 수 있는 마커(예를 들어, 형광 마커)로 표지될 수 있다. 예를 들어, 세포 흡수는 건강, 예를 들어, 처리된 세포를 포함하는 동물, 식물, 박테리아 또는 진균의 건강의 척도에 기초하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법의 효능은 변형 PMP가 결여된 조성물의 처리에 비하여 본 발명의 변형 PMP로 처리된 유기체에서 건강 변화를 비교함으로써 결정될 수 있다.
C. 식물 EV-마커
본 발명의 조성물 및 방법의 PMP는 PMP를 식물 EV를 이용하여 생산되는 것 및/또는 그의 세그먼트, 부분 또는 추출물을 포함하는 것으로서 식별하는 다양한 마커를 가질 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "식물 EV-마커"는 식물과 천연적으로 회합된 및 식물계에서 식물 EV 내로 또는 그 상으로 혼입된 성분, 예컨대 식물 단백질, 식물 핵산, 식물 소분자, 식물 지질 또는 그의 조합을 지칭한다. 식물 EV-마커의 예는 예를 들어, 문헌[Rutter and Innes, Plant Physiol. 173(1): 728-741, 2017]; 문헌[Raimondo et al., Oncotarget. 6(23): 19514, 2015]; 문헌[Ju et al., Mol. Therapy. 21(7):1345-1357, 2013]; 문헌[Wang et al., Molecular Therapy. 22(3): 522-534, 2014]; 및 문헌[Regente et al, J of Exp. Biol. 68(20): 5485-5496, 2017]에서 찾을 수 있으며; 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다. 식물 EV-마커의 추가의 예는 부록에 열거되어 있으며, 본원에 추가로 약술된다.
일부 경우에, 식물 EV 마커는 식물 지질을 포함할 수 있다. PMP에서 관찰될 수 있는 식물 지질 마커의 예에는 피토스테롤, 캄페스테롤, β-시토스테롤, 스티그마스테롤, 아베나스테롤, 글리코실 이노시톨 포스포릴 세라미드(GIPC), 당지질(예를 들어, 모노갈락토실디아실글리세롤(MGDG) 또는 디갈락토실디아실글리세롤(DGDG)) 또는 그의 조합이 포함된다. 예를 들어, PMP는 GIPC를 포함할 수 있으며, 이는 식물 내의 주요 스핑고지질 부류를 나타내며, 식물 내의 가장 풍부한 막 지질 중 하나이다. 다른 식물 EV 마커는 무생물적 또는 생물적 스트레스원(예를 들어, 박테리아 또는 진균 감염)에 반응하여 식물에 축적하는 지질, 예컨대 포스파티드산(PA) 또는 포스파티딜이노시톨-4-포스페이트(PI4P)를 포함할 수 있다.
대안적으로, 식물 EV 마커는 식물 단백질을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 단백질 식물 EV 마커는 식물이 무생물적 또는 생물적 스트레스원(예를 들어, 박테리아 또는 진균 감염)에 반응하여 분비하는 방어 단백질을 포함하여, 식물에 의해 천연적으로 생성되는 항미생물 단백질일 수 있다. 식물 병원체 방어 단백질은 용해성 N-에틸말레미드-감수성 인자 회합 단백질 수용체 단백질(SNARE) 단백질(예를 들어, 신탁신(Syntaxin)-121(SYP121; 진뱅크(GenBank) 수탁 번호: NP_187788.1 또는 NP_974288.1), Penetration1(PEN1; 진뱅크 수탁 번호: NP_567462.1)) 또는 ABC 수송체 Penetration3(PEN3; 진뱅크 수탁 번호: NP_191283.2)을 포함한다. 식물 EV 마커의 다른 예는 체관부 단백질(예를 들어, 체관부 단백질2-A1(PP2-A1), 진뱅크 수탁 번호: NP_193719.1), 칼슘-의존성 지질-결합 단백질 또는 렉틴(예를 들어, 자칼린(Jacalin)-관련 렉틴, 예를 들어, 헬리안투스 안누스(Helianthus annuus) 자칼린(Helja; 진뱅크: AHZ86978.1)을 포함하여, 식물에서 RNA의 장거리 수송을 촉진시키는 단백질을 포함한다. 예를 들어, RNA 결합 단백질은 글라이신-풍부 RNA 결합 단백질-7(GRP7; 진뱅크 수탁 번호: NP_179760.1)일 수 있다. 또한, 원형질연락사 기능을 조절하는 단백질은 일부 경우에 식물 EV에서 관찰될 수 있으며, 이는 시냅(Synap)-토트가민(Totgamin) A A(진뱅크 수탁 번호: NP_565495.1)와 같은 단백질을 포함한다. 일부 경우에, 식물 EV 마커는 지질 대사에 연루되는 단백질, 예컨대 포스포리파제 C 또는 포스포리파제 D를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 식물 단백질 EV 마커는 식물에서의 세포 추적 단백질이다. 식물 EV 마커가 단백질인 특정 경우에, 단백질 마커는 분비된 단백질과 전형적으로 회합된 신호 펩티드가 결여될 수 있다. 비통상적인 분비 단백질은 (i) 리더 서열의 결여, (ii) ER 또는 골지체에 특이적인 번역후 변형(PTM)의 부재 및/또는 (iii) 고전적인 ER/골지-의존성 분비 경로를 차단하는 브레펠딘 A(brefeldin A)에 의해 영향을 받지 않는 분비와 같은 몇몇의 공통의 특징을 공유하는 것으로 보인다. 당업자는 공개적으로 자유롭게 이용 가능한 다양한 툴(예를 들어, SecretomeP 데이터베이스: SUBA3(예를 들어, 아라비돕시스 단백질에 대한 하위세포 국소화 데이터베이스))을 사용하여, 신호 서열 또는 그의 결여에 대하여 단백질을 평가할 수 있다.
식물 EV 마커가 단백질인 경우에, 단백질은 식물 EV 마커, 예컨대, 부록에 열거된 식물 EV 마커 중 임의의 것에 대하여 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 단백질은 아라비돕시스 탈리아나 유래의 PEN1(진뱅크 수탁 번호: NP_567462.1)에 대하여 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 경우에, 식물 EV 마커는 식물에서 인코딩된 핵산, 예를 들어, 식물 RNA, 식물 DNA 또는 식물 PNA를 포함한다. 예를 들어, PMP는 식물에 의해 인코딩된 dsRNA, mRNA, 바이러스 RNA, 마이크로RNA(miRNA) 또는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 핵산은 본원에 논의된 바와 같이, 식물에서 RNA의 장거리 수송을 촉진시키는 단백질과 회합된 것일 수 있다. 일부 경우에, 핵산 식물 EV 마커는 식물이 식물 유해물(예를 들어, 병원체, 예컨대 진균)의 외래 전사물을 침묵화시키는 과정인 숙주-유도된 유전자 침묵화(HIGS)에 연루되는 것일 수 있다. 예를 들어, 핵산은 박테리아 또는 진균 유전자를 침묵화시키는 것일 수 있다. 일부 경우에, 핵산은 마이크로RNA, 예컨대 miR159 또는 miR166일 수 있으며, 이는 진균 병원체(예를 들어, 베르티실리움 달리아에(Verticillium dahliae)) 내의 유전자를 표적화한다. 일부 경우에, 단백질은 식물 방어 화합물의 운반에 연루되는 것, 예컨대 글루코시놀레이트(GSL) 수송 및 대사에 연루되는 단백질일 수 있으며, 이는 글루코시놀레이트 수송체-1 -1(GTR1; 진뱅크 수탁 번호: NP_566896.2), 글루코시놀레이트 수송체-2(GTR2; NP_201074.1) 또는 에피티오-특이적(Epithiospecific) 변형제 1(ESM1; NP_188037.1)을 포함한다.
식물 EV 마커가 핵산인 경우에, 핵산은 식물 EV 마커, 예를 들어, 부록에 열거된 식물 EV 마커를 인코딩하는 것들에 대하여 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 핵산은 miR159 또는 miR166에 대하여 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
일부 경우에, 식물 EV 마커는 식물에 의해 생성되는 화합물을 포함한다. 예를 들어, 화합물은 무생물적 또는 생물적 스트레스원, 예컨대 이차 대사물질에 대한 반응으로 생성되는 방어 화합물일 수 있다. PMP에서 발견되는 하나의 이러한 이차 대사물질은 글루코시놀레이트(GSL)이며, 이는 브라시카세아에(Brassicaceae) 식물에서 주로 발견되는 질소 및 황-함유 이차 대사물질이다. 다른 이차 대사물질은 이종감응물질을 포함할 수 있다.
일부 경우에, PMP는 또한, 전형적으로 식물에 의해 생성되지 않지만, 일반적으로 다른 유기체와 관련된 특정 마커(예를 들어, 동물 EV, 박테리아 EV 또는 진균 EV의 마커)(예를 들어, 지질, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드)의 결여에 기초하여 식물 EV를 이용하여 생성된 것으로서 확인될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, PMP는 동물 EV, 박테리아 EV 또는 진균 EV에서 전형적으로 관찰되는 지질이 결여된다. 일부 경우에, PMP는 동물 EV에 전형적인 지질(예를 들어, 스핑고미엘린)이 결여된다. 일부 경우에, PMP는 박테리아 EV 또는 박테리아 막에 전형적인 지질(예를 들어, LPS)을 함유하지 않는다. 일부 경우에, PMP는 진균 막에 전형적인 지질(예를 들어, 에르고스테롤)이 결여된다.
식물 EV 마커는 소분자(예를 들어, 질량 분석법, 질량 분광광도법), 지질(예를 들어, 질량 분석법, 질량 분광광도법), 단백질(예를 들어, 질량 분석법, 면역블롯팅) 또는 핵산(예를 들어, PCR 분석)의 식별을 가능하게 하는 해당 분야에 알려져 있는 임의의 접근법을 사용하여 확인될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 PMP 조성물은 검출 가능한 양, 예를 들어, 소정의 임계값 양의 본원에 기재된 식물 EV 마커를 포함한다.
D. 제제의 로딩
PMP는 본원에 기재된 것과 같은 이종 기능성 제제, 예를 들어, 세포 투과제 및/또는 이종 농업용제(예를 들어, 농약 제제, 시비제, 제초제, 식물 변형제), 이종 치료제(예를 들어, 항진균제, 항박테리아제, 살바이러스제, 항바이러스제, 살충제, 살선충제, 항기생충제, 또는 곤충 기피제)를 포함하도록 변형될 수 있다. PMP는 표적 유기체(예를 들어, 표적 동물, 식물, 박테리아, 또는 진균)로의 제제의 운반을 가능하게 하는 다양한 수단에 의해, 예를 들어, 제제의 캡슐화, 지질 이중층 구조 내의 성분의 혼입, 또는 (예를 들어, 컨쥬게이션에 의한) 성분과 PMP의 지질 이중층 구조의 표면의 회합에 의해 이러한 제제를 운반하거나, 이와 회합될 수 있다. 일부 경우에, 이종 기능성 제제(예를 들어, 세포 투과제)는, 본원의 섹션 IB에 기재된 바와 같은 PMP 제형에 포함된다.
이종 기능성 제제는 직접적으로 또는 간접적으로 PMP와 제제 사이의 회합을 가능하게 하는 해당 분야에 알려져 있는 임의의 방법에 의해 PMP 내로 또는 그 상으로 혼입되거나 로딩될 수 있다. 이종 기능성 제제는 생체내 방법(예를 들어, 식물체 내에서, 예를 들어, 이종 제제를 포함하는 트랜스제닉 식물로부터의 PMP의 생산을 통함) 또는 시험관내 방법(예를 들어, 조직 배양물에서 또는 세포 배양물에서) 또는 생체내 및 시험관내 방법 둘 모두에 의해 PMP 내로 혼입될 수 있다.
PMP가 이종 기능성 제제(예를 들어, 이종 농업용제(예를 들어, 농약 제제, 시비제, 제초제, 식물 변형제) 또는 이종 치료제(예를 들어, 항진균제, 항박테리아제, 살바이러스제, 항바이러스제, 살충제, 살선충제, 항기생충제, 또는 곤충 기피제))로 생체내에서 로딩되는 경우, PMP는 EV, 또는 그의 절편 또는 부분, 또는 식물체내에서 로딩된 EV를 함유하는 추출물을 이용하여 생산될 수 있다. 식물체내 방법은 EV로의 로딩을 위한 이종 기능성 제제를 발현하도록 유전학적으로 변형된 식물에서 이종 기능성 제제(예를 들어, 이종 농업용제(예를 들어, 농약 제제, 시비제, 제초제, 식물 변형제) 또는 이종 치료제(예를 들어, 항진균제, 항박테리아제, 살바이러스제, 항바이러스제, 살충제, 살선충제, 항기생충제, 또는 곤충 기피제))의 발현을 포함한다. 일부 경우에, 이종 기능성 제제는 식물에 대하여 이종이다. 대안적으로, 이종 기능성 제제는 식물에서 천연적으로 관찰될 수 있지만, 비-유전학적으로 변형된 식물에서 관찰되는 수준에 비하여 상승된 수준으로 발현되도록 조작된다.
일부 경우에, PMP는 시험관내에서 로딩될 수 있다. 물질은 비제한적으로 물리적, 화학적 및/또는 생물학적 방법(예를 들어, 조직 배양 또는 세포 배양)을 사용하여 PMP 상으로 또는 내로 로딩될 수 있다(예를 들어, 그에 의해 캡슐화될 수 있다). 예를 들어, 이종 기능성 제제는 전기천공법, 음파처리, 수동 확산, 교반, 지질 추출 또는 압출 중 하나 이상에 의해 PMP 내로 도입될 수 있다. 로딩된 PMP를 평가하여, 다양한 방법, 예컨대 HPLC(예를 들어, 소분자를 평가하기 위함); 면역블롯팅(예를 들어, 단백질을 평가하기 위함); 및/또는 정량적 PCR(예를 들어, 뉴클레오티드를 평가하기 위함)을 사용하여 로딩된 제제의 존재 또는 수준을 확인할 수 있다. 그러나, 당업자는 PMP 내로의 관심 물질의 로딩이 상기-예시된 방법에 제한되지 않음을 인식해야 한다.
일부 경우에, 이종 기능성 제제는 PMP에 컨쥬게이트될 수 있으며, 이종 기능성 제제는 PMP에 간접적으로 또는 직접적으로 결합되거나 연결된다. 예를 들어, 하나 이상의 이종 기능성 제제가 (예를 들어, 공유 또는 이온 결합에 의해) PMP의 지질 이중층에 직접 연결되도록 하나 이상의 이종 기능성 제제는 PMP에 화학적으로 연결될 수 있다. 일부 경우에, PMP로의 다양한 이종 기능성 제제의 컨쥬게이션은 먼저 하나 이상의 이종 기능성 제제를 적합한 용매 중에서 적절한 교차-결합제(예를 들어, 일반적으로 일차 아민과의 아미드 결합을 위한 카복실 활성화제로서 사용되며, 포스페이트 기와도 반응하는 N-에틸카보- 디이미드("EDC"))와 혼합함으로써 달성될 수 있다. 이종 기능성 제제가 교차-결합제에 부착되게 하기에 충분한 인큐베이션 기간 후에, 교차-결합제/이종 기능성 제제 혼합물을 이어서 PMP와 조합하고, 또 다른 인큐베이션 기간 후에, 수크로스 기울기(예를 들어, 및 8, 30, 45 및 60% 수크로스 기울기)로 처리하여, PMP에 컨쥬게이트된 이종 기능성 제제로부터 유리 이종 기능성 제제 및 유리 PMP를 분리할 수 있다. 혼합물과 수크로스 기울기의 조합 및 수반하는 원심분리 단계의 부분으로서, 이종 기능성 제제에 컨쥬게이트된 PMP는 이어서 수크로스 기울기에서 밴드로 관찰되어, 컨쥬게이트된 PMP를 이어서 수집하고, 세척하고, 본원에 기재된 바와 같은 이용을 위해 적합한 용액 중에 용해시킬 수 있게 한다.
일부 경우에, PMP는 예를 들어, 식물로의 PMP의 운반 이전 및 이후에 이종 기능성 제제와 안정하게 회합된다. 다른 경우에, PMP는 이종 기능성 제제가 예를 들어, 식물로의 PMP의 운반 후에 PMP로부터 분리되도록 이종 기능성 제제와 회합된다.
특정 제제 또는 용도에 따라, 다양한 농도의 이종 기능성 제제를 이용하여 PMP가 로딩될 수 있거나 PMP 조성물이 제형화될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 본원에 개시된 PMP 조성물이 약 0.001, 0.01, 0.1, 1.0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 95(또는 약 0.001 내지 95의 임의의 범위) 또는 그 이상의 wt%의 이종 기능성 제제를 포함하도록 PMP가 로딩되거나 PMP 조성물이 제형화된다. 일부 경우에, PMP 조성물이 약 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1.0, 0.1, 0.01, 0.001(또는 약 95 내지 0.001의 임의의 범위) 또는 그 미만의 wt%의 이종 기능성 제제를 포함하도록 PMP가 로딩되거나 PMP 조성물이 제형화된다. 예를 들어, PMP 조성물은 약 0.001 내지 약 0.01 wt%, 약 0.01 내지 약 0.1 wt%, 약 0.1 내지 약 1 wt%, 약 1 내지 약 5 wt% 또는 약 5 내지 약 10 wt%, 약 10 내지 약 20 wt%의 이종 기능성 제제를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 약 1, 5, 10, 50, 100, 200 또는 500, 1,000, 2,000(또는 약 1 내지 2,000의 임의의 범위) 또는 그 이상의 ㎍/㎖의 이종 기능성 제제를 사용하여 PMP가 로딩되거나 PMP 조성물이 제형화될 수 있다. 약 2,000, 1,000, 500, 200, 100, 50, 10, 5, 1(또는 약 2,000 내지 1의 임의의 범위) 또는 그 미만의 ㎍/㎖의 이종 기능성 제제를 사용하여 본 발명의 PMP가 로딩될 수 있거나 PMP 조성물이 제형화될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 PMP 조성물이 적어도 0.001 wt%, 적어도 0.01 wt%, 적어도 0.1 wt%, 적어도 1.0 wt%, 적어도 2 wt%, 적어도 3 wt%, 적어도 4 wt%, 적어도 5 wt%, 적어도 6 wt%, 적어도 7 wt%, 적어도 8 wt%, 적어도 9 wt%, 적어도 10 wt%, 적어도 15 wt%, 적어도 20 wt%, 적어도 30 wt%, 적어도 40 wt%, 적어도 50 wt%, 적어도 60 wt%, 적어도 70 wt%, 적어도 80 wt%, 적어도 90 wt% 또는 적어도 95 wt%의 이종 기능성 제제를 포함하도록 PMP가 로딩되거나 PMP 조성물이 제형화된다. 일부 경우에, 적어도 1 ㎍/㎖, 적어도 5 ㎍/㎖, 적어도 10 ㎍/㎖, 적어도 50 ㎍/㎖, 적어도 100 ㎍/㎖, 적어도 200 ㎍/㎖, 적어도 500 ㎍/㎖, 적어도 1,000 ㎍/㎖, 적어도 2,000 ㎍/㎖의 이종 기능성 제제를 사용하여 PMP가 로딩되거나 PMP 조성물이 제형화될 수 있다.
일부 경우에, PMP 조성물은 PMP를 이종 기능성 제제를 포함하거나 이로 이루어진 용액 중에 현탁화시킴으로써, 예를 들어, PMP를 격렬한 혼합에 의해 현탁화시키거나 재현탁화시킴으로써, 이종 기능성 제제를 사용하여 제형화된다. 이종 기능성 제제(예를 들어, 세포 투과제, 예를 들어, 효소, 세제, 이온성, 불소, 또는 쯔비터이온성 액체, 또는 지질)는, 예를 들어, 1% 미만, 또는 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%의 용액을 포함할 수 있다.
PMP 내로 로딩될 수 있는 특정 이종 기능성 제제의 예는 제목이 "이종 기능성 제제"인 섹션에 추가로 약술되어 있다.
E. 제타 전위
PMP 조성물은 예를 들어, 카고의 부재 하에 있는 경우 -30 mV 초과, 카고의 부재 하에 있는 경우 -20 mV 초과, -5mV 초과, 0 mV 초과 또는 약 30 mv의 제타 전위를 가질 수 있다. 일부 예에서, PMP 조성물은 음의 제타 전위, 예를 들어, 카고의 부재 하에 있는 경우 0 mV 미만, -10 mV 미만, -20 mV 미만, -30 mV 미만, -40 mV 미만 또는 -50 mV 미만의 제타 전위를 갖는다. 일부 예에서, PMP 조성물은 양의 제타 전위, 예를 들어, 카고의 부재 하에 있는 경우 0 mV 초과, 10 mV 초과, 20 mV 초과, 30 mV 초과, 40 mV 초과 또는 50 mV 초과의 제타 전위를 갖는다. 일부 예에서, PMP 조성물은 약 0의 제타 전위를 갖는다.
PMP 조성물의 제타 전위는 해당 분야에 알려져 있는 임의의 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 제타 전위는 일반적으로 간접적으로 측정되며, 예를 들어, 해당 분야에 알려져 있는 방법 및 기법을 사용하여 수득되는 데이터, 예를 들어, 전기영동 이동도 또는 동적 전기영동 이동도로부터의 이론적 모델을 사용하여 계산된다. 전기영동 이동도는 전형적으로 미량전기영동, 전기영동 광 산란 또는 가변 저항 펄스 감지를 사용하여 측정된다. 전기영동 광 산란은 동적 광 산란에 기초한다. 전형적으로, 제타 전위는 광자 상관 분광법(photon correlation spectroscopy) 또는 준-탄성 광 산란(quasi-elastic light scattering)으로도 알려져 있는 동적 광 산란(dynamic light scattering; DLS) 측정으로부터 이용 가능하다.
F. 제형
i. 농업 제형
적용, 취급, 수송, 보관 및 효과적 활동을 용이하게 하기 위하여, PMP(예를 들어, 본원에 기재된 변형 PMP)는 다른 물질을 사용하여 제형화될 수 있다. PMP는 예를 들어, 미끼, 농축 유제, 분진, 유화성 농축물, 훈증제, 겔, 과립, 마이크로캡슐화제, 종자 처리제, 현탁 농축물, 유현탁액, 정제, 수용성 액체, 수분산성 과립 또는 건조 유동성제, 습윤성 분말 및 초-저 부피 용액으로 제형화될 수 있다. 제형 유형에 대한 추가의 정보에 대하여, 문헌["Catalogue of Pesticide Formulation Types and International Coding System" Technical Monograph n°2, 5th Edition by CropLife International (2002)]을 참조한다.
PMP 조성물은 이러한 제제의 농축된 제형으로부터 제조된 수성 현탁액 또는 유제로서 적용될 수 있다. 이러한 수용성, 수현탁성 또는 유화성 제형은, 통상 습윤성 분말 또는 수분산성 과립으로 공지된 고체, 또는 통상 유화성 농축물 또는 수성 현탁액으로 공지된 액체이다. 압축되어 수분산성 과립을 형성할 수 있는 습윤성 분말은 PMP 조성물, 담체 및 계면활성제의 친밀한 혼합물을 포함한다. 담체는 통상 아타풀자이트 점토, 몬모릴로나이트 점토, 규조토 또는 정제된 실리케이트 중에서 선택된다. 습윤성 분말의 약 0.5% 내지 약 10%를 구성하는 유효한 계면활성제는 술폰화된 리그닌, 축합된 나프탈렌술포네이트, 나프탈렌술포네이트, 알킬벤젠술포네이트, 알킬 술페이트 및 비이온성 계면활성제, 예컨대 알킬 페놀의 에틸렌 옥시드 부가물 중에서 발견된다.
유화성 농축물은 적합한 농도, 예컨대 수혼화성 용매이거나 또는 수불혼화성 유기 용매와 유화제의 혼합물인 담체 중에 용해된 액체 리터당 약 50 내지 약 500 그램의 PMP를 포함할 수 있다. 유용한 유기 용매는 방향족, 특히 자일렌 및 석유 분획, 특히 석유의 고비점 나프탈렌 및 올레핀 부분, 예컨대 중질 방향족 나프타를 포함한다. 다른 유기 용매, 예컨대 로진 유도체를 비롯한 테르펜계 용매, 지방족 케톤, 예컨대 사이클로헥사논, 및 복합 알코올, 예컨대 2-에톡시에탄올이 또한 사용될 수 있다. 유화성 농축물에 적합한 유화제는 통상적인 음이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제로부터 선택된다.
수성 현탁액은 수성 담체 중에 약 5 중량% 내지 약 50 중량% 범위의 농도로 분산된 수불용성 PMP 조성물의 현탁액을 포함한다. 현탁액은 조성물을 미세하게 분쇄하고, 그것을 물 및 계면활성제로 구성된 담체 내로 격렬하게 혼합함으로써 제조된다. 또한, 무기 염 및 합성 또는 천연 고무와 같은 성분을 첨가하여 수성 담체의 밀도 및 점도를 증가시킬 수 있다.
PMP 조성물은 또한 토양에 적용하기에 특히 유용한 과립 조성물로서 적용될 수 있다. 과립 조성물은 통상, 점토 또는 유사 물질을 포함하는 담체 중에 분산된 약 0.5 중량% 내지 약 10 중량%의 PMP 조성물을 함유한다. 이러한 조성물은 통상, 제형을 적합한 용매 중에 용해시키고, 그것을 약 0.5 내지 약 3 ㎜ 범위의 적절한 입자 크기로 예비형성된 과립 담체에 적용함으로써 제조된다. 이러한 조성물은 또한 담체와 화합물의 도우(dough) 또는 페이스트(paste)를 제조하고, 이를 파쇄(crushing) 및 건조시켜 원하는 과립 입자 크기를 수득함으로써 제형화될 수 있다.
본 발명의 PMP 제형을 함유하는 분진은, 분말화된 형태의 PMP를 적합한 분진성 농업용 담체, 예컨대 카올린 점토, 분쇄 화산암 등과 친밀히 혼합함으로써 제조된다. 분진은 적합하게는 약 1% 내지 약 10%의 패킷을 함유할 수 있다. 그들은 분진 송풍 기계를 사용하여 종자 드레싱으로서 또는 경엽(foliage) 적용으로서 적용될 수 있다.
본 발명의 제형을 적절한 유기 용매, 통상 석유 오일, 예컨대 농업 화학에 널리 사용되는 분무 오일 중 용액의 형태로 적용하는 것이 동등하게 실용적이다.
PMP는 또한 에어로졸 조성물의 형태로 적용될 수 있다. 이러한 조성물에서, 패킷은 압력-발생 추진제 혼합물인 담체 중에 용해되거나 또는 분산된다. 에어로졸 조성물은 상기 혼합물이 무화(atomizing) 밸브를 통해 분배되는 용기에 포장된다.
또 다른 구현예는 수중유 유제이고, 유제는 층상 액정 코팅이 각각 제공되어 있으며 수성 상 중에 분산되어 있는 유성 구상체를 포함하고, 여기서 각각의 유성 구상체는 농업적으로 활성인 적어도 하나의 화합물을 포함하며 개별적으로 (1) 적어도 하나의 비이온성 친지성 표면-활성제, (2) 적어도 하나의 비이온성 친수성 표면-활성제 및 (3) 적어도 하나의 이온성 표면-활성제를 포함하는 단층 또는 소층 층으로 코팅되어 있고, 여기서 구상체는 평균 입자 직경이 800 나노미터 미만이다. 상기 구현예에 대한 추가의 정보는 미국 특허 공개 20070027034호(2007년 2월 1일 공개)에 개시되어 있다. 사용의 용이성을 위해, 이 구현예는 "OIWE"로서 지칭될 것이다.
또한, 일반적으로, 상기 개시된 분자가 제형에 사용되는 경우에, 이러한 제형은 또한 다른 성분을 함유할 수 있다. 이들 성분은 습윤제, 확산제, 접착제, 침투제, 완충제, 봉쇄제, 표류 감소제, 상용화제, 소포제, 세정제 및 유화제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다(이는 비-완전하고 상호 비-배타적인 열거임). 몇몇 성분이 하기에 기재되어 있다.
습윤제는 액체에 첨가되는 경우 액체와 그가 확산되는 표면 사이의 계면 장력을 감소시킴으로써 액체의 확산 또는 침투 능력을 증가시키는 물질이다. 습윤제는 농약 제형에서 다음 2가지 주요 기능에 사용된다: 가공 및 제조 동안 분말이 물에 습윤되는 속도를 증가시켜 가용성 액체를 위한 농축물 또는 현탁 농축물을 제조하는 것; 및 제품을 분무 탱크에서 물과 혼합하는 동안 습윤성 분말의 습윤 시간을 감소시키고 물이 수분산성 과립 내로 침투하는 것을 개선시키는 것. 습윤성 분말, 현탁 농축물 및 수분산성 과립 제형에 사용되는 습윤제의 예는 다음과 같다: 나트륨 라우릴 술페이트; 나트륨 디옥틸 술포숙시네이트; 알킬 페놀 에톡실레이트; 및 지방족 알코올 에톡실레이트.
분산제는 입자 표면 상에 흡착되어 입자의 분산 상태를 보존하고 입자의 재응집 방지를 보조하는 물질이다. 제조 동안 분산 및 현탁을 용이하게 하고, 분무 탱크에서 입자가 물에 재분산되는 것을 보장하기 위해, 분산제를 농화학 제형에 첨가한다. 분산제는 습윤성 분말, 현탁 농축물 및 수분산성 과립에 광범위하게 사용된다. 분산제로서 사용되는 계면활성제는, 입자 표면 상에 강하게 흡착되어 입자의 재응집에 대한 하전 또는 입체 장벽을 제공하는 능력을 갖는다. 가장 흔히 사용되는 계면활성제는 음이온성, 비이온성 또는 두 유형의 혼합물이다. 습윤성 분말 제형의 경우, 가장 흔한 분산제는 나트륨 리그노술포네이트이다. 현탁 농축물의 경우, 나트륨 나프탈렌 술포네이트 포름알데히드 축합물과 같은 다가전해질을 사용하여 매우 우수한 흡착 및 안정화가 수득된다. 트리스티릴페놀 에톡실레이트 포스페이트 에스테르가 또한 사용된다. 알킬아릴에틸렌 옥시드 축합물 및 EO-PO 블록 공중합체와 같은 비이온성 물질은 때때로 현탁 농축물을 위한 분산제로서 음이온성 물질과 조합된다. 최근에, 새로운 유형의 매우 높은 분자량의 중합체 계면활성제가 분산제로서 개발되었다. 이들은 매우 긴 소수성 '백본' 및 '빗형' 계면활성제의 '빗살'을 형성하는 수많은 에틸렌 옥시드 쇄를 갖는다. 이들 고분자량 중합체는 소수성 백본이 입자 표면 상에 많은 고정 점을 가지기 때문에 매우 우수한 장기 안정성을 현탁 농축물에 제공할 수 있다. 농화학 제형에 사용된 분산제의 예는 다음과 같다: 나트륨 리그노술포네이트; 나트륨 나프탈렌 술포네이트 포름알데히드 축합물; 트리스티릴페놀 에톡실레이트 포스페이트 에스테르; 지방족 알코올 에톡실레이트; 알킬 에톡실레이트; EO-PO(에틸렌 옥시드 - 프로필렌 옥시드) 블록 공중합체; 및 그라프트 공중합체.
유화제는 한 액체 상의 액적의 또 다른 액체 상 중의 현탁을 안정화시키는 물질이다. 유화제 없이, 두 액체는 두 불혼화성 액체 상으로 분리될 것이다. 가장 흔히 사용되는 유화제 블렌드는 알킬페놀 또는 12개 이상의 에틸렌 옥시드 단위를 갖는 지방족 알코올, 및 도데실벤젠술폰산의 유용성 칼슘 염을 함유한다. 8 내지 18의 친수성기-친지성기 균형("HLB") 값 범위가 통상적으로 우수한 안정한 유제를 제공할 것이다. 유제 안정성은 때때로 소량의 EO-PO 블록 공중합체 계면활성제를 첨가함으로써 개선될 수 있다.
가용화제는 임계 미셀 농도 초과의 농도에서 수 중에 미셀을 형성할 계면활성제이다. 이어서, 미셀은 미셀의 소수성 부분 내측의 수불용성 물질을 용해시키거나 가용화시킬 수 있다. 가용화를 위해 통상적으로 사용되는 계면활성제의 유형은 비이온성 물질, 소르비탄 모노올레에이트, 소르비탄 모노올레에이트 에톡실레이트 및 메틸 올레에이트 에스테르이다.
계면활성제는 때때로 단독으로, 또는 분무-탱크 믹스에 대한 애쥬번트(adjuvant)로서의 미네랄 또는 식물성 오일과 같은 다른 첨가제와 함께 사용되어 표적에 대한 PMP 조성물의 생물학적 성능을 개선시킨다. 생물증진을 위해 사용되는 계면활성제의 유형은 일반적으로 PMP 조성물의 성질 및 작용 방식에 따라 달라진다. 그러나, 이들은 종종 비이온성 물질, 예컨대 알킬 에톡실레이트; 선형 지방족 알코올 에톡실레이트; 지방족 아민 에톡실레이트이다.
농업 제형에서의 담체 또는 희석제는, PMP 조성물에 첨가되어 원하는 세기의 제품을 제공하는 물질이다. 담체는 통상적으로 흡수 능력이 높은 물질인 반면, 희석제는 통상적으로 흡수 능력이 낮은 물질이다. 담체 및 희석제는 분진, 습윤성 분말, 과립 및 수분산성 과립의 제형에서 사용된다.
유기 용매는 주로 유화성 농축물, 수중유 유제, 유현탁액 및 초저 부피 제형에, 및 보다 적은 정도로 과립 제형에 사용된다. 때때로 용매의 혼합물이 사용된다. 용매의 제1 주요 군은 지방족 파라핀계 오일, 예컨대 케로센 또는 정제 파라핀이다. 제2 주요 군(및 가장 통상적인 것)은 방향족 용매, 예컨대 자일렌 및 C9 및 C10 방향족 용매의 고분자량 분획을 포함한다. 제형이 물 내로 유화되는 경우에 PMP 조성물의 결정화를 방지하기 위해 염소화 탄화수소가 공용매로서 유용하다. 용매력을 증가시키기 위해 알코올이 때때로 보조용매로서 사용된다. 다른 용매는 식물성 오일, 종자 오일, 및 식물성 및 종자 오일의 에스테르를 포함할 수 있다.
액체의 레올로지 또는 유동 특성을 변형시키고, 분산된 입자 또는 액적의 분리 및 침강을 방지하기 위해, 현탁 농축물, 유제 및 유현탁액의 제형에서 주로 증점제 또는 겔화제가 사용된다. 증점제, 겔화제 및 침강방지제는 일반적으로 2가지 카테고리, 즉 수불용성 미립자 및 수용성 중합체에 속한다. 점토 및 실리카를 사용하여 현탁 농축물 제형을 생산하는 것이 가능하다. 이들 유형의 물질의 예는 몬모릴로나이트, 벤토나이트, 규산알루미늄마그네슘 및 아타풀자이트를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 수년 동안 수용성 다당류가 증점-겔화제로서 사용되어 왔다. 가장 통상적으로 사용되는 다당류의 유형은, 종자 및 해초의 천연 추출물, 또는 셀룰로스의 합성 유도체이다. 이들 유형의 물질의 예는 구아 검; 로커스트빈 검; 카라기난; 알기네이트; 메틸 셀룰로스; 나트륨 카복시메틸 셀룰로스(SCMC); 하이드록시에틸 셀룰로스(HEC)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 유형의 침강 방지제는 변형된 전분, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐 알코올 및 폴리에틸렌 옥시드에 기초한다. 또 다른 우수한 침강 방지제는 잔탄 검이다.
미생물은 제형화된 제품의 변질을 야기할 수 있다. 따라서, 그의 영향을 제거하거나 감소시키기 위해 보존제가 사용된다. 이러한 제제의 예는 다음을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 프로피온산 및 그의 나트륨 염; 소르브산 및 그의 나트륨 또는 칼륨 염; 벤조산 및 그의 나트륨 염; p-하이드록시벤조산 나트륨 염; 메틸 p-하이드록시벤조에이트; 및 1,2-벤즈이소티아졸린-3-온(BIT).
계면활성제의 존재는 종종 생산 및 분무 탱크를 통한 적용 시에 혼합 작업 동안 수계 제형이 발포되게 한다. 발포 경향을 감소시키기 위해, 종종 생산 단계 동안 또는 병에 충전하기 전에 소포제를 첨가한다. 일반적으로, 두 유형의 소포제, 즉 실리콘 및 비-실리콘이 존재한다. 실리콘은 통상적으로 디메틸 폴리실록산의 수성 유제인 한편, 비-실리콘 소포제는 수불용성 오일, 예컨대 옥탄올 및 노난올, 또는 실리카이다. 둘 모두의 경우에서, 소포제의 기능은 공기-물 계면에서 계면활성제를 제거하는 것이다.
"그린" 제제(예를 들어, 애쥬번트, 계면활성제, 용매)는 작물 보호 제형의 전체 환경 발자국을 감소시킬 수 있다. 그린 제제는 생분해성이며 일반적으로 천연 및/또는 지속가능한 공급원, 예를 들어 식물 및 동물 공급원으로부터 유래된다. 구체적 예는 다음과 같다: 식물성 오일, 종자 오일 및 그의 에스테르, 또한 알콕실화 알킬 폴리글루코시드.
일부 경우에, PMP는 동결-건조되거나 동결건조될 수 있다. 미국 특허 제4,311,712호를 참조한다. PMP는 이후에 물 또는 또 다른 액체와 접촉하여 재구성될 수 있다. 다른 성분, 예를 들어, 다른 이종 기능성 제제, 농업적으로 허용 가능한 담체 또는 본원에 기재된 제형에 따른 다른 물질이 동결건조된 또는 재구성된 PMP에 첨가될 수 있다.
조성물의 다른 선택적인 특징은 PMP 조성물을 자외선 및/또는 산성 조건에 대하여 보호하는 담체 또는 운반 비히클을 포함한다. 일부 경우에, 운반 비히클은 pH 완충제를 함유한다. 일부 경우에, 조성물은 예를 들어, 5.0 내지 약 8.0, 약 6.5 내지 약 7.5 또는 약 6.5 내지 약 7.0 중 어느 하나의 pH 범위를 포함하여, 약 4.5 내지 약 9.0의 범위의 pH를 갖도록 제형화된다.
농업적 제형에 대한 추가의 정보는 문헌["Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations" edited by D. A. Knowles, copyright 1998 by Kluwer Academic Publishers]을 참조한다. 또한, 문헌["Insecticides in Agriculture and Environment―Retrospects and Prospects" by A. S. Perry, I. Yamamoto, I. Ishaaya, and R. Perry, copyright 1998 by Springer-Verlag]도 참조한다.
ii. 약제학적 제형
본원에 기재된 변형 PMP는 예를 들어, 동물(예를 들어, 인간)로의 투여를 위하여 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 및/또는 부형제와 함께 동물(예를 들어, 인간)에 투여될 수 있다. 투여 방식 및 투여량에 따라, 본원에 기재된 방법의 약제학적 조성물은 손쉬운 운반을 가능하게 하기에 적합한 약제학적 조성물로 제형화될 것이다. 단일의 용량은 필요한 대로 단위 투여형으로 존재할 수 있다.
PMP 조성물은 예를 들어, 동물로의 경구 투여, 정맥내 투여(예를 들어, 주사 또는 주입) 또는 피하 투여를 위하여 제형화될 수 있다. 주사 가능한 제형에 있어서, 다양한 유효한 약제학적 담체가 해당 분야에 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd ed., (2012)] 및 문헌[ASHP Handbook on Injectable Drugs, 18th ed., (2014)] 참조).
본 발명의 조성물에서 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수여자에 대하여 비독성이다. 허용 가능한 담체 및 부형제는 완충제, 예컨대 인산염, 시트르산염, HEPES 및 TAE, 산화방지제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌, 보존제, 예컨대 헥사메토늄 클로라이드, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 레조르시놀 및 벤즈알코늄 클로라이드, 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 젤라틴, 덱스트란 및 면역글로불린, 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 히스티딘 및 라이신, 및 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 및 소르비톨을 포함할 수 있다. 조성물은 종래의 약제학적 관례에 따라 제형화될 수 있다. 제형 중 화합물의 농도는 투여될 활성 제제(예를 들어, PMP)의 투여량 및 투여 경로를 포함하는 수많은 인자에 따라 달라질 것이다.
동물로의 경구 투여를 위하여, PMP 조성물은 경구 제형의 형태로 제조될 수 있다. 경구 이용을 위한 제형은 약제학적으로 허용 가능한 비-독성 부형제와의 혼합물에서 활성 성분(들)을 함유하는 정제, 캐플릿(caplet), 캡슐, 시럽 또는 경구 액체 투여형을 포함할 수 있다. 이들 부형제는 예를 들어, 비활성 희석제 또는 충전제(예를 들어, 수크로스, 소르비톨, 당, 만니톨, 미정질 셀룰로스, 감자 전분을 포함하는 전분, 탄산칼슘, 염화나트륨, 락토스, 인산칼슘, 황산칼슘 또는 인산나트륨); 과립화제 및 붕해제(예를 들어, 미정질 셀룰로스를 포함하는 셀룰로스 유도체, 감자 전분을 포함하는 전분, 크로스카멜로스 나트륨, 알긴산염 또는 알긴산); 결합제(예를 들어, 수크로스, 글루코스, 소르비톨, 아카시아, 알긴산, 알긴산나트륨, 젤라틴, 전분, 예비젤라틴화된 전분, 미정질 셀룰로스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 카복시메틸셀룰로스 나트륨, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리에틸렌 글리콜); 및 윤활제, 활택제 및 접착방지제(예를 들어, 스테아르산마그네슘, 스테아르산아연, 스테아르산, 실리카, 수소화된 식물성 오일 또는 탈크)일 수 있다. 다른 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 착색제, 향미제, 가소제, 습윤제, 완충제 등일 수 있다. 경구 이용을 위한 제형은 또한, 츄어블 정제, 비-츄어블 정제, 캐플릿, 캡슐로서(예를 들어, 활성 성분이 비활성 고체 희석제와 혼합된 경질 젤라틴 캡슐로서, 또는 활성 성분이 물 또는 오일 매질과 혼합된 연질 젤라틴 캡슐로서) 단위 투여형으로 제공될 수 있다. 본원에 개시된 조성물은 또한 즉시-방출형, 연장 방출형 또는 지연-방출형 제형을 추가로 포함할 수 있다.
동물로의 비경구 투여를 위하여, PMP 조성물은 액체 용액 또는 현탁액의 형태로 제형화되고, 비경구 경로(예를 들어, 피하, 정맥내 또는 근육내)에 의해 투여될 수 있다. 약제학적 조성물은 주사 또는 주입을 위해 제형화될 수 있다. 비경구 투여를 위한 약제학적 조성물은 비히클로서 멸균 용액 또는 임의의 약제학적으로 허용 가능한 액체를 사용하여 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 비히클은 멸균수, 생리학적 염수 또는 세포 배양 배지(예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco’s Modified Eagle Medium; DMEM), α-변형 이글 배지(α-Modified Eagles Medium; α-MEM), F-12 배지)를 포함하나 이들에 제한되지 않는다. 제형화 방법은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Gibson (ed.) Pharmaceutical Preformulation and Formulation (2nd ed.) Taylor & Francis Group, CRC Press (2009)]을 참조한다.
II. 이종 기능성 제제
본원에 제조된 PMP는 이종 기능성 제제, 예를 들어, 이종 기능성 제제(예를 들어, 이종 농업용제(예를 들어, 농약 제제, 시비제, 제초제, 식물 변형제) 또는 이종 치료제(예를 들어, 항진균제, 항박테리아제, 살바이러스제, 항바이러스제, 살충제, 살선충제, 항기생충제, 또는 곤충 기피제))를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, PMP는 이종 기능성 제제를 캡슐화할 수 있다. 대안적으로, 이종 기능성 제제는 PMP의 표면 상에 매립되거나 그의 표면에 컨쥬게이트될 수 있다. 일부 경우에, PMP는 2가지 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10가지 초과)의 상이한 이종 기능성 제제를 포함한다. 이종 기능성 제제는 제제를 제조된 PMP 내로 도입하는데 효율적인 제조 방법 동안 임의의 단계에서 첨가될 수 있다.
특정 경우에, 이종 기능성 제제(예를 들어, 이종 농업용제(예를 들어, 농약 제제, 시비제, 제초제, 식물 변형 제제, 이종 핵산, 이종 폴리펩티드, 또는 이종 소분자) 또는 이종 치료제(예를 들어, 항진균제, 항박테리아제, 살바이러스제, 항바이러스제, 살선충제, 항기생충제, 또는 곤충 기피제))는 변형될 수 있다. 예를 들어, 변형은 화학적 변형, 예를 들어, 마커, 예를 들어, 형광 마커 또는 방사성 마커로의 컨쥬게이션일 수 있다. 다른 예에서, 변형은 제제의 안정성, 운반, 표적화, 생체이용률 또는 반감기를 향상시키는 모이어티, 예를 들어, 지질, 글리칸, 중합체(예를 들어, PEG), 양이온 모이어티로의 컨쥬게이션 또는 작동적 연결을 포함할 수 있다.
본원에서 제조된 PMP 내로 로딩될 수 있는 이종 기능성 제제의 예는 하기에 약술되어 있다.
A. 이종 농업용제
본원에서 제조된 PMP는 이종 농업용제(예를 들어, 식물 또는 식물과 연관된 유기체에 영향을 미치며, PMP 내로 로딩될 수 있는 제제), 예컨대 농약 제제, 제초제, 시비제 또는 식물 변형 제제를 포함할 수 있다.
예를 들어, 일부 경우에, PMP는 농약 제제를 포함할 수 있다. 농약 제제는 항진균제, 항박테리아 제제, 살충제, 살연체동물제, 살선충제, 살바이러스제 또는 그의 조합일 수 있다. 농약 제제는 화학적 제제, 예컨대 해당 분야에 널리 알려져 있는 것들일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 농약 제제는 펩티드, 폴리펩티드, 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 소분자일 수 있다. 농약 제제는 다양한 식물 유해물의 건강을 감소시킬 수 있는 제제일 수 있거나, 하나 이상의 특정 표적 식물 유해물(예를 들어, 특정 종 또는 속의 식물 유해물)을 표적화하는 것일 수 있다.
일부 경우에, PMP는 하나 이상의 이종 시비제를 포함할 수 있다. 이종 시비제의 예는, 식물 영양제 또는 식물 성장 조절제 등 당업계에 공지된 것들을 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 시비제는 식물 공생생물의 건강을 증가시킬 수 있는 펩티드, 폴리펩티드, 핵산, 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 시비제는 다양한 식물 또는 식물 공생생물의 건강을 증가시킬 수 있는 제제일 수 있거나, 하나 이상의 특정 표적 식물 또는 식물 공생생물(예를 들어, 특정 종 또는 속의 식물 또는 식물 공생생물)을 표적화하는 것일 수 있다.
다른 경우에, PMP는 하나 이상의 이종 식물 변형 제제를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 식물 변형제는 펩티드 또는 핵산을 포함할 수 있다.
i. 항박테리아 제제
본원에 기재된 PMP 조성물은 항박테리아제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, PMP 조성물은 2가지 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10가지 초과)의 상이한 항박테리아제를 포함한다. 예를 들어, 항박테리아 제제는 박테리아 식물 유해물(예를 들어, 박테리아 식물 병원체)의 건강을 감소(예를 들어, 성장을 감소시키거나 사멸)시킬 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 항생제를 포함하는 PMP 조성물을 (a) 표적 유해물 내측에서 또는 그 상에서 표적 수준(예를 들어, 소정의 또는 역치 수준)의 항생제 농도에 도달하고; (b) 표적 유해물의 건강을 감소시키기에 충분한 양으로, 그리고 그 시간 동안, 표적 유해물 또는 그로 침입된 식물과 접촉시킬 수 있다. 본원에 기재된 항박테리아제는 본원에 기재된 임의의 방법을 위하여 PMP 조성물에 제형화될 수 있으며, 특정 경우에, 그의 PMP와 회합될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "항박테리아 제제"는 박테리아, 예컨대 식물병원성 박테리아를 사멸시키거나, 그의 성장, 증식, 분열, 번식 또는 확산을 저해하는 물질을 지칭하며, 살박테리아제(예를 들어, 소독제 화합물, 방부제 화합물 또는 항생제) 또는 정균제(예를 들어, 화합물 또는 항생제)를 포함한다. 살박테리아성 항생제는 박테리아를 사멸시키는 한편, 정균성 항생제는 오직 그들의 성장 또는 번식만을 둔화시킨다.
살박테리아제는 소독제, 방부제 또는 항생제를 포함할 수 있다. 흔히 사용되는 소독제는 하기를 포함할 수 있다: 활성 염소(즉, 차아염소산염(예를 들어, 차아염소산나트륨), 클로라민, 디클로로이소시아누레이트 및 트리클로로이소시아누레이트, 습윤 염소, 이산화염소 등), 활성 산소(과산화물, 예컨대 과아세트산, 과황산칼륨, 과붕산나트륨, 과탄산나트륨 및 우레아 퍼하이드레이트), 요오드(요오드포비돈(포비돈-요오드, 베타딘), 루골 용액(Lugol's solution), 요오드 팅크투어, 요오드화 비이온성 계면활성제), 농축 알코올(주로 에탄올, n-프로판올으로도 지칭되는 1-프로판올 및 이소프로판올로 지칭되는 2-프로판올 및 이의 혼합물; 또한, 2-페녹시에탄올 및 1- 및 2-페녹시프로판올이 사용됨), 페놀 물질(예컨대, 페놀("카볼산" 이라고도 함), 크레졸(액체 칼륨 비누와 조합하여 "리졸"로 지칭됨), 할로겐화(염소화, 브롬화) 페놀, 예컨대 헥사클로로펜, 트리클로산, 트리클로로페놀, 트리브로모페놀, 펜타클로로페놀, 디브로몰 및 이의 염), 양이온성 계면활성제, 예컨대 일부 4차 암모늄 양이온(예컨대, 벤잘코늄 클로라이드, 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드 또는 클로라이드, 디데실디메틸암모늄 클로라이드, 세틸피리디늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드) 등, 비-4 차 화합물, 예컨대 클로르헥시딘, 글루코프로타민, 옥테니딘 디하이드로클로라이드 등), 강한 산화제, 예컨대 오존 및 과망간산염 용액, 중금속 및 이들의 염, 예컨대 콜로이드 은, 질산은, 염화 수은, 페닐 수은 염, 황산 구리, 산화 구리-클로라이드, 수산화구리, 구리 옥타노에이트, 구리 옥시클로라이드 술페이트, 황산구리, 황산구리 5수화물 등. 중금속 및 이들의 염은 가장 독성이고, 환경에 유해한 살박테리아제이므로, 이들의 사용은 강력하게 억제 또는 금지되며; 추가로, 또한 적절하게 농축된 강산(인산, 질산, 황산, 아미도황산, 톨루엔술폰산) 및 알칼리(수산화나트륨, 칼륨, 칼슘)이다.
방부제(즉, 인간 또는 동물의 신체, 피부, 점액, 상처 등에 사용할 수 있는 살균제), 상기 언급한 소독제의 일부는 적절한 조건(주로 농도, pH, 온도 및 인간/동물에 대한 독성) 하에서 사용할 수 있다. 이들 중, 하기의 것이 중요하다: 적절하게 희석된 염소 제제(즉, 다퀸 용액(Daquin's solution), 0.5% 과염화나트륨 또는 칼륨 용액, pH 7 내지 8 로 pH-조절됨, 또는 나트륨 벤젠술포클로라미드(클로라민 B)의 0.5 내지 1% 용액), 일부 요오드 제제, 예컨대 다양한 생약(연고, 용액, 상처 플라스터)에서의 요오도포비돈, 과거에는 또한 루골 용액(Lugol's solution), 우레아 퍼하이드레이트 용액 및 pH-완충된 0.1 내지 0.25% 과아세트산 용액으로서 과산화물, 주로 피부의 방부에 사용되는 방부성 첨가제를 갖거나 갖지 않는 알코올, 유기 약산, 예컨대 소르브산, 벤조산, 락트산 및 살리실산, 일부 페놀 화합물, 예컨대 헥사클로로펜, 트리클로산 및 디브로몰, 및 양이온-활성 화합물, 예컨대 0.05 내지 0.5% 벤잘코늄, 0.5 내지 4% 클로르헥시딘, 0.1 내지 2% 옥테니딘 용액.
본원에 기재된 PMP 조성물은 항생제를 포함할 수 있다. 해당 분야에 알려져 있는 임의의 항생제가 사용될 수 있다. 항생제는 흔히 그들의 작용 메커니즘, 화학 구조 또는 활성 스펙트럼에 기초하여 분류된다.
본원에 기재된 항생제는 임의의 박테리아 기능 또는 성장 과정을 표적화할 수 있으며, 정균성(예를 들어, 박테리아 성장을 둔화시키거나 예방함) 또는 살박테리아성(예를 들어, 박테리아를 사멸시킴)일 수 있다. 일부 경우에, 항생제는 살박테리아성 항생제이다. 일부 경우에, 살박테리아성 항생제는 박테리아 세포벽을 표적화하는 것(예를 들어, 페니실린(penicillin) 및 세팔로스포린(cephalosporin)); 세포막을 표적화하는 것(예를 들어, 폴리믹신(polymyxin)); 또는 필수 박테리아 효소를 저해하는 것(예를 들어, 리파미신(rifamycin), 리피아르미신(lipiarmycin), 퀴놀론(quinolone) 및 술폰아미드)이다. 일부 경우에, 살박테리아성 항생제는 아미노글리코시드(예를 들어, 카수가마이신(kasugamycin))이다. 일부 경우에, 항생제는 정균성 항생제이다. 일부 경우에, 정균성 항생제는 단백질 합성을 표적화한다(예를 들어, 마크롤리드(macrolide), 린코사미드(lincosamide) 및 테트라사이클린). 본원에서 사용될 수 있는 항생제의 추가의 부류는 사이클릭 리포펩티드(예컨대 다프토마이신(daptomycin), 글리실사이클린(예컨대 디게사이클린(tigecycline)), 옥사졸리디논(예컨대 리네졸리드(linezolid)) 또는 리피아르마이신(lipiarmycin)(예컨대 피닥소미신(fidaxomicin))을 포함한다. 항생제의 예에는 리팜피신(rifampicin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 독시사이클린(doxycycline), 앰피실린(ampicillin) 및 폴리믹신(polymyxin) B가 포함된다. 본원에 기재된 항생제는 임의의 수준의 표적 특이성을 가질 수 있다(예를 들어, 협- 또는 광-범위). 일부 경우에, 항생제는 협-범위 항생제이며, 이에 따라, 특정 유형의 박테리아, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 박테리아를 표적화한다. 대안적으로, 항생제는 다양한 박테리아를 표적화하는 광-범위 항생제일 수 있다.
항생제의 다른 비-제한적인 예는 표 1에서 찾을 수 있다. 당업자는 조성물 중 각 항생제의 적합한 농도가 항생제의 효능, 안정성, 별개의 항생제의 수, 제형 및 조성물의 적용 방법과 같은 인자에 좌우되는 것을 인식할 것이다.
[표 1]
Figure pct00001
ii. 항진균제
본원에 기재된 PMP 조성물은 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, PMP 조성물은 2가지 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10가지 초과)의 상이한 항진균제를 포함한다. 예를 들어, 항진균제는 진균 식물 유해물의 건강을 감소(예를 들어, 그의 성장을 감소시키거나 사멸)시킬 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 항진균제를 포함하는 PMP 조성물을 (a) 표적 진균 내측에서 또는 그 상에서 표적 수준(예를 들어, 소정의 또는 역치 수준)의 항생제 농도에 도달하고; (b) 표적 진균의 건강을 감소시키기에 충분한 양으로, 그리고 그 시간 동안 표적 진균 유해물 또는 그로 침입된 식물과 접촉시킬 수 있다. 본원에 기재된 항진균제는 본원에 기재된 임의의 방법을 위하여 PMP 조성물에 제형화될 수 있으며, 특정 경우에, 그의 PMP와 회합될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "살진균제" 또는 "항진균제"는 진균, 예컨대 식물병원성 진균을 사멸시키거나, 그의 성장, 증식, 분열, 번식 또는 확산을 저해하는 물질을 지칭한다. 많은 상이한 유형의 항진균제가 상업적으로 생산된 바 있다. 항진균제의 비제한적인 예는 아족시스트로빈, 만코제브, 프로티오코나졸, 폴펫, 테부코나졸, 디페노코나졸, 캡탄, 부피리메이트 또는 포세틸-Al을 포함한다. 추가의 예시적인 살진균제는 스트로빌루린(strobilurin), 아족시스트로빈(azoxystrobin), 디목시스트로빈(dimoxystrobin), 에네스트로부린(enestroburin), 플루옥사스트로빈(fluoxastrobin), 크레속심-메틸(kresoxim-methyl), 메토미노스트로빈(metominostrobin), 피콕시스트로빈(picoxystrobin), 피라클로스트로빈(pyraclostrobin), 트리플록시스트로빈(trifloxystrobin), 오리사스트로빈(orysastrobin), 카복사미드, 카복사닐리드(carboxanilide), 베날락실(benalaxyl), 베날락실-M, 베노다닐(benodanil), 카복신(carboxin), 메베닐(mebenil), 메프로닐(mepronil), 펜푸람(fenfuram), 펜헥사미드(fenhexamid), 플루톨라닐(flutolanil), 푸랄락실(furalaxyl), 푸르카바닐(furcarbanil), 푸라메트피르(furametpyr), 메탈락실(metalaxyl), 메탈락실-M(메페녹삼(mefenoxam)), 메트푸록삼(methfuroxam), 메트술포박스(metsulfovax), 오푸라세(ofurace), 옥사딕실(oxadixyl), 옥시카복신(oxycarboxin), 펜티오피라드(penthiopyrad), 피라카볼리드(pyracarbolid), 살리실아닐리드(salicylanilide), 테클로프탈람(tecloftalam), 티플루자미드(thifluzamide), 티아디닐(tiadinil), N-비페닐아미드, 빅사펜(bixafen), 보스칼리드(boscalid), 카복실산 모르폴리드, 디메토모르프(dimethomorph), 플루모르프(flumorph), 벤즈아미드, 플루메토베르(flumetover), 플루오피콜리드(fluopicolid)(피코벤자미드(picobenzamid)), 족사미드(zoxamid), 카복사미드, 카프로파미드(carpropamid), 디클로사이메트(diclocymet), 만디프로파미드(mandipropamid), 실티오팜(silthiofam), 아졸, 트리아졸, 비테르타놀(bitertanol), 브로무코나졸(bromuconazole), 사이프로코나졸(cyproconazole), 디페노코나졸(difenoconazole), 디니코나졸(diniconazole), 에닐코나졸(enilconazole), 에폭시코나졸(epoxiconazole), 펜부코나졸(fenbuconazole), 플루실라졸(flusilazol), 플루퀸코나졸(fluquinconazole), 플루트리아폴(flutriafol), 헥사코나졸(hexaconazole), 이미벤코나졸(imibenconazole), 이프코나졸(ipconazole), 메트코나졸(metconazole), 마이클로부타닐(myclobutanil), 펜코나졸(penconazole), 프로피코나졸(propiconazole), 프로티오코나졸(prothioconazole), 시메코나졸(simeconazole), 테부코나졸(tebuconazole), 테트라코나졸(tetraconazole), 트리아디메놀(triadimenol), 트리아디메폰(triadimefon), 트리티코나졸(triticonazole), 이미다졸, 사이아조파미드(cyazofamid), 이마잘릴(imazalil), 페푸라조에이트(pefurazoate), 프로클로라즈(prochloraz), 트리플루미졸(triflumizole), 벤즈이미다졸, 베노밀(benomyl), 카르벤다짐(carbendazim), 푸베리다졸(fuberidazole), 티아벤다졸(thiabendazole), 에타복삼(ethaboxam), 에트리디아졸(etridiazole), 하이멕사졸(hymexazol), 질소-함유 헤테로사이클릴 화합물, 피리딘, 푸아지남(fuazinam), 피리페녹스(pyrifenox), 피리미딘, 부피리메이트(bupirimate), 사이프로디닐(cyprodinil), 페림존(ferimzone), 페나리몰(fenarimol), 메파니피림(mepanipyrim), 누아리몰(nuarimol), 피리메타닐(pyrimethanil), 피페라진, 트리포린(triforine), 피롤, 플루디옥소닐(fludioxonil), 펜피클로닐(fenpiclonil), 모르폴린, 알디모르프(aldimorph), 도데모르프(dodemorph), 펜프로피모르프(fenpropimorph), 트리데모르프(tridemorph), 디카복시미드, 이프로디온(iprodione), 프로사이미돈(procymidone), 빈클로졸린(vinclozolin), 아시벤졸라(acibenzolar)-S-메틸, 아닐라진(anilazine), 캅탄(captan), 카프타폴(captafol), 다조메트(dazomet), 디클로메진(diclomezin), 페녹사닐(fenoxanil), 폴페트(folpet), 펜프로피딘(fenpropidin), 파목사돈(famoxadon), 페나미돈(fenamidon), 옥틸리논(octhilinone), 프로베나졸(probenazole), 프로퀴나지드(proquinazid), 피로퀼론(pyroquilon), 퀴녹시펜(quinoxyfen), 트리사이클라졸(tricyclazole), 카바메이트, 디티오카바메이트, 페르밤(ferbam), 만코제브(mancozeb), 마네브(maneb), 메티람(metiram), 메탐(metam), 프로피네브(propineb), 티람(thiram), 지네브(zineb), 지람(ziram), 디에토펜카르브(diethofencarb), 플루벤티아발리카르브(flubenthiavalicarb), 이프로발리카르브(iprovalicarb), 프로파모카르브(propamocarb), 구아니딘, 도딘(dodine), 이민옥타딘, 구아자틴(guazatine), 카수가마이신(kasugamycin), 폴리옥신, 스트렙토마이신, 발리다마이신(validamycin) A, 유기금속 화합물, 펜틴(fentin) 염, 황-함유 헤테로사이클릴 화합물, 이소프로티올란(isoprothiolane), 디티아논(dithianone), 유기인 화합물, 에디펜포스(edifenphos), 포세틸(fosetyl), 포세틸-알루미늄, 이프로벤포스(iprobenfos), 피라조포스(pyrazophos), 톨클로포스(tolclofos)-메틸, 유기염소 화합물, 티오파네이트-메틸, 클로로탈로닐(chlorothalonil), 디클로플루아니드(dichlofluanid), 톨릴플루아니드(tolylfluanid), 플루술파미드(flusulfamide), 프탈리드(phthalide), 헥사클로로벤젠, 펜사이쿠론(pencycuron), 퀸토젠(quintozene), 니트로페닐 유도체, 비나파크릴(binapacryl), 디노카프(dinocap), 디노부톤(dinobuton), 스피록사민(spiroxamine), 사이플루펜아미드(cyflufenamid), 사이목사닐(cymoxanil), 메트라페논(metrafenon), N-2-시아노페닐-3,4-디클로로이소티아졸-5-카복사미드(이소티아닐(isotianil)), N-(3',4',5'-트리플루오로비페닐-2-일)-3-디플루오로메틸-1-메틸피라졸-4-카복사미드, 3-[5-(4-클로로페닐)-2,3-디메틸이속사졸리딘-3-일]-피리딘, N-(3',4'-디클로로-4-플루오로비페닐-2-일)-3-디플루오로메틸-1-메틸피라졸-4-카복사미드, 5-클로로-7-(4-메틸피페리딘-1-일)-6-(2,4,6-트리플루오로페닐)-[1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리미딘, 2-부톡시-6-아이오도-3-프로필크로멘-4-온, N,N-디메틸-3-(3-브로모-6-플루오로-2-메틸인돌-1-술포닐)-[1,2,4]트리아졸-1-술폰아미드, 메틸-(2-클로로-5-[1-(3-메틸벤질옥시이미노)-에틸]벤질)카바메이트, 메틸-(2-클로로-5-[1-(6-메틸피리딘-2-일메톡시-이미노)에틸]벤질)카바메이트, 메틸 3-(4-클로로페닐)-3-(2-이소프로폭시카보닐아미노-3-메틸부티릴-아미노)프로피오네이트, 4-플루오로페닐 N-(1-(1-(4-시아노페닐)에탄술포닐)부트-2-일)카바메이트, N-(2-(4-[3-(4-클로로페닐)프로프-2-이닐옥시]-3-메톡시페닐)에틸)-2-메탄-술포닐아미노-3-메틸부티라미드, N-(2-(4-[3-(4-클로로페닐)프로프-2-이닐옥시]-3-메톡시페닐)에틸)-2-에탄술포닐아미노-3-메틸부티라미드, N-(4'-브로모비페닐-2-일)-4-디플루오로메틸-2-메틸티아졸-5-카복사미드, N-(4'-트리플루오로메틸비페닐-2-일)-4-디플루오로메틸-2-메틸티아졸-5-카복사미드, N-(4'-클로로-3'-플루오로비페닐-2-일)-4-디플루오로메틸-2-메틸티아졸-5-카복사미드, 또는 메틸 2-(오르토-((2,5-디메틸페닐옥시-메틸렌)페닐)-3-메톡시아크릴레이트를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 당업자는 조성물 중 각각의 항진균제의 적합한 농도가 항진균제의 효능, 안정성, 별개의 항진균제의 수, 제형 및 조성물의 적용 방법과 같은 인자에 좌우되는 것을 인식할 것이다.
iii. 살충제
본원에 기재된 PMP 조성물은 살충제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, PMP 조성물은 2가지 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10가지 초과)의 상이한 살충제를 포함한다. 예를 들어, 살충제는 곤충 식물 유해물의 건강을 감소(예를 들어, 그의 성장을 감소시키거나 사멸)시킬 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 살충제를 포함하는 PMP 조성물을 (a) 표적 곤충 내측에서 또는 그 상에서 표적 수준(예를 들어, 소정의 또는 역치 수준)의 살충제 농도에 도달하고; (b) 표적 곤충의 건강을 감소시키기에 충분한 양으로, 그리고 그 시간 동안 표적 곤충 유해물 또는 그로 침입된 식물과 접촉시킬 수 있다. 본원에 기재된 살충제는 본원에 기재된 임의의 방법을 위하여 PMP 조성물에 제형화될 수 있으며, 특정 경우에, 그의 PMP와 회합될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "살충제" 또는 "살충 제제"는 곤충, 예컨대 농업 유해 곤충을 사멸시키거나, 그의 성장, 증식, 번식 또는 확산을 저해하는 물질을 지칭한다. 살충제의 비제한적인 예는 표 2에 나타나 있다. 적합한 살충제의 추가의 비제한적인 예는 생물제제(biologics), 호르몬 또는 페로몬, 예컨대 아자디라크틴(azadirachtin), 바실러스(Bacillus) 종, 브베리아(Beauveria) 종, 코들레몬(codlemone), 메타리지움(Metarrhizium) 종, 파에실로마이세스(Paecilomyces) 종, 투린지엔시스(thuringiensis) 및 베르티실리움(Verticillium) 종, 및 미공지 또는 불특정 작용 기작을 갖는 활성 화합물, 예컨대 훈증제(예컨대 알루미늄 포스파이드, 메틸 브로마이드 및 술푸릴 플루오라이드) 및 선택적 피딩 저해제(예컨대 크라이올라이트(cryolite), 플로니카미드(flonicamid) 및 피메트로진(pymetrozine))를 포함한다. 당업자는 조성물 중 각 살충제의 적합한 농도가 살충제의 효능, 안정성, 별개의 살충제의 수, 제형 및 조성물의 적용 방법과 같은 인자에 좌우되는 것을 인식할 것이다.
[표 2]
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
iv. 살선충제
본원에 기재된 PMP 조성물은 살선충제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, PMP 조성물은 2가지 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10가지 초과)의 상이한 살선충제를 포함한다. 예를 들어, 살선충제는 식물 유해 선충의 건강을 감소(예를 들어, 그의 성장을 감소시키거나 사멸)시킬 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 살선충제를 포함하는 PMP 조성물을 (a) 표적 선충 내측에서 또는 그 상에서 표적 수준(예를 들어, 소정의 또는 역치 수준)의 살선충제 농도에 도달하고; (b) 표적 선충의 건강을 감소시키기에 충분한 양으로, 그리고 그 시간 동안 표적 유해 선충 또는 그로 침입된 식물과 접촉시킬 수 있다. 본원에 기재된 살선충제는 본원에 기재된 임의의 방법을 위하여 PMP 조성물에 제형화될 수 있으며, 특정 경우에, 그의 PMP와 회합될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "살선충제" 또는 "살선충 제제"는 선충, 예컨대 농업 선충 유해물을 사멸시키거나, 그의 성장, 증식, 번식 또는 확산을 저해하는 물질을 지칭한다. 살선충제의 비제한적인 예는 표 3에 나타나 있다. 당업자는 조성물 중 각 살선충제의 적합한 농도가 살충제의 효능, 안정성, 별개의 살충제의 수, 제형 및 조성물의 적용 방법과 같은 인자에 좌우되는 것을 인식할 것이다.
[표 3]
Figure pct00006
v. 살연체동물제
본원에 기재된 PMP 조성물은 살연체동물제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, PMP 조성물은 2가지 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10가지 초과)의 상이한 살연체동물제를 포함한다. 예를 들어, 살연체동물제는 식물 유해 연체동물의 건강을 감소(예를 들어, 그의 성장을 감소시키거나 사멸)시킬 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 살연체동물제를 포함하는 PMP 조성물을 (a) 표적 연체동물 내측에서 또는 그 상에서 표적 수준(예를 들어, 소정의 또는 역치 수준)의 살연체동물제 농도에 도달하고; (b) 표적 연체동물의 건강을 감소시키기에 충분한 양으로, 그리고 그 시간 동안 표적 유해 연체동물 또는 그로 침입된 식물과 접촉시킬 수 있다. 본원에 기재된 살연체동물제는 본원에 기재된 임의의 방법을 위하여 PMP 조성물에 제형화될 수 있으며, 특정 경우에, 그의 PMP와 회합될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "살연체동물제" 또는 "살연체동물 제제"는 연체동물, 예컨대 농업 유해 연체동물을 사멸시키거나, 그의 성장, 증식, 번식 또는 확산을 저해하는 물질을 지칭한다. 다수의 화학물질이 살연체동물제로서 사용될 수 있으며, 이는 금속 염, 예컨대 인산철(III), 황산알루미늄, 및 나트륨 EDTA 제2철,[3][4], 메트알데하이드(metaldehyde), 메티오카르브(methiocarb) 또는 아세틸콜린에스테라제 저해제를 포함한다. 당업자는 조성물 중 각각의 살연체동물제의 적합한 농도가 살연체동물제의 효능, 안정성, 별개의 살연체동물제의 수, 제형 및 조성물의 적용 방법과 같은 인자에 좌우되는 것을 인식할 것이다.
vi. 살바이러스제
본원에 기재된 PMP 조성물은 살바이러스제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, PMP 조성물은 2가지 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10가지 초과)의 상이한 살바이러스제를 포함한다. 예를 들어, 살바이러스제는 바이러스 식물 병원체의 건강을 감소시킬 수 있다(예를 들어, 그를 감소시키거나 제거할 수 있다). 본원에 기재된 바와 같은 살바이러스제를 포함하는 PMP 조성물을 (a) 표적 수준(예를 들어, 소정의 또는 역치 수준)의 살바이러스제 농도에 도달하고; (b) 표적 바이러스를 감소시키거나 제거하기에 충분한 양으로, 그리고 그 시간 동안 표적 바이러스 또는 그로 침입된 식물과 접촉시킬 수 있다. 본원에 기재된 살바이러스제는 본원에 기재된 임의의 방법을 위하여 PMP 조성물에 제형화될 수 있으며, 특정 경우에, 그의 PMP와 회합될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "살바이러스제" 또는 "항바이러스제"는 바이러스, 예컨대 농업 바이러스 병원체를 사멸시키거나, 그의 성장, 증식, 재생, 발생 또는 확산을 저해하는 물질을 지칭한다. 다수의 제제가 살바이러스제로서 사용될 수 있으며, 이는 화학물질 또는 생물학적 제제(예를 들어, 핵산, 예를 들어, dsRNA)를 포함한다. 당업자는 조성물 중 각각의 살바이러스제의 적합한 농도가 살바이러스제의 효능, 안정성, 별개의 살바이러스제의 수, 제형 및 조성물의 적용 방법과 같은 인자에 좌우되는 것을 인식할 것이다.
vii. 제초제
본원에 기재된 PMP 조성물은 1가지 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10가지 초과)의 제초제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 제초제는 잡초의 건강을 감소(예를 들어, 그의 성장을 감소시키거나 사멸)시킬 수 있다(예를 들어, 그를 감소시키거나 제거할 수 있다). 본원에 기재된 바와 같은 제초제를 포함하는 PMP 조성물을 (a) 식물 상의 표적 수준(예를 들어, 소정의 또는 역치 수준)의 제초제 농도에 도달하고; (b) 잡초의 건강을 감소시키기에 충분한 양으로, 그리고 그 시간 동안 표적 잡초와 접촉시킬 수 있다. 본원에 기재된 제초제는 본원에 기재된 임의의 방법을 위하여 PMP 조성물에 제형화될 수 있으며, 특정 경우에, 그의 PMP와 회합될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "제초제"는 잡초를 사멸시키거나, 그의 성장, 증식, 번식 또는 확산을 저해하는 물질을 지칭한다. 다수의 화합물질이 제초제로서 사용될 수 있으며, 이는 글루포시네이트, 프로파퀴자포프(Propaquizafop), 메타미트론(Metamitron), 메타자클로르(Metazachlor), 펜디메탈린(Pendimethalin), 플루페나세트(Flufenacet), 디플루페니칸(Diflufenican), 클로마존(Clomazone), 니코술푸론(Nicosulfuron), 메소트리온(Mesotrione), 피녹사덴(Pinoxaden), 술코트리온(Sulcotrione), 프로술포카르브(Prosulfocarb), 술펜트라존(Sulfentrazone), 비페녹스(Bifenox), 퀸메락(Quinmerac), 트리알레이트(Triallate), 터부틸라진(Terbuthylazine), 아트라진(Atrazine), 옥시플루오르펜(Oxyfluorfen), 디우론(Diuron), 트리플루랄린(Trifluralin) 또는 클로로톨루론(Chlorotoluron)을 포함한다. 제초제의 추가의 예는 벤조산 제초제, 예컨대 디캄바 에스테르, 페녹시알칸산 제초제, 예컨대 2,4-D, MCPA 및 2,4-DB 에스테르, 아릴옥시페녹시프로피온산 제초제, 예컨대 클로디나포프(clodinafop), 시할로포프(cyhalofop), 페녹사프로프(fenoxaprop), 플루아지포프(fluazifop), 할록시포프(haloxyfop) 및 퀴잘로포프(quizalofop) 에스테르, 피리딘카복실산 제초제, 예컨대 아미노피랄리드, 피클로람 및 클로피랄리드 에스테르, 피리미딘카복실산 제초제, 예컨대 아미노사이클로피라클로르 에스테르, 피리딜옥시알칸산 제초제, 예컨대 플루오르옥시피르(fluoroxypyr) 및 트리클로피르(triclopyr) 에스테르 및 하이드록시벤조니트릴 제초제, 예컨대 브로목시닐(bromoxynil) 및 이옥시닐(ioxynil) 에스테르, 아릴피리딘 카복실산의 에스테르 및 본원에 각각 그의 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 제7,314,849호, 미국 특허 제7,300,907호 및 미국 특허 제7,642,220호에 개시된 일반 구조의 아릴피리미딘 카복실산을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 제초제는 2,4-D, 2,4-DB, 아세토클로르(acetochlor), 아시플루오르펜(acifluorfen), 알라클로르(alachlor), 아메트린(ametryn), 아미트롤(amitrole), 아술람(asulam), 아트라진(atrazine), 아자페니딘(azafenidin), 베네핀(benefin), 벤술푸론(bensulfuron), 벤술리드(bensulide), 벤타존(bentazon), 브로마실(bromacil), 브로목시닐(bromoxynil), 부틸레이트, 카르펜트라존(carfentrazone), 클로람벤(chloramben), 클로르이무론(chlorimuron), 클로르프로함(chlorproham), 클로르술푸론(chlorsulfuron), 클레토딤(clethodim), 클로마존(clomazone), 클로피랄리드(clopyralid), 클로란술람(cloransulam), 시아나진(cyanazine), 사이클로에이트(cycloate), DCPA, 데스메디팜(desmedipham), 디클로베닐(dichlobenil), 디클로포프(diclofop), 디클로술람(diclosulam), 디에타틸(diethatyl), 디펜조쿠아트(difenzoquat), 디플루펜조피르(diflufenzopyr), 디메텐아미드(dimethenamid)-p, 디쿠아트(diquat), 디우론(diuron), DSMA, 엔도탈(endothall), EPTC, 에탈플루랄린(ethalfluralin), 에타메트술푸론(ethametsulfuron), 에토푸메세이트(ethofumesate), 페녹사프로프(fenoxaprop), 플루아지포프(fluazifop)-P, 플루카바존(flucarbazone), 플루페나세트(flufenacet), 플루메트술람(flumetsulam), 플루미클로락(flumiclorac), 플루미옥사진(flumioxazin), 플루오메투론(fluometuron), 플루록시피르(fluroxypyr), 플루티아세트(fluthiacet), 포메사펜(fomesafen), 포람술푸론(foramsulfuron), 글루포시네이트, 글리포세이트(glyphosate), 할로술푸론(halosulfuron), 할록시포프(haloxyfop), 헥사지논(hexazinone), 이마자메타벤즈(imazamethabenz), 이마자목스(imazamox), 이마자픽(imazapic), 이마자퀸(imazaquin), 이마제타피르(imazethapyr), 이속사벤(isoxaben), 이속사플루톨(isoxaflutole), 락토펜(lactofen), 리누론(linuron), MCPA, MCPB, 메소트리온(mesotrione), 메타졸(methazole), 메톨라클로르(metolachlor)-s, 메트리부진(metribuzin), 메트술푸론(metsulfuron), 몰리네이트(molinate), MSMA, 나프로파미드(napropamide), 나프탈람(naptalam), 니코술푸론(nicosulfuron), 노르플루라존(norflurazon), 오리잘린(oryzalin), 옥사디아존(oxadiazon), 옥사술푸론(oxasulfuron), 옥시플루오르펜(oxyfluorfen), 파라쿠아트(paraquat), 페불레이트(pebulate), 펠라르곤산(pelargonic acid), 펜디메탈린(pendimethalin), 펜메디팜(phenmedipham), 피클로람(picloram), 프리미술푸론(primisulfuron), 프로디아민(prodiamine), 프로메트린(prometryn), 프로나미드(pronamide), 프로파클로르(propachlor), 프로파닐(propanil), 프로술푸론(prosulfuron), 피라존(pyrazon), 피리데이트(pyridate), 피리티오박(pyrithiobac), 퀸클로락(quinclorac), 퀴잘로포프(quizalofop), 림술푸론(rimsulfuron), 세톡시딤(sethoxydim), 시두론(siduron), 시마진(simazine), 술펜트라존(sulfentrazone), 술포메투론(sulfometuron), 술포술푸론(sulfosulfuron), 테부티우론(tebuthiuron), 테르바실(terbacil), 티아조피르(thiazopyr), 티펜술푸론(thifensulfuron), 티오벤카르브(thiobencarb), 트랄콕시딤(tralkoxydim), 트리알레이트(triallate), 트리아술푸론(triasulfuron), 트리베누론(tribenuron), 트리클로피르(triclopyr), 트리플루랄린(trifluralin), 트리플루술푸론(triflusulfuron), 베르놀레이트(vernolate)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 당업자는 조성물 중 각각의 제초제의 적합한 농도가 제초제의 효능, 안정성, 별개의 제초제의 수, 제형 및 조성물의 적용 방법과 같은 인자에 좌우되는 것을 인식할 것이다.
viii. 기피제
본원에 기재된 PMP 조성물은 기피제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, PMP 조성물은 2가지 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10가지 초과)의 상이한 기피제를 포함한다. 예를 들어, 기피제는 본원에 기재된 유해물(예를 들어, 곤충, 선충 또는 연체동물); 미생물(예를 들어, 식물병원체 또는 식물내생생물, 예컨대 박테리아, 진균 또는 바이러스); 또는 잡초 중 임의의 것을 기피할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 기피제를 포함하는 PMP 조성물을 (a) 표적 수준(예를 들어, 소정의 또는 역치 수준)의 기피제 농도에 도달하고; (b) 미처리 식물에 비하여 식물 상의 유해물의 수준을 감소시키기에 충분한 양으로, 그리고 그 시간 동안 표적 식물 또는 그로 침입된 식물과 접촉시킬 수 있다. 본원에 기재된 기피제는 본원에 기재된 임의의 방법을 위하여 PMP 조성물에 제형화될 수 있으며, 특정 경우에, 그의 PMP와 회합될 수 있다.
일부 경우에, 기피제는 곤충 기피제이다. 널리 알려져 있는 곤충 기피제의 일부 예에는 다음이 포함된다: 벤질; 벤질 벤조에이트; 2,3,4,5-비스(부틸-2-엔)테트라하이드로푸르푸랄(MGK 기피제 11); 부톡시폴리프로필렌 글리콜; N-부틸아세트아닐리드; n-부틸-6,6-디메틸-5,6-디하이드로-1,4-피론-2-카복실레이트(인달론(Indalone)); 디부틸 아디페이트; 디부틸 프탈레이트; 디-n-부틸 숙시네이트(타바트렉스(Tabatrex)); N,N-디에틸-메타-톨루아미드(DEET); 디메틸 카베이트(엔도, 엔도)-디메틸 비사이클로[2.2.1] 헵트-5-엔-2,3-디카복실레이트); 디메틸 프탈레이트; 2-에틸-2-부틸-1,3-프로판디올; 2-에틸-1,3-헥산디올(러트거즈(Rutgers) 612); 디-n-프로필 이소신코메로네이트(MGK 기피제 326); 2-페닐사이클로헥사놀; p-메탄-3,8-디올 및 n-프로필 N,N-디에틸숙시나메이트. 다른 기피제는 시트로넬라 오일(citronella oil), 디메틸 프탈레이트, n-부틸메시틸 옥시드 옥살레이트 및 2-에틸 헥산디올-1,3(문헌[Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 2nd Ed., Vol. 11: 724-728]; 및 문헌[The Condensed Chemical Dictionary, 8th Ed., p 756] 참조)을 포함한다.
곤충 기피제는 합성 또는 비합성 곤충 기피제일 수 있다. 합성 곤충 기피제의 예에는 메틸 안트라닐레이트 및 다른 안트라닐레이트-계 곤충 기피제, 벤즈알데히드, DEET(N,N-디에틸-m-톨루아미드), 디메틸 카베이트, 디메틸 프탈레이트, 이카리딘(icaridin)(즉, 피카리딘(picaridin), 바이레펠(Bayrepel) 및 KBR 3023), 인달론(indalone)(예를 들어, "6-2-2" 혼합물(60% 디메틸 프탈레이트, 20% 인달론, 20% 에틸헥산디올)에 사용되는 바와 같음), IR3535(3-[N-부틸-N-아세틸]-아미노프로피온산, 에틸 에스테르), 메토플루트린(metofluthrin), 페르메트린(permethrin), SS220 또는 트리사이클로데세닐 알릴 에테르(tricyclodecenyl allyl ether)가 포함된다. 천연 곤충 기피제의 예에는 작살나무(칼리카르파(Callicarpa)) 잎, 자작 나무 껍질, 늪도금양(bog myrtle)(마이리카 게일(Myrica Gale)), 캣닢 오일(catnip oil)(예를 들어, 네페탈락톤(nepetalactone)), 시트로넬라 오일(citronella oil), 레몬 유칼립투스(코림비아 시트리오도라(Corymbia citriodora); 예를 들어, p-멘탄-3,8-디올(PMD))의 에센셜 오일, 님 오일(neem oil), 레몬그래스(lemongrass), 멜라루카 알터니폴리아(Melaleuca alternifolia)의 잎으로부터의 티 트리 오일(tea tree oil), 담배 또는 그의 추출물이 포함된다.
ix. 시비제
본원에 기재된 PMP 조성물은 시비제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이종 시비제는 PMP와 회합된다. 예를 들어, PMP는 이종 시비제를 캡슐화할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 이종 시비제는 PMP의 표면 상에 매립되거나 그의 표면에 컨쥬게이트될 수 있다.
이종 시비제의 예는, 식물 영양제 또는 식물 성장 조절제 등 당업계에 공지된 것들을 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 시비제는 식물 공생생물의 건강을 증가시킬 수 있는 펩티드, 폴리펩티드, 핵산, 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 시비제는 다양한 식물 또는 식물 공생생물의 건강을 증가시킬 수 있는 제제일 수 있거나, 하나 이상의 특정 표적 식물 또는 식물 공생생물(예를 들어, 특정 종 또는 속의 식물 또는 식물 공생생물)을 표적화하는 것일 수 있다.
일부 경우에, 시비제는 변형될 수 있다. 예를 들어, 변형은 화학적 변형, 예를 들어, 마커, 예를 들어, 형광 마커 또는 방사성 마커로의 컨쥬게이션일 수 있다. 다른 예에서, 변형은 제제의 안정성, 운반, 표적화, 생체이용률 또는 반감기를 향상시키는 모이어티, 예를 들어, 지질, 글리칸, 중합체(예를 들어, PEG), 양이온 모이어티로의 컨쥬게이션 또는 작동적 연결을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 PMP 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 이종 시비제의 예는 하기에 약술되어 있다.
일부 경우에, 이종 시비제는 식물의 성장에 필수적인 하나 이상의 식물 영양소를 공급하기 위하여 토양 또는 식물 조직에 적용되는 천연 또는 합성 기원의 임의의 물질을 포함한다. 식물 영양소는 다량영양소, 미량영양소 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 식물 다량영양소는 질소, 인, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 및/또는 황을 포함한다. 식물 미량영양소는 구리, 철, 망간, 몰리브덴, 아연, 보론, 규소, 코발트 및/또는 바나듐을 포함한다. 식물 영양소 비료의 예는 우레아, 질산암모늄, 황산암모늄, 비-압력 질소 용액, 액체 암모니아, 무수 암모니아, 티오황산암모늄, 황-코팅 우레아, 우레아-포름알데히드, IBDU, 중합체-코팅 우레아, 질산칼슘, 우레아포름 또는 메틸렌 우레아를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 질소 비료, 인 비료, 예컨대 디암모늄 포스페이트, 모노암모늄 포스페이트, 암모늄 폴리포스페이트, 농축된 과인산염 및 삼중 과인산염, 또는 칼륨 비료, 예컨대 염화칼륨, 황산칼륨, 칼륨-마그네슘 황산염, 질산칼륨을 포함한다. 이러한 조성물은 조성물 내에 유리 염 또는 이온으로서 존재할 수 있다. 비료는 그의 성분, 예컨대 질소, 인 또는 칼륨 중 하나 이상의 함량에 의해 명시될 수 있다. 비료 내의 이들 요소의 함량은 N-P-K 값(N=중량 백분율 기준 질소 함량, P=중량 백분율 기준 인 함량, 및 K=중량 백분율 기준 칼륨 함량)으로 나타낼 수 있다.
다른 한편, 무기 비료는 비-생 물질로부터 제조되며, 예를 들어, 질산암모늄, 황산암모늄, 우레아, 염화칼륨, 탄산칼륨, 인산암모늄, 무수 암모니아 및 기타 인산염을 포함한다. 무기 비료는 상업적으로 용이하게 입수 가능하며, 식물에 즉시 이용 가능한 가용성 형태의 영양소를 함유한다. 무기 비료는 일반적으로 저렴하며, 원하는 원소에 대한 단가가 낮다. 해당 분야의 숙련자는 시비제 내의 주어진 원소의 정확한 양을 계산하고 식물 또는 토양에 투여할 수 있음을 인식할 것이다.
비료는 추가로 유기 비료 또는 무기 비료로서 분류될 수 있다. 유기 비료는 생 물질로부터 유래된 조성물에서와 같이, 탄소 백본을 지니는 분자 골격을 갖는 비료를 포함한다. 유기 비료는 생 물질로부터 유래된 물질로부터 제조된다. 동물 분뇨, 퇴비, 골분, 우모분 및 혈분은 통상적인 유기 비료의 예이다. 다른 한편, 유기 비료는 통상적으로 식물에 즉시 이용 가능하지 않으며, 식물에 의한 사용 이전에 비료 성분을 더 단순한 구조로 분해하는 토양 미생물을 필요로 한다. 또한, 유기 비료는 통상적인 무기 비료를 사용하여 관찰되는 것과 같은 식물 성장 반응을 유도할 수 있을 뿐 아니라, 천연 유기 비료는 또한 토양 미생물 모집단 성장 및 활성을 자극할 수 있다. 증가된 토양 미생물 모집단(예를 들어, 식물 공생생물)은 토양의 물리적 및 화학적 특성에 유의미한 유익한 영향을 가질 수 있을 뿐 아니라, 질병 및 유해물 내성을 증가시킬 수 있다.
일 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 식물 영양소를 포함하는 PMP 조성물을 (a) 표적 수준(예를 들어, 소정의 또는 역치 수준)의 식물 영양소 농도(식물 내부 또는 식물 표면)에 도달하고; (b) 식물의 건강을 미처리 식물에 비해 증가시키기에 충분한 양으로, 그리고 그 시간 동안, 식물과 접촉시킬 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 식물 영양소를 포함하는 PMP 조성물을 (a) 표적 수준(예를 들어, 소정의 또는 역치 수준)의 식물 영양소 농도(식물 공생생물(예를 들어, 박테리아 또는 진균 내생공생생물) 내부 또는 식물 공생생물 표면)에 도달하고; (b) 식물 공생생물의 건강을 미처리 식물 공생생물에 비해 증가시키기에 충분한 양으로, 그리고 그 시간 동안, 식물 공생생물과 접촉시킬 수 있다.
이종 시비제는 식물 성장 조절제를 포함할 수 있다. 예시적인 식물 성장 조절제는 옥신(auxin), 시토키닌(cytokinin), 지베렐린(gibberellin) 및 아브시스산(abscisic acid)을 포함한다. 일부 경우에, 식물 성장 조절제는 아브시스산, 아미도클로르(amidochlor), 안시미돌(ancymidol), 6-벤질아미노푸린, 브라시놀라이드(brassinolide), 부트랄린(butralin), 클로르메쿼트(chlormequat)(클로르메쿼트 클로라이드), 콜린 클로라이드, 시클라닐리드(cyclanilide), 다미노자이드(daminozide), 디케굴락 (dikegulac), 디메티핀(dimethipin), 2,6-디메틸푸리딘, 에테폰(ethephon), 플루메트랄린(flumetralin), 플루르프리미돌(flurprimidol), 플루티아세트(fluthiacet), 포르클로르페누론(forchlorfenuron), 지베렐산(gibberellic acid), 이나벤피드(inabenfide), 인돌-3-아세트산, 말레산 하이드라지드, 메플루이디드(mefluidide), 메피쿼트(mepiquat) (메피쿼트 클로라이드), 나프탈렌아세트산, N6-벤질아데닌, 파클로부트라졸(paclobutrazole), 프로헥사디온(prohexadione)(프로헥사디온-칼슘), 프로하이드로자스몬(prohydrojasmon), 티디아주론(thidiazuron), 트리아펜테놀(triapenthenol), 트리부틸 포스포로트리티오에이트, 2,3,5-트리-아이오도벤조산, 트리넥사파크-에틸(trinexapac-ethyl) 및 유니코나졸(uniconazole)이다. 종자 코팅 조성물에 혼입될 수 있는 다른 식물 성장 조절제는 제US 2012/0108431호에 기재되어 있으며, 이는 그의 전문이 참조로 포함된다.
x. 식물 변형제
본원에 기재된 PMP 조성물은 하나 이상의 이종 식물 변형 제제를 포함한다. 예를 들어, PMP는 이종 식물 변형 제제를 캡슐화할 수 있다. 대안적으로 추가적으로, 이종 식물 변형제(예를 들어, 농약 제제 및/또는 기피제)는 PMP의 표면 상에 매립되거나 그의 표면에 컨쥬게이트될 수 있다.
일부 경우에, 식물 변형제는 펩티드 또는 핵산을 포함할 수 있다. 식물 변형제는 다양한 식물의 건강을 증가시키는 제제일 수 있거나, 하나 이상의 특정 식물(예를 들어, 특정 종 또는 속의 식물 )을 표적화하는 것일 수 있다. 또한, 일부 경우에, PMP 조성물은 2가지 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10가지 초과)의 상이한 식물 변형제를 포함한다.
일부 경우에, 이종 식물 변형제(예를 들어, 핵산 분자 또는 펩티드를 포함하는 제제)는 변형될 수 있다. 예를 들어, 변형은 화학적 변형, 예를 들어, 마커, 예를 들어, 형광 마커 또는 방사성 마커로의 컨쥬게이션일 수 있다. 다른 예에서, 변형은 제제의 안정성, 운반, 표적화, 생체이용률 또는 반감기를 향상시키는 모이어티, 예를 들어, 지질, 글리칸, 중합체(예를 들어, PEG), 양이온 모이어티로의 컨쥬게이션 또는 작동적 연결을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 PMP 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 이종 식물 변형제(예를 들어, 펩티드 또는 핵산)의 예는 하기에 약술되어 있다.
A. 폴리펩티드
본원에 기재된 PMP 조성물 (예를 들어, PMP)은 이종 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 PMP 조성물은 식물을 변형시키는(예를 들어, 예를 들어, 식물의 건강을 증가시키는) 폴리펩티드 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 식물의 건강을 증가시킬 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 포함하는 PMP 조성물을 (a) 표적 수준(예를 들어, 소정의 또는 역치 수준)의 폴리펩티드 농도에 도달하고; (b) 식물을 변형(예를 들어, 식물의 건강을 증가)시키기에 충분한 양으로, 그리고 그 시간 동안, 식물과 접촉시킬 수 있다.
본원에서 사용될 수 있는 폴리펩티드의 예는 효소(예를 들어, 대사적 재조합효소, 헬리카제, 인테그라제, RNAse, DNAse 또는 유비퀴틴화 단백질), 포어-형성 단백질, 신호전달 리간드, 세포 투과 펩티드, 전사 인자, 수용체, 항체, 나노바디, 유전자 편집 단백질(예를 들어, CRISPR-Cas 시스템, TALEN 또는 아연 핑거(zinc finger)), 리보단백질, 단백질 압타머 또는 샤페론을 포함할 수 있다.
본원에 포함되는 폴리펩티드는 천연 발생 폴리펩티드 또는 재조합으로 생성된 변이체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 폴리펩티드는 그의 기능적 단편 또는 변이체(예를 들어, 그의 효소적으로 활성인 단편 또는 변이체)일 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 천연 발생 폴리펩티드의 서열에 대하여, 예를 들어, 특정 영역에 걸쳐 또는 전체 서열에 걸쳐 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 본원에 기재된 폴리펩티드 중 임의의 것의 기능적으로 활성인 변이체일 수 있다. 일부 경우에, 폴리펩티드는 관심 단백질에 대하여 적어도 50%(예를 들어, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 그 이상)의 동일성을 가질 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드는 본원에 기재된 용도 중 임의의 것을 위하여 조성물 중에 제형화될 수 있다. 본원에 개시된 조성물은 임의의 수 또는 유형(예를 들어, 부류)의 폴리펩티드, 예컨대 적어도 약 1가지 폴리펩티드, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 또는 그 이상의 폴리펩티드 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 조성물 중 각각의 폴리펩티드의 적합한 농도는 폴리펩티드의 효능, 안정성, 조성물 중 별개의 폴리펩티드의 수, 제형 및 조성물의 적용 방법과 같은 인자에 좌우된다. 일부 경우에, 액체 조성물 중 각각의 폴리펩티드는 약 0.1 ng/㎖ 내지 약 100 ㎎/㎖이다. 일부 경우에, 고체 조성물 중 각각의 폴리펩티드는 약 0.1 ng/g 내지 약 100 mg/g이다.
폴리펩티드의 제조 방법은 해당 분야에 일상적이다. 일반적으로, 문헌[Smales & James (Eds.), Therapeutic Proteins: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press (2005)]; 및 문헌[Crommelin, Sindelar & Meibohm (Eds.), Pharmaceutical Biotechnology: Fundamentals and Applications, Springer (2013)]을 참조한다.
재조합 단백질이 또한, 곤충 세포, 효모, 박테리아, 포유동물 세포 또는 다른 세포를 사용하여 적절한 프로모터의 제어 하에서도 생성될 수 있지만, 폴리펩티드의 생성 방법은 식물 세포에서의 발현을 포함한다. 포유동물 발현 벡터는 비전사된 요소, 예컨대 복제 원점, 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 다른 5' 또는 3' 플랭킹 비전사되는 서열, 및 5' 또는 3' 비번역되는 서열, 예컨대 필수 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여자 및 수여자 부위 및 종결 서열을 포함할 수 있다. SV40 바이러스 게놈으로부터 유래된 DNA 서열, 예를 들어, SV40 원점, 조기 프로모터, 인핸서, 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위를 사용하여, 이종 DNA 서열의 발현에 필요한 다른 유전 요소를 제공할 수 있다. 박테리아, 진균, 효모 및 포유동물 세포 숙주에 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌[Green & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)]에 기재되어 있다.
다양한 포유동물 세포 배양 시스템을 사용하여 재조합 폴리펩티드 제제를 발현하고 제조할 수 있다. 포유동물 발현 시스템의 예는 CHO 세포, COS 세포, HeLA 및 BHK 세포주를 포함한다. 단백질 치료제의 생산을 위한 숙주 세포 배양 공정은 예를 들어, 문헌[Zhou and Kantardjieff (Eds.), Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing (Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology), Springer (2014)]에 기재되어 있다. 단백질의 정제는 문헌[Franks, Protein Biotechnology: Isolation, Characterization, and Stabilization, Humana Press (2013)]; 및 문헌[Cutler, Protein Purification Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press (2010)]에 기재되어 있다. 단백질 치료제의 제형은 문헌[Meyer (Ed.), Therapeutic Protein Drug Products: Practical Approaches to formulation in the Laboratory, Manufacturing, and the Clinic, Woodhead Publishing Series (2012)]에 기재되어 있다.
일부 경우에, PMP 조성물은 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 제제는 식물의 활성 및/또는 그의 성분의 기능을 차단하거나 강화하는 항체일 수 있다. 항체는 식물에서 폴리펩티드(예를 들어, 효소 또는 세포 수용체)의 길항제 또는 효능제로서 작용할 수 있다. 표적 항원에 대한 항체의 제조 및 이용은 해당 분야에 알려져 있다. 예를 들어, 항체 조작, 재생성 올리고뉴클레오티드의 이용, 5'-RACE, 파지 디스플레이 및 돌연변이유발; 항체 시험 및 특성화; 항체 약동학 및 약력학; 항체 정제 및 보관; 및 스크리닝 및 표지 기법을 포함하는 재조합 항체의 제조 방법에 대하여 문헌[Zhiqiang An (Ed.), Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, 1st Edition, Wiley, 2009 and also Greenfield (Ed.), Antibodies: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2013]을 참조한다.
B. 핵산
일부 경우에, 본원에 기재된 PMP는 이종 핵산을 포함한다. 수많은 핵산이 본원에 기재된 PMP 조성물 및 방법에서 유용하다. 본원에 개시된 PMP는 임의의 수 또는 유형(예를 들어, 부류)의 이종 핵산(예를 들어, DNA 분자 또는 RNA 분자, 예를 들어, mRNA, 가이드 RNA(gRNA) 또는 저해성 RNA 분자(예를 들어, siRNA, shRNA 또는 miRNA) 또는 하이브리드 DNA-RNA 분자), 예컨대 적어도 약 1가지의 핵산의 부류 또는 변이체, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20가지 또는 그 이상의 핵산의 부류 또는 변이체를 포함할 수 있다. 조성물 중 각각의 핵산의 적합한 농도는 효능, 핵산의 안정성, 별개의 핵산의 수, 제형, 및 조성물의 적용 방법과 같은 인자에 좌우된다. 본원에서 유용한 핵산의 예는 다이서(Dicer) 기질 작은 간섭 RNA(dsiRNA), 안티센스 RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀(shRNA), 마이크로RNA(miRNA), (비대칭 간섭 RNA) aiRNA, 펩티드 핵산(PNA), 모르폴리노, 잠금(locked) 핵산(LNA), 피위(piwi)-상호작용 RNA(piRNA), 리보자임, 데옥시리보자임(DNAzyme), 압타머(DNA, RNA), 원형 RNA(circRNA), 가이드 RNA(gRNA) 또는 DNA 분자를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 PMP 조성물을 (a) 표적 수준(예를 들어, 소정의 또는 역치 수준)의 핵산 농도에 도달하고; (b) 식물을 변형(예를 들어, 식물의 건강을 증가)시키기에 충분한 양으로, 그리고 그 시간 동안, 식물과 접촉시킬 수 있다.
(a) 펩티드를 인코딩하는 핵산
일부 경우에, PMP는 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산을 포함한다. 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 약 10 내지 약 50,000개 뉴클레오티드(nts), 약 25 내지 약 100개 nts, 약 50 내지 약 150개 nts, 약 100 내지 약 200개 nts, 약 150 내지 약 250개 nts, 약 200 내지 약 300개 nts, 약 250 내지 약 350개 nts, 약 300 내지 약 500개 nts, 약 10 내지 약 1000개 nts, 약 50 내지 약 1000개 nts, 약 100 내지 약 1000개 nts, 약 1000 내지 약 2000개 nts, 약 2000 내지 약 3000개 nts, 약 3000 내지 약 4000개 nts, 약 4000 내지 약 5000개 nts, 약 5000 내지 약 6000개 nts, 약 6000 내지 약 7000개 nts, 약 7000 내지 약 8000개 nts, 약 8000 내지 약 9000개 nts, 약 9000 내지 약 10,000개 nts, 약 10,000 내지 약 15,000개 nts, 약 10,000 내지 약 20,000개 nts, 약 10,000 내지 약 25,000개 nts, 약 10,000 내지 약 30,000개 nts, 약 10,000 내지 약 40,000개 nts, 약 10,000 내지 약 45,000개 nts, 약 10,000 내지 약 50,000개 nts 또는 그 사이의 임의의 범위의 길이를 가질 수 있다.
PMP 조성물은 또한, 관심 핵산 서열의 기능적 활성 변이체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 핵산의 변이체는 관심 핵산의 서열에 대하여 예를 들어, 특정 영역에 걸쳐 또는 전체 서열에 걸쳐, 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 일부 경우에, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 핵산 변이체에 의해 인코딩된 기능적 활성 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 핵산 변이체에 의해 인코딩된 기능적 활성 폴리펩티드는 예를 들어, 관심 폴리펩티드의 서열 또는 천연 유래된 폴리펩티드 서열에 대하여 특정 영역에 걸쳐 또는 전체 아미노산 서열에 걸쳐 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다.
단백질을 인코딩하는 핵산을 발현하기 위한 특정 방법은 적절한 프로모터의 제어 하에 곤충, 효모, 식물, 박테리아 또는 다른 세포를 포함하는 세포에서의 발현을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 비전사된 요소, 예컨대 복제 원점, 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 다른 5' 또는 3' 플랭킹 비전사되는 서열, 및 5' 또는 3' 비번역되는 서열, 예컨대 필수 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여자 및 수여자 부위 및 종결 서열을 포함할 수 있다. SV40 바이러스 게놈으로부터 유래된 DNA 서열, 예를 들어, SV40 원점, 조기 프로모터, 인핸서, 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위를 사용하여, 이종 DNA 서열의 발현에 필요한 다른 유전 요소를 제공할 수 있다. 박테리아, 진균, 효모 및 포유동물 세포 숙주에 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌[Green & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)]에 기재되어 있다.
재조합 방법을 사용한 유전학적 변형은 일반적으로 해당 분야에 알려져 있다. 원하는 유전자를 코딩하는 핵산 서열은 해당 분야에 알려져 있는 재조합 방법을 사용하여, 예컨대 유전자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝함으로써, 이를 포함하는 것으로 알려져 있는 벡터로부터 유전자를 유도함으로써, 또는 표준 기법을 사용하여 이를 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접 단리함으로써 수득될 수 있다. 대안적으로, 관심 유전자는 클로닝보다는 합성에 의해 생성될 수 있다.
천연 또는 합성 핵산의 발현은 전형적으로, 관심 유전자를 인코딩하는 핵산을 프로모터에 작동 가능하게 연결하고, 구축물을 발현 벡터 내로 혼입시킴으로써 달성된다. 발현 벡터는 박테리아에서의 복제 및 발현에 적합할 수 있다. 발현 벡터는 또한, 진핵생물에서의 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 원하는 핵산 서열의 발현에 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열 및 프로모터를 함유한다.
추가의 프로모터 요소, 예를 들어, 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 다수의 프로모터가 출발 부위의 하류에도 기능적 요소를 함유하는 것으로 최근에 밝혀진 바 있지만, 이들은 출발 부위의 상류 30 내지 110개 염기쌍(bp) 영역 내에 위치한다. 프로모터 요소 사이의 간격은 요소가 서로에 대하여 역전되거나 이동되는 경우, 프로모터 기능이 보존되도록 종종 유연하다. 티미딘 키나제(tk) 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 간격을 활성이 감소하기 시작하기 전에 50 bp 떨어지게 증가시킬 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소가 협동적으로 또는 독립적으로 기능하여 전사를 활성화할 수 있는 것으로 보인다.
적합한 프로모터의 일 예는 즉시 조기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 그에 작동 가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 유도할 수 있는 강력한 구성성 프로모터 서열이다. 적합한 프로모터의 또 다른 예는 신장 성장 인자-1α(EF-1α)이다. 그러나, 유인원 바이러스 40(SV40) 조기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스테인-바 바이러스 즉시 조기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 및 인간 유전자 프로모터, 예컨대, 비제한적으로 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터 및 크레아틴 키나제 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다른 구성성 프로모터 서열도 또한 사용될 수 있다.
대안적으로, 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다. 유도성 프로모터의 이용은 발현이 요망되는 경우에 그것이 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 턴 온(turning on)시키거나, 발현이 요망되지 않는 경우에 발현을 턴 오프(turning off)시킬 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
도입될 발현 벡터는 또한 선택 가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 모두를 함유하여, 바이러스 벡터를 통해 트랜스펙션시키거나, 감염시키고자 하는 세포의 집단으로부터 발현 세포의 확인 및 선택을 용이하게 할 수 있다. 다른 양태에서, 선택 가능한 마커는 개별 DNA 조각에서 운반되고, 동시-트랜스펙션 절차에서 사용될 수 있다. 선택 가능한 마커 및 리포터 유전자 둘 모두는 적절한 조절 서열이 플랭킹하여, 숙주 세포에서 발현을 가능하게 할 수 있다. 유용한 선택 가능한 마커는 예를 들어, 항생제-내성 유전자, 예컨대 neo 등을 포함한다.
잠재적으로 형질전환된 세포를 확인하고, 조절 서열의 기능을 평가하기 위하여, 리포터 유전자가 사용될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수여자 공급원에 존재하지 않거나 그에 의해 발현되지 않고 다소 용이한 검출 가능한 특성, 예를 들어 효소 활성에 의해 발현이 나타나는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수여자 세포 내로 도입된 후 적합한 시간에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제를 인코딩하는 유전자, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Ui-Tei et al., FEBS Letters 479:79-82, 2000]). 적합한 발현 시스템은 잘 알려져 있으며, 알려진 기법을 사용하여 제조되거나 상업적으로 수득될 수 있다. 일반적으로, 가장 높은 수준의 리포터 유전자 발현을 보이는 최소 5' 플랭킹 영역을 갖는 구축물이 프로모터로서 확인된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결되어, 프로모터-구동 전사를 조절하는 능력에 대하여 제제를 평가하는 데 사용될 수 있다.
일부 경우에, 유기체는 하나 이상의 단백질의 발현을 변경시키도록 유전학적으로 변형될 수 있다. 하나 이상의 단백질의 발현은 특정 시간, 예를 들어, 유기체의 발생 또는 분화 상태 동안 변형될 수 있다. 하나의 경우에, 본 발명은 하나 이상의 단백질, 예를 들어, 활성, 구조 또는 기능에 영향을 미치는 단백질의 발현을 변경시키기 위하여 조성물을 포함한다. 하나 이상의 단백질의 발현은 특정 위치(들)에 제한되거나, 유기체의 도처에 널리 퍼져 있을 수 있다.
(b) 합성 mRNA
PMP 조성물은 합성 mRNA 분자, 예를 들어, 폴리펩티드를 인코딩하는 합성 mRNA 분자를 포함할 수 있다. 합성 mRNA 분자는 예를 들어, 화학적으로 변형될 수 있다. mRNA 분자는 화학적으로 합성되거나, 시험관내에서 전사될 수 있다. mRNA 분자는 플라스미드, 예를 들어, 바이러스 벡터, 박테리아 벡터 또는 진핵 발현 벡터 상에 배치될 수 있다. 일부 예에서, mRNA 분자는 트랜스펙션, 전기천공법 또는 형질도입(예를 들어, 아데노바이러스 또는 렌티바이러스 형질도입)에 의해 세포로 운반될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 관심있는 변형된 RNA 제제는 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 갖는다. 이러한 변형이 알려져 있으며, 예를 들어, WO 2012/019168호에 기재되어 있다. 추가의 변형은 예를 들어, WO 2015/038892호; WO 2015/038892호; WO 2015/089511호; WO 2015/196130호; WO 2015/196118호 및 WO 2015/196128 A2호에 기재되어 있다.
일부 경우에, 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 변형된 RNA는 하나 이상의 말단 변형, 예를 들어, 5' 캡 구조 및/또는 폴리-A 테일(예를 들어, 100 내지 200개 뉴클레오티드 길이)을 갖는다. 5' 캡 구조는 CapO, Capl, ARCA, 이노신, Nl-메틸-구아노신, 2'플루오로-구아노신, 7-데아자-구아노신, 8-옥소-구아노신, 2-아미노-구아노신, LNA-구아노신 및 2-아지도-구아노신으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 경우에, 변형된 RNA는 또한, 적어도 하나의 코작 서열을 포함하는 5' UTR 및 3' UTR을 함유한다. 이러한 변형은 알려져 있으며, 예를 들어, WO 2012/135805호 및 WO 2013/052523호에 기재되어 있다. 추가의 말단 변형은 예를 들어, WO 2014/164253호 및 WO 2016/011306호, WO 2012/045075호 및 WO 2014/093924호에 기재되어 있다. 적어도 하나의 화학적 변형을 포함할 수 있는 캡핑된 RNA 분자(예를 들어, 변형된 mRNA)를 합성하기 위한 키메라 효소는 WO 2014/028429호에 기재되어 있다.
일부 경우에, 변형된 mRNA를 환화시키거나 콘카테머화시켜, 폴리-A 결합 단백질과 5'-말단 결합 단백질 사이의 상호작용을 보조하기 위한 번역 적격 분자를 생성할 수 있다. 환화 또는 콘카테머화의 기작은 적어도 3가지의 상이한 경로를 통해 발생할 수 있다: 1) 화학적, 2) 효소적 및 3) 리보자임 촉매작용된 경로. 새로 형성된 5'-/3'-연결기는 분자내 또는 분자간에 존재할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, WO 2013/151736호에 기재되어 있다.
변형된 RNA의 제조 및 정제 방법이 해당 분야에 알려져 있고, 개시되어 있다. 예를 들어, 변형된 RNA는 오직 시험관내 전사(IVT) 효소적 합성만을 사용하여 제조된다. IVT 폴리뉴클레오티드의 제조 방법은 해당 분야에 알려져 있으며, WO 2013/151666호, WO 2013/151668호, WO 2013/151663호, WO 2013/151669호, WO 2013/151670호, WO 2013/151664호, WO 2013/151665호, WO 2013/151671호, WO 2013/151672호, WO 2013/151667호 및 WO 2013/151736호에 기재되어 있다. 정제 방법은 시료를 RNA 전사물이 표면에 결합하게 하는 조건 하에서 복수의 티미딘 또는 그의 유도체 및/또는 복수의 우라실 또는 그의 유도체(폴리T/U)에 연결된 표면과 접촉시키고, 확대 가능한 방법을 통해 최대 10,000개 뉴클레오티드 길이의 더 긴 RNA의 분리를 가능하게 하는 이온(예를 들어, 음이온) 교환 크로마토그래피를 사용하여(WO 2014/144767호) 정제된 RNA 전사물을 표면으로부터 용리하고(WO 2014/152031호); 변형된 mRNA 시료가 DNAse 처리(WO 2014/152030호)를 겪게 함으로써 폴리A 테일을 포함하는 RNA 전사물을 정제하는 것을 포함한다.
변형된 RNA의 제형이 알려져 있으며, 예를 들어, WO 2013/090648호에 기재되어 있다. 예를 들어, 제형은 비제한적으로, 나노입자, 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 마이크로스 미소구체, 리피도이드(lipidoid), 리포플렉스(lipoplex), 리포좀, 중합체, 탄수화물(단순 당 포함), 양이온성 지질, 피브린 겔, 피브린 하이드로겔, 피브린 글루(glue), 피브린 실란트(sealant), 피브리노겐, 트롬빈, 신속하게 제거되는 지질 나노입자(reLNP) 및 그의 조합일 수 있다.
인간 질병의 분야에서 폴리펩티드를 인코딩하는 변형된 RNA, 항체, 바이러스 및 다양한 생체내 환경이 알려져 있으며, 예를 들어, 국제 공보 WO 2013/151666호, WO 2013/151668호, WO 2013/151663호, WO 2013/151669호, WO 2013/151670호, WO 2013/151664호, WO 2013/151665호, WO 2013/151736호의 표 6; 국제 공보 WO 2013/151672호의 표 6 및 표 7; 국제 공보 WO 2013/151671호의 표 6, 표 178 및 표 179; 국제 공보 WO 2013/151667호의 표 6, 표 185 및 표 186에 개시되어 있다. 상기 중 임의의 것은 IVT 폴리뉴클레오티드, 키메라 폴리뉴클레오티드 또는 원형 폴리뉴클레오티드로서 합성될 수 있으며, 각각은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 또는 말단 변형을 포함할 수 있다.
(c) 저해성 RNA
일부 경우에, PMP 조성물은 RNA 간섭(RNAi) 경로를 통해 작용하는 저해성 RNA 분자를 포함한다. 일부 경우에, 저해성 RNA 분자는 식물에서 유전자 발현의 수준을 감소시키고/감소시키거나 식물에서 단백질의 수준을 감소시킨다. 일부 경우에, 저해성 RNA 분자는 식물 유전자의 발현을 저해한다. 예를 들어, 저해성 RNA 분자는 식물 내의 유전자를 표적화하는 짧은 간섭 RNA, 짧은 헤어핀 RNA 및/또는 마이크로RNA를 포함할 수 있다. 특정 RNA 분자는 생물학적 RNA 간섭(RNAi) 과정을 통하여 유전자 발현을 저해할 수 있다. RNAi 분자는 전형적으로 15 내지 50개의 염기쌍(예컨대 약 18 내지 25개의 염기쌍)을 함유하고, 세포 내의 발현된 표적 유전자 내의 코딩 서열과 동일한(상보적인) 또는 거의 동일한(실질적으로 상보적인) 핵염기 서열을 갖는 RNA 또는 RNA-유사 구조를 포함한다. RNAi 분자는 비제한적으로 하기를 포함한다: 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중-가닥 RNA(dsRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 메로듀플렉스(meroduplex), 다이서 기질 및 다가 RNA 간섭(미국 특허 제8,084,599호, 제8,349,809호, 제8,513,207호 및 제9,200,276호). shRNA는 RNAi를 통해 표적 유전자의 발현을 감소시키는 헤어핀 턴(turn)을 포함하는 RNA 분자이다. shRNA는 예를 들어, 트랜스펙션, 전기천공법 또는 형질도입에 의해 플라스미드, 예를 들어, 바이러스 또는 박테리아 벡터의 형태로 세포로 운반될 수 있다. 마이크로RNA는 전형적으로 약 22개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 비-코딩 RNA 분자이다. miRNA는 mRNA 분자 상의 표적 부위에 결합하고, 예를 들어, mRNA의 절단, mRNA의 불안정화 또는 mRNA의 번역의 저해를 야기함으로써, mRNA를 침묵화시킨다. 일부 경우에, 저해성 RNA 분자는 기능의 음성 조절자의 수준 및/또는 활성을 감소시킨다. 다른 경우에, 저해제 RNA 분자는 기능의 양성 조절자의 저해제의 수준 및/또는 활성을 감소시킨다. 저해성 RNA 분자는 화학적으로 합성되거나 시험관내에서 전사될 수 있다.
일부 경우에, 핵산은 DNA, RNA 또는 PNA이다. 일부 경우에, RNA는 저해성 RNA이다. 일부 경우에, 저해성 RNA는 식물에서 유전자 발현을 저해한다. 일부 경우에, 핵산은, 식물에서, 효소(예를 들어, 대사성 재조합효소, 헬리카제, 인테그라제, RNAse, DNAse 또는 유비퀴틴화 단백질), 포어-형성 단백질, 신호전달 리간드, 세포 투과성 펩티드, 전사 인자, 수용체, 항체, 나노바디, 유전자 편집 단백질(예를 들어, CRISPR-Cas 시스템, TALEN 또는 아연 핑거), 리보단백질, 단백질 압타머 또는 샤페론의 발현을 증가시키는 mRNA, 변형된 mRNA 또는 DNA 분자이다. 일부 경우에, 핵산은 효소(예를 들어, 대사 효소, 재조합효소, 헬리카제 효소, 인테그라제 효소, RNAse 효소, DNAse 효소 또는 유비퀴틴화 단백질), 포어-형성 단백질, 신호전달 리간드, 세포 투과성 펩티드, 전사 인자, 수용체, 항체, 나노바디, 유전자 편집 단백질(예를 들어, CRISPR-Cas 시스템, TALEN 또는 아연 핑거), 리보단백질, 단백질 압타머 또는 샤페론의 발현을 증가시키는 mRNA, 변형된 mRNA 또는 DNA 분자이다. 일부 경우에, 식물 내의 발현의 증가는 참조 수준(예를 들어, 미처리 식물에서의 발현)에 비하여 약 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과의 발현의 증가이다. 일부 경우에, 식물 내의 발현의 증가는 참조 수준(예를 들어, 미처리 식물에서의 발현)에 비하여 약 2배, 약 4배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 25배, 약 50배, 약 75배 또는 약 100배 또는 그 이상의 발현의 증가이다.
일부 경우에, 핵산은 안티센스 RNA, dsiRNA, siRNA, shRNA, miRNA, aiRNA, PNA, 모르폴리노, LNA, piRNA, 리보자임, DNAzyme, 압타머(DNA, RNA), circRNA, gRNA 또는 DNA 분자(예를 들어, 안티센스 폴리뉴클레오티드)이며, 이는 예를 들어, 식물에서, 효소(대사성 효소, 재조합효소, 헬리카제 효소, 인테그라제 효소, RNAse 효소, DNAse 효소, 중합효소, 유비퀴틴화 단백질, 슈퍼옥시드 관리 효소 또는 에너지 생성 효소), 전사 인자, 분비 단백질, 구조적 인자(액틴, 키네신 또는 튜불린), 리보단백질, 단백질 압타머, 샤페론, 수용체, 신호전달 리간드 또는 수송체의 발현을 감소시키는 작용을 한다. 일부 경우에, 식물에서의 발현의 감소는 참조 수준(예를 들어, 미처리 식물에서의 발현)에 비하여 약 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과의 발현의 감소이다. 일부 경우에, 식물에서의 발현의 감소는 참조 수준(예를 들어, 미처리 식물에서의 발현)에 비하여 약 2배, 약 4배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 25배, 약 50배, 약 75배 또는 약 100배 또는 그 이상의 발현의 감소이다.
RNAi 분자는 표적 유전자의 전부 또는 단편에 대하여 실질적으로 상보적인 또는 완전히 상보적인 서열을 포함한다. RNAi 분자는 인트론과 엑손의 경계의 서열에 상보적이어서, 전사를 위하여 특정 유전자의 새로 생성된 핵 RNA 전사물이 mRNA로 성숙하는 것을 방지할 수 있다. 특정 유전자에 상보적인 RNAi 분자는 표적 유전자에 대한 mRNA와 혼성화하고, 그의 번역을 방지할 수 있다. 안티센스 분자는 DNA, RNA, 또는 그의 유도체 또는 혼성체일 수 있다. 이러한 유도체 분자의 예는 펩티드 핵산(PNA) 및 포스포로티오에이트-계 분자, 예컨대 데옥시리보핵 구아니딘(DNG) 또는 리보핵 구아니딘(RNG)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
RNAi 분자는 시험관내에서 합성된 바로 사용 가능한 RNA로서 또는 전사 시에 RNAo 분자를 제공하는 세포 내로 트랜스펙션되는 안티센스 유전자로서 제공될 수 있다. mRNA와의 혼성화는 RNAse H에 의한 혼성화된 분자의 분해 및/또는 번역 복합체의 형성의 저해를 초래한다. 둘 모두는 원래 유전자의 생성물을 생성하지 못한다.
관심 전사물에 혼성화하는 RNAi 분자의 길이는 대략 10개 뉴클레오티드, 약 15 또는 30개 뉴클레오티드 또는 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 이상의 뉴클레오티드일 수 있다. 표적화된 전사물에 대한 안티센스 서열의 동일성의 정도는 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95일 수 있다.
RNAi 분자는 또한 오버행, 즉, 전형적으로 쌍을 이루지 않은, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 본원에 정의된 쌍의 코어 서열에 의해 보통 형성되되는 이중 나선 구조에 직접 연루되지 않는 오버행 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. RNAi 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각 상에 독립적으로 약 1 내지 5개의 염기의 3' 및/또는 5' 오버행을 함유할 수 있다. 일부 경우에, 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 모두는 3' 및 5' 오버행을 함유한다. 일부 경우에, 한 가닥의 3' 오버행 뉴클레오티드 중 하나 이상은 다른 가닥의 하나 이상의 5' 오버행 뉴클레오티드와 염기 쌍을 이룬다. 다른 경우에, 하나의 가닥의 3' 오버행 뉴클레오티드 중 하나 이상은 다른 가닥의 하나 이상의 5' 오버행 뉴클레오티드와 염기 쌍을 이루지 않는다. RNAi 분자의 센스 및 안티센스 가닥은 동일한 수의 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있거나, 그렇지 않을 수 있다. 안티센스 및 센스 가닥은 듀플렉스를 형성할 수 있으며, 5' 말단만이 블런트 말단을 갖거나, 3' 말단만이 블런트 말단을 갖거나, 5' 및 3' 말단 둘 모두가 블런트 말단이거나, 5' 말단 또는 3' 말단 중 어느 것도 블런트 말단이 아니다. 또 다른 경우에, 오버행 내의 뉴클레오티드 중 하나 이상은 티오포스페이트, 포스포로티오에이트, 데옥시뉴클레오티드 역전(3'에서 3' 연결된) 뉴클레오티드를 함유하거나, 변형된 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드이다.
작은 간섭 RNA(siRNA) 분자는 표적 mRNA의 약 15 내지 약 25개의 연속 뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 경우에, siRNA 서열은 디뉴클레오티드 AA로 시작하며, 약 30 내지 70%(약 30 내지 60%, 약 40 내지 60% 또는 약 45% 내지 55%)의 GC-함량을 포함하며, 예를 들어, 표준 BLAST 검색에 의해 결정시, 그것이 도입될 게놈 내의 표적 이외의 임의의 뉴클레오티드 서열에 대하여 높은 동일성 백분율을 갖지 않는다.
siRNA 및 shRNA는 내인성 마이크로RNA(miRNA) 유전자의 처리 경로에서의 중간체와 유사하다(문헌[Bartel, Cell 116:281-297, 2004]). 일부 경우에, siRNA는 miRNA로서 기능할 수 있으며, 그 역도 그러하다(문헌[Zeng et al., Mol. Cell 9:1327-1333, 2002]; 문헌[Doench et al., Genes Dev. 17:438-442, 2003]). 외인성 siRNA는 siRNA에 대한 씨드 상보성을 사용하여 mRNA를 하향조절한다(문헌[Birmingham et al., Nat. Methods 3:199-204, 2006]). 3' UTR 내의 다중 표적 부위는 더 강력한 하향조절을 제공한다(문헌[Doench et al., Genes Dev. 17:438-442, 2003]).
알려져 있는 유효한 siRNA 서열 및 동족 결합 부위는 또한 관련 문헌에 널리 나타나 있다. RNAi 분자는 해당 분야에 알려져 있는 기술에 의해 용이하게 설계되고 생성된다. 또한, 효율적이고 특이적인 서열 모티프의 검색 기회를 증가시키는 계산 도구가 존재한다(문헌[Pei et al., Nat. Methods 3(9):670-676, 2006]; 문헌[Reynolds et al., Nat. Biotechnol. 22(3):326-330, 2004]; 문헌[Khvorova et al., Nat. Struct. Biol. 10(9):708-712, 2003]; 문헌[Schwarz et al., Cell 115(2):199-208, 2003]; 문헌[Ui-Tei et al., Nucleic Acids Res. 32(3):936-948, 2004]; 문헌[Heale et al., Nucleic Acids Res. 33(3):e30, 2005]; 문헌[Chalk et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 319(1):264-274, 2004]; 및 문헌[Amarzguioui et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 316(4):1050-1058, 2004]).
RNAi 분자는 유전자에 의해 인코딩된 RNA의 발현을 조절한다. 다수의 유전자가 서로 어느 정도의 서열 상동성을 공유할 수 있기 때문에, 일부 경우에, RNAi 분자를 충분한 서열 상동성을 갖는 유전자의 부류를 표적화하도록 설계할 수 있다. 일부 경우에, RNAi 분자는 상이한 유전자 표적 간에 공유되거나, 특정 유전자 표적에 대하여 특유한 서열에 대하여 상보성을 갖는 서열을 함유할 수 있다. 일부 경우에, RNAi 분자는 몇몇의 유전자 사이에 상동성을 갖는 RNA 서열의 보존된 영역을 표적화하도록 설계됨으로써, 유전자 과 내의 몇몇의 유전자(예를 들어, 상이한 유전자 아이소형, 스플라이스 변이체, 돌연변이 유전자 등)를 표적화할 수 있다. 일부 경우에, RNAi 분자는 단일 유전자의 특정 RNA 서열에 특유한 서열을 표적화하도록 설계될 수 있다.
저해성 RNA 분자는 예를 들어, 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어, 2'-플루오로, 2'-o-메틸, 2'-데옥시, 비잠금 핵산, 2'-하이드록시, 포스포로티오에이트, 2'-티오우리딘, 4'-티오우리딘, 2'-데옥시우리딘을 함유하도록 변형될 수 있다. 이론에 제한되지 않고, 이러한 변형이 뉴클레아제 내성 및/또는 혈청 안정성을 증가시키거나 면역원성을 감소시킬 수 있는 것으로 여겨진다.
일부 경우에, RNAi 분자는 생리학적으로 불안정한 결합 또는 링커를 통해 운반 중합체에 연결된다. 생리학적으로 불안정한 링커는 그것이 특정 생리학적 조건 하에 존재하는 때 화학적 전환(예를 들어, 절단)을 겪도록 선택된다(예를 들어, 이황화 결합은 세포질의 환원 환경에서 절단됨). 생리학적으로 불안정한 연결기의 절단에 의한 중합체로부터의 분자의 방출에 의해, 분자와 활성에 적절한 세포 성분의 상호작용이 용이하게 된다.
RNAi 분자-중합체 컨쥬게이트는 분자를 중합체에 공유적으로 연결함으로써 형성될 수 있다. 중합체는 그것이 반응성 기 A를 함유하도록 중합되거나 변형된다. RNAi 분자는 또한 그것이 반응성 기 B를 함유하도록 중합되거나 변형된다. 반응성 기 A 및 B는 그들이 해당 분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 가역적인 공유적 연결기를 통해 연결될 수 있도록 선택된다.
중합체로의 RNAi 분자의 컨쥬게이션은 과잉의 중합체의 존재 하에서 수행될 수 있다. RNAi 분자 및 중합체가 컨쥬게이션 동안 반대 전하의 것일 수 있기 때문에, 과잉의 중합체의 존재는 컨쥬게이트의 응집을 감소시키거나 제거할 수 있다. 대안적으로, 과잉의 운반체 중합체, 예컨대 다가양이온이 사용될 수 있다. 과잉의 중합체가 컨쥬게이트의 투여 이전에 컨쥬게이트된 중합체로부터 제거될 수 있다. 대안적으로, 과잉의 중합체는 컨쥬게이트와 동시-투여될 수 있다.
비-코딩 RNA, 예컨대 리보자임, RNAse P, siRNA 및 miRNA에 기초한 저해성 제제의 제조 및 이용은 또한 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Sioud, RNA Therapeutics: Function, Design, and Delivery (Methods in Molecular Biology). Humana Press (2010)]에 기재되어 있다.
(d) 유전자 편집
본원에 기재된 PMP 조성물은 유전자 편집 시스템의 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제제는 식물 내의 유전자에 변경(예를 들어, 삽입, 결실(예를 들어, 낙아웃(knockout)), 전좌, 역위, 단일 점 돌연변이 또는 기타 돌연변이)을 도입할 수 있다. 예시적인 유전자 편집 시스템은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFNs), 전사 활성화제-유사 이펙터-기반의 뉴클레아제(TALEN) 및 클러스터링되고 규칙적 간격의 짧은 팔린드로믹 반복부(CRISPR) 시스템을 포함한다. ZFN, TALEN 및 CRISPR-기반의 방법은 예를 들어, 문헌[Gaj et al., Trends Biotechnol. 31(7):397-405, 2013]에 기재되어 있다.
전형적인 CRISPR/Cas 시스템에서, 엔도뉴클레아제는 단일- 또는 이중-가닥 DNA 서열을 표적화하는 서열-특이적 비-코딩 가이드 RNA에 의해 표적 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 서열-편집될 게놈 내의 부위)에 지향된다. CRISPR 시스템의 3가지 부류(I 내지 III)가 확인된 바 있다. 부류 II CRISPR 시스템은 (다수의 Cas 단백질보다는) 단일의 Cas 엔도뉴클레아제를 이용한다. 하나의 부류 II CRISPR 시스템은 II형 Cas 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas9, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)를 포함한다. crRNA는 가이드 RNA, 즉, 표적 DNA 서열에 상응하는 전형적으로 약 20개 뉴클레오티드 RNA 서열을 함유한다. crRNA는 또한, tracrRNA에 결합하여, 부분적으로 이중-가닥인 구조를 형성하는 영역을 함유하며, 이는 RNase III에 의해 절단되어 crRNA/tracrRNA 하이브리드를 초래한다. RNA는 Cas 단백질을 지향시키기 위한 가이드로서 작용하여, 스페이서 서열에 따라 특정 DNA/RNA 서열을 침묵화시킨다. 예를 들어, 문헌[Horvath et al., Science 327:167-170, 2010]; 문헌[Makarova et al., Biology Direct 1:7, 2006]; 문헌[Pennisi, Science 341:833-836, 2013]을 참조한다. 표적 DNA 서열은 일반적으로 주어진 Cas 엔도뉴클레아제에 대하여 특이적인 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 인접해 있어야 하지만; PAM 서열은 주어진 게놈의 도처에서 나타난다. 다양한 원핵 종으로부터 확인된 CRISPR 엔도뉴클레아제 특유한 PAM 서열 요건을 가지며; PAM 서열의 예는 5'-NGG(SEQ ID NO: 1)(스트렙토코커스 피오게네스), 5'-NNAGAA(SEQ ID NO: 2)(스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) CRISPR1), 5'-NGGNG(SEQ ID NO: 3)(스트렙토코커스 써모필러스 CRISPR3) 및 5'-NNNGATT(SEQ ID NO: 4)(나이세리아 메닌지디티스(Neisseria meningiditis))를 포함한다. 일부 엔도뉴클레아제, 예를 들어, Cas9 엔도뉴클레아제는 G-풍부 PAM 부위, 예를 들어, 5'-NGG(SEQ ID NO: 1)와 회합되며, PAM 부위로부터(그로부터 5') 3개 뉴클레오티드 상류의 위치에 표적 DNA의 블런트-말단 절단을 수행한다. 또 다른 부류 II CRISPR 시스템은 Cas9보다 더 작은 V형 엔도뉴클레아제 Cpf1을 포함하며; 예는 AsCpf1(아시드아미노코커스(Acidaminococcus) 종 유래) 및 LbCpf1(라크노스피라세아에(Lachnospiraceae) 종 유래)을 포함한다. Cpf1-회합된 CRISPR 어레이는 tracrRNA의 요건 없이 성숙 crRNA로 처리되며; 다시 말하면, Cpf1 시스템은 표적 DNA 서열을 절단하기 위하여 오직 Cpf1 뉴클레아제 및 crRNA만을 필요로 한다. Cpf1 엔도뉴클레아제는 T-풍부 PAM 부위, 예를 들어, 5'-TTN(SEQ ID NO: 5)과 회합된다. Cpf1은 또한, 5'-CTA (SEQ ID NO: 6) PAM 모티프를 인식할 수 있다. Cpf1은 4- 또는 5-뉴클레오티드 5' 오버행을 갖는 오프셋 또는 스태거형 이중-가닥 파단부를 도입함으로써, 예를 들어, 코딩 가닥 상의 PAM 부위(그로부터 3')로부터 18개 뉴클레오티드 하류, 및 상보성 가닥 상의 PAM 부위로부터 23개 뉴클레오티드 하류에 위치한 5-뉴클레오티드 오프셋 또는 스태거형 절단으로 표적 DNA를 절단함으로써 표적 DNA를 절단하며; 이러한 오프셋 절단으로부터 초래되는 5-뉴클레오티드 오버행은 상동성 재조합에 의한 DNA 삽입에 의해 블런트-말단 절단된 DNA에서의 삽입에 의한 것보다 더욱 정밀한 게놈 편집을 가능하게 한다. 예를 들어, 문헌[Zetsche et al., Cell 163:759-771, 2015]을 참조한다.
유전자 편집의 목적을 위하여, CRISPR 어레이는 요망되는 표적 DNA 서열에 상응하는 하나의 또는 다수의 가이드 RNA 서열을 함유하도록 설계될 수 있으며; 예를 들어, 문헌[Cong et al., Science 339:819-823, 2013]; 문헌[Ran et al., Nature Protocols 8:2281-2308, 2013]을 참조한다. gRNA 서열의 적어도 약 16 또는 17개 뉴클레오티드는 DNA 절단이 발생하기 위하여 Cas9에 의해 요구되며; Cpf1에 있어서, gRNA 서열의 적어도 약 16개 뉴클레오티드는 검출 가능한 DNA 절단을 달성하기 위하여 필요하다. 실시에서, 가이드 RNA 서열은 일반적으로 17 내지 24개의 뉴클레오티드(예를 들어, 19, 20 또는 21개의 뉴클레오티드)의 길이를 갖고 표적화된 유전자 또는 핵산 서열에 대하여 상보성이도록 설계된다. 커스텀 gRNA 생성자 및 알고리즘은 효율적인 가이드 RNA의 설계에 사용하기 위하여 상업적으로 이용 가능하다. 유전자 편집은 또한, 자연 발생 crRNA-tracrRNA 복합체를 모방하고 tracrRNA(뉴클레아제에 결합) 및 적어도 하나의 crRNA(뉴클레아제를 편집에 대해 표적화된 서열로 가이드함) 둘 모두를 함유하는 엔지니어링된(합성) 단일 RNA 분자인, 키메라 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 사용하여 달성된 바 있다. 화학적으로 변형된 sgRNA는 또한, 게놈 편집에서 효율적인 것으로 입증된 바 있으며; 예를 들어, 문헌[Hendel et al., Nature Biotechnol. 985-991, 2015]을 참조한다.
야생형 Cas9 단백질이 gRNA에 의해 표적화된 특정 DNA 서열에서 이중-가닥 파단부(DSB)를 생성하는 한편, 변형된 기능을 갖는 수많은 CRISPR 엔도뉴클레아제가 알려져 있으며, 예를 들어, 닉카제 버전의 Cas9는 오직 단일-가닥 파단만을 생성하며; 촉매적으로 비활성인 Cas9(dCas9)는 표적 DNA를 절단하지 않는다. dCas9를 인코딩하는 유전자를 이펙터 도메인을 인코딩하는 유전자와 융합시켜, 표적 유전자의 발현을 억제(CRISPRi)하거나 활성화(CRISPRa)시킬 수 있다. 예를 들어, 유전자는 전사 침묵화제(예를 들어, KRAB 도메인) 또는 전사 활성화제(예를 들어, dCas9-VP64 융합물)를 갖는 Cas9 융합물을 인코딩할 수 있다. 2개의 gRNA에 상동성인 표적 서열에 DSB를 생성하기 위하여, FokI 뉴클레아제에 융합된 촉매적 비활성 Cas9(dCas9)(dCas9-FokI)를 인코딩하는 유전자가 포함될 수 있다. 예를 들어, 애드진 레포지터리(Addgene repository)(Addgene, 75 Sidney St., Suite 550A, Cambridge, MA 02139; addgene.org/crispr/)에 개시되고, 그로부터 공개적으로 이용 가능한 수많은 CRISPR/Cas9 플라스미드를 참조한다. 각각 개별 가이드 RNA에 의해 유도되는, 2개의 개별 이중-가닥 파단을 도입하는 이중 닉카제 Cas9는 더욱 정확한 게놈 편집을 달성하는 것으로 문헌[Ran et al., Cell 154:1380-1389, 2013]에 기재되어 있다.
진핵생물의 유전자를 편집하기 위한 CRISPR 기술은 미국 특허 출원 공개 제2016/0138008 A1호 및 제US2015/0344912 A1호에, 그리고 미국 특허 제8,697,359호, 제8,771,945호, 제8,945,839호, 제8,999,641호, 제8,993,233호, 제8,895,308호, 제8,865,406호, 제8,889,418호, 제8,871,445호, 제8,889,356호, 제8,932,814호, 제8,795,965호 및 제8,906,616호에 개시되어 있다. Cpf1 엔도뉴클레아제 및 상응하는 가이드 RNA 및 PAM 부위는 미국 특허 출원 공개 제2016/0208243 A1호에 개시되어 있다.
일부 경우에, 요망되는 게놈 변형은 상동성 재조합을 포함하며, 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열 내의 이중-가닥 DNA 파단부는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 가이드 RNA(들)에 이엉서 상동성 재조합 메커니즘을 사용한 파단부(들)의 수복(상동성-유도된 수복)에 의해 생성된다. 이러한 경우에, 이중-가닥 파단부에 삽입되거나 낙-인(knocked-in)될 요망되는 뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 공여자 주형이 세포 또는 대상체에 제공되며; 적합한 주형의 예는 단일-가닥 DNA 주형 및 이중-가닥 DNA 주형(예를 들어, 본원에 기재된 폴리펩티드에 연결됨)을 포함한다. 일반적으로, 약 50개 뉴클레오티드 미만의 영역에 걸친 뉴클레오티드 변경을 인코딩하는 공여자 주형은 단일-가닥 DNA의 형태로 제공되며; 더 큰 공여자 주형(예를 들어, 100개 초과의 뉴클레오티드)은 종종 이중-가닥 DNA 플라스미드로서 제공된다. 일부 경우에, 공여자 주형은 요망되는 상동성-유도된 수복을 달성하기에 충분하지만, 주어진 기간 후에(예를 들어, 하나 이상의 세포 분열 주기 후에) 세포 또는 대상체에서 지속되지 않는 양으로 세포 또는 대상체에게 제공된다. 일부 경우에, 공여자 주형은 표적 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 상동성 내인성 게놈 영역)과 적어도 1, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50개 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 상이한 코어 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 이 코어 서열은 표적화된 뉴클레오티드 서열과 높은 서열 동일성의 상동성 아암 또는 영역에 의해 플랭킹되며; 일부 경우에, 높은 동일성의 영역은 코어 서열의 각각의 측 상에 적어도 10, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 750 또는 적어도 1000개의 뉴클레오티드를 포함한다. 공여자 주형이 단일-가닥 DNA의 형태인 일부 경우에, 코어 서열은 코어 서열의 각각의 측 상에 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80 또는 적어도 100개의 뉴클레오티드를 포함하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 공여자 주형이 이중-가닥 DNA의 형태인 경우에, 코어 서열은 코어 서열의 각각의 측 상에 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900 또는 적어도 1000개의 뉴클레오티드를 포함하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 하나의 경우에, 이중-가닥 파단부는 이중 닉카제 Cas9를 사용하여 세포 또는 대상체의 표적 뉴클레오티드 서열 내로 도입된 후(문헌[Ran et al., Cell 154:1380-1389, 2013] 참조), 공여자 주형의 운반으로 이어진다.
일부 경우에, 조성물은 gRNA 및 표적화된 뉴클레아제, 예를 들어, Cas9, 예를 들어, 야생형 Cas9, 닉카제 Cas9(예를 들어, Cas9 D10A), 데드(dead) Cas9(dCas9), eSpCas9, Cpf1, C2C1 또는 C2C3, 또는 이러한 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 뉴클레아제 및 gRNA(들)의 선택은 표적화된 돌연변이가 뉴클레오티드의 결실인지, 치환인지 또는 부가인지, 예를 들어, 표적화된 서열에 대한 뉴클레오티드의 결실인지, 치환인지 또는 부가인지에 의해 결정된다. (하나 이상의) 이펙터 도메인의 전부 또는 그의 일부(예를 들어, 그의 생물학적 활성 부분)와 테더링된 촉매적 비활성 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 데드 Cas9(dCas9, 예를 들어, D10A; H840A)의 융합에 의해, 폴리펩티드에 연결되어, 조성물을 하나 이상의 RNA t서열(sgRNA)에 의해 특정 DNA 부위로 가이드하여, 하나 이상의 표적 핵산 서열의 활성 및/또는 발현을 조절할 수 있는 키메라 단백질이 생성된다.
경우들에서, 제제는 유전자 편집을 위한 CRISPR 시스템에 사용하기 위한 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 일부 경우에, 제제는 식물 내의 유전자의 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열)을 표적화하는(예를 들어, 절단하는) 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 또는 ZFN을 인코딩하는 mRNA를 포함한다. 일부 경우에, 제제는 식물 내의 유전자의 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열)을 표적화하는(예를 들어, 절단하는 TALEN 또는 TALEN을 인코딩하는 mRNA를 포함한다.
예를 들어, gRNA는 식물 내의 유전자의 변경을 조작하기 위하여 CRISPR 시스템에서 사용될 수 있다. 다른 예에서, ZFN 및/또는 TALEN은 식물 내의 유전자의 변경을 조작하기 위하여 사용될 수 있다. 예시적인 변경은 삽입, 결실(예를 들어, 낙아웃), 전좌, 역위, 단일 점 돌연변이 또는 다른 돌연변이를 포함한다. 변경은 예를 들어, 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 세포 내의 유전자에 도입될 수 있다. 일부 예에서, 변경은 식물 내의 유전자의 수준 및/또는 활성을 증가시킨다. 다른 예에서, 변경은 식물 내의 유전자의 수준 및/또는 활성을 감소시킨다(예를 들어, 낙 다운 또는 낙 아웃시킨다). 또 다른 예에서, 변경은 식물 내의 유전자에서 결함(예를 들어, 결함을 야기하는 돌연변이)을 교정한다.
일부 경우에, CRISPR 시스템은 식물 내의 표적 유전자를 편집하기 위하여(예를 들어, 염기쌍을 부가하거나 결실시키기 위하여) 사용된다. 다른 경우에, CRISPR 시스템은 조숙 정지 코돈을 도입함으로써, 예를 들어, 표적 유전자의 발현을 감소시키기 위해 사용된다. 또 다른 경우에, CRISPR 시스템은 가역적인 방식으로, 예를 들어, RNA 간섭과 유사하게 표적 유전자를 턴 오프시키기 위해 사용된다. 일부 경우에, CRISPR 시스템은 Cas를 유전자의 프로모터에 지향시킴으로써, 입체적으로 RNA 중합효소를 차단하기 위해 사용된다.
일부 경우에, CRISPR 시스템은 예를 들어, 미국 공개 제20140068797호, 문헌[Cong, Science 339: 819-823, 2013]; 문헌[Tsai, Nature Biotechnol. 32:6 569-576, 2014]; 미국 특허 제8,871,445호; 제8,865,406호; 제8,795,965호; 제8,771,945호; 및 제8,697,359호에 기재된 기술을 사용하여, 식물 내의 유전자를 편집하기 위하여 생성될 수 있다.
일부 경우에, CRISPR 간섭(CRISPRi) 기법은 식물 내의 특정 유전자의 전사 억제를 위해 사용될 수 있다. CRISPRi에서, 조작된 Cas9 단백질(예를 들어, 뉴클레아제-널(null) dCas9 또는 dCas9 융합 단백질, 예를 들어, dCas9-KRAB 또는 dCas9-SID4X 융합)은 서열 특이적 가이드 RNA(sgRNA)와 쌍을 이룰 수 있다. Cas9-gRNA 복합체는 RNA 중합효소를 차단함으로써, 전사 신장을 간섭할 수 있다. 복합체는 또한, 전사 인자 결합을 간섭함으로써 전사 개시를 차단할 수 있다. CRISPRi 방법은 최소의 오프-표적 효과와 함께 특이적이며, 다중화 가능하며, 예를 들어, (예를 들어, 다중의 gRNA를 사용하여) 1가지 초과의 유전자를 동시에 억제할 수 있다. 또한, CRISPRi 방법은 가역적인 유전자 억제를 허용한다.
일부 경우에, CRISPR-매개의 유전자 활성화(CRISPRa)는 식물 내의 유전자의 전사 활성화를 위해 사용될 수 있다. CRISPRa 기법에서, dCas9 융합 단백질은 전사 활성화제를 동원한다. 예를 들어, dCas9는 폴리펩티드(예를 들어, 활성화 도메인), 예컨대 VP64 또는 p65 활성화 도메인(p65D)에 융합되고, sgRNA(예를 들어, 단일의 sgRNA 또는 다중 sgRNA)와 함께 사용되어, 식물 내의 유전자 또는 유전자들을 활성화시킬 수 있다. 다중 활성화제는 다중 sgRNA에 의해 동원될 수 있으며 - 이는 활성화 효율을 증가시킬 수 있다. 다양한 활성화 도메인 및 단일의 또는 다중 활성화 도메인이 사용될 수 있다. 활성화제를 동원하기 위한 dCas9의 조작에 더하여, sgRNA도 또한 활성화제를 동원하기 위하여 조작될 수 있다. 예를 들어, RNA 압타머를 sgRNA 내로 혼입하여, 단백질(예를 들어, 활성화 도메인), 예컨대 VP64를 동원할 수 있다. 일부 예에서, 상승적 활성화 매개자(SAM) 시스템이 전사 활성화를 위해 사용될 수 있다. SAM에서, MS2 압타머를 sgRNA에 부가할 수 있다. MS2는 p65AD 및 열 충격 인자 1(HSF1)에 융합된 MS2 코트 단백질(MCP)을 동원한다.
CRISPRi 및 CRISPRa 기법은 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 문헌[Dominguez et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17:5-15, 2016]에 더욱 상세히 기재되어 있다. 또한, dCas9-매개의 후성유전학적 변형 및 문헌[Dominguez et al.]에 기재된 바와 같은 CRISPR 시스템을 사용한 동시의 활성화 및 억제는 식물 내의 유전자를 조절하기 위해 사용될 수 있다.
B. 이종 치료제
본원에서 제조된 PMP는, 이종 치료제(예를 들어, 동물, 예를 들어, 포유동물(예를 들어, 인간), 동물 병원체, 또는 이의 병원체 벡터에 영향을 끼치며, PMP 내로 로딩될 수 있는 제제), 예를 들어 치료 펩티드, 치료 핵산(예를 들어, 치료 RNA), 치료 소분자, 또는 병원체 방제 제제(예를 들어, 항진균제, 항박테리아제, 살바이러스제, 항바이러스제, 살충제, 살선충제, 항기생충제, 또는 곤충 기피제)를 포함할 수 있다. 이러한 제제가 로딩되는 PMP는 동물, 동물 병원체 또는 그의 병원체 벡터로의 운반을 위하여 약제학적으로 허용 가능한 담체를 사용하여 제형화될 수 있다.
i. 항박테리아 제제
본원에 기재된 PMP 조성물은 항박테리아제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 항생제를 포함하는 PMP 조성물을 동물 내측에서 또는 그 상에서 표적 수준(예를 들어, 소정의 또는 역치 수준)의 항생제 농도에 도달하고; 및/또는 동물의 박테리아 감염을 처리하거나 예방하기에 충분한 양으로, 그리고 그 시간 동안 동물에 투여할 수 있다. 본원에 기재된 항박테리아제는 본원에 기재된 임의의 방법을 위하여 PMP 조성물에 제형화될 수 있으며, 특정 경우에, 그의 PMP와 회합될 수 있다. 일부 경우에, PMP 조성물은 2가지 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10가지 초과)의 상이한 항박테리아제를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "항박테리아 제제"는 박테리아, 예컨대 식물병원성 박테리아를 사멸시키거나, 그의 성장, 증식, 분열, 번식 또는 확산을 저해하는 물질을 지칭하며, 살박테리아제(예를 들어, 소독제 화합물, 방부제 화합물 또는 항생제) 또는 정균제(예를 들어, 화합물 또는 항생제)를 포함한다. 살박테리아성 항생제는 박테리아를 사멸시키는 한편, 정균성 항생제는 오직 그들의 성장 또는 번식만을 둔화시킨다.
살박테리아제는 소독제, 방부제 또는 항생제를 포함할 수 있다. 흔히 사용되는 소독제는 하기를 포함할 수 있다: 활성 염소(즉, 차아염소산염(예를 들어, 차아염소산나트륨), 클로라민, 디클로로이소시아누레이트 및 트리클로로이소시아누레이트, 습윤 염소, 이산화염소 등), 활성 산소(과산화물, 예컨대 과아세트산, 과황산칼륨, 과붕산나트륨, 과탄산나트륨 및 우레아 퍼하이드레이트), 요오드(요오드포비돈(포비돈-요오드, 베타딘), 루골 용액(Lugol's solution), 요오드 팅크투어, 요오드화 비이온성 계면활성제), 농축 알코올(주로 에탄올, n-프로판올으로도 지칭되는 1-프로판올 및 이소프로판올로 지칭되는 2-프로판올 및 이의 혼합물; 또한, 2-페녹시에탄올 및 1- 및 2-페녹시프로판올이 사용됨), 페놀 물질(예컨대, 페놀("카볼산" 이라고도 함), 크레졸(액체 칼륨 비누와 조합하여 "리졸"로 지칭됨), 할로겐화(염소화, 브롬화) 페놀, 예컨대 헥사클로로펜, 트리클로산, 트리클로로페놀, 트리브로모페놀, 펜타클로로페놀, 디브로몰 및 이의 염), 양이온성 계면활성제, 예컨대 일부 4차 암모늄 양이온(예컨대, 벤잘코늄 클로라이드, 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드 또는 클로라이드, 디데실디메틸암모늄 클로라이드, 세틸피리디늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드) 등, 비-4 차 화합물, 예컨대 클로르헥시딘, 글루코프로타민, 옥테니딘 디하이드로클로라이드 등), 강한 산화제, 예컨대 오존 및 과망간산염 용액, 중금속 및 이들의 염, 예컨대 콜로이드 은, 질산은, 염화 수은, 페닐 수은 염, 황산 구리, 산화 구리-클로라이드, 수산화구리, 구리 옥타노에이트, 구리 옥시클로라이드 술페이트, 황산구리, 황산구리 5수화물 등. 중금속 및 이들의 염은 가장 독성이고, 환경에 유해한 살박테리아제이므로, 이들의 사용은 강력하게 억제 또는 금지되며; 추가로, 또한 적절하게 농축된 강산(인산, 질산, 황산, 아미도황산, 톨루엔술폰산) 및 알칼리(수산화나트륨, 칼륨, 칼슘)이다.
방부제(즉, 인간 또는 동물의 신체, 피부, 점액, 상처 등에 사용할 수 있는 살균제), 상기 언급한 소독제의 일부는 적절한 조건(주로 농도, pH, 온도 및 인간/동물에 대한 독성) 하에서 사용할 수 있다. 이들 중, 하기의 것이 중요하다: 적절하게 희석된 염소 제제(즉, 다퀸 용액(Daquin's solution), 0.5% 과염화나트륨 또는 칼륨 용액, pH 7 내지 8 로 pH-조절됨, 또는 나트륨 벤젠술포클로라미드(클로라민 B)의 0.5 내지 1% 용액), 일부 요오드 제제, 예컨대 다양한 생약(연고, 용액, 상처 플라스터)에서의 요오도포비돈, 과거에는 또한 루골 용액(Lugol's solution), 우레아 퍼하이드레이트 용액 및 pH-완충된 0.1 내지 0.25% 과아세트산 용액으로서 과산화물, 주로 피부의 방부에 사용되는 방부성 첨가제를 갖거나 갖지 않는 알코올, 유기 약산, 예컨대 소르브산, 벤조산, 락트산 및 살리실산, 일부 페놀 화합물, 예컨대 헥사클로로펜, 트리클로산 및 디브로몰, 및 양이온-활성 화합물, 예컨대 0.05 내지 0.5% 벤잘코늄, 0.5 내지 4% 클로르헥시딘, 0.1 내지 2% 옥테니딘 용액.
본원에 기재된 PMP 조성물은 항생제를 포함할 수 있다. 해당 분야에 알려져 있는 임의의 항생제가 사용될 수 있다. 항생제는 흔히 그들의 작용 메커니즘, 화학 구조 또는 활성 스펙트럼에 기초하여 분류된다.
본원에 기재된 항생제는 임의의 박테리아 기능 또는 성장 과정을 표적화할 수 있으며, 정균성(예를 들어, 박테리아 성장을 둔화시키거나 예방함) 또는 살박테리아성(예를 들어, 박테리아를 사멸시킴)일 수 있다. 일부 경우에, 항생제는 살박테리아성 항생제이다. 일부 경우에, 살박테리아성 항생제는 박테리아 세포벽을 표적화하는 것(예를 들어, 페니실린(penicillin) 및 세팔로스포린(cephalosporin)); 세포막을 표적화하는 것(예를 들어, 폴리믹신(polymyxin)); 또는 필수 박테리아 효소를 저해하는 것(예를 들어, 리파미신(rifamycin), 리피아르미신(lipiarmycin), 퀴놀론(quinolone) 및 술폰아미드)이다. 일부 경우에, 살박테리아성 항생제는 아미노글리코시드(예를 들어, 카수가마이신(kasugamycin))이다. 일부 경우에, 항생제는 정균성 항생제이다. 일부 경우에, 정균성 항생제는 단백질 합성을 표적화한다(예를 들어, 마크롤리드(macrolide), 린코사미드(lincosamide) 및 테트라사이클린). 본원에서 사용될 수 있는 항생제의 추가의 부류는 사이클릭 리포펩티드(예컨대 다프토마이신(daptomycin), 글리실사이클린(예컨대 디게사이클린(tigecycline)), 옥사졸리디논(예컨대 리네졸리드(linezolid)) 또는 리피아르마이신(lipiarmycin)(예컨대 피닥소미신(fidaxomicin))을 포함한다. 항생제의 예에는 리팜피신(rifampicin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 독시사이클린(doxycycline), 앰피실린(ampicillin) 및 폴리믹신(polymyxin) B가 포함된다. 본원에 기재된 항생제는 임의의 수준의 표적 특이성을 가질 수 있다(예를 들어, 협- 또는 광-범위). 일부 경우에, 항생제는 협-범위 항생제이며, 이에 따라, 특정 유형의 박테리아, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 박테리아를 표적화한다. 대안적으로, 항생제는 다양한 박테리아를 표적화하는 광-범위 항생제일 수 있다.
동물의 치료에 적합한 항박테리아제의 예는 페니실린(아목시실린(Amoxicillin), 앰피실린(Ampicillin), 바캄피실린(Bacampicillin), 카르베니실린(Carbenicillin), 클록사실린(Cloxacillin), 디클록사실린(Dicloxacillin), 플루클록사실린(Flucloxacillin), 메즐로실린(Mezlocillin), 나프실린(Nafcillin), 옥사실린(Oxacillin), 페니실린 G, 크리스티실린(Crysticillin) 300 A.S., 펜티즈(Pentids), 페르마펜(Permapen), 파이저펜(Pfizerpen), 파이저펜-AS, 와이실린(Wycillin), 페니실린 V, 피페라실린(Piperacillin), 피밤피실린(Pivampicillin), 피브메실리남(Pivmecillinam), 티카르실린(Ticarcillin)), 세팔로스포린(세파세트릴(Cefacetrile)(세파세트릴(cephacetrile)), 세파드록실(Cefadroxil)(세파드록실(cefadroxyl)), 세팔렉신(Cefalexin)(세팔렉신(cephalexin)), 세팔로글리신(Cefaloglycin)(세팔로글리신(cephaloglycin)), 세팔로니움(Cefalonium)(세팔로니움(cephalonium)), 세팔로리딘(Cefaloridine)(세팔로라딘(cephaloradine)), 세팔로틴(Cefalotin)(세팔로틴(cephalothin)), 세파피린(Cefapirin)(세파피린), 세파트리진(Cefatrizine), 세파자플루르(Cefazaflur), 세파제돈(Cefazedone), 세파졸린(Cefazolin)(세파졸린(cephazolin)), 세프라딘(Cefradine)(세프라딘(cephradine)), 세프록사딘(Cefroxadine), 세프테졸(Ceftezole), 세파클로르(Cefaclor), 세파만돌(Cefamandole), 세프메타졸(Cefmetazole), 세포니시드(Cefonicid), 세포테탄(Cefotetan), 세폭시틴(Cefoxitin), 세프프로질(Cefprozil)(세프프록실(cefproxil)), 세푸록심(Cefuroxime), 세푸조남(Cefuzonam), 세프카펜(Cefcapene), 세프달록심(Cefdaloxime), 세프디니르(Cefdinir), 세프디토렌(Cefditoren), 세페타메트(Cefetamet), 세픽심(Cefixime), 세프메녹심(Cefmenoxime), 세포디짐(Cefodizime), 세포탁심(Cefotaxime), 세프피미졸(Cefpimizole), 세프포독심(Cefpodoxime), 세프테람(Cefteram), 세프티부텐(Ceftibuten), 세프티오푸르(Ceftiofur), 세프티올렌(Ceftiolene), 세프티족심(Ceftizoxime), 세프트리악손(Ceftriaxone), 세포페라존(Cefoperazone), 세프타지딤(Ceftazidime), 세프클리딘(Cefclidine), 세페핌(Cefepime), 세플루프레남(Cefluprenam), 세포셀리스(Cefoselis), 세포조프란(Cefozopran), 세프피롬(Cefpirome), 세프퀴놈(Cefquinome), 세프토비프롤(Ceftobiprole), 세프타롤린(Ceftaroline), 세파클로메진(Cefaclomezine), 세팔로람(Cefaloram), 세파파롤(Cefaparole), 세프카넬(Cefcanel), 세페드롤로르(Cefedrolor), 세펨피돈(Cefempidone), 세페트리졸(Cefetrizole), 세피비트릴(Cefivitril), 세프마틸렌(Cefmatilen), 세프메피디움(Cefmepidium), 세포벡틴(Cefovecin), 세폭사졸(Cefoxazole), 세프로틸(Cefrotil), 세프수미드(Cefsumide), 세푸라세팀(Cefuracetime), 세프티옥시드(Ceftioxide), 조합, 세프타지딤/아비박탐(Avibactam), 세프톨로잔(Ceftolozane)/타조박탐(Tazobactam)), 모노박탐(Monobactam)(아즈트레오남(Aztreonam)), 카르바페넴(이미페넴(Imipenem), 이미페넴/실라스타틴(cilastatin), 도리페넴(Doripenem), 에르타페넴(Ertapenem), 메로페넴(Meropenem), 메로페넴/바보르박탐(vaborbactam)), 마크롤리드(아지트로마이신(Azithromycin), 에리트로마이신(Erythromycin), 클라리트로마이신(Clarithromycin), 디리트로마이신(Dirithromycin), 록시트로마이신(Roxithromycin), 텔리트로마이신(Telithromycin)), 린코사미드(클린다마이신(Clindamycin), 린코마이신(Lincomycin)), 스트렙토그라민(프리스티나마이신(Pristinamycin), 퀴누프리스틴(Quinupristin)/달포프리스틴(dalfopristin)), 아미노글리코시드(아미카신(Amikacin), 젠타미신(Gentamicin), 카나마이신(Kanamycin), 네오마이신(Neomycin), 네틸미신(Netilmicin), 파로모마이신(Paromomycin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 토브라마이신(Tobramycin)), 퀴놀론(플루메퀸(Flumequine), 날리딕스산(Nalidixic acid), 옥솔린산(Oxolinic acid), 피로미드산(Piromidic acid), 피페미드산(Pipemidic acid), 로족사신(Rosoxacin), 2세대, 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 에녹사신(Enoxacin), 로메플록사신(Lomefloxacin), 나디플록사신(Nadifloxacin), 노르플록사신(Norfloxacin), 오플록사신(Ofloxacin), 페플록사신(Pefloxacin), 루플록사신(Rufloxacin), 발로플록사신(Balofloxacin), 가티플록사신(Gatifloxacin), 그레파플록사신(Grepafloxacin), 레보플록사신(Levofloxacin), 목시플록사신(Moxifloxacin), 파주플록사신(Pazufloxacin), 스파르플록사신(Sparfloxacin), 테마플록사신(Temafloxacin), 토수플록사신(Tosufloxacin), 베시플록사신(Besifloxacin), 델라플록사신(Delafloxacin), 클리나플록사신(Clinafloxacin), 게미플록사신(Gemifloxacin), 프룰리플록사신(Prulifloxacin) , 시타플록사신(Sitafloxacin), 트로바플록사신(Trovafloxacin)), 술폰아미드(술프아메티졸(Sulfamethizole), 술프아메톡사졸(Sulfamethoxazole), 술프이속사졸, 트리메토프림(Trimethoprim)-술프아메톡사졸), 테트라사이클린(데메클로사이클린(Demeclocycline), 독시사이클린(Doxycycline), 미노사이클린(Minocycline), 옥시테트라사이클린(Oxytetracycline), 테트라사이클린(Tetracycline), 티게사이클린(Tigecycline)), 기타(리포펩티드, 플루오로퀴놀론, 리포글리코펩티드, 세팔로스포린, 마크로사이클릭, 클로람페니콜, 메트로니다졸, 티니다졸(Tinidazole), 니트로푸란토인(Nitrofurantoin), 글리코펩티드, 반코마이신, 테이코플라닌(Teicoplanin), 리포글리코펩티드, 텔라반신(Telavancin), 옥사졸리디논, 리네졸리드(Linezolid), 사이클로세린 2, 리파마이신(Rifamycin), 리팜핀(Rifampin), 리파부틴(Rifabutin), 리파펜틴(Rifapentine), 리팔라질(Rifalazil), 폴리펩티드, 바시트라신(Bacitracin), 폴리믹신(Polymyxin) B, 투베르악티노마이신, 비오마이신(Viomycin), 카프레오마이신(Capreomycin))를 포함한다.
당업자는 조성물 중 각 항생제의 적합한 농도가 항생제의 효능, 안정성, 별개의 항생제의 수, 제형 및 조성물의 적용 방법과 같은 인자에 좌우되는 것을 인식할 것이다.
ii. 항진균제
본원에 기재된 PMP 조성물은 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 항진균제를 포함하는 PMP 조성물을 동물 내측에서 또는 그 상에서 표적 수준(예를 들어, 소정의 또는 역치 수준)의 항진균제 농도에 도달하고; 및/또는 동물의 진균 감염을 처리하거나 예방하기에 충분한 양으로, 그리고 그 시간 동안 동물에 투여할 수 있다. 본원에 기재된 항진균제는 본원에 기재된 임의의 방법을 위하여 PMP 조성물에 제형화될 수 있으며, 특정 경우에, 그의 PMP와 회합될 수 있다. 일부 경우에, PMP 조성물은 2가지 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10가지 초과)의 상이한 항진균제를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "살진균제" 또는 "항진균제"는 진균, 예컨대 동물에 병원성인 진균을 사멸시키거나, 그의 성장, 증식, 분열, 번식 또는 확산을 저해하는 물질을 지칭한다. 많은 상이한 유형의 항진균제가 상업적으로 생산된 바 있다. 항진균제의 비제한적인 예는 알릴아민(아모롤핀(Amorolfin), 부테나핀(Butenafine), 나프티핀(Naftifine), 터비나핀(Terbinafine)), 이미다졸((비포나졸(Bifonazole), 부토코나졸(Butoconazole), 클로트리마졸(Clotrimazole), 에코나졸(Econazole), 펜티코나졸(Fenticonazole), 케토코나졸(Ketoconazole), 이소코나졸(Isoconazole), 룰리코나졸(Luliconazole), 미코나졸(Miconazole), 오모코나졸(Omoconazole), 옥시코나졸(Oxiconazole), 세르타코나졸(Sertaconazole), 술코나졸(Sulconazole), 티오코나졸(Tioconazole), 테르코나졸(Terconazole)); 트리아졸(알바코나졸(Albaconazole), 에피나코나졸(Efinaconazole), 플루코나졸(Fluconazole), 이사부코나졸(Isavuconazole), 이트라코나졸(Itraconazole), 포사코나졸(Posaconazole), 라부코나졸(Ravuconazole), 테르코나졸(Terconazole), 보리코나졸(Voriconazole)), 티아졸(알바푼긴(Abafungin)), 폴리엔(암포테리신 B(Amphotericin B), 나이스타틴(Nystatin), 나타마이신(Natamycin), 트리코마이신(Trichomycin)), 에키노칸딘(아니둘라푼긴(Anidulafungin), 카스포푼긴(Caspofungin), 미카푼긴(Micafungin)), 기타(톨나프테이트(Tolnaftate), 플루시토신(Flucytosine), 부테나핀(Butenafine), 그리세오풀빈(Griseofulvin), 시클로피록스(Ciclopirox), 셀레늄 술피드, 타바보롤(Tavaborole))를 포함한다. 당업자는 조성물 중 각각의 항진균제의 적합한 농도가 항진균제의 효능, 안정성, 별개의 항진균제의 수, 제형 및 조성물의 적용 방법과 같은 인자에 좌우되는 것을 인식할 것이다.
iii. 살충제
본원에 기재된 PMP 조성물은 살충제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 살충제는 동물 병원체의 곤충 벡터의 건강을 감소(예를 들어, 그의 성장을 감소시키거나 사멸)시킬 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 살충제를 포함하는 PMP 조성물을 (a) 곤충 내측에서 또는 그 상에서 표적 수준(예를 들어, 소정의 또는 역치 수준)의 살충제 농도에 도달하고; (b) 곤충의 건강을 감소시키기에 충분한 양으로, 그리고 그 시간 동안 곤충과 접촉시킬 수 있다. 일부 경우에, 살충제는 기생성 곤충의 건강을 감소(예를 들어, 그의 성장을 감소시키거나 사멸)시킬 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 살충제를 포함하는 PMP 조성물을 (a) 기생성 곤충 내측에서 또는 그 상에서 표적 수준(예를 들어, 소정의 또는 역치 수준)의 살충제 농도에 도달하고; (b) 기생성 곤충의 건강을 감소시키기에 충분한 양으로, 그리고 그 시간 동안 기생성 곤충 또는 기생성 곤충이 감염된 동물과 접촉시킬 수 있다. 본원에 기재된 살충제는 본원에 기재된 임의의 방법을 위하여 PMP 조성물에 제형화될 수 있으며, 특정 경우에, 그의 PMP와 회합될 수 있다. 일부 경우에, PMP 조성물은 2가지 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10가지 초과)의 상이한 살충제를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "살충제" 또는 "살충 제제"는 곤충, 예컨대 동물 병원체 또는 기생성 곤충의 곤충 벡터를 사멸시키거나, 그의 성장, 증식, 번식 또는 확산을 저해하는 물질을 지칭한다. 살충제의 비제한적인 예는 표 4에 나타나 있다. 적합한 살충제의 추가의 비제한적인 예는 생물제제(biologics), 호르몬 또는 페로몬, 예컨대 아자디라크틴(azadirachtin), 바실러스(Bacillus) 종, 브베리아(Beauveria) 종, 코들레몬(codlemone), 메타리지움(Metarrhizium) 종, 파에실로마이세스(Paecilomyces) 종, 투린지엔시스(thuringiensis) 및 베르티실리움(Verticillium) 종, 및 미공지 또는 불특정 작용 기작을 갖는 활성 화합물, 예컨대 훈증제(예컨대 알루미늄 포스파이드, 메틸 브로마이드 및 술푸릴 플루오라이드) 및 선택적 피딩 저해제(예컨대 크라이올라이트(cryolite), 플로니카미드(flonicamid) 및 피메트로진(pymetrozine))를 포함한다. 당업자는 조성물 중 각 살충제의 적합한 농도가 살충제의 효능, 안정성, 별개의 살충제의 수, 제형 및 조성물의 적용 방법과 같은 인자에 좌우되는 것을 인식할 것이다.
[표 4]
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
iv.살선충제
본원에 기재된 PMP 조성물은 살선충제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, PMP 조성물은 2가지 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10가지 초과)의 상이한 살선충제를 포함한다. 예를 들어, 살선충제는 기생성 선충의 건강을 감소(예를 들어, 그의 성장을 감소시키거나 사멸)시킬 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 살선충제를 포함하는 PMP 조성물을 (a) 기생성 선충 내측에서 또는 그 상에서 표적 수준(예를 들어, 소정의 또는 역치 수준)의 살선충제 농도에 도달하고; (b) 기생성 선충의 건강을 감소시키기에 충분한 양으로, 그리고 그 시간 동안 기생성 선충 또는 기생성 선충이 감염된 동물과 접촉시킬 수 있다. 본원에 기재된 살선충제는 본원에 기재된 임의의 방법을 위하여 PMP 조성물에 제형화될 수 있으며, 특정 경우에, 그의 PMP와 회합될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "살선충제" 또는 "살선충 제제"는 선충, 예컨대 기생성 선충을 사멸시키거나, 그의 성장, 증식, 번식 또는 확산을 저해하는 물질을 지칭한다. 살선충제의 비제한적인 예는 표 5에 나타나 있다. 당업자는 조성물 중 각 살선충제의 적합한 농도가 살충제의 효능, 안정성, 별개의 살충제의 수, 제형 및 조성물의 적용 방법과 같은 인자에 좌우되는 것을 인식할 것이다.
[표 5]
Figure pct00011
v. 항기생충제
본원에 기재된 PMP 조성물은 항기생충제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 항기생충제는 기생성 원생동물의 건강을 감소(예를 들어, 그의 성장을 감소시키거나 사멸)시킬 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 항기생충제를 포함하는 PMP 조성물을 (a) 원생동물 또는 원생동물이 감염된 동물 내측에서 또는 그 상에서 표적 수준(예를 들어, 소정의 또는 역치 수준)의 항기생충제 농도에 도달하고; (b) 원생동물의 건강을 감소시키기에 충분한 양으로, 그리고 그 시간 동안 원생동물과 접촉시킬 수 있다. 이것은 동물에서 기생생물의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 항기생충제를 포함하는 PMP 조성물을 동물 내측에서 또는 그 상에서 표적 수준(예를 들어, 소정의 또는 역치 수준)의 항기생충제 농도에 도달하고; 및/또는 동물의 기생생물(예를 들어, 기생성 선충, 기생성 곤충, 또는 원생동물) 감염을 처리하거나 예방하기에 충분한 양으로, 그리고 그 시간 동안 동물에 투여할 수 있다. 본원에 기재된 항기생충제는 본원에 기재된 임의의 방법을 위하여 PMP 조성물에 제형화될 수 있으며, 특정 경우에, 그의 PMP와 회합될 수 있다. 일부 경우에, PMP 조성물은 2가지 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10가지 초과)의 상이한 항기생충제를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "항기생충제" 또는 "항기생충제"는 기생성 원생동물, 기생성 선충, 또는 기생성 곤충 등의 기생생물을 사멸시키거나, 그의 성장, 증식, 번식 또는 확산을 저해하는 물질을 지칭한다. 항기생충제의 예는 구충제(베페니움(Bephenium), 디에틸카바마진, 이베르멕틴(Ivermectin), 니클로사미드(Niclosamide), 피페라진, 프라지쿠안텔(Praziquantel), 피란텔(Pyrantel), 피르비니움(Pyrvinium), 벤즈이미다졸(Benzimidazole), 알벤다졸(Albendazole), 플루벤다졸(Flubendazole), 메벤다졸(Mebendazole), 티아벤다졸(Thiabendazole), 레바미솔(Levamisole), 니트라족사니드(Nitazoxanide), 모노판텔(Monopantel), 에모데프시드(Emodepside), 스피로인돌(Spiroindole)), 살개선제(Scabicide)(벤질 벤조에이트, 벤질 벤조에이트/디술피람, 린단(Lindane), 말라티온(Malathion), 퍼메트린(Permethrin)), 이살충제(피페로닐 부톡시드(Piperonyl butoxide)/피레트린(pyrethrin), 스피노사드(Spinosad), 목시덱틴(Moxidectin)), 살개선제(크로타미톤(Crotamiton)), 항촌충제(니클로사미드(Niclosamide), 프란지쿠안텔(Pranziquantel), 알벤다졸), 항아메바제(리팜핀(Rifampin), 암포테리신(Apmphotericin) B); 또는 항원생동물제(멜라소프롤(Melarsoprol), 에플로르니틴(Eflornithine), 메트로니다졸(Metronidazole), 티니다졸(Tinidazole), 밀테포신(Miltefosine), 아르테미시닌(Artemisinin))를 포함한다. 특정 경우에, 항기생충제, 예를 들어, 레바미솔, 펜벤다졸(Fenbendazole), 옥스펜다졸(Oxfendazole), 알벤다졸, 목시덱틴(Moxidectin), 에프리노멕틴(Eprinomectin), 도라멕틴(Doramectin), 이베르멕틴 또는 클로르술론(Clorsulon)은 가축 동물에서 감염을 치료하거나 예방하는데 이용될 수 있다. 당업자는 조성물 중 각 항기생충제의 적합한 농도가 항기생충제의 효능, 안정성, 별개의 항기생충제의 수, 제형 및 조성물의 적용 방법과 같은 인자에 좌우되는 것을 인식할 것이다.
vi. 항바이러스제
본원에 기재된 PMP 조성물은 항바이러스제를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 항바이러스제를 포함하는 PMP 조성물을 동물 내측에서 또는 그 상에서 표적 수준(예를 들어, 소정의 또는 역치 수준)의 항바이러스제 농도에 도달하고; 및/또는 동물의 바이러스 감염을 처리하거나 예방하기에 충분한 양으로, 그리고 그 시간 동안 동물에 투여할 수 있다. 본원에 기재된 항바이러스제는 본원에 기재된 임의의 방법을 위하여 PMP 조성물에 제형화될 수 있으며, 특정 경우에, 그의 PMP와 회합될 수 있다. 일부 경우에, PMP 조성물은 2가지 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10가지 초과)의 상이한 항바이러스제를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "항바이러스제" 또는 "살바이러스제"는 바이러스, 예컨대 동물을 감염시키는 바이러스 병원체를 사멸시키거나, 그의 성장, 증식, 재생, 발생 또는 확산을 저해하는 물질을 지칭한다. 다수의 제제가 항바이러스제로서 사용될 수 있으며, 이는 화학물질 또는 생물학적 제제(예를 들어, 핵산, 예를 들어, dsRNA)를 포함한다. 본원에서 유용한 항바이러스제의 예는 아바카비르(Abacavir), 아시클로비르(Acyclovir)(아시클로비르(Aciclovir)), 아데포비르(Adefovir), 아만타딘(Amantadine), 암프레나비르(Amprenavir)(아게네라제(Agenerase)), 암플리젠(Ampligen), 아르비돌(Arbidol), 아타자나비르(Atazanavir), 아트리플라(Atripla), 발라비르(Balavir), 시도포비르(Cidofovir), 콤비비르(Combivir), 돌루테그라비르(Dolutegravir), 다루나비르(Darunavir), 델라비르딘(Delavirdine), 딜다노신(Didanosine), 도코사놀(Docosanol), 에독수딘(Edoxudine), 에파비렌즈(Efavirenz), 엠트리시타빈(Emtricitabine), 엔푸비르티드(Enfuvirtide), 엔테카비르(Entecavir), 에콜리에베르(Ecoliever), 팜시클로비르(Famciclovir), 포미비르센(Fomivirsen), 포삼프레나비르(Fosamprenavir), 포스카르네트(Foscarnet), 포스포네트(Fosfonet), 융합 저해제, 간시클로비르(Ganciclovir), 이바시타빈(Ibacitabine), 이뮤노비르(Imunovir), 이독수리딘(Idoxuridine), 이미퀴모드(Imiquimod), 인디나비르(Indinavir), 이노신(Inosine), 인테그라제 저해제, 인터페론 III형, 인터페론 II형, 인터페론 I형, 인터페론, 라미부딘(Lamivudine), 로피나비르(Lopinavir), 로비리드(Loviride), 마라비로크(Maraviroc), 모록시딘(Moroxydin), 메티사존(Methisazone), 넬피나비르(Nelfinavir), 네비라핀(Nevirapine), 넥사비르(Nexavir), 니타족사니드(Nitazoxanide), 뉴클레오시드 유사체, 노르비르(Norvir), 오셀타미비르(Oseltamivir)(타미플루(Tamiflu)), 페그인터페론(Peginterferon) 알파-2a, 펜시클로비르(Penciclovir), 페라미비르(Peramivir), 플레코나릴(Pleconaril), 포도필로톡신(Podophyllotoxin), 랄테그라비르(Raltegravir), 리바비린(Ribavirin), 리만타딘(Rimantadine), 리토나비르(Ritonavir), 피라미딘(Pyramidine), 사퀴나비르(Saquinavir), 소포스부비르(Sofosbuvir), 스타부딘(Stavudine), 상승적 인핸서(항레트로바이러스), 텔라프레비르(Telaprevir), 페노포비르(Tenofovir), 테노포비르 디소프록실(Tenofovir disoproxil), 티프라나비르(Tipranavir), 트리플루리딘(Trifluridine), 트리지비르(Trizivir), 트로만타딘(Tromantadine), 트루바다(Truvada), 발라시클로비르(Valaciclovir)(발트렉스(Valtrex)), 발간시클로비르(Valganciclovir), 비크리비록(Vicriviroc), 비다라빈(Vidarabine), 비라미딘(Viramidine), 잘시타빈(Zalcitabine), 자나미비르(Zanamivir)(렐렌자(Relenza)) 또는 지도부딘(Zidovudine)을 포함한다. 당업자는 조성물 중 각 항바이러스제의 적합한 농도가 항바이러스제의 효능, 안정성, 별개의 항바이러스제의 수, 제형 및 조성물의 적용 방법과 같은 인자에 좌우되는 것을 인식할 것이다.
vii. 기피제
본원에 기재된 PMP 조성물은 기피제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 기피제는 동물 병원체의 벡터, 예컨대 곤충을 기피시킬 수 있다. 본원에 기재된 기피제는 본원에 기재된 임의의 방법을 위하여 PMP 조성물에 제형화될 수 있으며, 특정 경우에, 그의 PMP와 회합될 수 있다. 일부 경우에, PMP 조성물은 2가지 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10가지 초과)의 상이한 기피제를 포함한다.
예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 기피제를 포함하는 PMP 조성물을 (a) 표적 수준(예를 들어, 소정의 또는 역치 수준)의 기피제 농도에 도달하고; (b) 대조군에 비하여 동물 근처 또는 인근 곤충의 수준을 감소시키기에 충분한 양으로, 그리고 그 시간 동안 곤충 벡터 또는 벡터의 서식지와 접촉시킬 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 바와 같은 기피제를 포함하는 PMP 조성물을 (a) 표적 수준(예를 들어, 소정의 또는 역치 수준)의 기피제 농도에 도달하고; (b) 미처리 동물에 비하여 동물 근처 또는 동물 상의 곤충의 수준을 감소시키기에 충분한 양으로, 그리고 그 시간 동안 동물과 접촉시킬 수 있다.
널리 알려져 있는 곤충 기피제의 일부 예에는 다음이 포함된다: 벤질; 벤질 벤조에이트; 2,3,4,5-비스(부틸-2-엔)테트라하이드로푸르푸랄(MGK 기피제 11); 부톡시폴리프로필렌 글리콜; N-부틸아세트아닐리드; n-부틸-6,6-디메틸-5,6-디하이드로-1,4-피론-2-카복실레이트(인달론(Indalone)); 디부틸 아디페이트; 디부틸 프탈레이트; 디-n-부틸 숙시네이트(타바트렉스(Tabatrex)); N,N-디에틸-메타-톨루아미드(DEET); 디메틸 카베이트(엔도, 엔도)-디메틸 비사이클로[2.2.1] 헵트-5-엔-2,3-디카복실레이트); 디메틸 프탈레이트; 2-에틸-2-부틸-1,3-프로판디올; 2-에틸-1,3-헥산디올(러트거즈(Rutgers) 612); 디-n-프로필 이소신코메로네이트(MGK 기피제 326); 2-페닐사이클로헥사놀; p-메탄-3,8-디올 및 n-프로필 N,N-디에틸숙시나메이트. 다른 기피제는 시트로넬라 오일(citronella oil), 디메틸 프탈레이트, n-부틸메시틸 옥시드 옥살레이트 및 2-에틸 헥산디올-1,3(문헌[Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 2nd Ed., Vol. 11: 724-728]; 및 문헌[The Condensed Chemical Dictionary, 8th Ed., p 756] 참조)을 포함한다.
일부 경우에, 기피제는 곤충 기피제이며, 이는 합성 또는 미합성 곤충 기피제를 포함한다. 합성 곤충 기피제의 예에는 메틸 안트라닐레이트 및 다른 안트라닐레이트-계 곤충 기피제, 벤즈알데히드, DEET(N,N-디에틸-m-톨루아미드), 디메틸 카베이트, 디메틸 프탈레이트, 이카리딘(icaridin)(즉, 피카리딘(picaridin), 바이레펠(Bayrepel) 및 KBR 3023), 인달론(indalone)(예를 들어, "6-2-2" 혼합물(60% 디메틸 프탈레이트, 20% 인달론, 20% 에틸헥산디올)에 사용되는 바와 같음), IR3535(3-[N-부틸-N-아세틸]-아미노프로피온산, 에틸 에스테르), 메토플루트린(metofluthrin), 페르메트린(permethrin), SS220 또는 트리사이클로데세닐 알릴 에테르(tricyclodecenyl allyl ether)가 포함된다. 천연 곤충 기피제의 예에는 작살나무(칼리카르파(Callicarpa)) 잎, 자작 나무 껍질, 늪도금양(bog myrtle)(마이리카 게일(Myrica Gale)), 캣닢 오일(catnip oil)(예를 들어, 네페탈락톤(nepetalactone)), 시트로넬라 오일(citronella oil), 레몬 유칼립투스(코림비아 시트리오도라(Corymbia citriodora); 예를 들어, p-멘탄-3,8-디올(PMD))의 에센셜 오일, 님 오일(neem oil), 레몬그래스(lemongrass), 멜라루카 알터니폴리아(Melaleuca alternifolia)의 잎으로부터의 티 트리 오일(tea tree oil), 담배 또는 그의 추출물이 포함된다.
III. 이용 방법
본원에서 PMP는 다양한 농업 또는 치료적 방법에서 유용하다. PMP(예를 들어, 본원에 기재된 변형 PMP를 포함함)의 이용 방법의 예는 하기에 추가로 기재되어 있다.
A. 식물로의 운반
예를 들어, 식물 또는 그의 부분을 PMP 조성물과 접촉시키는 단계에 의한 식물로의 PMP 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 변형 PMP를 포함함)의 운반 방법이 본원에 제공된다. 일부 경우에, 식물은 이종 기능성 제제를 포함하지 않는 PMP로 처리될 수 있다. 다른 경우에, PMP는 이종 기능성 제제, 예를 들어, 농약 제제(예를 들어, 항박테리아제, 항진균제, 살선충제, 살연체동물제, 살바이러스제 또는 제초제) 또는 유해물 방제 제제(예를 들어, 기피제), 시비제, 또는 식물 변형 제제를 포함한다.
일 양태에서, 식물의 건강의 증가 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은 본원에 기재된 PMP 조성물을 (예를 들어, 유효한 양 및 기간으로) 식물에 운반하여, 미처리 식물(예를 들어, PMP 조성물을 운반하지 않은 식물)에 비하여 식물의 건강을 증가시키는 단계를 포함한다.
PMP 조성물의 운반의 결과로서 식물의 건강의 증가는 예를 들어, 다수의 방식으로 나타남으로써, 더 나은 식물의 생산, 예를 들어, 개선된 수확량, 개선된 식물의 활력 또는 식물로부터 수확된 생산물의 품질을 초래할 수 있다. 개선된 식물의 수확량은 동일한 조건 하에서, 그러나 본 발명의 조성물의 적용 없이 생산된 식물의 동일한 생산물의 수확량에 비하여, 또는 통상적인 농업용제의 적용과 비교하여, (예를 들어, 식물 바이오매스, 곡물(grain), 종자 또는 과실 수확량, 단백질 함량, 탄수화물 또는 오일 함량 또는 엽면적에 의해 측정되는 바와 같은) 측정 가능한 양에 의한 식물의 생산물의 수확량의 증가에 관한 것이다. 예를 들어, 수확량은 적어도 약 0.5%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100% 또는 100%를 초과하여 증가될 수 있다. 수확량은 일부 기준으로 식물 또는 식물의 생산물의 중량 또는 부피에 따른 양에 관하여 표현될 수 있다. 기준은 시간, 성장 면적, 생산되는 식물의 중량 또는 사용되는 원재료의 양에 관하여 표현될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 하기를 포함하나 이들에 한정되지 않는 식물 조직의 수확량을 증가시킬 수 있다: 종자, 과실, 씨알, 꼬투리, 덩이줄기, 뿌리 및 잎.
PMP 조성물의 운반의 결과로서 식물의 건강의 증가는 또한 다른 방법, 예컨대 동일한 조건 하에서, 그러나 본 발명의 조성물의 투여 없이 또는 종래의 농업용제의 적용과 함께 생산된 식물의 동일한 인자에 비하여, 측정 가능한 또는 인지 가능한 양에 의한 활력 등급, 수목(단위 면적당 식물의 수), 식물 높이, 줄기 둘레, 줄기 길이, 잎 개수, 잎 크기, 식물 수관, 시각적 외양(예컨대 더욱 녹색의 엽색), 뿌리 등급, 출아, 단백질 함량의 증가 또는 개선, 증가된 분얼, 더 큰 잎, 더 많은 잎, 더 적은 죽은 기부엽, 더 강한 분얼지, 필요한 비료가 더 적음, 필요한 종자가 더 적음, 생산적인 분얼지가 더 많음, 보다 조기의 개화, 조기 곡물 또는 종자 성숙, 더 적은 식물 버스(도복), 증가된 슈트 성장, 조기의 발아 또는 이들 인자의 임의의 조합에 의해 측정될 수 있다.
식물에 유효량의 본원에 제공된 PMP 조성물을 전달하는 것을 포함하는 식물의 건강의 증가 또는 변형 방법으로서, 당해 방법은 식물을 변형시킴으로써, 미처리 식물에 비하여(예를 들어, 약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 약 100% 초과로) 식물에 유익한 형질을 도입하거나 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 특히, 당해 방법은 미처리 식물에 비하여 식물의 건강을 (예를 들어, 약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 약 100% 초과로) 증가시킬 수 있다.
일부 경우에, 식물 건강의 증가는 질병 저항성, 가뭄 내성, 내열성, 내한성, 내염성, 금속 내성, 제초제 내성, 화학물질 내성, 물 사용 효율, 질소 이용, 질소 스트레스에 대한 저항성, 질소 고정, 유해물 저항성, 초식동물 저항성, 병원체 저항성, 수확량, 물-제한 조건 하에서의 수확량, 활력, 성장, 광합성 능력, 영양소, 단백질 함량, 탄수화물 함량, 오일 함량, 바이오매스, 슈트 길이, 뿌리 길이, 뿌리 구조, 종자 중량 또는 수확 가능한 농산물의 양의 증가(예를 들어, 약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과)이다.
일부 경우에, 건강의 증가는 발생, 성장, 수율, 무생물적 스트레스원에 대한 내성, 생물적 스트레스원에 대한 내성의 증가(예를 들어, 약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 약 100% 초과로)이다. 무생물 스트레스는 예를 들어, 가뭄 스트레스, 염 스트레스, 열 스트레스, 한랭 스트레스 및 낮은 영양소 스트레스를 포함하는, 식물 또는 식물 부분이 겪는 환경 스트레스 조건을 지칭한다. 생물 스트레스는 예를 들어, 선충 스트레스, 곤충 초식 스트레스, 진균 병원체 스트레스, 박테리아 병원체 스트레스 또는 바이러스 병원체 스트레스를 포함하는, 식물 또는 식물 부분이 겪는 환경 스트레스 조건을 지칭한다. 스트레스는 일시적일 수 있으며, 예를 들어, 수시간, 수일, 수개월 또는 영구적, 예를 들어, 식물의 생 동안일 수 있다.
일부 경우에, 식물 건강의 증가는 식물로부터 수확된 생산물의 품질의 증가(예를 들어, 약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 약 100% 초과로)이다. 예를 들어, 식물 건강의 증가는 식물로부터 수확된 농산물의 상업적으로 유리한 특징(예를 들어, 맛 또는 외양)의 개선일 수 있다. 다른 경우에, 식물 건강의 증가는 식물로부터 수확된 생산물의 보관수명의 증가(예를 들어, 약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 약 100% 초과로)이다.
대안적으로, 건강의 증가는 인간 또는 동물 건강에 유익한 특질의 변경, 예컨대 알러지원 생성의 감소일 수 있다. 예를 들어, 건강의 증가는 동물(예를 들어, 인간)의 면역 반응을 촉진하는 알레르겐(예를 들어, 꽃가루)의 생산량 감소(예를 들어, 약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 약 100% 초과로)일 수 있다.
식물의 변형(예를 들어, 건강의 증가)는 하나 이상의 식물 부분의 변형으로부터 발생할 수 있다. 예를 들어, 식물은 식물의 잎, 종자, 화분, 뿌리, 과실, 슈트, 꽃, 세포, 원형질체 또는 조직(예를 들어, 분열 조직)을 접촉시킴으로써 변형될 수 있다. 따라서, 또 다른 양태에서, 식물의 꽃가루를 유효량의 본원의 PMP 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 식물의 건강의 증가 방법으로서, 당해 방법은 미처리 식물에 비하여 식물의 건강을 (예를 들어, 약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 약 100% 초과로) 증가시키는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 식물의 종자를 유효량의 본원에 개시된 PMP 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 식물의 건강의 증가 방법으로서, 당해 방법은 미처리 식물에 비하여 식물의 건강을 (예를 들어, 약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 약 100% 초과로) 증가시키는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 식물의 원형질체를 유효량의 본원의 PMP 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 방법으로서, 당해 방법은 미처리 식물에 비하여 식물의 건강을 (예를 들어, 약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 약 100% 초과로) 증가시키는 방법이 본원에 제공된다.
추가의 양태에서, 식물의 식물 세포를 유효량의 본원의 PMP 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 식물의 건강의 증가 방법으로서, 당해 방법은 미처리 식물에 비하여 식물의 건강을 (예를 들어, 약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 약 100% 초과로) 증가시키는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 식물의 분열 조직을 유효량의 본원의 PMP 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 식물의 건강의 증가 방법으로서, 당해 방법은 미처리 식물에 비하여 식물의 건강을 (예를 들어, 약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 약 100% 초과로) 증가시키는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 식물의 배아를 유효량의 본원의 PMP 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 식물의 건강의 증가 방법으로서, 당해 방법은 미처리 식물에 비하여 식물의 건강을 (예를 들어, 약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 약 100% 초과로) 증가시키는 방법이 본원에 제공된다.
제초제가 PMP 또는 그의 조성물에 포함되는 경우에, 당해 방법은 잡초의 건강을 감소시키거나, 그를 사멸시키기 위하여 추가로 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 당해 방법은 미처리 잡초(예를 들어, PMP 조성물을 투여하지 않은 잡초)에 비하여 잡초의 건강을 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 이상 감소시키는데 유효할 수 있다. 예를 들어, 당해 방법은 잡초를 사멸시킴으로써 미처리 잡초에 비하여 잡초의 집단을 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 이상 감소시키는데 유효할 수 있다. 일부 경우에, 당해 방법은 잡초를 실질적으로 제거한다. 본 발명에 따라 처리될 수 있는 잡초의 예는 본원에 추가로 기재되어 있다.
i.식물
다양한 식물은 본원에 기재된 PMP 조성물로 운반되거나 처리될 수 있다. 본 발명에 따른 PMP 조성물이 운반될 수 있는(즉, "처리된") 식물은 전체 식물, 및 슈트 식물 기관/구조(예를 들어, 잎, 줄기 또는 덩이줄기), 뿌리, 꽃 및 꽃 기관/구조(예를 들어, 포엽, 꽃받침, 꽃잎, 수술, 심피, 꽃밥 또는 밑씨), 종자(배아, 배유, 떡잎 또는 종피 포함) 및 과실(성숙 씨방), 식물 조직(예를 들어, 관다발 조직, 지상 조직 등) 및 세포(예를 들어, 공변 세포, 난세포 등) 및 이의 자손을 포함하나 이들에 한정되지 않는 그의 부분을 포함한다. 식물 부분은 추가로 식물의 부분, 예컨대 슈트, 뿌리, 줄기, 종자, 턱잎, 잎, 꽃잎, 꽃, 밑씨, 포엽, 가지, 잎자루, 절간, 수피(bark), 연모(pubescence), 분얼지, 뿌리줄기, 엽상체(frond), 블레이드(blade), 화분, 수술 등을 지칭할 수 있다.
본원에 개시된 방법에서 처리될 수 있는 식물의 부류는 속씨식물(단자엽 및 쌍자엽 식물), 겉씨식물, 양치식물, 쇠뜨기, 솔잎란, 석송류, 선태류 및 조류(예를 들어, 다세포 또는 단세포 조류)를 포함하는 고등 및 하등 식물의 부류를 포함한다. 본 발명에 따라 처리될 수 있는 식물은 임의의 관속 식물, 예를 들어, 알팔파, 사과, 아라비돕시스, 바나나, 보리, 캐놀라, 피마자, 국화, 클로버, 코코아, 커피, 목화, 목화씨, 옥수수, 크람베, 크랜베리, 십자화과, 오이, 덴드로비움, 마, 유칼립투스, 페스큐, 아마, 글라디올러스, 백합과, 아마씨, 기장, 머스크 멜론, 겨자, 귀리, 기름 야자, 종유 평지, 파파야, 땅콩, 파인애플, 관상용 식물, 강낭콩, 감자, 유채, 쌀, 호밀, 호밀풀, 홍화, 참깨, 수수, 대두, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 딸기, 담배, 토마토, 잔디, 밀 또는 채소 작물, 예컨대 상추, 셀러리, 브로콜리, 콜리플라워, 박과; 과실 및 견과류 나무, 예컨대 사과, 배, 복숭아, 오렌지, 자몽, 레몬, 라임, 아몬드, 피칸, 호두, 헤이즐; 덩굴식물, 예컨대 포도(예를 들어, 포도밭), 키위, 홉; 과실 관목 및 브램블, 예컨대 라즈베리, 블랙베리, 구스베리; 임목, 예컨대 물푸레나무, 소나무, 전나무, 단풍나무, 참나무, 밤나무, 포플러; 알팔파, 캐놀라, 피마자, 옥수수, 목화, 크람베, 아마, 아마씨, 겨자, 기름 야자, 종유 평지, 땅콩, 감자, 쌀, 홍화, 참깨, 대두, 사탕무, 해바라기, 담배, 토마토 및 밀을 포함하나 이들에 한정되지 않는 단자엽식물 또는 쌍자엽식물 또는 겉씨식물을 추가로 포함한다. 본 발명의 방법에 따라 처리될 수 있는 식물은 임의의 농작 식물, 예를 들어, 여물 작물, 종유 작물, 곡물 작물, 과실 작물, 채소 작물, 섬유 작물, 향신 작물, 견과 작물, 잔디 작물, 당 작물, 음료 작물 및 산림 작물을 포함한다. 특정 경우에, 당해 방법에서 처리되는 농작 식물은 대두 식물이다. 다른 특정 경우에, 농작 식물은 밀이다. 특정 경우에, 농작 식물은 옥수수이다. 특정 경우에, 농작 식물은 목화이다. 특정 경우에, 농작 식물은 알팔파이다. 특정 경우에, 농작 식물은 사탕무이다. 특정 경우에, 농작 식물은 쌀이다. 특정 경우에, 농작 식물은 감자이다. 특정 경우에, 농작 식물은 토마토이다.
특정 경우에, 식물은 농작물이다. 이러한 농작 식물의 예에는 에이서(Acer) 종, 알리움(Allium) 종, 아마란투스(Amaranthus) 종, 아나나스 코모수스(Ananas comosus), 아피움 그라베올렌스(Apium graveolens), 아라키스(Arachis) 종, 아스파라거스 오피시날리스(Asparagus officinalis), 베타 불가리스(Beta vulgaris), 브라시카(Brassica) 종(예를 들어, 브라시카 나푸스(Brassica napus), 브라시카 라파(Brassica rapa) 아종(캐놀라, 종유 평지, 순무 평지), 카넬리아 시넨시스(Camellia sinensis), 카나 인디카(Canna indica), 카나비스 사티바(Cannabis sativa), 캅시쿰(Capsicum) 종, 카스타네아(Castanea) 종, 시코리움 엔디비아(Cichorium endivia), 시트룰러스 라나투스(Citrullus lanatus), 시트러스(Citrus) 종, 코코스(Cocos) 종, 코페아(Coffea) 종, 코리안드럼 사티붐(Coriandrum sativum), 코릴루스(Corylus) 종, 크라타에구스(Crataegus) 종, 쿠쿠르비타(Cucurbita) 종, 쿠쿠미스(Cucumis) 종, 다우쿠스 카로타(Daucus carota), 파구스(Fagus) 종, 피쿠스 카리카(Ficus carica), 프라가리아(Fragaria) 종, 진크고 빌로바(Ginkgo biloba), 글라이신(Glycine) 종(예를 들어, 글라이신 맥스, 소자 히스피다(Soja hispida) 또는 소자 맥스(Soja max)), 고시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum), 헬리안투스(Helianthus) 종(예를 들어, 헬리안투스 안누스(Helianthus annuus)), 히비스쿠스(Hibiscus) 종, 호르듐(Hordeum) 종(예를 들어, 호르듐 불가레(Hordeum vulgare)), 이포모에아 바타타스(Ipomoea batatas), 주글란스(Juglans) 종, 락투카 사티바(Lactuca sativa), 리눔 우시타티시뭄(Linum usitatissimum), 리치 키넨시스(Litchi chinensis), 로투스(Lotus) 종, 로파 아쿠탄굴라(Luffa acutangula), 루피누스(Lupinus) 종, 리코페르시콘(Lycopersicon) 종(예를 들어, 리코페르시콘 에스쿨렌턴(Lycopersicon esculenturn), 리코페르시콘 리코페르시쿰(Lycopersicon lycopersicum), 리코페르시콘 피리포르메(Lycopersicon pyriforme)), 말루스(Malus) 종, 메디카고 사티바(Medicago sativa), 멘타(Mentha) 종, 미스칸투스 시넨시스(Miscanthus sinensis), 모루스 니그라(Morus nigra), 무사(Musa) 종, 니코티아나(Nicotiana) 종, 올레아(Olea) 종, 오리자(Oryza) 종(예를 들어, 오리자 사티바(Oryza sativa), 오리자 라티폴리아(Oryza latifolia)), 파니쿰 밀리아세움(Panicum miliaceum), 파니쿰 비르가툼(Panicum virgatum), 파시플로라 에둘리스(Passiflora edulis), 페트로셀리눔 크리스품(Petroselinum crispum), 파세올루스(Phaseolus) 종, 피누스(Pinus) 종, 피스타시아 베라(Pistacia vera), 피숨(Pisum) 종, 포아(Poa) 종, 포풀루스(Populus) 종, 프루누스(Prunus) 종, 피루스 코뮤니스(Pyrus communis), 퀘르쿠스(Quercus) 종, 라파누스 사티부스(Raphanus sativus), 레움 라바바룸(Rheum rhabarbarum), 리베스(Ribes) 종, 리시누스 코뮤니스(Ricinus communis), 루부스(Rubus) 종, 사카룸(Saccharum) 종, 살릭스(Salix) 종, 삼부쿠스(Sambucus) 종, 세칼레 세레알레(Secale cereale), 세사뭄(Sesamum) 종, 시내피스(Sinapis) 종, 솔라눔(Solanum) 종(예를 들어, 솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum), 솔라눔 인테그리폴리움(Solanum integrifolium) 또는 솔라눔 리코페르시쿰(Solanum lycopersicum)), 소르굼 비콜로르(Sorghum bicolor), 소르굼 할레펜스(Sorghum halepense), 스피나시아(Spinacia) 종, 타마린두스 인디카(Tamarindus indica), 테오브로마 카카오(Theobroma cacao), 트리폴리움(Trifolium) 종, 트리티코세칼레 림파우이(Triticosecale rimpaui), 트리티쿰(Triticum) 종(예를 들어, 트리티쿰 아에스티붐(Triticum aestivum), 트리티쿰 두룸(Triticum durum), 트리티쿰 투르기둠(Triticum turgidum), 트리티쿰 하이베르눔(Triticum hybernum), 트리티쿰 마차(Triticum macha), 트리티쿰 사티붐(Triticum sativum) 또는 트리티쿰 불가레(Triticum vulgare)), 백시니움(Vaccinium) 종, 비시아(Vicia) 종, 비그나(Vigna) 종, 비올라 오도라타(Viola odorata), 비티스(Vitis) 종 및 제아 메이즈(Zea mays)로부터 선택되는 사료 또는 여물 콩과식물, 관상용 식물, 식용 작물, 나무 또는 관목을 포함하나 이들에 한정되지 않는 단자엽 및 쌍자엽 식물을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 농작 식물은 벼, 종유 평지, 캐놀라, 대두, 옥수수(corn(maize)), 목화, 사탕수수, 알팔파, 수수 또는 밀이다.
특정 경우에, 조성물 및 방법을 사용하여 수확-후 식물 또는 식물 부분, 식품 또는 사료 제품을 처리할 수 있다. 일부 경우에, 식품 또는 사료 제품은 비-식물 식품 또는 사료 제품(예를 들어, 인간, 수의과 동물 또는 가축 식용 제품(예를 들어, 버섯))이다.
본 발명에 사용하기 위한 식물 또는 식물 부분은 임의의 식물 발생 단계의 식물을 포함한다. 특정 경우에, 운반은 발아, 묘목 성장, 영양 성장 및 생식 성장의 단계 동안 발생할 수 있다. 특정 경우에, 식물로의 운반은 영양 성장 및 생식 성장 단계 동안 발생한다. 대안적으로, 종자로의 운반이 발생할 수 있다. 영양 성장 및 생식 성장의 단계는 또한 본원에서 "성체" 또는 "성숙" 식물로도 지칭된다.
ii. 잡초
제초제가 PMP 또는 그의 조성물에 포함되는 경우에, 당해 방법은 잡초의 건강을 감소시키거나, 그를 사멸시키기 위하여 추가로 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 당해 방법은 미처리 잡초(예를 들어, PMP 조성물을 투여하지 않은 잡초)에 비하여 잡초의 건강을 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 이상 감소시키는데 유효할 수 있다. 예를 들어, 당해 방법은 잡초를 사멸시킴으로써 미처리 잡초에 비하여 잡초의 집단을 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 이상 감소시키는데 유효할 수 있다. 일부 경우에, 당해 방법은 잡초를 실질적으로 제거한다. 본 발명에 따라 처리될 수 있는 잡초의 예는 본원에 추가로 기재되어 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "잡초"는 원하지 않는 곳에서 성장하는 식물을 지칭한다. 이러한 식물은 전형적으로 침습적이며, 때때로 유해하거나 그렇게 될 위험을 갖는다. 잡초를 본 발명의 PMP 조성물로 처리하여, 식물의 존재, 생존력 또는 번식을 감소시키거나 제거할 수 있다. 예를 들어, 그리고 그에 제한되지 않고, 당해 방법을 사용하여, 식물을 손상시키는 것으로 알려져 있는 잡초를 표적화할 수 있다. 예를 들어, 그리고 그에 제한되지 않고, 잡초는 하기의 과의 군의 임의의 구성원일 수 있다: 그라미네아에(Gramineae), 움벨리페라에(Umbelliferae), 파필리오나세아에(Papilionaceae), 크루시페라에(Cruciferae), 말바세아에(Malvaceae), 유프호르비아세아에(Eufhorbiaceae), 콤포시타에(Compositae), 케노포디아세아에(Chenopodiaceae), 푸마리아세아에(Fumariaceae), 차리오필라세아에(Charyophyllaceae), 프리물라세아에(Primulaceae), 게라니아세아에(Geraniaceae), 폴리고나세아에(Polygonaceae), 준카세아에(Juncaceae), 사이페라세아에(Cyperaceae), 아이조아세아에(Aizoaceae), 아스테라세아에(Asteraceae), 콘볼불라세아에(Convolvulaceae), 쿠쿠르비타세아에(Cucurbitaceae), 유포르비아세아에(Euphorbiaceae), 폴리고나세아에(Polygonaceae), 포르툴라세아에(Portulaceae), 솔라나세아에(Solanaceae), 로사세아에(Rosaceae), 시마로우바세아에(Simaroubaceae), 라르디자발라세아에(Lardizabalaceae), 릴리아세아에(Liliaceae), 아마란타세아에(Amaranthaceae), 비타세아에(Vitaceae), 파바세아에(Fabaceae), 프리물라세아에(Primulaceae), 아포시나세아에(Apocynaceae), 아랄리아세아에(Araliaceae), 카리오필라세아에(Caryophyllaceae), 아스클레피아다세아에(Asclepiadaceae), 셀라스트라세아에(Celastraceae), 파바베라세아에(Papaveraceae), 오나그라세아에(Onagraceae), 라눈쿨라세아에(Ranunculaceae), 라미아세아에(Lamiaceae), 코멜리나세아에(Commelinaceae), 스크로풀라리아세아에(Scrophulariaceae), 디프사카세아에(Dipsacaceae), 보라기나세아에(Boraginaceae), 에퀴세타세아에(Equisetaceae), 게라니아세아에(Geraniaceae), 루비아세아에(Rubiaceae), 카나바세아에(Cannabaceae), 하이페리아카세아에(Hyperiacaceae), 발사미나세아에(Balsaminaceae), 로벨리아세아에(Lobeliaceae), 카프리폴리아세아에(Caprifoliaceae), 나이크타지나세아에(Nyctaginaceae), 옥살리다세아에(Oxalidaceae), 비타세아에(Vitaceae), 유르티카세아에(Urticaceae), 폴리포디아세아에(Polypodiaceae), 아나카르디아세아에(Anacardiaceae), 스밀라카세아에(Smilacaceae), 아라세아에(Araceae), 캄파눌라세아에(Campanulaceae), 타이파세아에(Typhaceae), 발레리아나세아에(Valerianaceae), 베르베나세아에(Verbenaceae), 비올라세아에(Violaceae). 예를 들어, 그에 제한되지 않고, 잡초는 롤리움 리지둠(Lolium Rigidum), 아마람투스 팔메리(Amaramthus palmeri), 아부틸론 테오프라트시(Abutilon theopratsi), 소르굼 할레펜세(Sorghum halepense), 코니자 카나덴시스(Conyza Canadensis), 세타리아 베르티실라타(Setaria verticillata), 카프셀라 파스토리스(Capsella pastoris) 및 사이페루스 로툰다스(Cyperus rotundas)로 이루어진 군의 임의의 구성원일 수 있다. 추가의 잡초는 예를 들어, 미모사피그라(Mimosapigra), 살비니아(salvinia), 하이프티스(hyptis), 센나(senna), 누구라(noogoora), 버르(burr), 자트로파 고시피폴리아(Jatropha gossypifolia), 파킨소니아 아쿨레아테(Parkinsonia aculeate), 크로몰라에나 오도라타(Chromolaena odorata), 크립토슬레기아 그란디플로라(Cryptoslegia grandiflora) 또는 안드로포곤 가이아누스(Andropogon gayanus)를 포함한다. 잡초는 단자엽 식물(예를 들어, 아그로스티스(Agrostis), 알로페쿠루스(Alopecurus), 아베나(Avena), 브로무스(Bromus), 사이페루스(Cyperus), 디지타리아(Digitaria), 에키노클로아(Echinochloa), 롤리움(Lolium), 모노코리아(Monochoria), 로트보엘리아(Rottboellia), 사지타리아(Sagittaria), 스키르푸스(Scirpus), 세타리아(Setaria), 시다(Sida) 또는 소르굼(Sorghum)) 또는 쌍자엽 식물(아부틸론(Abutilon), 아마란투스(Amaranthus), 케노포디움(Chenopodium), 크리산테뭄(Chrysanthemum), 코니자(Conyza), 갈륨(Galium), 이포모에아(Ipomoea), 나스투르튬(Nasturtium), 시나피스(Sinapis), 솔라눔(Solanum), 스텔라리아(Stellaria), 베로니카(Veronica), 비올라(Viola) 또는 잔튬(Xanthium))을 포함할 수 있다.
조성물 및 관련 방법을 사용하여, 병원체 또는 병원체 벡터가 거주하고 있는 임의의 서식지(예컨대, 식물, 식물 부분(예를 들어, 뿌리, 과실 및 종자) 상, 토양, 물 내 또는 토양, 물 상, 또는 또 다른 병원체 또는 병원체 벡터 서식지 상 등, 동물의 외부)에 있는 병원체 또는 병원체 벡터에 의한 침입을 예방하거나, 병원체 또는 병원체 벡터의 수를 감소시킬 수 있다. 따라서, 조성물 및 방법은 예를 들어, 벡터를 사멸시키거나, 손상시키거나, 그의 활성을 둔화시킴으로써 병원체 벡터의 손상 효과를 감소시킬 수 있으며, 그에 의해, 동물에 대한 병원체의 확산을 방제할 수 있다. 본원에 기재된 조성물을 사용하여, 임의의 발생 단계에 있는 임의의 병원체 또는 병원체 벡터(예를 들어, 그들의 알, 약충(nymph), 영(instar), 애벌레, 성충, 유충 또는 건조형의 ) 중 하나 이상을 방제하거나, 사멸시키거나, 손상시키거나, 무력하게 만들거나, 그의 활성을 감소시킬 수 있다. 이들 방법의 각각의 상세사항은 하기에 추가로 기재되어 있다.
B. 식물 유해물로의 운반
식물 유해물에 PMP 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 변형 PMP를 포함하는)의 운반 방법, 예를 들어, 식물 유해물을 PMP 조성물과 접촉시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 경우에, 식물 유해물은 이종 기능성 제제를 포함하지 않는 PMP로 처리될 수 있다. 다른 경우에, PMP는 이종 기능성 제제, 예를 들어, 농약 제제(예를 들어, 항박테리아제, 항진균제, 살선충제, 살연체동물제, 살바이러스제 또는 제초제) 또는 유해물 방제 제제(예를 들어, 기피제)를 포함한다. 예를 들어, 당해 방법은 예를 들어, PMP 조성물의 운반의 결과로서 유해물 침입을 예방하거나 치료하기 위하여, 유해물의 건강을 감소시키는데 유용할 수 있다.
일 양태에서, 유해물의 건강의 감소 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은 본원에 기재된 PMP 조성물을 (예를 들어, 유효량으로, 그리고 유효한 기간 동안) 유해물로 운반하여, 미처리 유해물(예를 들어, PMP 조성물을 운반하지 않은 유해물)에 비하여 유해물의 건강을 감소시키는 단계를 포함한다.
일 양태에서, (예를 들어, 치료 중인) 진균 감염을 갖는 식물에서의 진균 감염의 감소 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은 복수의 PMP를 포함하는 PMP 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 PMP 조성물)을 식물에 운반하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, (예를 들어, 치료 중인) 진균 감염을 갖는 식물에서의 진균 감염의 감소 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은 복수의 PMP를 포함하는 PMP 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 PMP 조성물)을 식물에 운반하는 단계를 포함하며, 복수의 PMP는 항진균제를 포함한다. 일부 경우에, 항진균제는 진균 감염을 야기하는 진균에서 유전자의 발현을 저해하는 핵산(예를 들어, dcl1 및 dcl2(즉, dcl1/2)이다. 일부 경우에, 진균 감염은 스클레로티니아 종(예를 들어, 스클레로티니아 스클레로티오룸), 보트리티스 종(예를 들어, 보트리티스 시네레아), 아스페르길루스 종, 푸사리움 종 또는 페니실리움 종에 속하는 진균에 의해 야기된다. 일부 경우에, 조성물은 아라비돕시스 아포플라스트 EV로부터 생산된 PMP를 포함한다. 일부 경우에, 당해 방법은 진균 감염을 감소시키거나 실질적으로 제거한다.
또 다른 양태에서, (예를 들어, 치료 중인) 박테리아 감염을 갖는 식물에서의 박테리아 감염의 감소 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은 복수의 PMP를 포함하는 PMP 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 PMP 조성물)을 식물 유해물에 운반하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, (예를 들어, 치료 중인) 박테리아 감염을 갖는 식물에서의 박테리아 감염의 감소 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은 복수의 PMP를 포함하는 PMP 조성물을 식물 유해물에 운반하는 단계를 포함하며, 복수의 PMP는 항박테리아 제제를 포함한다. 일부 경우에, 항박테리아 제제는 스트렙토마이신이다. 일부 경우에, 박테리아 감염은 슈도모나스 종에 속하는 박테리아(예를 들어, 슈도모나스 시린가에)에 의해 야기된다. 일부 경우에, 조성물은 아라비돕시스 아포플라스트 EV로부터 생산된 PMP를 포함한다. 일부 경우에, 당해 방법은 박테리아 감염을 감소시키거나 실질적으로 제거한다.
또 다른 양태에서, 식물 유해 곤충의 건강의 감소 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은 복수의 PMP를 포함하는 PMP 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 PMP 조성물)을 식물 유해 곤충에 운반하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 식물 유해 곤충의 건강의 감소 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은 복수의 PMP를 포함하는 PMP 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 PMP 조성물)을 식물 유해 곤충에 운반하는 단계를 포함하며, 복수의 PMP는 살충제를 포함한다. 일부 경우에, 살충제는 펩티드 핵산이다. 일부 경우에, 식물 유해 곤충은 진딧물이다. 일부 경우에, 식물 유해 곤충은 인시목(예를 들어, 스포돕테라 프루기페르다)이다. 일부 경우에, 당해 방법은 미처리 식물 유해 곤충에 비하여 식물 유해 곤충의 건강을 감소시킨다.
또 다른 양태에서, 식물 유해 선충의 건강의 감소 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은 복수의 PMP를 포함하는 PMP 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 PMP 조성물)을 식물 유해 선충에 운반하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 식물 유해 선충의 건강의 감소 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은 복수의 PMP를 포함하는 PMP 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 PMP 조성물)을 식물 유해 선충에 운반하는 단계를 포함하며, 복수의 PMP는 살선충제를 포함한다. 일부 경우에, 살선충제는 신경펩티드(예를 들어, Mi-NLP-15b)이다. 일부 경우에, 식물 유해 선충은 옥수수 뿌리혹 선충이다. 일부 경우에, 당해 방법은 미처리 식물 유해 선충에 비하여 식물 유해 선충의 건강을 감소시킨다.
또 다른 양태에서, 잡초의 건강의 감소 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은 복수의 PMP를 포함하는 PMP 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 PMP 조성물)을 잡초에 운반하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 잡초의 건강의 감소 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은 복수의 PMP를 포함하는 PMP 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 PMP 조성물)을 잡초에 운반하는 단계를 포함하며, 복수의 PMP는 제초제(예를 들어, 글루포시네이트)를 포함한다. 일부 경우에, 잡초는 왕바랭이(Indian goosegrass)(엘레우신 인디카(Eleusine indica))이다. 일부 경우에, 당해 방법은 미처리 잡초에 비하여 잡초의 건강을 감소시킨다.
PMP 조성물의 운반의 결과로서의 유해물의 건강의 감소는 다수의 방식으로 나타날 수 있다. 일부 경우에, 유해물의 건강의 감소는 PMP 조성물의 운반의 결과로서 유해물의 생리학의 악화 또는 쇠퇴(예를 들어, 감소된 건강 또는 생존)로서 나타날 수 있다. 일부 경우에, 유기체의 건강은 PMP 조성물을 투여하지 않은 유해물과 비교하여, 번식률, 생식력(fertility), 수명, 생존력, 운동성, 번식력(fecundity), 유해물 발생, 체중, 대사율 또는 활기(activity) 또는 생존을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 하나 이상의 파라미터에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공되는 방법 또는 조성물은 유해물의 전반적인 건강을 감소시키거나 유해물의 전반적인 생존을 감소시키는데 유효할 수 있다. 일부 경우에, 유해물의 생존 감소는 참조 수준(예를 들어, PMP 조성물을 받지 않은 유해물에서 관찰되는 수준)에 비하여 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과하여 더 크다. 일부 경우에, 당해 방법 및 조성물은 PMP 조성물을 투여하지 않은 유해물에 비하여 유해물 번식(번식률, 번식력)을 감소시키는데 유효하다. 일부 경우에, 당해 방법 및 조성물은 참조 수준(예를 들어, PMP 조성물을 받지 않은 유해물에서 관찰되는 수준)에 비하여 다른 생리학적 파라미터, 예컨대 운동성, 체중, 수명, 번식력 또는 대사율을 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과로 감소시키는데 유효하다.
일부 경우에, 유해물 건강의 감소는 PMP 조성물을 투여하지 않은 유해물에 비하여 유해물에서의 하나 이상의 영양소(예를 들어, 비타민, 탄수화물, 아미노산 또는 폴리펩티드)의 생성의 감소로서 나타날 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공되는 방법 또는 조성물은 참조 수준(예를 들어, PMP 조성물을 받지 않은 유해물에서 관찰되는 수준)에 비하여 유해물에서의 영양소(예를 들어, 비타민, 탄수화물, 아미노산 또는 폴리펩티드)의 생성을 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과로 감소시키는데 유효할 수 있다.
일부 경우에, 유해물 건강의 감소는 PMP 조성물을 투여하지 않은 유해물에 비하여 농약 제제에 대한 유해물의 감수성의 증가 및/또는 농약 제제에 대한 유해물의 저항성의 감소로서 나타날 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 방법 또는 조성물은 참조 수준(예를 들어, PMP 조성물을 받지 않은 유해물에서 관찰되는 수준)에 비하여 농약 제제에 대한 유해물의 감수성을 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과로 증가시키는데 유효할 수 있다. 농약 제제는 살충제를 포함하여, 해당 분야에 알려져 있는 임의의 농약 제제일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공되는 방법 또는 조성물은 PMP 조성물을 투여하지 않은 유해물에 비하여 농약 제제를 이용 가능한 기질로 대사하거나 분해시키는 유해물의 능력을 감소시킴으로써 농약 제제에 대한 유해물의 감수성을 증가시킬 수 있다.
일부 경우에, 유해물 건강의 감소는 PMP 조성물을 투여하지 않은 유해물에 비하여 이종감응물질 제제에 대한 유해물의 감수성의 증가 및/또는 이종감응물질 제제에 대한 유해물의 저항성의 감소로서 나타날 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공되는 방법 또는 조성물은 참조 수준(예를 들어, PMP 조성물을 받지 않은 유해물에서 관찰되는 수준)에 비하여 이종감응물질 제제에 대한 유해물의 저항성을 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과로 감소시키는데 유효할 수 있다. 일부 경우에, 이종감응물질 제제는 카페인, 소야시스타틴(soyacystatin), 페니트로티온(fenitrothion), 모노테르펜, 디테르펜 산 또는 페놀계 화합물(예를 들어, 타닌, 플라보노이드)이다. 일부 경우에, 본원에 제공되는 방법 또는 조성물은 PMP 조성물을 투여하지 않은 유해물에 비하여 이종감응물질 제제를 이용 가능한 기질로 대사하거나 분해시키는 유해물의 능력을 감소시킴으로써 이종감응물질 제제에 대한 유해물의 감수성을 증가시킬 수 있다.
일부 경우에, 본원에 제공되는 방법 또는 조성물은 PMP 조성물을 투여하지 않은 유해물에 비하여 기생생물 또는 병원체(예를 들어, 진균, 박테리아 또는 바이러스 병원체 또는 기생생물)에 대한 유해물의 저항성을 감소시키는데 유효할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공되는 방법 또는 조성물은 참조 수준(예를 들어, PMP 조성물을 받지 않은 유해물에서 관찰되는 수준)에 비하여 병원체 또는 기생생물(예를 들어, 진균, 박테리아 또는 바이러스 병원체; 또는 기생 응애)에 대한 유해물의 저항성을 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과로 감소시키는데 유효할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 제공되는 방법 또는 조성물은 PMP 조성물을 투여하지 않은 유해물에 비하여 식물 병원체(예를 들어, 식물 바이러스(예를 들어, TYLCV) 또는 식물 박테리아(예를 들어, 아그로박테리움(Agrobacterium) 종))를 운반하거나 전달하는 유해물의 능력을 감소시키는데 유효할 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공되는 방법 또는 조성물은 참조 수준(예를 들어, PMP 조성물을 받지 않은 유해물에서 관찰되는 수준)에 비하여 식물 병원체(예를 들어, 식물 바이러스(예를 들어, TYLCV) 또는 식물 박테리아(예를 들어, 아그로박테리움 종))를 운반하거나 전달하는 유해물의 능력을 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과로 감소시키는데 유효할 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 제초제가 PMP 또는 그의 조성물에 포함되는 경우에, 당해 방법은 잡초의 건강을 감소시키거나, 그를 사멸시키기 위하여 추가로 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 당해 방법은 미처리 잡초(예를 들어, PMP 조성물을 투여하지 않은 잡초)에 비하여 잡초의 건강을 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 이상 감소시키는데 유효할 수 있다. 예를 들어, 당해 방법은 잡초를 사멸시킴으로써 미처리 잡초에 비하여 잡초의 집단을 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 이상 감소시키는데 유효할 수 있다. 일부 경우에, 당해 방법은 잡초를 실질적으로 제거한다. 본 발명에 따라 처리될 수 있는 잡초의 예는 본원에 추가로 기재되어 있다.
일부 경우에, 유해물 건강의 감소는 PMP 조성물을 투여하지 않은 유해물에 비하여, 다른 건강 불이익, 예컨대 특정 환경 인자에 대한 관용(예를 들어, 고온 또는 저온 관용) 감소, 특정 서식지에서의 생존력 감소 또는 특정 식이를 지속하는 능력의 감소로서 나타날 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공되는 방법 또는 조성물은 본원에 기재된 임의의 복수의 방식으로 유해물 건강을 감소시키는데 유효할 수 있다. 추가로, PMP 조성물은 임의의 수의 유해물 강, 목, 과, 속 또는 종(예를 들어, 1가지의 유해물 종, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 200, 250, 500가지 또는 그 이상의 유해물 종)에서 유해물 건강을 감소시킬 수 있다. 일부 경우에, PMP 조성물은 단일의 유해물 강, 목, 과, 속 또는 종에서 작용한다.
유해물 건강은 해당 분야의 임의의 표준 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 일부 경우에, 유해물 건강은 개별 유해물을 평가함으로써 평가될 수 있다. 대안적으로, 유해물 건강은 유해물 집단을 평가함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 유해물 건강의 감소는 다른 곤충에 대한 성공적인 경쟁의 감소에 의한 유해물 집단의 크기의 감소의 야기로서 나타날 수 있다.
i. 진균
PMP 조성물 및 관련 방법은 예를 들어, 식물에서 진균 감염을 예방하거나 치료하기 위하여 진균의 건강을 감소시키기 위해 유용할 수 있다. 진균을 PMP 조성물과 접촉시킴으로써 PMP 조성물을 진균에 운반하기 위한 방법이 포함된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 당해 방법은 식물을 PMP 조성물과 접촉시킴으로써 PMP 조성물을 진균 감염의 위험이 있거나, 또는 이를 갖는 식물에 운반하는 단계를 포함한다.
PMP 조성물 및 관련 방법은 흰가루병 병원체, 예를 들어 블루메리아(Blumeria) 종, 예를 들어 블루메리아 그라미니스(Blumeria graminis); 포도스파에라(Podosphaera) 종, 예를 들어 포도스파에라 류코트리카(Podosphaera leucotricha); 스파에로테카(Sphaerotheca) 종, 예를 들어 스파에로테카 풀리기네아(Sphaerotheca fuliginea); 운시눌라(Uncinula) 종, 예를 들어 운시눌라 네카토르(Uncinula necator)에 의해 야기되는 질병; 녹병 병원체, 예를 들어 김노스포란기움(Gymnosporangium) 종, 예를 들어 김노스포란기움 사비나에(Gymnosporangium sabinae); 헤밀레이아(Hemileia) 종, 예를 들어 헤밀레이아 바스타트릭스(Hemileia vastatrix); 파코프소라(Phakopsora) 종, 예를 들어 파코프소라 파키리지(Phakopsora pachyrhizi) 및 파코프소라 메이보미아에(Phakopsora meibomiae); 푸시니아(Puccinia) 종, 예를 들어 푸시니아 레콘디테(Puccinia recondite), 피. 트리티시나(P. triticina), 피. 그라미니스(P. graminis) 또는 피. 스트리이포르미스(P. striiformis); 우로미세스(Uromyces) 종, 예를 들어 우로미세스 아펜디쿨라투스(Uromyces appendiculatus)에 의해 야기되는 질병; 난균류, 예를 들어 알부고(Albugo) 종, 예를 들어 알부고 칸디다(Albugo candida); 브레미아(Bremia) 종, 예를 들어 브레미아 락투카에(Bremia lactucae); 페로노스포라(Peronospora) 종, 예를 들어 페로노스포라 피시(Peronospora pisi) 또는 피. 브라시카에(P. brassicae); 피토프토라(Phytophthora) 종, 예를 들어 피토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans); 플라스모파라(Plasmopara) 종, 예를 들어 플라스모파라 비티콜라(Plasmopara viticola); 슈도페로노스포라(Pseudoperonospora) 종, 예를 들어 슈도페로노스포라 휴물리(Pseudoperonospora humuli) 또는 슈도페로노스포라 쿠벤시스(Pseudoperonospora cubensis); 피티움(Pythium) 종, 예를 들어 피티움 울티뭄(Pythium ultimum)의 군으로부터의 병원체에 의해 야기되는 질병; 예를 들어 알테르나리아(Alternaria) 종, 예를 들어 알테르나리아 솔라니(Alternaria solani); 세르코스포라(Cercospora) 종, 예를 들어 세르코스포라 베티콜라(Cercospora beticola); 클라디오스포리움(Cladiosporium) 종, 예를 들어 클라디오스포리움 쿠쿠메리눔(Cladiosporium cucumerinum); 코클리오볼루스(Cochliobolus) 종, 예를 들어 코클리오볼루스 사티부스(Cochliobolus sativus)(분생포자 형태: 드레크슬레라(Drechslera), 동의어: 헬민토스포리움(Helminthosporium)), 코클리오볼루스 미야베아누스(Cochliobolus miyabeanus); 콜레토트리쿰(Colletotrichum) 종, 예를 들어 콜레토트리쿰 린데무타니움(Colletotrichum lindemuthanium); 시클로코니움(Cycloconium) 종, 예를 들어 시클로코니움 올레아기눔(Cycloconium oleaginum); 디아포르테(Diaporthe) 종, 예를 들어 디아포르테 시트리(Diaporthe citri); 엘시노에(Elsinoe) 종, 예를 들어 엘시노에 파우세티이(Elsinoe fawcettii); 글로에오스포리움(Gloeosporium) 종, 예를 들어 글로에오스포리움 라에티콜로르(Gloeosporium laeticolor); 글로메렐라(Glomerella) 종, 예를 들어 글로메렐라 신굴라타(Glomerella cingulata); 구이그나르디아(Guignardia) 종, 예를 들어 구이그나르디아 비드웰리(Guignardia bidwelli); 렙토스파에리아(Leptosphaeria) 종, 예를 들어 렙토스파에리아 마쿨란스(Leptosphaeria maculans), 렙토스파에리아 노도룸(Leptosphaeria nodorum); 마그나포르테(Magnaporthe) 종, 예를 들어 마그나포르테 그리세아(Magnaporthe grisea); 미크로도키움(Microdochium) 종, 예를 들어 미크로도키움 니발레(Microdochium nivale); 미코스파에렐라(Mycosphaerella) 종, 예를 들어 미코스파에렐라 그라미니콜라(Mycosphaerella graminicola), 엠. 아라키디콜라(M. arachidicola) 및 엠. 피지엔시스(M. fijiensis); 파에오스파에리아(Phaeosphaeria) 종, 예를 들어 파에오스파에리아 노도룸(Phaeosphaeria nodorum); 피레노포라(Pyrenophora) 종, 예를 들어 피레노포라 테레스(Pyrenophora teres), 피레노포라 트리티시 레펜티스(Pyrenophora tritici repentis); 라물라리아(Ramularia) 종, 예를 들어 라물라리아 콜로-시그니(Ramularia collo-cygni), 라물라리아 아레올라(Ramularia areola); 린코스포리움(Rhynchosporium) 종, 예를 들어 린코스포리움 세칼리스(Rhynchosporium secalis); 셉토리아(Septoria) 종, 예를 들어 셉토리아 아피이(Septoria apii), 셉토리아 리코페르시이(Septoria lycopersii); 티풀라(Typhula) 종, 예를 들어 티풀라 인카르나타(Typhula incarnata); 벤투리아(Venturia) 종, 예를 들어 벤투리아 이나에쿠알리스(Venturia inaequalis)에 의해 야기되는 잎마름병 및 잎 위조병; 예를 들어 코르티시움(Corticium) 종, 예를 들어 코르티시움 그라미네아룸(Corticium graminearum); 푸사리움 종, 예를 들어 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum); 가에우만노미세스(Gaeumannomyces) 종, 예를 들어 가에우만노미세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis); 리족토니아(Rhizoctonia) 종, 예컨대 예를 들어 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani); 예를 들어 사로클라디움 오리자에(Sarocladium oryzae)로 인한 사로클라디움(Sarocladium) 질병; 예를 들어 스클레로티움 오리자에(Sclerotium oryzae)로 인한 스클레로티움(Sclerotium) 질병; 타페시아(Tapesia) 종, 예를 들어 타페시아 아쿠포르미스(Tapesia acuformis); 티엘라비옵시스(Thielaviopsis) 종, 예를 들어 티엘라비옵시스 바시콜라(Thielaviopsis basicola)에 의해 야기되는 뿌리 및 줄기병; 예를 들어 알테르나리아 종, 예를 들어 알테르나리아 종; 아스페르길루스 종, 예를 들어 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus); 클라도스포리움(Cladosporium) 종, 예를 들어 클라도스포리움 클라도스포리오이데스(Cladosporium cladosporioides); 클라비셉스(Claviceps) 종, 예를 들어 클라비셉스 푸르푸레아(Claviceps purpurea); 푸사리움 종, 예를 들어 푸사리움 쿨모룸(Fusarium culmorum); 지베렐라(Gibberella) 종, 예를 들어 지베렐라 제아에(Gibberella zeae); 모노그라펠라(Monographella) 종, 예를 들어 모노그라펠라 니발리스(Monographella nivalis); 셉토리아 종, 예를 들어 셉토리아 노도룸(Septoria nodorum)에 의해 야기되는 이삭 및 원추화(panicle) 질병(옥수수 속대 포함); 깜부기병 진균, 예를 들어 스파셀로테카(Sphacelotheca) 종, 예를 들어 스파셀로테카 레일리아나(Sphacelotheca reiliana); 틸레티아(Tilletia) 종, 예를 들어 틸레티아 카리에스(Tilletia caries), 티. 콘트로베르사(T. controversa); 우로시스티스(Urocystis) 종, 예를 들어 우로시스티스 오쿨타(Urocystis occulta); 우스틸라고(Ustilago) 종, 예를 들어 우스틸라고 누다(Ustilago nuda), 유. 누다 트리티시(U. nuda tritici)에 의해 야기되는 질병; 예를 들어 아스페르길루스 종, 예를 들어 아스페르길루스 플라부스; 보트리티스 종, 예를 들어 보트리티스 시네레아; 페니실리움 종, 예를 들어 페니실리움 엑스판숨(Penicillium expansum) 및 피. 푸르푸로게눔(P. purpurogenum); 스클레로티니아 종, 예를 들어 스클레로티니아 스클레로티오룸; 베르티실리움(Verticilium) 종, 예를 들어 베르티실리움 알보아트룸(Verticilium alboatrum)에 의해 야기되는 과실 썩음병; 예를 들어 예를 들어 알테르나리아 브라시시콜라(Alternaria brassicicola)에 의해 야기되는 알테르나리아 종; 예를 들어 아파노미세스 에우테이케스(Aphanomyces euteiches)에 의해 야기되는 아파노미세스(Aphanomyces) 종; 예를 들어 아스코키타 렌티스(Ascochyta lentis)에 의해 야기되는 아스코키타(Ascochyta) 종; 예를 들어 아스페르길루스 플라부스에 의해 야기되는 아스페르길루스 종; 예를 들어 클라도스포리움 헤르바룸(Cladosporium herbarum)에 의해 야기되는 클라도스포리움 종; 예를 들어 코클리오볼루스 사티부스에 의해 야기되는 코클리오볼루스 종; (분생포자 형태: 드레크슬레라, 비폴라리스(Bipolaris), 동의어: 헬민토스포리움); 예를 들어 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes)에 의해 야기되는 콜레토트리쿰 종; 예를 들어 푸사리움 쿨모룸에 의해 야기되는 푸사리움 종; 예를 들어 지베렐라 제아에에 의해 야기되는 지베렐라 종; 예를 들어 마크로포미나 파세올리나(Macrophomina phaseolina)에 의해 야기되는 마크로포미나(Macrophomina) 종; 예를 들어 모노그라펠라 니발리스에 의해 야기되는 모노그라펠라 종; 예를 들어 페니실리움 엑스판숨에 의해 야기되는 페니실리움 종; 포마(Phoma) 종, 예를 들어 포마 린감(Phoma lingam); 예를 들어 포몹시스 소자에(Phomopsis sojae)에 의해 야기되는 포몹시스(Phomopsis) 종; 예를 들어 피토프토라 칵토룸(Phytophthora cactorum)에 의해 야기되는 피토프토라 종; 예를 들어 피레노포라 그라미네아(Pyrenophora graminea)에 의해 야기되는 피레노포라 종; 예를 들어 피리쿨라리아 오리자에(Pyricularia oryzae)에 의해 야기되는 피리쿨라리아(Pyricularia) 종; 예를 들어 피티움 울티뭄에 의해 야기되는 피티움 종; 예를 들어 리족토니아 솔라니에 의해 야기되는 리족토니아 종; 예를 들어 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae)에 의해 야기되는 리조푸스(Rhizopus) 종; 예를 들어 스클레로티움 롤프시이(Sclerotium rolfsii)에 의해 야기되는 스클레로티움 종; 예를 들어 셉토리아 노도룸에 의해 야기되는 셉토리아 종; 예를 들어 티풀라 인카르나타에 의해 야기되는 티풀라 종; 예를 들어 베르티실리움 다흘리아에(Verticillium dahliae)에 의해 야기되는 베르티실리움(Verticillium) 종에 의해 야기되는 종자 및 토양매개 부패병, 곰팡이병, 위조병, 썩음병 및 모잘록병; 예를 들어 넥트리아(Nectria) 종, 예를 들어 넥트리아 갈리게나(Nectria galligena)에 의해 야기되는 암, 혹병 및 빗자루병; 예를 들어 모닐리니아(Monilinia) 종, 예를 들어 모닐리니아 락사(Monilinia laxa)에 의해 야기되는 위조병; 예를 들어 엑소바시디움(Exobasidium) 종, 예를 들어 엑소바시디움 벡산스(Exobasidium vexans); 타프리나(Taphrina) 종, 예를 들어 타프리나 데포르만스(Taphrina deformans)에 의해 야기되는 잎오갈병 또는 잎말림병; 예를 들어 파에모니엘라 클라미도스포라(Phaemoniella clamydospora), 파에오아크레모니움 알레오필룸(Phaeoacremonium aleophilum) 및 포미티포리아 메디테라네아(Fomitiporia mediterranea)로 인한 에스카(Esca) 질병; 예를 들어 유티파 라타(Eutypa lata)로 인한 유티파(Eutypa) 잔가지괴사; 예를 들어 가노데르마 보니넨세(Ganoderma boninense)로 인한 가노데르마(Ganoderma) 질병; 예를 들어 리기도포루스 리그노수스(Rigidoporus lignosus)로 인한 리기도포루스(Rigidoporus) 질병에 의해 야기되는 목본 식물의 쇠퇴 질병; 예를 들어 보트리티스 종, 예를 들어 보트리티스 시네레아에 의해 야기되는 꽃 및 종자의 질병; 예를 들어 리족토니아 종, 예를 들어 리족토니아 솔라니; 헬민토스포리움 종, 예를 들어 헬민토스포리움 솔라니(Helminthosporium solani)에 의해 야기되는 식물 덩이줄기의 질병; 예를 들어 플라스모디오포라(Plasmodiophora) 종, 예를 들어 플라모디오포라 브라시카에(Plamodiophora brassicae)에 의해 야기되는 뿌리혹병; 박테리아 병원체, 예를 들어 잔토모나스(Xanthomonas) 종, 예를 들어 잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 오리자에(Xanthomonas campestris pv. oryzae); 슈도모나스 종, 예를 들어 슈도모나스 시린가에 병원체변종 라크리만스(Pseudomonas syringae pv. lachrymans); 에르위니아(Erwinia) 종, 예를 들어 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)에 의해 야기되는 질병을 포함하여, 식물에서 진균 질병을 야기하는 진균으로의 운반에 적합하다.
예를 들어 알테르나리아 점무늬병(알테르나리아 종 아트란스 테누이시마(Alternaria spec. atrans tenuissima)), 탄저병(콜레토트리쿰 글로에오스포로이데스 데마티움 변종 트룬카툼(Colletotrichum gloeosporoidesdematium var. truncatum)), 갈색점무늬병(셉토리아 글리시네스(Septoria glycines)), 세르코스포라 잎 점무늬병 및 잎마름병(세르코스포라 키쿠키이(Cercospora kikuchii)), 코아네포라 잎마름병(코아네포라 인푼디불리페라 트리스포라(Choanephora infundibulifera trispora)(동의어)), 닥툴리오포라(Dactuliophora) 잎 점무늬병(닥툴리오포라 글리시네스(Dactuliophora glycines)), 노균병(페로노스포라 만슈리카(Peronospora manshurica)), 드레크슬레라(Drechslera) 마름병(드레크슬레라 글리시니(Drechslera glycini)), 백성병(frogeye) 잎 점무늬병(세르코스포라 소지나(Cercospora sojina)), 레프토스파에룰리나(Leptosphaerulina) 잎 점무늬병(레프토스파에룰리나 트리폴리이(Leptosphaerulina trifolii)), 필로스티카(Phyllosticta) 잎 점무늬병(필로스티카 소자에콜라(Phyllosticta sojaecola)), 꼬투리 및 줄기 마름병(포몹시스 소자에), 흰가루병(미크로스파에라 디푸사(Microsphaera diffusa)), 피레노카에타(pyrenochaeta) 잎 점무늬병(피레노카에타 글리시네스(Pyrenochaeta glycines)), 리족토니아 지상부, 경엽 및 거미줄 마름병(리족토니아 솔라니), 녹병(파코프소라 파키리지, 파코프소라 메이보미아에), 붉은곰팡이병(스파셀로마 글리시네스(Sphaceloma glycines)), 스템필리움(stemphylium) 잎 마름병(스템필리움 보트리오숨(Stemphylium botryosum)), 갈색무늬병(코리네스포라 카시이콜라(Corynespora cassiicola))에 의해 야기되는 잎, 줄기, 꼬투리 및 종자 상의 진균성 질병.
예를 들어 검은 뿌리 썩음병(칼로넥트리아 크로탈라리아에(Calonectria crotalariae)), 탄저병(마크로포미나 파세올리나(Macrophomina phaseolina)), 푸사리움 마름병 또는 위조병, 뿌리 썩음병, 및 꼬투리 및 지제부 썩음병(푸사리움 옥시스포룸, 푸사리움 오르토세라스(Fusarium orthoceras), 푸사리움 세미텍툼(Fusarium semitectum), 푸사리움 에퀴세티(Fusarium equiseti)), 미콜렙토디스쿠스(mycoleptodiscus) 뿌리 썩음병(미콜렙토디스쿠스 테레스트리스(Mycoleptodiscus terrestris)), 네오코스모스포라(neocosmospora)(네오코스모스포라 바신펙타(Neocosmospora vasinfecta)), 꼬투리 및 줄기 마름병(디아포르테 파세올로룸(Diaporthe phaseolorum)), 줄기 마름병(디아포르테 파세올로룸 변종 카울리보라(Diaporthe phaseolorum var. caulivora)), 피토프토라 썩음병(피토프토라 메가스페르마(Phytophthora megasperma)), 갈색 줄기 썩음병(피알로포라 그레가타(Phialophora gregata)), 피티움 썩음병(피티움 아파니데르마툼(Pythium aphanidermatum), 피티움 이레굴라레(Pythium irregulare), 피티움 데바리아눔(Pythium debaryanum), 피티움 미리오틸룸(Pythium myriotylum), 피티움 울티뭄), 리족토니아 뿌리 썩음병, 줄기 부패병 및 모잘록병(리족토니아 솔라니), 스클레로티니아 줄기 부패병(스클레로티니아 스클레로티오룸), 스클레로티니아 남부 마름병(스클레로티니아 롤프시이(Sclerotinia rolfsii)), 티엘라비옵시스 뿌리 썩음병(티엘라비옵시스 바시콜라)으로 인한 뿌리 및 줄기 기부 상의 진균성 질병.
특정 경우에, 진균은 스클레로티니아 종(스클레로티니아 스클레로티오룸)이다. 특정 경우에, 진균은 보트리티스 종(예를 들어, 보트리티스 시네레아)이다. 특정 경우에, 진균은 아스페르길루스 종이다. 특정 경우에, 진균은 푸사리움 종이다. 특정 경우에, 진균은 페니실리움 종이다.
본 발명의 조성물은 다양한 진균 방제 응용에 유용하다. 상기 기재된 조성물을 사용하여, 수확 이전의 진균 식물병원체 또는 수확-후 진균 병원체를 방제할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 기재된 조성물 중 임의의 것은, 조성물을 식물, 식물 주변의 영역 또는 식용 재배 버섯, 버섯 씨균 또는 버섯 컴포스트(compost)에 적용함으로써 표적 병원체, 예컨대 푸사리움 종, 보트리티스 종, 베르티실리움 종, 리족토니아 종, 트리코데르마(Trichoderma) 종 또는 피티움 종을 방제하기 위하여 사용된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 수확-후 병원체, 예컨대 페니실리움, 게오트리쿰(Geotrichum), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 또는 콜레토트리쿰 종을 방제하기 위하여 사용된다.
표 6은 본원에 기재된 PMP 조성물 및 관련 방법을 사용하여 치료되거나 예방될 수 있는 진균, 및 이와 관련된 식물 질병의 추가의 예를 제공한다.
[표 6]
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ii. 박테리아
PMP 조성물 및 관련 방법은 예를 들어, 식물에서 박테리아 감염을 예방하거나 치료하기 위하여 박테리아의 건강을 감소시키기 위해 유용할 수 있다. 박테리아를 PMP 조성물과 접촉시킴으로써 PMP 조성물을 박테리아에 운반하기 위한 방법이 포함된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 당해 방법은 식물을 PMP 조성물과 접촉시킴으로써 생물농약을 박테리아 감염의 위험이 있거나, 또는 이를 갖는 식물에 운반하는 단계를 포함한다.
PMP 조성물 및 관련 방법은 하기에 추가로 기재된 임의의 박테리아를 포함하는, 박테리아 또는 그로 감염된 식물로의 운반에 적합하다. 예를 들어, 박테리아는 악티노박테리아(Actinobacteria) 및 프로테오박테리아(Proteobacteria)에 속하는 것, 예컨대 부르크홀데리아세아에(Burkholderiaceae), 잔토모나다세아에(Xanthomonadaceae), 슈도모나다세아에(Pseudomonadaceae), 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 미크로박테리아세아에(Microbacteriaceae) 및 리조비아세아에(Rhizobiaceae) 과의 박테리아일 수 있다.
일부 경우에, 박테리아는 예를 들어, 아시도보락스 아베나에 아종 아베나에(Acidovorax avenae subsp. avenae)(=슈도모나스 아베나에 아종 아베나에(Pseudomonas avenae subsp. avenae)), 아시도보락스 아베나에 아종 카틀레야에(Acidovorax avenae subsp. cattleyae)(=슈도모나스 카틀레야에(Pseudomonas cattleyae)) 또는 아시도보락스 아베나에 아종 시트룰리(Acidovorax avenae subsp. citrulli)(=슈도모나스 슈도알칼리게네스 아종 시트룰리(Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli), 슈도모나스 아베나에 아종 시트룰리(Pseudomonas avenae subsp. citrulli))를 포함하는 아시도보락스 아베나에 아종이다.
일부 경우에, 박테리아는 예를 들어 부르크홀데리아 안드로포고니스(Burkholderia andropogonis)(=슈도모나스 안드로포고니스(Pseudomonas andropogonis), 슈도모나스 우드시이(Pseudomonas woodsii)), 부르크홀데리아 카리오필리(Burkholderia caryophylli)(=슈도모나스 카리오필리(Pseudomonas caryophylli)), 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia)(=슈도모나스 세파시아(Pseudomonas cepacia)), 부르크홀데리아 글라디올리(Burkholderia gladioli)(=슈도모나스 글라디올리(Pseudomonas gladioli)), 부르크홀데리아 글라디올리 병원체변종 아가리시콜라(Burkholderia gladioli pv. agaricicola)(=슈도모나스 글라디올리 병원체변종 아가리시콜라(Pseudomonas gladioli pv. agaricicola), 부르크홀데리아 글라디올리 병원체변종 알리이콜라(Burkholderia gladioli pv. alliicola) (즉, 슈도모나스 글라디올리 병원체변종 알리이콜라(Pseudomonas gladioli pv. alliicola), 부르크홀데리아 글라디올리 병원체변종 글라디올리(Burkholderia gladioli pv. gladioli)(즉, 슈도모나스 글라디올리, 슈도모나스 글라디올리 병원체변종 글라디올리(Pseudomonas gladioli pv. gladioli)), 부르크홀데리아 글루마에(즉, 슈도모나스 글루마에(Pseudomonas glumae)), 부르크홀데리아 플란타리이(Burkholderia plantarii)(즉, 슈도모나스 플란타리이(Pseudomonas plantarii)), 부르크홀데리아 솔라나세아룸(Burkholderia solanacearum)(즉, 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)) 또는 랄스토니아 종(Ralstonia spp.)을 포함하는 부르크홀데리아(Burkholderia) 종이다.
일부 경우에, 박테리아는 예를 들어 칸디다투스 리베리박터 종, 예를 들어 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스(Candidatus Liberibacter asiaticus), 리베리박터 아프리카누스(Liberibacter africanus)(Laf), 리베리박터 아메리카누스(Liberibacter americanus)(Lam), 리베리박터 아시아티쿠스(Liberibacter asiaticus)(Las), 리베리박터 에우로파에우스(Liberibacter europaeus)(Leu), 리베리박터 실라우로우스(Liberibacter psyllaurous) 또는 리베리박터 솔라나세아룸(Liberibacter solanacearum)(Lso)을 포함하는 리베리박터(Liberibacter) 종이다.
일부 경우에, 박테리아는 예를 들어 코리네박테륨 파시안스(Corynebacterium fascians), 코리네박테륨 플라쿰파시엔스 병원체변종 플라쿰파시엔스(Corynebacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens), 코리네박테륨 미시가네시스(Corynebacterium michiganensis), 코리네박테륨 미시가넨세 병원체변종 트리티시(Corynebacterium michiganense pv. tritici), 코리네박테륨 미시가넨세 병원체변종 네브라스켄세(Corynebacterium michiganense pv. nebraskense) 또는 코리네박테륨 세페도니쿰(Corynebacterium sepedonicum)을 포함하는 코리네박테륨(Corynebacterium) 종이다.
일부 경우에, 박테리아는 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora), 에르위니아 아나나스(Erwinia ananas), 에르위니아 카로토보라(Erwinia carotovora)(=펙토박테륨 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum)), 에르위니아 카로토보라 아종 아트로셉티카(Erwinia carotovora subsp. atroseptica), 에르위니아 카로토보라 아종 카로토보라(Erwinia carotovora subsp. carotovora), 에르위니아 크리산테미(Erwinia chrysanthemi), 에르위니아 크리산테미 병원체변종 제아에(Erwinia chrysanthemi pv. zeae), 에르위니아 디솔벤스(Erwinia dissolvens), 에르위니아 헤르비콜라(Erwinia herbicola), 에르위니아 라폰틱(Erwinia rhapontic), 에르위니아 스테와르티이이(Erwinia stewartiii), 에르위니아 트라케이필라(Erwinia tracheiphila) 또는 에르위니아 우레도보라(Erwinia uredovora)를 포함하는 에르위니아 종이다.
일부 경우에, 박테리아는 슈도모나스 시린가에 병원체변종 악티니디아에(Psa), 슈도모나스 시린가에 병원체변종 아트로파시엔스(Pseudomonas syringae pv. atrofaciens), 슈도모나스 시린가에 병원체변종 코로나파시엔스(Pseudomonas syringae pv. coronafaciens), 슈도모나스 시린가에 병원체변종 글리시네아(Pseudomonas syringae pv. glycinea), 슈도모나스 시린가에 병원체변종 라크리만스(Pseudomonas syringae pv. lachrymans), 슈도모나스 시린가에 병원체변종 마쿨리콜라(Pseudomonas syringae pv. maculicola), 슈도모나스 시린가에 병원체변종 파풀란스(Pseudomonas syringae pv. papulans), 슈도모나스 시린가에 병원체변종 스트리아파시엔스(Pseudomonas syringae pv. striafaciens), 슈도모나스 시린가에 병원체변종 시린가에(Pseudomonas syringae pv. syringae), 슈도모나스 시린가에 병원체변종 토마토(Pseudomonas syringae pv. tomato) 또는 슈도모나스 시린가에 병원체변종 타바시(Pseudomonas syringae pv. tabaci)를 포함하는 슈도모나스 시린가에 아종이다.
일부 경우에, 박테리아는 예를 들어 스트렙토마이세스 아시디스카비에스(Streptomyces acidiscabies), 스트렙토마이세스 알비도플라부스(Streptomyces albidoflavus), 스트렙토마이세스 칸디두스(Streptomyces candidus)(즉, 악티노마이세스 칸디두스(Actinomyces candidus)), 스트렙토마이세스 카비스카비에스(Streptomyces caviscabies), 스트렙토마이세스 콜리누스(Streptomyces collinus), 스트렙토마이세스 에우로파에이스카비에이(Streptomyces europaeiscabiei), 스트렙토마이세스 인테르메디우스(Streptomyces intermedius), 스트렙토마이세스 이포모에아에(Streptomyces ipomoeae), 스트렙토마이세스 루리디스카비에이(Streptomyces luridiscabiei), 스트렙토마이세스 니베이스카비에이(Streptomyces niveiscabiei), 스트렙토마이세스 푸니시스카비에이(Streptomyces puniciscabiei), 스트렙토마이세스 레투쿨리스카비에이(Streptomyces retuculiscabiei), 스트렙토마이세스 스카비에이(Streptomyces scabiei), 스트렙토마이세스 스카비에스(Streptomyces scabies), 스트렙토마이세스 세토니이(Streptomyces setonii), 스트렙토마이세스 스텔리이스카비에이(Streptomyces steliiscabiei), 스트렙토마이세스 투르기디스카비에스(Streptomyces turgidiscabies) 또는 스트렙토마이세스 웨드모렌시스(Streptomyces wedmorensis)를 포함하는 스트렙토마이세스 종이다.
일부 경우에, 박테리아는 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 알팔파에(Xanthomonas axonopodis pv. alfalfae)(=잔토모나스 알팔파에(Xanthomonas alfalfae)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 아우란티폴리이(Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii)(=잔토모나스 푸스칸스 아종 아우란티폴리이(Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 알리이(Xanthomonas axonopodis pv. allii)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 알리이(Xanthomonas campestris pv. allii), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 악소노포디스(Xanthomonas axonopodis pv. axonopodis), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 바우히니아에(Xanthomonas axonopodis pv. bauhiniae)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 바우히니아에(Xanthomonas campestris pv. bauhiniae)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 베고니아에(Xanthomonas axonopodis pv. begoniae)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 베고니아에(Xanthomonas campestris pv. begoniae)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 베틀리콜라(Xanthomonas axonopodis pv. betlicola)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 베틀리콜라(Xanthomonas campestris pv. betlicola)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 비오피티(Xanthomonas axonopodis pv. biophyti)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 비오피티(Xanthomonas campestris pv. biophyti)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 카자니(Xanthomonas axonopodis pv. cajani)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 카자니(Xanthomonas campestris pv. cajani)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 카사바에(Xanthomonas axonopodis pv. cassavae)(=잔토모나스 카사바에(Xanthomonas cassavae), 잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 카사바에(Xanthomonas campestris pv. cassavae)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 카시아에(Xanthomonas axonopodis pv. cassiae)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 카시아에(Xanthomonas campestris pv. cassiae)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 시트리(=잔토모나스 시트리(Xanthomonas citri)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 시트루멜로(Xanthomonas axonopodis pv. citrumelo)(=잔토모나스 알팔파에 아종 시트루멜로니스(Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 클리토리아에(Xanthomonas axonopodis pv. clitoriae)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 클리토리아에(Xanthomonas campestris pv. clitoriae)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 코라카나에(Xanthomonas axonopodis pv. coracanae)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 코라카나에(Xanthomonas campestris pv. coracanae)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 시아몹시디스(Xanthomonas axonopodis pv. cyamopsidis)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 시아몹시디스(Xanthomonas campestris pv. cyamopsidis)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 데스모디이(Xanthomonas axonopodis pv. desmodii)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 데스모디이(Xanthomonas campestris pv. desmodii)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 데스모디이강게티시(Xanthomonas axonopodis pv. desmodiigangetici)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 데스모디이강게티시(Xanthomonas campestris pv. desmodiigangetici)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 데스모디일락시플로리(Xanthomonas axonopodis pv. desmodiilaxiflori)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 데스모디일락시플로리(Xanthomonas campestris pv. desmodiilaxiflori)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 데스모디이로툰디폴리이(Xanthomonas axonopodis pv. desmodiirotundifolii)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 데스모디이로툰디폴리이(Xanthomonas campestris pv. desmodiirotundifolii)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 디에펜바키아에(Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 디에펜바키아에(Xanthomonas campestris pv. dieffenbachiae)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 에리트리나에(Xanthomonas axonopodis pv. erythrinae)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 에리트리나에(Xanthomonas campestris pv. erythrinae)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 파시쿨라리스(Xanthomonas axonopodis pv. fascicularis)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 파시쿨라리(Xanthomonas campestris pv. fasciculari)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 글리시네스(Xanthomonas axonopodis pv. glycines)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 글리시네스(Xanthomonas campestris pv. glycines)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 카야에(Xanthomonas axonopodis pv. khayae)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 카야에(Xanthomonas campestris pv. khayae)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 레스페데자에(Xanthomonas axonopodis pv. lespedezae)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 레스페데자에(Xanthomonas campestris pv. lespedezae)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 마쿨리폴리이가르데니아에(Xanthomonas axonopodis pv. maculifoliigardeniae)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 마쿨리폴리이가르데니아에(Xanthomonas campestris pv. maculifoliigardeniae)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 말바세아룸(Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum)(=잔토모나스 시트리 아종 말바세아룸(Xanthomonas citri subsp. malvacearum)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 마니호티스(Xanthomonas axonopodis pv. manihotis)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 마니호티스(Xanthomonas campestris pv. manihotis)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 마르티니이콜라(Xanthomonas axonopodis pv. martyniicola)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 마르티니이콜라(Xanthomonas campestris pv. martyniicola)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 멜후시이(Xanthomonas axonopodis pv. melhusii)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 멜후시이(Xanthomonas campestris pv. melhusii)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 나카타에코르코리(Xanthomonas axonopodis pv. nakataecorchori)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 나카타에코르코리(Xanthomonas campestris pv. nakataecorchori)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 파시플로라에(Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 파시플로라에(Xanthomonas campestris pv. passiflorae)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 파텔리이(Xanthomonas axonopodis pv. patelii)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 파텔리이(Xanthomonas campestris pv. patelii)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 페달리이(Xanthomonas axonopodis pv. pedalii)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 페달리이(Xanthomonas campestris pv. pedalii)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 파세올리(Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 파세올리(Xanthomonas campestris pv. phaseoli), 잔토모나스 파세올리(Xanthomonas phaseoli)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 파세올리 변종 푸스칸스(Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli var. fuscans)(= 잔토모나스 푸스칸스), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 필란티(Xanthomonas axonopodis pv. phyllanthi)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 필란티(Xanthomonas campestris pv. phyllanthi)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 피살리디콜라(Xanthomonas axonopodis pv. physalidicola)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 피살리디콜라(Xanthomonas campestris pv. physalidicola)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 포인세티이콜라(Xanthomonas axonopodis pv. poinsettiicola)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 포인세티이콜라(Xanthomonas campestris pv. poinsettiicola)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 푸니카에(Xanthomonas axonopodis pv. punicae)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 푸니카에(Xanthomonas campestris pv. punicae)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 린코시아에(Xanthomonas axonopodis pv. rhynchosiae)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 린코시아에(Xanthomonas campestris pv. rhynchosiae)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 리시니(Xanthomonas axonopodis pv. ricini)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 리시니(Xanthomonas campestris pv. ricini)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 세스바니아에(Xanthomonas axonopodis pv. sesbaniae)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 세스바니아에(Xanthomonas campestris pv. sesbaniae)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 타마린디(Xanthomonas axonopodis pv. tamarindi)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 타마린디(Xanthomonas campestris pv. tamarindi)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 바스쿨로룸(Xanthomonas axonopodis pv. vasculorum)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 바스쿨로룸(Xanthomonas campestris pv. vasculorum)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 베시카토리아(Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 베시카토리아(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria), 잔토모나스 베시카토리아), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 비그나에라디아타에(Xanthomonas axonopodis pv. vignaeradiatae)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 비그나에라디아타에(Xanthomonas campestris pv. vignaeradiatae)), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 비그니콜라(Xanthomonas axonopodis pv. vignicola)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 비그니콜라(Xanthomonas campestris pv. vignicola)) 또는 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 비티안스(Xanthomonas axonopodis pv. vitians)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 비티안스(Xanthomonas campestris pv. vitians))를 포함하는 잔토모나스 악소노포디스 아종이다.
일부 경우에, 박테리아는 잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 무사세아룸(Xanthomonas campestris pv. musacearum), 잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 프루니(Xanthomonas campestris pv. pruni)(=잔토모나스 아르보리콜라 pv. 프루니(Xanthomonas arboricola pv. pruni)) 또는 잔토모나스 프라가리아에(Xanthomonas fragariae)이다.
일부 경우에, 박테리아는 예를 들어 잔토모나스 트란스루센스 병원체변종 아르레나테리(Xanthomonas translucens pv. arrhenatheri)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 아르레나테리(Xanthomonas campestris pv. arrhenatheri)), 잔토모나스 트란스루센스 병원체변종 세레알리스(Xanthomonas translucens pv. cerealis)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 세레알리스(Xanthomonas campestris pv. cerealis)), 잔토모나스 트란스루센스 병원체변종 그라미니스(Xanthomonas translucens pv. graminis)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 그라미니스(Xanthomonas campestris pv. graminis)), 잔토모나스 트란스루센스 병원체변종 플레이(Xanthomonas translucens pv. phlei)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 플레이(Xanthomonas campestris pv. phlei)), 잔토모나스 트란스루센스 병원체변종 플레이프라텐시스(Xanthomonas translucens pv. phleipratensis)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 플레이프라텐시스(Xanthomonas campestris pv. phleipratensis)), 잔토모나스 트란스루센스 병원체변종 포아에(Xanthomonas translucens pv. poae)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 포아에(Xanthomonas campestris pv. poae)), 잔토모나스 트란스루센스 병원체변종 세칼리스(Xanthomonas translucens pv. secalis)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 세칼리스(Xanthomonas campestris pv. secalis)), 잔토모나스 트란스루센스 병원체변종 트란스루센스(Xanthomonas translucens pv. translucens)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 트란스루센스(Xanthomonas campestris pv. translucens)) 또는 잔토모나스 트란스루센스 병원체변종 운둘로사(Xanthomonas translucens pv. undulosa)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 운둘로사(Xanthomonas campestris pv. undulosa))를 포함하는 잔토모나스 트란스루센스(Xanthomonas translucens) 아종(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 호르데이(Xanthomonas campestris pv. hordei))이다.
일부 경우에, 박테리아는 잔토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae) 아종, 잔토모나스 오리자에 병원체변종 오리자에(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 오리자에(Xanthomonas campestris pv. oryzae)) 또는 잔토모나스 오리자에 병원체변종 오리지콜라(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)(=잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종 오리지콜라(Xanthomonas campestris pv. oryzicola))이다.
일부 경우에, 박테리아는 잔토모나다세아에 과로부터의 자일렐라 파스티디오사(Xylella fastidiosa)이다.
표 7은 본원에 기재된 PMP 조성물 및 관련 방법을 사용하여 치료되거나 예방될 수 있는 박테리아 및 그와 관련된 질병의 추가의 예를 보여준다.
[표 7]
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iii. 곤충
PMP 조성물 및 관련 방법은 예를 들어, 식물에서 곤충 침입을 예방하거나 치료하기 위하여 곤충의 건강을 감소시키기 위해 유용할 수 있다. 용어 "곤충"은 임의의 발생 단계, 즉, 미성숙 및 성체 곤충의 절지동물문 및 곤충강 또는 거미강에 속하는 임의의 유기체를 포함한다. 곤충을 PMP 조성물과 접촉시킴으로써 PMP 조성물을 곤충에 운반하기 위한 방법이 포함된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 당해 방법은 식물을 PMP 조성물과 접촉시킴으로써 생물농약을 곤충 침입의 위험이 있거나, 또는 이를 갖는 식물에 운반하는 단계를 포함한다.
PMP 조성물 및 관련 방법은 하기의 목에 속하는 곤충을 포함하는 곤충에 의한 침입을 예방하거나, 그것이 침입된 식물을 치료하기에 적합하다: 진드기목, 거미목, 이목(Anoplura), 딱정벌레목, 톡토기목, 집게벌레목, 바퀴목, 좀붙이목, 파리목(예를 들어, 점박이-날개 초파리(spotted-wing Drosophila)), 흰개미붙이목, 하루살이목, 귀뚜라미붙이목, 매미목(예를 들어, 진딧물, 온실가루이), 동시아목, 막시목, 흰개미목, 인시목, 털이목, 밑들이목, 풀잠자리목, 잠자리목, 메뚜기목, 대벌레목, 강도래목, 낫발이목, 다듬이벌레목, 벼룩목, 이목(Siphunculata), 좀목, 부채벌레목, 총채벌레목, 날도래목 또는 민벌레목.
일부 경우에, 곤충은 거미강으로부터의 것, 예를 들어 아카루스(Acarus) 종, 아세리아 쉘도니(Aceria sheldoni), 아쿨롭스(Aculops) 종, 아쿨루스(Aculus) 종, 암블리옴마(Amblyomma) 종, 암피테트라니쿠스 비엔넨시스(Amphitetranychus viennensis), 아르가스(Argas) 종, 부필루스(Boophilus) 종, 브레비팔푸스(Brevipalpus) 종, 브리오비아 그라미눔(Bryobia graminum), 브리오비아 프라에티오사(Bryobia praetiosa), 센트루로이데스(Centruroides) 종, 코리오프테스(Chorioptes) 종, 더마니수스 갈리나에(Dermanyssus gallinae), 더마토파고이데스 프테로니시누스(Dermatophagoides pteronyssinus), 더마토파고이데스 파리나에(Dermatophagoides farinae), 더마센토르(Dermacentor) 종, 에오테트라니쿠스(Eotetranychus) 종, 에피트리메루스 피리(Epitrimerus pyri), 유테트라니쿠스(Eutetranychus) 종, 에리오피에스(Eriophyes) 종, 글리시파구스 도메스티쿠스(Glycyphagus domesticus), 할로티데우스 데스트룩토르(Halotydeus destructor), 헤미타르소네무스(Hemitarsonemus) 종, 히알롬마(Hyalomma) 종, 익소데스(Ixodes) 종, 라트로덱투스(Latrodectus) 종, 록소셀레스(Loxosceles) 종, 메타테트라니쿠스(Metatetranychus) 종, 뉴트롬비쿨라 아우툼날리스(Neutrombicula autumnalis), 누페르사(Nuphersa) 종, 올리고니쿠스(Oligonychus) 종, 오르니토도루스(Ornithodorus) 종, 오르니토니수스(Ornithonyssus) 종, 파노니쿠스(Panonychus) 종, 필로코프트루타 올레이보라(Phyllocoptruta oleivora), 폴리파고타르소네무스 라투스(Polyphagotarsonemus latus), 프소로프테스(Psoroptes) 종, 리피세팔루스(Rhipicephalus) 종, 리조글리푸스(Rhizoglyphus) 종, 사르코프테스(Sarcoptes) 종, 스콜피오 마우루스(Scorpio maurus), 스테네오타르소네무스(Steneotarsonemus) 종, 스테네오타르소네무스 스핀키(Steneotarsonemus spinki), 타르소네무스(Tarsonemus) 종, 테트라니쿠스(Tetranychus) 종, 트롬비쿨라 알프레드두게시(Trombicula alfreddugesi), 바에조비스(Vaejovis) 종, 바사테스 리코페르시시(Vasates lycopersici)이다.
일부 경우에, 곤충은 순각강으로부터의 것, 예를 들어 게오필루스(Geophilus) 종 또는 스쿠티게라(Scutigera) 종이다.
일부 경우에, 곤충은 톡토기목으로부터의 것, 예를 들어 오니키우루스 아르마투스(Onychiurus armatus)이다.
일부 경우에, 곤충은 배각강으로부터의 것, 예를 들어 블라니울루스 구툴라투스(Blaniulus guttulatus); 곤충강으로부터의 것, 예를 들어 바퀴목으로부터의 것, 예를 들어 블라텔라 아사히나이(Blattella asahinai), 블라텔라 게르마니카(Blattella germanica), 블라타 오리엔탈리스(Blatta orientalis), 류코파에아 마데라에(Leucophaea maderae), 판클로라(Panchlora) 종, 파르코블라타(Parcoblatta) 종, 페리플라네타(Periplaneta) 종, 수펠라 롱기팔파(Supella longipalpa)이다.
일부 경우에, 곤충은 딱정벌레목으로부터의 것, 예를 들어 아칼림마 비타툼(Acalymma vittatum), 아칸토셀리데스 오브텍투스(Acanthoscelides obtectus), 아도레투스(Adoretus) 종, 아겔라스티카 알니(Agelastica alni), 아그리오테스(Agriotes) 종, 알피토비우스 디아페리누스(Alphitobius diaperinus), 암피말론 솔스티티알리스(Amphimallon solstitialis), 아노비움 푼크타툼(Anobium punctatum), 아노플로포라(Anoplophora) 종, 안토노무스(Anthonomus) 종, 안트레누스(Anthrenus) 종, 아피온(Apion) 종, 아포고니아(Apogonia) 종, 아토마리아(Atomaria) 종, 아타게누스(Attagenus) 종, 브루키디우스 오브텍투스(Bruchidius obtectus), 브루쿠스(Bruchus) 종, 카시다(Cassida) 종, 세로토마 트리푸르카타(Cerotoma trifurcata), 세우토린쿠스(Ceutorrhynchus) 종, 카에톡네마(Chaetocnema) 종, 클레오누스 멘디쿠스(Cleonus mendicus), 코노데루스(Conoderus) 종, 코스모폴리테스(Cosmopolites) 종, 코스텔리트라 제알란디카(Costelytra zealandica), 크테니세라(Ctenicera) 종, 쿠르쿨리오(Curculio) 종, 크립토레스테스 페루기네우스(Cryptolestes ferrugineus), 크립토린쿠스 라파티(Cryptorhynchus lapathi), 실린드로코프투루스(Cylindrocopturus) 종, 데르메스테스(Dermestes) 종, 디아브로티카(Diabrotica) 종, 디코크로시스(Dichocrocis) 종, 디클라디스파 아르미게라(Dicladispa armigera), 딜로보데루스(Diloboderus) 종, 에필라크나(Epilachna) 종, 에피트릭스(Epitrix) 종, 파우스티누스(Faustinus) 종, 기비움 프실로이데스(Gibbium psylloides), 그나토세루스 코르누투스(Gnathocerus cornutus), 헬룰라 운달리스(Hellula undalis), 헤테로니쿠스 아라토르(Heteronychus arator), 헤테로닉스(Heteronyx) 종, 힐라모르파 엘레간스(Hylamorpha elegans), 힐로트루페스 바줄루스(Hylotrupes bajulus), 히페라 포스티카(Hypera postica), 히포메세스 스쿠아모수스(Hypomeces squamosus), 히포테네무스(Hypothenemus) 종, 라크노스테르나 콘산구이네아(Lachnosterna consanguinea), 라시오더마 세리코르네(Lasioderma serricorne), 라테티쿠스 오리자에(Latheticus oryzae), 라트리디우스(Lathridius) 종, 레마(Lema) 종, 렙티노타르사 데셈리네아타(Leptinotarsa decemlineata), 류코프테라(Leucoptera) 종, 리소로프트루스 오리조필루스(Lissorhoptrus oryzophilus), 릭수스(Lixus) 종, 루페로데스(Luperodes) 종, 릭투스(Lyctus) 종, 메가셀리스(Megascelis) 종, 멜라노투스(Melanotus) 종, 멜리게테스 아에네우스(Meligethes aeneus), 멜로론타(Melolontha) 종, 미그돌루스(Migdolus) 종, 모노카무스(Monochamus) 종, 나우팍투스 크산토그라푸스(Naupactus xanthographus), 네크로비아(Necrobia) 종, 닙투스 홀로레우쿠스(Niptus hololeucus), 오릭테스 리노세로스(Oryctes rhinoceros), 오리자에필루스 수리나멘시스(Oryzaephilus surinamensis), 오리자파구스 오리자에(Oryzaphagus oryzae), 오티오린쿠스(Otiorrhynchus) 종, 옥시세토니아 주쿤다(Oxycetonia jucunda), 파에돈 코클레아리아에(Phaedon cochleariae), 필로파가(Phyllophaga) 종, 필로파가 헬레리(Phyllophaga helleri), 필로트레타(Phyllotreta) 종, 포필리아 자포니카(Popillia japonica), 프렘노트리페스(Premnotrypes) 종, 프로스테파누스 트룬카투스(Prostephanus truncatus), 프실리오데스(Psylliodes) 종, 프티누스(Ptinus) 종, 리조비우스 벤트랄리스(Rhizobius ventralis), 리조페르타 도미니카(Rhizopertha dominica), 시토필루스(Sitophilus) 종, 시토필루스 오리자에(Sitophilus oryzae), 스페노포루스(Sphenophorus) 종, 스테고비움 파니세움(Stegobium paniceum), 스테르네쿠스(Sternechus) 종, 심필레테스(Symphyletes) 종, 타니메쿠스(Tanymecus) 종, 테네브리오 몰리토르(Tenebrio molitor), 테네브리오이데스 마우레타니쿠스(Tenebrioides mauretanicus), 트리볼리움(Tribolium) 종, 트로고더마(Trogoderma) 종, 티키우스(Tychius) 종, 크실로트레쿠스(Xylotrechus) 종, 자브루스(Zabrus) 종이다.
일부 경우에, 곤충은 파리목으로부터의 것, 예를 들어 아에데스(Aedes) 종, 아그로미자(Agromyza) 종, 아나스트레파(Anastrepha) 종, 아노펠레스(Anopheles) 종, 아스폰딜리아(Asphondylia) 종, 박트로세라(Bactrocera) 종, 비비오 호르툴라누스(Bibio hortulanus), 칼리포라 에리트로세팔라(Calliphora erythrocephala), 칼리포라 비시나(Calliphora vicina), 세라티티스 카피타타(Ceratitis capitata), 키로노무스(Chironomus) 종, 크리소미이아(Chrysomyia) 종, 크리솝스(Chrysops) 종, 크리소조나 플루비알리스(Chrysozona pluvialis), 코클리오미이아(Cochliomyia) 종, 콘타리니아(Contarinia) 종, 코르딜로비아 안트로포파가(Cordylobia anthropophaga), 크리코토푸스 실베스트리스(Cricotopus sylvestris), 쿨렉스(Culex) 종, 쿨리코이데스(Culicoides) 종, 쿨리세타(Culiseta) 종, 큐테레브라(Cuterebra) 종, 다쿠스 올레아에(Dacus oleae), 다시네우라(Dasyneura) 종, 델리아(Delia) 종, 더마토비아 호미니스(Dermatobia hominis), 드로소필라(Drosophila) 종, 에키녹네무스(Echinocnemus) 종, 판니아(Fannia) 종, 가스테로필루스(Gasterophilus) 종, 글로시나(Glossina) 종, 헤마토포타(Haematopota) 종, 히드렐리아(Hydrellia) 종, 히드렐리아 그리세올라(Hydrellia griseola), 힐레미아(Hylemya) 종, 히포보스카(Hippobosca) 종, 히포더마(Hypoderma) 종, 리리오미자(Liriomyza) 종, 루실리아(Lucilia) 종, 루트조미이아(Lutzomyia) 종, 만소니아(Mansonia) 종, 무스카(Musca) 종, 오에스트루스(Oestrus) 종, 오시넬라 프리트(Oscinella frit), 파라타니타르수스(Paratanytarsus) 종, 파라라우테르보르니엘라 서브신크타(Paralauterborniella subcincta), 페고미이아(Pegomyia) 종, 플레보토무스(Phlebotomus) 종, 포르비아(Phorbia) 종, 포르미아(Phormia) 종, 피오필라 카세이(Piophila casei), 프로디플로시스(Prodiplosis) 종, 프실라 로사에(Psila rosae), 라골레티스(Rhagoletis) 종, 사르코파가(Sarcophaga) 종, 시물리움(Simulium) 종, 스토목시스(Stomoxys) 종, 타바누스(Tabanus) 종, 테타놉스(Tetanops) 종 또는 티풀라(Tipula) 종이다.
일부 경우에, 곤충은 노린재목으로부터의 것, 예를 들어 아나사 트리스티스(Anasa tristis), 안테스티옵시스(Antestiopsis) 종, 보이세아(Boisea) 종, 블리수스(Blissus) 종, 칼로코리스(Calocoris) 종, 캄필롬마 리비다(Campylomma livida), 카벨레리우스(Cavelerius) 종, 시멕스(Cimex) 종, 콜라리아(Collaria) 종, 크레온티아데스 딜루투스(Creontiades dilutus), 다시누스 피페리스(Dasynus piperis), 디켈롭스 푸르카투스(Dichelops furcatus), 디코노코리스 휴에티(Diconocoris hewetti), 디스데르쿠스(Dysdercus) 종, 유쉬스투스(Euschistus) 종, 유리가스터(Eurygaster) 종, 헬리오펠티스(Heliopeltis) 종, 호르시아스 노빌렐루스(Horcias nobilellus), 렙토코리사(Leptocorisa) 종, 렙토코리사 바리코르니스(Leptocorisa varicornis), 렙토글로수스 필로푸스(Leptoglossus phyllopus), 리구스(Lygus) 종, 마크로페스 엑스카바투스(Macropes excavatus), 미리다에(Miridae), 모날로니온 아트라툼(Monalonion atratum), 네자라(Nezara) 종, 오에발루스(Oebalus) 종, 펜토미다에(Pentomidae), 피에스마 쿼드라타(Piesma quadrata), 피에조도루스(Piezodorus) 종, 프살루스(Psallus) 종, 슈다시스타 페르세아(Pseudacysta persea), 로드니우스(Rhodnius) 종, 살베르겔라 신굴라리스(Sahlbergella singularis), 스캅토코리스 카스타네아(Scaptocoris castanea), 스코티노포라(Scotinophora) 종, 스테파니티스 나쉬(Stephanitis nashi), 티브라카(Tibraca) 종 또는 트리아토마(Triatoma) 종이다.
일부 경우에 곤충은 매미목으로부터의 것, 예를 들어 아시지아 아카시아에바일레야나에(Acizzia acaciaebaileyanae), 아시지아 도도나에아에(Acizzia dodonaeae), 아시지아 운카토이데스(Acizzia uncatoides), 아크리다 투리타(Acrida turrita), 아시르토시폰(Acyrthosipon) 종, 아크로고니아(Acrogonia) 종, 아에네올라미아(Aeneolamia) 종, 아고노세나(Agonoscena) 종, 알레이로데스 프롤레텔라(Aleyrodes proletella), 알레우롤로부스 바로덴시스(Aleurolobus barodensis), 알레우로트릭수스 플록코수스(Aleurothrixus floccosus), 알로카리다라 말라이옌시스(Allocaridara malayensis), 암라스카(Amrasca) 종, 아누라피스 카르두이(Anuraphis cardui), 아오니디엘라(Aonidiella) 종, 아파노스티그마 피리(Aphanostigma piri), 아피스(Aphis) 종, 아르보리디아 아피칼리스(Arboridia apicalis), 아리타이닐라(Arytainilla) 종, 아스피디엘라(Aspidiella) 종, 아스피디오투스(Aspidiotus) 종, 아타누스(Atanus) 종, 아울라코르툼 솔라니(Aulacorthum solani), 베미시아 타바시(Bemisia tabaci), 블라스토프실라 옥시덴탈리스(Blastopsylla occidentalis), 보레이오글리카스피스 멜라레우카에(Boreioglycaspis melaleucae), 브라키카우두스 헬리크리시(Brachycaudus helichrysi), 브라키콜루스(Brachycolus) 종, 브레비코리네 브라시카에(Brevicoryne brassicae), 카코프실라(Cacopsylla) 종, 칼리기포나 마르기나타(Calligypona marginata), 카르네오세팔라 풀기다(Carneocephala fulgida), 세라토바쿠나 라니게라(Ceratovacuna lanigera), 세르코피다에(Cercopidae), 세로플라스테스(Ceroplastes) 종, 카에토시폰 프라가에폴리이(Chaetosiphon fragaefolii), 키오나스피스 테갈렌시스(Chionaspis tegalensis), 클로리타 오누키이(Chlorita onukii), 콘드라크리스 로세아(Chondracris rosea), 크로마피스 주글란디콜라(Chromaphis juglandicola), 크리솜팔루스 피쿠스(Chrysomphalus ficus), 시카둘리나 음빌라(Cicadulina mbila), 코코미틸루스 할리(Coccomytilus halli), 코쿠스(Coccus) 종, 크립토미주스 리비스(Cryptomyzus ribis), 크립토네오사(Cryptoneossa) 종, 크테나리타이나(Ctenarytaina) 종, 달불루스(Dalbulus) 종, 디알레우로데스 시트리(Dialeurodes citri), 디아포리나 시트리(Diaphorina citri), 디아스피스(Diaspis) 종, 드로시카(Drosicha) 종, 디사피스(Dysaphis) 종, 디스미코쿠스(Dysmicoccus) 종, 엠포아스카(Empoasca) 종, 에리오소마(Eriosoma) 종, 에리트로네우라(Erythroneura) 종, 유칼립톨리마(Eucalyptolyma) 종, 유필루라(Euphyllura) 종, 유셀리스 빌로바투스(Euscelis bilobatus), 페리시아(Ferrisia) 종, 게오코쿠스 코페아에(Geococcus coffeae), 글리카스피스(Glycaspis) 종, 헤테로프실라 쿠바나(Heteropsylla cubana), 헤테로프실라 스피눌로사(Heteropsylla spinulosa), 호말로디스카 코아굴라타(Homalodisca coagulata), 히알로프테루스 아룬디니스(Hyalopterus arundinis), 이세리아(Icerya) 종, 이디오세루스(Idiocerus) 종, 이디오스코푸스(Idioscopus) 종, 라오델팍스 스트리아텔루스(Laodelphax striatellus), 레카니움(Lecanium) 종, 레피도사페스(Lepidosaphes) 종, 리파피스 에리시미(Lipaphis erysimi), 마크로시품(Macrosiphum) 종, 마크로스텔레스 파시프론스(Macrosteles facifrons), 마하나르바(Mahanarva) 종, 멜라나피스 사카리(Melanaphis sacchari), 메트칼피엘라(Metcalfiella) 종, 메토폴로피움 디로둠(Metopolophium dirhodum), 모넬리아 코스탈리스(Monellia costalis), 모넬리옵시스 페카니스(Monelliopsis pecanis), 미주스(Myzus) 종, 나소노비아 리비스니그리(Nasonovia ribisnigri), 네포테틱스(Nephotettix) 종, 네티고니클라 스펙트라(Nettigoniclla spectra), 닐라파르바타 루겐스(Nilaparvata lugens), 온코메토피아(Oncometopia) 종, 오르테지아 프라엘론가(Orthezia praelonga), 옥시아 키넨시스(Oxya chinensis), 파키프실라(Pachypsylla) 종, 파라베미시아 미리카에(Parabemisia myricae), 파라트리오자(Paratrioza) 종, 파를라토리아(Parlatoria) 종, 펨피구스(Pemphigus) 종, 페레그리누스 마이디스(Peregrinus maidis), 페나코쿠스(Phenacoccus) 종, 플로에오미주스 파세리니이(Phloeomyzus passerinii), 포로돈 휴물리(Phorodon humuli), 필록세라(Phylloxera) 종, 핀나스피스 아스피디스트라에(Pinnaspis aspidistrae), 플라노코쿠스(Planococcus) 종, 프로소피도프실라 플라바(Prosopidopsylla flava), 프로토풀비나리아 피리포르미스(Protopulvinaria pyriformis), 슈다울라카스피스 펜타고나(Pseudaulacaspis pentagona), 슈도코쿠스(Pseudococcus) 종, 프실롭시스(Psyllopsis) 종, 프실라(Psylla) 종, 프테로말루스(Pteromalus) 종, 피릴라(Pyrilla) 종, 쿼드라스피디오투스(Quadraspidiotus) 종, 퀘사다 기가스(Quesada gigas), 라스트로코쿠스(Rastrococcus) 종, 로팔로시품(Rhopalosiphum) 종, 사이세티아(Saissetia) 종, 스카포이데우스 티타누스(Scaphoideus titanus), 쉬자피스 그라미눔(Schizaphis graminum), 셀레나스피두스 아르티쿨라투스(Selenaspidus articulatus), 소가타(Sogata) 종, 소가텔라 푸르시페라(Sogatella furcifera), 소가토데스(Sogatodes) 종, 스틱토세팔라 페스티나(Stictocephala festina), 시포니누스 필리레아에(Siphoninus phillyreae), 테날라파라 말라이옌시스(Tenalaphara malayensis), 테트라고노세펠라(Tetragonocephela) 종, 티노칼리스 카리아에폴리아에(Tinocallis caryaefoliae), 토마스피스(Tomaspis) 종, 톡소프테라(Toxoptera) 종, 트리알레우로데스 바포라리오룸(Trialeurodes vaporariorum), 트리오자(Trioza) 종, 티플로시바(Typhlocyba) 종, 우나스피스(Unaspis) 종, 비테우스 비티폴리이(Viteus vitifolii), 지기나(Zygina) 종; 막시목으로부터의 것, 예를 들어 아크로미르멕스(Acromyrmex) 종, 아탈리아(Athalia) 종, 아타(Atta) 종, 디프리온(Diprion) 종, 호플로캄파(Hoplocampa) 종, 라시우스(Lasius) 종, 모노모리움 파라오니스(Monomorium pharaonis), 시렉스(Sirex) 종, 솔레놉시스 인빅타(Solenopsis invicta), 타피노마(Tapinoma) 종, 우로세루스(Urocerus) 종, 베스파 종(Vespa) 또는 제리스(Xeris) 종이다.
일부 경우에, 곤충은 등각목으로부터의 것, 예를 들어 아르마딜리디움 불가레(Armadillidium vulgare), 오니스쿠스 아셀루스(Oniscus asellus) 또는 포르셀리오 스카베르(Porcellio scaber)이다.
일부 경우에, 곤충은 흰개미목으로부터의 것, 예를 들어 코프토테르메스(Coptotermes) 종, 코르니테르메스 쿠물란스(Cornitermes cumulans), 크립토테르메스(Cryptotermes) 종, 인시시테르메스(Incisitermes) 종, 미크로테르메스 오베시(Microtermes obesi), 오돈토테르메스(Odontotermes) 종 또는 레티쿨리테르메스(Reticulitermes) 종이다.
일부 경우에, 곤충은 인시목으로부터의 것, 예를 들어 아크로이아 그리셀라(Achroia grisella), 아크로닉타 메이저(Acronicta major), 아독소피에스(Adoxophyes) 종, 아에디아 류코멜라스(Aedia leucomelas), 아그로티스(Agrotis) 종, 알라바마(Alabama) 종, 아미엘로이스 트란시텔라(Amyelois transitella), 아나르시아(Anarsia) 종, 안티카르시아(Anticarsia) 종, 아르기로플로세(Argyroploce) 종, 바라트라 브라시카에(Barathra brassicae), 보르보 신나라(Borbo cinnara), 부쿨라트릭스 투르베리엘라(Bucculatrix thurberiella), 부팔루스 피니아리우스(Bupalus piniarius), 부세올라(Busseola) 종, 카코에시아(Cacoecia) 종, 칼로프틸리아 테이보라(Caloptilia theivora), 카푸아 레티쿨라나(Capua reticulana), 카르포카프사 포모넬라(Carpocapsa pomonella), 카르포시나 니포넨시스(Carposina niponensis), 케이마토비아 브루마타(Cheimatobia brumata), 킬로(Chilo) 종, 코리스토네우라(Choristoneura) 종, 클리시아 암비구엘라(Clysia ambiguella), 크나팔로세루스(Cnaphalocerus) 종, 크나팔로크로시스 메디날리스(Cnaphalocrocis medinalis), 크네파시아(Cnephasia) 종, 코노포모르파(Conopomorpha) 종, 코노트라켈루스(Conotrachelus) 종, 코피타르시아(Copitarsia) 종, 시디아(Cydia) 종, 달라카 녹투이데스(Dalaca noctuides), 디아파니아(Diaphania) 종, 디아트라에아 사카랄리스(Diatraea saccharalis), 에아리아스(Earias) 종, 엑디톨로파 아우란티움(Ecdytolopha aurantium), 엘라스모팔푸스 리그노셀루스(Elasmopalpus lignosellus), 엘다나 사카리나(Eldana saccharina), 에페스티아(Ephestia) 종, 에피노티아(Epinotia) 종, 에피피아스 포스트비타나(Epiphyas postvittana), 에티엘라(Etiella) 종, 율리아(Eulia) 종, 유포에실리아 암비구엘라(Eupoecilia ambiguella), 유프록티스(Euproctis) 종, 육소아(Euxoa) 종, 펠티아(Feltia) 종, 갈레리아 멜로넬라(Galleria mellonella), 그라실라리아(Gracillaria) 종, 그라폴리타(Grapholitha) 종, 헤딜렙타(Hedylepta) 종, 헬리코베르파(Helicoverpa) 종, 헬리오티스(Heliothis) 종, 호프만노필라 슈도스프레텔라(Hofmannophila pseudospretella), 호모에오소마(Homoeosoma) 종, 호모나(Homona) 종, 히포노메우타 파델라(Hyponomeuta padella), 카키보리아 플라보파시아타(Kakivoria flavofasciata), 라피그마(Laphygma) 종, 라스페이레시아 몰레스타(Laspeyresia molesta), 류시노데스 오르보날리스(Leucinodes orbonalis), 류코프테라 종, 리토콜레티스(Lithocolletis) 종, 리토파네 안텐나타(Lithophane antennata), 로베시아(Lobesia) 종, 록사그로티스 알비코스타(Loxagrotis albicosta), 리만트리아(Lymantria) 종, 리오네티아(Lyonetia) 종, 말라코소마 뉴스트리아(Malacosoma neustria), 마루카 테스툴랄리스(Maruca testulalis), 맘스트라 브라시카에(Mamstra brassicae), 멜라니티스 레다(Melanitis leda), 모시스(Mocis) 종, 모노피스 오브비엘라(Monopis obviella), 미팀나 세파라타(Mythimna separata), 네마포곤 클로아셀루스(Nemapogon cloacellus), 님풀라(Nymphula) 종, 오이케티쿠스(Oiketicus) 종, 오리아(Oria) 종, 오르타가(Orthaga) 종, 오스트리니아(Ostrinia) 종, 오울레마 오리자에(Oulema oryzae), 파놀리스 플람메아(Panolis flammea), 파르나라(Parnara) 종, 펙티노포라(Pectinophora) 종, 페리류코프테라(Perileucoptera) 종, 프토리마에아(Phthorimaea) 종, 필록니스티스 시트렐라(Phyllocnistis citrella), 필로노릭테르(Phyllonorycter) 종, 피에리스(Pieris) 종, 플라티노타 스툴타나(Platynota stultana), 플로디아 인테르푼크텔라(Plodia interpunctella), 플루시아(Plusia) 종, 플루텔라 크실로스텔라(Plutella xylostella), 프라이스(Prays) 종, 프로데니아(Prodenia) 종, 프로토파르세(Protoparce) 종, 슈달레티아(Pseudaletia) 종, 슈달레티아 우니푼크타(Pseudaletia unipuncta), 슈도플루시아 인클루덴스(Pseudoplusia includens), 피라우스타 누빌랄리스(Pyrausta nubilalis), 라키플루시아 누(Rachiplusia nu), 스코에노비우스(Schoenobius) 종, 시르포파가(Scirpophaga) 종, 시르포파가 인노타타(Scirpophaga innotata), 스코티아 세게툼(Scotia segetum), 세사미아(Sesamia) 종, 세사미아 인페렌스(Sesamia inferens), 스파르가노티스(Sparganothis) 종, 스포도프테라(Spodoptera) 종, 스포도프테라 프라에피카(Spodoptera praefica), 스타트모포다(Stathmopoda) 종, 스토모프테릭스 서브세시벨라(Stomopteryx subsecivella), 시난테돈(Synanthedon) 종, 테시아 솔라니보라(Tecia solanivora), 테르메시아 겜마탈리스(Thermesia gemmatalis), 티네아 클로아셀라(Tinea cloacella), 티네아 펠리오넬라(Tinea pellionella), 티네올라 비셀리엘라(Tineola bisselliella), 토르트릭스(Tortrix) 종, 트리코파가 타페첼라(Trichophaga tapetzella), 트리코플루시아(Trichoplusia) 종, 트리포리자 인세르툴라스(Tryporyza incertulas), 투타 압솔루타(Tuta absoluta) 또는 비라콜라(Virachola) 종이다.
일부 경우에, 곤충은 메뚜기목(Orthoptera 또는 Saltatoria)으로부터의 것, 예를 들어, 아케타 도메스티쿠스(Acheta domesticus), 디크로플루스(Dichroplus) 종, 그릴로탈파(Gryllotalpa) 종, 히에로글리푸스(Hieroglyphus) 종, 로쿠스타(Locusta) 종, 멜라노플루스(Melanoplus) 종 또는 쉬스토세르카 그레가리아(Schistocerca gregaria)이다.
일부 경우에, 곤충은 이목으로부터의 것, 예를 들어 다말리니아(Damalinia) 종, 헤마토피누스(Haematopinus) 종, 리노그나투스(Linognathus) 종, 페디쿨루스(Pediculus) 종, 프티루스 푸비스(Ptirus pubis), 트리코덱테스(Trichodectes) 종이다.
일부 경우에, 곤충은 다듬이벌레목으로부터의 것, 예를 들어 레피나투스(Lepinatus) 종 또는 리포셀리스(Liposcelis) 종이다.
일부 경우에, 곤충은 벼룩목으로부터의 것, 예를 들어 세라토필루스(Ceratophyllus) 종, 크테노세팔리데스(Ctenocephalides) 종, 풀렉스 이리탄스(Pulex irritans), 툰가 페네트란스(Tunga penetrans) 또는 제노프실라 케옵시스(Xenopsylla cheopsis)이다.
일부 경우에, 곤충은 총채벌레목으로부터의 것, 예를 들어 아나포트립스 오브스쿠루스(Anaphothrips obscurus), 발리오트립스 비포르미스(Baliothrips biformis), 드레파노트립스 레우테리(Drepanothrips reuteri), 엔네오트립스 플라벤스(Enneothrips flavens), 프란클리니엘라(Frankliniella) 종, 헬리오트립스(Heliothrips) 종, 헤르시노트립스 페모랄리스(Hercinothrips femoralis), 리피포로트립스 크루엔타투스(Rhipiphorothrips cruentatus), 시르토트립스(Scirtothrips) 종, 타에니오트립스 카르다모미(Taeniothrips cardamomi) 또는 트립스(Thrips) 종이다.
일부 경우에, 곤충은 좀목(=티사누라(Thysanura))으로부터의 것, 예를 들어 크테노레피스마(Ctenolepisma) 종, 레피스마 사카리나(Lepisma saccharina), 레피스모데스 인퀼리누스(Lepismodes inquilinus) 또는 테르모비아 도메스티카(Thermobia domestica)이다.
일부 경우에, 곤충은 결합강, 예를 들어 스쿠티게렐라(Scutigerella) 종이다.
일부 경우에, 곤충은 먼지 응애(tarsonemid mite), 예컨대 피토네무스 팔리두스(Phytonemus pallidus), 폴리파고타소네무스 라투스(Polyphagotarsonemus latus), 타소네무스 빌로바투스(Tarsonemus bilobatus) 등; 유포디드 응애(Eupodid mite), 예컨대 펜탈레우스 에리트로세팔루스(Penthaleus erythrocephalus), 펜탈레우스 메이저(Penthaleus major) 등; 잎 응애(Spider mite), 예컨대 올리고나이쿠스 신카지이(Oligonychus shinkajii), 파노니쿠스 시트리(Panonychus citri), 파노니쿠스 모리(Panonychus mori), 파노니쿠스 울미(Panonychus ulmi), 테트라니쿠스 칸자와이(Tetranychus kanzawai), 테트라니쿠스 우르티카에(Tetranychus urticae) 등; 혹 응애, 예컨대 아카필라 테아바그란스(Acaphylla theavagrans), 아세리아 툴리파에(Aceria tulipae), 아쿨롭스 라이코페르시시(Aculops lycopersici), 아쿨롭스 펠레카시(Aculops pelekassi), 아쿨루스 스클레크텐달리(Aculus schlechtendali), 에리오피에스 키바엔시스(Eriophyes chibaensis), 필로코프트루타 올레이보라(Phyllocoptruta oleivora) 등; 진드기 응애(Acarid mite), 예컨대 리조글라이푸스 로비니(Rhizoglyphus robini), 타이로파구스 푸트레센티아에(Tyrophagus putrescentiae), 타이로파구스 시밀리스(Tyrophagus similis) 등; 봉아 응애, 예컨대 바로아 야코브소니(Varroa jacobsoni), 바로아 데스트럭토르(Varroa destructor) 등; 참진드기과(Ixodides), 예컨대 부필루스 미크로필루스(Boophilus microplus), 리피세팔루스 산구이네우스(Rhipicephalus sanguineus), 해마피살리스 론지코르니스(Haemaphysalis longicornis), 해모피살리스 플라바(Haemophysalis flava), 해모피살리스 캄파눌라타(Haemophysalis campanulata), 익소데스 오바투스(Ixodes ovatus), 딕소데스 퍼술카투스(Ixodes persulcatus), 암블리오마(Amblyomma) 종, 더마센토르(Dermacentor) 종 등; 발톱진드기과(Cheyletidae), 예컨대 케일레티엘라 야스구리(Cheyletiella yasguri), 케일레티엘라 블라케이(Cheyletiella blakei) 등; 모낭진드기과(Demodicidae), 예컨대 데모덱스 카니스(Demodex canis), 데모덱스 카티(Demodex cati) 등; 양진드기과(Psoroptidae), 예컨대 소롭테스 오비스(Psoroptes ovis) 등; 옴진드기과, 예컨대 사코프테스 스카비에이(Sarcoptes scabiei), 노토에드레스 카티(Notoedres cati), 네미도코프테스(Knemidocoptes) 종 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 응애이다.
표 8은 본원에 기재된 PMP 조성물 및 관련 방법을 사용하여 치료되거나 예방될 수 있는 침입을 야기하는 곤충의 추가의 예를 보여준다.
[표 8]
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
iv. 연체동물
PMP 조성물 및 관련 방법은 예를 들어, 식물에서 연체동물 침입을 예방하거나 치료하기 위하여 연체동물의 건강을 감소시키기 위해 유용할 수 있다. 용어 "연체동물"은 연체동물문에 속하는 임의의 유기체를 포함한다. 연체동물을 PMP 조성물과 접촉시킴으로써 PMP 조성물을 연체동물에 운반하기 위한 방법이 포함된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 당해 방법은 식물을 PMP 조성물과 접촉시킴으로써 생물농약을 연체동물 침입의 위험이 있거나, 또는 이를 갖는 식물에 운반하는 단계를 포함한다.
PMP 조성물 및 관련 방법은 농업 및 원예에서 육생 복족류(예를 들어, 민달팽이 및 달팽이)에 의한 침입을 예방하거나 치료하기에 적합하다. 그들은 농업 및 원예 작물에서 대부분 잡식성 유해물로서 발생하는 모든 육생 민달팽이 및 달팽이를 포함한다. 예를 들어, 연체동물은 아카티니대(Achatinidae), 아그리올리마시대(Agriolimacidae), 앰풀라리이대(Ampullariidae), 아리오니대(Arionidae), 브라다이바에니대(Bradybaenidae), 헬리시대(Helicidae), 하이드로미이대(Hydromiidae), 라임나에이대(Lymnaeidae), 밀라시대(Milacidae), 유로사이클리대(Urocyclidae) 또는 베로니켈라(Veronicellsidae) 과에 속할 수 있다.
예를 들어, 일부 경우에, 연체동물은 아카티나(Achatina) 종, 아카카티나(Archachatina) 종(예를 들어, 아카카티나 마르기나타(Archachatina marginata)), 아그리올리막스(Agriolimax) 종, 아리온(Arion) 종(예를 들어, 아리온 아테르(A. ater), 아리온 써쿰스크립투스(A. circumscriptus), 아리온 디스틴크투스(A. distinctus), 아리온 파시아투스(A. fasciatus), 아리온 호르텐시스(A. hortensis), 아리온 인터메디우스(A. intermedius), 아리온 루푸스(A. rufus), 아리온 수브푸스쿠스(A. subfuscus), 아리온 실바티쿠스(A. silvaticus), 아리온 루시타니쿠스(A. lusitanicus)), 아를리오막스(Arliomax) 종(예를 들어, 아를리오막스 콜룸비아누스(Ariolimax columbianus)), 바이옴팔라리아(Biomphalaria) 종, 브라다이바에나(Bradybaena) 종(예를 들어, 브라다이바에나 프루티쿰(B. fruticum)), 불리누스(Bulinus) 종, 칸타레우스(Cantareus) 종(예를 들어, 칸타레우스 아스페르세스(C. asperses)), 세파에아(Cepaea) 종(예를 들어, 세파에아 호르텐시스(C. hortensis), 세파에아 네모랄리스(C. nemoralis), 세파에아 호르텐시스(C. hortensis)), 세르누엘라(Cernuella) 종, 코클리셀라(Cochlicella) 종, 코클로디나(Cochlodina) 종(예를 들어, 코클로디나 라미나타(C. laminata)), 데로세라스(Deroceras) 종(예를 들어, 데로세라스 아그레스티스(D. agrestis), 데로세라스 엠피리코룸(D. empiricorum), 데로세라스 라에베(D. laeve), 데로세라스 파노르니마툼(D. panornimatum), 데로세라스 레티쿨라툼(D. reticulatum)), 디스쿠스(Discus) 종(예를 들어, 디스쿠스 로툰다투스(D. rotundatus)), 유옴팔리아(Euomphalia) 종, 갈바(Galba) 종(예를 들어, 갈바 트룬쿨라타(G. trunculata)), 헬리셀라(Helicella) 종(예를 들어, 헬리셀라 이탈라(H. itala), 헬리셀라 오브비아(H. obvia)), 헬리시고나(Helicigona) 종(예를 들어, 헬리시고나 아르부스토룸(H. arbustorum)), 헬리코디스쿠스(Helicodiscus) 종, 헬릭스(Helix) 종(예를 들어, 헬릭스 아페르타(H. aperta), 헬릭스 아스페르사(H. aspersa), 헬릭스 포마티아(H. pomatia)), 리막스(Limax) 종(예를 들어, 리막스 시네레오니거(L. cinereoniger), 리막스 플라부스(L. flavus), 리막스 마르기나투스(L. marginatus), 리막스 막시무스(L. maximus), 리막스 테넬루스(L. tenellus)), 리미콜라리아(Limicolaria) 종(예를 들어, 리미콜라리아 아우로라(Limicolaria aurora)), 라임나에아(Lymnaea) 종(예를 들어, 라임나에아 스타그날리스(L. stagnalis)), 메소돈(Mesodon) 종(예를 들어, 메손 티로이두스(Meson thyroidus)), 모나데니아(Monadenia) 종(예를 들어, 모나데니아 피델리스(Monadenia fidelis)), 밀락스(Milax) 종(예를 들어, 밀락스 가가테스(M. gagates), 밀락스 마르기나투스(M. marginatus), 밀락스 소웨르비이(M. sowerbyi), 밀락스 부다페스텐시스(M. budapestensis)), 온코멜라니아(Oncomelania) 종, 네오헬릭스(Neohelix) 종(예를 들어, 네오헬릭스 알볼라브리스(Neohelix albolabris)), 오페아스(Opeas) 종, 오탈라(Otala) 종(예를 들어, 오탈라 락테알(Otala lacteal)), 옥실로마(Oxyloma) 종(예를 들어, 옥실로마 페이페리(O. pfeifferi)), 포마세아(Pomacea) 종(예를 들어, 포마세아 카날리쿨라타(P. canaliculata)), 숙시네아(Succinea) 종, 탄도니아(Tandonia) 종(예를 들어, 탄도니아 부다페스텐시스(T. budapestensis), 탄도니아 소웨르비이(T. sowerbyi)), 테바(Theba) 종, 발로니아(Vallonia) 종 또는 조니토이데스(Zonitoides) 종(예를 들어, 조니토이데스 니티두스(Z. nitidus))이다.
v. 선충
PMP 조성물 및 관련 방법은 예를 들어, 식물에서 선충 침입을 예방하거나 치료하기 위하여 선충의 건강을 감소시키기 위해 유용할 수 있다. 용어 "선충"은 선충목에 속하는 임의의 유기체를 포함한다. 선충을 PMP 조성물과 접촉시킴으로써 PMP 조성물을 선충에 운반하기 위한 방법이 포함된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 당해 방법은 식물을 PMP 조성물과 접촉시킴으로써 생물농약을 선충 침입의 위험이 있거나, 또는 이를 갖는 식물에 운반하는 단계를 포함한다.
PMP 조성물 및 관련 방법은 예를 들어, 헬로이도기네(Meloidogyne) 종(뿌리혹), 헤테로데라(Heterodera) 종, 글로보데라(Globodera) 종, 프라틸렌쿠스(Pratylenchus) 종, 헬리코틸렌쿠스(Helicotylenchus) 종, 라도폴루스 시밀리스(Radopholus similis), 디틸렌쿠스 디프사시(Ditylenchus dipsaci), 로틸렌쿨루스 레니포르미스(Rotylenchulus reniformis), 지피네마(Xiphinema) 종, 아펠렌코이데스(Aphelenchoides) 종 및 벨로놀라이무스 론지카우다투스(Belonolaimus longicaudatus)를 포함하는 식물 손상을 야기하는 선충에 의한 침입을 예방하거나 치료하기에 적합하다. 일부 경우에, 선충은 식물 기생성 선충 또는 토양에 거주하는 선충이다. 식물 기생성 선충은 외부기생충, 예컨대 지피네마 종, 론지도루스(Longidorus) 종 및 트리코도루스(Trichodorus) 종; 반기생충 예컨대 타일렌쿨루스(Tylenchulus) 종; 이주성 내부기생충, 예컨대 프라틸렌쿠스 종, 라도폴루스 종 및 스쿠텔로네마(Scutellonema) 종; 정주성 기생충, 예컨대 헤테로데라 종, 글로보데라 종 및 멜로이도기네 종, 및 줄기 및 잎 내부기생충, 예컨대 디틸렌쿠스 종, 아펠렌코이데스 종 및 히르쉬마니엘라(Hirshmaniella) 종을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특히 유해한 뿌리 기생성 토양 선충은, 예컨대 헤테로데라 속 또는 글로보데라 속의 시스트 형성 선충, 및/또는 멜로이도기네 속의 뿌리혹 선충이다. 이들 속의 유해한 종은, 예를 들어 멜로이도기네 인코그나타(Meloidogyne incognata), 헤테로데라 글리시네스(Heterodera glycines)(대두 시스트 선충), 글로보데라 팔리다(Globodera pallida) 및 글로보데라 로스토키엔시스(Globodera rostochiensis)(감자 시스트 선충)이며, 이들 종은 본원에 기재된 PMP 조성물로 효과적으로 방제된다. 그러나, 본원에 기재된 PMP 조성물의 용도는 결코 이들 속 또는 종에 한정되지 않으며, 다른 선충에 동일한 방식으로 확장된다.
본원에 기재된 방법 및 조성물에 의해 표적화될 수 있는 선충의 다른 예는 예를 들어 아글렌쿠스 아그리콜라(Aglenchus agricola), 안구이나 트리티시(Anguina tritici), 아펠렌코이데스 아라키디스(Aphelenchoides arachidis), 아펠렌코이데스 프라가리아(Aphelenchoides fragaria) 및 일반적인 줄기 및 잎 내부기생충 아펠렌코이데스 종, 벨로노라이무스 그라실리스(Belonolaimus gracilis), 벨로노라이무스 롱기카우다투스(Belonolaimus longicaudatus), 벨로노라이무스 노르토니(Belonolaimus nortoni), 부르사펠렌쿠스 코코필루스(Bursaphelenchus cocophilus), 부르사펠렌쿠스 에레무스(Bursaphelenchus eremus), 부르사펠렌쿠스 크실로필루스(Bursaphelenchus xylophilus) 및 일반적인 부르사펠렌쿠스 종, 카코파우루스 페스티스(Cacopaurus pestis), 크리코네멜라 쿠르바타(Criconemella curvata), 크리코네멜라 오노엔시스(Criconemella onoensis), 크리코네멜라 오르나타(Criconemella ornata), 크리코네멜라 루시움(Criconemella rusium), 크리코네멜라 크세노플락스(Criconemella xenoplax)(=메소크리코네마 크세노플락스(Mesocriconema xenoplax)) 및 일반적인 크리코네멜라 종, 크리코네모이데스 페르니아에(Criconemoides ferniae), 크리코네모이데스 오노엔세(Criconemoides onoense), 크리코네모이데스 오르나툼(Criconemoides ornatum) 및 일반적인 크리코네모이데스 종, 디틸렌쿠스 데스트룩토르(Ditylenchus destructor), 디틸렌쿠스 딥사시(Ditylenchus dipsaci), 디틸렌쿠스 미셀리오파구스(Ditylenchus myceliophagus) 및 일반적인 줄기 및 잎 내부기생충 디틸렌쿠스 종, 도리코도루스 헤테로세팔루스(Dolichodorus heterocephalus), 글로보데라 팔리다(Globodera pallida)(=헤테로데라 팔리다(Heterodera pallida)), 글로보데라 로스토키엔시스(Globodera rostochiensis)(감자 시스트 선충), 글로보데라 솔라나세아룸(Globodera solanacearum), 글로보데라 타바쿰(Globodera tabacum), 글로보데라 비르기니아(Globodera virginia) 및 일반적인 정주성 시스트 형성 기생충 글로보데라 종, 헬리코틸렌쿠스 디고니쿠스(Helicotylenchus digonicus), 헬리코틸렌쿠스 디히스테라(Helicotylenchus dihystera), 헬리코틸렌쿠스 에리트리네(Helicotylenchus erythrine), 헬리코틸렌쿠스 물티신크투스(Helicotylenchus multicinctus), 헬리코틸렌쿠스 난누스(Helicotylenchus nannus), 헬리코틸렌쿠스 슈도로부스투스(Helicotylenchus pseudorobustus) 및 일반적인 헬리코틸렌쿠스 종, 헤미크리코네모이데스(Hemicriconemoides), 헤미시클리오포라 아레나리아(Hemicycliophora arenaria), 헤미시클리오포라 누다타(Hemicycliophora nudata), 헤미시클리오포라 파르바나(Hemicycliophora parvana), 헤테로데라 아베나에(Heterodera avenae), 헤테로데라 크루시페라에(Heterodera cruciferae), 헤테로데라 글리시네스(Heterodera glycines)(대두 시스트 선충), 헤테로데라 오리자에(Heterodera oryzae), 헤테로데라 스카크티이(Heterodera schachtii), 헤테로데라 제아에(Heterodera zeae) 및 일반적인 정주성 시스트 형성 기생충 헤테로데라 종, 히르쉬마니엘라 그라실리스(Hirschmaniella gracilis), 히르쉬마니엘라 오리자에(Hirschmaniella oryzae), 히르쉬마니엘라 스피니카우다타(Hirschmaniella spinicaudata) 및 일반적인 줄기 및 잎 내부기생충 히르쉬마니엘라 종, 호플로라이무스 아에깁티이(Hoplolaimus aegyptii), 호플로라이무스 칼리포르니쿠스(Hoplolaimus californicus), 호플로라이무스 콜룸부스(Hoplolaimus columbus), 호플로라이무스 갈레아투스(Hoplolaimus galeatus), 호플로라이무스 인디쿠스(Hoplolaimus indicus), 호플로라이무스 마그니스틸루스(Hoplolaimus magnistylus), 호플로라이무스 파라로부스투스(Hoplolaimus pararobustus), 롱기도루스 아프리카누스(Longidorus africanus), 롱기도루스 브레비안눌라투스(Longidorus breviannulatus), 롱기도루스 엘론가투스(Longidorus elongatus), 롱기도루스 라에비카피타투스(Longidorus laevicapitatus), 롱기도루스 비네아콜라(Longidorus vineacola) 및 일반적인 외부기생충 롱기도루스 종, 멜로이도기네 아크로네아(Meloidogyne acronea), 멜로이도기네 아프리카나(Meloidogyne africana), 멜로이도기네 아레나리아(Meloidogyne arenaria), 멜로이도기네 아레나리아 타메시(Meloidogyne arenaria thamesi), 멜로이도기네 아르티엘라(Meloidogyne artiella), 멜로이도기네 키투디(Meloidogyne chitwoodi), 멜로이도기네 코페이콜라(Meloidogyne coffeicola), 멜로이도기네 에티오피카(Meloidogyne ethiopica), 멜로이도기네 엑시구아(Meloidogyne exigua), 멜로이도기네 팔락스(Meloidogyne fallax), 멜로이도기네 그라미니콜라(Meloidogyne graminicola), 멜로이도기네 그라미니스(Meloidogyne graminis), 멜로이도기네 하플라(Meloidogyne hapla), 멜로이도기네 인코그니타(Meloidogyne incognita), 멜로이도기네 인코그니타 아크리타(Meloidogyne incognita acrita), 멜로이도기네 자바니카(Meloidogyne javanica), 멜로이도기네 키쿠옌시스(Meloidogyne kikuyensis), 멜로이도기네 미노르(Meloidogyne minor), 멜로이도기네 나시(Meloidogyne naasi), 멜로이도기네 파라나엔시스(Meloidogyne paranaensis), 멜로이도기네 타메시(Meloidogyne thamesi) 및 일반적인 정주성 기생충 멜로이도기네 종, 멜로이네마(Meloinema) 종, 나코부스 아베란스(Nacobbus aberrans), 네오틸렌쿠스 비기시(Neotylenchus vigissi), 파라펠렌쿠스 슈도파리에티누스(Paraphelenchus pseudoparietinus), 파라트리코도루스 알리우스(Paratrichodorus allius), 파라트리코도루스 로바투스(Paratrichodorus lobatus), 파라트리코도루스 미노르(Paratrichodorus minor), 파라트리코도루스 나누스(Paratrichodorus nanus), 파라트리코도루스 포로수스(Paratrichodorus porosus), 파라트리코도루스 테레스(Paratrichodorus teres) 및 일반적인 파라트리코도루스 종, 파라틸렌쿠스 하마투스(Paratylenchus hamatus), 파라틸렌쿠스 미누투스(Paratylenchus minutus), 파라틸렌쿠스 프로젝투스(Paratylenchus projectus) 및 일반적인 파라틸렌쿠스 종, 프라틸렌쿠스 아길리스(Pratylenchus agilis), 프라틸렌쿠스 알레니(Pratylenchus alleni), 프라틸렌쿠스 안디누스(Pratylenchus andinus), 프라틸렌쿠스 브라키우루스(Pratylenchus brachyurus), 프라틸렌쿠스 세레알리스(Pratylenchus cerealis), 프라틸렌쿠스 코페아에(Pratylenchus coffeae), 프라틸렌쿠스 크레나투스(Pratylenchus crenatus), 프라틸렌쿠스 델라트레이(Pratylenchus delattrei), 프라틸렌쿠스 기비카우다투스(Pratylenchus giibbicaudatus), 프라틸렌쿠스 구데이이(Pratylenchus goodeyi), 프라틸렌쿠스 하마투스(Pratylenchus hamatus), 프라틸렌쿠스 헥신시수스(Pratylenchus hexinciaus), 프라틸렌쿠스 루시(Pratylenchus loosi), 프라틸렌쿠스 네글렉투스(Pratylenchus neglectus), 프라틸렌쿠스 페네트란스(Pratylenchus penetrans), 프라틸렌쿠스 프라텐시스(Pratylenchus pratensis), 프라틸렌쿠스 스크리브네리(Pratylenchus scribneri), 프라틸렌쿠스 테레스(Pratylenchus teres), 프라틸렌쿠스 토르네이(Pratylenchus thornei), 프라틸렌쿠스 불누스(Pratylenchus vulnus), 프라틸렌쿠스 제아에(Pratylenchus zeae) 및 일반적인 이주성 내부기생충 프라틸렌쿠스 종, 슈도할렌쿠스 미누투스(Pseudohalenchus minutus), 실렌쿠스 마그니덴스(Psilenchus magnidens), 실렌쿠스 투미두스(Psilenchus tumidus), 푼크토데라 칼코엔시스(Punctodera chalcoensis), 퀴니술시우스 아쿠투스(Quinisulcius acutus), 라도폴루스 시트로필루스(Radopholus citrophilus), 라도폴루스 시밀리스(Radopholus similis), 일반적인 이주성 내부기생충 라도폴루스 종, 로틸렌쿨루스 보레알리스(Rotylenchulus borealis), 로틸렌쿨루스 파르부스(Rotylenchulus parvus), 로틸렌쿨루스 레니포르미스(Rotylenchulus reniformis) 및 일반적인 로틸렌쿨루스 종, 로틸렌쿠스 라우렌티누스(Rotylenchus laurentinus), 로틸렌쿠스 마크로도라투스(Rotylenchus macrodoratus), 로틸렌쿠스 로부스투스(Rotylenchus robustus), 로틸렌쿠스 우니포르미스(Rotylenchus uniformis) 및 일반적인 로틸렌쿠스 종, 스쿠텔로네마 브라키우룸(Scutellonema brachyurum), 스쿠텔로네마 브라디스(Scutellonema bradys), 스쿠텔로네마 클라트리카우다툼(Scutellonema clathricaudatum) 및 일반적인 이주성 내부기생충 스쿠텔로네마 종, 수반구이나 라디시올라(Subanguina radiciola), 테틸렌쿠스 니코티아나에(Tetylenchus nicotianae), 트리코도루스 실린드리쿠스(Trichodorus cylindricus), 트리코도루스 미노르(Trichodorus minor), 트리코도루스 프리미티부스(Trichodorus primitivus), 트리코도루스 프록시무스(Trichodorus proximus), 트리코도루스 시밀리스(Trichodorus similis), 트리코도루스 스파르수스(Trichodorus sparsus) 및 일반적인 외부기생충 트리코도루스 종, 틸렌코린쿠스 아그리(Tylenchorhynchus agri), 틸렌코린쿠스 브라시카에(Tylenchorhynchus brassicae), 틸렌코린쿠스 클라루스(Tylenchorhynchus clarus), 틸렌코린쿠스 클레이토니(Tylenchorhynchus claytoni), 틸렌코린쿠스 디기타투스(Tylenchorhynchus digitatus), 틸렌코린쿠스 에브리엔시스(Tylenchorhynchus ebriensis), 틸렌코린쿠스 막시무스(Tylenchorhynchus maximus), 틸렌코린쿠스 누두스(Tylenchorhynchus nudus), 틸렌코린쿠스 불가리스(Tylenchorhynchus vulgaris) 및 일반적인 틸렌코린쿠스 종, 틸렌쿨루스 세미페네트란스(Tylenchulus semipenetrans) 및 일반적인 반기생충 틸렌쿨루스 종, 지피네마 아메리카눔(Xiphinema americanum), 지피네마 브레비콜레(Xiphinema brevicolle), 지피네마 디모르피카우다툼(Xiphinema dimorphicaudatum), 지피네마 인덱스(Xiphinema index) 및 일반적인 외부기생충 지피네마 종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
선충 유해물의 다른 예는 크리코네마티대(Criconematidae), 벨로놀라이미대(Belonolaimidae), 호플로아이미대(Hoploaimidae), 헤테로데리대(Heteroderidae), 론지도리대(Longidoridae), 프라틸렌키대(Pratylenchidae), 트리코도리대(Trichodoridae) 또는 안구이니대(Anguinidae) 과에 속하는 종을 포함한다.
표 9는 본원에 기재된 PMP 조성물 및 관련 방법을 사용하여 치료되거나 예방될 수 있는 선충 및 그와 관련된 질병의 추가의 예를 보여준다.
[표 9]
Figure pct00028
Figure pct00029
vi. 바이러스
PMP 조성물 및 관련 방법은 예를 들어, 식물에서 바이러스 감염을 예방하거나 치료하기 위하여 바이러스의 건강을 감소시키기 위해 유용할 수 있다. 바이러스를 PMP 조성물과 접촉시킴으로써 PMP 조성물을 바이러스에 운반하기 위한 방법이 포함된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 당해 방법은 식물을 PMP 조성물과 접촉시킴으로써 PMP 조성물을 바이러스 감염의 위험이 있거나, 또는 이를 갖는 식물에 운반하는 단계를 포함한다.
PMP 조성물 및 관련 방법은 표 10에 열거된 바이러스 및 질병을 포함하는, 식물에서 바이러스 질병을 야기하는 바이러스로의 운반에 적합하다.
[표 10]
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Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
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C. 식물 공생생물로의 운반
본원에 개시된 PMP 조성물(예를 들어, 본원에 기술된 변형 PMP를 포함)을 식물 공생생물로 운반하는 방법이 본원에 제공된다. 공생생물을 PMP 조성물과 접촉시키는 단계에 의한 공생생물(예를 들어, 박테리아 내생공생생물, 진균 내생공생생물 또는 곤충)로의 PMP 조성물의 운반 방법이 포함된다. 당해 방법은 식물 공생생물, 예를 들어, 식물의 건강에 유익한 공생생물의 건강을 증가시키는데 유용할 수 있다. 일부 경우에, 식물 공생생물은 이종 기능성 제제를 포함하지 않는 PMP로 처리될 수 있다. 다른 경우에, PMP는 이종 기능성 제제, 예를 들어, 시비제를 포함한다.
이와 같이, 당해 방법을 사용하여, 식물 공생생물의 건강을 증가시킬 수 있다. 일 양태에서, 공생생물의 건강의 증가 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은 본원에 기재된 PMP 조성물을 (예를 들어, 유효한 양 및 유효한 기간으로) 공생생물에 운반하여, 미처리 공생생물(예를 들어, PMP 조성물을 운반하지 않은 공생생물)에 비하여 공생생물의 건강을 증가시키는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 진균(예를 들어, 식물의 진균 내생공생생물)의 건강의 증가 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은 복수의 PMP를 포함하는 PMP 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 PMP 조성물)을 내생공생생물에 운반하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 식물 공생생물은 내생공생 진균, 예컨대 아스페르길라세아에(Aspergillaceae), 세라토바시디아세아에(Ceratobasidiaceae), 코니오카에타세아에(Coniochaetaceae), 코르디시피타세아에(Cordycipitaceae), 코르티시아세아에(Corticiaceae), 시스토필로바시디아세아에(Cystofilobasidiaceae), 다비디엘라세아에(Davidiellaceae), 데바리오마이세타세아에(Debaryomycetaceae), 도티오라세아에(Dothioraceae), 에리시파세아에(Erysiphaceae), 필로바시디아세아에(Filobasidiaceae), 글로메렐라세아에(Glomerellaceae), 하이드나세아에(Hydnaceae), 하이포크레아세아에(Hypocreaceae), 렙토스파에리아세아에(Leptosphaeriaceae), 몬타그눌라세아에(Montagnulaceae), 모르티에렐라세아에(Mortierellaceae), 마이코스파에렐라세아에(Mycosphaerellaceae), 넥트리아세아에(Nectriaceae), 오르빌리아세아에(Orbiliaceae), 파에오스파에리아세아에(Phaeosphaeriaceae), 플레오스포라세아에(Pleosporaceae), 슈듀로티아세아에(Pseudeurotiaceae), 리조포다세아에(Rhizopodaceae), 스클레로티니아세아에(Sclerotiniaceae), 스테레아세아에(Stereaceae) 또는 트리코코마세아(Trichocomacea) 속의 진균일 수 있다.
또 다른 양태에서, 박테리아(예를 들어, 식물의 박테리아 내생공생생물)의 건강의 증가 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은 복수의 PMP를 포함하는 PMP 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 PMP 조성물)을 박테리아에 운반하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 식물 공생생물은 내생공생 박테리아, 예컨대 아세토박테라세아에(Acetobacteraceae), 아시도박테리아세아에(Acidobacteriaceae), 아시도써마세아에(Acidothermaceae), 아에로코카세아에(Aerococcaceae), 알칼리게나세아에(Alcaligenaceae), 알리사이클로바실라세아에(Alicyclobacillaceae), 알테로모나다세아에(Alteromonadaceae), 아나에롤리네아세아에(Anaerolineaceae), 아우란티모나다세아에(Aurantimonadaceae), 바실라세아에(Bacillaceae), 박테리오보라카세아에(Bacteriovoracaceae), 브델로비브리오나세아에(Bdellovibrionaceae), 브라디리조비아세아에(Bradyrhizobiaceae), 브레비박테리아세아에(Brevibacteriaceae), 브루셀라세아에(Brucellaceae), 부르크홀데리아세아에(Burkholderiaceae), 카복시도셀라세아에(Carboxydocellaceae), 카울로박테라세아에(Caulobacteraceae), 셀룰로모나다세아에(Cellulomonadaceae), 키티노파가세아에(Chitinophagaceae), 크로마티아세아에(Chromatiaceae), 크토니오박테라세아에(Chthoniobacteraceae), 크토노모나다세아에(Chthonomonadaceae), 클로스트리디아세아에(Clostridiaceae), 코마모나다세아에(Comamonadaceae), 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae), 콕시엘라세아에(Coxiellaceae), 크라이오모르파세아에(Cryomorphaceae), 사이클로박테리아세아에(Cyclobacteriaceae), 사이토파가세아에(Cytophagaceae), 데이노코카세아에(Deinococcaceae), 더마박테라세아에(Dermabacteraceae), 더마코카세아에(Dermacoccaceae), 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 엔테로코카세아에(Enterococcaceae), 에리트로박테라세아에(Erythrobacteraceae), 피브로박테라세아에(Fibrobacteraceae), 플람메오비르가세아에(Flammeovirgaceae), 플라보박테리아세아에(Flavobacteriaceae), 프란키아세아에(Frankiaceae), 푸소박테리아세아에(Fusobacteriaceae), 가이엘라세아에(Gaiellaceae), 겜마티모나다세아에(Gemmatimonadaceae), 게오더마토필라세아에(Geodermatophilaceae), 글라이 코르나이 세타세아에(Gly corny cetaceae), 할리안지아세아에(Haliangiaceae), 할로모나다세아에(Halomonadaceae), 홀로스포라세아에(Holosporaceae), 하이포미크로비아세아에(Hyphomicrobiaceae), 아이아미아세아에(Iamiaceae), 인트라스포란지아세아에(Intrasporangiaceae), 키네오스포리아세아에(Kineosporiaceae), 코리박테라세아에(Koribacteraceae), 라크노스피라세아에(Lachnospiraceae), 락토바실라세아에(Lactobacillaceae), 레지오넬라세아에(Legionellaceae), 렙토스피라세아에(Leptospiraceae), 류코노스토카세아에(Leuconostocaceae), 메틸로박테리아세아에(Methylobacteriaceae), 메틸로시스타세아에(Methylocystaceae), 메틸로필라세아에(Methylophilaceae), 미크로박테리아세아에(Microbacteriaceae), 미크로코카세아에(Micrococcaceae), 미크로모노스포라세아에(Micromonosporaceae), 모락셀라세아에(Moraxellaceae), 마이코박테리아세아에(Mycobacteriaceae), 마이코플라스마타세아에(Mycoplasmataceae), 마익소코카세아에(Myxococcaceae), 나카무렐라세아에(Nakamurellaceae), 네이세리아세아에(Neisseriaceae), 니트로소모나다세아에(Nitrosomonadaceae), 노카르디아세아에(Nocardiaceae), 노카르디오이다세아에(Nocardioidaceae), 오세아노스피릴라세아에(Oceanospirillaceae), 오피투타세아에(Opitutaceae), 옥살로박테라세아에(Oxalobacteraceae), 파에니바실라세아에(Paenibacillaceae), 파라클라마이디아세아에(Parachlamydiaceae), 파스튜렐라세아에(Pasteurellaceae), 파툴리박테라세아에(Patulibacteraceae), 펩토스트렙토코카세아에(Peptostreptococcaceae), 필로박테리아세아에(Phyllobacteriaceae), 피시리케치아세아에(Piscirickettsiaceae), 플란크토마이세타세아에(Planctomycetaceae), 플라노코카세아에(Planococcaceae), 폴리안지아세아에(Polyangiaceae), 포르파이로모나다세아에(Porphyromonadaceae), 프레보텔라세아에(Prevotellaceae), 프로미크로모노스포라세아에(Promicromonosporaceae), 슈도모나다세아에(Pseudomonadaceae), 슈도노카르디아세아에(Pseudonocardiaceae), 리조비아세아에(Rhizobiaceae), 로도박테라세아에(Rhodobacteraceae), 로도스피릴라세아에(Rhodospirillaceae), 로세이플렉사세아에(Roseiflexaceae), 루브로박테리아세아에(Rubrobacteriaceae), 산다라시나세아에(Sandaracinaceae), 산구이박테라세아에(Sanguibacteraceae), 사프로스피라세아에(Saprospiraceae), 세그닐리파라세아에(Segniliparaceae), 쉐와넬라세아에(Shewanellaceae), 시노박테라세아에(Sinobacteraceae), 솔리박테라세아에(Solibacteraceae), 솔리모나다세아에(Solimonadaceae), 솔리루브로박테라세아에(Solirubrobacteraceae), 스핀고박테리아세아에(Sphingobacteriaceae), 스핀고모나다세아에(Sphingomonadaceae), 스피로플라스마타세아에(Spiroplasmataceae), 스포리크타이아세아에(Sporichthyaceae), 스포롤락토바실라세아에(Sporolactobacillaceae), 스타필로코카세아에(Staphylococcaceae), 스트렙토코카세아에(Streptococcaceae), 스트렙토마이세타세아에(Streptomycetaceae), 신트로포박테라세아에(Syntrophobacteraceae), 베일로넬라세아에(Veillonellaceae), 베루코미크로비아세아에(Verrucomicrobiaceae), 위크셀라세아에(Weeksellaceae), 잔토박테라세아에(Xanthobacteraceae) 또는 잔토모나다세아에(Xanthomonadaceae) 속의 박테리아일 수 있다.
또 다른 양태에서, 곤충(예를 들어, 식물의 곤충 공생생물)의 건강의 감소 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은 복수의 PMP를 포함하는 PMP 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 PMP 조성물)을 곤충에 운반하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 곤충은 식물 화문매개자이다. 예를 들어, 곤충은 하이메노프테라(Hymenoptera) 또는 디프테라(Diptera) 속의 것일 수 있다. 일부 경우에, 하이메노프테라 속의 곤충은 벌이다. 다른 경우에, 디프테라 속의 곤충은 파리이다.
일부 경우에, 공생생물 건강의 증가는 PMP 조성물의 투여의 결과로서 공생생물의 생리학의 향상(예를 들어, 증가된 건강 또는 생존)으로서 나타날 수 있다. 일부 경우에, 유기체의 건강은 PMP 조성물을 투여하지 않은 공생생물과 비교하여, 번식률, 수명, 운동성, 번식력(fecundity), 체중, 대사율 또는 활기(activity) 또는 생존을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 하나 이상의 파라미터에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공되는 방법 또는 조성물은, PMP 조성물이 투여되지 않은 공생생물 유기체와 비교하여 공생생물의 전반적인 건강을 향상시키거나 공생생물의 전반적인 생존을 향상시키는데 유효할 수 있다. 일부 경우에, 공생생물의 생존 증가는 참조 수준(예를 들어, PMP 조성물을 받지 않은 공생생물에서 관찰되는 수준)에 비하여 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과하여 더 크다. 일부 경우에, 당해 방법 및 조성물은 PMP 조성물을 투여하지 않은 공생생물 유기체에 비하여 공생생물 번식(예를 들어, 번식률)을 증가시키는데 유효하다. 일부 경우에, 당해 방법 및 조성물은 참조 수준(예를 들어, PMP 조성물을 받지 않은 공생생물에서 관찰되는 수준)에 비하여 다른 생리학적 파라미터, 예컨대 운동성, 체중, 수명, 번식력 또는 대사율을 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과로 증가시키는데 유효하다.
일부 경우에, 공생생물 건강의 증가는 PMP 조성물이 투여되지 않은 공생생물 유기체에 비하여, 공생생물에 의해 수행되는 요망되는 활동(예를 들어, 수분, 유해물에 대한 포식, 종자 확산, 또는 폐기물 또는 유기 물질의 분해)의 빈도 또는 효능의 증가로서 나타날 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공되는 방법 또는 조성물은 참조 수준(예를 들어, PMP 조성물을 받지 않은 공생생물에서 관찰되는 수준)에 비하여 공생생물에 의해 수행되는 원하는 활성(예를 들어, 수분(pollination), 유해물 포식, 종자 파종, 또는 노폐물 또는 유기물의 분해)의 빈도 또는 효능을 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과로 증가시키는데 유효할 수 있다.
일부 경우에, 공생생물 건강의 증가는 PMP 조성물을 투여하지 않은 공생생물 유기체에 비하여 공생생물에서의 하나 이상의 영양소(예를 들어, 비타민, 탄수화물, 아미노산 또는 폴리펩티드)의 생성의 증가로서 나타날 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공되는 방법 또는 조성물은 참조 수준(예를 들어, PMP 조성물을 받지 않은 공생생물에서 관찰되는 수준)에 비하여 공생생물에서의 영양소(예를 들어, 비타민, 탄수화물, 아미노산 또는 폴리펩티드)의 생성을 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과로 증가시키는데 유효할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공되는 방법 또는 조성물은 공생생물 내의 하나 이상의 미생물(예를 들어, 내생공생생물)에 의한 영양소의 생성 또는 대사를 증가시킴으로써 관련 식물에서 영양소를 증가시킬 수 있다.
일부 경우에, 공생생물 건강의 증가는 PMP 조성물을 투여하지 않은 공생생물 유기체에 비하여 농약 제제에 대한 공생생물의 감수성의 감소 및/또는 농약 제제에 대한 유해물의 저항성의 증가로서 나타날 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 방법 또는 조성물은 참조 수준(예를 들어, PMP 조성물을 받지 않은 공생생물에서 관찰되는 수준)에 비하여 농약 제제에 대한 공생생물의 감수성을 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과로 감소시키는데 유효할 수 있다.
일부 경우에, 공생생물 건강의 증가는 PMP 조성물을 투여하지 않은 공생생물 유기체에 비하여 이종감응물질에 대한 공생생물의 감수성의 감소 및/또는 이종감응물질에 대한 유해물의 저항성의 증가로서 나타날 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공되는 방법 또는 조성물은 참조 수준(예를 들어, PMP 조성물을 받지 않은 공생생물에서 관찰되는 수준)에 비하여 이종감응물질 제제에 대한 공생생물의 저항성을 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과로 증가시키는데 유효할 수 있다. 일부 경우에, 이종감응물질 제제는 카페인, 소야시스타틴(soyacystatin) N, 모노테르펜, 디테르펜 산 또는 페놀계 화합물이다. 일부 경우에, 본원에 제공되는 방법 또는 조성물은 이종감응물질 제제를 이용 가능한 기질로 대사하거나 분해시키는 공생생물의 능력을 증가시킴으로써 이종감응물질 제제에 대한 공생생물의 감수성을 감소시킬 수 있다.
일부 경우에, 본원에 제공되는 방법 또는 조성물은 PMP 조성물을 투여하지 않은 공생생물 유기체에 비하여 기생생물 또는 병원체(예를 들어, 진균, 박테리아 또는 바이러스 병원체 또는 기생 응애(예를 들어, 꿀벌에서 발견되는 꿀벌응애(Varroa destructor mite)))에 대한 공생생물의 저항성을 증가시키는데 유효할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공되는 방법 또는 조성물은 참조 수준(예를 들어, PMP 조성물을 받지 않은 공생생물에서 관찰되는 수준)에 비하여 병원체 또는 기생생물(예를 들어, 진균, 박테리아 또는 바이러스 병원체; 또는 기생 응애(예를 들어, 꿀벌에서 발견되는 꿀벌응애(Varroa destructor mite)))에 대한 공생생물의 저항성을 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과로 증가시키는데 유효할 수 있다.
일부 경우에, 공생생물 건강의 증가는 PMP 조성물을 투여하지 않은 공생생물 유기체에 비하여, 다른 건강 이익, 예컨대 특정 환경 인자에 대한 내성(예를 들어, 고온 또는 저온 내성) 증가, 특정 서식지에서의 생존력 증가 또는 특정 식이를 지속하는 능력의 증가(예를 들어, 콩 대 옥수수 대사 능력의 향상)로서 나타날 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공되는 방법 또는 조성물은 본원에 기재된 임의의 복수의 방식으로 공생생물 건강을 증가시키는데 유효할 수 있다. 추가로, PMP 조성물은 임의의 수의 공생생물 강, 목, 과, 속 또는 종(예를 들어, 1가지의 공생생물 종, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ,10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 200, 250, 500가지 또는 그 이상의 공생생물 종)에서 공생생물 건강을 증가시킬 수 있다. 일부 경우에, PMP 조성물은 단일의 공생생물 강, 목, 과, 속 또는 종에서 작용한다.
공생생물 건강은 해당 분야의 임의의 표준 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 일부 경우에, 공생생물 건강은 개별 공생생물을 평가함으로써 평가될 수 있다. 대안적으로, 공생생물 건강은 공생생물 집단을 평가함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 공생생물 건강의 증가는 다른 곤충에 대한 성공적인 경쟁의 증가에 의한 공생생물 집단의 크기의 증가의 야기로서 나타날 수 있다.
본 발명의 조성물 또는 관련 방법으로 처리될 수 있는 식물 공생생물의 예는 본원에 추가로 기재되어 있다.
i. 진균
PMP 조성물 및 관련 방법은 진균, 예를 들어 식물의 내생공생생물인 진균(예를 들어, 균근 진균)의 건강을 증가시키는 데 유용할 수 있다.
일부 경우에, 진균은 아스페르길라세아에(Aspergillaceae), 세라토바시디아세아에(Ceratobasidiaceae), 코니오카에타세아에(Coniochaetaceae), 코르디시피타세아에(Cordycipitaceae), 코르티시아세아에(Corticiaceae), 시스토필로바시디아세아에(Cystofilobasidiaceae), 다비디엘라세아에(Davidiellaceae), 데바리오마이세타세아에(Debaryomycetaceae), 도티오라세아에(Dothioraceae), 에리시파세아에(Erysiphaceae), 필로바시디아세아에(Filobasidiaceae), 글로메렐라세아에(Glomerellaceae), 하이드나세아에(Hydnaceae), 하이포크레아세아에(Hypocreaceae), 렙토스파에리아세아에(Leptosphaeriaceae), 몬타그눌라세아에(Montagnulaceae), 모르티에렐라세아에(Mortierellaceae), 마이코스파에렐라세아에(Mycosphaerellaceae), 넥트리아세아에(Nectriaceae), 오르빌리아세아에(Orbiliaceae), 파에오스파에리아세아에(Phaeosphaeriaceae), 플레오스포라세아에(Pleosporaceae), 슈듀로티아세아에(Pseudeurotiaceae), 리조포다세아에(Rhizopodaceae), 스클레로티니아세아에(Sclerotiniaceae), 스테레아세아에(Stereaceae) 또는 트리코코마세아(Trichocomacea) 과의 것이다.
일부 경우에, 진균은 식물의 뿌리와 균근(예를 들어, 외생균근 또는 내생균근) 연관을 갖는 진균이며, 글로메로마이코타(Glomeromycota), 바시디오마이코타(Basidiomycota), 아스코마이코타(Ascomycota) 또는 자이고마이코타(Zygomycota)에 속하는 진균을 포함한다.
i. 박테리아
PMP 조성물 및 관련 방법은 박테리아, 예를 들어 식물의 내생공생생물인 박테리아(예를 들어, 질소 고정 박테리아)의 건강을 증가시키는 데 유용할 수 있다.
예를 들어, 박테리아는 아시도보락스(Acidovorax), 아그로박테리움(Agrobacterium), 바실러스(Bacillus), 부르크홀데리아(Burkholderia), 크리세오박테리움(Chryseobacterium), 쿠르토박테리움(Curtobacterium), 엔테로박터(Enterobacter), 에스케리키아(Escherichia), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 파에니바실러스(Paenibacillus), 판토에아(Pantoea), 슈도모나스(Pseudomonas), 랄스토니아(Ralstonia), 리조비움(Rhizobium), 사카리바실러스(Saccharibacillus), 스핑고모나스(Sphingomonas) 또는 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 속의 것일 수 있다.
일부 경우에, 박테리아는 하기의 과의 것이다: 아세토박테라세아에(Acetobacteraceae), 아시도박테리아세아에(Acidobacteriaceae), 아시도써마세아에(Acidothermaceae), 아에로코카세아에(Aerococcaceae), 알칼리게나세아에(Alcaligenaceae), 알리사이클로바실라세아에(Alicyclobacillaceae), 알테로모나다세아에(Alteromonadaceae), 아나에롤리네아세아에(Anaerolineaceae), 아우란티모나다세아에(Aurantimonadaceae), 바실라세아에(Bacillaceae), 박테리오보라카세아에(Bacteriovoracaceae), 브델로비브리오나세아에(Bdellovibrionaceae), 브라디리조비아세아에(Bradyrhizobiaceae), 브레비박테리아세아에(Brevibacteriaceae), 브루셀라세아에(Brucellaceae), 부르크홀데리아세아에(Burkholderiaceae), 카복시도셀라세아에(Carboxydocellaceae), 카울로박테라세아에(Caulobacteraceae), 셀룰로모나다세아에(Cellulomonadaceae), 키티노파가세아에(Chitinophagaceae), 크로마티아세아에(Chromatiaceae), 크토니오박테라세아에(Chthoniobacteraceae), 크토노모나다세아에(Chthonomonadaceae), 클로스트리디아세아에(Clostridiaceae), 코마모나다세아에(Comamonadaceae), 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae), 콕시엘라세아에(Coxiellaceae), 크리오모르파세아에(Cryomorphaceae), 사이클로박테리아세아에(Cyclobacteriaceae), 사이토파가세아에(Cytophagaceae), 데이노코카세아에(Deinococcaceae), 더마박테라세아에(Dermabacteraceae), 더마코카세아에(Dermacoccaceae), 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 엔테로코카세아에(Enterococcaceae), 에리트로박테라세아에(Erythrobacteraceae), 피브로박테라세아에(Fibrobacteraceae), 플라메오비르가세아에(Flammeovirgaceae), 플라보박테리아세아에(Flavobacteriaceae), 프란키아세아에(Frankiaceae), 푸소박테리아세아에(Fusobacteriaceae), 가이엘라세아에(Gaiellaceae), 겜마티모나다세아에(Gemmatimonadaceae), 게오더마토필라세아에(Geodermatophilaceae), 글라이 코르나이 세타세아에(Gly corny cetaceae), 할리안지아세아에(Haliangiaceae), 할로모나다세아에(Halomonadaceae), 홀로스포라세아에 (Holosporaceae), 하이포미크로비아세아에(Hyphomicrobiaceae), 아이아미아세아에(Iamiaceae), 인트라스포란지아세아에(Intrasporangiaceae), 키네오스포리아세아에(Kineosporiaceae), 코리박테라세아에(Koribacteraceae), 라크노스피라세아에(Lachnospiraceae), 락토바실라세아에(Lactobacillaceae), 레지오넬라세아에(Legionellaceae), 렙토스피라세아에(Leptospiraceae), 류코노스토카세아에(Leuconostocaceae), 메틸로박테리아세아에(Methylobacteriaceae), 메틸로시스타세아에(Methylocystaceae), 메틸로필라세아에(Methylophilaceae), 미크로박테리아세아에(Microbacteriaceae), 미크로코카세아에(Micrococcaceae), 미크로모노스포라세아에(Micromonosporaceae), 모락셀라세아에(Moraxellaceae), 마이코박테리아세아에(Mycobacteriaceae), 마이코플라스마타세아에(Mycoplasmataceae), 마익소코카세아에(Myxococcaceae), 나카무렐라세아에(Nakamurellaceae), 네이세리아세아에(Neisseriaceae), 니트로소모나다세아에(Nitrosomonadaceae), 노카르디아세아에(Nocardiaceae), 노카르디오이다세아에(Nocardioidaceae), 오세아노스피릴라세아에(Oceanospirillaceae), 오피투타세아에(Opitutaceae), 옥살로박테라세아에(Oxalobacteraceae), 파에니바실라세아에(Paenibacillaceae), 파라클라마이디아세아에(Parachlamydiaceae), 파스튜렐라세아에(Pasteurellaceae), 파툴리박테라세아에(Patulibacteraceae), 펩토스트렙토코카세아에(Peptostreptococcaceae), 필로박테리아세아에(Phyllobacteriaceae), 피시리케치아세아에(Piscirickettsiaceae), 플란크토마이세타세아에(Planctomycetaceae), 플라노코카세아에(Planococcaceae), 폴리안지아세아에(Polyangiaceae), 포르파이로모나다세아에(Porphyromonadaceae), 프레보텔라세아에(Prevotellaceae), 프로미크로모노스포라세아에(Promicromonosporaceae), 슈도모나다세아에(Pseudomonadaceae), 슈도노카르디아세아에(Pseudonocardiaceae), 리조비아세아에(Rhizobiaceae), 로도박테라세아에(Rhodobacteraceae), 로도스피릴라세아에(Rhodospirillaceae), 로세이플렉사세아에(Roseiflexaceae), 루브로박테리아세아에(Rubrobacteriaceae), 산다라시나세아에(Sandaracinaceae), 산구이박테라세아에(Sanguibacteraceae), 사프로스피라세아에(Saprospiraceae), 세그닐리파라세아에(Segniliparaceae), 쉬와넬라세아에(Shewanellaceae), 시노박테라세아에(Sinobacteraceae), 솔리박테라세아에(Solibacteraceae), 솔리모나다세아에(Solimonadaceae), 솔리루브로박테라세아에(Solirubrobacteraceae), 스핀고박테리아세아에(Sphingobacteriaceae), 스핀고모나다세아에(Sphingomonadaceae), 스피로플라스마타세아에(Spiroplasmataceae), 스포리크타이아세아에(Sporichthyaceae), 스포롤락토바실라세아에(Sporolactobacillaceae), 스타필로코카세아에(Staphylococcaceae), 스트렙토코카세아에(Streptococcaceae), 스트렙토마이세타세아에(Streptomycetaceae), 신트로포박테라세아에(Syntrophobacteraceae), 베일로넬라세아에(Veillonellaceae), 베루코미크로비아세아에(Verrucomicrobiaceae), 위크셀라세아에(Weeksellaceae), 잔토박테라세아에(Xanthobacteraceae) 또는 잔토모나다세아에(Xanthomonadaceae).
일부 경우에, 내생공생 박테리아는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 과의 것이다: 바실라세아에(Bacillaceae), 부르크홀데리아세아에(Burkholderiaceae), 코마모나다세아에(Comamonadaceae), 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 플라보박테리아세아에(Flavobacteriaceae), 메틸로박테리아세아에(Methylobacteriaceae), 미크로박테리아세아에(Microbacteriaceae), 파에니바실릴레아에(Paenibacillileae), 슈도몬나세아에(Pseudomonnaceae), 리조비아세아에(Rhizobiaceae), 스핀고모나다세아에(Sphingomonadaceae) 및 잔토모나다세아에(Xanthomonadaceae).
일부 경우에, 내생공생 박테리아는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 속의 것이다: 아시도보락스(Acidovorax), 아그로박테리움(Agrobacterium), 바실러스(Bacillus), 부르크홀데리아(Burkholderia), 크리세오박테리움(Chryseobacterium), 쿠르토박테리움(Curtobacterium), 엔테로박터(Enterobacter), 에스케리키아(Escherichia), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 파에니바실러스(Paenibacillus), 판토에아(Pantoea), 슈도모나스(Pseudomonas), 랄스토니아(Ralstonia), 사카리바실러스(Saccharibacillus), 스핀고모나스(Sphingomonas) 및 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas).
ii. 곤충
PMP 조성물 및 관련 방법은 곤충. 예를 들어 식물에 유익한 곤충의 건강을 증가시키기 위해 유용할 수 있다. 용어 "곤충"은 임의의 발생 단계, 즉, 미성숙 및 성체 곤충의 절지동물문 및 곤충강 또는 거미강에 속하는 임의의 유기체를 포함한다. 예를 들어, 숙주는 농업 응용에 사용되는 곤충을 포함할 수 있으며, 이는 농작물의 수분, 종자의 확산 또는 유해물 방제를 보조하는 곤충을 포함한다.
일부 경우에, 숙주는 식물의 수분을 보조한다(예를 들어, 벌, 딱정벌레, 말벌, 파리, 나비 또는 나방). 일부 경우에, 식물의 수분을 보조하는 숙주는 벌이다. 일부 경우에, 벌은 안드레니다에(Andrenidae), 아피다에(Apidae), 콜레티다에(Colletidae), 할리크티다에(Halictidae) 또는 메가칠리다에(Megachilidae) 과이다. 일부 예에서, 식물의 수분을 보조하는 숙주는 딱정벌레이다. 특정 경우에, PMP 조성물은 꿀벌의 건강을 증가시키는 데 사용될 수 있다.
일부 경우에, 식물의 수분을 보조하는 숙주는 딱정벌레, 예를 들어, 부프레스티다에(Buprestidae), 칸타리다에(Cantharidae), 세람바이시다에(Cerambycidae), 크라이소멜리다에(Chrysomelidae), 클레리다에(Cleridae), 콕시넬리다에(Coccinellidae), 엘라테리다에(Elateridae), 멜란드라이다에(Melandryidae), 멜로이다에(Meloidae), 멜라이리다에(Melyridae), 모르델리다에(Mordellidae), 니티둘리다에(Nitidulidae), 오에데메리다에(Oedemeridae), 스카라바에이다에(Scarabaeidae) 또는 스타필리니다에(Staphyllinidae) 과의 종이다.
일부 경우에, 식물의 수분을 보조하는 숙주는 나비 또는 나방(예를 들어, 레피돕테라(Lepidoptera))이다. 일부 경우에, 나비 또는 나방은 게오메트리다에(Geometridae), 헤스페리이다에(Hesperiidae), 라이카에니다에(Lycaenidae), 노크투이다에(Noctuidae), 나임팔리다에(Nymphalidae), 파필리오니다에(Papilionidae), 피에리다에(Pieridae) 또는 스핀기다에(Sphingidae) 과의 종이다.
일부 경우에, 식물의 수분을 보조하는 숙주는 파리(예를 들어, 디프테리아)이다. 일부 경우에, 파리는 안토마이이다에(Anthomyiidae), 비비오니다에(Bibionidae), 봄바일리이다에(Bombyliidae), 칼리포리다에(Calliphoridae), 세시도미이다에(Cecidomiidae), 세르토포고니다에(Certopogonidae), 크리오노미다에(Chrionomidae), 코노피다에(Conopidae), 쿨리시다에(Culicidae), 돌리코포디다에(Dolichopodidae), 엠피디다에(Empididae), 에프하이드리다에(Ephydridae), 론코프테리다에(Lonchopteridae), 무시다에(Muscidae), 마이세토필리다에(Mycetophilidae), 포리다에(Phoridae), 시물리이다에(Simuliidae), 스트라티오마이이다에(Stratiomyidae) 또는 시르피다에(Syrphidae) 과이다.
일부 경우에, 수분을 보조하는 숙주는 개미(예를 들어, 포르미시다에(Formicidae)), 잎벌(예를 들어, 텐트레디니다에(Tenthredinidae)) 또는 말벌(예를 들어, 스페시다에(Sphecidae) 또는 베스피다에(Vespidae))이다.
D. 동물 병원체로의 운반
본원에 기재된 것과 같은 동물(예를 들어, 인간) 병원체에 PMP 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 변형 PMP를 포함하는)의 운반 방법, 예를 들어, 병원체를 PMP 조성물과 접촉시키는 방법이 본원에 제공된다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “병원체”는 예를 들어, (i) 동물을 직접적으로 감염시킴으로써, (ii) 동물에서 질병 또는 질병 증상을 야기하는 제제를 생성함으로써(예를 들어, 병원성 독소 등을 생성하는 박테리아), 동물에서 질병 또는 질병 증상을 야기하고/야기하거나 동물에서 면역(예를 들어, 염증성 반응)을 야기하는(예를 들어, 무는(biting) 곤충, 예를 들어, 빈대) 유기체, 예컨대 미생물 또는 무척추동물을 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 병원체는 박테리아, 원생동물, 기생생물, 진균, 선충, 곤충, 바이로이드 및 바이러스 또는 이의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않으며, 각각의 병원체는 스스로 또는 또 다른 병원체와 협력하여 동물, 예를 들어 인간에서 질병 또는 증상을 야기할 수 있다.
일부 경우에, 동물(예를 들어, 인간) 병원체는 이종 기능성 제제를 포함하지 않는 PMP로 처리될 수 있다. 다른 경우에, PMP는 이종 기능성 제제, 예를 들어, 이종 치료제(예를 들어, 항박테리아제, 항진균제, 살충제, 살선충제, 항기생충제, 항바이러스제 또는 기피제)를 포함한다. 당해 방법은 예를 들어, PMP 조성물의 운반의 결과로서 병원체의 확산을 방제하거나 병원체 감염을 예방 또는 처리하는 등, 동물 병원체의 건강을 감소시키는데 유용할 수 있다.
본원에 기재된 방법에 따라 표적화될 수 있는 병원체의 예는 박테리아(예를 들어, 스트렙토코커스 종, 뉴모코커스 종, 슈도모나스 종, 시겔라 종, 살모넬라 종, 캄필로박터 종 또는 에스케리키아 종), 진균(사카로마이세스 종 또는 칸디다 종), 기생성 곤충(예를 들어, 시멕스 종), 기생성 선충(예를 들어, 헬리그모소모이데스 종) 또는 기생성 원생동물(예를 들어, 트리코모니아시스(Trichomoniasis) 종)을 포함한다.
예를 들어, 병원체의 건강의 감소 방법이 본원에 제공며, 당해 방법은 본원에 기재된 PMP 조성물을 병원체에 운반하는 단계를 포함하며, 당해 방법은 미처리 병원체에 비하여 병원체의 건강을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 당해 방법은 병원체가 성장하거나, 거주하거나, 번식하거나, 영양을 얻거나, 침입하는 적어도 하나의 서식지에 조성물을 운반하는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 방법의 일부 경우에서, 조성물은 병원체에 의한 섭취를 위하여 병원체 식용 조성물로서 운반된다. 본원에 기재된 방법의 일부 경우에서, 조성물은 액체, 고체, 에어로졸, 페이스트, 겔 또는 기체로서 (예를 들어, 병원체에게) 운반된다.
또한, 기생성 곤충의 건강의 감소 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은 복수의 PMP를 포함하는 PMP 조성물을 기생성 곤충에 운반하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 복수의 PMP를 포함하는 PMP 조성물을 기생성 곤충에 운반하는 단계를 포함하며, 당해 복수의 PMP는 살충제를 포함한다. 예를 들어, 기생성 곤충은 빈대일 수 있다. 기생성 곤충의 다른 비제한적인 예가 본원에 제공된다. 일부 경우에, 당해 방법은 미처리 기생성 곤충에 비하여 기생성 곤충의 건강을 감소시킨다.
추가적으로, 기생성 선충의 건강의 감소 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은 복수의 PMP를 포함하는 PMP 조성물을 기생성 선충에 운반하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 복수의 PMP를 포함하는 PMP 조성물을 기생성 선충에 운반하는 단계를 포함하며, 당해 복수의 PMP는 살선충제를 포함한다. 예를 들어, 기생성 선충은 헬리그모소모이데스 폴리자이러스(Heligmosomoides polygyrus)이다. 기생성 선충의 다른 비제한적인 예가 본원에 제공된다. 일부 경우에, 당해 방법은 미처리 기생성 선충에 비하여 기생성 선충의 건강을 감소시킨다.
기생성 원생동물의 건강의 감소 방법이 본원에 추가로 제공되며, 당해 방법은 복수의 PMP를 포함하는 PMP 조성물을 기생성 원생동물에 운반하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 복수의 PMP를 포함하는 PMP 조성물을 기생성 원생동물에 운반하는 단계를 포함하며, 당해 복수의 PMP는 항기생충제를 포함한다. 예를 들어, 기생성 원생동물은 티. 바지날리스(T. vaginalis)일 수 있다. 기생성 원생동물의 다른 비제한적인 예가 본원에 제공된다. 일부 경우에, 당해 방법은 미처리 기생성 원생동물에 비하여 기생성 원생동물의 건강을 감소시킨다.
PMP 조성물의 운반의 결과로서의 병원체의 건강의 감소는 다수의 방식으로 나타날 수 있다. 일부 경우에, 병원체의 건강의 감소는 PMP 조성물의 운반의 결과로서 병원체의 생리학의 악화 또는 쇠퇴(예를 들어, 감소된 건강 또는 생존)로서 나타날 수 있다. 일부 경우에, 유기체의 건강은 PMP 조성물을 투여하지 않은 병원체와 비교하여, 번식률, 생식력(fertility), 수명, 생존력, 운동성, 번식력(fecundity), 병원체 발생, 체중, 대사율 또는 활기(activity) 또는 생존을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 하나 이상의 파라미터에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공되는 방법 또는 조성물은 병원체의 전반적인 건강을 감소시키거나 병원체의 전반적인 생존을 감소시키는데 유효할 수 있다. 일부 경우에, 병원체의 생존 감소는 참조 수준(예를 들어, PMP 조성물을 받지 않은 병원체에서 관찰되는 수준)에 비하여 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과하여 더 크다. 일부 경우에, 당해 방법 및 조성물은 PMP 조성물을 투여하지 않은 병원체에 비하여 병원체 번식(번식률, 번식력)을 감소시키는데 유효하다. 일부 경우에, 당해 방법 및 조성물은 참조 수준(예를 들어, PMP 조성물을 받지 않은 병원체에서 관찰되는 수준)에 비하여 다른 생리학적 파라미터, 예컨대 운동성, 체중, 수명, 번식력 또는 대사율을 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과로 감소시키는데 유효하다.
일부 경우에, 유해물 건강의 감소는 PMP 조성물을 운반하지 않은 병원체에 비하여 항병원체 제제에 대한 병원체의 감수성의 증가 및/또는 항병원체 제제에 대한 병원체의 저항성의 감소로서 나타날 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 방법 또는 조성물은 참조 수준(예를 들어, PMP 조성물을 받지 않은 병원체에서 관찰되는 수준)에 비하여 농약 제제에 대한 유해물의 감수성을 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과로 증가시키는데 유효할 수 있다.
일부 경우에, 병원체 건강의 감소는 PMP 조성물을 전달하지 않은 병원체에 비하여, 다른 건강 불이익, 예컨대 특정 환경 인자에 대한 관용(예를 들어, 고온 또는 저온 관용) 감소, 특정 서식지에서의 생존력 감소 또는 특정 식이를 지속하는 능력의 감소로서 나타날 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공되는 방법 또는 조성물은 본원에 기재된 임의의 복수의 방식으로 병원체 건강을 감소시키는데 유효할 수 있다. 추가로, PMP 조성물은 임의의 수의 병원체 강, 목, 과, 속 또는 종(예를 들어, 1가지의 병원체 종, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ,10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 200, 250, 500가지 또는 그 이상의 병원체 종)에서 병원체 건강을 감소시킬 수 있다. 일부 경우에, PMP 조성물은 단일의 유해물 강, 목, 과, 속 또는 종에서 작용한다.
병원체 건강은 해당 분야의 임의의 표준 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 일부 경우에, 유해물 건강은 개별 병원체를 평가함으로써 평가될 수 있다. 대안적으로, 유해물 건강은 병원체 집단을 평가함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 병원체 건강의 감소는 다른 병원체에 대한 성공적인 경쟁의 감소에 의한 병원체 집단의 크기의 감소의 야기로서 나타날 수 있다.
본원에 기재된 PMP 조성물 및 관련 방법은 동물 병원체의 건강을 감소시킴으로써 동물에서 감염을 치료하거나 예방하는데 유용하다. 본 발명의 조성물 또는 관련 방법으로 처리될 수 있는 동물 병원체, 또는 이의 벡터의 예는 본원에 추가로 기재되어 있다.
i. 진균
PMP 조성물 및 관련 방법은 예를 들어, 동물에서 진균 감염을 예방하거나 치료하기 위하여 진균의 건강을 감소시키기 위해 유용할 수 있다. 진균을 PMP 조성물과 접촉시킴으로써 PMP 조성물을 진균에 운반하기 위한 방법이 포함된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 당해 방법은 PMP 조성물을 동물에 투여함으로써 진균 감염의 위험이 있는 또는 진균 감염의 예방 또는 치료를 필요로 하는 동물에서 (예를 들어, 본원에 기재된 진균에 의해 야기되는) 진균 감염을 예방하거나 치료하는 단계를 포함한다.
PMP 조성물 및 관련 방법은 자낭균문(Ascomycota)(푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 뉴모시스티스 지로베시이(Pneumocystis jirovecii), 아스페르길루스 종, 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis)/포사다시이(posadasii), 칸디다 알비칸스(Candida albicans)), 담자균문(Basidiomycota)(필로바시디엘라 네오포르만스(Filobasidiella neoformans), 트리코스포론(Trichosporon)), 미포자충문(Microsporidia)(엔세팔리토준 쿠니쿨리(Encephalitozoon cuniculi), 엔테로사이토준 비에네우시(Enterocytozoon bieneusi)), 털곰팡이아문(Mucoromycotina)(뮤코르 시르시넬로이데스(Mucor circinelloides), 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae), 리크테이미아 코림비페라(Lichtheimia corymbifera))에 속하는 진균에 의해 야기되는 감염을 포함하는 동물에서의 진균 감염의 치료 또는 예방에 적합하다.
일부 경우에, 진균 감염은 자낭균문, 담자균문, 병꼴균문(Chytridiomycota), 미포자충문 또는 접합균문(Zygomycota)에 속하는 것에 의해 야기되는 것이다. 진균 감염 또는 과성장은 하나 이상의 진균 종, 예를 들어, 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 씨. 트로피칼리스(C. tropicalis), 씨. 파라프실로시스(C. parapsilosis), 씨. 글라브라타(C. glabrata), 씨. 아우리스(C. auris), 씨. 크루세이(C. krusei), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 말라세지아 글로보세(Malassezia globose), 엠. 레스트릭타(M. restricta) 또는 데바리오마이세스 한세니이(Debaryomyces hansenii), 지베렐라 모닐리포르미스(Gibberella moniliformis), 알테르나리아 브라시시콜라(Alternaria brassicicola), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii), 피. 지로베시이(P. jirovecii), 피. 뮤리나(P. murina), 피. 오릭톨라지(P. oryctolagi), 피. 와케피엘디애(P. wakefieldiae) 및 아스페르길루스 클라바투스(Aspergillus clavatus)를 포함할 수 있다. 진균 종은 병원체 또는 기회감염 병원체로 간주될 수 있다.
일부 경우에, 진균 감염은 칸디다 속의 진균에 의해 야기된다(즉, 칸디다 감염). 예를 들어, 칸디다 감염은 씨. 알비칸스, 씨. 글라브라타, 씨. 두블리니엔시스(C. dubliniensis), 씨. 크루세이, 씨. 아우리스, 씨. 파라프실로시스, 씨. 트로피칼리스, 씨. 오르톱실로시스(C. orthopsilosis), 씨. 구일리에르몬디이(C. guilliermondii), 씨. 루고세(C. rugose) 및 씨. 루시타니애(C. lusitaniae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 칸디다 속의 진균에 의해 야기될 수 있다. 본원에 개시된 방법에 의해 치료될 수 있는 칸디다 감염은 칸디다혈증(candidemia), 구인두 칸디다증, 식도 칸디다증, 점막 칸디다증, 생식기 칸디다증, 음문질 칸디다증, 직장 칸디다증, 간 칸디다증, 신장 칸디다증, 폐 칸디다증, 비장 칸디다증, 외이도진균증, 골수염, 감염성 관절염, 심혈관 칸디다증(예를 들어, 심내막염) 및 침습성 칸디다증을 포함하나 이들에 제한되지 않는다.
ii. 박테리아
PMP 조성물 및 관련 방법은 예를 들어, 동물에서 박테리아 감염을 예방하거나 치료하기 위하여 진균의 건강을 감소시키기 위해 유용할 수 있다. 박테리아를 PMP 조성물과 접촉시킴으로써 PMP 조성물을 박테리아에 투여하기 위한 방법이 포함된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 당해 방법은 PMP 조성물을 동물에 투여함으로써 박테리아 감염의 위험이 있는 또는 박테리아 감염의 예방 또는 치료를 필요로 하는 동물에서 (예를 들어, 본원에 기재된 박테리아에 의해 야기되는) 진균 감염을 예방하거나 치료하는 단계를 포함한다.
PMP 조성물 및 관련 방법은 하기에 추가로 기재되는 임의의 박테리아에 의해 야기되는 동물 내의 박테리아 감염을 예방하거나 치료하기에 적합하다. 예를 들어, 박테리아는 바실러스목(비. 안트라시스(B. anthracis), 비. 세레우스(B. cereus), 에스. 아우레우스(S. aureus), 엘. 모노사이토게네스(L. monocytogenes)), 락토바실러스목(에스. 뉴모니애(S. pneumoniae), 에스. 피오게네스(S. pyogenes)), 클로스트리디움목(씨. 보툴리눔(C. botulinum), 씨. 디피실레(C. difficile), 씨. 퍼프린젠스(C. perfringens), 씨. 테타니(C. tetani)), 스피로헤타목(보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum)), 클라미디아목(클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미도필라 프시타시(Chlamydophila psittaci)), 악티노마이세스목(씨. 디프테리애(C. diphtheriae), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 엠. 아비움(M. avium)), 리케치아목(알. 프로와제키이(R. prowazekii), 알. 릭케트시이(R. rickettsii), 알. 타이피(R. typhi), 에이. 파고사이토필룸(A. phagocytophilum), 이. 차핀시스(E. chaffeensis)), 리조비아목(브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis)), 부르크홀데리아목(보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 부르크홀데리아 말레이(Burkholderia mallei), 비. 슈도말레이(B. pseudomallei)), 나이세리아목(나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae), 엔. 메닌지티디스(N. meningitidis)), 캄필로박터목(캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)), 레지오넬라목(레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila)), 슈도모나스목(에이. 바우만니이(A. baumannii), 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 피. 아에루기노사(P. aeruginosa)), 아에로모나스목(아에로모나스(Aeromonas) 종), 비브리오목(비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 브이. 파라해몰라이티쿠스(V. parahaemolyticus)), 티오트리카목, 파스튜렐라목(해모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae)), 엔테로박테리아목(클레브시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 와이. 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 이. 콜라이(E. coli))에 속하는 것일 수 있다.
iii. 기생성 곤충
PMP 조성물 및 관련 방법은 예를 들어, 동물에서 기생성 곤충 감염을 예방하거나 치료하기 위하여 기생성 곤충의 건강을 감소시키기 위해 유용할 수 있다. 용어 "곤충"은 임의의 발생 단계, 즉, 미성숙 및 성체 곤충의 절지동물문 및 곤충강 또는 거미강에 속하는 임의의 유기체를 포함한다. 곤충을 PMP 조성물과 접촉시킴으로써 PMP 조성물을 곤충에 운반하기 위한 방법이 포함된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 당해 방법은 PMP 조성물을 동물에 투여함으로써 기생성 곤충 감염의 위험이 있는 또는 기생성 곤충 감염의 예방 또는 치료를 필요로 하는 동물에서 (예를 들어, 본원에 기재된 기생성 곤충에 의해 야기되는) 원생동물 감염을 예방하거나 치료하는 단계를 포함한다.
PMP 조성물 및 관련 방법은 이목(Phthiraptera): 이아목(Anoplura)(흡혈이), 세각아목(Ischnocera)(새털이(Chewing lice)), 새털이아목(Amblycera)(새털이). 벼룩목(Siphonaptera): 벼룩과(Pulicidae)(고양이 벼룩), 쥐벼룩과(Ceratophyllidae)(닭-벼룩). 파리목(Diptera): 모기과(Culicidae)(모기), 둥에모기과(Ceratopogonidae)(깔따구), 나방파리과(Psychodidae) (모래파리), 먹파리과(Simuliidae)(흑파리), 등에과(Tabanidae)(등에), 집파리과(Muscidae)(집파리 등), 검정파리과(Calliphoridae)(검정파리), 체체파리과(Glossinidae)(체체파리), 쇠파리과(Oestridae)(쇠파리), 이파리과(Hippoboscidae)(양이파리). 반시목(Hemiptera): 침노린재과(Reduviidae)(침노린재), 빈대과(Cimicidae)(빈대). 거미강(Arachnida): 옴진드기류(Sarcoptidae)(옴좀진드기), 양진드기류(Psoroptidae)(양 개선충), 사이토디티다에(Cytoditidae)(기낭 응애), 라미노시오프테스(Laminosioptes)(낭-응애), 깃털진드기과(Analgidae)(깃털-응애), 진응애과(Acaridae)(가루-응애), 모낭진드기과(Demodicidae)(모낭 응애), 케일레티엘리다에(Cheyletiellidae)(털-응애), 털진드기과(Trombiculidae)(털진드기(Trombiculids)), 새진드기과(Dermanyssidae)(조류 응애), 가위집게진드기과(Macronyssidae)(조류 응애), 물렁진드기과(Argasidae)(물렁진드기), 참진드기과(Ixodidae)(참진드기)에 속하는 곤충에 의한 감염을 포함하는 기생성 곤충에 의한 동물 내의 감염을 예방하거나 치료하기에 적합하다.
iv. 원생동물
PMP 조성물 및 관련 방법은 예를 들어, 동물에서 기생성 원생동물 감염을 예방하거나 치료하기 위하여 기생성 원생동물의 건강을 감소시키기 위해 유용할 수 있다. 용어 "원생동물"은 원생동물문에 속하는 임의의 유기체를 포함한다. 기생성 원생동물을 PMP 조성물과 접촉시킴으로써 PMP 조성물을 기생성 원생동물에 운반하기 위한 방법이 포함된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 당해 방법은 PMP 조성물을 동물에 투여함으로써 원생동물 감염의 위험이 있는 또는 원생동물 감염의 예방 또는 치료를 필요로 하는 동물에서 (예를 들어, 본원에 기재된 원생동물에 의해 야기되는) 원생동물 감염을 예방하거나 치료하는 단계를 포함한다.
PMP 조성물 및 관련 방법은 유글레나류(Euglenozoa)(트립파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 트립파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 리슈마니아(Leishmania) 종), 이형엽상근족충강(Heterolobosea)(나에글레리아 포울레리(Naegleria fowleri)), 중복편모충강(Diplomonadida)(기아르디아 인테스티날리스(Giardia intestinalis)), 아메바류(Amoebozoa)(아칸타메바 카스텔라니이(Acanthamoeba castellanii), 발라무티아 만드릴라리스(Balamuthia mandrillaris), 엔타메바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica)), 블라스토시스티스(Blastocystis)(블라스토시스티스 호미니스(Blastocystis hominis)), 정단복합체충류(Apicomplexa)(바베시아 미크로티(Babesia microti), 크립토스포리디움 파붐(Cryptosporidium parvum), 사이클로스포라 카예타넨시스(Cyclospora cayetanensis), 플라스모디움(Plasmodium) 종, 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii))에 속하는 원생동물을 포함하는 동물 내의 기생성 원생동물에 의한 감염을 예방하거나 치료하는데 적합하다.
v. 선충
PMP 조성물 및 관련 방법은 예를 들어, 동물에서 기생성 선충 감염을 예방하거나 치료하기 위하여 기생성 선충의 건강을 감소시키기 위해 유용할 수 있다. 기생성 선충을 PMP 조성물과 접촉시킴으로써 PMP 조성물을 기생성 선충에 운반하기 위한 방법이 포함된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 당해 방법은 PMP 조성물을 동물에 투여함으로써 기생성 선충 감염의 위험이 있는 또는 기생성 선충 감염의 예방 또는 치료를 필요로 하는 동물에서 (예를 들어, 본원에 기재된 기생성 선충에 의해 야기되는) 원생동물 감염을 예방하거나 치료하는 단계를 포함한다.
PMP 조성물 및 관련 방법은 선충류(Nematoda)(회충): 안지오스트론질루스 칸토넨시스(Angiostrongylus cantonensis)(랫트 폐선충), 아스카리스 룸브리코이데스(Ascaris lumbricoides)(인간 회충), 바일리사스카리스 프로시오니스(Baylisascaris procyonis)(미국너구리 회충), 트리쿠리스 트리키우라(Trichuris trichiura)(인간 편충), 트리키넬라 스피랄리스(Trichinella spiralis), 스트론지로이데스 스테르코랄리스(Strongyloides stercoralis), 우체레리아 반크로프티(Wuchereria bancrofti), 브루기아 말라이이(Brugia malayi), 안실로스토마 두오데날레(Ancylostoma duodenale) 및 네카토르 아메리카누스(Necator americanus)(인간 구충), 촌충류(Cestoda)(촌충): 에키노코커스 그라눌로수스(Echinococcus granulosus), 에키노코커스 멀틸로쿨라리스(Echinococcus multilocularis), 타에니아 솔리움(Taenia solium)(갈고리촌충)에 속하는 선충을 포함하는 동물 내의 기생성 선충에 의한 감염을 예방하거나 치료하는데 적합하다.
vi. 바이러스
PMP 조성물 및 관련 방법은 예를 들어, 동물에서 바이러스 감염을 예방하거나 치료하기 위하여 바이러스의 건강을 감소시키기 위해 유용할 수 있다. 바이러스를 PMP 조성물과 접촉시킴으로써 PMP 조성물을 바이러스에 운반하기 위한 방법이 포함된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 당해 방법은 PMP 조성물을 동물에 투여함으로써 바이러스 감염의 위험이 있는 또는 바이러스 감염의 예방 또는 치료를 필요로 하는 동물에서 (예를 들어, 본원에 기재된 바이러스에 의해 야기되는) 바이러스 감염을 예방하거나 치료하는 단계를 포함한다.
PMP 조성물 및 관련 방법은 DNA 바이러스: 파보바이러스과(Parvoviridae), 파필로마바이러스과(Papillomaviridae), 폴리오마바이러스과(Polyomaviridae), 폭스바이러스과(Poxviridae), 헤르페스바이러스과(Herpesviridae); 단일-가닥 음의 가닥 RNA 바이러스: 아레나바이러스과(Arenaviridae), 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae)(루불라바이러스(Rubulavirus), 레스피로바이러스(Respirovirus), 뉴모바이러스(Pneumovirus), 모리빌리바이러스(Moribillivirus)), 필로바이러스과(Filoviridae)(마르부르그바이러스(Marburgvirus), 에볼라바이러스(Ebolavirus)), 보르나오바이러스과(Bornaoviridae), 랍도바이러스과(Rhabdoviridae), 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae), 부니아바이러스과(Bunyaviridae), 나이로바이러스(Nairovirus), 한타바이러스(Hantaviruses), 오르토부니아바이러스(Orthobunyavirus), 플레보바이러스(Phlebovirus). 단일-가닥 양의 가닥 RNA 바이러스: 아스트로바이러스과(Astroviridae), 코로나바이러스과(Coronaviridae), 칼리시바이러스과(Caliciviridae), 토가바이러스과(Togaviridae)(루비바이러스(Rubivirus), 알파바이러스(Alphavirus)), 플라비바이러스과(Flaviviridae((헤파시바이러스(Hepacivirus), 플라비바이러스(Flavivirus)), 피코나바이러스과(Picornaviridae)(헤파토바이러스(Hepatovirus), 리노바이러스(Rhinovirus), 엔테로바이러스(Enterovirus)); 또는 dsRNA 및 역전사 바이러스: 레오바이러스과(Reoviridae)(로타바이러스(Rotavirus), 콜티바이러스(Coltivirus), 시도르나바이러스(Seadornavirus)), 레트로바이러스과(Retroviridae)(델타레트로바이러스(Deltaretrovirus), 렌티바이러스(Lentivirus)), 헤파드나바이러스과(Hepadnaviridae)(오르토헤파드나바이러스(Orthohepadnavirus))에 속하는 바이러스에 의한 감염을 포함하는 동물 내의 바이러스 감염을 예방하거나 치료하기에 적합하다.
E. 병원체 벡터로의 운반
본원에 기재된 것과 같은 병원체 벡터에 PMP 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 변형 PMP를 포함하는)의 운반 방법, 예를 들어, 병원체 벡터를 PMP 조성물과 접촉시키는 방법이 본원에 제공된다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “벡터”는 동물 병원체를 저장소로부터 동물로 전달하거나 전파시킬 수 있는 곤충을 지칭한다. 예시적인 벡터는 곤충, 예컨대 반시류 및 일부 막시류 및 파리류, 예컨대 모기, 벌, 말벌, 깔따구, 이, 체체파리, 벼룩 및 개미, 및 거미류의 구성원, 예컨대 진드기(tick) 및 응애(mite)에서 관찰되는 바와 같은 피어싱-흡혈 구기(piercing-sucking mouthpart)를 갖는 것들을 포함한다.
일부 경우에, 동물(예를 들어, 인간) 병원체의 벡터는 이종 기능성 제제를 포함하지 않는 PMP로 처리될 수 있다. 다른 경우에, PMP는 이종 기능성 제제, 예를 들어, 이종 치료제(예를 들어, 항박테리아제, 항진균제, 살충제, 살선충제, 항기생충제, 항바이러스제 또는 기피제)를 포함한다. 당해 방법은 예를 들어, PMP 조성물의 운반의 결과로서 병원체의 확산을 방제하는 등, 병원체의 건강을 감소시키는데 유용할 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 표적화될 수 있는 병원체 벡터의 예에는 곤충, 예컨대 본원에 기재된 것들이 포함된다.
예를 들어, 동물 병원체 벡터의 건강의 감소 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은 본원에 기재된 유효량의 PMP 조성물을 벡터에 운반하는 단계를 포함하며, 당해 방법은 미처리 벡터에 비하여 벡터의 건강을 감소시킨다. 일부 경우에, 당해 방법은 벡터가 성장하거나, 거주하거나, 번식하거나, 영양을 얻거나, 침입하는 적어도 하나의 서식지에 조성물을 운반하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 조성물은 벡터에 의한 섭취를 위하여 식용 조성물로서 운반된다. 일부 경우에, 벡터는 곤충이다. 일부 경우에, 곤충은 모기, 진드기, 응애, 또는 이이다. 일부 경우에서, 조성물은 액체, 고체, 에어로졸, 페이스트, 겔 또는 기체로서 (예를 들어, 병원체 벡터에게) 운반된다.
예를 들어, 동물 병원체의 곤충 벡터의 건강의 감소 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은 복수의 PMP를 포함하는 PMP 조성물을 곤충에 운반하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 복수의 PMP를 포함하는 PMP 조성물을 벡터에 운반하는 단계를 포함하며, 당해 복수의 PMP는 살충제를 포함한다. 예를 들어, 곤충 벡터는 모기, 진드기, 응애, 또는 이일 수 있다. 병원체 벡터의 다른 비제한적인 예가 본원에 제공된다. 일부 경우에, 당해 방법은 미처리 벡터에 비하여 벡터의 건강을 감소시킨다.
일부 경우에, 벡터 건강의 감소는 조성물의 투여의 결과로서 벡터의 생리학의 악화 또는 쇠퇴(예를 들어, 감소된 건강 또는 생존)로서 나타날 수 있다. 일부 경우에, 유기체의 건강은 조성물을 투여하지 않은 벡터 유기체와 비교하여, 번식률, 수명, 운동성, 번식력(fecundity), 체중, 대사율 또는 활기(activity) 또는 생존을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 하나 이상의 파라미터에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공되는 방법 또는 조성물은 벡터의 전반적인 건강을 감소시키거나 벡터의 전반적인 생존을 감소시키는데 유효할 수 있다. 일부 경우에, 벡터의 생존 감소는 참조 수준(예를 들어, 조성물을 받지 않은 벡터에서 관찰되는 수준)에 비하여 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과하여 더 크다. 일부 경우에, 당해 방법 및 조성물은 조성물을 전달하지 않은 벡터 유기체에 비하여 벡터 번식(예를 들어, 번식률)을 감소시키는데 유효하다. 일부 경우에, 당해 방법 및 조성물은 참조 수준(예를 들어, 당해 조성물을 전달하지 않은 벡터에서 관찰되는 수준)에 비하여 다른 생리학적 파라미터, 예컨대 운동성, 체중, 수명, 번식력 또는 대사율을 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과로 감소시키는데 유효하다.
일부 경우에, 벡터 건강의 감소는 조성물을 전달하지 않은 벡터 유기체에 비하여 농약 제제에 대한 벡터의 감수성의 증가 및/또는 농약 제제에 대한 벡터의 저항성의 감소로서 나타날 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 방법 또는 조성물은 참조 수준(예를 들어, 조성물을 받지 않은 벡터에서 관찰되는 수준)에 비하여 농약 제제에 대한 벡터의 감수성을 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과로 증가시키는데 유효할 수 있다. 농약 제제는 살충제를 포함하여, 해당 분야에 알려져 있는 임의의 농약 제제일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공되는 방법 또는 조성물은 조성물을 전달하지 않은 벡터에 비하여 농약 제제를 이용 가능한 기질로 대사하거나 분해시키는 벡터의 능력을 감소시킴으로써 농약 제제에 대한 벡터의 감수성을 증가시킬 수 있다.
일부 경우에, 벡터 건강의 감소는 조성물을 전달하지 않은 벡터 유기체에 비하여, 다른 건강 불이익, 예컨대 특정 환경 인자에 대한 관용(예를 들어, 고온 또는 저온 관용) 감소, 특정 서식지에서의 생존력 감소 또는 특정 식이를 지속하는 능력의 감소로서 나타날 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공되는 방법 또는 조성물은 본원에 기재된 임의의 복수의 방식으로 벡터 건강을 감소시키는데 유효할 수 있다. 추가로 조성물은 임의의 수의 벡터 강, 목, 과, 속 또는 종(예를 들어, 1가지의 벡터 종, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ,10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 200, 250, 500가지 또는 그 이상의 벡터 종)에서 벡터 건강을 감소시킬 수 있다. 일부 경우에, 조성물은 단일의 벡터 강, 목, 과, 속 또는 종에서 작용한다.
벡터 건강은 해당 분야의 임의의 표준 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 일부 경우에, 벡터 건강은 개별 벡터를 평가함으로써 평가될 수 있다. 대안적으로, 벡터 건강은 벡터 집단을 평가함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 벡터 건강의 감소는 다른 벡터에 대한 성공적인 경쟁의 감소에 의한 벡터 집단의 크기의 감소의 야기로서 나타날 수 있다.
본원에 제공되는 조성물은 동물 병원체를 보유하는 벡터의 건강을 감소시킴으로써 벡터-매개 질병의 확산을 감소시키는데 효과적이다. 조성물은 본원에 기재된 제형 및 운반 방법 중 임의의 것을 사용하여 질병의 전파를 감소시키기에, 예를 들어, 벡터 사이의 수직 또는 수평 전파를 감소시키기에, 및/또는 동물로의 전파를 감소시키기에 유효한 양으로 그리고 그 기간 동안 곤충에 운반될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 조성물은 조성물이 운반되지 않은 벡터 유기체에 비하여, 벡터-매개 병원체의 수직 또는 수평 전파를 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 이상 감소시킬 수 있다. 또 다른 예로서, 본원에 기재된 조성물은 조성물이 운반되지 않은 벡터 유기체에 비하여, 곤충 벡터의 벡터 능력을 약 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 이상 감소시킬 수 있다.
본원에 제공되는 조성물 및 방법에 의해 제어될 수 있는 질병의 비제한적인 예는 토가바이러스과(Togaviridae) 바이러스에 의해 야기되는 질병(예를 들어, 치쿤구니아(Chikungunya), 로스강 열(Ross River fever), 마야로(Mayaro), 오니온-니옹 열(Onyon-nyong fever), 신드비스 열(Sindbis fever), 동부형 마뇌척수염바이러스(Eastern equine enchephalomyeltis), 서부형 마뇌척수염바이러스, 베네수엘라 마뇌척수염바이러스 또는 바마 포레스트(Barmah forest)); 플라비바이러스과(Flavivirdae) 바이러스에 의해 야기되는 질병(예를 들어, 뎅기열, 황열, 키아사누 포레스트(Kyasanur Forest) 질병, 옴스크(Omsk) 출혈열, 일본 뇌염, 무레이 밸리(Murray Valley) 뇌염, 로시오(Rocio), 세인트 루이스(St. Louis) 뇌염, 웨스트 나일(West Nile) 뇌염 또는 진드기-매개 뇌염); 부니아바이러스과(Bunyaviridae) 바이러스에 의해 야기되는 질병(예를 들어, 모래파리(Sandly) 열, 리프트 밸리(Rift Valley) 열, 라 크로스(La Crosse) 뇌염, 캘리포니아(California) 뇌염, 크리미안-콩고(Crimean-Congo) 출혈열 또는 오로퓨스(Oropouche) 열); 랍도바이러스과(Rhabdoviridae) 바이러스에 의해 야기되는 질병(예를 들어, 수포성 구내염); 오르비바이러스과(Orbiviridae)에 의해 야기되는 질병(예를 들어, 블루텅(Bluetongue)); 박테리아에 의해 야기되는 질병(예를 들어, 전염병(Plague), 야생토끼병(Tularaemia), 큐(Q) 열, 로키산 홍반열(Rocky Mountain spotted fever), 발진열(Murine typhus), 부톤네즈 열(Boutonneuse fever), 퀸즐랜드 진드기 티푸스(Queensland tick typhus), 시베리아 진드기 티푸스, 스크럽 티푸스(Scrub typhus), 재귀열 또는 라임병); 또는 원생동물에 의해 야기되는 질병(예를 들어, 말라리아, 아프리카 트리파노소마증(African trypanosomiasis), 나가나(Nagana), 샤가스병(Chagas disease), 리슈마니아증(Leishmaniasis), 피로플라스마증(Piroplasmosis), 밴크로프트 사상충증(Bancroftian filariasis) 또는 브루그 사상충증(Brugian filariasis))을 포함한다.
i. 병원체 벡터
본원에 제공된 방법 및 조성물은 동물 병원체에 대한 벡터의 건강을 감소시키는데 유용할 수 있다. 일부 경우에, 벡터는 곤충일 수 있다. 예를 들어, 곤충 벡터는 반시류 및 일부 막시류 및 파리류, 예컨대 모기, 벌, 말벌, 깔따구, 이, 체체파리, 벼룩 및 개미, 및 거미류의 구성원, 예컨대 진드기 및 응애; 아카리아(Acarina)(진드기 및 응애)의 목, 강 또는 과, 예를 들어, 대표적인 과, 공주진드기과(Argasidae), 새진드기과, 참진드기과, 양진드기류 또는 옴진드기류 및 대표적인 종, 암블리오마(Amblyomma) 종, 아노센톤(Anocenton) 종, 아가스(Argas) 종, 부필러스(Boophilus) 종, 케일레티엘라(Cheyletiella) 종, 코리오프테스(Chorioptes) 종, 데모덱스(Demodex) 종, 더마센토르(Dermacentor) 종, 덴마니수스(Denmanyssus) 종, 해모피살리스(Haemophysalis) 종, 히알로마(Hyalomma) 종, 익소데스(Ixodes) 종, 린자카루스(Lynxacarus) 종, 메소스티그마타(Mesostigmata) 종, 노토에드네스(Notoednes) 종, 오르니토도로스(Ornithodoros) 종, 오르니토니수스(Ornithonyssus) 종, 오토비우스(Otobius) 종, 오토덱테스(otodectes) 종, 뉴모니수스(Pneumonyssus) 종, 프소로프테스(Psoroptes) 종, 리피세팔러스(Rhipicephalus) 종, 산코프테스(Sancoptes) 종 또는 트롬비쿨라(Trombicula) 종; 이아목(흡혈이(sucking lice) 및 새털이(biting lice)), 예를 들어, 대표적인 종, 보비콜라(Bovicola) 종, 해마토피너스(Haematopinus) 종, 리노그나투스(Linognathus) 종, 메노폰(Menopon) 종, 페디쿨러스(Pediculus) 종, 펨피구스(Pemphigus) 종, 필록세라(Phylloxera) 종 또는 솔레노포테스(Solenopotes) 종; 파리목(파리), 예를 들어, 대표적인 종, 아에데스(Aedes) 종, 아노펠레스(Anopheles) 종, 칼리포라(Calliphora) 종, 크리소미아(Chrysomyia) 종, 크리소프스(Chrysops) 종, 코클리오미아(Cochliomyia) 종., Cw/ex 종, 쿨리코이데스(Culicoides) 종, 쿠테레브라(Cuterebra) 종, 더마토비아(Dermatobia) 종, 가스트로필러스(Gastrophilus) 종, 글로시나(Glossina) 종, 해마토비아(Haematobia) 종, 해마토포타(Haematopota) 종, 히포보스카(Hippobosca) 종, 하이포더마(Hypoderma) 종, 루실리아(Lucilia) 종, 라이페로시아(Lyperosia) 종, 멜로파거스(Melophagus) 종, 오에스트러스(Oestrus) 종, 파에니시아(Phaenicia) 종, 플레보토무스(Phlebotomus) 종, 포르미아(Phormia) 종, 진응애(개선충), 예를 들어, 사르코프티다에(Sarcoptidae) 종, 사르코파가(Sarcophaga) 종, 시물리움(Simulium) 종, 스토목시스(Stomoxys) 종, 타바누스(Tabanus) 종, 타니아(Tannia) 종 또는Zzpu/알파 종; 털이목(Mallophaga)(새털이), 예를 들어, 대표적인 종, 다말리나(Damalina) 종, 펠리콜라(Felicola) 종, 헤테로독서스(Heterodoxus) 종 또는 트리코덱테스(Trichodectes) 종; 또는 은시류(Siphonaptera)(날개없는 곤충), 예를 들어, 대표적인 종, 세라토필러스(Ceratophyllus) 종, 제놉실라(Xenopsylla) 종; 빈대과(Cimicidae)(노린재), 예를 들어, 대표적인 종, 시멕스(Cimex) 종, 트리토미나에(Tritominae) 종, 로디니우스(Rhodinius) 종 또는 트리아토마(Triatoma) 종에서 관찰되는 바와 같은 피어싱-흡혈 구기를 갖는 것들을 포함할 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다.
일부 경우에, 곤충은 파리목(예를 들어, 긴뿔파리(Nematocera) 아목, 예를 들어, 모기과)으로부터의 흡혈 곤충이다. 일부 경우에, 곤충은 보통모기(Culicinae), 코레트리나에(Corethrinae), 등에모기(Ceratopogonidae) 또는 먹파리(Simuliidae) 아과로부터의 것이다. 일부 경우에, 곤충은 쿨렉스(Culex) 종, 테오발디아(Theobaldia) 종, 아에데스(Aedes) 종, 아노펠레스(Anopheles) 종, 아에데스(Aedes) 종, 포르시포니이아(Forciponiyia) 종, 쿨리코이데스(Culicoides) 종 또는 헬레아(Helea) 종의 것이다.
특정 경우에, 곤충은 모기이다. 특정 경우에, 곤충은 진드기이다. 특정 경우에, 곤충은 응애이다. 특정 경우에, 곤충은 털이목이다.
F. 동물로의 운반
예를 들어, 동물 세포, 조직, 대상체 또는 그의 부분을 PMP 조성물과 접촉시키는 단계에 의한 동물 세포, 조직 또는 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)로의 PMP 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 변형 PMP를 포함함)의 운반 방법이 본원에 제공된다. 일부 경우에, 동물은 이종 기능성 제제를 포함하지 않는 PMP로 처리될 수 있다. 다른 경우에, PMP는 이종 기능성 제제, 예를 들어, 이종 치료제(예를 들어, 치료적 단백질 또는 펩티드 핵산, 또는 소분자, 항박테리아제, 항진균제, 살충제, 살선충제, 항기생충제, 항바이러스제 또는 기피제)를 포함한다.
일 양태에서, 동물의 건강의 증가 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은 본원에 기재된 PMP 조성물을 (예를 들어, 유효한 양 및 기간으로) 동물에 운반하여, 미처리 동물(예를 들어, PMP 조성물을 운반하지 않은 동물)에 비하여 동물의 건강을 증가시키는 단계를 포함한다.
PMP 조성물의 운반의 결과로서의 동물의 건강의 증가는 동물 건강(예를 들어, 포유동물의 건강, 예를 들어, 인간의 건강(예를 들어, 신체상태))을 평가하는 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다.
동물에 유효량의 본원에 제공된 PMP 조성물을 전달하는 것을 포함하는 동물의 건강의 증가 또는 변형 방법으로서, 당해 방법은 동물을 변형시킴으로써, 미처리 동물에 비하여(예를 들어, 약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 약 100% 초과로) 동물에 유익한 형질을 도입하거나 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 특히, 당해 방법은 미처리 동물에 비하여 동물, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간의 건강을 (예를 들어, 약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 약 100% 초과로) 증가시킬 수 있다.
추가의 양태에서, 동물의 세포를 유효량의 본원의 PMP 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 동물의 건강의 증가 방법으로서, 당해 방법은 미처리 동물에 비하여 동물, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간의 건강을 (예를 들어, 약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 약 100% 초과로) 증가시키는 방법이 본원에 제공된다.
특정 경우에, 동물은 포유동물, 예를 들어 인간이다. 특정 경우에, 동물은 가축 동물 또는 수의학적 동물이다. 특정 경우에, 동물은 마우스이다.
G. 적용 방법
본원에 기재된 식물은 식물로의 조성물의 운반 또는 투여를 가능하게 하는 임의의 적합한 방식으로 PMP 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 변형 PMP를 포함하는 것)에 노출될 수 있다. PMP 조성물은 단독으로 또는 다른 활성(예를 들어, 시비제) 또는 비활성 물질과 조합하여 운반될 수 있으며, 유효 농도의 PMP 조성물을 운반하도록 제형화된 농축액, 겔, 용액, 현탁액, 분무액, 분말, 펠렛, 브리켓(briquette), 브릭(brick) 등의 형태로, 예를 들어, 분무, 주입(예를 들어, 미세주입)에 의해, 설비, 푸어링(pouring), 딥핑(dipping)을 통해 적용될 수 있다. 본원에 기재된 조성물의 적용을 위한 양 및 위치는 일반적으로, 식물의 서식지, 식물이 PMP 조성물에 의해 표적화될 수 있는 생명주기 단계, 적용이 이루어져야 하는 장소, 및 PMP 조성물의 물리적 및 기능적 특징에 의해 결정된다.
일부 경우에, 조성물은 예를 들어, 백팩 분무, 항공 분무, 농작물 분무/살분 등에 의해 식물, 예를 들어, 농작물 상으로 직접 분무된다. PMP 조성물을 식물에 운반하는 경우에, PMP 조성물을 받는 식물은 임의의 식물 성장 단계에 있을 수 있다. 예를 들어, 제형화된 PMP 조성물은 식물 성장의 조기 단계에 종자-코팅 또는 뿌리 처리로서, 또는 농작물 사이클의 후기 단계에 전체 식물 처리로서 적용될 수 있다. 일부 경우에, PMP 조성물은 식물에 국소제로서 적용될 수 있다.
추가로, PMP 조성물은 식물의 조직의 도처에 흡수되고 분포되는 전신 제제로서 (예를 들어, 식물이 성장하는 토양 내에, 또는 식물에 관수하는데 사용되는 물 내에) 적용될 수 있다. 일부 경우에, 식물 또는 식품 유기체는 PMP 조성물을 발현하도록 유전학적으로 형질전환될 수 있다.
지연된 또는 연속 방출은 또한 PMP 조성물 또는 PMP 조성물(들)을 갖는 조성물을 용해성 또는 생침식성 코팅층, 예컨대 젤라틴으로 코팅하여, 이 코팅이 이용 환경에서 용해되거나 침식되어, 이어서 PMP 조성물을 이용 가능하게 만듬으로써 달성될 수 있거나, 또는 제제가 용해성 또는 침식성 매트릭스 내에 분산되게 함으로써 달성될 수 있다. 이러한 연속 방출 및/또는 분배 디바이스를 유리하게 사용하여, 유효 농도의 본원에 기재된 PMP 조성물 중 하나 이상을 지속적으로 유지할 수 있다.
일부 경우에, PMP 조성물은 식물의 부분, 예를 들어, 잎, 종자, 화분, 뿌리, 과실, 슈트 또는 꽃, 또는 그의 조직, 세포 또는 원형질체에 운반된다. 일부 경우에, PMP 조성물은 식물의 세포에 운반된다. 일부 경우에, PMP 조성물은 식물의 원형질체에 운반된다. 일부 경우에, PMP 조성물은 식물의 조직에 운반된다. 예를 들어, 조성물은 식물의 분열 조직(예를 들어, 정단 분열 조직, 측방 분열 조직 또는 절간 분열 조직)에 운반될 수 있다. 일부 경우에, 조성물은 식물의 영구 조직(예를 들어, 단순 조직(예를 들어, 실질조직, 후각조직 또는 후막조직) 또는 복합 영구 조직(예를 들어, 목부수액 또는 사부수액))에 운반된다. 일부 경우에, 조성물은 식물 배아에 운반된다.
일부 경우에, PMP 조성물은 필드 적용에 있어서 헥타르당 PMP의 양(g/ha 또는 ㎏/ha) 또는 헥타르당 활성 성분(예를 들어, 이종 기능성 제제 함유 또는 미함유 PMP)의 양 또는 산 당량(㎏ a.i./ha 또는 g a.i./ha)으로서 권고될 수 있다. 일부 경우에, 이종 기능성 제제가 PMP가 결여된 조성물에 적용되는 경우와 동일한 결과를 달성하기 위하여, 본 발명의 조성물에서 더 낮은 양의 이종 기능성 제제가 토양, 식물 배지, 종자 식물 조직 또는 식물에 적용되는데 필요할 수 있다. 예를 들어, 이종 기능성 제제의 양은 비-PMP 조성물에서 적용되는 동일한 이종 기능성 제제, 예를 들어, PMP가 없는 동일한 이종 기능성 제제의 직접적인 적용보다 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 50 또는 100배(또는 약 2 내지 약 100배의 임의의 범위, 예를 들어, 약 2 내지 10배; 약 5 내지 15배, 약 10 내지 20배; 약 10 내지 50배) 더 낮은 수준으로 적용될 수 있다. 본 발명의 PMP 조성물은 헥타르당 다양한 양, 예를 들어, 약 0.0001, 0.001, 0.005, 0.01, 0.1, 1, 2, 10, 100, 1,000, 2,000, 5,000(또는 약 0.0001 내지 5,000의 임의의 범위) ㎏/ha로 적용될 수 있다. 예를 들어, 약 0.0001 내지 약 0.01, 약 0.01 내지 약 10, 약 10 내지 약 1,000, 약 1,000 내지 약 5,000 kg/ha.
H. 치료적 방법
PMP 조성물(예를 들어, 본원에 기재되는 변형 PMP를 포함함)은 또한 다양한 치료 방법에서 유용할 수 있다. 예를 들어, 방법 및 조성물은 동물(예를 들어, 인간)에서의 병원체 감염의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “처리”는 예방적 및/또는 치료적 목적을 위하여 약제학적 조성물을 동물에 투여하는 것을 지칭한다. “감염을 예방하는 것”은 아직 아프지 않지만, 특정 질병에 걸리기 쉬운 또는 다르게는 특정 질병의 위험이 있는 동물의 예방적 처리를 지칭한다. “감염을 치료하는 것”은 동물의 질환을 개선시키거나 안정화시키기 위하여 이미 질병을 앓고 있는 동물에 대하여 치료를 시행하는 것을 지칭한다. 본 발명의 방법은 본원에 기재된 PMP 조성물을 동물, 예를 들어 인간에 운반하는 단계를 포함한다.
예를 들어, 진균 감염을 갖는 동물의 처리 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은 복수의 PMP를 포함하는 유효량의 PMP 조성물을 동물에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 당해 방법은 복수의 PMP를 포함하는 유효량의 PMP 조성물을 동물에 투여하는 단계를 포함하며, 복수의 PMP가 항진균제를 포함한다. 일부 경우에, 항진균제는 진균 감염을 야기하는 진균 내의 유전자의 발현을 저해하는 핵산이다(예컨대, 향상된 사상성 생육 단백질(Enhanced Filamentous Growth Protein)(EFG1)). 일부 경우에, 진균 감염이 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 의해 야기된다. 일부 경우에, 조성물은 아라비돕시스 아포플라스트 EV로부터 생산된 PMP를 포함한다. 일부 경우에, 당해 방법은 진균 감염을 감소시키거나 실질적으로 제거한다.
또 다른 양태에서, 박테리아 감염을 갖는 동물의 처리 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은 복수의 PMP를 포함하는 유효량의 PMP 조성물을 동물에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 당해 방법은 복수의 PMP를 포함하는 유효량의 PMP 조성물을 동물에 투여하는 단계를 포함하며, 복수의 PMP가 항박테리아제(예를 들어, 암포테리신 B)를 포함한다. 일부 경우에, 박테리아는 스트렙토코커스(Streptococcus) 종, 뉴모코커스(Pneumococcus) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 시겔라(Shigella) 종, 살모넬라(Salmonella) 종, 캄필로박터(Campylobacter) 종 또는 에스케리키아(Escherichia) 종이다. 일부 경우에, 조성물은 아라비돕시스 아포플라스트 EV로부터 생산된 PMP를 포함한다. 일부 경우에, 당해 방법은 박테리아 감염을 감소시키거나 실질적으로 제거한다. 일부 경우에, 동물은 인간, 수의학적 동물, 또는 가축 동물이다.
본 발명의 방법은 동물에서 (예를 들어, 동물 병원체에 의해 야기되는 바와 같은) 감염을 치료하는데 유용하며, 이는 질병을 이미 앓고 있는 동물에 대하여 치료를 시행하여, 동물의 질환을 개선시키거나 안정화시키는 것을 지칭한다. 이것은 개체에게 이익을 허용하고/허용하거나, 시작하는 양에 비하여 하나 이상의 병원체에 의한 동물 내의, 그 상의 또는 그 주변의 병원체의 콜로니화를 (예를 들어, 약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%) 감소시키는 것(예를 들어, 증상을 해소하기에 충분한 양으로 콜로니화를 감소시키는 것)을 포함할 수 있다. 그러한 경우에, 처리된 감염은 증상의 감소로서 나타날 수 있다(약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 약 100% 만큼). 일부 경우에, 처리된 감염은 개체의 생존 가능성을 증가시키거나(예를 들어, 약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 생존 가능성을 증가시킴), 또는 개체군의 전반적인 생존을 증가(예를 들어, 약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 생존 가능성을 증가시킴)시키는 데 유용하다. 예를 들어, 조성물 및 방법은 감염을 “실질적으로 제거”하기에 유효할 수 있으며, 이는 동물에서 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 동안) 증상을 지속 가능하게 해소하기에 충분한 양으로의 감염의 감소를 지칭한다.
본 발명의 방법은 (예를 들어, 동물 병원체에 의해 야기되는 바와 같은) 감염을 예방하는데 유용하며, 이는 초기 병원체 집단(예를 들어, 대략적으로 건강한 개체에서 관찰되는 양)을 유지하고/유지하거나, 감염의 발병을 예방하고/예방하거나, 감염과 관련된 증상 또는 질환을 예방하기에 충분한 양으로 하나 이상의 병원체에 의한 동물 내의, 그 상의 또는 그 주변의 콜로니화의 증가(예를 들어, 미처리 동물에 비하여 약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 또는 100% 초과)를 예방하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 개체는 면역손상된 개체(예를 들어, 암이 있거나, HIV/AIDS가 있거나, 면역억제제를 섭취하고 있는 개체)에서 또는 장기간 항생제 요법을 겪고 있는 개체에서, 침습적 의료 수술 준비 중(예를 들어, 수술 준비 중, 예컨대 이식, 줄기세포 요법, 이식편, 인공삽입물을 받는 중이거나, 장기간 또는 빈번한 정맥내 카테터 삽입을 받는 중이거나, 또는 중환자실에서 치료를 받는 중)인 동안 진균 감염을 예방하기 위한 예방적 처리를 받을 수 있다.
PMP 조성물은 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 경피, 동맥내, 복강내, 병소내, 두개내, 관절내, 전립선내, 늑막내, 기관내, 척추강내, 비강내, 질내, 직장내, 국부, 종양내, 복강내, 결막하, 소포내, 점막, 심낭내, 탯줄내, 안구내, 안와내, 경구, 국부, 경피, 유리체내(예를 들어, 유리체내 주사에 의함), 점안액에 의해, 흡입에 의해, 주사에 의해, 이식에 의해, 주입에 의해, 연속 주입에 의해, 직접적인 표적 세포 국소 관류 잠김에 의해, 카테터에 의해, 세척에 의해, 크림 또는 액체 조성물을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의한 투여를 위해 제형화되거나, 그에 의해 투여될 수 있다. 본원에 기재된 방법에서 사용되는 조성물은 또한 전신 투여 또는 국소 투여될 수 있다. 투여 방법은 다양한 요인(예를 들어, 투여되는 화합물 또는 조성물 및 치료되는 질환, 질병 또는 장애의 중증도)에 따라 달라질 수 있다. 일부 경우에, PMP 조성물은 정맥내, 근육내, 피하, 국부, 경구, 경피, 복강내, 안와내, 이식에 의해, 흡입에 의해, 척추강내, 심실내 또는 비강내로 투여된다. 투여는 부분적으로 투여가 단기적인지 만성적인지에 따라, 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어, 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해 이루어질 수 있다. 다양의 시점에 걸친 다수의 또는 단일의 투여, 볼루스(bolus) 투여 및 펄스(pulse) 주입을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 투여 일정이 본원에서 고려된다.
(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 병용하여 사용되는 경우) 본원에 기재된 감염의 예방 또는 치료에 있어서, 치료될 질병의 유형, 질병의 중증도 및 추이, 예방적 목적을 위해 투여되는지, 치료적 목적을 위해 투여되는지, 이전의 요법, 환자의 임상 병력 및 PMP 조성물에 대한 반응에 따라 달라질 것이다. PMP 조성물은 예를 들어, 한꺼번에 또는 일련의 처리에 걸쳐 환자에게 투여될 수 있다. 질환에 따른 수일 또는 그 이상에 걸친 반복 투여에 있어서, 치료는 일반적으로 요망되는 질병 증상의 억제가 발생할 때까지 또는 감염이 더 이상 검출 가능하지 않을 때까지 지속될 것이다. 이러한 용량은 (예를 들어, 환자가 예를 들어, 약 2 내지 약 20회 용량의 PMP 조성물을 받도록) 간헐적으로, 예를 들어, 매주 또는 2주마다 투여될 수 있다. 더 높은 초기 로딩 용량에 이어서 하나 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여 섭생이 유용할 수 있다. 이 요법의 진행은 종래의 기법 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
일부 경우에, 개체(예를 들어, 인간)에게 투여되는 PMP 조성물의 양은 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 5 g/㎏ (개체의 체중)(예를 들어, 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 0.1 ㎎/㎏, 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 1 ㎎/㎏, 약 1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏, 약 10 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏, 약 100 ㎎/㎏ 내지 1 g/㎏ 또는 약 1 g/㎏ 내지 5 g/㎏)의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 개체(예를 들어, 인간)에게 투여되는 PMP 조성물의 양은 적어도 0.01 ㎎/㎏ (개체의 체중)(예를 들어, 적어도 0.01 ㎎/㎏, 적어도 0.1 ㎎/㎏, 적어도 1 ㎎/㎏, 적어도 10 ㎎/㎏, 적어도 100 ㎎/㎏, 적어도 1 g/㎏ 또는 적어도 5 g/㎏)이다. 용량은 단회 용량 또는 다회 용량(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 7회 초과의 용량)으로서 투여될 수 있다. 일부 경우에, 동물에 투여되는 PMP 조성물은 단독으로 또는 추가의 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 치료에서 투여되는 항체의 용량은 단일의 치료에 비하여 감소될 수 있다. 이러한 요법의 진행은 종래의 기법에 의해 용이하게 모니터링된다.
IV. 키트
본 발명은 또한 본원에 기재된 PMP 조성물을 갖는 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 본 발명의 방법에 따라 식물에 대한 PMP 조성물의 적용 또는 운반에 대한 설명 자료를 추가로 포함할 수 있다. 당업자는 본 발명의 방법에서 PMP 조성물의 적용에 대한 설명이 임의의 형태의 설명일 수 있음을 인식할 것이다. 이러한 설명서는 기재된 설명 자료(예컨대, 라벨, 소책자, 팸플릿), (예컨대 오디오 카세트 또는 CD 상의) 구두의 설명 자료 또는 (예컨대 비디오 테이프 또는 DVD 상의) 비디오 설명을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
실시예
하기는 본 발명의 방법의 예이다. 다양한 다른 구현예가 상기 제공된 일반적인 설명을 고려하여 실시될 수 있음이 이해된다.
목차(실시예):
실시예 1. 식물로부터 식물 메신저 팩의 단리
실시예 2. 정제된 식물 메신저 팩(PMP)의 생산
실시예 3. 식물 메신저 팩 특성화.
실시예 4. 식물 메신저 팩 안정성의 특성화
실시예 5. 카고를 이용한 PMP 로딩.
실시예 6. PMP를 세포벽 투과 단백질로 변형시킴으로써 PMP 세포 흡수의 증가.
실시예 7. 이온성 액체를 사용한 PMP의 제형화에 의한 PMP 세포 흡수의 증가.
실시예 8. 불소 액체를 사용한 PMP의 제형화에 의한 PMP 세포 흡수의 증가.
실시예 9. 세포벽 투과를 개선시키기 위한 세제를 사용한 PMP의 제형화에 의한 PMP 흡수의 증가.
실시예 10. 쯔비터이온성 지질을 사용한 PMP의 제형화에 의한 PMP 세포 흡수의 증가.
실시예 11. 이온화 가능한 지질을 사용한 PMP의 제형화에 의한 PMP 세포 흡수의 증가.
실시예 12. 양이온성 지질을 사용한 PMP의 제형화에 의한 PMP 세포 흡수의 증가.
실시예 13. 양이온성 지질을 사용한 PMP의 변형.
실시예 14. 이온화 가능한 지질을 사용한 PMP의 변형.
실시예 15. 세포벽-투과 단백질 셀룰라제를 사용한 PMP의 변형.
실시예 1: 식물로부터 식물 메신저 팩의 단리
본 실시예는 잎 아포플라스트, 종자 아포플라스트, 뿌리, 과실, 채소, 화분, 사부수액, 목부수액 및 식물 세포 배양 배지를 포함하는 다양한 식물 공급원으로부터의 미정제 식물 메신저 팩(PMP)의 단리를 기술한다.
실험 설계:
a) 아라비돕시스 탈리아나 잎의 아포플라스트로부터의 PMP 단리
아라비돕시스(아라비돕시스 탈리아나 Col-0) 종자를 50% 표백제로 표면 살균하고, 0.8% 아가(agar)를 함유하는 0.53 무라시지 및 스쿡(Murashige and Skoog) 배지 상에 플레이팅한다. 종자를 4℃에서 2일 동안 춘화처리한 후, 단일 조건(9-h 일, 22℃, 150 μEm-2)으로 이동하였다. 1주 후에, 묘목을 Pro-Mix PGX로 전달한다. 식물을 수확 전에 4 내지 6주 동안 성장시킨다.
PMP를 문헌[Rutter and Innes, Plant Physiol. 173(1): 728-741, 2017]에 기재된 바와 같이, 4 내지 6주령 아라비돕시스 로제트의 아포플라스트 세척액으로부터 단리한다. 약술하여, 전체 로제트를 뿌리에서 수확하고, 소포 단리 완충액(20 mM MES, 2 mM CaCl2 및 0.1 M NaCl, pH6)으로 진공 침투시킨다. 침투된 식물을 조심히 닦아내어, 과잉의 유체를 제거하고, 30-㎖ 주사기 내측에 배치하고, 2℃에서 20분 동안 700g에서 50 ㎖ 코니컬 튜브에서 원심분리하여, EV를 함유하는 아포플라스트 세포외 유체를 수집한다. 다음으로, 아포플라스트 세포외 유체를 0.85 ㎛ 필터를 통해 여과하여, 큰 입자를 제거하고, PMP를 실시예 2에 기재된 바와 같이 정제한다.
b) 해바라기 종자의 아포플라스트로부터의 PMP 단리
무손상 해바라기 종자(에이치. 안누스 엘.(H. annuus L.))를 2시간 동안 수 중에 흡수시키고, 껍질을 벗겨 과피를 제거하고, 아포플라스트 세포외 유체를 문헌[Regente et al, FEBS Letters. 583: 3363-3366, 2009]으로부터 조정된, 변형된 진공 침투-원심분리 절차에 의해 추출한다. 약술하여, 종자를 소포 단리 완충액(20 mM MES, 2 mM CaCl2 및 0.1 M NaCl, pH6)에 침지시키고, 45 kPa의 압력에서 30초 간격으로 분리된 10초의 3회의 진공 펄스로 처리한다. 침투된 종자를 회수하고, 여과지 상에서 건조시키고, 소결 유리 필터에 넣고, 4℃에서 400g에서 20분 동안 원심분리한다. 아포플라스트 세포외 유체를 회수하고, 0.85 ㎛ 필터를 통해 여과하여, 큰 입자를 제거하고, PMP를 실시예 2에 기재된 바와 같이 정제한다.
c) 생강 뿌리로부터의 PMP 단리
신선한 생강(진지베르 오피시날레(Zingiber officinale)) 근경 뿌리를 지역 공급처로부터 구입하고, PBS로 3회 세척한다. 총 200 그램의 세척된 뿌리를 가장 높은 속도에서 10분 동안 믹서(오스테리저(Osterizer) 12-속도 블렌더)에서 분쇄하고(1분의 블렌딩마다 1분 정지), PMP를 문헌[Zhuang et al., J Extracellular Vesicles. 4(1):28713, 2015]에 기재된 바와 같이 단리한다. 약술하여, 생강 즙을 1,000g에서 10분 동안, 3,000g에서 20분 동안 및 10,000g에서 40분 동안 순차적으로 원심분리하여, PMP-함유 상청액으로부터 큰 입자를 제거한다. PMP를 실시예 2에 기재된 바와 같이 정제한다.
d) 자몽 즙으로부터의 PMP 단리
신선한 자몽(시트러스(Citrus) x 파라디시(paradisi))를 지역 공급처로부터 구입하고, 그들의 껍질을 제거하고, 과실을 미소한 변형과 함께 문헌[Wang et al., Molecular Therapy. 22(3): 522-534, 2014]에 기재된 바와 같이, 가장 높은 속도에서 10분 동안 믹서(오스테리저 12-속도 블렌더)에서 수동으로 압착하거나 분쇄하여(1분의 블렌딩마다 1분 정지), 즙을 수집한다. 약술하여, 즙/즙 펄프를 1,000g에서 10분 동안, 3,000g에서 20분 동안 및 10,000g에서 40분 동안 순차적으로 원심분리하여, PMP-함유 상청액으로부터 큰 입자를 제거한다. PMP를 실시예 2에 기재된 바와 같이 정제한다.
e) 브로콜리 헤드로부터의 PMP 단리
브로콜리(브라시카 올레라세아(Brassica oleracea) 변종 이탈리카(italica))를 이전에 기재된 바와 같이(문헌[Deng et al., Molecular Therapy, 25(7): 1641-1654, 2017]) 단리한다. 약술하여, 신선한 브로콜리를 지역 공급처로부터 구입하고, PBS로 3회 세척하고, 가장 높은 속도에서 10분 동안 믹서(오스테리저 12-속도 블렌더)에서 분쇄한다(매분의 블렌딩마다 1분 정지). 그런 다음, 브로콜리 즙을 1,000g에서 10분 동안, 3,000g에서 20분 동안 및 10,000g에서 40분 동안 순차적으로 원심분리하여, PMP-함유 상청액으로부터 큰 입자를 제거한다. PMP를 실시예 2에 기재된 바와 같이 정제한다.
f) 올리브 화분으로부터의 PMP 단리
올리브(올레아 유로파에아(Olea europaea)) 화분 PMP를 이전에 문헌[Prado et al., Molecular Plant. 7(3):573-577, 2014]에 기재된 바와 같이 단리한다. 약술하여, 올리브 화분(0.1 g)을 실온에서 30분 동안 습식 챔버에서 수화시킨 후, 20 ㎖의 발아 배지: 10% 수크로스, 0.03% Ca(NO3)2, 0.01% KNO3, 0.02% MgSO4 및 0.03% H3BO3를 함유하는 페트리 디쉬(직경 15 ㎝)로 옮긴다. 화분을 30℃에서 암 중에 16시간 동안 발아시킨다. 화분립은 튜브가 화분립의 직경보다 더 긴 경우에만 발아된 것으로 간주된다. PMP를 함유하는 배양된 배지를 수집하고, 원심분리에 의해 0.85 ㎛ 필터에서의 2회의 연속 여과에 의해 화분 데브리스를 제거한다. PMP를 실시예 2에 기재된 바와 같이 정제한다.
g) 아라비돕시스 사부수액으로부터의 PMP 단리
아라비돕시스(아라비돕시스 탈리아나 Col-0) 종자를 50% 표백제로 표면 살균하고, 0.8% 아가(agar)를 함유하는 0.53 무라시지 및 스쿡(Murashige and Skoog) 배지 상에 플레이팅한다. 종자를 4℃에서 2일 동안 춘화처리한 후, 단일 조건(9-h 일, 22℃, 150 μEm-2)으로 이동하였다. 1주 후에, 묘목을 Pro-Mix PGX로 전달한다. 식물을 수확 전에 4 내지 6주 동안 성장시킨다.
4 내지 6주령 아라비돕시스 로제트 잎으로부터의 사부수액을 문헌[Tetyuk et al., JoVE. 80, 2013]에 기재된 바와 같이 수집한다. 약술하여, 잎을 잎자루의 기부에서 절단하고, 스태킹하고, 암 중에 1시간 동안 20 mM K2-EDTA를 함유하는 반응 튜브에 넣어, 상처의 봉합을 방지한다. 잎을 용기로부터 조심히 제거하고, 멸균수로 완전히 세척하여, 모든 EDTA를 제거하고, 깨끗한 튜브에 넣고, 사부수액을 암 중에 5 내지 8시간 동안 수집한다. 잎을 폐기하고, 사부수액을 0.85 ㎛ 필터를 통해 여과하여, 큰 입자를 제거하고, PMP를 실시예 2에 기재된 바와 같이 정제한다.
h) 토마토 식물 목부수액으로부터의 PMP 단리
토마토(솔라눔 라이코페르시쿰(Solanum lycopersicum)) 종자를 유기-풍부 토양, 예컨대 선샤인 믹스(Sunshine Mix)(선 그로 호르티컬쳐(Sun Gro Horticulture), 미국 매사추세츠주 아가왐 소재)에서 단일의 포트에 식재하고, 22℃ 내지 28℃ 사이의 온실에 유지한다. 발아 약 2주 후에, 2개의 본엽 단계에, 묘목을 90% 모래 및 10% 유기 믹스를 함유하는 멸균 모래 토양으로 채워진 포트(10 ㎝ 직경 및 17 ㎝ 깊이) 내로 개별적으로 이식한다. 식물을 22 내지 28℃의 온실에서 4주 동안 유지한다.
4주령 토마토 식물로부터의 목부수액을 문헌[Kohlen et al., Plant Physiology. 155(2):721-734, 2011]에 기재된 바와 같이 수집한다. 약술하여, 토마토 식물을 하배축 위에서 순지르기하고, 플라스틱 고리를 줄기 주위에 둔다. 축적하는 목부수액을 순지르기 후에 90분 동안 수집한다. 목부수액을 0.85 ㎛ 필터를 통해 여과하여, 큰 입자를 제거하고, PMP를 실시예 2에 기재된 바와 같이 정제한다.
i) 담배 BY-2 세포 배양 배지로부터의 PMP 단리
담배 BY-2(니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) L 재배종 브라이트 옐로우(Bright Yellow) 2) 세포를 30 g/ℓ 수크로스, 2.0 ㎎/ℓ 인산이수소칼륨, 0.1 g/ℓ 미오-이노시톨, 0.2 ㎎/ℓ 2,4-디클로로페녹시아세트산 및 1 ㎎/ℓ 티아민 HCl이 보충된 MS 염(두케파(Duchefa), 네덜란드 하를렘 소재, at#M0221)으로 구성된 MS(문헌[Murashige and Skoog, 1962]) BY-2 배양 배지(pH 5.8) 중에 26℃에서 180 rpm의 진탕기 상에 암 중에 배양한다. 7일 지난 세포 배양물의 5%(v/v)를 100 ㎖의 신선한 액체 배지 내로 옮김으로써 BY-2 세포를 주마다 계대배양한다. 72 내지 96시간 후에, BY-2 배양된 배지를 수집하고, 4℃에서 300 g에서 10분 동안 원심분리하여, 세포를 제거한다. PMP를 함유하는 상청액을 수집하고, 0.85 ㎛ 필터 상에서의 여과에 의해 데브리스를 제거한다. PMP를 실시예 2에 기재된 바와 같이 정제한다.
실시예 2: 정제된 식물 메신저 팩(PMP)의 생산
본 실시예는 크기-배제 크로마토그래피, 밀도 기울기(이오딕사놀 또는 수크로스), 및 침전 또는 크기-배제 크로마토그래피에 의한 응집물의 제거와 조합된 한외여과를 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같은 미정제 PMP 분획으로부터의 정제된 PMP의 생산을 기술한다.
실험 설계:
a) 크기-배제 크로마토그래피와 조합된 한외여과를 사용한 정제된 자몽 PMP의 생산
실시예 1a로부터의 미정제 자몽 PMP 분획을 100-kDA 분자량 컷-오프(MWCO) 아미콘(Amicon) 스핀 필터(spin filter)(머크 밀리포어(Merck Millipore))를 사용하여 농축시킨다. 이후에, 농축된 미정제 PMP 용액을 PURE-EV 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(한사바이오메드 라이프 사이언스즈 리미티드(HansaBioMed Life Sciences Ltd)) 상으로 로딩하고, 제조처의 설명에 따라 단리한다. 정제된 PMP-함유 분획을 용리 후에 풀링한다. 선택적으로, PMP를 100-kDa MWCO 아미콘 스핀 필터를 사용하여 또는 접선 흐름 여과(TFF)에 의해 추가로 농축시킬 수 있다. 정제된 PMP를 실시예 3에 기재된 바와 같이 분석한다.
b) 이오딕사놀 기울기를 사용하여 정제된 아라비돕시스 아포플라스트 PMP의 생산
미정제 아라비돕시스 잎 아포플라스트 PMP를 실시예 1a에 기재된 바와 같이 단리하고, 정제된 PMP를 문헌[Rutter and Innes, Plant Physiol. 173(1): 728-741, 2017]에 기재된 바와 같이 이오딕사놀 기울기를 사용함으로써 생성한다. 불연속 이오딕사놀 기울기(옵티프렙(OptiPrep); 시그마-알드리치)를 제조하기 위하여, 수성 60% 옵티프렙 모액을 소포 단리 완충액(VIB; 20 mM MES, 2 mM CaCl2 및 0.1 M NaCl, pH6) 중에 희석함으로써 40%(v/v), 20%(v/v), 10%(v/v) 및 5%(v/v) 이오딕사놀의 용액을 생성한다. 3 ㎖의 40% 용액, 3 ㎖의 20% 용액, 3 ㎖의 10% 용액 및 2 ㎖의 5% 용액을 층화시킴으로써, 기울기를 형성한다. 실시예 1a로부터의 미정제 아포플라스트 PMP 용액을 4℃에서 40,000g에서 60분 동안 원심분리한다. 펠렛을 0.5 ㎖의 VIB 중에 재현탁화시키고, 기울기의 상측에 층화시킨다. 원심분리를 4℃에서 100,000g에서 17시간 동안 수행한다. 기울기의 상측의 처음 4.5 ㎖을 폐기하고, 이후에 아포플라스트 PMP를 함유하는 3배 부피의 0.7 ㎖을 수집하고, VIB를 사용하여 3.5 ㎖까지 올리고, 4℃에서 100,000g에서 60분 동안 원심분리한다. 펠렛을 3.5 ㎖의 VIB로 세척하고, 동일한 원심분리 조건을 사용하여 재펠렛화시킨다. 정제된 PMP 펠렛을 실시예 3에 기재된 바와 같은 이후의 분석을 위하여 조합한다.
c) 수크로스 기울기를 사용하여 정제된 자몽 PMP의 생산
미정제 자몽 즙 PMP를 실시예 1d에 기재된 바와 같이 단리하고, 150,000g에서 90분 동안 원심분리하고, PMP-함유 펠렛을 기재된 바와 같이(문헌[Mu et al., Molecular Nutrition & Food Research. 58(7):1561-1573, 2014]) 1 ㎖의 PBS 중에 재현탁화시킨다. 재현탁화된 펠렛을 수크로스 단계 기울기(8%/15%/30%/45%/60%)로 전달하고, 150,000g에서 120분 동안 원심분리하여, 정제된 PMP를 생성한다. 정제된 자몽 PMP를 30%/45% 계면으로부터 수집한 후에, 실시예 3에 기재된 바와 같이 분석한다.
d) 자몽 PMP로부터의 응집물의 제거
실시예 1d에 기재된 바와 같이 생성된 자몽 PMP 또는 실시예 2a 내지 2c로부터의 정제된 PMP로부터 단백질 응집물을 제거하기 위하여, 추가의 정제 단계를 포함시킬 수 있다. 생성된 PMP 용액을 다양한 pH를 통해 취하여, 단백질 응집물을 용액 중에 침전시킨다. 수산화나트륨 또는 염산의 첨가와 함께 pH를 3, 5, 7, 9 또는 11로 조정한다. pH를 보정된 pH 프로브를 사용하여 측정한다. 용액이 특정 pH로 존재하면, 그것을 여과하여, 미립자를 제거한다. 대안적으로, 단리된 PMP 용액을 하전된 중합체, 예컨대 폴리민(Polymin)-P 또는 프라에스톨(Praestol) 2640의 첨가를 사용하여 응집시킬 수 있다. 약술하여, ℓ당 2 내지 5 g의 폴리민-P 또는 프라에스톨 2640을 용액에 첨가하고, 임펠러를 사용하여 혼합한다. 그 다음, 용액을 여과하여 미립자를 제거한다. 대안적으로, 염 농도를 증가시킴으로써 응집물을 가용화시킨다. NaCl이 1 mol/ℓ로 존재할 때까지 이를 PMP 용액에 첨가한다. 그 다음, 용액을 여과하여, PMP를 정제한다. 대안적으로, 온도를 증가시킴으로써 응집물을 가용화시킨다. 단리된 PMP 혼합물을 그것을 5분 동안 50℃의 균일한 온도에 도달할 때까지 혼합 하에 가열한다. 그 다음, PMP 혼합물을 여과하여 PMP를 단리한다. 대안적으로, PMP 용액으로부터의 가용성 오염물질을 표준 절차에 따른 크기-배제 크로마토그래피 컬럼에 의해 분리하며, PMP는 제1 분획에서 용리되는 한편, 단백질 및 리보핵단백질 및 일부 지질단백질이 이후에 용리된다. CA/브래드포드(Bradford) 단백질 정량화를 통한 단백질 응집물의 제거 이전 및 이후에 단백질 농도를 측정하고 비교함으로써 단백질 응집물 제거의 효율을 결정한다. 생성된 PMP를 실시예 3에 기재된 바와 같이 분석한다.
실시예 3: 식물 메신저 팩 특성화
본 실시예는 실시예 1 또는 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성된 PMP의 특성화를 기술한다.
실험 설계:
a) PMP 농도의 결정
제조처의 설명에 따라 말버른 나노사이트(Malvern NanoSight)를 사용하는 나노입자 트래킹 분석(Nanoparticle Tracking Analysis; NTA)에 의해 또는 아이존 큐나노(iZon qNano))를 사용하는 가변 저항 펄스 감지(Tunable Resistive Pulse Sensing; TRPS)에 의해 PMP 입자 농도를 결정한다. DC 단백질 검정(바이오-라드(Bio-Rad))을 사용함으로써 정제된 PMP의 단백질 농도를 결정한다. 정제된 PMP의 지질 농도를 문헌[Rutter and Innes, Plant Physiol. 173(1): 728-741, 2017]에 기재된 바와 같이 형광 친지성 염료, 예컨대 DiOC6(아이씨엔 바이오메디컬즈(ICN Biomedicals))을 사용하여 결정한다. 약술하여, 실시예 2로부터의 정제된 PMP 펠렛을 MES 완충액(20 mM MES, pH 6) + 1% 식물 프로테아제 억제제 칵테일(시그마-알드리치) 및 2 mM 2,29-디피리딜 디술피드로 희석된 10 mM DiOC6(아이씨엔 바이오메디컬즈) 100 ㎖ 중에 재현탁화시킨다. 재현탁화된 PMP를 37℃에서 10분 동안 인큐베이션시키고, 3 ㎖의 MES 완충액으로 세척하고, 재펠렛화시키고(40,000g, 60분, 4℃), 신선한 MES 완충액 중에 재현탁화시킨다. DiOC6 형광 세기를 485 ㎚ 여기 및 535 ㎚ 방출에서 측정한다.
b) PMP의 생물물리학적 및 분자적 특성화
PMP를 문헌[Wu et al., Analyst. 140(2):386-406, 2015]으로부터의 프로토콜에 따라, JEOL 1010 투과 전자 현미경에서 전기 및 초저온-전자 현미경법에 의해 특성화한다. PMP의 크기 및 제타 전위를 또한 제조처의 설명에 따라 말베른 제타사이저(Malvern Zetasizer) 또는 아이존 큐나노를 사용하여 측정한다. 지질을 클로로포름 추출을 사용하여 PMP로부터 단리하고, 문헌[Xiao et al. Plant Cell. 22(10): 3193-3205, 2010]에 나타낸 바와 같이 LC-MS/MS로 특성화한다. 글리코실 이노시톨 포스포릴세라미드(GIPC) 지질을 문헌[Cacas et al., Plant Physiology. 170: 367-384, 2016]에 기재된 바와 같이 추출하고 정제하고, 상기 기재된 바와 같이 LC-MS/MS에 의해 분석한다. 전체 RNA, DNA 및 단백질을 설명에 따라 써모 피셔로부터의 Quant-It 키트를 사용하여 특성화한다. PMP 상의 단백질을 문헌[Rutter and Innes, Plant Physiol. 173(1): 728-741, 2017]에서의 프로토콜에 따라 LC-MS/MS에 의해 특성화한다. RNA 및 DNA를 트리졸(Trizol)을 사용하여 추출하고, 일루미나(Illumina)로부터의 넥스테라 메이트 페어 라이브러리 프렙 키트(Nextera Mate Pair Library Prep Kit) 및 리보-제로(Ribo-Zero) 식물 키트를 사용하여 TruSeq 전체 RNA를 갖는 라이브러리로 제조하고, 제조처의 설명에 따라 일루미나 MiSeq에서 시퀀싱한다.
실시예 4: 식물 메신저 팩 안정성의 특성화
본 실시예는 매우 다양한 저장 및 생리학적 조건 하에서의 PMP의 안정성을 측정하는 것을 기술한다.
실험 설계:
실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성된 PMP를 다양한 조건으로 처리한다. PMP를 물, 5% 수크로스 또는 PBS 중에 현탁화시키고, -20℃, 4℃, 20℃ 및 37℃에서 1, 7, 30 및 180일 동안 놔둔다. 또한, PMP를 수 중에 현탁화시키고, 회전식 증발기 시스템을 사용하여 건조하고, 4℃, 20℃ 및 37℃에서 1, 7 및 30, 및 180일 동안 놔둔다. 또한, PMP를 물 또는 5% 수크로스 용액 중에 현탁화시키고, 액체 질소 중에 급속-동결시키고, 동결건조시킨다. 그 다음, 1, 7, 30 및 180일 후에, 건조되고 동결건조된 PMP를 수 중에 재현탁화시킨다. 또한, 0℃ 초과의 온도에서의 조건을 사용한 이전의 3가지 실험을 인공 태양광 시뮬레이터에 노출시켜, 모의 야외 UV 조건에서 내용물 안정성을 결정한다. 또한, PMP를 1 유닛의 트립신의 부가와 함께 또는 그것 없이, 1, 3, 5, 7 및 9의 pH를 갖는 완충 용액에서, 또는 다른 모의 위액에서, 1, 6 및 24시간 동안 37℃, 40℃, 45℃, 50℃ 및 55℃의 온도로 처리한다.
각각의 이들 처리 후에, PMP가 다시 20℃가 되게 하고, pH 7.4로 중화시키고, 실시예 3에 기재된 방법의 일부 또는 모두를 사용하여 특성화한다.
실시예 5. 카고를 이용한 PMP 로딩.
본 실시예에는 식물에서 PMP 흡수 효율을 결정하기 위한 프로브로서 사용하기 위한 소분자, 단백질 및 핵산으로 PMP를 로딩하는 방법이 기재되어 있다.
a) PMP 내로의 소분자의 로딩
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 생산한다. PMP 내로 소분자를 로딩하기 위하여, PMP를 고체 형태의 또는 가용화된 소분자를 갖는 PBS 용액 중에 배치한다. 용액을 문헌[Sun, Mol. Ther., 2010]의 프로토콜에 따라, 22℃에서 1시간 동안 놔둔다. 대안적으로, 용액을 문헌[Wang et al, Nature Comm., 2013]으로부터의 프로토콜에 따라 음파분해하여, 천공 및 엑소좀 내로의 확산을 유도한다. 대안적으로, PMP를 문헌[Wahlgren et al, Nucl. Acids. Res. 2012]으로부터의 프로토콜에 따라 전기천공시킨다.
대안적으로, PMP 지질을 3.75 ㎖의 2:1(v/v) MeOH:CHCl3을 PBS 중 PMP 1 ㎖에 첨가함으로써 단리시키고, 와류시킨다. CHCl3(1.25 ㎖) 및 ddH2O(1.25 ㎖)를 순차적으로 첨가하고, 와류시킨다. 그 다음, 혼합물을 유리관 내에서, 22℃에서 10분 동안 2,000 r.p.m.에서 원심분리하여, 혼합물을 2개의 상(수성 상 및 유기 상)으로 분리한다. PMP 지질을 함유하는 유기상 시료를 질소(2 psi) 하에 가열함으로써 건조한다. 소분자-로딩된 PMP를 생산하기 위해, 단리된 PMP 지질을 소분자 용액과 혼합하고, 문헌[Haney et al, J Contr. Rel., 2015]으로부터의 프로토콜에 따라 지질 압출기를 통과시킨다.
사용 전에, 로딩된 PMP를 실시예 2에 기재된 방법을 사용하여 정제하여, 비결합된 소분자를 제거한다. 로딩된 PMP를 실시예 3에 기재된 바와 같이 특성화하며, 그들의 안정성을 실시예 4에 기재된 바와 같이 시험한다.
b) PMP 내로의 단백질 또는 펩티드의 로딩
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 생산한다. 단백질 또는 펩타이드를 PMP로 로딩시키기 위해, PMP를 PBS 중 단백질 또는 펩티드를 갖는 용액에 둔다. 단백질 또는 펩티드가 불용성이면, 그것이 가용성일 때까지 pH를 조정한다. 단백질 또는 펩티드가 여전히 불용성이면, 불용성 단백질 또는 펩티드를 사용한다. 그 다음, 용액을 문헌[Wang et al, Nature Comm., 2013]으로부터의 프로토콜에 따라 음파분해하여, 천공 및 PMP 내로의 확산을 유도한다. 대안적으로, PMP를 문헌[Wahlgren et al, Nucl. Acids. Res. 2012]으로부터의 프로토콜에 따라 전기천공시킨다.
대안적으로, PMP 지질을 3.75 ㎖의 2:1(v/v) MeOH:CHCl3을 PBS 중 PMP 1 ㎖에 첨가함으로써 단리시키고, 와류시킨다. CHCl3(1.25 ㎖) 및 ddH2O(1.25 ㎖)를 순차적으로 첨가하고, 와류시킨다. 그 다음, 혼합물을 유리관 내에서, 22℃에서 10분 동안 2,000 r.p.m.에서 원심분리하여, 혼합물을 2개의 상(수성 상 및 유기 상)으로 분리한다. PMP 지질을 함유하는 유기상 시료를 질소(2 psi) 하에 가열함으로써 건조한다. 소분자-로딩된 PMP를 생산하기 위해, 단리된 PMP 지질을 소분자 용액과 혼합하고, 문헌[Haney et al, J Contr. Rel., 2015]으로부터의 프로토콜에 따라 지질 압출기를 통과시킨다.
사용 전에, 로딩된 PMP를 실시예 2에 기재된 방법을 사용하여 정제하여, 비결합된 펩티드 및 단백질을 제거한다. 로딩된 PMP를 실시예 3에 기재된 바와 같이 특성화하며, 그들의 안정성을 실시예 4에 기재된 바와 같이 시험한다. 단백질 또는 펩티드의 로딩을 측정하기 위하여, 피어스(Pierce) 정량적 발색제 펩티드 검정을 로딩된 및 비로딩된 PMP의 작은 시료 상에서 사용한다.
c) PMP 내로의 핵산의 로딩
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 생산한다. 핵산을 PMP로 로딩시키기 위해, PMP를 PBS 중 핵산을 갖는 용액에 둔다. 그 다음, 용액을 문헌[Wang et al, Nature Comm., 2013]으로부터의 프로토콜에 따라 음파분해하여, 천공 및 PMP 내로의 확산을 유도한다. 대안적으로, PMP를 문헌[Wahlgren et al, Nucl. Acids. Res. 2012]으로부터의 프로토콜에 따라 전기천공시킨다.
대안적으로, PMP 지질을 3.75 ㎖의 2:1(v/v) MeOH:CHCl3을 PBS 중 PMP 1 ㎖에 첨가함으로써 단리시키고, 와류시킨다. CHCl3(1.25 ㎖) 및 ddH2O(1.25 ㎖)를 순차적으로 첨가하고, 와류시킨다. 그 다음, 혼합물을 유리관 내에서, 22℃에서 10분 동안 2,000 r.p.m.에서 원심분리하여, 혼합물을 2개의 상(수성 상 및 유기 상)으로 분리한다. PMP 지질을 함유하는 유기상 시료를 질소(2 psi) 하에 가열함으로써 건조한다. 소분자-로딩된 PMP를 생산하기 위해, 단리된 PMP 지질을 소분자 용액과 혼합하고, 문헌[Haney et al, J Contr. Rel., 2015]으로부터의 프로토콜에 따라 지질 압출기를 통과시킨다.
사용 전에, PMP를 실시예 2에 기재된 방법을 사용하여 정제하여, 비결합된 핵산을 제거한다. 로딩된 PMP를 실시예 3에 기재된 바와 같이 특성화하며, 그들의 안정성을 실시예 4에 기재된 바와 같이 시험한다. PMP에 로딩되는 핵산을 제조처의 설명에 따라 써모 피셔(Thermo Fisher)로부터의 퀀트-It 검정을 사용하여 정량화하거나, 핵산이 형광 표지된다면, 형광을 플레이트 판독기로 정량화한다.
실시예 6. PMP를 세포벽 투과 단백질로 변형시킴으로써 PMP 세포 흡수의 증가
본 실시예에는 세포벽 성분의 분해를 용이하게 하기 위한 셀룰라제를 이용한 PMP의 변형에 의하여, 식물, 진균 또는 박테리아 세포 내로의 PMP의 세포 흡수를 증가시키는 것이 기재되어 있다. 본 실시예에서, 셀룰라제가 모델 세포벽 분해 효소로서, 자몽 PMP가 모델 PMP로서, 목화가 모델 식물로서, 사카로마이세스 세레비지애가 모델 효모로서, 스클레로티니아 스클레로티오룸이 모델 진균으로서, 그리고 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae)가 모델 박테리아로서 사용된다.
실험 프로토콜:
a) 셀룰라제-PEG4-아지드의 합성
셀룰라제(시그마 알드리치(Sigma Aldrich))를 제조처의 설명에 따라 NHS-PEG4-아지드(써모피셔 사이언티픽)와 반응시킨다. 약술하여, 단백질을 5 mg/mL 초과의 농도로 PBS 중에 용해시키고, NHS-PEG4-아지드를 단백질의 부피의 10%와 동일한 부피의 DMF 중에 단백질에 대하여 10배 몰 과량으로 용해시킨다. 그 다음, 2개의 용액을 혼합하고, 2시간 동안 얼음 상에 둔다. 그 다음, 1 M Tris-HCl을 100 mM의 최종 농도로 첨가함으로써 반응을 중단한다. 관을 얼음 상에 15분 동안 놓아 완전히 켄칭시킨 다음, 완충액 교환을 제바 스핀 탈염 컬럼(Zeba spin desalting column)을 사용하여 수행한다.
b) 셀룰라제를 사용한 PMP의 변형
DSPE-PEG2000-DBCO를 클로로포름 중에 용해시키고, 시험관에 붓고, 진공 건조시켜, 박막을 형성한다. 그 다음, 그것을 PBS 중에 1%, 5%, 10%, 20% 및 50 %w/v 용액으로 재현탁화시켜 작은 미셀을 생성한다. 등몰량의 셀룰라제-PEG4-아지드를 용액에 첨가한다. 용액이 4°C에서 16시간 동안 반응되게 한다. 그런 다음, 용액을 실시예 1 및 실시예 2에서 생산된 PMP와 합하고, 문헌[Haney et al, J Contr. Rel., 2015]으로부터의 프로토콜에 따라 압출기를 통해 혼합한다. 충분한 양의 셀룰라제를 이 방식으로 PMP에 부착시켜, 독성의 증가 없이 세포벽 투과를 증가시킨다. 대안적으로, PMP의 외측을 변형시키기 위한 다른 방법은 문헌[Spanedda et al., Methods Mol Bio, 2016]에 기재된 바와 같이 사용된다.
생성되는 PMP를 실시예 2에 기재된 바와 같이 초원심분리 또는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 실시예 3 및 실시예 4의 방법을 사용하여 특성화하고, 안정성을 시험한다. 셀룰라제 활성을 제조처의 프로토콜에 따라 형광측정 셀룰라제 활성 검정 키트(아브캄(Abcam))를 사용하여 측정한다.
c) GFP 단백질이 로딩된 셀룰라제-변형 자몽 PMP를 사용하여 사카로마이세스 세레비지애에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산하고, 실시예 5에 기재된 바와 같이 GFP 단백질로 로딩한다. 일부 PMP를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 6b에 기재된 바와 같이 셀룰라제로 변형시킨다. PMP의 GFP 캡슐화를 웨스턴 블롯 또는 형광에 의해 측정하였다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, PKH26 표지 키트의 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 비표지된 염료를 실시예 2에 기재된 방법에 의해 세척 제거하고, 표지된 PMP 펠렛을 PBS 중에 재현탁화시킨다. GFP-로딩된 셀룰라제-변형된 PKH26-표지된 PMP에 비한 GFP-로딩된 변형 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 사카로마이세스 세레비지애 진균 세포를 처리하였다.
사카로마이세스 세레비지애를 ATCC(#9763)로부터 수득하고, 제조처의 지침에 따라 이를 효모 추출물 펩톤 덱스트로스 브로쓰(YPD)에서 30℃에서 유지하였다. 사카로마이세스 세레비지애에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 효모 세포를 선별 배지에서 OD600 0.4 내지 0.6까지 성장시키고, 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PKH26-표지된 GFP-로딩된 변형 PMP, 또는 미변형 PMP와 유리 슬라이드 상에서 직접 인큐베이션시킨다. PBS 대조군에 더하여, 사카로마이세스 세레비지애 세포를 PKH26 염료(최종 농도 5 ㎍/㎖)의 존재 하에 인큐베이션시킨다. 실온에서 5분, 30분 및 1시간의 인큐베이션 후에, 이미지를 고해상도 형광 현미경에서 획득한다. PMP는, PKH26 염료에 의한 세포막의 배타적인 염색에 대하여 효모 세포의 세포질이 적색 및/또는 녹색으로 변하거나 세포질에서 적색 막 및 녹색 GFP-로딩된 PMP가 관찰되는 경우 효모 세포에 의해 흡수된다. 미변형 GFP-로딩된 PMP에 비한 GFP-로딩된 셀룰라제-변형된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질/세포질 내의 녹색 PMP를 갖는 효모 세포의 백분율을 비교한다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 측정함으로써 각각의 세포에서 흡수의 양을 정량화하고, GFP-로딩된 셀룰라제-변형 PMP의 흡수 효율을 미변형 GFP-로딩된 PMP와 비교한다.
d) GFP 단백질이 로딩된 셀룰라제-변형 자몽 PMP를 사용하여 스클레로티니아 스클레로티오룸에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산하고, 실시예 5에 기재된 바와 같이 GFP 단백질로 로딩한다. 일부 PMP를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 6b에 기재된 바와 같이 셀룰라제로 변형시킨다. PMP의 GFP 캡슐화를 웨스턴 블롯 또는 형광에 의해 측정하였다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 비표지된 염료를 실시예 2에 기재된 방법에 의해 세척 제거하고, 표지된 PMP 펠렛을 PBS 중에 재현탁화시킨다. GFP-로딩된 셀룰라제-변형된 PKH26-표지된 PMP에 비한 GFP-로딩된 변형 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 스클레로티니아 스클레로티오룸 진균 세포를 처리하였다.
스클레로티니아 스클레로토리움(ATCC, #18687) 자낭포자에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 10,000개의 자낭포자를 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PKH26-표지된 GFP-로딩된 변형 PMP, 또는 미변형 PMP와 유리 슬라이드 상에서 직접 인큐베이션시키고 인큐베이션시킨다. PBS 대조군에 더하여, S. 스클레로티오룸 세포를 PKH26 염료(최종 농도 5 ㎍/㎖)의 존재 하에 인큐베이션시킨다. 실온에서 5분, 30분 및 1시간의 인큐베이션 후에, 이미지를 고해상도 형광 현미경에서 획득한다. PMP는, PKH26 염료에 의한 세포막의 배타적인 염색에 대하여 효모 세포의 세포질이 적색 및/또는 녹색으로 변하거나 세포질에서 적색 막 및 녹색 GFP-로딩된 PMP가 관찰되는 경우 효모 세포에 의해 흡수된다. 미변형 GFP-로딩된 PMP에 비한 GFP-로딩된 셀룰라제-변형된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질/세포질 내의 녹색 PMP를 갖는 스클레로티니아 스클레로티오룸 세포의 백분율을 비교한다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 측정함으로써 각각의 세포에서 흡수의 양을 정량화하고, GFP-로딩된 셀룰라제-변형 PMP의 흡수 효율을 미변형 GFP-로딩된 PMP와 비교한다.
e) 칼세인 AM이 로딩된 셀룰라제-변형 자몽 PMP를 사용하여 슈도모나스 시린가에에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산한다. 일부 PMP를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 6b에 기재된 바와 같이 셀룰라제로 변형시킨다. 변형 및 미변형 PMP에 실시예 5 및 문헌[Gray et al., MethodsX 2015]에 기재된 바와 같이 칼세인 AM(시그마 알드리치)을 로딩한다. 칼세인 AM은 PMP에 의해 캡슐화되는 때에만 형광이며, 캡슐화는 형광에 의해 측정된다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 칼세인 AM 로딩된 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 미표지 염료를 세척해내고, PMP를 실시예 2에 기재된 바와 같이 100 kDa 아미콘(Amicon) 필터를 사용하여 농축시킨다. 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 셀룰라제-변형된 PMP에 비한 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 슈도모나스 시린가에 박테리아 세포를 처리하였다.
슈도모나스 시린가에 박테리아를 ATCC(BAA-871)로부터 수득하고, 제조처의 설명에 따라 킹(King)의 배지 B 아가에서 성장시킨다. 슈도모나스 시린가에에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 1 ㎖ 하룻밤 박테리아 현탁액 중 10 ㎕를 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PKH26-표지된 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 미변형 및 셀룰라제-변형 PMP와 유리 슬라이드 상에서 직접 인큐베이션시킨다. 물 대조군에 더하여, 슈도모나스 시린가에 박테리아를 칼세인 AM (최종 농도 5 ㎍/㎖), PKH26 염료, 및 미변형 PMP의 존재 하에 인큐베이션시킨다(최종 농도 5 ㎍/㎖). 실온에서 5분, 30분 및 1시간의 인큐베이션 후에, 이미지를 고해상도 형광 현미경에서 획득한다. 미변형 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP에 비한 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 셀룰라제-변형된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질 또는 세포질 내의 녹색 및 적색 PMP를 갖는 박테리아 세포의 백분율을 비교한다. 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정함으로써 각각의 세포에서의 흡수의 양을 정량화하고, 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 셀룰라제-변형 PMP의 흡수 효율을 미변형 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP와 비교한다. PMP의 셀룰라제-변형은 미변형 PMP에 비하여 세포 흡수를 효율적으로 개선시킨다.
f) 목화 식물 내의 CLA1을 표적화하는 dsRNA가 로딩된 셀룰라제-변형 자몽 PMP의 증가된 PMP 흡수
셀룰라제-변형 PMP에 의한 세포 흡수의 증가를 입증하기 위하여, 자몽 PMP에 목화 광합성 유전자 GrCLA1(1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 신타제)을 표적화하는 커스텀 다이서 기질 siRNA(DsiRNA, IDT에 의해 설계됨) 또는 인공 miRNA(amiRNA, 식물 작은 RNA 마커 부위(P-SAMS; 문헌[Fahlgren et al., Bioinformatics. 32(1):157-158, 2016])를 사용하여 설계됨)를 로딩한다. GrCLA1은 아라비돕시스 클로로플라스토스 알테라도스(Arabidopsis Cloroplastos alterados) 1 유전자(AtCLA1)의 상동 유전자이며, 기능-소실은 본엽 상에 알비노 표현형을 초래하여, 침묵화 효율에 대한 가시적인 마커를 제공한다. 올리고뉴클레오티드를 IDT로부터 수득한다.
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산한다. 미변형 PMP에 비한 셀룰라제-변형된 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 자몽 PMP를 실시예 5에 기재된 바와 같이, GrCLA1-amiRNA 또는 GrCLA1-DsiRNA 듀플렉스(표 12)를 이용하여 로딩하였다. PMP의 amiRNA 또는 DsiRNA 캡슐화를 퀀트-It 리보그린 RNA 검정 키트를 사용하여 또는 대조군 형광 염료 표지된 amiRNA 또는 DsiRNA(IDT)를 사용하여 측정한다. 다음으로, 로딩된 PMP의 일부를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 6b에 기재된 바와 같이 셀룰라제로 변형시킨다. CLA1-amiRNA/DsiRNA-로딩된 셀룰라제-변형된 PMP에 비한 CLA1-amiRNA/DsiRNA-로딩된 PMP의 PMP 흡수 효율을 결정하기 위해, 목화씨를 처리하고 CLA1 유전자 침묵화에 대해 분석하였다. amiRNA 또는 DsiRNA(이 둘을 아울러서 dsRNA라고 함)가 로딩된 PMP를 멸균수 중 0, 1, 5, 10, 및 20 ng/㎕의 dsRNA 유효 용량의 당량을 운반하는 농도로 수 중에 제형화한다.
목화 종자(고시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum) 및 고시피움 라이몬디이(Gossypium raimondii))를 미국 국가 식물 생식질 시스템을 통해 수득한다. 살균된 종자를 흡습솜으로 싸고, 페트리 디쉬(Petri dish)에 두고, 성장 챔버 내에서 25°C, 150 μE m-2 S-1 광 세기에서, 14시간 광/10시간 암의 광주기로, 3일 동안 배치하여 발아시킨다. 묘목을 26/20°C 낮/밤 온도와 함께 장일 조건(long-day condition)(16/8시간 광/암 광주기) 하에 호글랜드(Hoagland)의 영양소 용액(시그마 알드리치)이 있는 멸균 배양관에서 성장시킨다. 4일 후에, 완전히 확장된 떡잎을 갖는 묘목(제1 본엽이 나타나기 이전)을 PMP 처리를 위해 사용한다.
7일 된 목화 묘목을 0.8%(w/v) 아가로스와 함께 1 x MS 비타민(시그마 알드리치) pH 5.6-5.8을 갖는 0.5 x 무라시지 및 스쿡(Murashige and Skoog; MS) 미네랄 염(시그마 알드리치) 상으로 옮기고, 전체 묘목에, 그룹마다 3개의 식물을 사용하여, 식물마다 1 ml 용액을 분무함으로써, 0(ddH2O), 1, 5, 10 및 20 ng/μl의 GrCLA1 dsRNA-로딩된 셀룰라제-변형 PMP 및 0(ddH2O), 1, 5, 10 및 20 ng/μl의 GrCLA1 dsRNA-로딩된 미변형 PMP의 유효 용량으로 처리한다. 대안적으로, PMP 처리 이전에, 목화 식물의 떡잎의 하측을 25 G 바늘로 떡잎을 관통하지 않게 펀칭한다. PMP 용액을 1 mL 무바늘 주사기를 사용하여 상해 부위를 통해 떡잎의 하측으로부터 손으로 침윤시킨다. 식물을 성장 챔버로 옮기고, 90 μmol m-2 s-1의 광 세기 및 26/20°C 낮/밤 온도를 사용하여 장일 조건(16시간/8시간 광/암 광주기) 하에 유지한다.
2, 5, 8 및 14일 후에, CLA1 dsRNA의 유전자 침묵화 효율을 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)을 사용하여 내인성 CLA1 mRNA의 발현 수준에 의해 시험한다. 전체 RNA를 제조처의 설명(인비트로겐(Invitrogen))에 따라 트리졸(Trizol) 시약을 사용하여 100 mg의 신선한 목화 잎으로부터 추출하고, RNase-부재 DNase I(프로메가(Promega))로 광범위하게 처리한다. 제1-가닥 cDNA를 슈퍼스크립트(SuperScript) TM 제1-가닥 합성 시스템(First-Strand Synthesis system)(인비트로겐)을 사용하여 2 μg의 전체 RNA로부터 합성한다. CLA1 전사물의 수준을 추정하기 위하여, qRT-PCR을 하기의 프로그램을 사용하여, 프라이머: GrCLA1q1_F 5’-CCAGGTGGGGCTTATGCATC-3’(SEQ ID NO: 7), GrCLA1q1_R 5’-CCACACCAAGGCTTGAACCC-3’(SEQ ID NO: 8), 및 GrCLA1q2_F 5’-GGCCGGATTCACGAAACGGT-3’(SEQ ID NO: 9), GrCLA1q2_R 5’-CGTCGAGATTGGCAGTTGGC-3’(SEQ ID NO: 10), 및 18s RNA_F 5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’(SEQ ID NO: 11), 18s RNA_ R 5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’(SEQ ID NO: 12)과 함께 SYBR 그린(Green) 리얼-타임(Real-Time) PCR 마스터 믹스(Master Mix)(써모 사이언티픽)를 사용하여 수행한다: (a) 5분 동안 95°C; (b) 30초 동안 94°C, 30초 동안 55°C; 및 30초 동안 72°C의 40 사이클. 18S rRNA 유전자를 내부 대조군으로서 사용하여 결과를 정규화시킨다. ΔΔCt 값을 계산하고, 셀룰라제-변형 PMP를 이용한 처리 후의 정규화된 CLA1 발현을 미변형 PMP를 이용한 처리 후의 정규화된 CLA1 발현과 비교함으로써 CLA1-dsRNA-로딩된 셀룰라제-변형 및 CLA1-dsRNA-로딩된 미변형 PMP를 이용한 처리 후의 목화 내의 CLA1 낙 다운 효율을 결정한다.
추가로, CLA1 dsRNA의 유전자 침묵화 효율을 표현형 광표백 분석에 의해 시험한다. 처리된 및 미처리된 목화 식물의 잎의 사진을 찍고, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 유전자 침묵화 백분율을 결정하며, 이는 대조군 잎의 녹색 색상에 비한 잎 상의 백색 광표백에 의해 반영된다. 식물당 3개의 잎을 검정하여, 광표백의 영향을 정량화하고, 셀룰라제-변형 대 미변형 CLA1-dsRNA-로딩된 PMP의 유전자 침묵화 효율을 평가한다.
셀룰라제-변형 PMP는 식물 세포에 의해 더욱 효율적으로 흡수되며, 미변형 PMP에 비하여 더 큰 CLA1 유전자 침묵화를 유도한다.
[표 12]
Figure pct00044
Figure pct00045
실시예 7: 이온성 액체를 사용한 PMP의 제형화에 의한 PMP 세포 흡수의 증가
본 실시예에는 개선된 세포 투과를 통하여 PMP 흡수를 개선시키기 위한 이온성 액체를 사용한 PMP의 제형화가 기재되어 있다. 이온성 액체는 식물 세포벽의 주요 성분인 셀룰로스를 가용화시키기 위한 잠재적인 제제로서 설명된 바 있으며, 또한, 진균 또는 박테리아의 세포벽 및/또는 동물 세포의 세포막 또는 세포외 매트릭스의 투과를 개선시킬 수 있다. 본 실시예에서, EMIM 아세테이트는 모델 이온성 액체로서 사용되며, 자몽 PMP는 모델 PMP로서, 목화는 모델 식물로서, 사카로마이세스 세레비지애는 모델 효모로서, MDA-MB-231은 모델 인간 세포주로서, 스클레로티니아 스클레로티오룸은 모델 진균으로서, 그리고 슈도모나스 시린가에는 모델 박테리아로서 사용된다.
실험 프로토콜:
a) 이온성 액체 중 PMP의 제형화
자몽 PMP의 농축 용액을 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 단리한다. PMP를 1%, 5%, 10%, 20%, 50% 또는 100%의 EMIM 아세테이트 용액 중에서의 격렬한 혼합을 사용하여 재현탁화시킨다. 대안적으로, BMIM 아세테이트, HMIM 아세테이트, MMIM 아세테이트, AllylMIM 아세테이트가 사용된다. 현탁액으로부터 100% 회수를 가정하고, 제형화 이전의 농도와 부피의 비를 곱하여 PMP의 농도를 결정한다. 이온성 액체 중 PMP 특징 및 안정성을 실시예 3 및 실시예 4에 기재된 바와 같이 평가한다.
b) GFP 단백질이 로딩된 EMIM 아세테이트-제형화된 자몽 PMP를 사용하여 사카로마이세스 세레비지애에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산하고, 실시예 5에 기재된 바와 같이 GFP 단백질로 로딩한다. PMP의 GFP 캡슐화를 웨스턴 블롯 또는 형광에 의해 측정하였다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, PKH26 표지 키트의 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 비표지된 염료를 실시예 2에 기재된 방법에 의해 세척 제거하고, 표지된 PMP 펠렛을 실시예 8a에 기재된 바와 같은 PBS(대조군) 또는 EMIM 아세테이트 용액 중에 재현탁화시킨다. GFP-로딩된 EMIM 아세테이트-제형화된 PKH26-표지된 PMP에 비한 PBS 중의 GFP-로딩된 변형 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 사카로마이세스 세레비지애 진균 세포를 처리하였다.
사카로마이세스 세레비지애를 ATCC(#9763)로부터 수득하고, 제조처의 지침에 따라 이를 효모 추출물 펩톤 덱스트로스 브로쓰(YPD)에서 30℃에서 유지하였다. 사카로마이세스 세레비지애에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 효모 세포를 선별 배지에서 OD600 0.4 내지 0.6까지 성장시키고, 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PKH26-표지된 GFP-로딩된 PBS 중의 변형 PMP 또는 EMIM 아세테이트와 유리 슬라이드 상에서 직접 인큐베이션시킨다. PBS 대조군에 더하여, 사카로마이세스 세레비지애 세포를 PKH26 염료(최종 농도 5 ㎍/㎖)의 존재 하에 인큐베이션시킨다. 실온에서 5분, 30분 및 1시간의 인큐베이션 후에, 이미지를 고해상도 형광 현미경에서 획득한다. PMP는, PKH26 염료에 의한 세포막의 배타적인 염색에 대하여 효모 세포의 세포질이 적색 및/또는 녹색으로 변하거나 세포질에서 적색 막 및 녹색 GFP-로딩된 PMP가 관찰되는 경우 효모 세포에 의해 흡수된다. PBS-제형화된 GFP-로딩된 PMP에 비한 GFP-로딩된 EMIM 아세테이트-제형화된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질/세포질 내의 녹색 PMP를 갖는 효모 세포의 백분율을 비교한다. 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정함으로써 각각의 세포에서의 흡수의 양을 정량화하고, GFP-로딩된 EMIM 아세테이트-제형화된 PMP의 흡수 효율을 PBS-제형화된 GFP-로딩된 PMP와 비교한다.
c) GFP 단백질이 로딩된 EMIM 아세테이트-제형화된 자몽 PMP를 사용하여 스클레로티니아 스클레로티오룸에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산하고, 실시예 5에 기재된 바와 같이 GFP 단백질로 로딩한다. 일부 PMP를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 6b에 기재된 바와 같이 셀룰라제로 변형시킨다. PMP의 GFP 캡슐화를 웨스턴 블롯 또는 형광에 의해 측정하였다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 비표지된 염료를 실시예 2에 기재된 방법에 의해 세척 제거하고, 표지된 PMP 펠렛을 PBS 중에 재현탁화시킨다. GFP-로딩된 EMIM 아세테이트-제형화된 PKH26-표지된 PMP에 비한 GFP-로딩된 변형 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 스클레로티니아 스클레로티오룸 진균 세포를 처리하였다.
스클레로티니아 스클레로토리움(ATCC, #18687) 자낭포자에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 10,000개의 자낭포자를 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PKH26-표지된 GFP-로딩된 EMIM 아세테이트에 제형화된 PMP, 또는 PBS에 제형화된 PMP와 유리 슬라이드 상에서 직접 인큐베이션시키고 인큐베이션시킨다. PBS 대조군에 더하여, S. 스클레로티오룸 세포를 PKH26 염료(최종 농도 5 ㎍/㎖)의 존재 하에 인큐베이션시킨다. 실온에서 5분, 30분 및 1시간의 인큐베이션 후에, 이미지를 고해상도 형광 현미경에서 획득한다. PMP는, PKH26 염료에 의한 세포막의 배타적인 염색에 대하여 효모 세포의 세포질이 적색 및/또는 녹색으로 변하거나 세포질에서 적색 막 및 녹색 GFP-로딩된 PMP가 관찰되는 경우 효모 세포에 의해 흡수된다. PBS 중에 제형화된 GFP-로딩된 PMP에 비한 GFP-로딩된 EMIM 아세테이트-제형화된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질/세포질 내의 녹색 PMP를 갖는 스클레로티니아 스클레로티오룸 세포의 백분율을 비교한다. 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정하고, 퍼플루오로옥탄 중에 제형화된 각각의 세포에서 흡수의 양을 정량화하고, EMIM 아세테이트-제형화된 PMP 중에 제형화된 GFP-로딩된 PMP의 흡수 효율을 PBS 중에 제형화된 GFP-로딩된 PMP와 비교한다.
d) 칼세인 AM이 로딩된 EMIM 아세테이트-제형화된 자몽 PMP를 사용하여 MDA-MB-231 세포에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산한다. 변형 및 미변형 PMP에 실시예 5 및 문헌[Gray et al., MethodsX 2015]에 기재된 바와 같이 칼세인 AM(시그마 알드리치)을 로딩한다. 칼세인 AM은 PMP에 의해 캡슐화되는 때에만 형광이며, 캡슐화는 형광에 의해 측정된다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 칼세인 AM 로딩된 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 미표지 염료를 세척해내고, PMP를 실시예 2에 기재된 바와 같이 100 kDa 아미콘(Amicon) 필터를 사용하여 농축시킨다. 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 EMIM 아세테이트-제형화된 PMP에 비한 PBS 중에 제형화된 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 인간 유방암 세포를 처리하였다.
MDA-MB-231 유방암 세포주를 ATCC(HTB-26)로부터 수득하고, 공급처의 설명에 따라 성장시키고 유지한다. 70 내지 80% 컨플루언시의 세포를 수집하고, 계수하고, 96-웰 배양물 처리된 웰 플레이트에 200 uL 세포 배양 배지 중 웰당 10,000개 세포의 씨딩 밀도로 씨딩한다. 세포를 3시간 동안 부착되게 한 다음, 배지를 제거하고, 세포를 둘베코(Dulbecco) PBS로 1회 세척하고, FCS가 없는 배지를 첨가하여 처리 이전에 3시간 동안 세포를 혈청 기아시킨다. 유방암 세포에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 세포를 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PBS 중에 제형화된 및 EMIM 아세테이트 중에 제형화된 PKH26-표지된 칼세인 AM-로딩된 PMP와 웰에서 직접 인큐베이션시킨다. PBS 대조군에 더하여, 세포를 칼세인 AM (최종 농도 5 ㎍/㎖), PKH26 염료, 및 미변형 PMP의 존재 하에 인큐베이션시킨다(최종 농도 5 ㎍/㎖). 37C에서 30분, 1시간, 2시간 및 4시간의 인큐베이션 후에, 세포를 PBS로 4 x 10’ 세척하여 배지 중 PMP를 제거한다. 다음으로, 이미지를 고해상도 형광 현미경(EVOS2 FL) 상에서 40배로 획득하여, 흡수 효율을 결정한다. PMP는, PKH26 염료에 의한 세포막의 배타적인 염색에 대하여 세포의 세포질이 적색 및/또는 녹색으로 변하거나 세포질에서 적색 막 및 녹색 칼세인 AM-로딩된 PMP가 관찰되는 경우 유방암 세포에 의해 흡수된다. PBS-제형화된 칼세인 AM-로딩된 PMP에 비한 칼세인 AM-로딩된 EMIM 아세테이트-제형화된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질/세포질 내의 녹색 PMP를 갖는 세포의 백분율을 비교한다. 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정함으로써 각각의 세포에서의 흡수의 양을 정량화하고, GFP-로딩된 EMIM 아세테이트-제형화된 PMP의 흡수 효율을 GFP-로딩된 PBS-제형화된 PMP와 비교한다.
e) 칼세인 AM이 로딩된 EMIM 아세테이트-제형화된 자몽 PMP를 사용하여 슈도모나스 시린가에에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산한다. 변형된 및 PBS-제형화된 PMP에 칼세인 AM(시그마 알드리치)을 실시예 5 및 문헌[Gray et al., MethodsX 2015]에 기재된 바와 같이 로딩한다. 칼세인 AM은 PMP에 의해 캡슐화되는 때에만 형광이며, 캡슐화는 형광에 의해 측정된다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, PKH26 표지 키트의 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 칼세인 AM 로딩된 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 비표지된 염료를 실시예 2에 기재된 방법에 의해 세척 제거하고, 표지된 PMP 펠렛을 실시예 8a에 기재된 바와 같은 PBS(대조군) 또는 EMIM 아세테이트 용액 중에 재현탁화시킨다. 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 EMIM 아세테이트-제형화된 PMP에 비한 PBS 중에 제형화된 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 슈도모나스 시린가에 박테리아 세포를 처리하였다.
슈도모나스 시린가에 박테리아를 ATCC(BAA-871)로부터 수득하고, 제조처의 설명에 따라 킹(King)의 배지 B 아가에서 성장시킨다. 슈도모나스 시린가에에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 1 ㎖ 하룻밤 박테리아 현탁액 중 10 ㎕를 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PBS-제형화된 PKH26-표지된 칼세인 AM-로딩된 PMP 및 PKH26-표지된 칼세인 AM-로딩된 EMIM 아세테이트-제형화된 PMP와 유리 슬라이드 상에서 직접 인큐베이션시킨다. PBS 대조군에 더하여, 슈도모나스 시린가에 박테리아를 칼세인 AM (최종 농도 5 ㎍/㎖), PKH26 염료의 존재 하에 인큐베이션시킨다(최종 농도 5 ㎍/㎖). 실온에서 5분, 30분 및 1시간의 인큐베이션 후에, 이미지를 고해상도 형광 현미경에서 획득한다. PBS-제형화된 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP에 비한 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 EMIM 아세테이트-제형화된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질 또는 세포질 내의 녹색 및 적색 PMP를 갖는 박테리아 세포의 백분율을 비교한다. 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정함으로써 각각의 세포에서의 흡수의 양을 정량화하고, 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 EMIM 아세테이트-제형화된 PMP의 흡수 효율을 PBS-제형화된 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP와 비교한다. PMP의 EMIM 아세테이트 제형화는 PBS-제형화된 PMP에 비하여 세포 흡수를 효율적으로 개선시킨다.
f) 목화 식물에서 CLA1을 표적화하는 dsRNA가 로딩된 EMIM 아세테이트-제형화된 자몽 PMP의 증가된 PMP 흡수
EMIM 아세테이트-제형화된 PMP에 의한 세포 흡수의 증가를 입증하기 위하여, 자몽 PMP에 목화 광합성 유전자 GrCLA1(1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 신타제)을 표적화하는 커스텀 다이서 기질 siRNA(DsiRNA, IDT에 의해 설계됨) 또는 인공 miRNA(amiRNA, 식물 작은 RNA 마커 부위(P-SAMS; 문헌[Fahlgren et al., Bioinformatics. 32(1):157-158, 2016])를 사용하여 설계됨)를 로딩한다. GrCLA1은 아라비돕시스 클로로플라스토스 알테라도스(Arabidopsis Cloroplastos alterados) 1 유전자(AtCLA1)의 상동 유전자이며, 기능-소실은 본엽 상에 알비노 표현형을 초래하여, 침묵화 효율에 대한 가시적인 마커를 제공한다. 올리고뉴클레오티드를 IDT로부터 수득한다.
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산한다. 자몽 PMP에 GrCLA1-amiRNA 또는 GrCLA1-DsiRNA 듀플렉스(표 12), 를 실시예 5에 기재된 바와 같이 로딩한다. PMP의 amiRNA 또는 DsiRNA 캡슐화를 퀀트-It 리보그린 RNA 검정 키트를 사용하여 또는 대조군 형광 염료 표지된 amiRNA 또는 DsiRNA(IDT)를 사용하여 측정한다. 로딩된 PMP의 일부를 PBS 중에 제형화하고, 나머지의 일부를 실시예 8b에 기재된 바와 같이 셀룰라제로 변형시킨다.
amiRNA 또는 DsiRNA(이 둘을 아울러서 dsRNA라고 함)가 로딩된 PMP를 멸균수 중 0, 1, 5, 10, 및 20 ng/㎕의 dsRNA 유효 용량의 당량을 운반하는 농도로 수(ddH2O) 중에 제형화한다.
CLA1-amiRNA/DsiRNA-로딩된 EMIM 아세테이트-제형화된 PMP에 비한 CLA1-amiRNA/DsiRNA-로딩된 PMP의 PMP 흡수 효율을 결정하기 위해, 목화씨를 처리하고 CLA1 유전자 침묵화에 대해 분석하였다.
목화 종자(고시피움 히르수툼 및 고시피움 라이몬디이)를 미국 국가 식물 생식질 시스템을 통해 수득한다. 살균된 종자를 흡습솜으로 싸고, 페트리 디쉬(Petri dish)에 두고, 성장 챔버 내에서 25°C, 150 μE m-2 S-1 광 세기에서, 14시간 광/10시간 암의 광주기로, 3일 동안 배치하여 발아시킨다. 묘목을 26/20°C 낮/밤 온도와 함께 장일 조건(long-day condition)(16/8시간 광/암 광주기) 하에 호글랜드(Hoagland)의 영양소 용액(시그마 알드리치)이 있는 멸균 배양관에서 성장시킨다. 4일 후에, 완전히 확장된 떡잎을 갖는 묘목(제1 본엽이 나타나기 이전)을 PMP 처리를 위해 사용한다.
7일 된 목화 묘목을 0.8%(w/v) 아가로스와 함께 1 x MS 비타민(시그마 알드리치) pH 5.6-5.8을 갖는 0.5 x 무라시지 및 스쿡(Murashige and Skoog; MS) 미네랄 염(시그마 알드리치) 상으로 옮기고, 전체 묘목에, 그룹마다 3개의 식물을 사용하여, 식물마다 1 ml 용액을 분무함으로써, 0(ddH2O), 1, 5, 10 및 20 ng/μl의 GrCLA1 dsRNA-로딩된 EMIM 아세테이트-제형화된 PMP 및 0(ddH2O), 1, 5, 10 및 20 ng/μl의 GrCLA1 dsRNA-로딩된 PBS-제형화된 PMP의 유효 용량으로 처리한다. 대안적으로, PMP 처리 이전에, 목화 식물의 떡잎의 하측을 25 G 바늘로 떡잎을 관통하지 않게 펀칭한다. 0(ddH2O), 1, 5, 10 및 20 ng/μl의 GrCLA1 dsRNA-로딩된 EMIM 아세테이트-제형화된 PMP, 및 0(ddH2O), 1, 5, 10 및 20 ng/μl의 GrCLA1 dsRNA-로딩된 VIB(실시예 1)-제형화된 PMP의 유효 용량을 갖는 PMP 용액을 1 mL 무바늘 주사기를 사용하여 상해 부위를 통해 떡잎의 하측으로부터 손으로 침윤시킨다. 식물을 성장 챔버로 옮기고, 90 μmol m-2 s-1의 광 세기 및 26/20°C 낮/밤 온도를 사용하여 장일 조건(16시간/8시간 광/암 광주기) 하에 유지한다.
2, 5, 8 및 14일 후에, CLA1 dsRNA의 유전자 침묵화 효율을 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)을 사용하여 내인성 CLA1 mRNA의 발현 수준에 의해 시험한다. 전체 RNA를 제조처의 설명(인비트로겐(Invitrogen))에 따라 트리졸(Trizol) 시약을 사용하여 100 mg의 신선한 목화 잎으로부터 추출하고, RNase-부재 DNase I(프로메가(Promega))로 광범위하게 처리한다. 제1-가닥 cDNA를 슈퍼스크립트(SuperScript) TM 제1-가닥 합성 시스템(First-Strand Synthesis system)(인비트로겐)을 사용하여 2 μg의 전체 RNA로부터 합성한다. CLA1 전사물의 수준을 추정하기 위하여, qRT-PCR을 하기의 프로그램을 사용하여, 프라이머: GrCLA1q1_F 5’-CCAGGTGGGGCTTATGCATC-3’(SEQ ID NO: 7), GrCLA1q1_R 5’-CCACACCAAGGCTTGAACCC-3’(SEQ ID NO: 8), 및 GrCLA1q2_F 5’-GGCCGGATTCACGAAACGGT-3’(SEQ ID NO: 9), GrCLA1q2_R 5’-CGTCGAGATTGGCAGTTGGC-3’(SEQ ID NO: 10), 및 18s RNA_F 5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’(SEQ ID NO: 11), 18s RNA_ R 5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’(SEQ ID NO: 12)과 함께 SYBR 그린(Green) 리얼-타임(Real-Time) PCR 마스터 믹스(Master Mix)(써모 사이언티픽)를 사용하여 수행한다: (a) 5분 동안 95°C; (b) 30초 동안 94°C, 30초 동안 55°C; 및 30초 동안 72°C의 40 사이클. 18S rRNA 유전자를 내부 대조군으로서 사용하여 결과를 정규화시킨다. ΔΔCt 값을 계산하고, EMIM 아세테이트-제형화된 PMP를 이용한 처리 후의 정규화된 CLA1 발현을 PBS-제형화된 PMP를 이용한 처리 후의 정규화된 CLA1 발현과 비교함으로써 CLA1-dsRNA-로딩된 EMIM 아세테이트-제형화된 및 CLA1-dsRNA-로딩된 PBS-제형화된 PMP를 이용한 처리 후의 목화에서의 CLA1 낙 다운 효율을 결정한다.
추가로, CLA1 dsRNA의 유전자 침묵화 효율을 표현형 광표백 분석에 의해 시험한다. EMIM 아세테이트-제형화된 PMP 및 PBS-제형화된 PMP로 처리된 식물의 잎의 사진을 찍고, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 유전자 침묵화 백분율을 결정하며, 이는 대조군 잎의 녹색 색상에 비하여 잎 상의 백색 광표백에 의해 반영된다. 식물당 3개의 잎을 검정하여, 광표백의 효과를 정량화하고, EMIM 아세테이트-제형화 대 PBS-제형화 CLA1-dsRNA-로딩된 PMP의 유전자 침묵화 효율을 평가한다.
EMIM 아세테이트-제형화된 PMP는 PBS-제형화된 PMP에 비하여 식물 세포에 의해 더욱 효율적으로 흡수되며, 더 큰 CLA1 유전자 침묵화를 유도한다.
실시예 8: 불소 액체를 사용한 PMP의 제형화에 의한 PMP 세포 흡수의 증가
본 실시예에는 개선된 세포 투과를 통하여 PMP 흡수를 개선시키기 위하여 불소 액체를 사용한 PMP의 제형화가 기재되어 있다. 불소 액체는 세포벽의 주요 성분인 셀룰로스를 가용화시키는 잠재적인 제제로서 설명된 바 있으며, 또한, 진균 또는 박테리아의 세포벽 및/또는 동물 세포의 세포막 또는 세포외 매트릭스의 투과를 개선시킬 수 있다. 본 실시예에서, 퍼플루오로옥탄이 모델 불소 액체로서 사용되며, 자몽 PMP가 모델 PMP로서, 목화가 모델 식물로서, 사카로마이세스 세레비지애가 모델 효모로서, MDA-MB-231이 모델 인간 세포주로서, 스클레로티니아 스클레로티오룸이 모델 진균으로서, 그리고 슈도모나스 시린가에가 모델 박테리아로서 사용된다.
실험 프로토콜:
a) 불소 액체 중 PMP의 제형화
자몽 PMP의 농축 용액을 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 단리한다. PMP를 1%, 5%, 10%, 20%, 50% 또는 100%의 퍼플루오로옥탄의 용액(시그마 알드리치) 중에서 격렬한 혼합을 사용하여 재현탁화시킨다. 대안적으로, 퍼플루오로헥산 또는 퍼플루오로(메틸데칼린)이 사용된다. 현탁액으로부터 100% 회수를 가정하고, 제형화 이전의 농도와 부피의 비를 곱하여 PMP의 농도를 결정한다. 불소 액체 중 PMP 특징 및 안정성을 실시예 3 및 실시예 4에 기재된 바와 같이 평가한다.
b) GFP 단백질이 로딩된 퍼플루오로옥탄-제형화된 자몽 PMP를 사용하여 사카로마이세스 세레비지애에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산하고, 실시예 5에 기재된 바와 같이 GFP 단백질로 로딩한다. PMP의 GFP 캡슐화를 웨스턴 블롯 또는 형광에 의해 측정하였다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, PKH26 표지 키트의 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 비표지된 염료를 실시예 2에 기재된 방법에 의해 세척 제거하고, 표지된 PMP 펠렛을 실시예 8a에 기재된 바와 같은 PBS(대조군) 또는 퍼플루오로옥탄 용액 중에 재현탁화시킨다. GFP-로딩된 퍼플루오로옥탄-제형화된 PKH26-표지된 PMP에 비한 PBS 중의 GFP-로딩된 변형 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 사카로마이세스 세레비지애 진균 세포를 처리하였다.
사카로마이세스 세레비지애를 ATCC(#9763)로부터 수득하고, 제조처의 지침에 따라 이를 효모 추출물 펩톤 덱스트로스 브로쓰(YPD)에서 30℃에서 유지하였다. 사카로마이세스 세레비지애에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 효모 세포를 선별 배지에서 OD600 0.4 내지 0.6까지 성장시키고, 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PKH26-표지된 GFP-로딩된 PBS 중의 변형 PMP 또는 퍼플루오로옥탄과 유리 슬라이드 상에서 직접 인큐베이션시킨다. PBS 대조군에 더하여, 사카로마이세스 세레비지애 세포를 PKH26 염료(최종 농도 5 ㎍/㎖)의 존재 하에 인큐베이션시킨다. 실온에서 5분, 30분 및 1시간의 인큐베이션 후에, 이미지를 고해상도 형광 현미경에서 획득한다. PMP는, PKH26 염료에 의한 세포막의 배타적인 염색에 대하여 효모 세포의 세포질이 적색 및/또는 녹색으로 변하거나 세포질에서 적색 막 및 녹색 GFP-로딩된 PMP가 관찰되는 경우 효모 세포에 의해 흡수된다. PBS-제형화된 GFP-로딩된 PMP에 비한 GFP-로딩된 퍼플루오로옥탄-제형화된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질/세포질 내의 녹색 PMP를 갖는 효모 세포의 백분율을 비교한다. 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정함으로써 각각의 세포에서의 흡수의 양을 정량화하고, GFP-로딩된 퍼플루오로옥탄-제형화된 PMP의 흡수 효율을 PBS-제형화된 GFP-로딩된 PMP와 비교한다.
c) GFP 단백질이 로딩된 퍼플루오로옥탄-제형화된 자몽 PMP를 사용하여 스클레로티니아 스클레로티오룸에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산하고, 실시예 5에 기재된 바와 같이 GFP 단백질로 로딩한다. 일부 PMP를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 6b에 기재된 바와 같이 셀룰라제로 변형시킨다. PMP의 GFP 캡슐화를 웨스턴 블롯 또는 형광에 의해 측정하였다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 비표지된 염료를 실시예 2에 기재된 방법에 의해 세척 제거하고, 표지된 PMP 펠렛을 PBS 중에 재현탁화시킨다. GFP-로딩된 퍼플루오로옥탄-제형화된 PKH26-표지된 PMP에 비한 GFP-로딩된 변형 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 스클레로티니아 스클레로티오룸 진균 세포를 처리하였다.
스클레로티니아 스클레로토리움(ATCC, #18687) 자낭포자에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 10,000개의 자낭포자를 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PKH26-표지된 GFP-로딩된 퍼플루오로옥탄에 제형화된 PMP, 또는 PBS에 제형화된 PMP와 유리 슬라이드 상에서 직접 인큐베이션시키고 인큐베이션시킨다. PBS 대조군에 더하여, S. 스클레로티오룸 세포를 PKH26 염료(최종 농도 5 ㎍/㎖)의 존재 하에 인큐베이션시킨다. 실온에서 5분, 30분 및 1시간의 인큐베이션 후에, 이미지를 고해상도 형광 현미경에서 획득한다. PMP는, PKH26 염료에 의한 세포막의 배타적인 염색에 대하여 효모 세포의 세포질이 적색 및/또는 녹색으로 변하거나 세포질에서 적색 막 및 녹색 GFP-로딩된 PMP가 관찰되는 경우 효모 세포에 의해 흡수된다. PBS 중에 제형화된 GFP-로딩된 PMP에 비한 GFP-로딩된 퍼플루오로옥탄-제형화된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질/세포질 내의 녹색 PMP를 갖는 스클레로티니아 스클레로티오룸 세포의 백분율을 비교한다. 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정하고, 퍼플루오로옥탄 중에 제형화된 각각의 세포에서 흡수의 양을 정량화하고, 퍼플루오로옥탄-제형화된 PMP 중에 제형화된 GFP-로딩된 PMP의 흡수 효율을 PBS 중에 제형화된 GFP-로딩된 PMP와 비교한다.
d) 칼세인 AM이 로딩된 퍼플루오로옥탄-제형화된 자몽 PMP를 사용하여 MDA-MB-231 세포에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산한다. 변형 및 미변형 PMP에 실시예 5 및 문헌[Gray et al., MethodsX 2015]에 기재된 바와 같이 칼세인 AM(시그마 알드리치)을 로딩한다. 칼세인 AM은 PMP에 의해 캡슐화되는 때에만 형광이며, 캡슐화는 형광에 의해 측정된다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 칼세인 AM 로딩된 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 미표지 염료를 세척해내고, PMP를 실시예 2에 기재된 바와 같이 100 kDa 아미콘(Amicon) 필터를 사용하여 농축시킨다. 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 퍼플루오로옥탄-제형화된 PMP에 비한 PBS 중에 제형화된 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 인간 유방암 세포를 처리하였다.
MDA-MB-231 유방암 세포주를 ATCC(HTB-26)로부터 수득하고, 공급처의 설명에 따라 성장시키고 유지한다. 70 내지 80% 컨플루언시의 세포를 수집하고, 계수하고, 96-웰 배양물 처리된 웰 플레이트에 200 uL 세포 배양 배지 중 웰당 10,000개 세포의 씨딩 밀도로 씨딩한다. 세포를 3시간 동안 부착되게 한 다음, 배지를 제거하고, 세포를 둘베코(Dulbecco) PBS로 1회 세척하고, FCS가 없는 배지를 첨가하여 처리 이전에 3시간 동안 세포를 혈청 기아시킨다. 유방암 세포에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 세포를 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PBS 중에 제형화된 및 퍼플루오로옥탄 중에 제형화된 PKH26-표지된 칼세인 AM-로딩된 PMP와 웰에서 직접 인큐베이션시킨다. PBS 대조군에 더하여, 세포를 칼세인 AM (최종 농도 5 ㎍/㎖), PKH26 염료, 및 미변형 PMP의 존재 하에 인큐베이션시킨다(최종 농도 5 ㎍/㎖). 37C에서 30분, 1시간, 2시간 및 4시간의 인큐베이션 후에, 세포를 PBS로 4 x 10’ 세척하여 배지 중 PMP를 제거한다. 다음으로, 이미지를 고해상도 형광 현미경(EVOS2 FL) 상에서 40배로 획득하여, 흡수 효율을 결정한다. PMP는, PKH26 염료에 의한 세포막의 배타적인 염색에 대하여 세포의 세포질이 적색 및/또는 녹색으로 변하거나 세포질에서 적색 막 및 녹색 칼세인 AM-로딩된 PMP가 관찰되는 경우 유방암 세포에 의해 흡수된다. PBS-제형화된 칼세인 AM-로딩된 PMP에 비한 칼세인 AM-로딩된 퍼플루오로옥탄-제형화된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질/세포질 내의 녹색 PMP를 갖는 세포의 백분율을 비교한다. 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정함으로써 각각의 세포에서의 흡수의 양을 정량화하고, GFP-로딩된 퍼플루오로옥탄-제형화된 PMP의 흡수 효율을 GFP-로딩된 PBS-제형화된 PMP와 비교한다.
e) 칼세인 AM이 로딩된 퍼플루오로옥탄-제형화된 자몽 PMP를 사용하여 슈도모나스 시린가에에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산한다. 변형된 및 PBS-제형화된 PMP에 칼세인 AM(시그마 알드리치)을 실시예 5 및 문헌[Gray et al., MethodsX 2015]에 기재된 바와 같이 로딩한다. 칼세인 AM은 PMP에 의해 캡슐화되는 때에만 형광이며, 캡슐화는 형광에 의해 측정된다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, PKH26 표지 키트의 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 칼세인 AM 로딩된 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 비표지된 염료를 실시예 2에 기재된 방법에 의해 세척 제거하고, 표지된 PMP 펠렛을 실시예 8a에 기재된 바와 같은 PBS(대조군) 또는 퍼플루오로옥탄 용액 중에 재현탁화시킨다. 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 퍼플루오로옥탄-제형화된 PMP에 비한 PBS 중에 제형화된 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 슈도모나스 시린가에 박테리아 세포를 처리하였다.
슈도모나스 시린가에 박테리아를 ATCC(BAA-871)로부터 수득하고, 제조처의 설명에 따라 킹(King)의 배지 B 아가에서 성장시킨다. 슈도모나스 시린가에에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 1 ㎖ 하룻밤 박테리아 현탁액 중 10 ㎕를 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PBS-제형화된 PKH26-표지된 칼세인 AM-로딩된 PMP 및 PKH26-표지된 칼세인 AM-로딩된 퍼플루오로옥탄-제형화된 PMP와 유리 슬라이드 상에서 직접 인큐베이션시킨다. PBS 대조군에 더하여, 슈도모나스 시린가에 박테리아를 칼세인 AM (최종 농도 5 ㎍/㎖), PKH26 염료의 존재 하에 인큐베이션시킨다(최종 농도 5 ㎍/㎖). 실온에서 5분, 30분 및 1시간의 인큐베이션 후에, 이미지를 고해상도 형광 현미경에서 획득한다. PBS-제형화된 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP에 비한 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 퍼플루오로옥탄-제형화된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질 또는 세포질 내의 녹색 및 적색 PMP를 갖는 박테리아 세포의 백분율을 비교한다. 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정함으로써 각각의 세포에서의 흡수의 양을 정량화하고, 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 퍼플루오로옥탄-제형화된 PMP의 흡수 효율을 PBS-제형화된 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP와 비교한다. PMP의 퍼플루오로옥탄-제형화는 PBS-제형화된 PMP에 비하여 세포 흡수를 효율적으로 개선시킨다.
f) 목화 식물 내의 CLA1을 표적화하는 dsRNA가 로딩된 퍼플루오로옥탄-제형화된 자몽 PMP의 증가된 PMP 흡수
퍼플루오로옥탄-제형화된 PMP에 의한 세포 흡수의 증가를 입증하기 위하여, 자몽 PMP에 목화 광합성 유전자 GrCLA1(1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 신타제)을 표적화하는 커스텀 다이서 기질 siRNA(DsiRNA, IDT에 의해 설계됨) 또는 인공 miRNA(amiRNA, 식물 작은 RNA 마커 부위(P-SAMS; 문헌[Fahlgren et al., Bioinformatics. 32(1):157-158, 2016])를 사용하여 설계됨)를 로딩한다. GrCLA1은 아라비돕시스 클로로플라스토스 알테라도스(Arabidopsis Cloroplastos alterados) 1 유전자(AtCLA1)의 상동 유전자이며, 기능-소실은 본엽 상에 알비노 표현형을 초래하여, 침묵화 효율에 대한 가시적인 마커를 제공한다. 올리고뉴클레오티드를 IDT로부터 수득한다.
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산한다. 자몽 PMP에 GrCLA1-amiRNA 또는 GrCLA1-DsiRNA 듀플렉스(표 12), 를 실시예 5에 기재된 바와 같이 로딩한다. PMP의 amiRNA 또는 DsiRNA 캡슐화를 퀀트-It 리보그린 RNA 검정 키트를 사용하여 또는 대조군 형광 염료 표지된 amiRNA 또는 DsiRNA(IDT)를 사용하여 측정한다. 로딩된 PMP의 일부를 PBS 중에 제형화하고, 나머지의 일부를 실시예 8b에 기재된 바와 같이 셀룰라제로 변형시킨다.
amiRNA 또는 DsiRNA(이 둘을 아울러서 dsRNA라고 함)가 로딩된 PMP를 멸균수 중 0, 1, 5, 10, 및 20 ng/㎕의 dsRNA 유효 용량의 당량을 운반하는 농도로 수(ddH2O) 중에 제형화한다.
CLA1-amiRNA/DsiRNA-로딩된 퍼플루오로옥탄-제형화된 PMP에 비한 CLA1-amiRNA/DsiRNA-로딩된 PMP의 PMP 흡수 효율을 결정하기 위해, 목화씨를 처리하고 CLA1 유전자 침묵화에 대해 분석하였다.
목화 종자(고시피움 히르수툼 및 고시피움 라이몬디이)를 미국 국가 식물 생식질 시스템을 통해 수득한다. 살균된 종자를 흡습솜으로 싸고, 페트리 디쉬(Petri dish)에 두고, 성장 챔버 내에서 25°C, 150 μE m-2 S-1 광 세기에서, 14시간 광/10시간 암의 광주기로, 3일 동안 배치하여 발아시킨다. 묘목을 26/20°C 낮/밤 온도와 함께 장일 조건(long-day condition)(16/8시간 광/암 광주기) 하에 호글랜드(Hoagland)의 영양소 용액(시그마 알드리치)이 있는 멸균 배양관에서 성장시킨다. 4일 후에, 완전히 확장된 떡잎을 갖는 묘목(제1 본엽이 나타나기 이전)을 PMP 처리를 위해 사용한다.
7일 된 목화 묘목을 0.8%(w/v) 아가로스와 함께 1 x MS 비타민(시그마 알드리치) pH 5.6-5.8을 갖는 0.5 x 무라시지 및 스쿡(Murashige and Skoog; MS) 미네랄 염(시그마 알드리치) 상으로 옮기고, 전체 묘목에, 그룹마다 3개의 식물을 사용하여, 식물마다 1 ml 용액을 분무함으로써, 0(ddH2O), 1, 5, 10 및 20 ng/μl의 GrCLA1 dsRNA-로딩된 퍼플루오로옥탄-제형화된 PMP 및 0(ddH2O), 1, 5, 10 및 20 ng/μl의 GrCLA1 dsRNA-로딩된 PBS-제형화된 PMP의 유효 용량으로 처리한다. 대안적으로, PMP 처리 이전에, 목화 식물의 떡잎의 하측을 25 G 바늘로 떡잎을 관통하지 않게 펀칭한다. 0(ddH2O), 1, 5, 10 및 20 ng/μl의 GrCLA1 dsRNA-로딩된 퍼플루오로옥탄-제형화된 PMP, 및 0(ddH2O), 1, 5, 10 및 20 ng/μl의 GrCLA1 dsRNA-로딩된 VIB(실시예 1)-제형화된 PMP의 유효 용량을 갖는 PMP 용액을 1 mL 무바늘 주사기를 사용하여 상해 부위를 통해 떡잎의 하측으로부터 손으로 침윤시킨다. 식물을 성장 챔버로 옮기고, 90 μmol m-2 s-1의 광 세기 및 26/20°C 낮/밤 온도를 사용하여 장일 조건(16시간/8시간 광/암 광주기) 하에 유지한다.
2, 5, 8 및 14일 후에, CLA1 dsRNA의 유전자 침묵화 효율을 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)을 사용하여 내인성 CLA1 mRNA의 발현 수준에 의해 시험한다. 전체 RNA를 제조처의 설명(인비트로겐(Invitrogen))에 따라 트리졸(Trizol) 시약을 사용하여 100 mg의 신선한 목화 잎으로부터 추출하고, RNase-부재 DNase I(프로메가(Promega))로 광범위하게 처리한다. 제1-가닥 cDNA를 슈퍼스크립트(SuperScript) TM 제1-가닥 합성 시스템(First-Strand Synthesis system)(인비트로겐)을 사용하여 2 μg의 전체 RNA로부터 합성한다. CLA1 전사물의 수준을 추정하기 위하여, qRT-PCR을 하기의 프로그램을 사용하여, 프라이머: GrCLA1q1_F 5’-CCAGGTGGGGCTTATGCATC-3’(SEQ ID NO: 7), GrCLA1q1_R 5’-CCACACCAAGGCTTGAACCC-3’(SEQ ID NO: 8), 및 GrCLA1q2_F 5’-GGCCGGATTCACGAAACGGT-3’(SEQ ID NO: 9), GrCLA1q2_R 5’-CGTCGAGATTGGCAGTTGGC-3’(SEQ ID NO: 10), 및 18s RNA_F 5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’(SEQ ID NO: 11), 18s RNA_ R 5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’(SEQ ID NO: 12)과 함께 SYBR 그린(Green) 리얼-타임(Real-Time) PCR 마스터 믹스(Master Mix)(써모 사이언티픽)를 사용하여 수행한다: (a) 5분 동안 95°C; (b) 30초 동안 94°C, 30초 동안 55°C; 및 30초 동안 72°C의 40 사이클. 18S rRNA 유전자를 내부 대조군으로서 사용하여 결과를 정규화시킨다. ΔΔCt 값을 계산하고, 퍼플루오로옥탄-제형화된 PMP를 이용한 처리 후의 정규화된 CLA1 발현을 PBS-제형화된 PMP를 이용한 처리 후의 정규화된 CLA1 발현과 비교함으로써 CLA1-dsRNA-로딩된 퍼플루오로옥탄-제형화된 및 CLA1-dsRNA-로딩된 PBS-제형화된 PMP를 이용한 처리 후의 목화 내의 CLA1 낙 다운 효율을 결정한다.
추가로, CLA1 dsRNA의 유전자 침묵화 효율을 표현형 광표백 분석에 의해 시험한다. 퍼플루오로옥탄-제형화된 PMP 및 PBS-제형화된 PMP로 처리된 식물의 잎의 사진을 찍고, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 유전자 침묵화 백분율을 결정하며, 이는 대조군 잎의 녹색 색상에 비하여 잎 상의 백색 광표백에 의해 반영된다. 식물당 3개의 잎을 검정하여, 광표백의 효과를 정량화하고, 퍼플루오로옥탄-제형화된 대 PBS-제형화된 CLA1-dsRNA-로딩된 PMP의 유전자 침묵화 효율을 평가한다.
퍼플루오로옥탄-제형화된 PMP는 PBS-제형화된 PMP에 비하여 식물 세포에 의해 더욱 효율적으로 흡수되며, 더 큰 CLA1 유전자 침묵화를 유도한다.
실시예 9: 세포 투과를 개선시키기 위하여 세제를 사용한 PMP의 제형화에 의한 PMP 흡수의 증가
본 실시예에는 세포막의 투과를 용이하게 하기 위하여 세제를 사용한 PMP의 변형에 의한, 동물, 식물, 진균 또는 박테리아 세포 내로의 PMP의 세포 흡수의 증가가 기재되어 있다. 본 실시예에서, 사포닌이 모델 세제로서, 자몽 PMP가 모델 PMP로서, 목화가 모델 식물로서, 사카로마이세스 세레비지애가 모델 효모로서, MDA-MB-231이 모델 인간 세포주로서, 스클레로티니아 스클레로티오룸이 모델 진균으로서, 그리고 슈도모나스 시린가에가 모델 박테리아로서 사용된다.
실험 프로토콜:
a) 사포닌을 사용한 PMP의 변형
자몽 PMP의 농축 용액을 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 단리한다. PMP를 0.001%, 0.01% 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%w/v의 사포닌 용액(아반티 폴라 리피즈(Avanti Polar Lipids)) 중에서의 격렬한 혼합을 사용하여 재현탁화시킨다. 대안적으로, CHAPS가 사용된다. 현탁액으로부터 100% 회수를 가정하고, 제형화 이전의 농도와 부피의 비를 곱하여 PMP의 농도를 결정한다. 사포닌-변형 PMP 특징 및 안정성을 실시예 3 및 실시예 4에 기재된 바와 같이 평가한다.
b) GFP 단백질이 로딩된 사포닌-변형 자몽 PMP를 사용하여 사카로마이세스 세레비지애에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산하고, 실시예 5에 기재된 바와 같이 GFP 단백질로 로딩한다. 일부 PMP를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 9a에 기재된 바와 같이 사포닌으로 변형시킨다. PMP의 GFP 캡슐화를 웨스턴 블롯 또는 형광에 의해 측정하였다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, PKH26 표지 키트의 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 비표지된 염료를 실시예 2에 기재된 방법에 의해 세척 제거하고, 표지된 PMP 펠렛을 PBS 중에 재현탁화시킨다. GFP-로딩된 사포닌-변형된 PKH26-표지된 PMP에 비한 GFP-로딩된 변형 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 사카로마이세스 세레비지애 진균 세포를 처리하였다.
사카로마이세스 세레비지애를 ATCC(#9763)로부터 수득하고, 제조처의 지침에 따라 이를 효모 추출물 펩톤 덱스트로스 브로쓰(YPD)에서 30℃에서 유지하였다. 사카로마이세스 세레비지애에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 효모 세포를 선별 배지에서 OD600 0.4 내지 0.6까지 성장시키고, 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PKH26-표지된 GFP-로딩된 변형 PMP, 또는 미변형 PMP와 유리 슬라이드 상에서 직접 인큐베이션시킨다. PBS 대조군에 더하여, 사카로마이세스 세레비지애 세포를 PKH26 염료(최종 농도 5 ㎍/㎖)의 존재 하에 인큐베이션시킨다. 실온에서 5분, 30분 및 1시간의 인큐베이션 후에, 이미지를 고해상도 형광 현미경에서 획득한다. PMP는, PKH26 염료에 의한 세포막의 배타적인 염색에 대하여 효모 세포의 세포질이 적색 및/또는 녹색으로 변하거나 세포질에서 적색 막 및 녹색 GFP-로딩된 PMP가 관찰되는 경우 효모 세포에 의해 흡수된다. 미변형 GFP-로딩된 PMP에 비한 GFP-로딩된 사포닌-변형된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질/세포질 내의 녹색 PMP를 갖는 효모 세포의 백분율을 비교한다. 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정함으로써 각각의 세포에서의 흡수의 양을 정량화하고, GFP-로딩된 사포닌-변형 PMP의 흡수 효율을 미변형 GFP-로딩된 PMP와 비교한다.
c) GFP 단백질이 로딩된 사포닌-변형 자몽 PMP를 사용하여 스클레로티니아 스클레로티오룸에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산하고, 실시예 5에 기재된 바와 같이 GFP 단백질로 로딩한다. 일부 PMP를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 6b에 기재된 바와 같이 사포닌으로 변형시킨다. PMP의 GFP 캡슐화를 웨스턴 블롯 또는 형광에 의해 측정하였다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 비표지된 염료를 실시예 2에 기재된 방법에 의해 세척 제거하고, 표지된 PMP 펠렛을 PBS 중에 재현탁화시킨다. GFP-로딩된 사포닌-변형된 PKH26-표지된 PMP에 비한 GFP-로딩된 변형 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 스클레로티니아 스클레로티오룸 진균 세포를 처리하였다.
스클레로티니아 스클레로토리움(ATCC, #18687) 자낭포자에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 10,000개의 자낭포자를 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PKH26-표지된 GFP-로딩된 변형 PMP, 또는 미변형 PMP와 유리 슬라이드 상에서 직접 인큐베이션시키고 인큐베이션시킨다. PBS 대조군에 더하여, S. 스클레로티오룸 세포를 PKH26 염료(최종 농도 5 ㎍/㎖)의 존재 하에 인큐베이션시킨다. 실온에서 5분, 30분 및 1시간의 인큐베이션 후에, 이미지를 고해상도 형광 현미경에서 획득한다. PMP는, PKH26 염료에 의한 세포막의 배타적인 염색에 대하여 효모 세포의 세포질이 적색 및/또는 녹색으로 변하거나 세포질에서 적색 막 및 녹색 GFP-로딩된 PMP가 관찰되는 경우 효모 세포에 의해 흡수된다. 미변형 GFP-로딩된 PMP에 비한 GFP-로딩된 사포닌-변형된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질/세포질 내의 녹색 PMP를 갖는 스클레로티니아 스클레로티오룸 세포의 백분율을 비교한다. 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정함으로써 각각의 세포에서의 흡수의 양을 정량화하고, GFP-로딩된 사포닌-변형 PMP의 흡수 효율을 미변형 GFP-로딩된 PMP와 비교한다.
d) 칼세인 AM이 로딩된 사포닌-변형 자몽 PMP를 사용하여 MDA-MB-231 세포에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산한다. 일부 PMP를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 6b에 기재된 바와 같이 사포닌으로 변형시킨다. 변형 및 미변형 PMP에 실시예 5 및 문헌[Gray et al., MethodsX 2015]에 기재된 바와 같이 칼세인 AM(시그마 알드리치)을 로딩한다. 칼세인 AM은 PMP에 의해 캡슐화되는 때에만 형광이며, 캡슐화는 형광에 의해 측정된다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 칼세인 AM 로딩된 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 미표지 염료를 세척해내고, PMP를 실시예 2에 기재된 바와 같이 100 kDa 아미콘(Amicon) 필터를 사용하여 농축시킨다. 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 사포닌-변형된 PMP에 비한 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 인간 유방암 세포를 처리하였다.
MDA-MB-231 유방암 세포주를 ATCC(HTB-26)로부터 수득하고, 공급처의 설명에 따라 성장시키고 유지한다. 70 내지 80% 컨플루언시의 세포를 수집하고, 계수하고, 96-웰 배양물 처리된 웰 플레이트에 200 uL 세포 배양 배지 중 웰당 10,000개 세포의 씨딩 밀도로 씨딩한다. 세포를 3시간 동안 부착되게 한 다음, 배지를 제거하고, 세포를 둘베코(Dulbecco) PBS로 1회 세척하고, FCS가 없는 배지를 첨가하여 처리 이전에 3시간 동안 세포를 혈청 기아시킨다. 유방암 세포에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 세포를 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PKH26-표지된 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 미변형 및 사포닌-변형 PMP와 웰에서 직접 인큐베이션시킨다. PBS 대조군에 더하여, 세포를 칼세인 AM (최종 농도 5 ㎍/㎖), PKH26 염료, 및 미변형 PMP의 존재 하에 인큐베이션시킨다(최종 농도 5 ㎍/㎖). 37C에서 30분, 1시간, 2시간 및 4시간의 인큐베이션 후에, 세포를 PBS로 4 x 10’ 세척하여 배지 중 PMP를 제거한다. 다음으로, 이미지를 고해상도 형광 현미경(EVOS2 FL) 상에서 40배로 획득하여, 흡수 효율을 결정한다. PMP는, PKH26 염료에 의한 세포막의 배타적인 염색에 대하여 세포의 세포질이 적색 및/또는 녹색으로 변하거나 세포질에서 적색 막 및 녹색 칼세인 AM-로딩된 PMP가 관찰되는 경우 유방암 세포에 의해 흡수된다. 미변형 칼세인 AM-로딩된 PMP에 비한 칼세인 AM-로딩된 사포닌-변형된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질/세포질 내의 녹색 PMP를 갖는 세포의 백분율을 비교한다. 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정함으로써 각각의 세포에서의 흡수의 양을 정량화하고, GFP-로딩된 사포닌-변형 PMP의 흡수 효율을 미변형 GFP-로딩된 PMP와 비교한다.
e) 칼세인 AM이 로딩된 사포닌-변형 자몽 PMP를 사용하여 슈도모나스 시린가에에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산한다. 일부 PMP를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 9b에 기재된 바와 같이 사포닌으로 변형시킨다. 변형 및 미변형 PMP에 실시예 5 및 문헌[Gray et al., MethodsX 2015]에 기재된 바와 같이 칼세인 AM(시그마 알드리치)을 로딩한다. 칼세인 AM은 PMP에 의해 캡슐화되는 때에만 형광이며, 캡슐화는 형광에 의해 측정된다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, PKH26 표지 키트의 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 칼세인 AM 로딩된 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 미표지 염료를 세척해내고, PMP를 실시예 2에 기재된 바와 같이 100 kDa 아미콘(Amicon) 필터를 사용하여 농축시킨다. 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 사포닌-변형된 PMP에 비한 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 슈도모나스 시린가에 박테리아 세포를 처리하였다.
슈도모나스 시린가에 박테리아를 ATCC(BAA-871)로부터 수득하고, 제조처의 설명에 따라 킹(King)의 배지 B 아가에서 성장시킨다. 슈도모나스 시린가에에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 1 ㎖ 하룻밤 박테리아 현탁액 중 10 ㎕를 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PKH26-표지된 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 미변형 및 사포닌-변형 PMP와 유리 슬라이드 상에서 직접 인큐베이션시킨다. 물 대조군에 더하여, 슈도모나스 시린가에 박테리아를 칼세인 AM (최종 농도 5 ㎍/㎖), PKH26 염료, 및 미변형 PMP의 존재 하에 인큐베이션시킨다(최종 농도 5 ㎍/㎖). 실온에서 5분, 30분 및 1시간의 인큐베이션 후에, 이미지를 고해상도 형광 현미경에서 획득한다. 미변형 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP에 비한 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 사포닌-변형된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질 또는 세포질 내의 녹색 및 적색 PMP를 갖는 박테리아 세포의 백분율을 비교한다. 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정함으로써 각각의 세포에서의 흡수의 양을 정량화하고, 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 사포닌-변형 PMP의 흡수 효율을 미변형 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP와 비교한다. PMP의 사포닌-변형은 미변형 PMP에 비하여 세포 흡수를 효율적으로 개선시킨다.
f) 목화 식물 내의 CLA1을 표적화하는 dsRNA가 로딩된 사포닌-변형 자몽 PMP의 증가된 PMP 흡수
사포닌-변형 PMP에 의한 세포 흡수의 증가를 입증하기 위하여, 자몽 PMP에 목화 광합성 유전자 GrCLA1(1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 신타제)을 표적화하는 커스텀 다이서 기질 siRNA(DsiRNA, IDT에 의해 설계됨) 또는 인공 miRNA(amiRNA, 식물 작은 RNA 마커 부위(P-SAMS; 문헌[Fahlgren et al., Bioinformatics. 32(1):157-158, 2016])를 사용하여 설계됨)를 로딩한다. GrCLA1은 아라비돕시스 클로로플라스토스 알테라도스(Arabidopsis Cloroplastos alterados) 1 유전자(AtCLA1)의 상동 유전자이며, 기능-소실은 본엽 상에 알비노 표현형을 초래하여, 침묵화 효율에 대한 가시적인 마커를 제공한다. 올리고뉴클레오티드를 IDT로부터 수득한다.
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산한다. 사포닌-변형 대 미변형 PMP의 PMP 흡수 효율을 결정하기 위하여, 자몽 PMP에 GrCLA1-amiRNA 또는 GrCLA1-DsiRNA 듀플렉스(표 12),를 실시예 5에 기재된 바와 같이 로딩한다. PMP의 amiRNA 또는 DsiRNA 캡슐화를 퀀트-It 리보그린 RNA 검정 키트를 사용하여 또는 대조군 형광 염료 표지된 amiRNA 또는 DsiRNA(IDT)를 사용하여 측정한다. 다음으로, 로딩된 PMP의 일부를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 9b에 기재된 바와 같이 사포닌으로 변형시킨다. CLA1-amiRNA/DsiRNA-로딩된 사포닌-변형된 PMP에 비한 CLA1-amiRNA/DsiRNA-로딩된 PMP의 PMP 흡수 효율을 결정하기 위해, 목화씨를 처리하고 CLA1 유전자 침묵화에 대해 분석하였다. amiRNA 또는 DsiRNA(이 둘을 아울러서 dsRNA라고 함)가 로딩된 PMP를 멸균수 중 0, 1, 5, 10, 및 20 ng/㎕의 dsRNA 유효 용량의 당량을 운반하는 농도로 수 중에 제형화한다.
목화 종자(고시피움 히르수툼 및 고시피움 라이몬디이)를 미국 국가 식물 생식질 시스템을 통해 수득한다. 살균된 종자를 흡습솜으로 싸고, 페트리 디쉬(Petri dish)에 두고, 성장 챔버 내에서 25°C, 150 μE m-2 S-1 광 세기에서, 14시간 광/10시간 암의 광주기로, 3일 동안 배치하여 발아시킨다. 묘목을 26/20°C 낮/밤 온도와 함께 장일 조건(long-day condition)(16/8시간 광/암 광주기) 하에 호글랜드(Hoagland)의 영양소 용액(시그마 알드리치)이 있는 멸균 배양관에서 성장시킨다. 4일 후에, 완전히 확장된 떡잎을 갖는 묘목(제1 본엽이 나타나기 이전)을 PMP 처리를 위해 사용한다.
7일 된 목화 묘목을 0.8%(w/v) 아가로스와 함께 1 x MS 비타민(시그마 알드리치) pH 5.6-5.8을 갖는 0.5 x 무라시지 및 스쿡(Murashige and Skoog; MS) 미네랄 염(시그마 알드리치) 상으로 옮기고, 전체 묘목에, 그룹마다 3개의 식물을 사용하여, 식물마다 1 ml 용액을 분무함으로써, 0(ddH2O), 1, 5, 10 및 20 ng/μl의 GrCLA1 dsRNA-로딩된 사포닌-변형 PMP 및 0(ddH2O), 1, 5, 10 및 20 ng/μl의 GrCLA1 dsRNA-로딩된 미변형 PMP의 유효 용량으로 처리한다. 대안적으로, PMP 처리 이전에, 목화 식물의 떡잎의 하측을 25 G 바늘로 떡잎을 관통하지 않게 펀칭한다. PMP 용액을 1 mL 무바늘 주사기를 사용하여 상해 부위를 통해 떡잎의 하측으로부터 손으로 침윤시킨다. 식물을 성장 챔버로 옮기고, 90 μmol m-2 s-1의 광 세기 및 26/20°C 낮/밤 온도를 사용하여 장일 조건(16시간/8시간 광/암 광주기) 하에 유지한다.
2, 5, 8 및 14일 후에, CLA1 dsRNA의 유전자 침묵화 효율을 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)을 사용하여 내인성 CLA1 mRNA의 발현 수준에 의해 시험한다. 전체 RNA를 제조처의 설명(인비트로겐(Invitrogen))에 따라 트리졸(Trizol) 시약을 사용하여 100 mg의 신선한 목화 잎으로부터 추출하고, RNase-부재 DNase I(프로메가(Promega))로 광범위하게 처리한다. 제1-가닥 cDNA를 슈퍼스크립트(SuperScript) TM 제1-가닥 합성 시스템(First-Strand Synthesis system)(인비트로겐)을 사용하여 2 μg의 전체 RNA로부터 합성한다. CLA1 전사물의 수준을 추정하기 위하여, qRT-PCR을 하기의 프로그램을 사용하여, 프라이머: GrCLA1q1_F 5’-CCAGGTGGGGCTTATGCATC-3’(SEQ ID NO: 7), GrCLA1q1_R 5’-CCACACCAAGGCTTGAACCC-3’(SEQ ID NO: 8), 및 GrCLA1q2_F 5’-GGCCGGATTCACGAAACGGT-3’(SEQ ID NO: 9), GrCLA1q2_R 5’-CGTCGAGATTGGCAGTTGGC-3’(SEQ ID NO: 10), 및 18s RNA_F 5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’(SEQ ID NO: 11), 18s RNA_ R 5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’(SEQ ID NO: 12)과 함께 SYBR 그린(Green) 리얼-타임(Real-Time) PCR 마스터 믹스(Master Mix)(써모 사이언티픽)를 사용하여 수행한다: (a) 5분 동안 95°C; (b) 30초 동안 94°C, 30초 동안 55°C; 및 30초 동안 72°C의 40 사이클. 18S rRNA 유전자를 내부 대조군으로서 사용하여 결과를 정규화시킨다. ΔΔCt 값을 계산하고, 사포닌-변형 PMP를 이용한 처리 후의 정규화된 CLA1 발현을 미변형 PMP를 이용한 처리 후의 정규화된 CLA1 발현과 비교함으로써 CLA1-dsRNA-로딩된 사포닌-변형 및 CLA1-dsRNA-로딩된 미변형 PMP를 이용한 처리 후의 목화 내의 CLA1 낙 다운 효율을 결정한다.
추가로, CLA1 dsRNA의 유전자 침묵화 효율을 표현형 광표백 분석에 의해 시험한다. 처리된 및 미처리된 목화 식물의 잎의 사진을 찍고, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 유전자 침묵화 백분율을 결정하며, 이는 대조군 잎의 녹색 색상에 비한 잎 상의 백색 광표백에 의해 반영된다. 식물당 3개의 잎을 검정하여, 광표백의 효과를 정량화하고, 사포닌-변형 대 미변형 CLA1-dsRNA-로딩된 PMP의 유전자 침묵화 효율을 평가한다.
사포닌-변형 PMP는 미변형 PMP에 비하여 식물 세포에 의해 더욱 효율적으로 흡수되며, 더 큰 CLA1 유전자 침묵화를 유도한다.
실시예 10: 쯔비터이온성 지질을 사용한 PMP의 제형화에 의한 PMP 세포 흡수의 증가
본 실시예에는 세포벽 및/또는 세포막의 투과를 용이하게 하기 위한 쯔비터이온성 지질을 사용한 PMP의 변형에 의한, 동물, 식물, 진균 또는 박테리아 세포 내로의 PMP의 세포 흡수의 증가가 기재되어 있다. 본 실시예에서, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(DOPC)이 모델 쯔비터이온성 지질로서, 자몽 PMP가 모델 PMP로서, 목화가 모델 식물로서, 사카로마이세스 세레비지애가 모델 효모로서, MDA-MB-231이 모델 인간 세포주로서, 스클레로티니아 스클레로티오룸이 모델 진균으로서, 그리고 슈도모나스 시린가에가 모델 박테리아로서 사용된다.
실험 프로토콜:
a) DOPC를 사용한 PMP의 변형
자몽 PMP의 농축 용액을 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 단리한다. PMP를 0.001%, 0.01% 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%w/v의 DOPC 용액(아반티 폴라 리피즈(Avanti Polar Lipids)) 중에서의 격렬한 혼합을 사용하여 재현탁화시킨다. 대안적으로, DEPC가 사용된다. 현탁액으로부터 100% 회수를 가정하고, 제형화 이전의 농도와 부피의 비를 곱하여 PMP의 농도를 결정한다. DOPC-변형 PMP 특징 및 안정성을 실시예 3 및 실시예 4에 기재된 바와 같이 평가한다.
b) GFP 단백질이 로딩된 DOPC-변형 자몽 PMP를 사용하여 사카로마이세스 세레비지애에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산하고, 실시예 5에 기재된 바와 같이 GFP 단백질로 로딩한다. 일부 PMP를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 10b에 기재된 바와 같이 DOPC로 변형시킨다. PMP의 GFP 캡슐화를 웨스턴 블롯 또는 형광에 의해 측정하였다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, PKH26 표지 키트의 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 비표지된 염료를 실시예 2에 기재된 방법에 의해 세척 제거하고, 표지된 PMP 펠렛을 PBS 중에 재현탁화시킨다. GFP-로딩된 DOPC-변형된 PKH26-표지된 PMP에 비한 GFP-로딩된 변형 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 사카로마이세스 세레비지애 진균 세포를 처리하였다.
사카로마이세스 세레비지애를 ATCC(#9763)로부터 수득하고, 제조처의 지침에 따라 이를 효모 추출물 펩톤 덱스트로스 브로쓰(YPD)에서 30℃에서 유지하였다. 사카로마이세스 세레비지애에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 효모 세포를 선별 배지에서 OD600 0.4 내지 0.6까지 성장시키고, 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PKH26-표지된 GFP-로딩된 변형 PMP, 또는 미변형 PMP와 유리 슬라이드 상에서 직접 인큐베이션시킨다. PBS 대조군에 더하여, 사카로마이세스 세레비지애 세포를 PKH26 염료(최종 농도 5 ㎍/㎖)의 존재 하에 인큐베이션시킨다. 실온에서 5분, 30분 및 1시간의 인큐베이션 후에, 이미지를 고해상도 형광 현미경에서 획득한다. PMP는, PKH26 염료에 의한 세포막의 배타적인 염색에 대하여 효모 세포의 세포질이 적색 및/또는 녹색으로 변하거나 세포질에서 적색 막 및 녹색 GFP-로딩된 PMP가 관찰되는 경우 효모 세포에 의해 흡수된다. 미변형 GFP-로딩된 PMP에 비한 GFP-로딩된 DOPC-변형된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질/세포질 내의 녹색 PMP를 갖는 효모 세포의 백분율을 비교한다. 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정함으로써 각각의 세포에서의 흡수의 양을 정량화하고, GFP-로딩된 DOPC-변형 PMP의 흡수 효율을 미변형 GFP-로딩된 PMP와 비교한다.
c) GFP 단백질이 로딩된 DOPC-변형 자몽 PMP를 사용하여 스클레로티니아 스클레로티오룸에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산하고, 실시예 5에 기재된 바와 같이 GFP 단백질로 로딩한다. 일부 PMP를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 6b에 기재된 바와 같이 DOPC로 변형시킨다. PMP의 GFP 캡슐화를 웨스턴 블롯 또는 형광에 의해 측정하였다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 비표지된 염료를 실시예 2에 기재된 방법에 의해 세척 제거하고, 표지된 PMP 펠렛을 PBS 중에 재현탁화시킨다. GFP-로딩된 DOPC-변형된 PKH26-표지된 PMP에 비한 GFP-로딩된 변형 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 스클레로티니아 스클레로티오룸 진균 세포를 처리하였다.
스클레로티니아 스클레로토리움(ATCC, #18687) 자낭포자에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 10,000개의 자낭포자를 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PKH26-표지된 GFP-로딩된 변형 PMP, 또는 미변형 PMP와 유리 슬라이드 상에서 직접 인큐베이션시키고 인큐베이션시킨다. PBS 대조군에 더하여, S. 스클레로티오룸 세포를 PKH26 염료(최종 농도 5 ㎍/㎖)의 존재 하에 인큐베이션시킨다. 실온에서 5분, 30분 및 1시간의 인큐베이션 후에, 이미지를 고해상도 형광 현미경에서 획득한다. PMP는, PKH26 염료에 의한 세포막의 배타적인 염색에 대하여 효모 세포의 세포질이 적색 및/또는 녹색으로 변하거나 세포질에서 적색 막 및 녹색 GFP-로딩된 PMP가 관찰되는 경우 효모 세포에 의해 흡수된다. 미변형 GFP-로딩된 PMP에 비한 GFP-로딩된 DOPC-변형된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질/세포질 내의 녹색 PMP를 갖는 스클레로티니아 스클레로티오룸 세포의 백분율을 비교한다. 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정함으로써 각각의 세포에서의 흡수의 양을 정량화하고, GFP-로딩된 DOPC-변형 PMP의 흡수 효율을 미변형 GFP-로딩된 PMP와 비교한다.
d) 칼세인 AM이 로딩된 DOPC-변형 자몽 PMP를 사용하여 MDA-MB-231 세포에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산한다. 일부 PMP를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 6b에 기재된 바와 같이 DOPC로 변형시킨다. 변형 및 미변형 PMP에 실시예 5 및 문헌[Gray et al., MethodsX 2015]에 기재된 바와 같이 칼세인 AM(시그마 알드리치)을 로딩한다. 칼세인 AM은 PMP에 의해 캡슐화되는 때에만 형광이며, 캡슐화는 형광에 의해 측정된다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 칼세인 AM 로딩된 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 미표지 염료를 세척해내고, PMP를 실시예 2에 기재된 바와 같이 100 kDa 아미콘(Amicon) 필터를 사용하여 농축시킨다. 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 DOPC-변형된 PMP에 비한 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 인간 유방암 세포를 처리하였다.
MDA-MB-231 유방암 세포주를 ATCC(HTB-26)로부터 수득하고, 공급처의 설명에 따라 성장시키고 유지한다. 70 내지 80% 컨플루언시의 세포를 수집하고, 계수하고, 96-웰 배양물 처리된 웰 플레이트에 200 uL 세포 배양 배지 중 웰당 10,000개 세포의 씨딩 밀도로 씨딩한다. 세포를 3시간 동안 부착되게 한 다음, 배지를 제거하고, 세포를 둘베코(Dulbecco) PBS로 1회 세척하고, FCS가 없는 배지를 첨가하여 처리 이전에 3시간 동안 세포를 혈청 기아시킨다. 유방암 세포에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 세포를 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PKH26-표지된 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 미변형 및 DOPC-변형 PMP와 웰에서 직접 인큐베이션시킨다. PBS 대조군에 더하여, 세포를 칼세인 AM (최종 농도 5 ㎍/㎖), PKH26 염료, 및 미변형 PMP의 존재 하에 인큐베이션시킨다(최종 농도 5 ㎍/㎖). 37C에서 30분, 1시간, 2시간 및 4시간의 인큐베이션 후에, 세포를 PBS로 4 x 10’ 세척하여 배지 중 PMP를 제거한다. 다음으로, 이미지를 고해상도 형광 현미경(EVOS2 FL) 상에서 40배로 획득하여, 흡수 효율을 결정한다. PMP는, PKH26 염료에 의한 세포막의 배타적인 염색에 대하여 세포의 세포질이 적색 및/또는 녹색으로 변하거나 세포질에서 적색 막 및 녹색 칼세인 AM-로딩된 PMP가 관찰되는 경우 유방암 세포에 의해 흡수된다. 미변형 칼세인 AM-로딩된 PMP에 비한 칼세인 AM-로딩된 DAB-변형된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질/세포질 내의 녹색 PMP를 갖는 세포의 백분율을 비교한다. 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정함으로써 각각의 세포에서의 흡수의 양을 정량화하고, GFP-로딩된 DOPC-변형 PMP의 흡수 효율을 미변형 GFP-로딩된 PMP와 비교한다.
e) 칼세인 AM이 로딩된 DOPC-변형 자몽 PMP를 사용하여 슈도모나스 시린가에에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산한다. 일부 PMP를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 10b에 기재된 바와 같이 DOPC로 변형시킨다. 변형 및 미변형 PMP에 실시예 5 및 문헌[Gray et al., MethodsX 2015]에 기재된 바와 같이 칼세인 AM(시그마 알드리치)을 로딩한다. 칼세인 AM은 PMP에 의해 캡슐화되는 때에만 형광이며, 캡슐화는 형광에 의해 측정된다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, PKH26 표지 키트의 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 칼세인 AM 로딩된 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 미표지 염료를 세척해내고, PMP를 실시예 2에 기재된 바와 같이 100 kDa 아미콘(Amicon) 필터를 사용하여 농축시킨다. 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 DOPC-변형된 PMP에 비한 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 슈도모나스 시린가에 박테리아 세포를 처리하였다.
슈도모나스 시린가에 박테리아를 ATCC(BAA-871)로부터 수득하고, 제조처의 설명에 따라 킹(King)의 배지 B 아가에서 성장시킨다. 슈도모나스 시린가에에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 1 ㎖ 하룻밤 박테리아 현탁액 중 10 ㎕를 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PKH26-표지된 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 미변형 및 DOPC-변형 PMP와 유리 슬라이드 상에서 직접 인큐베이션시킨다. 물 대조군에 더하여, 슈도모나스 시린가에 박테리아를 칼세인 AM (최종 농도 5 ㎍/㎖), PKH26 염료, 및 미변형 PMP의 존재 하에 인큐베이션시킨다(최종 농도 5 ㎍/㎖). 실온에서 5분, 30분 및 1시간의 인큐베이션 후에, 이미지를 고해상도 형광 현미경에서 획득한다. 미변형 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP에 비한 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 DOPC-변형된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질 또는 세포질 내의 녹색 및 적색 PMP를 갖는 박테리아 세포의 백분율을 비교한다. 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정함으로써 각각의 세포에서의 흡수의 양을 정량화하고, 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 DOPC-변형 PMP의 흡수 효율을 미변형 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP와 비교한다. PMP의 DOPC-변형은 미변형 PMP에 비하여 세포 흡수를 효율적으로 개선시킨다.
f) 목화 식물 내의 CLA1을 표적화하는 dsRNA가 로딩된 DOPC-변형 자몽 PMP의 증가된 PMP 흡수
DOPC-변형 PMP에 의한 세포 흡수의 증가를 입증하기 위하여, 자몽 PMP에 목화 광합성 유전자 GrCLA1(1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 신타제)을 표적화하는 커스텀 다이서 기질 siRNA(DsiRNA, IDT에 의해 설계됨) 또는 인공 miRNA(amiRNA, 식물 작은 RNA 마커 부위(P-SAMS; 문헌[Fahlgren et al., Bioinformatics. 32(1):157-158, 2016])를 사용하여 설계됨)를 로딩한다. GrCLA1은 아라비돕시스 클로로플라스토스 알테라도스(Arabidopsis Cloroplastos alterados) 1 유전자(AtCLA1)의 상동 유전자이며, 기능-소실은 본엽 상에 알비노 표현형을 초래하여, 침묵화 효율에 대한 가시적인 마커를 제공한다. 올리고뉴클레오티드를 IDT로부터 수득한다.
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산한다. 미변형 PMP에 비한 DOPC-변형된 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 자몽 PMP를 실시예 5에 기재된 바와 같이, GrCLA1-amiRNA 또는 GrCLA1-DsiRNA 듀플렉스(표 12)를 이용하여 로딩하였다. PMP의 amiRNA 또는 DsiRNA 캡슐화를 퀀트-It 리보그린 RNA 검정 키트를 사용하여 또는 대조군 형광 염료 표지된 amiRNA 또는 DsiRNA(IDT)를 사용하여 측정한다. 다음으로, 로딩된 PMP의 일부를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 10b에 기재된 바와 같이 DOPC로 변형시킨다. CLA1-amiRNA/DsiRNA-로딩된 DOPC-변형된 PMP에 비한 CLA1-amiRNA/DsiRNA-로딩된 PMP의 PMP 흡수 효율을 결정하기 위해, 목화씨를 처리하고 CLA1 유전자 침묵화에 대해 분석하였다. amiRNA 또는 DsiRNA(이 둘을 아울러서 dsRNA라고 함)가 로딩된 PMP를 멸균수 중 0, 1, 5, 10, 및 20 ng/㎕의 dsRNA 유효 용량의 당량을 운반하는 농도로 수 중에 제형화한다.
목화 종자(고시피움 히르수툼 및 고시피움 라이몬디이)를 미국 국가 식물 생식질 시스템을 통해 수득한다. 살균된 종자를 흡습솜으로 싸고, 페트리 디쉬(Petri dish)에 두고, 성장 챔버 내에서 25°C, 150 μE m-2 S-1 광 세기에서, 14시간 광/10시간 암의 광주기로, 3일 동안 배치하여 발아시킨다. 묘목을 26/20°C 낮/밤 온도와 함께 장일 조건(long-day condition)(16/8시간 광/암 광주기) 하에 호글랜드(Hoagland)의 영양소 용액(시그마 알드리치)이 있는 멸균 배양관에서 성장시킨다. 4일 후에, 완전히 확장된 떡잎을 갖는 묘목(제1 본엽이 나타나기 이전)을 PMP 처리를 위해 사용한다.
7일 된 목화 묘목을 0.8%(w/v) 아가로스와 함께 1 x MS 비타민(시그마 알드리치) pH 5.6-5.8을 갖는 0.5 x 무라시지 및 스쿡(Murashige and Skoog; MS) 미네랄 염(시그마 알드리치) 상으로 옮기고, 전체 묘목에, 그룹마다 3개의 식물을 사용하여, 식물마다 1 ml 용액을 분무함으로써, 0(ddH2O), 1, 5, 10 및 20 ng/μl의 GrCLA1 dsRNA-로딩된 DOPC-변형 PMP 및 0(ddH2O), 1, 5, 10 및 20 ng/μl의 GrCLA1 dsRNA-로딩된 미변형 PMP의 유효 용량으로 처리한다. 대안적으로, PMP 처리 이전에, 목화 식물의 떡잎의 하측을 25 G 바늘로 떡잎을 관통하지 않게 펀칭한다. PMP 용액을 1 mL 무바늘 주사기를 사용하여 상해 부위를 통해 떡잎의 하측으로부터 손으로 침윤시킨다. 식물을 성장 챔버로 옮기고, 90 μmol m-2 s-1의 광 세기 및 26/20°C 낮/밤 온도를 사용하여 장일 조건(16시간/8시간 광/암 광주기) 하에 유지한다.
2, 5, 8 및 14일 후에, CLA1 dsRNA의 유전자 침묵화 효율을 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)을 사용하여 내인성 CLA1 mRNA의 발현 수준에 의해 시험한다. 전체 RNA를 제조처의 설명(인비트로겐(Invitrogen))에 따라 트리졸(Trizol) 시약을 사용하여 100 mg의 신선한 목화 잎으로부터 추출하고, RNase-부재 DNase I(프로메가(Promega))로 광범위하게 처리한다. 제1-가닥 cDNA를 슈퍼스크립트(SuperScript) TM 제1-가닥 합성 시스템(First-Strand Synthesis system)(인비트로겐)을 사용하여 2 μg의 전체 RNA로부터 합성한다. CLA1 전사물의 수준을 추정하기 위하여, qRT-PCR을 하기의 프로그램을 사용하여, 프라이머: GrCLA1q1_F 5’-CCAGGTGGGGCTTATGCATC-3’(SEQ ID NO: 7), GrCLA1q1_R 5’-CCACACCAAGGCTTGAACCC-3’(SEQ ID NO: 8), 및 GrCLA1q2_F 5’-GGCCGGATTCACGAAACGGT-3’(SEQ ID NO: 9), GrCLA1q2_R 5’-CGTCGAGATTGGCAGTTGGC-3’(SEQ ID NO: 10), 및 18s RNA_F 5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’(SEQ ID NO: 11), 18s RNA_ R 5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’(SEQ ID NO: 12)과 함께 SYBR 그린(Green) 리얼-타임(Real-Time) PCR 마스터 믹스(Master Mix)(써모 사이언티픽)를 사용하여 수행한다: (a) 5분 동안 95°C; (b) 30초 동안 94°C, 30초 동안 55°C; 및 30초 동안 72°C의 40 사이클. 18S rRNA 유전자를 내부 대조군으로서 사용하여 결과를 정규화시킨다. ΔΔCt 값을 계산하고, DOPC-변형 PMP를 이용한 처리 후의 정규화된 CLA1 발현을 미변형 PMP를 이용한 처리 후의 정규화된 CLA1 발현과 비교함으로써 CLA1-dsRNA-로딩된 DOPC-변형 및 CLA1-dsRNA-로딩된 미변형 PMP를 이용한 처리 후의 목화에서의 CLA1 낙 다운 효율을 결정한다.
추가로, CLA1 dsRNA의 유전자 침묵화 효율을 표현형 광표백 분석에 의해 시험한다. 처리된 및 미처리된 목화 식물의 잎의 사진을 찍고, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 유전자 침묵화 백분율을 결정하며, 이는 대조군 잎의 녹색 색상에 비한 잎 상의 백색 광표백에 의해 반영된다. 식물당 3개의 잎을 검정하여, 광표백의 효과를 정량화하고, DOPC-변형 대 미변형 CLA1-dsRNA-로딩된 PMP의 유전자 침묵화 효율을 평가한다.
DOPC-변형 PMP는 미변형 PMP에 비하여 식물 세포에 의해 더욱 효율적으로 흡수되며, 더 큰 CLA1 유전자 침묵화를 유도한다.
실시예 11: 이온화 가능한 지질을 사용한 PMP의 제형화에 의한 PMP 세포 흡수의 증가
본 실시예에는 세포벽 및/또는 세포막의 투과를 용이하게 하기 위한 이온화 가능한 지질을 사용한 PMP의 변형에 의한, 동물, 식물, 진균 또는 박테리아 세포 내로의 PMP의 세포 흡수의 증가가 기재되어 있다. 본 실시예에서, 1,1‘-((2-(4-(2-((2-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)에틸) (2-하이드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200)이 모델 이온화 가능한 지질로서, 자몽 PMP가 모델 PMP로서, 목화가 모델 식물로서, 사카로마이세스 세레비지애가 모델 효모로서, MDA-MB-231이 모델 인간 세포주로서, 스클레로티니아 스클레로티오룸이 모델 진균으로서, 그리고 슈도모나스 시린가에가 모델 박테리아로서 사용된다.
실험 프로토콜:
a) C12-200을 사용한 PMP의 변형
자몽 PMP의 농축 용액을 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 단리한다. 문헌[Love PNAS 2010]의 합성 프로토콜에 따름으로써, C12-200(이온화 가능한 지질)을 수득한다. PMP를 0.001%, 0.01% 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%w/v의 C12-200 용액(아반티 폴라 리피즈(Avanti Polar Lipids)) 중에서의 격렬한 혼합을 사용하여 재현탁화시킨다. 현탁액으로부터 100% 회수를 가정하고, 제형화 이전의 농도와 부피의 비를 곱하여 PMP의 농도를 결정한다. C12-200-변형 PMP 특징 및 안정성을 실시예 3 및 실시예 4에 기재된 바와 같이 평가한다.
b) GFP 단백질이 로딩된 C12-200-변형 자몽 PMP를 사용하여 사카로마이세스 세레비지애에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산하고, 실시예 5에 기재된 바와 같이 GFP 단백질로 로딩한다. 일부 PMP를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 11b에 기재된 바와 같이 C12-200으로 변형시킨다. PMP의 GFP 캡슐화를 웨스턴 블롯 또는 형광에 의해 측정하였다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, PKH26 표지 키트의 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 비표지된 염료를 실시예 2에 기재된 방법에 의해 세척 제거하고, 표지된 PMP 펠렛을 PBS 중에 재현탁화시킨다. GFP-로딩된 C12-200-변형된 PKH26-표지된 PMP에 비한 GFP-로딩된 변형 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 사카로마이세스 세레비지애 진균 세포를 처리하였다.
사카로마이세스 세레비지애를 ATCC(#9763)로부터 수득하고, 제조처의 지침에 따라 이를 효모 추출물 펩톤 덱스트로스 브로쓰(YPD)에서 30℃에서 유지하였다. 사카로마이세스 세레비지애에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 효모 세포를 선별 배지에서 OD600 0.4 내지 0.6까지 성장시키고, 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PKH26-표지된 GFP-로딩된 변형 PMP, 또는 미변형 PMP와 유리 슬라이드 상에서 직접 인큐베이션시킨다. PBS 대조군에 더하여, 사카로마이세스 세레비지애 세포를 PKH26 염료(최종 농도 5 ㎍/㎖)의 존재 하에 인큐베이션시킨다. 실온에서 5분, 30분 및 1시간의 인큐베이션 후에, 이미지를 고해상도 형광 현미경에서 획득한다. PMP는, PKH26 염료에 의한 세포막의 배타적인 염색에 대하여 효모 세포의 세포질이 적색 및/또는 녹색으로 변하거나 세포질에서 적색 막 및 녹색 GFP-로딩된 PMP가 관찰되는 경우 효모 세포에 의해 흡수된다. 미변형 GFP-로딩된 PMP에 비한 GFP-로딩된 C12-200-변형된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질/세포질 내의 녹색 PMP를 갖는 효모 세포의 백분율을 비교한다. 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정함으로써 각각의 세포에서의 흡수의 양을 정량화하고, GFP-로딩된 C12-200-변형 PMP의 흡수 효율을 미변형 GFP-로딩된 PMP와 비교한다.
c) GFP 단백질이 로딩된 C12-200-변형 자몽 PMP를 사용하여 스클레로티니아 스클레로티오룸에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산하고, 실시예 5에 기재된 바와 같이 GFP 단백질로 로딩한다. 일부 PMP를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 6b에 기재된 바와 같이 C12-200으로 변형시킨다. PMP의 GFP 캡슐화를 웨스턴 블롯 또는 형광에 의해 측정하였다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 비표지된 염료를 실시예 2에 기재된 방법에 의해 세척 제거하고, 표지된 PMP 펠렛을 PBS 중에 재현탁화시킨다. GFP-로딩된 C12-200-변형된 PKH26-표지된 PMP에 비한 GFP-로딩된 변형 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 스클레로티니아 스클레로티오룸 진균 세포를 처리하였다.
스클레로티니아 스클레로토리움(ATCC, #18687) 자낭포자에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 10,000개의 자낭포자를 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PKH26-표지된 GFP-로딩된 변형 PMP, 또는 미변형 PMP와 유리 슬라이드 상에서 직접 인큐베이션시키고 인큐베이션시킨다. PBS 대조군에 더하여, S. 스클레로티오룸 세포를 PKH26 염료(최종 농도 5 ㎍/㎖)의 존재 하에 인큐베이션시킨다. 실온에서 5분, 30분 및 1시간의 인큐베이션 후에, 이미지를 고해상도 형광 현미경에서 획득한다. PMP는, PKH26 염료에 의한 세포막의 배타적인 염색에 대하여 효모 세포의 세포질이 적색 및/또는 녹색으로 변하거나 세포질에서 적색 막 및 녹색 GFP-로딩된 PMP가 관찰되는 경우 효모 세포에 의해 흡수된다. 미변형 GFP-로딩된 PMP에 비한 GFP-로딩된 C12-200-변형된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질/세포질 내의 녹색 PMP를 갖는 스클레로티니아 스클레로티오룸 세포의 백분율을 비교한다. 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정함으로써 각각의 세포에서의 흡수의 양을 정량화하고, GFP-로딩된 C12-200-변형 PMP의 흡수 효율을 미변형 GFP-로딩된 PMP와 비교한다.
d) 칼세인 AM이 로딩된 C12-200-변형 자몽 PMP를 사용하여 MDA-MB-231 세포에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산한다. 일부 PMP를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 6b에 기재된 바와 같이 C12-200으로 변형시킨다. 변형 및 미변형 PMP에 실시예 5 및 문헌[Gray et al., MethodsX 2015]에 기재된 바와 같이 칼세인 AM(시그마 알드리치)을 로딩한다. 칼세인 AM은 PMP에 의해 캡슐화되는 때에만 형광이며, 캡슐화는 형광에 의해 측정된다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 칼세인 AM 로딩된 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 미표지 염료를 세척해내고, PMP를 실시예 2에 기재된 바와 같이 100 kDa 아미콘(Amicon) 필터를 사용하여 농축시킨다. 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 C12-200-변형된 PMP에 비한 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 인간 유방암 세포를 처리하였다.
MDA-MB-231 유방암 세포주를 ATCC(HTB-26)로부터 수득하고, 공급처의 설명에 따라 성장시키고 유지한다. 70 내지 80% 컨플루언시의 세포를 수집하고, 계수하고, 96-웰 배양물 처리된 웰 플레이트에 200 uL 세포 배양 배지 중 웰당 10,000개 세포의 씨딩 밀도로 씨딩한다. 세포를 3시간 동안 부착되게 한 다음, 배지를 제거하고, 세포를 둘베코(Dulbecco) PBS로 1회 세척하고, FCS가 없는 배지를 첨가하여 처리 이전에 3시간 동안 세포를 혈청 기아시킨다. 유방암 세포에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 세포를 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PKH26-표지된 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 미변형 및 C12-200-변형 PMP와 웰에서 직접 인큐베이션시킨다. PBS 대조군에 더하여, 세포를 칼세인 AM (최종 농도 5 ㎍/㎖), PKH26 염료, 및 미변형 PMP의 존재 하에 인큐베이션시킨다(최종 농도 5 ㎍/㎖). 37C에서 30분, 1시간, 2시간 및 4시간의 인큐베이션 후에, 세포를 PBS로 4 x 10’ 세척하여 배지 중 PMP를 제거한다. 다음으로, 이미지를 고해상도 형광 현미경(EVOS2 FL) 상에서 40배로 획득하여, 흡수 효율을 결정한다. PMP는, PKH26 염료에 의한 세포막의 배타적인 염색에 대하여 세포의 세포질이 적색 및/또는 녹색으로 변하거나 세포질에서 적색 막 및 녹색 칼세인 AM-로딩된 PMP가 관찰되는 경우 유방암 세포에 의해 흡수된다. 미변형 칼세인 AM-로딩된 PMP에 비한 칼세인 AM-로딩된 C12-200-변형된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질/세포질 내의 녹색 PMP를 갖는 세포의 백분율을 비교한다. 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정함으로써 각각의 세포에서의 흡수의 양을 정량화하고, GFP-로딩된 C12-200-변형 PMP의 흡수 효율을 미변형 GFP-로딩된 PMP와 비교한다.
e) 칼세인 AM이 로딩된 C12-200-변형 자몽 PMP를 사용하여 슈도모나스 시린가에에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산한다. 일부 PMP를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 11b에 기재된 바와 같이 C12-200으로 변형시킨다. 변형 및 미변형 PMP에 실시예 5 및 문헌[Gray et al., MethodsX 2015]에 기재된 바와 같이 칼세인 AM(시그마 알드리치)을 로딩한다. 칼세인 AM은 PMP에 의해 캡슐화되는 때에만 형광이며, 캡슐화는 형광에 의해 측정된다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, PKH26 표지 키트의 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 칼세인 AM 로딩된 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 미표지 염료를 세척해내고, PMP를 실시예 2에 기재된 바와 같이 100 kDa 아미콘(Amicon) 필터를 사용하여 농축시킨다. 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 C12-200-변형된 PMP에 비한 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 슈도모나스 시린가에 박테리아 세포를 처리하였다.
슈도모나스 시린가에 박테리아를 ATCC(BAA-871)로부터 수득하고, 제조처의 설명에 따라 킹(King)의 배지 B 아가에서 성장시킨다. 슈도모나스 시린가에에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 1 ㎖ 하룻밤 박테리아 현탁액 중 10 ㎕를 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PKH26-표지된 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 미변형 및 C12-200-변형 PMP와 유리 슬라이드 상에서 직접 인큐베이션시킨다. 물 대조군에 더하여, 슈도모나스 시린가에 박테리아를 칼세인 AM (최종 농도 5 ㎍/㎖), PKH26 염료, 및 미변형 PMP의 존재 하에 인큐베이션시킨다(최종 농도 5 ㎍/㎖). 실온에서 5분, 30분 및 1시간의 인큐베이션 후에, 이미지를 고해상도 형광 현미경에서 획득한다. 미변형 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP에 비한 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 C12-200-변형된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질 또는 세포질 내의 녹색 및 적색 PMP를 갖는 박테리아 세포의 백분율을 비교한다. 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정함으로써 각각의 세포에서의 흡수의 양을 정량화하고, 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 C12-200-변형 PMP의 흡수 효율을 미변형 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP와 비교한다. PMP의 C12-200 변형은 미변형 PMP에 비하여 세포 흡수를 효율적으로 개선시킨다.
f) 목화 식물 내의 CLA1을 표적화하는 dsRNA가 로딩된 C12-200-변형 자몽 PMP의 증가된 PMP 흡수
C12-200-변형 PMP에 의한 세포 흡수의 증가를 입증하기 위하여, 자몽 PMP에 목화 광합성 유전자 GrCLA1(1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 신타제)을 표적화하는 커스텀 다이서 기질 siRNA(DsiRNA, IDT에 의해 설계됨) 또는 인공 miRNA(amiRNA, 식물 작은 RNA 마커 부위(P-SAMS; 문헌[Fahlgren et al., Bioinformatics. 32(1):157-158, 2016])를 사용하여 설계됨)를 로딩한다. GrCLA1은 아라비돕시스 클로로플라스토스 알테라도스(Arabidopsis Cloroplastos alterados) 1 유전자(AtCLA1)의 상동 유전자이며, 기능-소실은 본엽 상에 알비노 표현형을 초래하여, 침묵화 효율에 대한 가시적인 마커를 제공한다. 올리고뉴클레오티드를 IDT로부터 수득한다.
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산한다. 미변형 PMP에 비한 C12-200-변형된 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 자몽 PMP를 실시예 5에 기재된 바와 같이, GrCLA1-amiRNA 또는 GrCLA1-DsiRNA 듀플렉스(표 12)를 이용하여 로딩하였다. PMP의 amiRNA 또는 DsiRNA 캡슐화를 퀀트-It 리보그린 RNA 검정 키트를 사용하여 또는 대조군 형광 염료 표지된 amiRNA 또는 DsiRNA(IDT)를 사용하여 측정한다. 다음으로, 로딩된 PMP의 일부를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 11b에 기재된 바와 같이 C12-200로 변형시킨다. CLA1-amiRNA/DsiRNA-로딩된 C12-200-변형된 PMP에 비한 CLA1-amiRNA/DsiRNA-로딩된 PMP의 PMP 흡수 효율을 결정하기 위해, 목화씨를 처리하고 CLA1 유전자 침묵화에 대해 분석하였다. amiRNA 또는 DsiRNA(이 둘을 아울러서 dsRNA라고 함)가 로딩된 PMP를 멸균수 중 0, 1, 5, 10, 및 20 ng/㎕의 dsRNA 유효 용량의 당량을 운반하는 농도로 수 중에 제형화한다.
목화 종자(고시피움 히르수툼 및 고시피움 라이몬디이)를 미국 국가 식물 생식질 시스템을 통해 수득한다. 살균된 종자를 흡습솜으로 싸고, 페트리 디쉬(Petri dish)에 두고, 성장 챔버 내에서 25°C, 150 μE m-2 S-1 광 세기에서, 14시간 광/10시간 암의 광주기로, 3일 동안 배치하여 발아시킨다. 묘목을 26/20°C 낮/밤 온도와 함께 장일 조건(long-day condition)(16/8시간 광/암 광주기) 하에 호글랜드(Hoagland)의 영양소 용액(시그마 알드리치)이 있는 멸균 배양관에서 성장시킨다. 4일 후에, 완전히 확장된 떡잎을 갖는 묘목(제1 본엽이 나타나기 이전)을 PMP 처리를 위해 사용한다.
7일 된 목화 묘목을 0.8%(w/v) 아가로스와 함께 1 x MS 비타민(시그마 알드리치) pH 5.6-5.8을 갖는 0.5 x 무라시지 및 스쿡(Murashige and Skoog; MS) 미네랄 염(시그마 알드리치) 상으로 옮기고, 전체 묘목에, 그룹마다 3개의 식물을 사용하여, 식물마다 1 ml 용액을 분무함으로써, 0(ddH2O), 1, 5, 10 및 20 ng/μl의 GrCLA1 dsRNA-로딩된 C12-200-변형 PMP 및 0(ddH2O), 1, 5, 10 및 20 ng/μl의 GrCLA1 dsRNA-로딩된 미변형 PMP의 유효 용량으로 처리한다. 대안적으로, PMP 처리 이전에, 목화 식물의 떡잎의 하측을 25 G 바늘로 떡잎을 관통하지 않게 펀칭한다. PMP 용액을 1 mL 무바늘 주사기를 사용하여 상해 부위를 통해 떡잎의 하측으로부터 손으로 침윤시킨다. 식물을 성장 챔버로 옮기고, 90 μmol m-2 s-1의 광 세기 및 26/20°C 낮/밤 온도를 사용하여 장일 조건(16시간/8시간 광/암 광주기) 하에 유지한다.
2, 5, 8 및 14일 후에, CLA1 dsRNA의 유전자 침묵화 효율을 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)을 사용하여 내인성 CLA1 mRNA의 발현 수준에 의해 시험한다. 전체 RNA를 제조처의 설명(인비트로겐(Invitrogen))에 따라 트리졸(Trizol) 시약을 사용하여 100 mg의 신선한 목화 잎으로부터 추출하고, RNase-부재 DNase I(프로메가(Promega))로 광범위하게 처리한다. 제1-가닥 cDNA를 슈퍼스크립트(SuperScript) TM 제1-가닥 합성 시스템(First-Strand Synthesis system)(인비트로겐)을 사용하여 2 μg의 전체 RNA로부터 합성한다. CLA1 전사물의 수준을 추정하기 위하여, qRT-PCR을 하기의 프로그램을 사용하여, 프라이머: GrCLA1q1_F 5’-CCAGGTGGGGCTTATGCATC-3’(SEQ ID NO: 7), GrCLA1q1_R 5’-CCACACCAAGGCTTGAACCC-3’(SEQ ID NO: 8), 및 GrCLA1q2_F 5’-GGCCGGATTCACGAAACGGT-3’(SEQ ID NO: 9), GrCLA1q2_R 5’-CGTCGAGATTGGCAGTTGGC-3’(SEQ ID NO: 10), 및 18s RNA_F 5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’(SEQ ID NO: 11), 18s RNA_ R 5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’(SEQ ID NO: 12)과 함께 SYBR 그린(Green) 리얼-타임(Real-Time) PCR 마스터 믹스(Master Mix)(써모 사이언티픽)를 사용하여 수행한다: (a) 5분 동안 95°C; (b) 30초 동안 94°C, 30초 동안 55°C; 및 30초 동안 72°C의 40 사이클. 18S rRNA 유전자를 내부 대조군으로서 사용하여 결과를 정규화시킨다. ΔΔCt 값을 계산하고, C12-200-변형 PMP를 이용한 처리 후의 정규화된 CLA1 발현을 미변형 PMP를 이용한 처리 후의 정규화된 CLA1 발현과 비교함으로써 CLA1-dsRNA-로딩된 C12-200 -변형 및 CLA1-dsRNA-로딩된 미변형 PMP를 이용한 처리 후의 목화에서의 CLA1 낙 다운 효율을 결정한다.
추가로, CLA1 dsRNA의 유전자 침묵화 효율을 표현형 광표백 분석에 의해 시험한다. 처리된 및 미처리된 목화 식물의 잎의 사진을 찍고, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 유전자 침묵화 백분율을 결정하며, 이는 대조군 잎의 녹색 색상에 비한 잎 상의 백색 광표백에 의해 반영된다. 식물당 3개의 잎을 검정하여, 광표백의 효과를 정량화하고, C12-200-변형 대 미변형 CLA1-dsRNA-로딩된 PMP의 유전자 침묵화 효율을 평가한다.
C12-200-변형 PMP는 미변형 PMP에 비하여 식물 세포에 의해 더욱 효율적으로 흡수되며, 더 큰 CLA1 유전자 침묵화를 유도한다.
실시예 12: 양이온성 지질을 사용한 PMP의 제형화에 의한 PMP 세포 흡수의 증가
본 실시예에는 세포벽 및/또는 세포막의 투과를 용이하게 하기 위한 양이온성 지질을 사용한 PMP의 변형에 의한, 동물, 식물, 진균 또는 박테리아 세포 내로의 PMP의 세포 흡수의 증가가 기재되어 있다. 본 실시예에서, 자몽 PMP가 모델 PMP로서, 목화가 모델 식물로서, 사카로마이세스 세레비지애가 모델 효모로서, MDA-MB-231이 모델 인간 세포주로서, 스클레로티니아 스클레로티오룸이 모델 진균으로서, 그리고 슈도모나스 시린가에가 모델 박테리아로서 사용된다.
실험 프로토콜:
a) 양이온성 지질을 사용한 PMP의 변형
자몽 PMP의 농축 용액을 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 단리한다. PMP를 0.001%, 0.01% 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%w/v의 양이온성 지질 용액(아반티 폴라 리피즈(Avanti Polar Lipids)) 중에서의 격렬한 혼합을 사용하여 재현탁화시킨다. 현탁액으로부터 100% 회수를 가정하고, 제형화 이전의 농도와 부피의 비를 곱하여 PMP의 농도를 결정한다. 양이온성 지질-변형 PMP 특징 및 안정성을 실시예 3 및 실시예 4에 기재된 바와 같이 평가한다.
b) GFP 단백질이 로딩된 양이온성 지질-변형 자몽 PMP를 사용하여 사카로마이세스 세레비지애에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산하고, 실시예 5에 기재된 바와 같이 GFP 단백질로 로딩한다. 일부 PMP를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 12b에 기재된 바와 같이 양이온성 지질로 변형시킨다. PMP의 GFP 캡슐화를 웨스턴 블롯 또는 형광에 의해 측정하였다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, PKH26 표지 키트의 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 비표지된 염료를 실시예 2에 기재된 방법에 의해 세척 제거하고, 표지된 PMP 펠렛을 PBS 중에 재현탁화시킨다. GFP-로딩된 양이온성 지질-변형된 PKH26-표지된 PMP에 비한 GFP-로딩된 변형 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 사카로마이세스 세레비지애 진균 세포를 처리하였다.
사카로마이세스 세레비지애를 ATCC(#9763)로부터 수득하고, 제조처의 지침에 따라 이를 효모 추출물 펩톤 덱스트로스 브로쓰(YPD)에서 30℃에서 유지하였다. 사카로마이세스 세레비지애에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 효모 세포를 선별 배지에서 OD600 0.4 내지 0.6까지 성장시키고, 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PKH26-표지된 GFP-로딩된 변형 PMP, 또는 미변형 PMP와 유리 슬라이드 상에서 직접 인큐베이션시킨다. PBS 대조군에 더하여, 사카로마이세스 세레비지애 세포를 PKH26 염료(최종 농도 5 ㎍/㎖)의 존재 하에 인큐베이션시킨다. 실온에서 5분, 30분 및 1시간의 인큐베이션 후에, 이미지를 고해상도 형광 현미경에서 획득한다. PMP는, PKH26 염료에 의한 세포막의 배타적인 염색에 대하여 효모 세포의 세포질이 적색 및/또는 녹색으로 변하거나 세포질에서 적색 막 및 녹색 GFP-로딩된 PMP가 관찰되는 경우 효모 세포에 의해 흡수된다. 미변형 GFP-로딩된 PMP에 비한 GFP-로딩된 양이온성 지질-변형된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질/세포질 내의 녹색 PMP를 갖는 효모 세포의 백분율을 비교한다. 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정함으로써 각각의 세포에서의 흡수의 양을 정량화하고, GFP-로딩된 양이온성 지질-변형 PMP의 흡수 효율을 미변형 GFP-로딩된 PMP와 비교한다.
c) GFP 단백질이 로딩된 양이온성 지질-변형 자몽 PMP를 사용하여 스클레로티니아 스클레로티오룸에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산하고, 실시예 5에 기재된 바와 같이 GFP 단백질로 로딩한다. 일부 PMP를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 6b에 기재된 바와 같이 양이온성 지질로 변형시킨다. PMP의 GFP 캡슐화를 웨스턴 블롯 또는 형광에 의해 측정하였다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 비표지된 염료를 실시예 2에 기재된 방법에 의해 세척 제거하고, 표지된 PMP 펠렛을 PBS 중에 재현탁화시킨다. GFP-로딩된 양이온성 지질-변형된 PKH26-표지된 PMP에 비한 GFP-로딩된 변형 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 스클레로티니아 스클레로티오룸 진균 세포를 처리하였다.
스클레로티니아 스클레로토리움(ATCC, #18687) 자낭포자에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 10,000개의 자낭포자를 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PKH26-표지된 GFP-로딩된 변형 PMP, 또는 미변형 PMP와 유리 슬라이드 상에서 직접 인큐베이션시키고 인큐베이션시킨다. PBS 대조군에 더하여, S. 스클레로티오룸 세포를 PKH26 염료(최종 농도 5 ㎍/㎖)의 존재 하에 인큐베이션시킨다. 실온에서 5분, 30분 및 1시간의 인큐베이션 후에, 이미지를 고해상도 형광 현미경에서 획득한다. PMP는, PKH26 염료에 의한 세포막의 배타적인 염색에 대하여 효모 세포의 세포질이 적색 및/또는 녹색으로 변하거나 세포질에서 적색 막 및 녹색 GFP-로딩된 PMP가 관찰되는 경우 효모 세포에 의해 흡수된다. 미변형 GFP-로딩된 PMP에 비한 GFP-로딩된 양이온성 지질-변형된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질/세포질 내의 녹색 PMP를 갖는 스클레로티니아 스클레로티오룸 세포의 백분율을 비교한다. 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정함으로써 각각의 세포에서의 흡수의 양을 정량화하고, GFP-로딩된 양이온성 지질-변형 PMP의 흡수 효율을 미변형 GFP-로딩된 PMP와 비교한다.
d) 칼세인 AM이 로딩된 양이온성 지질-변형 자몽 PMP를 사용하여 MDA-MB-231 세포에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산한다. 일부 PMP를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 6b에 기재된 바와 같이 양이온성 지질로 변형시킨다. 변형 및 미변형 PMP에 실시예 5 및 문헌[Gray et al., MethodsX 2015]에 기재된 바와 같이 칼세인 AM(시그마 알드리치)을 로딩한다. 칼세인 AM은 PMP에 의해 캡슐화되는 때에만 형광이며, 캡슐화는 형광에 의해 측정된다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 칼세인 AM 로딩된 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 미표지 염료를 세척해내고, PMP를 실시예 2에 기재된 바와 같이 100 kDa 아미콘(Amicon) 필터를 사용하여 농축시킨다. 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 양이온성 지질-변형된 PMP에 비한 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 인간 유방암 세포를 처리하였다.
MDA-MB-231 유방암 세포주를 ATCC(HTB-26)로부터 수득하고, 공급처의 설명에 따라 성장시키고 유지한다. 70 내지 80% 컨플루언시의 세포를 수집하고, 계수하고, 96-웰 배양물 처리된 웰 플레이트에 200 uL 세포 배양 배지 중 웰당 10,000개 세포의 씨딩 밀도로 씨딩한다. 세포를 3시간 동안 부착되게 한 다음, 배지를 제거하고, 세포를 둘베코(Dulbecco) PBS로 1회 세척하고, FCS가 없는 배지를 첨가하여 처리 이전에 3시간 동안 세포를 혈청 기아시킨다. 유방암 세포에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 세포를 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PKH26-표지된 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 미변형 및 양이온성 지질-변형 PMP와 웰에서 직접 인큐베이션시킨다. PBS 대조군에 더하여, 세포를 칼세인 AM (최종 농도 5 ㎍/㎖), PKH26 염료, 및 미변형 PMP의 존재 하에 인큐베이션시킨다(최종 농도 5 ㎍/㎖). 37C에서 30분, 1시간, 2시간 및 4시간의 인큐베이션 후에, 세포를 PBS로 4 x 10’ 세척하여 배지 중 PMP를 제거한다. 다음으로, 이미지를 고해상도 형광 현미경(EVOS2 FL) 상에서 40배로 획득하여, 흡수 효율을 결정한다. PMP는, PKH26 염료에 의한 세포막의 배타적인 염색에 대하여 세포의 세포질이 적색 및/또는 녹색으로 변하거나 세포질에서 적색 막 및 녹색 칼세인 AM-로딩된 PMP가 관찰되는 경우 유방암 세포에 의해 흡수된다. 미변형 칼세인 AM-로딩된 PMP에 비한 칼세인 AM-로딩된 양이온성 지질-변형된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질/세포질 내의 녹색 PMP를 갖는 세포의 백분율을 비교한다. 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정함으로써 각각의 세포에서의 흡수의 양을 정량화하고, GFP-로딩된 양이온성 지질-변형 PMP의 흡수 효율을 미변형 GFP-로딩된 PMP와 비교한다.
e) 칼세인 AM이 로딩된 양이온성 지질-변형 자몽 PMP를 사용하여 슈도모나스 시린가에에 의한 증가된 PMP 흡수
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산한다. 일부 PMP를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 12b에 기재된 바와 같이 양이온성 지질로 변형시킨다. 변형 및 미변형 PMP에 실시예 5 및 문헌[Gray et al., MethodsX 2015]에 기재된 바와 같이 칼세인 AM(시그마 알드리치)을 로딩한다. 칼세인 AM은 PMP에 의해 캡슐화되는 때에만 형광이며, 캡슐화는 형광에 의해 측정된다. 다음으로, 모든 PMP 제형을 일부 변형하여 제조처의 프로토콜에 따라 적색 PKH26(시그마) 친지성 막 염료로 표지한다. 약술하여, PKH26 표지 키트의 1 ㎖의 희석액 C 중 50 ㎎의 칼세인 AM 로딩된 PMP를 2 ㎖의 1 mM PKH26과 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖의 1% BSA를 첨가함으로써 표지를 중단시킨다. 모든 미표지 염료를 세척해내고, PMP를 실시예 2에 기재된 바와 같이 100 kDa 아미콘(Amicon) 필터를 사용하여 농축시킨다. 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 양이온성 지질-변형된 PMP에 비한 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 슈도모나스 시린가에 박테리아 세포를 처리하였다.
슈도모나스 시린가에 박테리아를 ATCC(BAA-871)로부터 수득하고, 제조처의 설명에 따라 킹(King)의 배지 B 아가에서 성장시킨다. 슈도모나스 시린가에에 의한 PMP 흡수를 결정하기 위하여, 1 ㎖ 하룻밤 박테리아 현탁액 중 10 ㎕를 0(음성 대조군), 1, 10, 또는 50, 100 및 250 ㎍/㎖의 PKH26-표지된 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 미변형 및 양이온성 지질-변형 PMP와 유리 슬라이드 상에서 직접 인큐베이션시킨다. 물 대조군에 더하여, 슈도모나스 시린가에 박테리아를 칼세인 AM (최종 농도 5 ㎍/㎖), PKH26 염료, 및 미변형 PMP의 존재 하에 인큐베이션시킨다(최종 농도 5 ㎍/㎖). 실온에서 5분, 30분 및 1시간의 인큐베이션 후에, 이미지를 고해상도 형광 현미경에서 획득한다. 미변형 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP에 비한 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 양이온성 지질-변형된 PMP의 흡수 효율을 평가하기 위하여, PMP-처리된 세포와 PBS 및 PKH26 염료만의 대조군 간에, 오직 막만의 염색에 비한, 녹색 세포질 또는 세포질 내의 녹색 및 적색 PMP를 갖는 박테리아 세포의 백분율을 비교한다. 세포로부터의 적색 및 녹색 형광 신호 중간값을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정함으로써 각각의 세포에서의 흡수의 양을 정량화하고, 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 양이온성 지질-변형 PMP의 흡수 효율을 미변형 칼세인 AM-로딩된 PKH26-표지된 PMP와 비교한다. PMP의 양이온성 지질 변형은 미변형 PMP에 비하여 세포 흡수를 효율적으로 개선시킨다.
f) 목화 식물 내의 CLA1을 표적화하는 dsRNA가 로딩된 양이온성 지질-변형 자몽 PMP의 증가된 PMP 흡수
양이온성 지질-변형 PMP에 의한 세포 흡수의 증가를 입증하기 위하여, 자몽 PMP에 목화 광합성 유전자 GrCLA1(1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 신타제)을 표적화하는 커스텀 다이서 기질 siRNA(DsiRNA, IDT에 의해 설계됨) 또는 인공 miRNA(amiRNA, 식물 작은 RNA 마커 부위(P-SAMS; 문헌[Fahlgren et al., Bioinformatics. 32(1):157-158, 2016])를 사용하여 설계됨)를 로딩한다. GrCLA1은 아라비돕시스 클로로플라스토스 알테라도스(Arabidopsis Cloroplastos alterados) 1 유전자(AtCLA1)의 상동 유전자이며, 기능-소실은 본엽 상에 알비노 표현형을 초래하여, 침묵화 효율에 대한 가시적인 마커를 제공한다. 올리고뉴클레오티드를 IDT로부터 수득한다.
PMP를 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 자몽으로부터 생산한다. 미변형 PMP에 비한 양이온성 지질-변형된 PMP의 PMP흡수 효율을 결정하기 위해, 자몽 PMP를 실시예 5에 기재된 바와 같이, GrCLA1-amiRNA 또는 GrCLA1-DsiRNA 듀플렉스(표 12)를 이용하여 로딩하였다. PMP의 amiRNA 또는 DsiRNA 캡슐화를 퀀트-It 리보그린 RNA 검정 키트를 사용하여 또는 대조군 형광 염료 표지된 amiRNA 또는 DsiRNA(IDT)를 사용하여 측정한다. 다음으로, 로딩된 PMP의 일부를 대조군으로서 확보하고, 나머지를 실시예 12b에 기재된 바와 같이 양이온성 지질로 변형시킨다. CLA1-amiRNA/DsiRNA-로딩된 양이온성 지질-변형된 PMP에 비한 CLA1-amiRNA/DsiRNA-로딩된 PMP의 PMP 흡수 효율을 결정하기 위해, 목화씨를 처리하고 CLA1 유전자 침묵화에 대해 분석하였다. amiRNA 또는 DsiRNA(이 둘을 아울러서 dsRNA라고 함)가 로딩된 PMP를 멸균수 중 0, 1, 5, 10, 및 20 ng/㎕의 dsRNA 유효 용량의 당량을 운반하는 농도로 수 중에 제형화한다.
목화 종자(고시피움 히르수툼 및 고시피움 라이몬디이)를 미국 국가 식물 생식질 시스템을 통해 수득한다. 살균된 종자를 흡습솜으로 싸고, 페트리 디쉬(Petri dish)에 두고, 성장 챔버 내에서 25°C, 150 μE m-2 S-1 광 세기에서, 14시간 광/10시간 암의 광주기로, 3일 동안 배치하여 발아시킨다. 묘목을 26/20°C 낮/밤 온도와 함께 장일 조건(long-day condition)(16/8시간 광/암 광주기) 하에 호글랜드(Hoagland)의 영양소 용액(시그마 알드리치)이 있는 멸균 배양관에서 성장시킨다. 4일 후에, 완전히 확장된 떡잎을 갖는 묘목(제1 본엽이 나타나기 이전)을 PMP 처리를 위해 사용한다.
7일 된 목화 묘목을 0.8%(w/v) 아가로스와 함께 1 x MS 비타민(시그마 알드리치) pH 5.6-5.8을 갖는 0.5 x 무라시지 및 스쿡(Murashige and Skoog; MS) 미네랄 염(시그마 알드리치) 상으로 옮기고, 전체 묘목에, 그룹마다 3개의 식물을 사용하여, 식물마다 1 ml 용액을 분무함으로써, 0(ddH2O), 1, 5, 10 및 20 ng/μl의 GrCLA1 dsRNA-로딩된 양이온성 지질-변형 PMP 및 0(ddH2O), 1, 5, 10 및 20 ng/μl의 GrCLA1 dsRNA-로딩된 미변형 PMP의 유효 용량으로 처리한다. 대안적으로, PMP 처리 이전에, 목화 식물의 떡잎의 하측을 25 G 바늘로 떡잎을 관통하지 않게 펀칭한다. PMP 용액을 1 mL 무바늘 주사기를 사용하여 상해 부위를 통해 떡잎의 하측으로부터 손으로 침윤시킨다. 식물을 성장 챔버로 옮기고, 90 μmol m-2 s-1의 광 세기 및 26/20°C 낮/밤 온도를 사용하여 장일 조건(16시간/8시간 광/암 광주기) 하에 유지한다.
2, 5, 8 및 14일 후에, CLA1 dsRNA의 유전자 침묵화 효율을 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)을 사용하여 내인성 CLA1 mRNA의 발현 수준에 의해 시험한다. 전체 RNA를 제조처의 설명(인비트로겐(Invitrogen))에 따라 트리졸(Trizol) 시약을 사용하여 100 mg의 신선한 목화 잎으로부터 추출하고, RNase-부재 DNase I(프로메가(Promega))로 광범위하게 처리한다. 제1-가닥 cDNA를 슈퍼스크립트(SuperScript) TM 제1-가닥 합성 시스템(First-Strand Synthesis system)(인비트로겐)을 사용하여 2 μg의 전체 RNA로부터 합성한다. CLA1 전사물의 수준을 추정하기 위하여, qRT-PCR을 하기의 프로그램을 사용하여, 프라이머: GrCLA1q1_F 5’-CCAGGTGGGGCTTATGCATC-3’(SEQ ID NO: 7), GrCLA1q1_R 5’-CCACACCAAGGCTTGAACCC-3’(SEQ ID NO: 8), 및 GrCLA1q2_F 5’-GGCCGGATTCACGAAACGGT-3’(SEQ ID NO: 9), GrCLA1q2_R 5’-CGTCGAGATTGGCAGTTGGC-3’(SEQ ID NO: 10), 및 18s RNA_F 5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’(SEQ ID NO: 11), 18s RNA_ R 5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’(SEQ ID NO: 12)과 함께 SYBR 그린(Green) 리얼-타임(Real-Time) PCR 마스터 믹스(Master Mix)(써모 사이언티픽)를 사용하여 수행한다: (a) 5분 동안 95°C; (b) 30초 동안 94°C, 30초 동안 55°C; 및 30초 동안 72°C의 40 사이클. 18S rRNA 유전자를 내부 대조군으로서 사용하여 결과를 정규화시킨다. ΔΔCt 값을 계산하고, 양이온성 지질-변형 PMP를 이용한 처리 후의 정규화된 CLA1 발현을 미변형 PMP를 이용한 처리 후의 정규화된 CLA1 발현과 비교함으로써 CLA1-dsRNA-로딩된 양이온성 지질-변형 및 CLA1-dsRNA-로딩된 미변형 PMP를 이용한 처리 후의 목화에서의 CLA1 낙 다운 효율을 결정한다.
추가로, CLA1 dsRNA의 유전자 침묵화 효율을 표현형 광표백 분석에 의해 시험한다. 처리된 및 미처리된 목화 식물의 잎의 사진을 찍고, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 유전자 침묵화 백분율을 결정하며, 이는 대조군 잎의 녹색 색상에 비한 잎 상의 백색 광표백에 의해 반영된다. 식물당 3개의 잎을 검정하여, 광표백의 효과를 정량화하고, 양이온성 지질-변형 대 미변형 CLA1-dsRNA-로딩된 PMP의 유전자 침묵화 효율을 평가한다.
양이온성 지질-변형 PMP는 미변형 PMP에 비하여 식물 세포에 의해 더욱 효율적으로 흡수되며, 더 큰 CLA1 유전자 침묵화를 유도한다.
실시예 13: 양이온성 지질을 사용한 PMP의 변형
본 실시예에는 양이온성 지질을 사용한 PMP의 변형에 의하여, 인간 및 식물 세포에서 표면 전하를 변형시키고, 카고 로딩 능력을 증가시키고, PMP의 세포 흡수를 증가시키는 능력이 입증되어 있다. 본 실시예에서, DOTAP(1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판) 및 DC-콜레스테롤(3ß-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤)이 모델 양이온성 지질로서, 자몽 및 레몬 PMP가 모델 PMP로서, siRNA/트랜스-활성화 CRISPR RNA(TracrRNA)가 모델 음전하 페이로드로서, COLO679가 모델 인간 세포주로서, 그리고 제아 메이즈(Zea mays)(옥수수) 블랙 멕시칸 스위트(Black Mexican sweet; BMS)가 모델 식물 세포주로서 사용된다.
실험 프로토콜:
a) 레몬/자몽 PMP의 생산
유기농 홍자몽 또는 유기농 황레몬을 지역 식료품점으로부터 수득하였다. 6 리터의 자몽 즙을 착즙기를 사용하여 수집하였으며, pH를 NaOH를 사용하여 pH 4로 조정하고, 1 U/㎖ 펙티나제(시그마, 17389)와 인큐베이션시켜, 펙틴 오염물질을 제거한 후에, 20분 동안 3,000g에 이어서 40분 동안 10,000g에서 원심분리하여 큰 데브리스를 제거하였다. 다음으로, 착즙을 500 mM EDTA pH 8.6과 50 mM EDTA, pH 7.7의 최종 농도로 30분 동안 인큐베이션시켜, 칼슘을 킬레이트화시키고, 펙틴 거대분자의 형성을 방지하였다. 이후에, EDTA-처리된 즙을 11 ㎛, 1 ㎛ 및 0.45 ㎛ 필터를 통과시켜, 큰 입자를 제거하였다. 여과된 즙을 300 kDa TFF를 사용하여 접선 흐름 여과(TFF)에 의해 세척하고 농축시켰다. 즙을 10배 농축시킨 다음, PBS 중의 10 투석부피로 투석여과를 행하고, 120 ㎖의 최종 농도까지 추가로 농축하였다(50배). 다음으로, 본 발명자들은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 PMP-함유 분획을 용리하였으며, 이는 280에서의 흡광도(스펙트라맥스®) 및 단백질 농도(피어스™ BCA 단백질 검정)에 의해 분석하여, PMP-함유 분획 및 오염물질을 함유하는 후기 분획을 확인하였다. 정제된 PMP를 함유하였던 SEC 분획 3 내지 7(분획 9 내지 12는 오염물질을 함유함)을 함께 풀링하고, 0.8 ㎛, 0.45 ㎛ 및 0.22 ㎛ 주사기 필터를 사용한 순차적인 여과에 의해 여과 살균하고, PMP를 40,000x g에서 1.5시간 동안 펠렛화시키고, 펠렛을 4 ㎖의 울트로퓨어(UltaPure)™ DNase/RNase-부재 멸균수(써모피셔, 10977023)에서 재현탁화시킴으로써 추가로 농축시켰다. 최종 PMP 농도(7.56x1012개 PMP/㎖) 및 PMP 크기(70.3 ㎚ +/- 12.4 ㎚ SD)를 제조처에 의해 제공되는 농도 및 크기 표준을 사용하여 NanoFCM에 의해 결정하였다. 생성된 자몽(GF) 또는 레몬(LM) PMP를 하기에 기재된 바와 같이 블라이-다이어(Bligh-Dyer) 방법을 사용하여 지질 추출을 위해 사용하였다.
b) 양이온성 지질을 사용한 PMP의 변형
지질 재구성된 PMP(LPMP)를 제조하기 위하여, 자몽 또는 레몬 PMP의 농축 용액으로부터의 전체 지질 추출을 블라이-다이어 방법을 사용하여 수행하였다(문헌[Bligh and Dyer, J Biolchem Physiol, 37: 911-917, 1959]). 약술하여, 1 mL의 농축 PMP(1012-1013개 PMP/mL)를 3.5 mL의 클로로포름:메탄올 혼합물(1:2, v/v)과 혼합하고, 잘 와류시켰다. 그 다음, 1.25mL의 클로로포름을 첨가하고, 와류시킨 후에, 1.25 mL의 멸균수와 함께 진탕시켰다. 마지막으로, 혼합물을 실온에서 5분 동안 300 g에서 원심분리하였다. 지질을 함유하는 하측 유기상을 TurboVap® 시스템(Biotage®)을 사용하여 회수하고 건조시켰다. 천연 LPMP의 지질 조성을 변형시키기 위하여, 합성 양이온성 지질(DOTAP, DC-콜레스테롤)을 클로로포름:메탄올(9:1) 중에 용해시키고, 25% 또는 40%(w/w)의 전체 지질이 되도록 PMP 추출된 지질에 첨가한 후, 격렬하게 혼합하였다. 건조된 지질막을 비활성 기체(예를 들어, 질소)의 스트림을 사용한 용매의 증발에 의해 또는 TurboVap® 시스템을 사용한 증발에 의해 제조하였다(도 1). 추출된 지질로부터 재구성된 PMP를 제조하기 위하여, 물 또는 완충액(예를 들어, PBS)을 건조된 지질막에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 수화되게 하였다. 형성된 지질 입자를 10회의 동결-해동 사이클 또는 음파처리(브란슨(Branson) 2800 음파처리조, 10 분, 실온)로 처리하였다. 그 다음, 지질 이중층의 수 및 전체 입자 크기를 감소시키기 위하여, 지질 PMP를 미니 익스트루더(Mini Extruder)(아반티® 폴라 리피즈)를 사용하여 0.8 μm, 0.4 μm 및 0.2 μm 폴리카보네이트 필터를 통해 압출시켰다(도 1). 농축된 LPMP가 필요하면, 4oC에서 30분 동안 100,000 x g에서 초원심분리에 의해 시료를 농축시켰다. 최종 펠렛을 멸균 초순수 또는 PBS 중에 재현탁화시키고, 추가의 사용 시까지 4℃로 유지하였다. 최종 LPMP 농도및 중간값 LPMP 크기(89 내지 104 ㎚ 범위)를 제조처에 의해 제공되는 농도 및 크기 표준을 사용하여 NanoFCM에 의해 결정하였다. 표면 전하(제타 전위)를 제타사이저(Zetasizer)(말번 파날리티컬(Malvern Panalytical))를 사용하여 동적 광 산란에 의해 측정하였다(도 4a). LPMP 크기 및 농도의 범위는 LM LPMP에 있어서 83 ±19 nm 및 1.7x1012개 LPMP/mL, DOTAP-변형 LPMP에 있어서 106 ± 25 nm 및 6.54x1010개 LPMP/mL, 및 DC-콜레스테롤-변형 PMP에 있어서 91 ±17 nm 및 3.08 x1011개 LPMP/mL였다(도 2). 양이온성 지질 DOTAP 및 DC-콜레스테롤을 사용한 LPMP의 변형은 LPMP의 표면 전하를 변경시켰다: 양이온성 지질 함량이 증가할수록, LPMP의 표면 전하가 증가하였다(도 4a). 추출된 레몬 지질로부터 재구성된 LPMP의 Cryo-EM 이미지의 분석에 의해, LPMP의 구형도 및 입자 크기 분포를 확인하였다(68.7 ± 23 nm (SD))(도 3a 및 도 3b).
c) 음으로 하전된 카고를 이용한 양이온성 지질-변형 PMP의 로딩
siRNA/TracrRNA를 로딩하기 위하여, GF 또는 LM 추출된 지질에 양이온성 지질을 보충하고, 상기 기재된 바와 같이 건조시켰다. 뉴클레아제 미함유 물 또는 듀플렉스(Duplex) 완충액(IDT®) 중에 용해된 siRNA/TracrRNA를 건조된 지질막에, PMP 지질 1 mg당 1.5 nmol로 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 수화되게 하였다. 형성된 지질 입자를 10회의 동결-해동 사이클로 처리하고, 미니 익스트루더(아반티® 폴라 리피즈)를 사용하여 0.8 μm, 0.4 μm 및 0.2 μm 폴리카보네이트 필터를 통해 압출시켰다(도 1). 로딩된 PMP를 100 kDa MWCO 멤브레인과 함께 투석 디바이스(스펙트럼(Spectrum)®)에서 PBS에 대하여 하룻밤 투석한 다음, 0.2 μm 폴리에테르술폰(PES) 필터를 사용하여 멸균하였다. 또한, 시료를 정제하고, 초원심분리를 사용하여 농축시켰다. 로딩된 PMP를 4 oC에서 100,000 x g에서 30분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 펠렛을 1 mL PBS 중에 재현탁화시키고, 100,000 x g에서 30분 동안 농축시켰다. 생성된 펠렛을 PBS(인간 세포에 의한 세포 흡수에 대하여) 또는 물(식물 세포에 의한 세포 흡수에 대하여) 중에 재현탁화시켰다. RNA-로딩된 LPMP의 크기 및 입자의 수를 NanoFCM에 의해 평가하였다: 평균 크기 및 입자 농도는 미변형 LPMP에 있어서 89 ± 15 nm 및 1.54x1012개의 LPMP/mL였으며, DC-Chol에 있어서 104 ± 25 nm 및 2.54x1011개의 LPMP/mL였으며, DOTAP 에 있어서 100 ± 30 nm 및 9.7x1011개의 LPMP/mL였다. RNA 로딩을 퀀트-iTTM 리보그린TM 검정에 의해 또는 표지된 카고(알렉사 플루오르 555로 표지된 siRNA 또는 ATTO 550으로 표지된 TracrRNA)의 형광 세기의 측정에 의해 결정하였다. 리보그린TM 검정을 헤파린(5 mg/mL) 및 1% 트리톤-X100의 존재 하에 제조처의 프로토콜에 따라 수행하여 PMP를 용해시키고, 캡슐화된 카고를 방출시켰다. 양이온성 지질 DOTAP 및 DC-콜레스테롤을 사용한 LPMP의 변형에 의해, 양이온성 지질이 없는 LPMP에 비하여, LPMP의 표면 전하가 변경되었으며, 음으로 하전된 카고(예를 들어, RNA)의 로딩이 증가되었다(도 4a 내지 도 4d).
d) 인간 세포(COLO679)에 의한 DOTAP 변형 PMP의 증가된 흡수
DOTAP(20%, w/w)가 보충된 자몽으로부터의 지질 변형 PMP(LPMP)를 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. 다음으로, PMP 제형을 일부 변형하여, 제조처의 프로토콜에 따라 녹색 PKH67 친지성 막 염료(시그마)로 표지하였다. 약술하여, 300 μL의 LPMP(대략 1x1012개 PMP/mL)를 희석제 C와 1:1 혼합한 후, 희석제 C 중에 희석된 PKH67 염료와 혼합하고(염료:시료의 최종 비는 1:500, v/v였음), 100 rpm에서 진탕시키면서, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 유리 염료를 PBS로 평형화된 제바TM 스핀 탈염 컬럼(40 kDa MWCO, 써모 피셔 사이언티픽) 상에서의 LPMP의 정제에 의해 제거하였다. 표지된 LPMP를 0.2 μm 멸균 필터를 사용하여 멸균하고, 초원심분리에 의해 농축시키고(30분, 100,000 g, 4oC), 멸균 PBS 중에 재현탁화시켰다. 최종 LPMP 농도 및 평균 크기(LPMP에 있어서 1.1x1012개LPMP/mL 및 83 ± 19 nm; DOTAP에 있어서 8.95x1011 및 100 ± 30 nm)를 NanoFCM에 의해 결정하였다. 형광 세기를 분광광도계(스펙트라맥스(SpectraMax)®) 를 사용하여 Ex/Em = 485/510 nm에서 확인하였다. 동일한 농도(1:500, v/v)의 유리 PKH67 염료를 동일한 접근법을 사용하여 정제하였다.
COLO679 세포를 10%의 열 불활성화 FBS(집코(Gibco)) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(집코)이 있는 RPMI 1640 배지(써모 피셔 사이언티픽) 중에 배양하였다. 세포를 실험 1일 전에 96-웰 플레이트에 6000개 세포/웰로 씨딩하였다. PKH67-표지된 LPMP의 흡수를 결정하기 위하여, COLO679 세포를 37 oC에서 3일 동안 웰당 2x1010개의 입자의 농도의 LPMP와 함께 인큐베이션시켰다. 유리 PKH67 염료를 대조군으로서 사용하였다. 인큐베이션 시간의 마지막에, 세포를 빙냉 PBS 1x로 2회 세척하고, PBS 중 4% 포름알데히드 100 μL로 15 내지 30분 동안 고정하였다. 세포 핵을 DAPI(써모 피셔 사이언티픽)로 염색하였다. 이미지를 40x 대물 렌즈와 함께 형광 현미경(올림푸스(Olympus) IX83)을 사용하여 획득하였다. DOTAP를 사용한 변형에 의해, 양이온성 지질이 없는 LPMP에 비하여, COLO679 세포를 사용한 LPMP의 흡수/회합이 증가되었다(도 5). 본 발명자들의 데이터는 DOTAP-변형 LPMP가 추가의 양이온성 지질이 없는 LPMP에 비하여 COLO679 세포를 사용한 비히클의 흡수 및/또는 회합을 향상시켰음을 뒷받침한다.
e) DC-콜레스테롤-변형 PMP에 의한 식물 세포로의 RNA의 증가된 운반
제아 메이즈, 블랙 멕시칸 스위트(BMS) 세포를 아라비돕시스 생물 자원 센터(Arabidopsis Biological Resource Center; ABRC)로부터 구입하였다. BMS 세포를 4.3 g/ℓ의 무라시지 및 스쿡 기저 염 혼합물(시그마 M5524), 2% 수크로스(S0389, 밀리포어 시그마), 2 ㎎/ℓ의 2,4-디클로로페녹시아세트산(D7299, 밀리포어 시그마), 250 ㎍/ℓ의 티아민 HCL(V-014, 밀리포어 시그마) 및 ddH2O 중 1x MS 비타민 용액을 함유하는 무라시지 및 스쿡 기저 배지 pH 5.8에서 성장시켰다. 1x 비타민 믹스 용액은 니아신(N0761-100G, 밀리포어 시그마(Millipore Sigma)), 피록시딘 하이드로클로라이드(P6280-25G, 밀리포어 시그마), D-판토텐산 헤미칼슘 염(P5155-100G, 밀리포어 시그마), L-아스파라긴(A4159-25G, 밀리포어 시그마) 및 미오-이노시톨(I7508-100G, 밀리포어 시그마)을 1.3 mg/L, 250 μg/L, 250 μg/L, 130 mg/L 및 200 mg/L의 각각의 최종 농도로 함유하였다. 세포를 진탕시키면서(110 rpm), 24°C에서 암 조건에서 1L 통기형 코니컬(conical) 멸균 플라스크에서 성장시켰다.
BMS 세포 처리를 위하여, 10 ㎖의 세포 현탁액을 취하여, 팩 세포 부피(PCV) 백분율을 결정하였다. PCV는 세포 배양물 분취액의 총 부피로 나눈 세포의 부피로 정의되며, 백분율로서 표현된다. 세포를 3900 rpm에서 5분 동안 원심분리하였으며, 세포 펠렛의 부피를 결정하였다. BMS에 대한 PCV%는 20%였다. 흡수 실험을 위하여, 상기 기재된 바와 같이 세포를 배지 중에 희석시킴으로써 배양물의 PCV%를 4%로 조정하였다. LPMP, 및 DC-콜레스테롤로 변형된 LPMP에, 상기 기재된 바와 같이 ATTO 550으로 표지된 TracrRNA를 로딩하고, 멸균시키고, 멸균수 중에 재현탁화시켰다. 입자의 평균 크기 및 농도를 NanoFCM에 의해 분석하였으며, DC-Chol에 있어서 104 ± 25 nm 및 2.54x1011개 LPMP/mL, 및 미변형 LPMP에 있어서 89 ± 15 nm 및 1.54x1012개 LPMP/mL이었다. 시료 중 TracrRNA ATTO 550(IDT)의 양을 퀀트-iTTM 리보그린®에 의해 정량화하였다. LPMP 및 433 ng의 TracrRNA를 함유하는 DC-콜레스테롤을 사용하여 변형된 LPMP 둘 모두 50 μL를 24-웰 플레이트 내의 식물 세포 현탁액의 450 μL의 분취액에 2벌로 첨가하였다. 50μl의 멸균 초순수를 세포에 첨가하고, 음성 대조군으로서 사용하였다. 세포를 암 중에서 24℃에서 3시간 동안 인큐베이션시켰으며, 1 ㎖의 초순수 멸균수로 3회 세척하여, 세포에 의해 흡수되지 않은 입자를 제거했다. 세포를 표면형광 현미경(올림푸스 IX83) 상에서의 영상화를 위하여 500 μL의 멸균 초순수 중에 재현탁화시켰다. 검출 가능한 형광을 갖지 않았던 음성 대조군(초순수 멸균수)에 비하여, 가변적인 형광 신호가 LPMP 및 DC-콜레스테롤로 변형된 LPMP를 이용하여 처리된 식물 세포에서 검출될 수 없었다(도 6). DC-콜레스테롤로 변형된 LPMP는 가장 강력한 형광 신호를 나타내었으며, 이는 이 PMP 변형이 식물 세포로의 TracrRNA의 가장 높은 운반을 가졌음을 나타낸다. 본 발명자들의 데이터는 양이온성 지질 DC-콜레스테롤을 사용한 LPMP의 변형이 시험관 내에서 식물 세포에 의한 레몬 LPMP 흡수를 개선시켰음을 보여준다.
실시예 14: 이온화 가능한 지질을 사용한 PMP의 변형
본 실시예에는 이온화 가능한 지질을 사용한 PMP의 변형에 의하여, pH-의존적 방식으로 표면 전하를 변형시켜, 카고 로딩 능력과, 식물 세포 내로의 PMP의 세포 흡수를 증가시키는 능력이 입증되어 있다. 본 실시예에서, C12-200(1,1‘-((2-(4-(2-((2-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)에틸)
(2-하이드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)) 및 MC3((6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트, DLin-MC3-DMA)이 모델 이온화 가능한 지질로서 사용되고, 레몬 PMP가 모델 PMP로서 사용되고, 트랜스-활성화 CRISPR RNA(TracrRNA), 단일의 가이드 RNA(gRNA)가 모델 음전하 페이로드로서 사용된다. 블랙 멕시칸 스위트(Black Mexican Sweet; BMS) 옥수수 세포가 모델 식물 세포주로서 사용된다.
a) 이온화 가능한 지질을 사용한 PMP의 변형
지질-변형 PMP(LPMP)를 제조하기 위하여, 지질을 실시예 13에 기재된 바와 같이 단리된, 레몬 PMP의 농축 용액으로부터 블라이-다이어 방법(문헌[Bligh and Dyer, 1959, J Biolchem Physiol 37:911-917])을 사용하여 추출하였다. 이온화 가능한 지질을 25% 또는 40%(w/w)의 전체 지질이 되도록 클로로포름:메탄올(9:1) 중 PMP 추출된 지질 원액에 첨가하고, 지질을 격렬한 혼합에 의해 재현탁화시켰다. 추출된 지질로부터 건조된 지질막 및 재구성된 PMP를 실시예 13에 기재된 바와 같이 제조하였다. LPMP의 크기 및 입자의 수를 NanoFCM에 의해 평가하였다. LPMP 크기 및 농도의 범위는 LM LPMP에 있어서 83 ±19 nm 및 1.7x1012개 LPMP/mL, MC3-변형 LPMP에 있어서 88 ± 22 nm 및 1.35x1012개 LPMP/mL, 및 C12-200-변형 PMP에 있어서 86 ±16 nm 및 1.19 x1012개 LPMP/mL였다(도 7). 표면 전하(제타 전위)를 제타사이저(말번 파날리티컬)를 사용하여 동적 광 산란에 의해 측정하였다. 이온화 가능한 지질 C12-200 및 MC3를 사용한 지질-재구성된 PMP의 변형은 LPMP의 표면 전하의 pH-의존적 변화를 가능하게 하였다: pH가 감소할수록, LPMP의 표면 전하가 증가하였다(도 8a).
b) 음으로 하전된 카고를 이용한 이온화 가능한 지질-변형 PMP의 로딩
뉴클레아제 미함유 물 또는 듀플렉스 완충액(IDT®) 중에 용해된 TracrRNA/gRNA를 건조된 지질막에, PMP 지질 1 mg당 1.5 nmol로 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 수화되게 하였다. 0.1 M 시트레이트 완충액 pH 3.2(테크노바(Teknova))를 사용하여 재현탁화된 지질 용액의 pH를 4.5로 조정하여, RNA 포획을 촉진시켰다. 그 다음, 지질 용액을 5회의 동결-해동 사이클로 처리하였다. 이후에, 지질 용액의 pH를 0.1 M 중탄산염 완충액(pH 10)을 사용하여 pH 9가 되게 한 다음, 지질을 추가 5회의 동결-해동 사이클로 처리하였다. 형성된 지질 입자를 미니 익스트루더(아반티® 폴라 리피즈)를 사용하여 0.8 μm, 0.4 μm 및 0.2 μm 폴리카보네이트 필터를 통해 압출시켰다. 로딩된 PMP를 100 kDa MWCO 멤브레인과 함께 투석 디바이스(스펙트럼(Spectrum)®)에서 PBS에 대하여 하룻밤 투석한 다음, 0.2 μm 폴리에테르술폰(PES) 필터를 사용하여 멸균하였다. 또한, 시료를 정제하고, 초원심분리를 사용하여 농축시켰다. 로딩된 PMP를 4 oC에서 100,000 x g에서 30분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 펠렛을 1 mL PBS 중에 재현탁화시키고, 100,000 x g에서 30분 동안 농축시켰다. 생성된 펠렛을 수 중에 재현탁화시켰다(식물 세포에 의한 세포 흡수를 위함). RNA-로딩된 LPMP의 크기 및 입자의 수를 NanoFCM에 의해 평가하였다. 평균 크기 및 입자 농도는 미변형 LPMP에 있어서 89 ± 15 nm 및 1.54x1012개 LPMP/mL였으며; C12-200-변형 LPMP에 있어서 87 ± 16 nm 및 7.15 x1011개 LPMP/mL였으며; MC3-변형 LPMP에 있어서 93 ± 27 nm 및 2.4x1011개 LPMP/mL였다. RNA 로딩을 리보그린TM 검정에 의해 또는 표지된 카고(TracrRNA ATTO 550)의 형광 세기의 측정에 의해 결정하였다. 리보그린TM 검정을 헤파린(5 mg/mL) 및 1% 트리톤-X100의 존재 하에 제조처의 프로토콜에 따라 수행하여 PMP를 용해시키고, 캡슐화된 카고를 방출시켰다. 이온화 가능한 지질 MC3 및 C12-200을 사용한 지질-재구성된 PMP의 변형은, 이온화 가능한 지질이 없는 LPMP에 비하여, LPMP의 표면 전하의 pH-의존적 변화 및 산성 pH에서 음으로 하전된 카고(예를 들어, RNA)의 증가된 로딩을 가능하게 하였다(도 8b 및 도 8c).
c) 식물 세포(BMS)에 의한 C12-200 변형 PMP의 증가된 흡수
제아 메이즈 블랙 멕시칸 스위트(BMS) 세포를 실시예 13(e)에 기재된 바와 같이 배양하였다. BMS 세포 처리를 위하여, 10 ㎖의 세포 현탁액을 취하여, 팩 세포 부피(PCV) 백분율을 결정하였다. PCV는 세포 배양물 분취액의 총 부피로 나눈 세포의 부피로 정의되며, 백분율로서 표현된다. 세포를 3900 rpm에서 5분 동안 원심분리하였으며, 세포 펠렛의 부피를 결정하였다. BMS에 대한 PCV%는 20%였다. 흡수 실험을 위하여, 상기 기재된 바와 같이 세포를 배지 중에 희석시킴으로써 배양물의 PCV%를 4%로 조정하였다. LPMP, 및 C12-200으로 변형된 LPMP에, 상기 기재된 바와 같이 TracrRNA ATTO 550을 로딩하고, 멸균시키고, 멸균수 중에 재현탁화시켰다. NanoFCM에 의해 분석되는 입자의 평균 크기 및 농도는 C12-200-LPMP에 있어서 87 ± 16 nm 및 7.15x1011개 LPMP/mL였으며, 미변형 LPMP에 있어서 89 ± 15 nm 및 7.15Ex1012개 LPMP/mL이었다. 시료 중 TracrRNA ATTO 550(IDT)의 양을 퀀트-iTTM 리보그린TM에 의해 정량화하였다. LPMP 또는 433 ng의 TracrRNA를 함유하는 C12-200을 사용하여 변형된 LPMP 50 μL를 24-웰 플레이트 내의 식물 세포 현탁액의 450 μL의 분취액에 2벌로 첨가하였다. 50 μl의 멸균 초순수를 세포에 첨가하였으며, 음성 대조군으로서 사용하였다. 세포를 암 중에서 24℃에서 3시간 동안 인큐베이션시켰으며, 1 ㎖의 초순수 멸균수로 3회 세척하여, 세포에 의해 흡수되지 않은 입자를 제거했다. 세포를 표면형광 현미경(올림푸스 IX83) 상에서의 영상화를 위하여 500 μL의 멸균 초순수 중에 재현탁화시켰다. 검출 가능한 형광을 갖지 않았던 음성 대조군(초순수 멸균수)에 비하여, 가변적인 형광 신호가 LPMP 및 C12-200으로 변형된 LPMP를 이용하여 처리된 식물 세포에서 검출될 수 없었다(도 9). C12-200으로 변형된 LPMP는 가장 강력한 형광 신호를 나타내었으며, 이는 이 PMP 변형이 식물 세포를 사용한 TracrRNA의 가장 높은 운반/회합을 가졌음을 나타낸다. 본 발명자들의 데이터는 C12-200 이온화 가능한 지질을 이용한 LPMP의 변형이 시험관 내에서 식물 세포에 의한 레몬 LPMP 흡수를 개선시켰음을 보여준다.
실시예 15: 세포벽-투과 단백질 셀룰라제를 이용한 PMP의 변형
본 실시예에는 세포벽 성분의 분해를 용이하게 하기 위한 셀룰라제를 이용한 PMP의 변형에 의해 식물, 진균 또는 박테리아 세포 내로의 PMP의 세포 흡수를 증가시키는 능력이 입증되어 있다. 본 실시예에서, 셀룰라제가 모델 세포벽 분해 효소로서, 자몽 PMP가 모델 PMP로서, 그리고 옥수수 블랙 멕시칸 스위트(maize Black Mexican Sweet) 세포가 모델 식물 세포로서 사용된다.
실험 프로토콜:
a) 셀룰라제-PEG4-아지드의 합성
효소를 추적하기 위하여, 셀룰라제(시그마 알드리치)를 제조처의 설명에 따라 알렉사 플루오르® 488 형광 표지(써모피셔 사이언티픽)로 표지하였다. 약술하여, 20 mg의 셀룰라제를 2 mL의 중탄산염 완충액(pH 8.3) 중에 10 mg/mL의 최종 농도로 용해시켰다. 알렉사 플루오르® 488(AF488)을 무수 DMSO(10 mg/mL) 중에 용해시키고, 30 μL의 AF488을 용해된 셀룰라제에 첨가하였다. 실온(RT), 150 rpm, 암 중에 1시간 동안 인큐베이션 후에, 혼합물을 4°C에서 하룻밤 유지하였다. 유리 염료를 PBS로 평형화된 PD-10 탈염 컬럼(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))에 의해 제거하였다. PBS 중 수집된 AF488-표지된 셀룰라제(BCA 검정에 의해 검출되는 바와 같이 0.45 mg/mL)를 제조처의 설명에 따라 NHS-PEG4-아지드(써모피셔 사이언티픽)와 반응시켰다. 약술하여, NHS-PEG4-아지드를 무수 DMSO 중에 100 mM의 최종 농도로 용해시키고, 2 mL의 AF488-표지된 셀룰라제에 10 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 2개의 용액을 혼합하고, 실온, 150 rpm, 30분, 암 중에 인큐베이션시켰다. Tris-HCl을 100 mM의 최종 농도로 첨가함으로써 반응을 중단시켰다. 관을 2시간 동안 4°C로 설정하여, 반응을 완전히 켄칭시킨 다음, 정제를 PBS로 평형화된 제바 스핀 탈염 컬럼(MWCO 7 kDa)을 사용하여 수행하였다. 아미콘® 울트라 10K 디바이스(MWCO 10 kDa, 4 mL)를 사용하여, AF488-표지된 셀룰라제-PEG4-아지드를 농축시켰다. 변형 셀룰라제는 BCA 검정에 의해 검출되는 바와 같이 0.38 mg/mL의 단백질 농도를 가졌으며, 형광측정 셀룰라제 활성 검정 키트(아브캄)에 의해 검출되는 바와 같이 32%의 초기 효소 활성을 유지하였다.
b) 셀룰라제-PEG4-아지드를 이용한 PMP의 변형
몇몇의 전략을 사용하여 자몽 PMP의 표면을 셀룰라제로 변형시켰다.
변형 프로토콜 b.1
PMP의 아미노기를 제조처의 설명에 따라 NHS-포스핀(써모피셔 사이언티픽)과 반응시킨 다음, PMP-포스핀을 포스핀과 아지드기 사이의 구리-부재 반응을 통하여 AF488-표지된 셀룰라제-PEG4-아지드(실시예 15(a)에 기재된 바와 같음)와 컨쥬게이트시켰다. 약술하여, NHS-포스핀을 무수 DMSO 중에 10 mM의 최종 농도로 용해시키고, PBS 중에 재현탁화된 PMP(8.4x1012개 PMP/mL)에 1 mM의 최종 NHS-포스핀 농도로 첨가하였다. 2개의 용액을 혼합하고, 실온, 150 rpm에서, 30분 동안 인큐베이션시켰다. Tris-HCl을 150 mM의 최종 농도로 첨가함으로써 반응을 중단시켰다. 관을 2시간 동안 4°C로 설정하여, 반응을 완전히 켄칭시킨 다음, 정제를 아미콘® 울트라 100K 디바이스(MWCO 100 kDa, 0.5 mL)에 이어서 PBS로 평형화된 제바 스핀 탈염 컬럼(MWCO 7 kDa)을 사용하여 수행하였다. 그 다음, PMP-포스핀을 700 μL의 AF488-표지된 셀룰라제-PEG4-아지드와 혼합하고, 37°C, 암 중에 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 혼합물을 스펙트라(Spectra)/포르(Por)® 바이오테크(Biotech)-그레이드(Grade) 투석(Dialysis) 튜빙(Tubing) 300 kDa MWCO(스펙트럼 래보러터리즈 인코포레이티드(Spectrum Laboratories Inc.))를 사용하여 4°C에서 2일 동안 PBS에 대하여 투석하여, 미결합 셀룰라제 및 추가의 화학물질 및 부산물을 제거하였다. 투석 후에, 셀룰라제-변형 PMP를 아미콘® 울트라 100K 디바이스(MWCO 100 kDa)를 사용하여 농축시켰다. 최종 생성물은 BCA 검정에 의해 검출되는 바와 같이 0.8 mg/mL의 단백질 농도, 및 NanoFCM에 의해 검출되는 바와 같이 4%의 형광 게이트된 집단과 함께, 5.3x1012개 PMP/mL의 입자 농도를 가졌다. 잔류 초기 효소 활성은 9.3%였다.
변형 프로토콜 b.2
PMP의 카복실-기를 제조처의 설명에 따라 NH2-DBCO(밀리포어시그마)와 반응시킨 다음, PMP-DBCO를 구리-부재 화학: DBCO와 아지드기 사이의 반응을 통해 AF488-표지된 셀룰라제-PEG4-아지드와 컨쥬게이트시켰다(실시예 15(a)). 먼저, PMP의 카복실기를 제조처의 설명에 따라 EDC 하이드로클로라이드(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드, 써모피셔 사이언티픽)를 사용하여 활성화시켰다. 약술하여, 0.2 mL의 자몽 PMP(3.8x1013개 PMP/mL)를 아세테이트 완충액 중에 신선하게 용해된 1 mg의 EDC와 혼합하였다(최종 pH ~5-5.5). 혼합물을 실온에서 15분 동안 인큐베이션시킨 다음, 용해된 DBCO-NH2(10 mM, 무수 DMSO)와 1 mM의 최종 농도로 조합하였다. 반응 혼합물을 실온, 150 rpm에서, 30분 인큐베이션시켰다. 1 M Tris-HCl을 150 mM의 최종 농도로 첨가함으로써 반응을 중단시켰다. 관을 2시간 동안 4°C로 설정하여, 반응을 완전히 켄칭시킨 다음, 정제를 아미콘® 울트라 100K 디바이스(MWCO 100 kDa, 0.5 mL)에 이어서 PBS로 평형화된 제바 스핀 탈염 컬럼(MWCO 7 kDa)을 사용하여 수행하였다. 두번째로, PMP-DBCO를 700 μL의 AF488-표지된 셀룰라제-PEG4-아지드와 혼합시키고, 37°C에서 암 중에 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 미결합 셀룰라제 및 부산물을 제거하기 위하여, 혼합물을 스펙트라/포르® 바이오테크-그레이드 투석 튜빙 300 kDa MWCO(스펙트럼 래보러터리즈 인코포레이티드)를 사용하여 4°C에서 2일 동안 PBS에 대하여 투석하였다. 투석 후에, 셀룰라제-변형 PMP를 아미콘® 울트라 100K 디바이스(MWCO 100 kDa)를 사용하여 농축시켰다. 최종 생성물은 BCA 검정에 의해 검출되는 바와 같이 0.9 mg/mL의 단백질 농도, 및 NanoFCM에 의해 검출되는 바와 같이 7%의 형광 게이트된 집단과 함께, 5.2x1012개 PMP/mL의 입자 농도를 가졌다. 잔류 초기 효소 활성은 형광측정 셀룰라제 활성 검정 키트(아브캄)에 의해 검출되는 바와 같이 8.4%였다.
변형 프로토콜 b.3
PMP의 아미노-기를 제조처의 설명에 따라 NHS-PEG4-DBCO(밀리포어시그마)와 반응시킨 다음, PMP-PEG4-DBCO를 DBCO와 아지드기 사이의 구리-부재 반응을 통하여 AF488-표지된 셀룰라제-PEG4-아지드(실시예 15(a))와 컨쥬게이트시켰다. 약술하여, NHS-PEG4-DBCO을 무수 DMSO 중에 10 mM의 최종 농도로 용해시키고, PBS 중에 재현탁화된 PMP(8.4x1012개 PMP/mL)에 1 mM의 최종 NHS-PEG4-DBCO 농도로 첨가하였다. 2개의 용액을 혼합하고, 실온, 150 rpm에서 30분 인큐베이션시켰다. 1 M Tris-HCl을 150 mM의 최종 농도로 첨가함으로써 반응을 중단시켰다. 관을 2시간 동안 4°C로 설정하여, 반응을 완전히 켄칭시킨 다음, 정제를 아미콘® 울트라 100K 디바이스(MWCO 100 kDa, 0.5 mL)에 이어서 PBS로 평형화된 제바 스핀 탈염 컬럼(MWCO 7 kDa)을 사용하여 수행하였다. 그 다음, PMP-PEG4-DBCO를 700 μL의 AF488-표지된 셀룰라제-PEG4-아지드와 혼합하고, 37°C에서 암 중에 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 혼합물을 스펙트라/포르® 바이오테크-그레이드 투석 튜빙 300 kDa MWCO(스펙트럼 래보러터리즈 인코포레이티드)를 사용하여 4°C에서 2일 동안 PBS에 대하여 투석하였다. 투석 후에, 셀룰라제-변형 PMP를 아미콘® 울트라 100K 디바이스(MWCO 100 kDa)를 사용하여 농축시켰다. 최종 생성물은 BCA 검정에 의해 검출되는 바와 같이 1.3 mg/mL의 단백질 농도, 및 NanoFCM에 의해 검출되는 바와 같이 17%의 형광 게이트된 집단과 함께, 2x1012개 PMP/mL의 입자 농도를 가졌다. 잔류 초기 효소 활성은 형광측정 셀룰라제 활성 검정 키트(아브캄)에 의해 검출되는 바와 같이 17%였다.
c) 셀룰라제를 이용한 PMP의 변형(c.1)
자몽 PMP의 카복실-기를 카보디이미드 화학을 사용하여 AF488-표지된 셀룰라제의 아미노-기와 반응시켰다. 먼저, PMP의 카복실-기를 제조처의 설명에 따라 EDC 하이드로클로라이드(써모피셔 사이언티픽)를 사용하여 활성화시켰다. 약술하여, 0.2 mL의 자몽 PMP(3.8x1013개 PMP/mL)를 아세테이트 완충액(최종 pH ~5-5.5) 중 신선하게 용해된 1 mg의 EDC와 혼합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, AF488-표지된 셀룰라제를 실온, 150 rpm, 암 중에서 2시간 동안 활성화된 PMP와 함께 인큐베이션시켰다. 정제를 PBS로 평형화된 제바 스핀 탈염 컬럼(MWCO 7 kDa)을 사용하여 수행한 후에, 스펙트라/포르® 바이오테크-그레이드 투석 튜빙 300 kDa MWCO(스펙트럼 래보러터리즈 인코포레이티드)를 사용하여 4°C에서 2일 동안 PBS에 대하여 투석하였다. 투석 후에, 셀룰라제-변형 PMP를 아미콘® 울트라 100K 디바이스(MWCO 100 kDa)를 사용하여 농축시켰다. 최종 생성물은 BCA 검정에 의해 검출되는 바와 같이 1.1 mg/mL의 단백질 농도, 및 NanoFCM에 의해 검출되는 바와 같이 27%의 형광 게이트된 집단과 함께, 1.6x1012개 PMP/mL의 입자 농도를 가졌다. 잔류 초기 효소 활성은 형광측정 셀룰라제 활성 검정 키트(아브캄)에 의해 검출되는 바와 같이 9.2%였다.
d) 친지성 염료를 이용한 셀룰라제-변형 PMP의 표지
생성된 알렉사플루오르488-표지된 셀룰라제-변형 자몽 PMP를 이중 표지를 갖도록 친지성 PKH26 염료(밀리포어시그마)로 표지하였다(녹색 - AF488 및 적색 - PKH26). 변형된 PMP(PBS 중 2x1012개 PMP/mL)를 1:1 v/v 비로 희석제 C(밀리포어시그마)와 혼합하였다. PKH26 염료를 희석제 C 중에 용해시키고, 1:500(염료:희석제 C, v/v)과 동일한 최종 비로 사전희석된 PMP와 혼합하였다. 반응 혼합물을 37°C에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, PBS 로 평형화된 제바 스핀 탈염 컬럼(MWCO 7 kDa)을 사용하여 정제하여, 유리 염료를 제거하였다. 그 다음, PKH26-표지된 셀룰라제-변형 PMP를 아미콘® 울트라 100K 디바이스(MWCO 100 kDa, 10분, 4,000g, 3회)를 사용하여 농축시켰다. 최종 PMP를 NanoFCM을 사용하여 분석하고(대략 7x1012개 PMP/mL), PKH26 표지의 형광 세기에 기초하여 정규화시켰다(Ex/Em = 550/570 nm). 희석제 C와 인큐베이션시키고, 상기 기재된 바와 동일한 방식으로 정제된 유리 염료를 대조군으로서 사용하였다.
e) 셀룰라제-변형 자몽 PMP를 사용하여 제아 메이즈 BMS 식물 세포에 의한 증가된 PMP 흡수
제아 메이즈, 블랙 멕시칸 스위트(BMS) 세포를 실시예 13(e)에 기재된 바와 같이 성장시켰다. BMS 세포 처리를 위하여, 10 ㎖의 세포 현탁액을 취하여, 팩 세포 부피(PCV) 백분율을 결정하였다. 세포를 3900 rpm에서 5분 동안 원심분리하였으며, 세포 펠렛의 부피를 결정하였다. BMS에 대한 PCV%는 20%였다. 흡수 실험을 위하여, 상기 기재된 바와 같이 세포를 배지 중에 희석시킴으로써 배양물의 PCV%를 4%로 조정하였다.
자몽 PMP를 실시예 15(b)에 기재된 바와 같이 상이한 교차-결합을 사용하여 알렉사플루오르488-표지된 셀룰라제와 컨쥬게이트시켜, 셀룰라제-컨쥬게이트된 PMP를 제공한 후, PMP 지질막을 PKH26 표지하였다. PKH26으로 표지된, 그러나 셀룰라제 변형이 없는 자몽 PMP의 대조군(GF-PMP)도 또한 제조하였다. 모든 시료를 멸균시켰으며, 멸균수 중에 재현탁화시키고, 상기 기재된 바와 같이 NanoFCM, 단백질 검정 및 셀룰라제 활성 검정에 의해 분석하였다. 그 다음, 동일한 양의 PMP(2.65x1012개 PMP/mL)를 함유하는 각각의 셀룰라제-변형 PMP 및 GF-PMP 250 μL를 24-웰 플레이트에서 250 μL의 BMS 세포 현탁액에 2벌로 첨가하였다. 250 μl의 멸균 초순수 및 유리 PKH26 염료 표지 대조군을 세포에 첨가하였으며, 음성 대조군으로서 사용하였다. 세포를 24°C에서 암 중에 30분 동안 인큐베이션시키고, 1 mL의 멸균 초순수로 3회 세척하여, 세포에 의해 흡수되지 않은 입자를 제거하였다. 세포를 표면형광 현미경(올림푸스 IX83) 상에서의 영상화를 위하여 500 μL의 멸균 초순수 중에 재현탁화시켰다. 멸균 초순수와 인큐베이션시킨 세포 및 PKH26 표지 대조군은 검출 가능한 형광 수준을 갖지 않았다. PKH26으로 표지된 GF-PMP와 인큐베이션시킨 세포로부터의 형광 신호는 셀룰라제 변형-PMP로 처리된 식물 세포로부터의 형광 신호에 비하여 매우 낮았다/검출 가능하지 않았다(도 10). NH2-DBCO(변형 프로토콜 b.2) 또는 NHS-PEG4-DBCO(변형 프로토콜 b.3) 링커를 통해 셀룰라제-아지드로 변형된 PMP는 이들 셀룰라제-변형 PMP가 식물 세포에서 가장 높은 흡수를 가졌음을 나타낸다. 본 발명자들의 데이터는 셀룰라제를 이용한 PMP의 변형이 시험관 내에서 식물 세포에 의한 자몽 PMP 흡수를 개선시켰음을 보여준다.
기타 구현예
본 발명의 일부 구현예는 하기의 넘버링된 단락 내에 있다.
1. 미변형 PMP에 비해 증가된 세포 흡수를 갖는 복수의 변형 PMP를 포함하는 식물 메신저 팩(PMP) 조성물.
2. 단락 1에 있어서, 증가된 세포 흡수는 미처리 PMP에 비하여 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%의 증가된 세포 흡수인 PMP 조성물.
3. 단락 1에 있어서, 증가된 세포 흡수가 미변형 PMP에 비하여 적어도 2배, 4배, 5배, 10배, 100배 또는 1000배의 증가된 세포 흡수인 PMP 조성물.
4. 단락 1 내지 단락 3 중 어느 한 단락에 있어서, 세포가 식물 세포인 PMP 조성물.
5. 단락 1 내지 단락 3 중 어느 한 단락에 있어서, 세포가 박테리아 세포인 PMP 조성물.
6. 단락 1 내지 단락 3 중 어느 한 단락에 있어서, 세포가 진균 세포인 PMP 조성물.
7. 단락 1 내지 단락 6 중 어느 한 단락에 있어서, 변형 PMP가 세포 투과제를 포함하는 PMP 조성물.
8. 단락 1 내지 단락 7 중 어느 한 단락에 있어서, 변형 PMP가 식물 세포 투과제를 포함하는 PMP 조성물.
9. 단락 1 내지 단락 7 중 어느 한 단락에 있어서, 변형 PMP가 박테리아 세포 투과제를 포함하는 PMP 조성물.
10. 단락 1 내지 단락 7 중 어느 한 단락에 있어서, 변형 PMP가 진균 세포 투과제를 포함하는 PMP 조성물.
11. 단락 1 내지 단락 10 중 어느 한 단락에 있어서, 세포 투과제가 효소, 또는 그의 기능성 도메인을 포함하는 PMP 조성물.
12. 단락 11에 있어서, 효소가 박테리아 효소, 진균 효소, 식물 효소, 또는 원생동물 효소인 PMP 조성물.
13. 단락 12에 있어서, 효소는 세포벽 분해 능력이 있는 박테리아 효소 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가지는 PMP 조성물.
14. 단락 12에 있어서, 효소는 세포벽 분해 능력이 있는 진균 효소 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가지는 PMP 조성물.
15. 단락 12에 있어서, 효소는 세포벽 분해 능력이 있는 식물 효소 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가지는 PMP 조성물.
16. 단락 12에 있어서, 효소는 세포벽 분해 능력이 있는 원생동물 효소 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가지는 PMP 조성물.
17. 단락 12에 있어서, 효소가 셀룰라제인 PMP 조성물.
18. 단락 17에 있어서, 셀룰라제는 박테리아 셀룰라제의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가지는 PMP 조성물.
19. 단락 17에 있어서, 셀룰라제는 진균 셀룰라제의 서열의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가지는 PMP 조성물.
20. 단락 17에 있어서, 셀룰라제는 원생동물 셀룰라제의 전부 또는 일부에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 가지는 PMP 조성물.
21. 단락 8에 있어서, 세포 투과제가 세제를 포함하는 PMP 조성물.
22. 단락 21에 있어서, 세제가 사포닌인 PMP 조성물.
23. 단락 8에 있어서, 세포 투과제가 양이온성 지질을 포함하는 PMP 조성물.
24. 단락 23에 있어서, 양이온성 지질이 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC)인 PMP 조성물.
25. 단락 23에 있어서, 양이온성 지질이 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(DOPC)인 PMP 조성물.
26. 단락 1 내지 단락 25 중 어느 한 단락에 있어서, 조성물이 실온에서 적어도 1일 동안 안정하고/안정하거나 4℃에서 적어도 1주 동안 안정한 PMP 조성물.
27. 단락 26에 있어서, PMP가 적어도 24시간, 48시간, 7일 또는 30일 동안 안정한 PMP 조성물.
28. 단락 27에 있어서, PMP가 적어도 4℃, 20℃, 24℃ 또는 37℃의 온도에서 안정한 PMP 조성물.
29. 단락 1 내지 단락 28 중 어느 한 단락에 있어서, 조성물 중 PMP가 진균의 건강을 감소시키기에 유효한 농도로 존재하는 PMP 조성물.
30. 단락 1 내지 단락 28 중 어느 한 단락에 있어서, 조성물 중 PMP가 박테리아의 건강을 감소시키기에 유효한 농도로 존재하는 PMP 조성물.
31. 단락 1 내지 단락 28 중 어느 한 단락에 있어서, 조성물 중 PMP가 식물의 건강을 증가시키기에 유효한 농도로 존재하는 PMP 조성물.
32. 단락 1 내지 단락 28 중 어느 한 단락에 있어서, 조성물 중 PMP가 식물의 건강을 감소시키기에 유효한 농도로 존재하는 PMP 조성물.
33. 단락 1 내지 단락 32 중 어느 한 단락에 있어서, 조성물 중 복수의 변형 PMP가 적어도 1, 10, 50, 100 또는 250 ㎍의 PMP 단백질/㎖의 농도로 존재하는 PMP 조성물.
34. 단락 1 내지 단락 33 중 어느 한 단락에 있어서, 변형 PMP가 이종 기능성 제제를 포함하는 PMP 조성물.
35. 단락 34에 있어서, 변형 PMP가 2종 이상의 상이한 이종 기능성 제제를 포함하는 PMP 조성물.
36. 단락 34 또는 단락 35에 있어서, 이종 기능성 제제가 복수의 PMP의 각각에 의해 캡슐화된 PMP 조성물.
37. 단락 34 또는 단락 35에 있어서, 이종 기능성 제제가 복수의 PMP의 각각의 표면 상에 매립된 PMP 조성물.
38. 단락 34 또는 단락 35에 있어서, 이종 기능성 제제가 복수의 PMP의 각각의 표면에 컨쥬게이트된 PMP 조성물.
39. 단락 34 내지 단락 38 중 어느 한 단락에 있어서, 이종 기능성 제제가 시비제인 PMP 조성물.
40. 단락 39에 있어서, 시비제가 식물 영앙제인 PMP 조성물.
41. 단락 34 내지 단락 38 중 어느 한 단락에 있어서, 이종 기능성 제제가 제초제인 PMP 조성물.
42. 단락 34 내지 단락 39 및 단락 41 중 어느 하나에 있어서, 이종 기능성 제제는 이종 폴리펩티드, 이종 핵산, 또는 이종 소분자인 PMP 조성물.
43. 단락 42에 있어서, 이종 핵산은 DNA, RNA, PNA, 또는 하이브리드 DNA-RNA 분자인 PMP 조성물.
44. 단락 43에 있어서, RNA가 메신저 RNA(mRNA), 가이드 RNA(gRNA), 또는 저해성 RNA인 PMP 조성물.
45. 단락 44에 있어서, 저해성 RNA가 RNAi, shRNA, 또는 miRNA인 PMP 조성물.
46. 단락 44 또는 단락 45에 있어서, 저해성 RNA는 식물에서 유전자 발현을 저해하는 PMP 조성물.
47. 단락 44 또는 단락 45에 있어서, 저해성 RNA는 식물 공생생물에서 유전자 발현을 저해하는 PMP 조성물.
48. 단락 42 또는 단락 43에 있어서, 핵산은, 식물에서, 효소, 포어-형성 단백질, 신호전달 리간드, 세포 투과성 펩티드, 전사 인자, 수용체, 항체, 나노바디, 유전자 편집 단백질, 리보단백질, 단백질 압타머 또는 샤페론의 발현을 증가시키는 mRNA, 변형된 mRNA 또는 DNA 분자인, PMP 조성물.
49. 단락 42 또는 단락 43에 있어서, 핵산은 안티센스 RNA, siRNA, shRNA, miRNA, aiRNA, PNA, 모르폴리노, LNA, piRNA, 리보자임, DNAzyme, 압타머, circRNA, gRNA 또는 DNA 분자이며, 이는 예를 들어, 식물에서, 효소, 전사 인자, 분비 단백질, 구조적 인자, 리보단백질, 단백질 압타머, 샤페론, 수용체, 신호전달 리간드 또는 수송체의 발현을 감소시키는 PMP 조성물.
50. 단락 42에 있어서, 폴리펩티드는, 효소, 포어-형성 단백질, 신호전달 리간드, 세포 투과성 펩티드, 전사 인자, 수용체, 항체, 나노바디, 유전자 편집 단백질, 리보단백질, 단백질 압타머 또는 샤페론인, PMP 조성물.
51. 단락 1 내지 단락 50 중 어느 한 단락에 있어서, 식물이 농업 또는 원예 식물인 PMP 조성물.
52. 단락 51에 있어서, 식물이 대두 식물, 밀 식물, 또는 옥수수 식물인 PMP 조성물.
53. 단락 1 내지 단락 50 중 어느 한 단락에 있어서, 식물이 잡초인 PMP 조성물.
54. 단락 1 내지 단락 53 중 어느 한 단락에 있어서, 조성물이 식물로의 운반을 위해 제형화되는 PMP 조성물.
55. 단락 1 내지 단락 54 중 어느 한 단락에 있어서,조성물이 농업적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 PMP 조성물.
56. 단락 1 내지 단락 55 중 어느 한 단락에 있어서, 조성물이 액체, 고체, 에어로졸, 페이스트, 겔 또는 기체 조성물로서 제형화된 PMP 조성물.
57. 증가된 식물 세포 흡수를 갖는 복수의 변형 PMP를 포함하는 PMP 조성물로서, PMP가 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 생산되는 PMP 조성물:
(a) 식물 또는 그의 부분으로부터 초기 시료를 제공하는 단계로서, 식물 또는 그의 부분이 EV를 포함하는 단계;
(b) 초기 시료로부터 미정제 PMP 분획을 단리하는 단계로서, 미정제 PMP 분획이 초기 시료 내의 수준에 비하여 감소된 수준의 식물 또는 그의 부분 유래의 적어도 하나의 오염물질 또는 원하지 않는 성분을 갖는 단계;
(c) 미정제 PMP 분획을 정제함으로써, 복수의 순수한 PMP를 생산하는 단계로서, 복수의 순수한 PMP가 미정제 EV 분획 내의 수준에 비하여 감소된 수준의 식물 또는 그의 부분 유래의 적어도 하나의 오염물질 또는 원하지 않는 성분을 갖는 단계;
(d) 순수한 PMP에 식물 세포 투과제를 로딩함으로써, 미변형 PMP에 비하여 증가된 식물 세포 흡수를 갖는 변형 PMP를 생성하는 단계; 및
(e) 식물로의 운반을 위하여 단계 (d)의 PMP를 제형화하는 단계.
58. 단락 1 내지 단락 57 중 어느 한 단락의 PMP 조성물을 포함하는 박테리아.
59. 단락 1 내지 단락 57 중 어느 한 단락의 PMP 조성물을 포함하는 진균.
60. 단락 1 내지 단락 57 중 어느 한 단락의 PMP 조성물을 포함하는 식물.
61. 식물을 단락 1 내지 단락 57 중 어느 한 단락의 PMP 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 식물로의 PMP 조성물의 운반 방법.
62. 식물의 건강의 증가 방법으로서, 방법이 단락 1 내지 단락 57 중 어느 한 단락의 유효량의 조성물을 식물에 운반하는 단계를 포함하며, 방법이 미처리 식물에 비하여 식물의 건강을 증가시키는 방법.
63. 단락 61 또는 단락 62에 있어서, PMP가 이종 시비제인 방법.
64. 단락 61 내지 단락 63 중 어느 한 단락에 있어서,식물이 농업 또는 원예 식물인 방법.
65. 단락 64에 있어서, 식물이 대두 식물, 밀 식물, 또는 옥수수 식물인 방법.
66. 식물의 건강의 감소 방법으로서, 방법이 단락 1 내지 단락 57 중 어느 한 단락의 유효량의 조성물을 식물에 운반하는 단계를 포함하며, 방법이 미처리 식물에 비하여 식물의 건강을 감소시키는 방법.
67. 단락 61 또는 단락 66에 있어서, PMP가 이종 농약 제제인 방법.
68. 단락 61, 단락 66 및 단락 67 중 어느 한 단락에 있어서, 식물이 잡초인 방법.
69. 단락 61 내지 단락 68 중 어느 한 단락에 있어서, PMP 조성물이 식물의 잎, 종자, 뿌리, 과실, 슈트(shoot), 화분, 또는 꽃으로 운반되는 방법.
70. 단락 61 내지 단락 69 중 어느 한 단락에 있어서, PMP 조성물이 액체, 고체, 에어로졸, 페이스트, 겔 또는 기체로서 운반되는 방법.
71. 단락 1 내지 단락 3 중 어느 한 단락에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 PMP 조성물.
72. 단락 1 내지 단락 3 중 어느 한 단락에 있어서, 세포가 인간 세포인 PMP 조성물.
73. 포유류의 건강의 증가 방법으로서, 방법이 단락 1 내지 단락 57 중 어느 한 단락의 유효량의 조성물을 포유류에 운반하는 단계를 포함하며, 방법이 미처리 포유류에 비하여 포유류의 건강을 증가시키는 방법.
74. 단락 73에 있어서, PMP가 이종 치료제를 포함하는 방법.
75. 단락 73 또는 단락 74에 있어서, 포유류가 인간인 방법.
76. 증가된 동물 세포 흡수를 갖는 복수의 변형 PMP를 포함하는 PMP 조성물로서, PMP가 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 생산되는 PMP 조성물:
(a) 식물 또는 그의 부분으로부터 초기 시료를 제공하는 단계로서, 식물 또는 그의 부분이 EV를 포함하는 단계;
(b) 초기 시료로부터 미정제 PMP 분획을 단리하는 단계로서, 미정제 PMP 분획이 초기 시료 내의 수준에 비하여 감소된 수준의 식물 또는 그의 부분 유래의 적어도 하나의 오염물질 또는 원하지 않는 성분을 갖는 단계;
(c) 미정제 PMP 분획을 정제함으로써, 복수의 순수한 PMP를 생산하는 단계로서, 복수의 순수한 PMP가 미정제 EV 분획 내의 수준에 비하여 감소된 수준의 식물 또는 그의 부분 유래의 적어도 하나의 오염물질 또는 원하지 않는 성분을 갖는 단계;
(d) 순수한 PMP에 세포 투과제를 로딩함으로써, 미변형 PMP에 비하여 증가된 동물 세포 흡수를 갖는 변형 PMP를 생성하는 단계; 및
(e) 동물로의 운반을 위하여 단계 (d)의 PMP를 제형화하는 단계.
77. 표적 세포로의 식물 메신저 팩(PMP)의 운반 방법으로서, 상기 방법이 외인성 이온화 가능한 지질을 포함하는 PMP를 표적 세포에 도입하는 단계로서, 외인성 이온화 가능한 지질을 포함하는 PMP가 미변형 PMP에 비하여 표적 세포에 의한 증가된 흡수를 갖는 단계를 포함하는 방법.
78. 단락 77에 있어서, 변형 PMP는 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 90% 초과의 이온화 가능한 지질을 포함하는 방법.
79. 단락 77에 있어서, 변형 PMP는 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 90% 초과의 식물 세포외 소포(EV)로부터 유래된 지질을 포함하는 방법.
80. 단락 77에 있어서, 외인성 이온화 가능한 지질이 1,1‘-((2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸) (2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아자네디일)비스(도데칸-2-올) (C12-200)인 방법.
81. 표적 세포로의 식물 메신저 팩(PMP)의 운반 방법으로서, 상기 방법이 외인성 쯔비터이온성 지질을 포함하는 PMP를 표적 세포에 도입하는 단계로서, 외인성 쯔비터이온성 지질을 포함하는 PMP가 미변형 PMP에 비하여 표적 세포에 의한 증가된 흡수를 갖는 단계를 포함하는 방법.
82. 단락 81에 있어서, 변형 PMP는 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 90% 초과의 쯔비터이온성 지질을 포함하는 방법.
83. 단락 81에 있어서, 변형 PMP는 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 90% 초과의 식물 세포외 소포(EV)로부터 유래된 지질을 포함하는 방법.
84. 단락 81에 있어서, 외인성 쯔비터이온성 지질이 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC) 또는 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(DOPC)인 방법.
85. 외인성 양이온성 지질을 포함하는 복수의 변형 PMP를 포함하는 PMP 조성물.
86. 단락 85에 있어서, 변형 PMP의 각각은 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 90% 초과의 양이온성 지질을 포함하는 PMP 조성물.
87. 외인성 이온화 가능한 지질을 포함하는 복수의 변형 PMP를 포함하는 PMP 조성물.
88. 단락 87에 있어서, 변형 PMP의 각각은 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 90% 초과의 이온화 가능한 지질을 포함하는 PMP 조성물.
89. 단락 87에 있어서, 이온화 가능한 지질이 C12-200인 PMP 조성물.
90. 외인성 쯔비터이온성 지질을 포함하는 복수의 변형 PMP를 포함하는 PMP 조성물.
91. 단락 90에 있어서, 변형 PMP의 각각은 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 90% 초과의 쯔비터이온성 지질을 포함하는 PMP 조성물.
92. 단락 90에 있어서, 쯔비터이온성 지질이 DEPC 또는 DOPC인 PMP 조성물.
93. 증가된 식물 세포 흡수를 갖는 복수의 변형 PMP를 포함하는 PMP 조성물로서, PMP가 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 생산되는 PMP 조성물:
(a) 복수의 정제된 PMP를 제공하는 단계;
(b) 복수의 PMP를 처리하여, 지질막을 생성하는 단계; 및
(c) 외인성 양이온성 지질의 존재 하에 지질 막을 재구성함으로써 증가된 세포 흡수를 갖는 변형 PMP를 생성하는 단계로서, 상기 재구성된 PMP가 적어도 1%의 외인성 양이온성 지질을 포함하는 단계.
94. 증가된 식물 세포 흡수를 갖는 복수의 변형 PMP를 포함하는 PMP 조성물로서, PMP가 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 생산되는 PMP 조성물:
(a) 복수의 정제된 PMP를 제공하는 단계;
(b) 복수의 PMP를 처리하여, 지질막을 생성하는 단계; 및
(c) 외인성 이온화 가능한 지질의 존재 하에 지질 막을 재구성함으로써 증가된 세포 흡수를 갖는 변형 PMP를 생성하는 단계로서, 상기 재구성된 PMP가 적어도 1%의 외인성 이온화 가능한 지질을 포함하는 단계.
95. 증가된 식물 세포 흡수를 갖는 복수의 변형 PMP를 포함하는 PMP 조성물로서, PMP가 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 생산되는 PMP 조성물:
(a) 복수의 정제된 PMP를 제공하는 단계;
(b) 복수의 PMP를 처리하여, 지질막을 생성하는 단계; 및
(c) 외인성 쯔비터이온성 지질의 존재 하에 지질 막을 재구성함으로써 증가된 세포 흡수를 갖는 변형 PMP를 생성하는 단계로서, 상기 재구성된 PMP가 적어도 1%의 외인성 쯔비터이온성 지질을 포함하는 단계.
본 발명이 이해의 명확성의 목적을 위하여 예시 및 예를 통해 다소 상세하게 기재되어 있지만, 설명 및 실시예가 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 본원에 열거된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그들 전문이 참조로 명시적으로 포함된다.
기타 구현예는 청구범위 내에 있다.
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Claims (14)

  1. 표적 세포로의 식물 메신저 팩(PMP)의 운반 방법으로서, 상기 방법이 외인성 양이온성 지질을 포함하는 PMP를 표적 세포에 도입하는 단계로서, 외인성 양이온성 지질을 포함하는 PMP가 미변형 PMP에 비하여 표적 세포에 의한 증가된 흡수를 갖는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 변형 PMP는 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 90% 초과의 양이온성 지질을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 변형 PMP는 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 90% 초과의 식물 세포외 소포(EV)로부터 유래된 지질을 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 증가된 세포 흡수는 미처리 PMP에 비하여 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%의 증가된 세포 흡수인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 변형 PMP가 이종 기능성 제제를 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 이종 기능성 제제가 복수의 PMP의 각각에 의해 캡슐화된 방법.
  7. 제5항에 있어서, 이종 기능성 제제가 복수의 PMP의 각각의 표면 상에 매립된 방법.
  8. 제5항에 있어서, 이종 기능성 제제가 복수의 PMP의 각각의 표면에 컨쥬게이트된 방법.
  9. 제1항에 있어서, 세포가 식물 세포인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 세포가 박테리아 세포인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 세포가 진균 세포인 방법.
  12. 미변형 PMP에 비해 증가된 세포 흡수를 갖는 복수의 변형 PMP를 포함하는 식물 메신저 팩(PMP) 조성물.
  13. 증가된 식물 세포 흡수를 갖는 복수의 변형 PMP를 포함하는 PMP 조성물로서, PMP가 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 생산되는 PMP 조성물:
    (a) 식물 또는 그의 부분으로부터 초기 시료를 제공하는 단계로서, 식물 또는 그의 부분이 EV를 포함하는 단계;
    (b) 초기 시료로부터 미정제 PMP 분획을 단리하는 단계로서, 미정제 PMP 분획이 초기 시료 내의 수준에 비하여 감소된 수준의 식물 또는 그의 부분 유래의 적어도 하나의 오염물질 또는 원하지 않는 성분을 갖는 단계;
    (c) 미정제 PMP 분획을 정제함으로써, 복수의 순수한 PMP를 생산하는 단계로서, 복수의 순수한 PMP가 미정제 EV 분획 내의 수준에 비하여 감소된 수준의 식물 또는 그의 부분 유래의 적어도 하나의 오염물질 또는 원하지 않는 성분을 갖는 단계;
    (d) 순수한 PMP에 식물 세포 투과제를 로딩함으로써, 미변형 PMP에 비하여 증가된 식물 세포 흡수를 갖는 변형 PMP를 생성하는 단계; 및
    (e) 식물로의 운반을 위하여 단계 (d)의 PMP를 제형화하는 단계.
  14. 증가된 동물 세포 흡수를 갖는 복수의 변형 PMP를 포함하는 PMP 조성물로서, PMP가 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 생산되는 PMP 조성물:
    (a) 식물 또는 그의 부분으로부터 초기 시료를 제공하는 단계로서, 식물 또는 그의 부분이 EV를 포함하는 단계;
    (b) 초기 시료로부터 미정제 PMP 분획을 단리하는 단계로서, 미정제 PMP 분획이 초기 시료 내의 수준에 비하여 감소된 수준의 식물 또는 그의 부분 유래의 적어도 하나의 오염물질 또는 원하지 않는 성분을 갖는 단계;
    (c) 미정제 PMP 분획을 정제함으로써, 복수의 순수한 PMP를 생산하는 단계로서, 복수의 순수한 PMP가 미정제 EV 분획 내의 수준에 비하여 감소된 수준의 식물 또는 그의 부분 유래의 적어도 하나의 오염물질 또는 원하지 않는 성분을 갖는 단계;
    (d) 순수한 PMP에 세포 투과제를 로딩함으로써, 미변형 PMP에 비하여 증가된 동물 세포 흡수를 갖는 변형 PMP를 생성하는 단계; 및
    (e) 동물로의 운반을 위하여 단계 (d)의 PMP를 제형화하는 단계.

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