BR112021003311A2 - pacotes de mensageiros de plantas modificados e seus usos - Google Patents

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BR112021003311A2
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Maria Helena Christine Van Rooijen
Hok Hei TAM
Maier Steve Avendano Amado
Barry Andrew Martin
Ignacio Martinez
Piotr Stanislaw KOWALSKI
Nataliya Vladimirovna Nukolova
John Patrick Jr. Casey
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Abstract

pacotes de mensageiros de plantas modificados e seus usos. a presente invenção refere-se a composições incluindo uma pluralidade de pacotes de mensageiros de plantas (por exemplo, incluindo uma vesícula extracelular (ev) de planta ou seu segmento, porção ou extro), que são modificados para terem captação celular intensificada (por exemplo, captação celular vegetal animal, captação celular bacteriana ou captação celular fúngica), por exemplo, para uso em uma variedade de métodos agrícolas ou terapêuticos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “PACOTES DE MENSAGEIROS DE PLANTAS MODIFICADOS E SEUS USOS”.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e é deste modo incorporada por referência em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 23 de agosto, 2019, é denominada 51296- 005WO2_Sequence_Listing_08.23.19_ST25 e tem 10.171 bytes em tamanho.
ANTECEDENTES A entrega de agentes agrícolas ou terapêuticos pode ser limitada pelo grau ao qual o agente consegue penetrar as barreiras celulares e deste modo atuar efetivamente em um organismo. Por exemplo, a barreira formada pela parede celular vegetal, parede celular bacteriana ou parede celular fúngica ou pela membrana celular e/ou matriz extracelular de uma célula animal coloca um desafio à captação celular de agentes úteis na agricultura ou aplicações terapêuticas. Portanto existe uma necessidade na técnica de métodos e composições promovendo a captação celular de agentes.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a pacotes de mensageiros de plantas (PMPs) modificados que têm captação celular (por exemplo, célula vegetal, célula fúngica ou célula bacteriana) intensificada. Os PMPs modificados aqui são úteis em uma variedade de composições ou métodos agrícolas ou terapêuticos. Em um primeiro aspecto é proporcionado aqui um método para entregar um pacote de mensageiro de planta (PMP) a uma célula alvo, compreendendo o método introduzir um PMP compreendendo um lipídeo catiônico exógeno na célula alvo, em que o PMP compreendendo o lipídeo catiônico exógeno tem captação aumentada pela célula alvo em relação a um PMP não modificado.
Em algumas modalidades, o PMP modificado compreende pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais do que 90% de lipídeo catiônico.
Em algumas modalidades, o PMP modificado compreende pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais do que 90% de lipídeos derivados de uma vesícula extracelular (EV) de planta.
Em algumas modalidades, a captação celular aumentada é uma captação celular aumentada de pelo menos 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100% em relação a um PMP não modificado.
Em algumas modalidades, os PMPs modificados compreendem um agente funcional heterólogo.
Em algumas modalidades, o agente funcional heterólogo é encapsulado por cada um da pluralidade de PMPs, embebido na superfície de cada um da pluralidade de PMPs ou conjugado à superfície de cada um da pluralidade de PMPs.
Em algumas modalidades, a célula é uma célula de mamífero (por exemplo, uma célula humana), uma célula vegetal, uma célula bacteriana ou uma célula fúngica.
Em outro aspecto é proporcionada aqui uma composição de PMP compreendendo uma pluralidade de PMPs modificados tendo captação celular aumentada em relação a um PMP não modificado.
Em alguns casos, a célula é uma célula vegetal.
Em alguns casos, a célula é uma célula fúngica.
Em alguns casos, a célula é uma célula bacteriana.
Em algumas modalidades, a captação celular aumentada é uma captação celular aumentada de pelo menos 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100% em relação a um PMP não modificado.
Em algumas modalidades, a captação celular aumentada é uma captação celular aumentada de pelo menos 2x vezes, 4x vezes, 5x vezes, 10x vezes, 100x vezes ou 1000x vezes em relação a um PMP não modificado.
Em algumas modalidades, os PMPs modificados incluem um agente de penetração de células.
Em algumas modalidades, o agente de penetração de células é uma enzima ou um domínio funcional (por exemplo, um domínio degradante da parede celular vegetal, um domínio degradante da parede celular bacteriana ou um domínio degradante da parede celular fúngica) do mesmo.
Em algumas modalidades, a enzima é uma enzima bacteriana capaz de degradar paredes das células vegetais.
Em algumas modalidades, a enzima tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima bacteriana capaz de degradar paredes das células vegetais.
Em algumas modalidades, a enzima é uma enzima fúngica capaz de degradar paredes das células vegetais.
Em algumas modalidades, a enzima tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima fúngica capaz de degradar paredes das células vegetais.
Em algumas modalidades, a enzima é uma enzima vegetal capaz de degradar paredes das células vegetais.
Em algumas modalidades, a enzima degradante das paredes celulares tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima vegetal capaz de degradar paredes das células vegetais.
Em algumas modalidades, a enzima é uma enzima protozoária capaz de degradar paredes das células vegetais.
Em algumas modalidades, a enzima degradante das paredes celulares tem pelo menos 30%, 40%,
50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima protozoária capaz de degradar paredes das células vegetais.
Em algumas modalidades, a enzima é uma enzima bacteriana capaz de degradar paredes das células bacterianas.
Em algumas modalidades, a enzima tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima bacteriana capaz de degradar paredes das células bacterianas.
Em algumas modalidades, a enzima é uma enzima fúngica capaz de degradar paredes das células bacterianas.
Em algumas modalidades, a enzima tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima fúngica capaz de degradar paredes das células bacterianas.
Em algumas modalidades, a enzima é uma enzima vegetal capaz de degradar paredes das células bacterianas.
Em algumas modalidades, a enzima degradante das paredes celulares tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima vegetal capaz de degradar paredes das células bacterianas.
Em algumas modalidades, a enzima é uma enzima protozoária capaz de degradar paredes das células bacterianas.
Em algumas modalidades, a enzima degradante das paredes celulares tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima protozoária capaz de degradar paredes das células bacterianas.
Em algumas modalidades, a enzima é uma enzima bacteriana capaz de degradar paredes das células fúngicas.
Em algumas modalidades, a enzima tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima bacteriana capaz de degradar paredes das células fúngicas.
Em algumas modalidades, a enzima é uma enzima fúngica capaz de degradar paredes das células fúngicas.
Em algumas modalidades, a enzima tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima fúngica capaz de degradar paredes das células fúngicas.
Em algumas modalidades, a enzima é uma enzima vegetal capaz de degradar paredes das células fúngicas.
Em algumas modalidades, a enzima degradante das paredes celulares tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima vegetal capaz de degradar paredes das células fúngicas.
Em algumas modalidades, a enzima é uma enzima protozoária capaz de degradar paredes das células fúngicas.
Em algumas modalidades, a enzima degradante das paredes celulares tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima protozoária capaz de degradar paredes das células fúngicas.
Em algumas modalidades, a enzima é uma celulase.
Em algumas modalidades, a celulase tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma celulase bacteriana.
Em algumas modalidades, a celulase tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma celulase fúngica.
Em algumas modalidades, a celulase tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção de uma celulase protozoária.
Em algumas modalidades, o agente de penetração de células é um detergente.
Em algumas modalidades, o detergente é saponina.
Em algumas modalidades, o agente de penetração de células inclui um lipídeo catiônico.
Em algumas modalidades, o lipídeo catiônico é 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DOPC). Em algumas modalidades, o lipídeo catiônico é 1,2-dierucoil-sn-glicero-3- fosfocolina (DEPC). Em algumas modalidades, a composição é estável durante pelo menos 24 horas (por exemplo, pelo menos 24 horas, 30 horas ou 40 horas), pelo menos 48 horas (por exemplo, pelo menos 48 horas (= 2 dias), 3 dias, 4 dias, 5 dias ou 6 dias), pelo menos sete dias (por exemplo, pelo menos sete dias (= 1 semana), pelo menos 2 semanas, pelo menos 3 semanas ou pelo menos 4 semanas) ou pelo menos 30 dias (por exemplo, pelo menos 30 dias, pelo menos 60 dias ou pelo menos 90 dias). Em algumas modalidades, a composição é estável a uma temperatura de pelo menos 24 °C (por exemplo, pelo menos 24 °C, 25 °C, 26 °C, 27 °C, 28 °C, 29 °C, 30 °C, 37 °C, 42 °C ou mais do que 42 °C), pelo menos 20 °C (por exemplo, pelo menos 20 °C, 21 °C, 22°C ou 23 °C), pelo menos 4 °C (por exemplo, pelo menos 5 °C, 10 °C ou 15 °C), pelo menos -20 °C (por exemplo, pelo menos -20 °C, -15 °C, - 10 °C, -5 °C ou 0 °C) ou pelo menos -80 °C (por exemplo, pelo menos - 80 °C, -70 °C, -60 °C, -50 °C, -40 °C ou -30 °C). Em algumas modalidades, os PMPs são estáveis em nitrogênio líquido (cerca de - 195,8 °C). Em algumas modalidades, a composição é estável durante pelo menos um dia à temperatura ambiente e/ou estável durante pelo menos uma semana a 4 ºC.
Em algumas modalidades, a composição é estável sob radiação de UV.
Em algumas modalidades, a composição é estável durante um período definido aqui sob a temperatura no habitat natural de uma planta.
Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas aqui, os PMPs podem incluir uma pluralidade de proteínas (isto é, proteínas de PMP), e a concentração de PMPs pode ser medida como a concentração de proteínas de PMP aí.
Em algumas modalidades, a pluralidade de PMPs na composição está a uma concentração de pelo menos 0,025 µg de proteína de PMP/mL (por exemplo, pelo menos 0,025, 0,05, 0,1 ou 0,5 µg de proteína de PMP/mL), pelo menos 1 µg de proteína de PMP/mL (por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 µg de proteína de PMP/mL), pelo menos 10 µg de proteína de PMP/mL (por exemplo, pelo menos 10, 15, 20 , 25, 30, 35, 40 ou 45 µg de proteína de PMP/mL), pelo menos 50 µg de proteína de PMP/mL (por exemplo, pelo menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, ou 95 µg de proteína de PMP/mL), pelo menos 100 µg de proteína de PMP/mL (por exemplo, pelo menos 100, 125, 150, 175, 200 ou 225 µg de proteína de PMP/mL), pelo menos 250 µg de proteína de PMP/mL (por exemplo, pelo menos 250, 300, 350, 400, 450 ou 500 µg de proteína de PMP/mL) ou pelo menos 500 µg de proteína de PMP/mL (por exemplo, pelo menos 500, 600, 700, 800 ou 900 µg de proteína de PMP/mL). Em algumas modalidades, a pluralidade de PMPs na composição está a uma concentração de pelo menos 1 mg de proteína de PMP/mL (por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 proteína de PMP/mL) ou pelo menos 10 mg de proteína de PMP/mL (por exemplo, pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 mg de proteína de PMP/mL). Em algumas modalidades das composições aqui, os PMPs incluem uma vesícula extracelular (EV) da planta purificada ou um seu segmento ou extrato.
Em algumas modalidades, a EV da planta é uma vesícula extracelular (EV) da planta modificada.
Em certas modalidades, a EV da planta é um exossomo da planta ou uma microvesícula da planta.
Em algumas modalidades, os PMPs incluem um marcador de EV da planta, tal como aqueles delineados no Apêndice.
Em algumas modalidades das composições aqui, a pluralidade de PMPs pode ser pura.
Por exemplo, a composição pode estar substancialmente isenta (por exemplo, tem menos do que 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%) de organelas tais como cloroplastos de plantas, mitocôndrias ou núcleos da planta.
Em algumas modalidades, os PMPs modificados incluem um agente funcional heterólogo.
Em algumas modalidades, os PMPs modificados incluem dois ou mais agentes funcionais heterólogos diferentes.
Em algumas modalidades, o agente funcional heterólogo é encapsulado por cada um da pluralidade de PMPs.
Em algumas modalidades, o agente funcional heterólogo é embebido na superfície de cada um da pluralidade de PMPs.
Em algumas modalidades, o agente funcional heterólogo é conjugado à superfície de cada um da pluralidade de PMPs.
Em algumas modalidades, o agente funcional heterólogo é um agente agrícola heterólogo.
Em algumas modalidades, o agente agrícola heterólogo é um agente pesticida.
Em algumas modalidades, o agente funcional heterólogo é um agente fertilizante.
Em algumas modalidades, o agente funcional heterólogo é um agente pesticida.
Em algumas modalidades, o agente pesticida é um agente antifúngico, um agente antibacteriano, um agente inseticida, um agente moluscicida, um agente nematicida ou um agente herbicida.
Em algumas modalidades, o agente funcional heterólogo é um agente repelente.
Em algumas modalidades, o agente funcional heterólogo é um agente modificador das plantas.
Em algumas modalidades, o agente funcional heterólogo é um agente terapêutico heterólogo.
Em algumas modalidades, o agente terapêutico heterólogo inclui um agente antifúngico, um agente antibacteriano, um agente virucida, um agente antiviral, um agente inseticida, um agente nematicida, um agente antiparasitário ou um repelente de insetos.
Em algumas modalidades, o agente funcional heterólogo é um polipeptídeo heterólogo, um ácido nucleico heterólogo ou uma molécula pequena heteróloga.
Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo é um DNA, um RNA, um PNA ou uma molécula híbrida de DNA-RNA.
Em algumas modalidades, o RNA é um RNA mensageiro (mRNA), um RNA guia (gRNA) ou um RNA inibidor.
Em algumas modalidades, o RNA inibidor é RNAi, shRNA, ou miRNA.
Em algumas modalidades, o RNA inibidor inibe a expressão gênica em uma planta.
Em algumas modalidades, o RNA inibidor inibe a expressão gênica em um simbionte vegetal.
Em algumas modalidades, o ácido nucleico é um mRNA, um mRNA modificado ou uma molécula de DNA que, na planta, aumenta a expressão de uma enzima, uma proteína formadora de poros, um ligando de sinalização, um peptídeo de penetração de células, um fator de transcrição, um receptor, um anticorpo, um nanocorpo, uma proteína de edição gênica, uma riboproteína, um aptâmero de proteína ou uma chaperona.
Em algumas modalidades, o ácido nucleico é um antissenso RNA, um siRNA, um shRNA, um miRNA, um aiRNA, um PNA, um morfolino, um LNA, um piRNA, uma ribozima, uma DNAzima, um aptâmero, um circRNA, um gRNA ou uma molécula de DNA que, na planta, diminui a expressão de uma enzima, um fator de transcrição, uma proteína secretora, um fator estrutural, uma riboproteína, um aptâmero de proteína, uma chaperona, um receptor, um ligando de sinalização ou um transportador.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo é uma enzima, proteína formadora de poros, ligando de sinalização, peptídeo de penetração de células, fator de transcrição, receptor, anticorpo, nanocorpo, proteína de edição gênica, riboproteína, um aptâmero de proteína ou chaperona.
Em algumas modalidades, a composição é formulada para entrega a uma planta.
Em algumas modalidades, a composição inclui um transportador agricolamente aceitável.
Em algumas modalidades, a composição é formulada para entrega a um animal (por exemplo, um humano). Em algumas modalidades, a composição inclui um transportador farmaceuticamente aceitável.
Em algumas modalidades, a composição é formulada como um líquido, um sólido, um aerossol, uma pasta, um gel ou uma composição gasosa.
Em algumas modalidades, a planta é uma planta agrícola ou hortícola.
Em algumas modalidades, a planta agrícola é uma planta de soja, uma planta de trigo ou uma planta de milho.
Em algumas modalidades, os PMPs na composição estão a uma concentração eficaz para aumentar a aptidão da planta (por exemplo, uma planta agrícola ou hortícola). Em algumas modalidades, a planta agrícola é uma erva daninha.
Em algumas modalidades, os PMPs na composição estão a uma concentração eficaz para diminuir a aptidão de uma planta (por exemplo, uma erva daninha). Em outro aspecto é proporcionada aqui uma composição de PMP compreendendo uma pluralidade de PMPs modificados tendo captação celular animal aumentada, em que os PMPs são produzidos por um processo que compreende as etapas de: (a) proporcionar uma amostra inicial de uma planta, ou uma parte da mesma, em que a planta ou parte da mesma compreende EVs; (b) isolar uma fração de PMP em bruto da amostra inicial, em que a fração de PMP em bruto tem um nível diminuído de pelo menos um contaminante ou componente indesejado da planta ou parte da mesma em relação ao nível na amostra inicial; (c) purificar a fração de PMP em bruto, produzindo deste modo uma pluralidade de PMPs puros, em que a pluralidade de PMPs puros tem um nível diminuído de pelo menos um contaminante ou componente indesejado da planta ou parte da mesma em relação ao nível na fração de EV em bruto; (d) carregar os PMPs puros com um agente de penetração de células, gerando deste modo PMPs modificados tendo captação celular animal aumentada em relação a um PMP não modificado; e (e) formular os PMPs da etapa (d) para entrega a um animal.
Em outro aspecto é proporcionada aqui uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs modificados tendo captação celular vegetal aumentada, em que os PMPs são produzidos por um processo que inclui as etapas de: (a) proporcionar uma planta ou uma parte da mesma; (b) liberar uma pluralidade de vesículas extracelulares (EVs) da planta, ou parte da mesma, e coletar as EVs em uma amostra inicial; (c) separar a pluralidade de EVs em uma fração de EV em bruto, em que a fração de EV em bruto tem um nível diminuído de células vegetais ou detritos celulares em relação ao nível na amostra inicial; (d) purificar a fração de EV em bruto, produzindo deste modo uma pluralidade de PMPs puros, em que a pluralidade de PMPs puros tem um nível diminuído de organelas vegetais, componentes da parede celular ou agregados moleculares vegetais (por exemplo, agregados de proteína, agregados de proteína-ácido nucleico, agregados de lipoproteína ou estruturas lipido-proteicas) em relação ao nível na fração de EV em bruto; e (e) carregar os PMPs com um agente funcional heterólogo que aumenta a captação celular vegetal, gerando deste modo PMPs modificados tendo captação celular vegetal aumentada em relação a um PMP não modificado.
Em outro aspecto é proporcionada aqui uma composição de
PMP incluindo uma pluralidade de PMPs modificados tendo captação celular bacteriana aumentada, em que os PMPs são produzidos por um processo que inclui as etapas de: (a) proporcionar uma planta ou uma parte da mesma; (b) liberar uma pluralidade de vesículas extracelulares (EVs) da planta, ou parte da mesma, e coletar as EVs em uma amostra inicial; (c) separar a pluralidade de EVs em uma fração de EV em bruto, em que a fração de EV em bruto tem um nível diminuído de células vegetais ou detritos celulares em relação ao nível na amostra inicial; (d) purificar a fração de EV em bruto, produzindo deste modo uma pluralidade de PMPs puros, em que a pluralidade de PMPs puros tem um nível diminuído de organelas vegetais, componentes da parede celular ou agregados moleculares vegetais (por exemplo, agregados de proteína, agregados de proteína-ácido nucleico, agregados de lipoproteína ou estruturas lipido-proteicas) em relação ao nível na fração de EV em bruto; e (e) carregar os PMPs com um agente funcional heterólogo que aumenta a captação celular bacteriana, gerando deste modo PMPs modificados tendo captação celular bacteriana aumentada em relação a um PMP não modificado.
Em outro aspecto é proporcionada aqui uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs modificados tendo captação celular fúngica aumentada, em que os PMPs são produzidos por um processo que inclui as etapas de: (a) proporcionar uma amostra inicial de uma planta, ou uma parte da mesma, em que a planta ou parte da mesma compreende EVs; (b) isolar uma fração de PMP em bruto da amostra inicial, em que a fração de PMP em bruto tem um nível diminuído de pelo menos um contaminante ou componente indesejado da planta ou parte da mesma em relação ao nível na amostra inicial; (c) purificar a fração de PMP em bruto, produzindo deste modo uma pluralidade de PMPs puros, em que a pluralidade de PMPs puros tem um nível diminuído de pelo menos um contaminante ou componente indesejado da planta ou parte da mesma em relação ao nível na fração de EV em bruto; (d) carregar os PMPs puros com um agente de penetração de células vegetais, gerando deste modo PMPs modificados tendo captação celular vegetal aumentada em relação a um PMP não modificado; e (e) formular os PMPs da etapa (d) para entrega a uma planta.
Em outro aspecto é proporcionada aqui uma planta incluindo qualquer composição de PMP aqui.
Em outro aspecto é proporcionada aqui uma bactéria incluindo qualquer composição de PMP aqui.
Em outro aspecto é proporcionado aqui um fungo incluindo qualquer composição de PMP aqui.
Em outro aspecto é proporcionado um método de entregar uma composição de PMP a uma planta incluindo contatar a planta com qualquer uma das composições de PMP aqui.
Em outro aspecto é proporcionado aqui um método de aumentar a aptidão de um mamífero, compreendendo o método entregar ao mamífero uma quantidade eficaz da composição de qualquer uma das composições de PMP aqui, em que o método aumenta a aptidão do mamífero em relação a um mamífero não tratado.
Em algumas modalidades, o PMP compreende um agente terapêutico heterólogo.
Em algumas modalidades, o mamífero é um humano.
Ainda em outro aspecto é proporcionado aqui um método de aumentar a aptidão de uma planta, incluindo o método entregar à planta uma quantidade eficaz de qualquer uma das composições de PMP aqui, em que o método aumenta a aptidão da planta em relação a uma planta não tratada.
Em algumas modalidades, o PMP inclui um agente fertilizante heterólogo.
Em algumas modalidades, o PMP inclui um agente modificador das plantas.
Em algumas modalidades, o PMP inclui um agente pesticida heterólogo.
Em algumas modalidades, a planta é uma planta agrícola ou hortícola.
Em algumas modalidades, a planta é uma planta de soja, uma planta de trigo ou uma planta de milho.
Em outro aspecto é proporcionado aqui um método de diminuir a aptidão de uma planta, incluindo o método entregar à planta uma quantidade eficaz de qualquer composição de PMP descrita aqui, em que o método diminui a aptidão da planta em relação a uma planta não tratada.
Em algumas modalidades, os PMPs incluem um herbicida heterólogo.
Em algumas modalidades, a planta é uma erva daninha.
Em algumas modalidades dos métodos aqui, a composição de PMP é entregue a uma folha, semente, raiz, fruto, rebento ou flor da planta.
Em outro aspecto é proporcionado um método de entregar uma composição de PMP a uma bactéria incluindo contatar a bactéria com qualquer uma das composições de PMP aqui.
Ainda em outro aspecto é proporcionado aqui um método de diminuir a aptidão de uma bactéria, incluindo o método entregar à bactéria uma quantidade eficaz de qualquer uma das composições de PMP aqui, em que o método diminui a aptidão da bactéria em relação a uma bactéria não tratada.
Em algumas modalidades, o PMP inclui um agente antibacteriano heterólogo.
Em algumas modalidades, a bactéria é um patógeno vegetal.
Em algumas modalidades, a bactéria é um patógeno animal (por exemplo, humano). Em outro aspecto é proporcionado um método de entregar uma composição de PMP a um fungo incluindo contatar o fungo com qualquer uma das composições de PMP aqui.
Ainda em outro aspecto é proporcionado aqui um método de diminuir a aptidão de um fungo, incluindo o método entregar ao fungo uma quantidade eficaz de qualquer uma das composições de PMP aqui, em que o método diminui a aptidão do fungo em relação a um fungo não tratado.
Em algumas modalidades, o PMP inclui um agente antifúngico heterólogo.
Em algumas modalidades, o fungo é um patógeno vegetal.
Em algumas modalidades, o fungo é um patógeno animal (por exemplo, humano). Em algumas modalidades dos métodos aqui, a composição de PMP é entregue como um líquido, um sólido, um aerossol, uma pasta, um gel ou um gás.
Em outro aspecto é proporcionada aqui uma formulação de controle agrícola compreendendo qualquer composição de PMP descrita aqui e um transportador ou excipiente adequado para uso agrícola.
A formulação pode estar em um líquido, sólido (por exemplo, grânulo, pélete, pó, pó apto a fluir ou líquido molhável), aerossol, pasta, gel ou forma de gás.
A formulação pode ser configurada (e/ou combinada com instruções) para ser diluída (por exemplo, a composição é um sólido solúvel ou sólido dispersível em água), pulverizada em, pintada em, injetada ou aplicada a, uma planta, solo ou sementes.
Em outro aspecto são proporcionados aqui Kits compreendendo qualquer composição de PMP descrita aqui e instruções para uso como em composições agrícolas (por exemplo, composições de controle de ervas daninhas, composições fertilizantes ou composições modificadoras de plantas). Em outro aspecto é proporcionado aqui um método para entregar um pacote de mensageiro de planta (PMP) a uma célula alvo, compreendendo o método introduzir um PMP compreendendo um lipídeo ionizável exógeno na célula alvo, em que o PMP compreendendo o lipídeo ionizável exógeno tem captação aumentada pela célula alvo em relação a um PMP não modificado.
Em algumas modalidades, o PMP modificado compreende pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais do que 90% de lipídeo ionizável.
Em algumas modalidades, o PMP modificado compreende pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais do que 90% de lipídeos derivados de uma vesícula extracelular
(EV) de planta.
Em algumas modalidades, o lipídeo ionizável exógeno é 1,1‘-((2-(4-(2-((2-(bis(2-hidroxidodecil)amino)etil)(2- hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1-il)etil)azanedi-il)bis(dodecan-2-ol) (C12-200). Em outro aspecto é proporcionado aqui um método para entregar um pacote de mensageiro de planta (PMP) a uma célula alvo, compreendendo o método introduzir um PMP compreendendo um lipídeo zwitteriônico exógeno na célula alvo, em que o PMP compreendendo o lipídeo zwitteriônico exógeno tem captação aumentada pela célula alvo em relação a um PMP não modificado.
Em algumas modalidades, o PMP modificado compreende pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais do que 90% de lipídeo zwitteriônico.
Em algumas modalidades, o PMP modificado compreende pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais do que 90% de lipídeos derivados de uma vesícula extracelular (EV) de planta.
Em algumas modalidades, o lipídeo zwitteriônico exógeno é 1,2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DEPC) ou 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DOPC). Em outro aspecto é proporcionada aqui uma composição de PMP compreendendo uma pluralidade de PMPs modificados compreendendo um lipídeo catiônico exógeno.
Em algumas modalidades, cada um dos PMPs modificados compreende pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais do que 90% de lipídeo catiônico.
Em outro aspecto é proporcionada aqui uma composição de PMP compreendendo uma pluralidade de PMPs modificados compreendendo um lipídeo ionizável exógeno.
Em algumas modalidades, cada um dos PMPs modificados compreende pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais do que 90% de lipídeo ionizável.
Em algumas modalidades, o lipídeo ionizável é C12-200. Em outro aspecto é proporcionada aqui uma composição de PMP compreendendo uma pluralidade de PMPs modificados compreendendo um lipídeo zwitteriônico exógeno.
Em algumas modalidades, cada um dos PMPs modificados compreende pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais do que 90% de lipídeo zwitteriônico.
Em algumas modalidades, o lipídeo zwitteriônico é DEPC ou DOPC.
Em outro aspecto é proporcionada aqui uma composição de PMP compreendendo uma pluralidade de PMPs modificados tendo captação celular vegetal aumentada, em que os PMPs são produzidos por um processo que compreende as etapas de (a) proporcionar uma pluralidade de PMPs purificados; (b) processar a pluralidade de PMPs para produzir um filme de lipídeos; e (c) reconstituir o filme de lipídeos na presença de um lipídeo catiônico exógeno, em que os PMPs reconstituídos compreendem pelo menos 1% de lipídeo catiônico exógeno, produzindo deste modo PMPs modificados tendo captação celular aumentada.
Em outro aspecto é proporcionada aqui uma composição de PMP compreendendo uma pluralidade de PMPs modificados tendo captação celular vegetal aumentada, em que os PMPs são produzidos por um processo que compreende as etapas de (a) proporcionar uma pluralidade de PMPs purificados; (b) processar a pluralidade de PMPs para produzir um filme de lipídeos; e (c) reconstituir o filme de lipídeos na presença de um lipídeo ionizável exógeno, em que os PMPs reconstituídos compreendem pelo menos 1% de lipídeo ionizável exógeno, produzindo deste modo PMPs modificados tendo captação celular aumentada.
Em outro aspecto é proporcionada aqui uma composição de PMP compreendendo uma pluralidade de PMPs modificados tendo captação celular vegetal aumentada, em que os PMPs são produzidos por um processo que compreende as etapas de (a) proporcionar uma pluralidade de PMPs purificados; (b) processar a pluralidade de PMPs para produzir um filme de lipídeos; e (c) reconstituir o filme de lipídeos na presença de um lipídeo zwitteriônico exógeno, em que os PMPs reconstituídos compreendem pelo menos 1% de lipídeo zwitteriônico exógeno, produzindo deste modo PMPs modificados tendo captação celular aumentada.
Outras características e vantagens da invenção serão aparentes a partir da seguinte Descrição Detalhada e das Reivindicações.
Definições Como usado aqui, um transportador ou excipiente “agricolamente aceitável” é um que é adequado para uso na agricultura, por exemplo, para uso em plantas.
Em certas modalidades, o transportador ou excipiente agricolamente aceitável não tem efeitos secundários adversos indevidos nas plantas, no meio ambiente ou em humanos ou animais que consomem os produtos agrícolas resultantes derivados deles proporcionais a uma relação risco/benefício razoável.
Como usado aqui, “entregar” ou “contatar” se refere a aplicar a uma planta, animal, fungo ou bactéria uma composição de PMP diretamente na planta, animal, fungo ou bactéria ou adjacente à planta, animal, fungo ou bactéria, em uma região onde a composição é eficaz para alterar a aptidão da planta, animal, fungo ou bactéria.
Em métodos onde a composição é diretamente contatada com uma planta, animal, fungo ou bactéria, a composição pode ser contatada com a planta, animal, fungo ou bactéria inteiro ou com somente uma porção da planta, animal, fungo ou bactéria.
Como usado aqui, “diminuir a aptidão de uma planta” se refere a qualquer interrupção da fisiologia de uma planta (por exemplo,
uma erva daninha) em consequência da administração de uma composição descrita aqui (por exemplo, uma composição de PMP incluindo PMPs modificados, opcionalmente incluindo um agente funcional heterólogo), incluindo, mas não se limitando a, diminuir uma população de uma planta (por exemplo, uma erva daninha) em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% , 90%, 95%, 99%, 100% ou mais.
Uma diminuição na aptidão da planta pode ser determinada em comparação com uma planta à qual a composição não foi administrada.
Como usado aqui, o termo “quantidade eficaz”, “concentração eficaz” ou "concentração eficaz para” se refere a uma quantidade de um PMP modificado, ou um agente funcional heterólogo aí, suficiente para efetuar o resultado recitado ou para alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível pré-determinado ou limiar) em ou sobre um organismo alvo.
Como usado aqui, “aumentar a aptidão de uma planta” se refere a um aumento na produção da planta, por exemplo, um rendimento melhorado, vigor melhorado da planta ou qualidade do produto coletado da planta em consequência da administração de uma composição descrita aqui (por exemplo, uma composição de PMP incluindo PMPs modificados, opcionalmente incluindo um agente funcional heterólogo). Um rendimento melhorado de uma planta se relaciona com um aumento no rendimento de um produto (por exemplo, como medido pelo rendimento de biomassa, grãos, sementes ou frutos, conteúdo de proteína, conteúdo de carboidratos ou óleo ou área foliar da planta) da planta em uma quantidade mensurável em relação ao rendimento do mesmo produto da planta produzido sob as mesmas condições, mas sem a aplicação das presentes composições ou em comparação com aplicação de agentes agrícolas convencionais.
Por exemplo, o rendimento pode ser aumentado em pelo menos cerca de
0,5%, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 100% ou mais do que 100%. O rendimento pode ser expresso em termos de uma quantidade por peso ou volume da planta ou um produto da planta em alguma base.
A base pode ser expressa em termos de tempo, área de cultivo, peso das plantas produzidas ou quantidade de matéria-prima usada.
Um aumento na aptidão da planta pode ser também medido por outros meios, tais como um aumento ou melhoria da classificação do vigor, aumento no estande (o número de plantas por unidade de área), aumento na altura da planta, aumento na circunferência do caule, aumento na copa da planta, melhoria na aparência (tal como cor da folha mais verde como medido visualmente), aumento na classificação da raiz, aumento na emergência de plântulas, conteúdo de proteína, aumento no tamanho das folhas, aumento no número das folhas, menos folhas basais mortas, aumento na força dos perfilhos, diminuição nos requisitos nutrientes ou fertilizantes, aumento na germinação das sementes, aumento na produtividade dos perfilhos, aumento na floração, menos verso da planta (alojamento), crescimento aumentado de rebentos ou qualquer combinação destes fatores, em uma quantidade mensurável ou percetível em relação ao mesmo fator da planta produzida sob as mesmas condições, mas sem a administração das presentes composições ou com aplicação de agentes agrícolas convencionais.
Como usado aqui, o termo “heterólogo” se refere a um agente que é (1) exógeno à planta (por exemplo, tendo origem em uma fonte que não é a planta a partir da qual o PMP é produzido) ou (2) endógeno à planta a partir da qual o PMP é produzido, mas está presente no PMP (por exemplo, usando carga, engenharia genética, abordagens in vitro ou in vivo) a uma concentração que é mais elevada do que aquela encontrada na natureza (por exemplo, como encontrada em uma vesícula extracelular da planta ocorrendo naturalmente). Como usado aqui, o termo “agente funcional” se refere a um agente (por exemplo, um agente agrícola (por exemplo, agente pesticida, agente fertilizante, agente herbicida, agente modificador das plantas) ou um agente terapêutico (por exemplo, um agente antifúngico, um agente antibacteriano agente, um agente virucida, um agente antiviral, um agente inseticida, um agente nematicida, um agente antiparasitário ou um repelente de inseto)) que está ou pode estar associado a PMPs (por exemplo, carregado em ou sobre PMPs (por exemplo, encapsulado por, embebido em ou conjugado a PMPs) usando métodos in vivo ou in vitro e é capaz de efetuar o resultado recitado (por exemplo, aumentar ou diminuir a aptidão de uma planta, praga vegetal, simbionte vegetal, patógeno animal (por exemplo, humano) ou vetor de patógeno animal) de acordo com as presentes composições ou métodos.
Como usado aqui, o termo “agente agrícola” se refere a um agente que pode atuar em uma planta, uma praga vegetal ou um simbionte vegetal, tal como um agente pesticida, repelente de pragas, agente fertilizante, agente modificador das plantas ou agente modificador de simbionte de plantas.
Como usado aqui, o termo “agente fertilizante” se refere a um agente que é capaz de aumentar a aptidão de uma planta (por exemplo, um nutriente vegetal ou um regulador do crescimento vegetal) ou um simbionte vegetal (por exemplo, um ácido nucleico ou um peptídeo). Como usado aqui, o termo “agente pesticida” se refere a um agente, composição ou substância nele, que controla ou diminui a aptidão (por exemplo, mata ou inibe o crescimento, proliferação, divisão, reprodução ou propagação) de uma praga agrícola, ambiental ou doméstica/caseira, tal como um inseto, molusco, nematódeo, fungo, bactéria, erva daninha ou vírus.
Os pesticidas são entendidos como incluindo inseticidas ocorrendo naturalmente ou sintéticos (larvicidas ou adulticidas), reguladores do crescimento de insetos, acaricidas (miticidas), moluscicidas, nematicidas, ectoparasiticidas, bactericidas, fungicidas ou herbicidas.
O termo “agente pesticida” pode englobar adicionalmente outras moléculas bioativas tais como antibióticos, antivirais, pesticidas, antifúngicos, anti-helmínticos, nutrientes e/ou agentes que atordoam ou abrandam o movimento dos insetos.
Como usado aqui, o termo “agente modificador das plantas” se refere a um agente que pode alterar as propriedades genéticas (por exemplo, aumentar a expressão gênica, diminuir a expressão gênica ou, de outro modo, alterar a sequência de nucleotídeos de DNA ou RNA) ou propriedades bioquímicas de uma planta de uma maneira que resulta em um aumento na aptidão da planta.
Como usado aqui, o termo “agente terapêutico” se refere a um agente que pode atuar em um animal, por exemplo, um mamífero (por exemplo, um humano), um patógeno animal ou um vetor de patógeno, tal como um agente antifúngico, um agente antibacteriano, um agente virucida, um agente antiviral, um agente inseticida, um agente nematicida, um agente antiparasitário ou um repelente de insetos.
Como usado aqui, o termo “formulado para entrega a uma planta” se refere a uma composição de PMP que inclui um transportador agricolamente aceitável.
Como usado aqui, um transportador ou excipiente “agricolamente aceitável” é um que é adequado para uso na agricultura sem efeitos secundários adversos indevidos nas plantas, no meio ambiente ou em humanos ou animais que consomem os produtos agrícolas resultantes derivados deles proporcionais a uma relação risco/benefício razoável.
Como definido aqui, os termos “ácido nucleico” e “polinucleotídeo” são permutáveis e se referem a RNA ou DNA que é linear ou ramificado, de fita simples ou dupla, ou um seu híbrido, independentemente do comprimento (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 500, 1000 ou mais ácidos nucleicos). O termo engloba também híbridos de RNA/DNA.
Os nucleotídeos são tipicamente ligados em um ácido nucleico por ligações de fosfodiéster, embora o termo “ácido nucleico” englobe também análogos de ácidos nucleicos tendo outros tipos de ligações ou esqueletos (por exemplo, ligações ou esqueletos de fosforamida, fosforotioato, fosforoditioato, O-metilfosforoamidato, morfolino, ácido nucleico trancado (LNA), ácido nucleico de glicerol (GNA), ácido nucleico de treose (TNA) e ácido nucleico de peptídeo (PNA), entre outros). Os ácidos nucleicos podem ter fita simples, fita dupla ou conter porções de sequência de fita simples e fita dupla.
Um ácido nucleico pode conter qualquer combinação de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos, bem como qualquer combinação de bases, incluindo, por exemplo, adenina, timina, citosina, guanina, uracila, e bases modificadas ou não canônicas (incluindo, por exemplo, hipoxantina, xantina, 7-metilguanina, 5,6-di-hidrouracila, 5-metilcitosina, e 5- hidroximetilcitosina). Como usado aqui, o termo “praga” se refere a organismos que causam danos a plantas ou outros organismos, estão presentes onde não são desejados ou são de outro modo prejudiciais para humanos, por exemplo, por impactação de métodos ou produtos agrícolas humanos.
As pragas podem incluir, por exemplo, invertebrados (por exemplo, insetos, nematódeos ou moluscos), microrganismos (por exemplo, fitopatógenos, endófitos, parasitas obrigatórios, parasitas facultativos ou saprófitos facultativos), tais como bactérias, fungos ou vírus; ou ervas daninhas.
Como usado aqui, o termo “agente pesticida” ou “pesticida” se refere a um agente, composição ou substância nele, que controla ou diminui a aptidão (por exemplo, mata ou inibe o crescimento, proliferação, divisão, reprodução ou propagação) de uma praga agrícola, ambiental ou doméstica/caseira, tal como um inseto, molusco, nematódeo, fungo, bactéria, erva daninha ou vírus.
Os pesticidas são entendidos como englobando inseticidas ocorrendo naturalmente ou sintéticos (larvicidas ou adulticidas), reguladores do crescimento de insetos, acaricidas (miticidas), moluscicidas, nematicidas, ectoparasiticidas, bactericidas, fungicidas ou herbicidas.
O termo “agente pesticida” pode englobar adicionalmente outras moléculas bioativas tais como antibióticos, antivirais, pesticidas, antifúngicos, anti- helmínticos, nutrientes e/ou agentes que atordoam ou abrandam o movimento dos insetos.
O agente pesticida pode ser heterólogo.
Como usado aqui, o termo “heterólogo” se refere a um agente (por exemplo, um agente pesticida) que é (1) exógeno à planta (por exemplo, tendo origem em uma fonte que não é a planta ou parte da planta a partir da qual o PMP é produzido) (por exemplo, adicionado ao PMP usando abordagens de carga descritas aqui) ou (2) endógeno à célula ou tecido da planta a partir do qual o PMP é produzido, mas presente no PMP (por exemplo, adicionado ao PMP usando abordagens de carga descritas aqui, engenharia genética, abordagens in vitro ou in vivo) a uma concentração que é mais elevada do que aquela encontrada na natureza (por exemplo, mais elevada do que uma concentração encontrada em uma vesícula extracelular da planta ocorrendo naturalmente). Como usado aqui, o termo “repelente” se refere a um agente, composição ou substância nele, que impede as pragas de se aproximarem ou permanecerem em uma planta.
Um repelente pode, por exemplo, diminuir o número de pragas sobre ou na vizinhança de uma planta, mas pode não necessariamente matar ou diminuir a aptidão da praga.
Como usado aqui, o termo “peptídeo”, “proteína” ou “polipeptídeo” engloba qualquer cadeia de aminoácidos ocorrendo naturalmente ou não naturalmente (D- ou L-aminoácidos), independentemente do comprimento (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 40, 50, 100 ou mais aminoácidos), da presença ou ausência de modificações pós-translacionais (por exemplo, glicosilação ou fosforilação) ou da presença de, por exemplo, um ou mais grupos de acila diferentes de amino (por exemplo, açúcar, lipídeo, etc.) covalentemente ligados ao peptídeo, e inclui, por exemplo, proteínas naturais, polipeptídeos e peptídeos sintéticos ou recombinantes, moléculas híbridas, peptoides ou peptidomiméticos.
Como usado aqui, a “percentagem de identidade” entre duas sequências é determinada pelo algoritmo BLAST 2.0, que é descrito em Altschul et al., (1990) J.
Mol.
Biol. 215: 403-410. Software para realizar análises BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information.
Como usado aqui, o termo “planta” se refere a plantas inteiras, órgãos de plantas, tecidos de plantas, sementes, células de plantas, sementes e descendência das mesmas.
As células de plantas incluem, sem limitação, células de sementes, culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calos, folhas, raízes, rebentos, gametófitos, esporófitos, pólen e microesporos.
As partes de plantas incluem tecidos diferenciados e indiferenciados incluindo os, mas não se limitando aos, seguintes: raízes, caules, rebentos, folhas, pólen, sementes, frutos, produtos coletados, tecido tumoral, seiva (por exemplo, seiva do xilema e seiva do floema) e várias formas de células e cultura (por exemplo, células individuais, protoplastos, embriões e tecido caloso). O tecido de planta pode estar em uma planta ou em um órgão, tecido ou cultura de células de planta.
Como usado aqui, o termo “pacote de mensageiro de planta” ou “PMP” se refere a uma estrutura de lipídeos (por exemplo, uma estrutura de bicamada de lipídeos, unilamelar ou multilamelar) (por exemplo, uma estrutura de lipídeos vesiculares), que tem cerca de 5- 2000 nm em diâmetro que inclui ou é derivado de uma vesícula extracelular da planta, ou seu segmento, porção ou extrato, incluindo quaisquer componentes de lipídeos ou não lipídeos (por exemplo, peptídeos, ácidos nucleicos ou moléculas pequenas associados a eles). Os PMPs podem incluir opcionalmente agentes adicionais, tais como agentes funcionais heterólogos (por exemplo, um agente agrícola heterólogo (por exemplo, agente pesticida, agente fertilizante, agente herbicida, agente modificador das plantas) ou um agente terapêutico heterólogo (por exemplo, um agente antifúngico, um agente antibacteriano, um agente virucida, um agente antiviral, um agente inseticida, um agente nematicida, um agente antiparasitário ou um repelente de insetos)), incluindo polinucleotídeos, polipeptídeos ou moléculas pequenas.
Os PMPs podem transportar ou se associar a agentes adicionais, tais como um agente funcional heterólogo (por exemplo, um agente agrícola heterólogo (por exemplo, agente pesticida, agente fertilizante, agente herbicida, agente modificador das plantas) ou um agente terapêutico heterólogo (por exemplo, um antifúngico agente, um agente antibacteriano, um agente virucida, um agente antiviral, um agente inseticida, um agente nematicida, um agente antiparasitário ou um repelente de insetos)), por uma variedade de meios para permitir a entrega do agente adicional a uma planta alvo, por exemplo, por encapsulação do agente adicional, incorporação do componente na estrutura de bicamada de lipídeos ou associação do componente (por exemplo, por conjugação) à superfície da estrutura de bicamada de lipídeos.
Agentes adicionais podem ser incorporados nos PMPs in vivo
(por exemplo, in planta) ou in vitro (por exemplo, em cultura de tecidos, em cultura de células ou sinteticamente incorporados). Como usado aqui, o termo “PMPs modificados” se refere a uma composição incluindo uma pluralidade de PMPs, em que os PMPs incluem um agente heterólogo (por exemplo, um agente de penetração de células) capaz de aumentar a captação celular (por exemplo, captação celular vegetal, captação celular bacteriana ou captação celular fúngica) do PMP, ou uma sua porção ou componente (por exemplo, um agente funcional heterólogo transportado pelo PMP), em relação a um PMP não modificado.
Os PMPs podem ser modificados in vitro ou in vivo.
Como usado aqui, o termo “PMPs não modificados” se refere a uma composição incluindo uma pluralidade de PMPs que carecem de um agente de captação celular heterólogo capaz de aumentar a captação celular (por exemplo, captação celular animal, captação celular vegetal, captação celular bacteriana ou captação celular fúngica) do PMP.
Como usado aqui, o termo “captação celular” se refere à captação de um PMP ou uma sua porção ou componente (por exemplo, um agente funcional heterólogo transportado pelo PMP) por uma célula, tal como uma célula animal, uma célula vegetal, uma célula bacteriana ou célula fúngica.
Por exemplo, a captação pode envolver transferência do PMP ou uma sua porção ou componente do ambiente extracelular para a ou através da membrana celular, parede celular, matriz extracelular ou para o ambiente intracelular da célula.
A captação celular de PMPs pode ocorrer através de mecanismos celulares ativos ou passivos.
Como usado aqui, o termo “agente de penetração de células” se refere a agentes que alteram propriedades (por exemplo, permeabilidade) da parede celular, matriz extracelular ou membrana celular de uma célula (por exemplo, uma célula animal, uma célula vegetal, uma célula bacteriana ou uma célula fúngica) de uma maneira que promove captação celular aumentada em relação a uma célula que não foi contatada com o agente.
Como usado aqui, o termo “vesícula extracelular da planta”, “EV da planta” ou “EV” se refere a uma estrutura de bicamada de lipídeos encerrada ocorrendo naturalmente em uma planta.
Opcionalmente, a EV da planta inclui um ou mais marcadores de EV da planta.
Como usado aqui, o termo “marcador de EV da planta” se refere a um componente que está naturalmente associado a uma planta, tal como uma proteína da planta, um ácido nucleico da planta, uma molécula pequena da planta, um lipídeo da planta, ou uma sua combinação incluindo, mas não se limitando a qualquer um dos marcadores de EV da planta listados no Apêndice.
Em alguns casos, o marcador de EV da planta é um marcador de identificação de uma EV da planta mas não é um agente pesticida.
Em alguns casos, o marcador de EV da planta é um marcador de identificação de uma EV da planta e também um agente pesticida (por exemplo, associado à ou encapsulado pela pluralidade de PMPs ou não diretamente associado à ou encapsulado pela pluralidade de PMPs). Como usado aqui, o termo "pacote de mensageiro de plantas” ou “PMP” se refere a uma estrutura de lipídeos (por exemplo, uma estrutura em bicamada de lipídeos, unilamelar, multilamelar; por exemplo, uma estrutura vesicular de lipídeos), que tem cerca de 5-2000 nm (por exemplo, pelo menos 5-1000 nm, pelo menos 5-500 nm, pelo menos 400-500 nm, pelo menos 25-250 nm, pelo menos 50-150 nm ou pelo menos 70-120 nm) em diâmetro, que é derivada de (por exemplo, enriquecida, isolada ou purificada a partir de) uma fonte ou segmento, porção, ou seu extrato, de plantas, incluindo componentes de lipídeos ou não lipídeos (por exemplo, peptídeos, ácidos nucleicos ou moléculas pequenas) associados a elas e que foi enriquecida, isolada ou purificada a partir de uma planta, uma parte da planta ou uma célula da planta, removendo o enriquecimento ou o isolamento um ou mais contaminantes ou componentes indesejados da planta de fonte.
Os PMPs podem ser preparações altamente purificadas de EVs ocorrendo naturalmente.
Preferencialmente, pelo menos 1% dos contaminantes ou componentes indesejados da planta de fonte são removidos (por exemplo, pelo menos 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% ou 100%) de um ou mais contaminantes ou componentes indesejados da planta de fonte, por exemplo, componentes da parede celular da planta; pectina; organelas da planta (por exemplo, mitocôndrias; plastídeos tais como cloroplastos, leucoplastos ou amiloplastos; e núcleos); cromatina da planta (por exemplo, um cromossomo de planta); ou agregados moleculares da planta (por exemplo, agregados de proteína, agregados de proteína-ácido nucleico, agregados de lipoproteína ou estruturas lipido-proteicas). Preferencialmente, um PMP é pelo menos 30% puro (por exemplo, pelo menos 40% puro, pelo menos 50% puro, pelo menos 60% puro, pelo menos 70% puro, pelo menos 80% puro, pelo menos 90% puro, pelo menos 99% puro ou 100% puro) em relação ao um ou mais contaminantes ou componentes indesejados da planta de fonte como medido por peso (p/p), visualização espectral (% de transmitância) ou condutividade (S/m). Em alguns casos, o PMP é um PMP extraído de lipídeos (LPMP). Como usado aqui, os termos “PMP extraído de lipídeos” e “LPMP” se referem a um PMP que foi derivado de uma estrutura de lipídeos (por exemplo, uma estrutura em bicamada de lipídeos, unilamelar, multilamelar; por exemplo, uma estrutura de lipídeos vesicular) derivada de (por exemplo, enriquecido, isolado ou purificado de) uma fonte vegetal, em que a estrutura de lipídeos é rompida (por exemplo, rompida por extração de lipídeos) e remontada ou reconstituída em uma fase líquida (por exemplo, uma fase líquida contendo uma carga) usando métodos padrão, por exemplo, reconstituída por um método compreendendo hidratação de filme de lipídeos e/ou injeção de solvente, para produzir o LPMP, como é descrito aqui.
O método pode, se desejado, compreender adicionalmente sonicação, tratamento por congelamento/descongelamento e/ou extrusão de lipídeos, por exemplo, para reduzir o tamanho dos PMPs reconstituídos.
Um PMP (por exemplo, um LPMP) pode compreender entre 10% e 100% de lipídeos derivados da estrutura de lipídeos da fonte vegetal, por exemplo, pode conter pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de lipídeos derivados da estrutura de lipídeos da fonte vegetal.
Um PMP (por exemplo, um LPMP) pode compreender todas as ou uma fração das espécies de lipídeos presentes na estrutura de lipídeos da fonte vegetal, por exemplo, pode conter pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou 100% das espécies de lipídeos presentes na estrutura de lipídeos da fonte vegetal.
Um PMP (por exemplo, um LPMP) pode compreender nenhuma das, uma fração das ou todas as espécies de proteínas presentes na estrutura de lipídeos da fonte vegetal, por exemplo, pode conter 0%, menos do que 1%, menos do que 5%, menos do que 10%, menos do que 15%, menos do que 20%, menos do que 30%, menos do que 40%, menos do que 50%, menos do que 60%, menos do que 70%, menos do que 80%, menos do que 90%, menos do que 100% ou 100% das espécies de proteínas presentes na estrutura de lipídeos da fonte vegetal.
Em alguns casos, a bicamada de lipídeos do PMP (por exemplo, LPMP) não contém proteínas.
Em alguns casos, a estrutura de lipídeos do PMP (por exemplo, LPMP) contém uma quantidade reduzida de proteínas em relação à estrutura de lipídeos da fonte vegetal.
Os PMPs (por exemplo, LPMPs) podem incluir opcionalmente lipídeos exógenos, por exemplo, lipídeos que são (1) exógenos à planta (por exemplo, tendo origem em uma fonte que não é a planta ou parte da planta a partir da qual o PMP é produzido) (por exemplo, adicionado o PMP usando métodos descritos aqui) ou (2) endógenos à célula ou tecido da planta a partir do qual o PMP é produzido, mas presente no PMP (por exemplo, adicionado ao PMP usando métodos descritos aqui, engenharia genética, abordagens in vitro ou in vivo) a uma concentração que é mais elevada do que aquela encontrada na natureza (por exemplo, mais elevada do que uma concentração encontrada em uma vesícula extracelular da planta ocorrendo naturalmente). A composição de lipídeos do PMP pode incluir 0%, menos do que 1% ou, pelo menos, 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais de 95% de lipídeo exógeno.
Lipídeos exógenos exemplificativos incluem lipídeos catiônicos, lipídeos ionizáveise lipídeos zwitteriônicos.
O lipídeo exógeno pode ser um agente de penetração de células.
Os PMPs podem incluir opcionalmente agentes adicionais, tais como agentes funcionais heterólogos, por exemplo, agentes de penetração de células, agentes pesticidas, agentes fertilizantes, agentes modificadores das plantas, agentes terapêuticos, polinucleotídeos, polipeptídeos ou moléculas pequenas.
Os PMPs podem transportar ou se associar a agentes adicionais (por exemplo, agentes funcionais heterólogos) em uma variedade de modos para permitir a entrega do agente a uma planta alvo, por exemplo, por encapsulação do agente, incorporação do agente na estrutura em bicamada de lipídeos ou associação do agente (por exemplo, por conjugação) à superfície da estrutura em bicamada de lipídeos.
Os agentes funcionais heterólogos podem ser incorporados nos PMPs in vivo (por exemplo, in planta) ou in vitro (por exemplo, em cultura de tecidos, em cultura de células ou sinteticamente incorporados). Como usado aqui, o termo “lipídeo catiônico” se refere a uma molécula anfifílica (por exemplo, um lipídeo ou um lipidoide) contendo um grupo catiônico (por exemplo, um grupo de cabeça catiônico). Como usado aqui, o termo “lipidoide” se refere a uma molécula tendo uma ou mais características de um lipídeo.
Como usado aqui, o termo “lipídeo ionizável” se refere a uma molécula anfifílica (por exemplo, um lipídeo ou um lipidoide) contendo um grupo (por exemplo, um grupo de cabeça) que pode ser ionizado, por exemplo, dissociado para produzir uma ou mais espécies eletricamente carregadas, sob uma dada condição (por exemplo, pH). Como usado aqui, o termo “lipídeo zwitteriônico” se refere a uma molécula anfifílica (por exemplo, um lipídeo ou um lipidoide) contendo um grupo (por exemplo, um grupo de cabeça) tendo pelo menos uma espécie tendo uma carga positiva e pelo menos uma espécie tendo uma carga negativa, em que a carga líquida do grupo é zero.
Como usado aqui, o termo “composição de PMP estável” (por exemplo, uma composição incluindo PMPs carregados ou não carregados) se refere a uma composição de PMP que ao longo de um período de tempo (por exemplo, pelo menos 24 horas, pelo menos 48 horas, pelo menos 1 semana, pelo menos 2 semanas, pelo menos 3 semanas, pelo menos 4 semanas, pelo menos 30 dias, pelo menos 60 dias ou pelo menos 90 dias) retém pelo menos 5% (por exemplo, pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%) do número inicial de PMPs (por exemplo, PMPs por mL de solução) em relação ao número de PMPs na composição de PMP (por exemplo, aquando da produção ou formulação) opcionalmente a uma gama de temperaturas definida (por exemplo, uma temperatura de pelo menos 24 °C (por exemplo, pelo menos 24 °C, 25 °C, 26 °C, 27 °C, 28 °C, 29 °C ou 30°C), pelo menos 20 °C (por exemplo, pelo menos 20 °C, 21 °C, 22 °C ou 23°C), pelo menos 4 °C (por exemplo, pelo menos 5 °C, 10 °C ou 15°C), pelo menos -20 °C (por exemplo, pelo menos -20 °C, -15 °C, -10 °C, - 5°C ou 0 °C) ou -80 °C (por exemplo, pelo menos -80 °C, -70 °C, -60 °C, -50 °C, -40 °C ou -30 °C)); ou retém pelo menos 5% (por exemplo, pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%) de sua atividade (por exemplo, atividade de penetração da parede celular e/ou atividade pesticida e/ou repelente) em relação à atividade inicial do PMP (por exemplo, aquando da produção ou formulação) opcionalmente a uma gama de temperaturas definida (por exemplo, uma temperatura de pelo menos 24 °C (por exemplo, pelo menos 24 °C, 25 °C, 26 °C, 27 °C, 28°C, 29 °C ou 30 °C), pelo menos 20 °C (por exemplo, pelo menos 20°C, 21 °C, 22 °C ou 23 °C), pelo menos 4 °C (por exemplo, pelo menos 5 °C, 10 °C, ou 15 °C), pelo menos -20 °C (por exemplo, pelo menos -20 °C, -15 °C, -10 °C, -5 °C ou 0 °C) ou -80 °C (por exemplo, pelo menos -80 °C, -70 °C, -60 °C, -50 °C, -40 °C ou -30 °C)). Como usado aqui, o termo “formulado para entrega a um animal” se refere a uma composição de PMP que inclui um transportador farmaceuticamente aceitável.
Como usado aqui, um transportador ou excipiente “farmaceuticamente aceitável” é um que é adequado para administração a um animal (por exemplo, humano), por exemplo, sem efeitos secundários adversos indevidos ao animal (por exemplo, humano). Como usado aqui, o termo “não tratado” se refere a uma planta, animal, fungo ou bactéria que não foi contatado com ou ao qual não foi entregue uma composição de PMP aqui, incluindo uma planta, animal, fungo ou bactéria separado ao qual não foi entregue a composição de PMP, a mesma planta, animal, fungo ou bactéria sujeito a tratamento avaliado em um ponto temporal antes da entrega da composição de PMP ou a mesma planta, animal, fungo ou bactéria sujeito a tratamento avaliado em uma parte não tratada da planta, animal, fungo ou bactéria.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um diagrama esquemático mostrando um fluxo de trabalho para preparação de PMPs reconstituídos a partir de lipídeos (LPMPs) a partir de PMPs de toranja e limão. A Figura 2 é um gráfico mostrando a frequência relativa de partículas de um dado tamanho (nm) em LPMPs; LPMPs com DC- colesterol (DC-Col) adicional; e LPMPs com DOTAP (DOTAP) adicionado. Os dados foram adquiridos por NanoFCM usando padrões de concentração e tamanho proporcionados pelo fabricante. A Figura 3A é uma micrografia crioeletrônica mostrando LPMPs reconstruídos a partir de lipídeos de PMP de limão extraídos. Barra de escala: 500 nm. A Figura 3B é um gráfico mostrando a frequência relativa de partículas de um dado diâmetro esférico equivalente (nm) em LPMPs reconstruídos a partir de lipídeos de limão extraídos, como medido usando microscopia crioeletrônica. A Figura 4A é um gráfico mostrando o potencial zeta (mV) de LPMPs não compreendendo lipídeos adicionados (LPMPs) e LPMPs compreendendo DOTAP ou DC-colesterol a 25% ou 40% como medido usando dispersão de luz dinâmica (DLS). Os dados são apresentados como Média ± SD. A Figura 4B é um gráfico de barras mostrando a percentagem de entrada de siRNA marcado com Alexa Fluor 555 que foi recuperada a partir de LPMPs após carga de LPMPs de lipídeos de toranja não compreendendo lipídeos adicionados (LPMPs) e LPMPs de lipídeos de toranja compreendendo DOTAP a 20%. A Figura 4C é um gráfico de barras mostrando a percentagem de entrada de TracrRNA marcado com ATTO que foi recuperada a partir de LPMPs após carga de LPMPs de lipídeos de limão não compreendendo lipídeos adicionados (LPMPs) e LPMPs de lipídeos de limão compreendendo DC-colesterol (DC-Col) a 40%. A Figura 4D é um gráfico de barras mostrando a concentração de TracrRNA (µg/mL) em LPMPs compreendendo DC- colesterol a 40% que não foram tratados ou foram lisados usando Triton- X100 e heparina (+TX +heparina), como medido usando uma análise Quant-iTTM RiboGreen®. A Figura 5 é um conjunto de fotomicrografias mostrando fluorescência de DAPI (linha superior) e PKH67 (linha central) em células COLO697 tratadas com LPMPs marcados com PKH67 de lipídeos de toranja não compreendendo lipídeos adicionados (coluna central) e LPMPs contendo DOTAP a 20% (coluna direita). Uma imagem mesclada compreendendo os sinais de DAPI e PKH67 é mostrada na linha inferior de painéis.
As células tratadas com o corante PKH67 são mostradas como um controle.
Barra de escala: 50 µm.
A Figura 6 é um conjunto de fotomicrografias mostrando contraste de fases (coluna da esquerda), fluorescência de ATTO 550 (coluna central) e vistas mescladas de células de maís Black Mexican Sweet (BMS) tratadas com LPMPs não compreendendo lipídeos adicionados (linha central) e LPMPs compreendendo DC-colesterol (DC-Col) a 40%. As células que foram tratadas somente com H2O são proporcionadas como um controle negativo (painéis superiores). A captação de LPMPs ou LPMPs modificados com DC-Colesterol por uma célula é indicada pela presença do sinal de ATT0 550 de TracrRNA na célula.
Barra de escala: 100 µm.
A Figura 7 é um gráfico mostrando a frequência relativa de partículas de um dado tamanho (nm) em LPMPs não modificados; LPMPs com MC3 adicionado; e LPMPs com DOTAP C12-200 adicionado.
Os dados foram adquiridos por NanoFCM usando padrões de concentração e tamanho proporcionados pelo fabricante.
A Figura 8A é um gráfico mostrando o potencial zeta (mV) de LPMPs não compreendendo lipídeos adicionados (LPMPs) a pH 7, LPMPs compreendendo MC3 a 40% a pH 4 e pH 7 e LPMPs compreendendo C12-200 a 25% a pH 4 e pH 7. Os dados são apresentados como Média ± SD.
A Figura 8B é um gráfico de barras mostrando a percentagem de entrada de TracrRNA marcado com ATTO 550 que foi recuperada a partir de LPMPs após carga de LPMPs de lipídeos de limão não compreendendo lipídeos adicionados (LPMPs) a pH 7, LPMPs compreendendo MC3 a 40% a pH 4 e pH 9 e LPMPs compreendendo C12-200 a 25% a pH 4 e pH 9. Os dados são apresentados como Média ± SD.
A Figura 8C é um gráfico de barras mostrando a concentração de sgRNA (µg/mL) em LPMPs compreendendo C12-200 a 25% que não foram tratados ou foram lisados usando Triton-X100 e heparina (+TX +heparina), como medido usando uma análise Quant- iTTM RiboGreen®. A Figura 9 é um conjunto de fotomicrografias mostrando contraste de fases (coluna da esquerda), fluorescência de ATTO 550 (coluna central) e vistas mescladas de células de maís Black Mexican Sweet (BMS) tratadas com LPMPs de lipídeos de limão não compreendendo lipídeos adicionados (linha central) e LPMPs compreendendo C12-200 a 25% (linha inferior). As células que foram tratadas somente com H2O são proporcionadas como um controle negativo (linha superior). A captação de LPMPs ou LPMPs modificados com C12-200 por uma célula é indicada pela presença do sinal de ATT0 550 de TracrRNA na célula. Barra de escala: 100 µm. A Figura 10 é um conjunto de fotomicrografias mostrando contraste de fases (linha superior), fluorescência de Alexa Fluor 488 indicando celulase marcada (segunda linha), fluorescência de PKH26 indicando membranas de PMP marcadas (terceira linha) e vistas mescladas (linha inferior) de células de maís Black Mexican (BMS) tratadas com LPMPs de lipídeos de toranja não contendo celulase adicionada (quarta coluna). Captação de LPMPs ou LPMPs modificados com celulase usando os protocolos de modificação c.1 (PMPs conjugados com AlexaFluor488-celulase através de química de carbodi- imida usando reticulante de EDC). b.3 (PMPs conjugados com AlexaFluor488-celulase-azida usando ligante de NH2-DBCO), b.2 (PMPs conjugados com AlexaFluor488-celulase-azida usando ligante de NH2-DBCO), ou b.1 (PMPs conjugados com AlexaFluor488-celulase- azida usando NHS-Fosfina). A captação de PMPs modificados por celulase é indicada pela presença do sinal de fluorescência de PKH26 nas células. Barra de escala: 100 µm.
DESCRIÇÃO DETALHADA São apresentados aqui pacotes de mensageiros de plantas (PMPs) modificados que têm captação celular intensificada, por exemplo, por uma célula animal (por exemplo, uma célula de mamífero, por exemplo, uma célula humana), uma célula vegetal, uma célula bacteriana ou uma célula fúngica. Os PMPs são montagens de lipídeos produzidas inteiramente ou parcialmente a partir de vesículas extracelulares (EVs) da planta ou seus segmentos, porções ou extratos. Os PMPs podem incluir opcionalmente agentes adicionais (por exemplo, agentes funcionais heterólogos (por exemplo, um agente agrícola heterólogo (por exemplo, agente pesticida, agente fertilizante, agente herbicida, agente modificador das plantas) ou um agente terapêutico heterólogo (por exemplo, um agente antifúngico, um agente antibacteriano, um agente virucida, um agente antiviral, um agente inseticida, um agente nematicida, um agente antiparasitário ou um repelente de insetos)). Os PMPs modificados e composições e métodos relacionados descritos aqui podem ser usados em uma variedade de métodos agrícolas e terapêuticos.
I.
Composições de Pacotes de Mensageiros de Plantas Modificados As composições de PMP descritas aqui incluem uma pluralidade de pacotes de mensageiros de plantas (PMPs) modificadas.
Um PMP é uma estrutura de lipídeos (por exemplo, estrutura em bicamada de lipídeos, unilamelar ou multilamelar) que inclui uma EV da planta ou seu segmento, porção ou extrato (por exemplo, extrato de lipídeos). As EVs da planta se referem a uma estrutura em bicamada de lipídeos encerrada que ocorre naturalmente em uma planta e que têm cerca de 5-2000 nm em diâmetro.
As EVs da planta podem ter origem em uma variedade de vias de biogênese de plantas.
Na natureza, as EVs da planta podem ser encontradas nos compartimentos intracelulares e extracelulares das plantas, tais como o apoplasto da planta, o compartimento localizado fora da membrana plasmática e formado por um contínuo de paredes celulares e o espaço extracelular.
Alternativamente, os PMPs podem ser EVs da planta enriquecidos encontrados em meios de cultura de células após secreção a partir de células de plantas.
As EVs da planta podem ser separadas das plantas, proporcionando deste modo PMPs, por uma variedade de métodos adicionalmente descritos aqui.
Adicionalmente, os PMPs podem incluir opcionalmente um agente funcional heterólogo (por exemplo, um agente agrícola heterólogo (por exemplo, agente pesticida, agente fertilizante, agente herbicida, agente modificador das plantas) ou um agente terapêutico heterólogo (por exemplo, um agente de penetração de células, um agente antifúngico, um agente antibacteriano, um agente virucida, um agente antiviral, um agente inseticida, um agente nematicida, um agente antiparasitário ou um repelente de insetos)), que pode ser introduzido in vivo ou in vitro.
Os PMPs podem incluir EVs das plantas ou seus segmentos, porções ou extratos.
Opcionalmente, os PMPs podem também incluir lipídeos exógenos (por exemplo, esteróis (por exemplo, colesterol), lipídeos catiônicos, lipídeos zwitteriônicos ou lipídeos ionizáveis) adicionalmente a lipídeos derivados de EVs da planta.
Em algumas modalidades, os EVs da planta têm cerca de 5-1000 nm em diâmetro.
Por exemplo, o PMP pode incluir uma EV da planta, ou seu segmento, porção ou extrato, que tem um diâmetro médio de cerca de 5-50 nm, cerca de 50-100 nm, cerca de 100-150 nm, cerca de 150-200 nm, cerca de 200-250 nm, cerca de 250-300 nm, cerca de 300-350 nm, cerca de 350-400 nm, cerca de 400-450 nm, cerca de 450-500 nm, cerca de 500- 550 nm, cerca de 550-600 nm, cerca de 600-650 nm, cerca de 650-700 nm, cerca de 700-750 nm, cerca de 750-800 nm, cerca de 800-850 nm, cerca de 850-900 nm, cerca de 900-950 nm, cerca de 950-1000 nm, cerca de 1000-1250 nm, cerca de 1250-1500 nm, cerca de 1500-1750 nm ou cerca de 1750-2000 nm.
Em alguns casos, o PMP inclui uma EV da planta, ou seu segmento, porção ou extrato, que tem um diâmetro médio de cerca de 5-950 nm, cerca de 5-900 nm, cerca de 5-850 nm, cerca de 5-800 nm, cerca de 5-750 nm, cerca de 5-700 nm, cerca de 5- 650 nm, cerca de 5-600 nm, cerca de 5-550 nm, cerca de 5-500 nm, cerca de 5-450 nm, cerca de 5-400 nm, cerca de 5-350 nm, cerca de 5- 300 nm, cerca de 5-250 nm, cerca de 5-200 nm, cerca de 5-150 nm, cerca de 5-100 nm, cerca de 5-50 nm ou cerca de 5-25 nm.
Em certos casos, a EV da planta, ou seu segmento, porção ou extrato, tem um diâmetro médio de cerca de 50-200 nm.
Em certos casos, a EV da planta, ou seu segmento, porção ou extrato, tem um diâmetro médio de cerca de 50-300 nm.
Em certos casos, a EV da planta, ou seu segmento, porção ou extrato, tem um diâmetro médio de cerca de 200-500 nm.
Em certos casos, a EV da planta, ou seu segmento, porção ou extrato, tem um diâmetro médio de cerca de 30-150 nm.
Em alguns casos, o PMP pode incluir uma EV da planta, ou seu segmento, porção ou extrato, que tem um diâmetro médio de pelo menos 5 nm, pelo menos 50 nm, pelo menos 100 nm, pelo menos 150 nm, pelo menos 200 nm, pelo menos 250 nm, pelo menos 300 nm, pelo menos 350 nm, pelo menos 400 nm, pelo menos 450 nm, pelo menos 500 nm, pelo menos 550 nm, pelo menos 600 nm, pelo menos 650 nm, pelo menos 700 nm, pelo menos 750 nm, pelo menos 800 nm, pelo menos 850 nm, pelo menos 900 nm, pelo menos 950 nm ou pelo menos 1000 nm.
Em alguns casos, o PMP inclui uma EV da planta, ou seu segmento, porção ou extrato, que tem um diâmetro médio menor do que 1000 nm, menor do que 950 nm, menor do que 900 nm, menor do que 850 nm, menor do que 800 nm, menor do que 750 nm, menor do que 700 nm, menor do que 650 nm, menor do que 600 nm, menor do que 550 nm, menor do que 500 nm, menor do que 450 nm, menor do que 400 nm, menor do que 350 nm, menor do que 300 nm, menor do que 250 nm, menor do que 200 nm, menor do que 150 nm, menor do que 100 nm ou menor do que 50 nm.
Uma variedade de métodos (por exemplo, um método de dispersão de luz dinâmica) padrão na técnica pode ser usada para medir o diâmetro das partículas da EV da planta ou seu segmento, porção ou extrato.
Em alguns casos, o PMP pode incluir uma EV da planta, ou seu segmento, porção ou extrato, que tem uma área superficial média de 77 nm2 a 3,2x106 nm2 (por exemplo, 77-100 nm2, 100-1000 nm2, 1000-1x104 nm2, 1x104-1x105 nm2, 1x105-1x106 nm2 ou 1x106-3,2x106 nm2). Em alguns casos, o PMP pode incluir uma EV da planta, ou seu segmento, porção ou extrato, que tem um volume médio de 65 nm3 a 5,3x108 nm3 (por exemplo, 65-100 nm3, 100-1000 nm3, 1000-1x104 nm3, 1x104-1x105 nm3, 1x105-1x106 nm3, 1x106-1x107 nm3, 1x107-1x108 nm3, 1x108-5,3x108 nm3). Em alguns casos, o PMP pode incluir uma EV da planta, ou seu segmento, porção ou extrato, que tem uma área superficial média de pelo menos 77 nm2 (por exemplo, pelo menos 77 nm2, pelo menos 100 nm2, pelo menos 1000 nm2, pelo menos 1x104 nm2, pelo menos 1x105 nm2, pelo menos 1x106 nm2 ou pelo menos 2x106 nm2). Em alguns casos, o PMP pode incluir uma EV da planta, ou seu segmento, porção ou extrato, que tem um volume médio de pelo menos 65 nm3 (por exemplo, pelo menos 65 nm3, pelo menos 100 nm3, pelo menos 1000 nm3, pelo menos 1x104 nm3, pelo menos 1x105 nm3, pelo menos 1x106 nm3, pelo menos 1x107 nm3, pelo menos 1x108 nm3, pelo menos 2x108 nm3, pelo menos 3x108 nm3, pelo menos 4x108 nm 3 ou pelo menos 5x108 nm3). Em alguns casos, o PMP pode ter o mesmo tamanho que a EV da planta ou seu segmento, extrato ou porção.
Alternativamente, o PMP pode ter um tamanho diferente da EV da planta inicial a partir da qual o PMP é produzido.
Por exemplo, o PMP pode ter um diâmetro de cerca de 5-2000 nm em diâmetro.
Por exemplo, o PMP pode ter um diâmetro médio de cerca de 5-50 nm, cerca de 50-100 nm, cerca de 100-150 nm, cerca de 150-200 nm, cerca de 200-250 nm, cerca de 250- 300 nm, cerca de 300-350 nm, cerca de 350-400 nm, cerca de 400-450 nm, cerca de 450-500 nm, cerca de 500-550 nm, cerca de 550-600 nm, cerca de 600-650 nm, cerca de 650-700 nm, cerca de 700-750 nm, cerca de 750-800 nm, cerca de 800-850 nm, cerca de 850-900 nm, cerca de 900-950 nm, cerca de 950-1000 nm, cerca de 1000-1200 nm, cerca de 1200-1400 nm, cerca de 1400-1600 nm, cerca de 1600-1800 nm ou cerca de 1800-2000 nm.
Em alguns casos, o PMP pode ter um diâmetro médio de pelo menos 5 nm, pelo menos 50 nm, pelo menos 100 nm, pelo menos 150 nm, pelo menos 200 nm, pelo menos 250 nm, pelo menos 300 nm, pelo menos 350 nm, pelo menos 400 nm, pelo menos 450 nm, pelo menos 500 nm, pelo menos 550 nm, pelo menos 600 nm, pelo menos 650 nm, pelo menos 700 nm, pelo menos 750 nm, pelo menos 800 nm, pelo menos 850 nm, pelo menos 900 nm, pelo menos 950 nm, pelo menos 1000 nm, pelo menos 1200 nm, pelo menos 1400 nm, pelo menos 1600 nm, pelo menos 1800 nm ou cerca de 2000 nm.
Uma variedade de métodos (por exemplo, um método de dispersão de luz dinâmica) padrão na técnica pode ser usada para medir o diâmetro das partículas dos PMPs.
Em alguns casos, o tamanho do PMP é determinado após carga de agentes funcionais heterólogos ou após outras modificações aos PMPs.
Em alguns casos, o PMP pode ter uma área superficial média de 77 nm2 a 1,3x107 nm2 (por exemplo, 77-100 nm2, 100-1000 nm2, 1000-1x104 nm2, 1x104-1x105 nm2, 1x105-1x106 nm2 ou 1x106-1,3x107 nm2). Em alguns casos, o PMP pode ter um volume médio de 65 nm3 a 4,2 x109 nm3 (por exemplo, 65-100 nm3, 100-1000 nm3, 1000-1x104 nm3, 1x104-1x105 nm3, 1x105-1x106 nm3, 1x106-1x107 nm3, 1x107-1x108 nm3, 1x108-1x109 nm3 ou 1x109-4,2x109 nm3). Em alguns casos, o PMP tem uma área superficial média de pelo menos 77 nm2 (por exemplo, pelo menos 77 nm2, pelo menos 100 nm2, pelo menos 1000 nm2, pelo menos 1x104 nm2, pelo menos 1x105 nm2, pelo menos 1x106 nm2 ou pelo menos 1x107 nm2). Em alguns casos, o PMP tem um volume médio de pelo menos 65 nm3 (por exemplo, pelo menos 65 nm3, pelo menos 100 nm3, pelo menos 1000 nm3, pelo menos 1x104 nm3, pelo menos 1x105 nm3, pelo menos 1x106 nm3, pelo menos 1x107 nm3, pelo menos 1x108 nm3, pelo menos 1x109 nm3, pelo menos 2x109 nm3, pelo menos 3x109 nm3 ou pelo menos 4x109 nm3). Em alguns casos, o PMP pode incluir uma EV da planta intacta.
Alternativamente, o PMP pode incluir um segmento, porção ou extrato da área superficial total da vesícula (por exemplo, um segmento, porção ou extrato incluindo menos do que 100% (por exemplo, menos do que 90%, menos do que 80%, menos do que 70%, menos do que 60%, menos do que 50%, menos do que 40%, menos do que 30%, menos do que 20%, menos do que 10%, menos do que 10%, menos do que 5% ou menos do que 1%) da área superficial total da vesícula) de uma EV da planta.
O segmento, porção ou extrato pode ter qualquer forma, tal como um segmento circunferencial, segmento esférico (por exemplo, hemisfério), segmento curvilíneo, segmento linear ou segmento plano.
Nos casos onde o segmento é um segmento esférico da vesícula, o segmento esférico pode representar um que surge da divisão de uma vesícula esférica ao longo de um par de linhas paralelas ou um que surge da divisão de uma vesícula esférica ao longo de um par de linhas não paralelas.
Conformemente, a pluralidade de PMPs pode incluir uma pluralidade de EVs da planta intactas, uma pluralidade de segmentos, porções ou extratos de EV da planta ou uma mistura de segmentos de EVs da planta e EVs da planta intactas.
Um perito na técnica apreciará que a razão entre EVs da planta intactos e segmentados dependerá do método de isolamento particular usado.
Por exemplo, triturar ou combinar uma planta, ou parte da mesma, pode produzir PMPs que contêm uma percentagem mais elevada de segmentos, porções ou extratos de EV da planta do que um método de extração não destrutivo, tal como infiltração a vácuo.
Nos casos onde o PMP inclui um segmento, porção ou extrato de uma EV da planta, o segmento, porção ou extrato de EV pode ter uma área superficial média menor do que aquela de uma vesícula intacta, por exemplo, uma área superficial média menor do que 77 nm2, 100 nm2, 1000 nm2, 1x104 nm2, 1x105 nm2, 1x106 nm2 ou 3,2x106 nm2). Em alguns casos, o segmento, porção ou extrato de EV tem uma área superficial de menos do que 70 nm2, 60 nm2, 50 nm2, 40 nm2, 30 nm2, 20 nm2 ou 10 nm2). Em alguns casos, o PMP pode incluir uma EV da planta, ou seu segmento, porção ou extrato, que tem um volume médio menor do que aquele de uma vesícula intacta, por exemplo, um volume médio de menos do que 65 nm3, 100 nm3, 1000 nm3, 1x104 nm3, 1x10 5 nm3, 1x106 nm3, 1x107 nm3, 1x108 nm3 ou 5,3x108 nm3). Nos casos onde o PMP inclui um extrato de uma EV da planta, por exemplo, nos casos onde o PMP inclui lipídeos extraídos (por exemplo, com clorofórmio) de uma EV da planta, o PMP pode incluir pelo menos 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, ou mais do que 99%, de lipídeos extraídos (por exemplo, com clorofórmio) de uma EV da planta.
Os PMPs na pluralidade podem incluir segmentos de EV da planta e/ou lipídeos extraídos de EV da planta ou uma sua mistura.
São delineados adicionalmente aqui detalhes dizendo respeito a métodos de produzir PMPs modificados, marcadores de EV da planta que podem ser associados a PMPs e formulações para composições incluindo PMPs.
A.
Métodos de Produção Os PMPs podem ser produzidos a partir de EVs da planta, ou um seu segmento, porção ou extrato (por exemplo, extrato de lipídeos), que ocorrem naturalmente nas plantas, ou suas partes, incluindo tecidos de plantas ou células de plantas.
Um método exemplificativo para produzir PMPs inclui (a) proporcionar uma amostra inicial de uma planta, ou uma parte da mesma, em que a planta ou parte da mesma compreende EVs; e (b) isolar uma fração de PMP em bruto da amostra inicial, em que a fração de PMP em bruto tem um nível diminuído de pelo menos um contaminante ou componente indesejado da planta ou parte da mesma em relação ao nível na amostra inicial.
O método pode incluir adicionalmente um passo adicional (c)
compreendendo purificar a fração de PMP em bruto, produzindo deste modo uma pluralidade de PMPs puros, em que a pluralidade de PMPs puros tem um nível diminuído de pelo menos um contaminante ou componente indesejado da planta ou parte da mesma em relação ao nível na fração de EV em bruto.
Cada passo de produção é discutido em detalhe adicional, em baixo.
Métodos exemplificativos dizendo respeito ao isolamento e purificação de PMPs são encontrados, por exemplo, em Rutter e Innes, Plant Physiol. 173 (1): 728-741, 2017; Rutter et al., Bio.
Protoc. 7 (17): e2533, 2017; Regente et al., J of Exp.
Biol. 68 (20): 5485-5496, 2017; Mu et al., Mol.
Nutr.
Food Res., 58, 1561–1573, 2014 e Regente et al., FEBS Letters. 583: 3363-3366, 2009, cada um dos quais é aqui incorporado por referência.
Em alguns casos, uma pluralidade de PMPs pode ser isolada de uma planta por um processo que inclui as etapas de: (a) proporcionar uma amostra inicial de uma planta, ou uma parte da mesma, em que a planta ou parte da mesma compreende EVs; (b) isolar uma fração de PMP em bruto da amostra inicial, em que a fração de PMP em bruto tem um nível diminuído de pelo menos um contaminante ou componente indesejado da planta ou parte da mesma em relação ao nível na amostra inicial (por exemplo, um nível que é diminuído em pelo menos 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% ou 100%); e (c) purificar a fração de PMP em bruto, produzindo deste modo uma pluralidade de PMPs puros, em que a pluralidade de PMPs puros tem um nível diminuído de pelo menos um contaminante ou componente indesejado da planta ou parte da mesma em relação ao nível na fração de EV em bruto (por exemplo, um nível que é diminuído em pelo menos 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% ou 100%). Os PMPs proporcionados aqui podem incluir uma EV da planta, ou seu segmento, porção ou extrato, produzida a partir de uma variedade de plantas.
Os PMPs podem ser produzidos a partir de qualquer gênero de plantas (vasculares ou não vasculares) incluindo mas não se limitando a angiospermas (plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas), gimnospermas, samambaias, selaginelas, cavalinhas, psilófitas, licófitas, algas (por exemplo, unicelulares ou multicelulares, por exemplo, archaeplastida) ou briófitas.
Em certos casos, os PMPs podem ser produzidos usando uma planta vascular, por exemplo, monocotiledôneas ou dicotiledôneas ou gimnospermas.
Por exemplo, os PMPs podem ser produzidos usando alfafa, maçã, Arabidopsis, banana, cevada, uma espécie de Brassica (por exemplo, Arabidopsis thaliana ou Brassica napus), canola, mamona, chicória, crisântemo, trevo, cacau, café, algodão, semente de algodão, milho, crambe, oxicoco, pepino, dendróbio, dióscoreia, eucalipto, festuca, linho, gladíolo, liliácea, linhaça, painço, meloa, mostarda, aveia, dendê, colza, mamão, amendoim, abacaxi, plantas ornamentais, Phaseolus, batata, colza, arroz, centeio, azevém, cártamo, gergelim, sorgo, soja, beterraba-sacarina, cana-de-açúcar, girassol, morango, tabaco, tomate, grama, trigo ou culturas vegetais tais como alface, aipo, brócolis, couve- flor, cucurbitáceas; árvores de fruta e nozes, tais como maçã, pera, pêssego, laranja, toranja, limão, lima, amêndoa, noz-pecã, nozes, avelã; videiras, tais como uvas, quiuí, lúpulo; arbustos de frutas e silvas, tais como framboesa, amora-preta, groselha; árvores florestais, tais como freixo, pinheiro, abeto, bordo, carvalho, castanheiro, álamo; com alfafa, canola, mamona, milho, algodão, crambe, linho, linhaça, mostarda, dendê, colza, amendoim, batata, arroz, cártamo, gergelim, soja, beterraba, girassol, tabaco, tomate ou trigo.
Os PMPs podem ser produzidos usando uma planta inteira (por exemplo, uma roseta inteira ou plântulas) ou alternativamente a partir de uma ou mais partes da planta (por exemplo, folha, semente,
raiz, fruta, vegetal, pólen, seiva do floema ou seiva do xilema). Por exemplo, os PMPs podem ser produzidos usando órgãos/estruturas vegetativas de rebentos (por exemplo, folhas, caules ou tubérculos), raízes, flores e órgãos/estruturas florais (por exemplo, pólen, brácteas, sépalas, pétalas, estames, carpelos, anteras ou óvulos), semente (incluindo embrião, endosperma ou tegumento), fruta (o ovário maduro), seiva (por exemplo, seiva do floema ou xilema), tecido de planta (por exemplo, tecido vascular, tecido do solo, tecido tumoral ou similares) e células (por exemplo, células individuais, protoplastos, embriões, tecido caloso, células guarda, óvulos ou similares) ou descendência dos mesmos.
Por exemplo, o passo de isolamento pode envolver (a) proporcionar uma planta ou uma parte da mesma.
Em alguns exemplos, a parte de planta é uma folha de Arabidopsis.
A planta pode estar em qualquer etapa de desenvolvimento.
Por exemplo, os PMPs podem ser produzidos usando plântulas, por exemplo, plântulas de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas ou 8 semanas de idade (por exemplo, plântulas de Arabidopsis). Outros PMPs exemplificativos podem incluir PMPs produzidos usando raízes (por exemplo, raízes de gengibre), suco de fruta (por exemplo, suco de toranja), legumes e hortaliças (por exemplo, brócolis), pólen (por exemplo, pólen de oliveira), seiva do floema (por exemplo, seiva do floema de Arabidopsis) ou seiva do xilema (por exemplo, seiva do xilema de tomate). Os PMPs podem ser produzidos usando uma planta, ou parte da mesma, por uma variedade de métodos.
Qualquer método que permita a liberação da fração apoplástica contendo EV de uma planta, ou uma fração de outro modo extracelular que contenha PMPs compreendendo EVs secretadas (por exemplo, meio de cultura de células), é adequado nos presentes métodos.
As EVs podem ser separadas da planta ou parte da planta por métodos destrutivos (por exemplo, trituração ou combinação de uma planta ou qualquer parte da planta) ou não destrutivos (lavagem ou infiltração a vácuo de uma planta ou qualquer parte da planta). Por exemplo, a planta, ou parte da mesma, pode ser infiltrada a vácuo, triturada, combinada ou uma sua combinação para se isolarem EVs da planta ou parte da planta, produzindo deste modo PMPs.
Por exemplo, o passo de isolamento pode envolver infiltração em vácuo da planta (por exemplo, com um tampão de isolamento de vesículas) para liberar e coletar a fração apoplástica.
Alternativamente, o passo de isolamento pode envolver triturar ou combinar a planta para liberar as EVs, produzindo deste modo PMPs.
Após se isolarem as EVs da planta, produzindo deste modo PMPs, os PMPs podem ser separados ou coletados em uma fração de PMP em bruto (por exemplo, uma fração apoplástica). Por exemplo, o passo de separação pode envolver separar a pluralidade de PMPs em uma fração de PMP em bruto usando centrifugação (por exemplo, centrifugação diferencial ou ultracentrifugação) e/ou filtração para separar a fração contendo PMP vegetal de grandes contaminantes, incluindo detritos de tecidos vegetais ou células vegetais.
Como tal, a fração de PMP em bruto terá um número diminuído de grandes contaminantes, incluindo detritos de tecidos vegetais ou células vegetais, em comparação com a amostra inicial da planta ou parte da planta.
Dependendo do método usado, a fração de PMP em bruto pode compreender adicionalmente um nível diminuído de organelas de células vegetais (por exemplo, núcleos, mitocôndrias ou cloroplastos), em comparação com a amostra inicial da planta ou parte da planta.
Em alguns casos, o passo de isolamento pode envolver separar a pluralidade de PMPs em uma fração de PMP em bruto usando centrifugação (por exemplo, centrifugação diferencial ou ultracentrifugação) e/ou filtração para separar a fração contendo PMP das células de plantas ou detritos celulares.
Em tais casos, a fração de PMP em bruto terá um número diminuído de células de plantas ou detritos celulares, em comparação com a amostra inicial da planta ou parte da planta de fonte.
A fração de PMP em bruto pode ser adicionalmente purificada por métodos de purificação adicionais para produzir uma pluralidade de PMPs puros.
Por exemplo, a fração de PMP em bruto pode ser separada de outros componentes da planta por ultracentrifugação, por exemplo, usando um gradiente de densidade (iodixanol ou sacarose) e/ou uso de outras abordagens para se removerem componentes agregados (por exemplo, precipitação ou cromatografia por exclusão de tamanhos). Os PMPs puros resultantes podem ter um nível diminuído de contaminantes ou outros componentes indesejados da planta de fonte (por exemplo, um ou mais componentes diferentes de PMP, tais como agregados de proteína, agregados de ácido nucleico, agregados de proteína-ácido nucleico, lipoproteínas livres, estruturas lipido-proteicas), núcleos, componentes da parede celular, organelas de células ou uma sua combinação) em relação a uma ou mais frações geradas durante as etapas de separação precoces ou em relação a um nível de limiar pré-estabelecido, por exemplo, uma especificação de liberação comercial.
Por exemplo, os PMPs puros podem ter um nível diminuído (por exemplo, em cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100%; ou em cerca de 2x vezes, 4x vezes, 5x vezes, 10x vezes, 20x vezes, 25x vezes, 50x vezes, 75x vezes, 100x vezes ou mais do que 100x vezes) de organelas de plantas ou componentes da parede celular em relação ao nível na amostra inicial.
Em alguns casos, os PMPs puros são substancialmente isentos (por exemplo, têm níveis indetectáveis) de um ou mais componentes diferentes de PMP, tais como agregados de proteína, agregados de ácido nucleico, agregados de proteína-ácido nucleico, lipoproteínas livres, estruturas lipido- proteicas), núcleos, componentes da parede celular, organelas de células ou uma sua combinação.
Exemplos adicionais das etapas de liberação e separação podem ser encontrados no Exemplo 1. Os PMPs podem estar a uma concentração de, por exemplo, 1x109, 5x109, 1x1010, 5x1010, 5x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 9x1012, 1x1013 ou mais do que 1x1013 PMPs/mL.
Por exemplo, os agregados de proteína podem ser removidos de PMPs.
Por exemplo, os PMPs podem ser levados através de uma gama de pHs (por exemplo, como medido usando uma sonda de pH) para separar por precipitação os agregados de proteína em solução.
O pH pode ser ajustado até, por exemplo, pH 3, pH 5, pH 7, pH 9 ou pH 11 com a adição de, por exemplo, hidróxido de sódio ou ácido clorídrico.
Logo que a solução esteja ao pH especificado, ela pode ser filtrada para se removerem os particulados.
Alternativamente, os PMPs podem ser floculados usando a adição de polímeros carregados, tais como Polymin-P ou Praestol 2640. Brevemente, Polymin-P ou Praestol 2640 é adicionado à solução e misturado com um impulsor.
A solução pode ser depois filtrada para se removerem os particulados.
Alternativamente, os agregados podem ser solubilizados por aumento da concentração de sal.
Por exemplo, NaCl pode ser adicionado aos PMPs até estarem a, por exemplo, 1 mol/L.
A solução pode ser depois filtrada para se isolarem os PMPs.
Alternativamente, os agregados são solubilizados por aumento da temperatura.
Por exemplo, os PMPs podem ser aquecidos sob mistura até a solução ter alcançado uma temperatura uniforme de, por exemplo, 50 °C durante 5 minutos.
A mistura de PMP pode ser depois filtrada para se isolarem os PMPs.
Alternativamente, os contaminantes solúveis de soluções de PMP podem ser separados por coluna de cromatografia por exclusão de tamanhos de acordo com procedimentos padrão, onde os PMPs eluem nas primeiras frações, ao passo que as proteínas e as ribonucleoproteínas e algumas lipoproteínas são eluídas mais tarde.
A eficiência da remoção de agregados de proteína pode ser determinada por medição e comparação da concentração de proteína antes da e após remoção de agregados de proteína através da quantificação de proteínas BCA/Bradford.
Qualquer um dos métodos de produção descritos aqui pode ser suplementado com quaisquer métodos quantitativos ou qualitativos conhecidos na técnica para caracterizar ou identificar os PMPs em qualquer passo do processo de produção.
Os PMPs podem ser caracterizados por uma variedade de métodos de análise para se estimar o rendimento de PMP, a concentração de PMP, a pureza de PMP, a composição de PMP ou os tamanhos de PMP.
Os PMPs podem ser avaliados por um número de métodos conhecidos na técnica que permitem a visualização, quantificação ou caracterização qualitativa (por exemplo, identificação da composição) dos PMPs, tais como microscopia (por exemplo, microscopia eletrônica de transmissão), dispersão de luz dinâmica, rastreamento de nanopartículas, espectroscopia (por exemplo, análise de infravermelhos com transformada de Fourier) ou espectrometria de massa (análise de proteínas e lipídeos). Em certos casos podem ser usados métodos (por exemplo, espectroscopia de massa) para se identificarem marcadores de EV da planta presentes no PMP, tais como marcadores divulgados no Apêndice.
Para auxiliar na análise e caracterização da fração de PMP, os PMPs podem ser adicionalmente marcados ou corados.
Por exemplo, os PMPs podem ser corados com iodeto de 3,3'-di- hexiloxacarbocianina (DIOC6), um corante lipofílico fluorescente, PKH67 (Sigma Aldrich); Alexa Fluor® 488 (Thermo Fisher Scientific) ou DyLightTM 800 (Thermo Fisher). Na ausência de formas sofisticadas de rastreamento de nanopartículas, esta abordagem relativamente simples quantifica o conteúdo total da membrana e pode ser usada para medir indiretamente a concentração de PMPs (Rutter e Innes, Plant Physiol. 173 (1): 728-741, 2017; Rutter et al., Bio.
Protoc. 7 (17): e2533, 2017). Para medições mais precisas, e para se avaliarem as distribuições dos tamanhos de PMPs, pode ser usado rastreamento de nanopartículas.
Durante o processo de produção, os PMPs podem ser opcionalmente preparados tal que os PMPs estejam a uma concentração aumentada (por exemplo, em cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100%; ou em cerca de 2x vezes, 4x vezes, 5x vezes, 10x vezes, 20x vezes, 25x vezes, 50x vezes, 75x vezes, 100x vezes ou mais do que 100x vezes) em relação ao nível de EV em uma amostra de controle ou inicial.
Os PMPs podem constituir cerca de 0,1% a cerca de 100% da composição de PMP, tal como qualquer um de cerca de 0,01% a cerca de 100%, cerca de 1% a cerca de 99,9%, cerca de 0,1% a cerca de 10%, cerca de 1% a cerca de 25%, cerca de 10% a cerca de 50%, cerca de 50% a cerca de 99% ou cerca de 75% a cerca de 100%. Em alguns casos, a composição inclui pelo menos qualquer de 0,1%, 0,5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais PMPs, por exemplo, como medido por peso/vol, percentagem da composição da proteína de PMP e/ou percentagem da composição de lipídeos (por exemplo, por medição de lipídeos fluorescentemente marcados); Ver, por exemplo, Exemplo 3). Em alguns casos, os agentes concentrados são usados como produtos comerciais, por exemplo, o usuário final pode usar agentes diluídos, que têm uma concentração substancialmente mais baixa de ingrediente ativo.
Em algumas modalidades, a composição é formulada como uma formulação de concentrado agrícola, por exemplo, uma formulação de concentrado de volume ultrabaixo.
Conforme ilustrado pelo Exemplo 1, os PMPs podem ser produzidos usando uma variedade de plantas, ou suas partes (por exemplo, o apoplasto da folha, apoplasto da semente, raiz, fruta, vegetal, pólen, seiva do floema ou xilema). Por exemplo, os PMPs podem ser liberados da fração apoplástica de uma planta, tal como o apoplasto de uma folha (por exemplo, folhas de apoplasto de Arabidopsis thaliana) ou o apoplasto de sementes (por exemplo, apoplasto de sementes de girassol). Outros PMPs exemplificativos são produzidos usando raízes (por exemplo, raízes de gengibre), suco de frutas (por exemplo, suco de toranja), legumes e hortaliças (por exemplo, brócolis), pólen (por exemplo, pólen de oliveira), seiva do floema (por exemplo, seiva do floema de Arabidopsis), seiva do xilema (por exemplo, seiva do xilema de tomate) ou sobrenadante de cultura de células (por exemplo, sobrenadante de cultura de células de tabaco BY2). Este exemplo demonstra adicionalmente a produção de PMPs a partir destas várias fontes de plantas. Como ilustrado pelo Exemplo 2, os PMPs podem ser purificados por uma variedade de métodos, por exemplo, por uso de um gradiente de densidade (iodixanol ou sacarose) em conjunção com ultracentrifugação e/ou métodos para se removerem contaminantes agregados, por exemplo, precipitação ou cromatografia por exclusão de tamanhos. Por exemplo, o Exemplo 2 ilustra a purificação de PMPs que foram obtidos através das etapas de separação delineados no Exemplo
1. Adicionalmente, os PMPs podem ser caracterizados de acordo com os métodos ilustrados no Exemplo 3. O PMP pode ser modificado antes do uso, como delineado adicionalmente aqui. B. PMPs modificados e composições de PMP Após produção dos PMPs, os PMPs podem ser modificados por carga com ou formulação com um agente heterólogo (por exemplo,
um agente de penetração de células vegetais) que é capaz de aumentar a captação celular (por exemplo, captação celular animal (por exemplo, captação celular mamífera, por exemplo, captação celular humana), captação celular vegetal, captação celular bacteriana ou captação celular fúngica) em relação a um PMP não modificado.
Por exemplo, os PMPs modificados podem incluir (por exemplo, ser carregados com, por exemplo, encapsular ou ser conjugados a) ou ser formulados com (por exemplo, ser suspensos ou ressuspensos em uma solução compreendendo) um agente de penetração de células, tal como uma enzima, detergente, líquido iônico, fluorado ou zwitteriônico ou lipídeo.
Em alguns casos, o agente de penetração de células é uma enzima.
Por exemplo, a enzima pode ser uma enzima animal, bacteriana, fúngica, protozoária, mamífera ou vegetal que é capaz de degradar paredes celulares (por exemplo, uma parede celular animal, uma parede celular vegetal, parede celular bacteriana ou uma parede celular fúngica). Em alguns casos, a enzima é uma enzima bacteriana capaz de degradar paredes das células vegetais.
Em alguns casos, a enzima tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima bacteriana capaz de degradar paredes das células vegetais.
Em alguns casos, a enzima é uma enzima fúngica capaz de degradar paredes das células vegetais.
Em alguns casos, a enzima tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima fúngica capaz de degradar paredes das células vegetais.
Em alguns casos, a enzima é uma enzima vegetal capaz de degradar paredes das células vegetais.
Em alguns casos, a enzima degradante das paredes celulares tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima vegetal capaz de degradar paredes das células vegetais.
Em alguns casos, a enzima é uma enzima protozoária capaz de degradar paredes das células vegetais.
Em alguns casos, a enzima degradante das paredes celulares tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima protozoária capaz de degradar paredes das células vegetais.
Em alguns casos, a enzima é uma enzima bacteriana capaz de degradar paredes das células bacterianas.
Em alguns casos, a enzima tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima bacteriana capaz de degradar paredes das células bacterianas.
Em alguns casos, a enzima é uma enzima fúngica capaz de degradar paredes das células bacterianas.
Em alguns casos, a enzima tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima fúngica capaz de degradar paredes das células bacterianas.
Em alguns casos, a enzima é uma enzima vegetal capaz de degradar paredes das células bacterianas.
Em alguns casos, a enzima degradante das paredes celulares tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima vegetal capaz de degradar paredes das células bacterianas.
Em alguns casos, a enzima é uma enzima protozoária capaz de degradar paredes das células bacterianas.
Em alguns casos, a enzima degradante das paredes celulares tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima protozoária capaz de degradar paredes das células bacterianas.
Em alguns casos, a enzima é uma enzima bacteriana capaz de degradar paredes das células fúngicas.
Em alguns casos, a enzima tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima bacteriana capaz de degradar paredes das células fúngicas.
Em alguns casos, a enzima é uma enzima fúngica capaz de degradar paredes das células fúngicas.
Em alguns casos, a enzima tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima fúngica capaz de degradar paredes das células fúngicas.
Em alguns casos, a enzima é uma enzima vegetal capaz de degradar paredes das células fúngicas.
Em alguns casos, a enzima degradante das paredes celulares tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima vegetal capaz de degradar paredes das células fúngicas.
Em alguns casos, a enzima é uma enzima protozoária capaz de degradar paredes das células fúngicas.
Em alguns casos, a enzima degradante das paredes celulares tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima protozoária capaz de degradar paredes das células fúngicas.
Em alguns casos, a enzima é uma enzima animal capaz de degradar a matriz extracelular animal (por exemplo, matriz extracelular de mamífero, por exemplo, matriz extracelular humana). Em alguns casos, a enzima é uma celulase.
Por exemplo, a celulase pode ter pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma celulase bacteriana.
Em alguns casos, a celulase tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma celulase fúngica.
Em alguns casos, a celulase tem pelo menos 30%, 40%, 50%,
60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção de uma celulase protozoária.
Em alguns casos, o agente de penetração de células é um detergente.
Em algumas modalidades, o detergente é saponina ou 3- [(3-Colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanossulfonato (CHAPS). Em alguns casos, o agente de penetração de paredes celulares é um líquido iônico.
Em algumas modalidades, o líquido iônico é Acetato de 1-etil-3-metilimidazólio (acetato de EMIM). Em outras modalidades, o líquido iônico é acetato de BMIM, acetato de HMIM, acetato de MMIM ou acetato de AlilMIM.
Em alguns casos, o agente de penetração de células é um líquido fluorado.
Em algumas modalidades, o líquido fluorado é perfluoro-octano.
Em outras modalidades, o líquido fluorado é perfluoro- hexano ou perfluoro(metildecalina). Em alguns casos, o agente de penetração de células é um lipídeo catiônico.
Em algumas modalidades, o lipídeo catiônico é DC- colesterol ou dioleoil-3-trimetilamônio propano (DOTAP). Em alguns casos, o agente de penetração de células é um lipídeo ionizável.
Em algumas modalidades, o lipídeo ionizável é 1,1‘- ((2-(4-(2-((2-(bis(2-hidroxidodecil)amino)etil)(2- hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1-il)etil)azanedi-il)bis(dodecan-2-ol) (C12-200) ou 4-(Dimetilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)- heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ila, DLin-MC3-DMA (MC3). Em alguns casos, os PMPs compreendem pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais do que 90% de lipídeo ionizável (por exemplo, C12-200 ou MC3). Em alguns casos, o agente de penetração de células é um lipídeo zwitteriônico.
Em algumas modalidades, o lipídeo zwitteriônico é 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DOPC) ou 1,2-dierucoil-sn- glicero-3-fosfocolina (DEPC). Em alguns casos, os PMPs compreendem pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais do que 90% de lipídeo zwitteriônico (por exemplo, DOPC ou DEPC). O agente pode aumentar a captação do PMP como um todo ou pode aumentar a captação de uma porção ou componente do PMP, tal como um agente funcional heterólogo (por exemplo, um agente agrícola heterólogo (por exemplo, agente pesticida, agente fertilizante, agente herbicida, agente modificador das plantas) ou um agente terapêutico heterólogo (por exemplo, um agente antifúngico, um agente antibacteriano, um agente virucida, um agente antiviral, um agente inseticida, um agente nematicida, um agente antiparasitário ou um repelente de insetos)) transportado pelo PMP.
O grau ao qual a captação celular (por exemplo, captação celular vegetal, captação celular bacteriana ou captação celular fúngica) é aumentada pode variar dependendo da planta ou parte da planta para a qual a composição é entregue, a formulação de PMP e outras modificações feitas ao PMP.
Por exemplo, os PMPs modificados podem ter uma captação celular (por exemplo, captação celular animal, captação celular vegetal, captação celular bacteriana ou captação celular fúngica) aumentada de pelo menos 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100% em relação a um PMP não modificado.
Em alguns casos, a captação celular (por exemplo, captação celular animal, captação celular vegetal, captação celular bacteriana ou captação celular fúngica) aumentada é uma captação celular aumentada de pelo menos 2x vezes, 4x vezes, 5x vezes, 10x vezes, 100x vezes ou 1000x vezes em relação a um PMP não modificado.
Em outro aspecto, os PMPs podem ser modificados com outros componentes (por exemplo, lipídeos, por exemplo, esteróis, por exemplo, colesterol; ou moléculas pequenas) para alterar adicionalmente as características funcionais e estruturais do PMP.
Por exemplo, os PMPs podem ser adicionalmente modificados com moléculas de estabilização que aumentam a estabilidade dos PMPs (por exemplo, durante pelo menos um dia à temperatura ambiente e/ou estável durante pelo menos uma semana a 4 °C). A captação celular dos PMPs modificados pode ser medida por uma variedade de métodos conhecidos na técnica.
Por exemplo, os PMPs, ou um seu componente, podem ser marcados com um marcador (por exemplo, um marcador fluorescente) que pode ser detectado em células isoladas para confirmar a captação.
Por exemplo, a captação celular pode ser detectada com base em medidas de aptidão, por exemplo, aptidão de um animal, planta, bactéria ou fungo compreendendo a célula tratada.
Por exemplo, a eficácia das presentes composições e métodos pode ser determinada por comparação de mudanças de aptidão em organismos tratados com os PMPs presentemente modificados em relação ao tratamento de composições carecendo de PMPs modificados.
C.
Marcadores de EV da Planta Os PMPs das presentes composições e métodos podem ter uma gama de marcadores que identificam os PMPs como sendo produzidos usando uma EV da planta e/ou incluindo um seu segmento, porção ou extrato.
Como usado aqui, o termo “marcador de EV da planta” se refere a um componente que está naturalmente associado a uma planta e incorporado na ou sobre a EV da planta in planta, tal como uma proteína de planta, um ácido nucleico de planta, uma molécula pequena de planta, um lipídeo de planta ou uma sua combinação.
Exemplos de marcadores de EV da planta podem ser encontrados, por exemplo, em Rutter e Innes, Plant Physiol. 173 (1): 728-741, 2017; Raimondo et al., Oncotarget. 6 (23): 19514, 2015; Ju et al., Mol.
Therapy. 21 (7): 1345-1357, 2013; Wang et al., Molecular Therapy. 22 (3): 522-534, 2014; e Regente et al., J of Exp.
Biol. 68 (20): 5485-5496,
2017; cada um dos quais é incorporado aqui por referência.
Exemplos adicionais de marcadores de EV da planta estão listados no Apêndice e são adicionalmente delineados aqui.
Em alguns casos, o marcador de EV da planta pode incluir um lipídeo de planta.
Exemplos de marcadores de lipídeos de planta que podem ser encontrados nos PMPs incluem fitosterol, campesterol, β-sitosterol, estigmasterol, avenasterol, glicosil inositol fosforil ceramidas (GIPCs), glicolipídeos (por exemplo, monogalactosildiacilglicerol (MGDG) ou digalactosildiacilglicerol (DGDG)) ou uma sua combinação.
Por exemplo, o PMP pode incluir GIPCs, que representam a principal classe de esfingolipídeos em plantas e são um dos lipídeos de membrana mais abundantes em plantas.
Outros marcadores de EV da planta podem incluir lipídeos que se acumulam em plantas em resposta a estressores abióticos ou bióticos (por exemplo, infeção bacteriana ou fúngica), tais como ácido fosfatídico (PA) ou fosfatidilinositol-4-fosfato (PI4P). Alternativamente, o marcador de EV da planta pode incluir uma proteína de planta.
Em alguns casos, o marcador de EV da planta de proteína pode ser uma proteína antimicrobiana naturalmente produzida pelas plantas, incluindo proteínas de defesa que as plantas secretam em resposta a estressores abióticos ou bióticos (por exemplo, infeção bacteriana ou fúngica). As proteínas de defesa de patógenos de plantas incluem proteínas receptoras de proteínas de associação a fatores sensíveis a N -etilmalemida (SNARE) (por exemplo, Sintaxina- 121 (SYP121; No. de Acesso do GenBank: NP_187788.1 ou NP_974288.1), Penetração1 (PEN1; No. de Acesso do GenBank: NP_567462.1)) ou Penetração3 do transportador ABC (PEN3; No. de Acesso do GenBank: NP_191283.2). Outros exemplos de marcadores de EV da planta incluem proteínas que facilitam o transporte de longa distância de RNA em plantas, incluindo proteínas do floema (por exemplo, Proteína do floema 2-A1 (PP2-A1), No. de Acesso do GenBank: NP_193719.1), proteínas de ligação a lipídeos dependentes de cálcio ou lectinas (por exemplo, lectinas relacionadas com Jacalina, por exemplo, jacalina de Helianthus annuus (Helja; GenBank: AHZ86978.1). Por exemplo, a proteína de ligação a RNA pode ser Proteína-7 de Ligação a RNA Rica em Glicina (GRP7; Número de Acesso do GenBank: NP_179760.1). Adicionalmente, as proteínas que regulam a função dos plasmodesmos podem em alguns casos ser encontradas em EVs da planta, incluindo proteínas tais como Synap- Totgamina A A (No. de Acesso do GenBank: NP_565495.1). Em alguns casos, o marcador de EV da planta pode incluir uma proteína envolvida no metabolismo de lipídeos, tais como fosfolipase C ou fosfolipase D.
Em alguns casos, o marcador de EV de proteína de planta é uma proteína de tráfego celular em plantas.
Em certos casos onde o marcador de EV da planta é uma proteína, o marcador de proteína pode não ter um peptídeo sinal que está tipicamente associado a proteínas secretadas.
As proteínas secretoras não convencionais parecem partilhar várias características comuns como (i) ausência de uma sequência líder, (ii) ausência de modificações pós-translacionais (PTMs) específicas de ER ou aparelho de Golgi e/ou (iii) secreção não afetada pela brefeldina A que bloqueia a via de secreção clássica dependente de ER/Golgi.
Um perito na técnica pode usar uma variedade de ferramentas livremente acessíveis ao público (por exemplo, Base de Dados SecretomeP; SUBA3 (SUBcellular localization database for Arabidopsis proteins)) para se avaliar uma proteína quanto a uma sequência sinal ou sua ausência.
Nos casos onde o marcador de EV da planta é uma proteína, a proteína pode ter uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequências com um marcador de EV da planta, tal como qualquer um dos marcadores de EV da planta listados no Apêndice.
Por exemplo, a proteína pode ter uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequências com PEN1 de Arabidopsis thaliana (Número de Acesso do GenBank: NP_567462.1). Em alguns casos, o marcador de EV da planta inclui um ácido nucleico codificado em plantas, por exemplo, um RNA de planta, um DNA de planta ou um PNA de planta.
Por exemplo, o PMP pode incluir dsRNA, mRNA, um RNA viral, um microRNA (miRNA) ou um pequeno RNA de interferência (siRNA) codificado por uma planta.
Em alguns casos, o ácido nucleico pode ser um que esteja associado a uma proteína que facilite o transporte de longa distância de RNA em plantas, como discutido aqui.
Em alguns casos, o marcador de EV da planta de ácido nucleico pode ser um envolvido no silenciamento gênico induzido pelo hospedeiro (HIGS), que é o processo pelo qual as plantas silenciam os transcritos estranhos de pragas de plantas (por exemplo, patógenos tais como fungos). Por exemplo, o ácido nucleico pode ser um que silencie genes bacterianos ou fúngicos.
Em alguns casos, o ácido nucleico pode ser um microRNA, tal como miR159 ou miR166, que visa genes em um patógeno fúngico (por exemplo, Verticillium dahliae). Em alguns casos, a proteína pode ser uma envolvida no transporte de compostos de defesa de plantas, tais como proteínas envolvidas no transporte e metabolismo de glucosinolato (GSL), incluindo Transportador de Glucosinolato-1 -1 (GTR1; No. de Acesso do GenBank: NP_566896.2), Transportador de Glucosinolato-2 (GTR2; NP_201074.1) ou Modificador Epitioespecífico 1 (ESM1; NP_188037.1). Nos casos onde o marcador de EV da planta é um ácido nucleico, o ácido nucleico pode ter uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%,
80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequências com um marcador de EV da planta, por exemplo, tal como aqueles codificando os marcadores de EV da planta listados no Apêndice.
Por exemplo, o ácido nucleico pode ter uma sequência de polinucleotídeos tendo pelo menos 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequências com miR159 ou miR166. Em alguns casos, o marcador de EV da planta inclui um composto produzido pelas plantas.
Por exemplo, o composto pode ser um composto de defesa produzido em resposta a estressores abióticos ou bióticos, tais como metabolitos secundários.
Um tal metabolito secundário que é encontrado em PMPs são os glucosinolatos (GSLs), que são metabolitos secundários contendo nitrogênio e enxofre encontrados maioritariamente em plantas Brassicaceae.
Outros metabolitos secundários podem incluir aleloquímicos.
Em alguns casos, os PMPs podem ser também identificados como sendo produzidos usando uma EV da planta com base na ausência de certos marcadores (por exemplo, lipídeos, polipeptídeos ou polinucleotídeos) que não são tipicamente produzidos por plantas, mas estão geralmente associados a outros organismos (por exemplo, marcadores de EVs animais, EVs bacterianas ou EVs fúngicas). Por exemplo, em alguns casos, o PMP não tem lipídeos tipicamente encontrados em EVs animais, EVs bacterianas ou EVs fúngicas.
Em alguns casos, o PMP não tem lipídeos típicos de EVs animais (por exemplo, esfingomielina). Em alguns casos, o PMP não contém lipídeos típicos de EVs bacterianas ou membranas bacterianas (por exemplo, LPS). Em alguns casos, o PMP não tem lipídeos típicos de membranas fúngicas (por exemplo, ergosterol). Os marcadores de EV da planta podem ser identificados usando quaisquer abordagens conhecidas na técnica que permitam a identificação de moléculas pequenas (por exemplo, espectroscopia de massa, espectrometria de massa), lipídeos (por exemplo, espectroscopia de massa, espectrometria de massa), proteínas (por exemplo, espectroscopia de massa, imunotransferência) ou ácidos nucleicos (por exemplo, análise de PCR). Em alguns casos, uma composição de PMP descrita aqui inclui uma quantidade detectável, por exemplo, uma quantidade limiar pré-determinada, de um marcador de EV da planta descrito aqui.
D.
Carga de Agentes Os PMPs podem ser modificados para incluírem um agente funcional heterólogo, por exemplo, um agente de penetração de células e/ou um agente agrícola heterólogo (por exemplo, agente pesticida, agente fertilizante, agente herbicida, agente modificador das plantas), um agente terapêutico heterólogo (por exemplo, um agente antifúngico, um agente antibacteriano, um agente virucida, um agente antiviral, um agente inseticida, um agente nematicida, um agente antiparasitário ou um repelente de insetos)), tal como aqueles descritos aqui.
Os PMPs podem transportar ou se associar a tais agentes por uma variedade de meios para permitir a entrega do agente a um organismo alvo (por exemplo, um animal, planta, bactéria ou fungo alvo), por exemplo, por encapsulação do agente, incorporação do componente na estrutura em bicamada de lipídeos ou associação do componente (por exemplo, por conjugação) à superfície da estrutura em bicamada de lipídeos do PMP.
Em alguns casos, o agente funcional heterólogo (por exemplo, agente de penetração de células) está incluído na formulação de PMP, como descrito na Seção IB aqui.
O agente funcional heterólogo pode ser incorporado ou carregado nos ou sobre os PMPs por quaisquer métodos conhecidos na técnica que permitam a associação, diretamente ou indiretamente, entre os PMPs e o agente.
Os agentes funcionais heterólogos podem ser incorporados nos PMPs por um método in vivo (por exemplo, in planta, por exemplo, através da produção de PMPs a partir de uma planta transgênica que compreende o agente heterólogo) ou in vitro (por exemplo, em cultura de tecidos ou em cultura de células) ou métodos tanto in vivo como in vitro.
Em casos onde os PMPs são carregados com um agente funcional heterólogo (por exemplo, um agente agrícola heterólogo (por exemplo, agente pesticida, agente fertilizante, agente herbicida, agente modificador das plantas) ou um agente terapêutico heterólogo (por exemplo, um agente antifúngico, um agente antibacteriano, um agente virucida, um agente antiviral, um agente inseticida, um agente nematicida, um agente antiparasitário ou um repelente de insetos)) in vivo, os PMPs podem ser produzidos usando EVs, ou um seu segmento ou porções, ou um extrato contendo EVs que foi carregado in planta.
Os métodos in planta incluem expressão do agente funcional heterólogo (por exemplo, um agente agrícola heterólogo (por exemplo, agente pesticida, agente fertilizante, agente herbicida, agente modificador das plantas) ou um agente terapêutico heterólogo (por exemplo, um agente antifúngico, um agente antibacteriano, um agente virucida, um agente antiviral, um agente inseticida, um agente nematicida, um agente antiparasitário ou um repelente de insetos)) em uma planta que foi geneticamente modificada para expressar o agente funcional heterólogo para carga em EVs.
Em alguns casos, o agente funcional heterólogo é exógeno à planta.
Alternativamente, o agente funcional heterólogo pode ser naturalmente encontrado na planta, mas manipulado para ser expresso a um nível elevado em relação ao nível daquele encontrado em uma planta não geneticamente modificada.
Em alguns casos, os PMPs podem ser carregados in vitro.
A substância pode ser carregada sobre os ou nos (por exemplo, pode ser encapsulada pelos) PMPs usando, mas não se limitando a, métodos físicos, químicos e/ou biológicos (por exemplo, em cultura de tecidos ou em cultura de células). Por exemplo, o agente funcional heterólogo pode ser introduzido em PMPs por uma ou mais de eletroporação, sonicação, difusão passiva, agitação, extração de lipídeos ou extrusão.
Os PMPs carregados podem ser avaliados para se confirmar a presença ou nível do agente carregado usando uma variedade de métodos, tais como HPLC (por exemplo, para se avaliarem moléculas pequenas); imunotransferência (por exemplo, para se avaliarem proteínas); e/ou PCR quantitativa (por exemplo, para se avaliarem nucleotídeos). No entanto deve ser apreciado pelos peritos na técnica que a carga de uma substância de interesse em PMPs não está limitada aos métodos ilustrados acima.
Em alguns casos, o agente funcional heterólogo pode ser conjugado ao PMP, no qual o agente funcional heterólogo está conectado ou unido, indiretamente ou diretamente, ao PMP.
Por exemplo, um ou mais agentes heterólogos funcionais podem ser quimicamente ligados a um PMP, tal que o um ou mais agentes funcionais heterólogos sejam unidos (por exemplo, por ligações covalentes ou iônicas) diretamente à bicamada de lipídeos do PMP.
Em alguns casos, a conjugação de vários agentes funcionais heterólogos aos PMPs pode ser alcança por mistura em primeiro lugar do um ou mais agentes funcionais heterólogos com um agente de reticulação apropriado (por exemplo, N-etilcarbo-di-imida (“EDC”), que é geralmente utilizado como um agente de ativação de carboxila para ligação de amida com aminas primárias e também reage com grupos fosfato) em um solvente adequado.
Após um período de incubação suficiente para permitir que o agente funcional heterólogo se anexe ao agente de reticulação, a mistura de agente de reticulação/agente funcional heterólogo pode ser depois combinada com os PMPs e, após outro período de incubação, sujeita a um gradiente de sacarose (por exemplo, gradiente de sacarose a 8, 30, 45 e 60%) para separar o agente funcional heterólogo livre e os PMPs livres dos agentes funcionais heterólogos conjugados aos PMPs.
Como parte da combinação da mistura com um gradiente de sacarose, e um passo de centrifugação acompanhante, os PMPs conjugados aos agentes funcionais heterólogos são depois vistos como uma banda no gradiente de sacarose, tal que os PMPs conjugados possam ser depois coletados, lavados e dissolvidos em uma solução adequada para uso como descrito aqui.
Em alguns casos, os PMPs estão estavelmente associados ao agente funcional heterólogo antes da e após entrega do PMP, por exemplo, a uma planta.
Em outros casos, os PMPs estão associados ao agente funcional heterólogo tal que o agente funcional heterólogo se torne dissociado dos PMPs após entrega do PMP, por exemplo, a uma planta.
Os PMPs podem ser carregados ou a composição de PMP pode ser formulada com várias concentrações do agente funcional heterólogo, dependendo do agente ou uso particular.
Por exemplo, em alguns casos, os PMPs são carregados ou a composição de PMP é formulada tal que a composição de PMP divulgada aqui inclua cerca de 0,001, 0,01, 0,1, 1,0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 95 (ou qualquer gama entre cerca de 0,001 e 95) ou mais % em peso de um agente funcional heterólogo.
Em alguns casos, os PMPs são carregados ou a composição de PMP é formulada tal que a composição de PMP inclua cerca de 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1,0, 0,1, 0,01, 0,001 (ou qualquer gama entre cerca de 95 e 0,001) ou menos % em peso de um agente funcional heterólogo.
Por exemplo, a composição de PMP pode incluir cerca de 0,001 a cerca de 0,01% em peso, cerca de 0,01 a cerca de 0,1% em peso, cerca de 0,1 a cerca de 1% em peso, cerca de 1 a cerca de 5%
em peso ou cerca de 5 a cerca de 10% em peso, cerca de 10 a cerca de 20% em peso do agente funcional heterólogo.
Em alguns casos, o PMP pode ser carregado ou a composição de PMP é formulada com cerca de 1, 5, 10, 50, 100, 200 ou 500, 1.000, 2.000 (ou qualquer gama entre cerca de 1 e 2.000) ou mais μg/mL de um agente funcional heterólogo.
Um PMP da invenção pode ser carregado ou uma composição de PMP pode ser formulada com cerca de 2.000, 1.000, 500, 200, 100, 50, 10, 5, 1 (ou qualquer gama entre cerca de 2.000 e 1) ou menos μg/mL de um agente funcional heterólogo.
Em alguns casos, os PMPs são carregados ou a composição de PMP é formulada tal que a composição de PMP divulgada aqui inclua pelo menos 0,001% em peso, pelo menos 0,01% em peso, pelo menos 0,1% em peso, pelo menos 1,0% em peso, pelo menos 2% em peso, pelo menos 3% em peso, pelo menos 4% em peso, pelo menos 5% em peso, pelo menos 6% em peso, pelo menos 7% em peso, pelo menos 8% em peso, pelo menos 9% em peso, pelo menos 10% em peso, pelo menos 15% em peso, pelo menos 20% em peso, pelo menos 30% em peso, pelo menos 40% em peso, pelo menos 50% em peso, pelo menos 60% em peso, pelo menos 70% em peso, pelo menos 80% em peso, pelo menos 90% em peso ou pelo menos 95% em peso de um agente funcional heterólogo.
Em alguns casos, o PMP pode ser carregado ou a composição de PMP pode ser formulada com pelo menos 1 μg/mL, pelo menos 5 μg/mL, pelo menos 10 μg/mL, pelo menos 50 μg/mL, pelo menos 100 μg/mL, pelo menos 200 μg/mL, pelo menos 500 μg/mL, pelo menos 1.000 μg/mL, pelo menos 2.000 μg/mL de um agente funcional heterólogo.
Em alguns casos, a composição de PMP é formulada com o agente funcional heterólogo por suspensão dos PMPs em uma solução compreendendo o ou consistindo no agente funcional heterólogo, por exemplo, suspensão ou ressuspensão dos PMPs por mistura vigorosa.
O agente funcional heterólogo (por exemplo, agente de penetração de células, por exemplo, enzima, detergente, líquido iônico, fluorado ou zwitteriônico ou lipídeo) pode compreender, por exemplo, menos do que 1% ou pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% da solução.
Exemplos de agentes funcionais heterólogos adicionais que podem ser carregados nos PMPs são adicionalmente delineados na seção intitulada “Agentes Funcionais Heterólogos”. E.
Potencial Zeta A composição de PMP pode ter, por exemplo, um potencial zeta de mais do que -30 mV quando na ausência de carga, mais do que -20 mV, mais do que -5 mV, mais do que 0 mV ou cerca de 30 mv quando na ausência de carga.
Em alguns exemplos, a composição de PMP tem um potencial zeta negativo, por exemplo, um potencial zeta de menos do que 0 mV, menos do que -10 mV, menos do que -20 mV, menos do que -30 mV, menos do que -40 mV ou menos do que -50 mV quando na ausência de carga.
Em alguns exemplos, a composição de PMP tem um potencial zeta positivo, por exemplo, um potencial zeta de mais do que 0 mV, mais do que 10 mV, mais do que 20 mV, mais do que 30 mV, mais do que 40 mV ou mais do que 50 mV quando na ausência de carga.
Em alguns exemplos, a composição de PMP tem um potencial zeta de cerca de 0. O potencial zeta da composição de PMP pode ser medido usando qualquer método conhecido na técnica.
Os potenciais zeta são geralmente medidos indiretamente, por exemplo, calculados usando modelos teóricos a partir dos dados obtidos usando métodos e técnicas conhecidos na técnica, por exemplo, mobilidade eletroforética ou mobilidade eletroforética dinâmica.
A mobilidade eletroforética é tipicamente medida usando microeletroforese, dispersão de luz eletroforética ou detecção de pulso resistivo ajustável.
A dispersão de luz eletroforética é baseada na dispersão de luz dinâmica.
Tipicamente, os potenciais zeta são acessíveis a partir de medições de dispersão de luz dinâmica (DLS), também conhecida como espectroscopia de correlação de fótons ou dispersão de luz quase-elástica.
F.
Formulações i.
Formulações Agrícolas Para permitir facilidade de aplicação, manuseamento, transporte, armazenamento e atividade efetiva, os PMPs (por exemplo, PMPs modificados como descrito aqui) podem ser formulados com outras substâncias.
Os PMPs podem ser formulados em, por exemplo, iscas, emulsões concentradas, pós, concentrados emulsificáveis, fumigantes, géis, grânulos, microencapsulações, tratamentos de sementes, concentrados em suspensão, suspoemulsões, comprimidos, líquidos solúveis em água, grânulos dispersíveis em água ou fluidos secos, pós molháveis e soluções de volume ultrabaixo.
Para informação adicional sobre tipos de formulação ver ”Catalogue of Pesticide Formulation Types and International Coding System” Monografia Técnica n° 2, 5ª Edição pela CropLife International (2002). As composições de PMP podem ser aplicadas como suspensões ou emulsões aquosas preparadas a partir de formulações concentradas de tais agentes.
Tais formulações solúveis em água, suspensíveis em água ou emulsificáveis são sólidos, usualmente conhecidos como pós molháveis, ou grânulos dispersíveis em água, ou líquidos usualmente conhecidos como concentrados emulsificáveis, ou suspensões aquosas.
Os pós molháveis, que podem ser compactados para formar grânulos dispersíveis em água, compreendem uma mistura íntima da composição de PMP, um transportador e tensoativos.
O transportador é usualmente selecionado de entre as argilas de atapulgita, as argilas de montmorilonita, as terras diatomáceas ou os silicatos purificados.
Tensoativos eficazes, incluindo de cerca de 0,5%
a cerca de 10% do pó molhável, são encontrados entre ligninas sulfonadas, naftalenossulfonatos condensados, naftalenossulfonatos, alquilbenzenossulfonatos, sulfatos de alquila e tensoativos não iônicos tais como adutos de óxido de etileno de fenóis de alquila.
Os concentrados emulsificáveis podem compreender uma concentração adequada de PMPs, tal como de cerca de 50 a cerca de 500 gramas por litro de líquido dissolvido em um transportador que é um solvente miscível em água ou uma mistura de solvente orgânico imiscível em água e emulsificantes.
Solventes orgânicos úteis incluem aromáticos, especialmente xilenos e frações de petróleo, especialmente as porções naftalênicas e olefínicas de elevado ponto de ebulição do petróleo tais como nafta aromática pesada.
Outros solventes orgânicos podem ser também usados, tais como os solventes terpênicos incluindo derivados de colofónia, cetonas alifáticas tais como ciclo-hexanona e álcoois complexos tais como 2-etoxietanol.
Emulsificantes adequados para concentrados emulsificáveis são selecionados de tensoativos aniônicos e não iônicos convencionais.
As suspensões aquosas compreendem suspensões de composições de PMP insolúveis em água dispersos em um transportador aquoso a uma concentração na gama de cerca de 5% a cerca de 50% em peso.
As suspensões são preparadas por trituração fina da composição e sua mistura vigorosa em um transportador compreendido por água e tensoativos.
Ingredientes, tais como sais inorgânicos e gomas sintéticas ou naturais, podem ser também adicionados, para aumentar a densidade e viscosidade do transportador aquoso.
As composições de PMP podem ser também aplicadas como composições granulares que são particularmente úteis para aplicações ao solo.
As composições granulares contêm usualmente de cerca de 0,5% a cerca de 10% em peso da composição de PMP, disperso em um transportador que compreende argila ou uma substância similar.
Tais composições são usualmente preparadas por dissolução da formulação em um solvente adequado e sua aplicação a um transportador granular que foi pré-formado com o tamanho das partículas apropriado, na gama de cerca de 0,5 a cerca de 3 mm.
Tais composições podem ser também formuladas por preparação de uma massa ou pasta do transportador e composto e esmagamento e secagem para se obter o tamanho das partículas granulares desejado.
As poeiras contendo a presente formulação de PMP são preparados por mistura íntima dos PMPs na forma de pó com um transportador agrícola empoeirado adequado, tal como argila de caulim, rocha vulcânica moída e similares.
As poeiras podem conter adequadamente de cerca de 1% a cerca de 10% dos pacotes.
Podem ser aplicadas como uma cobertura de sementes ou como uma aplicação de folhagem com uma máquina sopradora de poeiras.
É igualmente prático aplicar a presente formulação na forma de uma solução em um solvente orgânico apropriado, usualmente óleo de petróleo, tal como os óleos de pulverização, que são amplamente usados na química agrícola.
Os PMPs podem ser também aplicados na forma de uma composição de aerossol.
Em tais composições, os pacotes são dissolvidos ou dispersos em um transportador, que é uma mistura de propulsor geradora de pressão.
A composição de aerossol é embalada em um recipiente a partir do qual a mistura é dispensada através de uma válvula de atomização.
Outra modalidade é uma emulsão de óleo-em-água, em que a emulsão compreende glóbulos oleosos que são cada um proporcionados com um revestimento de cristal líquido lamelar e são dispersos em uma fase aquosa, em que cada glóbulo oleoso compreende pelo menos um composto que é agricolamente ativo, e é individualmente revestido com uma camada monolamelar ou oligolamelar incluindo: (1) pelo menos um agente tensoativo lipofílico não iônico, (2) pelo menos um agente tensoativo hidrofílico não iônico e (3) pelo menos um agente tensoativo iônico, em que os glóbulos têm um diâmetro médio das partículas de menos do que 800 nanômetros.
Informação adicional sobre a modalidade é divulgada na publicação de patente dos E.U.A. 20070027034 publicada a 1 de fev., 2007. Para facilidade de uso, esta modalidade será referida como “OIWE”. Adicionalmente, geralmente, quando as moléculas divulgadas acima são usadas em uma formulação, tal formulação pode também conter outros componentes.
Estes componentes incluem, mas não estão limitados a, (esta é uma lista não exaustiva e não mutuamente exclusiva) molhantes, propagadores, adesivos, penetrantes, tampões, agentes sequestrantes, agentes de redução da deriva, agentes de compatibilidade, agentes antiespumantes, agentes de limpeza e emulsificantes.
Alguns componentes são descritos de seguida.
Um agente molhante é uma substância que quando adicionada a um líquido aumenta o poder de propagação ou penetração do líquido por redução da tensão interfacial entre o líquido e a superfície na qual está se propagando.
Os agentes molhantes são usados para duas funções principais nas formulações agroquímicas: durante o processamento e fabricação para aumentar a taxa de molhagem dos pós em água para fazer concentrados para líquidos solúveis ou concentrados em suspensão; e durante a mistura de um produto com água em um tanque de pulverização para reduzir o tempo de molhagem de pós molháveis e para melhorar a penetração de água em grânulos dispersíveis em água.
Exemplos de agentes molhantes usados em formulações de pós molháveis, concentrado em suspensão e grânulos dispersíveis em água são: lauril sulfato de sódio; sulfossuccinato de dioctila de sódio; etoxilatos de fenol de alquila; e etoxilatos de álcool alifático.
Um agente dispersante é uma substância que se adsorve na superfície das partículas e ajuda a preservar o estado de dispersão das partículas e previna que elas se reagreguem.
Os agentes dispersantes são adicionados às formulações agroquímicas para facilitar a dispersão e suspensão durante a fabricação e para assegurar que as partículas se redispersem na água em um tanque de pulverização.
São amplamente usados em pós molháveis, concentrados em suspensão e grânulos dispersíveis em água.
Os tensoativos que são usados como agentes dispersantes têm a capacidade de se adsorver fortemente na superfície de uma partícula e proporcionar uma barreira carregada ou estérica para a reagregação de partículas.
Os tensoativos mais comummente usados são aniônicos, não iônicos ou misturas dos dois tipos.
Para formulações de pós molháveis, os agentes dispersantes mais comuns são lignossulfonatos de sódio.
Para concentrados em suspensão, adsorção e estabilização muito boas são obtidas usando polieletrólitos, tais como condensados de formaldeído de naftalenossulfonato de sódio.
Ésteres de fosfato de etoxilato de tristirilfenol são também usados.
Não iônicos tais como condensados de óxido de alquilariletileno e copolímeros em bloco de EO-PO, são por vezes combinados com aniônicos como agentes dispersantes para concentrados em suspensão.
Nos últimos anos, novos tipos de tensoativos poliméricos de peso molecular muito elevado foram desenvolvidos como agentes dispersantes.
Estes têm “esqueletos” hidrofóbicos muito longos e um grande número de cadeias de óxido de etileno formando os “dentes” de um tensoativo em “pente”. Estes polímeros de peso molecular elevado podem dar estabilidade a longo prazo muito boa aos concentrados em suspensão porque os esqueletos hidrofóbicos têm muitos pontos de ancoragem nas superfícies das partículas.
Exemplos de agentes dispersantes usados em formulações agroquímicas são: lignossulfonatos de sódio; condensados de formaldeído de naftalenossulfonato de sódio; ésteres de fosfato de etoxilato de tristirilfenol; etoxilatos de álcool alifático; etoxilatos de alquila; copolímeros em bloco de EO-PO (óxido de etileno - óxido de propileno); e copolímeros de enxerto.
Um agente emulsificante é uma substância que estabiliza uma suspensão de gotículas de uma fase líquida em outra fase líquida.
Sem o agente emulsificante, os dois líquidos se separariam em duas fases líquidas imiscíveis.
As combinações de emulsificantes mais comummente usadas contêm alquilfenol ou álcool alifático com doze ou mais unidades de óxido de etileno e o sal de cálcio solúvel em óleo do ácido dodecilbenzenossulfônico.
Uma gama de valores de equilíbrio hidrófilo-lipófilo (“HLB”) de 8 a 18 irá normalmente proporcionar boas emulsões estáveis.
A estabilidade da emulsão pode por vezes ser melhorada pela adição de uma pequena quantidade de um tensoativo de copolímero em bloco de EO-PO.
Um agente solubilizante é um tensoativo que formará micélios em água a concentrações acima da concentração micelar crítica.
Os micélios são depois capazes de dissolver ou solubilizar materiais insolúveis em água dentro da parte hidrofóbica do micélio.
Os tipos de tensoativos usualmente usados para solubilização são não iônicos, mono-oleatos de sorbitana, etoxilatos de mono-oleato de sorbitana e ésteres de oleato de metila.
Os tensoativos são por vezes usados, sozinhos ou com outros aditivos tais como óleos minerais ou vegetais, como adjuvantes para misturas em tanque de pulverização para melhorar o desempenho biológico da composição de PMP no alvo.
Os tipos de tensoativos usados para biointensificação dependem geralmente da natureza e modo de ação da composição de PMP.
No entanto são frequentemente não iônicos tais como: etoxilatos de alquila; etoxilatos de álcool alifático lineares; etoxilatos de amina alifática.
Um transportador ou diluente em uma formulação agrícola é um material adicionado à composição de PMP para dar um produto da resistência requerida.
Os transportadores são usualmente materiais com elevadas capacidades de captação, enquanto os diluentes são usualmente materiais com baixas capacidades de captação.
Os transportadores e diluentes são usados na formulação de poeiras, pós molháveis, grânulos e grânulos dispersíveis em água.
Os solventes orgânicos são usados maioritariamente na formulação de concentrados emulsificáveis, emulsões óleo-em-água, suspoemulsões e formulações de volume ultrabaixo e, em menor extensão, formulações granulares.
Por vezes são usadas misturas de solventes.
Os primeiros grupos principais de solventes são óleos parafínicos alifáticos tais como querosene ou parafinas refinadas.
O segundo grupo principal (e o mais comum) compreende os solventes aromáticos tais como xileno e frações de peso molecular mais elevado de solventes aromáticos C9 e C10. Os hidrocarbonetos clorados são úteis como cossolventes para prevenir a cristalização de composição de PMP quando a formulação é emulsificada em água.
Os álcoois são por vezes usados como cossolventes para aumentar o poder do solvente.
Outros solventes podem incluir óleos vegetais, óleos de sementes e ésteres de óleos vegetais e de sementes.
Os espessantes ou agentes gelificantes são usados maioritariamente na formulação de concentrados em suspensão, emulsões e suspoemulsões para modificar a reologia ou propriedades de fluxo do líquido e para prevenir a separação e sedimentação das partículas ou gotículas dispersas.
Os agentes espessantes, gelificantes e antissedimentação se enquadram geralmente em duas categorias, nomeadamente, particulados insolúveis em água e polímeros solúveis em água.
É possível produzir formulações de concentrado em suspensão usando argilas e sílicas.
Exemplos destes tipos de materiais incluem, mas não estão limitados a, montmorilonita, bentonita, silicato de alumínio e magnésio e atapulgita.
Polissacarídeos solúveis em água têm sido usados como agentes espessantes-gelificantes por muitos anos.
Os tipos de polissacarídeos mais comummente usados são extratos naturais de sementes e algas marinhas ou são derivados sintéticos da celulose.
Exemplos destes tipos de materiais incluem, mas não estão limitados a, goma-guar; goma de alfarroba; carragenina; alginatos; celulose de metila; carboximetilcelulose de sódio (SCMC); celulose de hidroxietila (HEC). Outros tipos de agentes antissedimentação são baseados em amidos modificados, poliacrilatos, álcool de polivinila e óxido de polietileno.
Outro bom agente antissedimentação é goma-xantana.
Os microrganismos podem causar deterioração dos produtos formulados.
Portanto são usados agentes de preservação para eliminar ou reduzir seu efeito.
Exemplos de tais agentes incluem, mas não estão limitados a: ácido propiônico e seu sal de sódio; ácido sórbico e seus sais de sódio ou potássio; ácido benzoico e seu sal de sódio; sal de sódio do ácido p-hidroxibenzoico; p-hidroxibenzoato de metilo; e 1,2- benzisotiazolin-3-ona (BIT). A presença de tensoativos faz frequentemente com que as formulações à base de água formem espuma durante as operações de mistura na produção e na aplicação através de um tanque de pulverização.
De modo a se reduzir a tendência para a formação de espuma são frequentemente adicionados agentes antiespumantes durante a etapa de produção ou antes do enchimento em garrafas.
Geralmente existem dois tipos de agentes antiespumantes, nomeadamente silicones e não silicones.
Os silicones são geralmente emulsões aquosas de polissiloxano de dimetila, enquanto os agentes antiespumantes não silicone são óleos insolúveis em água, tais como octanol e nonanol, ou sílica.
Em ambos os casos, a função do agente antiespumante é deslocar o tensoativo da interface ar-água.
Agentes “verdes” (por exemplo, adjuvantes, tensoativos, solventes) podem reduzir a pegada ambiental global das formulações de proteção de culturas.
Os agentes verdes são biodegradáveis e geralmente derivados de fontes naturais e/ou sustentáveis, por exemplo, fontes de plantas e animais.
Exemplos específicos são: óleos vegetais, óleos de sementes e seus ésteres, também poliglucosídeos de alquila alcoxilados.
Em alguns casos, os PMPs podem ser criodessecados ou liofilizados.
Ver Pat. dos E.U.A.
No. 4,311,712. Os PMPs podem ser reconstituídos após contato com água ou outro líquido.
Outros componentes podem ser adicionados aos PMPs liofilizados ou reconstituídos, por exemplo, outros agentes funcionais heterólogos, transportadores agricolamente aceitáveis ou outros materiais de acordo com as formulações descritas aqui.
Outras características opcionais da composição incluem transportadores ou veículos de entrega que protegem a composição de PMP contra UV e/ou condições ácidas.
Em alguns casos, o veículo de administração contém um tampão de pH.
Em alguns casos, a composição é formulada para ter um pH na gama de cerca de 4,5 a cerca de 9,0, incluindo por exemplo gamas de pH de cerca de qualquer um de 5,0 a cerca de 8,0, cerca de 6,5 a cerca de 7,5 ou cerca de 6,5 a cerca de 7,0. Para informação adicional sobre formulações agrícolas ver “Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations” editado por DA Knowles, copyright 1998 por Kluwer Academic Publishers.
Ver também “Insecticides in Agriculture and Environment—Retrospects and Prospects” por AS Perry, I.
Yamamoto, I.
Ishaaya e R.
Perry, copyright 1998 por Springer-Verlag.
ii.
Formulações Farmacêuticas Os PMPs modificados descritos aqui podem ser formulados em composições farmacêuticas, por exemplo, para administração a um animal (por exemplo, um humano). A composição farmacêutica pode ser administrada a um animal (por exemplo, humano) com um diluente, transportador e/ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis.
Dependendo do modo de administração e da dosagem, a composição farmacêutica dos métodos descritos aqui será formulada em composições farmacêuticas adequadas para permitir entrega fácil.
A dose única pode ser em uma forma de dose unitária como necessário.
Uma composição de PMP pode ser formulada para, por exemplo, administração oral, administração intravenosa (por exemplo, injeção ou infusão) ou administração subcutânea a um animal.
Para formulações injetáveis, vários transportadores farmacêuticos eficazes são conhecidos na técnica (Ver, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22ª ed., (2012) e ASHP Handbook on Injectable Drugs, 18ª ed., (2014)). Os transportadores e excipientes farmaceuticamente aceitáveis nas presentes composições não são tóxicos para os receptores às dosagens e concentrações empregues.
Os transportadores e excipientes aceitáveis podem incluir tampões tais como fosfato, citrato, HEPES e TAE, antioxidantes tais como ácido ascórbico e metionina, conservantes tais como cloreto de hexametônio, cloreto de octadecildimetilbenzilamônio, resorcinol e cloreto de benzalcônio, proteínas tais como albumina sérica humana, gelatina, dextrano e imunoglobulinas, polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona, aminoácidos tais como glicina, glutamina, histidina e lisina e carboidratos tais como glucose, manose, sacarose e sorbitol.
As composições podem ser formuladas de acordo com a prática farmacêutica convencional.
A concentração do composto na formulação irá variar dependendo de um número de fatores, incluindo a dosagem do agente ativo (por exemplo, PMP) a ser administrado e a via de administração.
Para administração oral a um animal, a composição de PMP pode ser preparada na forma de uma formulação oral.
As formulações para uso oral podem incluir comprimidos, caplets, cápsulas, xaropes ou formas de dosagem líquidas orais contendo o(s) ingrediente(s) ativo(s) em uma mistura com excipientes farmaceuticamente aceitáveisnão tóxicos.
Estes excipientes podem ser, por exemplo, diluentes inertes ou enchimentos (por exemplo, sacarose, sorbitol, açúcar, manitol, celulose microcristalina, amidos incluindo amido de batata, carbonato de cálcio, cloreto de sódio, lactose, fosfato de cálcio, sulfato de cálcio ou fosfato de sódio); agentes de granulação e desintegração (por exemplo, derivados de celulose incluindo celulose microcristalina, amido, incluindo amido de batata, croscarmelose sódica, alginatos ou ácido algínico); agentes de ligação (por exemplo, sacarose, glucose, sorbitol, acácia, ácido algínico, alginato de sódio, gelatina, amido, amido pré- gelatinizado, celulose microcristalina, silicato de magnésio e alumínio, carboximetilcelulose sódica, metilcelulose, metilcelulose de hidroxipropila, etilcelulose, polivinilpirrolidona ou polietilenoglicol); e agentes lubrificantes, deslizantes e antiadesivos (por exemplo, estearato de magnésio, estearato de zinco, ácido esteárico, sílicas, óleos vegetais hidrogenados ou talco). Outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis podem ser corantes, agentes aromatizantes, plastificantes, molhantes, agentes tamponantes e similares.
As formulações para uso oral podem também ser proporcionadas na forma de dosagem unitária como comprimidos mastigáveis, comprimidos não mastigáveis, caplets, cápsulas (por exemplo, como cápsulas de gelatina duras em que o ingrediente ativo é misturado com um diluente sólido inerte, ou como cápsulas de gelatina moles em que o ingrediente ativo é misturado com água ou um meio de óleo). As composições divulgadas aqui podem também incluir uma formulação de liberação imediata, liberação prolongada ou liberação retardada.
Para administração parenteral a um animal, as composições de PMP podem ser formuladas na forma de soluções ou suspensões líquidas e administradas por uma via parenteral (por exemplo, subcutânea, intravenosa ou intramuscular). A composição farmacêutica pode ser formulada para injeção ou infusão.
As composições farmacêuticas para administração parenteral podem ser formuladas usando uma solução estéril ou qualquer líquido farmaceuticamente aceitável como um veículo.
Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, água estéril, solução salina fisiológica ou meio de cultura de células (por exemplo, Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), Meio de Eagle α-Modificado (α- MEM), meio F-12). Os métodos de formulação são conhecidos na técnica, ver, por exemplo, Gibson (ed.) Pharmaceutical Preformulation and Formulation (2ª ed.) Taylor & Francis Group, CRC Press (2009). II.
Agentes Funcionais Heterólogos Os PMPs fabricados aqui podem incluir adicionalmente um agente funcional heterólogo, tal como um agente funcional heterólogo (por exemplo, um agente agrícola heterólogo (por exemplo, agente pesticida, agente fertilizante, agente herbicida, agente modificador das plantas) ou um agente terapêutico heterólogo (por exemplo, um agente antifúngico, um agente antibacteriano, um agente virucida, um agente antiviral, um agente inseticida, um agente nematicida, um agente antiparasitário ou um repelente de insetos)). Por exemplo, o PMP pode encapsular o agente funcional heterólogo.
Alternativamente, o agente funcional heterólogo pode ser embebido na ou conjugado à superfície do PMP.
Em alguns casos, os PMPs incluem dois ou mais (por exemplo,
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10) diferentes agentes funcionais heterólogos.
Os agentes funcionais heterólogos podem ser adicionados em qualquer passo durante o processo de fabricação eficaz para introduzir o agente nos PMPs fabricados.
Em certos casos, o agente funcional heterólogo (por exemplo, um agente agrícola heterólogo (por exemplo, agente pesticida, agente fertilizante, agente herbicida, agente modificador de plantas, um ácido nucleico heterólogo, um polipeptídeo heterólogo ou uma molécula pequena heteróloga) ou um agente terapêutico heterólogo (por exemplo, um agente antifúngico, um agente antibacteriano, um agente virucida, um agente antiviral, um agente nematicida, um agente antiparasitário ou um repelente de insetos)) pode ser modificado.
Por exemplo, a modificação pode ser uma modificação química, por exemplo, conjugação a um marcador, por exemplo, marcador fluorescente ou um marcador radioativo.
Em outros exemplos, a modificação pode incluir conjugação ou ligação operacional a uma fração que intensifica a estabilidade, entrega, direcionamento, biodisponibilidade ou meia-vida do agente, por exemplo, um lipídeo, uma glicana, um polímero (por exemplo, PEG), uma fração catiônica.
Exemplos de agentes funcionais heterólogos que podem ser carregados nos PMPs fabricados aqui são delineados em baixo.
A.
Agentes Agrícolas Heterólogos Os PMPs fabricados aqui podem incluir um agente agrícola heterólogo (por exemplo, um agente que afeta uma planta ou um organismo que se associa a uma planta e pode ser carregado em um PMP), tal como um agente pesticida, agente herbicida, agente fertilizante ou um agente modificador de plantas.
Por exemplo, em alguns casos, os PMPs podem incluir um agente pesticida.
O agente pesticida pode ser um agente antifúngico, um agente antibacteriano, um agente inseticida, um agente moluscicida,
um agente nematicida, um agente virucida ou uma sua combinação.
O agente pesticida pode ser um agente químico, tal como aqueles bem conhecidos na técnica.
Alternativamente ou adicionalmente, o agente pesticida pode ser um peptídeo, um polipeptídeo, um ácido nucleico, um polinucleotídeo ou uma molécula pequena.
O agente pesticida pode ser um agente que pode diminuir a aptidão de uma variedade de pragas de plantas ou pode ser um que visa uma ou mais pragas de plantas alvo específicas (por exemplo, uma espécie ou gênero específico de pragas de plantas). Em alguns casos, os PMPs podem incluir um ou mais agentes fertilizantes heterólogos.
Exemplos de agentes fertilizantes heterólogos incluem nutrientes vegetais ou reguladores do crescimento vegetal, tais como aqueles bem conhecidos na técnica.
Alternativamente, ou adicionalmente, o agente fertilizante pode ser um peptídeo, um polipeptídeo, um ácido nucleico ou um polinucleotídeo que pode aumentar a aptidão de um simbionte vegetal.
O agente fertilizante pode ser um agente que pode aumentar a aptidão de uma variedade de plantas ou simbiontes vegetais ou pode ser um que visa uma ou mais plantas alvo ou simbiontes vegetais específicos (por exemplo, uma espécie ou gênero específico de plantas ou simbiontes vegetais). Em outros casos, os PMPs podem incluir um ou mais agentes modificadores de plantas heterólogos.
Em alguns casos, o agente modificador de plantas pode incluir um peptídeo ou um ácido nucleico. i.
Agentes antibacterianos As composições de PMP descritas aqui podem incluir adicionalmente um agente antibacteriano.
Em alguns casos, as composições de PMP incluem dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10) diferentes agentes antibacterianos.
Por exemplo, o agente antibacteriano pode diminuir a aptidão de (por exemplo, diminuir o crescimento ou morte) uma praga de plantas bacteriana (por exemplo, um patógeno de plantas bacteriano). Uma composição de PMP incluindo um antibiótico como descrito aqui pode ser contatada com uma praga alvo, ou sua planta infestada, em uma quantidade e durante um tempo suficiente para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de antibióticos dentro da ou na praga alvo; e (b) diminuir a aptidão da praga alvo.
Os antibacterianos descritos aqui podem ser formulados em uma composição de PMP para qualquer um dos métodos descritos aqui e, em certos casos, podem estar associados ao seu PMP.
Como usado aqui, o termo “agente antibacteriano” se refere a um material que mata ou inibe o crescimento, proliferação, divisão, reprodução ou propagação de bactérias, tais como bactérias fitopatogênicas, e inclui agentes bactericidas (por exemplo, compostos desinfetantes, compostos antissépticos ou antibióticos) ou bacteriostáticos (por exemplo, compostos ou antibióticos). Os antibióticos bactericidas matam as bactérias, enquanto os antibióticos bacteriostáticos somente abrandam seu crescimento ou reprodução.
Os bactericidas podem incluir desinfetantes, antissépticos ou antibióticos.
Os desinfetantes mais usados podem incluir: cloro ativo (isto é, hipocloritos (por exemplo, hipoclorito de sódio), cloraminas, dicloroisocianurato e tricloroisocianurato, cloro úmido, dióxido de cloro, etc.), oxigênio ativo (peróxidos, tais como ácido peracético, persulfato de potássio, perborato de sódio, percarbonato de sódio e peridrato de ureia), iodo (iodopovidona (povidona-iodo, Betadine), solução de Lugol, tintura de iodo, tensoativos não iônicos iodados), álcoois concentrados (maioritariamente etanol, 1-propanol, também chamado n-propanol e 2- propanol, chamado isopropanol e suas misturas; adicionalmente são usados 2-fenoxietanol e 1- e 2-fenoxipropanóis), substâncias fenólicas (tais como fenol (também chamado ácido carbólico), cresóis (chamados
Lisol em combinação com sabões de potássio líquidos), fenóis halogenados (clorados, bromados), tais como hexaclorofeno, triclosano, triclorofenol, tribromofenol, pentaclorofenol, Dibromol e seus sais), tensoativos catiônicos, tais como alguns cátions de amônio quaternário (tais como cloreto de benzalcônio, brometo ou cloreto de cetiltrimetilamônio, cloreto de didecildimetilamônio, cloreto de cetilpiridínio, cloreto de benzetônio) e outros, compostos não quaternários, tais como clorexidina, glucoprotamina, di-hidrocloreto de octenidina, etc.), oxidantes fortes, tais como ozônio e soluções de permanganato; metais pesados e seus sais, tais como prata coloidal, nitrato de prata, cloreto de mercúrio, sais de fenilmercúrio, sulfato de cobre, cloreto-óxido de cobre, hidróxido de cobre, octanoato de cobre, sulfato de oxicloreto de cobre, sulfato de cobre, sulfato de cobre penta- hidratado, etc.
Metais pesados e seus sais são os bactericidas mais tóxicos e perigosos para o meio ambiente e, portanto, seu uso é fortemente oprimido ou cancelado; adicionalmente, também ácidos fortes apropriadamente concentrados (ácidos fosfórico, nítrico, sulfúrico, amidossulfúrico, toluenossulfônico) e alcalinos (hidróxidos de sódio, potássio, cálcio). Como antissépticos (isto é, agentes germicidas que podem ser usados no corpo humano ou animal, pele, mucosas, feridas e similares), poucos dos desinfetantes mencionados acima podem ser usados, sob condições apropriadas (maioritariamente concentração, pH, temperatura e toxicidade para homem/animal). Entre eles são importantes: preparações de cloro apropriadamente diluídas (isto é, solução de Daquin, solução de hipoclorito de sódio ou potássio a 0,5%, pH ajustado até pH 7-8, ou solução de benzenossulfocloramida de sódio a 0,5-1% (cloramina B)), algumas preparações de iodo, tais como a iodopovidona em vários galênicos (pomadas, soluções, pensos para feridas), no passado também solução de Lugol, peróxidos como soluções de peridrato de ureia e soluções de ácido peracético tamponadas com pH a 0,1-0,25%, álcoois com ou sem aditivos antissépticos, usados maioritariamente para antissepsia da pele, ácidos orgânicos fracos tais como ácido sórbico, ácido benzoico, ácido láctico e ácido salicílico, alguns compostos fenólicos, tais como hexaclorofeno, triclosano e dibromol, e compostos ativos catiônicos, tais como soluções de benzalcônio a 0,05-0,5%, clorexidina a 0,5-4%, octenidina a 0,1-2%. A composição de PMP descrita aqui pode incluir um antibiótico.
Pode ser usado qualquer antibiótico conhecido na técnica.
Os antibióticos são comummente classificados com base em seu mecanismo de ação, estrutura química ou espectro de atividade.
O antibiótico descrito aqui pode visar qualquer função ou processos de crescimento bacterianos e pode ser bacteriostático (por exemplo, abranda ou previne o crescimento bacteriano) ou bactericida (por exemplo, mata bactérias). Em alguns casos, o antibiótico é um antibiótico bactericida.
Em alguns casos, o antibiótico bactericida é um que visa a parede da célula bacteriana (por exemplo, penicilinas e cefalosporinas); um que visa a membrana celular (por exemplo, polimixinas); ou um que inibe enzimas bacterianas essenciais (por exemplo, rifamicinas, lipiarmicinas, quinolonas e sulfonamidas). Em alguns casos, o antibiótico bactericida é um aminoglicosídeo (por exemplo, casugamicina). Em alguns casos, o antibiótico é um antibiótico bacteriostático.
Em alguns casos, o antibiótico bacteriostático visa a síntese de proteínas (por exemplo, macrolídeos, lincosamidas e tetraciclinas). Classes adicionais de antibióticos que podem ser usados aqui incluem lipopeptídeos cíclicos (tais como daptomicina), glicilciclinas (tais como tigeciclina), oxazolidinonas (tais como linezolida) ou lipiarmicinas (tais como fidaxomicina). Exemplos de antibióticos incluem rifampicina, ciprofloxacina, doxiciclina, ampicilina e polimixina B.
O antibiótico descrito aqui pode ter qualquer nível de especificidade pelo alvo (por exemplo, espectro estreito ou amplo). Em alguns casos, o antibiótico é um antibiótico de espectro estreito e assim visa tipos específicos de bactérias, tais como bactérias Gram-negativas ou Gram- positivas.
Alternativamente, o antibiótico pode ser um antibiótico de espectro amplo que visa uma gama ampla de bactérias.
Outros exemplos não limitantes de antibióticos são encontrados na Tabela 1. Um perito na técnica apreciará que uma concentração adequada de cada antibiótico na composição depende de fatores tais como eficácia, estabilidade do antibiótico, número de antibióticos distintos, a formulação e métodos de aplicação da composição.
Tabela 1. Exemplos de Antibióticos Antibióticos Ação Penicilinas, cefalosporinas, vancomicina Síntese da parede celular Polimixina, gramicidina Agente ativo em membranas, interrompem a membrana celular Tetraciclinas, macrolídeos, cloranfenicol, Inibem a síntese de proteínas clindamicina, espectinomicina Sulfonamidas Inibem vias dependentes de folato Ciprofloxacina Inibem DNA-girase Isoniazida, rifampicina, pirazinamida, etambutol, Agentes antimicobacterianos (mambutol)l, estreptomicina ii.
Agentes antifúngicos As composições de PMP descritas aqui podem incluir adicionalmente um agente antifúngico.
Em alguns casos, as composições de PMP incluem dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10) diferentes agentes antifúngicos.
Por exemplo, o agente antifúngico pode diminuir a aptidão de (por exemplo, diminuir o crescimento ou matar) uma praga de plantas fúngica.
Uma composição de PMP incluindo um antifúngico como descrito aqui pode ser contatada com uma praga fúngica alvo, ou planta infestada com ela, em uma quantidade e durante um tempo suficiente para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de antibióticos dentro do ou no fungo alvo; e (b) diminuir a aptidão do fungo alvo.
Os antifúngicos descritos aqui podem ser formulados em uma composição de PMP para qualquer um dos métodos descritos aqui e, em certos casos, podem estar associados ao seu PMP.
Como usado aqui, o termo “fungicida” ou “agente antifúngico” se refere a uma substância que mata ou inibe o crescimento, proliferação, divisão, reprodução ou propagação de fungos, tais como fungos fitopatogênicos.
Muitos tipos diferentes de agentes antifúngicos foram produzidos comercialmente.
Exemplos não limitantes de agentes antifúngicos incluem: azoxistrobina, mancozebe, protioconazol, folpete, tebuconazol, difenoconazol, captano, bupirimato ou fosetil-Al.
Fungicidas exemplificativos adicionais incluem, mas não estão limitados a, estrobilurinas, azoxistrobina, dimoxistrobina, enestroburina, fluoxastrobina, cresoxim-metila, metominostrobina, picoxistrobina, piraclostrobina, trifloxistrobina, orisastrobina, carboxamidas, carboxanilidas, benaxalaxil, benalaxil-M, benodanil, carboxina, mebenil, mepronil, fenfuram, fenexamida, flutolanil, furalaxil, furcarbanil, furametpir, metalaxil, metalaxil-M (mefenoxam), metfuroxam, metsulfovax, ofurace, oxadixil, oxicarboxina, pentiopirade, piracarbolida, salicilanilida, tecloftalam, tifluzamida, tiadinil, N-bifenilamidas, bixafeno, boscalide, morfolídeos de ácido carboxílico, dimetomorfe, flumorfe, benzamidas, flumetover, fluopicolida (picobenzamida), zoxamida, carboxamidas, carpropamida, diclocimete, mandipropamida, siltiofam, azóis, triazóis, bitertanol, bromuconazol, ciproconazol, difenoconazol, diniconazol, enilconazol, epoxiconazol, fenbuconazol, flusilazol, fluquinconazol, flutriafol, hexaconazol, imibenconazol, ipconazol, metconazol, miclobutanil, penconazol, propiconazol, protioconazol, simeconazol, tebuconazol, tetraconazol, triadimenol, triadimefona,
triticonazol, Imidazóis, ciazofamida, imazalil, pefurazoato, procloraz, triflumizol, benzimidazóis, benomil, carbendazim, fuberidazol, tiabendazol, etaboxam, etridiazol, himexazol, compostos de heterociclila contendo nitrogênio, piridinas, fuazinam, pirifenox, pirimidinas, bupirimato, ciprodinil, ferimzona, fenarimol, mepanipirim, nuarimol, pirimetanil, piperazinas, triforina, pirróis, fludioxonil, fenpiclonil, morfolinas, aldimorfe, dodemorfe, fenpropimorfe, tridemorfe, dicarboximidas, iprodiona, procimidona, vinclozolina, acibenzolar-S- metila, anilazina, captano, captafol, dazomete, diclomezina, fenoxanil, folpete, fenpropidina, famoxadona, fenamidona, octilinona, probenazol, proquinazida, piroquilona, quinoxifeno, triciclazol, carbamatos, ditiocarbamatos, ferbam, mancozebe, manebe, metiram, metam, propinebe, tiram, zinebe, ziram, dietofencarbe, flubentiavalicarbe, iprovalicarbe, propamocarbe, guanidinas, dodina, iminoctadina, guazatina, casugamicina, polioxinas, estreptomicina, validamicina A, compostos organometálicos, sais de fentina, compostos de heterociclila contendo enxofre, isoprotiolano, ditianona, compostos de organofósforo, edifenfos, fosetil, fosetil-alumínio, iprobenfos, pirazofos, tolclofos-metila, Compostos de organocloro, tiofanato-metila, clorotalonil, diclofluanida, tolilfluanida, flussulfamida, ftalida, hexaclorobenzeno, pencicurona, quintozeno, derivados de nitrofenila, binapacril, dinocape, dinobutona, espiroxamina, ciflufenamida, cimoxanil, metrafenona, N-2-cianofenil-3,4-dicloroisotiazol-5- carboxamida (isotianil), N-(3′,4′,5′-trifluorobifenil-2-il)-3-difluorometil-1- metilpirazol-4-carboxamida, 3-[5-(4-clorofenil)-2,3-dimetilisoxazolidin-3- il]-piridina, N-(3′,4′-dicloro-4-fluorobifenil-2-il)-3-difluorometil-1- metilpirazol-4-carboxamida, 5-cloro-7-(4-metilpiperidin-1-il)-6-(2,4,6- trifluorofenil)-[1,2,4]tria-zolo[1,5-a]pirimidina, 2-butóxi-6-iodo-3- propilcromen-4-ona, N,N-dimetil-3-(3-bromo-6-fluoro-2-metilindol-1- sulfonil)-[1,2,4]triazol-1-sulfonamida, metil-(2-cloro-5-[1-(3-
metilbenzilóxi-imino)-etil]benzil)carbamato, metil-(2-cloro-5-[1-(6- metilpiridin-2-ilmetóxi-imino)etil]benzil)carbamato, 3-(4-clorofenil)-3-(2- isopropoxicarbonilamino-3-metilbutiril-amino)propionato de metila, N-(1- (1-(4-cianofenil)etanossulfonil)but-2-il)carbamato de 4-fluorofenila, N- (2-(4-[3-(4-clorofenil)prop-2-iniloxi]-3-metoxifenil)etil)-2- metanossulfonilamino-3-metilbutiramida, N-(2-(4-[3-(4-clorofenil)prop-2- iniloxi]-3-metoxifenil)etil)-2-etanossulfonilamino-3-metilbutiramida, N- (4′-bromobifenil-2-il)-4-difluorometil-2-metiltiazol-5-carboxamida, N-(4′- trifluorometilbifenil-2-il)-4-difluorometil-2-metiltiazol-5-carboxamida, N- (4′-cloro-3′-fluorobifenil-2-il)-4-difluorometil-2-metiltiazol-5-carboxamida ou 2-(orto-((2,5-dimetilfeniloxi-metileno)fenil)-3-metoxiacrilato de metila.
Um perito na técnica apreciará que uma concentração adequada de cada antifúngico na composição depende de fatores tais como eficácia, estabilidade do antifúngico, número de antifúngicos distintos, a formulação e métodos de aplicação da composição. iii.
Inseticidas As composições de PMP descritas aqui podem incluir adicionalmente um inseticida.
Em alguns casos, as composições de PMP incluem dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10) diferentes agentes inseticidas.
Por exemplo, o inseticida pode diminuir a aptidão de (por exemplo, diminuir o crescimento ou matar) uma praga de plantas de insetos.
Uma composição de PMP incluindo um inseticida como descrito aqui pode ser contatada com uma praga de insetos alvo, ou planta infestada com ela, em uma quantidade e durante um tempo suficiente para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de inseticidas dentro do ou no inseto alvo; e (b) diminuir a aptidão do inseto alvo.
Os inseticidas descritos aqui podem ser formulados em uma composição de PMP para qualquer um dos métodos descritos aqui e, em certos casos, podem estar associados ao seu PMP.
Como usado aqui, o termo “inseticida” ou “agente inseticida” se refere a uma substância que mata ou inibe o crescimento, proliferação, reprodução ou propagação de insetos, tais como pragas de insetos agrícolas.
Exemplos não limitantes de inseticidas estão listados na Tabela 2. Exemplos não limitantes adicionais de inseticidas adequados incluem biológicos, hormônios ou feromônios tais como azadiractina, espécies de Bacillus, espécies de Beauveria, codlemona, espécies de Metarrhizium, espécies de Paecilomyces, thuringiensis e espécies de Verticillium, e compostos ativos tendo mecanismos de ação desconhecidos ou não especificados tais como fumigantes (tais como fosfeto de alumínio, brometo de metila e fluoreto de sulfurila) e inibidores seletivos da alimentação (tais como criolita, flonicamida e pimetrozina). Um perito na técnica apreciará que uma concentração adequada de cada inseticida na composição depende de fatores tais como eficácia, estabilidade do inseticida, número de inseticidas distintos, a formulação e métodos de aplicação da composição.
Tabela 2. Exemplos de inseticidas Classe Compostos cloronicotinilos/neonicotinoides acetamiprida, clotianidina, dinotefurano, imidacloprida, nitenpiram, nitiazina, tiacloprida, tiametoxam, imidaclotiz, (2E)-1-[(2-cloro-1,3-tiazol- 5-il)metil]-3,5-dimetil-N-nitro-1,3,5-tri-azinan-2-imina, inibidores de acetilcolinesterase (AChE) (tais como carbamatos e organofosfatos) carbamatos alanicarbe, aldicarbe, aldoxicarbe, alixicarbe, aminocarbe, bendiocarbe, benfuracarbe, bufencarbe, butacarbe, butocarboxim, butoxicarboxim, carbaril, carbofurano, carbossulfano, cloetocarbe, dimetilano, etiofencarbe, fenobucarbe, fenotiocarbe, formetanato, furatiocarbe, isoprocarbe, metam-sódio, metiocarbe, metomil, metolcarbe, oxamil, fosfocarbe, pirimicarbe, promecarbe, propoxur, tiodicarbe, tiofanox, triazamato, trimetacarbe, XMC, xililcarbe organofosfatos acefato, azametifos, azinfos (-metila, -etila), bromofos-etila, bromfenvinfos (-metila), butatiofos, cadusafos, carbofenotiona, cloretoxifos, clorfenvinfos, clormofos, clorpirifos (-metila/-etila), coumafos, cianofenfos, cianofos, demetona-S-metila, demetona-S- metilsulfona, dialifos, diazinona, diclofentiona, diclorvos/DDVP,
Classe Compostos dicrotofos, dimetoato, dimetilvinfos, dioxabenzofos, dissulfotona, EPN, etiona, etoprofos, etrimfos, famfur, fenamifos, fenitrotiona, fensulfotiona, fentiona, flupirazofos, fonofos, formotiona, fosmetilano, fostiazato, heptenofos, iodofenfos, iprobenfos, isazofos, isofenfos, O-salicilato de isopropila, isoxationa, malationa, mecarbam, metacrifos, metamidofos, metidationa, mevinfos, monocrotofos, nalede, ometoato, oxidemetona- metila, parationa (-metila/-etila), fentoato, forato, fosalona, fosmete, fosfamidona, fosfocarbe, foxim, pirimifos (-metila/-etila), profenofos, propafos, propetamfos, protiofos, protoato, piraclofos, piridafentiona, piridationa, quinalfos, sebufos, sulfotepe, sulprofos, tebupirimfos, temefos, terbufos, tetraclorvinfos, tiometona, triazofos, triclorfona, vamidotiona piretroides acrinatrina, aletrina (d-cis-trans, d-trans), cipermetrina (alfa-, beta-, teta- , zeta-), permetrina (cis-, trans-), beta-ciflutrina, bifentrina, bioaletrina, bioaletrina-S-ciclopentil-isômero, bioetanometrina, biopermetrina, biorresmetrina, chlovaportrina, cis-cipermetrina, cis-resmetrina, cis- permetrina, clocitrina, cicloprotrina, ciflutrina, cialotrina, cifenotrina, DDT, deltametrina, empentrina (1R-isômero), esfenvalerato, etofenprox, fenflutrina, fenpropatrina, fenpiritrina, fenvalerato, flubrocitrinato, flucitrinato, flufenprox, flumetrina, fluvalinato, fubfenprox, gama- cialotrina, imiprotrina, cadetrina, lambda, cialotrina, metoflutrina, fenotrina (isômero 1R-trans), praletrina, proflutrina, protrifenbuto, piresmetrina, resmetrina, RU 15525, silafluofeno, tau-fluvalinato, teflutrina, teraletrina, tetrametrina (1R-isômero), tralocitrina, tralometrina, transflutrina, ZXI 8901, piretrinas (piretro) oxadiazinas indoxacarbe, moduladores do receptor de acetilcolina (tais como espinosinas) espinosinas espinosade ciclodieno canficloro, clordano, endossulfano, gama-HCH, HCH, heptacloro, organocloros lindano, metoxicloro fipróis acetoprol, etiprol, vaniliprol, fipronil mectinas abamectina, avermectina, emamectina, emamectina-benzoato, fenoxicarbe, hidropreno, quinopreno, metopreno, ivermectina, lepimectina, epofenonano, piriproxifeno, milbemectina, milbemicina, tripreno diacil-hidrazinas cromafenozida, halofenozida, metoxifenozida, tebufenozida benzoilureias bistrifluorona, clorfluazurona, diflubenzurona, fluazurona, flucicloxurona, flufenoxurona, hexaflumurona, lufenurona, novalurona, noviflumurona,
Classe Compostos penfluorona, teflubenzurona, triflumurona organoestanhos azociclotina, ciexatina, óxido de fenbutatina pirróis clorfenapir dinitrofenóis binapacril, dinobutona, dinocape, DNOC METIs fenazaquina, fenpiroximato, pirimidifeno, piridabeno, tebufenpirade, tolfenpirade, rotenona, acequinocil, fluacrpirim, desreguladores microbianos da membrana intestinal de insetos (tais como estirpes de Bacillus thuringiensis), inibidores da síntese de lipídeos (tais como ácidos tetrônicos e ácidos tetrâmicos) ácidos tetrônicos espirodiclofeno, espiromesifeno, espirotetramate ácidos tetrâmicos carbonato de cis-3-(2,5-dimetilfenil)-8-metóxi-2-oxo-1- azaespiro[4.5]dec-3-en-4-ila e etila (sinônimo: ácido carbônico, éster de etila de 3-(2,5- dimetilfenil)-8-metóxi-2-oxo-1-azaespiro[4.5]dec-3-en-4- ila; No.
Reg.
CAS: 382608-10-8), carboxamidas (tais como flonicamida), agonistas octopaminérgicos (tais como amitraz), inibidores da ATPase estimulada por magnésio (tais como propargite), agonistas do receptor de rianodina (tais como ftalamidas ou rinaxapir) ftalamidas N2-[1,1-dimetil-2-(metilsulfonil)etil]-3-iodo-N1-[2-metil-4-[1,2,2,2- tetrafluoro-1-(trifluorometil)etil]fenil]-1,2-benzenodi-carboxamida (isto é, flubendiamida; No. reg.
CAS: 272451-65-7)
iv.
Nematicida As composições de PMP descritas aqui podem incluir adicionalmente um nematicida.
Em alguns casos, as composições de PMP incluem dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10) diferentes nematicidas.
Por exemplo, o nematicida pode diminuir a aptidão de (por exemplo, diminuir o crescimento ou matar) uma praga de plantas de nematódeos.
Uma composição de PMP incluindo um nematicida como descrito aqui pode ser contatada com uma praga de nematódeos alvo, ou planta infestada com ela, em uma quantidade e durante um tempo suficiente para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de nematicidas dentro do ou no nematódeo alvo; e (b) diminuir a aptidão do nematódeo alvo.
Os nematicidas descritos aqui podem ser formulados em uma composição de PMP para qualquer um dos métodos descritos aqui e, em certos casos, podem estar associados ao seu PMP.
Como usado aqui, o termo “nematicida” ou “agente nematicida” se refere a uma substância que mata ou inibe o crescimento, proliferação, reprodução ou propagação de nematódeos, tais como pragas de nematódeos agrícolas.
Exemplos não limitantes de nematicidas estão listados na Tabela 3. Um perito na técnica apreciará que uma concentração adequada de cada nematicida na composição depende de fatores tais como eficácia, estabilidade do nematicida, número de nematicidas distintos, a formulação e métodos de aplicação da composição.
Tabela 3. Exemplos de Nematicidas FUMIGANTES DD, 1,3-Dicloropropeno, Dibrometo de Etileno, 1,2-Dibromo-3-Cloropropano, Brometo de Metila, Cloropicrina, Metam Sódio, Dazomete, Isotiocianato de Metila (MITC), Tetratiocarbonato de Sódio, Cloropicrina, CARBAMATOS Aldicarbe, Aldoxicarbe, Carbofurano, Oxamil, Cleotocarbe ORGANOFOSFATOS Etoprofos, Fenamifos, Cadusafos, Fostiazato, Fensulfotiona, Tionazina, Isazofos, BIOQUÍMICOS DITERA®, CLANDOSAN®, SINCOCIN® v.
Moluscicida As composições de PMP descritas aqui podem incluir adicionalmente um moluscicida.
Em alguns casos, as composições de PMP incluem dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10) diferentes moluscicidas.
Por exemplo, o moluscicida pode diminuir a aptidão de (por exemplo, diminuir o crescimento ou matar) uma praga de plantas de moluscos.
Uma composição de PMP incluindo um moluscicida como descrito aqui pode ser contatada com uma praga de moluscos alvo, ou planta infestada com ela, em uma quantidade e durante um tempo suficiente para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de moluscicidas dentro do ou no molusco alvo; e (b) diminuir a aptidão do molusco alvo.
Os moluscicidas descritos aqui podem ser formulados em uma composição de PMP para qualquer um dos métodos descritos aqui e, em certos casos, podem estar associados ao seu PMP.
Como usado aqui, o termo “moluscicida” ou “agente moluscicida” se refere a uma substância que mata ou inibe o crescimento, proliferação, reprodução ou propagação de moluscos, tais como pragas de moluscos agrícolas.
Um número de químicos pode ser empregue como um moluscicida, incluindo sais de metal tais como fosfato de ferro (III), sulfato de alumínio e EDTA férrico de sódio, [3][4], metaldeído, metiocarbe ou inibidores de acetilcolinesterase.
Um perito na técnica apreciará que uma concentração adequada de cada moluscicida na composição depende de fatores tais como eficácia, estabilidade do moluscicida, número de moluscicidas distintos, a formulação e métodos de aplicação da composição. vi.
Virucidas As composições de PMP descritas aqui podem incluir adicionalmente um virucida.
Em alguns casos, as composições de PMP incluem dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10) diferentes virucidas.
Por exemplo, o virucida pode diminuir a aptidão de (por exemplo, diminuir ou eliminar) um patógeno de plantas viral.
Uma composição de PMP incluindo um virucida como descrito aqui pode ser contatada com um vírus alvo, ou planta infestada com ele, em uma quantidade e durante um tempo suficiente para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de virucidas; e (b) diminuir ou eliminar o vírus alvo.
Os virucidas descritos aqui podem ser formulados em uma composição de PMP para qualquer um dos métodos descritos aqui e, em certos casos, podem estar associados ao seu PMP.
Como usado aqui, o termo “virucida” ou “antiviral” se refere a uma substância que mata ou inibe o crescimento, proliferação, reprodução, desenvolvimento ou propagação de vírus, tais como patógenos de vírus agrícolas.
Um número de agentes pode ser empregue como um virucida, incluindo químicos ou agentes biológicos (por exemplo, ácidos nucleicos, por exemplo, dsRNA). Um perito na técnica apreciará que uma concentração adequada de cada virucida na composição depende de fatores tais como eficácia, estabilidade do virucida, número de virucidas distintos, a formulação e métodos de aplicação da composição. vii.
Herbicidas As composições de PMP descritas aqui podem incluir adicionalmente um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10) herbicidas.
Por exemplo, o herbicida pode diminuir a aptidão de (por exemplo, diminuir ou eliminar) uma erva daninha.
Uma composição de PMP incluindo um herbicida como descrito aqui pode ser contatado com a erva daninha alvo em uma quantidade e durante um período de tempo suficientes para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de herbicidas na planta e (b) diminuir a aptidão da erva daninha.
Os herbicidas descritos aqui podem ser formulados em uma composição de PMP para qualquer um dos métodos descritos aqui e, em certos casos, podem estar associados ao seu PMP.
Como usado aqui, o termo “herbicida” se refere a uma substância que mata ou inibe o crescimento, proliferação, reprodução ou propagação de ervas daninhas.
Um número de químicos pode ser empregue como herbicidas, incluindo Glufosinato, Propaquizafope, Metamitrona, Metazacloro, Pendimetalina, Flufenacete, Diflufenicano, Clomazona, Nicossulfurona, Mesotriona, Pinoxadeno, Sulcotriona, Prossulfocarbe, Sulfentrazona, Bifenox, Quinmerac, Trialato, Terbutilazina, Atrazina, Oxifluorfeno, Diurona, Trifluralina ou
Clorotolurona.
Exemplos adicionais de herbicidas incluem, mas não estão limitados a, herbicidas de ácido benzoico, tais como ésteres de dicamba, herbicidas de ácido fenoxialcanoico, tais como ésteres de 2,4- D, MCPA e 2,4-DB, herbicidas de ácido ariloxifenoxipropiônico, tais como ésteres de clodinafope, cialofope, fenoxaprope, fluazifope, haloxifope e quizalofope, herbicidas de ácido piridinacarboxílico, tais como ésteres de aminopiralida, picloram e clopiralida, herbicidas de ácidos pirimidinacarboxílico, tais como ésteres de aminociclopiracloro, herbicidas de ácido piridiloxialcanoico, tais como ésteres de fluoroxipir e triclopir, e herbicidas de hidroxibenzonitrila, tais como ésteres de bromoxinil e ioxinil, ésteres dos ácidos arilpiridinacarboxílicos e ácidos arilpirimidinacarboxílicos das estruturas genéricas divulgadas na Pat. dos E.U.A.
No. 7,314,849; Pat. dos E.U.A.
No. 7,300,907 e Pat. dos E.U.A.
No. 7,642,220, cada uma das quais é incorporada por referência aqui em sua totalidade.
Em certas modalidades, o herbicida pode ser selecionado do grupo consistindo em 2,4-D, 2,4-DB, acetocloro, acifluorfeno, alacloro, ametrina, amitrol, asulam, atrazina, azafenidina, benefina, bensulfurona, bensulida, bentazona, bromacil, bromoxinil, butilato, carfentrazona, clorambeno, clorimurona, clorprofam, clorsulfurona, cletodim, clomazona, clopiralida, cloransulam, cianazina, cicloato, DCPA, desmedifam, diclobenil, diclofope, diclosulam, dietatil, difenzoquate, diflufenzopir, dimetenamida-p, diquat, diurona, DSMA, endotal, EPTC, etalfluralina, etametsulfurona, etofumesato, fenoxaprope, fluazifope-P, flucarbazona, flufenacete, flumetsulam, flumiclorac, flumioxazina, fluometurona, fluroxipir, flutiacete, fomessafeno, foramsulfurona, glufosinato, glifosato, halossulfurona, haloxifope, hexazinona, imazametabenz, imazamox, imazapic, imazaquina, imazetapir, isoxabeno, isoxaflutol, lactofeno, linurona, MCPA, MCPB, mesotriona, metazol, metolaclor-s, metribuzina, metsulfurona, molinato, MSMA, napropamida, naptalam,
nicossulfurona, norflurazona, orizalina, oxadiazona, oxassulfurona, oxifluorfeno, paraquate, pebulato, ácido pelargônico, pendimetalina, fenmedifam, picloram, primissulfurona, prodiamina, prometrina, pronamida, propacloro, propanil, prossulfurona, pirazona, piridato, piritiobac, quinclorac, quizalofope, rimsulfurona, setoxidim, sidurona, simazina, sulfentrazona, sulfometurona, sulfossulfurona, tebutiurona, terbacil, tiazopir, tifensulfurona, tiobencarbe, tralcoxidim, trialato, triassulfurona, tribenurona, triclopir, trifluralina, triflussulfurona, vernolato.
Um perito na técnica apreciará que uma concentração adequada de cada herbicida na composição depende de fatores tais como eficácia, estabilidade do herbicida, número de herbicidas distintos, a formulação e métodos de aplicação da composição. viii.
Repelentes As composições de PMP descritas aqui podem incluir adicionalmente um repelente.
Em alguns casos, as composições de PMP incluem dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10) diferentes repelentes.
Por exemplo, o repelente pode repelir qualquer uma das pragas descritas aqui (por exemplo, insetos, nematódeos ou moluscos); microrganismos (por exemplo, fitopatógenos ou endófitos, tais como bactérias, fungos ou vírus); ou ervas daninhas.
Uma composição de PMP incluindo um repelente como descrito aqui pode ser contatada com uma planta alvo, ou planta infestada com ela, em uma quantidade e durante um tempo suficiente para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de repelentes; e (b) diminuir os níveis da praga na planta em relação a uma planta não tratada.
O repelente descrito aqui pode ser formulado em uma composição de PMP para qualquer um dos métodos descritos aqui e, em certos casos, pode estar associado ao seu PMP.
Em alguns casos, o repelente é um repelente de insetos.
Alguns exemplos de repelentes de insetos bem conhecidos incluem: benzil; benzoato de benzila; 2,3,4,5-bis(butil-2-eno)tetra-hidrofurfural (MGK Repelente 11); butoxipolipropilenoglicol; N-butilacetanilida; normal-butil-6,6-dimetil-5,6-di-hidro-1,4-pirona-2-carboxilato (Indalona); adipato de dibutila; ftalato de dibutila; succinato de di-normal-butila (Tabatrex); N,N-dietil-meta-toluamida (DEET); carbato de dimetila (biciclo[2.2.1]hept-5-eno-2,3-dicarboxilato de (endo,endo)-dimetila); ftalato de dimetila; 2-etil-2-butil-1,3-propanodiol; 2-etil-1,3-hexanodiol (Rutgers 612); isocincomeronato de di-normal-propila (MGK Repelente 326); 2-fenilciclo-hexanol; p-metano-3,8-diol e N,N-dietilsuccinamato de normal-propila.
Outros repelentes incluem óleo de citronela, ftalato de dimetila, oxalato de óxido de normal-butilmesitila e hexanodiol-1,3 de 2- etila (Ver Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 2ª Ed., Vol. 11: 724-728; e The Condensed Chemical Dictionary, 8ª Ed., p 756). Um repelente de insetos pode ser um repelente de insetos sintético ou não sintético.
Exemplos de repelentes de insetos sintéticos incluem antranilato de metila e outros repelentes de insetos à base de antranilato, benzaldeído, DEET (N,N-dietil-m-toluamida), carbato de dimetila, ftalato de dimetila, icaridina (isto é, picaridina, Bayrepel e KBR 3023), indalona (por exemplo, como usado em uma mistura “6-2-2” (Ftalato de dimetila a 60%, Indalona a 20%, Etil-hexanodiol a 20%), IR3535 (Ácido 3-[N-butil-N-acetil]-aminopropiônico, éster de etila), metoflutrina, permetrina, SS220 ou éter de triciclodecenila alila.
Exemplos de repelentes de insetos naturais incluem folhas de beautyberry (Callicarpa), casca de bétula, murta do pântano (Myrica gale), óleo de erva-gateira (por exemplo, nepetalactona), óleo de citronela, óleo essencial de eucalipto de limão (Corymbia citriodora; por exemplo, p-mentano-3,8-diol (PMD)), óleo de nim, capim-limão, óleo da árvore do chá das folhas de Melaleuca alternifolia, tabaco ou seus extratos.
ix.
Agentes Fertilizantes As composições de PMP descritas aqui podem incluir adicionalmente um agente fertilizante heterólogo.
Em alguns casos, o agente fertilizante heterólogo está associado aos PMPs.
Por exemplo, um PMP pode encapsular o agente fertilizante heterólogo.
Adicionalmente, ou alternativamente, o agente fertilizante heterólogo pode ser embebido na ou conjugado à superfície do PMP.
Exemplos de agentes fertilizantes heterólogos incluem nutrientes vegetais ou reguladores do crescimento vegetal, tais como aqueles bem conhecidos na técnica.
Alternativamente, ou adicionalmente, o agente fertilizante pode ser um peptídeo, um polipeptídeo, um ácido nucleico ou um polinucleotídeo que pode aumentar a aptidão de um simbionte vegetal.
O agente fertilizante pode ser um agente que pode aumentar a aptidão de uma variedade de plantas ou simbiontes vegetais ou pode ser um que visa uma ou mais plantas alvo ou simbiontes vegetais específicos (por exemplo, uma espécie ou gênero específico de plantas ou simbiontes vegetais). Em alguns casos, o agente fertilizante heterólogo pode ser modificado.
Por exemplo, a modificação pode ser uma modificação química, por exemplo, conjugação a um marcador, por exemplo, marcador fluorescente ou um marcador radioativo.
Em outros exemplos, a modificação pode incluir conjugação ou ligação operacional a uma fração que intensifica a estabilidade, entrega, direcionamento, biodisponibilidade ou meia-vida do agente, por exemplo, um lipídeo, uma glicana, um polímero (por exemplo, PEG), uma fração catiônica.
Exemplos de agentes fertilizantes heterólogos que podem ser usados nas composições de PMP e métodos presentemente divulgados são delineados em baixo.
Em alguns casos, o agente fertilizante heterólogo inclui qualquer material de origem natural ou sintética que é aplicado aos solos ou aos tecidos vegetais para fornecer um ou mais nutrientes vegetais essenciais ao crescimento de plantas.
O nutriente da planta pode incluir um macronutriente, micronutriente ou uma sua combinação.
Os macronutrientes vegetais incluem nitrogênio, fósforo, potássio, cálcio, magnésio e/ou enxofre.
Os micronutrientes vegetais incluem cobre, ferro, manganês, molibdênio, zinco, boro, silício, cobalto e/ou vanádio.
Exemplos de fertilizantes de nutrientes vegetais incluem um fertilizante de nitrogênio incluindo, mas não se limitando a, ureia, nitrato de amônio, sulfato de amônio, soluções de nitrogênio sem pressão, amônia aquosa, amônia anidra, tiossulfato de amônio, ureia revestida com enxofre, ureia-formaldeídos, IBDU, ureia revestida com polímero, nitrato de cálcio, forma de ureia ou ureia de metileno, fertilizantes de fósforo tais como fosfato de diamônio, fosfato de monoamônio, polifosfato de amônio, superfosfato concentrado e superfosfato triplo ou fertilizantes de potássio tais como cloreto de potássio, sulfato de potássio, sulfato de potássio-magnésio, nitrato de potássio.
Tais composições podem existir como sais livres ou íons dentro da composição.
Os fertilizantes podem ser designados pelo conteúdo de um ou mais de seus componentes, tais como nitrogênio, fósforo ou potássio.
O conteúdo destes elementos em um fertilizante pode ser indicado pelo valor N—P—K (onde N = conteúdo de nitrogênio por percentagem em peso, P = conteúdo de fósforo por percentagem em peso e K = conteúdo de potássio por percentagem em peso). Os fertilizantes inorgânicos, por outro lado, são fabricados a partir de materiais não vivos e incluem, por exemplo, nitrato de amônio, sulfato de amônio, ureia, cloreto de potássio, potássio, fosfato de amônio, amônia anidra e outros sais de fosfato.
Os fertilizantes inorgânicos estão prontamente comercialmente disponíveis e contêm nutrientes na forma solúvel que estão imediatamente disponíveis para a planta.
Os fertilizantes inorgânicos são geralmente baratos, tendo um baixo custo unitário para o elemento desejado.
Um perito na técnica apreciará que a quantidade exata de um dado elemento em um agente fertilizante pode ser calculada e administrada à planta ou solo.
Os fertilizantes podem ser adicionalmente classificados como fertilizantes orgânicos ou fertilizantes inorgânicos.
Os fertilizantes orgânicos incluem fertilizantes tendo um esqueleto molecular com um esqueleto de carbono, tal como em composições derivadas de matéria viva.
Os fertilizantes orgânicos são feitos de materiais derivados de coisas vivas.
Estrume animal, composto, farinha de ossos, farinha de penas e farinha de sangue são exemplos de fertilizantes orgânicos comuns.
Os fertilizantes orgânicos, por outro lado, não estão tipicamente imediatamente disponíveis para as plantas e requerem microrganismos do solo para quebrar os componentes do fertilizante em estruturas mais simples antes do uso pelas plantas.
Adicionalmente, os fertilizantes orgânicos podem não só provocar uma resposta de crescimento das plantas como observado com fertilizantes inorgânicos comuns, mas os fertilizantes orgânicos naturais podem também estimular o crescimento e atividades da população microbiana do solo.
A população microbiana do solo aumentada (por exemplo, simbiontes vegetais) pode ter efeitos benéficos significativos nas propriedades físicas e químicas do solo, bem como resistência crescente a doenças e pragas.
Em um aspecto, uma composição de PMP incluindo um nutriente vegetal como descrito aqui pode ser contatado com a planta em uma quantidade e durante um período de tempo suficientes para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de nutriente vegetal dentro da ou na planta e (b) aumentar a aptidão da planta em relação a uma planta não tratada.
Em outro aspecto, uma composição de PMP incluindo um nutriente vegetal como descrito aqui pode ser contatado com o simbionte vegetal em uma quantidade e durante um período de tempo suficientes para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de nutriente vegetal dentro do ou no simbionte vegetal (por exemplo, um endossimbionte de bactéria ou fúngico) e (b) aumentar a aptidão do simbionte vegetal em relação a um simbionte vegetal não tratado.
O agente fertilizante heterólogo pode incluir um regulador do crescimento de plantas.
Reguladores do crescimento de plantas exemplificativas incluem auxinas, citocininas, giberelinas e ácido abscísico.
Em alguns casos, o regulador do crescimento de plantas é ácido abscísico, amidocloro, ancimidol, 6-benzilaminopurina, brassinolídeo, butralina, clormequate (cloreto de clormequate), cloreto de colina, ciclanilida, daminozida, dicegulac, dimetipina, 2,6- dimetilpuridina, etefona, flumetralina,, flurprimidol, flutiacete, forclorfenurona, ácido giberélico, inabenfida, ácido indol-3-acético, hidrazida maleica, mefluidida, mepiquate (cloreto de mepiquate), ácido naftalenoacético, N-6-benziladenina, paclobutrazol, pro-hexadiona (pro- hexadiona- cálcio), pro-hidrojasmona, tidiazurona, triapentenol, fosforotritioato de tributila, ácido 2,3,5-tri-iodobenzoico, trinexapac-etila e uniconazol.
Outros reguladores do crescimento de plantas que podem ser incorporados em composições de revestimento de sementes são descritos em US 2012/0108431, que é incorporada por referência em sua totalidade. x.
Agentes modificadores de Plantas As composições de PMP descritas aqui incluem um ou mais agentes modificadores de plantas heterólogos.
Por exemplo, os PMPs podem encapsular o agente modificador de plantas heterólogo.
Alternativamente ou adicionalmente, o agente modificador de plantas heterólogo pode ser embebido na ou conjugado à superfície do PMP.
Em alguns casos, o agente modificador de plantas pode incluir um peptídeo ou um ácido nucleico.
O agente modificador de plantas pode ser um agente que aumenta a aptidão de uma variedade de plantas ou pode ser um que visa uma ou mais plantas específicas (por exemplo, uma espécie ou gênero específico de plantas). Adicionalmente, em alguns casos, as composições de PMP incluem dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10) diferentes agentes modificadores de plantas.
Adicionalmente, em alguns casos, o agente modificador de plantas heterólogo (por exemplo, um agente incluindo uma molécula de ácido nucleico ou peptídeo) pode ser modificado.
Por exemplo, a modificação pode ser uma modificação química, por exemplo, conjugação a um marcador, por exemplo, marcador fluorescente ou um marcador radioativo.
Em outros exemplos, a modificação pode incluir conjugação ou ligação operacional a uma fração que intensifica a estabilidade, entrega, direcionamento, biodisponibilidade ou meia-vida do agente, por exemplo, um lipídeo, uma glicana, um polímero (por exemplo, PEG), uma fração catiônica.
Exemplos de agentes modificadores de plantas heterólogos (por exemplo, peptídeos ou ácidos nucleicos) que podem ser usados nas composições de PMP e métodos presentemente divulgados são delineados em baixo.
A.
Polipeptídeos A composição de PMP (por exemplo, PMPs) descrita aqui pode incluir um polipeptídeo heterólogo.
Em alguns casos, a composição de PMP descrita aqui inclui um polipeptídeo ou seus fragmentos funcionais ou derivados que modificam uma planta (por exemplo, aumenta a aptidão da planta). Por exemplo, o polipeptídeo pode aumentar a aptidão de uma planta.
Uma composição de PMP incluindo um polipeptídeo como descrito aqui pode ser contatado com uma planta em uma quantidade e durante tempo suficientes para: (a)
alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de polipeptídeo; e (b) modificar a planta (por exemplo, aumentar a aptidão da planta). Exemplos de polipeptídeos que podem ser usados aqui podem incluir uma enzima (por exemplo, uma recombinase metabólica, uma helicase, uma integrase, uma RNAse, uma DNAse ou uma proteína de ubiquitinação), uma proteína formadora de poros, um ligando de sinalização, um peptídeo de penetração de células, um fator de transcrição, um receptor, um anticorpo, um nanocorpo, uma proteína de edição gênica (por exemplo, sistema CRISPR-Cas, TALEN ou dedo de zinco), riboproteína, um aptâmero de proteína ou uma chaperona.
Os polipeptídeos incluídos aqui podem incluir polipeptídeos ocorrendo naturalmente ou variantes recombinantemente produzidas.
Em alguns casos, o polipeptídeo pode ser um seu fragmento ou variante funcional (por exemplo, um seu fragmento ou variante enzimaticamente ativo). Por exemplo, o polipeptídeo pode ser uma variante funcionalmente ativa de qualquer um dos polipeptídeos descritos aqui com pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade, por exemplo, ao longo de uma região especificada ou ao longo da sequência inteira, com uma sequência de um polipeptídeo descrito aqui ou um polipeptídeo ocorrendo naturalmente.
Em alguns casos, o polipeptídeo pode ter pelo menos 50% (por exemplo, pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% ou mais) identidade com uma proteína de interesse.
Os polipeptídeos descritos aqui podem ser formulados em uma composição para qualquer um dos usos descritos aqui.
As composições divulgadas aqui podem incluir qualquer número ou tipo (por exemplo, classes) de polipeptídeos, tal como pelo menos cerca de qualquer um de 1 polipeptídeo, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 ou mais polipeptídeos.
Uma concentração adequada de cada polipeptídeo na composição depende de fatores tais como eficácia, estabilidade do polipeptídeo, número de polipeptídeos distintos na composição, a formulação e métodos de aplicação da composição.
Em alguns casos, cada polipeptídeo em uma composição líquida é de cerca de 0,1 ng/mL a cerca de 100 mg/mL.
Em alguns casos, cada polipeptídeo em uma composição sólida é de cerca de 0,1 ng/g a cerca de 100 mg/g.
Métodos de fabricação de um polipeptídeo são rotina na técnica.
Ver, em geral, Smales & James (Eds.), Therapeutic Proteins: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press (2005); e Crommelin, Sindelar & Meibohm (Eds.), Pharmaceutical Biotechnology: Fundamentals and Applications, Springer (2013). Métodos para produção de um polipeptídeo envolvem expressão em células de plantas, embora as proteínas recombinantes possam ser também produzidas usando células de insetos, células de levedura, bactéria, mamífero ou outras células sob o controle de promotores apropriados.
Os vetores de expressão de mamífero podem compreender elementos não transcritos tais como uma origem de replicação, um promotor e intensificador adequados e outras sequências não transcritas flanqueantes 5' ou 3' e sequências não traduzidas 5' ou 3' tais como locais de ligação ao ribossomo necessários, um local de poliadenilação, locais dadores e aceitadores de encadeamento e sequências de terminação.
Sequências de DNA derivadas do genoma viral do SV40, por exemplo, origem de SV40, promotor inicial, intensificador, locais de encadeamento e poliadenilação podem ser usadas para proporcionar os outros elementos genéticos requeridos para expressão de uma sequência de DNA heteróloga.
Vetores de clonagem e expressão apropriados para uso com hospedeiros celulares bacterianos, fúngicos, de levedura e mamífero são descritos em Green & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Quarta Edição), Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012). Vários sistemas de cultura de células de mamífero podem ser empregues para expressar e fabricar um agente de polipeptídeo recombinante.
Exemplos de sistemas de expressão de mamífero incluem células CHO, células COS, linhas de células HeLA e BHK.
Processos de cultura de células hospedeiras para produção de agentes terapêuticos proteicos são descritos, por exemplo, em Zhou e Kantardjieff (Eds.), Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing (Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology), Springer (2014). A purificação de proteínas é descrita em Franks, Protein Biotechnology: Isolation, Characterization, and Stabilization, Humana Press (2013); e em Cutler, Protein Purification Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press (2010). A formulação de terapêuticos de proteína é descrita em Meyer (Ed.), Therapeutic Protein Drug Products: Practical Approaches to formulation in the Laboratory, Manufacturing, and the Clinic, Woodhead Publishing Series (2012). Em alguns casos, a composição de PMP inclui um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno.
Por exemplo, um agente descrito aqui pode ser um anticorpo que bloqueia ou potencia a atividade e/ou função de um componente da planta.
O anticorpo pode atuar como um antagonista ou agonista de um polipeptídeo (por exemplo, enzima ou receptor celular) na planta.
A preparação e uso de anticorpos contra um antígeno alvo são conhecidos na técnica.
Ver, por exemplo, Zhiqiang An (Ed.), Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, 1ª Edição, Wiley, 2009 e também Greenfield (Ed.), Antibodies: A Laboratory Manual, 2ª Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2013, para métodos de preparação de anticorpos recombinantes, incluindo manipulação de anticorpos, uso de oligonucleotídeos degenerados, 5'-RACE, exibição em fagos e mutagênese; teste e caracterização de anticorpos; farmacocinética e farmacodinâmica de anticorpos; purificação e armazenamento de anticorpos; e técnicas de rastreamento e marcação. B. Ácidos Nucleicos Em alguns casos, os PMPs descritos aqui incluem um ácido nucleico heterólogo. Numerosos ácidos nucleicos são úteis nas composições de PMP e métodos descritos aqui. Os PMPs divulgados aqui podem incluir qualquer número ou tipo (por exemplo, classes) de ácidos nucleicos heterólogos (por exemplo, molécula de DNA ou molécula de RNA, por exemplo, mRNA, RNA guia (gRNA) ou molécula de RNA inibidor (por exemplo, siRNA, shRNA ou miRNA) ou uma molécula de DNA-RNA híbrida), tal como pelo menos cerca de 1 classe ou variante de um ácido nucleico, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 ou mais classes ou variantes de ácidos nucleicos. Uma concentração adequada de cada ácido nucleico na composição depende de fatores tais como eficácia, estabilidade do ácido nucleico, número de ácidos nucleicos distintos, a formulação e métodos de aplicação da composição. Exemplos de ácidos nucleicos úteis aqui incluem um pequeno RNA de interferência (dsiRNA) com substrato Dicer, um RNA antissenso, um curto RNA de interferência (siRNA), um grampo de cabelo curto (shRNA), um microRNA (miRNA), um (RNA de interferência assimétrico) aiRNA, um ácido nucleico de peptídeo (PNA), um morfolino, um ácido nucleico bloqueado (LNA), um RNA de interação com piwi (piRNA), uma ribozima, uma desoxirribozima (DNAzime), um aptâmero (DNA, RNA), um RNA circular (circRNA), um RNA guia (gRNA) ou uma molécula de
DNA Uma composição de PMP incluindo um ácido nucleico como descrito aqui pode ser contatado com uma planta em uma quantidade e durante tempo suficientes para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo,
um nível predeterminado ou limiar) de concentração de ácido nucleico; e (b) modificar a planta (por exemplo, aumentar a aptidão da planta). (a) Ácidos Nucleicos Codificando Peptídeos Em alguns casos, os PMPs incluem um ácido nucleico heterólogo codificando um polipeptídeo. Os ácidos nucleicos codificando um polipeptídeo podem ter um comprimento de cerca de 10 a cerca de 50 000 nucleotídeos (nts), cerca de 25 a cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 50 a cerca de 150 nucleotídeos, cerca de 100 a cerca de 200 nucleotídeos, cerca de 150 a cerca de 250 nucleotídeos, cerca de 200 a cerca de 300 nucleotídeos, cerca de 250 a cerca de 350 nucleotídeos, cerca de 300 a cerca de 500 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 1000 nucleotídeos, cerca de 50 a cerca de 1000 nucleotídeos, cerca de 100 a cerca de 1000 nucleotídeos, cerca de 1000 a cerca de 2000 nucleotídeos, cerca de 2000 a cerca de 3000 nucleotídeos, cerca de 3000 a cerca de 4000 nucleotídeos, cerca de 4000 a cerca de 5000 nucleotídeos, cerca de 5000 a cerca de 6000 nucleotídeos, cerca de 6000 a cerca de 7000 nucleotídeos, cerca de 7000 a cerca de 8000 nucleotídeos, cerca de 8000 a cerca de 9000 nucleotídeos, cerca de 9000 a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 10.000 a cerca de
15.000 nucleotídeos, cerca de 10.000 a cerca de 20000 nucleotídeos, cerca de 10.000 a cerca de 25.000 nucleotídeos, cerca de 10.000 a cerca de 30.000 nucleotídeos, cerca de 10.000 a cerca de 40.000 nucleotídeos, cerca de 10.000 a cerca de 45.000 nucleotídeos, cerca de
10.000 a cerca de 50.000 nucleotídeos ou qualquer gama intermédia. A composição de PMP pode também incluir variantes funcionalmente ativas de uma sequência de ácido nucleico de interesse. Em alguns casos, a variante dos ácidos nucleicos tem pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade, por exemplo, ao longo de uma região especificada ou ao longo da sequência inteira, com uma sequência de um ácido nucleico de interesse.
Em alguns casos, a invenção inclui um polipeptídeo funcionalmente ativo codificado por uma variante de ácido nucleico como descrito aqui.
Em alguns casos, o polipeptídeo funcionalmente ativo codificado pela variante de ácido nucleico tem pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade, por exemplo, ao longo uma região especificada ou ao longo da sequência de aminoácidos inteira, com uma sequência de um polipeptídeo de interesse ou a sequência de polipeptídeos naturalmente derivada.
Certos métodos para expressar um ácido nucleico codificando uma proteína podem envolver expressão em células, incluindo células de insetos, leveduras, plantas, bactérias ou outras sob o controle de promotores apropriados.
Os vetores de expressão podem incluir elementos não transcritos, tais como uma origem de replicação, um promotor e intensificador adequados e outras sequências não transcritas flanqueantes 5' ou 3' e sequências não traduzidas 5' ou 3' tais como locais de ligação ao ribossomo necessários, um local de poliadenilação, locais dadores e aceitadores de encadeamento e sequências de terminação.
Sequências de DNA derivadas do genoma viral do SV40, por exemplo, origem de SV40, promotor inicial, intensificador, locais de encadeamento e poliadenilação podem ser usadas para proporcionar os outros elementos genéticos requeridos para expressão de uma sequência de DNA heteróloga.
Vetores de clonagem e expressão apropriados para uso com hospedeiros celulares bacterianos, fúngicos, de levedura e mamífero são descritos em Green et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Quarta Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012.
A modificação genética usando métodos recombinantes é geralmente conhecida na técnica.
Uma sequência de ácido nucleico codificando um gene desejado pode ser obtida usando métodos recombinantes conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, por rastreamento de bibliotecas de células expressando o gene, por derivação do gene a partir de um vetor conhecido como incluindo o mesmo ou por isolamento diretamente a partir de células e tecidos contendo o mesmo, usando técnicas padrão.
Alternativamente, um gene de interesse pode ser produzido sinteticamente, ao invés de clonado.
A expressão de ácidos nucleicos naturais ou sintéticos é tipicamente alcançada por ligação operacional de um ácido nucleico codificando o gene de interesse a um promotor e incorporação do construto em um vetor de expressão.
Os vetores de expressão podem ser adequados para replicação e expressão em bactérias.
Os vetores de expressão podem ser também adequados para replicação e integração em eucariotas.
Vetores de clonagem típicos contêm terminadores da transcrição e tradução, sequências de iniciação e promotores úteis para expressão da sequência de ácido nucleico desejada.
Elementos promotores adicionais, por exemplo, intensificadores, regulam a frequência da iniciação transcricional.
Tipicamente, estes estão localizados na região 30-110 pares de bases (pb) a montante do local de início, embora tenha sido recentemente mostrado que um número de promotores contém também elementos funcionais a jusante do local de início.
O espaçamento entre elementos promotores é frequentemente flexível, tal que a função promotora seja conservada quando os elementos são invertidos ou deslocados entre si.
No promotor de timidina cinase (tk), o espaçamento entre elementos promotores pode ser aumentado até afastamento de 50 pb antes de a atividade começar a declinar.
Dependendo do promotor parece que elementos individuais podem funcionar cooperativamente ou independentemente para ativar a transcrição.
Um exemplo de um promotor adequado é a sequência do promotor inicial imediato do citomegalovírus (CMV). Esta sequência promotora é uma sequência promotora constitutiva forte capaz de dirigir níveis elevados de expressão de qualquer sequência de polinucleotídeos operacionalmente ligada a ela.
Outro exemplo de um promotor adequado é o Fator de Crescimento de Alongamento-1α (EF- 1α). No entanto, outras sequências de promotores constitutivos podem ser também usadas, incluindo o, mas não se limitando ao, promotor inicial do vírus símio 40 (SV40), vírus do tumor mamário de camundongo (MMTV), promotor de repetições terminais longas (LTR) do vírus da imunodeficiência humana (HIV), promotor de MoMuLV, um promotor do vírus da leucemia aviária, um promotor inicial imediato do vírus de Epstein-Barr, um promotor do vírus do sarcoma de Rous, bem como promotores de genes humanos tais como o, mas não se limitando ao, promotor da actina, promotor de miosina, promotor de hemoglobina e promotor de creatina cinase.
Alternativamente, o promotor pode ser um promotor induzível.
O uso de um promotor induzível proporciona um interruptor molecular capaz de ligar a expressão da sequência de polinucleotídeos que é operacionalmente ligada quando tal expressão é desejada ou desligar a expressão quando a expressão não é desejada.
Exemplos de promotores induzíveis incluem, mas não estão limitados a, um promotor da metalotionina, um promotor de glucocorticoides, um promotor da progesterona e um promotor da tetraciclina.
O vetor de expressão a ser introduzido pode também conter um gene marcador selecionável ou um gene repórter ou ambos para facilitar a identificação e seleção de células de expressão a partir da população de células que se pretende transfectar ou infectar através de vetores virais.
Em outros aspectos, o marcador selecionável pode ser transportado em uma porção separada de DNA e usado em um procedimento de cotransfecção.
Tanto marcadores selecionáveis como genes repórter podem ser flanqueados com sequências reguladoras apropriadas para permitir a expressão nas células hospedeiras.
Marcadores selecionáveis úteis incluem, por exemplo, genes de resistência a antibióticos, tais como neo e similares.
Os genes repórter podem ser usados para se identificarem células potencialmente transformadas e para se avaliar a funcionalidade de sequências reguladoras.
Em geral, um gene repórter é um gene que não está presente na nem é expresso pela fonte receptora e que codifica um polipeptídeo cuja expressão é manifestada por alguma propriedade facilmente detectável, por exemplo, atividade enzimática.
A expressão do gene repórter é avaliada em um momento adequado após o DNA ter sido introduzido nas células receptoras.
Genes repórter adequados podem incluir genes codificando luciferase, beta-galactosidase, cloranfenicol acetil-transferase, fosfatase alcalina secretada ou o gene da proteína verde fluorescente (por exemplo, Ui-Tei et al., FEBS Letters 479: 79-82, 2000). Sistemas de expressão adequados são bem conhecidos e podem ser preparados usando técnicas conhecidas ou obtidos comercialmente.
Em geral, o construto com a região flanqueante 5' mínima mostrando o nível mais elevado de expressão do gene repórter é identificado como o promotor.
Tais regiões promotoras podem ser ligadas a um gene repórter e usadas para se avaliarem agentes quanto à capacidade de modular a transcrição dirigida por promotores.
Em alguns casos, um organismo pode ser geneticamente modificado para alterar a expressão de uma ou mais proteínas.
A expressão da uma ou mais proteínas pode ser modificada durante um tempo específico, por exemplo, estado de desenvolvimento ou diferenciação do organismo.
Em um caso, a invenção inclui uma composição para alterar a expressão de uma ou mais proteínas, por exemplo, proteínas que afetam a atividade, estrutura ou função.
A expressão da uma ou mais proteínas pode ser restringida a localização(ões) específica(s) ou disseminada ao longo do organismo. (b) mRNA Sintético A composição de PMP pode incluir uma molécula de mRNA sintética, por exemplo, uma molécula de mRNA sintética codificando um polipeptídeo.
A molécula de mRNA sintética pode ser modificada, por exemplo, quimicamente.
A molécula de mRNA pode ser quimicamente sintetizada ou transcrita in vitro.
A molécula de mRNA pode ser disposta em um plasmídeo, por exemplo, um vetor viral, vetor bacteriano ou vetor de expressão eucariótico.
Em alguns exemplos, a molécula de mRNA pode ser entregue a células por transfecção, eletroporação ou transdução (por exemplo, transdução adenoviral ou lentiviral). Em alguns casos, o agente de RNA modificado de interesse descrito aqui tem nucleosídeos ou nucleotídeos modificados.
Tais modificações são conhecidas e são descritas, por exemplo, em WO 2012/019168. Modificações adicionais são descritas, por exemplo, em WO 2015/038892; WO 2015/038892; WO 2015/089511; WO 2015/196130; WO 2015/196118 e WO 2015/196128 A2. Em alguns casos, o RNA modificado codificando um polipeptídeo de interesse tem uma ou mais modificações terminais, por exemplo, uma estrutura de proteção terminal 5' e/ou uma cauda de poli- A (por exemplo, de entre 100-200 nucleotídeos em comprimento). A estrutura de proteção terminal 5' pode ser selecionada do grupo consistindo em CapO, Capl, ARCA, inosina, Nl-metil-guanosina, 2'fluoro-guanosina, 7-desaza-guanosina, 8-oxo-guanosina, 2-amino- guanosina, LNA-guanosina e 2-azido-guanosina.
Em alguns casos, os RNAs modificados contêm também uma 5' UTR incluindo pelo menos uma sequência de Kozak e uma 3' UTR.
Tais modificações são conhecidas e são descritas, por exemplo, em WO 2012/135805 e WO 2013/052523. Modificações terminais adicionais são descritas, por exemplo, em WO 2014/164253 e WO 2016/011306, WO 2012/045075, e WO 2014/093924. Enzimas quiméricas para sintetizar moléculas de RNA com proteção terminal (por exemplo, mRNA modificado) que podem incluir pelo menos uma modificação química são descritas em WO 2014/028429. Em alguns casos, um mRNA modificado pode ser ciclizado, ou concatemerizado, para gerar uma molécula competente para tradução para auxiliar interações entre proteínas de ligação de poli-A e proteínas de ligação de extremidade 5'. O mecanismo de ciclização ou concatemerização pode ocorrer através de pelo menos 3 vias diferentes: 1) química, 2) enzimática e 3) catalisada por ribozimas.
A ligação 5'/3' recém-formada pode ser intramolecular ou intermolecular.
Tais modificações são descritas, por exemplo, em WO 2013/151736. Métodos de preparação e purificação de RNA modificados são conhecidos e divulgados na técnica.
Por exemplo, os RNAs modificados são preparados usando somente síntese enzimática com transcrição in vitro (IVT). Métodos de preparação de polinucleotídeos IVT são conhecidos na técnica e são descritos em WO 2013/151666, WO 2013/151668, WO 2013/151663, WO 2013/151669, WO 2013/151670, WO 2013/151664, WO 2013/151665, WO 2013/151671, WO 2013/151672, WO 2013/151667 e WO 2013/151736. Os métodos de purificação incluem purificar um transcrito de RNA incluindo uma cauda de poliA por contato da amostra com uma superfície ligada a uma pluralidade de timidinas ou seus derivados e/ou uma pluralidade de uracilas ou seus derivados (poliT/U) sob condições tais que o transcrito de RNA se ligue à superfície e eluição do transcrito de RNA purificado a partir da superfície (WO 2014/152031); usando cromatografia de permuta iônica (por exemplo, aniônica) que permite a separação de RNAs mais longos até 10.000 nucleotídeos em comprimento através de um método escalonável (WO 2014/144767); e sujeição de uma amostra de mRNA modificado a tratamento com DNAse (WO 2014/152030). Formulações de RNA modificados são conhecidas e são descritas, por exemplo, em WO 2013/090648. Por exemplo, a formulação pode ser, mas não está limitada a, nanopartículas, microesferas de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), lipidoides, lipoplex, lipossomo, polímeros, carboidratos (incluindo açúcares simples), lipídeos catiônicos, gel de fibrina, hidrogel de fibrina, cola de fibrina, selante de fibrina, fibrinogênio, trombina, nanopartículas de lipídeos rapidamente eliminadas (reLNP) e suas combinações.
RNAs modificados codificando polipeptídeos nas áreas de doença humana, anticorpos, vírus e uma variedade de cenários in vivo são conhecidos e são divulgados, por exemplo, na Tabela 6 das Publicações Internacionais Nos.
WO 2013/151666, WO 2013/151668, WO 2013/151663, WO 2013/151669, WO 2013/151670, WO 2013/151664, WO 2013/151665, WO 2013/151736; Tabelas 6 e 7 da Publicação Internacional No.
WO 2013/151672; Tabelas 6, 178 e 179 da Publicação Internacional No.
WO 2013/151671; Tabelas 6, 185 e 186 da Publicação Internacional No WO 2013/151667. Qualquer um dos anteriores pode ser sintetizado como um polinucleotídeo IVT, polinucleotídeo quimérico ou um polinucleotídeo circular, e cada um pode incluir um ou mais nucleotídeos modificados ou modificações terminais. (c) RNA Inibidor Em alguns casos, a composição de PMP inclui uma molécula de RNA inibidor, por exemplo, que atua através da via de interferência de RNA (RNAi). Em alguns casos, a molécula de RNA inibidora diminui o nível de expressão gênica em uma planta e/ou diminui o nível de uma proteína na planta.
Em alguns casos, a molécula de RNA inibidora inibe a expressão de um gene da planta.
Por exemplo, uma molécula de RNA inibidora pode incluir um curto RNA de interferência, um curto RNA em grampo de cabelo e/ou um microRNA que tem visa um gene na planta.
Certas moléculas de RNA podem inibir a expressão gênica através do processo biológico de interferência de RNA (RNAi). As moléculas de RNAi incluem RNA ou estruturas tipo RNA tipicamente contendo 15-50 pares de bases (tal como cerca de 18-25 pares de bases) e tendo uma sequência de núcleobases idêntica (complementar) ou quase idêntica (substancialmente complementar) a uma sequência codificante em um gene alvo expresso dentro da célula.
As moléculas de RNAi incluem, mas não estão limitadas a: RNA interferentes curtos (siRNA), RNA de fita dupla (dsRNA), RNA em grampo curtos (shRNA), merodúplexes, substratos dicer e interferência de RNA multivalente (Pat. dos E.U.A.
Nos. 8,084,599, 8,349,809, 8,513,207 e 9,200,276). Um shRNA é uma molécula de RNA incluindo uma volta em grampo de cabelo que diminui a expressão de genes alvo através de RNAi.
Os shRNAs podem ser entregues a células na forma de plasmídeos, por exemplo, vetores virais ou bacterianos, por exemplo, por transfecção, eletroporação ou transdução.
Um microRNA é uma molécula de RNA não codificante que tem tipicamente um comprimento de cerca de 22 nucleotídeos.
Os miRNAs se ligam a locais alvo em moléculas de mRNA e silenciam o mRNA, por exemplo, ao causarem clivagem do mRNA, desestabilização do mRNA ou inibição da tradução do mRNA.
Em alguns casos, a molécula de RNA inibidora diminui o nível e/ou atividade de um regulador negativo da função.
Em outros casos, a molécula de RNA inibidora diminui o nível e/ou atividade de um inibidor de um regulador positivo da função.
A molécula de RNA inibidor pode ser quimicamente sintetizada ou transcrita in vitro.
Em alguns casos, o ácido nucleico é um DNA, um RNA ou um PNA.
Em alguns casos, o RNA é um RNA inibidor.
Em alguns casos, o RNA inibidor inibe a expressão gênica em uma planta.
Em alguns casos, o ácido nucleico é um mRNA, um mRNA modificado ou uma molécula de DNA que, na planta, aumenta a expressão de uma enzima (por exemplo, uma recombinase metabólica, uma helicase, uma integrase, uma RNAse, uma DNAse ou uma proteína de ubiquitinação), uma proteína formadora de poros, um ligando de sinalização, um peptídeo de penetração de células, um fator de transcrição, um receptor, um anticorpo, um nanocorpo, uma proteína de edição gênica (por exemplo, sistema CRISPR-Cas, TALEN ou dedo de zinco), riboproteína, um aptâmero de proteína ou uma chaperona.
Em alguns casos, o ácido nucleico é um mRNA, um mRNA modificado ou uma molécula de DNA que aumenta a expressão de uma enzima (por exemplo, uma enzima metabólica, uma enzima recombinase, uma enzima helicase, uma enzima integrase, uma enzima RNAse, uma enzima DNAse ou uma proteína de ubiquitinação), uma proteína formadora de poros, um ligando de sinalização, um peptídeo de penetração de células, um fator de transcrição, um receptor, um anticorpo, um nanocorpo, uma proteína de edição gênica (por exemplo, um sistema CRISPR-Cas, uma TALEN ou um dedo de zinco), uma riboproteína, um aptâmero de proteína ou uma chaperona.
Em alguns casos, o aumento na expressão na planta é um aumento na expressão de cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, a expressão em uma planta não tratada). Em alguns casos, o aumento na expressão na planta é um aumento na expressão de cerca de 2x vezes, cerca de 4x vezes, cerca de 5x vezes, cerca de 10x vezes, cerca de 20x vezes, cerca de 25x vezes, cerca de 50x vezes, cerca de 75x vezes ou cerca de 100x vezes ou mais, em relação a um nível de referência (por exemplo, a expressão em uma planta não tratada).
Em alguns casos, o ácido nucleico é um RNA antissenso, um dsiRNA, um siRNA, um shRNA, um miRNA, um aiRNA, um PNA, um morfolino, um LNA, um piRNA, uma ribozima, uma DNAzima, um aptâmero (DNA, RNA), um circRNA, um gRNA ou uma molécula de DNA (por exemplo, um polinucleotídeo antissenso) que atua para reduzir, na planta, a expressão de, por exemplo, uma enzima (uma enzima metabólica, uma enzima recombinase, uma enzima helicase, uma enzima integrase, uma enzima RNAse, uma enzima DNAse, uma enzima polimerase, uma proteína de ubiquitinação, uma enzima de gestão de superóxido ou uma enzima de produção de energia), um fator de transcrição, uma proteína secretora, um fator estrutural (actina, cinesina ou tubulina), um riboproteína, um aptâmero de proteína, uma chaperona, um receptor, um ligando de sinalização ou um transportador.
Em alguns casos, a diminuição na expressão na planta é uma diminuição na expressão de cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, a expressão em uma planta não tratada). Em alguns casos, a diminuição na expressão na planta é uma diminuição na expressão de cerca de 2x vezes, cerca de 4x vezes, cerca de 5x vezes, cerca de 10x vezes, cerca de 20x vezes, cerca de 25x vezes, cerca de 50x vezes, cerca de 75x vezes ou cerca de 100x vezes ou mais, em relação a um nível de referência (por exemplo, a expressão em uma planta não tratada). As moléculas de RNAi incluem uma sequência substancialmente complementar, ou totalmente complementar, a todo ou um fragmento de um gene alvo.
As moléculas de RNAi podem complementar sequências na fronteira entre íntrons e éxons para prevenir a maturação de transcritos de RNA nuclear recém-gerados de genes específicos em mRNA para transcrição.
As moléculas de RNAi complementares a genes específicos podem hibridar com o mRNA para um gene alvo e prevenir sua tradução.
A molécula antissenso pode ser DNA, RNA ou um seu derivado ou híbrido.
Exemplos de tais moléculas derivadas incluem, mas não estão limitados a, ácido nucleico de peptídeo (PNA) e moléculas à base de fosforotioato tais como guanidina desoxirribonucleica (DNG) ou guanidina ribonucleica (RNG). As moléculas de RNAi podem ser proporcionadas como RNA pronto-a-usar sintetizado in vitro ou como um gene antissenso transfectado em células que originarão moléculas de RNAi após transcrição.
A hibridação com mRNA resulta em degradação da molécula hibridada por RNAse H e/ou inibição da formação de complexos de tradução.
Ambos fazem com que não seja produzido o produto do gene original.
O comprimento da molécula de RNAi que hibrida com o transcrito de interesse pode ser cerca de 10 nucleotídeos, entre cerca de 15 e 30 nucleotídeos, ou cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais nucleotídeos.
O grau de identidade da sequência antissenso com o transcrito visado pode ser pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95. As moléculas de RNAi podem também incluir protuberâncias, isto é, tipicamente nucleotídeos protuberantes, não emparelhados que não estão diretamente envolvidos na estrutura em hélice dupla normalmente formada pelas sequências do núcleo do par definido aqui da fita senso e fita antissenso.
As moléculas de RNAi podem conter protuberâncias 3' e/ou 5' de cerca de 1-5 bases independentemente em cada uma das fitas senso e fitas antissenso.
Em alguns casos, tanto a fita senso como a fita antissenso contêm protuberâncias 3' e 5'. Em alguns casos, um ou mais dos nucleotídeos protuberantes 3' de uma fita formam pares de bases com um ou mais nucleotídeos protuberantes 5' da outra fita.
Em outros casos, o um ou mais dos nucleotídeos protuberantes 3' de uma fita não formam pares de bases com um ou mais nucleotídeos protuberantes 5' da outra fita.
As fitas senso e antissenso de uma molécula de RNAi podem ou não conter o mesmo número de bases de nucleotídeos.
As fitas antissenso e senso podem formar uma hélice dupla em que a extremidade 5' tem somente uma extremidade não coesiva, a extremidade 3' tem somente uma extremidade não coesiva, ambas as extremidades 5' e 3' são não coesivas ou nem a extremidade 5' nem a extremidade 3' são não coesivas.
Em outro caso, um ou mais dos nucleotídeos na protuberância contêm um tiofosfato, fosforotioato, nucleotídeo invertido (ligado 3' a 3') em desoxinucleotídeo ou é um ribonucleotídeo ou desoxinucleotídeo modificado.
As moléculas de pequeno RNA de interferência (siRNA) incluem uma sequência de nucleotídeos que é idêntica a cerca de 15 a cerca de 25 nucleotídeos contíguos do mRNA alvo.
Em alguns casos, a sequência de siRNA começa com o dinucleotídeo AA, inclui um conteúdo de GC de cerca de 30-70% (cerca de 30-60%, cerca de 40- 60% ou cerca de 45%-55%) e não tem uma elevada percentagem de identidade com qualquer sequência de nucleotídeos sem ser o alvo no genoma no qual é para ser introduzida, por exemplo como determinado por pesquisa BLAST padrão. siRNA e shRNA se assemelham a intermediários na via de processamento dos genes de microRNA (miRNA) endógenos (Bartel, Cell 116: 281-297, 2004). Em alguns casos, os siRNAs podem funcionar como miRNAs e vice-versa (Zeng et al., Mol.
Cell 9: 1327-1333, 2002; Doench et al., Genes Dev. 17: 438-442, 2003). Os siRNAs exógenos subregulam mRNA com complementaridade de semente com o siRNA (Birmingham et al., Nat.
Methods 3: 199-204, 2006). Múltiplos locais alvo dentro de uma 3' UTR dão subregulação mais forte (Doench et al., Genes Dev. 17: 438-442, 2003).
Sequências de siRNA e locais de ligação cognatos eficazes conhecidos estão também bem representados na literatura relevante.
As moléculas de RNAi são prontamente desenhadas e produzidas por tecnologias conhecidas na técnica.
Adicionalmente existem ferramentas computacionais que aumentam a chance de se descobrirem motivos de sequências eficazes e específicos (Pei et al., Nat.
Methods 3 (9): 670- 676, 2006; Reynolds et al., Nat.
Biotechnol. 22 (3): 326-330, 2004; Khvorova et al., Nat.
Struct.
Biol. 10 (9): 708-712, 2003; Schwarz et al., Cell 115 (2): 199-208, 2003; Ui-Tei et al., Nucleic Acids Res. 32 (3): 936- 948, 2004; Heale et al., Nucleic Acids Res. 33 (3): e30, 2005; Chalk et al., Biochem.
Biophys.
Res.
Commun. 319 (1): 264-274, 2004; e Amarzguioui et al., Biochem.
Biophys.
Res.
Commun. 316 (4): 1050- 1058, 2004). A molécula de RNAi modula a expressão de RNA codificado por um gene.
Como múltiplos genes podem partilhar algum grau de homologia de sequências entre si, em alguns casos, a molécula de RNAi pode ser desenhada para visar uma classe de genes com suficiente homologia de sequências.
Em alguns casos, a molécula de RNAi pode conter uma sequência que tem complementaridade com sequências que são partilhadas entre diferentes alvos gênicos ou são únicas de um alvo gênico específico.
Em alguns casos, a molécula de RNAi pode ser desenhada para visar regiões conservadas de uma sequência de RNA tendo homologia entre vários genes visando deste modo vários genes em uma família de genes (por exemplo, diferentes isoformas gênicas, variantes de encadeamento, genes mutantes, etc.). Em alguns casos, a molécula de RNAi pode ser desenhada para visar uma sequência que seja única de uma sequência de RNA específica de um único gene.
Uma molécula de RNA inibidor pode ser modificada, por exemplo, para conter nucleotídeos modificados, por exemplo, 2'-flúor, 2'-o-metila, 2'-desoxi, ácido nucleico não bloqueado, 2'-hidróxi,
fosforotioato, 2'-tiouridina, 4'-tiouridina, 2'-desoxiuridina.
Sem ficar restringido pela teoria se acredita que tais modificações podem aumentar a resistência a nucleases e/ou estabilidade no soro ou diminuir a imunogenicidade.
Em alguns casos, a molécula de RNAi é ligada a um polímero de entrega através de uma ligação ou ligante fisiologicamente lábil.
O ligante fisiologicamente lábil é selecionado tal que sofra uma transformação química (por exemplo, clivagem) quando presente em certas condições fisiológicas (por exemplo, ligação de dissulfeto clivada no ambiente redutor do citoplasma celular). A liberação da molécula a partir do polímero, por clivagem da ligação fisiologicamente lábil, facilita a interação da molécula com os componentes celulares apropriados para atividade.
O conjugado molécula de RNAi-polímero pode ser formado por ligação covalente da molécula ao polímero.
O polímero é polimerizado ou modificado tal que contenha um grupo reativo A.
A molécula de RNAi é também polimerizada ou modificada tal que contenha um grupo reativo B. os grupos reativos A e B são escolhidos tal que possam ser ligados através de uma ligação covalente reversível usando métodos conhecidos na técnica.
A conjugação da molécula de RNAi ao polímero pode ser realizada na presença de um excesso de polímero.
Como a molécula de RNAi e o polímero podem ter carga oposta durante a conjugação, a presença de polímero em excesso pode reduzir ou eliminar a agregação do conjugado.
Alternativamente pode ser usado um excesso de um polímero transportador, tal como um policátion.
O polímero em excesso pode ser removido do polímero conjugado antes da administração do conjugado.
Alternativamente, o polímero em excesso pode ser coadministrado com o conjugado.
A preparação e uso de agentes inibidores com base em RNA não codificante tais como ribozimas, RNAse P, siRNAs e miRNAs são também conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito em Sioud, RNA Therapeutics: Function, Design, and Delivery (Methods in Molecular Biology). Humana Press (2010). (d) Edição Gênica As composições de PMP descritas aqui podem incluir um componente de um sistema de edição gênica.
Por exemplo, o agente pode introduzir uma alteração (por exemplo, inserção, deleção (por exemplo, nocaute), translocação, inversão, mutação pontual única ou outra mutação) em um gene na planta.
Sistemas de edição gênica exemplificativos incluem as nucleases de dedos de zinco (ZFNs), Nucleases à base de Efetores Tipo Ativadores da Transcrição (TALEN) e o sistema de repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente intercaladas (CRISPR). Métodos à base de ZFNs, TALENs e CRISPR são descritos, por exemplo, em Gaj et al., Trends Biotechnol. 31 (7): 397-405, 2013. Em um sistema CRISPR/Cas típico, uma endonuclease é dirigida a uma sequência de nucleotídeos alvo (por exemplo, um local no genoma que é para ser editado quanto à sequência) por RNAs guias não codificantes, específicos da sequência que visam sequências de DNA de fita simples ou dupla.
Foram identificadas três classes (I-III) de sistemas CRISPR.
Os sistemas CRISPR de classe II usam uma única endonuclease Cas (em vez de múltiplas proteínas Cas). Um sistema CRISPR de classe II inclui uma endonuclease Cas de tipo II tal como Cas9, um RNA de CRISPR (“crRNA”) e um crRNA transativador (“tracrRNA”). O crRNA contém um RNA guia, isto é, tipicamente uma sequência de RNA com cerca de 20 nucleotídeos que corresponde a uma sequência de DNA alvo.
O crRNA contém também uma região que se liga ao tracrRNA para formar uma estrutura parcialmente de fita dupla que é clivada por RNase III, resultando em um híbrido crRNA/tracrRNA.
Os RNA servem como guias para dirigir proteínas Cas para silenciar sequências de DNA/RNA específicas, dependendo da sequência espaçadora.
Ver, por exemplo, Horvath et al., Science 327: 167-170, 2010; Makarova et al., Biology Direct 1: 7, 2006; Pennisi, Science 341: 833-836, 2013. A sequência de DNA alvo tem geralmente de ser adjacente a um motivo adjacente protoespaçador (“PAM”) que é específico de uma dada endonuclease Cas; no entanto, sequências PAM aparecem ao longo de um dado genoma.
As endonucleases de CRISPR identificadas a partir de várias espécies procarióticas têm requisitos únicos de sequências PAM; exemplos de sequências PAM incluem 5'-NGG (SEQ ID NO: 1) (Streptococcus pyogenes), 5'-NNAGAA (SEQ ID NO: 2) (CRISPR1 de Streptococcus thermophilus) e 5'- NNNGATT (SEQ ID NO: 3) (CRISPR3 de Streptococcus thermophilus) e 5'-NNNGATT (SEQ ID NO: 4) (Neisseria meningiditis). Algumas endonucleases, por exemplo, endonucleases Cas9, estão associadas a locais PAM ricos em G, por exemplo, 5'-NGG (SEQ ID NO: 1), e efetuam clivagem em extremidades não coesivas do DNA alvo em uma localização 3 nucleotídeos a montante do (5’ a partir do) local PAM.
Outro sistema CRISPR de classe II inclui a endonuclease de tipo V Cpf1, que é mais pequena do que Cas9; exemplos incluem AsCpf1 (de Acidaminococcus sp.) e LbCpf1 (de Lachnospiraceae sp.). Arranjos CRISPR associados a Cpf1 são processados em crRNA maduros sem o requisito de um tracrRNA; por outras palavras, um sistema Cpf1 requer somente a nuclease Cpf1 e um crRNA para clivar a sequência de DNA alvo.
As endonucleases Cpf1 estão associadas a locais PAM ricos em T, por exemplo, 5'-TTN (SEQ ID NO: 5). Cpf1 pode também reconhecer um motivo PAM 5'-CTA (SEQ ID NO: 6). Cpf1 cliva o DNA alvo por introdução de uma quebra de fita dupla assimétrica ou coesiva com uma protuberância 5' de 4 ou 5 nucleotídeos, por exemplo, clivagem de um DNA alvo com um corte assimétrico ou coesivo de 5 nucleotídeos localizado 18 nucleotídeos a jusante do (3’ a partir do) local PAM na fita codificante e 23 nucleotídeos a jusante do local PAM na fita complementar; a protuberância de 5 nucleotídeos que resulta de tal clivagem assimétrica permite edição do genoma mais precisa por inserção de DNA por recombinação homóloga do que por inserção em DNA clivado em extremidades não coesivas.
Ver, por exemplo, Zetsche et al., Cell 163: 759-771, 2015. Para os propósitos da edição gênica podem ser desenhadas redes de CRISPR que contenham uma ou múltiplas sequências de RNA guia correspondendo a uma sequência de DNA alvo desejada; ver, por exemplo, Cong et al., Science 339: 819-823, 2013; Ran et al., Nature Protocols 8: 2281-2308, 2013. Pelo menos cerca de 16 ou 17 nucleotídeos da sequência de gRNA são requeridos por Cas9 para que ocorra clivagem de DNA; para Cpf1, pelo menos cerca de 16 nucleotídeos da sequência de gRNA são necessários para se alcançar clivagem de DNA detectável.
Na prática, as sequências de RNA guia são geralmente desenhadas para terem um comprimento de entre 17- 24 nucleotídeos (por exemplo 19, 20, ou 21 nucleotídeos) e complementaridade com a sequência do gene ou ácido nucleico visada.
Geradores de gRNA e algoritmos customizados estão comercialmente disponíveis para uso no desenho de RNA guia eficazes.
Foi também alcançada edição gênica usando um RNA guia simples (sgRNA) quimérico, uma molécula de RNA simples manipulada (sintética) que mimetiza um complexo crRNA-tracrRNA ocorrendo naturalmente e contém tanto um tracrRNA (para ligação da nuclease) como pelo menos um crRNA (para guiar a nuclease para a sequência visada para edição). Foi também demonstrado que sgRNAs quimicamente modificados são eficazes na edição do genoma; ver, por exemplo, Hendel et al., Nature Biotechnol. 985-991, 2015. Enquanto Cas9 de tipo selvagem gera quebras de fita dupla
(DSB) em sequências de DNA específicas visadas por um gRNA, um número de endonucleases de CRISPR tendo funcionalidades modificadas está disponível, por exemplo: uma versão nickase de Cas9 gera somente uma quebra de fita simples; uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) não corta o DNA alvo mas interfere na transcrição por impedimento estérico. dCas9 pode ser adicionalmente fundida a um efetor para reprimir (CRISPRi) ou ativar (CRISPRa) a expressão de um gene alvo.
Por exemplo, Cas9 pode ser fundida a um repressor da transcrição (por exemplo, um domínio KRAB) ou um ativador da transcrição (por exemplo, uma fusão dCas9–VP64). Uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) fundida à nuclease FokI (dCas9-FokI) pode ser usada para gerar DSB em sequências alvo homólogas a dois gRNA.
Ver, por exemplo, os numerosos plasmídeos CRISPR/Cas9 divulgados no e publicamente disponíveis a partir do repositório Addgene (Addgene, 75 Sidney St., Suite 550A, Cambridge, MA 02139; addgene.org/crispr/). Uma Cas9 nickase dupla que introduz duas quebras de fita dupla separadas, cada uma dirigida por um RNA guia separado, é descrita como alcançando edição do genoma mais precisa por Ran et al., Cell 154: 1380-1389, 2013. Tecnologia CRISPR para edição dos genes de eucariotas é divulgada nas Publicações de Pedidos de Patentes US 2016/0138008 A1 e US 2015/0344912 A1 e nas patentes dos EUA 8,697,359, 8,771,945, 8,945,839, 8,999,641, 8,993,233, 8,895,308, 8,865,406, 8,889,418, 8,871,445, 8,889,356, 8,932,814, 8,795,965 e 8,906,616. A endonuclease Cpf1 e correspondentes RNAs guia e locais PAM são divulgados na Publicação de Pedido de Patente dos EUA 2016/0208243 A1. Em alguns casos, a modificação do genoma desejada envolve recombinação homóloga, em que uma ou mais quebras de DNA de fita dupla na sequência de nucleotídeos alvo são geradas pela nuclease guiada por RNA e RNA(s) guia(s), seguida por reparação da(s) quebra(s) usando um mecanismo de recombinação homóloga (“reparação dirigida pela homologia”). Em tais casos, um molde dador que codifica a sequência de nucleotídeos desejada a ser inserida ou modificada na quebra de fita dupla é proporcionado à célula ou sujeito; exemplos de moldes adequados incluem moldes de DNA de fita simples e moldes de DNA de fita dupla (por exemplo, ligados ao polipeptídeo descrito aqui). Em geral, um molde dador codificando uma mudança de nucleotídeos ao longo de uma região de menos do que cerca de 50 nucleotídeos é proporcionado na forma de DNA de fita simples; modelos dadores maiores (por exemplo, mais do que 100 nucleotídeos) são frequentemente proporcionados como plasmídeos de DNA de fita dupla.
Em alguns casos, o molde dador é proporcionado à célula ou sujeito em uma quantidade que é suficiente para alcançar a reparação dirigida pela homologia desejada, mas que não persiste na célula ou sujeito após um dado período de tempo (por exemplo, após um ou mais ciclos de divisão celular). Em alguns casos, um molde dador tem uma sequência de nucleotídeos de núcleo que difere da sequência de nucleotídeos alvo (por exemplo, uma região genômica endógena homóloga) em pelo menos 1, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50 ou mais nucleotídeos.
Esta sequência de núcleo é flanqueada por braços de homologia ou regiões de elevada identidade de sequências com a sequência de nucleotídeos visada; em alguns casos, as regiões de elevada identidade incluem pelo menos 10, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 150, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 600, pelo menos 750 ou pelo menos 1000 nucleotídeos de cada lado da sequência de núcleo.
Em alguns casos onde o molde dador está na forma de um DNA de fita simples, a sequência de núcleo é flanqueada por braços de homologia incluindo pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80 ou pelo menos 100 nucleotídeos em cada lado da sequência de núcleo.
Nos casos onde o molde dador está na forma de um DNA de fita dupla, a sequência de núcleo é flanqueada por braços de homologia incluindo pelo menos 500, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos 900 ou pelo menos 1000 nucleotídeos em cada lado da sequência de núcleo.
Em um caso, duas quebras de fita dupla separadas são introduzidas na sequência de nucleotídeos alvo da célula ou sujeito com uma Cas9 nickase dupla (ver Ran et al., Cell 154: 1380-1389, 2013), seguido por entrega do molde doador.
Em alguns casos, a composição inclui um gRNA e uma nuclease visada, por exemplo, uma Cas9, por exemplo, uma Cas9 de tipo selvagem, uma Cas9 nickase (por exemplo, Cas9 D10A), uma Cas9 morta (dCas9), eSpCas9, Cpf1, C2C1 ou C2C3 ou um ácido nucleico codificando uma tal nuclease.
A escolha da nuclease e gRNA(s) é determinada por se a mutação visada é uma deleção, substituição ou adição de nucleotídeos, por exemplo, uma deleção, substituição ou adição de nucleotídeos a uma sequência visada.
As fusões de uma endonuclease cataliticamente inativa, por exemplo, uma Cas9 morta (dCas9, por exemplo, D10A; H840A) presa com todo ou uma porção de (por exemplo, porção biologicamente ativa de) um (um ou mais) domínio(s) efetor(es) criam proteínas quiméricas que podem ser ligadas ao polipeptídeo para guiar a composição para locais de DNA específicos por uma ou mais sequências de RNA (sgRNA) para modular a atividade e/ou expressão de um ou mais sequências de ácidos nucleicos alvo.
Em casos, o agente inclui um RNA guia (gRNA) para uso em um sistema CRISPR para edição gênica.
Em alguns casos, o agente inclui uma nuclease de dedos de zinco (ZFN), ou um mRNA codificando um ZFN, que visa (por exemplo, cliva) uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, sequência de DNA) de um gene na planta.
Em alguns casos, o agente inclui uma TALEN, ou um mRNA codificando uma TALEN, que visa (por exemplo, cliva) uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, sequência de DNA) em um gene na planta.
Por exemplo, o gRNA pode ser usado em um sistema CRISPR para manipular uma alteração em um gene na planta.
Em outros exemplos, o ZFN e/ou TALEN podem ser usados para manipular uma alteração em um gene na planta.
Alterações exemplificativas incluem inserções, deleções (por exemplo, nocautes), translocações, inversões, mutações pontuais únicas ou outras mutações.
A alteração pode ser introduzida no gene em uma célula, por exemplo, in vitro, ex vivo ou in vivo.
Em alguns exemplos, a alteração aumenta o nível e/ou atividade de um gene na planta.
Em outros exemplos, a alteração diminui o nível e/ou atividade de (por exemplo, inativa ou silencia) um gene na planta.
Ainda em outro exemplo, a alteração corrige um defeito (por exemplo, uma mutação causando um defeito), em um gene na planta.
Em alguns casos, o sistema CRISPR é usado para editar (por exemplo, para adicionar ou eliminar um par de bases) um gene alvo na planta.
Em outros casos, o sistema CRISPR é usado para introduzir um códon de paragem prematura, por exemplo, diminuindo deste modo a expressão de um gene alvo.
Ainda em outros casos, o sistema CRISPR é usado para desligar um gene alvo de uma maneira reversível, por exemplo, similarmente à interferência de RNA.
Em alguns casos, o sistema CRISPR é usado para dirigir Cas para um promotor de um gene, bloqueando deste modo estericamente uma RNA polimerase.
Em alguns casos, um sistema CRISPR pode ser gerado para editar um gene na planta, usando tecnologia descrita, por exemplo, na Publicação dos E.U.A.
No. 20140068797, Cong, Science 339: 819-823, 2013; Tsai, Nature Biotechnol. 32: 6 569-576, 2014; Patente dos E.U.A.
No.: 8,871,445; 8,865,406; 8,795,965; 8,771,945; e 8,697,359.
Em alguns casos, a técnica de interferência de CRISPR (CRISPRi) pode ser usada para repressão transcricional de genes específicos na planta.
Em CRISPRi, uma proteína Cas9 manipulada (por exemplo, dCas9 nula como nuclease ou proteína de fusão com dCas9, por exemplo, fusão dCas9–KRAB ou dCas9–SID4X) pode emparelhar com um RNA guia específico da sequência (sgRNA). O complexo Cas9-gRNA pode bloquear RNA polimerase, interferindo deste modo no alongamento da transcrição.
O complexo pode também bloquear a iniciação da transcrição por interferência na ligação do fator de transcrição.
O método CRISPRi é específico com efeitos fora do alvo mínimos e pode atuar como múltiplex, por exemplo, pode reprimir simultaneamente mais do que um gene (por exemplo, usando múltiplos gRNA). Igualmente, o método CRISPRi permite repressão gênica reversível.
Em alguns casos, a ativação gênica mediada por CRISPR (CRISPRa) pode ser usada para ativação transcricional de um gene na planta.
Na técnica CRISPRa, proteínas de fusão com dCas9 recrutam ativadores transcricionais.
Por exemplo, dCas9 pode ser fundida a polipeptídeos (por exemplo, domínios de ativação) tais como VP64 ou o domínio de ativação de p65 (p65D) e usado com sgRNA (por exemplo, um único sgRNA ou múltiplos sgRNAs), para ativar um gene ou genes na planta.
Múltiplos ativadores podem ser recrutados usando múltiplos sgRNAs – isto pode aumentar a eficiência da ativação.
Pode ser usada uma variedade de domínios de ativação e único ou múltiplos domínios de ativação.
Adicionalmente à manipulação de dCas9 para se recrutarem ativadores, os sgRNAs podem também ser manipulados para se recrutarem ativadores.
Por exemplo, aptâmeros de RNA podem ser incorporados em um sgRNA para se recrutarem proteínas (por exemplo, domínios de ativação) tais como VP64. Em alguns exemplos, o sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) pode ser usado para ativação transcricional.
Em SAM, aptâmeros MS2 são adicionados ao sgRNA.
MS2 recruta a proteína de revestimento (MCP) de MS2 fundida a p65AD e fator de choque térmico 1 (HSF1). As técnicas CRISPRi e CRISPRa são descritas em maior detalhe, por exemplo, em Dominguez et al., Nat.
Rev.
Mol.
Cell Biol. 17: 5-15, 2016, incorporado aqui por referência.
Adicionalmente, modificações epigenéticas mediadas por dCas9 e ativação e repressão simultâneas usando sistemas CRISPR, como descrito em Dominguez et al., podem ser usadas para modular um gene na planta.
B.
Agentes Terapêuticos Heterólogos Os PMPs fabricados aqui podem incluir um agente terapêutico heterólogo (por exemplo, um agente que afeta um animal (por exemplo, um mamífero, por exemplo, um humano), um patógeno animal ou um seu vetor de patógeno e pode ser carregado em um PMP), tal como um peptídeo terapêutico, um ácido nucleico terapêutico (por exemplo, um RNA terapêutico), uma molécula pequena terapêutica ou um agente de controle de patógenos (por exemplo, um agente antifúngico, um agente antibacteriano, um agente virucida, um agente antiviral, um agente inseticida, um agente nematicida, um agente antiparasitário ou um repelente de insetos). Os PMPs carregados com tais agentes podem ser formulados com um transportador farmaceuticamente aceitável para entrega a um animal, um patógeno animal ou um seu vetor de patógeno. i.
Agentes antibacterianos As composições de PMP descritas aqui podem incluir adicionalmente um agente antibacteriano.
Por exemplo, uma composição de PMP incluindo um antibiótico como descrito aqui pode ser administrada a um animal em uma quantidade e durante um tempo suficientes para: alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de antibiótico dentro do ou no animal; e/ou tratar ou prevenir uma infeção bacteriana no animal.
Os antibacterianos descritos aqui podem ser formulados em uma composição de PMP para qualquer um dos métodos descritos aqui e, em certos casos, podem estar associados ao seu PMP.
Em alguns casos, as composições de PMP incluem dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10) diferentes agentes antibacterianos.
Como usado aqui, o termo “agente antibacteriano” se refere a um material que mata ou inibe o crescimento, proliferação, divisão, reprodução ou propagação de bactérias, tais como bactérias fitopatogênicas, e inclui agentes bactericidas (por exemplo, compostos desinfetantes, compostos antissépticos ou antibióticos) ou bacteriostáticos (por exemplo, compostos ou antibióticos). Os antibióticos bactericidas matam as bactérias, enquanto os antibióticos bacteriostáticos somente abrandam seu crescimento ou reprodução.
Os bactericidas podem incluir desinfetantes, antissépticos ou antibióticos.
Os desinfetantes mais usados podem incluir: cloro ativo (isto é, hipocloritos (por exemplo, hipoclorito de sódio), cloraminas, dicloroisocianurato e tricloroisocianurato, cloro úmido, dióxido de cloro, etc.), oxigênio ativo (peróxidos, tais como ácido peracético, persulfato de potássio, perborato de sódio, percarbonato de sódio e peridrato de ureia), iodo (iodopovidona (povidona-iodo, Betadine), solução de Lugol, tintura de iodo, tensoativos não iônicos iodados), álcoois concentrados (maioritariamente etanol, 1-propanol, também chamado n-propanol e 2- propanol, chamado isopropanol e suas misturas; adicionalmente são usados 2-fenoxietanol e 1- e 2-fenoxipropanóis), substâncias fenólicas (tais como fenol (também chamado ácido carbólico), cresóis (chamados Lisol em combinação com sabões de potássio líquidos), fenóis halogenados (clorados, bromados), tais como hexaclorofeno, triclosano, triclorofenol, tribromofenol, pentaclorofenol, Dibromol e seus sais),
tensoativos catiônicos, tais como alguns cátions de amônio quaternário (tais como cloreto de benzalcônio, brometo ou cloreto de cetiltrimetilamônio, cloreto de didecildimetilamônio, cloreto de cetilpiridínio, cloreto de benzetônio) e outros, compostos não quaternários, tais como clorexidina, glucoprotamina, di-hidrocloreto de octenidina, etc.), oxidantes fortes, tais como ozônio e soluções de permanganato; metais pesados e seus sais, tais como prata coloidal, nitrato de prata, cloreto de mercúrio, sais de fenilmercúrio, sulfato de cobre, cloreto-óxido de cobre, hidróxido de cobre, octanoato de cobre, sulfato de oxicloreto de cobre, sulfato de cobre, sulfato de cobre penta- hidratado, etc.
Metais pesados e seus sais são os bactericidas mais tóxicos e perigosos para o meio ambiente e, portanto, seu uso é fortemente oprimido ou cancelado; adicionalmente, também ácidos fortes apropriadamente concentrados (ácidos fosfórico, nítrico, sulfúrico, amidossulfúrico, toluenossulfônico) e alcalinos (hidróxidos de sódio, potássio, cálcio). Como antissépticos (isto é, agentes germicidas que podem ser usados no corpo humano ou animal, pele, mucosas, feridas e similares), poucos dos desinfetantes mencionados acima podem ser usados, sob condições apropriadas (maioritariamente concentração, pH, temperatura e toxicidade para homem/animal). Entre eles são importantes: preparações de cloro apropriadamente diluídas (isto é, solução de Daquin, solução de hipoclorito de sódio ou potássio a 0,5%, pH ajustado até pH 7-8, ou solução de benzenossulfocloramida de sódio a 0,5-1% (cloramina B)), algumas preparações de iodo, tais como a iodopovidona em vários galênicos (pomadas, soluções, pensos para feridas), no passado também solução de Lugol, peróxidos como soluções de peridrato de ureia e soluções de ácido peracético tamponadas com pH a 0,1-0,25%, álcoois com ou sem aditivos antissépticos, usados maioritariamente para antissepsia da pele, ácidos orgânicos fracos tais como ácido sórbico, ácido benzoico, ácido láctico e ácido salicílico, alguns compostos fenólicos, tais como hexaclorofeno, triclosano e dibromol, e compostos ativos catiônicos, tais como soluções de benzalcônio a 0,05-0,5%, clorexidina a 0,5-4%, octenidina a 0,1-2%. A composição de PMP descrita aqui pode incluir um antibiótico.
Pode ser usado qualquer antibiótico conhecido na técnica.
Os antibióticos são comummente classificados com base em seu mecanismo de ação, estrutura química ou espectro de atividade.
O antibiótico descrito aqui pode visar qualquer função ou processos de crescimento bacterianos e pode ser bacteriostático (por exemplo, abranda ou previne o crescimento bacteriano) ou bactericida (por exemplo, mata bactérias). Em alguns casos, o antibiótico é um antibiótico bactericida.
Em alguns casos, o antibiótico bactericida é um que visa a parede da célula bacteriana (por exemplo, penicilinas e cefalosporinas); um que visa a membrana celular (por exemplo, polimixinas); ou um que inibe enzimas bacterianas essenciais (por exemplo, rifamicinas, lipiarmicinas, quinolonas e sulfonamidas). Em alguns casos, o antibiótico bactericida é um aminoglicosídeo (por exemplo, casugamicina). Em alguns casos, o antibiótico é um antibiótico bacteriostático.
Em alguns casos, o antibiótico bacteriostático visa a síntese de proteínas (por exemplo, macrolídeos, lincosamidas e tetraciclinas). Classes adicionais de antibióticos que podem ser usados aqui incluem lipopeptídeos cíclicos (tais como daptomicina), glicilciclinas (tais como tigeciclina), oxazolidinonas (tais como linezolida) ou lipiarmicinas (tais como fidaxomicina). Exemplos de antibióticos incluem rifampicina, ciprofloxacina, doxiciclina, ampicilina e polimixina B.
O antibiótico descrito aqui pode ter qualquer nível de especificidade pelo alvo (por exemplo, espectro estreito ou amplo). Em alguns casos, o antibiótico é um antibiótico de espectro estreito e assim visa tipos específicos de bactérias, tais como bactérias Gram-negativas ou Gram-
positivas.
Alternativamente, o antibiótico pode ser um antibiótico de espectro amplo que visa uma gama ampla de bactérias.
Exemplos de agentes antibacterianos adequados para o tratamento de animais incluem Penicilinas (Amoxicilina, Ampicilina, Bacampicilina, Carbenicilina, Cloxacilina, Dicloxacilina, Flucloxacilina, Mezlocilina, Nafcilina, Oxacilina, Penicilina G, Cristicilina 300 AS, Pentids, Permapeno, Pfizerpeno, Pfizerpeno-AS, Vicilina, Penicilina V, Piperacilina, Pivampicilina, Pivmecilinam, Ticarcilina), Cefalosporinas (Cefacetril (cefacetrilo), Cefadroxil (cefadroxil), Cefalexina (cefalexina), Cefaloglicina (cefaloglicina), Cefalônio (cefalônio), Cefaloridina (cefaloradina), Cefalotina (cefalotina), Cefapirina (cefapirina), Cefatrizina, Cefazaflur, Cefazedona, Cefazolina (cefazolina), Cefradina (cefradina), Cefroxadina, Ceftezol, Cefaclor, Cefamandol, Cefmetazol, Cefonicid, Cefotetano, Cefoxitina, Cefprozil (cefproxil), Cefuroxima, Cefuzonam, Cefcapeno, Cefdaloxima, Cefdinir, Cefditoreno, Cefetamete, Cefixima, Cefmenoxima, Cefodizima, Cefotaxima, Cefpimizol, Cefpodoxima, Cefteram, Ceftibuteno, Ceftiofur, Ceftioleno, Ceftizoxima, Ceftriaxona, Cefoperazona, Ceftazidima, Cefclidina, Cefepima, Cefluprenam, Cefoselis, Cefozoprano, Cefpirom, Cefquinome, Ceftobiprol, Ceftarolina, Cefaclomezina, Cefaloram, Cefaparol, Cefcanel, Cefedrolor, Cefempidona, Cefetrizol, Cefivitril, Cefmatileno, Cefmepídio, Cefovecina, Cefoxazol, Cefrotil, Cefsumida, Cefuracetima, Ceftioxida, Combinações, Ceftazidima/Avibactam, Ceftolozano/Tazobactam, Monobactamas (Aztreonam), Carbapenêmicos (Imipenem, Imipenem/cilastatina, Doripenem, Ertapenem, Meropenem, Meropenem/vaborbactam), Macrolídeo (Azitromicina, Eritromicina, Claritromicina, Diritromicina, Roxitromicina, Telitromicina), Lincosamidas (Clindamicina, Lincomicina), Estreptograminas (Pristinamicina, Quinupristina/dalfopristina), Aminoglicosídeo (Amicacina, Gentamicina, Canamicina, Neomicina,
Netilmicina, Paromomicina, Estreptomicina, Tobramicina), Quinolona (Flumequina, Ácido nalidíxico, Ácido oxolínico, Ácido piromídico, Ácido pipemídico, Rosoxacina, Segunda Geração, Ciprofloxacina, Enoxacina, Lomefloxacina, Nadifloxacina, Norfloxacina, Ofloxacina, Pefloxacina, Rufloxacina, Balofloxacina, Gatifloxacina, Grepafloxacina, Levofloxacina, Moxifloxacina, Pazufloxacina, Sparfloxacina, Temafloxacina, Tosufloxacina, Besifloxacina, Delafloxacina, Clinafloxacina, Gemifloxacina, Prulifloxacina, Sitafloxacina, Trovafloxacina), Sulfonamidas (Sulfametizol, Sulfametoxazol, Sulfisoxazol, Trimetoprim-Sulfametoxazol), Tetraciclina (Demeclociclina, Doxiciclina, Minociclina, Oxitetraciclina, Tetraciclina, Tigeciclina), Outros (Lipopeptídeos, Fluoroquinolona, Lipoglicopeptídeos, Cefalosporina, Macrocíclicos, Cloranfenicol, Metronidazol, Tinidazol, Nitrofurantoína, Glicopeptídeos, Vancomicina, Teicoplanina, Lipoglicopeptídeos, Telavancina, Oxazolidinonas, Linezolida, Ciclosserina 2, Rifamicinas, Rifampina, Rifabutina, Rifapentina, Rifalazil, Polipeptídeos, Bacitracina, Polimixina B, Tuberactinomicinas, Viomicina, Capreomicina). Uma pessoa versada na técnica apreciará que uma concentração adequada de cada antibiótico na composição depende de fatores tais como eficácia, estabilidade do antibiótico, número de antibióticos distintos, a formulação e métodos de aplicação da composição. ii.
Agentes antifúngicos As composições de PMP descritas aqui podem incluir adicionalmente um agente antifúngico.
Por exemplo, uma composição de PMP incluindo um antifúngico como descrito aqui pode ser administrada a um animal em uma quantidade e durante um tempo suficiente para alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de antifúngico dentro do ou no animal; e/ou tratar ou prevenir uma infeção fúngica no animal.
Os antifúngicos descritos aqui podem ser formulados em uma composição de PMP para qualquer um dos métodos descritos aqui e, em certos casos, podem estar associados ao seu PMP.
Em alguns casos, as composições de PMP incluem dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10) diferentes agentes antifúngicos.
Como usado aqui, o termo “fungicida” ou “agente antifúngico” se refere a uma substância que mata ou inibe o crescimento, proliferação, divisão, reprodução ou propagação de fungos, tais como fungos que são patogênicos para animais.
Muitos tipos diferentes de agentes antifúngicos foram produzidos comercialmente.
Exemplos não limitantes de agentes antifúngicos incluem: Alilaminas (Amorolfina, Butenafina, Naftifina, Terbinafina), Imidazóis (Bifonazol, Butoconazol, Clotrimazol, Econazol, Fenticonazol, Cetoconazol, Isoconazol, Luliconazol, Miconazol, Omoconazol, Oxiconazol, Sertaconazol, Sulconazol, Tioconazol, Terconazol); Triazóis (Albaconazol, Efinaconazol, Fluconazol, Isavuconazol, Itraconazol, Posaconazol, Ravuconazol, Terconazol, Voriconazol), Tiazóis (Abafungina), Polienos (Anfotericina B, Nistatina, Natamicina, Tricomicina), Equinocandinas (Anidulafungina, Caspofungina, Micafungina), Outros (Tolnaftato, Flucitosina, Butenafina, Griseofulvina, Ciclopirox, Sulfeto de selênio, Tavaborol). Um perito na técnica apreciará que uma concentração adequada de cada antifúngico na composição depende de fatores tais como eficácia, estabilidade do antifúngico, número de antifúngicos distintos, a formulação e métodos de aplicação da composição. iii.
Inseticidas As composições de PMP descritas aqui podem incluir adicionalmente um inseticida.
Por exemplo, o inseticida pode diminuir a aptidão de (por exemplo, diminuir o crescimento ou matar) um vetor de insetos de um patógeno de animais.
Uma composição de PMP incluindo um inseticida como descrito aqui pode ser contatado com um inseto, em uma quantidade e durante tempo suficientes para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de inseticidas dentro do ou no inseto; e (b) diminuir a aptidão do inseto.
Em alguns casos, o inseticida pode diminuir a aptidão de (por exemplo, diminuir o crescimento ou matar) um inseto parasitário.
Uma composição de PMP incluindo um inseticida como descrito aqui pode ser contatado com um inseto parasitário, ou um animal infectado com ele, em uma quantidade e durante tempo suficientes para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de inseticidas dentro do ou no inseto parasitário; e (b) diminuir a aptidão do inseto parasitário.
Os inseticidas descritos aqui podem ser formulados em uma composição de PMP para qualquer um dos métodos descritos aqui e, em certos casos, podem estar associados ao seu PMP.
Em alguns casos, as composições de PMP incluem dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10) diferentes agentes inseticidas.
Como usado aqui, o termo “inseticida” ou “agente inseticida” se refere a uma substância que mata ou inibe o crescimento, proliferação, reprodução ou propagação de insetos, tais como vetores de insetos de patógenos de animais ou insetos parasitários.
Exemplos não limitantes de inseticidas estão listados na Tabela 4. Exemplos não limitantes adicionais de inseticidas adequados incluem biológicos, hormônios ou feromônios tais como azadiractina, espécies de Bacillus, espécies de Beauveria, codlemona, espécies de Metarrhizium, espécies de Paecilomyces, thuringiensis e espécies de Verticillium, e compostos ativos tendo mecanismos de ação desconhecidos ou não especificados tais como fumigantes (tais como fosfeto de alumínio, brometo de metila e fluoreto de sulfurila) e inibidores seletivos da alimentação (tais como criolita, flonicamida e pimetrozina). Um perito na técnica apreciará que uma concentração adequada de cada inseticida na composição depende de fatores tais como eficácia, estabilidade do inseticida, número de inseticidas distintos, a formulação e métodos de aplicação da composição.
Tabela 4. Exemplos de inseticidas Classe Compostos cloronicotinilos/neonicotinoides acetamiprida, clotianidina, dinotefurano, imidacloprida, nitenpiram, nitiazina, tiacloprida, tiametoxam, imidaclotiz, (2E)-1-[(2-cloro-1,3-tiazol- 5-il)metil]-3,5-dimetil-N-nitro-1,3,5-tri-azinan-2-imina, inibidores de acetilcolinesterase (AChE) (tais como carbamatos e organofosfatos) carbamatos alanicarbe, aldicarbe, aldoxicarbe, alixicarbe, aminocarbe, bendiocarbe, benfuracarbe, bufencarbe, butacarbe, butocarboxim, butoxicarboxim, carbaril, carbofurano, carbossulfano, cloetocarbe, dimetilano, etiofencarbe, fenobucarbe, fenotiocarbe, formetanato, furatiocarbe, isoprocarbe, metam-sódio, metiocarbe, metomil, metolcarbe, oxamil, fosfocarbe, pirimicarbe, promecarbe, propoxur, tiodicarbe, tiofanox, triazamato, trimetacarbe, XMC, xililcarbe organofosfatos acefato, azametifos, azinfos (-metila, -etila), bromofos-etila, bromfenvinfos (-metila), butatiofos, cadusafos, carbofenotiona, cloretoxifos, clorfenvinfos, clormofos, clorpirifos (-metila/-etila), coumafos, cianofenfos, cianofos, demetona-S-metila, demetona-S- metilsulfona, dialifos, diazinona, diclofentiona, diclorvos/DDVP, dicrotofos, dimetoato, dimetilvinfos, dioxabenzofos, dissulfotona, EPN, etiona, etoprofos, etrimfos, famfur, fenamifos, fenitrotiona, fensulfotiona, fentiona, flupirazofos, fonofos, formotiona, fosmetilano, fostiazato, heptenofos, iodofenfos, iprobenfos, isazofos, isofenfos, O-salicilato de isopropila, isoxationa, malationa, mecarbam, metacrifos, metamidofos, metidationa, mevinfos, monocrotofos, nalede, ometoato, oxidemetona- metila, parationa (-metila/-etila), fentoato, forato, fosalona, fosmete, fosfamidona, fosfocarbe, foxim, pirimifos (-metila/-etila), profenofos, propafos, propetamfos, protiofos, protoato, piraclofos, piridafentiona, piridationa, quinalfos, sebufos, sulfotepe, sulprofos, tebupirimfos, temefos, terbufos, tetraclorvinfos, tiometona, triazofos, triclorfona, vamidotiona piretroides acrinatrina, aletrina (d-cis-trans, d-trans), cipermetrina (alfa-, beta-, teta- , zeta-), permetrina (cis-, trans-), beta-ciflutrina, bifentrina, bioaletrina, bioaletrina-S-ciclopentil-isômero, bioetanometrina, biopermetrina, biorresmetrina, chlovaportrina, cis-cipermetrina, cis-resmetrina, cis-
Classe Compostos permetrina, clocitrina, cicloprotrina, ciflutrina, cialotrina, cifenotrina, DDT, deltametrina, empentrina (1R-isômero), esfenvalerato, etofenprox, fenflutrina, fenpropatrina, fenpiritrina, fenvalerato, flubrocitrinato, flucitrinato, flufenprox, flumetrina, fluvalinato, fubfenprox, gama- cialotrina, imiprotrina, cadetrina, lambda, cialotrina, metoflutrina, fenotrina (isômero 1R-trans), praletrina, proflutrina, protrifenbuto, piresmetrina, resmetrina, RU 15525, silafluofeno, tau-fluvalinato, teflutrina, teraletrina, tetrametrina (1R-isômero), tralocitrina, tralometrina, transflutrina, ZXI 8901, piretrinas (piretro) oxadiazinas indoxacarbe, moduladores do receptor de acetilcolina (tais como espinosinas) espinosinas espinosade ciclodieno canficloro, clordano, endossulfano, gama-HCH, HCH, heptacloro, organocloros lindano, metoxicloro fipróis acetoprol, etiprol, vaniliprol, fipronil mectinas abamectina, avermectina, emamectina, emamectina-benzoato, fenoxicarbe, hidropreno, quinopreno, metopreno, ivermectina, lepimectina, epofenonano, piriproxifeno, milbemectina, milbemicina, tripreno diacil-hidrazinas cromafenozida, halofenozida, metoxifenozida, tebufenozida benzoilureias bistrifluorona, clorfluazurona, diflubenzurona, fluazurona, flucicloxurona, flufenoxurona, hexaflumurona, lufenurona, novalurona, noviflumurona, penfluorona, teflubenzurona, triflumurona organoestanhos azociclotina, ciexatina, óxido de fenbutatina pirróis clorfenapir dinitrofenóis binapacril, dinobutona, dinocape, DNOC METIs fenazaquina, fenpiroximato, pirimidifeno, piridabeno, tebufenpirade, tolfenpirade, rotenona, acequinocil, fluacrpirim, desreguladores microbianos da membrana intestinal de insetos (tais como estirpes de Bacillus thuringiensis), inibidores da síntese de lipídeos (tais como ácidos tetrônicos e ácidos tetrâmicos) ácidos tetrônicos espirodiclofeno, espiromesifeno, espirotetramate ácidos tetrâmicos carbonato de cis-3-(2,5-dimetilfenil)-8-metóxi-2-oxo-1- azaespiro[4.5]dec-3-en-4-ila e etila (sinônimo: ácido carbônico, éster de etila de 3-(2,5- dimetilfenil)-8-metóxi-2-oxo-1-azaespiro[4.5]dec-3-en-4- ila; No.
Reg.
CAS: 382608-10-8), carboxamidas (tais como flonicamida), agonistas octopaminérgicos (tais como amitraz), inibidores da ATPase estimulada por magnésio (tais como propargite), agonistas do receptor
Classe Compostos de rianodina (tais como ftalamidas ou rinaxapir) ftalamidas N2-[1,1-dimetil-2-(metilsulfonil)etil]-3-iodo-N1- [2-metil-4-[1,2,2,2- tetrafluoro-1-(trifluorometil)etil]fenil]-1,2-benzenodi-carboxamida (isto é, flubendiamida; No. reg.
CAS: 272451-65-7)
iv.
Nematicidas As composições de PMP descritas aqui podem incluir adicionalmente um nematicida.
Em alguns casos, a composição de PMP inclui dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10) diferentes nematicidas.
Por exemplo, o nematicida pode diminuir a aptidão de (por exemplo, diminuir o crescimento ou matar) um nematódeo parasitário.
Uma composição de PMP incluindo um nematicida como descrito aqui pode ser contatado com um nematódeo parasitário, ou um animal infectado com ele, em uma quantidade e durante tempo suficientes para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de nematicidas dentro do ou no nematódeo alvo; e (b) diminuir a aptidão do nematódeo parasitário.
Os nematicidas descritos aqui podem ser formulados em uma composição de PMP para qualquer um dos métodos descritos aqui e, em certos casos, podem estar associados ao seu PMP.
Como usado aqui, o termo “nematicida” ou “agente nematicida” se refere a uma substância que mata ou inibe o crescimento, proliferação, reprodução ou propagação de nematódeos, tais como um nematódeo parasitário.
Exemplos não limitantes de nematicidas estão listados na Tabela 5. Um perito na técnica apreciará que uma concentração adequada de cada nematicida na composição depende de fatores tais como eficácia, estabilidade do nematicida, número de nematicidas distintos, a formulação e métodos de aplicação da composição.
Tabela 5. Exemplos de Nematicidas
FUMIGANTES DD, 1,3-Dicloropropeno, Dibrometo de Etileno, 1,2-Dibromo-3-Cloropropano, Brometo de Metila, Cloropicrina, Metam Sódio, Dazomete, Isotiocianato de Metila (MITC), Tetratiocarbonato de Sódio, Cloropicrina, CARBAMATOS Aldicarbe, Aldoxicarbe, Carbofurano, Oxamil, Cleotocarbe ORGANOFOSFATOS Etoprofos, Fenamifos, Cadusafos, Fostiazato, Fensulfotiona, Tionazina, Isazofos, BIOQUÍMICOS DITERA®, CLANDOSAN®, SINCOCIN® v.
Agente antiparasitário As composições de PMP descritas aqui podem incluir adicionalmente um agente antiparasitário.
Por exemplo, o antiparasitário pode diminuir a aptidão de (por exemplo, diminuir o crescimento ou matar) um protozoário parasitário.
Uma composição de PMP incluindo um antiparasitário como descrito aqui pode ser contatado com um protozoário em uma quantidade e durante tempo suficientes para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de antiparasitário dentro do ou no protozoário ou animal infectado com ele; e (b) diminuir a aptidão do protozoário.
Isto pode ser útil no tratamento ou prevenção de parasitas em animais.
Por exemplo, uma composição de PMP incluindo um agente antiparasitário como descrito aqui pode ser administrada a um animal em uma quantidade e durante um tempo suficientes para: alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de antiparasitário dentro do ou no animal; e/ou tratar ou prevenir uma infeção por parasitas (por exemplo, nematódeo parasitário, inseto parasitário ou protozoário) no animal.
O antiparasitário descrito aqui pode ser formulado em uma composição de PMP para qualquer um dos métodos descritos aqui e, em certos casos, pode estar associado ao seu PMP.
Em alguns casos, a composição de PMP inclui dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10) diferentes agentes antiparasitários.
Como usado aqui, o termo “antiparasitário” ou “agente antiparasitário” se refere a uma substância que mata ou inibe o crescimento, proliferação, reprodução ou propagação de parasitas, tais como protozoários parasitários, nematódeos parasitários ou insetos parasitários.
Exemplos de agentes antiparasitários incluem Anti- helmínticos (Befênio, Dietilcarbamazina, Ivermectina, Niclosamida, Piperazina, Praziquantel, Pirantel, Pirvínio, Benzimidazóis, Albendazol, Flubendazol, Mebendazol, Tiabendazol, Levamisol, Nitazoxanida, Monopantel, Emodepsida, Espiroindóis), Escabicidas (Benzoato de benzila, Benzoato de benzila/dissulfiram, Lindano, Malationa, Permetrina), Pediculicidas (Butóxido de piperonila/piretrinas, Espinosada, Moxidectina), Escabicidas (Crotamitona), Anticestódeos (Niclosamida, Pranziquantel, Albendazol), Antiamébicos (Rifampina, Anfotericina B); ou Antiprotozoários (Melarsoprol, Eflornitina, Metronidazol, Tinidazol, Miltefosina, Artemisinina). Em certos casos, o agente antiparasitário pode ser usado para tratar ou prevenir infeções em animais de criação, por exemplo, Levamisol, Fenbendazol, Oxfendazol, Albendazol, Moxidectina, Eprinomectina, Doramectina, Ivermectina ou Clorsulona.
Um perito na técnica apreciará que uma concentração adequada de cada antiparasitário na composição depende de fatores tais como eficácia, estabilidade do antiparasitário, número de antiparasitários distintos, a formulação e métodos de aplicação da composição. vi.
Agente antiviral As composições de PMP descritas aqui podem incluir adicionalmente um agente antiviral.
Uma composição de PMP incluindo um agente antiviral como descrito aqui pode ser administrada a um animal em uma quantidade e durante um tempo suficientes para alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de antiviral dentro do ou no animal; e/ou para tratar ou prevenir uma infeção viral no animal.
Os antivirais descritos aqui podem ser formulados em uma composição de PMP para qualquer um dos métodos descritos aqui e, em certos casos, podem estar associados ao seu PMP.
Em alguns casos, a composição de PMP inclui dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10) diferentes antivirais.
Como usado aqui, o termo “antiviral” ou “virucida” se refere a uma substância que mata ou inibe o crescimento, proliferação, reprodução, desenvolvimento ou propagação de vírus, tais como patógenos virais que infectam animais.
Um número de agentes pode ser empregue como um antiviral, incluindo químicos ou agentes biológicos (por exemplo, ácidos nucleicos, por exemplo, dsRNA). Exemplos de agentes antivirais úteis aqui incluem Abacavir, Aciclovir (Aciclovir), Adefovir, Amantadina, Amprenavir (Agenerase), Ampligen, Arbidol, Atazanavir, Atripla, Balavir, Cidofovir, Combivir, Dolutegravir, Darunavir, Delavirdina, Didanosina, Docosanol, Edoxudina, Efavirenz, Emtricitabina, Enfuvirtida, Entecavir, Ecoliever, Famciclovir, Fomivirsen, Fosamprenavir, Foscarnete, Fosfonete, Inibidor da fusão, Ganciclovir, Ibacitabina, Imunovir, Idoxuridina, Imiquimod, Indinavir, Inosina, Inibidor de integrase, Interferon tipo III, Interferon tipo II, Interferon tipo I, Interferon, Lamivudina, Lopinavir, Lovirida, Maraviroc, Moroxidina, Metisazona, Nelfinavir, Nevirapina, Nexavir, Nitazoxanida, Análogos de nucleosídeos, Norvir, Oseltamivir (Tamiflu), Peginterferon alfa-2a, Penciclovir, Peramivir, Pleconaril, Podofilotoxina, Raltegravir, Ribavirina, Rimantadina, Ritonavir, Piramidina, Saquinavir, Sofosbuvir, Stavudina, Intensificador sinérgico (antirretroviral), Telaprevir, Tenofovir, Tenofovir disoproxil, Tipranavir, Trifluridina, Trizivir, Tromantadina, Truvada, Valaciclovir (Valtrex), Valganciclovir, Vicriviroc, Vidarabina, Viramidina, Zalcitabina, Zanamivir (Relenza) ou Zidovudina.
Um perito na técnica apreciará que uma concentração adequada de cada antiviral na composição depende de fatores tais como eficácia,
estabilidade dos antivirais, número de antivirais distintos, a formulação e métodos de aplicação da composição. vii.
Repelentes As composições de PMP descritas aqui podem incluir adicionalmente um repelente.
Por exemplo, o repelente pode repelir um vetor de patógenos de animais, tais como insetos.
O repelente descrito aqui pode ser formulado em uma composição de PMP para qualquer um dos métodos descritos aqui e, em certos casos, pode estar associado ao seu PMP.
Em alguns casos, a composição de PMP inclui dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10) diferentes repelentes.
Por exemplo, uma composição de PMP incluindo um repelente como descrito aqui pode ser contatado com um vetor de inseto ou um habitat do vetor em uma quantidade e durante tempo suficientes para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de repelentes; e (b) diminuir os níveis do inseto próximo ou na vizinhança de animais em relação a um controle.
Alternativamente, uma composição de PMP incluindo um repelente como descrito aqui pode ser contatado com um animal em uma quantidade e durante tempo suficientes para: (a) alcançar um nível alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limiar) de concentração de repelentes; e (b) diminuir os níveis do inseto próximo ou na vizinhança do animal em relação a um animal não tratado.
Alguns exemplos de repelentes de insetos bem conhecidos incluem: benzil; benzoato de benzila; 2,3,4,5-bis(butil-2-eno)tetra- hidrofurfural (MGK Repelente 11); butoxipolipropilenoglicol; N- butilacetanilida; normal-butil-6,6-dimetil-5,6-di-hidro-1,4-pirona-2- carboxilato (Indalona); adipato de dibutila; ftalato de dibutila; succinato de di-normal-butila (Tabatrex); N,N-dietil-meta-toluamida (DEET); carbato de dimetila (biciclo[2.2.1]hept-5-eno-2,3-dicarboxilato de
(endo,endo)-dimetila); ftalato de dimetila; 2-etil-2-butil-1,3-propanodiol; 2-etil-1,3-hexanodiol (Rutgers 612); isocincomeronato de di-normal- propila (MGK Repelente 326); 2-fenilciclo-hexanol; p-metano-3,8-diol e N,N-dietilsuccinamato de normal-propila.
Outros repelentes incluem óleo de citronela, ftalato de dimetila, oxalato de óxido de normal- butilmesitila e hexanodiol-1,3 de 2-etila (Ver Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 2ª Ed., Vol. 11: 724-728; e The Condensed Chemical Dictionary, 8ª Ed., p 756). Em alguns casos, o repelente é um repelente de insetos, incluindo repelentes de insetos sintéticos ou não sintéticos.
Exemplos de repelentes de insetos sintéticos incluem antranilato de metila e outros repelentes de insetos à base de antranilato, benzaldeído, DEET (N,N- dietil-m-toluamida), carbato de dimetila, ftalato de dimetila, icaridina (isto é, picaridina, Bayrepel e KBR 3023), indalona (por exemplo, como usado em uma mistura “6-2-2” (Ftalato de dimetila a 60%, Indalona a 20%, Etil-hexanodiol a 20%), IR3535 (Ácido 3-[N-butil-N-acetil]- aminopropiônico, éster de etila), metoflutrina, permetrina, SS220 ou éter de triciclodecenila alila.
Exemplos de repelentes de insetos naturais incluem folhas de beautyberry (Callicarpa), casca de bétula, murta do pântano (Myrica gale), óleo de erva-gateira (por exemplo, nepetalactona), óleo de citronela, óleo essencial de eucalipto de limão (Corymbia citriodora; por exemplo, p-mentano-3,8-diol (PMD)), óleo de nim, capim-limão, óleo da árvore do chá das folhas de Melaleuca alternifolia, tabaco ou seus extratos.
III.
Métodos e Uso Os PMPs aqui são úteis em uma variedade de métodos agrícolas ou terapêuticos.
Exemplos de métodos de uso de PMPs (por exemplo, incluindo PMPs modificados descritos aqui) são descritos adicionalmente em baixo.
A.
Entrega a uma Planta
São proporcionados aqui métodos de entregar uma composição de PMP (por exemplo, incluindo PMPs modificados descritos aqui) a uma planta, por exemplo, por contato da planta, ou parte da mesma, com a composição de PMP.
Em alguns casos, as plantas podem ser tratadas com PMPs não incluindo um agente funcional heterólogo.
Em outros casos, os PMPs incluem um agente funcional heterólogo, por exemplo, agentes pesticidas (por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, nematicidas, moluscicidas, virucidas, herbicidas), agentes de controle de pragas (por exemplo, repelentes), agentes fertilizantes ou agentes modificadores de plantas.
Em um aspecto é proporcionado aqui um método de aumentar a aptidão de uma planta, incluindo o método entregar à planta a composição de PMP descrita aqui (por exemplo, em uma quantidade e duração eficazes) para aumentar a aptidão da planta em relação a uma planta não tratada (por exemplo, uma planta à qual não foi entregue a composição de PMP). Um aumento na aptidão da planta em consequência da entrega de uma composição de PMP pode se manifestar em um número de modos, por exemplo, resultando deste modo em uma melhor produção da planta, por exemplo, um rendimento melhorado, vigor da planta ou qualidade do produto coletado a partir da planta melhorado.
Um rendimento melhorado de uma planta se relaciona com um aumento no rendimento de um produto (por exemplo, como medido pelo rendimento de biomassa, grãos, sementes ou frutos, conteúdo de proteína, conteúdo de carboidratos ou óleo ou área foliar da planta) da planta em uma quantidade mensurável em relação ao rendimento do mesmo produto da planta produzido sob as mesmas condições, mas sem a aplicação das presentes composições ou em comparação com aplicação de agentes agrícolas convencionais.
Por exemplo, o rendimento pode ser aumentado em pelo menos cerca de 0,5%, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 100% ou mais do que 100%. O rendimento pode ser expresso em termos de uma quantidade por peso ou volume da planta ou um produto da planta em alguma base.
A base pode ser expressa em termos de tempo, área de cultivo, peso das plantas produzidas ou quantidade de matéria-prima usada.
Por exemplo, tais métodos podem aumentar o rendimento de tecidos de plantas incluindo, mas não se limitando a: sementes, frutos, grãos, cápsulas, tubérculos, raízes e folhas.
Um aumento na aptidão de uma planta em consequência da entrega de uma composição de PMP pode ser também medido por outros métodos, tais como um aumento ou melhoria da classificação do vigor, o estande (o número de plantas por unidade de área), altura da planta, circunferência do caule, comprimento do caule, número de folhas, tamanho das folhas, copa da planta, aparência visual (tal como cor da folha mais verde), classificação da raiz, emergência, conteúdo de proteína, perfilhamento aumentado, folhas maiores, mais folhas, menos folhas basais mortas, perfilhos mais fortes, menos fertilizante necessário, menos sementes necessárias, perfilhos mais produtivos, floração precoce, maturação inicial dos grãos ou sementes, menos verso da planta (alojamento), crescimento aumentado de rebentos, germinação precoce ou qualquer combinação destes fatores, em uma quantidade mensurável ou percetível em relação ao mesmo fator da planta produzida sob as mesmas condições, mas sem a administração das presentes composições ou com aplicação de agentes agrícolas convencionais.
É proporcionado aqui um método de modificar ou aumentar a aptidão de uma planta, incluindo o método entregar à planta uma quantidade eficaz de uma composição de PMP proporcionada aqui, em que o método modifica a planta e deste modo introduz ou aumenta um traço benéfico na planta (por exemplo, em cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100%) em relação a uma planta não tratada.
Em particular, o método aumentar a aptidão da planta (por exemplo, em cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100%) em relação a uma planta não tratada.
Em alguns casos, o aumento na aptidão da planta é um aumento (por exemplo, em cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100%) na resistência a doenças, tolerância à seca, tolerância ao calor, tolerância ao frio, tolerância ao sal, tolerância a metais, tolerância a herbicidas, tolerância a químicos, eficiência de uso de água, utilização de nitrogênio, resistência ao estresse de nitrogênio, fixação de nitrogênio, resistência a pragas, resistência a herbívoros, resistência a patógenos, rendimento, rendimento sob condições de limitação de água, vigor, crescimento, capacidade fotossintética, nutrição, conteúdo de proteína, conteúdo de carboidrato, conteúdo de óleo, biomassa, comprimento dos rebentos, comprimento das raízes, arquitetura das raízes, peso das sementes ou quantidade de produto coletável.
Em alguns casos, o aumento na aptidão é um aumento (por exemplo, em cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100%) no desenvolvimento, crescimento, rendimento, resistência a estressores abióticos ou resistência a estressores bióticos.
Um estresse abiótico se refere a uma condição de estresse ambiental a que uma planta ou parte da planta está sujeita que inclui, por exemplo, estresse por seca, estresse por sal, estresse por calor, estresse por frio e estresse por baixo conteúdo de nutrientes.
Um estresse biótico se refere a uma condição de estresse ambiental a que uma planta ou parte da planta está sujeita que inclui, por exemplo, estresse por nematódeos, estresse por insetos herbívores, estresse por patógenos fúngicos, estresse por patógenos bacterianos ou estresse por patógenos virais.
O estresse pode ser temporário, por exemplo, várias horas, vários dias, vários meses, ou permanente, por exemplo, durante a vida da planta.
Em alguns casos, o aumento na aptidão da planta é um aumento (por exemplo, em cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100%) na qualidade dos produtos coletados a partir da planta.
Por exemplo, o aumento na aptidão da planta pode ser uma melhoria nas características comercialmente favoráveis (por exemplo, sabor ou aparência) de um produto coletado a partir da planta.
Em outros casos, o aumento na aptidão da planta é um aumento na vida útil de um produto coletado a partir da planta (por exemplo, em cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100%). Alternativamente, o aumento na aptidão pode ser uma alteração de um traço que é benéfica para a saúde humana ou animal, tal como uma redução na produção de alérgenos.
Por exemplo, o aumento na aptidão pode ser uma diminuição (por exemplo, em cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100%) na produção de um alérgeno (por exemplo, pólen) que estimula uma resposta imunitária em um animal (por exemplo, humano). A modificação da planta (por exemplo, aumento na aptidão) pode surgir da modificação de uma ou mais partes da planta.
Por exemplo, a planta pode ser modificada por contato da folha, semente, pólen, raiz, fruta, rebento, flor, células, protoplastos ou tecido (por exemplo, tecido meristemático) da planta.
Como tal, em outro aspecto, é proporcionado aqui um método de aumentar a aptidão de uma planta,
incluindo o método contatar o pólen da planta com uma quantidade eficaz de uma composição de PMP aqui, em que o método aumenta a aptidão da planta (por exemplo, em cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100%) em relação a uma planta não tratada.
Ainda em outro aspecto é proporcionado aqui um método de aumentar a aptidão de uma planta, incluindo o método contatar uma semente da planta com uma quantidade eficaz de uma composição de PMP divulgada aqui, em que o método aumenta a aptidão da planta (por exemplo, em cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100%) em relação a uma planta não tratada.
Em outro aspecto é proporcionado aqui um método contatar um protoplasto da planta com uma quantidade eficaz de uma composição de PMP aqui, em que o método aumenta a aptidão da planta (por exemplo, em cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100%) em relação a uma planta não tratada.
Em um aspecto adicional é proporcionado aqui um método de aumentar a aptidão de uma planta, incluindo o método contatar uma célula vegetal da planta com uma quantidade eficaz de uma composição de PMP aqui, em que o método aumenta a aptidão da planta (por exemplo, em cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100%) em relação a uma planta não tratada.
Em outro aspecto é proporcionado aqui um método de aumentar a aptidão de uma planta, incluindo o método contatar um tecido meristemático da planta com uma quantidade eficaz de uma composição de PMP aqui, em que o método aumenta a aptidão da planta (por exemplo, em cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%,
50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100%) em relação a uma planta não tratada.
Em outro aspecto é proporcionado aqui um método de aumentar a aptidão de uma planta, incluindo o método contatar um embrião da planta com uma quantidade eficaz de uma composição de PMP aqui, em que o método aumenta a aptidão da planta (por exemplo, em cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100%) em relação a uma planta não tratada.
Nos casos onde um herbicida é incluído no PMP, ou suas composições, os métodos podem ser adicionalmente usados para diminuir a aptidão de ou matar ervas daninhas.
Em tais casos, o método pode ser eficaz para diminuir a aptidão da erva daninha em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais em comparação com uma erva daninha não tratada (por exemplo, uma erva daninha à qual a composição de PMP não foi administrada). Por exemplo, o método pode ser eficaz para matar a erva daninha, diminuindo deste modo a população da erva em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais em comparação com uma erva daninha não tratada.
Em alguns casos, o método elimina substancialmente a erva daninha.
Exemplos de ervas daninhas que podem ser tratadas de acordo com os presentes métodos são adicionalmente descritos aqui. i.
Plantas Uma variedade de plantas pode ser entregue ou tratada com uma composição de PMP descrita aqui.
As plantas às quais pode ser entregue uma composição de PMP (isto é, “tratadas”) de acordo com os presentes métodos incluem plantas inteiras e suas partes, incluindo, mas não se limitando a, órgãos/estruturas vegetativos de rebentos (por exemplo, folhas, caules e tubérculos), raízes, flores e órgãos/estruturas florais (por exemplo, brácteas, sépalas, pétalas, estames, carpelos,
anteras e óvulos), semente (incluindo embrião, endosperma, cotilédones e tegumento) e fruta (o ovário maduro), tecido de plantas (por exemplo, tecido vascular, tecido triturado e similares) e células (por exemplo, células guarda, óvulos e similares) e descendência dos mesmos.
As partes das plantas podem adicionalmente se referir a partes da planta tais como o rebento, raiz, caule, sementes, estípulas, folhas, pétalas, flores, óvulos, brácteas, ramos, pecíolos, internódios, casca, pubescência, perfilhos, rizomas, frondes, lâminas, pólen, estame e similares.
A classe de plantas que pode ser tratada em um método divulgado aqui inclui a classe de plantas superiores e inferiores, incluindo angiospermas (plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas), gimnospermas, samambaias, cavalinhas, psilófitas, licófitas, briófitas e algas (por exemplo, algas multicelulares ou unicelulares). As plantas que podem ser tratadas de acordo com os presentes métodos incluem adicionalmente qualquer planta vascular, por exemplo monocotiledôneas ou dicotiledôneas ou gimnospermas, incluindo, mas não se limitando a, alfafa, maçã, Arabidopsis, banana, cevada, canola, mamona, chicória, crisântemo, trevo, cacau, café, algodão, semente de algodão, milho, crambe, oxicoco, crucíferas, pepino, dendróbio, dióscoreia, eucalipto, festuca, linho, gladíolo, liliácea, linhaça, painço, meloa, mostarda, aveia, dendê, colza, mamão, amendoim, abacaxi, plantas ornamentais, Phaseolus, batata, colza, arroz, centeio, azevém, cártamo, gergelim, sorgo, soja, beterraba-sacarina, cana-de-açúcar, girassol, morango, tabaco, tomate, grama, trigo e culturas vegetais tais como alface, aipo, brócolis, couve-flor, cucurbitáceas; árvores de fruta e nozes, tais como maçã, pera, pêssego, laranja, toranja, limão, lima, amêndoa, noz-pecã, nozes, avelã; videiras, tais como uvas (por exemplo, uma vinha), quiuí, lúpulo; arbustos de frutas e silvas, tais como framboesa, amora-preta, groselha; árvores florestais, tais como freixo,
pinheiro, abeto, bordo, carvalho, castanheiro, álamo; com alfafa, canola, mamona, milho, algodão, crambe, linho, linhaça, mostarda, dendê, colza, amendoim, batata, arroz, cártamo, gergelim, soja, beterraba, girassol, tabaco, tomate e trigo.
As plantas que podem ser tratadas de acordo com os métodos da presente invenção incluem qualquer planta de cultura, por exemplo, cultura de forragem, cultura de sementes oleaginosas, cultura de grãos, cultura de frutas, cultura de legumes e hortaliças, cultura de fibras, cultura de especiarias, cultura de nozes, cultura de gramas, cultura de açúcar, cultura de bebida e cultura florestal.
Em certos casos, a planta de cultura que é tratada no método é uma planta de soja.
Em certos outros casos, a planta de cultura é trigo.
Em certos casos, a planta de cultura é milho.
Em certos casos, a planta de cultura é algodão.
Em certos casos, a planta de cultura é alfafa.
Em certos casos, a planta de cultura é beterraba-sacarina.
Em certos casos, a planta de cultura é arroz.
Em certos casos, a planta de cultura é batata.
Em certos casos, a planta de cultura é tomate.
Em certos casos, a planta é uma cultura.
Exemplos de tais plantas de cultura incluem, mas não estão limitados a, plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas incluindo, mas não se limitando a, forragem ou leguminosas forrageiras, plantas ornamentais, culturas alimentares, árvores ou arbustos selecionados de Acer spp., Allium spp., Amaranthus spp., Ananas comosus, Apium graveolens, Arachis spp, Asparagus officinalis, Beta vulgaris, Brassica spp. (por exemplo, Brassica napus, Brassica rapa ssp. (canola, colza, nabo), Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Castanea spp., Cichorium endivia, Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Cucurbita spp., Cucumis spp., Daucus carota, Fagus spp., Ficus carica, Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (por exemplo, Glycine max, Soja hispida ou Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por exemplo,
Helianthus annuus), Hibiscus spp., Hordeum spp. (por exemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Lycopersicon spp. (por exemplo, Lycopersicon esculenturn, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Malus spp., Medicago sativa, Mentha spp., Miscanthus sinensis, Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Oryza spp. (por exemplo, Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Petroselinum crispum, Phaseolus spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prunus spp., Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis spp., Solanum spp. (por exemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium ou Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Spinacia spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por exemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum ou Triticum vulgare), Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., e Zea mays.
Em certas modalidades, a planta de cultura é arroz, colza, canola, soja, milho (maís), algodão, cana-de-açúcar, alfafa, sorgo ou trigo.
Em certo caso, as composições e métodos podem ser usados para tratar plantas ou partes de plantas pós-coleta, alimento ou produtos de ração.
Em alguns casos, o alimento ou produto de ração é um alimento ou produto de ração diferente de plantas (por exemplo, um produto comestível para humanos, animais veterinários ou gado (por exemplo, cogumelos)). A planta ou parte da planta para uso na presente invenção inclui plantas em qualquer etapa de desenvolvimento da planta.
Em certos casos, a entrega pode ocorrer durante as etapas de germinação, crescimento de plântulas, crescimento vegetativo e crescimento reprodutivo.
Em certos casos, a entrega à planta ocorre durante as etapas de crescimento vegetativo e reprodutivo.
Alternativamente, a entrega pode ocorrer a uma semente.
As etapas de crescimento vegetativo e reprodutivo são também referidas aqui como plantas “adultas” ou “maduras”. ii.
Ervas Daninhas Nos casos onde um herbicida é incluído no PMP, ou suas composições, os métodos podem ser adicionalmente usados para diminuir a aptidão de ou matar ervas daninhas.
Em tais casos, o método pode ser eficaz para diminuir a aptidão da erva daninha em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais em comparação com uma erva daninha não tratada (por exemplo, uma erva daninha à qual a composição de PMP não foi administrada). Por exemplo, o método pode ser eficaz para matar a erva daninha, diminuindo deste modo a população da erva em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais em comparação com uma erva daninha não tratada.
Em alguns casos, o método elimina substancialmente a erva daninha.
Exemplos de ervas daninhas que podem ser tratadas de acordo com os presentes métodos são adicionalmente descritos aqui.
Como usado aqui, o termo “erva daninha” se refere a uma planta que cresce onde não é desejada.
Tais plantas são tipicamente invasivas e, por vezes, prejudiciais, ou têm o risco de se tornarem assim.
As ervas daninhas podem ser tratadas com as presentes composições de PMP para reduzir ou eliminar a presença, viabilidade ou reprodução da planta.
Por exemplo, e sem estar limitado a isso, os métodos podem ser usados para visar ervas daninhas conhecidas por danificarem plantas.
Por exemplo, e sem estar limitado a isso, as ervas daninhas podem ser qualquer membro do seguinte grupo de famílias: Gramineae, Umbelliferae, Papilionaceae, Cruciferae, Malvaceae, Eufhorbiaceae, Compositae, Chenopodiaceae, Fumariaceae, Charyophyllaceae, Primulaceae, Geraniaceae, Polygonaceae, Juncaceae, Cyperaceae, Aizoaceae, Asteraceae, Convolvulaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Polygonaceae, Portulaceae, Solanaceae, Rosaceae, Simaroubaceae, Lardizabalaceae, Liliaceae, Amaranthaceae, Vitaceae, Fabaceae, Primulaceae, Apocynaceae, Araliaceae, Caryophyllaceae, Asclepiadaceae, Celastraceae, Papaveraceae, Onagraceae, Ranunculaceae, Lamiaceae, Commelinaceae, Scrophulariaceae, Dipsacaceae, Boraginaceae, Equisetaceae, Geraniaceae, Rubiaceae, Cannabaceae, Hyperiacaceae, Balsaminaceae, Lobeliaceae, Caprifoliaceae, Nyctaginaceae, Oxalidaceae, Vitaceae, Urticaceae, Polypodiaceae, Anacardiaceae, Smilacaceae, Araceae, Campanulaceae, Typhaceae, Valerianaceae, Verbenaceae, Violaceae.
Por exemplo, e sem estar limitado a isso, as ervas daninhas podem ser qualquer membro do grupo consistindo em Lolium Rigidum, Amaramthus palmeri, Abutilon theopratsi, Sorghum halepense, Conyza Canadensis, Setaria verticillata, Capsella pastoris e Cyperus rotundas.
Ervas daninhas adicionais incluem, por exemplo, Mimosa pigra, Salvinia, Hyptis, Senna, Noogoora, rebarba, Jatropha gossypifolia, Parkinsonia aculeate, Chromolaena odorata, Cryptoslegia grandiflora ou Andropogon gayanus.
As ervas daninhas podem incluir plantas monocotiledôneas (por exemplo, Agrostis, Alopecurus, Avena, Bromus, Cyperus, Digitaria, Echinochloa, Lolium, Monochoria, Rottboellia, Sagittaria, Scirpus, Setaria, Sida ou Sorghum) ou plantas dicotiledôneas (Abutilon, Amaranthus, Chenopodium, Chrysanthemum, Conyza, Galium, Ipomoea, Nasturtium, Sinapis, Solanum, Stellaria, Veronica, Viola ou Xanthium). As composições e métodos relacionados podem ser usados para prevenir a infestação pelos ou reduzir os números de patógenos ou vetores de patógenos em quaisquer habitats nos quais residam (por exemplo, fora dos animais, por exemplo, em plantas, partes de plantas (por exemplo, raízes, frutos e sementes), no ou sobre o solo, água ou em outro habitat de patógeno ou vetor de patógeno.
Conformemente, as composições e métodos podem reduzir o efeito prejudicial de vetores de patógenos por, por exemplo, morte, ferida ou abrandamento da atividade do vetor e podem deste modo controlar a aptidão do patógeno para animais.
As composições divulgadas aqui podem ser usadas para controlar, matar, ferir, paralisar ou reduzir a atividade de um ou mais de quaisquer patógenos ou vetores de patógenos em qualquer etapa de desenvolvimento, por exemplo, seu ovo, ninfa, instar, larvas, adulto, juvenil ou formas dessecadas.
Os detalhes de cada um destes métodos são descritos adicionalmente em baixo.
B.
Entrega a uma Praga de Plantas São proporcionados aqui métodos de entregar uma composição de PMP (por exemplo, incluindo PMPs modificados descritos aqui) a uma praga de plantas, por exemplo, por contato da praga de plantas com a composição de PMP.
Em alguns casos, as pragas de plantas podem ser tratadas com PMPs não incluindo um agente funcional heterólogo.
Em outros casos, os PMPs incluem um agente funcional heterólogo, por exemplo, agentes pesticidas (por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, nematicidas, moluscicidas, virucidas ou herbicidas) ou agentes de controle de pragas (por exemplo, repelentes). Por exemplo, os métodos podem ser úteis para diminuir a aptidão de uma praga, por exemplo, para prevenir ou tratar uma infestação de pragas em consequência da entrega de uma composição de PMP.
Em um aspecto é proporcionado aqui um método de diminuir a aptidão de uma praga, incluindo o método entregar à praga a composição de PMP descrita aqui (por exemplo, em uma quantidade e durante uma duração eficazes) para diminuir a aptidão da praga em relação a uma praga não tratada (por exemplo, uma praga à qual não foi entregue a composição de PMP). Em um aspecto é proporcionado aqui um método de diminuir uma infeção fúngica em (por exemplo, tratar) uma planta tendo uma infeção fúngica, em que o método inclui entregar à planta uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs (por exemplo, uma composição de PMP descrita aqui). Em outro aspecto é proporcionado aqui um método de diminuir uma infeção fúngica em (por exemplo, tratar) uma planta tendo uma infeção fúngica, em que o método inclui entregar à planta uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs (por exemplo, uma composição de PMP descrita aqui), e em que a pluralidade de PMPs inclui um agente antifúngico.
Em alguns casos, o agente antifúngico é um ácido nucleico que inibe a expressão de um gene (por exemplo, dcl1 e dcl2 (isto é, dcl1/2)) em um fungo que causa a infeção fúngica.
Em alguns casos, a infeção fúngica é causada por um fungo pertencendo a uma Sclerotinia spp. (por exemplo, Sclerotinia sclerotiorum), uma Botrytis spp. (por exemplo, Botrytis cinerea), uma Aspergillus spp., uma Fusarium spp. ou uma Penicillium spp.
Em alguns casos, a composição inclui um PMP produzido a partir de uma EV de apoplasto de Arabidopsis.
Em alguns casos, o método diminui ou elimina substancialmente a infeção fúngica.
Em outro aspecto é proporcionado aqui um método de diminuir uma infeção bacteriana em (por exemplo, tratar) uma planta tendo uma infeção bacteriana, em que o método inclui entregar à praga de plantas uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs (por exemplo, uma composição de PMP descrita aqui). Em outro aspecto é proporcionado aqui um método de diminuir uma infeção bacteriana em (por exemplo, tratar) uma planta tendo uma infeção bacteriana, em que o método inclui entregar à praga de plantas uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs, e em que a pluralidade de PMPs inclui um agente antibacteriano.
Em alguns casos, o agente antibacteriano é estreptomicina.
Em alguns cassos, a infeção bacteriana é causada por uma bactéria pertencendo a uma espécie de Pseudomonas spp. (por exemplo, Pseudomonas syringae). Em alguns casos, a composição inclui um PMP produzido a partir de uma EV de apoplasto de Arabidopsis.
Em alguns casos, o método diminui ou elimina substancialmente a infeção bacteriana.
Em outro aspecto é proporcionado aqui um método de diminuir a aptidão de uma praga de plantas de insetos, em que o método inclui entregar à praga de plantas de insetos uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs (por exemplo, uma composição de PMP descrita aqui). Em outro aspecto é proporcionado aqui um método de diminuir a aptidão de uma praga de plantas de insetos, em que o método inclui entregar à praga de plantas de insetos uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs (por exemplo, uma composição de PMP descrita aqui), e em que a pluralidade de PMPs inclui um agente inseticida.
Em alguns casos, o agente inseticida é um ácido nucleico de peptídeos.
Em alguns casos, a praga de plantas de insetos é um afídeo.
Em alguns casos, a praga de plantas de insetos é um lepidóptero, por exemplo, Spodoptera frugiperda.
Em alguns casos, o método diminui a aptidão da praga de plantas de insetos em relação a uma praga de plantas de insetos não tratada.
Em outro aspecto é proporcionado aqui um método de diminuir a aptidão de uma praga de plantas de nematódeos, em que o método inclui entregar à praga de plantas de nematódeos uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs (por exemplo,
uma composição de PMP descrita aqui). Em outro aspecto é proporcionado aqui um método de diminuir a aptidão de uma praga de plantas de nematódeos, em que o método inclui entregar à praga de nematódeos uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs (por exemplo, uma composição de PMP descrita aqui), e em que a pluralidade de PMPs inclui um agente nematicida.
Em alguns casos, o agente nematicida é um neuropeptídeo (por exemplo, Mi-NLP-15b). Em alguns casos, a praga de plantas de nematódeos é um nematódeo dos nós da raiz do milho.
Em alguns casos, o método diminui a aptidão da praga de plantas de nematódeos em relação a uma praga de plantas de nematódeos não tratada.
Em outro aspecto é proporcionado aqui um método de diminuir a aptidão de uma erva daninha, em que o método inclui entregar à erva daninha uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs (por exemplo, uma composição de PMP descrita aqui). Em outro aspecto é proporcionado aqui um método de diminuir a aptidão de uma erva daninha, em que o método inclui entregar à erva daninha uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs (por exemplo, uma composição de PMP descrita aqui), e em que a pluralidade de PMPs inclui um agente herbicida (por exemplo, Glufosinato). Em alguns casos, a erva daninha é uma goosegrass indiana (Eleusine indica). Em alguns casos, o método diminui a aptidão da erva daninha em relação a uma erva daninha não tratada.
Uma diminuição na aptidão da praga em consequência da entrega de uma composição de PMP pode se manifestar de um número de modos.
Em alguns casos, a diminuição na aptidão da praga pode se manifestar como uma deterioração ou declínio na fisiologia da praga
(por exemplo, saúde ou sobrevivência reduzida) em consequência da entrega da composição de PMP.
Em alguns casos, a aptidão de um organismo pode ser medida por um ou mais parâmetros, incluindo, mas não se limitando a, taxa reprodutiva, fertilidade, expectativa de vida, viabilidade, mobilidade, fecundidade, desenvolvimento da praga, peso corporal, taxa ou atividade metabólica ou sobrevivência em comparação com uma praga à qual a composição de PMP não foi administrada.
Por exemplo, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para diminuir a saúde global da praga ou para diminuir a sobrevivência global da praga.
Em alguns casos, a sobrevivência diminuída da praga é cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, um nível encontrado em uma praga que não recebe uma composição de PMP). Em alguns casos, os métodos e composições são eficazes para diminuir a reprodução da praga (por exemplo, taxa reprodutiva, fertilidade) em comparação com uma praga à qual a composição de PMP não foi administrada.
Em alguns casos, os métodos e composições são eficazes para diminuir outros parâmetros fisiológicos, tais como mobilidade, peso corporal, expectativa de vida, fecundidade ou taxa metabólica, em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, um nível encontrado em uma praga que não recebe uma composição de PMP). Em alguns casos, a diminuição na aptidão da praga pode se manifestar como uma diminuição na produção de um ou mais nutrientes na praga (por exemplo, vitaminas, carboidratos, aminoácidos ou polipeptídeos) em comparação com uma praga à qual a composição de PMP não foi administrada.
Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para diminuir a produção de nutrientes na praga (por exemplo, vitaminas, carboidratos, aminoácidos ou polipeptídeos) em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, um nível encontrado em uma praga que não recebe uma composição de PMP). Em alguns casos, a diminuição na aptidão da praga pode se manifestar como um aumento na sensibilidade da praga a um agente pesticida e/ou uma diminuição na resistência da praga a um agente pesticida em comparação com uma praga à qual a composição de PMP não foi administrada.
Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para aumentar a sensibilidade da praga a um agente pesticida em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, um nível encontrado em uma praga que não recebe uma composição de PMP). O agente pesticida pode ser qualquer agente pesticida conhecido na técnica, incluindo agentes inseticidas.
Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem aumentar a sensibilidade da praga a um agente pesticida por diminuição da capacidade da praga de metabolizar ou degradar o agente pesticida em substratos usáveis em comparação com uma praga à qual a composição de PMP não foi administrada.
Em alguns casos, a diminuição na aptidão da praga pode se manifestar como um aumento na sensibilidade da praga a um agente aleloquímico e/ou uma diminuição na resistência da praga a um agente aleloquímico em comparação com uma praga à qual a composição de PMP não foi administrada.
Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para diminuir a resistncia da praga a um agente aleloquímico em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, um nível encontrado em uma praga que não recebe uma composição de PMP). Em alguns casos, o agente aleloquímico é cafeína, cistatina de soja, fenitrotiona, monoterpenos, ácidos de diterpenos ou compostos fenólicos (por exemplo, taninos, flavonoides). Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem aumentar a sensibilidade da praga a um agente aleloquímico por diminuição da capacidade da praga de metabolizar ou degradar o agente aleloquímico em substratos usáveis em comparação com uma praga à qual a composição de PMP não foi administrada.
Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para diminuir a resistência da praga a parasitas ou patógenos (por exemplo, patógenos ou parasitas fúngicos, bacterianos ou virais) em comparação com uma praga à qual a composição de PMP não foi administrada.
Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para diminuir a resistência da praga a um patógeno ou parasita (por exemplo, patógenos fúngicos, bacterianos ou virais; ou ácaros parasitas) em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, um nível encontrado em uma praga que não recebe uma composição de PMP). Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para diminuir a capacidade da praga de transportar ou transmitir um patógeno de plantas (por exemplo, vírus de plantas (por exemplo, TYLCV) ou uma bactéria de plantas (por exemplo, Agrobacterium spp.)) em comparação com uma praga à qual a composição de PMP não foi administrada.
Por exemplo, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para diminuir a capacidade da praga de transportar ou transmitir um patógeno de plantas (por exemplo, um vírus de plantas (por exemplo, TYLCV) ou bactéria de plantas (por exemplo, Agrobacterium spp.)) em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, um nível encontrado em uma praga que não recebe uma composição de PMP). Adicionalmente ou alternativamente, nos casos onde um herbicida é incluído no PMP, ou suas composições, os métodos podem ser adicionalmente usados para diminuir a aptidão de ou matar ervas daninhas.
Em tais casos, o método pode ser eficaz para diminuir a aptidão da erva daninha em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais em comparação com uma erva daninha não tratada (por exemplo, uma erva daninha à qual a composição de PMP não foi administrada). Por exemplo, o método pode ser eficaz para matar a erva daninha, diminuindo deste modo a população da erva em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais em comparação com uma erva daninha não tratada.
Em alguns casos, o método elimina substancialmente a erva daninha.
Exemplos de ervas daninhas que podem ser tratadas de acordo com os presentes métodos são adicionalmente descritos aqui.
Em alguns casos, a diminuição na aptidão da praga pode se manifestar como outras desvantagens de aptidão, tais como uma tolerância diminuída a certos fatores ambientais (por exemplo, uma tolerância à temperatura elevada ou baixa), uma capacidade diminuída para sobreviver em certos habitats ou uma capacidade diminuída de manter uma certa dieta em comparação com uma praga à qual a composição de PMP não foi administrada.
Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para diminuir a aptidão da praga em qualquer pluralidade de modos descritos aqui.
Adicionalmente, a composição de PMP pode diminuir a aptidão da praga em qualquer número de classes, ordens, famílias, gêneros ou espécies de pragas (por exemplo, 1 espécie de praga, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ,10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 200, 250, 500 ou mais espécies de pragas). Em alguns casos, a composição de PMP atua em uma única classe, ordem, família, gênero ou espécie de patógeno.
A aptidão da praga pode ser avaliada usando quaisquer métodos padrão da técnica.
Em alguns casos, a aptidão da praga pode ser avaliada por avaliação de uma praga individual.
Alternativamente, a aptidão da praga pode ser avaliada por avaliação de uma população de pragas.
Por exemplo, uma diminuição na aptidão da praga pode se manifestar como uma diminuição na competição bem-sucedida contra outros insetos, levando deste modo a uma diminuição no tamanho da população de pragas. i.
Fungos As composições de PMP e métodos relacionados podem ser úteis para diminuir a aptidão de um fungo, por exemplo, para prevenir ou tratar uma infeção fúngica em uma planta.
Estão incluídos métodos para entregar uma composição de PMP a um fungo por contato do fungo com a composição de PMP.
Adicionalmente ou alternativamente, os métodos incluem entregar a composição de PMP a uma planta em risco de ou tendo uma infeção fúngica, por contato da planta com a composição de PMP.
As composições de PMP e métodos relacionados são adequados para entrega a fungos que causam doenças fúngicas em plantas, incluindo doenças causadas por patógenos de oídio, por exemplo espécies de Blumeria, por exemplo Blumeria graminis; espécies de Podosphaera, por exemplo Podosphaera leucotricha; espécies de Sphaerotheca, por exemplo Sphaerotheca fuliginea; espécies de Uncinula, por exemplo Uncinula necator; doenças causadas por patógenos da ferrugem, por exemplo espécies de Gymnosporangium, por exemplo Gymnosporangium sabinae; espécies de Hemileia, por exemplo Hemileia vastatrix; espécies de Phakopsora, por exemplo Phakopsora pachyrhizi e Phakopsora meibomiae; espécies de Puccinia, por exemplo Puccinia recondite, P. triticina, P. graminis ou P. striiformis ou P. hordei; espécies de Uromyces, por exemplo Uromyces appendiculatus; doenças causadas por patógenos do grupo dos Oomycetes, por exemplo espécies de Albugo, por exemplo Algubo candida; espécies de Bremia, por exemplo Bremia lactucae; espécies de Peronospora, por exemplo Peronospora pisi, P. parasitica ou P. brassicae; espécies de Phytophthora, por exemplo Phytophthora infestans; espécies de Plasmopara, por exemplo Plasmopara viticola; espécies de Pseudoperonospora, por exemplo Pseudoperonospora humuli ou Pseudoperonospora cubensis; espécies de Pythium, por exemplo Pythium ultimum; doenças da mancha das folhas e doenças da murcha das folhas causadas, por exemplo, por espécies de Alternaria, por exemplo Alternaria solani; espécies de Cercospora, por exemplo Cercospora beticola; espécies de Cladiosporium, por exemplo Cladiosporium cucumerinum; espécies de Cochliobolus, por exemplo Cochliobolus sativus (forma de conídios de: Drechslera, Sin: Helminthosporium), Cochliobolus miyabeanus; espécies de Colletotrichum, por exemplo Colletotrichum lindemuthanium; espécies de Cycloconium, por exemplo Cycloconium oleaginum; espécies de Diaporthe, por exemplo Diaporthe citri; espécies de Elsinoe, por exemplo Elsinoe fawcettii; espécies de Gloeosporium, por exemplo Gloeosporium laeticolor; espécies de Glomerella, por exemplo Glomerella cingulata; espécies de Guignardia, por exemplo Guignardia bidwelli; espécies de Leptosphaeria, por exemplo Leptosphaeria maculans, Leptosphaeria nodorum; espécies de Magnaporthe, por exemplo Magnaporthe grisea; espécies de Microdochium, por exemplo
Microdochium nivale; espécies de Mycosphaerella, por exemplo Mycosphaerella graminicola, M. arachidicola e M. fifiensis; espécies de Phaeosphaeria, por exemplo Phaeosphaeria nodorum; espécies de Pyrenophora, por exemplo Pyrenophora teres, Pyrenophora tritici repentis; espécies de Ramularia, por exemplo Ramularia collo-cygni, Ramularia areola; espécies de Rhynchosporium, por exemplo Rhynchosporium secalis; espécies de Septoria, por exemplo Septoria apii, Septoria lycopersii; espécies de Typhula, por exemplo Typhula incarnata; espécies de Venturia, por exemplo Venturia inaequalis; doenças da raiz e caule causadas, por exemplo, por espécies de Corticium, por exemplo Corticium graminearum; espécies de Fusarium, por exemplo Fusarium oxysporum; espécies de Gaeumannomyces, por exemplo Gaeumannomyces graminis; espécies de Rhizoctonia, tais como, por exemplo Rhizoctonia solani; doenças de Sarocladium causadas por exemplo por Sarocladium oryzae; doenças de Sclerotium causadas por exemplo por Sclerotium oryzae; espécies de Tapesia, por exemplo Tapesia acuformis; espécies de Thielaviopsis, por exemplo Thielaviopsis basicola; doenças da espiga e panícula (incluindo espigas de milho) causadas, por exemplo, por espécies de Alternaria, por exemplo Alternaria spp.; espécies de Aspergillus, por exemplo Aspergillus flavus; espécies de Cladosporium, por exemplo Cladosporium cladosporioides; espécies de Claviceps, por exemplo Claviceps purpurea; espécies de Fusarium, por exemplo Fusarium culmorum; espécies de Gibberella, por exemplo Gibberella zeae; espécies de Monographella, por exemplo Monographella nivalis; espécies de Septoria, por exemplo Septoria nodorum; doenças causadas por fungos obscuros, por exemplo espécies de Sphacelotheca, por exemplo Sphacelotheca reiliana; espécies de Tilletia, por exemplo Tilletia caries, T. controversa; espécies de Urocystis, por exemplo Urocystis occulta; espécies de Ustilago, por exemplo Ustilago nuda, U. nuda tritici; podridão da fruta causada, por exemplo, por espécies de Aspergillus, por exemplo Aspergillus flavus; espécies de Botrytis, por exemplo Botrytis cinerea; espécies de Penicillium, por exemplo Penicillium expansum e P. purpurogenum; espécies de Sclerotinia, por exemplo Sclerotinia sclerotiorum; espécies de Verticilium, por exemplo Verticilium alboatrum; doenças de decadência de sementes e solo, mofo, murcha, podridão e amortecimento causadas, por exemplo, por espécies de Alternaria, causadas por exemplo por Alternaria brassicicola; espécies de Aphanomyces, causadas por exemplo por Aphanomyces euteiches; espécies de Ascochyta, causadas por exemplo por Ascochyta lentis; espécies de Aspergillus, causadas por exemplo por Aspergillus flavus; espécies de Cladosporium, causadas por exemplo por Cladosporium herbarum; espécies de Cochliobolus, causadas por exemplo por Cochliobolus sativus; (Forma de conídios: Drechslera, Bipolaris Sin: Helminthosporium); espécies de Colletotrichum, causadas por exemplo por Colletotrichum coccodes; espécies de Fusarium, causadas por exemplo por Fusarium culmorum; espécies de Gibberella, causadas por exemplo por Gibberella zeae; espécies de Macrophomina, causadas por exemplo por Macrophomina phaseolina; espécies de Monographella, causadas por exemplo por Monographella nivalis; espécies de Penicillium, causadas por exemplo por Penicillium expansum; espécies de Phoma, causadas por exemplo por Phoma lingam; espécies de Phomopsis, causadas por exemplo por Phomopsis sojae; espécies de Phytophthora, causadas por exemplo por Phytophthora cactorum; espécies de Pyrenophora, causadas por exemplo por Pyrenophora graminea; espécies de Pyricularia, causadas por exemplo por Pyricularia oryzae; espécies de Pythium, causadas por exemplo por Pythium ultimum; espécies de Rhizoctonia, causadas por exemplo por Rhizoctonia solani; espécies de Rhizopus, causadas por exemplo por
Rhizopus oryzae; espécies de Sclerotium, causadas por exemplo por Sclerotium rolfsii; espécies de Septoria, causadas por exemplo por Septoria nodorum; espécies de Typhula, causadas por exemplo por Typhula incarnata; espécies de Verticillium, causadas por exemplo por Verticillium dahliae; cânceres, galhas e vassoura-de-bruxa causados, por exemplo, por espécies de Nectria, por exemplo Nectria galligena; doenças de murcha causadas, por exemplo, por espécies de Monilinia, por exemplo Monilinia laxa; doenças de bolhas nas folhas ou enrolamento das folhas causadas, por exemplo, por espécies de Exobasidium, por exemplo Exobasidium vexans; espécies de Taphrina, por exemplo Taphrina deformans; doenças de declínio de plantas de madeira causadas, por exemplo, pela doença de Esca, causada por exemplo por Phaemoniella clamydospora, Phaeoacremonium aleophilum e Fomitiporia mediterranea; dyeback de Eutypa, causada por exemplo por Eutypa lata; doenças de Ganoderma causadas por exemplo por Ganoderma boninense; doenças de Rigidoporus causadas por exemplo por Rigidoporus lignosus; doenças de flores e sementes causadas, por exemplo, por espécies de Botrytis, por exemplo Botrytis cinerea; doenças de tubérculos de plantas causadas, por exemplo, por espécies de Rhizoctonia, por exemplo Rhizoctonia solani; espécies de Helminthosporium, por exemplo Helminthosporium solani; Hérnia das couves causada, por exemplo, por espécies de Plasmodiophora, por exemplo Plamodiophora brassicae; doenças causadas por patógenos bacterianos, por exemplo espécies de Xanthomonas, por exemplo Xanthomonas campestris pv. oryzae; espécies de Pseudomonas, por exemplo Pseudomonas syringae pv. lachrymans; espécies de Erwinia, por exemplo Erwinia amylovora.
Doenças fúngicas em folhas, caules, vagens e sementes causadas, por exemplo, por mancha foliar de Alternaria (espec. de Alternaria atrans tenuissima), Antracnose (Colletotrichum gloeosporoides dematium var.
Truncatum), mancha marrom (Septoria glycines), mancha e ferrugem das folhas de Cercospora (Cercospora kikuchii), mancha das folha de Choanephora (Choanephora infundibulifera trispora (Sin.)), mancha das folha de Dactuliophora (Dactuliophora glycines), míldio (Peronospora manshurica), mancha de Drechslera (Drechslera glycini), mancha das folhas (Cercospora sojina), mancha das folhas de Leptosphaerulina (Leptosphaerulina trifolii), mancha das folhas de Phyllostica (Phyllosticta sojaecola), mancha das vagens e caules (Phomopsis sojae), míldio (Microsphaera diffusa), mancha das folhas de Pyrenochaeta (Pyrenochaeta glycines), mancha aérea, da folhagem e teias de Rhizoctonia (Rhizoctonia solani), ferrugem (Phakopsora pachyrhizi, Phakopsora meibomiae), sarna (Sphaceloma glycines), mancha das folhas de Stemphylium (Stemphylium botryosum), mancha alvo (Corynespora cassiicola). Doenças fúngicas nas raízes e na base do caule causadas, por exemplo, por podridão negra da raiz (Calonectria crotalariae), podridão do carvão (Macrophomina phaseolina), ferrugem ou murcha, podridão da raiz e podridão das vagens e colar de Fusarium (Fusarium oxysporum, Fusarium orthoceras, Fusarium semitectum, Fusarium equiseti), podridão da raiz de Mycoleptodiscus (Mycoleptodiscus terrestris), Neocosmospora (Neocosmospora vasinfecta), podridão das vagens e caules (Diaporthe phaseolorum), câncer do caule (Diaporthe phaseolorum var. caulivora), podridão de Phytophthora (Phytophthora megasperma), podridão de caule marrom (Phialophora gregata), podridão de Pythium (Pythium aphanidermatum, Pythium irregulare, Pythium debaryanum, Pythium myriotylum, Pythium ultimum), podridão da raiz, decadência dos caules e amortecimento de Rhizoctonia (Rhizoctonia solani), decadência do caule de Sclerotinia (Sclerotinia sclerotiorum), ferrugem do sul de Sclerotinia (Sclerotinia rolfsii), podridão da raiz de Thielaviopsis (Thielaviopsis basicola).
Em certos casos, o fungo é uma Sclerotinia spp. (Sclerotinia sclerotiorum). Em certos casos, o fungo é uma Botrytis spp. (por exemplo, Botrytis cinerea). Em certos casos, o fungo é uma Aspergillus spp.
Em certos casos, o fungo é uma Fusarium spp.
Em certos casos, o fungo é uma Penicillium spp.
As composições da presente invenção são úteis em várias aplicações de controle de fungos.
As composições descritas acima podem ser usadas para controlar fitopatógenos fúngicos antes da coleta ou patógenos fúngicos pós-coleta.
Em uma modalidade, qualquer uma das composições descritas acima é usada para controlar patógenos alvo tais como espécies de Fusarium, espécies de Botrytis, espécies de Verticillium, espécies de Rhizoctonia, espécies de Trichoderma ou espécies de Pythium por aplicação a composição a plantas, à área rodeando as plantas ou cogumelos cultivados comestíveis, sementes de cogumelo ou composto de cogumelos.
Em outra modalidade, as composições da presente invenção são usadas para controlar patógenos pós-coleta tais como espécies de Penicillium, Geotrichum, Aspergillus niger ou Colletotrichum.
A Tabela 6 proporciona exemplos adicionais de fungos, e doenças de plantas associadas aos mesmos, que podem ser tratados ou prevenidos usando a composição de PMP e métodos relacionados descritos aqui.
Tabela 6. Pragas fúngicas Doença Agente Causador Mancha das folhas de Alternaria do trigo Alternaria triticina Mancha das folhas de Alternaria de culturas de Alternaria japonica couve Ferrugem da soja americana Phakopsora meibomiae Ferrugem de Ampelopsis Phakopsora ampelopsidis Anêmona Ochropsora ariae Mancha angular das folhas de Citrus Pseudocercospora angolensis Ferrugem de Rubus do ártico Phragmidium arcticum
Doença Agente Causador Praga de Ascochyta de favas Didymella fabae Dieback de cinzas Chalara fraxinea Ferrugem de Rosa da Ásia Phragmidium butleri Ferrugem de avelã da Ásia Pucciniastrum coryli Ferrugem rosa de Kuehneola da Ásia Kuehneola japonica Ferrugem de Rubus da Ásia Phragmidium assamense Ferrugem de Phragmidium Rubus da Ásia Phragmidium arisanense Ferrugem de pistache da Ásia Pileolaria pistaciae Ferrugem de rosa da Ásia Gerwasia rosae Ferrugem de Rubus da Ásia Hamaspora hashiokai Ferrugem de soja da Ásia Phakopsora pachyrhizi Fuligem de cana-de-açúcar da Ásia Sporisorium sacchari Casca de Verruga da Ásia, câncer da bolha, Botryosphaeria berengeriana f. sp. podridão anelar, câncer de Physalospora de pera e pyricola maçã Podridão marrom da Ásia/Europa de Rosaceae Monilinia fructigena Podridão marrom de fruta da Ásia Monilia polystroma Ferrugem de Rubus da Ásia de Barclay Phragmidium barclayi Mancha negra das folhas de soja Arkoola nigra Mancha de bolhas de chá Exobasidium vexans Mancha azul de carvalho mongol Ophiostoma longicollum Ferrugem de Caixa ou Ferrugem de Buxo Puccinia buxi Ferrugem marrom de cana-de-açúcar Puccinia melanocephala Queima das folhas de cereja Apiognomonia erythrostoma Mancha de chocolate de peras Ya Li Alternaria yaliinficiens Ferrugem Branca de Crisântemo Puccinia horiana Ferrugem das Folhas do Café Hemileia vastatrix Ferrugem de Rubus da Ásia Comum Hamaspora acutissima Lariço comum Melampsora capraearum Ferrugem comum de batata e tomate Puccinia pittieriana Dieback do pinheiro de Crumenulopsis Crumenulopsis sororia Ferrugem de Lírio-de-um-dia Puccinia hemerocallidis Míldio Penugento de Digitalis Peronospora digitalis Míldio Penugento (Plasmopara) de Impatiens Plasmopara obducens Berinjela Puccinia substriata var. substriata Ergot de milheto Claviceps fusiformis Câncer de lariço europeu Lachnellula willkommii
Doença Agente Causador Ferrugem de Rubus da Ásia com poucas locações Phragmidium pauciloculare Fuligem de bandeira de trigo Urocystis agropyri Ferrugem de Gladiolus Uromyces transversalis Goplana dioscoreae Goplana dioscoreae Ferrugem das folha de uva Phakopsora euvitis Ferrugem de Rubus cinza Phragmidium griseum Ferrugem do rododendro dos Himalaias Chrysomyxa himalensis Ferrugem de Rubus de Hiratsuka Phragmidium hiratsukanum Dente de cavalo ou ergot de maís Claviceps gigantea Ferrugem de maçã japonesa Gymnosporangium yamadae Chamaecyparis japonesa Gymnosporangium miyabei Ergot de sorgo japonês Claviceps sorghicola Ferrugem rosa de Kamtschatka Phragmidium kamtschatkae Murcha tardia de maís Harpophora maydis Ferrugem de Rubus da Ásia de esporos longos Hamaspora longissima Doença Mal seco de Citrus Phoma tracheiphila Miscanthus Puccinia miscanthi Ferrugem de amora Aecidium mori Ferrugem de Nambu Rubus Phragmidium nambuanum Podridão do pescoço de cebola Ciborinia allii Ferrugem de Rubus da Nova Zelândia Hamaspora australis Mancha azul do norte de pinheiro Leptographium wingfieldii Abeto do norte Chrysomyxa rhododendri Murcha de Carvalho Ceratocystis fagacearum Ferrugem laranja de cana-de-açúcar Puccinia kuehnii Peronospora radii Peronospora radii Ferrugem de Pistache Pileolaria terebinthi Sarna de Poinsettia Sphaceloma poinsettiae Fuligem de batata Thecaphora solani Puccinia gladioli on Gladiolus Puccinia gladioli Puccinia glyceriae (anam.
Aecidium hydrangea Puccinia glyceriae Puccinia mccleanii em Gladiolus Puccinia mccleanii Puccinia psidii Puccinia psidii Pucciniastrum actinidiae em Actinidia spp.
Pucciniastrum actinidiae Ferrugem vermelha de Miscanthus Puccinia erythropus Ferrugem de amora preta da Europa Phragmidium bulbosum Ferrugem de Rubus saxitilis Phragmidium acuminatum
Doença Agente Causador Ferrugem em Rubus da Ásia Gerwasia rubi Ferrugem em Rubus a América do sul Gerwasia imperialis Ferrugem de pinheiro silvestre Cronartium flaccidum Ferrugem de rebentos de buxo Calonectria pseudonaviculata Fungo de vespa Sirex Amylostereum areolatum Solanum Puccinia agrophila Ferrugem de Rubus da América do sul Gerwasia mayorii Fuligem de Sporisorium de Saccharum selvagem Sporisorium pulverulentum Ferrugem das agulhas de abeto Chrysomyxa abietis Stackburn, ferrugem de plântulas, mancha foliar de Alternaria padwickii arroz Queda repentina das agulhas de Abeto (SNEED) Setomelanomma holmii Doença açucarada ou ergot asiática do sorgo Claviceps sorghi Ferrugem de batata-doce Endophyllum kaernbachii Ferrugem de Rubus de Taiwan Phragmidium formosanum Mancha de alcatrão de milho Phyllachora maydis Ferrugem de Teca Olivea tectonae Thekopsora areolate Thekopsora areolata Doença de derrame de berinjela Diaporthe vexans Ferrugem de Kuehneola tropical americana de Kuehneola loeseneriana Rubus Ferrugem de Mainsia tropical americana de Rubus Mainsia rubi Ferrugem Tropical de Soja Aecidium glycines Uromyces gladioli em Gladiolus Uromyces gladioli Uromyces nyikensis em Gladiolus Uromyces nyikensis Uromycladium tepperianum em Acacia spp.
Uromycladium tepperianum Rubus Variável Gerwasia variabilis Ferrugem de Rubus de Wineberry Hamaspora sinica var. sinica Ferrugem de Rubus de Yamada Phragmidium yamadanum Antracnose, ferrugem das folhas e podridão do Colletotrichum graminicola caule anthracnose (teleomorfo: Glomerella graminicola), Glomerella tucumanensis (anamorfo: Glomerella falcatum) Podridão de espigas e caroço de Aspergillus Aspergillus flavus Mancha de folhas e bainha com bandas Rhizoctonia solani = Rhizoctonia microsclerotia (teleomorfo:
Doença Agente Causador Thanatephorus cucumeris) Ferrugem de feijão Uromyces appendiculatus Doença de feixe preto Acremonium strictum = Cephalosporium acremonium Podridão de núcleo preto Lasiodiplodia theobromae = Botryodiplodia theobromae Borde blanco Marasmiellus sp.
Mancha marrom (mancha preta, podridão do caule) Physoderma maydis Míldio penugento com listras marrons Sclerophthora rayssiae var. zeae Podridão do núcleo de Cephalosporium Acremonium strictum = Cephalosporium acremonium Podridão de carvão Macrophomina phaseolina Ferrugem comum de milho Puccinia sorghi Ferrugem do sul de milho Puccinia polysora Ferrugem tropical de milho Physopella pallescens, P. zeae = Angiospora zeae Podridão de espiga de Corticium Thanatephorus cucumeris = Corticium sasakii Ferrugem de algodão Puccinia schedonnardi Ferrugem do sudoeste de algodão Puccinia cacabata Ferrugem tropical de algodão Phakopsora gossypii Míldio penugento maluco Sclerophthora macrospora = S. macrospora Mancha das folhas de Curvularia Curvularia clavata, C. eragrostidis, = C. maculans (teleomorfo: Cochliobolus eragrostidis), Curvularia inaequalis, C. intermedia (teleomorph: Cochliobolus intermedius), Curvularia lunata (teleomorph: Cochliobolus lunatus), Curvularia pallescens (teleomorph: Cochliobolus pallescens), Curvularia senegalensis, C. tuberculata (teleomorph: Cochliobolus tuberculatus) Mancha das folhas de Didymella Didymella exitialis Podridão de espigas e podridão do caule de Diplodia frumenti (teleomorfo: Diplodia Botryosphaeria festucae)
Doença Agente Causador Podridão de espigas, podridão da haste, podridão Diplodia maydis = Stenocarpella das sementes e praga das plântulas de Diplodia maydis Mancha das folhas ou risca das folhas de Diplodia Stenocarpella macrospora = Diplodia macrospore Míldio penugento das folhas de uva Plasmopara viticola Podridão de espigas secas (podridão de espigas, Nigrospora oryzae (teleomorfo: núcleo e caule) Khuskia oryzae) Podridão de espigas, menor Aspergillus glaucus, A. niger, Aspergillus spp., Cunninghamella sp., Curvularia pallescens, Doratomyces stemonitis = Cephalotrichum stemonitis, Fusarium culmorum, Gonatobotrys simplex, Pithomyces maydicus, Rhizopus microsporus, R. stolonifer = R. nigricans, Scopulariopsis brumptii epitea Melampsora larici Ergot (dente de cavalo, diente del caballo) Claviceps gigantea (anamorfo: Sphacelia sp.) Mancha ocular Aureobasidium zeae = Kabatiella zeae Podridão de espigas e caule de Fusarium Fusarium subglutinans = F. moniliforme var. subglutinans Podridão de núcleo, raiz e haste, podridão das Fusarium moniliforme (teleomorfo: sementes e praga das plântulas de Fusarium Gibberella fujikuroi) Podridão do caule, podridão da raiz de plântulas de Fusarium avenaceum (teleomorfo: Fusarium Gibberella avenacea) Podridão das espigas e caule de Gibberella Gibberella zeae (anamorfo: Fusarium graminearum) Podridão de espigas cinzas Botryosphaeria zeae = Physalospora zeae (anamorfo: Macrophoma zeae) Mancha cinza das folhas (Cercospora Cercospora sorghi = C. sorghi var. maydis, C. zeae-maydis leaf spot) Míldio penugento das espigas verdes Sclerospora graminicola Podridão das espigas de Helminthosporium (raça 1) Bipolaris zeicola = Helminthosporium carbonum
Doença Agente Causador Podridão da raiz de Helmintosporium Exserohilum pedicellatum = Helminthosporium pedicellatum (teleomorph: Setosphaeria) Podridão das espigas de Hormodendrum (podridão Cladosporium cladosporioides = de Cladosporium) Hormodendrum cladosporioides, C. herbarum (teleomorph: Mycosphaerella tassiana) Mancha das folhas de Hyalothyridium Hyalothyridium maydis Míldio penugento da Java Peronosclerospora maydis = Sclerospora maydis Murcha tardia Cephalosporium maydis Ferrugem das folhas (marrom) Puccinia recondita (anamorfo: Aecidium clematitis) Manchas das folhas, menores Alternaria alternata, Ascochyta maydis, A. tritici, A. zeicola, Bipolaris victoriae = Helminthosporium victoriae (teleomorph: Cochliobolus victoriae), C. sativus (anamorph: Bipolaris sorokiniana = H.
Exserohilum maydis, Leptothyrium zeae, Ophiosphaerella herpotricha, Setosphaeria prolata) Graphium penicillioides, Leptosphaeria prolatum = Drechslera prolata (teleomorph: sorokinianum = H. sativum), Epicoccum nigrum, (anamorph: Scolecosporiella sp.), Paraphaeosphaeria michotii, Phoma sp., Septoria zeae, S. zeicola, S. zeina Fungos de ferrugem Puccinia veronicae-longifoliae Ferrugem rosa de almíscar Phragmidium rosae-moschatae Ferrugem rosa de Multiflora Phragmidium rosae-multiflorae Ferrugem das folhas de milho do norte Exaerohilum turcicum = Helminthosporium turcicum, Setosphaeria turcica Mancha das folhas de milho do norte Cochliobolus carbonum Ferrugem da coroa de aveia Puccinia coronata
Doença Agente Causador Ferrugem do caule de Aveia Puccinia graminis Ferrugem de amendoim Puccinia arachidis Podridão das espigas de Penicillium (olho azul, Penicillium spp., P. chrysogenum, P. bolor azul) expansum, P. oxalicum Ferrugem de salgueiro-lariço Melampsora larici-pentandrae Podridão do caule e podridão da raiz de Phaeocytostroma ambiguum, Phaeocytostroma Phaeocytosporella zeae Mancha das folhas de Phaeosphaeria Phaeosphaeria maydis, Sphaerulina maydis Míldio penugento das Filipinas Peronosclerospora philippinensis = Sclerospora philippinensis Podridão das espigas de Physalospora Botryosphaeria Botryosphaeria festucae = Physalospora zeicola, (anamorfo: Diplodia frumenti) Ferrugem comum de batata Puccinia pittierianap Ferrugem deformadora de batata Aecidium cantensis Oídio de Cereais e gramas Erysiphe graminis Oídio de Rosa Sphaerotheca pannosa Oídio de Trigo Blumeria graminis f. sp. tritici, Oídio de Cevada Blumeria graminis f. sp. hordei Oídio de Uva Microsphaera diffusa Oídio de Leguminosa Erysiphe necator (ou Uncinula necator) Oídio de Uva Leveillula taurica, ou Oidiopsis taurica Oídio de Cebola Podosphaera leucotricha Oídio de Maçã Podosphaera xanthii, Erysiphe cichoracearum, Podosphaera fusca, Leveillula taurica Oídio de Cucurbitáceas Microsphaera syringae Oídio de Lilases Podosphaera aphanis, Geum rivale Oídio de Morango Erysiphe berberidis Oídio de Hawthorn Podosphaera oxyacanthae Oídio de Groselha Sphaerotheca mors-uvae Bainha de folha roxa Hemiparasitic bacteria e fungi Podridão do caule e podridão da raiz de Phoma terrestris, Pyrenochaeta Pyrenochaeta terrestris
Doença Agente Causador Podridão da raiz de Pythium Pythium spp., P. arrhenomanes, P. graminicola Podridão do caule de Pythium Pythium aphanidermatum = P. butleri L.
Doença de núcleo vermelho (bolor das espigas, Epicoccum nigrum podridão das folhas e sementes) Podridão das espigas de Rhizoctonia Rhizoctonia zeae (teleomorfo: Waitea circinata) Podridão da raiz e podridão do caule de Rhizoctonia Rhizoctonia solani, Rhizoctonia zeae Podridões da raiz, menores Alternaria alternata, Cercospora sorghi, Dictochaeta fertilis, Fusarium acuminatum (teleomorfo: Gibberella acuminate), F. equiseti (teleomorfo: G. intricans), F. oxysporum, F. pallidoroseum, F. poae, F. roseum, F. cyanogena, (anamorfo: F. sulphureum), Microdochium bolleyi, Mucor sp., Periconia circinata, Phytophthora cactorum, P. drechsleri, P. nicotianae var. parasitica, Rhizopus arrhizus Mancha das folhas de Rostratum (doença das Setosphaeria rostrata, folhas, podridão das espigas e caule) Helminthosporium (anamorfo: Exserohilum rostratum = Helminthosporium rostratum) rugosae Phragmidium rosae Ferrugem, milho comum Puccinia sorghi Ferrugem, milho do sul Puccinia polysora Ferrugem, milho tropical Physopella pallescens, P. zeae = Angiospora zeae sativae Balansia oryzae Podridão das espigas de Sclerotium (ferrugem do Sclerotium rolfsii (teleomorfo: Athelia sul) rolfsii) Podridão de sementes-ferrugem de plântulas Bipolaris sorokiniana, B. zeicola = Helminthosporium carbonum, Diplodia maydis, Exserohilum pedicellatum, Exserohilum turcicum
Doença Agente Causador = Helminthosporium turcicum, Fusarium avenaceum, F. culmorum, F. moniliforme, Gibberella zeae (anamorfo: F. graminearum), Macrophomina phaseolina, Penicillium spp., Phomopsis sp., Pythium spp., Rhizoctonia solani, R. zeae, Sclerotium rolfsii, Spicaria sp.
Mancha das folhas de Selenofoma Selenophoma sp.
Podridão da bainha Gaeumannomyces graminis Podridão de palha Myrothecium gramineum sieboldii Hamaspora rubi Bolor de silagem Monascus purpureus, M. rubber Fuligem, comum Ustilago zeae = U. maydis Fuligem, falsa Ustilaginoidea virens Fuligem, cabeça Sphacelotheca reiliana = Sporisorium holci-sorghi Míldio penugento de Sorghum Peronosclerospora sorghi = Sclerospora sorghi Mancha das folhas e podridão do caule de milho do Cochliobolus heterostrophus sul (anamorfo: Bipolaris maydis = Helminthosporium maydis) Mancha das folhas do sul Stenocarpella macrospora = Diplodia macrospora Ferrugem de soja Phakopsora pachyrhizi Míldio penugento de Spontaneum Peronosclerospora spontanea = Sclerospora spontanea Podridão do caule, menor Cercospora sorghi, Fusarium episphaeria, F. merismoides, F. oxysportum, F. poae, F. roseum, F. solani (teleomorfo: Nectria haematococca), F. tricinctum, Mariannaea elegans, Mucor sp., Rhopographus zeae, Spicaria sp.
Ferrugem da haste Puccinia graminis = P. graminis f. sp. secalis Podridões de armazenamento Aspergillus spp., Penicillium spp. e outros fungos
Doença Agente Causador Ferrugem comum de cana-de-açúcar Puccinia melanocephala = P. eriantha Míldio penugento de cana-de-açúcar Peronosclerospora sacchari = Sclerospora sacchari Mancha de alcatrão Phyllachora maydis thunbergii Phragmidium rubi Podridão das espigas e podridão da raiz de Trichoderma viride = T. lignorum Trichoderma (teleomorfo: Hypocrea sp.) Ferrugem das folhas de trigo (marrom) Puccinia triticina = P.
Recondita f.
Sp. tritici = P. tritici-duri Ferrugem do caule de trigo (preto) Puccinia graminis = P. graminis f. sp. tritici Ferrugem das listra de trigo (amarela) Puccinia striiformis (anamorfo: P. uredoglumarum) Podridão branca das espigas, podridão da raiz e Stenocarpella maydis = Diplodia caule zeae Mancha amarela das folhas Ascochyta ischaemi, Phyllosticta maydis (teleomorfo: Mycosphaerella zeae-maydis) Mancha zonata das folhas Gloeocercospora sorghi ii.
Bactérias As composições de PMP e métodos relacionados podem ser úteis para diminuir a aptidão de uma bactéria, por exemplo, para prevenir ou tratar uma infeção bacteriana em uma planta.
Estão incluídos métodos para entregar uma composição de PMP a uma bactéria por contato da bactéria com a composição de PMP.
Adicionalmente ou alternativamente, os métodos incluem entregar o biopesticida a uma planta em risco de ou tendo uma infeção bacteriana, por contato da planta com a composição de PMP.
As composições de PMP e métodos relacionados são adequados para entrega a bactérias, ou a uma planta infectada com elas, incluindo qualquer bactéria descrita adicionalmente em baixo.
Por exemplo, a bactéria pode ser uma pertencendo a Actinobacteria ou
Proteobacteria, tais como bactérias nas famílias das Burkholderiaceae, Xanthomonadaceae, Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae, Microbacteriaceae e Rhizobiaceae.
Em alguns casos, a bactéria é uma Acidovorax avenae subsp., incluindo, por exemplo, Acidovorax avenae subsp. avenae (=Pseudomonas avenae subsp. avenae), Acidovorax avenae subsp. cattleyae (=Pseudomonas cattleyae) ou Acidovorax avenae subsp. citrulli (=Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli, Pseudomonas avenae subsp. citrulli). Em alguns casos, a bactéria é uma Burkholderia spp., incluindo, por exemplo, Burkholderia andropogonis (=Pseudomonas andropogonis, Pseudomonas woodsii), Burkholderia caryophylli (=Pseudomonas caryophylli), Burkholderia cepacia (=Pseudomonas cepacia), Burkholderia gladioli (=Pseudomonas gladioli), Burkholderia gladioli pv. agaricicola (=Pseudomnas gladioli pv. agaricicola), Burkholderia gladioli pv. alliicola (isto é, Pseudomonas gladioli pv. alliicola), Burkholderia gladioli pv. gladioli (isto é, Pseudomonas gladioli, Pseudomonas gladioli pv. gladioli), Burkholderia glumae (isto é, Pseudomonas glumae), Burkholderia plantarii (isto é, Pseudomonas plantarii), Burkholderia solanacearum (isto é, Ralstonia solanacearum), ou Ralstonia spp.
Em alguns casos, a bactéria é uma Liberibacter spp., incluindo espéc. de Candidatus Liberibacter, incluindo, por exemplo, Candidatus Liberibacter asiaticus, Liberibacter africanus (Laf), Liberibacter americanus (Lam), Liberibacter asiaticus (Las), Liberibacter europaeus (Leu), Liberibacter psyllaurous, ou Liberibacter solanacearum (Lso). Em alguns casos, a bactéria é uma Corynebacterium spp. incluindo, por exemplo, Corynebacterium fascians, Corynebacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, Corynebacterium michiganensis,
Corynebacterium michiganense pv. tritici, Corynebacterium michiganense pv. nebraskense, ou Corynebacterium sepedonicum.
Em alguns casos, a bactéria é uma Erwinia spp. incluindo, por exemplo, Erwinia amylovora, Erwinia ananas, Erwinia carotovora (isto é, Pectobacterium carotovorum), Erwinia carotovora subsp. atroseptica, Erwinia carotovora subsp. carotovora, Erwinia chrysanthemi, Erwinia chrysanthemi pv. zeae, Erwinia dissolvens, Erwinia herbicola, Erwinia rhapontic, Erwinia stewartiii, Erwinia tracheiphila, ou Erwinia uredovora.
Em alguns casos, a bactéria é uma Pseudomonas syringae subsp., incluindo, por exemplo, Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa), Pseudomonas syringae pv. atrofaciens, Pseudomonas syringae pv. coronafaciens, Pseudomonas syringae pv. glycinea, Pseudomonas syringae pv. lachrymans, Pseudomonas syringae pv. maculicola Pseudomonas syringae pv. papulans, Pseudomonas syringae pv. striafaciens, Pseudomonas syringae pv. syringae, Pseudomonas syringae pv. tomato, ou Pseudomonas syringae pv. tabaci.
Em alguns casos, a bactéria é uma Streptomyces spp., incluindo, por exemplo, Streptomyces acidiscabies, Streptomyces albidoflavus, Streptomyces candidus (isto é, Actinomyces candidus), Streptomyces caviscabies, Streptomyces collinus, Streptomyces europaeiscabiei, Streptomyces intermedius, Streptomyces ipomoeae, Streptomyces luridiscabiei, Streptomyces niveiscabiei, Streptomyces puniciscabiei, Streptomyces retuculiscabiei, Streptomyces scabiei, Streptomyces scabies, Streptomyces setonii, Streptomyces steliiscabiei, Streptomyces turgidiscabies, ou Streptomyces wedmorensis.
Em alguns casos, a bactéria é uma Xanthomonas axonopodis subsp., incluindo, por exemplo, Xanthomonas axonopodis pv. alfalfae (=Xanthomonas alfalfae), Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii (=Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii), Xanthomonas axonopodis pv. allii (=Xanthomonas campestris pv. allii), Xanthomonas axonopodis pv. axonopodis, Xanthomonas axonopodis pv. bauhiniae (=Xanthomonas campestris pv. bauhiniae), Xanthomonas axonopodis pv. begoniae (=Xanthomonas campestris pv. begoniae), Xanthomonas axonopodis pv. betlicola (=Xanthomonas campestris pv. betlicola), Xanthomonas axonopodis pv. biophyti (=Xanthomonas campestris pv. biophyti), Xanthomonas axonopodis pv. cajani (=Xanthomonas campestris pv. cajani), Xanthomonas axonopodis pv. cassavae (=Xanthomonas cassavae, Xanthomonas campestris pv. cassavae), Xanthomonas axonopodis pv. cassiae (=Xanthomonas campestris pv. cassiae), Xanthomonas axonopodis pv. citri (=Xanthomonas citri), Xanthomonas axonopodis pv. citrumelo (=Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis), Xanthomonas axonopodis pv. clitoriae (=Xanthomonas campestris pv. clitoriae), Xanthomonas axonopodis pv. coracanae (=Xanthomonas campestris pv. coracanae), Xanthomonas axonopodis pv. cyamopsidis (=Xanthomonas campestris pv. cyamopsidis), Xanthomonas axonopodis pv. desmodii (=Xanthomonas campestris pv. desmodii), Xanthomonas axonopodis pv. desmodiigangetici (=Xanthomonas campestris pv. desmodiigangetici), Xanthomonas axonopodis pv. desmodiilaxiflori (=Xanthomonas campestris pv. desmodiilaxiflori), Xanthomonas axonopodis pv. desmodiirotundifolii (=Xanthomonas campestris pv. desmodiirotundifolii), Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae (=Xanthomonas campestris pv. dieffenbachiae), Xanthomonas axonopodis pv. erythrinae (=Xanthomonas campestris pv. erythrinae), Xanthomonas axonopodis pv. fascicularis (=Xanthomonas campestris pv. fasciculari), Xanthomonas axonopodis pv. glycines (=Xanthomonas campestris pv. glycines), Xanthomonas axonopodis pv. khayae (=Xanthomonas campestris pv. khayae), Xanthomonas axonopodis pv. lespedezae (=Xanthomonas campestris pv. lespedezae), Xanthomonas axonopodis pv. maculifoliigardeniae (=Xanthomonas campestris pv. maculifoliigardeniae), Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum (=Xanthomonas citri subsp. malvacearum), Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (=Xanthomonas campestris pv. manihotis), Xanthomonas axonopodis pv. martyniicola (=Xanthomonas campestris pv. martyniicola), Xanthomonas axonopodis pv. melhusii (=Xanthomonas campestris pv. melhusii), Xanthomonas axonopodis pv. nakataecorchori (=Xanthomonas campestris pv. nakataecorchori), Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (=Xanthomonas campestris pv. passiflorae), Xanthomonas axonopodis pv. patelii (=Xanthomonas campestris pv. patelii), Xanthomonas axonopodis pv. pedalii (=Xanthomonas campestris pv. pedalii), Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (=Xanthomonas campestris pv. phaseoli, Xanthomonas phaseoli), Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli var. fuscans (=Xanthomonas fuscans), Xanthomonas axonopodis pv. phyllanthi (=Xanthomonas campestris pv. phyllanthi), Xanthomonas axonopodis pv. physalidicola (=Xanthomonas campestris pv. physalidicola), Xanthomonas axonopodis pv. poinsettiicola (=Xanthomonas campestris pv. poinsettiicola), Xanthomonas axonopodis pv. punicae (=Xanthomonas campestris pv. punicae), Xanthomonas axonopodis pv. rhynchosiae (=Xanthomonas campestris pv. rhynchosiae), Xanthomonas axonopodis pv. ricini (=Xanthomonas campestris pv. ricini), Xanthomonas axonopodis pv. sesbaniae (=Xanthomonas campestris pv. sesbaniae), Xanthomonas axonopodis pv. tamarindi (=Xanthomonas campestris pv. tamarindi), Xanthomonas axonopodis pv. vasculorum (=Xanthomonas campestris pv. vasculorum), Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria (=Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Xanthomonas vesicatoria), Xanthomonas axonopodis pv. vignaeradiatae (=Xanthomonas campestris pv. vignaeradiatae), Xanthomonas axonopodis pv. vignicola (=Xanthomonas campestris pv. vignicola), ou Xanthomonas axonopodis pv. vitians (=Xanthomonas campestris pv. vitians). Em alguns casos, a bactéria é Xanthomonas campestris pv. musacearum, Xanthomonas campestris pv. pruni (=Xanthomonas arboricola pv. pruni), ou Xanthomonas fragariae.
Em alguns casos, a bactéria é uma Xanthomonas translucens supsp. (=Xanthomonas campestris pv. hordei) including por exemplo, Xanthomonas translucens pv. arrhenatheri (=Xanthomonas campestris pv. arrhenatheri), Xanthomonas translucens pv. cerealis (=Xanthomonas campestris pv. cerealis), Xanthomonas translucens pv. graminis (=Xanthomonas campestris pv. graminis), Xanthomonas translucens pv. phlei (=Xanthomonas campestris pv. phlei), Xanthomonas translucens pv. phleipratensis (=Xanthomonas campestris pv. phleipratensis), Xanthomonas translucens pv. poae (=Xanthomonas campestris pv. poae), Xanthomonas translucens pv. secalis (=Xanthomonas campestris pv. secalis), Xanthomonas translucens pv. translucens (=Xanthomonas campestris pv. translucens), ou Xanthomonas translucens pv. undulosa (=Xanthomonas campestris pv. undulosa). Em alguns casos, a bactéria é uma Xanthomonas oryzae supsp., Xanthomonas oryzae pv. oryzae (=Xanthomonas campestris pv. oryzae), ou Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (=Xanthomonas campestris pv. oryzicola). Em alguns casos, a bactéria é uma Xylella fastidiosa da família de Xanthomonadaceae.
A Tabela 7 mostra exemplos adicionais de bactérias, e doenças associadas às mesmas, que podem ser tratadas ou prevenidas usando a composição de PMP e métodos relacionados descritos aqui.
Tabela 7. Pragas bacterianas
Doença Agente Causador Ferrugem bacteriana das folhas e podridão do Pseudomonas avenae subsp. avenae caule Mancha bacteriana das folhas Xanthomonas campestris pv. holcicola Podridão bacteriana do caule Enterobacter dissolvens = Erwinia dissolvens Podridão bacteriana do caule e topo Erwinia carotovora subsp. carotovora, Erwinia chrysanthemi pv.
Zeae Tira bacteriana Pseudomonas andropogonis Mancha de chocolate Pseudomonas syringae pv.
Coronafaciens Ferrugem bacteriana de Goss (sardas e murcha Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis = das folhas) Cornebacterium michiganense pv.
Nebraskense
Mancha de Holcus Pseudomonas syringae pv.
Syringae Bainha de folha roxa Bactérias hemiparasitárias Podridão de sementes-ferrugem de plântulas Bacillus subtilis Doença de Stewart (murcha bacteriana) Pantoea stewartii = Erwinia stewartii Enfezamento do milho (enfezamento da Mesa Achapparramiento, enfezamento, Spiroplasma kunkelii Central ou Rio Grande) Podridão mole Dickeya dianthicola Podridão mole Dickeya solani Ferrugem de fogo Erwinia amylovora Podridão mole P. atrosepticum Podridão mole Pectobacterium carotovorum ssp. carotovorum Podridão mole Pectobacterium wasabiae Ferrugem bacteriana Pseudomonas syringae pv.
Porri e pv.
Tomato Doença da mancha Marrom Pseudomonas tolaasii Murcha bacteriana Ralstonia solanacearum Murcha bacteriana Ralstonia solanacearum Sarna comum Streptomyces scabies Sarna comum Streptomyces scabies Mancha das folhas de Xanthomonas de cebola Xanthomonas axonopodis pv. allii Câncer de Citrus da Ásia Xanthomonas axonopodis pv. citri Mancha bacteriana de Citrus Xanthomonas axonopodis pv. citrumelo Mancha bacteriana Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Doença de Pierce Xylella fastidiosa iii.
Insetos As composições de PMP e métodos relacionados podem ser úteis para diminuir a aptidão de um inseto, por exemplo, para prevenir ou tratar uma infeção de insetos em uma planta.
O termo “inseto” inclui qualquer organismo pertencendo ao filo Arthropoda e à classe Insecta ou à classe Arachnida, em qualquer etapa de desenvolvimento, isto é, insetos imaturos e adultos.
Estão incluídos métodos para entregar uma composição de PMP a um inseto por contato do inseto com a composição de PMP.
Adicionalmente ou alternativamente, os métodos incluem entregar o biopesticida a uma planta em risco de ou tendo uma infestação de insetos, por contato da planta com a composição de PMP.
As composições de PMP e métodos relacionados são adequados para prevenir ou tratar a infestação por um inseto, ou uma planta infestada com ele, incluindo insetos pertencendo às seguintes ordens: Acari, Araneae, Anoplura, Coleoptera, Collembola, Dermaptera, Dictyoptera, Diplura, Diptera (por exemplo, Drosophila de asa manchada), Embioptera, Ephemeroptera, Grylloblatodea, Hemiptera (por exemplo, afídeos, Mosca branca da estufa), Homoptera, Hymenoptera, Isoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Mecoptera, Neuroptera, Odonata, Orthoptera, Phasmida, Plecoptera, Protura, Psocoptera, Siphonaptera, Siphunculata, Thysanura, Strepsiptera, Thysanoptera, Trichoptera ou Zoraptera.
Em alguns casos, o inseto é da classe Arachnida, por exemplo,Acarus spp., Aceria sheldoni, Aculops spp., Aculus spp., Amblyomma spp., Amphitetranychus viennensis, Argas spp., Boophilus spp., Brevipalpus spp., Bryobia graminum, Bryobia praetiosa, Centruroides spp., Chorioptes spp., Dermanyssus gallinae, Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Dermacentor spp., Eotetranychus spp., Epitrimerus pyri, Eutetranychus spp., Eriophyes spp., Glycyphagus domesticus, Halotydeus destructor, Hemitarsonemus spp., Hyalomma spp., Ixodes spp., Latrodectus spp., Loxosceles spp., Metatetranychus spp., Neutrombicula autumnalis,
Nuphersa spp., Oligonychus spp., Ornithodorus spp., Ornithonyssus spp., Panonychus spp., Phyllocoptruta oleivora, Polyphagotarsonemus latus, Psoroptes spp., Rhipicephalus spp., Rhizoglyphus spp., Sarcoptes spp., Scorpio maurus, Steneotarsonemus spp., Steneotarsonemus spinki, Tarsonemus spp., Tetranychus spp., Trombicula alfreddugesi, Vaejovis spp., ou Vasates lycopersici.
Em alguns casos, o inseto é da classe Chilopoda, por exemplo, Geophilus spp. ou Scutigera spp.
Em alguns casos, o inseto é da ordem Collembola, por exemplo, Onychiurus armatus.
Em alguns casos, o inseto é da classe Diplopoda, por exemplo, Blaniulus guttulatus; da classe Insecta, por exemplo, da ordem Blattodea, por exemplo, Blattella asahinai, Blattella germanica, Blatta orientalis, Leucophaea maderae, Panchlora spp., Parcoblatta spp., Periplaneta spp., ou Supella longipalpa.
Em alguns casos, o inseto é da ordem Coleoptera, por exemplo, Acalymma vittatum, Acanthoscelides obtectus, Adoretus spp., Agelastica alni, Agriotes spp., Alphitobius diaperinus, Amphimallon solstitialis, Anobium punctatum, Anoplophora spp., Anthonomus spp., Anthrenus spp., Apion spp., Apogonia spp., Atomaria spp., Attagenus spp., Bruchidius obtectus, Bruchus spp., Cassida spp., Cerotoma trifurcata, Ceutorrhynchus spp., Chaetocnema spp., Cleonus mendicus, Conoderus spp., Cosmopolites spp., Costelytra zealandica, Ctenicera spp., Curculio spp., Cryptolestes ferrugineus, Cryptorhynchus lapathi, Cylindrocopturus spp., Dermestes spp., Diabrotica spp. (por exemplo, corn rootworm), Dichocrocis spp., Dicladispa armigera, Diloboderus spp., Epilachna spp., Epitrix spp., Faustinus spp., Gibbium psylloides, Gnathocerus cornutus, Hellula undalis, Heteronychus arator, Heteronyx spp., Hylamorpha elegans, Hylotrupes bajulus, Hypera postica, Hypomeces squamosus, Hypothenemus spp., Lachnosterna consanguinea, Lasioderma serricorne, Latheticus oryzae, Lathridius spp., Lema spp., Leptinotarsa decemlineata, Leucoptera spp., Lissorhoptrus oryzophilus, Lixus spp., Luperodes spp., Lyctus spp., Megascelis spp., Melanotus spp., Meligethes aeneus, Melolontha spp., Migdolus spp., Monochamus spp., Naupactus xanthographus, Necrobia spp., Niptus hololeucus, Oryctes rhinoceros, Oryzaephilus surinamensis, Oryzaphagus oryzae, Otiorrhynchus spp., Oxycetonia jucunda, Phaedon cochleariae, Phyllophaga spp., Phyllophaga helleri, Phyllotreta spp., Popillia japonica, Premnotrypes spp., Prostephanus truncatus, Psylliodes spp., Ptinus spp., Rhizobius ventralis, Rhizopertha dominica, Sitophilus spp., Sitophilus oryzae, Sphenophorus spp., Stegobium paniceum, Sternechus spp., Symphyletes spp., Tanymecus spp., Tenebrio molitor, Tenebrioides mauretanicus, Tribolium spp., Trogoderma spp., Tychius spp., Xylotrechus spp., ou Zabrus spp.
Em alguns casos, o inseto é da ordem Diptera, por exemplo, Aedes spp., Agromyza spp., Anastrepha spp., Anopheles spp., Asphondylia spp., Bactrocera spp., Bibio hortulanus, Calliphora erythrocephala, Calliphora vicina, Ceratitis capitata, Chironomus spp., Chrysomyia spp., Chrysops spp., Chrysozona pluvialis, Cochliomyia spp., Contarinia spp., Cordylobia anthropophaga, Cricotopus sylvestris, Culex spp., Culicoides spp., Culiseta spp., Cuterebra spp., Dacus oleae, Dasyneura spp., Delia spp., Dermatobia hominis, Drosophila spp., Echinocnemus spp., Fannia spp., Gasterophilus spp., Glossina spp., Haematopota spp., Hydrellia spp., Hydrellia griseola, Hylemya spp., Hippobosca spp., Hypoderma spp., Liriomyza spp., Lucilia spp., Lutzomyia spp., Mansonia spp., Musca spp. (por exemplo, Musca domestica), Oestrus spp., Oscinella frit, Paratanytarsus spp., Paralauterborniella subcincta, Pegomyia spp., Phlebotomus spp., Phorbia spp., Phormia spp., Piophila casei, Prodiplosis spp., Psila rosae, Rhagoletis spp., Sarcophaga spp., Simulium spp., Stomoxys spp.,
Tabanus spp., Tetanops spp., ou Tipula spp.
Em alguns casos, o inseto é da ordem Heteroptera, por exemplo, Anasa tristis, Antestiopsis spp., Boisea spp., Blissus spp., Calocoris spp., Campylomma livida, Cavelerius spp., Cimex spp., Collaria spp., Creontiades dilutus, Dasynus piperis, Dichelops furcatus, Diconocoris hewetti, Dysdercus spp., Euschistus spp., Eurygaster spp., Heliopeltis spp., Horcias nobilellus, Leptocorisa spp., Leptocorisa varicornis, Leptoglossus phyllopus, Lygus spp., Macropes excavatus, Miridae, Monalonion atratum, Nezara spp., Oebalus spp., Pentomidae, Piesma quadrata, Piezodorus spp., Psallus spp., Pseudacysta persea, Rhodnius spp., Sahlbergella singularis, Scaptocoris castanea, Scotinophora spp., Stephanitis nashi, Tibraca spp., ou Triatoma spp.
Em alguns casos, o inseto é da ordem Homiptera, por exemplo, Acizzia acaciaebaileyanae, Acizzia dodonaeae, Acizzia uncatoides, Acrida turrita, Acyrthosipon spp., Acrogonia spp., Aeneolamia spp., Agonoscena spp., Aleyrodes proletella, Aleurolobus barodensis, Aleurothrixus floccosus, Allocaridara malayensis, Amrasca spp., Anuraphis cardui, Aonidiella spp., Aphanostigma pini, Aphis spp. (por exemplo, Apis gossypii), Arboridia apicalis, Arytainilla spp., Aspidiella spp., Aspidiotus spp., Atanus spp., Aulacorthum solani, Bemisia tabaci, Blastopsylla occidentalis, Boreioglycaspis melaleucae, Brachycaudus helichrysi, Brachycolus spp., Brevicoryne brassicae, Cacopsylla spp., Calligypona marginata, Carneocephala fulgida, Ceratovacuna lanigera, Cercopidae, Ceroplastes spp., Chaetosiphon fragaefolii, Chionaspis tegalensis, Chlorita onukii, Chondracris rosea, Chromaphis juglandicola, Chrysomphalus ficus, Cicadulina mbila, Coccomytilus halli, Coccus spp., Cryptomyzus ribis, Cryptoneossa spp., Ctenarytaina spp., Dalbulus spp., Dialeurodes citri, Diaphorina citri, Diaspis spp., Drosicha spp., Dysaphis spp., Dysmicoccus spp., Empoasca spp., Eriosoma spp., Erythroneura spp., Eucalyptolyma spp.,
Euphyllura spp., Euscelis bilobatus, Ferrisia spp., Geococcus coffeae, Glycaspis spp., Heteropsylla cubana, Heteropsylla spinulosa, Homalodisca coagulata, Homalodisca vitripennis, Hyalopterus arundinis, Icerya spp., Idiocerus spp., Idioscopus spp., Laodelphax striatellus, Lecanium spp., Lepidosaphes spp., Lipaphis erysimi, Macrosiphum spp., Macrosteles facifrons, Mahanarva spp., Melanaphis sacchari, Metcalfiella spp., Metopolophium dirhodum, Monellia costalis, Monelliopsis pecanis, Myzus spp., Nasonovia ribisnigri, Nephotettix spp., Nettigoniclla spectra, Nilaparvata lugens, Oncometopia spp., Orthezia praelonga, Oxya chinensis, Pachypsylla spp., Parabemisia myricae, Paratrioza spp., Parlatoria spp., Pemphigus spp., Pentatomidae spp. (por exemplo, Halyomorpha halys), Peregrinus maidis, Phenacoccus spp., Phloeomyzus passerinii, Phorodon humuli, Phylloxera spp., Pinnaspis aspidistrae, Planococcus spp., Prosopidopsylla flava, Protopulvinaria pyriformis, Pseudaulacaspis pentagona, Pseudococcus spp., Psyllopsis spp., Psylla spp., Pteromalus spp., Pyrilla spp., Quadraspidiotus spp., Quesada gigas, Rastrococcus spp., Rhopalosiphum spp., Saissetia spp., Scaphoideus titanus, Schizaphis graminum, Selenaspidus articulatus, Sogata spp., Sogatella furcifera, Sogatodes spp., Stictocephala festina, Siphoninus phillyreae, Tenalaphara malayensis, Tetragonocephela spp., Tinocallis caryaefoliae, Tomaspis spp., Toxoptera spp., Trialeurodes vaporariorum, Trioza spp., Typhlocyba spp., Unaspis spp., Viteus vitifolii, Zygina spp.; da ordem Hymenoptera, por exemplo, Acromyrmex spp., Athalia spp., Atta spp., Diprion spp., Hoplocampa spp., Lasius spp., Monomorium pharaonis, Sirex spp., Solenopsis invicta, Tapinoma spp., Urocerus spp., Vespa spp., ou Xeris spp.
Em alguns casos, o inseto é da ordem Isopoda, por exemplo, Armadillidium vulgare, Oniscus asellus, ou Porcellio scaber.
Em alguns casos, o inseto é da ordem Isoptera, por exemplo,
Coptotermes spp., Cornitermes cumulans, Cryptotermes spp., Incisitermes spp., Microtermes obesi, Odontotermes spp., ou Reticulitermes spp.
Em alguns casos, o inseto é da ordem Lepidoptera, por exemplo, Achroia grisella, Acronicta major, Adoxophyes spp., Aedia leucomelas, Agrotis spp., Alabama spp., Amyelois transitella, Anarsia spp., Anticarsia spp., Argyroploce spp., Barathra brassicae, Borbo cinnara, Bucculatrix thurberiella, Bupalus piniarius, Busseola spp., Cacoecia spp., Caloptilia theivora, Capua reticulana, Carpocapsa pomonella, Carposina niponensis, Cheimatobia brumata, Chilo spp., Choristoneura spp., Clysia ambiguella, Cnaphalocerus spp., Cnaphalocrocis medinalis, Cnephasia spp., Conopomorpha spp., Conotrachelus spp., Copitarsia spp., Cydia spp., Dalaca noctuides, Diaphania spp., Diatraea saccharalis, Earias spp., Ecdytolopha aurantium, Elasmopalpus lignosellus, Eldana saccharina, Ephestia spp., Epinotia spp., Epiphyas postvittana, Etiella spp., Eulia spp., Eupoecilia ambiguella, Euproctis spp., Euxoa spp., Feltia spp., Galleria mellonella, Gracillaria spp., Grapholitha spp., Hedylepta spp., Helicoverpa spp., Heliothis spp., Hofmannophila pseudospretella, Homoeosoma spp., Homona spp., Hyponomeuta padella, Kakivoria flavofasciata, Laphygma spp., Laspeyresia molesta, Leucinodes orbonalis, Leucoptera spp., Lithocolletis spp., Lithophane antennata, Lobesia spp., Loxagrotis albicosta, Lymantria spp., Lyonetia spp., Malacosoma neustria, Maruca testulalis, Mamstra brassicae, Melanitis leda, Mocis spp., Monopis obviella, Mythimna separata, Nemapogon cloacellus, Nymphula spp., Oiketicus spp., Oria spp., Orthaga spp., Ostrinia spp., Oulema oryzae, Panolis flammea, Parnara spp., Pectinophora spp., Perileucoptera spp., Phthorimaea spp., Phyllocnistis citrella, Phyllonorycter spp., Pieris spp., Platynota stultana, Plodia interpunctella, Plusia spp., Plutella xylostella, Prays spp., Prodenia spp., Protoparce spp., Pseudaletia spp.,
Pseudaletia unipuncta, Pseudoplusia includens, Pyrausta nubilalis, Rachiplusia nu, Schoenobius spp., Scirpophaga spp., Scirpophaga innotata, Scotia segetum, Sesamia spp., Sesamia inferens, Sparganothis spp., Spodoptera spp., Spodoptera praefica, Stathmopoda spp., Stomopteryx subsecivella, Synanthedon spp., Tecia solanivora, Thermesia gemmatalis, Tinea cloacella, Tinea pellionella, Tineola bisselliella, Tortrix spp., Trichophaga tapetzella, Trichoplusia spp., Tryporyza incertulas, Tuta absoluta, ou Virachola spp.
Em alguns casos, o inseto é da ordem Orthoptera ou Saltatoria, por exemplo, Acheta domesticus, Dichroplus spp., Gryllotalpa spp., Hieroglyphus spp., Locusta spp., Melanoplus spp., ou Schistocerca gregaria.
Em alguns casos, o inseto é da ordem Phthiraptera, por exemplo, Damalinia spp., Haematopinus spp., Linognathus spp., Pediculus spp., Ptirus pubis, Trichodectes spp.
Em alguns casos, o inseto é da ordem Psocoptera, por exemplo, Lepinatus spp., ou Liposcelis spp.
Em alguns casos, o inseto é da ordem Siphonaptera, por exemplo, Ceratophyllus spp., Ctenocephalides spp., Pulex irritans, Tunga penetrans, ou Xenopsylla cheopsis.
Em alguns casos, o inseto é da ordem Thysanoptera, por exemplo, Anaphothrips obscurus, Baliothrips biformis, Drepanothrips reuteri, Enneothrips flavens, Frankliniella spp., Heliothrips spp., Hercinothrips femoralis, Rhipiphorothrips cruentatus, Scirtothrips spp., Taeniothrips cardamomi, ou Thrips spp.
Em alguns casos, o inseto é da ordem Zygentoma (=Thysanura), por exemplo, Ctenolepisma spp., Lepisma saccharina, Lepismodes inquilinus, ou Thermobia domestica.
Em alguns casos, o inseto é da classe Symphyla, por exemplo, Scutigerella spp.
Em alguns casos, o inseto é um ácaro, incluindo, mas não se limitando a, Ácaros tarsonemídeos, tais como Phytonemus pallidus, Polyphagotarsonemus latus, Tarsonemus bilobatus ou similares; Ácaros eupodídeos, tais como Penthaleus erythrocephalus, Penthaleus major ou similares; Spider mites, tais como Oligonychus shinkajii, Panonychus citri, Panonychus mori, Panonychus ulmi, Tetranychus kanzawai, Tetranychus urticae ou similares; Ácaros eriofídeos, tais como Acaphylla theavagrans, Aceria tulipae, Aculops lycopersici, Aculops pelekassi, Aculus schlechtendali, Eriophyes chibaensis, Phyllocoptruta oleivora ou similares; Ácaros acarídeos, tais como Rhizoglyphus robini, Tyrophagus putrescentiae, Tyrophagus similis ou similares; Ácaros de crias de abelhas, tais como Varroa jacobsoni, Varroa destructor ou similares; Ixodides, tais como Boophilus microplus, Rhipicephalus sanguineus, Haemaphysalis longicornis, Haemophysalis flava, Haemophysalis campanulata, Ixodes ovatus, Ixodes persulcatus, Amblyomma spp., Dermacentor spp. ou similares; Cheyletidae, tais como Cheyletiella yasguri, Cheyletiella blakei ou similares; Demodicidae, tais como Demodex canis, Demodex cati ou similares; Psoroptidae, tais como Psoroptes ovis ou similares; Scarcoptidae, tais como Sarcoptes scabiei, Notoedres cati, Knemidocoptes spp. ou similares.
A Tabela 8 mostra exemplos adicionais de insetos que causam infestações que podem ser tratadas ou prevenidas usando as composições de PMP e métodos relacionados descritos aqui.
Tabela 8. Pragas de insetos Nome Comum Nome latino Broca do milho europeia Ostrinia nubilalis Lagarta das espigas do milho Helicoverpa zea Lagarta-do-cartucho da beterraba Spodoptera exigua Lagarta-do-cartucho do outono Spodoptera frugiperda Broca do milho do sudoeste Diatraea grandiosella Broca do caule do milho Elasmopalpus lignosellus
Nome Comum Nome latino Broca do caule Papaipema nebris Lagarta-do-cartucho comum Pseudaletia unipuncta Lagarta negra Agrotis ipsilon Lagarta do feijão ocidental Striacosta albicosta Lagarta-do-cartucho com tiras amarelas Spodoptera ornithogalli Lagarta-do-cartucho com tiras amarelas ocidental Spodoptera praefica Lagarta-do-cartucho do sul Spodoptera eridania Lagarta-do-cartucho do sul Spodoptera eridania Lagarta variegada Peridroma saucia Broca do caule Papaipema nebris Looper do repolho Trichoplusia ni Traça do tomate Keiferia lycopersicella Verme do tabaco Manduca sexta Verme do tomate Manduca quinquemaculata Verme do repolho importado Artogeia rapae Borboleta do repolho Pieris brassicae Looper do repolho Trichoplusia ni Mariposa de dorso de diamante Plutella xylostella Lagarta-do-cartucho da beterraba Spodoptera exigua Lagarta comum Agrotis segetum Minhoca da batata Phthorimaea operculella Mariposa de dorso de diamante Plutella xylostella Broca da cana-de-açúcar Diatraea saccharalis Lagarta vítrea Crymodes devastator Lagarta sujo Feltia ducens Lagarta de dorso de argila Agrotis gladiaria Lagarta de trevo verde Plathypena scabra Looper da soja Pseudoplusia includes Lagarta de veludo Anticarsia gemmatalis Verme da raiz do milho do norte Coleoptera Diabrotica barberi Verme da raiz do milho do sul Diabrotica undecimpunctata Verme da raiz do milho ocidental Diabrotica virgifera Gorgulho do maís Sitophilus zeamais Besouro da batata do Colorado Leptinotarsa decemlineata Besouro da pulga do tabaco Epitrix hirtipennis Besouro-pulga das crucíferas Phyllotreta cruciferae Besouro da pulga negra ocidental Phyllotreta pusilla
Nome Comum Nome latino Gorgulho da pimenta Anthonomus eugenii Besouro da batata do Colorado Leptinotarsa decemlineata Besouro-pulga da batata Epitrix cucumeris Vermes Melanpotus spp.
Hemicrepidus memnonius Vermes Ceutorhychus assimilis Gorgulho das vagens das sementes do repolho Phyllotreta cruciferae Besouro-pulga das crucíferas Melanolus spp.
Verme Aeolus mellillus Verme do trigo Aeolus mancus Verme da areia Horistonotus uhlerii Percevejo do maís Sphenophorus maidis Percevejo Timothy Sphenophorus zeae Percevejo Bluegrass Sphenophorus parvulus Percevejo do milho do sul Sphenophorus callosus Larvas brancas Phyllophaga spp.
Besouro-pulga do milho Chaetocnema pulicaria Besouro japonês Popillia japonica Besouro mexicano Epilachna varivestis Besouro das folhas do feijão Cerotoma trifurcate Besouros de bolha Epicauta pestifera Epicauta lemniscata
Afídeo das folhas do milho Homoptera Rhopalosiphum maidis Afídeo da raiz do milho Anuraphis maidiradicis Afídeo verde do pêssego Myzus persicae Afídeo da batata Macrosiphum euphorbiae Mosca branca de estufa Trileurodes vaporariorum Mosca branca da batata-doce Bemisia tabaci Mosca branca da folha de prata Bemisia argentifolii Afídeo do repolho Brevicoryne brassicae Afídeo verde do pêssego Myzus persicae Cigarrinha da batata Empoasca fabae Psilídeo da batata Paratrioza cockerelli Mosca branca da folha de prata Bemisia argentifolii Mosca branca da batata-doce Bemisia tabaci Afídeo da cenoura Cavariella aegopodii Afídeo do repolho Brevicoryne brassicae Mosca das Índias Ocidentais Saccharosydne saccharivora
Nome Comum Nome latino Afídeo amarelo da cana-de-açúcar Sipha flava Pulga da alfada com três cantos Spissistilus festinus Lygus hesperus Hemiptera Lygus lineolaris Inseto Lygus Lygus rugulipennis Percevejo verde Acrosternum hilare Percevejo marrom Euschistus servus Percevejo Blissus leucopterus leucopterus Minador Diptera Liriomyza trifolii Minador de vegetais Liriomyza sativae Minador do tomate Scrobipalpula absoluta Larva das sementes de milho Delia platura Larva do repolho Delia brassicae Mosca da raiz do repolho Delia radicum Mosca da ferrugem da cenoura Psilia rosae Larva da raiz da beterraba Tetanops myopaeformis Gafanhoto diferencial Orthoptera Melanoplus differentialis Gafanhoto de patas vermelhas Melanoplus femurrubrum Gafanhoto de duas tiras Melanoplus bivittatus iv.
Moluscos As composições de PMP e métodos relacionados podem ser úteis para diminuir a aptidão de um molusco, por exemplo, para prevenir ou tratar uma infeção de moluscos em uma planta.
O termo “molusco” inclui qualquer organismo pertencendo ao filo Mollusca.
Estão incluídos métodos para entregar uma composição de PMP a um molusco por contato do molusco com a composição de PMP.
Adicionalmente ou alternativamente, os métodos incluem entregar o biopesticida a uma planta em risco de ou tendo uma infestação de moluscos, por contato da planta com a composição de PMP.
As composições de PMP e métodos relacionados são adequados para prevenir ou tratar a infestação por Gastrópodes terrestres (por exemplo, lesmas e caracóis) na agricultura e horticultura.
Incluem todas as lesmas e caracóis terrestres que ocorrem maioritariamente como pragas polífagas em culturas agrícolas e hortícolas.
Por exemplo, o molusco pode pertencer à família Achatinidae, Agriolimacidae, Ampullariidae, Arionidae, Bradybaenidae, Helicidae, Hydromiidae, Lymnaeidae, Milacidae, Urocyclidae ou Veronicellidae.
Por exemplo, em alguns casos, o molusco é Achatina spp., Archachatina spp. (por exemplo, Archachatina marginata), Agriolimax spp., Arion spp. (por exemplo, A. ater, A. circumscriptus, A. distinctus, A. fasciatus, A. hortensis, A. intermedius, A. rufus, A. subfuscus, A. silvaticus, A. lusitanicus), Arliomax spp. (por exemplo, Ariolimax columbianus), Biomphalaria spp., Bradybaena spp. (por exemplo, B. fruticum), Bulinus spp., Cantareus spp. (por exemplo, C. asperses), Cepaea spp. (por exemplo, C. hortensis, C. nemoralis, C. hortensis), Cernuella spp., Cochlicella spp., Cochlodina spp. (por exemplo, C. laminata), Deroceras spp. (por exemplo, D. agrestis, D. empiricorum, D. laeve, D. panornimatum, D. reticulatum), Discus spp. (por exemplo, D. rotundatus), Euomphalia spp., Galba spp. (por exemplo, G. trunculata), Helicella spp. (por exemplo, H. itala, H. obvia), Helicigona spp. (por exemplo, H. arbustorum), Helicodiscus spp., Helix spp. (por exemplo, H. aperta, H. aspersa, H. pomatia), Limax spp. (por exemplo, L. cinereoniger, L. flavus, L. marginatus, L. maximus, L. tenellus), Limicolaria spp. (por exemplo, Limicolaria aurora), Lymnaea spp. (por exemplo, L. stagnalis), Mesodon spp. (por exemplo, Meson thyroidus), Monadenia spp. (por exemplo, Monadenia fidelis), Milax spp. (por exemplo, M. gagates, M. marginatus, M. sowerbyi, M. budapestensis), Oncomelania spp., Neohelix spp. (por exemplo, Neohelix albolabris), Opeas spp., Otala spp. (por exemplo, Otala lacteal), Oxyloma spp. (por exemplo, O. pfeifferi), Pomacea spp. (por exemplo, P. canaliculata), Succinea spp., Tandonia spp. (por exemplo, T. budapestensis, T. sowerbyi), Theba spp., Vallonia spp., ou Zonitoides spp. (por exemplo,
Z. nitidus). v.
Nematódeos As composições de PMP e métodos relacionados podem ser úteis para diminuir a aptidão de um nematódeo, por exemplo, para prevenir ou tratar uma infeção de nematódeos em uma planta.
O termo “nematódeo” inclui qualquer organismo pertencendo ao filo Nematoda.
Estão incluídos métodos para entregar uma composição de PMP a um nematódeo por contato do nematódeo com a composição de PMP.
Adicionalmente ou alternativamente, os métodos incluem entregar o biopesticida a uma planta em risco de ou tendo uma infestação de nematódeos, por contato da planta com a composição de PMP.
As composições de PMP e métodos relacionados são adequados para prevenir ou tratar a infestação por nematódeos que causam danos a plantas incluindo, por exemplo, Meloidogyne spp. (nó da raiz), Heterodera spp., Globodera spp., Pratylenchus spp., Helicotylenchus spp., Radopholus similis, Ditylenchus dipsaci, Rotylenchulus reniformis, Xiphinema spp., Aphelenchoides spp. e Belonolaimus longicaudatus.
Em alguns casos, o nematódeo é um nematódeo parasitário de plantas ou um nematódeo vivendo no solo.
Nematódeos parasitários de plantas incluem, mas não estão limitados a, ectoparasitas tais como Xiphinema spp., Longidorus spp. e Trichodorus spp.; semiparasitas tais como Tylenchulus spp.; endoparasitas migratórios tais como Pratylenchus spp., Radopholus spp. e Scutellonema spp.; parasitas sedentários tais como Heterodera spp., Globodera spp. e Meloidogyne spp. e endoparasitas de caules e folhas como Ditylenchus spp., Aphelenchoides spp. e Hirshmaniella spp.
Nematódeos do solo parasitários de raízes especialmente nocivos são tais como nematódeos formadores de cistos dos gêneros Heterodera ou Globodera e/ou nematódeos das galhas da raiz do gênero Meloidogyne.
Espécies nocivas destes gêneros são, por exemplo, Meloidogyne incognita, Heterodera glycines (nematódeo formador de cistos da soja), Globodera pallida e Globodera rostochiensis (nematódeo formador de cistos da batata), cujas espécies são eficazmente controladas com as composições de PMP descritas aqui.
No entanto, o uso das composições de PMP descritas aqui não está de modo nenhum restringido a estes gêneros ou espécies, mas também se estende do mesmo modo a outros nematódeos.
Outros exemplos de nematódeos que podem ser visados pelos métodos e composições descritos aqui incluem mas não estão limitados a, por exemplo, Aglenchus agricola, Anguina tritici, Aphelenchoides arachidis, Aphelenchoides fragaria e os endoparasitas do caule e folhas Aphelenchoides spp. em geral, Belonolaimus gracilis, Belonolaimus longicaudatus, Belonolaimus nortoni, Bursaphelenchus cocophilus, Bursaphelenchus eremus, Bursaphelenchus xylophilus, Bursaphelenchus mucronatus, e Bursaphelenchus spp. em geral, Cacopaurus pestis, Criconemella curvata, Criconemella onoensis, Criconemella ornata, Criconemella rusium, Criconemella xenoplax (=Mesocriconema xenoplax) e Criconemella spp. em geral, Criconemoides femiae, Criconemoides onoense, Criconemoides ornatum e Criconemoides spp. em geral, Ditylenchus destructor, Ditylenchus dipsaci, Ditylenchus myceliophagus e os endoparasitas do caule e folhas Ditylenchus spp. em geral, Dolichodorus heterocephalus, Globodera pallida (=Heterodera pallida), Globodera rostochiensis (nematódeo dos cistos da batata), Globodera solanacearum, Globodera tabacum, Globodera virginia e os parasitas sedentários, formadores de cistos Globodera spp. em geral, Helicotylenchus digonicus, Helicotylenchus dihystera, Helicotylenchus erythrine, Helicotylenchus multicinctus, Helicotylenchus nannus, Helicotylenchus pseudorobustus e Helicotylenchus spp. em geral, Hemicriconemoides, Hemicycliophora arenaria, Hemicycliophora nudata, Hemicycliophora parvana,
Heterodera avenae, Heterodera cruciferae, Heterodera glycines (nematódeo dos cistos da soja), Heterodera oryzae, Heterodera schachtii, Heterodera zeae e os parasitas sedentários, formadores de cistos Heterodera spp. em geral, Hirschmaniella gracilis, Hirschmaniella oryzae Hirschmaniella spinicaudata e os endoparasitas do caule e folhas Hirschmaniella spp. em geral, Hoplolaimus aegyptii, Hoplolaimus califomicus, Hoplolaimus columbus, Hoplolaimus galeatus, Hoplolaimus indicus, Hoplolaimus magnistylus, Hoplolaimus pararobustus, Longidorus africanus, Longidorus breviannulatus, Longidorus elongatus, Longidorus laevicapitatus, Longidorus vineacola e os ectoparasitas Longidorus spp. em geral, Meloidogyne acronea, Meloidogyne africana, Meloidogyne arenaria, Meloidogyne arenaria thamesi, Meloidogyne artiella, Meloidogyne chitwoodi, Meloidogyne coffeicola, Meloidogyne ethiopica, Meloidogyne exigua, Meloidogyne fallax, Meloidogyne graminicola, Meloidogyne graminis, Meloidogyne hapla, Meloidogyne incognita, Meloidogyne incognita acrita, Meloidogyne javanica, Meloidogyne kikuyensis, Meloidogyne minor, Meloidogyne naasi, Meloidogyne paranaensis, Meloidogyne thamesi e os parasitas sedentários Meloidogyne spp. em geral, Meloinema spp., Nacobbus aberrans, Neotylenchus vigissi, Paraphelenchus pseudoparietinus, Paratrichodorus allius, Paratrichodorus lobatus, Paratrichodorus minor, Paratrichodorus nanus, Paratrichodorus porosus, Paratrichodorus teres e Paratrichodorus spp. em geral, Paratylenchus hamatus, Paratylenchus minutus, Paratylenchus projectus e Paratylenchus spp. em geral, Pratylenchus agilis, Pratylenchus alleni, Pratylenchus andinus, Pratylenchus brachyurus, Pratylenchus cerealis, Pratylenchus coffeae, Pratylenchus crenatus, Pratylenchus delattrei, Pratylenchus giibbicaudatus, Pratylenchus goodeyi, Pratylenchus hamatus, Pratylenchus hexincisus, Pratylenchus loosi, Pratylenchus neglectus, Pratylenchus penetrans, Pratylenchus pratensis, Pratylenchus scribneri,
Pratylenchus teres, Pratylenchus thornei, Pratylenchus vulnus, Pratylenchus zeae e os endoparasitas migratórios Pratylenchus spp. em geral, Pseudohalenchus minutus, Psilenchus magnidens, Psilenchus tumidus, Punctodera chalcoensis, Quinisulcius acutus, Radopholus citrophilus, Radopholus similis, os endoparasitas migratórios Radopholus spp. em geral, Rotylenchulus borealis, Rotylenchulus parvus, Rotylenchulus reniformis e Rotylenchulus spp. em geral, Rotylenchus laurentinus, Rotylenchus macrodoratus, Rotylenchus robustus, Rotylenchus uniformis e Rotylenchus spp. em geral, Scutellonema brachyurum, Scutellonema bradys, Scutellonema clathricaudatum e os endoparasitas migratórios Scutellonema spp. em geral, Subanguina radiciola, Tetylenchus nicotianae, Trichodorus cylindricus, Trichodorus minor, Trichodorus primitivus, Trichodorus proximus, Trichodorus similis, Trichodorus sparsus e os ectoparasitas Trichodorus spp. em geral, Tylenchorhynchus agri, Tylenchorhynchus brassicae, Tylenchorhynchus clarus, Tylenchorhynchus claytoni, Tylenchorhynchus digitatus, Tylenchorhynchus ebriensis, Tylenchorhynchus maximus, Tylenchorhynchus nudus, Tylenchorhynchus vulgaris e Tylenchorhynchus spp. em geral, Tylenchulus semipenetrans e os semiparasitas Tylenchulus spp. em general, Xiphinema americanum, Xiphinema brevicolle, Xiphinema dimorphicaudatum, Xiphinema index e os ectoparasitas Xiphinema spp. em geral.
Outros exemplos de pragas de nematódeos incluem espécies pertencendo à família Criconematidae, Belonolaimidae, Hoploaimidae, Heteroderidae, Longidoridae, Pratylenchidae, Trichodoridae, ou Anguinidae.
A Tabela 9 mostra exemplos adicionais de nematódeos, e doenças associadas aos mesmos, que podem ser tratados ou prevenidos usando as composições de PMP e métodos relacionados descritos aqui.
Tabela 9. Pragas de Nematódeos Doença Agente Causador Furador Dolichoderus spp., D. heterocephalus
Bulbo e haste (Europa) Ditylenchus dipsaci Cavando Radopholus similes R. similis Cisto Heterodera avenae, H. zeae, H. schachti; Globodera rostochiensis, G.pallida, e G. tabacum; Heterodera trifolii, H. medicaginis, H. ciceri, H. mediterranea, H. cyperi, H. salixophila, H. zeae, H.goettingiana, H. riparia, H. humuli, H. latipons, H. sorghi, H. fici, H.litoralis, e H. turcomanica; Punctodera chalcoensis
Adaga Xiphinema spp., X. americanum, X.
Mediterraneum Nó da raiz falso Nacobbus dorsalis Lança Hoplolaimus spp., H. galeatus Lança, Columbia Hoplolaimus Columbus Lesão Pratylenchus spp., P. brachyurus, P. coffeae P. crenatus, P.hexincisus, P. neglectus, P. penetrans, P. scribneri, P. magnica, P. neglectus, P. thornei, P. vulnus, P. zeae
Agulha Longidorus spp., L. breviannulatus Outros Hirschmanniella species, Pratylenchoid magnicauda Anel Criconemella spp., C. ornata Nó da raiz Meloidogyne spp., M. arenaria, M. chitwoodi, M. artiellia, M. fallax, M. hapla, M. javanica, M. incognita, M. microtyla, M. partityla, M. panyuensis, M, paranaensis
Doença Agente Causador Espiral Helicotylenchus spp. Picada Belonolaimus spp., B. longicaudatus Raiz atarracada Paratrichodorus spp., P. christiei, P. minor, Quinisulcius acutus, Trichodorus spp.
Enfezamento Tylenchorhynchus dubius vi. Vírus As composições de PMP e métodos relacionados podem ser úteis para diminuir a aptidão de um vírus, por exemplo, para prevenir ou tratar uma infeção viral em uma planta. Estão incluídos métodos para entregar uma composição de PMP a um vírus por contato do vírus com a composição de PMP. Adicionalmente ou alternativamente, os métodos incluem entregar a composição de PMP a uma planta em risco de ou tendo uma infeção viral, por contato da planta com a composição de PMP. As composições de PMP e métodos relacionados são adequados para entrega a um vírus que causa doenças virais em plantas, incluindo os vírus e doenças listados na Tabela 10. Tabela 10. Patógenos Virais de Plantas Doença Agente Causador Alfamovírus: Alfamovírus do mosaico da alfafa Bromoviridae Alfacriptovírus: Alfacriptovírus da alfalfa 1, Alfacriptovírus da beterraba 1, Alfacriptovírus da beterraba 2, Partitiviridae Alfacriptovírus da beterraba 3, Alfacriptovírus do cravo 1, Alfacriptovírus da cenoura 1, alfacriptovírus temperado da cenoura 3, alfacriptovírus temperado da cenoura 4, Alfacriptovírus do pé de galo, Alfacriptovírus do trevo 1, Alfacriptovírus do trevo 3, Alfacriptovírus da extremidade amarela do rabanete, Alfacriptovírus do azevém, Alfacriptovírus temperado do espinafre, Alfacriptovírus de Vicia, Alfacriptovírus do trevo branco 1, Alfacriptovírus do trevo branco 3
Doença Agente Causador Badnavírus Badnavírus de riscas da banana, Badnavírus de rebentos inchados de Cacao, Badnavírus da mancha amarela de Canna, Badnavírus da mancha amarela de Commelina, Badnavírus baciliforme de Dioscorea, Badnavírus da mancha de Kalanchoe, Badnavírus baciliforme de arroz trungo, Badnavírus da mancha anelar de Schefflera, Badnavírus baciliforme da cana-de-açúcar Betacriptovírus: Betacriptovírus temperado da cenoura 2, betacriptovírus do trevo 2, Partitiviridae Betacriptovírus do trevo vermelho 2, Betacriptovírus do trevo branco 2 Bigeminivírus: Bigeminivírus do mosaico de Abutilon, Bigeminivírus da veia amarela de Ageratum, Geminiviridae Bigeminivírus do mosaico do feijão Calico, Bigeminivírus do mosaico dourado do feijão, Bigeminivírus do mosaico da veia amarela de Bhendi, Bigeminivírus do mosaico africano da mandioca, Bigeminivírus do mosaico da mandioca indiana, Bigeminivírus de Chino del tomate, Bigeminivírus do amassamento da folha do algodão, Bigeminivírus do enrolamento da folha do algodão, Bigeminivírus da veia amarela do cróton, Bigeminivírus do mosaico amarelo de Dolichos, Bigeminivírus do mosaico de Euphorbia, Bigeminivírus do mosaico amarelo de Horsegram, Bigeminivírus do mosaico de Jatropha, Bigeminivírus do mosaico dourado do feilão- de-lima, Bigeminivírus do enrolamento das folhas do melão, Bigeminivírus do mosaico amarelo do feijão-mungo, Bigeminivírus do enrolamento das folhas do quiabo, Bigeminivírus de hasteco da pimenta, Bigeminivírus do Texas da pimenta, Bigeminivírus do mosaico amarelo da batata, Bigeminivírus do mosaico de Rhynchosia, Bigeminivírus do mosaico dourado de Serrano, Bigeminivírus do enrolamento das folhas da abóbora, Bigeminivírus do enrolamento das folhas do tabaco, Bigeminivírus do enrolamento das folhas australianas do tomate, Bigeminivírus do mosaico dourado do tomate, Bigeminivírus do enrolamento das folhas indianas do tomate, Bigeminivírus do amassamento das folhas do tomate, Bigeminivírus das manchas do tomate, Bigeminivírus do enrolamento das folhas amarelas do tomate, Bigeminivírus do mosaico amarelo do tomate, Bigeminivírus do enfezamento clorótico
Doença Agente Causador da melancia, Bigeminivírus das manchas enroladas da melancia Bromovírus: Bromovírus das manchas da fava, Bromovírus do mosaico de Brome, Bromoviridae Bromovírus das manchas amarelas de Cassia, Bromovírus das manchas cloróticas do feijão-caupi, Bromovírus das manchas amarelas de Melandrium, Bromovírus latente da primavera da Virgínia Bimovírus: Bimovírus do mosaico suave da cevada, Bimovírus do mosaico amarelo da cevada, Potyviridae Bimovírus do mosaico da aveia, Bimovírus do mosaico de necrose do arroz, Bimovírus do mosaico de raias do fuso do trigo, Bimovírus do mosaico amarelo do trigo Capilovírus Capilovírus do sulco do caule da maçã, Capilovírus A da cereja, Capilovírus das folhas dos citrinos, Capilovírus das folhas cloróticas do lilás Carlavírus Carlavírus da queima do mirtilo, Carlavírus 2 do Cato, Carlavírus latente da alcaparra, Carlavírus latente do cravo, Carlavírus B de Chrysanthemum, Carlavírus latente do dente-de-leão, Carlavírus do sabugueiro, Carlavírus S do figo, Carlavírus S de Helenium, Carlavírus latente da madressilva, Carlavírus latente americano do lúpulo, Carlavírus latente do lúpulo, Carlavírus do mosaico do lúpulo, Carlavírus latente de Kalanchoe, Carlavírus das manchas do lilás, Carlavírus sem sintomas do lírio, Carlavírus latente da amora, Carlavírus da necrose venosa do melão, Carlavírus latente de Nerine, Carlavírus latente de Passiflora, Carlavírus das estrias da ervilha, Carlavírus do mosaico do álamo, Carlavírus M da batata, Carlavírus S da batata, Carlavírus do mosaico venoso do trevo vermelho, Carlavírus latente da chalota, Carlavírus das extremidades amarelas pseudoligeiras do morango Carmovírus: Carmovírus do mosaico ligeiro do feijão, Carmovírus das manchas cloróticas de Cardamine, Tombusviridae Carmovírus das manchas do cravo, Carmovírus das manchas das folhas do pepino, Carmovírus com origem no solo do pepino, Carmovírus do mosaico de Galinsoga, Carmovírus das manchas anelares de Hibiscus, Carmovírus das manchas necróticas do melão, Carmovírus da quebra de flores de Pelargonium,
Doença Agente Causador Carmovírus da dobra do nabo Caulimovírus Caulimovírus das manchas anelares vermelhas do mirtilo, Caulimovírus do anel gravado do cravo, Caulimovírus do mosaico da couve-flor, Caulimovírus do mosaico de Dahlia, Caulimovírus do mosaico da figueira, Caulimovírus latente do rábano-silvestre, Caulimovírus do mosaico de Mirabilis, Caulimovírus das riscas cloróticas do amendoim, Caulimovírus das manchas cloróticas da soja, Caulimovírus da batata-doce, Caulimovírus das manchas do cardo Closterovírus Closterovírus do enfezamento amarelo da beterraba, Closterovírus amarelo da beterraba, Closterovírus da clorose grave da fava, Closterovírus amarelo da bardana, Closterovírus das manchas necróticas do cravo, Closterovírus da tristeza de Citrus, Closterovírus amarelo do trevo, Closterovírus associado à picada do caule da videira, Closterovírus das folhas amarelas do trigo Comovírus: Comovírus das manchas das vagens do feijão, Comovírus do mosaico rugoso do feijão, Comovírus das manchas da fava, Comoviridae Comovírus do mosaico verdadeiro da fava, Comovírus do mosaico do feijão-caupi, Comovírus do mosaico grave do feijão-caupi, Comovírus do mosaico da glicina, Comovírus do mosaico leve da ervilha, Comovírus das manchas da batata andina, Comovírus do mosaico da ervilha de codorniz, Comovírus do mosaico do rabanete, Comovírus das manchas do trevo-vermelho, Comovírus do mosaico da abóbora, Comovírus C de Ullucus Cucumovírus: Cucumovírus do mosaico do pepino, Cucumovírus do enfezamento do amendoim, Bromoviridae Cucumovírus da aspermia do tomate Citorrabdovírus: Citorrabdovírus do mosaico estriado amarelo da cevada, Citorrabdovírus venoso amarelo da fava, Rhabdoviridae Citorrabdovírus amarelo necrótico do brócolis, Citorrabdovírus do mosaico do norte dos cereais, Citorrabdovírus das estrias das folhas de Festuca, Citorrabdovírus amarelo necrótico da alface, Citorrabdovírus de Sonchus, Citorrabdovírus das dobras do morango, Diantovírus Diantovírus das manchas anelares do cravo, Diantovírus do mosaico necrótico do trevo-vermelho, Diantovírus do mosaico necrótico do trevo-doce, Enamovírus Enamovírus do mosaico da ervilha Fijivírus: Fijivírus anão áspero do milho, Fijivírus anão estéril da aveia,
Doença Agente Causador Reoviridae Fijivírus do enfezamento do pangola, Fijivírus anão de listras pretas do arroz, Fijivírus da doença de Fifi da cana-de-açúcar Furovírus Furovírus venoso amarelo necrótico da beterraba, Furovírus com origem no solo da beterraba, Furovírus da necrose do feijão, Furovírus das tiras douradas da aveia, Furovírus da aglutinação do amendoim, Furovírus mop-top da batata, Furovírus das manchas cloróticas de Sorghum, Furovírus do mosaico com origem no solo do trigo Hordeivírus Hordeivírus do branqueamento latente de Anthoxanthum, Hordeivírus do mosaico das listras da cevada, Hordeivírus das manchas anelares de Lychnis, Hordeivírus semilatente de Poa Hibrigeminivírus: Hibrigeminivírus do topo encaracolado da beterraba, Hibrigeminivírus do pseudoencaracolado Geminiviridae do tomate Idaeovírus Idaeovírus anão da framboesa Ilarvírus: Ilarvírus do mosaico da maçã, Ilarvírus 2 de Asparagus, Ilarvírus do choque necrótico do mirtilo, Bromoviridae Ilarvírus rugo das folhas de Citrus, Ilarvírus da variegação de Citrus, Ilarvírus das manchas do olmo, Ilarvírus de Humulus japonicus, Ilarvírus do mosaico de Hydrangea, Ilarvírus das manchas anelares do lilás, Ilarvírus das manchas de Parietaria, Ilarvírus do padrão de linhas da ameixa-americana, Ilarvírus anão da ameixa seca, Ilarvírus das manchas anelares necróticas de Prunus, Ilarvírus latente do espinafre, Ilarvírus das riscas do tabaco, Ilarvírus do mosaico da maçã de Tulare, Ipomovírus: Ipomovírus das manchas ligeiras da batata-doce, Ipomovírus anão amarelo Potyviridae batata-doce Luteovírus Luteovírus anã amarelo da cevada, Luteovírus do enrolamento das folhas do feijão, Luteovírus do amarelecimento ligeiro da beterraba, Luteovírus amarelo ocidental da beterraba, Luteovírus das folhas vermelhas da cenoura, Luteovírus rosette assistor do amendoim, Luteovírus do enrolamento das folhas da batata, Luteovírus amarelo de Solanum, Luteovírus anão da soja, Luteovírus anão da soja da Indonésia, Luteovírus das extremidades amarelas ligeiras do morango, Luteovírus das folhas vermelha do trevo subterrâneo,
Doença Agente Causador Luteovírus anão necrótico do tabaco Maclomovírus Maclomovírus das manchas cloróticas do maís Macluravírus Macluravírus do mosaico de Maclura, Macluravírus latente de Narcissus Marafivírus Marafivírus das linhas gravadas da grama Bermuda, Marafivírus de maís rayado fino, Marafivírus anã azul da aveia Monogeminivírus: Monogeminivírus do mosaico estriado de Chloris, Monogeminivírus do mosaico estriado de Digitaria, Geminiviridae Monogeminivírus das riscas de Digitaria, Monogeminivírus das riscas de maís, Monogeminivírus das riscas de Miscanthus, Monogeminivírus das riscas de Panicum, Monogeminivírus do mosaico estriado de Paspalum, Monogeminivírus das riscas da cana-de-açúcar, Monogeminivírus anão amarelo do tabaco, Monogeminivírus anão do trigo Nanavírus Nanavírus do topo em leque da banana, Nanavírus do decaimento das folhas do coco, Nanavírus amarelo necrótico da fava, Nanavírus anão da ervilhaca-leiteira, Nanavírus do enfezamento do trevo subterrâneo Necrovírus Necrovírus da necrose do tabaco, Necrovírus das tiras amarelas do cravo, Necrovírus da necrose de Lisianthus Nepovírus: Nepovírus do mosaico de Arabis, Nepovírus de Arracacha A, Nepovírus latente da alcachofra italiana, Comoviridae Nepovírus das manchas amarelas da alcachofra, Nepovírus das manchas das folhas do mirtilo, Nepovírus da necrose de Cacao, Nepovírus das manchas verdes da mandioca, Nepovírus do enrolamento das folhas da cereja, Nepovírus das folhas das raspas da cereja, Nepovírus das manchas amarelas da chicória, Nepovírus latente do trevo-carmesim, Nepovírus do enfezamento necrótico de Cycas, Nepovírus latente da videira búlgara, Nepovírus do mosaico do cromo da videira, Nepovírus das folhas em leque da videira, Nepovírus das manchas anelares latente de Hibiscus, Nepovírus latente da luzerna australiana, Nepovírus das manchas anelares da amora, Nepovírus das manchas anelares latente do mirobálano, Nepovírus das manchas anelares latente da oliveira, Nepovírus do mosaico da roseta do pêssego, Nepovírus das manchas anelares pretas da batata, Nepovírus U da batata, Nepovírus das manchas anelares da framboesa, Nepovírus das manchas anelares do tabaco, Nepovírus anelar preto do tomate, Nepovírus das manchas anelares do tomate
Doença Agente Causador Nucleorrabdovírus: Nucleorrabdovírus latente da cenoura, Nucleorrabdovírus venoso vermelho penugento do coentro, Rhabdoviridae Nucleorrabdovírus do mosaico da pastinaga de vaca, Nucleorrabdovírus das tiras cloróticas de Cynodon, Nucleorrabdovírus venoso amarelo de Datura, Nucleorrabdovírus anão das manchas da berinjela, Nucleorrabdovírus do mosaico do maís, Nucleorrabdovírus do amarelecimento venoso de Pittosporum, Nucleorrabdovírus anão amarelo da batata, Nucleorrabdovírus da rede amarela de Sonchus, Nucleorrabdovírus venoso amarelo da serralha, Nucleorrabdovírus da eliminação da veia do tomate, Nucleorrabdovírus do mosaico estriado do trigo americano Orizavírus: Orizavírus do enfezamento irregular de Echinochloa, Orizavírus do enfezamento irregular do arroz Reoviridae Ourmiavírus Ourmiavírus baciliforme da mandioca marfinense, Ourmiavírus do melão Ourmia, Ourmiavírus das manchas zonatas de Pelargonium Fitorreovírus: Fitorreovírus de tumores das feridas do trevo, Fitorreovírus anão do arroz, Reoviridae Fitorreovírus anão da galhas do arroz, Fitorreovírus do enfezamento do arroz, Fitorreovírus da batata-doce Potexvírus Potexvírus 3 de Asparagus, Potexvírus X do cato, Potexvírus X da mandioca, Potexvírus X da chicória, Potexvírus do mosaico amarelo do trevo, Potexvírus X de Commelina, Potexvírus do mosaico de Cymbidium, Potexvírus X de Daphne, Potexvírus do mosaico do rabo-de-raposa, Potexvírus das manchas anelares de Hydrangea, Potexvírus X de lilás, Potexvírus do mosaico de Narcissus, Potexvírus X de Nerine, Potexvírus do mosaico da papaia, Potexvírus do mosaico do pepino, Potexvírus do mosaico de Plantago asiatica, Potexvírus X da banana, Potexvírus do mosaico da batata aucuba, Potexvírus X da batata, Potexvírus X da tulipa, Potexvírus das manchas de Viola, Potexvírus do mosaico do trevo-branco Potivírus: Potivírus do mosaico de Alstroemeria, Potivírus da manchas das folhas de Amaranthus, Potyviridae Potivírus do mosaico de Araujia, Potivírus Y da mandioquinha, Potivírus latente da
Doença Agente Causador alcachofra, Potivírus 1 de Asparagus, Potivírus do mosaico da banana, Potivírus da necrose do mosaico comum do feijão, Potivírus do mosaico comum do feijão, Potivírus do mosaico amarelo do feijão, Potivírus do mosaico da beterraba, Potivírus do mosaico de Bidens, Potivírus das manchas de Bidens, Potivírus do mosaico do cardamomo, Potivírus das manchas venosas do cravo, Potivírus das folhas finas da cenoura, Potivírus das tiras marrons da mandioca, Potivírus das manchas amarelas de Cassia, Potivírus do mosaico do aipo, Potivírus anão do feijão-caupi, Potivírus do mosaico de distorção do feijão-caupi, Potivírus venoso amarelo do trevo, Potivírus de Commelina diffusa, Potivírus do mosaico de Commelina, Potivírus das bandas venosas verdes do feijão-caupi, Potivírus do mosaico em origem em afídeos do feijão-caupi marroquino, Potivírus do mosaico rugoso de feijão-caupi, Potivírus do mosaico de Crinum, Potivírus Y de Daphne, Potivírus de Datura colombiana, Potivírus do mosaico de distorção de Datura, Potivírus da necrose de Datura, Potivírus do cordão de Datura, Potivírus do mosaico de Dendrobium, Potivírus do mosaico de Desmodium, Potivírus de Dioscorea alata, Potivírus do mosaico de bandas verdes de Dioscorea, Potivírus do mosaico verde da berinjela, Potivírus das manchas anelares de Euphorbia, Potivírus do mosaico de Freesia, Potivírus das manchas oculares do amendoim, Potivírus sem sintomas do guar, Potivírus do mosaico da grama da Guiné, Potivírus Y de Helenium, Potivírus do mosaico do meimendro, Potivírus do mosaico de Hippeastrum, Potivírus do mosaico de Hyacinth, Potivírus do mosaico de Iris fulva, Potivírus do mosaico ligeiro de Iris, Potivírus do mosaico grave de Iris, Potivírus do mosaico de Johnsongrass, Potivírus Y de Kennedya, Potivírus das tiras amarelas do alho-poró, Potivírus do mosaico da alface, Potivírus das manchas do lírio, Potivírus do mosaico anão do maís, Potivírus da eliminação venosa de Malva, Potivírus das manchas da calêndula, Potivírus das tiras amarelas de Narcissus, Potivírus de Nerine, Potivírus anão amarelo da cebola, Potivírus do mosaico de Ornithogalum, Potivírus das manchas anelares da papaia, Potivírus do mosaico da pastinaga, Potivírus das manchas anelares de Passiflora, Potivírus de Passiflora sul-africana,
Doença Agente Causador Potivírus amadeirado do maracujá, Potivírus do mosaico do patchouli, Potivírus do mosaico da ervilha, Potivírus do mosaico com origem em sementes da ervilha, Potivírus do mosaico verde do amendoim, Potivírus das manchas do amendoim, Potivírus das manchas da pimenta indiana, Potivírus das manchas da pimenta, Potivírus do mosaico grave da pimenta, Potivírus das manchas venosas da pimenta, Potivírus da varíola da ameixa, Potivírus do mosaico da uva-de-rato, Potivírus A da batata, Potivírus V da batata, Potivírus Y da batata, Potivírus do mosaico de Primula, Potivírus das manchas de Ranunculus, Potivírus do mosaico de Sorghum, Potivírus do mosaico da soja, Potivírus Y da lavanda-do-mar, Potivírus do mosaico da cana-de-açúcar, Potivírus das manchas da batata-doce, Potivírus G da batata-doce, Potivírus do mosaico de distorção do feijão-espada, Potivírus do mosaico do tamarillo, Potivírus do mosaico de Telfairia, Potivírus do gravado do tabaco, Potivírus do mosaico das bandas de veias do tabaco, Potivírus das manchas venosas do tabaco, Potivírus da murcha do tabaco, Potivírus do tomate do Peru, Potivírus de Tradescantia-Zebrina, Potivírus 1 de Tropaeolum, Potivírus 2 de Tropaeolum, Potivírus da tuberose, Potivírus da quebra das bandas da tulipa, Potivírus da quebra da tulipa, Potivírus das manchas cloróticas da tulipa, Potivírus do mosaico do nabo, Potivírus do mosaico de Ullucus, Potivírus do mosaico de Vallota, Potivírus do mosaico da baunilha, Potivírus da necrose da baunilha, Potivírus do mosaico de distorção de Voandzeia, Potivírus 1 do mosaico da melancia, Potivírus 2 do mosaico da melancia, Potivírus do mosaico da batata-selvagem, Potivírus do mosaico venoso de Wisteria, Potivírus do mosaico do inhame, Potivírus das manchas amarelas da abobrinha, Potivírus do mosaico amarelo da abobrinha Rimovírus: Rimovírus do mosaico de Hordeum, manchas necróticas da aveia Potyviridae Rimovírus do mosaico de Agropyron Rimovírus do mosaico do azevém, Rimovírus do mosaico estriado do trigo
Doença Agente Causador RNAs satélite RNA satélite do mosaico de Arabis, RNA satélite das manchas amarelas da chicória, RNA satélite do mosaico do pepino, RNA satélite das folhas em leque da videira, RNA satélite das manchas anelares latente do morango, RNA satélite das manchas anelares do tabaco, RNA satélite dos anéis pretos do tomate, RNA satélite das manchas do tabaco Velvet Satelivírus Satelivírus do mosaico das linhas brancas do maís, Satelivírus do mosaico de Panicum, Satelivírus do mosaico do tabaco, Satelivírus da necrose do tabaco Sequivírus: Sequivírus do mosaico amarelo do dente-de-leão, Sequivírus das manchas amarelas Sequiviridae da pastinaga Sobemovírus Sobemovírus do mosaico do feijão do sul, Sobemovírus do cordão do mirtilo, Sobemovírus das manchas do pé-de-galo, Sobemovírus das tiras transientes da luzerna, Sobemovírus das manchas amarelas do arroz, Sobemovírus das manchas amarelas de Rottboellia, Sobemovírus das manchas de Solanum nodiflorum, Sobemovírus do mosaico dos pés-de-urtiga, Sobemovírus das manchas do trevo subterrâneo, Sobemovírus da roseta do nabo, Sobemovírus das manchas do tabaco Velvet Tenuivírus Tenuivírus das tiras do maís, Tenuivírus do enfezamento do arroz, Tenuivírus de hoja blanca do arroz, Tenuivírus das tiras do arroz Tobamovírus Tobamovírus do mosaico das manchas verdes do pepino, Tobamovírus do mosaico do jasmin-manga, Tobamovírus do mosaico das manchas verdes de Kyuri, Tobamovírus das manchas anelares de Odontoglossum, Tobamovírus das manchas ligeiras da páprica, Tobamovírus das manchas ligeiras da pimenta, Tobamovírus do mosaico da língua- de-ovelha, Tobamovírus de Opuntia Sammons, Tobamovírus do mosaico do cânhamo Sunn, Tobamovírus do mosaico verde mole do tabaco, Tobamovírus do mosaico do tabaco, Tobamovírus do mosaico do tomate, Tobamovírus das manchas ligeiras de Ullucus Tobravírus Tobravírus do acastanhamento precoce da ervilha, Tobravírus das manchas anelares da pimenta,
Doença Agente Causador Tobravírus do chocalho do tabaco Tombusvírus: Tombusvírus das rugas manchadas da alcachofra, Tombusvírus das manchas anelares do cravo italiano, Tombusviridae Tombusvírus da necrose do pepino, Tombusvírus das manchas anelares de Cymbidium, Tombusvírus das rugas manchas da berinjela, Tombusvírus latente da videira argelina, Tombusvírus do Rio Lato, Tombusvírus do Rio Neckar, Tombusvírus do enrolamento das folhas de Pelargonium, Tombusvírus da pimenta marroquina, Tombusvírus do mosaico asteroide de Petunia, Tombusvírus do enfezamento do tomate Tospovírus: Tospovírus das manchas necróticas de Impatiens, Tospovírus das manchas amarelas do amendoim, Bunyaviridae Tospovírus da murcha manchada do tomate Tricovírus Tricovírus das manchas das folhas cloróticas da maçã, Tricovírus latente de Heracleum, Tricovírus T da batata Timovírus Timovírus latente de Abelia, Timovírus das manchas de Belladonna, Timovírus do mosaico amarelo de Cacau, Timovírus venoso amarelo de Clitoria, Timovírus das manchas amarelas de Desmodium, Timovírus das manchas de Dulcamara, Timovírus do mosaico da berinjela, Timovírus latente de Erysimum, Timovírus do mosaico amarelo de Kennedya, Timovírus do mosaico rugoso do melão, Timovírus do mosaico do quiabo, Timovírus do mosaico amarelo de Ononis, Timovírus do mosaico amarelo do maracujá, Timovírus do mosaico de Physalis, Timovírus das manchas de Plantago, Timovírus latente da batata andina, Timovírus das manchas de Scrophularia, Timovírus do mosaico amarelo do nabo, Timovírus do mosaico necrótico de Voandzeia, Timovírus do mosaico do pepino selvagem Umbravírus Umbravírus das bandas venosas amarelas do feijão, Umbravírus mimético de manchas da cenoura, Umbravírus das manchas da cenoura, Umbravírus mimético de manchas da cenoura, Umbravírus da roseta do amendoim, Umbravírus das manchas da alface, Umbravírus das manchas do tabaco
Doença Agente Causador Varicosavírus Varicosavírus da necrose das folhas de Freesia, Varicosavírus das veias grandes da alface, Varicosavírus do enfezamento do tabaco Waikavírus: Waikavírus amarelo de Anthriscus, Waikavírus anão clorótico do maís, Sequiviridae Waikavírus esférico do arroz tungro, Putativo Vírus do mosaico venoso do trevo, Potivírus das tiras de Alstroemeria, Não agrupados Potivírus do mosaico de Amaranthus, Potivírus do mosaico do lírio amazônico Vírus Potivírus do mosaico de Anthoxanthum, Vírus da picada da haste da maçã, Potivírus de Aquilegia, Rabdovírus de Asclepias, Rabdovírus de Atropa belladonna, Vírus do mosaico da cevada, Vírus do mosaico de riscas amarelas da cevada, Vírus do mosaico da distorção da beterraba, Rabdovírus do enrolamento das folhas da beterraba, Vírus de RNA associado a ST9 amarelo da beterraba ocidental, Vírus da necrose da framboesa-preta, Potivírus do mosaico amarelo da amora, Potivírus do mosaico ligeiro da berinjela, Potivírus B da fava, Potivírus V da fava, Vírus das manchas anelares amarela da fava, Potivírus das manchas de Bryonia, Vírus do mosaico da bardana, Vírus das manchas da bardana, Rabdovírus da clorose de Callistephus chinensis, Potivírus do mosaico do canário, Potivírus do mosaico de Canavalia maritima, Rabdovírus do cravo, Potivírus do mosaico da cenoura, Rabdovírus sem sintomas da mandioca, Vírus do mosaico de Cassia, Vírus das manchas anelares de Cassia, Potivírus do mosaico amarelo do aipo, Vírus da rede amarela do aipo, Vírus da clorose da chama do cereal, Potivírus filiforme do feijão-caupi, Potivírus das manchas venosas do chili, Potivírus das manchas de Chrysanthemum, Rabdovírus da clorose venosa de Chrysanthemum, Rabdovírus da leprose de Citrus, Vírus das manchas anelares de Citrus, Vírus do mosaico ligeiro do trevo, Potivírus das tiras do pé-de-galo, Rabdovírus da doença por Colocasia bobone, Rabdovírus da pele de sapo do pepino, Vírus do amarelecimento venoso do pepino, Potivírus de Cypripedium calceolus, Potivírus do mosaico de Datura innoxia húngara, Potivírus de Dioscorea trifida, Potivírus do mosaico manchado da azeda, Vírus associado ao amarelecimento de Dodonaea, Potivírus das manchas graves da berinjela, Rabdovírus da fasciação de Euonymus, Rabdovírus de Euonymus, Potivírus da samambaia, Potivírus do figo, Rabdovírus em sintomas de Gerbera, Vírus das manchas da videira, Vírus do enfezamento da videira, Vírus da necrose do guar, Potivírus do mosaico de
Doença Agente Causador Habenaria, Rabdovírus do amarelecimento de Holcus lanatus, Potivírus das tiras de Holcus, Rabdovírus das tiras das folhas de Iris germanica, Vírus dos anéis necróticos da Iris japonesa, Potivírus do mosaico de Isachne, Vírus isométrico de Kalanchoe, Rabdovírus de eliminação venosa de Kenaf, Potivírus do mosaico de Launaea, Rabdovírus das veias amarelas do tremoço, Vírus das manchas oculares do maís, Vírus das linhas do maís, Vírus do enfezamento murchado/clorótico do maís, Vírus do mosaico das linhas brancas do maís, Vírus das manchas de Malvastrum, Potivírus do mosaico de Melilotus, Potivírus do mosaico de bandas venosas do melão, Potivírus das manchas de Melothria, Vírus do mosaico de Mimosa, Potivírus das manchas do feijão-mungo, Potivírus da degeneração de Narcissus, Potivírus do amarelecimento de estação tardia de Narcissus, Potivírus Y de Nerine, Potivírus do mosaico de Nothoscordum, Vírus das manchas anelares do carvalho, Rabdovírus das manchas da orquídea, Potivírus do mosaico da palma, Potivírus das manchas verdes da salsa, Rabdovírus da salsa, Vírus do enrolamento das folhas da pastinaga, Potivírus das manchas do maracujá do Sri Lanka, Rabdovírus da eliminação venosa do maracujá, Rabdovírus das manchas do patchouli, Vírus da necrose do caule da ervilha, Potivírus da paralisia superior do amendoim, Rabdovírus de clorose venosa do amendoim, Potivírus do mosaico de Pecteilis, Potivírus do mosaico ligeiro da pimenta, Potivírus das manchas de Perilla, Rabdovírus da proliferação do feijão-guandu, Vírus do mosaico da esterilidade do feijão-guandu, Potivírus 7 da banana, Rabdovírus das manchas da banana, Potivírus de Pleioblastus chinês, Potivírus de declínio do álamo, Potivírus das manchas de Primula, Vírus do mosaico da granadilha-roxa, Rabdovírus sem sintomas de Ranunculus repens, Vírus do enfezamento do arroz amarelo, Rabdovírus da necrose das folhas de Saintpaulia, Rabdovírus da eliminação venosa de Sambucus, Rabdovírus de Sarracenia purpurea, Potivírus das manchas anelares cloróticas do
Doença Agente Causador trevo, Vírus do mosaico ligeiro da soja, Rabdovírus da soja, Vírus esférico da soja, Vírus das veias amarelas da soja, Potivírus Z da soja, Rabdovírus C latente do morango, Vírus das manchas do morango, Vírus da palidose do morango, Potivírus do mosaico do girassol, Potivírus latente da batata-doce, Potivírus do mosaico da carda, Vírus das manchas anelares de thimbleberry, Potivírus das manchas ligeiras do tomate, Potivírus das manchas de Trichosanthes, Vírus da necrose do halo da tulipa, Vírus do mosaico da tulipa, Vírus da eliminação venosa do nabo, Vírus da murcha das folhas do feijão Urd, Rabdovírus do mosaico de Vigna sinensis, Vírus das manchas amarelas do agrião, Potivírus do mosaico da melancia marroquina, Rabdovírus das manchas cloróticas do trigo, Potivírus da norça-branca, Vírus latente de wineberry, Potivírus das manchas ligeiras de Zinnia, Potivírus do mosaico de Zoysia
C.
Entrega a um Simbionte Vegetal São proporcionados aqui métodos de entregar a um simbionte vegetal uma composição de PMP (por exemplo, incluindo PMPs modificados descritos aqui) divulgada aqui.
Estão incluídos métodos para entregar uma composição de PMP a um simbionte vegetal (por exemplo, um endossimbionte bacteriano, um endossimbionte fúngico ou um inseto) por contato do simbionte com uma composição de PMP.
Os métodos podem ser úteis para aumentar a aptidão do simbionte vegetal, por exemplo, um simbionte que é benéfico para a aptidão de uma planta.
Em alguns casos, os simbiontes vegetais podem ser tratados com PMPs não incluindo um agente funcional heterólogo.
Em outros casos, os PMPs incluem um agente funcional heterólogo, por exemplo, agentes fertilizantes.
Como tal, os métodos podem ser usados para aumentar a aptidão de um simbionte vegetal.
Em um aspecto é proporcionado aqui um método de aumentar a aptidão de um simbionte, incluindo o método entregar ao simbionte a composição de PMP descrita aqui (por exemplo, em uma quantidade e durante uma duração eficazes) para aumentar a aptidão do simbionte em relação a um simbionte não tratado (por exemplo, um simbionte ao qual não foi entregue a composição de PMP). Em um aspecto é proporcionado aqui um método de aumentar a aptidão de um fungo (por exemplo, um endossimbionte fúngico de uma planta), em que o método inclui entregar ao endossimbionte uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs (por exemplo, uma composição de PMP descrita aqui). Por exemplo, o simbionte vegetal pode ser um fungo endossimbiótico, tal como um fungo do gênero Aspergillaceae, Ceratobasidiaceae, Coniochaetaceae, Cordycipitaceae, Corticiaceae, Cystofilobasidiaceae, Davidiellaceae, Debaryomycetaceae, Dothioraceae, Erysiphaceae, Filobasidiaceae, Glomerellaceae, Hydnaceae, Hypocreaceae, Leptosphaeriaceae, Montagnulaceae, Mortierellaceae, Mycosphaerellaceae, Nectriaceae, Orbiliaceae, Phaeosphaeriaceae, Pleosporaceae, Pseudeurotiaceae, Rhizopodaceae, Sclerotiniaceae, Stereaceae, ou Trichocomacea.
Em outro aspecto é proporcionado aqui um método de aumentar a aptidão de uma bactéria (por exemplo, um endossimbionte bacteriano de uma planta), em que o método inclui entregar à bactéria uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs (por exemplo, uma composição de PMP descrita aqui). Por exemplo, o simbionte vegetal pode ser uma bactéria endossimbiótica, tal como uma bactéria do gênero Acetobacteraceae, Acidobacteriaceae, Acidothermaceae, Aerococcaceae, Alcaligenaceae, Alicyclobacillaceae, Alteromonadaceae, Anaerolineaceae, Aurantimonadaceae, Bacillaceae, Bacteriovoracaceae, Bdellovibrionaceae, Bradyrhizobiaceae, Brevibacteriaceae, Brucellaceae, Burkholderiaceae,
Carboxydocellaceae, Caulobacteraceae, Cellulomonadaceae, Chitinophagaceae, Chromatiaceae, Chthoniobacteraceae, Chthonomonadaceae, Clostridiaceae, Comamonadaceae, Corynebacteriaceae, Coxiellaceae, Cryomorphaceae, Cyclobacteriaceae, Cytophagaceae, Deinococcaceae, Dermabacteraceae, Dermacoccaceae, Enterobacteriaceae, Enterococcaceae, Erythrobacteraceae, Fibrobacteraceae, Flammeovirgaceae, Flavobacteriaceae, Frankiaceae, Fusobacteriaceae, Gaiellaceae, Gemmatimonadaceae, Geodermatophilaceae, Gly corny cetaceae, Haliangiaceae, Halomonadaceae, Holosporaceae, Hyphomicrobiaceae, Iamiaceae, Intrasporangiaceae, Kineosporiaceae, Koribacteraceae, Lachnospiraceae, Lactobacillaceae, Legionellaceae, Leptospiraceae, Leuconostocaceae, Methylobacteriaceae, Methylocystaceae, Methylophilaceae, Microbacteriaceae, Micrococcaceae, Micromonosporaceae, Moraxellaceae, Mycobacteriaceae, Mycoplasmataceae, Myxococcaceae, Nakamurellaceae, Neisseriaceae, Nitrosomonadaceae, Nocardiaceae, Nocardioidaceae, Oceanospirillaceae, Opitutaceae, Oxalobacteraceae, Paenibacillaceae, Parachlamydiaceae, Pasteurellaceae, Patulibacteraceae, Peptostreptococcaceae, Phyllobacteriaceae, Piscirickettsiaceae, Planctomycetaceae, Planococcaceae, Polyangiaceae, Porphyromonadaceae, Prevotellaceae, Promicromonosporaceae, Pseudomonadaceae, Pseudonocardiaceae, Rhizobiaceae, Rhodobacteraceae, Rhodospirillaceae, Roseiflexaceae, Rubrobacteriaceae, Sandaracinaceae, Sanguibacteraceae, Saprospiraceae, Segniliparaceae, Shewanellaceae, Sinobacteraceae, Solibacteraceae, Solimonadaceae, Solirubrobacteraceae, Sphingobacteriaceae, Sphingomonadaceae, Spiroplasmataceae, Sporichthyaceae, Sporolactobacillaceae, Staphylococcaceae,
Streptococcaceae, Streptomycetaceae, Syntrophobacteraceae, Veillonellaceae, Verrucomicrobiaceae, Weeksellaceae, Xanthobacteraceae, ou Xanthomonadaceae.
Ainda em outro aspecto é proporcionado aqui um método de aumentar a aptidão de um inseto (por exemplo, um simbionte de insetos de uma planta), em que o método inclui entregar ao inseto uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs (por exemplo, uma composição de PMP descrita aqui). Em alguns casos, o inseto é um polinizador de plantas.
Por exemplo, o inseto pode ser do gênero Hymenoptera ou Diptera.
Em alguns casos, o inseto do gênero Hymenoptera é uma abelha.
Em outros casos, o inseto do gênero Diptera é uma mosca.
Em alguns casos, o aumento na aptidão do simbionte pode se manifestar como uma melhoria na fisiologia do simbionte (por exemplo, saúde ou sobrevivência melhorada) em consequência da administração da composição de PMP.
Em alguns casos, a aptidão de um organismo pode ser medida por um ou mais parâmetros, incluindo, mas não se limitando a, taxa reprodutiva, expectativa de vida, viabilidade, mobilidade, fecundidade, peso corporal, taxa ou atividade metabólica ou sobrevivência em comparação com um simbionte ao qual a composição de PMP não foi entregue.
Por exemplo, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para melhorar a saúde global do simbionte ou para melhorar a sobrevivência global do simbionte em comparação com um organismo simbionte ao qual a composição de PMP não foi administrada.
Em alguns casos, a sobrevivência melhorada do simbionte é cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, um nível encontrado em um simbionte que não recebe uma composição de PMP). Em alguns casos, os métodos e composições são eficazes para aumentar a reprodução (por exemplo, taxa reprodutiva) do simbionte em comparação com um organismo simbionte ao qual a composição de PMP não foi administrada.
Em alguns casos, os métodos e composições são eficazes para aumentar outros parâmetros fisiológicos, tais como mobilidade, peso corporal, expectativa de vida, fecundidade ou taxa metabólica, em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, um nível encontrado em um simbionte que não recebe uma composição de PMP). Em alguns casos, o aumento na aptidão do simbionte pode se manifestar como um aumento na frequência ou eficácia de uma atividade desejada levada a cabo pelo simbionte (por exemplo, polinização, predação em pragas, disseminação de sementes ou degradação de resíduos ou material orgânico) em comparação com um organismo simbionte ao qual a composição de PMP não foi administrada.
Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para aumentar a frequência ou eficácia de uma atividade desejada levada a cabo pelo simbionte (por exemplo, polinização, predação em pragas, disseminação de sementes ou degradação de resíduos ou material orgânico) em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, um nível encontrado em um simbionte que não recebe uma composição de PMP). Em alguns casos, o aumento na aptidão do simbionte pode se manifestar como um aumento na produção de um ou mais nutrientes no simbionte (por exemplo, vitaminas, carboidratos, aminoácidos ou polipeptídeos) em comparação com um organismo simbionte ao qual a composição de PMP não foi administrada.
Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para aumentar a produção de nutrientes no simbionte (por exemplo, vitaminas, carboidratos, aminoácidos ou polipeptídeos) em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, um nível encontrado em um simbionte que não recebe uma composição de PMP). Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem aumentar nutrientes em uma planta associada por aumento da produção ou metabolismo de nutrientes por um ou mais microrganismos (por exemplo, endossimbionte) no simbionte.
Em alguns casos, o aumento na aptidão do simbionte pode se manifestar como uma diminuição na sensibilidade do simbionte a um agente pesticida e/ou um aumento na resistência do simbionte a um agente pesticida em comparação com um organismo simbionte ao qual a composição de PMP não foi administrada.
Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para diminuir a sensibilidade do simbionte a um agente pesticida em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, um nível encontrado em um simbionte que não recebe uma composição de PMP). Em alguns casos, o aumento na aptidão do simbionte pode se manifestar como uma diminuição na sensibilidade do simbionte a um agente aleloquímico e/ou um aumento na resistência do simbionte a um agente aleloquímico em comparação com um organismo simbionte ao qual a composição de PMP não foi administrada.
Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para aumentar a resistncia do simbionte a um agente aleloquímico em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo,
um nível encontrado em um simbionte que não recebe uma composição de PMP). Em alguns casos, o agente aleloquímico é cafeína, cistatina de soja N, monoterpenos, ácidos de diterpenos ou compostos fenólicos.
Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem diminuir a sensibilidade do simbionte a um agente aleloquímico por aumento da capacidade do simbionte de metabolizar ou degradar o agente aleloquímico em substratos usáveis.
Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para aumentar a resistência do simbionte a parasitas ou patógenos (por exemplo, patógenos fúngicos, bacterianos ou virais; ou ácaros parasitários (por exemplo, ácaro Varroa destructor em abelhas melíferas)) em comparação com um organismo simbionte ao qual a composição de PMP não foi administrada.
Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para aumentar a resistência do simbionte a um patógeno ou parasita (por exemplo, patógenos fúngicos, bacterianos ou virais; ou ácaros parasitários (por exemplo, ácaro Varroa destructor em abelhas melíferas)) em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, um nível encontrado em um simbionte que não recebe uma composição de PMP). Em alguns casos, o aumento na aptidão do simbionte pode se manifestar como outras vantagens de aptidão, tais como tolerância melhorada a certos fatores ambientais (por exemplo, uma tolerância a temperatura elevada ou baixa), capacidade melhorada de sobreviver em certos habitats ou uma capacidade melhorada de manter uma certa dieta (por exemplo, uma capacidade melhorada de metabolizar soja vs. milho) em comparação com um organismo simbionte ao qual a composição de PMP não foi administrada.
Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para aumentar a aptidão do simbionte em qualquer pluralidade de modos descritos aqui.
Adicionalmente, a composição de PMP pode aumentar a aptidão do simbionte em qualquer número de classes, ordens, famílias, gêneros ou espécies de simbiontes (por exemplo, 1 espécie de simbionte, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ,10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 200, 250, 500, ou mais espécies de simbiontes). Em alguns casos, a composição de PMP atua em uma única classe, ordem, família, gênero ou espécie de simbionte.
A aptidão do simbionte pode ser avaliada usando quaisquer métodos padrão da técnica.
Em alguns casos, a aptidão do simbionte pode ser avaliada por avaliação de um simbionte individual.
Alternativamente, a aptidão do simbionte pode ser avaliada por avaliação de uma população de simbiontes.
Por exemplo, um aumento na aptidão do simbionte pode se manifestar como um aumento na competição bem-sucedida contra outros insetos, levando deste modo a um aumento no tamanho da população de simbiontes.
Exemplos de simbiontes vegetais que podem ser tratadas com as presentes composições ou métodos relacionados são adicionalmente descritos aqui. i.
Fungos As composições de PMP e métodos relacionados podem ser úteis para aumentar a aptidão de um fungo, por exemplo, um fungo que é um endossimbionte de uma planta (por exemplo, fungo micorrízico). Em alguns casos, o fungo é da família Aspergillaceae, Ceratobasidiaceae, Coniochaetaceae, Cordycipitaceae, Corticiaceae, Cystofilobasidiaceae, Davidiellaceae, Debaryomycetaceae, Dothioraceae, Erysiphaceae, Filobasidiaceae, Glomerellaceae, Hydnaceae, Hypocreaceae, Leptosphaeriaceae, Montagnulaceae, Mortierellaceae, Mycosphaerellaceae, Nectriaceae, Orbiliaceae, Phaeosphaeriaceae, Pleosporaceae, Pseudeurotiaceae,
Rhizopodaceae, Sclerotiniaceae, Stereaceae, ou Trichocomacea.
Em alguns casos, o fungo é um fungo tendo uma associação micorrízica (por exemplo, ectomicorrízica ou endomicorrízica) com as raízes de uma planta, incluindo fungos pertencendo a Glomeromycota, Basidiomycota, Ascomycota ou Zygomycota. i.
Bactérias As composições de PMP e métodos relacionados podem ser úteis para aumentar a aptidão de uma bactéria, por exemplo, uma bactéria que é um endossimbionte de uma planta (por exemplo, bactéria fixadora de nitrogênio). Por exemplo, a bactéria pode ser do gênero Acidovorax, Agrobacterium, Bacillus, Burkholderia, Chryseobacterium, Curtobacterium, Enterobacter, Escherichia, Methylobacterium, Paenibacillus, Pantoea, Pseudomonas, Ralstonia, Rhizobium, Saccharibacillus, Sphingomonas ou Stenotrophomonas.
Em alguns casos, a bactéria é da família: Acetobacteraceae, Acidobacteriaceae, Acidothermaceae, Aerococcaceae, Alcaligenaceae, Alicyclobacillaceae, Alteromonadaceae, Anaerolineaceae, Aurantimonadaceae, Bacillaceae, Bacteriovoracaceae, Bdellovibrionaceae, Bradyrhizobiaceae, Brevibacteriaceae, Brucellaceae, Burkholderiaceae, Carboxydocellaceae, Caulobacteraceae, Cellulomonadaceae, Chitinophagaceae, Chromatiaceae, Chthoniobacteraceae, Chthonomonadaceae, Clostridiaceae, Comamonadaceae, Corynebacteriaceae, Coxiellaceae, Cryomorphaceae, Cyclobacteriaceae, Cytophagaceae, Deinococcaceae, Dermabacteraceae, Dermacoccaceae, Enterobacteriaceae, Enterococcaceae, Erythrobacteraceae, Fibrobacteraceae, Flammeovirgaceae, Flavobacteriaceae, Frankiaceae, Fusobacteriaceae, Gaiellaceae, Gemmatimonadaceae, Geodermatophilaceae, Gly corny cetaceae, Haliangiaceae,
Halomonadaceae, Holosporaceae, Hyphomicrobiaceae, Iamiaceae, Intrasporangiaceae, Kineosporiaceae, Koribacteraceae, Lachnospiraceae, Lactobacillaceae, Legionellaceae, Leptospiraceae, Leuconostocaceae, Methylobacteriaceae, Methylocystaceae, Methylophilaceae, Microbacteriaceae, Micrococcaceae, Micromonosporaceae, Moraxellaceae, Mycobacteriaceae, Mycoplasmataceae, Myxococcaceae, Nakamurellaceae, Neisseriaceae, Nitrosomonadaceae, Nocardiaceae, Nocardioidaceae, Oceanospirillaceae, Opitutaceae, Oxalobacteraceae, Paenibacillaceae, Parachlamydiaceae, Pasteurellaceae, Patulibacteraceae, Peptostreptococcaceae, Phyllobacteriaceae, Piscirickettsiaceae, Planctomycetaceae, Planococcaceae, Polyangiaceae, Porphyromonadaceae, Prevotellaceae, Promicromonosporaceae, Pseudomonadaceae, Pseudonocardiaceae, Rhizobiaceae, Rhodobacteraceae, Rhodospirillaceae, Roseiflexaceae, Rubrobacteriaceae, Sandaracinaceae, Sanguibacteraceae, Saprospiraceae, Segniliparaceae, Shewanellaceae, Sinobacteraceae, Solibacteraceae, Solimonadaceae, Solirubrobacteraceae, Sphingobacteriaceae, Sphingomonadaceae, Spiroplasmataceae, Sporichthyaceae, Sporolactobacillaceae, Staphylococcaceae, Streptococcaceae, Streptomycetaceae, Syntrophobacteraceae, Veillonellaceae, Verrucomicrobiaceae, Weeksellaceae, Xanthobacteraceae, ou Xanthomonadaceae.
Em alguns casos, a bactéria endossimbiótica é de uma família selecionada do grupo consistindo em: Bacillaceae, Burkholderiaceae, Comamonadaceae, Enterobacteriaceae, Flavobacteriaceae, Methylobacteriaceae, Microbacteriaceae, Paenibacillileae, Pseudomonnaceae, Rhizobiaceae, Sphingomonadaceae e Xanthomonadaceae.
Em alguns casos, a bactéria endossimbiótica é de um gênero selecionado do grupo consistindo em: Acidovorax, Agrobacterium, Bacillus, Burkholderia, Chryseobacterium, Curtobacterium, Enterobacter, Escherichia, Methylobacterium, Paenibacillus, Pantoea, Pseudomonas, Ralstonia, Saccharibacillus, Sphingomonas, e Stenotrophomonas. ii.
Insetos As composições de PMP e métodos relacionados podem ser úteis para aumentar a aptidão de um inseto, por exemplo, um inseto que é benéfico para a planta.
O termo “inseto” inclui qualquer organismo pertencendo ao filo Arthropoda e à classe Insecta ou à classe Arachnida, em qualquer etapa de desenvolvimento, isto é, insetos imaturos e adultos.
Por exemplo, o hospedeiro pode incluir insetos que são usados em aplicações agrícolas, incluindo insetos que auxiliam na polinização de culturas, disseminação de sementes ou controle de pragas.
Em alguns casos, o hospedeiro auxilia na polinização de uma planta (por exemplo, abelhas, besouros, vespas, moscas, borboletas ou traças). Em alguns casos, o hospedeiro auxiliando na polinização de uma planta é uma abelha.
Em alguns casos, a abelha é da família Andrenidae, Apidae, Colletidae, Halictidae ou Megachilidae.
Em alguns exemplos, o hospedeiro auxiliando na polinização de uma planta é um besouro.
Em casos particulares, a composição de PMP pode ser usada para aumentar a aptidão de uma abelha melífera.
Em alguns casos, o hospedeiro auxiliando na polinização de uma planta é um besouro, por exemplo, uma espécie na família Buprestidae, Cantharidae, Cerambycidae, Chrysomelidae, Cleridae, Coccinellidae, Elateridae, Melandryidae, Meloidae, Melyridae, Mordellidae, Nitidulidae, Oedemeridae, Scarabaeidae ou Staphyllinidae.
Em alguns casos, o hospedeiro auxiliando na polinização de uma planta é uma borboleta ou traça (por exemplo, Lepidoptera). Em alguns casos, a borboleta ou traça é uma espécie na família Geometridae, Hesperiidae, Lycaenidae, Noctuidae, Nymphalidae, Papilionidae, Pieridae ou Sphingidae.
Em alguns casos, o hospedeiro auxiliando na polinização de uma planta é uma mosca (por exemplo, Diptera). Em alguns casos, a mosca está na família Anthomyiidae, Bibionidae, Bombyliidae, Calliphoridae, Cecidomiidae, Certopogonidae, Chrionomidae, Conopidae, Culicidae, Dolichopodidae, Empididae, Ephydridae, Lonchopteridae, Muscidae, Mycetophilidae, Phoridae, Simuliidae, Stratiomyidae ou Syrphidae.
Em alguns casos, o hospedeiro auxiliando na polinização é uma formiga (por exemplo, Formicidae), vespão (por exemplo, Tenthredinidae) ou vespa (por exemplo, Sphecidae ou Vespidae). D.
Entrega a um Patógeno Animal São proporcionados aqui métodos de entregar uma composição de PMP (por exemplo, incluindo PMPs modificados descritos aqui) a um patógeno animal (por exemplo, humano), tal como um divulgado aqui, por contato do patógeno com uma composição de PMP.
Como usado aqui, o termo “patógeno” se refere a um organismo, tal como um microrganismo ou um invertebrado, que causa doença ou sintomas de doença em um animal por, por exemplo, (i) infeção direta do animal, (ii) por produção de agentes que causam doença ou sintomas de doença em um animal (por exemplo, bactérias que produzem toxinas patogênicas e similares) e/ou (iii) que provocam uma resposta imunitária (por exemplo, inflamatória) em animais (por exemplo, insetos mordedores, por exemplo, percevejos). Como usado aqui, os patógenos incluem, mas não estão limitados a, bactérias, protozoários, parasitas, fungos, nematódeos, insetos, viroides e vírus, ou qualquer sua combinação, em que cada patógeno é capaz, por si próprio ou em conjunto com outro patógeno, de provocar doença ou sintomas em animais, tais como humanos.
Em alguns casos, o patógeno animal (por exemplo, humano) pode ser tratado com PMPs não incluindo um agente funcional heterólogo.
Em outros casos, os PMPs incluem um agente funcional heterólogo, por exemplo, um agente terapêutico heterólogo (por exemplo, agente antibacteriano, agente antifúngico, inseticida, nematicida, agente antiparasitário, agente antiviral ou um repelente). Os métodos podem ser úteis para diminuir a aptidão de um patógeno animal, por exemplo, para prevenir ou tratar uma infeção por patógenos ou controlar a propagação de um patógeno em consequência da entrega da composição de PMP.
Exemplos de patógenos que podem ser visados de acordo com os métodos descritos aqui incluem bactérias (por exemplo, Streptococcus spp., Pneumococcus spp., Pseudomonas spp., Shigella spp, Salmonella spp., Campylobacter spp., ou uma Escherichia spp.), fungos (Saccharomyces spp. ou uma Candida spp.), insetos parasitários (por exemplo, Cimex spp.), nematódeos parasitários (por exemplo, Heligmosomoides spp.) ou protozoários parasitários (por exemplo, Trichomoniasis spp.). Por exemplo é proporcionado aqui um método de diminuir a aptidão de um patógeno, incluindo o método entregar ao patógeno uma composição de PMP descrita aqui, em que o método diminui a aptidão do patógeno em relação a um patógeno não tratado.
Em algumas modalidades, o método inclui entregar a composição a pelo menos um habitat onde o patógeno cresce, vive, se reproduz, se alimenta ou infesta.
Em alguns casos dos métodos descritos aqui, a composição é entregue como uma composição comestível pelo patógeno para ingestão pelo patógeno.
Em alguns casos dos métodos descritos aqui, a composição é entregue (por exemplo, a um patógeno) como um líquido, um sólido, um aerossol, uma pasta, um gel ou um gás.
É também proporcionado aqui um método de diminuir a aptidão de um inseto parasitário, em que o método inclui entregar ao inseto parasitário uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs.
Em alguns casos, o método inclui entregar ao inseto parasitário uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs, em que a pluralidade de PMPs inclui um agente inseticida.
Por exemplo, o inseto parasitário pode ser um percevejo.
Outros exemplos não limitantes de insetos parasitários são proporcionados aqui.
Em alguns casos, o método diminui a aptidão do inseto parasitário em relação a um inseto parasitário não tratado.
É adicionalmente proporcionado aqui um método de diminuir a aptidão de um nematódeo parasitário, em que o método inclui entregar ao nematódeo parasitário uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs.
Em alguns casos, o método inclui entregar ao nematódeo parasitário uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs, em que a pluralidade de PMPs inclui um agente nematicida.
Por exemplo, o nematódeo parasitário é Heligmosomoides polygyrus.
Outros exemplos não limitantes de nematódeos parasitários são proporcionados aqui.
Em alguns casos, o método diminui a aptidão do nematódeo parasitário em relação a um nematódeo parasitário não tratado.
É adicionalmente proporcionado aqui um método de diminuir a aptidão de um protozoário parasitário, em que o método inclui entregar ao protozoário parasitário uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs.
Em alguns casos, o método inclui entregar ao protozoário parasitário uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs, em que a pluralidade de PMPs inclui um agente antiparasitário.
Por exemplo, o protozoário parasitário pode ser T. vaginalis.
Outros exemplos não limitantes de protozoários parasitários são proporcionados aqui.
Em alguns casos, o método diminui a aptidão do protozoário parasitário em relação a um protozoário parasitário não tratado.
Uma diminuição na aptidão do patógeno em consequência da entrega de uma composição de PMP pode se manifestar de um número de modos.
Em alguns casos, a diminuição na aptidão do patógeno pode se manifestar como uma deterioração ou declínio na fisiologia do patógeno (por exemplo, saúde ou sobrevivência reduzida) em consequência da entrega da composição de PMP.
Em alguns casos, a aptidão de um organismo pode ser medida por um ou mais parâmetros, incluindo, mas não se limitando a, taxa reprodutiva, fertilidade, expectativa de vida, viabilidade, mobilidade, fecundidade, desenvolvimento do patógeno, peso corporal, taxa ou atividade metabólica ou sobrevivência em comparação com um patógeno ao qual a composição de PMP não foi administrada.
Por exemplo, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para diminuir a saúde global do patógeno ou para diminuir a sobrevivência global do patógeno.
Em alguns casos, a sobrevivência diminuída do patógeno é cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, um nível encontrado em um patógeno que não recebe uma composição de PMP). Em alguns casos, os métodos e composições são eficazes para diminuir a reprodução do patógeno (por exemplo, taxa reprodutiva, fertilidade) em comparação com um patógeno ao qual a composição de PMP não foi administrada.
Em alguns casos, os métodos e composições são eficazes para diminuir outros parâmetros fisiológicos, tais como mobilidade, peso corporal, expectativa de vida, fecundidade ou taxa metabólica, em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, um nível encontrado em um patógeno que não recebe uma composição de PMP).
Em alguns casos, a diminuição na aptidão da praga pode se manifestar como um aumento na sensibilidade do patógeno a um agente antipatogênico e/ou uma diminuição na resistência do patógeno a um agente antipatogênico em comparação com um patógeno ao qual a composição de PMP não foi entregue.
Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para aumentar a sensibilidade do patógeno a um agente pesticida em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, um nível encontrado em uma praga que não recebe uma composição de PMP). Em alguns casos, a diminuição na aptidão do patógeno pode se manifestar como outras desvantagens de aptidão, tais como uma tolerância diminuída a certos fatores ambientais (por exemplo, uma tolerância à temperatura elevada ou baixa), uma capacidade diminuída para sobreviver em certos habitats ou uma capacidade diminuída de manter uma certa dieta em comparação com um patógeno ao qual a composição de PMP não foi administrada.
Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para diminuir a aptidão do patógeno em qualquer pluralidade de modos descritos aqui.
Adicionalmente, a composição de PMP pode diminuir a aptidão do patógeno em qualquer número de classes, ordens, famílias, gêneros ou espécies de patógenos (por exemplo, 1 espécie de patógeno, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ,10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 200, 250, 500 ou mais espécies de patógenos). Em alguns casos, a composição de PMP atua em uma única classe, ordem, família, gênero ou espécie de patógeno.
A aptidão do patógeno pode ser avaliada usando quaisquer métodos padrão da técnica.
Em alguns casos, a aptidão da praga pode ser avaliada por avaliação de um patógeno individual.
Alternativamente,
a aptidão da praga pode ser avaliada por avaliação de uma população de patógenos.
Por exemplo, uma diminuição na aptidão do patógeno pode se manifestar como uma diminuição na competição bem-sucedida contra outros patógenos, levando deste modo a uma diminuição no tamanho da população de patógenos.
As composições de PMP e métodos relacionados descritos aqui são úteis para diminuir a aptidão de um patógeno de animais e deste modo tratar ou prevenir infeções em animais.
Exemplos de patógenos de animais, ou seus vetores, que podem ser tratadas com as presentes composições ou métodos relacionados são adicionalmente descritos aqui. i.
Fungos As composições de PMP e métodos relacionados podem ser úteis para diminuir a aptidão de um fungo, por exemplo, para prevenir ou tratar uma infeção fúngica em um animal.
Estão incluídos métodos para entregar uma composição de PMP a um fungo por contato do fungo com a composição de PMP.
Adicionalmente ou alternativamente, os métodos incluem prevenir ou tratar uma infeção fúngica (por exemplo, causada por um fungo descrito aqui) em um animal em seu risco ou com sua necessidade, por administração ao animal de uma composição de PMP.
As composições de PMP e métodos relacionados são adequados para tratamento ou prevenção de infeções fúngicas em animais, incluindo infeções causadas por fungos pertencendo a Ascomycota (Fusarium oxysporum, Pneumocystis jirovecii, Aspergillus spp., Coccidioides immitis/posadasii, Candida albicans), Basidiomycota (Filobasidiella neoformans, Trichosporon), Microsporidia (Encephalitozoon cuniculi, Enterocytozoon bieneusi), Mucoromycotina (Mucor circinelloides, Rhizopus oryzae, Lichtheimia corymbifera). Em alguns casos, a infeção fúngica é uma causada por um pertencendo ao filo Ascomycota, Basidomycota, Chytridiomycota, Microsporidia, ou Zygomycota.
A infeção ou sobrecrescimento fúngico pode incluir uma ou mais espécies fúngicas, por exemplo, Candida albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata, C. auris, C. krusei, Saccharomyces cerevisiae, Malassezia globose, M. restricta, ou Debaryomyces hansenii, Gibberella moniliformis, Alternaria brassicicola, Cryptococcus neoformans, Pneumocystis carinii, P. jirovecii, P. murina, P. oryctolagi, P. wakefieldiae, e Aspergillus clavatus.
A espécie fúngica pode ser considerada um patógeno ou um patógeno oportunista.
Em alguns casos, a infeção fúngica é causada por um fungo no gênero Candida (isto é, uma infeção por Candida). Por exemplo, uma infeção por Candida pode ser causada por um fungo no gênero Candida que é selecionado do grupo consistindo em C. albicans, C. glabrata, C. dubliniensis, C. krusei, C. auris, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. orthopsilosis, C. guilliermondii, C. rugose, e C. lusitaniae.
Candida infeções que podem ser tratadas pelos métodos divulgados aqui incluem, mas não estão limitados a, candidemia, candidíase orofaríngea, candidíase esofágica, candidíase mucosal, candidíase genital, candidíase vulvovaginal, candidíase retal, candidíase hepática, candidíase renal, candidíase pulmonar, candidíase esplênica, otomicose, osteomielite, artrite séptica, candidíase cardiovascular (por exemplo, endocardite) e candidíase invasiva. ii.
Bactérias As composições de PMP e métodos relacionados podem ser úteis para diminuir a aptidão de uma bactéria, por exemplo, para prevenir ou tratar uma infeção bacteriana em um animal.
Estão incluídos métodos para administrar uma composição de PMP a uma bactéria por contato da bactéria com a composição de PMP.
Adicionalmente ou alternativamente, os métodos incluem prevenir ou tratar uma infeção bacteriana (por exemplo, causada por uma bactéria descrita aqui) em um animal em seu risco ou com sua necessidade, por administração ao animal de uma composição de PMP.
As composições de PMP e métodos relacionados são adequados para prevenir ou tratar uma infeção bacteriana em animais causada por qualquer bactéria descrita adicionalmente em baixo.
Por exemplo, a bactéria pode ser uma pertencendo a Bacillales (B. anthracis, B. cereus, S. aureus, L. monocytogenes), Lactobacillales (S. pneumoniae, S. pyogenes), Clostridiales (C. botulinum, C. difficile, C. perfringens, C. tetani), Spirochaetales (Borrelia burgdorferi, Treponema pallidum), Chlamydiales (Chlamydia trachomatis, Chlamydophila psittaci), Actinomycetales (C. diphtheriae, Mycobacterium tuberculosis, M. avium), Rickettsiales (R. prowazekii, R. rickettsii, R. typhi, A. phagocytophilum, E. chaffeensis), Rhizobiales (Brucella melitensis), Burkholderiales (Bordetella pertussis, Burkholderia mallei, B. pseudomallei), Neisseriales (Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis), Campylobacterales (Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori), Legionellales (Legionella pneumophila), Pseudomonadales (A. baumannii, Moraxella catarrhalis, P. aeruginosa), Aeromonadales (Aeromonas sp.), Vibrionales (Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus), Thiotrichales, Pasteurellales (Haemophilus influenzae), Enterobacteriales (Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Yersinia pestis, Y. enterocolitica, Shigella flexneri, Salmonella enterica, E. coli). iii.
Insetos Parasitários As composições de PMP e métodos relacionados podem ser úteis para diminuir a aptidão de um inseto parasitário, por exemplo, para prevenir ou tratar uma infeção por inseto parasitário em um animal.
O termo “inseto” inclui qualquer organismo pertencendo ao filo Arthropoda e à classe Insecta ou à classe Arachnida, em qualquer etapa de desenvolvimento, isto é, insetos imaturos e adultos.
Estão incluídos métodos para entregar uma composição de PMP a um inseto por contato do inseto com a composição de PMP.
Adicionalmente ou alternativamente, os métodos incluem prevenir ou tratar uma infeção por inseto parasitário (por exemplo, causada por um inseto parasitário descrito aqui) em um animal em seu risco ou com sua necessidade, por administração ao animal de uma composição de PMP.
As composições de PMP e métodos relacionados são adequados para prevenir ou tratar infeção em animais por um inseto parasitário, incluindo infeções por insetos pertencendo a Phthiraptera: Anoplura (Piolho sugador), Ischnocera (Piolho Mastigador), Amblycera (Piolho Mastigador). Siphonaptera: Pulicidae (Pulgas do gato), Ceratophyllidae (Pulgas da galinha). Diptera: Culicidae (Mosquitos), Ceratopogonidae (Mosquitos), Psychodidae (Flebotomíneos), Simuliidae (Moscas negras), Tabanidae (Moscas do cavalo), Muscidae (Moscas do cavalo, etc.), Calliphoridae (Borboletas), Glossinidae (Moscas tsé-tsé), Oestridae (Moscas-do-mato), Hippoboscidae (Moscas-piolho). Hemiptera: Reduviidae (Percevejos assassinos), Cimicidae (Percevejos). Arachnida: Sarcoptidae (Ácaros sarcóticos), Psoroptidae (Ácaros psorópticos), Cytoditidae (Ácaros do saco de ar), Laminosioptes (Ácaros dos cistos), Analgidae (Ácaros das penas), Acaridae (Ácaros dos grãos), Demodicidae (Ácaros do folículo piloso), Cheyletiellidae (Ácaros do pelo), Trombiculidae (Trombiculídeos), Dermanyssidae (Ácaros das aves), Macronyssidae (Ácaros das aves), Argasidae (Carrapatos moles), Ixodidae (Carrapatos duros). iv.
Protozoários As composições de PMP e métodos relacionados podem ser úteis para diminuir a aptidão de um protozoário parasitário, por exemplo, para prevenir ou tratar uma infeção por protozoário parasitário em um animal.
O termo “protozoário” inclui qualquer organismo pertencendo ao filo Protozoa.
Estão incluídos métodos para entregar uma composição de PMP a um protozoário parasitário por contato do protozoário parasitário com a composição de PMP.
Adicionalmente ou alternativamente, os métodos incluem prevenir ou tratar uma infeção protozoária (por exemplo, causada por um protozoário descrito aqui) em um animal em seu risco ou com sua necessidade, por administração ao animal de uma composição de PMP.
As composições de PMP e métodos relacionados são adequados para prevenir ou tratar infeção por protozoários parasitários em animais, incluindo protozoários pertencendo a Euglenozoa (Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei, Leishmania spp.), Heterolobosea (Naegleria fowleri), Diplomonadida (Giardia intestinalis), Amoebozoa (Acanthamoeba castellanii, Balamuthia mandrillaris, Entamoeba histolytica), Blastocystis (Blastocystis hominis), Apicomplexa (Babesia microti, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis, Plasmodium spp., Toxoplasma gondii). v.
Nematódeos As composições de PMP e métodos relacionados podem ser úteis para diminuir a aptidão de um nematódeo parasitário, por exemplo, para prevenir ou tratar uma infeção por nematódeo parasitário em um animal.
Estão incluídos métodos para entregar uma composição de PMP a um nematódeo parasitário por contato do nematódeo parasitário com a composição de PMP.
Adicionalmente ou alternativamente, os métodos incluem prevenir ou tratar uma infeção por nematódeo parasitário (por exemplo, causada por um nematódeo parasitário descrito aqui) em um animal em seu risco ou com sua necessidade, por administração ao animal de uma composição de PMP.
As composições de PMP e métodos relacionados são adequados para prevenir ou tratar infeção por nematódeos parasitários em animais, incluindo nematódeos pertencendo a Nematoda (lombrigas): Angiostrongylus cantonensis (lagarta de rato), Ascaris lumbricoides (lombriga de humano), Baylisascaris procyonis (lombiga de guaxinim), Trichuris trichiura (lagarta de humano), Trichinella spiralis, Strongyloides stercoralis, Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Ancylostoma duodenale and Necator americanus (ancilóstomo de humano), Cestoda (tênias): Echinococcus granulosus, Echinococcus multilocularis, Taenia solium (tênia de porco). vi.
Vírus As composições de PMP e métodos relacionados podem ser úteis para diminuir a aptidão de um vírus, por exemplo, para prevenir ou tratar uma infeção viral em um animal.
Estão incluídos métodos para entregar uma composição de PMP a um vírus por contato do vírus com a composição de PMP.
Adicionalmente ou alternativamente, os métodos incluem prevenir ou tratar uma infeção viral (por exemplo, causada por um vírus descrito aqui) em um animal em seu risco ou com sua necessidade, por administração ao animal de uma composição de PMP.
As composições de PMP e métodos relacionados são adequados para prevenir ou tratar uma infeção viral em animais, incluindo infeções por vírus pertencendo a vírus de DNA: Parvoviridae, Papillomaviridae, Polyomaviridae, Poxviridae, Herpesviridae; Vírus de RNA de fita negativa de fita única: Arenaviridae, Paramyxoviridae (Rubulavírus, Respirovírus, Pneumovírus, Moribilivírus), Filoviridae (Marburgvírus, Ebolavírus), Bornaoviridae, Rhabdoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Nairovírus, Hantunyavírus, Hantunyavírus.
Vírus de RNA de fita positiva de fita única: Astroviridae, Coronaviridae, Caliciviridae, Togaviridae (Rubivírus, Alfavírus), Flaviviridae (Hepacivírus, Flavivírus), Picornaviridae (Hepatovírus, Rinovírus, Enterovírus); ou Vírus de dsRNA e Retrotranscritos: Reoviridae (Rotavírus, Coltivírus, Seadornavírus), Retroviridae (Deltarretrovírus, Lentivírus), Hepadnaviridae (Orto-hepadnavírus).
E.
Entrega a um Vetor de Patógeno São proporcionados aqui métodos de entregar uma composição de PMP (por exemplo, incluindo PMPs modificados descritos aqui) a vetor de patógeno, tal como um divulgado aqui, por contato do vetor de patógeno com uma composição de PMP.
Como usado aqui, o termo "vetor" se refere a um inseto que pode transportar ou transmitir um patógeno de animais de um reservatório para um animal.
Vetores exemplificativos incluem insetos, como aqueles com partes bucais perfuradoras-sugadoras, como as presentes em Hemiptera e alguns Hymenoptera e Diptera como mosquitos, abelhas, vespas, cecidomídeos, piolhos, mosca tsé-tsé, pulgas e formigas, bem como membros de Arachnidae como carrapatos e ácaros.
Em alguns casos, o vetor do patógeno animal (por exemplo, humano) pode ser tratado com PMPs não incluindo um agente funcional heterólogo.
Em outros casos, os PMPs incluem um agente funcional heterólogo, por exemplo, um agente terapêutico heterólogo (por exemplo, agente antibacteriano, agente antifúngico, inseticida, nematicida, agente antiparasitário, agente antiviral ou um repelente). Os métodos podem ser úteis para diminuir a aptidão de um vetor de patógeno, por exemplo, para controlar a propagação de um patógeno em consequência da entrega da composição de PMP.
Exemplos de vetores de patógenos que podem ser visados de acordo com os presentes métodos incluem insetos, tais como aqueles descritos aqui.
Por exemplo é proporcionado aqui um método de diminuir a aptidão de um vetor de patógeno de animais, incluindo o método entregar ao vetor uma quantidade eficaz das composições de PMP descritas aqui, em que o método diminui a aptidão do vetor em relação a um vetor não tratado.
Em alguns casos, o método inclui entregar a composição a pelo menos um habitat onde o vetor cresce, vive, se reproduz, se alimenta ou infesta.
Em alguns casos, a composição é entregue como uma composição comestível para ingestão pelo vetor.
Em alguns casos, o vetor é um inseto.
Em alguns casos, o inseto é um mosquito, um carrapato, um ácaro ou um piolho.
Em alguns casos, a composição é entregue (por exemplo, ao vetor de patógeno) como um líquido, um sólido, um aerossol, uma pasta, um gel ou um gás.
Por exemplo é proporcionado aqui um método de diminuir a aptidão de um vetor de insetos de um patógeno de animais, em que o método inclui entregar ao vetor uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs.
Em alguns casos, o método inclui entregar ao vetor uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs, em que a pluralidade de PMPs inclui um agente inseticida.
Por exemplo, o vetor de insetos pode ser um mosquito, carrapato, ácaro ou piolho.
Outros exemplos não limitantes de vetores de patógenos são proporcionados aqui.
Em alguns casos, o método diminui a aptidão do vetor em relação a um vetor não tratado.
Em alguns casos, a diminuição na aptidão do vetor pode se manifestar como uma deterioração ou declínio na fisiologia do vetor (por exemplo, saúde ou sobrevivência reduzida) em consequência da administração de uma composição.
Em alguns casos, a aptidão de um organismo pode ser medida por um ou mais parâmetros, incluindo, mas não se limitando a, taxa reprodutiva, expectativa de vida, viabilidade, mobilidade, fecundidade, peso corporal, taxa ou atividade metabólica ou sobrevivência em comparação com um organismo vetor ao qual a composição não foi entregue.
Por exemplo, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para diminuir a saúde global do vetor ou para diminuir a sobrevivência global do vetor.
Em alguns casos, a sobrevivência diminuída do vetor é cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, um nível encontrado em um vetor que não recebe uma composição). Em alguns casos, os métodos e composições são eficazes para diminuir a reprodução do vetor (por exemplo, taxa reprodutiva) em comparação com um organismo vetor ao qual a composição não foi entregue.
Em alguns casos, os métodos e composições são eficazes para diminuir outros parâmetros fisiológicos, tais como mobilidade, peso corporal, expectativa de vida, fecundidade ou taxa metabólica, em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, um nível encontrado em um vetor que não é entregue à composição). Em alguns casos, a diminuição na aptidão do vetor pode se manifestar como um aumento na sensibilidade do vetor a um agente pesticida e/ou uma diminuição na resistência do vetor a um agente pesticida em comparação com um organismo vetor ao qual a composição não foi entregue.
Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para aumentar a sensibilidade do vetor a um agente pesticida em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um nível de referência (por exemplo, um nível encontrado em um vetor que não recebe uma composição). O agente pesticida pode ser qualquer agente pesticida conhecido na técnica, incluindo agentes inseticidas.
Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem aumentar a sensibilidade do vetor a um agente pesticida por diminuição da capacidade do vetor de metabolizar ou degradar o agente pesticida em substratos usáveis em comparação com um vetor ao qual a composição não foi entregue.
Em alguns casos, a diminuição na aptidão do vetor pode se manifestar como outras desvantagens de aptidão, tais como tolerância diminuída a certos fatores ambientais (por exemplo, uma tolerância à temperatura elevada ou baixa), capacidade diminuída para sobreviver em certos habitats ou uma capacidade diminuída de manter uma certa dieta em comparação com um organismo vetor ao qual a composição não foi entregue.
Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para diminuir a aptidão do vetor em qualquer pluralidade de modos descritos aqui.
Adicionalmente, a composição pode diminuir a aptidão do vetor em qualquer número de classes, ordens, famílias, gêneros ou espécies de vetores (por exemplo, 1 espécie de vetor, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ,10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 200, 250, 500 ou mais espécies de vetores). Em alguns casos, a composição atua em uma única classe, ordem, família, gênero ou espécie de vetor.
A aptidão do vetor pode ser avaliada usando quaisquer métodos padrão da técnica.
Em alguns casos, a aptidão do vetor pode ser avaliada por avaliação de um vetor individual.
Alternativamente, a aptidão do vetor pode ser avaliada por avaliação de uma população de vetores.
Por exemplo, uma diminuição na aptidão do vetor pode se manifestar como uma diminuição na competição bem-sucedida contra outros vetores, levando deste modo a uma diminuição no tamanho da população de vetores.
Por diminuição da aptidão de vetores que transportam patógenos de animais, as composições proporcionadas aqui são eficazes para reduzir a propagação de doenças transmitidas por vetores.
A composição pode ser entregue aos insetos usando qualquer uma das formulações e métodos de entrega descritos aqui, em uma quantidade e durante uma duração eficazes para reduzir a transmissão da doença, por exemplo, reduzir a transmissão vertical ou horizontal entre vetores e/ou reduzir a transmissão para animais.
Por exemplo, a composição descrita aqui pode reduzir a transmissão vertical ou horizontal de um patógeno transmitido por vetores em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais em comparação com um organismo vetor ao qual a composição não foi entregue.
Como outro exemplo, a composição descrita aqui pode reduzir a competência vetorial de um vetor de insetos em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais em comparação com um organismo vetor ao qual a composição não foi entregue.
Exemplos não limitantes de doenças que podem ser controladas pelas composições e métodos proporcionados aqui incluem doenças causadas por vírus Togaviridae (por exemplo, Chikungunya, febre de Ross River, Mayaro, febre de Onyon-nyong, febre de Sindbis, encefalomielite equina oriental, encefalomielite equina ocidental, encefalomielite equina venezuelana ou floresta de Barmah); doenças causadas por vírus Flavivirdae (por exemplo, Febre de Dengue, Febre amarela, doença da Floresta de Kyasanur, febre hemorrágica de Omsk, encefalite japonesa, encefalite de Murray Valley, Rocio, encefalite de St.
Louis, encefalite do Nilo ocidental ou Encefalite transmitida pelo carrapato); doenças causadas por vírus Bunyaviridae (por exemplo, febre de Sandly, febre de Rift Valley, encefalite de La Crosse, encefalite da Califórnia, febre hemorrágica da Crimeia-Congo ou febre de Oropouche); doença causada por vírus Rhabdoviridae (por exemplo, Estomatite vesicular); doença causada por Orbiviridae (por exemplo, Língua azul); doenças causadas por bactérias (por exemplo, Peste, Tularemia, febre Q, febre maculosa das Montanhas Rochosas, Tifo murino, febre de Boutonneuse, tifo do carrapato de Queensland, tifo do carrapato siberiano, Tifo dos arbustos, Febre recorrente ou doença de Lyme); ou doenças causadas por protozoários (por exemplo, Malária, tripanossomíase africana, Nagana, doença de Chagas, Leishmaniose, Piroplasmose, Filariose bancroftiana ou Filariose brugiana). i.
Vetores de Patógenos Os métodos e composições proporcionados aqui podem ser úteis para diminuir a aptidão de um vetor para um patógeno animal.
Em alguns casos, o vetor pode ser um inseto.
Por exemplo, o vetor de inseto pode incluir aqueles, mas não está limitado àqueles, com aparelhos bucais perfurantes-sugadores, como encontrado em Hemiptera e alguns Hymenoptera e Diptera tais como mosquitos, abelhas, vespas, mosquitos, piolhos, mosca tsé-tsé, pulgas e formigas, como bem como membros dos Arachnidae tais como carrapatos e ácaros; ordem, classe ou família de Acarina (carrapatos e ácaros), por exemplo, representantes das famílias Argasidae, Dermanyssidae, Ixodidae, Psoroptidae ou Sarcoptidae e representantes das espécies Amblyomma spp., Anocenton spp., Argas spp., Boophilus spp., Cheyletiella spp., Chorioptes spp., Demodex spp., Dermacentor spp., Denmanyssus spp., Haemophysalis spp., Hyalomma spp., Ixodes spp., Lynxacarus spp., Mesostigmata spp., Notoednes spp., Ornithodoros spp., Ornithonyssus spp., Otobius spp., otodectes spp., Pneumonyssus spp., Psoroptes spp., Rhipicephalus spp., Sancoptes spp., ou Trombicula spp.; Anoplura (piolhos sugadores e mordedores) por exemplo representantes das espécies Bovicola spp., Haematopinus spp., Linognathus spp., Menopon spp., Pediculus spp., Pemphigus spp., Phylloxera spp., ou Solenopotes spp.; Diptera (moscas) por exemplo representantes das espécies Aedes spp., Anopheles spp., Calliphora spp., Chrysomyia spp., Chrysops spp., Cochliomyia spp., Cw/ex spp., Culicoides spp., Cuterebra spp., Dermatobia spp., Gastrophilus spp., Glossina spp., Haematobia spp., Haematopota spp., Hippobosca spp., Hypoderma spp., Lucilia spp., Lyperosia spp., Melophagus spp., Oestrus spp., Phaenicia spp., Phlebotomus spp., Phormia spp., Acari (sarna sarcóptica) por exemplo, Sarcoptidae spp., Sarcophaga spp., Simulium spp., Stomoxys spp., Tabanus spp., Tannia spp. ou Zzpu/alpha spp.; Mallophaga (piolhos mordedores), por exemplo, representantes das espécies Damalina spp., Felicola spp., Heterodoxus spp. ou Trichodectes spp.; ou Siphonaptera (insetos sem asadas), por exemplo,
representantes das espécies Ceratophyllus spp., Xenopsylla spp; Cimicidae (percevejos), por exemplo, representantes das espécies Cimex spp., Tritominae spp., Rhodinius spp., ou Triatoma spp.
Em alguns casos, o inseto é um inseto sugador de sangue da ordem Diptera (por exemplo, subordem Nematocera, por exemplo, família Colicidae). Em alguns casos, o inseto é das subfamílias Culicinae, Corethrinae, Ceratopogonidae ou Simuliidae.
Em alguns casos, o inseto é de uma Culex spp., Theobaldia spp., Aedes spp., Anopheles spp., Aedes spp., Forciponiyia spp., Culicoides spp., ou Helea spp.
Em certos casos, o inseto é um mosquito.
Em certos casos, o inseto é um carrapato.
Em certos casos, o inseto é um ácaro.
Em certos casos, o inseto é um piolho mordedor.
D.
Entrega a um Animal São proporcionados aqui métodos de entregar uma composição de PMP (por exemplo, incluindo PMPs modificados descritos aqui) a uma célula, tecido ou sujeito animal (por exemplo, um mamífero, por exemplo, um humano), por exemplo, por contato da célula, tecido, sujeito animal, ou uma parte da mesma, com a composição de PMP.
Em alguns casos, os animais podem ser tratados com PMPs não incluindo um agente funcional heterólogo.
Em outros casos, os PMPs incluem um agente funcional heterólogo, por exemplo, um agente terapêutico heterólogo (por exemplo, uma proteína ou peptídeo, ácido nucleico ou molécula pequena terapêutico, um agente antibacteriano, agente antifúngico, inseticida, nematicida, agente antiparasitário, agente antiviral ou um repelente). Em um aspecto é proporcionado aqui um método de aumentar a aptidão de um animal, incluindo o método entregar ao animal a composição de PMP descrita aqui (por exemplo, em uma quantidade e duração eficazes) para aumentar a aptidão do animal em relação a um animal não tratado (por exemplo, um animal ao qual não foi entregue a composição de PMP). Um aumento na aptidão do animal em consequência da entrega de uma composição de PMP pode ser determinado por qualquer método de avaliar a aptidão do animal (por exemplo, aptidão de um mamífero, por exemplo, aptidão (por exemplo, saúde) de um humano). É proporcionado aqui um método de modificar ou aumentar a aptidão de um animal, incluindo o método entregar ao animal uma quantidade eficaz de uma composição de PMP proporcionada aqui, em que o método modifica o animal e deste modo introduz ou aumenta um traço benéfico no animal (por exemplo, em cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100%) em relação a um animal não tratado.
Em particular, o método aumentar a aptidão do animal, por exemplo, um mamífero, por exemplo, um humano (por exemplo, em cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100%) em relação a um animal não tratado.
Em um aspecto adicional é proporcionado aqui um método de aumentar a aptidão de um animal, incluindo o método contatar uma célula do animal com uma quantidade eficaz de uma composição de PMP aqui, em que o método aumenta a aptidão do animal, por exemplo, mamífero, por exemplo, humano (por exemplo, em cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100%) em relação a um animal não tratado.
Em certos casos, o animal é um mamífero, por exemplo, um humano.
Em certos casos, o animal é um animal de criação ou um animal veterinário.
Em certos casos, o animal é um camundongo.
G.
Métodos de Aplicação Uma planta descrita aqui pode ser exposta a uma composição de PMP (por exemplo, incluindo PMPs modificados descritos aqui) em qualquer maneira adequada que permita entregar ou administrar a composição à planta.
A composição de PMP pode ser entregue sozinha ou em combinação com outras substâncias ativas (por exemplo, agentes fertilizantes) ou inativas e pode ser aplicada por, por exemplo, pulverização, injeção (por exemplo, microinjeção), através de plantas, vertimento, imersão, na forma de líquidos concentrados, géis, soluções, suspensões, pulverizações, pós, péletes, briquetes, tijolos e similares, formulados para entregar uma concentração eficaz da composição de PMP.
Quantidades e localizações para aplicação das composições descritas aqui são geralmente determinados pelo habitat da planta, pela etapa do ciclo de vida na qual a planta pode ser visada pela composição de PMP, pelo local onde a aplicação é para ser feita e pelas características físicas e funcionais da composição de PMP.
Em alguns casos, a composição é pulverizada diretamente em uma planta, por exemplo, culturas, por, por exemplo, pulverização de mochila, pulverização aérea, pulverização/empoeiramento de culturas, etc.
Nos casos onde a composição de PMP é administrada a uma planta, a planta recebendo a composição de PMP pode estar em qualquer etapa de crescimento da planta.
Por exemplo, as composições de PMP formuladas podem ser aplicadas como um revestimento de sementes ou tratamento de raízes em etapas precoces do crescimento da planta ou como um tratamento total da planta em etapas mais tardias do ciclo da cultura.
Em alguns casos, a composição de PMP pode ser aplicada como um agente tópico a uma planta.
Além disso, a composição de PMP pode ser aplicada (por exemplo, no solo no qual uma planta cresce ou na água que é usada para regar a planta) como um agente sistêmico que é absorvido e distribuído através dos tecidos de uma planta.
Em alguns casos, as plantas ou organismos alimentares podem ser geneticamente transformados para expressar a composição de PMP.
A liberação retardada ou contínua pode ser também alcançada por revestimento da composição de PMP ou uma composição com a(s) composição(ões) de PMP com uma camada de revestimento dissolvível ou bioerodível, tal como gelatina, revestimento esse que se dissolve ou corrói no ambiente de uso, para depois tornar disponível a composição de PMP ou por dispersão do agente em uma matriz dissolvível ou erodível.
Tais dispositivos de liberação e/ou dispensa contínuos podem ser vantajosamente empregues para manter consistentemente uma concentração eficaz de uma ou mais das composições de PMP descritas aqui.
Em alguns casos, a composição de PMP é entregue a uma parte da planta, por exemplo, uma folha, semente, pólen, raiz, fruta, rebento ou flor ou um seu tecido, célula ou protoplasto.
Em alguns casos, a composição de PMP é entregue a uma célula da planta.
Em alguns casos, a composição de PMP é entregue a um protoplasto da planta.
Em alguns casos, a composição de PMP é entregue a um tecido da planta.
Por exemplo, a composição pode ser entregue ao tecido meristemático da planta (por exemplo, meristema apical, meristema lateral ou meristema intercalar). Em alguns casos, a composição é entregue ao tecido permanente da planta (por exemplo, tecidos simples (por exemplo, parênquima, colênquima ou esclerênquima) ou tecido permanente complexo (por exemplo, xilema ou floema)). Em alguns casos, a composição é entregue a um embrião da planta.
Em alguns casos, a composição de PMP pode ser recomendada para aplicação em campos como uma quantidade de PMPs por hectare (g/ha ou kg/ha) ou a quantidade de ingrediente ativo (por exemplo, PMP com ou sem um agente funcional heterólogo) ou equivalente de ácido por hectare (kg de a.i./ha ou g de a.i./ha). Em alguns casos, uma quantidade mais baixa de agente funcional heterólogo nas presentes composições pode ser requerida para ser aplicada ao solo, meios de plantas, sementes, tecido de plantas ou plantas para se alcançarem os mesmos resultados como onde o agente funcional heterólogo é aplicado em uma composição não tendo PMPs.
Por exemplo, a quantidade de agente funcional heterólogo pode ser aplicada a níveis de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 50 ou 100 vezes (ou qualquer gama entre cerca de 2 e cerca de 100 vezes, por exemplo cerca de 2 a 10 vezes; cerca de 5 a 15 vezes, cerca de 10 a 20 vezes; cerca de 10 a 50 vezes) menos do que o mesmo agente funcional heterólogo aplicado em uma composição diferente de PMP, por exemplo, aplicação direta do mesmo agente funcional heterólogo sem PMPs.
As composições de PMP da invenção podem ser aplicadas a uma variedade de quantidades por hectare, por exemplo a cerca de 0,0001, 0,001, 0,005, 0,01, 0,1, 1, 2, 10, 100, 1.000, 2.000, 5.000 (ou qualquer gama entre cerca de 0,0001 e 5.000) kg/ha.
Por exemplo, cerca de 0,0001 a cerca de 0,01, cerca de 0,01 a cerca de 10, cerca de 10 a cerca de 1.000, cerca de 1.000 a cerca de 5.000 kg/ha.
H.
Métodos Terapêuticos As composições de PMP (por exemplo, incluindo PMPs modificados descritos aqui) podem ser também úteis em uma variedade de métodos terapêuticos.
Por exemplo, os métodos e a composição podem ser usados para a prevenção ou tratamento de infeções por patógenos em animais (por exemplo, humanos). Como usado aqui, o termo “tratamento” se refere a administrar uma composição farmacêutica a um animal para propósitos profiláticos e/ou terapêuticos. “Prevenir uma infeção” se refere ao tratamento profilático de um animal que ainda não está doente, mas que é suscetível de, ou de outro modo em risco de, uma doença particular. “Tratar uma infeção” se refere a administrar tratamento a um animal já está sofrendo de uma doença para melhorar ou estabilizar a condição do animal.
Os presentes métodos envolvem entregar as composições de PMP descritas aqui a um animal, tal como um humano.
Por exemplo é proporcionado aqui um método de tratar um animal tendo uma infeção fúngica, em que o método inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz de uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs.
Em alguns casos, o método inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz de uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs, em que a pluralidade de PMPs inclui um agente antifúngico.
Em alguns casos, o agente antifúngico é um ácido nucleico que inibe a expressão de um gene em um fungo que causa a infeção fúngica (por exemplo, Proteína de Crescimento Filamentoso Intensificado (EFG1)). Em alguns casos, a infeção fúngica é causada por Candida albicans.
Em alguns casos, a composição inclui um PMP produzido a partir de uma EV de apoplasto de Arabidopsis.
Em alguns casos, o método diminui ou elimina substancialmente a infeção fúngica.
Em outro aspecto é proporcionado aqui um método de tratar um animal tendo uma infeção bacteriana, em que o método inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz de uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs.
Em alguns casos, o método inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz de uma composição de PMP incluindo uma pluralidade de PMPs, e em que a pluralidade de PMPs inclui um agente antibacteriano (por exemplo, Anfotericina B). Em alguns casos, a bactéria é uma Streptococcus spp., Pneumococcus spp., Pseudomonas spp., Shigella spp, Salmonella spp., Campylobacter spp. ou uma Escherichia spp.
Em alguns casos, a composição inclui um PMP produzido a partir de uma EV de apoplasto de Arabidopsis.
Em alguns casos, o método diminui ou elimina substancialmente a infeção bacteriana.
Em alguns casos, o animal é um humano, um animal veterinário ou um animal de criação.
Os presentes métodos são úteis para tratar uma infeção (por exemplo, como causada por um patógeno de animais) em um animal, que se refere a administrar tratamento a um animal já sofrendo de uma doença para melhorar ou estabilizar a condição do animal.
Isto pode envolver reduzir a colonização de um patógeno em, sobre ou em torno de um animal por um ou mais patógenos (por exemplo em, cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100%) em relação a uma quantidade inicial e/ou permitir benefício para o indivíduo (por exemplo, reduzir a colonização em uma quantidade suficiente para resolver os sintomas). Em tais casos, uma infeção tratada pode se manifestar como uma diminuição nos sintomas (por exemplo, em cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100%). Em alguns casos, uma infeção tratada é eficaz para aumentar a probabilidade de sobrevivência de um indivíduo (por exemplo, um aumento na probabilidade de sobrevivência em cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100%) ou aumentar a sobrevivência global de uma população (por exemplo, um aumento na probabilidade de sobrevivência em cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100%). Por exemplo, as composições e métodos podem ser eficazes para “eliminar substancialmente” uma infeção, que se refere a uma diminuição na infeção em uma quantidade suficiente para resolver sustentavelmente os sintomas (por exemplo, durante pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses) no animal.
Os presentes métodos são úteis para prevenir uma infeção (por exemplo, como causada por um patógeno de animais), que se refere a prevenir um aumento na colonização em, sobre ou em torno de um animal por um ou mais patógenos (por exemplo, em 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% em relação a um animal não tratado) em uma quantidade suficiente para manter uma população de patógenos inicial (por exemplo, aproximadamente a quantidade encontrada em um indivíduo saudável), prevenir o início de uma infeção e/ou prevenir sintomas ou condições associadas à infeção.
Por exemplo, os indivíduos podem receber tratamento profilático para prevenir uma infeção fúngica enquanto estão sendo preparados para um procedimento médico invasivo (por exemplo, preparação para cirurgia, tal como receber um transplante, terapia com células-tronco, um enxerto, uma prótese, receber um tratamento de longo prazo ou cateterismo intravenoso frequente ou receber tratamento em uma unidade de cuidados intensivos), em indivíduos imunocomprometidos (por exemplo, indivíduos com câncer, com HIV/AIDS ou tomando agentes imunossupressores) ou em indivíduos submetidos a terapia com antibióticos a longo prazo.
A composição de PMP pode ser formulada para administração ou administrada por qualquer método adequado, incluindo, por exemplo, intravenosamente, intramuscularmente, subcutaneamente, intradermicamente, percutaneamente, intra- arterialmente, intraperitonealmente, intralesionalmente, intracranianalmente, intra-articularmente, intraprostaticamente, intrapleuralmente, intratraquealmente, intratecalmente, intravaginalmente, intrarretalmente, topicamente, intratumoralmente, peritonealmente, subconjuntivalmente, intravesicularmente, mucosalmente, intrapericardialmente, intraumbilicalmente, intraocularmente, intraorbitalmente, oralmente, topicamente, transdermicamente, intravitrealmente (por exemplo, por injeção intravítrea), por colírio, por inalação, por injeção, por implantação, por infusão, por infusão contínua, por perfusão localizada banhando as células alvo diretamente, por cateter, por lavagem, em cremes ou em composições de lipídeos.
As composições utilizadas nos métodos descritos aqui podem ser também administradas sistemicamente ou localmente.
O método de administração pode variar dependendo de vários fatores (por exemplo, o composto ou composição sendo administrado e a gravidade da condição, doença ou disfunção sendo tratada). Em alguns casos, a composição de PMP é administrada intravenosamente, intramuscularmente, subcutaneamente, topicamente, oralmente, transdermicamente, intraperitonealmente, intraorbitalmente, por implantação, por inalação, intratecalmente, intraventricularmente ou intranasalmente.
A dosagem pode ser por qualquer via adequada, por exemplo, por injeções, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é breve ou crônica.
Vários esquemas de dosagem incluindo mas não se limitando a administrações únicas ou múltiplas ao longo de vários pontos temporais, administração de bólus e infusão em pulsos são contemplados aqui.
Para a prevenção ou tratamento de uma infeção descrita aqui (quando usado sozinho ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratada, da gravidade e curso da doença, se o é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia prévia, historial clínico do paciente e resposta à composição de PMP.
A composição de PMP pode ser, por exemplo, administrada ao paciente em uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos.
Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento seria geralmente mantido até que ocorra uma supressão desejada dos sintomas da doença ou a infeção não seja mais detectável.
Tais doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo, a cada semana ou a cada duas semanas (por exemplo, tal que o paciente receba, por exemplo, de cerca de duas a cerca de vinte, doses da composição de PMP.
Pode ser administrada uma dose de carga inicial mais elevada, seguida por uma ou mais doses mais baixas.
No entanto,
outros regimes de dosagem podem ser úteis.
O progresso desta terapia é facilmente monitorizado por técnicas e ensaios convencionais.
Em alguns casos, a quantidade da composição de PMP administrada ao indivíduo (por exemplo, humano) pode estar na gama de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 5 g/kg (por exemplo, cerca de 0,01 mg/kg - 0,1 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg - 1 mg/kg, cerca de 1 mg/kg - 10 mg/kg, cerca de 10 mg/kg - 100 mg/kg, cerca de 100 mg/kg - 1 g/kg ou cerca de 1 g/kg - 5 g/kg), do peso corporal do indivíduo.
Em alguns casos, a quantidade da composição de PMP administrada ao indivíduo (por exemplo, humano) é pelo menos 0,01 mg/kg (por exemplo, pelo menos 0,01 mg/kg, pelo menos 0,1 mg/kg, pelo menos 1 mg/kg, pelo menos 10 mg/kg, pelo menos 100 mg/kg, pelo menos 1 g/kg ou pelo menos 5 g/kg), do peso corporal do indivíduo.
A dose pode ser administrada como uma dose única ou como doses múltiplas (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais do que 7 doses). Em alguns casos, a composição de PMP administrada ao animal pode ser administrada sozinha ou em combinação com um agente terapêutico adicional.
A dose do anticorpo administrado em um tratamento de combinação pode ser reduzida em comparação com um único tratamento.
O progresso desta terapia é facilmente monitorizado por técnicas convencionais.
IV.
Kits A presente invenção proporciona também um kit incluindo um recipiente tendo uma composição de PMP descrita aqui.
O kit pode incluir adicionalmente material de instrução para aplicar ou entregar a composição de PMP a uma planta de acordo com um método da presente invenção.
O especialista perito apreciará que as instruções para aplicar a composição de PMP nos métodos da presente invenção podem ser qualquer forma de instrução.
Tais instruções incluem, mas não estão limitadas a, material de instrução escrito (tal como uma etiqueta, um livreto, um panfleto), material de instrução oral (tal como em uma fita cassete ou CD) ou instruções de vídeo (tal como em uma fita de vídeo ou DVD).
EXEMPLOS O que se segue são exemplos dos métodos da invenção. É entendido que várias outras modalidades podem ser praticadas, dada a descrição geral proporcionada acima. Tabela de Conteúdos (Exemplos): Exemplo 1. Isolamento de Pacotes de Mensageiros de Plantas a partir de plantas. Exemplo 2. Produção de Pacotes de Mensageiros de Plantas (PMPs) purificados. Exemplo 3. Caracterização de Pacotes de Mensageiros de Plantas. Exemplo 4. Caracterização da estabilidade dos Pacotes de Mensageiros de Plantas. Exemplo 5. Carga de PMPs com carga. Aumento da captação celular de PMP por modificação de PMPs com Exemplo 6. proteínas de penetração de paredes celulares. Aumento da captação celular de PMP por formulação de PMPs com Exemplo 7. líquidos iônicos. Aumento da captação celular de PMP por formulação de PMPs com Exemplo 8. líquidos fluorados. Aumento da captação de PMP por formulação de PMPs com detergentes Exemplo 9. para melhorar a penetração da parede celular. Aumento da captação celular de PMP por formulação de PMPs com Exemplo 10. lipídeos zwitteriônicos. Aumento da captação celular de PMP por formulação de PMPs com Exemplo 11. lipídeos ionizáveis. Aumento da captação celular de PMP por formulação de PMPs com Exemplo 12. lipídeos catiônicos. Exemplo 13. Modificação de PMPs usando lipídeos catiônicos. Exemplo 14. Modificação de PMPs usando lipídeos ionizáveis. Modificação de PMPs com a proteína de penetração de paredes celulares Exemplo 15. celulase.
Exemplo 1: Isolamento de Pacotes de Mensageiros de Plantas a partir de plantas Este exemplo descreve o isolamento de pacotes mensageiros de plantas (PMPs) em bruto a partir de várias fontes de plantas, incluindo o apoplasto das folhas, apoplasto das sementes, raiz, fruta, vegetal, pólen, floema, seiva do xilema e meio de cultura de células de plantas.
Desenho experimental: a) Isolamento de PMP a partir do apoplasto de folhas de Arabidopsis thaliana As sementes de Arabidopsis (Arabidopsis thaliana Col-0) são esterilizadas à superfície com lixívia a 50% e plaqueadas em meio de Murashige e Skoog 0,53 contendo ágar a 0,8%. As sementes são vernalizadas durante 2 d a 4 °C antes de serem movidas para condições de dias curtos (dias de 9 h, 22 °C, 150 μEm-2). Após 1 semana, as plântulas são transferidas para Pro-Mix PGX.
As plantas são cultivadas durante 4-6 semanas antes da coleta.
Os PMPs são isolados a partir da lavagem apoplástica de rosetas de Arabidopsis com 4-6 semanas de idade, como descrito por Rutter e Innes, Plant Physiol. 173 (1): 728-741, 2017. Brevemente, rosetas inteiras são coletadas na raiz e infiltradas a vácuo com tampão de isolamento de vesículas (MES a 20 mM, CaCl2 a 2 mM e NaCl a 0,1 M, pH 6). As plantas infiltradas são cuidadosamente enxugadas para se remover fluido em excesso, colocadas dentro de seringas de 30 mL e centrifugadas em tubos cônicos de 50 mL a 700 g durante 20min a 2 °C para se coletar o fluido extracelular do apoplasto contendo EVs.
De seguida, o fluido extracelular do apoplasto é filtrado através de um filtro de 0,85 μm para se removerem as partículas grandes, e os PMPs são purificados como descrito no Exemplo 2. b) Isolamento de PMP a partir do apoplasto de sementes de girassol Sementes de girassol intactas (H. annuus L.) são embebidas em água durante 2 horas, descascadas para se remover o pericarpo, e o fluido extracelular apoplástico é extraído por um procedimento de infiltração a vácuo-centrifugação modificado, adaptado a partir de
Regente et al., FEBS Letters. 583: 3363-3366, 2009. Brevemente, as sementes são imersas em tampão de isolamento de vesículas (MES a 20 mM, CaCl2 a 2 mM e NaCl a 0,1 M, pH 6) e sujeitas a três pulsos de vácuo de 10 s, separados por intervalos de 30 s a uma pressão de 45 kPa.
As sementes infiltradas são recuperadas, secas em papel de filtro, colocadas em filtros de frita de vidro e centrifugadas durante 20 min a 400 g a 4 °C.
O fluido extracelular do apoplasto é recuperado, filtrado através de um filtro de 0,85 μm para se removerem as partículas grandes, e os PMPs são purificados como descrito no Exemplo 2. c) Isolamento de PMP a partir de raízes de gengibre Raízes de rizoma de gengibre frescas (Zingiber officinale) são adquiridas de um fornecedor local e lavadas 3x com PBS.
Um total de 200 gramas de raízes lavadas é triturado em um misturador (liquidificador Osterizer de 12 velocidades) à velocidade mais elevada durante 10 min (pausa 1 min para cada 1 min de combinação), e os PMPs são isolados como descrito em Zhuang et al., J Extracellular Vesicles. 4 (1): 28713, 2015. Brevemente, o suco de gengibre é sequencialmente centrifugado a 1.000 g durante 10 min, 3.000 g durante 20 min e 10.000 g durante 40 min para se removerem as partículas grandes do sobrenadante contendo PMP.
Os PMPs são purificados como descrito no Exemplo 2. d) Isolamento de PMP a partir de suco de toranja Toranjas frescas (Citrus × paradisi) são adquiridas de um fornecedor local, suas cascas são removidas, e a fruta é manualmente prensada ou triturada em um misturador (liquidificador Osterizer de 12 velocidades) à velocidade mais elevada durante 10 min (pausa 1 min para cada minuto de combinação) para se coletar o suco, como descrito por Wang et al., Molecular Therapy. 22 (3): 522-534, 2014 com modificações mínimas.
Brevemente, o suco/polpa de suco é sequencialmente centrifugado a 1.000 g durante 10 min, 3.000 g durante
20 min e 10.000 g durante 40 min para se removerem as partículas grandes do sobrenadante contendo PMP.
Os PMPs são purificados como descrito no Exemplo 2. e) Isolamento de PMP a partir de cabeças de brócolis Os PMPs de brócolis (Brassica oleracea var.
Italica) são isolados como previamente descrito (Deng et al., Molecular Therapy, 25 (7): 1641-1654, 2017). Brevemente, os brócolis frescos são adquiridos de um fornecedor local, lavados três vezes com PBS e triturados em um misturador (liquidificador Osterizer de 12 velocidades) à velocidade mais elevada durante 10 min (pausa 1 min para cada minuto de combinação). O suco de brócolis é depois sequencialmente centrifugado a 1.000 g durante 10 min, 3.000 g durante 20 min e 10.000 g durante 40 min para se removerem as partículas grandes do sobrenadante contendo PMP.
Os PMPs são purificados como descrito no Exemplo 2. f) Isolamento de PMP a partir de pólen de oliveira Os PMPs de pólen de oliveira (Olea europaea) são isolados como previamente descrito em Prado et al., Molecular Plant. 7 (3): 573- 577, 2014. Brevemente, o pólen de oliveira (0,1 g) é hidratado em uma câmara úmida à temperatura ambiente durante 30 min antes de ser transferido para placas de Petri (15 cm em diâmetro) contendo 20 mL de meio de germinação: sacarose a 10%, Ca(NO3)2 a 0,03%, KNO3 a 0,01%, MgSO4 a 0,02% e H3BO3 a 0,03%. O pólen é germinado a 30 °C na escuridão durante 16 h.
Os grãos de pólen são considerados germinados somente quando o tubo é mais longo do que o diâmetro do grão de pólen.
O meio de cultura contendo PMPs é coletado e limpo de detritos de pólen por duas filtrações sucessivas em filtros de 0,85 um por centrifugação.
Os PMPs são purificados como descrito no Exemplo 2. g) Isolamento de PMP a partir da seiva do floema de Arabidopsis As sementes de Arabidopsis (Arabidopsis thaliana Col-0) são esterilizadas à superfície com lixívia a 50% e plaqueadas em meio de Murashige e Skoog 0,53 contendo ágar a 0,8%. As sementes são vernalizadas durante 2 d a 4 °C antes de serem movidas para condições de dias curtos (dias de 9 h, 22 °C, 150 μEm-2). Após 1 semana, as plântulas são transferidas para Pro-Mix PGX.
As plantas são cultivadas durante 4-6 semanas antes da coleta.
A seiva do floema de folhas de roseta de Arabidopsis com 4- 6 semanas de idade é coletada como descrito por Tetyuk et al., JoVE. 80, 2013. Brevemente, as folhas são cortadas na base do pecíolo, empilhadas e colocadas em um tubo de reação contendo K2-EDTA a 20 mM durante uma hora na escuridão para prevenir o selamento da ferida.
As folhas são gentilmente removidas do recipiente, lavadas extensamente com água destilada para se remover todo o EDTA, colocadas em um tubo limpo, e a seiva do floema é coletada durante 5- 8 horas na escuridão.
As folhas são descartadas, a seiva do floema é filtrada através de um filtro de 0,85 μm para se removerem as partículas grandes, e os PMPs são purificados como descrito no Exemplo 2. h) Isolamento de PMP a partir da seiva do xilema do tomate Sementes de tomate (Solanum lycopersicum) são plantadas em um único vaso em solo rico orgânico, tal como Sunshine Mix (Sun Gro Horticulture, Agawam, MA) e mantidas em uma estufa entre 22 °C e 28 °C.
Cerca de duas semanas após germinação, na etapa de duas folhas verdadeiras, as plântulas são transplantadas individualmente para vasos (10 cm de diâmetro e 17 cm de profundidade) preenchidos com solo arenoso estéril contendo areia a 90% e mistura orgânica a 10%. As plantas são mantidas em uma estufa a 22-28 °C durante quatro semanas.
A seiva do xilema de tomateiros com 4 semanas de idade é coletada como descrito por Kohlen et al., Plant Physiology. 155 (2): 721- 734, 2011. Brevemente, os tomateiros são decapitados acima do hipocótilo, e um anel de plástico é colocado em torno do caule.
A seiva do xilema acumulada é coletada durante 90 minutos após decapitação.
A seiva do xilema é filtrada através de um filtro de 0,85 μm para se removerem as partículas grandes, e os PMPs são purificados como descrito no Exemplo 2. i) Isolamento de PMP a partir do meio de cultura de células BY-2 do tabaco Células de tabaco BY-2 (Nicotiana tabacum L cv.
Bright Yellow 2) são cultivadas na escuridão a 26 °C, em um agitador a 180 rpm em meio de cultura MS (Murashige e Skoog, 1962) BY-2 (pH 5,8) compreendendo sais de MS (Duchefa, Haarlem, Países Baixos, em # M0221) suplementado com sacarose a 30 g/L, di-hidrogenofosfato de potássio a 2,0 mg/L, mio-inositol a 0,1 g/L, ácido 2,4-diclorofenoxiacético a 0,2 mg/L e tiamina HCl a 1 mg/L.
As células BY-2 são subcultivadas semanalmente por transferência de 5% (v/v) de uma cultura de células com 7 dias de idade para 100 mL de meio líquido fresco.
Após 72-96 horas, o meio cultivado BY-2 é coletado e centrifugado a 300 g a 4 °C durante 10 minutos para se removerem as células.
O sobrenadante contendo PMPs é coletado e limpo de detritos por filtração em filtro de 0,85 um.
Os PMPs são purificados como descrito no Exemplo 2. Exemplo 2: Produção de Pacotes de Mensageiros de Plantas (PMPs) purificados Este exemplo descreve a produção de PMPs purificados a partir de frações de PMP em bruto como descrito no Exemplo 1, usando ultrafiltração combinada com cromatografia por exclusão de tamanhos, um gradiente de densidade (iodixanol ou sacarose) e a remoção de agregados por precipitação ou cromatografia por exclusão de tamanhos.
Desenho experimental: a) Produção de PMPs de toranja purificados usando ultrafiltração combinada com cromatografia por exclusão de tamanhos A fração de PMP de toranja em bruto do Exemplo 1a é concentrada usando filtro de rotação Amicon com limiar de exclusão de peso molecular (MWCO) de 100 kDA (Merck Millipore). Subsequentemente, a solução de PMP em bruto concentrada é carregada em uma coluna de cromatografia por exclusão de tamanhos PURE-EV (HansaBioMed Life Sciences Ltd) e isolada de acordo com as instruções do fabricante.
As frações contendo PMP purificadas são agrupadas após eluição.
Opcionalmente, os PMPs podem ser adicionalmente concentrados usando um filtro de rotação Amicon com MWCO de 100 kDa ou por Filtração de Fluxo Tangencial (TFF). Os PMPs purificados são analisados como descrito no Exemplo 3. b) Produção de PMPs de apoplasto de Arabidopsis purificados usando um gradiente de iodixanol Os PMPs de apoplasto de folhas de Arabidopsis em bruto são isolados como descrito no Exemplo 1a, e os PMPs purificados são produzidos por uso de um gradiente de iodixanol como descrito em Rutter e Innes, Plant Physiol. 173 (1): 728-741, 2017. Para se prepararem gradientes descontínuos de iodixanol (OptiPrep; Sigma- Aldrich) são criadas soluções de iodixanol a 40% (v/v), 20% (v/v), 10% (v/v) e 5% (v/v) por diluição de uma solução de estoque aquosa de OptiPrep a 60% em tampão de isolamento de vesículas (VIB; MES a 20 mM, CaCl2 a 2 mM e NaCl a 0,1 M, pH 6). O gradiente é formado por colocação em camadas de 3 mL de solução a 40%, 3 mL de solução a 20%, 3 mL de solução a 10% e 2 mL de solução a 5%. A solução de PMP de apoplasto em bruto do Exemplo 1a é centrifugada a 40.000 g durante 60 min a 4 °C.
O pélete é ressuspenso em 0,5 mL de VIB e colocado em camadas no topo do gradiente.
A centrifugação é realizada a 100.000 g durante 17 h a 4 °C.
Os primeiros 4,5 mL no topo do gradiente são descartados e, subsequentemente, 3 volumes de 0,7 mL que contêm os PMPs do apoplasto são coletados, trazidos para 3,5 mL com VIB e centrifugados a 100.000 g durante 60 min a 4 °C.
Os péletes são lavados com 3,5 mL de VIB e repeletizados usando as mesmas condições de centrifugação.
Os péletes de PMP purificados são combinados para análise subsequente, como descrito no Exemplo 3. c) Produção de PMPs de toranja purificados usando um gradiente de sacarose Os PMPs de suco de toranja em bruto são isolados como descrito no Exemplo 1d, centrifugados a 150.000 g durante 90 min, e o pélete contendo PMP é ressuspenso em 1 mL de PBS como descrito (Mu et al., Molecular Nutrition & Food Research. 58 (7): 1561-1573, 2014). O pélete ressuspenso é transferido para um gradiente de passos de sacarose (8%/15%/30%/45%/60%) e centrifugado a 150.000 g durante 120 min para produzir PMPs purificados.
Os PMPs de toranja purificados são coletados a partir da interface a 30%/45% e, subsequentemente, analisados, como descrito no Exemplo 3. d) Remoção de agregados a partir de PMPs de toranja De modo a se removerem agregados de proteína de PMPs de toranja produzidos como descrito no Exemplo 1d ou PMPs purificados do Exemplo 2a-c, um passo de purificação adicional pode ser incluído.
A solução de PMP produzida é submetida a uma gama de pHs para se precipitarem agregados de proteína em solução.
O pH é ajustado até 3, 5, 7, 9 ou 11 com a adição de hidróxido de sódio ou ácido clorídrico.
O pH é medido usando uma sonda de pH calibrada.
Logo que a solução esteja ao pH especificado, ela é filtrada para se removerem os particulados.
Alternativamente, a solução de PMP isolada pode ser floculada usando a adição de polímeros carregados, tais como Polymin- P ou Praestol 2640. Brevemente, 2-5 g de Polymin-P ou Praestol 2640 são adicionados à solução e misturado com um impulsor.
A solução é depois filtrada para se removerem os particulados.
Alternativamente, os agregados são solubilizados por aumento da concentração de sal.
NaCl é adicionado à solução de PMP até estar a 1 mol/L.
A solução é depois filtrada para se purificarem os PMPs.
Alternativamente, os agregados são solubilizados por aumento da temperatura.
A mistura de PMP isolada é aquecida sob agitação até ter alcançado uma temperatura uniforme de 50 °C durante 5 minutos.
A mistura de PMP é depois filtrada para se isolarem os PMPs.
Alternativamente, os contaminantes solúveis de soluções de PMP são separados por coluna de cromatografia por exclusão de tamanhos de acordo com procedimentos padrão, onde os PMPs eluem nas primeiras frações, ao passo que as proteínas e as ribonucleoproteínas e algumas lipoproteínas são eluídas mais tarde.
A eficiência da remoção de agregados de proteína é determinada por medição e comparação da concentração de proteína antes da e após remoção de agregados de proteína através da quantificação de proteínas BCA/Bradford.
Os PMPs produzidos são analisados como descrito no Exemplo 3. Exemplo 3: Caracterização de Pacotes de Mensageiros de Plantas Este exemplo descreve a caracterização de PMPs produzidos como descrito no Exemplo 1 ou Exemplo 2. Desenho experimental: a) Determinação da concentração de PMP A concentração de partículas de PMP é determinada por Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA) usando um Malvern NanoSight, ou por Sensor de Pulso Resistente Ajustável (TRPS) usando um iZon qNano, seguindo as instruções do fabricante.
A concentração de proteína de PMPs purificados é determinada por uso do ensaio DC Protein (Bio-Rad). A concentração de lipídeos de PMPs purificados é determinada usando um corante lipofílico fluorescente, tal como DiOC6 (ICN Biomedicals), como descrito por Rutter e Innes, Plant Physiol. 173 (1): 728-741, 2017. Brevemente, os péletes de PMP purificados do
Exemplo 2 são ressuspensos em 100 mL de DiOC6 a 10 mM (ICN Biomedicals) diluído com tampão de MES (MES a 20 mM, pH 6) mais cocktail de inibidor de protease de plantas a 1% (Sigma-Aldrich) e dissulfeto de 2,29-dipiridila a 2 mM.
Os PMPs ressuspensos são incubados a 37 ºC durante 10 min, lavados com 3 mL de tampão de MES, repeletizados (40.000 g, 60 min, a 4 °C) e ressuspensos em tampão de MES fresco.
A intensidade de fluorescência de DiOC6 é medida à excitação de 485 nm e à emissão de 535 nm. b) Caracterização biofísica e molecular de PMPs Os PMPs são caracterizados por microscopia eletrônica e crioeletrônica em um microscópio eletrônico de transmissão JEOL 1010, seguindo o protocolo de Wu et al., Analyst. 140 (2): 386-406, 2015. O tamanho e o potencial zeta dos PMPs são também medidos usando um Malvern Zetasizer ou iZon qNano, seguindo as instruções do fabricante.
Os lipídeos são isolados a partir de PMPs usando extração com clorofórmio e caracterizados com LC-MS/MS como demonstrado em Xiao et al.
Plant Cell. 22 (10): 3193-3205, 2010. Os lipídeos de glicosil inositol fosforilceramidas (GIPCs) são extraídos e purificados como descrito por Cacas et al., Plant Physiology. 170: 367-384, 2016, e analisados por LC-MS/MS como descrito acima.
O RNA total, DNA e proteína são caracterizados usando Kits Quant-It da Thermo Fisher de acordo com as instruções.
As proteínas nos PMPs são caracterizadas por LC-MS/MS seguindo o protocolo em Rutter e Innes, Plant Physiol. 173 (1): 728-741, 2017. O RNA e o DNA são extraídos usando Trizol, preparados em bibliotecas com o kit TruSeq Total RNA with Ribo-Zero Plant e o Kit Nextera Mate Pair Library Prep da Illumina e sequenciados em um Illumina MiSeq seguindo as instruções do fabricante.
Exemplo 4: Caracterização da estabilidade dos Pacotes de Mensageiros de Plantas Este exemplo descreve a medição da estabilidade de PMPs sob uma ampla variedade de condições de armazenamento e fisiológicas.
Desenho experimental: Os PMPs produzidos como descrito nos Exemplos 1 e 2 são sujeitos a várias condições.
Os PMPs são suspensos em água, sacarose a 5% ou PBS e deixados durante 1, 7, 30 e 180 dias a -20 ºC, 4 °C, 20 °C e 37 °C.
Os PMPs são também suspensos em água e secos usando um sistema de evaporador rotativo e deixados durante 1, 7 e 30 e 180 dias a 4 °C, 20 °C e 37 °C.
Os PMPs são também suspensos em água ou solução de sacarose a 5%, congelados em nitrogênio líquido e liofilizados.
Após 1, 7, 30 e 180 dias, os PMPs secos e liofilizados são depois ressuspensos em água.
As três experiências prévias com condições a temperaturas acima de 0 ºC foram também expostas a um simulador de luz solar artificial de modo a se determinar a estabilidade do conteúdo em condições de UV externas simuladas.
Os PMPs são também sujeitos a temperaturas de 37 °C, 40 ºC, 45 °C, 50 °C e 55 °C durante 1, 6 e 24 horas em soluções tamponadas com um pH de 1, 3, 5, 7, e 9 com ou sem adição de 1 unidade de tripsina ou em outros fluidos gástricos simulados.
Após cada um destes tratamentos, os PMPs são trazidos de volta a 20 °C, neutralizados até pH 7,4 e caracterizados usando alguns dos ou todos os métodos descritos no Exemplo 3. Exemplo 5. Carga de PMPs com carga Este exemplo descreve métodos de carga de PMPs com moléculas pequenas, proteínas e ácidos nucleicos para usar como sondas para determinar a eficiência de captação de PMP em plantas. a) Carga de moléculas pequenas em PMPs Os PMPs são produzidos como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Para carregar moléculas pequenas em PMPs, os PMPs são colocados em solução de PBS com a molécula pequena na forma sólida ou solubilizada.
A solução é deixada durante 1 hora a 22 °C, de acordo com o protocolo em Sun, Mol.
Ther., 2010. Alternativamente, a solução é sonicada para induzir poração e difusão nos exossomos de acordo com o protocolo de Wang et al., Nature Comm., 2013. Alternativamente, os PMPs são eletroporados de acordo com o protocolo de Wahlgren et al.
Nucl.
Acids.
Res. 2012. Alternativamente, os lipídeos de PMP são isolados por adição de 3,75 mL de MeOH:CHCl3 2:1 (v/v) a 1 mL de PMPs em PBS e são submetidos a vórtex.
CHCl3 (1,25 mL) e ddH2O (1,25 mL) são adicionados sequencialmente e submetidos a vórtex.
A mistura é depois centrifugada a 2.000 r.p.m. durante 10 min a 22 °C em tubos de vidro para separar a mistura em duas fases (fase aquosa e fase orgânica). A amostra da fase orgânica contendo os lipídeos de PMP é seca por aquecimento sob nitrogênio (2 psi). Para produzir PMPs carregados com moléculas pequenas, os lipídeos de PMP isolados são misturados com a solução de moléculas pequenas e passados através de uma extrusora de lipídeos de acordo com o protocolo de Haney et al., J Contr Rel., 2015. Antes do uso, os PMPs carregados são purificados usando métodos como descrito no Exemplo 2 para remover moléculas pequenas não ligadas.
Os PMPs carregados são caracterizados como descrito no Exemplo 3, e sua estabilidade é testada como descrito no Exemplo 4. b) Carga de proteínas ou peptídeos em PMPs Os PMPs são produzidos como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Para carregar proteínas ou peptídeos em PMPs, os PMPs são colocados em solução com a proteína ou peptídeo em PBS.
Se a proteína ou peptídeo for insolúvel, o pH é ajustado até ser solúvel.
Se a proteína ou peptídeo ainda for insolúvel, a proteína ou peptídeo insolúvel é usado.
A solução é depois sonicada para induzir poração e difusão nos PMPs de acordo com o protocolo de Wang et al., Nature Comm., 2013. Alternativamente, os PMPs são eletroporados de acordo com o protocolo de Wahlgren et al.
Nucl.
Acids.
Res. 2012. Alternativamente, os lipídeos de PMP são isolados por adição de 3,75 mL de MeOH:CHCl3 2:1 (v/v) a 1 mL de PMPs em PBS e são submetidos a vórtex.
CHCl3 (1,25 mL) e ddH2O (1,25 mL) são adicionados sequencialmente e submetidos a vórtex.
A mistura é depois centrifugada a 2.000 r.p.m. durante 10 min a 22 °C em tubos de vidro para separar a mistura em duas fases (fase aquosa e fase orgânica). A amostra da fase orgânica contendo os lipídeos de PMP é seca por aquecimento sob nitrogênio (2 psi). Para produzir PMPs carregados com moléculas pequenas, os lipídeos de PMP isolados são misturados com a solução de moléculas pequenas e passados através de uma extrusora de lipídeos de acordo com o protocolo de Haney et al., J Contr Rel., 2015. Antes do uso, os PMPs carregados são purificados usando os métodos como descrito no Exemplo 2 para remover peptídeos e proteína não ligados.
Os PMPs carregados são caracterizados como descrito no Exemplo 3, e sua estabilidade é testada como descrito no Exemplo 4. Para se medir a carga da proteína ou peptídeo, o Ensaio Pierce Quantitative Colorimetric Peptide é usado em uma pequena amostra de PMPs carregados e não carregados. c) Carga de ácidos nucleicos em PMPs Os PMPs são produzidos como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Para carregar ácidos nucleicos em PMPs, os PMPs são colocados em solução com o ácido nucleico em PBS.
A solução é depois sonicada para induzir poração e difusão nos PMPs de acordo com o protocolo de Wang et al., Nature Comm., 2013. Alternativamente, os PMPs são eletroporados de acordo com o protocolo de Wahlgren et al.
Nucl.
Acids.
Res. 2012.
Alternativamente, os lipídeos de PMP são isolados por adição de 3,75 mL de MeOH:CHCl3 2:1 (v/v) a 1 mL de PMPs em PBS e são submetidos a vórtex.
CHCl3 (1,25 mL) e ddH2O (1,25 mL) são adicionados sequencialmente e submetidos a vórtex.
A mistura é depois centrifugada a 2.000 r.p.m. durante 10 min a 22 °C em tubos de vidro para separar a mistura em duas fases (fase aquosa e fase orgânica). A amostra da fase orgânica contendo os lipídeos de PMP é seca por aquecimento sob nitrogênio (2 psi). Para produzir PMPs carregados com moléculas pequenas, os lipídeos de PMP isolados são misturados com a solução de moléculas pequenas e passados através de uma extrusora de lipídeos de acordo com o protocolo de Haney et al., J Contr Rel., 2015. Antes do uso, os PMPs são purificados usando os métodos como descrito no Exemplo 2 para remover ácidos nucleicos não ligados.
Os PMPs carregados são caracterizados como descrito no Exemplo 3, e sua estabilidade é testada como descrito no Exemplo 4. Os ácidos nucleicos que são carregados nos PMPs são quantificados usando um ensaio Quant-It da Thermo Fisher seguindo as instruções do fabricante, ou a fluorescência é quantificada com um leitor de placa se os ácidos nucleicos forem fluorescentemente marcados.
Exemplo 6. Aumento da captação celular de PMP por modificação de PMPs com proteínas de penetração de paredes celulares Este exemplo descreve o aumento da captação celular de PMPs em células vegetais, fúngicas ou bacterianas, por modificação dos PMPs com celulase para facilitar a degradação de componentes da parede celular.
Em este exemplo, a celulase é usada como uma enzima degradante da parede celular modelo, PMPs de toranja como PMP modelo, algodão como uma planta modelo, Saccharomyces cerevisiae como uma levedura modelo, S. sclerotiorum como um fungo modelo e Pseudomonas syringae como uma bactéria modelo.
Protocolo Experimental: a) Síntese de celulase-PEG4-azida A celulase (Sigma Aldrich) é reagida com NHS-PEG4-azida (ThermoFisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante.
Brevemente, a proteína é dissolvida em PBS a uma concentração de >5 mg/mL, e a NHS-PEG4-azida é dissolvida em um volume de DMF igual a 10% do volume da proteína em um excesso molar de 10x em relação à proteína.
As duas soluções são depois misturadas e mantidas em gelo durante 2 horas.
A reação é depois parada por adição de Tris-HCl a 1 M até uma concentração final de 100 mM.
O tubo é colocado em gelo durante 15 minutos para se extinguir totalmente e, depois, a troca de tampões é realizada usando colunas de dessalinização giratória Zeba. b) Modificação de PMPs com celulase DSPE-PEG2000-DBCO é dissolvido em clorofórmio, vertido em um tubo de teste e seco a vácuo de modo a formar um filme fino.
É depois ressuspenso em PBS em soluções a 1%, 5%, 10%, 20% e 50% p/v para criar pequenas micelas.
Uma quantidade equimolar da celulase-PEG4-azida é adicionada à solução.
A solução é deixada a reagir durante 16 horas a 4 °C.
De seguida, a solução é combinada com PMPs produzidos nos Exemplos 1 e 2 e misturada através de uma extrusora de acordo com o protocolo de Haney et al., J Contr.
Rel., 2015. Uma quantidade suficiente de celulase é ligada aos PMPs desta maneira para aumentar a penetração das paredes celulares sem aumentar a toxicidade.
Alternativamente, outros métodos para modificar o exterior de PMPs são usados como descrito em Spanedda et al., Methods Mol Bio, 2016. Os PMPs resultantes são purificados usando ultracentrifugação ou cromatografia por exclusão de tamanhos como descrito no Exemplo 2 e caracterizados e testados quanto à estabilidade usando os métodos no Exemplo 3 e Exemplo 4. A atividade de celulase é medida usando o kit fluorometric Cellulase Activity Assay (Abcam) seguindo o protocolo do fabricante. c) Captação de PMP aumentada por Saccharomyces cerevisiae com PMPs de toranja modificados com celulase carregados com proteína
GFP Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2 e são carregados com proteína GFP como descrito no Exemplo 5. Alguns dos PMPs são separados como controles, e o resto é modificado com celulase como descrito no Exemplo 6b. A encapsulação de GFP de PMPs é medida por transferência de Western ou fluorescência. Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações. Brevemente, 50 mg de PMPs em 1 mL de C diluído do kit de marcação PKH26 são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37 ºC durante 5 min. A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por métodos descritos no Exemplo 2, e os péletes de PMP marcados são ressuspensos em PBS. Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com GFP versus PMPs marcados com PKH26 modificados com celulase carregados com GFP, células fúngicas de Saccharomyces cerevisiae são tratadas. Saccharomyces cerevisiae é obtida a partir da ATCC (#9763) e mantida a 30 °C em caldo de extrato de levedura, peptona e dextrose (YPD) como indicado pelo fabricante. Para se determinar a captação de PMP por S. cerevisiae, as células de levedura são cultivadas até uma OD600 de 0,4–0,6 em meio de seleção e incubadas com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs modificados carregados com GFP marcados com PKH26 diretamente em lâminas de vidro. Adicionalmente a um controle de PBS, as células de S.
cerevisiae são incubadas na presença de corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL). Após incubação de 5 min, 30 min e 1 h à temperatura ambiente são adquiridas imagens em um microscópio de fluorescência de elevada resolução.
Os PMPs são captados por células de levedura quando membrana vermelha e PMPs carregados com GFP verdes são observados no citoplasma ou se o citoplasma da célula de levedura fica vermelho e/ou verde, versus a coloração exclusiva da membrana celular pelo corante PKH26. Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs modificados com celulase carregados com GFP em comparação com os PMPs carregados com GFP não modificados, a percentagem de células de levedura com um citoplasma verde/PMPs verdes no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs modificados com celulase carregados com GFP é comparada com os PMPs carregados com GFP não modificados. d) Captação de PMP aumentada por S. sclerotiorum com PMPs de toranja modificados com celulase carregados com proteína GFP Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2 e são carregados com proteína GFP como descrito no Exemplo 5. Alguns dos PMPs são separados como controles, e o resto é modificado com celulase como descrito no Exemplo 6b.
A encapsulação de GFP de PMPs é medida por transferência de Western ou fluorescência.
Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações.
Brevemente, 50 mg de PMPs em 1 mL de C diluído são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37ºC durante 5 min.
A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por métodos descritos no Exemplo 2, e os péletes de PMP marcados são ressuspensos em PBS.
Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com GFP versus PMPs marcados com PKH26 modificados com celulase carregados com GFP, células fúngicas de S. sclerotiorum são tratadas.
Para se determinar a captação de PMP por ascósporos de S. sclerotiorum (ATCC, # 18687), 10.000 ascósporos são incubados com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs modificados carregados com GFP marcados com PKH26 ou PMPs não modificados diretamente em lâminas de vidro.
Adicionalmente a um controle de PBS, as células de S. sclerotiorum são incubadas na presença de corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL). Após incubação de 5 min, 30 min e 1 h à temperatura ambiente são adquiridas imagens em um microscópio de fluorescência de elevada resolução.
Os PMPs são captados por células de levedura quando membrana vermelha e PMPs carregados com GFP verdes são observados no citoplasma ou se o citoplasma da célula de levedura fica vermelho e/ou verde, versus a coloração exclusiva da membrana celular pelo corante PKH26. Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs modificados com celulase carregados com GFP em comparação com os PMPs carregados com GFP não modificados, a percentagem de células de S. sclerotiorum com um citoplasma verde/PMPs verdes no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs modificados com celulase carregados com GFP é comparada com os PMPs carregados com GFP não modificados. e) Captação de PMP aumentada por Pseudomonas syringae com PMPs de toranja modificados com celulase carregados com Calceína AM Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Alguns dos PMPs são separados como controles, e o resto é modificado com celulase como descrito no Exemplo 6b.
Os PMPs modificados e não modificados são carregados com Calceína AM (Sigma Aldrich) como descrito no Exemplo 5 e Gray et al., Methods X 2015. A Calceína AM é fluorescente somente quando encapsulada por PMPs, e a encapsulação é medida por fluorescência.
Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações.
Brevemente, 50 mg de PMPs carregados com Calceína AM em 1 mL de C diluído são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37 ºC durante 5 min.
A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por lavagem e os PMPs são concentrados usando um filtro Amicon de 100 kDa como descrito no Exemplo 2. Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM versus PMPs modificados com celulase marcados com PKH26 carregados com Calceína AM, células bacterianas de Pseudomonas syringae são tratadas.
As bactérias Pseudomonas syringae são obtidas a partir da ATCC (BAA-871) e cultivadas em ágar B de Meio de King de acordo com as instruções do fabricante.
Para se determinar a captação de PMP por P. syringae, 10 uL de uma suspensão bacteriana de 1 mL durante a noite são incubados com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs não modificados e modificados com celulase marcados com PKH26 carregados com Calceína AM marcados com PKH26 diretamente em uma lâmina de vidro.
Adicionalmente a um controle de água, as bactérias P. syringae são incubadas na presença de Calceína AM (concentração final 5 μg/mL), corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL) e PMPs não modificados.
Após incubação de 5 min, 30 min e 1 h à temperatura ambiente são adquiridas imagens em um microscópio de fluorescência de elevada resolução.
Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs modificados com celulase marcados com PKH26 carregados com Calceína AM em comparação com os PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM não modificados, a percentagem de células bacterianas com um citoplasma verde ou PMPs verdes e vermelhos no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs modificados com celulase marcados com PKH26 carregados com Calceína AM é comparada com os PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM não modificados.
A modificação de celulase de PMPs melhora a captação celular eficientemente em comparação com PMPs não modificados. f) Captação aumentada de PMP de PMPs de toranja modificados com celulase carregados com dsRNA visando CLA1 em plantas de algodão Para demonstrar um aumento na captação celular por PMPs modificados com celulase, os PMPs de toranja são carregados com miRNAs artificiais (amiRNAs, desenhados usando Plant Small RNA Maker Site (P-SAMS; Fahlgren et al., Bioinformatics. 32 (1): 157-158, 2016)) ou siRNA de substrato de dicer customizado (DsiRNA, desenhado pela IDT) visando o gene de fotossíntese do algodão GrCLA1 (1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato sintase). GrCLA1 é um gene homólogo do gene Arabidopsis Cloroplastos alterado 1 (AtCLA1), cuja perda de função resulta em um fenótipo albino nas folhas verdadeiras, proporcionando um marcador visual da eficiência de silenciamento.
Os oligonucleotídeos são obtidos a partir da IDT.
Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs modificados com celulase versus não modificados, os PMPs de toranja são carregados com dúplexes GrCLA1-amiRNA ou GrCLA1-DsiRNA (Tabela 12), como descrito no Exemplo 5. A encapsulação de amiRNA ou DsiRNA de PMPs é medida usando o kit Quant-It RiboGreen RNA assay ou usando um amiRNA ou DsiRNA marcado com corante fluorescente de controle (IDT). De seguida, parte dos PMPs carregados é separada como controles, e o resto é modificado com celulase como descrito no Exemplo 6b.
Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs carregados com CLA1-amiRNA/DsiRNA versus PMPs modificados com celulase carregados com CLA1-amiRNA/DsiRNA, plântulas de algodão são tratadas e analisadas quanto ao silenciamento do gene CLA1. PMPs carregados com amiRNA ou DsiRNA (coletivamente referidos como dsRNA) são formulados em água até uma concentração que entrega um equivalente a uma dose eficaz de dsRNA de 0, 1, 5, 10 e 20 ng/μL em água estéril.
Sementes de algodão (Gossypium hirsutum e Gossypium raimondii) são obtidas através do US National Plant Germplasm System.
As sementes esterilizadas são envolvidas em algodão absorvente úmido, colocadas em placas de Petri e colocadas em uma câmara de crescimento a 25 °C, 150 μE m-2 S-1 de intensidade de luz, com um fotoperíodo 14 horas de luz/10 horas de escuridão durante 3 dias para germinarem.
As plântulas são cultivadas em vasos de cultura estéreis com solução de nutrientes de Hoagland (Sigma Aldrich) sob condições de dias longos (fotoperíodo de luz/escuridão de 16/8 h) com temperaturas de dia/noite de 26/20 °C.
Após 4 dias, as plântulas com cotilédones totalmente expandidos (antes de a primeira folha verdadeira ter aparecido) são usadas para tratamentos com PMP.
As plântulas de algodão com sete dias de idade são transferidas para sais minerais de Murashige e Skoog (MS) 0,5 x (Sigma Aldrich) com 1 x vitaminas MS (Sigma Aldrich) pH 5,6-5,8, com agarose a 0,8% (p/v) e são tratadas com uma dose eficaz de 0 (ddH2O), 1, 5, 10 e 20 ng/μL de PMPs modificados com celulase carregados com dsRNA de GrCLA1 e 0 (ddH2O), 1, 5, 10 e 20 ng/μL de PMPs não modificados carregados com dsRNA de GrCLA1 por pulverização da plântula inteira, 1 mL de solução por planta, com 3 plantas por grupo.
Alternativamente, antes do tratamento com PMP, o lado inferior dos cotilédones da planta de algodão é perfurado com uma agulha de 25 G sem perfurar através dos cotilédones.
As soluções de PMP são infiltradas manualmente a partir do lado inferior dos cotilédones através dos locais da ferida usando uma seringa sem agulha de 1 mL.
As plantas são transferidas para uma câmara de crescimento e mantidas sob condições de dias longos (fotoperíodo de luz/escuridão de 16 h/8 h) com intensidade de luz de 90 μmol m−2 s−1 e temperaturas de dia/noite de 26/20 ºC.
Após 2, 5, 8 e 14 dias, a eficiência de silenciamento gênico do dsRNA de CLA1 é examinada pelo nível de expressão de mRNA endógeno de CLA1 usando reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR). O RNA total é extraído a partir de 100 mg de folhas frescas de algodão usando reagente Trizol de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen) e tratado extensivamente com DNase I isenta de RNase (Promega). O cDNA da primeira fita é sintetizado a partir de 2 µg de RNA total com o sistema SuperScriptTM First-Strand Synthesis (Invitrogen). Para se estimarem os níveis de transcritos de CLA1, a qRT-PCR é realizada usando SYBR Green Real-Time PCR Master Mix (Thermo Scientific) com iniciadores:
GrCLA1q1_F 5'-CCAGGTGGGGCTTATGCATC-3' (SEQ ID NO: 7), GrCLA1q1_R 5'-CCACACCAAGGCTTGAACCC-3' (SEQ ID NO: 8) e GrCLA1q2_F 5'-GGCCGGATTCACGAAACGGT-3' (SEQ ID NO: 9), GrCLA1q2_R 5'-CGTCGAGATTGGCAGTTGGC-3' (SEQ ID NO: 10) e 18s RNA_F 5'-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3' (SEQ ID NO: 11), 18s RNA_ R 5'-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3' (SEQ ID NO: 12), usando o seguinte programa: (a) 95 °C durante 5 min; (b) 40 ciclos de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s; e 72 °C durante 30 s.
O gene de 18S rRNA é usado como controle interno para normalizar os resultados.
A eficiência de silenciamento de CLA1 em algodão após tratamento com PMPs modificados com celulase carregados com CLA1-dsRNA e PMPs não modificados carregados com CLA1-dsRNA é determinada por cálculo do valor ΔΔCt, comparando a expressão de CLA1 normalizada após tratamento com PMPs modificados com celulase com a expressão de CLA1 normalizada após tratamento com PMPs não modificados.
Adicionalmente, a eficiência de silenciamento gênico de dsRNA de CLA1 é examinada por análise de fotobranqueamento fenotípico.
Folhas de plantas de algodão tratadas e não tratadas são fotografadas, e o software ImageJ é usado para determinar a percentagem de silenciamento gênico, que é refletida por fotobranqueamento branco na folha versus a cor verde da folha de controle.
Três folhas por planta são avaliadas para se quantificar o efeito do fotobranqueamento, e a eficiência de silenciamento gênico de PMPs carregados com CLA1-dsRNA modificados com celulase versus não modificados é avaliada.
Os PMPs modificados com celulase são captados mais eficientemente pelas células vegetais e induzem maior silenciamento do gene CLA1 em comparação com os PMPs não modificados.
Tabela 12. GrCLA1-amiRNA e GrCLA1-DsiRNA
Nome do Sequência de Espécies Tipo Nome dsRNA (5'-3') dsRNA* (5'-3') gene referência
UGGCAACAAUAUU GACAAAAAGAUUGU Gossypium CotAD_74769_B amiRNA_ GhCLA1 amiRNA UUUGUCUC (SEQ UGCCACA (SEQ ID hirsutum GI-AD1_v1,0 GhCL-1 ID NO: 13) NO: 14)
UUAGUACCCUGCC GGCAAAGGAAGGGU Gossypium CotAD_74769_B amiRNA_ GhCLA1 amiRNA UUUGCCAU(SEQ ID ACUAACA (SEQ ID hirsutum GI-AD1_v1,0 GhCL-2 NO: 15) NO: 16)
UACUUCGUGUGAC GGCAAAGUAACACG Gossypium CotAD_74769_B amiRNA_ GhCLA1 amiRNA UUUGCCAC(SEQ ID AAGUACA(SEQ ID NO: hirsutum GI-AD1_v1,0 GhCL-3 NO: 17) 18)
UGGCAACAAUAUU GACAAAAAGAUUGU Gossypium amiRNA_ GrCLA1 XM_012600276 amiRNA UUUGUCUC (SEQ UGCCACA(SEQ ID raimondii GrCL-1 ID NO: 19) NO: 20)
UCAGUACCCUGCC GGCAAAGGAAGGGU Gossypium amiRNA_ GrCLA1 XM_012600276 amiRNA UUUGCCAU (SEQ ID ACUGACA(SEQ ID NO: raimondii GrCL-2 NO: 21) 22)
UACUUCGUGUGAC GGCAAAGUAACACG Gossypium amiRNA_ GrCLA1 XM_012600276 amiRNA UUUGCCAC(SEQ ID AAGUACA(SEQ ID NO: raimondii GrCL-3 NO: 23) 24)
UUAGUGGCCAUCA GCCUGUUGCUGGCC Gossypium amiRNA_ GhCLA1 GALV01059036 amiRNA ACAGGCCG (SEQ ACUAACA(SEQ ID NO: hirsutum GhCL-4 ID NO: 25) 26)
UAUCGAUGUUAGU GUGGCCACGAACAU Gossypium amiRNA_ GhCLA1 GALV01059036 amiRNA GGCCACCU(SEQ ID CGAUACA(SEQ ID NO: hirsutum GhCL-5 NO:27) 28)
UACCGGUACCCGU GAAACAACUGGUAC Gossypium amiRNA_ GhCLA1 GALV01059036 amiRNA UGUUUCAC(SEQ ID CGGUACA (SEQ ID hirsutum GhCL-6 NO: 29) NO: 30)
CAGUCCACUUAGU CUUGAUGAUGAUAC Gossypium DsiRNA_ GrCLA1 XM_012600276 DsiRNA AUCAUCAUCAAG UAAGUGGACUGUG raimondii GrCL-1 (SEQ ID NO: 31) (SEQ ID NO: 32)
GUCCACUUAGUAU UGCUUGAUGAUGAU Gossypium DsiRNA_ GrCLA1 XM_012600276 DsiRNA CAUCAUCAAGCA ACUAAGUGGACUG raimondii GrCL-2 (SEQ ID NO: 33) (SEQ ID NO: 34) Gossypium DsiRNA_ AGUCCACUUAGUA GrCLA1 XM_012600276 DsiRNA raimondii GrCL-3 UCAUCAUCAAGC GCUUGAUGAUGAUA
Nome do Sequência de Espécies Tipo Nome dsRNA (5'-3') dsRNA* (5'-3') gene referência (SEQ ID NO: 35) CUAAGUGGACUGU (SEQ ID NO: 36)
AAUCUUUCAUUGA AAGGCUAUCCAAUC Gossypium DsiRNA_ GrCLA1 XM_012600276 DsiRNA UUGGAUAGCCTT AAUGAAAGAUUUA raimondii GrCL-4 (SEQ ID NO: 37) (SEQ ID NO: 38)
CAACAACCUUACG UGUGAUAUUACUCG Gossypium DsiRNA_ GrCLA1 XM_012600276 DsiRNA AGUAAUAUCACA UAAGGUUGUUGGG raimondii GrCL-5 (SEQ ID NO: 39) (SEQ ID NO: 40)
CAUCGAUGAUUUA GAGAAUAGAAACUAA Gossypium DsiRNA_ GhCLA1 GALV01059036 DsiRNA GUUUCUAUUCTC AUCAUCGAUGUU hirsutum GhCL-1 (SEQ ID NO: 41) (SEQ ID NO: 42)
UCGAUGAUUUAGU UUGAGAAUAGAAAC Gossypium DsiRNA_ GhCLA1 GALV01059036 DsiRNA UUCUAUUCUCAA UAAAUCAUCGAUG hirsutum GhCL-2 (SEQ ID NO: 43) (SEQ ID NO: 44)
AUCGAUGAUUUAG UGAGAAUAGAAACU Gossypium DsiRNA_ GhCLA1 GALV01059036 DsiRNA UUUCUAUUCUCA AAAUCAUCGAUGU hirsutum GhCL-3 (SEQ ID NO: 45) (SEQ ID NO: 46)
CGAUGAUUUAGUU UUUGAGAAUAGAAA Gossypium DsiRNA_ GhCLA1 GALV01059036 DsiRNA UCUAUUCUCAAA CUAAAUCAUCGAU hirsutum GhCL-4 (SEQ ID NO: 47) (SEQ ID NO: 48)
GAUAUGAUUGUUA UGUCAUUAAGAAUA Gossypium DsiRNA_ GhCLA1 GALV01059036 DsiRNA UUCUUAAUGACA ACAAUCAUAUCAG hirsutum GhCL-5 (SEQ ID NO: 49) (SEQ ID NO: 50) Exemplo 7: Aumento da captação celular de PMP por formulação de PMPs com líquidos iônicos Este exemplo descreve a formulação de PMPs com líquidos iônicos de modo a melhorar a captação de PMP através de penetração de células melhorada. Os líquidos iônicos foram descritos como agentes potenciais para solubilizar a celulose, um componente importante das paredes das células vegetais, e podem também melhorar a penetração de paredes celulares de fungos ou bactérias e/ou a membrana celular ou matriz extracelular de células animais. Em este exemplo, Acetato de
EMIM é usado como um líquido iônico modelo, PMPs de toranja são usados como um PMP modelo, algodão como uma planta modelo, Saccharomyces cerevisiae como uma levedura modelo, MDA-MB-231 como uma linha de células humanas modelo, S. sclerotiorum como um fungo modelo e Pseudomonas syringae como uma bactéria modelo.
Protocolo Experimental: a) Formulação de PMPs em líquido iônico Uma solução concentrada de PMPs de toranja é isolada como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Os PMPs são ressuspensos com mistura vigorosa em soluções de Acetato de EMIM a 1%, 5%, 10%, 20%, 50% ou 100%. Alternativamente, acetato de BMIM, acetato de HMIM, acetato de MMIM, acetato de AlilMIM são usados.
A concentração de PMPs é determinada assumindo 100% de recuperação da suspensão e multiplicando a concentração antes da formulação pela razão dos volumes.
As características e estabilidade de PMP no líquido iônico são avaliadas como descrito no Exemplo 3 e Exemplo 4. b) Captação de PMP aumentada por Saccharomyces cerevisiae com PMPs de toranja formulados em Acetato de EMIM carregados com proteína GFP Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2 e são carregados com proteína GFP como descrito no Exemplo 5. A encapsulação de GFP de PMPs é medida por transferência de Western ou fluorescência.
Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações.
Brevemente, 50 mg de PMPs em 1 mL de C diluído do kit de marcação PKH26 são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37 ºC durante 5 min.
A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por métodos descritos no Exemplo 2, e os péletes de PMP marcados são ressuspensos em PBS (controle) ou solução de Acetato de EMIM como descrito no Exemplo 8a.
Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com GFP em PBS versus PMPs marcados com PKH26 formulados em Acetato de EMIM carregados com GFP, células fúngicas de Saccharomyces cerevisiae são tratadas.
Saccharomyces cerevisiae é obtida a partir da ATCC (#9763) e mantida a 30 °C em caldo de extrato de levedura, peptona e dextrose (YPD) como indicado pelo fabricante.
Para se determinar a captação de PMP por S. cerevisiae, as células de levedura são cultivadas até uma OD600 de 0,4–0,6 em meio de seleção e incubadas com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs modificados carregados com GFP marcados com PKH26 em PBS ou Acetato de EMIM, diretamente em lâminas de vidro.
Adicionalmente a um controle de PBS, as células de S. cerevisiae são incubadas na presença de corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL). Após incubação de 5 min, 30 min e 1 h à temperatura ambiente são adquiridas imagens em um microscópio de fluorescência de elevada resolução.
Os PMPs são captados por células de levedura quando membrana vermelha e PMPs carregados com GFP verdes são observados no citoplasma ou se o citoplasma da célula de levedura fica vermelho e/ou verde, versus a coloração exclusiva da membrana celular pelo corante PKH26. Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs formulados em Acetato de EMIM carregados com GFP em comparação com os PMPs carregados com GFP formulados em PBS, a percentagem de células de levedura com um citoplasma verde/PMPs verdes no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs formulados em Acetato de EMIM carregados com GFP é comparada com os PMPs carregados com GFP formulados em PBS. c) Captação de PMP aumentada por S. sclerotiorum com PMPs de toranja formulados em Acetato de EMIM carregados com proteína GFP Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2 e são carregados com proteína GFP como descrito no Exemplo 5. Alguns dos PMPs são separados como controles, e o resto é modificado com celulase como descrito no Exemplo 6b.
A encapsulação de GFP de PMPs é medida por transferência de Western ou fluorescência.
Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações.
Brevemente, 50 mg de PMPs em 1 mL de C diluído são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37ºC durante 5 min.
A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por métodos descritos no Exemplo 2, e os péletes de PMP marcados são ressuspensos em PBS.
Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com GFP versus PMPs marcados com PKH26 formulados em Acetato de EMIM carregados com GFP, células fúngicas de S. sclerotiorum são tratadas.
Para se determinar a captação de PMP por ascósporos de S. sclerotiorum (ATCC, # 18687), 10.000 ascósporos são incubados com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs carregados com GFP marcados com PKH26 formulados em Acetato de EMIM ou PMPs formulados em PBS diretamente em lâminas de vidro.
Adicionalmente a um controle de PBS, as células de S. sclerotiorum são incubadas na presença de corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL).
Após incubação de 5 min, 30 min e 1 h à temperatura ambiente são adquiridas imagens em um microscópio de fluorescência de elevada resolução. Os PMPs são captados por células de levedura quando membrana vermelha e PMPs carregados com GFP verdes são observados no citoplasma ou se o citoplasma da célula de levedura fica vermelho e/ou verde, versus a coloração exclusiva da membrana celular pelo corante PKH26. Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs formulados em Acetato de EMIM carregados com GFP em comparação com os PMPs carregados com GFP formulados em PBS, a percentagem de células de S. sclerotiorum com um citoplasma verde/PMPs verdes no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs carregados com GFP formulados em Acetato de EMIM é comparada com os PMPs carregados com GFP formulados em PBS. d) Captação de PMP aumentada por células MDA-MB-231 com PMPs de toranja formulados em Acetato de EMIM carregados com Calceína
AM Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Os PMPs modificados e não modificados são carregados com Calceína AM (Sigma Aldrich) como descrito no Exemplo 5 e Gray et al., Methods X 2015. A Calceína AM é fluorescente somente quando encapsulada por PMPs, e a encapsulação é medida por fluorescência. Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações. Brevemente, 50 mg de PMPs carregados com Calceína AM em 1 mL de C diluído são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37 ºC durante 5 min.
A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por lavagem e os PMPs são concentrados usando um filtro Amicon de 100 kDa como descrito no Exemplo 2. Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM formulados em PBS versus PMPs formulados em Acetato de EMIM marcados com PKH26 carregados com Calceína AM, células de câncer de mama humano são tratadas.
A linha de células de câncer de mama MDA-MB-231 é obtida a partir da ATCC (HTB-26) e cultivada e mantida de acordo com as instruções do fornecedor.
As células à confluência de 70-80% são coletadas, contadas e semeadas em placa de poços tratados com cultura de 96 poços a uma densidade de semeadura de 10.000 células por poço em 200 uL de meio de cultura de células.
As células são deixadas a aderir durante 3 horas, depois o meio é removido, as células são lavadas uma vez com Dulbecco PBS, e meio sem FCS é adicionado para privar as células de soro durante 3 horas antes do tratamento.
Para se determinar a captação de PMP por células de câncer de mama, as células são incubadas com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs carregados com Calceína AM marcados com PKH26 formulados em PBS e formulados em Acetato de EMIM diretamente no poço.
Adicionalmente a um controle de PBS, as células são incubadas na presença de Calceína AM (concentração final 5 μg/mL), corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL) e PMPs não modificados.
Após incubação de 30 min, 1 h, 2 h e 4 h a 37 oC, as células são lavadas 4 x 10´ com PBS para remover os PMPs do meio.
As imagens são de seguida adquiridas em um microscópio de fluorescência de elevada resolução (EVOS2 FL) a 40x para se determinar a eficiência de captação.
Os PMPs são captados por células de câncer de mama quando membrana vermelha e PMPs carregados com Calceína AM verdes são observados no citoplasma ou se o citoplasma da célula fica vermelho e/ou verde, versus a coloração exclusiva da membrana celular pelo corante PKH26. Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs formulados em Acetato de EMIM carregados com Calceína AM em comparação com os PMPs carregados com Calceína AM formulados em PBS, a percentagem de células com um citoplasma verde/PMPs verdes no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs formulados em Acetato de EMIM carregados com GFP é comparada com os PMPs formulados em PBS carregados com GFP. e) Captação de PMP aumentada por Pseudomonas syringae com PMPs de toranja formulados em Acetato de EMIM carregados com Calceína
AM Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Os PMPs modificados e formulados em PBS são carregados com Calceína AM (Sigma Aldrich) como descrito no Exemplo 5 e Gray et al., Methods X 2015. A Calceína AM é fluorescente somente quando encapsulada por PMPs, e a encapsulação é medida por fluorescência. Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações. Brevemente, 50 mg de PMPs carregados com Calceína AM em 1 mL de C diluído do kit de marcação PKH26 são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37 ºC durante 5 min. A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por métodos descritos no Exemplo 2, e os péletes de PMP marcados são ressuspensos em PBS (controle) ou solução de Acetato de EMIM como descrito no Exemplo 8a.
Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM formulados em PBS versus PMPs formulados em Acetato de EMIM marcados com PKH26 carregados com Calceína AM, células bacterianas de Pseudomonas syringae são tratadas.
As bactérias Pseudomonas syringae são obtidas a partir da ATCC (BAA-871) e cultivadas em ágar B de Meio de King de acordo com as instruções do fabricante.
Para se determinar a captação de PMP por P. syringae, 10 μL de uma suspensão bacteriana de 1 mL durante a noite são incubados com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs carregados com Calceína AM marcados com PKH26 formulados em PBS e PMPs formulados em Acetato de EMIM carregados com Calceína AM marcados com PKH26 diretamente em uma lâmina de vidro.
Adicionalmente a um controle de PBS, as bactérias P. syringae são incubadas na presença de Calceína AM (concentração final 5 μg/mL), corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL). Após incubação de 5 min, 30 min e 1 h à temperatura ambiente são adquiridas imagens em um microscópio de fluorescência de elevada resolução.
Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs formulados em Acetato de EMIM marcados com PKH26 carregados com Calceína AM em comparação com os PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM formulados em PBS, a percentagem de células bacterianas com um citoplasma verde ou PMPs verdes e vermelhos no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs formulados em Acetato de EMIM marcados com PKH26 carregados com Calceína AM é comparada com os PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM formulados em PBS.
A formulação em Acetato de EMIM de PMPs melhora a captação celular eficientemente em comparação com os PMPs formulados em PBS. f) Captação aumentada de PMP de PMPs de toranja formulados em Acetato de EMIM carregados com dsRNA visando CLA1 em plantas de algodão Para demonstrar um aumento na captação celular por PMPs formulados em Acetato de EMIM, os PMPs de toranja são carregados com miRNAs artificiais (amiRNAs, desenhados usando Plant Small RNA Maker Site (P-SAMS; Fahlgren et al., Bioinformatics. 32 (1): 157-158, 2016)) ou siRNA de substrato de dicer customizado (DsiRNA, desenhado pela IDT) visando o gene de fotossíntese do algodão GrCLA1 (1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato sintase). GrCLA1 é um gene homólogo do gene Arabidopsis Cloroplastos alterado 1 (AtCLA1), cuja perda de função resulta em um fenótipo albino nas folhas verdadeiras, proporcionando um marcador visual da eficiência de silenciamento.
Os oligonucleotídeos são obtidos a partir da IDT.
Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Os PMPs de toranja são carregados com dúplexes GrCLA1-amiRNA ou GrCLA1-DsiRNA (Tabela 12), como descrito no Exemplo 5. A encapsulação de amiRNA ou DsiRNA de PMPs é medida usando o kit Quant-It RiboGreen RNA assay ou usando um amiRNA ou DsiRNA marcado com corante fluorescente de controle (IDT). Parte dos PMPs carregados é formulada em PBS, e parte do resto é modificada com celulase como descrito no Exemplo 8b.
PMPs carregados com amiRNA ou DsiRNA (coletivamente referidos como dsRNA) são formulados em água (ddH2O) até uma concentração que entrega um equivalente a uma dose eficaz de dsRNA de 0, 1, 5, 10 e 20 ng/μL em água estéril.
Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs carregados com CLA1-amiRNA/DsiRNA versus PMPs formulados em Acetato de EMIM carregados com CLA1- amiRNA/DsiRNA, plântulas de algodão são tratadas e analisadas quanto ao silenciamento do gene CLA1. Sementes de algodão (Gossypium hirsutum e Gossypium raimondii) são obtidas através do US National Plant Germplasm System.
As sementes esterilizadas são envolvidas em algodão absorvente úmido, colocadas em placas de Petri e colocadas em uma câmara de crescimento a 25 °C, 150 μE m-2 S-1 de intensidade de luz, com um fotoperíodo 14 horas de luz/10 horas de escuridão durante 3 dias para germinarem.
As plântulas são cultivadas em vasos de cultura estéreis com solução de nutrientes de Hoagland (Sigma Aldrich) sob condições de dias longos (fotoperíodo de luz/escuridão de 16/8 h) com temperaturas de dia/noite de 26/20 °C.
Após 4 dias, as plântulas com cotilédones totalmente expandidos (antes de a primeira folha verdadeira ter aparecido) são usadas para tratamentos com PMP.
As plântulas de algodão com sete dias de idade são transferidas para sais minerais de Murashige e Skoog (MS) 0,5 x (Sigma Aldrich) com 1 x vitaminas MS (Sigma Aldrich) pH 5,6-5,8, com agarose a 0,8% (p/v) e são tratadas com uma dose eficaz de 0 (ddH2O), 1, 5, 10 e 20 ng/μL de PMPs formulados em Acetato de EMIM carregados com dsRNA de GrCLA1 e 0 (ddH2O), 1, 5, 10 e 20 ng/μL de PMPs formulados em PBS carregados com dsRNA de GrCLA1 por pulverização da plântula inteira, 1 mL de solução por planta, com 3 plantas por grupo.
Alternativamente, antes do tratamento com PMP, o lado inferior dos cotilédones da planta de algodão é perfurado com uma agulha de 25 G sem perfurar através dos cotilédones.
As soluções de PMP com uma dose eficaz de 0 (ddH2O), 1, 5, 10 e 20 ng/μL de PMPs formulados em Acetato de EMIM carregados com dsRNA de GrCLA1 e 0 (ddH2O), 1, 5,
10 e 20 ng/μL de PMPs formulados em VIB (Exemplo 1) carregados com dsRNA de GrCLA1 são infiltradas manualmente a partir do lado inferior dos cotilédones através dos locais de ferida usando uma seringa sem agulha de 1 mL.
As plantas são transferidas para uma câmara de crescimento e mantidas sob condições de dias longos (fotoperíodo de luz/escuridão de 16 h/8 h) com intensidade de luz de 90 μmol m−2 s−1 e temperaturas de dia/noite de 26/20 ºC.
Após 2, 5, 8 e 14 dias, a eficiência de silenciamento gênico do dsRNA de CLA1 é examinada pelo nível de expressão de mRNA endógeno de CLA1 usando reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR). O RNA total é extraído a partir de 100 mg de folhas frescas de algodão usando reagente Trizol de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen) e tratado extensivamente com DNase I isenta de RNase (Promega). O cDNA da primeira fita é sintetizado a partir de 2 µg de RNA total com o sistema SuperScriptTM First-Strand Synthesis (Invitrogen). Para se estimarem os níveis de transcritos de CLA1, a qRT-PCR é realizada usando SYBR Green Real-Time PCR Master Mix (Thermo Scientific) com iniciadores: GrCLA1q1_F 5'-CCAGGTGGGGCTTATGCATC-3' (SEQ ID NO: 7), GrCLA1q1_R 5'-CCACACCAAGGCTTGAACCC-3' (SEQ ID NO: 8) e GrCLA1q2_F 5'-GGCCGGATTCACGAAACGGT-3' (SEQ ID NO: 9), GrCLA1q2_R 5'-CGTCGAGATTGGCAGTTGGC-3' (SEQ ID NO: 10) e 18s RNA_F 5'-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3' (SEQ ID NO: 11), 18s RNA_ R 5'-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3' (SEQ ID NO: 12), usando o seguinte programa: (a) 95 °C durante 5 min; (b) 40 ciclos de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s; e 72 °C durante 30 s.
O gene de 18S rRNA é usado como controle interno para normalizar os resultados.
A eficiência de silenciamento de CLA1 em algodão após tratamento com PMPs formulados em Acetato de EMIM carregados com CLA1-dsRNA e formulados em PBS carregados com CLA1-dsRNA é determinada por cálculo do valor ΔΔCt, comparando a expressão de CLA1 normalizada após tratamento com PMPs formulados em Acetato de EMIM com a expressão de CLA1 normalizada após tratamento com PMPs formulados em PBS.
Adicionalmente, a eficiência de silenciamento gênico de dsRNA de CLA1 é examinada por análise de fotobranqueamento fenotípico.
Folhas de plantas tratadas com PMPs formulados em Acetato de EMIM e PMPs formulados em PBS são fotografadas, e o software ImageJ é usado para determinar a percentagem de silenciamento gênico, que é refletida por fotobranqueamento branco na folha versus a cor verde da folha de controle.
Três folhas por planta são avaliadas para se quantificar o efeito do fotobranqueamento, e a eficiência de silenciamento gênico de PMPs carregados com CLA1- dsRNA formulados em Acetato de EMIM versus formulados em PBS é avaliada.
Os PMPs formulados em Acetato de EMIM são captados mais eficientemente pelas células vegetais e induzem maior silenciamento do gene CLA1 em comparação com os PMPs formulados em PBS.
Exemplo 8: Aumento da captação celular de PMP por formulação de PMPs com líquidos fluorados Este exemplo descreve a formulação de PMPs com líquidos fluorados de modo a melhorar a captação de PMP através de penetração de células melhorada.
Os líquidos fluorados foram descritos como agentes potenciais de solubilizar a celulose, um componente importante das paredes das células, e podem também melhorar a penetração de paredes celulares de fungos ou bactérias e/ou a membrana celular ou matriz extracelular de células animais.
Em este exemplo, perfluoro-octano é usado como um líquido fluorado modelo, PMPs de toranja são usados como um PMP modelo, algodão como uma planta modelo, Saccharomyces cerevisiae como uma levedura modelo, MDA-MB-231 como uma linha de células humanas modelo, S. sclerotiorum como um fungo modelo e Pseudomonas syringae como uma bactéria modelo.
Protocolo Experimental: a) Formulação de PMPs em líquido fluorado Uma solução concentrada de PMPs de toranja é isolada como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Os PMPs são ressuspensos com mistura vigorosa em soluções de perfluoro-octano (Sigma Aldrich) a 1%, 5%, 10%, 20%, 50% ou 100%. Alternativamente, perfluoro- hexano, ou Perfluoro(metildecalina), é usado.
A concentração de PMPs é determinada assumindo 100% de recuperação da suspensão e multiplicando a concentração antes da formulação pela razão dos volumes.
As características e estabilidade de PMP no líquido fluorado são avaliadas como descrito no Exemplo 3 e Exemplo 4. b) Captação de PMP aumentada por Saccharomyces cerevisiae com PMPs de toranja formulados em perfluoro-octano carregados com proteína GFP Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2 e são carregados com proteína GFP como descrito no Exemplo 5. A encapsulação de GFP de PMPs é medida por transferência de Western ou fluorescência.
Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações.
Brevemente, 50 mg de PMPs em 1 mL de C diluído do kit de marcação PKH26 são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37 ºC durante 5 min.
A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por métodos descritos no Exemplo 2, e os péletes de PMP marcados são ressuspensos em PBS (controle) ou solução de perfluoro-octano como descrito no Exemplo 8a.
Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com GFP em PBS versus PMPs marcados com PKH26 formulados em perfluoro- octano carregados com GFP, células fúngicas de Saccharomyces cerevisiae são tratadas.
Saccharomyces cerevisiae é obtida a partir da ATCC (#9763) e mantida a 30 °C em caldo de extrato de levedura, peptona e dextrose (YPD) como indicado pelo fabricante.
Para se determinar a captação de PMP por S. cerevisiae, as células de levedura são cultivadas até uma OD600 de 0,4–0,6 em meio de seleção e incubadas com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs modificados carregados com GFP marcados com PKH26 em PBS ou perfluoro- octano, diretamente em lâminas de vidro.
Adicionalmente a um controle de PBS, as células de S. cerevisiae são incubadas na presença de corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL). Após incubação de 5 min, 30 min e 1 h à temperatura ambiente são adquiridas imagens em um microscópio de fluorescência de elevada resolução.
Os PMPs são captados por células de levedura quando membrana vermelha e PMPs carregados com GFP verdes são observados no citoplasma ou se o citoplasma da célula de levedura fica vermelho e/ou verde, versus a coloração exclusiva da membrana celular pelo corante PKH26. Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs formulados em perfluoro- octano carregados com GFP em comparação com os PMPs carregados com GFP formulados em PBS, a percentagem de células de levedura com um citoplasma verde/PMPs verdes no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs formulados em perfluoro-octano carregados com GFP é comparada com os PMPs carregados com GFP formulados em PBS. c) Captação de PMP aumentada por S. sclerotiorum com PMPs de toranja formulados em Perfluoro-octano carregados com proteína GFP Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2 e são carregados com proteína GFP como descrito no Exemplo 5. Alguns dos PMPs são separados como controles, e o resto é modificado com celulase como descrito no Exemplo 6b.
A encapsulação de GFP de PMPs é medida por transferência de Western ou fluorescência.
Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações.
Brevemente, 50 mg de PMPs em 1 mL de C diluído são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37ºC durante 5 min.
A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por métodos descritos no Exemplo 2, e os péletes de PMP marcados são ressuspensos em PBS.
Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com GFP versus PMPs marcados com PKH26 formulados em Perfluoro-octano com carregados com GFP, células fúngicas de S. sclerotiorum são tratadas.
Para se determinar a captação de PMP por ascósporos de S. sclerotiorum (ATCC, # 18687), 10.000 ascósporos são incubados com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs carregados com GFP marcados com PKH26 formulados em Perfluoro- octano ou PMPs formulados em PBS diretamente em lâminas de vidro.
Adicionalmente a um controle de PBS, as células de S. sclerotiorum são incubadas na presença de corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL). Após incubação de 5 min, 30 min e 1 h à temperatura ambiente são adquiridas imagens em um microscópio de fluorescência de elevada resolução. Os PMPs são captados por células de levedura quando membrana vermelha e PMPs carregados com GFP verdes são observados no citoplasma ou se o citoplasma da célula de levedura fica vermelho e/ou verde, versus a coloração exclusiva da membrana celular pelo corante PKH26. Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs formulados em Perfluoro-octano carregados com GFP em comparação com os PMPs carregados com GFP formulados em PBS, a percentagem de células de S. sclerotiorum com um citoplasma verde/PMPs verdes no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs carregados com GFP formulados em Perfluoro-octano é comparada com os PMPs carregados com GFP formulados em PBS. d) Captação de PMP aumentada por células MDA-MB-231 com PMPs de toranja formulados em Perfluoro-octano carregados com Calceína
AM Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Os PMPs modificados e não modificados são carregados com Calceína AM (Sigma Aldrich) como descrito no Exemplo 5 e Gray et al., Methods X 2015. A Calceína AM é fluorescente somente quando encapsulada por PMPs, e a encapsulação é medida por fluorescência. Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações. Brevemente, 50 mg de PMPs carregados com Calceína AM em 1 mL de C diluído são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37 ºC durante 5 min. A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por lavagem e os PMPs são concentrados usando um filtro Amicon de 100 kDa como descrito no Exemplo 2. Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM formulados em PBS versus PMPs formulados em Perfluoro-octano marcados com PKH26 carregados com Calceína AM, células de câncer de mama humano são tratadas.
A linha de células de câncer de mama MDA-MB-231 é obtida a partir da ATCC (HTB-26) e cultivada e mantida de acordo com as instruções do fornecedor.
As células à confluência de 70-80% são coletadas, contadas e semeadas em placa de poços tratados com cultura de 96 poços a uma densidade de semeadura de 10.000 células por poço em 200 uL de meio de cultura de células.
As células são deixadas a aderir durante 3 horas, depois o meio é removido, as células são lavadas uma vez com Dulbecco PBS, e meio sem FCS é adicionado para privar as células de soro durante 3 horas antes do tratamento.
Para se determinar a captação de PMP por células de câncer de mama, as células são incubadas com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs carregados com Calceína AM marcados com PKH26 formulados em PBS e formulados em Perfluoro-octano diretamente no poço.
Adicionalmente a um controle de PBS, as células são incubadas na presença de Calceína AM (concentração final 5 μg/mL), corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL) e PMPs não modificados.
Após incubação de 30 min, 1 h, 2 h e 4 h a 37 oC, as células são lavadas 4 x 10´ com PBS para remover os PMPs do meio.
As imagens são de seguida adquiridas em um microscópio de fluorescência de elevada resolução (EVOS2 FL) a 40x para se determinar a eficiência de captação.
Os PMPs são captados por células de câncer de mama quando membrana vermelha e PMPs carregados com Calceína AM verdes são observados no citoplasma ou se o citoplasma da célula fica vermelho e/ou verde, versus a coloração exclusiva da membrana celular pelo corante PKH26. Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs formulados em Perfluoro-octano carregados com Calceína AM em comparação com os PMPs carregados com Calceína AM formulados em PBS, a percentagem de células com um citoplasma verde/PMPs verdes no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs formulados em Perfluoro-octano carregados com GFP é comparada com os PMPs formulados em PBS carregados com GFP. e) Captação de PMP aumentada por Pseudomonas syringae com PMPs de toranja formulados em perfluoro-octano carregados com Calceína
AM Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Os PMPs modificados e formulados em PBS são carregados com Calceína AM (Sigma Aldrich) como descrito no Exemplo 5 e Gray et al., Methods X 2015. A Calceína AM é fluorescente somente quando encapsulada por PMPs, e a encapsulação é medida por fluorescência. Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações. Brevemente, 50 mg de PMPs carregados com Calceína AM em 1 mL de C diluído do kit de marcação PKH26 são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37 ºC durante 5 min. A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por métodos descritos no Exemplo 2, e os péletes de PMP marcados são ressuspensos em PBS (controle) ou solução de perfluoro-octano como descrito no Exemplo 8a. Para se determinar a eficiência de captação de
PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM formulados em PBS versus PMPs formulados em perfluoro-octano marcados com PKH26 carregados com Calceína AM, células bacterianas de Pseudomonas syringae são tratadas.
As bactérias Pseudomonas syringae são obtidas a partir da ATCC (BAA-871) e cultivadas em ágar B de Meio de King de acordo com as instruções do fabricante.
Para se determinar a captação de PMP por P. syringae, 10 uL de uma suspensão bacteriana de 1 mL durante a noite são incubados com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs carregados com Calceína AM marcados com PKH26 formulados em PBS e PMPs formulados em perfluoro-octano carregados com Calceína AM marcados com PKH26 diretamente em uma lâmina de vidro.
Adicionalmente a um controle de PBS, as bactérias P. syringae são incubadas na presença de Calceína AM (concentração final 5 μg/mL), corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL). Após incubação de 5 min, 30 min e 1 h à temperatura ambiente são adquiridas imagens em um microscópio de fluorescência de elevada resolução.
Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs formulados em perfluoro-octano marcados com PKH26 carregados com Calceína AM em comparação com os PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM formulados em PBS, a percentagem de células bacterianas com um citoplasma verde ou PMPs verdes e vermelhos no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs formulados em perfluoro-octano marcados com PKH26 carregados com Calceína AM é comparada com os PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM formulados em PBS.
A formulação em perfluoro-octano de PMPs melhora a captação celular eficientemente em comparação com os PMPs formulados em PBS. f) Captação aumentada de PMP de PMPs de toranja formulados em perfluoro-octano carregados com dsRNA visando CLA1 em plantas de algodão Para demonstrar um aumento na captação celular por PMPs formulados em perfluoro-octano, os PMPs de toranja são carregados com miRNAs artificiais (amiRNAs, desenhados usando Plant Small RNA Maker Site (P-SAMS; Fahlgren et al., Bioinformatics. 32 (1): 157-158, 2016)) ou siRNA de substrato de dicer customizado (DsiRNA, desenhado pela IDT) visando o gene de fotossíntese do algodão GrCLA1 (1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato sintase). GrCLA1 é um gene homólogo do gene Arabidopsis Cloroplastos alterado 1 (AtCLA1), cuja perda de função resulta em um fenótipo albino nas folhas verdadeiras, proporcionando um marcador visual da eficiência de silenciamento.
Os oligonucleotídeos são obtidos a partir da IDT.
Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Os PMPs de toranja são carregados com dúplexes GrCLA1-amiRNA ou GrCLA1-DsiRNA (Tabela 12), como descrito no Exemplo 5. A encapsulação de amiRNA ou DsiRNA de PMPs é medida usando o kit Quant-It RiboGreen RNA assay ou usando um amiRNA ou DsiRNA marcado com corante fluorescente de controle (IDT). Parte dos PMPs carregados é formulada em PBS, e parte do resto é modificada com celulase como descrito no Exemplo 8b.
PMPs carregados com amiRNA ou DsiRNA (coletivamente referidos como dsRNA) são formulados em água (ddH2O) até uma concentração que entrega um equivalente a uma dose eficaz de dsRNA de 0, 1, 5, 10 e 20 ng/μL em água estéril.
Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs carregados com CLA1-amiRNA/DsiRNA versus PMPs formulados em perfluoro-octano carregados com CLA1- amiRNA/DsiRNA, plântulas de algodão são tratadas e analisadas quanto ao silenciamento do gene CLA1. Sementes de algodão (Gossypium hirsutum e Gossypium raimondii) são obtidas através do US National Plant Germplasm System.
As sementes esterilizadas são envolvidas em algodão absorvente úmido, colocadas em placas de Petri e colocadas em uma câmara de crescimento a 25 °C, 150 μE m-2 S-1 de intensidade de luz, com um fotoperíodo 14 horas de luz/10 horas de escuridão durante 3 dias para germinarem.
As plântulas são cultivadas em vasos de cultura estéreis com solução de nutrientes de Hoagland (Sigma Aldrich) sob condições de dias longos (fotoperíodo de luz/escuridão de 16/8 h) com temperaturas de dia/noite de 26/20 °C.
Após 4 dias, as plântulas com cotilédones totalmente expandidos (antes de a primeira folha verdadeira ter aparecido) são usadas para tratamentos com PMP.
As plântulas de algodão com sete dias de idade são transferidas para sais minerais de Murashige e Skoog (MS) 0,5 x (Sigma Aldrich) com 1 x vitaminas MS (Sigma Aldrich) pH 5,6-5,8, com agarose a 0,8% (p/v) e são tratadas com uma dose eficaz de 0 (ddH2O), 1, 5, 10 e 20 ng/μL de PMPs formulados em perfluoro-octano carregados com dsRNA de GrCLA1 e 0 (ddH2O), 1, 5, 10 e 20 ng/μL de PMPs formulados em PBS carregados com dsRNA de GrCLA1 por pulverização da plântula inteira, 1 mL de solução por planta, com 3 plantas por grupo.
Alternativamente, antes do tratamento com PMP, o lado inferior dos cotilédones da planta de algodão é perfurado com uma agulha de 25 G sem perfurar através dos cotilédones.
As soluções de PMP com uma dose eficaz de 0 (ddH2O), 1, 5, 10 e 20 ng/μL de PMPs formulados em perfluoro-octano carregados com dsRNA de GrCLA1 e 0 (ddH2O), 1, 5, 10 e 20 ng/μL de PMPs formulados em VIB (Exemplo 1) carregados com dsRNA de GrCLA1 são infiltradas manualmente a partir do lado inferior dos cotilédones através dos locais de ferida usando uma seringa sem agulha de 1 mL.
As plantas são transferidas para uma câmara de crescimento e mantidas sob condições de dias longos (fotoperíodo de luz/escuridão de 16 h/8 h) com intensidade de luz de 90 μmol m−2 s−1 e temperaturas de dia/noite de 26/20 ºC.
Após 2, 5, 8 e 14 dias, a eficiência de silenciamento gênico do dsRNA de CLA1 é examinada pelo nível de expressão de mRNA endógeno de CLA1 usando reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR). O RNA total é extraído a partir de 100 mg de folhas frescas de algodão usando reagente Trizol de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen) e tratado extensivamente com DNase I isenta de RNase (Promega). O cDNA da primeira fita é sintetizado a partir de 2 µg de RNA total com o sistema SuperScriptTM First-Strand Synthesis (Invitrogen). Para se estimarem os níveis de transcritos de CLA1, a qRT-PCR é realizada usando SYBR Green Real-Time PCR Master Mix (Thermo Scientific) com iniciadores: GrCLA1q1_F 5'-CCAGGTGGGGCTTATGCATC-3' (SEQ ID NO: 7), GrCLA1q1_R 5'-CCACACCAAGGCTTGAACCC-3' (SEQ ID NO: 8) e GrCLA1q2_F 5'-GGCCGGATTCACGAAACGGT-3' (SEQ ID NO: 9), GrCLA1q2_R 5'-CGTCGAGATTGGCAGTTGGC-3' (SEQ ID NO: 10) e 18s RNA_F 5'-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3' (SEQ ID NO: 11), 18s RNA_ R 5'-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3' (SEQ ID NO: 12), usando o seguinte programa: (a) 95 °C durante 5 min; (b) 40 ciclos de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s; e 72 °C durante 30 s.
O gene de 18S rRNA é usado como controle interno para normalizar os resultados.
A eficiência de silenciamento de CLA1 em algodão após tratamento com PMPs formulados em perfluoro-octano carregados com CLA1-dsRNA e formulados em PBS carregados com CLA1-dsRNA é determinada por cálculo do valor ΔΔCt, comparando a expressão de CLA1 normalizada após tratamento com PMPs formulados em perfluoro-octano com a expressão de CLA1 normalizada após tratamento com PMPs formulados em PBS.
Adicionalmente, a eficiência de silenciamento gênico de dsRNA de CLA1 é examinada por análise de fotobranqueamento fenotípico.
Folhas de plantas tratadas com PMPs formulados em perfluoro-octano e PMPs formulados em PBS são fotografadas, e o software ImageJ é usado para determinar a percentagem de silenciamento gênico, que é refletida por fotobranqueamento branco na folha versus a cor verde da folha de controle.
Três folhas por planta são avaliadas para se quantificar o efeito do fotobranqueamento, e a eficiência de silenciamento gênico de PMPs carregados com CLA1- dsRNA formulados em perfluoro-octano versus formulados em PBS é avaliada.
Os PMPs formulados em perfluoro-octano são captados mais eficientemente pelas células vegetais e induzem maior silenciamento do gene CLA1 em comparação com os PMPs formulados em PBS.
Exemplo 9: Aumento da captação de PMP por formulação de PMPs com detergentes para melhorar a penetração de células Este exemplo descreve o aumento da captação celular de PMPs em células animais, vegetais, fúngicas ou bacterianas, por modificação dos PMPs com detergentes para facilitar a penetração de membranas celulares.
Em este exemplo, saponina é usada como um detergente modelo, PMPs de toranja como PMP modelo, algodão como uma planta modelo, Saccharomyces cerevisiae como uma levedura modelo, MDA-MB-231 como uma linha de células humanas modelo, S. sclerotiorum como um fungo modelo e Pseudomonas syringae como uma bactéria modelo.
Protocolo Experimental: a) Modificação de PMPs com saponina
Uma solução concentrada de PMPs de toranja é isolada como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Os PMPs são ressuspensos com mistura vigorosa em soluções de saponina a 0,001%, 0,01% 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30% p/v (Avanti Polar Lipids). Alternativamente é usado CHAPS. A concentração de PMPs é determinada assumindo 100% de recuperação da suspensão e multiplicando a concentração antes da formulação pela razão dos volumes. As características e estabilidade de PMP modificado com saponina são avaliadas como descrito no Exemplo 3 e Exemplo 4. b) Captação de PMP aumentada por Saccharomyces cerevisiae com PMPs de toranja modificados com saponina carregados com proteína
GFP Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2 e são carregados com proteína GFP como descrito no Exemplo 5. Alguns dos PMPs são separados como controles, e o resto é modificado com saponina como descrito no Exemplo 9a. A encapsulação de GFP de PMPs é medida por transferência de Western ou fluorescência. Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações. Brevemente, 50 mg de PMPs em 1 mL de C diluído do kit de marcação PKH26 são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37 ºC durante 5 min. A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por métodos descritos no Exemplo 2, e os péletes de PMP marcados são ressuspensos em PBS. Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com GFP versus PMPs marcados com PKH26 modificados com saponina carregados com GFP, células fúngicas de Saccharomyces cerevisiae são tratadas. Saccharomyces cerevisiae é obtida a partir da ATCC (#9763)
e mantida a 30 °C em caldo de extrato de levedura, peptona e dextrose (YPD) como indicado pelo fabricante.
Para se determinar a captação de PMP por S. cerevisiae, as células de levedura são cultivadas até uma OD600 de 0,4–0,6 em meio de seleção e incubadas com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs modificados carregados com GFP marcados com PKH26 diretamente em lâminas de vidro.
Adicionalmente a um controle de PBS, as células de S. cerevisiae são incubadas na presença de corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL). Após incubação de 5 min, 30 min e 1 h à temperatura ambiente são adquiridas imagens em um microscópio de fluorescência de elevada resolução.
Os PMPs são captados por células de levedura quando membrana vermelha e PMPs carregados com GFP verdes são observados no citoplasma ou se o citoplasma da célula de levedura fica vermelho e/ou verde, versus a coloração exclusiva da membrana celular pelo corante PKH26. Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs modificados com saponina carregados com GFP em comparação com os PMPs carregados com GFP não modificados, a percentagem de células de levedura com um citoplasma verde/PMPs verdes no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs modificados com saponina carregados com GFP é comparada com os PMPs carregados com GFP não modificados. c) Captação de PMP aumentada por S. sclerotiorum com PMPs de toranja modificados com saponina carregados com proteína GFP Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2 e são carregados com proteína GFP como descrito no Exemplo 5. Alguns dos PMPs são separados como controles, e o resto é modificado com saponina como descrito no Exemplo 6b.
A encapsulação de GFP de PMPs é medida por transferência de Western ou fluorescência.
Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações.
Brevemente, 50 mg de PMPs em 1 mL de C diluído são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37 ºC durante 5 min.
A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por métodos descritos no Exemplo 2, e os péletes de PMP marcados são ressuspensos em PBS.
Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com GFP versus PMPs marcados com PKH26 modificados com saponina carregados com GFP, células fúngicas de S. sclerotiorum são tratadas.
Para se determinar a captação de PMP por ascósporos de S. sclerotiorum (ATCC, # 18687), 10.000 ascósporos são incubados com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs modificados carregados com GFP marcados com PKH26 ou PMPs não modificados diretamente em lâminas de vidro.
Adicionalmente a um controle de PBS, as células de S. sclerotiorum são incubadas na presença de corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL). Após incubação de 5 min, 30 min e 1 h à temperatura ambiente são adquiridas imagens em um microscópio de fluorescência de elevada resolução.
Os PMPs são captados por células de levedura quando membrana vermelha e PMPs carregados com GFP verdes são observados no citoplasma ou se o citoplasma da célula de levedura fica vermelho e/ou verde, versus a coloração exclusiva da membrana celular pelo corante PKH26. Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs modificados com saponina carregados com GFP em comparação com os PMPs carregados com GFP não modificados, a percentagem de células de S.
sclerotiorum com um citoplasma verde/PMPs verdes no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs modificados com saponina carregados com GFP é comparada com os PMPs carregados com GFP não modificados. d) Captação de PMP aumentada por células MDA-MB-231 com PMPs de toranja modificados com saponina carregados com Calceína AM Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Alguns dos PMPs são separados como controles, e o resto é modificado com saponina como descrito no Exemplo 6b.
Os PMPs modificados e não modificados são carregados com Calceína AM (Sigma Aldrich) como descrito no Exemplo 5 e Gray et al., Methods X 2015. A Calceína AM é fluorescente somente quando encapsulada por PMPs, e a encapsulação é medida por fluorescência.
Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações.
Brevemente, 50 mg de PMPs carregados com Calceína AM em 1 mL de C diluído são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37 ºC durante 5 min.
A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por lavagem e os PMPs são concentrados usando um filtro Amicon de 100 kDa como descrito no Exemplo 2. Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM versus PMPs modificados com saponina marcados com PKH26 carregados com Calceína AM, células de câncer de mama humano são tratadas.
A linha de células de câncer de mama MDA-MB-231 é obtida a partir da ATCC (HTB-26) e cultivada e mantida de acordo com as instruções do fornecedor.
As células à confluência de 70-80% são coletadas, contadas e semeadas em placa de poços tratados com cultura de 96 poços a uma densidade de semeadura de 10.000 células por poço em 200 uL de meio de cultura de células.
As células são deixadas a aderir durante 3 horas, depois o meio é removido, as células são lavadas uma vez com Dulbecco PBS, e meio sem FCS é adicionado para privar as células de soro durante 3 horas antes do tratamento.
Para se determinar a captação de PMP por células de câncer de mama, as células são incubadas com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs não modificados e modificados com saponina marcados com PKH26 carregados com Calceína AM marcados com PKH26 diretamente no poço.
Adicionalmente a um controle de PBS, as células são incubadas na presença de Calceína AM (concentração final 5 μg/mL), corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL) e PMPs não modificados.
Após incubação de 30 min, 1 h, 2 h e 4 h a 37 oC, as células são lavadas 4 x 10´ com PBS para remover os PMPs do meio.
As imagens são de seguida adquiridas em um microscópio de fluorescência de elevada resolução (EVOS2 FL) a 40x para se determinar a eficiência de captação.
Os PMPs são captados por células de câncer de mama quando membrana vermelha e PMPs carregados com Calceína AM verdes são observados no citoplasma ou se o citoplasma da célula fica vermelho e/ou verde, versus a coloração exclusiva da membrana celular pelo corante PKH26. Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs modificados com saponina carregados com Calceína AM em comparação com os PMPs carregados com Calceína AM não modificados, a percentagem de células com um citoplasma verde/PMPs verdes no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs modificados com saponina carregados com GFP é comparada com os PMPs carregados com GFP não modificados. e) Captação de PMP aumentada por Pseudomonas syringae com PMPs de toranja modificados com saponina carregados com Calceína AM Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Alguns dos PMPs são separados como controles, e o resto é modificado com saponina como descrito no Exemplo 9b.
Os PMPs modificados e não modificados são carregados com Calceína AM (Sigma Aldrich) como descrito no Exemplo 5 e Gray et al., Methods X 2015. A Calceína AM é fluorescente somente quando encapsulada por PMPs, e a encapsulação é medida por fluorescência.
Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações.
Brevemente, 50 mg de PMPs carregados com Calceína AM em 1 mL de C diluído do kit de marcação PKH26 são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37 ºC durante 5 min.
A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por lavagem e os PMPs são concentrados usando um filtro Amicon de 100 kDa como descrito no Exemplo 2. Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM versus PMPs modificados com saponina marcados com PKH26 carregados com Calceína AM, células bacterianas de Pseudomonas syringae são tratadas.
As bactérias Pseudomonas syringae são obtidas a partir da ATCC (BAA-871) e cultivadas em ágar B de Meio de King de acordo com as instruções do fabricante.
Para se determinar a captação de PMP por P. syringae, 10 μL de uma suspensão bacteriana de 1 mL durante a noite são incubados com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs não modificados e modificados com saponina marcados com PKH26 carregados com Calceína AM marcados com PKH26 diretamente em uma lâmina de vidro.
Adicionalmente a um controle de água, as bactérias P. syringae são incubadas na presença de Calceína AM (concentração final 5 μg/mL), corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL) e PMPs não modificados.
Após incubação de 5 min, 30 min e 1 h à temperatura ambiente são adquiridas imagens em um microscópio de fluorescência de elevada resolução.
Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs modificados com saponina marcados com PKH26 carregados com Calceína AM em comparação com os PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM não modificados, a percentagem de células bacterianas com um citoplasma verde ou PMPs verdes e vermelhos no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs modificados com saponina marcados com PKH26 carregados com Calceína AM é comparada com os PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM não modificados.
A modificação de saponina de PMPs melhora a captação celular eficientemente em comparação com PMPs não modificados. f) Captação aumentada de PMP de PMPs de toranja modificados com saponina carregados com dsRNA visando CLA1 em plantas de algodão Para demonstrar um aumento na captação celular por PMPs modificados com saponina, os PMPs de toranja são carregados com miRNAs artificiais (amiRNAs, desenhados usando Plant Small RNA Maker Site (P-SAMS; Fahlgren et al., Bioinformatics. 32 (1): 157-158,
2016)) ou siRNA de substrato de dicer customizado (DsiRNA, desenhado pela IDT) visando o gene de fotossíntese do algodão GrCLA1 (1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato sintase). GrCLA1 é um gene homólogo do gene Arabidopsis Cloroplastos alterado 1 (AtCLA1), cuja perda de função resulta em um fenótipo albino nas folhas verdadeiras, proporcionando um marcador visual da eficiência de silenciamento.
Os oligonucleotídeos são obtidos a partir da IDT.
Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs modificados com saponina versus não modificados, os PMPs de toranja são carregados com dúplexes GrCLA1-amiRNA ou GrCLA1-DsiRNA (Tabela 12), como descrito no Exemplo 5. A encapsulação de amiRNA ou DsiRNA de PMPs é medida usando o kit Quant-It RiboGreen RNA assay ou usando um amiRNA ou DsiRNA marcado com corante fluorescente de controle (IDT). De seguida, parte dos PMPs carregados é separada como controles, e o resto é modificado com saponina como descrito no Exemplo 9b.
Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs carregados com CLA1-amiRNA/DsiRNA versus PMPs modificados com saponina carregados com CLA1-amiRNA/DsiRNA, plântulas de algodão são tratadas e analisadas quanto ao silenciamento do gene CLA1. PMPs carregados com amiRNA ou DsiRNA (coletivamente referidos como dsRNA) são formulados em água até uma concentração que entrega um equivalente a uma dose eficaz de dsRNA de 0, 1, 5, 10 e 20 ng/μL em água estéril.
Sementes de algodão (Gossypium hirsutum e Gossypium raimondii) são obtidas através do US National Plant Germplasm System.
As sementes esterilizadas são envolvidas em algodão absorvente úmido, colocadas em placas de Petri e colocadas em uma câmara de crescimento a 25 °C, 150 μE m-2 S-1 de intensidade de luz, com um fotoperíodo 14 horas de luz/10 horas de escuridão durante 3 dias para germinarem.
As plântulas são cultivadas em vasos de cultura estéreis com solução de nutrientes de Hoagland (Sigma Aldrich) sob condições de dias longos (fotoperíodo de luz/escuridão de 16/8 h) com temperaturas de dia/noite de 26/20 °C.
Após 4 dias, as plântulas com cotilédones totalmente expandidos (antes de a primeira folha verdadeira ter aparecido) são usadas para tratamentos com PMP.
As plântulas de algodão com sete dias de idade são transferidas para sais minerais de Murashige e Skoog (MS) 0,5 x (Sigma Aldrich) com 1 x vitaminas MS (Sigma Aldrich) pH 5,6-5,8, com agarose a 0,8% (p/v) e são tratadas com uma dose eficaz de 0 (ddH2O), 1, 5, 10 e 20 ng/μL de PMPs modificados com saponina carregados com dsRNA de GrCLA1 e 0 (ddH2O), 1, 5, 10 e 20 ng/μL de PMPs não modificados carregados com dsRNA de GrCLA1 por pulverização da plântula inteira, 1 mL de solução por planta, com 3 plantas por grupo.
Alternativamente, antes do tratamento com PMP, o lado inferior dos cotilédones da planta de algodão é perfurado com uma agulha de 25 G sem perfurar através dos cotilédones.
As soluções de PMP são infiltradas manualmente a partir do lado inferior dos cotilédones através dos locais da ferida usando uma seringa sem agulha de 1 mL.
As plantas são transferidas para uma câmara de crescimento e mantidas sob condições de dias longos (fotoperíodo de luz/escuridão de 16 h/8 h) com intensidade de luz de 90 μmol m−2 s−1 e temperaturas de dia/noite de 26/20 ºC.
Após 2, 5, 8 e 14 dias, a eficiência de silenciamento gênico do dsRNA de CLA1 é examinada pelo nível de expressão de mRNA endógeno de CLA1 usando reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR). O RNA total é extraído a partir de 100 mg de folhas frescas de algodão usando reagente Trizol de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen) e tratado extensivamente com DNase I isenta de RNase (Promega). O cDNA da primeira fita é sintetizado a partir de 2 µg de RNA total com o sistema SuperScriptTM First-Strand Synthesis (Invitrogen). Para se estimarem os níveis de transcritos de CLA1, a qRT-PCR é realizada usando SYBR Green Real-Time PCR Master Mix (Thermo Scientific) com iniciadores: GrCLA1q1_F 5'-CCAGGTGGGGCTTATGCATC-3' (SEQ ID NO: 7), GrCLA1q1_R 5'-CCACACCAAGGCTTGAACCC-3' (SEQ ID NO: 8) e GrCLA1q2_F 5'-GGCCGGATTCACGAAACGGT-3' (SEQ ID NO: 9), GrCLA1q2_R 5'-CGTCGAGATTGGCAGTTGGC-3' (SEQ ID NO: 10) e 18s RNA_F 5'-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3' (SEQ ID NO: 11), 18s RNA_ R 5'-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3' (SEQ ID NO: 12), usando o seguinte programa: (a) 95 °C durante 5 min; (b) 40 ciclos de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s; e 72 °C durante 30 s.
O gene de 18S rRNA é usado como controle interno para normalizar os resultados.
A eficiência de silenciamento de CLA1 em algodão após tratamento com PMPs modificados com saponina carregados com CLA1-dsRNA e PMPs não modificados carregados com CLA1-dsRNA é determinada por cálculo do valor ΔΔCt, comparando a expressão de CLA1 normalizada após tratamento com PMPs modificados com saponina com a expressão de CLA1 normalizada após tratamento com PMPs não modificados.
Adicionalmente, a eficiência de silenciamento gênico de dsRNA de CLA1 é examinada por análise de fotobranqueamento fenotípico.
Folhas de plantas de algodão tratadas e não tratadas são fotografadas e o software ImageJ é usado para determinar a percentagem de silenciamento gênico, que é refletida por fotobranqueamento branco na folha versus a cor verde da folha de controle.
Três folhas por planta são avaliadas para se quantificar o efeito do fotobranqueamento, e a eficiência de silenciamento gênico de PMPs carregados com CLA1-dsRNA modificados com saponina versus não modificados é avaliada.
Os PMPs modificados com saponina são captados mais eficientemente pelas células vegetais e induzem maior silenciamento do gene CLA1 em comparação com os PMPs não modificados.
Exemplo 10: Aumento da captação celular de PMP por formulação de PMPs com lipídeos zwitteriônicos Este exemplo descreve o aumento da captação celular de PMPs em células animais, vegetais, fúngicas ou bacterianas, por modificação dos PMPs com lipídeos zwitteriônicos para facilitar a penetração da parede celular e/ou membrana celular.
Em este exemplo, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DOPC) é usada como um lipídeo zwitteriônico modelo, PMPs de toranja como PMP modelo, algodão como uma planta modelo, Saccharomyces cerevisiae como uma levedura modelo, MDA-MB-231 como uma linha de células humanas modelo, S. sclerotiorum como um fungo modelo e Pseudomonas syringae como uma bactéria modelo.
Protocolo Experimental: a) Modificação de PMPs com DOPC Uma solução concentrada de PMPs de toranja é isolada como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Os PMPs são ressuspensos com mistura vigorosa em soluções de DOPC a 0,001%, 0,01% 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30% p/v (Avanti Polar Lipids). Alternativamente é usada DEPC.
A concentração de PMPs é determinada assumindo 100% de recuperação da suspensão e multiplicando a concentração antes da formulação pela razão dos volumes.
As características e estabilidade de DOPC modificado com saponina são avaliadas como descrito no Exemplo 3 e Exemplo 4. b) Captação de PMP aumentada por Saccharomyces cerevisiae com PMPs de toranja modificados com DOPC carregados com proteína GFP Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2 e são carregados com proteína GFP como descrito no Exemplo 5. Alguns dos PMPs são separados como controles, e o resto é modificado com DOPC como descrito no Exemplo 10b.
A encapsulação de GFP de PMPs é medida por transferência de Western ou fluorescência.
Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações.
Brevemente, 50 mg de PMPs em 1 mL de C diluído do kit de marcação PKH26 são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37ºC durante 5 min.
A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por métodos descritos no Exemplo 2, e os péletes de PMP marcados são ressuspensos em PBS.
Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com GFP versus PMPs marcados com PKH26 modificados com DOPC carregados com GFP, células fúngicas de Saccharomyces cerevisiae são tratadas.
Saccharomyces cerevisiae é obtida a partir da ATCC (#9763) e mantida a 30 °C em caldo de extrato de levedura, peptona e dextrose (YPD) como indicado pelo fabricante.
Para se determinar a captação de PMP por S. cerevisiae, as células de levedura são cultivadas até uma OD600 de 0,4–0,6 em meio de seleção e incubadas com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs modificados carregados com GFP marcados com PKH26 diretamente em lâminas de vidro.
Adicionalmente a um controle de PBS, as células de S. cerevisiae são incubadas na presença de corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL). Após incubação de 5 min, 30 min e 1 h à temperatura ambiente são adquiridas imagens em um microscópio de fluorescência de elevada resolução.
Os PMPs são captados por células de levedura quando membrana vermelha e PMPs carregados com GFP verdes são observados no citoplasma ou se o citoplasma da célula de levedura fica vermelho e/ou verde, versus a coloração exclusiva da membrana celular pelo corante PKH26. Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs modificados com DOPC carregados com GFP em comparação com os PMPs carregados com GFP não modificados, a percentagem de células de levedura com um citoplasma verde/PMPs verdes no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs modificados com DOPC carregados com GFP é comparada com os PMPs carregados com GFP não modificados. c) Captação de PMP aumentada por S. sclerotiorum com PMPs de toranja modificados com DOPC carregados com proteína GFP Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2 e são carregados com proteína GFP como descrito no Exemplo 5. Alguns dos PMPs são separados como controles, e o resto é modificado com DOPC como descrito no Exemplo 6b.
A encapsulação de GFP de PMPs é medida por transferência de Western ou fluorescência.
Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações.
Brevemente, 50 mg de PMPs em 1 mL de C diluído são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37 ºC durante 5 min.
A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por métodos descritos no Exemplo 2, e os péletes de PMP marcados são ressuspensos em PBS.
Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com GFP versus PMPs marcados com PKH26 modificados com DOPC carregados com GFP, células fúngicas de S. sclerotiorum são tratadas.
Para se determinar a captação de PMP por ascósporos de
S. sclerotiorum (ATCC, # 18687), 10.000 ascósporos são incubados com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs modificados carregados com GFP marcados com PKH26 ou PMPs não modificados diretamente em lâminas de vidro.
Adicionalmente a um controle de PBS, as células de S. sclerotiorum são incubadas na presença de corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL). Após incubação de 5 min, 30 min e 1 h à temperatura ambiente são adquiridas imagens em um microscópio de fluorescência de elevada resolução.
Os PMPs são captados por células de levedura quando membrana vermelha e PMPs carregados com GFP verdes são observados no citoplasma ou se o citoplasma da célula de levedura fica vermelho e/ou verde, versus a coloração exclusiva da membrana celular pelo corante PKH26. Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs modificados com DOPC carregados com GFP em comparação com os PMPs carregados com GFP não modificados, a percentagem de células de S. sclerotiorum com um citoplasma verde/PMPs verdes no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs modificados com DOPC carregados com GFP é comparada com os PMPs carregados com GFP não modificados. d) Captação de PMP aumentada por células MDA-MB-231 com PMPs de toranja modificados com DOPC carregados com Calceína AM Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Alguns dos PMPs são separados como controles, e o resto é modificado com DOPC como descrito no Exemplo 6b.
Os PMPs modificados e não modificados são carregados com Calceína AM (Sigma Aldrich) como descrito no Exemplo 5 e Gray et al.,
Methods X 2015. A Calceína AM é fluorescente somente quando encapsulada por PMPs, e a encapsulação é medida por fluorescência.
Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações.
Brevemente, 50 mg de PMPs carregados com Calceína AM em 1 mL de C diluído são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37 ºC durante 5 min.
A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por lavagem e os PMPs são concentrados usando um filtro Amicon de 100 kDa como descrito no Exemplo 2. Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM versus PMPs modificados com DOPC marcados com PKH26 carregados com Calceína AM, células de câncer de mama humano são tratadas.
A linha de células de câncer de mama MDA-MB-231 é obtida a partir da ATCC (HTB-26) e cultivada e mantida de acordo com as instruções do fornecedor.
As células à confluência de 70-80% são coletadas, contadas e semeadas em placa de poços tratados com cultura de 96 poços a uma densidade de semeadura de 10.000 células por poço em 200 uL de meio de cultura de células.
As células são deixadas a aderir durante 3 horas, depois o meio é removido, as células são lavadas uma vez com Dulbecco PBS, e meio sem FCS é adicionado para privar as células de soro durante 3 horas antes do tratamento.
Para se determinar a captação de PMP por células de câncer de mama, as células são incubadas com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs não modificados e modificados com DOPC marcados com PKH26 carregados com Calceína AM marcados com PKH26 diretamente no poço.
Adicionalmente a um controle de PBS, as células são incubadas na presença de Calceína AM (concentração final 5 μg/mL), corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL) e PMPs não modificados.
Após incubação de 30 min, 1 h, 2 h e 4 h a 37 oC, as células são lavadas 4 x 10´ com PBS para remover os PMPs do meio.
As imagens são de seguida adquiridas em um microscópio de fluorescência de elevada resolução (EVOS2 FL) a 40x para se determinar a eficiência de captação.
Os PMPs são captados por células de câncer de mama quando membrana vermelha e PMPs carregados com Calceína AM verdes são observados no citoplasma ou se o citoplasma da célula fica vermelho e/ou verde, versus a coloração exclusiva da membrana celular pelo corante PKH26. Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs modificados com DOPC carregados com Calceína AM em comparação com os PMPs carregados com Calceína AM não modificados, a percentagem de células com um citoplasma verde/PMPs verdes no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs modificados com DOPC carregados com GFP é comparada com os PMPs carregados com GFP não modificados. e) Captação de PMP aumentada por Pseudomonas syringae com PMPs de toranja modificados com DOPC carregados com Calceína AM Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Alguns dos PMPs são separados como controles, e o resto é modificado com DOPC como descrito no Exemplo 10b.
Os PMPs modificados e não modificados são carregados com Calceína AM (Sigma Aldrich) como descrito no Exemplo 5 e Gray et al., Methods X 2015. A Calceína AM é fluorescente somente quando encapsulada por PMPs, e a encapsulação é medida por fluorescência.
Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações.
Brevemente, 50 mg de PMPs carregados com Calceína AM em 1 mL de C diluído do kit de marcação PKH26 são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37 ºC durante 5 min.
A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por lavagem e os PMPs são concentrados usando um filtro Amicon de 100 kDa como descrito no Exemplo 2. Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM versus PMPs modificados com DOPC marcados com PKH26 carregados com Calceína AM, células bacterianas de Pseudomonas syringae são tratadas.
As bactérias Pseudomonas syringae são obtidas a partir da ATCC (BAA-871) e cultivadas em ágar B de Meio de King de acordo com as instruções do fabricante.
Para se determinar a captação de PMP por P. syringae, 10 μL de uma suspensão bacteriana de 1 mL durante a noite são incubados com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs não modificados e modificados com DOPC marcados com PKH26 carregados com Calceína AM marcados com PKH26 diretamente em uma lâmina de vidro.
Adicionalmente a um controle de água, as bactérias P. syringae são incubadas na presença de Calceína AM (concentração final 5 μg/mL), corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL) e PMPs não modificados.
Após incubação de 5 min, 30 min e 1 h à temperatura ambiente são adquiridas imagens em um microscópio de fluorescência de elevada resolução.
Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs modificados com DOPC marcados com PKH26 carregados com Calceína AM em comparação com os PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM não modificados, a percentagem de células bacterianas com um citoplasma verde ou PMPs verdes e vermelhos no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs modificados com DOPC marcados com PKH26 carregados com Calceína AM é comparada com os PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM não modificados.
A modificação de DOPC de PMPs melhora a captação celular eficientemente em comparação com PMPs não modificados. f) Captação aumentada de PMP de PMPs de toranja modificados com DOPC carregados com dsRNA visando CLA1 em plantas de algodão Para demonstrar um aumento na captação celular por PMPs modificados com DOPC, os PMPs de toranja são carregados com miRNAs artificiais (amiRNAs, desenhados usando Plant Small RNA Maker Site (P-SAMS; Fahlgren et al., Bioinformatics. 32 (1): 157-158, 2016)) ou siRNA de substrato de dicer customizado (DsiRNA, desenhado pela IDT) visando o gene de fotossíntese do algodão GrCLA1 (1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato sintase). GrCLA1 é um gene homólogo do gene Arabidopsis Cloroplastos alterado 1 (AtCLA1), cuja perda de função resulta em um fenótipo albino nas folhas verdadeiras, proporcionando um marcador visual da eficiência de silenciamento.
Os oligonucleotídeos são obtidos a partir da IDT.
Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs modificados com DOPC versus não modificados, os PMPs de toranja são carregados com dúplexes GrCLA1-amiRNA ou GrCLA1-DsiRNA (Tabela 12), como descrito no Exemplo 5. A encapsulação de amiRNA ou DsiRNA de PMPs é medida usando o kit Quant-It RiboGreen RNA assay ou usando um amiRNA ou DsiRNA marcado com corante fluorescente de controle (IDT). De seguida, parte dos PMPs carregados é separada como controles, e o resto é modificado com DOPC como descrito no Exemplo 10b.
Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs carregados com CLA1-amiRNA/DsiRNA versus PMPs modificados com DOPC carregados com CLA1-amiRNA/DsiRNA, plântulas de algodão são tratadas e analisadas quanto ao silenciamento do gene CLA1. PMPs carregados com amiRNA ou DsiRNA (coletivamente referidos como dsRNA) são formulados em água até uma concentração que entrega um equivalente a uma dose eficaz de dsRNA de 0, 1, 5, 10 e 20 ng/μL em água estéril.
Sementes de algodão (Gossypium hirsutum e Gossypium raimondii) são obtidas através do US National Plant Germplasm System.
As sementes esterilizadas são envolvidas em algodão absorvente úmido, colocadas em placas de Petri e colocadas em uma câmara de crescimento a 25 °C, 150 μE m-2 S-1 de intensidade de luz, com um fotoperíodo 14 horas de luz/10 horas de escuridão durante 3 dias para germinarem.
As plântulas são cultivadas em vasos de cultura estéreis com solução de nutrientes de Hoagland (Sigma Aldrich) sob condições de dias longos (fotoperíodo de luz/escuridão de 16/8 h) com temperaturas de dia/noite de 26/20 °C.
Após 4 dias, as plântulas com cotilédones totalmente expandidos (antes de a primeira folha verdadeira ter aparecido) são usadas para tratamentos com PMP.
As plântulas de algodão com sete dias de idade são transferidas para sais minerais de Murashige e Skoog (MS) 0,5 x (Sigma Aldrich) com 1 x vitaminas MS (Sigma Aldrich) pH 5,6-5,8, com agarose a 0,8% (p/v) e são tratadas com uma dose eficaz de 0 (ddH2O), 1, 5, 10 e 20 ng/μL de PMPs modificados com DOPC carregados com dsRNA de GrCLA1 e 0 (ddH2O), 1, 5, 10 e 20 ng/μL de PMPs não modificados carregados com dsRNA de GrCLA1 por pulverização da plântula inteira, 1 mL de solução por planta, com 3 plantas por grupo.
Alternativamente,
antes do tratamento com PMP, o lado inferior dos cotilédones da planta de algodão é perfurado com uma agulha de 25 G sem perfurar através dos cotilédones.
As soluções de PMP são infiltradas manualmente a partir do lado inferior dos cotilédones através dos locais da ferida usando uma seringa sem agulha de 1 mL.
As plantas são transferidas para uma câmara de crescimento e mantidas sob condições de dias longos (fotoperíodo de luz/escuridão de 16 h/8 h) com intensidade de luz de 90 μmol m−2 s−1 e temperaturas de dia/noite de 26/20 ºC.
Após 2, 5, 8 e 14 dias, a eficiência de silenciamento gênico do dsRNA de CLA1 é examinada pelo nível de expressão de mRNA endógeno de CLA1 usando reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR). O RNA total é extraído a partir de 100 mg de folhas frescas de algodão usando reagente Trizol de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen) e tratado extensivamente com DNase I isenta de RNase (Promega). O cDNA da primeira fita é sintetizado a partir de 2 µg de RNA total com o sistema SuperScriptTM First-Strand Synthesis (Invitrogen). Para se estimarem os níveis de transcritos de CLA1, a qRT-PCR é realizada usando SYBR Green Real-Time PCR Master Mix (Thermo Scientific) com iniciadores: GrCLA1q1_F 5'-CCAGGTGGGGCTTATGCATC-3' (SEQ ID NO: 7), GrCLA1q1_R 5'-CCACACCAAGGCTTGAACCC-3' (SEQ ID NO: 8) e GrCLA1q2_F 5'-GGCCGGATTCACGAAACGGT-3' (SEQ ID NO: 9), GrCLA1q2_R 5'-CGTCGAGATTGGCAGTTGGC-3' (SEQ ID NO: 10) e 18s RNA_F 5'-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3' (SEQ ID NO: 11), 18s RNA_ R 5'-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3' (SEQ ID NO: 12), usando o seguinte programa: (a) 95 °C durante 5 min; (b) 40 ciclos de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s; e 72 °C durante 30 s.
O gene de 18S rRNA é usado como controle interno para normalizar os resultados.
A eficiência de silenciamento de CLA1 em algodão após tratamento com PMPs modificados com DOPC carregados com CLA1-
dsRNA e PMPs não modificados carregados com CLA1-dsRNA é determinada por cálculo do valor ΔΔCt, comparando a expressão de CLA1 normalizada após tratamento com PMPs modificados com DOPC com a expressão de CLA1 normalizada após tratamento com PMPs não modificados.
Adicionalmente, a eficiência de silenciamento gênico de dsRNA de CLA1 é examinada por análise de fotobranqueamento fenotípico.
Folhas de plantas de algodão tratadas e não tratadas são fotografadas e o software ImageJ é usado para determinar a percentagem de silenciamento gênico, que é refletida por fotobranqueamento branco na folha versus a cor verde da folha de controle.
Três folhas por planta são avaliadas para se quantificar o efeito do fotobranqueamento, e a eficiência de silenciamento gênico de PMPs carregados com CLA1-dsRNA modificados com DOPC versus não modificados é avaliada.
Os PMPs modificados com DOPC são captados mais eficientemente pelas células vegetais e induzem maior silenciamento do gene CLA1 em comparação com os PMPs não modificados.
Exemplo 11: Aumento da captação celular de PMP por formulação de PMPs com lipídeos ionizáveis Este exemplo descreve o aumento da captação celular de PMPs em células animais, vegetais, fúngicas ou bacterianas, por modificação dos PMPs com lipídeos ionizáveis para facilitar a penetração da parede celular e/ou membrana celular.
Em este exemplo, 1,1‘-((2-(4-(2-((2-(bis(2-hidroxidodecil)amino)etil)(2- hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1-il)etil)azanodi-il)bis(dodecan-2-ol) (C12-200) é usado como um lipídeo ionizável modelo, PMPs de toranja como PMP modelo, algodão como uma planta modelo, Saccharomyces cerevisiae como uma levedura modelo, MDA-MB-231 como uma linha de células humanas modelo, S. sclerotiorum como um fungo modelo e
Pseudomonas syringae como uma bactéria modelo. Protocolo Experimental: a) Modificação de PMPs com C12-200 Uma solução concentrada de PMPs de toranja é isolada como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. C12-200 (Lipídeos ionizáveis) é obtido seguindo o protocolo de síntese em Love PNAS 2010. Os PMPs são ressuspensos com mistura vigorosa em soluções de C12-200 a 0,001%, 0,01% 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30% p/v (Avanti Polar Lipids). A concentração de PMPs é determinada assumindo 100% de recuperação da suspensão e multiplicando a concentração antes da formulação pela razão dos volumes. As características e estabilidade de PMP modificado com C12-200 são avaliadas como descrito no Exemplo 3 e Exemplo 4. b) Captação de PMP aumentada por Saccharomyces cerevisiae com PMPs de toranja modificados com C12-200 carregados com proteína
GFP Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2 e são carregados com proteína GFP como descrito no Exemplo 5. Alguns dos PMPs são separados como controles, e o resto é modificado com C12-200 como descrito no Exemplo 11b. A encapsulação de GFP de PMPs é medida por transferência de Western ou fluorescência. Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações. Brevemente, 50 mg de PMPs em 1 mL de C diluído do kit de marcação PKH26 são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37 ºC durante 5 min. A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por métodos descritos no Exemplo 2, e os péletes de PMP marcados são ressuspensos em PBS. Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com GFP versus PMPs marcados com PKH26 modificados com C12-200 carregados com GFP, células fúngicas de Saccharomyces cerevisiae são tratadas.
Saccharomyces cerevisiae é obtida a partir da ATCC (#9763) e mantida a 30 °C em caldo de extrato de levedura, peptona e dextrose (YPD) como indicado pelo fabricante.
Para se determinar a captação de PMP por S. cerevisiae, as células de levedura são cultivadas até uma OD600 de 0,4–0,6 em meio de seleção e incubadas com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs modificados carregados com GFP marcados com PKH26 diretamente em lâminas de vidro.
Adicionalmente a um controle de PBS, as células de S. cerevisiae são incubadas na presença de corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL). Após incubação de 5 min, 30 min e 1 h à temperatura ambiente são adquiridas imagens em um microscópio de fluorescência de elevada resolução.
Os PMPs são captados por células de levedura quando membrana vermelha e PMPs carregados com GFP verdes são observados no citoplasma ou se o citoplasma da célula de levedura fica vermelho e/ou verde, versus a coloração exclusiva da membrana celular pelo corante PKH26. Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs modificados com C12-200 carregados com GFP em comparação com os PMPs carregados com GFP não modificados, a percentagem de células de levedura com um citoplasma verde/PMPs verdes no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs modificados com C12-200 carregados com GFP é comparada com os PMPs carregados com GFP não modificados. c) Captação de PMP aumentada por S. sclerotiorum com PMPs de toranja modificados com C12-200 carregados com proteína GFP Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2 e são carregados com proteína GFP como descrito no Exemplo 5. Alguns dos PMPs são separados como controles, e o resto é modificado com C12-200 como descrito no Exemplo 6b.
A encapsulação de GFP de PMPs é medida por transferência de Western ou fluorescência.
Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações.
Brevemente, 50 mg de PMPs em 1 mL de C diluído são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37ºC durante 5 min.
A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por métodos descritos no Exemplo 2, e os péletes de PMP marcados são ressuspensos em PBS.
Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com GFP versus PMPs marcados com PKH26 modificados com C12-200 carregados com GFP, células fúngicas de S. sclerotiorum são tratadas.
Para se determinar a captação de PMP por ascósporos de S. sclerotiorum (ATCC, # 18687), 10.000 ascósporos são incubados com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs modificados carregados com GFP marcados com PKH26 ou PMPs não modificados diretamente em lâminas de vidro.
Adicionalmente a um controle de PBS, as células de S. sclerotiorum são incubadas na presença de corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL). Após incubação de 5 min, 30 min e 1 h à temperatura ambiente são adquiridas imagens em um microscópio de fluorescência de elevada resolução.
Os PMPs são captados por células de levedura quando membrana vermelha e PMPs carregados com GFP verdes são observados no citoplasma ou se o citoplasma da célula de levedura fica vermelho e/ou verde, versus a coloração exclusiva da membrana celular pelo corante PKH26. Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs modificados com C12-200 carregados com GFP em comparação com os PMPs carregados com DOPC não modificados, a percentagem de células de S. sclerotiorum com um citoplasma verde/PMPs verdes no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs modificados com C12-200 carregados com GFP é comparada com os PMPs carregados com GFP não modificados. d) Captação de PMP aumentada por células MDA-MB-231 com PMPs de toranja modificados com C12-200 carregados com Calceína AM Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Alguns dos PMPs são separados como controles, e o resto é modificado com C12-200 como descrito no Exemplo 6b.
Os PMPs modificados e não modificados são carregados com Calceína AM (Sigma Aldrich) como descrito no Exemplo 5 e Gray et al., Methods X 2015. A Calceína AM é fluorescente somente quando encapsulada por PMPs, e a encapsulação é medida por fluorescência.
Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações.
Brevemente, 50 mg de PMPs carregados com Calceína AM em 1 mL de C diluído são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37 ºC durante 5 min.
A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por lavagem e os PMPs são concentrados usando um filtro Amicon de 100 kDa como descrito no Exemplo 2. Para se determinar a eficiência de captação de PMP de
PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM versus PMPs modificados com C12-200 marcados com PKH26 carregados com Calceína AM, células de câncer de mama humano são tratadas.
A linha de células de câncer de mama MDA-MB-231 é obtida a partir da ATCC (HTB-26) e cultivada e mantida de acordo com as instruções do fornecedor.
As células à confluência de 70-80% são coletadas, contadas e semeadas em placa de poços tratados com cultura de 96 poços a uma densidade de semeadura de 10.000 células por poço em 200 uL de meio de cultura de células.
As células são deixadas a aderir durante 3 horas, depois o meio é removido, as células são lavadas uma vez com Dulbecco PBS, e meio sem FCS é adicionado para privar as células de soro durante 3 horas antes do tratamento.
Para se determinar a captação de PMP por células de câncer de mama, as células são incubadas com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs não modificados e modificados com C12-200 marcados com PKH26 carregados com Calceína AM marcados com PKH26 diretamente no poço.
Adicionalmente a um controle de PBS, as células são incubadas na presença de Calceína AM (concentração final 5 μg/mL), corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL) e PMPs não modificados.
Após incubação de 30 min, 1 h, 2 h e 4 h a 37 oC, as células são lavadas 4 x 10´ com PBS para remover os PMPs do meio.
As imagens são de seguida adquiridas em um microscópio de fluorescência de elevada resolução (EVOS2 FL) a 40x para se determinar a eficiência de captação.
Os PMPs são captados por células de câncer de mama quando membrana vermelha e PMPs carregados com Calceína AM verdes são observados no citoplasma ou se o citoplasma da célula fica vermelho e/ou verde, versus a coloração exclusiva da membrana celular pelo corante PKH26. Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs modificados com C12-200 carregados com Calceína AM em comparação com os PMPs carregados com
Calceína AM não modificados, a percentagem de células com um citoplasma verde/PMPs verdes no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs modificados com C12-200 carregados com GFP é comparada com os PMPs carregados com GFP não modificados. e) Captação de PMP aumentada por Pseudomonas syringae com PMPs de toranja modificados com C12-200 carregados com Calceína AM Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Alguns dos PMPs são separados como controles, e o resto é modificado com C12-200 como descrito no Exemplo 11b.
Os PMPs modificados e não modificados são carregados com Calceína AM (Sigma Aldrich) como descrito no Exemplo 5 e Gray et al., Methods X 2015. A Calceína AM é fluorescente somente quando encapsulada por PMPs, e a encapsulação é medida por fluorescência.
Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações.
Brevemente, 50 mg de PMPs carregados com Calceína AM em 1 mL de C diluído do kit de marcação PKH26 são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37 ºC durante 5 min.
A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por lavagem e os PMPs são concentrados usando um filtro Amicon de 100 kDa como descrito no Exemplo 2. Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM versus PMPs modificados com C12-200 marcados com PKH26 carregados com Calceína AM, células bacterianas de Pseudomonas syringae são tratadas.
As bactérias Pseudomonas syringae são obtidas a partir da ATCC (BAA-871) e cultivadas em ágar B de Meio de King de acordo com as instruções do fabricante.
Para se determinar a captação de PMP por P. syringae, 10 μL de uma suspensão bacteriana de 1 mL durante a noite são incubados com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs não modificados e modificados com C12-200 marcados com PKH26 carregados com Calceína AM marcados com PKH26 diretamente em uma lâmina de vidro.
Adicionalmente a um controle de água, as bactérias P. syringae são incubadas na presença de Calceína AM (concentração final 5 μg/mL), corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL) e PMPs não modificados.
Após incubação de 5 min, 30 min e 1 h à temperatura ambiente são adquiridas imagens em um microscópio de fluorescência de elevada resolução.
Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs modificados com C12-200 marcados com PKH26 carregados com Calceína AM em comparação com os PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM não modificados, a percentagem de células bacterianas com um citoplasma verde ou PMPs verdes e vermelhos no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs modificados com C12-200 marcados com PKH26 carregados com Calceína AM é comparada com os PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM não modificados.
A modificação de C12-200 de PMPs melhora a captação celular eficientemente em comparação com PMPs não modificados. f) Captação aumentada de PMP de PMPs de toranja modificados com C12-200 carregados com dsRNA visando CLA1 em plantas de algodão
Para demonstrar um aumento na captação celular por PMPs modificados com C12-200, os PMPs de toranja são carregados com miRNAs artificiais (amiRNAs, desenhados usando Plant Small RNA Maker Site (P-SAMS; Fahlgren et al., Bioinformatics. 32 (1): 157-158, 2016)) ou siRNA de substrato de dicer customizado (DsiRNA, desenhado pela IDT) visando o gene de fotossíntese do algodão GrCLA1 (1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato sintase). GrCLA1 é um gene homólogo do gene Arabidopsis Cloroplastos alterado 1 (AtCLA1), cuja perda de função resulta em um fenótipo albino nas folhas verdadeiras, proporcionando um marcador visual da eficiência de silenciamento.
Os oligonucleotídeos são obtidos a partir da IDT.
Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs modificados com C12-200 versus não modificados, os PMPs de toranja são carregados com dúplexes GrCLA1-amiRNA ou GrCLA1-DsiRNA (Tabela 12), como descrito no Exemplo 5. A encapsulação de amiRNA ou DsiRNA de PMPs é medida usando o kit Quant-It RiboGreen RNA assay ou usando um amiRNA ou DsiRNA marcado com corante fluorescente de controle (IDT). De seguida, parte dos PMPs carregados é separada como controles, e o resto é modificado com C12-200 como descrito no Exemplo 11b.
Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs carregados com CLA1-amiRNA/DsiRNA versus PMPs modificados com C12-200 carregados com CLA1-amiRNA/DsiRNA, plântulas de algodão são tratadas e analisadas quanto ao silenciamento do gene CLA1. PMPs carregados com amiRNA ou DsiRNA (coletivamente referidos como dsRNA) são formulados em água até uma concentração que entrega um equivalente a uma dose eficaz de dsRNA de 0, 1, 5, 10 e 20 ng/μL em água estéril.
Sementes de algodão (Gossypium hirsutum e Gossypium raimondii) são obtidas através do US National Plant Germplasm System.
As sementes esterilizadas são envolvidas em algodão absorvente úmido, colocadas em placas de Petri e colocadas em uma câmara de crescimento a 25 °C, 150 μE m-2 S-1 de intensidade de luz, com um fotoperíodo 14 horas de luz/10 horas de escuridão durante 3 dias para germinarem.
As plântulas são cultivadas em vasos de cultura estéreis com solução de nutrientes de Hoagland (Sigma Aldrich) sob condições de dias longos (fotoperíodo de luz/escuridão de 16/8 h) com temperaturas de dia/noite de 26/20 °C.
Após 4 dias, as plântulas com cotilédones totalmente expandidos (antes de a primeira folha verdadeira ter aparecido) são usadas para tratamentos com PMP.
As plântulas de algodão com sete dias de idade são transferidas para sais minerais de Murashige e Skoog (MS) 0,5 x (Sigma Aldrich) com 1 x vitaminas MS (Sigma Aldrich) pH 5,6-5,8, com agarose a 0,8% (p/v) e são tratadas com uma dose eficaz de 0 (ddH2O), 1, 5, 10 e 20 ng/μL de PMPs modificados com C12-200 carregados com dsRNA de GrCLA1 e 0 (ddH2O), 1, 5, 10 e 20 ng/μL de PMPs não modificados carregados com dsRNA de GrCLA1 por pulverização da plântula inteira, 1 mL de solução por planta, com 3 plantas por grupo.
Alternativamente, antes do tratamento com PMP, o lado inferior dos cotilédones da planta de algodão é perfurado com uma agulha de 25 G sem perfurar através dos cotilédones.
As soluções de PMP são infiltradas manualmente a partir do lado inferior dos cotilédones através dos locais da ferida usando uma seringa sem agulha de 1 mL.
As plantas são transferidas para uma câmara de crescimento e mantidas sob condições de dias longos (fotoperíodo de luz/escuridão de 16 h/8 h) com intensidade de luz de 90 μmol m−2 s−1 e temperaturas de dia/noite de 26/20 ºC.
Após 2, 5, 8 e 14 dias, a eficiência de silenciamento gênico do dsRNA de CLA1 é examinada pelo nível de expressão de mRNA endógeno de CLA1 usando reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR). O RNA total é extraído a partir de 100 mg de folhas frescas de algodão usando reagente Trizol de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen) e tratado extensivamente com DNase I isenta de RNase (Promega). O cDNA da primeira fita é sintetizado a partir de 2 µg de RNA total com o sistema SuperScriptTM First-Strand Synthesis (Invitrogen). Para se estimarem os níveis de transcritos de CLA1, a qRT-PCR é realizada usando SYBR Green Real-Time PCR Master Mix (Thermo Scientific) com iniciadores: GrCLA1q1_F 5'-CCAGGTGGGGCTTATGCATC-3' (SEQ ID NO: 7), GrCLA1q1_R 5'-CCACACCAAGGCTTGAACCC-3' (SEQ ID NO: 8) e GrCLA1q2_F 5'-GGCCGGATTCACGAAACGGT-3' (SEQ ID NO: 9), GrCLA1q2_R 5'-CGTCGAGATTGGCAGTTGGC-3' (SEQ ID NO: 10) e 18s RNA_F 5'-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3' (SEQ ID NO: 11), 18s RNA_ R 5'-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3' (SEQ ID NO: 12), usando o seguinte programa: (a) 95 °C durante 5 min; (b) 40 ciclos de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s; e 72 °C durante 30 s.
O gene de 18S rRNA é usado como controle interno para normalizar os resultados.
A eficiência de silenciamento de CLA1 em algodão após tratamento com PMPs modificados com C12-200 carregados com CLA1-dsRNA e PMPs não modificados carregados com CLA1-dsRNA é determinada por cálculo do valor ΔΔCt, comparando a expressão de CLA1 normalizada após tratamento com PMPs modificados com C12- 200 com a expressão de CLA1 normalizada após tratamento com PMPs não modificados.
Adicionalmente, a eficiência de silenciamento gênico de dsRNA de CLA1 é examinada por análise de fotobranqueamento fenotípico.
Folhas de plantas de algodão tratadas e não tratadas são fotografadas e o software ImageJ é usado para determinar a percentagem de silenciamento gênico, que é refletida por fotobranqueamento branco na folha versus a cor verde da folha de controle.
Três folhas por planta são avaliadas para se quantificar o efeito do fotobranqueamento, e a eficiência de silenciamento gênico de PMPs carregados com CLA1-dsRNA modificados com C12-200 versus não modificados é avaliada.
Os PMPs modificados com C12-200 são captados mais eficientemente pelas células vegetais e induzem maior silenciamento do gene CLA1 em comparação com os PMPs não modificados.
Exemplo 12: Aumento da captação celular de PMP por formulação de PMPs com lipídeos catiônicos Este exemplo descreve o aumento da captação celular de PMPs em células animais, vegetais, fúngicas ou bacterianas, por modificação dos PMPs com lipídeos catiônicos para facilitar a penetração da parede celular e/ou membrana celular.
Em este exemplo, PMPs de toranja são usados como PMPs modelo, algodão como uma planta modelo, Saccharomyces cerevisiae como uma levedura modelo, MDA-MB-231 como uma linha de células humanas modelo, S. sclerotiorum como um fungo modelo e Pseudomonas syringae como uma bactéria modelo.
Protocolo Experimental: a) Modificação de PMPs com um lipídeo catiônico Uma solução concentrada de PMPs de toranja é isolada como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Os PMPs são ressuspensos com mistura vigorosa em soluções de um lipídeo catiônico a 0,001%, 0,01% 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30% p/v (Avanti Polar Lipids). A concentração de PMPs é determinada assumindo 100% de recuperação da suspensão e multiplicando a concentração antes da formulação pela razão dos volumes.
As características e estabilidade de PMP modificado com lipídeo catiônico são avaliadas como descrito no Exemplo 3 e Exemplo 4. b) Captação de PMP aumentada por Saccharomyces cerevisiae com
PMPs de toranja modificados com lipídeo catiônico carregados com proteína GFP Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2 e são carregados com proteína GFP como descrito no Exemplo 5. Alguns dos PMPs são separados como controles, e o resto é modificado com um lipídeo catiônico como descrito no Exemplo 12b.
A encapsulação de GFP de PMPs é medida por transferência de Western ou fluorescência.
Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações.
Brevemente, 50 mg de PMPs em 1 mL de C diluído do kit de marcação PKH26 são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37 ºC durante 5 min.
A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por métodos descritos no Exemplo 2, e os péletes de PMP marcados são ressuspensos em PBS.
Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com GFP versus PMPs marcados com PKH26 modificados com lipídeo catiônico carregados com GFP, células fúngicas de Saccharomyces cerevisiae são tratadas.
Saccharomyces cerevisiae é obtida a partir da ATCC (#9763) e mantida a 30 °C em caldo de extrato de levedura, peptona e dextrose (YPD) como indicado pelo fabricante.
Para se determinar a captação de PMP por S. cerevisiae, as células de levedura são cultivadas até uma OD600 de 0,4–0,6 em meio de seleção e incubadas com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs modificados carregados com GFP marcados com PKH26 diretamente em lâminas de vidro.
Adicionalmente a um controle de PBS, as células de S. cerevisiae são incubadas na presença de corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL). Após incubação de 5 min, 30 min e 1 h à temperatura ambiente são adquiridas imagens em um microscópio de fluorescência de elevada resolução.
Os PMPs são captados por células de levedura quando membrana vermelha e PMPs carregados com GFP verdes são observados no citoplasma ou se o citoplasma da célula de levedura fica vermelho e/ou verde, versus a coloração exclusiva da membrana celular pelo corante PKH26. Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs modificados com lipídeo catiônico carregados com GFP em comparação com os PMPs carregados com GFP não modificados, a percentagem de células de levedura com um citoplasma verde/PMPs verdes no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs modificados com lipídeo catiônico carregados com GFP é comparada com os PMPs carregados com GFP não modificados. c) Captação de PMP aumentada por S. sclerotiorum com PMPs de toranja modificados com lipídeo catiônico carregados com proteína GFP Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2 e são carregados com proteína GFP como descrito no Exemplo 5. Alguns dos PMPs são separados como controles, e o resto é modificado com um lipídeo catiônico como descrito no Exemplo 6b.
A encapsulação de GFP de PMPs é medida por transferência de Western ou fluorescência.
Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações.
Brevemente, 50 mg de PMPs em 1 mL de C diluído são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37ºC durante 5 min.
A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por métodos descritos no
Exemplo 2, e os péletes de PMP marcados são ressuspensos em PBS.
Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com GFP versus PMPs marcados com PKH26 modificados com lipídeo catiônico carregados com GFP, células fúngicas de S. sclerotiorum são tratadas.
Para se determinar a captação de PMP por ascósporos de S. sclerotiorum (ATCC, # 18687), 10.000 ascósporos são incubados com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs modificados carregados com GFP marcados com PKH26 ou PMPs não modificados diretamente em lâminas de vidro.
Adicionalmente a um controle de PBS, as células de S. sclerotiorum são incubadas na presença de corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL). Após incubação de 5 min, 30 min e 1 h à temperatura ambiente são adquiridas imagens em um microscópio de fluorescência de elevada resolução.
Os PMPs são captados por células de levedura quando membrana vermelha e PMPs carregados com GFP verdes são observados no citoplasma ou se o citoplasma da célula de levedura fica vermelho e/ou verde, versus a coloração exclusiva da membrana celular pelo corante PKH26. Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs modificados com lipídeo catiônico carregados com GFP em comparação com os PMPs carregados com GFP não modificados, a percentagem de células de S. sclerotiorum com um citoplasma verde/PMPs verdes no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs modificados com lipídeo catiônico carregados com GFP é comparada com os PMPs carregados com GFP não modificados. d) Captação de PMP aumentada por células MDA-MB-231 com PMPs de toranja modificados com lipídeo catiônico carregados com Calceína
AM Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Alguns dos PMPs são separados como controles, e o resto é modificado com um lipídeo catiônico como descrito no Exemplo 6b. Os PMPs modificados e não modificados são carregados com Calceína AM (Sigma Aldrich) como descrito no Exemplo 5 e Gray et al., Methods X 2015. A Calceína AM é fluorescente somente quando encapsulada por PMPs, e a encapsulação é medida por fluorescência. Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações. Brevemente, 50 mg de PMPs carregados com Calceína AM em 1 mL de C diluído são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37 ºC durante 5 min. A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por lavagem e os PMPs são concentrados usando um filtro Amicon de 100 kDa como descrito no Exemplo 2. Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM versus PMPs modificados com lipídeo catiônico marcados com PKH26 carregados com Calceína AM, células de câncer de mama humano são tratadas. A linha de células de câncer de mama MDA-MB-231 é obtida a partir da ATCC (HTB-26) e cultivada e mantida de acordo com as instruções do fornecedor. As células à confluência de 70-80% são coletadas, contadas e semeadas em placa de poços tratados com cultura de 96 poços a uma densidade de semeadura de 10.000 células por poço em 200 µL de meio de cultura de células. As células são deixadas a aderir durante 3 horas, depois o meio é removido, as células são lavadas uma vez com Dulbecco PBS, e meio sem FCS é adicionado para privar as células de soro durante 3 horas antes do tratamento.
Para se determinar a captação de PMP por células de câncer de mama, as células são incubadas com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs não modificados e modificados com lipídeo catiônico marcados com PKH26 carregados com Calceína AM marcados com PKH26 diretamente no poço.
Adicionalmente a um controle de PBS, as células são incubadas na presença de Calceína AM (concentração final 5 μg/mL), corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL) e PMPs não modificados.
Após incubação de 30 min, 1 h, 2 h e 4 h a 37 oC, as células são lavadas 4 x 10´ com PBS para remover os PMPs do meio.
As imagens são de seguida adquiridas em um microscópio de fluorescência de elevada resolução (EVOS2 FL) a 40x para se determinar a eficiência de captação.
Os PMPs são captados por células de câncer de mama quando membrana vermelha e PMPs carregados com Calceína AM verdes são observados no citoplasma ou se o citoplasma da célula fica vermelho e/ou verde, versus a coloração exclusiva da membrana celular pelo corante PKH26. Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs modificados com lipídeo catiônico carregados com Calceína AM em comparação com os PMPs carregados com Calceína AM não modificados, a percentagem de células com um citoplasma verde/PMPs verdes no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs modificados com lipídeo catiônico carregados com GFP é comparada com os PMPs carregados com GFP não modificados. e) Captação de PMP aumentada por Pseudomonas syringae com PMPs de toranja modificados com lipídeo catiônico carregados com Calceína
AM Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Alguns dos PMPs são separados como controles, e o resto é modificado com um lipídeo catiônico como descrito no Exemplo 12b.
Os PMPs modificados e não modificados são carregados com Calceína AM (Sigma Aldrich) como descrito no Exemplo 5 e Gray et al., Methods X 2015. A Calceína AM é fluorescente somente quando encapsulada por PMPs, e a encapsulação é medida por fluorescência.
Todas as formulações de PMP são depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH26 (Sigma) vermelho de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações.
Brevemente, 50 mg de PMPs carregados com Calceína AM em 1 mL de C diluído do kit de marcação PKH26 são misturados com 2 mL de PKH26 a 1 mM e incubados a 37 ºC durante 5 min.
A marcação é parada por adição de 1 mL de BSA a 1%. Todo o corante não marcado é separado por lavagem e os PMPs são concentrados usando um filtro Amicon de 100 kDa como descrito no Exemplo 2. Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM versus PMPs modificados com lipídeo catiônico marcados com PKH26 carregados com Calceína AM, células bacterianas de Pseudomonas syringae são tratadas.
As bactérias Pseudomonas syringae são obtidas a partir da ATCC (BAA-871) e cultivadas em ágar B de Meio de King de acordo com as instruções do fabricante.
Para se determinar a captação de PMP por P. syringae, 10 μL de uma suspensão bacteriana de 1 mL durante a noite são incubados com 0 (controle negativo), 1, 10 ou 50, 100 e 250 µg/mL de PMPs não modificados e modificados com lipídeo catiônico marcados com PKH26 carregados com Calceína AM marcados com PKH26 diretamente em uma lâmina de vidro.
Adicionalmente a um controle de água, as bactérias P. syringae são incubadas na presença de Calceína AM (concentração final 5 μg/mL), corante PKH26 (concentração final 5 μg/mL) e PMPs não modificados.
Após incubação de 5 min, 30 min e 1 h à temperatura ambiente são adquiridas imagens em um microscópio de fluorescência de elevada resolução.
Para se avaliar a eficiência de captação de PMPs modificados com lipídeo catiônico marcados com PKH26 carregados com Calceína AM em comparação com os PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM não modificados, a percentagem de células bacterianas com um citoplasma verde ou PMPs verdes e vermelhos no citoplasma, versus coloração somente da membrana é comparada entre as células tratadas com PMP e os controles somente com PBS e corante PKH26. A quantidade de captação em cada célula é quantificada por medição do sinal de fluorescência vermelho e verde mediano da célula usando software ImageJ, e a eficiência de captação de PMPs modificados com lipídeo catiônico marcados com PKH26 carregados com Calceína AM é comparada com os PMPs marcados com PKH26 carregados com Calceína AM não modificados.
A modificação de lipídeo catiônico de PMPs melhora a captação celular eficientemente em comparação com PMPs não modificados. f) Captação aumentada de PMP de PMPs de toranja modificados com lipídeo catiônico carregados com dsRNA visando CLA1 em plantas de algodão Para demonstrar um aumento na captação celular por PMPs modificados com lipídeo catiônico, os PMPs de toranja são carregados com miRNAs artificiais (amiRNAs, desenhados usando Plant Small RNA Maker Site (P-SAMS; Fahlgren et al., Bioinformatics. 32 (1): 157-158, 2016)) ou siRNA de substrato de dicer customizado (DsiRNA, desenhado pela IDT) visando o gene de fotossíntese do algodão GrCLA1 (1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato sintase). GrCLA1 é um gene homólogo do gene Arabidopsis Cloroplastos alterado 1 (AtCLA1), cuja perda de função resulta em um fenótipo albino nas folhas verdadeiras, proporcionando um marcador visual da eficiência de silenciamento.
Os oligonucleotídeos são obtidos a partir da IDT.
Os PMPs são produzidos a partir de toranja como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2. Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs modificados com lipídeo catiônico versus não modificados, os PMPs de toranja são carregados com dúplexes GrCLA1-amiRNA ou GrCLA1-DsiRNA (Tabela 12), como descrito no Exemplo 5. A encapsulação de amiRNA ou DsiRNA de PMPs é medida usando o kit Quant-It RiboGreen RNA assay ou usando um amiRNA ou DsiRNA marcado com corante fluorescente de controle (IDT). De seguida, parte dos PMPs carregados é separada como controles, e o resto é modificado com um lipídeo catiônico como descrito no Exemplo 12b.
Para se determinar a eficiência de captação de PMP de PMPs carregados com CLA1-amiRNA/DsiRNA versus PMPs modificados com lipídeo catiônico carregados com CLA1-amiRNA/DsiRNA, plântulas de algodão são tratadas e analisadas quanto ao silenciamento do gene CLA1. PMPs carregados com amiRNA ou DsiRNA (coletivamente referidos como dsRNA) são formulados em água até uma concentração que entrega um equivalente a uma dose eficaz de dsRNA de 0, 1, 5, 10 e 20 ng/μL em água estéril.
Sementes de algodão (Gossypium hirsutum e Gossypium raimondii) são obtidas através do US National Plant Germplasm System.
As sementes esterilizadas são envolvidas em algodão absorvente úmido, colocadas em placas de Petri e colocadas em uma câmara de crescimento a 25 °C, 150 μE m-2 S-1 de intensidade de luz, com um fotoperíodo 14 horas de luz/10 horas de escuridão durante 3 dias para germinarem.
As plântulas são cultivadas em vasos de cultura estéreis com solução de nutrientes de Hoagland (Sigma Aldrich) sob condições de dias longos (fotoperíodo de luz/escuridão de 16/8 h) com temperaturas de dia/noite de 26/20 °C.
Após 4 dias, as plântulas com cotilédones totalmente expandidos (antes de a primeira folha verdadeira ter aparecido) são usadas para tratamentos com PMP.
As plântulas de algodão com sete dias de idade são transferidas para sais minerais de Murashige e Skoog (MS) 0,5 x (Sigma Aldrich) com 1 x vitaminas MS (Sigma Aldrich) pH 5,6-5,8, com agarose a 0,8% (p/v) e são tratadas com uma dose eficaz de 0 (ddH2O), 1, 5, 10 e 20 ng/μL de PMPs modificados com lipídeo catiônico carregados com dsRNA de GrCLA1 e 0 (ddH2O), 1, 5, 10 e 20 ng/μL de PMPs não modificados carregados com dsRNA de GrCLA1 por pulverização da plântula inteira, 1 mL de solução por planta, com 3 plantas por grupo.
Alternativamente, antes do tratamento com PMP, o lado inferior dos cotilédones da planta de algodão é perfurado com uma agulha de 25 G sem perfurar através dos cotilédones.
As soluções de PMP são infiltradas manualmente a partir do lado inferior dos cotilédones através dos locais da ferida usando uma seringa sem agulha de 1 mL.
As plantas são transferidas para uma câmara de crescimento e mantidas sob condições de dias longos (fotoperíodo de luz/escuridão de 16 h/8 h) com intensidade de luz de 90 μmol m−2 s−1 e temperaturas de dia/noite de 26/20 ºC.
Após 2, 5, 8 e 14 dias, a eficiência de silenciamento gênico do dsRNA de CLA1 é examinada pelo nível de expressão de mRNA endógeno de CLA1 usando reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR). O RNA total é extraído a partir de 100 mg de folhas frescas de algodão usando reagente Trizol de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen) e tratado extensivamente com DNase I isenta de RNase (Promega). O cDNA da primeira fita é sintetizado a partir de 2 µg de RNA total com o sistema SuperScriptTM First-Strand Synthesis (Invitrogen). Para se estimarem os níveis de transcritos de CLA1, a qRT-PCR é realizada usando SYBR
Green Real-Time PCR Master Mix (Thermo Scientific) com iniciadores: GrCLA1q1_F 5'-CCAGGTGGGGCTTATGCATC-3' (SEQ ID NO: 7), GrCLA1q1_R 5'-CCACACCAAGGCTTGAACCC-3' (SEQ ID NO: 8) e GrCLA1q2_F 5'-GGCCGGATTCACGAAACGGT-3' (SEQ ID NO: 9), GrCLA1q2_R 5'-CGTCGAGATTGGCAGTTGGC-3' (SEQ ID NO: 10) e 18s RNA_F 5'-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3' (SEQ ID NO: 11), 18s RNA_ R 5'-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3' (SEQ ID NO: 12), usando o seguinte programa: (a) 95 °C durante 5 min; (b) 40 ciclos de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s; e 72 °C durante 30 s.
O gene de 18S rRNA é usado como controle interno para normalizar os resultados.
A eficiência de silenciamento de CLA1 em algodão após tratamento com PMPs modificados com lipídeo catiônico carregados com CLA1-dsRNA e PMPs não modificados carregados com CLA1- dsRNA é determinada por cálculo do valor ΔΔCt, comparando a expressão de CLA1 normalizada após tratamento com PMPs modificados com lipídeo catiônico com a expressão de CLA1 normalizada após tratamento com PMPs não modificados.
Adicionalmente, a eficiência de silenciamento gênico de dsRNA de CLA1 é examinada por análise de fotobranqueamento fenotípico.
Folhas de plantas de algodão tratadas e não tratadas são fotografadas e o software ImageJ é usado para determinar a percentagem de silenciamento gênico, que é refletida por fotobranqueamento branco na folha versus a cor verde da folha de controle.
Três folhas por planta são avaliadas para se quantificar o efeito do fotobranqueamento, e a eficiência de silenciamento gênico de PMPs carregados com CLA1-dsRNA modificados com lipídeo catiônico versus não modificados é avaliada.
Os PMPs modificados com lipídeo catiônico são captados mais eficientemente pelas células vegetais e induzem maior silenciamento do gene CLA1 em comparação com os PMPs não modificados.
Exemplo 13: Modificação de PMPs usando lipídeos catiônicos Este exemplo demonstra a capacidade de modificar a carga superficial, aumentar a capacidade de carga de carga e aumentar a captação celular de PMPs em células humanas e vegetais, por modificação de PMPs com lipídeos catiônicos.
Em este exemplo, DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano) e DC-Colesterol (3ß-[N- (N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol) são usados como lipídeos catiônicos modelo, PMPs de toranja e limão como PMPs modelo, siRNA/RNA de CRISPR Trans-ativante (TracrRNA) como uma carga útil negativamente carregada modelo, COLO679 como uma linha de células humanas modelo e Zea mays (milho) Black Mexican sweet (BMS) como uma linha de células vegetais modelo.
Protocolo Experimental: a) Produção de PMPs de limão/toranja Toranjas orgânicas vermelhas ou limões orgânicos amarelos foram obtidos a partir de uma mercearia local.
Seis litros de suco de toranja foram coletados em uma prensa de suco, o pH ajustado até pH 4 com NaOH, incubados com pectinase a 1U/mL (Sigma, 17389) para se removerem os contaminantes de pectina e, subsequentemente, centrifugados a 3.000 g durante 20 minutos, seguido por 10.000 g durante 40 minutos para se removerem os grandes detritos.
De seguida, o suco processado foi incubado com EDTA a 500 mM pH 8,6, até uma concentração final de EDTA a 50 mM, pH 7,7 durante 30 minutos para quelar o cálcio e prevenir a formação de macromoléculas de pectina.
Subsequentemente, o suco tratado com EDTA foi passado através de um filtro de 11 µm, 1 µm e 0,45 µm para se removerem as grandes partículas.
O suco filtrado foi lavado e concentrado por Filtração de Fluxo Tangencial (TFF) usando uma TFF de 300 kDa.
O suco foi concentrado 10x, seguido por diafiltração em 10 diavolumes em de PBS e, adicionalmente, concentrado até uma concentração final de 120 mL (50x). De seguida usámos cromatografia por exclusão de tamanhos (SEC) para eluir as frações contendo PMP, que foram analisadas por absorbância a 280 (SpectraMax®) e concentração de proteína (Ensaio PierceTM BCA Protein) para verificar as frações contendo PMP e frações tardias contendo contaminantes.
As frações de SEC 3-7 continham PMPs purificados (as frações 9-12 continham contaminantes) e foram agrupadas, esterilizadas por filtração sequencial usando filtros de seringa de 0,8 µm, 0,45 µm e 0,22 µm e concentradas adicionalmente por peletização de PMPs durante 1,5 hrs a 40.000x g e o pélete ressuspenso em 4 mL de Água Destilada Isenta de DNase/RNase UltraPure™ (ThermoFisher, 10977023). A concentração final de PMP (7,56x1012 PMPs/mL) e tamanho de PMP (70,3 nm +/- 12,4 nm SD) foram determinados por NanoFCM, usando padrões de concentração e tamanho proporcionados pelo fabricante.
Os PMPs de toranja (GF) ou limão (LM) produzidos foram usados para extração de lipídeos usando o método de Bligh-Dyer, como descrito em baixo. b) Modificação de PMPs com lipídeos catiônicos Para preparar PMPs reconstituídos com lipídeos (LPMP), a extração de lipídeos totais de uma solução concentrada de PMPs de toranja ou limão foi realizada usando o método Bligh-Dyer de (Bligh e Dyer, J Biolchem Physiol, 37: 911-917, 1959). Brevemente, 1 mL de PMPs concentrados (1012-1013 PMPs/mL) foi misturado com uma mistura de clorofórmio:metanol de 3,5 mL (1:2, v/v) e submetido a vórtex bem.
Depois, 1,25 mL de clorofórmio foram adicionados e submetidos a vórtex, seguido por agitação com 1,25 mL de água estéril.
Finalmente, a mistura foi centrifugada a 300 g durante 5 minutos à TA.
A fase orgânica inferior contendo lipídeos foi recuperada e seca usando um sistema TurboVap® (Biotage®). Para modificar a composição de lipídeos de LPMPs naturais, lipídeos catiônicos sintéticos (DOTAP, DC-
Colesterol) foram dissolvidos em clorofórmio:metanol (9:1) e adicionados aos lipídeos extraídos de PMP para totalizar 25% ou 40% (p/p) do lipídeo total, seguido por mistura vigorosa.
O filme de lipídeos seco foi preparado por evaporação do solvente com uma corrente de gás inerte (por exemplo, nitrogênio) ou por evaporação usando o sistema TurboVap® (Figura 1). Para preparar PMPs reconstruídos a partir de lipídeos extraídos, água ou tampão (por exemplo, PBS) foi adicionado ao filme de lipídeos seco e foi deixado durante 1 h à TA para hidratar.
As partículas de lipídeos formadas foram sujeitas a 10 ciclos de congelamento-descongelamento ou sonicação (banho de sonicação Branson 2800, 10 min, TA). Em seguida, para reduzir o número de bicamadas de lipídeos e o tamanho global de partículas, os PMPs de lipídeos foram extrudados através de filtros de policarbonato de 0,8 µm, 0,4 µm e 0,2 µm usando uma Mini Extrusora (Avanti® Polar Lipids) (Figura 1). Se fosse requerido LPMP concentrado, as amostras foram concentradas por ultracentrifugação a 100.000 x g durante 30 min a 4ºC.
O pélete final foi ressuspenso em água UltraPure estéril ou PBS e mantido a 4 oC até ao uso adicional.
A concentração final de LPMP e o tamanho mediano de LPMP (variando de 89-104 nm) foram determinados por NanoFCM, usando padrões de concentração e tamanho proporcionados pelo fabricante.
A carga superficial (potencial zeta) foi medida por dispersão de luz dinâmica usando um Zetasizer (Malvern Panalytical) (Figura 4A). A gama de tamanho e concentrações de LPMP foi 83±19 nm e 1,7x1012 LPMPs/mL para LPMPs de LM, 106±25 nm e 6,54x1010 LPMPs/mL para LPMPs modificados com DOTAP e 91±17 nm e 3,08x1011 LPMPs/mL para PMPs modificados com DC-Colesterol (Figura 2). A modificação de LPMPs com os lipídeos catiônicos DOTAP e DC-Colesterol mudou a carga superficial de LPMPs: com conteúdo crescente de lipídeo catiônico, a carga superficial de LPMPs aumentou (Figura 4A). A análise das imagens Cryo-EM de
LPMPs reconstruídos a partir de lipídeos de limão extraídos confirmou a esfericidade de LPMPs e a distribuição dos tamanhos das partículas (68,7 ± 23 nm (SD)) (Figs. 3A e 3B). c) Carga de PMPs modificados com lipídeos catiônicos com carga negativamente carregada Para carregar siRNA/TracrRNA, os lipídeos extraídos de GF ou LM foram suplementados com lipídeos catiônicos e secos como descrito acima. siRNA/TracrRNA dissolvido em uma água isenta de nuclease ou Tampão de Dúplex (IDT®) foi adicionado ao filme de lipídeos seco a 1,5 nmol por 1 mg de lipídeos de PMP e foi deixado durante 1 h à TA para hidratar.
As partículas de lipídeos formadas foram sujeitas a 10 ciclos de congelamento-descongelamento e extrudadas através de filtros de policarbonato de 0,8 µm, 0,4 µm e 0,2 µm usando uma Mini Extrusora (Avanti® Polar Lipids) (Figura 1). Os PMPs carregados foram dialisados durante a noite contra PBS em um dispositivo de diálise (Spectrum®) com uma membrana MWCO de 100 kDa e depois esterilizados usando filtros de Poliétersulfona (PES) de 0,2 µm.
Adicionalmente, as amostras foram purificadas e concentradas usando ultracentrifugação.
Os PMPs carregados foram centrifugados durante 30 min a 100.000 x g a 4 ºC, o sobrenadante foi removido, e o pélete foi ressuspenso em 1 mL de PBS e concentrado a 100.000 x g durante 30 min.
O pélete resultante foi ressuspenso em PBS (para captação celular por células humanas) ou água (para captação celular por células vegetais). O tamanho dos LPMPs carregados com RNA e o número de partículas foram avaliados por NanoFCM: o tamanho médio e a concentração de partículas foram 89 ± 15 nm e 1,54x1012 LPMPs/mL para LPMPs não modificados, 104 ± 25 nm e 2,54x1011 LPMPs/mL para DC-Col e 100 ± 30 nm e 9,7x1011 LPMPs/mL para DOTAP.
A carga de RNA foi determinada pelo ensaio Quant-iTTM RiboGreenTM ou por medição da intensidade fluorescente da carga marcada (siRNA marcado com Alexa Fluor 555 ou TracrRNA marcado com ATTO 550). O ensaio RiboGreenTM foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante na presença de heparina (5 mg/mL) e Triton-X100 a 1% para lisar os PMPs e liberar a carga encapsulada.
A modificação de LPMPs com os lipídeos catiônicos DOTAP e DC-Colesterol mudou a carga superficial de LPMPs e aumentou a carga de carga negativamente carregada (por exemplo, RNA), em comparação com LPMPs sem lipídeos catiônicos (Figs. 4A-4D). d) Captação aumentada de PMPs modificados com DOTAP por células humanas (COLO679) PMPs modificados com lipídeos (LPMP) de toranja suplementados com DOTAP (20%, p/p) foram preparados como descrito acima.
As formulações de PMP foram depois marcadas com corante de membrana lipofílica PKH67 verde (Sigma) de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações.
Brevemente, 300 µL de LPMPs (aprox. 1x1012 PMPs/mL) foram misturados 1:1 com diluente C, seguido por mistura com corante PKH67 diluído em diluente C (a razão final de corante:amostra foi 1:500, v/v) e incubação à TA durante 1 h com agitação a 100 rpm.
O corante livre foi removido por purificação de LPMPs em Colunas de Dessalinização ZebaTM Spin (MWCO de 40 kDa, Thermo Fisher Scientific) equilibradas com PBS.
Os LPMPs marcados foram esterilizados usando filtros estéreis de 0,2 µm, concentrados por ultracentrifugação (30 min, 100.000 g, 4 ºoC) e ressuspensos em PBS estéril.
A concentração final de LPMP e o tamanho médio (1,1x1012 LPMPs/mL e 83 ± 19 nm para LPMP; 8,95x1011 e 100 ± 30 nm para DOTAP) foram determinados por NanoFCM.
A intensidade fluorescente foi avaliada usando um espectrofotômetro (SpectraMax®) a Ex/Em = 485/510 nm.
O corante PKH67 livre à mesma concentração (1:500, v/v) foi purificado usando a mesma abordagem.
As células COLO679 foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific) com FBS inativado pelo calor a 10% (Gibco) e Penicilina-Estreptomicina a 1% (Gibco). As células foram semeadas em uma placa de 96 poços a 6000 células/poço um dia antes da experiência.
Para determinar a captação de LPMPs marcados com PKH67, as células COLO679 foram incubadas com LPMPs à concentração de 2x1010 partículas por poço durante 3 h a 37 ºC.
O corante PKH67 livre foi usado como um controle.
No final do tempo de incubação, as células foram lavadas duas vezes com PBS gelado 1x e fixadas com 100 µL de formaldeído a 4% em PBS durante 15-30 min.
Os núcleos das células foram corados com DAPI (Thermo Fisher Scientific). As imagens foram adquiridas usando um microscópio de fluorescência (Olympus IX83) com uma lente objetiva de 40x.
A modificação com DOTAP aumentou a captação/associação de LPMPs com as células COLO679, em comparação com LPMPs sem lipídeos catiônicos (Figura 5). Nossos dados sugerem que os LPMPs modificados com DOTAP intensificaram a captação e/ou associação de veículo com células COLO679 em comparação com LPMPs sem lipídeos catiônicos adicionais. e) Entrega aumentada de RNA a células vegetais por PMPs modificadas por DC-Colesterol Células de Zea mays, Black Mexican sweet (BMS) foram adquiridas do Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC). As células de BMS foram cultivadas em meio basal de Murashige e Skoog pH 5,8, contendo Mistura de Sais Basais de Murashige e Skoog a 4,3 g/L (Sigma M5524), sacarose a 2% (S0389, Millipore Sigma), ácido 2,4- diclorofenoxiacético a 2 mg/mL (D7299, Millipore Sigma), tiamina HCl a 250 µg/L (V-014, Millipore Sigma) e uma solução de mistura de vitaminas MS 1x em ddH2O.
A solução de mistura de vitaminas 1x continha niacina (N0761-100G, Millipore Sigma), Hidrocloreto de piroxidina (P6280-25G, Millipore Sigma), sal hemicálcio de ácido D- pantotênico (P5155-100G, Millipore Sigma), L-Asparagina (A4159-25G, Millipore Sigma) e Mio-inositol (I7508-100G, Millipore Sigma) às respectivas concentrações finais de 1,3 mg/L, 250 μg/L, 250 μg/L, 130 mg/L e 200 mg/L.
As células foram cultivadas em frascos cônicos estéreis ventilados de 1 L, em condições de escuridão a 24 C com agitação (110 rpm). Para tratamento com células de BMS, 10 mL das suspensões de células foram retirados para se determinar a percentagem de Volume de Células Empacotadas (PCV). O PCV é definido como o volume de células dividido pelo volume total da alíquota de cultura de células e expresso como uma percentagem.
As células foram centrifugadas durante 5 min a 3900 rpm, e o volume do pélete de células foi determinado.
A % de PCV para BMS foi 20%. Para a experiência de captação, a % de PCV das culturas foi ajustada até 4% por diluição das células no meio como descrito acima.
Os LPMPs e LPMPs modificados com DC-Colesterol foram carregados com TracrRNA marcado com ATTO 550 como descrito acima, esterilizados e ressuspensos em água estéril.
O tamanho médio e a concentração das partículas foram analisados por NanoFCM e foram 104 ± 25 nm e 2,54x1011 LPMPs/mL para DC-Col e 89 ± 15 nm e 1,54x1012 LPMPs/mL para LPMPs não modificados.
A quantidade de TracrRNA ATTO 550 (IDT) em amostras foi quantificada por Quant-iTTM RiboGreen®. 50 µL tanto de LPMPs como de LPMP modificados com DC-Colesterol contendo 433 ng de TracrRNA foram adicionados a uma alíquota de 450 µL de suspensão de células vegetais em uma placa de 24 poços em duplicado. 50 µL de água estéril ultrapura foram adicionados às células e foram usados como um controle negativo.
As células foram incubadas durante 3 horas a 24 C na escuridão e foram lavadas três vezes com 1 mL de água estéril ultrapura para remover as partículas que não haviam sido captadas pelas células.
As células foram ressuspensas em 500 µL de água estéril ultrapura para visualização em um microscópio de epifluorescência (Olympus IX83). Em comparação com o controle negativo (água estéril ultrapura), que não tinha fluorescência detectável, um sinal fluorescente variável pôde ser detectado em células vegetais tratadas com LPMPs e LPMPs modificados com DC-Colesterol (Figura 6). Os LPMPs modificados com DC-Colesterol exibiram o sinal de fluorescência mais forte, indicando que esta modificação PMP teve a entrega mais elevada de TracrRNA às células vegetais.
Nossos dados mostram que a modificação de LPMPs com o lipídeo catiônico DC- Colesterol melhorou a captação de LPMP de limão por células vegetais in vitro.
Exemplo 14: Modificação de PMPs usando lipídeos ionizáveis Este exemplo demonstra a capacidade de modificar a carga superficial de uma maneira dependente do pH, aumentando a capacidade de carga de carga e captação celular de PMPs em células vegetais, por modificação de PMPs com lipídeos ionizáveis.
Em este exemplo, C12-200 (1,1‘-((2-(4-(2-((2-(bis(2-hidroxidodecil)amino)etil) (2-hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1-il)etil)azanodi-il)bis(dodecan-2- ol)) e MC3 (4-(Dimetilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)- heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ila, DLin-MC3-DMA) são usados como lipídeos ionizáveis modelo, PMPs de limão são usados como um PMP modelo e RNA de CRISPR Trans-ativante (TracrRNA), RNA guia único (gRNA) como uma carga útil negativamente carregada modelo.
Células de maís Black Mexican Sweet (BMS) são usadas como uma linha de células vegetais modelo. a) Modificação de PMPs com lipídeos ionizáveis Para preparar PMPs modificados com lipídeos (LPMP), os lipídeos foram extraídos usando o método de Bligh-Dyer (Bligh e Dyer, 1959, J Biolchem Physiol 37: 911-917) a partir de uma solução concentrada de PMPs de limão, isolados como descrito no Exemplo 13. Lipídeos ionizáveis foram adicionados à solução de estoque de lipídeos extraídos com PMP em Clorofórmio:Metanol (9:1) para totalizar 25% ou 40% (p/p) de lipídeos totais, e os lipídeos foram ressuspensos por mistura vigorosa. O filme de lipídios seco e os PMPs reconstruídos a partir de lipídeos extraídos foram preparados como descrito no Exemplo
13. O tamanho dos LPMPs e o número de partículas foram avaliados por NanoFCM. A gama de tamanho e concentrações de LPMP foi 83 ±19 nm e 1,7x1012 LPMPs/mL para LPMPs de LM, 88 ± 22 nm e 1,35x1012 LPMPs/mL para LPMPs modificados com MC3 e 86 ±16 nm e 1,19 x1012 LPMP/mL para PMPs modificados com C12-200 (Figura 7). A carga superficial (potencial zeta) foi medida por dispersão de luz dinâmica usando um Zetasizer (Malvern Panalytical). A modificação de PMPs reconstruídos com lipídeos com os lipídeos ionizáveis C12-200 e MC3 permitiu a mudança dependente do pH na carga superficial de LPMPs: com pH decrescente, a carga superficial de LPMP aumentou (Figura 8A). b) Carga de PMPs modificados com lipídeos ionizáveis com carga negativamente carregada TracrRNA/gRNA dissolvido em uma água isenta de nuclease ou Tampão de Dúplex (IDT®) foi adicionado ao filme de lipídeos seco a 1,5 nmol por 1 mg de lipídeos de PMP e foi deixado durante 1 h à TA para hidratar. Tampão de citrato a 0,1 M pH 3,2 (Teknova) foi usado para ajustar o pH da solução de lipídeos ressuspensa até 4,5 para promover o aprisionamento de RNA. A solução de lipídeos foi depois sujeita a 5 ciclos de congelamento-descongelamento. Subsequentemente, o pH da solução de lipídeos foi levado até pH 9 usando tampão de bicarbonato a 0,1 M (pH 10) e os lipídeos foram depois sujeitos a 5 ciclos adicionais de congelamento- descongelamento. As partículas de lipídeos formadas foram extrudadas através de filtros de policarbonato de 0,8 µm, 0,4 µm e 0,2 µm usando uma Mini Extrusora (Avanti® Polar Lipids). Os PMPs carregados foram dialisados durante a noite contra PBS em um dispositivo de diálise (Spectrum®) com uma membrana MWCO de 100 kDa e depois esterilizados usando filtros de Poliétersulfona (PES) de 0,2 µm.
Adicionalmente, as amostras foram purificadas e concentradas usando ultracentrifugação.
Os PMPs carregados foram centrifugados durante 30 min a 100.000 x g a 4 ºC, o sobrenadante foi removido, e o pélete foi ressuspenso em 1 mL de PBS e concentrado a 100.000 x g durante 30 min.
O pélete resultante foi ressuspenso em água (para captação celular por células vegetais). O tamanho dos LPMPs carregados com RNA e o número de partículas foram avaliados por NanoFCM.
O tamanho médio e concentração de partículas de LPMP foi 89 ± 15 nm e 1,54x1012 LPMPs/mL para LPMP não modificado; 87 ± 16 nm e 7,15 x1011 LPMPs/mL para LPMPs modificados com C12-200; e 93 ± 27 nm e 2,4x1011 LPMP/mL para LPMPs modificados com MC3. A carga de RNA foi determinada pelo ensaio RiboGreenTM ou pela medição da intensidade fluorescente da carga marcada (TracrRNA ATTO 550). O ensaio RiboGreenTM foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante na presença de heparina (5 mg/mL) e Triton-X100 a 1% para lisar os PMPs e liberar a carga encapsulada.
A modificação de PMPs reconstruídos com lipídeos com os lipídeos ionizáveis MC3 e C12-200 permitiu a mudança dependente do pH na carga superficial de LPMPs e carga aumentada de carga negativamente carregada (por exemplo, RNA) em pH ácido, em comparação com LPMPs sem lipídeos ionizáveis (Figs. 8B e 8C). c) Captação aumentada de PMPs modificados com C12-200 por células vegetais (BMS) Células de Zea mays Black Mexican Sweet (BMS) foram cultivadas como descrito no Exemplo 13(e). Para tratamento com células de BMS, 10 mL das suspensões de células foram retirados para se determinar a percentagem de Volume de Células Empacotadas (PCV). O PCV é definido como o volume de células dividido pelo volume total da alíquota de cultura de células e expresso como uma percentagem.
As células foram centrifugadas durante 5 min a 3900 rpm, e o volume do pélete de células foi determinado.
A % de PCV para BMS foi 20%. Para a experiência de captação, a % de PCV das culturas foi ajustada até 4% por diluição das células no meio como descrito acima.
Os LPMPs e LPMPs modificados com C12-200 foram carregados com TracrRNA ATTO 550 como descrito acima, esterilizados e ressuspensos em água estéril.
O tamanho médio e a concentração das partículas analisados por NanoFCM foram 87 ± 16 nm e 7,15x1011 LPMPs/mL para C12-200-LPMPs e 89 ± 15 nm e 7,15Ex1012 LPMPs/mL para LPMPs não modificados.
A quantidade de TracrRNA ATTO 550 (IDT) em amostras foi quantificada por Quant-iTTM RiboGreenTM. 50 µL de LPMPs ou LPMPs modificados com C12-200 contendo 433 ng de TracrRNA foram adicionados a uma alíquota de 450 µL de suspensão de células vegetais em uma placa de 24 poços em duplicado. 50 µL de água estéril ultrapura foram adicionados às células e foram usados como um controle negativo.
As células foram incubadas durante 3 horas a 24 C na escuridão e foram lavadas três vezes com 1 mL de água estéril ultrapura para remover as partículas que não haviam sido captadas pelas células.
As células foram ressuspensas em 500 µL de água estéril ultrapura para visualização em um microscópio de epifluorescência (Olympus IX83). Em comparação com o controle negativo (água estéril ultrapura), que não tinha fluorescência detectável, um sinal fluorescente variável pôde ser detectado em células vegetais tratadas com LPMPs e LPMPs modificados com C12-200 (Figura 9). Os LPMPs modificados com C12-200 exibiram o sinal de fluorescência mais forte, indicando que esta modificação PMP teve a entrega/associação mais elevada de TracrRNA com células vegetais.
Nossos dados mostram que a modificação de LPMPs com o lipídeo ionizável C12-200 melhorou a captação de LPMP de limão por células vegetais in vitro.
Exemplo 15: Modificação de PMPs com a proteína de penetração de paredes celulares celulase Este exemplo demonstra a capacidade de se aumentar a captação celular de PMPs em células vegetais, fúngicas ou bacterianas por modificação dos PMPs com celulase para facilitar a degradação de componentes da parede celular.
Em este exemplo, a celulase é usada como uma enzima de degradação da parede celular modelo, PMPs de toranja são usados como um PMP modelo e as células de maís Black Mexican Sweet são usadas como uma célula vegetal modelo.
Protocolo Experimental: a) Síntese de celulase-PEG4-azida De modo a rastrear a enzima, a celulase (Sigma Aldrich) foi marcada com o marcador fluorescente Alexa Fluor® 488 (ThermoFisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante.
Brevemente, 20 mg de celulase foram dissolvidos em 2 mL de tampão de bicarbonato (pH 8,3) até uma concentração final de 10 mg/mL.
Alexa Fluor® 488 (AF488) foi dissolvido em DMSO anidro (10 mg/mL), e 30 µL de AF488 foram adicionados à celulase dissolvida.
Após incubação durante 1 h à temperatura ambiente (TA), 150 rpm, escuridão, a mistura foi mantida a 4 °C durante a noite.
O corante livre foi removido por colunas de dessalinização PD-10 equilibradas com PBS (GE Healthcare). A celulase marcada com AF488 coletada em PBS (0,45 mg/mL, como detectado pelo ensaio BCA) foi reagida com NHS-PEG4-azida (ThermoFisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante.
Brevemente, NHS-PEG4-azida foi dissolvida em DMSO anidro até uma concentração final de 100 mM e adicionada a 2 mL de celulase marcada com AF488 até uma concentração final de 10 mM.
As duas soluções foram misturadas e incubadas à TA, 150 rpm, 30 min, escuridão.
A reação foi parada por adição de Tris-HCl até uma concentração final de 100 mM.
O tubo foi ajustado para 2 h a 4 °C para extinguir totalmente a reação e, depois, a purificação foi realizada usando colunas de dessalinização spin Zeba (MWCO 7 kDa) equilibradas com PBS.
Um dispositivo Amicon® Ultra 10K (MWCO 10 kDa, 4 mL) foi usado para concentrar a celulase-PEG4-azida marcada com AF488. A celulase modificada tinha uma concentração de proteína de 0,38 mg/mL, como detectado pelo ensaio BCA, e reteve uma atividade enzimática inicial de 32% como detectado pelo kit fluorometric Cellulase Activity Assay (Abcam). b) Modificação de PMPs com celulase-PEG4-azida Várias estratégias foram empregues para modificar a superfície dos PMPs de toranja com celulase.
Protocolo de modificação b.1 Os grupos amino de PMPs foram reagidos com NHS-Fosfina (ThermoFisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante e, depois, PMP-Fosfina foi conjugada com celulase-PEG4-azida marcada com AF488 (como descrito no Exemplo 15(a)) através de uma reação isenta de cobre entre os grupos fosfina e azida.
Brevemente, NHS- Fosfina foi dissolvida em DMSO anidro até uma concentração final de 10 mM e adicionada a PMPs ressuspendos em PBS (8,4x1012 PMPs/mL) até uma concentração final de NHS-Fosfina de 1 mM.
As duas soluções foram misturadas e incubadas à TA, 150 rpm, durante 30 min.
A reação foi parada por adição de Tris-HCl até uma concentração final de 150 mM.
O tubo foi ajustado para 2 h a 4 °C para extinguir totalmente a reação e, depois, a purificação foi realizada usando um dispositivo Amicon® Ultra 100K (MWCO 100 kDa, 0,5 mL) seguido por colunas de dessalinização spin Zeba (MWCO 7 kDa) equilibradas com
PBS.
Depois, a PMP-Fosfina foi misturada com 700 µL de celulase- PEG4-azida marcada com AF488 e incubada durante 3 h a 37 °C na escuridão.
A mistura foi dialisada contra PBS durante 2 dias a 4 °C usando Spectra/Por® Biotech-Grade Dialysis Tubing 300 kDa MWCO (Spectrum Laboratories Inc.) para remover a celulase não ligada e químicos e subprodutos adicionais.
Após diálise, os PMPs modificados com celulase foram concentrados usando o dispositivo Amicon® Ultra 100K (MWCO 100 kDa). O produto final tinha uma concentração de proteína de 0,8 mg/mL como detectado pelo ensaio BCA e uma concentração de partículas de 5,3x1012 PMPs/mL, com uma população bloqueada fluorescente de 4% como detectado por NanoFCM.
A atividade enzimática inicial restante foi 9,3%. Protocolo de modificação b.2 Os grupos carboxila de PMPs foram reagidos com NH2- DBCO (MilliporeSigma) de acordo com as instruções do fabricante e, depois, PMP-DBCO foi conjugada com celulase-PEG4-azida marcada com AF488 (Exemplo 15(a)) através de química isenta de cobre: reação entre os grupos DBCO e azida.
Em primeiro lugar, os grupos carboxila de PMPs foram ativados usando hidrocloreto de EDC (hidrocloreto de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida, ThermoFisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante.
Brevemente, 0,2 mL de PMPs de toranja (3,8x1013 PMPs/mL) foram misturados com 1 mg de EDC recém-dissolvido em tampão de acetato (pH final ~5-5,5). A mistura foi incubada à TA durante 15 min e depois combinada com DBCO-NH2 dissolvido (10 mM, DMSO anidro) até uma concentração final de 1 mM.
A mistura reacional foi incubada à TA, 150 rpm, 30 min.
A reação foi parada por adição de Tris-HCl a 1 M até uma concentração final de 150 mM.
O tubo foi ajustado para 2 h a 4 °C para extinguir totalmente a reação e, depois, a purificação foi realizada usando um dispositivo Amicon® Ultra 100K (MWCO 100 kDa, 0,5 mL) seguido por colunas de dessalinização spin Zeba (MWCO 7 kDa) equilibradas com PBS.
Em segundo lugar, o PMP-DBCO foi misturado com 700 µL de celulase- PEG4-azida marcada com AF488 e incubado durante 3 h a 37 °C na escuridão.
Para remover a celulase não ligada e subprodutos, a mistura foi dialisada contra PBS durante 2 dias a 4 °C usando Spectra/Por® Biotech-Grade Dialysis Tubing 300 kDa MWCO (Spectrum Laboratories Inc.). Após diálise, os PMPs modificados com celulase foram concentrados usando o dispositivo Amicon® Ultra 100K (MWCO 100 kDa). O produto final tinha uma concentração de proteína de 0,9 mg/mL como detectado pelo ensaio BCA e uma concentração de partículas de 5,2x1012 PMPs/mL, com uma população bloqueada fluorescente de 7% como detectado por NanoFCM.
A atividade enzimática inicial restante foi 8,4%, como detectado pelo kit fluorometric Cellulase Activity Assay (Abcam). Protocolo de modificação b.3 Os grupos amino de PMPs foram reagidos com NHS-PEG4- DBCO (MilliporeSigma) de acordo com as instruções do fabricante e, depois, PMP-PEG4-DBCO foi conjugada com celulase-PEG4-azida marcada com AF488 (Exemplo 15(a)) através de uma reação isenta de cobre entre os grupos DBCO e azida.
Brevemente, o NHS-PEG4-DBCO foi dissolvido em DMSO anidro até uma concentração final de 10 mM e adicionada a PMPs ressuspendos em PBS (8,4x1012 PMPs/mL) até uma concentração final de NHS-PEG4-DBCO de 1 mM.
As duas soluções foram misturadas e incubadas à TA, 150 rpm, 30 min.
A reação foi parada por adição de Tris-HCl a 1 M até uma concentração final de 150 mM.
O tubo foi ajustado para 2 h a 4 °C para extinguir totalmente a reação e, depois, a purificação foi realizada usando um dispositivo Amicon® Ultra 100K (MWCO 100 kDa, 0,5 mL) seguido por colunas de dessalinização spin Zeba (MWCO 7 kDa) equilibradas com PBS.
Depois, o PMP-PEG4-DBCO foi misturado com 700 µL de celulase-
PEG4-azida marcada com AF488 e incubado durante 3 h a 37 °C na escuridão.
A mistura foi dialisada contra PBS durante 2 dias a 4 °C usando Spectra/Por® Biotech-Grade Dialysis Tubing 300 kDa MWCO (Spectrum Laboratories Inc.). Após diálise, os PMPs modificados com celulase foram concentrados usando um dispositivo Amicon® Ultra 100K (MWCO 100 kDa). O produto final tinha uma concentração de proteína de 1,3 mg/mL como detectado pelo ensaio BCA e uma concentração de partículas de 2x1012 PMPs/mL, com uma população bloqueada fluorescente de 17% como detectado por NanoFCM.
A atividade enzimática inicial restante foi 17%, como detectado pelo kit fluorometric Cellulase Activity Assay (Abcam). c) Modificação de PMPs com celulase (c.1) Os grupos carboxila de PMPs de toranja foram reagidos com grupos amino de celulase marcada com AF488 usando uma química de carbodi-imida.
Em primeiro lugar, os grupos carboxila de PMPs foram ativados usando hidrocloreto de EDC (ThermoFisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante.
Brevemente, 0,2 mL de PMPs de toranja (3,8x1013 PMPs/mL) foram misturados com 1 mg de EDC recém-dissolvido em tampão de acetato (pH final ~5-5,5) e incubados à TA durante 15 min.
Depois, a celulase marcada com AF488 foi incubada com PMPs ativados durante 2 h, TA, 150 rpm, escuridão.
A purificação foi realizada usando colunas de dessalinização Zeba spin (MWCO 7 kDa) equilibradas com PBS, seguido por diálise contra PBS durante 2 dias a 4 °C usando Spectra/Por® Biotech-Grade Dialysis Tubing 300 kDa MWCO (Spectrum Laboratories Inc.). Após diálise, os PMPs modificados com celulase foram concentrados usando um dispositivo Amicon® Ultra 100K (MWCO 100 kDa). O produto final tinha uma concentração de proteína de 1,1 mg/mL como detectado pelo ensaio BCA e uma concentração de partículas de 1,6x1012 PMPs/mL, com uma população bloqueada fluorescente de 27% como detectado por
NanoFCM.
A atividade enzimática inicial restante foi 9,2%, como detectado pelo kit fluorometric Cellulase Activity Assay (Abcam). d) Marcação de PMPs modificados com celulase com corante lipofílico Os PMPs de toranja modificados com celulase marcados com AlexaFluor488 resultantes foram marcados com corante PKH26 lipofílico (MilliporeSigma) de modo a terem dupla marcação (verde - AF488 e vermelho - PKH26). Os PMPs modificados (2x1012 PMPs/mL em PBS) foram misturados com diluente C (MilliporeSigma) a uma razão de 1:1 v/v.
O corante PKH26 foi dissolvido no diluente C e misturado com os PMPs pré-diluídos a uma razão final igual a 1:500 (corante:diluente C, v/v). As misturas reacionais foram incubadas durante 30 min a 37 °C seguido por purificação usando colunas de dessalinização spin Zeba (MWCO 7 kDa) equilibradas com PBS para remover o corante livre.
Depois, os PMPs modificados com celulase marcados com PKH26 foram concentrados usando um dispositivo Amicon® Ultra 100K (MWCO 100 kDa, 10 min, 4.000 g, 3 vezes). Os PMPs finais foram analisados usando NanoFCM (aprox. 7x1012 PMPs/mL) e normalizados com base na intensidade fluorescente do marcador PKH26 (Ex/Em = 550/570 nm). Corante livre incubado com diluente C e purificado do mesmo modo como descrito acima foi usado como um controle. e) Captação de PMP aumentada por células vegetais de Zea mays BMS com PMPs de toranja modificados com celulase Células de Zea mays, Black Mexican dweet (BMS) foram cultivadas como descrito no Exemplo 13(e). Para tratamento com células de BMS, 10 mL das suspensões de células foram retirados para se determinar a percentagem de Volume de Células Empacotadas (PCV). As células foram centrifugadas durante 5 min a 3900 rpm, e o volume do pélete de células foi determinado.
A % de PCV para BMS foi
20%. Para a experiência de captação, a % de PCV das culturas foi ajustada até 4%, por diluição das células no meio como descrito acima.
Os PMPs de toranja foram conjugados com celulase marcada com AlexaFluor488 usando diferentes reticulações originando PMPs conjugados com celulase como descrito no Exemplo 15(b), seguido por marcação de PKH26 da membrana de lipídeos de PMP.
Um grupo de controle de PMPs de toranja marcados com PKH26 mas sem modificação de celulase (GF-PMP) foi também preparado.
Todas as amostras foram esterilizadas, ressuspensas em água estéril e analisadas por NanoFCM, ensaio de proteína e ensaio de atividade de celulase como descrito acima.
Depois, 250 µL de cada PMP modificado com celulase e GF-PMP contendo uma quantidade igual de PMPs (2,65x1012 PMPs/mL) foram adicionados a 250 µL de suspensão de células BMS em uma placa de 24 poços em duplicado. 250 µL de água estéril ultrapura e controle de marcação de corante PKH26 livre foram adicionados às células e foram usados como um controle negativo.
As células foram incubadas durante 30 min a 24 °C na escuridão e foram lavadas três vezes com 1 mL de água estéril ultrapura para remover as partículas que não haviam sido captadas pelas células.
As células foram ressuspensas em 500 µL de água estéril ultrapura para visualização em um microscópio de epifluorescência (Olympus IX83). As células incubadas com água estéril ultrapura e controle de marcação de PKH26 não tinham nível de fluorescência detectável.
O sinal fluorescente de células incubadas com GF-PMP marcadas com PKH26 foi muito baixo/não detectável em comparação com o sinal fluorescente de células vegetais tratadas com PMPs modificados com celulase (Figura 10). Os PMPs modificados com celulase-azida através de ligantes NH2- DBCO (protocolo de modificação b.2) ou NHS-PEG4-DBCO (protocolo de modificação b.3) exibiram o sinal de fluorescência mais forte, indicando que estes PMP modificados com celulase tiveram a captação mais elevada em células vegetais. Nossos dados mostram que a modificação de PMPs com celulase melhorou a captação de PMP de toranja pelas células vegetais in vitro.
OUTRAS MODALIDADES Algumas modalidades da invenção estão dentro dos seguintes parágrafos numerados.
1. Uma composição de pacote de mensageiro de planta (PMP) compreendendo uma pluralidade de PMPs modificados tendo captação celular aumentada em relação a um PMP não modificado.
2. A composição de PMP do parágrafo 1, em que a captação celular aumentada é uma captação celular aumentada de pelo menos 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100% em relação a um PMP não modificado.
3. A composição de PMP do parágrafo 1, em que a captação celular aumentada é uma captação celular aumentada de pelo menos 2x vezes, 4x vezes, 5x vezes, 10x vezes, 100x vezes ou 1000x vezes em relação a um PMP não modificado.
4. A composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1- 3, em que a célula é uma célula vegetal.
5. A composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1- 3, em que a célula é uma célula bacteriana.
6. A composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1- 3, em que a célula é uma célula fúngica.
7. A composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1- 6, em que os PMPs modificados compreendem um agente de penetração de células.
8. A composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1- 7, em que os PMPs modificados compreendem um agente de penetração de células vegetais.
9. A composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1-
7, em que os PMPs modificados compreendem um agente de penetração de células bacterianas.
10. A composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1- 7, em que os PMPs modificados compreendem um agente de penetração de células fúngicas.
11. A composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1- 10, em que o agente de penetração de células compreende uma enzima ou um seu domínio funcional.
12. A composição de PMP do parágrafo 11, em que a enzima é uma enzima bacteriana, uma enzima fúngica, uma enzima vegetal ou uma enzima protozoária.
13. A composição de PMP do parágrafo 12, em que a enzima tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima bacteriana capaz de degradar paredes celulares.
14. A composição de PMP do parágrafo 12, em que a enzima tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima fúngica capaz de degradar paredes celulares.
15. A composição de PMP do parágrafo 12, em que a enzima tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima vegetal capaz de degradar paredes celulares.
16. A composição de PMP do parágrafo 12, em que a enzima tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma enzima protozoária capaz de degradar paredes celulares.
17. A composição de PMP do parágrafo 12, em que a enzima é uma celulase.
18. A composição de PMP do parágrafo 17, em que a celulase tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma celulase bacteriana.
19. A composição de PMP do parágrafo 17, em que a celulase tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda a ou uma porção da sequência de uma celulase fúngica.
20. A composição de PMP do parágrafo 17, em que a celulase tem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de identidade com toda ou uma porção de uma celulase protozoária.
21. A composição de PMP do parágrafo 8, em que o agente de penetração de células compreende um detergente.
22. A composição de PMP do parágrafo 21, em que o detergente é saponina.
23. A composição de PMP do parágrafo 8, em que o agente de penetração de células compreende um lipídeo catiônico.
24. A composição de PMP do parágrafo 23, em que o lipídeo catiônico é 1,2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DEPC).
25. A composição de PMP do parágrafo 23, em que o lipídeo catiônico é 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DOPC).
26. A composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1- 25, em que a composição é estável durante pelo menos um dia à temperatura ambiente e/ou estável durante pelo menos uma semana a 4 °C.
27. A composição de PMP do parágrafo 26, em que os PMPs são estáveis durante pelo menos 24 horas, 48 horas, sete dias ou 30 dias.
28. A composição de PMP do parágrafo 27, em que os PMPs são estáveis a uma temperatura de pelo menos 4 ºC, 20 °C, 24 °C ou
37 °C.
29. A composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1- 28, em que os PMPs na composição estão a uma concentração eficaz para diminuir a aptidão de um fungo.
30. A composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1- 28, em que os PMPs na composição estão a uma concentração eficaz para diminuir a aptidão de uma bactéria.
31. A composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1- 28, em que os PMPs na composição estão a uma concentração eficaz para aumentar a aptidão de uma planta.
32. A composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1- 28, em que os PMPs na composição estão a uma concentração eficaz para diminuir a aptidão de uma planta.
33. A composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1- 32, em que a pluralidade de PMPs modificados na composição está a uma concentração de pelo menos 1, 10, 50, 100 ou 250 µg de proteína de PMP/mL.
34. A composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1- 33, em que os PMPs modificados compreendem um agente funcional heterólogo.
35. A composição de PMP do parágrafo 34, em que os PMPs modificados compreendem dois ou mais agentes funcionais heterólogos diferentes.
36. A composição de PMP do parágrafo 34 ou 35, em que o agente funcional heterólogo é encapsulado por cada um da pluralidade de PMPs.
37. A composição de PMP do parágrafo 34 ou 35, em que o agente funcional heterólogo é embebido na superfície de cada um da pluralidade de PMPs.
38. A composição de PMP do parágrafo 34 ou 35, em que o agente funcional heterólogo é conjugado à superfície de cada um da pluralidade de PMPs.
39. A composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 34-38, em que o agente funcional heterólogo é um agente fertilizante.
40. A composição de PMP do parágrafo 39, em que o agente fertilizante é um nutriente vegetal.
41. A composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 34-38, em que o agente funcional heterólogo é um agente herbicida.
42. A composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 34-39 e 41, em que o agente funcional heterólogo é um polipeptídeo heterólogo, um ácido nucleico heterólogo ou uma molécula pequena heteróloga.
43. A composição de PMP do parágrafo 42, em que o ácido nucleico heterólogo é um DNA, um RNA, um PNA ou uma molécula híbrida de DNA-RNA.
44. A composição de PMP do parágrafo 43, em que o RNA é um RNA mensageiro (mRNA), um RNA guia (gRNA) ou um RNA inibidor.
45. A composição de PMP do parágrafo 44, em que o RNA inibidor é RNAi, shRNA ou miRNA.
46. A composição de PMP do parágrafo 44 ou 45, em que o RNA inibidor inibe a expressão gênica em uma planta.
47. A composição de PMP do parágrafo 44 ou 45, em que o RNA inibidor inibe a expressão gênica em um simbionte vegetal.
48. A composição de PMP do parágrafo 42 ou 43, em que o ácido nucleico é um mRNA, um mRNA modificado ou uma molécula de DNA que, na planta, aumenta a expressão de uma enzima, uma proteína formadora de poros, um ligando de sinalização, um peptídeo de penetração de células, um fator de transcrição, um receptor, um anticorpo, um nanocorpo, uma proteína de edição gênica, uma riboproteína, um aptâmero de proteína ou uma chaperona.
49. A composição de PMP do parágrafo 42 ou 43, em que o ácido nucleico é um RNA antissenso, um siRNA, um shRNA, um miRNA, um aiRNA, um PNA, um morfolino, um LNA, um piRNA, uma ribozima, uma DNAzima, um aptâmero, um circRNA, um gRNA ou uma molécula de DNA que, na planta, reduz a expressão de uma enzima, um fator de transcrição, uma proteína secretora, um fator estrutural, uma riboproteína, um aptâmero de proteína, uma chaperona, um receptor, um ligando de sinalização ou um transportador.
50. A composição de PMP do parágrafo 42, em que o polipeptídeo é uma enzima, proteína formadora de poros, ligando de sinalização, peptídeo de penetração de células, fator de transcrição, receptor, anticorpo, nanocorpo, proteína de edição gênica, riboproteína, um aptâmero de proteína ou chaperona.
51. A composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1- 50, em que a planta é uma planta agrícola ou hortícola.
52. A composição de PMP do parágrafo 51, em que a planta agrícola é uma planta de soja, uma planta de trigo ou uma planta de milho.
53. A composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1- 50, em que a planta é uma erva daninha.
54. A composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1- 53, em que a composição é formulada para entrega a uma planta.
55. A composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1- 54, em que a composição compreende um transportador agricolamente aceitável.
56. A composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1- 55, em que a composição é formulada como um líquido, um sólido, um aerossol, uma pasta, um gel ou uma composição de gás.
57. Uma composição de PMP compreendendo uma pluralidade de PMPs modificados tendo captação celular vegetal aumentada, em que os PMPs são produzidos por um processo que compreende as etapas de: (a) proporcionar uma amostra inicial de uma planta, ou uma parte da mesma, em que a planta ou parte da mesma compreende EVs; (b) isolar uma fração de PMP em bruto da amostra inicial, em que a fração de PMP em bruto tem um nível diminuído de pelo menos um contaminante ou componente indesejado da planta ou parte da mesma em relação ao nível na amostra inicial; (c) purificar a fração de PMP em bruto, produzindo deste modo uma pluralidade de PMPs puros, em que a pluralidade de PMPs puros tem um nível diminuído de pelo menos um contaminante ou componente indesejado da planta ou parte da mesma em relação ao nível na fração de EV em bruto; (d) carregar os PMPs puros com um agente de penetração de células vegetais, gerando deste modo PMPs modificados tendo captação celular vegetal aumentada em relação a um PMP não modificado; e (e) formular os PMPs da etapa (d) para entrega a uma planta.
58. Uma bactéria compreendendo a composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1-57.
59. Um fungo compreendendo a composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1-57.
60. Uma planta compreendendo a composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1-57.
61. Um método de entregar uma composição de PMP a uma planta compreendendo contatar a planta com a composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1-57.
62. Um método de aumentar a aptidão de uma planta,
compreendendo o método entregar à planta uma quantidade eficaz da composição de qualquer um dos parágrafos 1-57, em que o método aumenta a aptidão da planta em relação a uma planta não tratada.
63. O método do parágrafo 61 ou 62, em que o PMP compreende um agente fertilizante heterólogo.
64. O método de qualquer um dos parágrafos 61-63, em que a planta é uma planta agrícola ou hortícola.
65. O método do parágrafo 64, em que a planta é uma planta de soja, uma planta de trigo ou uma planta de milho.
66. Um método de diminuir a aptidão de uma planta, compreendendo o método entregar à planta uma quantidade eficaz da composição de qualquer um dos parágrafos 1-57, em que o método diminui a aptidão da planta em relação a uma planta não tratada.
67. O método do parágrafo 61 ou 66, em que o PMP compreende um agente pesticida heterólogo.
68. O método de qualquer um dos parágrafos 61, 66 e 67, em que a planta é uma erva daninha.
69. O método de qualquer um dos parágrafos 61-68, em que a composição de PMP é entregue a uma folha, semente, raiz, fruto, rebento, pólen ou flor da planta.
70. O método de qualquer um dos parágrafos 61-69, em que a composição de PMP é entregue como um líquido, um sólido, um aerossol, uma pasta, um gel ou um gás.
71. A composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1- 3, em que a célula é uma célula de mamífero.
72. A composição de PMP de qualquer um dos parágrafos 1- 3, em que a célula é uma célula humana.
73. Um método de aumentar a aptidão de um mamífero, compreendendo o método entregar ao mamífero uma quantidade eficaz da composição de qualquer um dos parágrafos 1-57, em que o método aumenta a aptidão do mamífero em relação a um mamífero não tratado.
74. O método do parágrafo 73, em que o PMP compreende um agente terapêutico heterólogo.
75. O método do parágrafo 73 ou 74, em que o mamífero é um humano.
76. Uma composição de PMP compreendendo uma pluralidade de PMPs modificados tendo captação celular animal aumentada, em que os PMPs são produzidos por um processo que compreende as etapas de: (a) proporcionar uma amostra inicial de uma planta, ou uma parte da mesma, em que a planta ou parte da mesma compreende EVs; (b) isolar uma fração de PMP em bruto da amostra inicial, em que a fração de PMP em bruto tem um nível diminuído de pelo menos um contaminante ou componente indesejado da planta ou parte da mesma em relação ao nível na amostra inicial; (c) purificar a fração de PMP em bruto, produzindo deste modo uma pluralidade de PMPs puros, em que a pluralidade de PMPs puros tem um nível diminuído de pelo menos um contaminante ou componente indesejado da planta ou parte da mesma em relação ao nível na fração de EV em bruto; (d) carregar os PMPs puros com um agente de penetração de células, gerando deste modo PMPs modificados tendo captação celular animal aumentada em relação a um PMP não modificado; e (e) formular os PMPs da etapa (d) para entrega a um animal.
77. Um método para entregar um pacote de mensageiro de planta (PMP) a uma célula alvo, compreendendo o método introduzir um PMP compreendendo um lipídeo ionizável exógeno na célula alvo, em que o PMP compreendendo o lipídeo ionizável exógeno tem captação aumentada pela célula alvo em relação a um PMP não modificado.
78. O método do parágrafo 77, em que o PMP modificado compreende pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais do que 90% de lipídeo ionizável.
79. O método do parágrafo 77, em que o PMP modificado compreende pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais do que 90% de lipídeos derivados de uma vesícula extracelular (EV) de planta.
80. O método do parágrafo 77, em que o lipídeo ionizável exógeno é 1,1‘-((2-(4-(2-((2-(bis(2-hidroxidodecil)amino)etil)(2- hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1-il)etil)azanedi-il)bis(dodecan-2-ol) (C12-200).
81. Um método para entregar um pacote de mensageiro de planta (PMP) a uma célula alvo, compreendendo o método introduzir um PMP compreendendo um lipídeo zwitteriônico exógeno na célula alvo, em que o PMP compreendendo o lipídeo zwitteriônico exógeno tem captação aumentada pela célula alvo em relação a um PMP não modificado.
82. O método do parágrafo 81, em que o PMP modificado compreende pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais do que 90% de lipídeo zwitteriônico.
83. O método do parágrafo 81, em que o PMP modificado compreende pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais do que 90% de lipídeos derivados de uma vesícula extracelular (EV) de planta.
84. O método do parágrafo 81, em que o lipídeo zwitteriônico exógeno é 1,2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DEPC) ou 1,2-dioleoil- sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DOPC).
85. Uma composição de PMP compreendendo uma pluralidade de PMPs modificados compreendendo um lipídeo catiônico exógeno.
86. A composição de PMP do parágrafo 85, em que cada um dos PMPs modificados compreende pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais do que 90% de lipídeo catiônico.
87. Uma composição de PMP compreendendo uma pluralidade de PMPs modificados compreendendo um lipídeo ionizável exógeno.
88. A composição de PMP do parágrafo 87, em que cada um dos PMPs modificados compreende pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais do que 90% de lipídeo ionizável.
89. A composição de PMP do parágrafo 87, em que o lipídeo ionizável é C12-200.
90. Uma composição de PMP compreendendo uma pluralidade de PMPs modificados compreendendo um lipídeo zwitteriônico exógeno.
91. A composição de PMP do parágrafo 90, em que cada um dos PMPs modificados compreende pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais do que 90% de lipídeo zwitteriônico.
92. A composição de PMP do parágrafo 90, em que o lipídeo zwitteriônico é DEPC ou DOPC.
93. Uma composição de PMP compreendendo uma pluralidade de PMPs modificados tendo captação celular vegetal aumentada, em que os PMPs são produzidos por um processo que compreende as etapas de: (a) proporcionar uma pluralidade de PMPs purificados; (b) processar a pluralidade de PMPs para produzir um filme de lipídeos; e (c) reconstituir o filme de lipídeos na presença de um lipídeo catiônico exógeno, em que os PMPs reconstituídos compreendem pelo menos 1% de lipídeo catiônico exógeno, produzindo deste modo PMPs modificados tendo captação celular aumentada.
94. Uma composição de PMP compreendendo uma pluralidade de PMPs modificados tendo captação celular vegetal aumentada, em que os PMPs são produzidos por um processo que compreende as etapas de: (a) proporcionar uma pluralidade de PMPs purificados; (b) processar a pluralidade de PMPs para produzir um filme de lipídeos; e (c) reconstituir o filme de lipídeos na presença de um lipídeo ionizável exógeno, em que os PMPs reconstituídos compreendem pelo menos 1% de lipídeo ionizável exógeno, produzindo deste modo PMPs modificados tendo captação celular aumentada.
95. Uma composição de PMP compreendendo uma pluralidade de PMPs modificados tendo captação celular vegetal aumentada, em que os PMPs são produzidos por um processo que compreende as etapas de: (a) proporcionar uma pluralidade de PMPs purificados; (b) processar a pluralidade de PMPs para produzir um filme de lipídeos; e (c) reconstituir o filme de lipídeos na presença de um lipídeo zwitteriônico exógeno, em que os PMPs reconstituídos compreendem pelo menos 1% de lipídeo zwitteriônico exógeno, produzindo deste modo PMPs modificados tendo captação celular aumentada. Embora a invenção anterior tenha sido descrita em algum detalhe a título de ilustração e exemplo para propósitos de clareza de entendimento, as descrições e exemplos não devem ser considerados como limitando o escopo da invenção. As divulgações de todas as patentes e literatura científica citadas aqui são expressamente incorporadas em sua totalidade por referência. Outras modalidades estão dentro das reivindicações.
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Arabidopsis C0LGG8 Provável serina/treonina-proteína cinase tipo thaliana receptor LRR At1g53430 (EC 2.7.11.1) Arabidopsis F4HQT8 Proteína não caracterizada thaliana Arabidopsis F4HWU0 Proteína da superfamília de proteínas cinases thaliana Arabidopsis F4I082 proteína da superfamília de albuminas 2S inibidora thaliana bifuncional/proteína de transferência de lipídeos/armazenamento de sementes Arabidopsis F4I3M3 Cinase com proteína contendo domínio de repetição thaliana de tetratricopeptídeo Arabidopsis F4IB62 Proteína da família de proteínas cinases com thaliana repetição rica em leucina Arabidopsis O03042 Cadeia grande de ribulose bifosfato carboxilase thaliana (Subunidade grande de RuBisCO) (EC 4.1.1.39) Arabidopsis O03986 Proteína de choque térmico 90-4 (AtHSP90.4) thaliana (AtHsp90-4) (Proteína de choque térmico 81-4) (Hsp81-4) Arabidopsis O04023 Homólogo de proteína SRC2 (AtSRC2) thaliana Arabidopsis O04309 Lectina 35 relacionada com Jacalina (Proteína 1 thaliana responsiva a JA) (At3g16470 tipo proteína de ligação à Mirosinase) Arabidopsis O04314 Proteína 1 de ligação a PYK10 (Lectina 30 thaliana relacionada com Jacalina) (Proteína induzida por ácido jasmônico) Arabidopsis O04922 Provável glutationa peroxidase 2 (EC 1.11.1.9) thaliana
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Arabidopsis O22126 Proteína 8 arabinogalactana tipo fasciclina thaliana (AtAGP8) Arabidopsis O23179 Proteína 1 tipo patatina (AtPLP1) (EC 3.1.1.-) thaliana (Fosfolipase A IIgamma relacionada com a patatina) (pPLAIIg) (Fosfolipase A IVA) (AtPLAIVA) Arabidopsis O23207 Provável NAD(P)H desidrogenase (quinona) tipo thaliana FQR1 2 (EC 1.6.5.2) Arabidopsis O23255 Adenosil-homocisteinase 1 (AdoHciase 1) (EC thaliana 3.3.1.1) (Proteína EMBRIÃO DEFEITUOSA 1395) (Proteína SILENCIAMENTO GÊNICO DEPENDENTE DA HOMOLOGIA 1) (S-adenosil-L- homocisteína hidrolase 1) (SAH hidrolase 1) Arabidopsis O23482 Transportador de oligopeptídeo 3 (AtOPT3) thaliana Arabidopsis O23654 Subunidade A catalítica de próton ATPase de tipo V thaliana (Subunidade A de V-ATPase) (EC 3.6.3.14) (Subunidade de 69 kDa de V-ATPase) (Subunidade A de H(+)-ATPase vacuolar) (Subunidade alfa da bomba de prótons vacuolar) Arabidopsis O48788 Provável cinase receptora inativa At2g26730 thaliana Arabidopsis O48963 Fototropina-1 (EC 2.7.11.1) (Proteína 1 de thaliana hipocótilo não fototrópica) (Proteína de fototropismo de raiz 1) Arabidopsis O49195 Proteína de armazenamento vegetativo 1 thaliana Arabidopsis O50008 5-metiltetra-hidropteroiltriglutamato--homocisteína thaliana metiltransferase 1 (EC 2.1.1.14) (Metionina sintase independente da cobalamina 1) (AtMS1) (Metionina sintase independente da vitamina B12 1) Arabidopsis O64696 Proteína não caracterizada putativa At2g34510 thaliana Arabidopsis O65572 Carotenoide 9,10(9',10')-dioxigenase 1 de clivagem thaliana (EC 1.14.99.n4) (AtCCD1) (Enzima de clivagem de neoxantina NC1) (AtNCED1) Arabidopsis O65660 Proteína 1 contendo domínio PLAT (AtPLAT1)
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso thaliana (Proteína 1 de domínio PLAT) Arabidopsis O65719 Proteína 3 de choque térmico de 70 kDa (Proteína thaliana 3 cognata de choque térmico de 70 kDa) (Proteína cognata de choque térmico 70-3) (AtHsc70-3) (Proteína de choque térmico 70-3) (AtHsp70-3) Arabidopsis O80517 Uclacianina-2 (Proteína II de ligação ao cobre azul) thaliana (BCB II) (Fitocianina 2) (Uclacianina-II) Arabidopsis O80576 At2g44060 (Proteína abundante de embriogênese thaliana tardia, grupo 2) (Similar a proteínas abundantes de embriogênese tardia) Arabidopsis O80725 Membro da família 4 de transportadores ABC B thaliana (Transportador ABCB.4) (AtABCB4) (Proteína 4 de resistência a múltiplos fármacos) (P-glicoproteína 4) Arabidopsis O80837 Remorina (Proteína de ligação ao DNA) thaliana Arabidopsis O80852 Glutationa S-transferase F9 (AtGSTF9) (EC thaliana 2.5.1.18) (AtGSTF7) (Membro 9 de classe-phi GST) Arabidopsis O80858 Proteína expressa (Proteína não caracterizada thaliana putativa At2g30930) (Proteína não caracterizada putativa At2g30930; F7F1.14) Arabidopsis O80939 Receptor cinase IV.1 contendo domínio de lectina thaliana de tipo L (Cinase receptora e de cinase de Arabidopsis thaliana) (AthlecRK-e) (LecRK-IV.1) (EC 2.7.11.1) (Cinase Receptora de Lectina 1) Arabidopsis O80948 Lectina 23 relacionada com Jacalina (At2g39330 thaliana tipo proteína de ligação à Mirosinase) Arabidopsis O82628 Subunidade G1 de próton ATPase de tipo V thaliana (Subunidade G1 de V-ATPase) (Isoforma 1 da subunidade G de H(+)-ATPase vacuolar) (Subunidade G1 da bomba de prótons vacuolar) Arabidopsis P10795 Cadeia pequena de ribulose bifosfato carboxilase thaliana 1A, cloroplástica (Subunidade pequena de RuBisCO 1A) (EC 4.1.1.39) Arabidopsis P10896 Ribulose bisfosfato carboxilase/oxigenase ativase, thaliana cloroplástica (RA) (RuBisCO ativase) Arabidopsis P17094 Proteína ribossômica 60S L3-1 (Proteína EMBRIÃO
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso thaliana DEFEITUOSO 2207) Arabidopsis P19456 ATPase 2, tipo membrana plasmática (EC 3.6.3.6) thaliana (Bomba de prótons 2) Arabidopsis P20649 ATPase 1, tipo membrana plasmática (EC 3.6.3.6) thaliana (Bomba de prótons 1) Arabidopsis P22953 Provável mediador da subunidade 37e de thaliana transcrição da RNA polimerase II (Proteína 1 de choque térmico de 70 kDa) (Proteína 1 cognata de choque térmico de 70 kDa) (Proteína cognata de choque térmico 70-1) (AtHsc70-1) (Proteína de choque térmico 70-1) (AtHsp70-1) (Proteína
PRIMEIRAMENTE RESPONSIVA À DESIDRATAÇÃO 2) Arabidopsis P23586 Proteína de transporte de açúcar 1 (Transportador thaliana de glucose) (Transportador de hexose 1) Arabidopsis P24636 Cadeia beta-4 da tubulina (Beta-4-tubulina) thaliana Arabidopsis P25696 Enolase bifuncional 2/ativador transcricional (EC thaliana 4.2.1.11) (2-fosfo-D-glicerato hidro-liase 2) (2- fosfoglicerato desidratase 2) (BAIXA EXPRESSÃO DE GENES OSMOTICAMENTE RESPONSIVOS 1) Arabidopsis P25856 Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase GAPA1, thaliana cloroplástica (EC 1.2.1.13) (Subunidade 1 de gliceraldeídofosfato desidrogenase A dependente de NADP) Arabidopsis P28186 Proteína relacionada com Ras RABE1c (AtRABE1c) thaliana (Proteína relacionada com Ras Ara-3) (Proteína relacionada com Ras Rab8A) (AtRab8A) Arabidopsis P30302 Aquaporina PIP2-3 (Proteína intrínseca da thaliana membrana plasmática 2-3) (AtPIP2; 3) (Proteína intrínseca da membrana plasmática 2c) (PIP2c) (RD28-PIP) (TMP2C) (Proteína intrínseca de tonoplastos induzida por estresse hídrico) (WSI- TIP) [Clivada em: Aquaporina PIP2-3, N- terminalmente processada] Arabidopsis P31414 Bomba de próton 1 da membrana vacuolar
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso thaliana energizada com pirofosfato (EC 3.6.1.1) (Pirofosfatase 1 inorgânica energizada com pirofosfato) (H(+)-PPase 1) (Pirofosfatase de próton vacuolar 1) (Pirofosfatase de próton vacuolar 3) Arabidopsis P32961 Nitrilase 1 (EC 3.5.5.1) thaliana Arabidopsis P38666 Proteína ribossômica 60S L24-2 (Proteína thaliana VÁLVULA CURTA 1) Arabidopsis P39207 Nucleosídeo difosfato cinase 1 (EC 2.7.4.6) thaliana (Nucleosídeo difosfato cinase I) (NDK I) (NDP cinase I) (NDPK I) Arabidopsis P42643 Proteína GF14 chi tipo 14-3-3 (Fator regulador geral thaliana 1) Arabidopsis P42737 Anidrase beta carbônica 2, cloroplástica (AtbCA2) thaliana (AtbetaCA2) (EC 4.2.1.1) (Beta carbonato desidratase 2) Arabidopsis P42759 Desidrina ERD10 (Proteína induzida por baixa thaliana temperatura LTI45) Arabidopsis P42761 Glutationa S-transferase F10 (AtGSTF10) (EC thaliana 2.5.1.18) (AtGSTF4) (Membro 10 de classe-phi GST) (Proteína RESPOSTA INICIAL À DESIDRATAÇÃO 13) Arabidopsis P42763 Desidrina ERD14 thaliana Arabidopsis P42791 Proteína ribossômica 60S L18-2 thaliana Arabidopsis P43286 Aquaporina PIP2-1 (Proteína intrínseca da thaliana membrana plasmática 2-1) (AtPIP2; 1) (Proteína intrínseca da membrana plasmática 2a) (PIP2a) [Clivada em: Aquaporina PIP2-1, N-terminalmente processada] Arabidopsis P46286 Proteína ribossômica L8-1 60S (Proteína L2 thaliana ribossômica 60S) (Proteína EMBRIÃO DEFEITUOSA 2296) Arabidopsis P46422 Glutationa S-transferase F2 (AtGSTF2) (EC thaliana 2.5.1.18) (Proteína de ligação a auxina de 24 kDa)
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso (AtPM24) (Membro 2 de classe-phi GST) Arabidopsis P47998 Cisteína sintase 1 (EC 2.5.1.47) (At.OAS.5-8) (Ala thaliana sintase beta-substituída 1;1) (ARAth-Bsas1;1) (CSase A) (AtCS-A) (Cys-3A) (O-acetilserina (tiol)- liase 1) (OAS-TL A) (O-acetilserina sulfidrilase) (Proteína INÍCIO DA MORTE DAS FOLHAS 3) Arabidopsis P48347 Proteína GF14 épsilon tipo 14-3-3 (Fator regulador thaliana geral 10) Arabidopsis P48491 Triosefosfato isomerase, citosólica (TIM) (Triose- thaliana fosfato isomerase) (EC 5.3.1.1) Arabidopsis P50318 Fosfoglicerato cinase 2, cloroplástica (EC 2.7.2.3) thaliana Arabidopsis P53492 Actina-7 (Actina-2) thaliana Arabidopsis P54144 Membro 1 de transportador de amônio 1 (AtAMT1;1) thaliana Arabidopsis P92963 Proteína RABB1c relacionada com Ras (AtRABB1c) thaliana (Proteína Rab2A relacionada com Ras) (AtRab2A) Arabidopsis P93004 Aquaporina PIP2-7 (Proteína intrínseca da thaliana membrana plasmática 2-7) (AtPIP2; 7) (Proteína intrínseca da membrana plasmática 3) (Oroteína intrínseca principal induzida pelo estresse salino) [Clivada em: Aquaporina PIP2-7, N-terminalmente processada] Arabidopsis P93025 Fototropina-2 (EC 2.7.11.1) (Defeituoso na proteína thaliana de evitação de cloroplasto 1) (Proteína 1 tipo hipocótilo 1 não fototrópico) (AtKin7) (Proteína 1 tipo NPH1) Arabidopsis P93819 Malato desidrogenase 1, citoplasmática (EC thaliana 1.1.1.37) (Malato desidrogenase 1 dependente de NAD citosólica) (cNAD-MDH1) (Malato desidrogenase citossólica 1) (MDH1 citosólica) Arabidopsis Q03250 Proteína 7 de ligação a RNA rica em glicina (AtGR- thaliana RBP7) (AtRBG7) (Proteína 7 rica em glicina) (AtGRP7) (Proteína FRIA, RITMO CIRCADIANO E LIGAÇÃO AO RNA 2) (Proteína CCR2)
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Arabidopsis Q05431 L-ascorbato peroxidase 1, citosólica (AP) (AtAPx01) thaliana (EC 1.11.1.11) Arabidopsis Q06611 Aquaporina PIP1-2 (AtPIP1; 2) (Proteína intrínseca thaliana da membrana plasmática 1b) (PIP1b) (Proteína transmembranar A) (AthH2) (TMP-A) Arabidopsis Q07488 Proteína de cobre azul (Proteína de ligação de thaliana cobre azul) (AtBCB) (Fitocianina 1) (Estelacianina) Arabidopsis Q0WLB5 Cadeia pesada 2 de clatrina thaliana Arabidopsis Q0WNJ6 Cadeia pesada 1 de clatrina thaliana Arabidopsis Q1ECE0 Proteína 4-1 associada à vesícula (Homólogo 4-1 de thaliana VAP vegetal) (AtPVA41) (Proteína INDUZIDA POR MANITOL ASSOCIADA À MEMBRANA) (AtMAMI) (Proteína 4-1 associada a VAMP) Arabidopsis Q38882 Fosfolipase D alfa 1 (AtPLDalpha1) (PLD alfa 1) (EC thaliana 3.1.4.4) (Colina fosfatase 1) (PLDalpha) (Fosfolipase hidrolisante de fosfatidilcolina D 1) Arabidopsis Q38900 Peptidil-prolil cis-trans isomerase CYP19-1 (PPIase thaliana CYP19-1) (EC 5.2.1.8) (Ciclofilina de 19 kDa 1) (Rotamase ciclofilina-3) Arabidopsis Q39033 Fosfoinositídeo fosfolipase C 2 (EC 3.1.4.11) thaliana (Fosfoinositídeo fosfolipase PLC2) (AtPLC2) (PI- PLC2) Arabidopsis Q39085 Delta (24)-esterol redutase (EC 1.3.1.72) (Proteína thaliana de alongamento celular DIMINUTO) (Proteína de alongamento celular Dwarf1) (Proteína CABBAGE1) (Proteína RESPOSTA DE FLUÊNCIA MUITO BAIXA INTENSIFICADA 1) Arabidopsis Q39228 Proteína de transporte de açúcar 4 (Transportador thaliana de hexose 4) Arabidopsis Q39241 Tiorredoxina H5 (AtTrxh5) (Proteína LÓCUS DE thaliana INSENSIBILIDADE À VICTORINA 1) (Tiorredoxina 5) (AtTRX5) Arabidopsis Q39258 Subunidade E1 de próton ATPase de tipo V thaliana (Subunidade E1 de V-ATPase) (Proteína EMBRIÃO
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso DEFEITUOSO 2448) (Isoforma 1 da subunidade E de H(+)-ATPase vacuolar) (Subunidade E1 da bomba de prótons vacuolar) Arabidopsis Q42112 Proteína ribossômica ácida 60S P0-2 thaliana Arabidopsis Q42403 Tiorredoxina H3 (AtTrxh3) (Tiorredoxina 3) thaliana (AtTRX3) Arabidopsis Q42479 Proteína cinase dependente de cálcio 3 (EC thaliana 2.7.11.1) (Isoforma de proteína cinase dependente de cálcio CDPK6) (AtCDPK6) Arabidopsis Q42547 Catalase-3 (EC 1.11.1.6) thaliana Arabidopsis Q56WH1 Cadeia alfa-3 da tubulina thaliana Arabidopsis Q56WK6 Patelina-1 thaliana Arabidopsis Q56X75 Proteína 4D2 tipo CASP (AtCASPL4D2) thaliana Arabidopsis Q56ZI2 Patelina-2 thaliana Arabidopsis Q7Y208 Glicerofosfodiéster fosfodiesterase GDPDL1 (EC thaliana 3.1.4.46) (Tipo flicerofosfodiéster fosfodiesterase 1) (ATGDPDL1) (Tipo glicerofosfodiesterase 3) (Proteína 2 TIPO SHV3) Arabidopsis Q84VZ5 Proteína ancorada por GPI não caracterizada thaliana At5g19240 Arabidopsis Q84WU7 Proteína da família das aspartil proteases thaliana eucarióticas (Proteína não caracterizada putativa At3g51330) Arabidopsis Q8GUL8 Proteína ancorada por GPI não caracterizada thaliana At5g19230 Arabidopsis Q8GYA4 Proteína cinase tipo receptor rica em cisteína 10 thaliana (RLK10 rica em cisteína) (EC 2.7.11.-) (Proteína cinase tipo receptor 4) Arabidopsis Q8GYN5 Proteína 4 que interage com RPM1 thaliana
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Arabidopsis Q8GZ99 At5g49760 (Proteína da família das proteínas thaliana cinase de repetição rica em leucina) (Proteína cinase tipo receptor de repetição rica em leucina) (Proteína cinase receptora putativa) Arabidopsis Q8L636 Permutador de sódio/cálcio NCL (Na(+)/Ca(2+)- thaliana proteína de permuta NCL) (Proteína tipo NCX) (AtNCL) Arabidopsis Q8L7S1 At1g45200 (At1g45200/At1g45200) (Tipo thaliana triacilglicerol lipase 1) Arabidopsis Q8LAA6 Provável aquaporina PIP1-5 (AtPIP1; 5) (Proteína thaliana intrínseca da membrana plasmática 1d) (PIP1d) Arabidopsis Q8LCP6 Endoglucanase 10 (EC 3.2.1.4) (Endo-1,4-beta thaliana glucanase 10) Arabidopsis Q8RWV0 Transcetolase-1, cloroplástica (TK) (EC 2.2.1.1) thaliana Arabidopsis Q8S8Q6 Tetraspanina-8 thaliana Arabidopsis Q8VZG8 Cinase tipo receptor de interação de MDIS1 2 thaliana (AtMIK2) (Provável serina/treonina-proteína cinase tipo receptor LRR At4g08850) (EC 2.7.11.1) Arabidopsis Q8VZU2 Sintaxina-132 (AtSYP132) thaliana Arabidopsis Q8W4E2 Subunidade B3 de próton ATPase de tipo V thaliana (Subunidade B3 de V-ATPase) (Isoforma 3 da subunidade B de H(+)-ATPase vacuolar) (Subunidade B3 da bomba de prótons vacuolar) Arabidopsis Q8W4S4 Subunidade a3 de próton ATPase de tipo V thaliana (Subunidade a3 de V-ATPase) (Isoforma 3 de subunidade a de próton ATPase de tipo V de 95 kDa) (Isoforma a3 de V-ATPase de 95 kDa) (Isoforma 3 de subunidade a de H (+)-ATPase vacuolar) (Subunidade a3 da bomba de prótons vacuolar) (Isoforma 3 de subunidade a de ATPase de 95 kDa de translocação de prótons vacuolar) Arabidopsis Q93VG5 Proteína ribossômica 40S S8-1 thaliana
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Arabidopsis Q93XY5 Tetraspanina-18 (Proteína 2 homóloga de TOM2A) thaliana Arabidopsis Q93YS4 Membro da família G dos transportadores ABC 22 thaliana (Transportador ABC ABCG.22) (AtABCG22) (Proteína homóloga do complexo branco-marrom 23) (AtWBC23) Arabidopsis Q93Z08 Glucana endo-1,3-beta-glucosidase 6 (EC 3.2.1.39) thaliana ((1->3)-beta-glucana endo-hidrolase 6) ((1->3)- beta-glucanase 6) (Beta-1,3-endoglucanase 6) (Beta-1,3-glucanase 6) Arabidopsis Q940M8 3-oxo-5-alfa-esteroide 4-desidrogenase (DUF1295) thaliana (At1g73650/F25P22_7) Arabidopsis Q944A7 Provável serina/treonina-proteína cinase At4g35230 thaliana (EC 2.7.11.1) Arabidopsis Q944G5 Proteína NRT1/PTR FAMÍLIA 2.10 (AtNPF2.10) thaliana (Proteína TRANSPORTADOR DE GLUCOSINOLATO-1) Arabidopsis Q94AZ2 Proteína de transporte de açúcar 13 (Transportador thaliana de hexose 13) (Supressor de multicópias da proteína 1 de deficiência de snf4) Arabidopsis Q94BT2 Proteína 12 induzida por auxina em culturas de thaliana raízes Arabidopsis Q94CE4 Anidrase beta carbônica 4 (AtbCA4) (AtbetaCA4) thaliana (EC 4.2.1.1) (Beta carbonato desidratase 4) Arabidopsis Q94KI8 Proteína 1 de canal de cálcio de dois poros thaliana (Proteína 1 do canal de cálcio) (AtCCH1) (Proteína 2 sobrerregulada da oxigenação de ácidos graxos) (Proteína do canal de cálcio dependente da voltagem TPC1) (AtTPC1) Arabidopsis Q96262 Proteína de ligação catiônica associada à thaliana membrana plasmática 1 (AtPCAP1) (Proteína desestabilizadora de microtúbulos 25) Arabidopsis Q9C5Y0 Fosfolipase D delta (AtPLDdelta) (PLD delta) (EC thaliana 3.1.4.4) Arabidopsis Q9C7F7 Proteína de transferência de lipídeos não específica thaliana ancorada a GPI 1 (AtLTPG-1) (Proteína LTP-GPI-
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso ANCORADA 1) Arabidopsis Q9C821 Proteína cinase tipo receptor rica em prolina thaliana PERK15 (EC 2.7.11.1) (Cinase receptora tipo extensina rica em prolina 15) (AtPERK15) Arabidopsis Q9C8G5 Proteína ERD4 tipo CSC1 (Proteína thaliana INICIALMENTE RESPONSIVA AO ESTRESSE DE DESIDRATAÇÃO 4) Arabidopsis Q9C9C5 Proteína ribossômica 60S L6-3 thaliana Arabidopsis Q9CAR7 Proteína 2 de resposta induzida por thaliana hipersensibilidade (AtHIR2) Arabidopsis Q9FFH6 Proteína 13 de arabinogalactana tipo fasciclina thaliana Arabidopsis Q9FGT8 Lipocalina-1 induzida por temperatura (AtTIL1) thaliana Arabidopsis Q9FJ62 Glicerofosfodiéster fosfodiesterase GDPDL4 (EC thaliana 3.1.4.46) (Tipo flicerofosfodiéster fosfodiesterase 4) (ATGDPDL4) (Tipo glicerofosfodiesterase 1) (Proteína 1 TIPO SHV3) Arabidopsis Q9FK68 Proteína RABA1c relacionada com Ras (AtRABA1c) thaliana Arabidopsis Q9FKS8 Transportador de lisina histidina 1 thaliana Arabidopsis Q9FM65 Proteína 1 de arabinogalactana tipo fasciclina thaliana Arabidopsis Q9FNH6 Proteína 3 tipo NDR1/HIN1 thaliana Arabidopsis Q9FRL3 Transportador de açúcar tipo ERD6 6 thaliana Arabidopsis Q9FWR4 Glutationa S-transferase DHAR1, mitocondrial (EC thaliana 2.5.1.18) (Homólogo 1 de canal intracelular de cloreto) (Homólogo de CLIC 1) (Desidroascorbato redutase dependente de glutationa 1) (AtDHAR1) (Desidroascorbato redutase dependente de GSH 1) (mtDHAR) Arabidopsis Q9FX54 Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase GAPC2,
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso thaliana citosólica (EC 1.2.1.12) (Subunidade 2 de gliceraldeídofosfato desidrogenase C dependente de NAD) Arabidopsis Q9LE22 Provável proteína de ligação ao cálcio CML27 thaliana (Proteína tipo calmodulina 27) Arabidopsis Q9LEX1 At3g61050 (Proteína CaLB) (Proteína da família de thaliana ligação de lipídeos dependente de cálcio (domínio CaLB)) Arabidopsis Q9LF79 ATPase 8 de transporte de cálcio, tipo membrana thaliana plasmática (EC 3.6.3.8) (Isoforma 8 de Ca(2+)- ATPase) Arabidopsis Q9LJG3 GDSL esterase/lipase ESM1 (EC 3.1.1.-) (Lipase thaliana extracelular ESM1) (Proteína MODIFICADOR DE EPITIOESPECIFICADOR 1) (AtESM1) Arabidopsis Q9LJI5 Subunidade d1 de próton ATPase de tipo V thaliana (Subunidade d1 de V-ATPase) (Isoforma 1 da subunidade d de H(+)-ATPase vacuolar) (Subunidade d1 da bomba de prótons vacuolar) Arabidopsis Q9LME4 Provável proteína fosfatase 2C 9 (AtPP2C09) (EC thaliana 3.1.3.16) (Proteína fosfatase associada a fitocromo 2C) (PAPP2C) Arabidopsis Q9LNP3 At1g17620/F11A6_23 (F1L3.32) (Família de thaliana glicoproteínas ricas em hidroxiprolina abundante na embriogênese tardia (LEA)) (Proteína não caracterizada putativa At1g17620) Arabidopsis Q9LNW1 Proteína RABA2b relacionada com Ras thaliana (AtRABA2b) Arabidopsis Q9LQU2 Proteína RESISTÊNCIA AO CÁDMIO DE thaliana PLANTAS 1 (AtPCR1) Arabidopsis Q9LQU4 Proteína RESISTÊNCIA AO CÁDMIO DE thaliana PLANTAS 2 (AtPCR2) Arabidopsis Q9LR30 Glutamato--glioxilato aminotransferase 1 (AtGGT2) thaliana (EC 2.6.1.4) (Alanina aminotransferase GGT1) (EC
2.6.1.2) (Alanina--glioxilato aminotransferase GGT1) (EC 2.6.1.44) (Alanina-2-oxoglutarato aminotransferase 1) (EC 2.6.1.-)
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Arabidopsis Q9LSI9 Serina/treonina-proteína cinase BIR2 tipo receptor thaliana LRR inativa (Proteína CINASE 2 TIPO RECEPTOR DE INTERAÇÃO COM BAK1) Arabidopsis Q9LSQ5 NAD(P)H desidrogenase (quinona) FQR1 (EC thaliana 1.6.5.2) (Quinona redutase 1 tipo flavodoxina) Arabidopsis Q9LUT0 Proteína da superfamília das proteínas cinases thaliana (Proteína não caracterizada putativa At3g17410) (Proteína tipo serina/treonina proteína cinase) Arabidopsis Q9LV48 Proteína cinase tipo receptor rica em prolina PERK1 thaliana (EC 2.7.11.1) (Cinase receptora tipo extensina rica em prolina 1) (AtPERK1) Arabidopsis Q9LX65 Subunidade H de próton ATPase de tipo V thaliana (Subunidade H de V-ATPase) (Subunidade H de H(+)-ATPase vacuolar) (Subunidade H da bomba de prótons vacuolar) Arabidopsis Q9LYG3 Enzima 2 málica dependente de NADP (AtNADP- thaliana ME2) (Enzima málica NADP 2) (EC 1.1.1.40) Arabidopsis Q9M088 Glucana endo-1,3-beta-glucosidase 5 (EC 3.2.1.39) thaliana ((1->3)-beta-glucana endo-hidrolase 5) ((1->3)- beta-glucanase 5) (Beta-1,3-endoglucanase 5) (Beta-1,3-glucanase 5) Arabidopsis Q9M2D8 Proteína não caracterizada At3g61260 thaliana Arabidopsis Q9M386 Família de glicoproteínas ricas em hidroxiprolina thaliana abundante na embriogênese tardia (LEA) (Proteína não caracterizada putativa At3g54200) (Proteína não caracterizada putativa F24B22.160) Arabidopsis Q9M390 Proteína NRT1/PTR FAMÍLIA 8.1 (AtNPF8.1) thaliana (Transportador de peptídeo PTR1) Arabidopsis Q9M5P2 Proteína de membrana associada ao transportador thaliana secretor 3 (AtSC3) (Proteína 3 da membrana transportadora secretora) Arabidopsis Q9M8T0 Provável cinase receptora inativa At3g02880 thaliana Arabidopsis Q9SDS7 Subunidade C de próton ATPase de tipo V thaliana (Subunidade C de V-ATPase) (Subunidade C de
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso H(+)-ATPase vacuolar) (Subunidade C da bomba de prótons vacuolar) Arabidopsis Q9SEL6 Transporte de vesícula v-SNARE 11 (AtVTI11) thaliana (Proteína GRAVITROPISMO DE REBENTOS 4) (Receptor de proteína de anexação de NSF solúvel de vesícula VTI1a) (AtVTI1a) (Proteína de transporte de vesícula v-SNARE VTI1a) Arabidopsis Q9SF29 Sintaxina-71 (AtSYP71) thaliana Arabidopsis Q9SF85 Adenosina cinase 1 (AK 1) (EC 2.7.1.20) thaliana (Adenosina 5'-fosfotransferase 1) Arabidopsis Q9SIE7 Proteína 2 contendo domínio PLAT (AtPLAT2) thaliana (Proteína 2 de domínio PLAT) Arabidopsis Q9SIM4 Proteína ribossômica 60S L14-1 thaliana Arabidopsis Q9SIU8 Provável proteína fosfatase 2C 20 (AtPP2C20) (EC thaliana 3.1.3.16) (AtPPC3; 1.2) Arabidopsis Q9SJ81 Proteína 7 de arabinogalactana tipo fasciclina thaliana Arabidopsis Q9SKB2 Serina/treonina/tirosina-proteína cinase tipo thaliana receptor rica em leucina SOBIR1 (EC 2.7.10.1) (EC
2.7.11.1) (Proteína EVERSHED) (Proteína SUPRESSORA DE BIR1-1) Arabidopsis Q9SKR2 Sinaptotagmina-1 (NTMC2T1.1) (Sinaptotagmina A) thaliana Arabidopsis Q9SLF7 Proteína ribossômica ácida 60S P2-2 thaliana Arabidopsis Q9SPE6 Proteína de anexação de NSF alfa-solúvel 2 (Alfa- thaliana SNAP2) (Proteína de anexação de fator sensível a N-etilmaleimida alfa 2) Arabidopsis Q9SRH6 Proteína 3 de resposta induzida por thaliana hipersensibilidade (AtHIR3) Arabidopsis Q9SRY5 Glutationa S-transferase F7 (EC 2.5.1.18) thaliana (AtGSTF8) (Membro 7 de classe-phi GST) (Glutationa S-transferase 11) Arabidopsis Q9SRZ6 Isocitrato desidrogenase citosólica [NADP] (EC
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso thaliana 1.1.1.42) Arabidopsis Q9SSK5 Proteína tipo MLP 43 thaliana Arabidopsis Q9SU13 Proteína 2 de arabinogalactana tipo fasciclina thaliana Arabidopsis Q9SU40 Proteína tipo mono-cobre oxidase SKU5 (Raízes thaliana tortas) Arabidopsis Q9SUR6 Cistina liase CORI3 (EC 4.4.1.35) (Proteína thaliana INDUZIDA POR CORONATINA 3) (Proteína RESPONSIVA AO ÁCIDO JASMÔNICO 2) (Tirosina aminotransferase CORI3) Arabidopsis Q9SVC2 Sintaxina-122 (AtSYP122) (Synt4) thaliana Arabidopsis Q9SVF0 Proteína não caracterizada putativa AT4g38350 thaliana (Proteína não caracterizada putativa F22I13.120) Arabidopsis Q9SW40 Proteína da superfamília dos facilitadores principais thaliana (Proteína não caracterizada putativa AT4g34950) (Proteína não caracterizada putativa T11I11.190) Arabidopsis Q9SYT0 Anexina D1 (AnAt1) (Anexina A1) thaliana Arabidopsis Q9SZ11 Glicerofosfodiéster fosfodiesterase GDPDL3 (EC thaliana 3.1.4.46) (Tipo glicerofosfodiéster fosfodiesterase 3) (ATGDPDL3) (Tipo glicerofosfodiesterase 2) (Proteína MUTANTE PELOS DAS RAÍZES 5) (Proteína SHAVEN 3) Arabidopsis Q9SZN1 Subunidade B2 de próton ATPase de tipo V thaliana (Subunidade B2 de V-ATPase) (Isoforma 2 da subunidade B de H(+)-ATPase vacuolar) (Subunidade B2 da bomba de prótons vacuolar) Arabidopsis Q9SZP6 AT4g38690/F20M13_250 (Proteína da superfamília thaliana das fosfodiesterases tipo PLC) (Proteína não caracterizada putativa AT4g38690) (Proteína não caracterizada putativa F20M13.250) Arabidopsis Q9SZR1 ATPase 10 de transporte de cálcio, tipo membrana thaliana plasmática (EC 3.6.3.8) (Isoforma 10 de Ca(2+)- ATPase)
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Arabidopsis Q9T053 Fosfolipase D gama 1 (AtPLDgama1) (PLD gama 1) thaliana (EC 3.1.4.4) (Colina fosfatase) (Lecitinase D) (Lipofosfodiesterase II) Arabidopsis Q9T076 Proteína 2 tipo nodulina inicial (Proteína tipo thaliana fitocianina) Arabidopsis Q9T0A0 Acil-CoA de cadeia longa sintetase 4 (EC 6.2.1.3) thaliana Arabidopsis Q9T0G4 Proteína não caracterizada putativa AT4g10060 thaliana (Proteína não caracterizada putativa T5L19.190) Arabidopsis Q9XEE2 Anexina D2 (AnAt2) thaliana Arabidopsis Q9XGM1 Subunidade D de próton ATPase de tipo V thaliana (Subunidade D de V-ATPase) (Subunidade D de H(+)-ATPase vacuolar) (Subunidade D da bomba de prótons vacuolar) Arabidopsis Q9XI93 At1g13930/F16A14.27 (F16A14.14) (Proteína thaliana F7A19.2) (Proteína tipo oleosina-B3) Arabidopsis Q9XIE2 Membro da família G dos transportadores ABC 36 thaliana (Transportador ABC ABCG.36) (AtABCG36) (Proteína 8 de resistência pleiotrópica a fármacos) (Proteína PENETRAÇÃO 3) Arabidopsis Q9ZPZ4 Proteína não caracterizada putativa (Proteína não thaliana caracterizada putativa At1g09310) (Proteína T31J12.3) Arabidopsis Q9ZQX4 Subunidade F de próton ATPase de tipo V thaliana (Subunidade F de V-ATPase) (Subunidade de 14 kDa de V-ATPase) (Subunidade F de H(+)-ATPase vacuolar) (Subunidade F de bomba de prótons vacuolar) Arabidopsis Q9ZSA2 Proteína cinase dependente de cálcio 21 (EC thaliana 2.7.11.1) Arabidopsis Q9ZSD4 Sintaxina-121 (AtSYP121) (Proteína relacionada thaliana com a sintaxina At-Syr1) Arabidopsis Q9ZV07 Provável aquaporina PIP2-6 (Proteína intrínseca da thaliana membrana plasmática 2-6) (AtPIP2; 6) (Proteína intrínseca da membrana plasmática 2e) (PIP2e)
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso [Clivada em: Provável aquaporina PIP2-6, N- terminalmente processada] Arabidopsis Q9ZVF3 Proteína tipo MLP 328 thaliana Arabidopsis Q9ZWA8 Proteína 9 de arabinogalactana tipo fasciclina thaliana Arabidopsis Q9ZSD4 SYR1, Proteína 1 Relacionada com a Sintaxina, thaliana também conhecida como SYP121, PENETRAÇÃO1/PEN1 (Proteína PENETRAÇÃO 1) Citrus lemon A1ECK0 Glutarredoxina putativa Citrus lemon A9YVC9 Subunidade beta de pirofosfato--frutose 6-fosfato 1- fosfotransferase (PFP) (EC 2.7.1.90) (6- fosfofrutocinase, dependente de pirofosfato) (PPi- PFK) (6-Fosfofrutose-1-cinase dependente de pirofosfato) Citrus lemon B2YGY1 Glicosiltransferase (EC 2.4.1.-) Citrus lemon B6DZD3 Glutationa S-transferase Tau2 (Glutationa transferase Tau2) Citrus lemon C3VIC2 Fator de alongamento da tradução Citrus lemon C8CPS0 Subunidade alfa de importina Citrus lemon D3JWB5 Flavanona 3-hidroxilase Citrus lemon E0ADY2 Ácido cafeico O-metiltransferase putativa Citrus lemon E5DK62 Subunidade alfa de ATP sintase (Fragmento) Citrus lemon E9M5S3 L-galactose-1-fosfato fosfatase putativa Citrus lemon F1CGQ9 Proteína de choque térmico 90 Citrus lemon F8WL79 Aminopeptidase (EC 3.4.11.-) Citrus lemon F8WL86 Proteína de choque térmico Citrus lemon K9JG59 Proteína relacionada com o amadurecimento ao estresse de ácido abscísico Citrus lemon Q000W4 Quelato de Fe (III) redutase Citrus lemon Q39538 Proteína de choque térmico (Fragmento) Citrus lemon Q5UEN6 Proteína de partícula de reconhecimento de sinal putativa Citrus lemon Q8GV08 Desidrina Citrus lemon Q8L893 Fosfoglucomutase citosólica (Fragmento)
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Citrus lemon Q8S990 Proteína inibidora de poligalacturonase Citrus lemon Q8W3U6 Proteína inibidora de poligalacturonase Citrus lemon Q93XL8 Desidrina COR15 Citrus lemon Q941Q1 Classe 1 de hemoglobina não simbiótica Citrus lemon Q9MBF3 Proteína de ligação a RNA rica em glicina Citrus lemon Q9SP55 Subunidade G de próton ATPase de tipo V (Subunidade G de V-ATPase) (Subunidade G da bomba de prótons vacuolar) Citrus lemon Q9THJ8 Cadeia grande de ribulose bifosfato carboxilase (EC
4.1.1.39) (Fragmento) Citrus lemon Q9ZST2 Subunidade ALFA de pirofosfato--frutose 6-fosfato 1-fosfotransferase (PFP) (6-fosfofrutocinase, dependente de pirofosfato) (PPi-PFK) (6- Fosfofrutose-1-cinase dependente de pirofosfato) Citrus lemon Q9ZWH6 Inibidor de poligalacturonase Citrus lemon S5DXI9 Proteína da nucleocápside Citrus lemon S5NFC6 GTP ciclo-hidrolase Citrus lemon V4RG42 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4RGP4 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4RHN8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4RJ07 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4RJK9 Adenosil-homocisteinase (EC 3.3.1.1) Citrus lemon V4RJM1 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4RJX1 Proteína ribossômica 40S S6 Citrus lemon V4RLB2 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4RMX8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4RNA5 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4RP81 Glicosiltransferase (EC 2.4.1.-) Citrus lemon V4RPZ5 Proteína associada à adenilil ciclase Citrus lemon V4RTN9 Histona H4 Citrus lemon V4RUZ4 Fosfosserina aminotransferase (EC 2.6.1.52) Citrus lemon V4RVF6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4RXD4 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4RXG2 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4RYA0 Proteína não caracterizada
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Citrus lemon V4RYE3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4RYH3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4RYX8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4RZ12 Subunidade beta´ de Coatomer Citrus lemon V4RZ89 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4RZE3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4RZF3 1,2-di-hidróxi-3-ceto-5-metiltiopenteno dioxigenase (EC 1.13.11.54) (Acirredutona dioxigenase (requerendo Fe(2+))) (ARD) (Fe-ARD) Citrus lemon V4RZM7 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4RZX6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4S1V0 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4S2B6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4S2N1 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4S2S5 Proteína não caracterizada (Fragmento) Citrus lemon V4S346 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4S3T8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4S409 Cianato hidratase (Cianase) (EC 4.2.1.104) (Cianato hidrolase) (Cianato liase) Citrus lemon V4S4E4 Histona H2B Citrus lemon V4S4F6 Mono-oxigenase contendo flavina (EC 1.-.-.-) Citrus lemon V4S4J1 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4S4K9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4S535 Tipo alfa da subunidade de proteassomo (EC
3.4.25.1) Citrus lemon V4S5A8 Isocitrato desidrogenase [NADP] (EC 1.1.1.42) Citrus lemon V4S5G8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4S5I6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4S5N4 Proteína não caracterizada (Fragmento) Citrus lemon V4S5Q3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4S5X8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4S5Y1 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4S6P4 ATPase de transporte de cálcio (EC 3.6.3.8) Citrus lemon V4S6W0 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4S6W7 Proteína não caracterizada (Fragmento)
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Citrus lemon V4S6Y4 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4S773 Proteína ribossômica L19 Citrus lemon V4S7U0 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4S7U5 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4S7W4 Piruvato cinase (EC 2.7.1.40) Citrus lemon V4S885 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4S8T3 Peptidil-prolil cis-trans isomerase (PPIase) (EC
5.2.1.8) Citrus lemon V4S920 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4S999 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4S9G5 Fosfoglicerato cinase (EC 2.7.2.3) Citrus lemon V4S9Q6 Beta-amilase (EC 3.2.1.2) Citrus lemon V4SA44 Serina/treonina-proteína fosfatase (EC 3.1.3.16) Citrus lemon V4SAE0 Alfa-1,4 glucana fosforilase (EC 2.4.1.1) Citrus lemon V4SAF6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SAI9 Subunidade M do fator de iniciação da tradução eucariótica 3 (eIF3m) Citrus lemon V4SAJ5 Proteína ribossômica Citrus lemon V4SAR3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SB37 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SBI0 Fator de alongamento 1-alfa Citrus lemon V4SBI8 D-3-fosfoglicerato desidrogenase (EC 1.1.1.95) Citrus lemon V4SBL9 Proteína de ligação a poliadenilato (PABP) Citrus lemon V4SBR1 S-formilglutationa hidrolase (EC 3.1.2.12) Citrus lemon V4SBR6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SCG7 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SCJ2 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SCQ6 Peptidil-prolil cis-trans isomerase (PPIase) (EC
5.2.1.8) Citrus lemon V4SDJ8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SE41 Proteína DETOXIFICAÇÃO (Proteína de extrusão de múltiplos fármacos e compostos tóxicos) Citrus lemon V4SE90 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SED1 Subunidade de flavoproteína succinato desidrogenase [ubiquinona], mitocondrial (EC
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso
1.3.5.1) Citrus lemon V4SEI1 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SEN9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SEX8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SF31 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SF69 Proteína ribossômica 40S S24 Citrus lemon V4SF76 Cisteína sintase (EC 2.5.1.47) Citrus lemon V4SFK3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SFL4 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SFW2 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SGC9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SGJ4 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SGN4 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SGV6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SGV7 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SHH1 ATPase da membrana plasmática (EC 3.6.3.6) (Fragmento) Citrus lemon V4SHI2 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SHJ3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SI86 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SI88 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SIA2 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SIC1 Fosfolipase D (EC 3.1.4.4) Citrus lemon V4SJ14 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SJ48 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SJ69 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SJD9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SJS7 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SJT5 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SKA2 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SKG4 Glucose-6-fosfato isomerase (EC 5.3.1.9) Citrus lemon V4SKJ1 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SL90 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SLC6 Tipo beta da subunidade de proteassomo (EC
3.4.25.1)
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Citrus lemon V4SLI7 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SLQ6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SMD8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SMN7 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SMV5 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SN00 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SNA9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SNC1 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SNC4 Aconitato hidratase (Aconitase) (EC 4.2.1.3) Citrus lemon V4SNZ3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SP86 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SPM1 Proteína ribossômica 40S S12 Citrus lemon V4SPW4 Proteína ribossômica 40S S4 Citrus lemon V4SQ71 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SQ89 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SQ92 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SQC7 Peroxidase (EC 1.11.1.7) Citrus lemon V4SQG3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SR15 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SRN3 Membro da superfamília transmembranar 9 Citrus lemon V4SS09 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SS11 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SS50 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SSB6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SSB8 Tipo alfa da subunidade de proteassomo (EC
3.4.25.1) Citrus lemon V4SSL7 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SSQ1 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SST6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SSW9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SSX5 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SU82 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SUD3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SUL7 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SUP3 Proteína não caracterizada
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Citrus lemon V4SUT4 UDP-glucose 6-desidrogenase (EC 1.1.1.22) Citrus lemon V4SUY5 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SV60 Serina/treonina-proteína fosfatase (EC 3.1.3.16) Citrus lemon V4SV61 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SVI5 Tipo alfa da subunidade de proteassomo (EC
3.4.25.1) Citrus lemon V4SVI6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SW04 Proteína não caracterizada (Fragmento) Citrus lemon V4SWD9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SWJ0 Proteína ribossômica 40S S3a Citrus lemon V4SWQ9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SWR9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SWU9 Frutose-bisfosfato aldolase (EC 4.1.2.13) Citrus lemon V4SX11 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SX99 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SXC7 Tipo alfa da subunidade de proteassomo (EC
3.4.25.1) Citrus lemon V4SXQ5 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SXW1 Proteína tipo beta-adaptina Citrus lemon V4SXY9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SY74 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SY90 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SY93 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SYH9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SYK6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SZ03 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SZ73 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SZI9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4SZX7 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T057 Proteína ribossômica L15 Citrus lemon V4T0V5 Subunidade A do fator de iniciação da tradução eucariótica 3 (eIF3a) (subunidade 10 do fator de iniciação da tradução eucariótica 3) Citrus lemon V4T0Y1 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T1Q6 Proteína não caracterizada
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Citrus lemon V4T1U7 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T2D9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T2M6 Cadeia beta da tubulina Citrus lemon V4T3G2 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T3P3 6-fosfogluconato desidrogenase, descarboxilante (EC 1.1.1.44) Citrus lemon V4T3V9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T3Y6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T4H3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T4I7 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T4M7 Superóxido dismutase [Cu-Zn] (EC 1.15.1.1) Citrus lemon V4T539 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T541 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T576 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T5E1 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T5I3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T5W7 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T6T5 Proteína ribossômica ácida 60S P0 Citrus lemon V4T722 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T785 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T7E2 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T7I7 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T7N0 Tipo beta da subunidade de proteassomo (EC
3.4.25.1) Citrus lemon V4T7N4 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T7T2 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T7W5 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T825 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T846 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T8E9 S-aciltransferase (EC 2.3.1.225) (Palmitoiltransferase) Citrus lemon V4T8G2 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T8G9 Corismato sintase (EC 4.2.3.5) Citrus lemon V4T8Y6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T8Y8 Proteína não caracterizada
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Citrus lemon V4T939 Carboxipeptidase (EC 3.4.16.-) Citrus lemon V4T957 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T998 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T9B9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4T9Y7 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TA70 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TAF6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TB09 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TB32 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TB89 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TBN7 Fosfoinositídeo fosfolipase C (EC 3.1.4.11) Citrus lemon V4TBQ3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TBS4 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TBU3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TCA6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TCL3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TCS5 Pectato liase (EC 4.2.2.2) Citrus lemon V4TD99 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TDB5 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TDI2 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TDY3 Serina/treonina-proteína cinase (EC 2.7.11.1) Citrus lemon V4TE72 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TE95 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TEC0 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TED8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TES4 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TEY9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TF24 Tipo alfa da subunidade de proteassomo (EC
3.4.25.1) Citrus lemon V4TF52 Uricase (EC 1.7.3.3) (Urato oxidase) Citrus lemon V4TFV8 Catalase (EC 1.11.1.6) Citrus lemon V4TGU1 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TH28 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TH78 Proteína tipo retículo Citrus lemon V4THM9 Proteína não caracterizada
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Citrus lemon V4TIU2 Ribulose-fosfato 3-epimerase (EC 5.1.3.1) Citrus lemon V4TIW6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TIY6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TIZ5 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TJ75 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TJC3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TJQ9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TK29 Subunidade reguladora da enzima E1 de ativação de NEDD8 Citrus lemon V4TL04 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TLL5 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TLP6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TM00 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TM19 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TMB7 Proteína não caracterizada (Fragmento) Citrus lemon V4TMD1 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TMD6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TMV4 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TN30 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TN38 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TNY8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TP87 Anidrase carbônica (EC 4.2.1.1) (Carbonato desidratase) Citrus lemon V4TPM1 Homosserina desidrogenase (HDH) (EC 1.1.1.3) Citrus lemon V4TQB6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TQM7 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TQR2 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TQV9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TS21 Tipo beta da subunidade de proteassomo (EC
3.4.25.1) Citrus lemon V4TS28 Anexina Citrus lemon V4TSD8 Proteína não caracterizada (Fragmento) Citrus lemon V4TSF8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TSI9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TT89 Proteína não caracterizada
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Citrus lemon V4TTA0 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TTR8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TTV4 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TTZ7 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TU54 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TVB6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TVG1 Fator de iniciação da tradução eucariótica 5A (eIF- 5A) Citrus lemon V4TVJ4 Profilina Citrus lemon V4TVM6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TVM9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TVP7 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TVT8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TW14 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TWG9 Subunidade delta da proteína 1 do complexo T Citrus lemon V4TWU1 Provável metiltiorribulose-1-fosfato desidratase/ enolase-fosfatase E1 bifuncional [Inclui: Enolase- fosfatase E1 (EC 3.1.3.77) (2,3-diceto-5-metiltio-1- fosfopentano fosfatase); Metiltiorribulose-1-fosfato desidratase (MTRu-1-P desidratase) (EC
4.2.1.109)] Citrus lemon V4TWX8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TXH0 Glutamato descarboxilase (EC 4.1.1.15) Citrus lemon V4TXK9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TXU9 Tiamina tiazol sintase, cloroplástica (Enzima biossintética de tiazol) Citrus lemon V4TY40 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TYJ6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TYP5 Proteína ribossômica 60S L13 Citrus lemon V4TYP6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TYR6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TYZ8 Cadeia alfa da tubulina Citrus lemon V4TZ91 Inibidor de dissociação de guanosina nucleotídeo difosfato Citrus lemon V4TZA8 Proteína não caracterizada
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Citrus lemon V4TZJ1 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TZK5 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TZP2 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TZT8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4TZU3 Proteína cinase ativada por mitogênio (EC
2.7.11.24) Citrus lemon V4TZU5 Di-hidrolipoil desidrogenase (EC 1.8.1.4) Citrus lemon V4TZZ0 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U003 Subunidade k do fator de iniciação da tradução eucariótica 3 (eIF3k) (eIF-3 p25) Citrus lemon V4U068 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U088 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U0J7 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U133 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U1A8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U1K1 Xilose isomerase (EC 5.3.1.5) Citrus lemon V4U1M1 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U1V0 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U1X7 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U1X9 Tipo beta da subunidade de proteassomo (EC
3.4.25.1) Citrus lemon V4U251 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U283 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U2E4 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U2F7 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U2H8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U2L0 Malato desidrogenase (EC 1.1.1.37) Citrus lemon V4U2L2 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U2W4 Subunidade C de próton ATPase de tipo V Citrus lemon V4U3L2 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U3W8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U412 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U4K2 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U4M4 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U4N5 Fator de iniciação de tradução eucariótica 6 (eIF-6)
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Citrus lemon V4U4S9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U4X3 Serina hidroximetiltransferase (EC 2.1.2.1) Citrus lemon V4U4Z9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U500 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U5B0 Subunidade E do fator de iniciação da tradução eucariótica 3 (eIF3e) (Subunidade 6 do fator de iniciação da tradução eucariótica 3) Citrus lemon V4U5B8 Glutationa peroxidase Citrus lemon V4U5R5 Citrato sintase Citrus lemon V4U5Y8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U6I5 Subunidade beta de ATP sintase (EC 3.6.3.14) Citrus lemon V4U6Q8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U706 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U717 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U726 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U729 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U734 Serina/treonina-proteína fosfatase (EC 3.1.3.16) Citrus lemon V4U7G7 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U7H5 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U7R1 Transportador de potássio Citrus lemon V4U7R7 Proteína cinase ativada por mitogênio (EC
2.7.11.24) Citrus lemon V4U833 Enzima málica Citrus lemon V4U840 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U8C3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U8J1 3-fosfochiquimato 1-carboxiviniltransferase (EC
2.5.1.19) Citrus lemon V4U8J8 Subunidade gama da proteína 1 do complexo T Citrus lemon V4U995 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U999 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4U9C7 Subunidade D de fator de iniciação de tradução eucariótica 3 (eIF3d) (Subunidade 7 do fator de iniciação de tradução eucariótica 3) (eIF-3-zeta) Citrus lemon V4U9G8 Prolina iminopeptidase (EC 3.4.11.5) Citrus lemon V4U9L1 Proteína não caracterizada
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Citrus lemon V4UA63 Fitocromo Citrus lemon V4UAC8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UAR4 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UB30 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UBK8 Subunidade a de próton ATPase de tipo V Citrus lemon V4UBL3 Subunidade alfa de Coatomer Citrus lemon V4UBL5 Proteína não caracterizada (Fragmento) Citrus lemon V4UBM0 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UBZ8 Aspartato aminotransferase (EC 2.6.1.1) Citrus lemon V4UC72 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UC97 Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) Citrus lemon V4UCE2 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UCT9 Acetil-coenzima A sintetase (EC 6.2.1.1) Citrus lemon V4UCZ1 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UE34 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UE78 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UER3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UET6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UEZ6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UFD0 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UFG8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UFK1 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UG68 Subunidade I do fator de iniciação da tradução eucariótica 3 (eIF3i) Citrus lemon V4UGB0 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UGH4 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UGL9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UGQ0 Ubiquitinil hidrolase 1 (EC 3.4.19.12) Citrus lemon V4UH00 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UH48 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UH77 Tipo alfa da subunidade de proteassomo (EC
3.4.25.1) Citrus lemon V4UHD8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UHD9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UHF1 Proteína não caracterizada
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Citrus lemon V4UHZ5 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UI07 Proteína ribossômica 40S S8 Citrus lemon V4UI34 Subunidade L do fator de iniciação da tradução eucariótica 3 (eIF3l) Citrus lemon V4UIF1 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UIN5 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UIX8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UJ12 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UJ42 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UJ63 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UJB7 Proteína não caracterizada (Fragmento) Citrus lemon V4UJC4 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UJX0 Fosfotransferase (EC 2.7.1.-) Citrus lemon V4UJY5 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UK18 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UK52 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UKM9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UKS4 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UKV6 Proteína ribossômica 40S SA Citrus lemon V4UL30 Subunidade beta de pirofosfato--frutose 6-fosfato 1- fosfotransferase (PFP) (EC 2.7.1.90) (6- fosfofrutocinase, dependente de pirofosfato) (PPi- PFK) (6-Fosfofrutose-1-cinase dependente de pirofosfato) Citrus lemon V4UL39 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4ULH9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4ULL2 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4ULS0 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UMU7 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UN36 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UNT5 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UNW1 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UP89 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UPE4 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UPF7 Proteína não caracterizada
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Citrus lemon V4UPK0 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UPX5 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UQ58 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UQF6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UR21 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UR80 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4URK3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4URT3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4US96 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4USQ8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UT16 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UTC6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UTC8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UTP6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UTY0 Tipo alfa da subunidade de proteassomo (EC
3.4.25.1) Citrus lemon V4UU96 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UUB6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UUJ9 Aminopeptidase (EC 3.4.11.-) Citrus lemon V4UUK6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UV09 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UV83 Lisina--tRNA ligase (EC 6.1.1.6) (Lisil-tRNA sintetase) Citrus lemon V4UVJ5 Diacilglicerol cinase (DAG quinase) (EC 2.7.1.107) Citrus lemon V4UW03 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UW04 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UWR1 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UWV8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4UX36 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4V003 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4V0J0 Proteína ribossômica 40S S26 Citrus lemon V4V1P8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4V4V0 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4V5T8 Modificador de dobra de ubiquitina 1 Citrus lemon V4V600 Proteína não caracterizada
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Citrus lemon V4V622 Aldeído desidrogenase Citrus lemon V4V6W1 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4V6Z2 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4V738 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4V8H5 Proteína associada à classificação de proteína vacuolar 35 Citrus lemon V4V9P6 Subunidade F do fator de iniciação da tradução eucariótica 3 (eIF3f) (eIF-3-épsilon) Citrus lemon V4V9V7 Cadeia pesada de clatrina Citrus lemon V4V9X3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4VAA3 Superóxido dismutase (EC 1.15.1.1) Citrus lemon V4VAF3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4VBQ0 Proteína não caracterizada (Fragmento) Citrus lemon V4VCL1 Tipo beta da subunidade de proteassomo (EC
3.4.25.1) Citrus lemon V4VCZ9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4VDK1 Peptidilprolil isomerase (EC 5.2.1.8) Citrus lemon V4VEA1 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4VEB3 Alanina--tRNA ligase (EC 6.1.1.7) (Alanil-tRNA sintetase) (AlaRS) Citrus lemon V4VEE3 Glutamina sintetase (EC 6.3.1.2) Citrus lemon V4VFM3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4VFN5 Tipo beta da subunidade de proteassomo (EC
3.4.25.1) Citrus lemon V4VGD6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4VGL9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4VHI6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4VIP4 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4VJT4 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4VK14 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4VKI5 Proteína-L-isoaspartato O-metiltransferase (EC
2.1.1.77) Citrus lemon V4VKP2 Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (EC 1.2.1.-) Citrus lemon V4VL73 Acil-coenzima A oxidase Citrus lemon V4VLL7 Proteína não caracterizada
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Citrus lemon V4VN43 Proteína não caracterizada (Fragmento) Citrus lemon V4VQH3 Metilenotetra-hidrofolato redutase (EC 1.5.1.20) Citrus lemon V4VTC9 Proteína não caracterizada (Fragmento) Citrus lemon V4VTT4 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4VTY7 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4VU14 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4VU32 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4VUK6 S-(hidroximetil)glutationa desidrogenase (EC
1.1.1.284) Citrus lemon V4VVR8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4VXE2 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4VY37 Fosfomanomutase (EC 5.4.2.8) Citrus lemon V4VYC0 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4VYV1 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4VZ80 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4VZJ7 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4W2P2 Alfa-manosidase (EC 3.2.1.-) Citrus lemon V4W2Z9 Proteína do canal de cloreto Citrus lemon V4W378 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4W4G3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4W5F1 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4W5N8 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4W5U2 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4W6G1 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4W730 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4W7J4 ATPase 1 tipo Obg Citrus lemon V4W7L5 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4W8C5 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4W8C9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4W8D3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4W951 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4W9F6 Proteína ribossômica 60S L18a Citrus lemon V4W9G2 Proteína não caracterizada (Fragmento) Citrus lemon V4W9L3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4W9Y8 Proteína não caracterizada
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Citrus lemon V4WAP9 Subunidade beta de Coatomer (Proteína de revestimento beta) Citrus lemon V4WBK6 Subunidade 7 do complexo de citocromo b-c1 Citrus lemon V4WC15 Enzima málica Citrus lemon V4WC19 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4WC74 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4WC86 Subunidade B reguladora de 55 kDA de serina/treonina-proteína fosfatase 2A Citrus lemon V4WCS4 Proteína nuclear de ligação a GTP Citrus lemon V4WD80 Aspartato aminotransferase (EC 2.6.1.1) Citrus lemon V4WDK0 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4WDK3 6-Fosfofrutocinase dependente de ATP (ATP-PFK) (Fosfofrutocinase) (EC 2.7.1.11) (Fosfo- hexocinase) Citrus lemon V4WE00 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4WEE3 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4WEN2 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4WG97 Proteína relacionada com a autofagia Citrus lemon V4WGV2 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4WGW5 Uridina cinase (EC 2.7.1.48) Citrus lemon V4WHD4 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4WHF8 Sacarose sintase (EC 2.4.1.13) Citrus lemon V4WHK2 Pectinesterase (EC 3.1.1.11) Citrus lemon V4WHQ4 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4WHT6 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4WJ93 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4WJA9 Proteína não caracterizada Citrus lemon V4WJB1 Proteína não caracterizada Citrus lemon V9HXG3 Proteína dissulfeto-isomerase (EC 5.3.4.1) Citrus lemon W8Q8K1 Pirofosfatase inorgânica putativa Citrus lemon W8QJL0 Isopentenil pirofosfato isomerase putativa Uva Número de Proteínas Identificadas Acesso Uva A5C5K3 (+2) Adenosil-homocisteinase Uva Q9M6B5 Álcool desidrogenase 6
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Uva A3FA65 (+1) Aquaporina PIP1;3 Uva Q0MX13 Aquaporina PIP2;2 (+2) Uva A3FA69 (+4) Aquaporina PIP2;4 Uva A5AFS1 (+2) Fator de alongamento 1-alfa Uva UPI0001985 fator de alongamento 2 702 Uva D7T227 Enolase Uva D7TJ12 Enolase Uva A5B118 (+1) Frutose-bisfosfato aldolase Uva E0CQ39 Glucose-6-fosfato isomerase Uva D7TW04 Glutationa peroxidase Uva A1YW90 Glutationa S-transferase (+3) Uva A5BEW0 Histona H4 Uva UPI00015C9 HSC70-1 (proteína 1 cognata de choque térmico de A6A 70 kDa); isoforma 1 de ligação ao ATP Uva D7FBC0 Malato desidrogenase (+1) Uva D7TBH4 Enzima málica Uva A5ATB7 (+1) Metilenotetra-hidrofolato redutase Uva A5JPK7 (+1) Monodesidroascorbato redutase Uva A5AKD8 Peptidil-prolil cis-trans isomerase Uva A5BQN6 Peptidil-prolil cis-trans isomerase Uva A5CAF6 Fosfoglicerato cinase Uva Q09VU3 Fosfolipase D (+1) Uva D7SK33 Fosforilase Uva A5AQ89 Profilina Uva C5DB50 Fosfoglicerato mutase independente de 2,3- (+2) bifosfoglicerato putativa Uva D7TIZ5 Piruvato cinase Uva A5BV65 Triosefosfato isomerase Toranja G8Z362 (+1) (E)-beta-farneseno sintase Toranja Q5CD81 (E)-beta-ocimeno sintase
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Toranja D0UZK1 1,2-ramnosiltransferase (+2) Toranja A7ISD3 1,6-ramnosiltransferase Toranja Q80H98 Proteína de 280 kDa Toranja Q15GA4 Poliproteína de 286 kDa (+2) Toranja D7NHW9 2-fosfo-D-glicerato hidrolase Toranja D0EAL9 Poliproteína de 349 kDa Toranja Q9DTG5 Poliproteína de 349 kDa Toranja O22297 Celulase ácida Toranja Q8H986 Quitinase ácida de classe I Toranja D3GQL0 Aconitato hidratase 1 Toranja K7N8A0 Actina Toranja A8W8Y0 Álcool acil transferase Toranja Q84V85 Óxido de aleno sintase Toranja F8WL79 Aminopeptidase Toranja Q09MG5 Apocitocromo f Toranja J7EIR8 Ascorbato peroxidase Toranja B9VRH6 Ascorbato peroxidase Toranja G9I820 Fator de resposta à auxina Toranja J7ICW8 Beta-amilase Toranja Q8L5Q9 Beta-galactosidase Toranja A7BG60 Beta-pineno sintase Toranja C0KLD1 Beta-tubulina Toranja Q91QZ1 Proteína da cápside Toranja Q3SAK9 Proteína da cápside Toranja D2U833 Cotransportador de cloreto catiônico Toranja C3VPJ0 (+3) Chalcona sintase Toranja D5LM39 Proteína do canal de cloreto Toranja Q9M4U0 Cinamato 4-hidroxilase CYP73 Toranja Q39627 Citrina Toranja G2XKD3 Proteína de revestimento Toranja Q3L2I6 Proteína de revestimento Toranja D5FV16 Fator de ligação a CRT/DRE Toranja Q8H6S5 CTV.2
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Toranja Q8H6Q8 CTV.20 Toranja Q8H6Q7 CTV.22 Toranja Q1I1D7 Citocromo P450 Toranja Q7Y045 Desidrina Toranja F8WLD2 Proteína de reparação de excisão de DNA Toranja Q09MI8 Subunidade beta'' de RNA polimerase dirigida por
DNA Toranja D2WKC9 Resposta de etileno 1 Toranja D2WKD2 Sensor de resposta de etileno 1 Toranja D7PVG7 Proteína 1 tipo 3 insensível ao etileno Toranja G3CHK8 Subunidade E do fator de iniciação da tradução eucariótica 3 Toranja A9NJG4 Hidroperoxido de ácidos graxos liase (+3) Toranja B8Y9B5 Proteína da família de caixas F Toranja Q000W4 Quelato de Fe (III) redutase Toranja Q6Q3H4 Frutocinase Toranja F8WL95 Poliproteína Gag-pol Toranja Q8L5K4 Gama-terpineno sintase, cloroplástica Toranja Q9SP43 Glucose-1-fosfato adenililtransferase Toranja Q3HM93 Glutationa S-transferase Toranja D0VEW6 Fator de transcrição da família GRAS Toranja F8WL87 Proteína de choque térmico Toranja H9NHK0 Hsp90 Toranja Q8H6R4 Jp18 Toranja G3CHK6 Proteína da família de repetições ricas em leucina Toranja B2YGX9 Limonoide UDP-glucosiltransferase (+1) Toranja Q05KK0 Proteína de caixa MADS Toranja F8WLB4 Proteína contendo domínio de canal iônico mecanossensível Toranja Q5CD82 Monoterpeno sintase Toranja F8WLC4 Fator de transcrição MYB Toranja A5YWA9 Proteína de domínio NAC Toranja Q09MC9 Subunidade 5 de NAD(P)H-quinona oxidorredutase,
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso cloroplástica Toranja Q8H6R9 Proteína de resistência a doenças tipo NBS-LRR Toranja Q8H6S0 Proteína de resistência a doenças tipo NBS-LRR Toranja Q8H6R6 Proteína de resistência a doenças tipo NBS-LRR Toranja J9WR93 p1a Toranja Q1X8V8 P23 Toranja E7DSS0 P23 (+4) Toranja G0Z9I6 p27 Toranja I3XHN0 p33 Toranja B8YDL3 Proteína p33 Toranja B9VB22 Proteína p33 Toranja P87587 P346 Toranja B9VB56 Proteína p349 Toranja I3RWW7 Proteína p349 Toranja B9VB20 Proteína p349 Toranja Q9WID7 Proteína p349 Toranja Q2XP16 P353 Toranja O04886 (+1) Pectinesterase 1 Toranja F8WL74 Peptidil-prolil cis-trans isomerase Toranja Q0ZA67 Peroxidase Toranja F1CT41 Fosfoenolpiruvato carboxilase Toranja B1PBV7 Fitoeno sintase (+2) Toranja Q9ZWQ8 Proteína associada a plastídeo-lipídeo, cloroplástica Toranja Q94FM1 Poliproteína pol Toranja Q94FM0 Poliproteína pol Toranja G9I825 Proteína de ligação a poli C Toranja O64460 (+7) Inibidor de poligalacturonase Toranja I3XHM8 Poliproteína Toranja C0STR9 Poliproteína Toranja H6U1F0 Poliproteína Toranja B8QHP8 Poliproteína Toranja I3V6C0 Poliproteína Toranja C0STS0 Poliproteína
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Toranja K0FGH5 Poliproteína Toranja Q3HWZ1 Poliproteína Toranja F8WLA5 Proteína contendo PPR Toranja Q06652 (+1) Provável hidroperóxido de fosfolipídeos glutationa peroxidase Toranja P84177 Profilina Toranja Q09MB4 Proteína ycf2 Toranja A8C183 Subunidade II do centro de reação PSI Toranja A5JVP6 Proteína 2b putativa Toranja D0EFM2 Fator de iniciação da tradução eucariótico 1 putativo Toranja Q18L98 Poliproteína gag-pol putativa Toranja B5AMI9 Proteína de movimento putativa Toranja A1ECK5 Proteína de dedos de zinco responsivos a múltiplos estresses putativa Toranja B5AMJ0 Poliproteína de replicase putativa Toranja I7CYN5 RNA polimerase dependente de RNA putativa Toranja Q8RVR2 Terpeno sintase putativa Toranja B5TE89 Proteína não caracterizada putativa Toranja Q8JVF3 Proteína não caracterizada putativa Toranja F8WLB0 Proteína não caracterizada putativa ORF43 Toranja A5JVP4 Replicase viral putativa Toranja M1JAW3 Replicase Toranja H6VXK8 Poliproteína replicase Toranja J9UF50 (+1) Proteína replicase 1a Toranja J9RV45 Proteína replicase 2a Toranja Q5EGG5 Poliproteína associada à replicase Toranja G9I823 Proteína 1 do motivo de reconhecimento de RNA Toranja J7EPC0 RNA polimerase dependente de RNA Toranja Q6DN67 RNA polimerase L dirigida a RNA Toranja A9CQM4 Homólogo de SEPALLATA1 Toranja Q9SLS2 Sacarose sintase Toranja Q9SLV8 Sacarose sintase (+1) Toranja Q38JC1 Lipocalina induzida por temperatura Toranja D0ELH6 Tiorredoxina contendo domínio de
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso tetratricopeptídeo Toranja D2KU75 Proteína tipo taumatina Toranja C3VIC2 Fator de alongamento da tradução Toranja D5LY07 Ubiquitina/proteína de fusão ribossômica Toranja C6KI43 Proteína da família 1 de UDP-glucosiltransferases Toranja A0FKR1 Citrato vacuolar/simulador de H+ Toranja Q944C8 Invertase vacuolar Toranja Q9MB46 Subunidade E de próton ATPase de tipo V Toranja F8WL82 Proteína da família de repetições WD-40 Helianthuus annuus HanXRQChr Hsp90 03g0080391 Helianthuus annuus HanXRQChr Hsp90 13g0408351 Helianthuus annuus HanXRQChr Hsp90 13g0408441 Helianthuus annuus HanXRQChr Hsp90 14g0462551 Helianthuus annuus HanXRQChr Hsp70 02g0044471 Helianthuus annuus HanXRQChr Hsp70 02g0044481 Helianthuus annuus HanXRQChr Hsp70 05g0132631 Helianthuus annuus HanXRQChr Hsp70 05g0134631 Helianthuus annuus HanXRQChr Hsp70 05g0134801 Helianthuus annuus HanXRQChr glutationa S-transferase 10g0299441 Helianthuus annuus HanXRQChr glutationa S-transferase 16g0516291 Helianthuus annuus HanXRQChr lactato/malato desidrogenase 03g0091431 Helianthuus annuus HanXRQChr lactato/malato desidrogenase 13g0421951 Helianthuus annuus HanXRQChr lactato/malato desidrogenase
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso 10g0304821 Helianthuus annuus HanXRQChr lactato/malato desidrogenase 12g0373491 Helianthuus annuus HanXRQChr superfamília de GTPase pequenas, tipo Rab 01g0031071 Helianthuus annuus HanXRQChr superfamília de GTPase pequenas, tipo Rab 01g0031091 Helianthuus annuus HanXRQChr superfamília de GTPase pequenas, tipo Rab 02g0050791 Helianthuus annuus HanXRQChr superfamília de GTPase pequenas, tipo Rab 11g0353711 Helianthuus annuus HanXRQChr superfamília de GTPase pequenas, tipo Rab 13g0402771 Helianthuus annuus HanXRQChr isocitrato/isopropilmalato desidrogenase 07g0190171 Helianthuus annuus HanXRQChr isocitrato/isopropilmalato desidrogenase 16g0532251 Helianthuus annuus HanXRQChr fosfoenolpiruvato carboxilase 03g0079131 Helianthuus annuus HanXRQChr fosfoenolpiruvato carboxilase 15g0495261 Helianthuus annuus HanXRQChr fosfoenolpiruvato carboxilase 13g0388931 Helianthuus annuus HanXRQChr fosfoenolpiruvato carboxilase 14g0442731 Helianthuus annuus HanXRQChr UTP--glucose-1-fosfato uridililtransferase 15g0482381 Helianthuus annuus HanXRQChr UTP--glucose-1-fosfato uridililtransferase 16g0532261 Helianthuus annuus HanXRQChr tubulina 05g0135591 Helianthuus annuus HanXRQChr tubulina 06g0178921 Helianthuus annuus HanXRQChr tubulina 08g0237071 Helianthuus annuus HanXRQChr tubulina
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso 11g0337991 Helianthuus annuus HanXRQChr tubulina 13g0407921 Helianthuus annuus HanXRQChr tubulina 05g0145191 Helianthuus annuus HanXRQChr tubulina 07g0187021 Helianthuus annuus HanXRQChr tubulina 07g0189811 Helianthuus annuus HanXRQChr tubulina 09g0253681 Helianthuus annuus HanXRQChr tubulina 10g0288911 Helianthuus annuus HanXRQChr tubulina 11g0322631 Helianthuus annuus HanXRQChr tubulina 12g0367231 Helianthuus annuus HanXRQChr tubulina 13g0386681 Helianthuus annuus HanXRQChr tubulina 13g0393261 Helianthuus annuus HanXRQChr ubiquitina 12g0371591 Helianthuus annuus HanXRQChr ubiquitina 12g0383641 Helianthuus annuus HanXRQChr ubiquitina 17g0569881 Helianthuus annuus HanXRQChr fotossistema II HCF136, fator de 06g0171511 estabilidade/montagem Helianthuus annuus HanXRQChr fotossistema II HCF136, fator de 17g0544921 estabilidade/montagem Helianthuus annuus HanXRQChr subunidade de proteassomo tipo B 16g0526461 Helianthuus annuus HanXRQChr subunidade de proteassomo tipo B 17g0565551 Helianthuus annuus HanXRQChr subunidade de proteassomo tipo B
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso 05g0149801 Helianthuus annuus HanXRQChr subunidade de proteassomo tipo B 09g0241421 Helianthuus annuus HanXRQChr subunidade de proteassomo tipo B 11g0353161 Helianthuus annuus HanXRQChr família I3 de inibidores de proteinase (Kunitz) 16g0506311 Helianthuus annuus HanXRQChr família I3 de inibidores de proteinase (Kunitz) 16g0506331 Helianthuus annuus HanXRQChr metalopeptidase (família M10) 09g0265401 Helianthuus annuus HanXRQChr metalopeptidase (família M10) 09g0265411 Helianthuus annuus HanXRQChr ATPase, tipo AAA 05g0154561 Helianthuus annuus HanXRQChr ATPase, tipo AAA 08g0235061 Helianthuus annuus HanXRQChr ATPase, tipo AAA 09g0273921 Helianthuus annuus HanXRQChr ATPase, tipo AAA 16g0498881 Helianthuus annuus HanXRQChr oxoácido desidrogenase aciltransferase 02g0058711 Helianthuus annuus HanXRQChr oxoácido desidrogenase aciltransferase 08g0214191 Helianthuus annuus HanXRQChr superfamília de GTPase pequenas, tipo SAR1 08g0208631 Helianthuus annuus HanXRQChr superfamília de GTPase pequenas, tipo SAR1 11g0331441 Helianthuus annuus HanXRQChr superfamília de GTPase pequenas, tipo SAR1 12g0371571 Helianthuus annuus HanXRQChr superfamília de GTPase pequenas, tipo SAR1 12g0383571 Helianthuus annuus HanXRQChr superfamília de GTPase pequenas, tipo SAR1 14g0446771 Helianthuus annuus HanXRQChr superfamília de GTPase pequenas, tipo SAR1
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso 17g0539461 Helianthuus annuus HanXRQChr superfamília de GTPase pequenas, tipo SAR1 17g0548271 Helianthuus annuus HanXRQChr superfamília de GTPase pequenas, tipo SAR1 17g0569871 Helianthuus annuus HanXRQChr ATPase, complexo V1, subunidade A 10g0311201 Helianthuus annuus HanXRQChr ATPase, complexo V1, subunidade A 12g0359711 Helianthuus annuus HanXRQChr frutose-1,6-bisfosfatase 04g0124671 Helianthuus annuus HanXRQChr frutose-1,6-bisfosfatase 06g0176631 Helianthuus annuus HanXRQCP fotossistema II PsbD/D2, centro de reação g0579861 Helianthuus annuus HanXRQChr fotossistema II PsbD/D2, centro de reação 00c0439g05 74731 Helianthuus annuus HanXRQChr fotossistema II PsbD/D2, centro de reação 04g0099321 Helianthuus annuus HanXRQChr fotossistema II PsbD/D2, centro de reação 08g0210231 Helianthuus annuus HanXRQChr fotossistema II PsbD/D2, centro de reação 11g0326671 Helianthuus annuus HanXRQChr fotossistema II PsbD/D2, centro de reação 17g0549121 Helianthuus annuus HanXRQCP proteína D1 do fotossistema II g0579731 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína D1 do fotossistema II 00c0126g05 71821 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína D1 do fotossistema II 00c0165g05 72191 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína D1 do fotossistema II 00c0368g05
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso 74171 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína D1 do fotossistema II 00c0454g05 74931 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína D1 do fotossistema II 00c0524g05 75441 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína D1 do fotossistema II 00c0572g05 75941 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína D1 do fotossistema II 09g0257281 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína D1 do fotossistema II 11g0326571 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína D1 do fotossistema II 11g0327051 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína D1 do fotossistema II 16g0503941 Helianthuus annuus HanXRQCP citocromo b559 do fotossistema II g0580061 Helianthuus annuus HanXRQChr citocromo b559 do fotossistema II 01g0020331 Helianthuus annuus HanXRQChr citocromo b559 do fotossistema II 10g0283581 Helianthuus annuus HanXRQChr citocromo b559 do fotossistema II 10g0284271 Helianthuus annuus HanXRQChr citocromo b559 do fotossistema II 10g0289291 Helianthuus annuus HanXRQChr citocromo b559 do fotossistema II 10g0318171 Helianthuus annuus HanXRQChr citocromo b559 do fotossistema II 11g0326851 Helianthuus annuus HanXRQChr citocromo b559 do fotossistema II 16g0529011 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína de ligação a clorofila A-B 08g0219051
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Helianthuus annuus HanXRQChr proteína de ligação a clorofila A-B 12g0370841 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína de ligação a clorofila A-B 02g0053151 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína de ligação a clorofila A-B 02g0053161 Helianthuus annuus HanXRQCP citocromo f g0580051 Helianthuus annuus HanXRQChr citocromo f 01g0020341 Helianthuus annuus HanXRQChr citocromo f 10g0283571 Helianthuus annuus HanXRQChr citocromo f 10g0284261 Helianthuus annuus HanXRQChr citocromo f 10g0289281 Helianthuus annuus HanXRQChr citocromo f 10g0318181 Helianthuus annuus HanXRQChr citocromo f 11g0326841 Helianthuus annuus HanXRQChr citocromo f 15g0497521 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 06g0163851 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 09g0252071 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 12g0374041 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 04g0128141 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 05g0163131 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 03g0076971 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 05g0159851
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 05g0159971 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 11g0324631 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 13g0408051 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 03g0089331 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 13g0419951 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 15g0497041 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 16g0499761 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 04g0106961 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 06g0175811 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 04g0122771 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 09g0245691 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 16g0520021 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 03g0060471 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 14g0429531 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 06g0171911 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 15g0479091 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 15g0479101 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 17g0543641
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 17g0543661 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 04g0105831 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 09g0258341 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 10g0287141 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 15g0463911 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 03g0076171 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 05g0159291 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 13g0407551 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 12g0380701 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 15g0477271 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 17g0545211 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 17g0570741 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 17g0570761 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 02g0044021 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 05g0152871 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 01g0012781 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 08g0230861 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 13g0391831
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Helianthuus annuus HanXRQChr inibidor bifuncional de tripsina/alfa-amilase 11g0337791 Helianthuus annuus HanXRQChr 2-oxoácido desidrogenase aciltransferase 10g0312371 Helianthuus annuus HanXRQChr fosfatase ácida (classe B) 09g0276191 Helianthuus annuus HanXRQChr aldose-1-epimerase 05g0142271 Helianthuus annuus HanXRQChr alfa-D-fosfo-hexomutase 14g0439791 Helianthuus annuus HanXRQChr alfa-L-fucosidase 09g0251071 Helianthuus annuus HanXRQChr anexina 05g0147371 Helianthuus annuus HanXRQChr Protease Asp (Família de peptidases A1) 09g0247561 Helianthuus annuus HanXRQChr Enzima da ponte de berberina (S)- 13g0409681 reticulina:oxigênio oxidorredutase Helianthuus annuus HanXRQChr beta-hidroxiacil-(proteína transportadora de acila) 10g0295971 desidratase Helianthuus annuus HanXRQChr família de carboidratos esterases 13 - CE13 (pectina 13g0412571 acilesterase - PAE) Helianthuus annuus HanXRQChr família de carboidratos esterases 8 - CE8 (pectina 12g0360101 metilesterase - PME) Helianthuus annuus HanXRQChr anidrase carbônica 01g0019231 Helianthuus annuus HanXRQChr ligação de retinaldeído celular/transporte de alfa- 02g0036611 tocoferol Helianthuus annuus HanXRQChr chaperonina Cpn60 10g0313581 Helianthuus annuus HanXRQChr clatrina 09g0251791 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína de ligação a clorofila A-B 11g0329811 Helianthuus annuus HanXRQChr -metionina sintase independente de cobalamina 13g0398861 (vitamina B12)
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Helianthuus annuus HanXRQChr ciclofilina 10g0298981 Helianthuus annuus HanXRQChr Protease Cys (família das papaínas) 04g0103281 Helianthuus annuus HanXRQChr citocromo P450 09g0268361 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína dirigente 17g0535591 Helianthuus annuus HanXRQChr expansina 03g0065901 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína expressa (domínio de cupina, domínio da 11g0336761 proteína de armazenamento de sementes) Helianthuus annuus HanXRQChr proteína expressa (domínio de cupina, domínio da 10g0280931 proteína de armazenamento de sementes) Helianthuus annuus HanXRQChr proteína expressa (domínio de cupina, domínio da 10g0288971 proteína de armazenamento de sementes) Helianthuus annuus HanXRQChr proteína expressa (domínio de cupina, domínio da 12g0380361 proteína de armazenamento de sementes) Helianthuus annuus HanXRQChr proteína expressa (domínio de cupina, domínio da 09g0254381 proteína de armazenamento de sementes) Helianthuus annuus HanXRQChr proteína expressa (domínio de cupina, domínio da 04g0112711 proteína de armazenamento de sementes) Helianthuus annuus HanXRQChr proteína expressa (domínio de cupina, domínio da 07g0196131 proteína de armazenamento de sementes) Helianthuus annuus HanXRQChr proteína expressa (domínio de cupina, domínio da 10g0301281 proteína de armazenamento de sementes) Helianthuus annuus HanXRQChr proteína expressa (domínio de cupina, domínio da 10g0301931 proteína de armazenamento de sementes) Helianthuus annuus HanXRQChr proteína expressa (domínio de cupina) 13g0404461 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína expressa (DUF642) 01g0015821 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína expressa (domínio homólogo de Gnk2, 03g0065301 proteína antifúngica de sementes de Ginkgo) Helianthuus annuus HanXRQChr proteína expressa (domínios LRR) 03g0068311
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Helianthuus annuus HanXRQChr proteína expressa (domínios LRR) 10g0291371 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína de arabinogalactana tipo fasciclina (FLA) 03g0075061 Helianthuus annuus HanXRQChr ferritina 08g0221961 Helianthuus annuus HanXRQChr desidrogenase dependente de FMN 09g0257521 Helianthuus annuus HanXRQChr frutose-bisfosfato aldolase 14g0441641 Helianthuus annuus HanXRQChr germina 10g0312621 Helianthuus annuus HanXRQChr guicose-metanol-colina oxidorredutase 09g0244271 Helianthuus annuus HanXRQChr glutamato sintase 03g0061571 Helianthuus annuus HanXRQChr gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase 05g0144801 Helianthuus annuus HanXRQChr diéster de glicerofosforila fosfodiesterase 17g0550211 Helianthuus annuus HanXRQChr família de glicosídeos hidrolases 16 - GH16 06g0175391 (endoxiloglucana transferase) Helianthuus annuus HanXRQChr família de glicosídeos hidrolases 17 - GH17 (beta- 11g0351571 1,3-glucosidase) Helianthuus annuus HanXRQChr família de glicosídeos hidrolases 18 - GH18 05g0141461 Helianthuus annuus HanXRQChr família de glicosídeos hidrolases 19 - GH19 09g0276721 Helianthuus annuus HanXRQChr família de glicosídeos hidrolases 2 - GH2 02g0046191 Helianthuus annuus HanXRQChr família de glicosídeos hidrolases 20 - GH20 (N- 16g0524981 acetil-beta-glucosaminidase) Helianthuus annuus HanXRQChr família de glicosídeos hidrolases 27 - GH27 (alfa- 11g0322851 galactosidase/melibiase) Helianthuus annuus HanXRQChr família de glicosídeos hidrolases 3 - GH3 10g0293191
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Helianthuus annuus HanXRQChr família de glicosídeos hidrolases 31 - GH31 (alfa- 16g0511881 xilosidase) Helianthuus annuus HanXRQChr família de glicosídeos hidrolases 32 - GH32 14g0461441 (invertase vacuolar) Helianthuus annuus HanXRQChr família de glicosídeos hidrolases 35 - GH35 (beta- 13g0423671 galactosidase) Helianthuus annuus HanXRQChr família de glicosídeos hidrolases 35 - GH35 (beta- 10g0319301 galactosidase) Helianthuus annuus HanXRQChr família de glicosídeos hidrolases 38 - GH38 (alfa- 09g0256531 manosidase) Helianthuus annuus HanXRQChr família de glicosídeos hidrolases 5 - GH5 (glucana- 11g0320901 1,3-beta glucosidase) Helianthuus annuus HanXRQChr família de glicosídeos hidrolases 51 - GH51 (alfa- 05g0130491 arabinofuranosidase) Helianthuus annuus HanXRQChr família de glicosídeos hidrolases 79 - GH79 (endo- 10g0314191 beta-glucuronidase/heparanase) Helianthuus annuus HanXRQChr homóloga com PMR5 (Resistente ao Oídio) de A. 13g0397411 thaliana (acilação de carboidratos) Helianthuus annuus HanXRQChr família de inibidores I3 (família Kunitz-P) 14g0444681 Helianthuus annuus HanXRQChr lactato/malato desidrogenase 14g0445181 Helianthuus annuus HanXRQChr lectina (D-manose) 17g0564111 Helianthuus annuus HanXRQChr lectina (domínio PAN-2) 17g0558861 Helianthuus annuus HanXRQChr lipase acil-hidrolase (família GDSL) 02g0039251 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína de transferência de lipídeos/inibidor de 01g0000161 tripsina-alfa amilase Helianthuus annuus HanXRQChr lectina de ligação à manose 02g0047121 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína transportadora mitocondrial 10g0303361 Helianthuus annuus HanXRQChr multicobre oxidase 15g0489551
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Helianthuus annuus HanXRQChr ceramidase não lisossômica neutra/alcalina 05g0135581 Helianthuus annuus HanXRQChr nucleosídeo difosfato cinase 01g0017621 Helianthuus annuus HanXRQChr peroxidase 10g0295991 Helianthuus annuus HanXRQChr peroxirredoxina 13g0398251 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína 1 induzida por fosfato (phi) 11g0333171 Helianthuus annuus HanXRQChr fosfodiesterase/nucleotídeo pirofosfatase/fosfato 03g0060421 transferase Helianthuus annuus HanXRQChr fosfofrutocinase 03g0078011 Helianthuus annuus HanXRQChr fosfoglicerato cinase 13g0408831 Helianthuus annuus HanXRQChr fosfoglicerato mutase 10g0286701 Helianthuus annuus HanXRQChr fotossistema II PsbP, complexo de evolução de 06g0171591 oxigênio Helianthuus annuus HanXRQChr proteína associada a lipídeos de plastídeo/domínio 14g0434951 conservado de fibrilina Helianthuus annuus HanXRQChr plastocianina (proteína de ligação a cobre azul) 05g0146621 Helianthuus annuus HanXRQChr polifenol oxidase 11g0330251 Helianthuus annuus HanXRQChr subunidade de proteassomo tipo A 04g0094541 Helianthuus annuus HanXRQChr subunidade de proteassomo tipo B 03g0081271 Helianthuus annuus HanXRQChr fosfatase ácida roxa 12g0356851 Helianthuus annuus HanXRQChr transferase dependente de fosfato de piridoxal 15g0485781 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 11g0336791
Tabela 1: Marcadores de EV da Planta Espécies No. de Nome da Proteína Exemplificativas Acesso Helianthuus annuus HanXRQChr proteína ribossômica 11g0330521 Helianthuus annuus HanXRQChr ribulose bifosfato carboxilase, subunidade grande 11g0326801 Helianthuus annuus HanXRQChr subunidade pequena de ribulose-1,5-bisfosfato 16g0523951 carboxilase Helianthuus annuus HanXRQChr S-adenosil-L-homocisteína hidrolase 01g0022151 Helianthuus annuus HanXRQChr S-adenosilmetionina sintetase 14g0454811 Helianthuus annuus HanXRQChr Proteína extracelular tipo SCP (PR-1) 04g0109991 Helianthuus annuus HanXRQChr Ser carboxipeptidase (Família de peptidases S10) 03g0072241 Helianthuus annuus HanXRQChr Ser protease (subtilisina) (Família de peptidases 12g0377221 S8) Helianthuus annuus HanXRQChr superóxido dismutase 02g0055581 Helianthuus annuus HanXRQChr taumatina (PR5) 15g0493261 Helianthuus annuus HanXRQChr transcetolase 16g0532531 Helianthuus annuus HanXRQChr fator de alongamento da tradução EFTu / EF1A 07g0197421 Helianthuus annuus HanXRQChr proteína tumoral translacionalmente controlada 06g0173951

Claims (14)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para entregar um pacote de mensageiro de planta (PMP) a uma célula alvo, caracterizado por o método compreender introduzir um PMP compreendendo um lipídeo catiônico exógeno na célula alvo, em que o PMP compreendendo o lipídeo catiônico exógeno tem captação aumentada pela célula alvo em relação a um PMP não modificado.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o PMP modificado compreender pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais do que 90% de lipídeo catiônico.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o PMP modificado compreender pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais do que 90% de lipídeos derivados de uma vesícula extracelular (EV) de planta.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a captação celular aumentada ser uma captação celular aumentada de pelo menos 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100% em relação a um PMP não modificado.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os PMPs modificados compreenderem um agente funcional heterólogo.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o agente funcional heterólogo ser encapsulado por cada um da pluralidade de PMPs.
7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o agente funcional heterólogo ser embebido na superfície de cada um da pluralidade de PMPs.
8. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o agente funcional heterólogo ser conjugado à superfície de cada um da pluralidade de PMPs.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a célula ser uma célula vegetal.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a célula ser uma célula bacteriana.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a célula ser uma célula fúngica.
12. Composição de pacote de mensageiro de planta (PMP), caracterizada por compreender uma pluralidade de PMPs modificados tendo captação celular aumentada em relação a um PMP não modificado.
13. Composição de PMP, caracterizada por compreender uma pluralidade de PMPs modificados tendo captação celular vegetal aumentada, em que os PMPs são produzidos por um processo que compreende as etapas de: (a) proporcionar uma amostra inicial de uma planta, ou uma parte da mesma, em que a planta ou parte da mesma compreende EVs; (b) isolar uma fração de PMP em bruto da amostra inicial, em que a fração de PMP em bruto tem um nível diminuído de pelo menos um contaminante ou componente indesejado da planta ou parte da mesma em relação ao nível na amostra inicial; (c) purificar a fração de PMP em bruto, produzindo deste modo uma pluralidade de PMPs puros, em que a pluralidade de PMPs puros tem um nível diminuído de pelo menos um contaminante ou componente indesejado da planta ou parte da mesma em relação ao nível na fração de EV em bruto; (d) carregar os PMPs puros com um agente de penetração de células vegetais, gerando deste modo PMPs modificados tendo captação celular vegetal aumentada em relação a um PMP não modificado; e
(e) formular os PMPs da etapa (d) para entrega a uma planta.
14. Composição de PMP, caracterizada por compreender uma pluralidade de PMPs modificados tendo captação celular animal aumentada, em que os PMPs são produzidos por um processo que compreende as etapas de: (a) proporcionar uma amostra inicial de uma planta, ou uma parte da mesma, em que a planta ou parte da mesma compreende EVs; (b) isolar uma fração de PMP em bruto da amostra inicial, em que a fração de PMP em bruto tem um nível diminuído de pelo menos um contaminante ou componente indesejado da planta ou parte da mesma em relação ao nível na amostra inicial; (c) purificar a fração de PMP em bruto, produzindo deste modo uma pluralidade de PMPs puros, em que a pluralidade de PMPs puros tem um nível diminuído de pelo menos um contaminante ou componente indesejado da planta ou parte da mesma em relação ao nível na fração de EV em bruto; (d) carregar os PMPs puros com um agente de penetração de células, gerando deste modo PMPs modificados tendo captação celular animal aumentada em relação a um PMP não modificado; e (e) formular os PMPs da etapa (d) para entrega a um animal.
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