MX2013014419A - Composiciones de nanoparticulas lipidicas y metodo para administracion de arnm. - Google Patents

Composiciones de nanoparticulas lipidicas y metodo para administracion de arnm.

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Abstract

En la presente se divulgan composiciones y métodos para modular la producción de una proteína en una célula objetivo; las composiciones y métodos divulgados en la presente son capaces de mejorar enfermedades asociadas con deficiencias proteicas o enzimáticas.

Description

COMPOSICIONES DE NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS Y MÉTODOS PARA ADMINISTRACIÓN DE ARNM MEMORIA DESCRIPTIVA Aún se necesitan nuevos abordajes y terapias para el tratamiento de deficiencias proteicas y enzimáticas. Por ejemplo, las enfermedades de almacenamiento lisosómico son un grupo de aproximadamente 50 trastornos metabólicos heredados raros que resultan de defectos en la función lisosómica, generalmente debido a una deficiencia de una enzima necesaria para el metabolismo. La enfermedad de Fabry es una enfermedad de almacenamiento lisosómico que resulta de una deficiencia de la enzima alfa galactosidasa (GLA), que provoca que un glucolípido conocido como globotriaosilceramida se acumule en los vasos sanguíneos y otros tejidos, conduciendo a varias manifestaciones dolorosas. Para determinadas enfermedades, como la enfermedad de Fabry, se necesita reemplazar una proteína o enzima que normalmente es secretada por células en el torrente sanguíneo. Las terapias, tales como terapia génica, que aumentan el nivel o producción de una proteína o enzima afectada podrían proporcionar un tratamiento o incluso la cura para dichos trastornos. Sin embargo, han habido vahas limitaciones al uso de terapia génica convencional a estos efectos.
La terapia génica convencional implica el uso de ADN para inserción de información genética deseada en las células huésped. El ADN introducido en la célula generalmente se integra en cierta medida en el genoma de una o más células transfectadas, permitiendo una acción duradera del material genético introducido en el huésped. Aunque pueden haber beneficios sustanciales por dicha acción sostenida, la integración de ADN exógeno en un genoma huésped también puede provocar muchos efectos nocivos. Por ejemplo, es posible que el ADN introducido se inserte en un gen intacto, resultando en una mutación que impide o incluso elimina totalmente la función del gen endógeno. Por consiguiente, la terapia génica con ADN puede resultar en una alteración de una función genética vital en el huésped tratado, tal como por ejemplo, eliminación o reducción de forma nociva de la producción de una enzima esencial o interrupción de un gen fundamental para la regulación del crecimiento celular, resultando en una proliferación celular aumentada o cancerosa. Además, con terapia génica basada en ADN convencional es necesaria una expresión eficaz del producto génico deseado para incluir una secuencia promotora fuerte, que nuevamente puede conducir a cambios indeseables en la regulación de la expresión génica normal en la célula. También es posible que el material genético basado en ADN resulte en la inducción de anticuerpos anti-ADN indeseados que, a su vez, pueden desencadenar una respuesta inmunitaria posiblemente fatal. Los abordajes de terapia génica usando vectores virales también pueden resultar en una respuesta inmunitaria adversa. En algunas circunstancias, el vector viral incluso puede integrarse en el genoma huésped. Además, la producción de vectores virales de grado clínico es también costosa y lleva mucho tiempo. La administración direccionada del material genético introducido usando vectores virales también puede ser difícil de controlar. Por consiguiente, aunque la terapia génica basada en ADN ha sido evaluada para la administración de proteínas secretadas usando vectores virales (Patente estadounidense No. 6.066.626; US2004/01 10709), estos abordajes pueden ser limitados por estas diversas razones.
Otro obstáculo aparente en estos abordajes anteriores en la administración de ácidos nucleicos que codifican las proteínas secretadas, está en los niveles de proteína que se producen en última instancia. Es difícil lograr niveles considerables de la proteína deseada en la sangre, y las cantidades no se sostienen con el tiempo. Por ejemplo, la cantidad de proteína producida por administración de ácido nucleico no alcanza nos niveles fisiológicos normales. Véase, por ejemplo, US2004/0110709.
A diferencia del ADN, el uso de ARN como agente de terapia génica es sustancialmente más seguro porque (1 ) el ARN no implica el riesgo de integrarse establemente en el genoma de la célula transfectada, eliminado así la preocupación de que el material genético introducido altere el funcionamiento normal de un gen esencial, o provoque una mutación que resulte en efectos nocivos u oncógenos; (2) no es necesario el uso de secuencias promotoras externas para la traducción eficaz de la proteína codificada, evitando nuevamente posibles efectos secundarios nocivos; (3) a diferencia del ADN plasmídico (ADNp), el ARN mensajero (ARNm) carece de motivos CpG inmunógenos de forma que no se generan anticuerpos anti- ARN; y (4) cualesquiera efectos nocivos que resulten de terapia génica basada en ARNm serán de duración limitada debido a la semivida relativamente corta del ARN. Además, no es necesario que el ARNm ingrese al núcleo para llevar a cabo su función, mientras que el ADN debe superar esta importante barrera.
Una razón por la que la terapia génica basada en ARNm no ha sido usada más en el pasado es que el ARNm es bastante menos estable que el ADN, especialmente cuando llega al citoplasma de una célula y se expone a las enzimas degradadoras. La presencia de un grupo hidroxilo en el segundo carbono del resto de azúcar en el ARNm provoca un impedimento esférico que evita que el ARNm forme la estructura de doble hélice más estable del ADN y, por consiguiente, hace que el ARNm sea más propenso a la degradación hidrolítica. Como resultado, hasta poco tiempo atrás, se creía ampliamente que el ARNm era demasiado lábil como para soportar los protocolos de transfección. Los avances en las modificaciones para la estabilización del ARN han provocado un mayor interés por el uso de ARNm en lugar de ADN plasmídico en la terapia génica. Ciertos vehículos de administración, tales como vehículos de administración polimérícos o lipidíeos catiónicos también pueden ayudar a proteger el ARNm transfectado de las RNasas endógenas. Sin embargo, a pesar de la estabilidad aumentada del ARNm modificado, la administración de ARNm a las células in vivo de una forma que posibilite niveles terapéuticos de producción proteica es aún un desafío, especialmente para ARNm que codifique proteínas de longitud completa. Aunque se ha logrado la administración de ARNm que codifica proteínas secretadas (US2009/0286852), se desconocen los niveles de proteína secretada de longitud completa que se producirían realmente a través de administración de ARNm ¡n vivo y no hay una razón para esperar que los niveles superen aquellos observados con la terapia génica basada en ADN.
A la fecha, se han hecho progresos considerables usando terapia génica de ARNm solamente en aplicaciones donde niveles bajos de traducción no son un factor limitante, tal como inmunización con antígenos que codifican ARNm. Los ensayos clínicos que implican la vacunación contra antígenos tumorales mediante inyección intradérmica de ARNm desnudo o formando complejo con protamína han demostrado viabilidad, ausencia de toxicidad y resultados prometedores. X. Su et al., Mol. Pharmaceutics 8:774-787 (201 1 ). Infelizmente, los bajos niveles de traducción han restringido en gran medida la explotación de la terapia génica basada en ARNm en otras aplicaciones que requieren niveles más altos de expresión sostenida de la proteína codificada por el ARNm para ejercer un efecto biológico o terapéutico.
La invención proporciona métodos de administración de agentes terapéuticos génicos de ARNm que conducen a la producción de niveles terapéuticamente efectivos de proteínas secretadas a través de un "efecto prolongado". En realizaciones de la invención, se carga ARNm que codifica una proteína secretada en nanopartículas lipídicas y se administra a las células objetivo in vivo. Las células objetivo a continuación actúan como una fuente de efecto prolongado para la producción de proteína secretada soluble en el sistema circulatorio a niveles terapéuticos. En algunas realizaciones, los niveles de proteína secretada producidos están por encima de niveles fisiológicos normales.
La invención proporciona composiciones y métodos para administración intracelular de ARNm en un vehículo de transferencia liposómico a una o más células objetivo para la producción de niveles terapéuticos de proteína funcional secretada.
Las composiciones y métodos de la invención son útiles en la gestión y tratamiento de una gran cantidad de enfermedades, en particular, enfermedades que resultan de deficiencias proteicas y/o enzimáticas, donde la proteína o enzima se secreta normalmente. Los individuos que padecen dichas enfermedades pueden tener defectos genéticos subyacentes que conducen a la expresión comprometida de una proteína o enzima, incluida, por ejemplo, la no síntesis de la proteína secretada, la síntesis reducida de la proteína secretada o la síntesis de una proteína secretada que carece o tiene actividad biológica disminuida. En particular, los métodos y composiciones de la invención son útiles para el tratamiento de trastornos de almacenamiento lisosómico y/o trastornos metabólicos del ciclo de la urea que se producen como resultado de uno o más defectos en la biosíntesis de enzimas secretadas que participan en el ciclo de la urea.
Las composiciones de la invención comprenden un ARNm, un vehículo de transferencia y, opcionalmente, un agente para facilitar el contacto con y la posterior transfección de una célula objetivo. El ARNm puede codificar una proteína secretada clínicamente útil. Por ejemplo, el ARNm puede codificar una enzima secretada funcional del ciclo de la urea o una enzima secretada que participa en trastornos de almacenamiento lisosómico. El ARNm puede codificar, por ejemplo, eritropoyetina (por ejemplo, EPO humana) o a-galactosidasa (por ejemplo, a-galactosidasa humana (GLA humana).
En algunas realizaciones, el ARNm puede comprender una o más modificaciones que confieren estabilidad al ARNm (por ejemplo, comparada con una versión natural o nativa del ARNm) y pueden comprender también una o más modificaciones con respecto al de origen natural que corrigen un defecto implicado en la expresión aberrante asociada de la proteína. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de la presente invención pueden comprender modificaciones en una o ambas regiones no traducidas en 5' y 3'. Dichas modificaciones pueden incluir, a modo no taxativo, la inclusión de una secuencia parcial de un gen de citomegalovirus (CMV) inmediato temprano 1 (IE1 ), un extremo de poli A, una estructura Capí o una secuencia que codifica una horma del crecimiento humana (hGH)). En algunas realizaciones, el ARNm se modifica para disminuir la inmunigenicidad del ARNm.
También se contemplan métodos para tratar a un sujeto que comprenden administrar una composición de la invención. Por ejemplo, se proporcionan métodos para tratar o prevenir afecciones en las que la producción de una proteína secretada específica y/o la utilización de una proteína secretada específica es inadecuada o peligrosa. En una realización, los métodos proporcionados en la presente pueden usarse para tratar a un sujeto que tiene una deficiencia en una o más de las enzimas del ciclo de la urea o en una o más enzimas deficientes en un trastorno de almacenamiento lisosómico.
En una realización preferida, el ARNm en las composiciones de la invención se formula en un vehículo de transferencia liposómico para facilitar la administración a una célula objetivo. Los vehículos de transferencia contemplados pueden comprender uno o más lipidos catiónicos, lipidos no catiónicos y/o lipidos modificados por PEG. Por ejemplo, el vehículo de transferencia puede comprender al menos uno de los siguientes lipidos catiónicos: C12-200, DLin-KC2-DMA, DODAP, HGT4003, ICE, HGT5000 o HGT5001. En realizaciones, el vehículo de transferencia comprende colesterol (col) y/o un lípido modificado por PEG. En algunas realizaciones, los vehículos de transferencia comprenden DMG-PEG2K. En determinadas realizaciones, el vehículo de transferencia comprende una de las siguientes formulaciones lipídicas: C12-200, DOPE, col, DMG-PEG2K; DODAP, DOPE, colesterol, DMG-PEG2K; HGT5000, DOPE, col, DMG-PEG2K, HGT5001 , DOPE, col, DMG-PEG2K.
La invención también proporciona composiciones y métodos útiles para facilitar la transfección y administración de una o más moléculas de ARNm a células objetivo capaces de exhibir el "efecto prolongado". Por ejemplo, las composiciones y métodos de la presente invención contemplan el uso de ligandos de direccionamiento capaces de potenciar la afinidad de la composición con una o más células objetivo. En una realización, el ligando de direccionamiento e apolipoproteina-B o apolipoproteína-E y las células objetivo correspondientes expresan receptores de lipoproteina de baja densidad, facilitando así el reconocimiento del ligando de direccionamiento. Los métodos y composiciones de la presente invención pueden usarse para dirigirse preferencialmente a un vasto número de células objetivo. Por ejemplo, las células objetivo contempladas incluyen, a modo no taxativo, hepatocitos, células epiteliales, células hematopoyéticas, células epitelial, células endoteliales, células pulmonares, células óseas, células madre, células mesenquimales, células neurales, células cardíacas, adipocítos, células de músculo liso vascular, cardiomiocitos, células de músculos esquelético, células beta, células pituitarias, células de recubrimiento sinovial, células ováricas, células testiculares, fibroblastos, células B, células T, reticulocitos, leucocitos, granulocitos y células tumorales.
En realizaciones, la proteína secretada es producida por la célula objetivo durante una cantidad de tiempo sostenida. Por ejemplo, la proteína secretada puede producirse durante más de una hora, más de cuatro, más de seis, más de 12, más de 24, más de 48 horas o más de 72 horas después de la administración. En algunas realizaciones, el polipéptido se expresa a un nivel pico aproximadamente seis horas después de la administración. En algunas realizaciones, la expresión del polipéptido es sostenida al menos a un nivel terapéutico. En algunas realizaciones, el polipéptido se expresa a al menos un nivel terapéutico durante más de una hora, más de cuatro, más de seis, más de 12, más de 24, más de 48 horas o más de 72 horas después de la administración. En algunas realizaciones, el polipéptido es detectable en dicho nivel en el suero o tejido del paciente (por ejemplo, hígado o pulmón). En algunas realizaciones, el nivel polipéptido detectable es de la expresión continua a partir de la composición de ARNm durante períodos de tiempo de más de una hora, más de cuatro, más de seis, más de 12, más de 24, más de 48 horas o más de 72 horas después de la administración.
En ciertas realizaciones, la proteína secretada se produce a niveles por encima de los niveles fisiológicos normales. El nivel de proteina secretada puede aumentarse en comparación con un testigo.
En algunas realizaciones el testigo es el nivel fisiológico de referencia del polipéptido en un individuo normal o en una población de individuos normales. En otras realizaciones, el testigo es el nivel fisiológico de referencia del polipéptido en un individuo que tiene una deficiencia en la proteína relevante o en una población de individuos que tienen una deficiencia en la proteína o polipéptido relevante. En algunas realizaciones, el testigo puede ser el nivel normal de la proteína o polipéptido relevante en el individuo al que se administra la composición. En otras realizaciones, el testigo es el nivel de expresión del polipéptido tras otra intervención terapéutica, por ejemplo, tas inyección directa del polipéptido correspondiente, en uno o más puntos de tiempo comparables.
En ciertas realizaciones, el polipéptido se expresa mediante la célula testigo a un nivel que es al menos 1.5 veces, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, 30 veces, al menos 100 veces, al menos 500 veces, al menos 5000 veces, al menos 50 000 veces o al menos 100 000 veces mayor que un testigo. En algunas realizaciones, el aumento de la expresión mayor que el testigo se sostiene durante más de una hora, más de cuatro, más de seis, más de 12, más de 24, más de 48 horas o más de 72 horas después de la administración. Por ejemplo, en una realización, los niveles de la proteína secretada se detectan en el suero al menos 1.5 veces, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, 30 veces, al menos 100 veces, al menos 500 veces, al menos 5000 veces, al menos 50 000 veces o al menos 100 000 veces mayores que un testigo durante al menos 48 horas o 2 días. En ciertas realizaciones, los niveles de proteína secretada son detectables a los 3 días, 4 días, 5 días o 1 semana o más después de la administración. Se pueden observar niveles aumentados de proteina secretada en el suero y/o en un tejido (por ejemplo, hígado, pulmón).
En algunas realizaciones, el método proporciona una semivida en circulación sostenida de la proteína secretada deseada. Por ejemplo, la proteina secretada puede detectarse durante más horas o más días que la semivida observada a través de inyección subcutánea de la proteína secretada. En realizaciones, la semivida de la proteína secretada se sostiene durante más de un 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días o 1 semana o más.
En algunas realizaciones, la administración comprende un única dosis o dosis repetidas. En ciertas realizaciones, la dosis se administra intravenosamente o mediante administración pulmonar.
El polipéptido puede ser, por ejemplo, uno o más de eritropoyetina, a-galactosidasa, receptor de LDL, Factor VIII, Factor IX, a-L-iduronidasa (para MPS I), iduronato sulfatasa (para MPS II), heparán-N-sulfatasa (para MPS MIA), a-?-acetilglucosaminidasa (para MPS IIIB), galactosa 6-sultatasa (para MPS IVA), lipasa acida lisosómica, arilsulfatasa-A.
Ciertas realizaciones se refieren a composiciones y métodos que proporcionan ARNm a una célula o sujeto, codificando al menos una parte del mismo una proteína funcional, en una cantidad que es sustancialmente menor que la cantidad de proteína funcional correspondiente generada a partir de dicho ARNm. Dicho de otra forma, en ciertas realizaciones, el¦ARNm administrado a la célula puede producir una cantidad de proteína que es sustancialmente mayor que la cantidad de ARNm administrada a la célula. Por ejemplo, en una cantidad de tiempo dada, por ejemplo 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20 o 24 horas después de la administración de ARNm a una célula o sujeto, la cantidad de proteína correspondiente generada por dicho ARNm puede ser al menos 1.5, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 o más veces mayor que la cantidad de ARNm realmente administrada a la célula o sujeto. Esto puede medirse basándose en la masa, basándose en los moles y/o basándose en las moléculas. La proteína puede medirse de varias formas. Por ejemplo, para una célula, la proteína medida puede medirse como una proteína intracelular, como una proteína extracelular o una combinación de las dos. Para un sujeto, la proteína medida puede ser proteina medida en suero; en un tejido o tejidos específicos tales como del hígado, ríñones, corazón o cerebro; en un tipo de célula específico tal como uno de los varios tipos celulares del hígado o cerebro; o en cualquier combinación de suero, tejido y/o tipo celular. Además, se puede medir una cantidad de referencia de proteína endógena en la célula o sujeto antes de la administración del ARNm y luego restarse de la proteina medida después de la administración del ARNm para proporcionar la cantidad de proteína correspondiente generada a partir del ARNm. De esta forma, el ARNm puede proporcionar una fuente de reservorio o depósito de una gran cantidad de material terapéutico para la célula o sujeto, por ejemplo, en comparación con la cantidad de ARNm administrada a la célula o sujeto. La fuente de depósito puede actuar como una fuente continua para la expresión polipeptídica a partir del ARNm durante períodos sostenidos de tiempo.
Lo tratado anteriormente y muchas otras características y ventajas relacionadas de la presente invención se entenderán mejor en referencia a la siguiente descripción detallada de la invención cuando se toma conjuntamente con los ejemplos que acompañan. Las diversas realizaciones descritas en la presente son complementarias y pueden usarse combinadas o usarse juntas de una forma entendida por el experto en virtud de las explicaciones contenidas en la presente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La FIG. 1 muestra la secuencia nucleotídica de una secuencia de CMV en 5' (SEQ ID NO:1 ), en donde X, si está presente, es GGA.
La FIG. 2 muestra la secuencia nucleotídica de una secuencia de hGH en 3' (SEQ ID NO:2).
La FIG. 3 muestra la secuencia nucleotídica de ARNm de eritropoyetína humana (EPO)(SEQ ID NO:3). Esta secuencia puede estar flanqueada en el extremo 5' por la SEQ ID NO:1 y en el extremo 3' por SEQ ID NO:2.
La FIG. 4 muestra la secuencia nucleotídica de ARNm de alfa-galactosidasa humana (GLA)(SEQ ID NO:4). Esta secuencia puede estar flanqueada en el extremo 5' por la SEQ ID NO: 1 y en el extremo 3' por SEQ ID NO:2.
La FIG. 5 muestra la secuencia nucleotídica de ARNm de alfa-antitripsina humana (A1AT) (SEQ ID NO:5). Esta secuencia puede estar flanqueada en el extremo 5' por la SEQ ID NO:1 y en el extremo 3' por SEQ ID NO:2.
La FIG. 6 muestra la secuencia nucleotídica de ARNm del factor IX humano (FIX)(SEQ ID NO:6). Esta secuencia puede estar flanqueada en el extremo 5' por la SEQ ID NO: 1 y en el extremo 3' por SEQ ID NO:2.
La FIG. 7 muestra la cuantificación de los niveles de proteina hEPO secretada, tales como se miden a través de ELISA. La proteína detectada es resultado de su producción a través del ARNm de hEPO administrado intravenosamente a través de una única dosis de varias formulaciones de nanopartículas lipídicas. Las formulaciones C 12-200 (30 ug), HGT4003 (150 ug), ICE (100 ug), DODAP (200 ug) se representan como el componente lipídico catiónico/ionizable de cada artículo de prueba {Formulaciones 1-4). Los valores se basan en muestras de sangre cuatro horas después de la administración.
La FIG. 8 muestra la medición del hematocrito de ratones tratados con una única dosis IV de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de EPO humana {Formulaciones 1-4). Se tomaron muestras de sangre completa a las 4 hr (Días 1 ), 24 hr (Día 2), 4 días, 7 días y 10 días después de la administración.
La FIG. 9 muestra las mediciones de hematocrito de ratones tratados con nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de EPO humana con un dosis IV única o tres inyecciones (día 1 , día 3, día 5). Se tomaron muestras de sangre completa antes de la inyección (día -4), el día 7 y el día 15. La Formulación 1 se administró: (30 ug, dosis única) o (3 x 10 ug, dosis día 1 , día 3, día 5); La Formulación 2 se administró: (3 x 50 ug, dosis día 1 , día 3, día 5).
La FIG. 10 muestra la cuantíficación de los niveles de proteína a-galactosidasa humana (hGLA) secretada, tales como se miden a través de ELISA. La proteína detectada es resultado de la producción a partir del ARNm de hGLA administrado a través de nanopartículas lipídicas {Formulación 1; dosis intravenosa única de 30 ug, en base a ARNm encapsulado). La proteína hGLA se detecta por 48 horas.
La FIG. 1 1 muestra la actividad de hGLA en suero. La actividad de hGLA se midió usando el sustrato 4-metilumbeliferil-a-D-galactopiranósido (4-MU-a-gal) a 37°C. Los datos son un promedio de 6 a 9 mediciones individuales.
La FIG. 12 muestra la cuantificación de los niveles de proteína hGLA en suero tales como se miden a través de ELISA. La proteína se produce a partir de ARNm de hGLA administrado a través de nanopartículas lipídicas basadas en C12-200 (C12-200:DOPE:Col:D GPEG2K, 40:30:25:5 {Formulación 1); 30 ug de ARNm basados en ARNm encapsulado, dosis IV única). La proteína hGLA se monitorea por 72 horas, por dosis única intravenosa, basada en ARNm encapsulado). La proteína hGLA se monitorea por 72 horas.
La FIG. 13 muestra la cuantificación de los niveles de proteína hGLA en el hígado, ríñones y bazo, tales como se miden a través de ELISA. La proteína se produce a partir de ARNm de hGLA administrado a través de nanopartículas lipídicas basadas en C12-200 (Formulación 1 ; 30 ug de ARNm basados en ARNm encapsulado, dosis IV única). La proteína hGLA se monitorea por 72 horas.
Las FIGS. 14A-14B muestran un estudio de respuesta a dosis q ue monitorea la producción de proteína de hGLA tal como es secretada la proteína GLA humana derivada de RT en suero (figura 14A) e hígado (figura 14B). Las muestras se midieron 24 horas posadministración {Formulación 1; dosis única, IV, N=4 ratones/grupo) y se cuantificaron mediante ELISA.
La FIG. 15 muestra los perfiles farmacocinéticos de Alfa-galactosidasa basada en ERT en ratones lampiños atímicos (dosis de 40 ug/kg) y proteína hGLA producida a partir de MRT (Formulación 1; dosis de ARNm 1.0 mg/kg).
La FIG. 16 muestra la cuantificación de los niveles de proteína hGLA en ratones con Fabry tratados con MRT, tales como se miden a través de ELISA. La proteína se produce a partir de ARNm de hGLA administrado a través de nanoparticulas lipídicas basadas en C12-200 {Formulación 1; 10 ug de ARNm por dosis única intravenosa basada en ARNm encapsulado). El suero se monítorea por 72 horas.
La FIG. 17 muestra la cuantificación de los niveles de proteína hGLA en el hígado, ríñones, bazo y corazón de ratones con genes inactívados con Fabry tratados con MRT, tales como se miden a través de ELISA. La proteína se produce a partir de ARNm de hGLA administrado a través de nanoparticulas lipídicas basadas en C12-200 (Formulación 1; 30 ug de ARNm basados en ARNm encapsulado, dosis IV única). La proteina hGLA se monitorea por 72 horas. Los valores de la literatura que representan los niveles fisiológicos normales se grafican como líneas discontinuas.
La FIG. 18 muestra la cuantificación de los niveles de proteína hGLA secretada en ratones con Fabry tratados con MRT y Alfa-galactosidasa, tales como se miden usando ELISA. Ambas terapias fueron dosificadas con una dosis única intravenosa de 1.0 mg/kg.
La FIG. 19 muestra la cuantificación de los niveles de proteina hGLA en el hígado, ríñones, bazo y corazón de ratones con genes inactivados con Fabry tratados con MRT y ERT (Alfa-galactosidasa), tales como se miden a través de ELISA. La proteína se produce a partir de ARNm de hGLA administrado a través de nanopartículas lipídicas {Formulación 1; 1.0 mg/kg de ARNm basado en ARNm encapsulado, dosis IV única).
La FIG. 20 muestra la cuantificación relativa de globotrioasilceramida (Gb3) y liso-Gb3 en los ríñones de ratones tratados y sin tratar. Los ratones con genes desactivados con Fabry machos se trataron con una dosis única de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de GLA o Alfa-galactosidasa a 1.0 mg/kg. Las cantidades reflejan la cantidad de Gb3/liso-Gb3 una semana después de la administración.
La FIG. 21 muestra la cuantificación relativa de globotrioasilceramida (Gb3) y liso-Gb3 en el corazón de ratones tratados y sin tratar. Los ratones con genes desactivados con Fabry machos se trataron con una dosis única de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de GLA o Alfa-galactosidasa a 1.0 mg/kg. Las cantidades reflejan la cantidad de Gb3/liso-Gb3 una semana después de la administración.
La FIG. 22 muestra un estudio de respuesta a dosis que monitorea la producción de proteína de GLA tal como es secretada la proteína GLA humana derivada de MRT en suero. Las muestras se midieron 24 horas después de la administración (dosis única, IV, N=4 ratones/grupo) de nanoparticulas lipídicas basadas en HGT4003 (Formulación 3) o HGT5000 (Formulación 5) y se cuantificaron a través de ELISA.
Las FIGS. 23A-23B muestran la producción de proteína hGLA tal como se mide en el suero (figura 23A) o en el hígado, ríñones y bazo (figura 23B). Las muestras se midieron 6 horas y 24 horas después de la administración (dosis única, IV, N=4 ratones/grupo) de nanoparticulas lipídicas basadas en HGT5001 (Formulación 6) y se cuantificaron a través de ELISA.
La FIG. 24 muestra la cuantificación de los niveles de proteina de Factor IX humano secretados medidos usando ELISA (media ng/mL + desviación típica) La proteína FIX se produce a partir de ARNm de FIX administrado a través de nanoparticulas lipídicas basadas en C12-2O0 (C12- 200:DOPE:Col:DMGPEG2K, 40:30:25:5 (Formulación 1; 30 ug de ARNm por dosis única intravenosa basada en ARNm encapsulado). La proteína FIX se monitorea por 72 horas. (n=24 ratones) La FIG. 25 muestra la cuantificación de los niveles de proteína a- 1 -antitripsina humana (A1AT) secretada, tales como se miden usando ELISA.
La proteína A1AT se produce a partir de ARNm de A1AT administrado a través de nanoparticulas lipídicas basadas en C12-200 (C 2- 200:DOPE:Col:DMGPEG2K, 40:30 25:5 (Formulación 1; 30 ug de ARNm por dosis única intravenosa basada en ARNm encapsulado). La proteína A1AT se rnonitorea por 24 horas.
La FIG. 26 muestra la cuantificación basada en ELISA de la proteína hEPO detectada en los pulmones y suero de ratones tratados después de administración intratraqueal de nanopartículas cargadas con ARNm de hEPO (mlU medido) (nanopartículas lipidicas basadas en C12-200, HGT5000 o HGT5001 ; Formulaciones 1, 5, 6 respectivamente). Los animales se sacrificaron 6 horas después de la administración (n=4 ratones por grupo).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona composiciones y métodos para administración intracelular de ARNm en un vehículo de transferencia liposómico a una o más células objetivo para la producción de niveles terapéuticos de proteína funcional secretada.
El término "funcional", tal como se usa en la presente para calificar a una proteína o enzima, significa que la proteína o enzima tiene actividad biológica, o alternativamente, es capaz de llevar a cabo la misma o una función similar a la de una proteína o enzima con funcionamiento normal. Las composiciones de ARNm de la invención son útiles para el tratamiento de varios trastornos metabolicos o genéticos y, en particular, aquellos trastornos genéticos o metabolicos que implican la no expresión, expresión alterada o deficiencia de una proteína o enzima. La expresión "niveles terapéuticos" se refiere a los niveles de proteína detectados en la sangre y tejidos que están por encima de los niveles testigo, en donde el testigo pueden ser niveles fisiológicos normales, o los niveles en el sujeto antes de la administración de la composición de ARNm. El término "secretado" se refiere a la proteína que se detecta fuera de la célula objetivo, en el espacio extracelular. La proteina puede detectarse en la sangre o en tejidos. En el contexto de la presente invención, el término "producido/a" se usa en su sentido más amplio para referirse a la traducción de al menos un ARNm en una proteina o enzima. Tales como se proporcionan en la presente, las composiciones incluyen un vehículo de transferencia. Tal como se usa en la presente, la expresión "vehículo de transferencia" incluye cualquiera de los portadores, diluyentes, excipientes farmacéuticos estándares y similares que generalmente se usan en conexión con la administración de agentes biológicamente activos, incluidos ácidos nucleicos. Las composiciones y, en particular, los vehículos de transferencia descritos en la presente son capaces de administrar ARNm a la célula objetivo. En realizaciones, el vehículo de transferencia es una nanopartícula lipidica.
ARNm El ARNm en las composiciones de la invención puede codificar, por ejemplo, una hormona, enzima, receptor, polipéptido, péptido u otra proteina secretada de interés que se secreta normalmente. En una realización de la invención, el ARNm puede tener opcionalmente modificaciones químicas o biológicas que, por ejemplo, mejoran la estabilidad y/o semivida de dicho ARNm o que mejoran o de otra forma facilitan la producción de proteina.
Los métodos de la invención proporcionan la coadministración opcional de uno o más ARNm singulares a células objetivo, por ejemplo, combinando dos ARNm singulares en un único vehículo de transferencia. En una realización de la presente invención, un primer ARNm terapéutico y un segundo ARNm terapéutico, pueden formularse en un único vehículo de transferencia y administrarse. La presente invención también contempla la coadministración de un primer ARNm terapéutico y un segundo ácido nucleico para facilitar y/o potenciar la función o administración del primer ARNm terapéutico. Por ejemplo, dicho segundo ácido nucleico (por ejemplo, ARNm exógeno o sintético) puede codificar una proteína transportadora que tras la expresión (por ejemplo, traducción del ARNm exógeno o sintético) facilita la administración o potencia la actividad biológica del primer ARNm. Alternativamente, el primer ARNm terapéutico puede administrarse con un segundo ácido nucleico que funciona como una "chaperona", por ejemplo, para dirigir el pliegue del primer ARNm mensajero.
Los métodos de la invención también proporcionan la administración de uno o más ácidos nucleicos terapéuticos para tratar un único trastorno o deficiencia, en donde cada uno de dichos ácidos nucleicos funciona mediante un mecanismo de acción diferente. Por ejemplo, las composiciones de la presente invención pueden comprender un primer ARNm terapéutico que, por ejemplo, se administra para corregir una deficiencia proteica o enzimática endógena, y que está acompañado por un segundo ácido nucleico, que se administra para desactivar o "inactivar" un ácido nucleico endógeno con función alterada y su producto proteico o enzimático. Dichos "segundos" ácidos nucleicos pueden codificar, por ejemplo, el ARNm o ARNip, Tras la transfección, un ARNm natural en las composiciones de la invención puede descomponerse con una semivida de entre 30 minutos y varios días. El ARNm de las composiciones de la invención preferiblemente conserva al menos alguna capacidad para ser traducido, produciendo así una proteína o enzima secretada funcional. Por lo tanto, la invención proporciona composiciones que comprenden y métodos de administración de un ARNm estabilizado. En algunas realizaciones de la invención, la actividad del ARNm se prolonga por un período de tiempo extendido. Por ejemplo, la actividad del ARNm puede prolongarse a fin de que las composiciones de la presente invención se administren a aun sujeto semisemanalmente o bisemansalmente o preferiblemente, mensualmente, bimensualmente, trimestralmente o anualmente. La actividad extendida o prolongada del ARNm de la presente invención, se relaciona directamente con la cantidad de proteina o enzima funcional secretada producida a partir de dicho ARNm. De forma similar, la actividad de las composiciones de la presente invención puede extenderse o prolongarse adicionalmente mediante modificaciones hechas para mejorar o potenciar la traducción del ARNm. Además, la cantidad de proteína o enzima funcional producida por la célula objetivo es una función de la cantidad de ARNm administrado a las células objetivo y de la estabilidad de dicho ARNm. En la medida que la estabilidad del ARNm de la presente invención pueda mejorarse o potenciarse, la semivida, la actividad de la proteína o enzima secretada producida y la frecuencia de dosificación de la composición pueden extenderse adicionalmente.
Por lo tanto, en algunas realizaciones, el ARNm en las composiciones de la invención comprende al menos una modificación que confiere estabilidad aumentada o potenciada al ácido nucleico, incluida, por ejemplo, resistencia mejorada a la digestión por nucleasa in vivo. Tales como se usan en la presente, los términos "modificación" y "modificado/a" se refieren a los ácidos nucleicos proporcionados en la presente, incluyen al menos una alteración que preferiblemente potencia la ejemplo y proporciona un ARNm más estable (por ejemplo, resistente a la digestión por nucleasa) que la versión de origen natural del ARNm. Tales como se usan en la presente, los términos "estable" y "estabilidad" se refieren a los ácidos nucleicos de la presente invención y particularmente en relación con el ARNM, se refieren a la resistencia aumentada o potenciada a la degradación por, por ejemplo, nucleasas (es decir, endonucleasas o exonucleasas) que normalmente son capaces de degradar dichos ARNm. La estabilidad aumentada puede incluir, por ejemplo, menos sensibilidad a la hidrólisis u otra destrucción por enzimas endógenas (por ejemplo, endonucleasas o exonucleasas) y condiciones dentro de la célula o tejido objetivo, aumentando o potenciando así la residencia de dicho ARNm en la célula, tejido, sujeto y/o citoplasma objetivo. Las moléculas de ARNm estabilizadas proporcionadas en la presente demuestran semividas más extensas con respecto a sus contrapartes de origen natural, no modificadas (por ejemplo, la versión natural del ARNm). También contemplan los términos "modificación" y "modificado/a" como tales que se refieren al ARNm de la presente invención, alteraciones que mejoran o potencian la traducción de los ácidos nucleicos del ARNm, incluida, por ejemplo, la inclusión de secuencias que funcionan en la iniciación de la traducción proteica (por ejemplo, la secuencia consenso de Kozac). (Kozak, M., Nucleic Acids Res 15 (20): 8125-48 (1987)).
En algunas realizaciones, el ARNm de la invención ha sufrido una modificación química o biológica que volverse más estable. Las modificaciones ejemplares en un ARNm incluyen la reducción de una base (por ejemplo, mediante supresión o mediante sustitución de un nucleótido por otro) o modificación de una base, por ejemplo, la modificación química de una base. La frase "modificaciones químicas", tal como se usa en la presente, incluye modificaciones que introducen químicos que difieren de los existentes de forma natural en el ARNm, por ejemplo, modificaciones covalentes tales como la introducción de nucleótidos modificados, (por ejemplo, análogos nucleotídicos o la inclusión de grupos colgantes que no se encuentran naturalmente en dichas moléculas de ARNm).
Adicionalmente, las modificaciones adecuadas incluyen alteraciones en uno o más nucleótidos de un codón a fin de que el codón codifique el mismo aminoácido pero que sea más estable que el codón que se encuentra en la versión natural del ARNm. Por ejemplo, se ha demostrado una relación inversa entre la estabilidad del ARN y una cantidad mayor de residuos de cítidinas (C) y/o uridinas (U), y se descubrió que el ARN que carece de residuos de C y U es más estable a la mayoría de las RNasas (Heidenreich, ef al. J Biol Chem 269, 2131-8 (1994)). En algunas realizaciones, la cantidad de residuos de C y/o U en una secuencia de ARNm se reduce. En una otra realización, la cantidad de residuos de C y/o U se reduce mediante sustitución de un codón que codifica un aminoácido específico por otro codón que codifica el mismo o un aminoácido relacionado. Las modificaciones contempladas en los ácidos nucleicos de ARNm de la presente invención también incluyen la incorporación de pseudouridinas. La incorporación de pseudouridinas en los ácidos nucleicos del ARNm de la presente invención puede potenciar la estabilidad y capacidad translacional, así como disminuir la inmunogenicidad in vivo. Véase, por ejemplo, arikó, K., et al., Molecular Therapy 16 (1 1 ): 1833-1840 (2008). Las sustituciones y modificaciones en el ARNm de la presente invención pueden llevarse a cabo mediante métodos conocidos para uno o más expertos en la técnica.
Las restricciones en la reducción de la cantidad de residuos de C y U en una secuencia será probablemente mayor dentro de la región codificante de un ARNm, en comparación con una región no traducida, (es decir, probablemente no será posible eliminar todos los residuos de C y U presentes en el mensajero mientras aún se conserva la capacidad del mensajero para codificar la secuencia de aminoácidos deseada). Sin embargo, la degeneración del código genético, presenta una oportunidad para permitir la reducción de la cantidad de residuos de C y/o U que están presentes en la secuencia, mientras se mantiene la misma capacidad codificante (es decir, dependiendo del aminoácido codificado por un codón, existen varias posibilidades de modificación de las secuencias de ARN que pueden ser posibles). Por ejemplo, los codones para Gly puede alterarse para GGA o GGG en lugar de GGU o GGC.
El término modificación también incluye, por ejemplo, la incorporación de ligaduras no nucleotídicas o nucleótidos modificados en las secuencias de ARNm de la presente invención (por ejemplo, modificaciones en uno o ambos extremos 3' y 5* de una molécula de ARNm que codifica una proteina o enzima secretada funcional). Dichas modificaciones incluyen la adición de bases a una secuencia de ARNm (por ejemplo, la inclusión de un extremo poli A o un extremo poli A más largo), la alteración de UTR en 3* o de UTR en 5', la formación de un complejo entre el ARNm y un agente (por ejemplo, una proteína o molécula de ácido nucleico complementaria), y la inclusión de elementos que cambian la estructura de una molécula de ARNm (por ejemplo, que forman estructuras secundarias).
Se cree que el extremo poli A estabiliza a los mensajeros naturales. Por lo tanto, en una realización, se puede agregar un extremo poli A largo a una molécula de ARNm, proporcionando así un ARNm más estable. Los extremos poli A pueden agregarse usando una variedad de técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, se pueden agregar extremos poli A largos a ARNm sintético o transcrito in vitro usando poli A polimerasa (Yokoe, et al. Nature Biotechnology. 1996; 14: 1252-1256). Un vector de transcripción también puede codificar extremos poli A largos. Además, los extremos poli A se pueden agregar mediante transcripción directamente a partir de productos de PCR. En una realización, la longitud del extremo poli A es de al menos aproximadamente 90, 200, 300, 400, al menos 500 nucleótidos. En una realización, la longitud del extremo poli A se ajusta para controlar la estabilidad de una molécula de ARNm modificada de la invención y, por consiguiente, la transcripción de la proteína. Por ejemplo, dado que la longitud del extremo poli A puede influir en la semivida de una molécula de ARNm, la longitud del extremo poli A puede ajustarse para modificar el nivel de resistencia del ARNm a las nucleasas y así controlar el tiempo de la expresión proteica en una célula. En una realización, las moléculas de ARNm estabilizadas son suficientemente resistentes a la degradación in vivo (por ejemplo, mediante nucleasas), a fin de que puedan administrarse a la célula objetivo sin un vehículo de transferencia.
En una realización, un ARNm puede modificarse mediante la incorporación de secuencia sin traducir (UTR, por sus siglas en inglés) en 3' y/o 5' que no se encuentran naturalmente en el ARNm natural. En una realización, se puede incorporar una secuencia flanqueadora en 3' y/o 5' que flanquea naturalmente un ARNm y codifica una segunda proteína no traducida, a la secuencia nucleotídica de una molécula de ARNm que codifica una proteína terapéutica o funcional a efectos de modificarla. Por ejemplo, se pueden incorporar secuencias de 3' o 5' de moléculas de ARNm que son estables (por ejemplo, globina, actina, GAPDH, tubulina, histona o enzimas del ciclo de ácido cítrico) en la región 3' y/o 5' de una molécula de ácido nucleico de ARNm codificante para aumentar la estabilidad de la molécula de ARNm codificante. Véase, por ejemplo, US2003/0083272.
En algunas realizaciones, el ARNm en las composiciones de la invención incluyen la modificación del extremo 5' del ARNm para incluir una secuencia parcial de un gen de CMV inmediato temprano 1 (IE1) o un fragmento del mismo (por ejemplo, SEQ ID NO.1) para mejorar la resistencia a las nucleasas y/o mejorar la semivida del ARNm. Además de aumentar la estabilidad de la secuencia de ácido nucleico del ARNm, se descubrió sorprendentemente que la inclusión de una secuencia parcial de un gen de CMV inmediato temprano 1 (IE1 ) potencia la traducción del ARNm y la expresión de la proteina o enzima funcional. También se contempla en la presente la inclusión de una secuencia de gen de la hormona del crecimiento humana (hGH) o un fragmento de la misma (por ejemplo, SEQ ID NO:2) a los extremos 3' del ácido nucleico (por ejemplo, ARNm) para estabilizar adicionalmente el ARNm. Generalmente, las modificaciones preferidas mejoran la estabilidad y/o las propiedades farmacocinéticas (por ejemplo, la semivida) del ARNm con respecto a sus contrapartes no modificadas, e incluyen, por ejemplo, modificaciones hechas para mejorar la resistencia de dichos ARNm a la digestión por nucleasas in vivo.
Además se contemplan variantes de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:1 y/o SEQ ID NO:2, en donde las variantes mantienen las propiedades funcionales de los ácidos nucleicos, incluida la estabilización del ARNm y/o propiedades farmacocinéticas (por ejemplo, semivida). Las variantes pueden tener más de 90%, más de 95%, más de 98% o más de 99% de identidad secuencial con la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2.
En algunas realizaciones, la composición puede comprender un reactivo estabilizante. Las composiciones pueden incluir uno o más reactivos de formulación que se unen directa o indirectamente y estabilizan el ARNm, potenciando así el tiempo de residencia en la célula objetivo. Dichos reactivos preferiblemente conducen a una semivida mejorada del ARNm en las células objetivo. Por ejemplo, la estabilidad de un ARNm y la eficacia de la traducción pueden aumentarse mediante la incorporación de "reactivos estabilizantes" que forman complejos con el ARNm que se producen naturalmente dentro de una célula (véase, por ejemplo, la Patente estadounidense No. 5.677.124). La incorporación de un reactivo estabilizante puede lograrse por ejemplo, combinando el poli A y una proteína con el ARNm para que se estabilice in vitro antes de cargar o encapsular el ARNm dentro de un vehículo de transferencia. Los reactivos estabilizantes ejemplares incluyen una o más proteínas, péptídos, aptámeros, proteína accesorias translacionales, proteínas de unión a ARNm y/o factores de iniciación de la traducción.
La estabilización de las composiciones también puede mejorarse mediante el uso de restos de opsonización-inhibición, que típicamente son grandes polímeros hidrófilos que se unen químicamente o físicamente al vehículo de transferencia (por ejemplo, mediante la intercalación de un ancla soluble por lípídos en la propia membrana, o mediante la unión directa con grupos activos de lípídos de membrana). Estos polímeros hidrófilos de opsonización-inhibición forman una capa superficial protectora que disminuye considerablemente la absorción de los liposomas por el sistema de macrófagos-monocitos y el sistema reticuloendotelial (por ejemplo, tal como se describe en la Patente estadounidense No. 4,920,016, cuyo divulgación completa se incorpora a la presente a modo de referencia). Los vehículos de transferencia modificados con restos de opsonización-inhibición, por consiguiente, permanecen en la circulación mucho más tiempo que sus contrapartes no modificadas.
Cuando el ARN se híbrida con una molécula de ácido nucleico complementaria (por ejemplo, ADN o ARN) puede protegerse de las nucleasas. (Krieg, et al. Melton. Methods in Enzymology. 1987; 155, 397-415). La estabilidad del ARNm hibridado es probable debido a la especificidad de hebra simple inherente de la mayoría de las RNasas. En algunas realizaciones, el reactivo estabilizante seleccionado para formar un complejo con ARNm es una proteína eucariótica, (por ejemplo, una proteína de mamífero). En otra realización adicional, el ARNm puede modificarse mediante hibridación con una segunda molécula de ácido nucleico Si se hibridara una molécula de ARNm entera con una molécula de ácido nucleico complementaria, la iniciación de la traducción podría reducirse. En algunas realizaciones, la región no traducida en 5' y la región de inicio AUG de la molécula de ARNm pueden dejarse opcionalmente sin hibridar. Luego del inicio de la traducción, la actividad de desenrollamiento del complejo ribosómico puede funcionar incluso en dúplexes de alta afinidad a fin de que la traducción pueda proceder. (Liebhaber. J. Mol. Biol. 1992; 226: 2-13; Monia, et al. J Biol Chem. 1993; 268: 14514-22.) Se entenderá que cualquiera de los métodos descritos anteriormente para mejorar la estabilidad del ARNm pueden usarse solos o en combinación con uno o más de cualquiera d de los otros métodos y/o composiciones descritos anteriormente.
El ARNm de la presente invención puede combinarse opcionalmente con un gen reportero (por ejemplo, hacia 3' o hacia 5' de la región codificante del ARNm) que, por ejemplo, facilita la determinación de la administración del ARNm a las células o tejidos objetivo. Los genes reporteros adecuados pueden incluir, por ejemplo, ARNm de proteína verde fluorescente (ARNm de GFP), ARNm de Renilla Luciferase (ARNm de Luciferase), ARNm de Firefly Luciferase o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, el ARNm de GFP puede fusionarse con un ARNm que codifica una proteína se secretable para facilitar la confirmación de la ubicación del ARNm en las células objetivo que actuarán como depósito para la producción de la proteína.
Tales como se usan en la presente, los términos "transfectar" o "transfección" significan la introducción intracelular de un ARNm en una célula o preferiblemente en una célula objetivo. El ARNm introducido puede mantenerse establemente o transitoriamente en la célula objetivo. La expresión "eficacia de transfección'' se refiere a la cantidad relativa de ARNm absorbida por la célula objetivo que se somete a la transfección. En la práctica, la eficacia de transfección se estima por la cantidad de un producto de ácido nucleico reportero expresado por las células objetivo después de la transfección. Las realizaciones preferidas incluyen composiciones con altas eficacias de transfección y, en particular, aquellas composiciones que minimizan los efectos adversos que son mediados por la transfección de células no objetivo. Las composiciones de la presente invención que demuestran altas eficacias de transfección mejoran la probabilidad de administrar dosificaciones adecuadas del ARNm a la célula objetivo, mientras se minimizan potenciales efectos adversos sistémicos. En una realización de la presente invención, los vehículos de transferencia de la presente invención son capaces de administrar grandes secuencias de ARNm (por ejemplo, ARNm de al menos 1 kDa, 1 .5kDa, 2 kDa, 2.5kDa, 5kDa, 10kDa, 12kDa, 1 5kDa, 20kDa, 25kDa, 30kDa o más). El ARNm se puede formular con uno o más reactivos aceptables, que proporcionan un vehículo para administrar dicho ARNm a las células objetivo. Los reactivos apropiados generalmente se seleccionan en relación con varios factores, que incluyen, entre otras cosas, las propiedades biológicas o químicas del ARNm, la vía de administración prevista, el ambiente biológico anticipado al cual se expondrá el ARNm y las propiedades específicas de las células objetivo previstas. En algunas realizaciones, los vehículos de transferencia, tales como liposomas, encapsulan el ARNm sin comprometer la actividad biológica. En algunas realizaciones, el vehículo de transferencia demuestra unión preferencial y/o sustancial a una célula objetivo con respecto a células no objetivo. En una realización preferida, el vehículo de transferencia administra su contenido a la célula objetivo a fin de que el ARNm se administra en el compartimento subcelular adecuado, tal como el citoplasma.
Vehículo de transferencia En realizaciones, el vehículo de transferencia en las composiciones de la invención es una vehículo de transferencia liposómico, por ejemplo, una nanopartícula lipidica. En una realización, el vehículo de transferencia puede seleccionarse y/o prepararse para optimizar la administración de ARNm a una célula objetivo. Por ejemplo, si la célula objetivo es un hepatocito, las propiedades del vehículo de transferencia (por ejemplo, tamaño, carga y/o pH) pueden optimizarse para administrar eficazmente dicho vehículo de transferencia a la célula objetivo, reducir el aclaramiento inmunítario y/o promover la retención de dicha célula objetivo. Alternativamente, sí la célula objetivo es el sistema nervioso central (por ejemplo, el ARNm se administra para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, se puede dirigir específicamente hacia el cerebro o tejido espinal), la selección y preparación del vehículo de transferencia debe considerar la penetración y la retención dentro de la barrera hematoencefálica y/o el uso de medios alternativos de administración directa de dichos vehículo de transferencia a dicha célula objetivo. En una realización, las composiciones de la presente invención pueden combinarse con agentes que facilitan la transferencia de ARNm exógeno (por ejemplo, agentes que alteran o mejoran la permeabilidad de la barrera hemato-encefálica y potencian así la transferencia de ARNm exógeno a las células objetivo).
El uso de vehículos de transferencia liposómicos para facilitar la administración de ácidos nucleicos a las células objetivo se contempla en la presente invención. Los liposomas (por ejemplo, nanopartículas lipidicas liposómicas) son generalmente útiles en una variedad de aplicaciones en investigación, industria y medicina, particularmente por su uso como vehículos de transferencia de compuestos de diagnóstico o terapéuticos in vivo (Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321 , 1998; Drummond et al., Pharmacol. Rev. , 51 : 691 -743, 1999) y generalmente se caracterizan como vesículas microscópicas que tienen un espacio acuoso interior aislado de un medio exterior mediante una membrana de una o más bicapas. Las membranas de bicapa de los liposomas típicamente están formadas por moléculas anfifílicas, tales como lípídos de origen sintético o natural que comprenden dominios hidrófilos e hidrófobos separados espacialmente (Lasic, Trends Biotechnol. , 16: 307-321 , 1 998). Las membranas de bicapa de los liposomas también pueden estar formadas por polímeros y tensioactivos anfifílicos (por ejemplo, polimerosomas, niosomas, etc.).
En el contexto de la presente invención, un vehículo de transferencia liposómico típicamente sirve para transportar el ARNm hacia la célula objetivo. A los efectos de la presente invención, los vehículos de transferencia liposómicos se preparan para contener los ácidos nucleicos deseados. El proceso de incorporación de la una entidad deseada (por ejemplo, un ácido nucleico) en un liposoma a menudo se denomina "carga" (Lasic, ef al., FEBS Lett., 312: 255-258, 1992). Los ácidos nucleicos incorporados al liposoma pueden ubicarse completamente o parcialmente en el espacio interior del liposoma, dentro de la membrana de bicapa del liposoma, o asociados con la superficie exterior de la membrana liposómica. La incorporación de un ácido nucleico en liposomas también se denomina en la presente "encapsulación" donde el ácido nucleico se contiene completamente dentro del espacio interior del liposoma. El objeto de incorporar un ARNm en un vehículo de transferencia, tal como un liposoma, es a menudo proteger el ácido nucleico de un ambiente que puede contener enzimas o químicos que degradan ácidos nucleicos y/o sistemas o receptores que provocan la excreción rápida de los ácidos nucleicos. Por consiguiente, en una realización preferida de la presente invención, el vehículo de transferencia seleccionado es capaz de potenciar la estabilidad del ARNm contenido en el mismo. El liposoma puede posibilitar que el ARNm encapsulado alcance la célula objetivo y/o preferiblemente puede permitir que el ARNm mencapsulado alcance la célula objetivo o, alternativamente limitar la administración de dicho ARNm a otros sitios o células donde la presencia del ARNm administrado puede ser inútil o indeseado. Además, la incorporación del ARNm en un vehículo de transferencia, tal como, por ejemplo, un liposoma catiónico, también facilita la administración de dicho ARNm a una célula objetivo.
De forma ideal, los vehículos de transferencia liposómicos se preparan para encapsular uno o más ARNm deseados a fin de que las composiciones demuestren una eficacia de transfección alta y estabilidad potenciada. Aunque los liposomas pueden facilitar la introducción de ácidos nucleicos en las células objetivo, la adición de policationes (por ejemplo, poli L-lisina y protamina), como un copolímero, puede facilitar y, en algunos casos, potenciar marcadamente la eficacia de transfección de varios tipos de liposomas catiónicos en 2-28 veces en varias lineas celulares in vitro e in vivo. (Véase N.J. Caplen, ef a/., Gene Ther. 1995; 2: 603; S. Li, et al., Gene Ther. 1997; 4, 891.) Nanoparticulas lipidicas En una realización preferida de la presente invención, el vehículo de transferencia se formula como una nanopartícula lipídíca. Tal como se usa en la presente, la frase "nanopartícula lipídíca" se refiere a un vehículo de transferencia que comprende uno o más lípidos (por ejemplo, lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos y lípidos modificados por PEG). Preferiblemente, las nanoparticulas lipidicas se formulan para administrar uno o más ARNm a una o más células objetivo. Los ejemplos de lípidos adecuados incluyen, por ejemplo, los compuestos de fosfatidilo (por ejemplo, fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos y gangliósidos). También se contempla el uso de polímeros como vehículos de transferencia, ya sea solos o en combinación con otros vehículos de transferencia. Los polímeros adecuados pueden incluir, por ejemplo, poliacrilatos, polialquicianoacrilatos, poliláctido, copolímeros de poliláctido-poliglicólido, policaprolactonas, dextrano, albúmina, gelatina, alginato, colágeno, quitosano, ciclodextrinas, dendrímeros y polietilenimina. En una realización, el vehículo de transferencia se selecciona en base a su capacidad para facilitar la transfección de un ARNm a una célula objetivo.
La invención contempla el uso de nanopartículas lipídicas como vehículos de transferencia que comprende un lipido catiónico para encapsular y/o potenciar la administración de ARNm en una célula objetivo que actuará como un depósito para la producción proteica. Tal como se usa en la presente, la frase "lipido catiónico" se refiere a cualquiera de varias especies de lipidos que portan una carga positiva neta a un pH seleccionado, tal como pH fisiológico. Las nanopartículas lipídicas contempladas pueden prepararse incluyendo mezclas lipídicas multicomponentes de relaciones variables empleando uno o más lipidos catiónicos, lipidos no catiónicos y lipidos modificados por PEG. Se han descrito varios lipidos catiónicos en la literatura, muchos de estos se encuentran disponibles en el mercado.
Los lipidos catiónicos particularmente adecuados para uso en las composiciones y métodos de la invención incluyen aquellos descritos en la publicación de patente internacional WO 2010/053572, incorporada a la presente a modo de referencia y más particularmente, C 12-200 descrito en el párrafo [00225] de WO 2010/053572. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la invención empelan nanopartículas lipídicas que comprenden un lipido catiónico ionizable descrito en la solicitud de patente provisional estadounidense 61/617.468, presentada el 29 de marzo de 2012 (incorporada a la presente a modo de referencia), tal como, por ejemplo, (1 5Z 8Z)-N,N-dimetil-6-(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1 -il)tetracosa-15, 18-dien-1 -amina (HGT5000), (15Z.18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-1 -il)tetracosa-4,15, 18-trien-1 -amina (HGT5001 ) y (15Z, 18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-1 -il)tetracosa-5, 15, 18-trien-1 -amina (HGT5002).
En algunas realizaciones, se usa el lípido catiónico cloruro de N-[1 -(2,3-dioleilox¡)propil]-N,N,N-trimetilamonio o "DOTMA". (Felgner et al. (Proc. Nat'l Acad. Sci. 84:7413(1987); la Patente estadounidense No. 4.897.355). El DOTMA puede formularse solo o puede combinarse con el lipido neutro, dioleoilfosfatidil-etanolamina o "DOPE" u otros lipidos catiónicos o no catiónicos en un vehículo de transferencia liposómico o una nanoparticula lipídica, y dichos liposomas pueden usarse para potenciar la administración de ácidos nucleicos a células objetivo. Otros lipidos catiónicos adecuados incluyen, por ejemplo, 5-carboxiespermilglicinadioctadecilamida o "DOGS," 2,3-dioleiloxi-N-[2(espermina-carboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio o "DOSPA" (Behr et al. Proc. Nat.'l Acad. Sci. 86. 6982 (1989); la Patente estadounidense No. 5.171.678; la Patente estadounidense No. 5.334.761 ), 1 ,2-Dioleo¡l-3-Dimetilamonio-Propano o "DODAP", 1 ,2-Dioleoil-3-Trimetilamonio-Propano o "DOTAP". Los lipidos catiónicos contemplados también incluyen 1 ,2-disteariloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DSDMA", 1 ,2-dioleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DODMA", 1 ,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DLinDMA", 1 ,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DLenDMA", cloruro de N-diole¡l-N,N-dimetilamonio o "DODAC", bromuro de N,N-distearil-N,N-dimetilamonio o "DDAB", bromuro de N-(1 ,2-dim¡ristiloxiprop-3-il)-N,N-d¡metil-N-h¡drox¡et¡l amonio o "DMRIE", 3-dimetilamino-2-(colest-5-en-3-beta-oxibutan-4-oxi)-1-(c¡ s,cis-9, 12-octadecadienoxi)propano o "CLinDMA", 2-[5'-(colest-5-en-3-beta-oxi)-3'-oxapentoxi)-3-dimetil-1-(cis,cis-9', 1 -2'-octadecadienoxi)propano o "CpLinDMA", N,N-dimetil-3,4-dioleiloxibencilamina o "DMOBA", 1 ,2-N.N'-dtoleilcarbamil-3-dimetilaminopropano o "DOcarbDAP", 2,3-Dilinoleoiloxi-N,N-dimetilpropilamina o "DLinDAP", 1 ,2-N,N'-Dilinoleilcarbamil-3-dimetilaminopropano o "DLincarbDAP", 1 ,2-Dilinoleoilcarbamil-3-dimetilaminopropano o "DLinCDAP", 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1 ,3]-dioxolano o "DL¡n-K-DMA", 2,2-dilinoleil-4-dimet¡laminoetil-[1 ,3]-dioxolano o "DLin-K-XTC2-DMA" y 2-(2,2-di((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1 -il)-1 ,3-dioxolan-4-il)-N,N-dimetiletanamina (DLin-KC2-DMA)) (Véase, WO 2010/042877; Semple et al., Nature Biotech. 28:172-176 (2010)) o mezclas de los mismos. (Heyes, J., et al., J Controlled Reléase 107. 276-287 (2005); Morrissey, DV., ef al., Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005); Publicación PCT WO2005/121348A1).
El uso de lípidos catiónicos basados en colesterol también se contempla en la presente invención. Dichos lípidos catiónicos basados en colesterol pueden usarse ya sea solos o en combinación con otros lípidos catiónicos o no catiónicos. Los lípidos catiónicos basados en colesterol incluyen, por ejemplo, DC-Col (N,N-dimetil-N-etilcarboxamidocolesterol), 1 ,4-bis(3-N-oleilamino-propil)piperazina (Gao, et al. Biochem. Biophys. Res.
Comm. 179, 280 (1991 ); Wolf et al. BioTechniques 23, 139 ( 1997); la Patente estadounidense No. 5.744.335) o ICE.
Además, existen varios reactivos disponibles en el mercado para potenciar la eficacia de transfección. Los ejemplos adecuados incluyen LIPOFECTIN (DOTMA:DOPE) (Invitrogen, Carlsbad, Calif.), LIPOFECTAMINE (DOSPA:DOPE) (Invitrogen), LIPOFECTAMINE2000. (Invitrogen), FUGENE, TRANSFECTAM (DOGS) y EFFECTENE.
También se contemplan lipidos catiónicos tales como lípidos basados en dialquilamino, basados en imidazol y basados en guanidinio. Por ejemplo, ciertas realizaciones se dirigen a una composición que comprende uno o más lipidos catiónicos basados en imidazol, por ejemplo, éster de colesterol imidazol o lípido "ICE" (3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-dimetil-17-((R)-6-metilheptan-2-il)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro-1 H-ciclopenta[a]fenantren-3-il 3-(1 H-imidazol-4-il)propanoato, tal como se representa mediante la estructura (I) a continuación. En una realización preferida, un vehículo de transferencia para administración de ARNm puede comprender uno o más lípidos catiónicos basados en imidazol, por ejemplo, éster de colesterol imidazol o lípido "ICE" (3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-dimetil-17-((R)-6-metilheptan-2-il)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro-1 H-ciclopenta[a]fenantren-3-il 3-(1 H-imidazol-4-il)propanoato, tal como se representa mediante la estructura (I).
(I) Sin ánimo de ceñirse a ninguna teoría específica, se cree que la fusogenicidad del lipido catiónico basado en imidazol ICE se relaciona con la alteración endosómica que es facilitada por el grupo imidazol, que tiene una pKa más baja en relación con los lípidos catiónicos tradicionales. La alteración endosómica a su vez promueve la hinchazón osmótica y la alteración de la membrana liposómica, seguida de la transfección o liberación intracelular de los contenidos de ácido(s) nucleico(s) cargados en los mismos a la célula objetivo.
Los lípidos catiónicos basados en imidazol también se caracterizan por su toxicidad reducida con respecto a otros lípidos catiónicos. Los lípidos catiónicos basados en imidazol (por ejemplo, ICE) pueden usarse como el único lipido catiónico en la nanopartícula lipídica o, alternativamente, pueden combinarse con lipídico catiónicos tradicionales, lípidos no catiónicos y lípidos modificados por PEG. El lipido catiónico puede comprender una relación molar e aproximadamente 1 % a aproximadamente 90%, aproximadamente 2% a aproximadamente 70%, aproximadamente 5% a aproximadamente 50%, aproximadamente 10% a aproximadamente 40% del lipido total presente en el vehículo de transferencia o preferiblemente aproximadamente 20% a aproximadamente 70% del lípido total presente en el vehículo de transferencia.
De forma similar, ciertas realizaciones se dirigen a nanoparticulas lipidicas que comprenden el lípido catiónico HGT4003 2-((2,3- Bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1 -iloxi)propil)d¡sulfanil)-N,N- dimetiletanamina, tal como se representa mediante la estructura (II) a continuación y tal como se describe adicionalmente en la Solicitud Provisional estadounidense No:61/494.745, presentada el 8 de junio de 201 1 , cuyas divulgaciones completas se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad: (I) En otras realizaciones, las composiciones y métodos descritos en la presente se dirigen a nanoparticulas lipidicas que comprenden uno o más lipidos escindibles, tales como, por ejemplo, uno o más lipidos catiónicos que comprenden un grupo funcional disulfuro escíndible (S-S) (por ejemplo, HGT4001 , HGT4002, HGT4003, HGT4004 y HGT4005), tal como se describe adicionalmente en la Solicitud provisional estadounidense No: 61/494,745, cuya divulgación completa se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad.
El uso de fosfolípidos modificados con polietilenglicol (PEG) y lipidos derivados tales como ceramidas derivadas (PEG-CER), incluidas N- Octanoil-esfingosina-1 -[Succ¡n¡l(Metoxi PolietilenGlicol)-2000] (ceramida C8 PEG-2000) también se contempla en la presente invención, ya sea solos o preferiblemente en combinación con otros lipidos juntos que comprenden el vehículo de transferencia (por ejemplo, una nanopartícula lipídica). Los lipidos modificados por PEG contemplados incluyen, a modo no taxativo, una cadena de polietilenglicol de hasta 5 kDa de longitud acoplada covalentemente con una cadena(s) alquilo de C6-C2o de longitud. La adición de dichos componentes puede evitar la acumulación de complejos y también puede proporcionar un medio para aumentar la vida de circulación y aumentan la administración de la composición lípido-ácido nucleico a la célula objetivo, (Klibanov et al. (1990) FEBS Letters, 268 (1 ): 235-237) o pueden seleccionarse para intercambiar rápidamente fuera de la formulación in vivo (véase la Patente estadounidense No. 5.885.613). Los lipidos intercambiables particularmente útiles son ceramidas de PEG que tienen cadenas de acilo más cortas (por ejemplo, C14 o C18). El fosfolípido modificado por PEG y lipidos derivados de la presente invención pueden comprender una relación molar de aproximadamente 0% a aproximadamente 20%, aproximadamente 0.5% a aproximadamente 20%, aproximadamente 1 % a aproximadamente 1 5%, aproximadamente 4% a aproximadamente 10% o aproximadamente 2% del lipido total presente en el vehículo de transferencia liposómico.
La presente invención también contempla el uso de lipidos no catiónicos. Tal como se usa en la presente, la frase "lipido no catiónico" se refiere a cualquier lipido neutro, zwitteriónico o aniónico. Tal como se usa en la presente, la frase "lípido aniónico" se refiere a cualquiera de varias especies de lípidos que portan una carga negativa neta a un pH seleccionado, tal como pH fisiológico. Los lípidos no catiónicos incluyen, a modo no taxativo, distearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina (POPE), dioleoil-fosfatidiletanolamina 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato (DOPE-mal), dipalmitoil fosfatidíl etanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), distearoil-fosfatidil-etanolamina (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1-trans PE, 1-estearoil-2-oleoil-fosfatidietanolamina (SOPE), colesterol o una mezcla de los mismos. Dichos lípidos no catiónicos pueden usarse solos, pero preferiblemente se usan en combinación con otros excipientes, por ejemplo, lípidos catiónicos. Cuando se usa en combinación con un lípido catiónico, el lípido no catiónico puede comprender una relación molar de 5% a aproximadamente 90%, o preferiblemente aproximadamente 10 % a aproximadamente 70% del lípido total presente en el vehículo de transferencia.
Preferiblemente, el vehículo de transferencia (por ejemplo, una nanopartícula lipídica) se prepara combinando múltiples componentes lipidíeos y/o poliméricos. Por ejemplo, un vehículo de transferencia puede prepararse usando C12-200, DOPE, col, DMG-PEG2K a una relación molar de 40:30:25:5, o DODAP, DOPE, colesterol, DMG-PEG2K a una relación molar de 18:56:20:6, o HGT5000, DOPE, col, DMG-PEG2K a una relación molar de 40:20:35:5, o HGT5001 , DOPE, col, DMG-PEG2K a una relación molar de 40:20:35:5. La selección de lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos y/o lípidos modificados por PEG que comprenden la nanoparticula lipidica, así como la relación molar relativa de dichos lípidos entre sí, se basa en las características del lípido(s) seleccionado(s), la naturaleza de las células objetivo previstas, las características del ARNm que va a administrarse. Las consideraciones adicionales incluyen, por ejemplo, la saturación de la cadena alquilo, así como el tamaño, la carga, el pH, la pKa, la fusogenicidad y la toxicidad del lípido(s) seleccionado(s). Por consiguiente, las relaciones molares pueden ajustará en consonancia. Por ejemplo, en realizaciones, el porcentaje de lípido catiónico en la nanoparticula lipidica puede ser mayor que 1 0%, mayor que 20%, mayor que 30%, mayor que 40%, mayor que 50%, mayor que 60% o mayor que 70%. El porcentaje de lípido no catiónico en la nanoparticula lipidica puede ser mayor que 5%, mayor que 10%, mayor que 20%, mayor que 30% o mayor que 40%. El porcentaje de colesterol en la nanoparticula lipidica puede ser mayor que 10%, mayor que 20%, mayor que 30% o mayor que 40%. El porcentaje de lípido modificado por PEG en la nanoparticula lipidica puede ser mayor que 1 %, mayor que 2%, mayor que 5%, mayor que 0% o mayor que 20%.
En ciertas realizaciones preferidas, las nanopartículas lipídicas de la invención comprenden al menos uno de los siguientes lípidos catiónicos: C 12-200, DLin-KC2-DMA, DODAP, HGT4003, ICE, HGT5000 o HGT5001 . En realizaciones, el vehículo de transferencia comprende colesterol y/o un lípido modificado por PEG. En algunas realizaciones, los vehículos de transferencia comprenden DMG-PEG2K. En determinadas realizaciones, el vehículo de transferencia comprende una de las siguientes formulaciones lipidicas: C12-200, DOPE, col, DMG-PEG2K; DODAP, DOPE, colesterol, DMG-PEG2K; HGT5000, DOPE, col, DMG-PEG2K, HGT5001 , DOPE, col, DMG-PEG2K.
Los vehículos de transferencia liposómicos para uso en las composiciones de la invención pueden prepararse mediante varias técnicas que se conocen actualmente en la materia. Se pueden preparar vesículas multilamelares (MLV) medíante técnicas convencionales, por ejemplo, depositando un lípido seleccionado en la pared interior de un contenedor o recipiente adecuado disolviendo el lípido en un disolvente apropiado, y luego evaporando el disolvente para dejar una película delgada en el interior del recipiente o mediante secado por pulverización. A continuación puede agregarse una fase acuosa al recipiente con movimiento vorticial que resulta en la formación de MLV. Luego se pueden formar vesículas unilamelares (ULV) mediante homogenizacíón, sonicación o extrusión de las vesículas multilamelares. Además, las vesículas unilamelares pueden formarse mediante técnicas de remoción de detergente.
En ciertas realizaciones de la presente invención, las composiciones de la presente invención comprenden un vehículo de transferencia en donde el ARNm se asocia en la superficie del vehículo de transferencia y se encapsula dentro del mismo vehículo de transferencia. Por ejemplo, durante la preparación de las composiciones de la presente invención, los vehículos de transferencia liposómicos catiónicos pueden asociarse con el ARNm a través de interacciones electrostáticas.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden cargarse con un radionucleido diagnóstico, materiales fluorescentes u otros materiales que son detectables en aplicaciones in vitro e in vivo. Por ejemplo, los materiales de diagnóstico adecuados para uso en la presente invención pueden incluir Rodamina-dioleoilfosfa-tidiletanolamina (Rh-PE), ARNm de proteína verde fluorescente (ARNm de GFP), ARNm de Renilla Luciferase y ARNm de Firefly Luciferase.
Para la selección del tamaño adecuado de un vehículo de transferencia liposomico se debe tener en consideración el sitio de la célula o tejido objetivo y en alguna medida la aplicación para la cual se está creando el liposoma. En algunas realizaciones, puede ser deseable limitar la transfección del ARNm a ciertas células o tejidos. Por ejemplo, para dirigirse a hepatocitos un vehículo de transferencia liposomico puede tener un tamaño tal que sus dimensiones sean menores que las fenestraciones de la capa endotelial que recubre los sinusoides hepáticos en el hígado; por consiguiente, el vehículo de transferencia liposomico puede penetrar fácilmente dichas fenestraciones endoteliales para alcanzar los hepatocitos objetivo. Alternativamente, un vehículo de transferencia liposomico puede tener un tamaño tal que las dimensiones del liposoma sean de un diámetro suficiente para limitar o evitar expresamente la distribución a ciertas células o tejidos. Por ejemplo, un vehículo de transferencia liposómico puede tener un tamaño tal que sus dimensiones sean mayores que las fenestraciones de la capa endotelíal que recubre los sinusoides para limitar así la distribución del vehículo de transferencia liposómico a los hepatocitos. Generalmente, el tamaño del vehículo de transferencia está dentro del rango de aproximadamente 25 a 250 nm, preferiblemente menos de aproximadamente 250nm, 175nm, 150nm, 125nm, 100nm, 75nm, 50nm, 25nm o 10nm.
Una variedad de métodos alternativos conocidos en la técnica están disponibles para ajusfar el tamaño de una población de vehículos de transferencia liposómicos. Uno de dichos métodos para adaptar el tamaño se describe en la Patente estadounidense No. 4.737.323, incorporada a la presente a modo de referencia. La sonicación de una suspensión liposómica por baño o sonda de sonicación produce una reducción progresiva del tamaño hasta pequeñas ULV con menos de aproximadamente 0.05 micrones de diámetro. La homogeneizacion es otro método que depende de energía de cizallamiento para fragmentar los liposomas grandes en pequeños. En un procedimiento de homogeneizacion típico, las MLV se recirculan a través de un homogenizador de emulsión estándar hasta que se observan tamaños de liposoma seleccionados, típicamente entre aproximadamente 0.1 y 0.5 micrones. El tamaño de las vesículas liposómicas puede determinarse mediante difracción de luz eléctrica quasi (QELS, por sus siglas en inglés) tal como se describe en Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10:421-450 (1981 ), incorporada a la presente a modo de referencia. El diámetro de liposoma promedio puede reducirse mediante sonicación de los liposomas formados. Se pueden alterar ciclos de sonicación intermitentes con evaluaciones QELS para lleva a cabo una síntesis liposómica eficiente.
Células objetivo Tal como se usa en la presente, al expresión "célula objetivo" se refiere a una célula o tejido a la que se dirige una composición de la invención. En algunas realizaciones, las células objetivo son deficientes en una proteína o enzima de interés. Por ejemplo, cuando se desea administrar un ácido nucleico a un hepatocito, el hepatocito representa la célula objetivo. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención se transfectan a las células objetivo en una base discriminatoria (es decir, no se transfectan a células no objetivo). Las composiciones de la invención también puede prepararse para dirigirse preferencialmente a una variedad de células objetivo, que incluye, a modo no taxativo, hepatocitos, células epiteliales, células hematopoyéticas, células epiteliales, células endoteliales, células pulmonares, células óseas, células madre, células mesenquimales, células neurales (por ejemplo, meninges, astrocitos, neuronas motoras, células de los ganglios de la raíz posterior y neuronas motoras de la asta anterior), células fotorreceptoras (por ejemplo, conos y bastones), células epiteliales pigmentadas retínales, células secretoras, células cardíacas, adipocitos, células de músculo liso vascular, cardíomiocitos, células de músculo esquelético, células beta, células pituitarias, células de recubrimiento sinovial, células ováricas, células testiculares, fibroblastos, células B, células T, reticulocitos, leucocitos, granulocitos y células tumorales.
Las composiciones de la invención pueden prepararse para distribuirse preferencialmente a células objetivo tales como en el corazón, pulmones, ríñones, hígado y bazo. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención se distribuyen a las células del hígado para facilitar la administración y la posterior expresión del ARNm comprendido en las mismas mediante las células del hígado (por ejemplo, hepatocitos). Los hepatocitos objetivo pueden funcionar como un "reservorio" o "depósito" biológico capaz de producir y excretar sistémicamente una proteina o enzima funcional. Por consiguiente, en una realización de la invención, el vehículo de transferencia liposómico puede dirigirse a hepatocitos y/o preferencialmente distribuirse a las células del hígado tras la administración. Luego de la transfección de los hepatocitos objetivo el ARNm cargado en el vehículo liposómico se traduce y se produce un producto proteico funcional, que se excreta y distribuye sistémicamente. En otras realizaciones, células distintas a los hepatocitos (por ejemplo, de pulmón, bazo, corazón, oculares o células del sistema nervioso central) pueden servir como una ubicación del depósito para la producción proteica.
En una realización, las composiciones de la invención facilitan la producción endógena en el sujeto de una o más proteínas y/o enzimas funcionales y, en particular, la producción de proteínas y/o enzimas que demuestran menos ¡nmunogenicídad con respecto sus contrapartes preparadas recombinantemente. En una realización preferida de la presente invención, los vehículos de transferencia comprenden ARNm que codifica una proteina o enzima deficiente. Tras la distribución de dichas composiciones a los tejidos objetivo y la posterior transfección de dichas células objetivo, el ARNm exógeno cargado en el vehículo de transferencia liposómico (por ejemplo, una nanopartícula lipidica) puede traducirse in vivo para producir una proteína o enzima funcional codificada por el ARNm administrado exógenamente (por ejemplo, una proteína o enzima en la cual el sujeto es deficiente). Por consiguiente, las composiciones de la presente invención explotan una capacidad del sujeto para traducir ARNm preparado exógenamente o recombinantemente para producir una proteína o enzima traducida endógenamente y producir así (y cuando corresponde, excretar) una proteina o enzima funcional. Las proteínas o enzimas expresadas o traducidas también pueden caracterizarse por la inclusión in vivo de modificaciones postraslacionales naturales que a menudo pueden estar ausentes en las proteínas o enzimas preparadas recombinantemente, reduciendo asi adicionalmente la inmunogenicidad de la proteína o enzima traducida.
La administración de ARNm que codifica una proteína o enzima deficiente evita la necesidad de administrar los ácidos nucleicos a organelos específicos dentro de una célula objetivo (por ejemplo, mitocondrias). En cambio, tras la transfección de una célula objetivo y administración de los ácidos nucleicos al citoplasma de la célula objetivo, el contenido del ARNm de un vehículo de transferencia puede traducirse y se puede expresar una proteína o enzima funcional.
La presente invención también contempla el direccionamiento discriminatorio de las células y tejidos objetivo mediante medios de direccionamiento pasivos y activos. El fenómeno del direccionamiento pasivo explota los patrones de distribuciones naturales de un vehículo de transferencia in vivo sin depender del uso de excipientes adicionales o medios para potenciar el reconocimiento del vehículo de transferencia por las células objetivo. Por ejemplo, es probable que los vehículos de transferencia que se someten a fagocitosis por las células del sistema reticulo-endotelial se acumulen en el hígado o bazo y, por consiguiente, pueden proporcionar medios para dirigir pasivamente la administración de composiciones a dichas células objetivo.
Alternativamente, la presente invención contempla el direccionamiento activo, que implica el uso de excipientes adicionales, denominados en la presente "ligandos de direccionamiento" que pueden unirse (covalentemente o no covalentemente) al vehículo de transferencia para estimular la ubicación de dichos vehículos de transferencia en determinadas células objetivo o tejidos objetivo. Por ejemplo, el direccionamiento puede ser mediado por la inclusión de uno o más ligandos de direccionamiento endógenos (por ejemplo, apolipoproteína E) en o sobre el vehículo de transferencia para estimular la distribución a las células o tejidos objetivo. El reconocimiento del ligando de direccionamiento por los tejidos objetivo facilita activamente la distribución tisular y la absorción celular del vehículo de transferencia y/o su contenidos en las células y tejidos objetivo (por ejemplo, la inclusión de un ligando de direccionamiento de apolipoproteína-E en o sobre el vehículo de transferencia estimula el reconocimiento y la unión del vehículo de transferencia a receptores de lipoproteina de baja densidad endógenos expresados por hepatocitos). Tal como se proporciona en la presente, la composición puede comprender un ligando capaz de potenciar la afinidad de la composición con la célula objetivo. Los ligandos de direccionamiento puede ligarse a la bicapa externa de la partícula lipídica durante la formulación o posformulación. Estos métodos se conocen bien en la técnica. Además, algunas formulaciones de partículas lipídicas pueden emplear polímeros fusogénícos tales como PEAA, hemaglutinina, otros lipopéptidos (véase las Solicitudes de patente estadounidense Nos. de serie 08/835.281 y 60/083.294, que se incorporan a la presente a modo de referencia) y otras características útiles para administración in vivo y/o intracelular. En otras realizaciones diversas, las composiciones de la presente invención demuestran eficacias de transfección mejoradas y/o demuestran selectividad potenciada hacia las células o tejidos objetivo de interés. Por lo tanto, se contemplan composiciones que comprenden uno o más ligandos (por ejemplo, péptidos, aptámeros, oligonucleótidos, una vitamina u otras moléculas) que con capaces de potenciar la afinidad de las composiciones y sus contenidos de ácido nucleico con las células y tejidos objetivo. Los ligandos apropiados opcionalmente pueden unirse o ligarse a la superficie del vehículo de transferencia. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento puede abarcar la superficie de un vehículo de transferencia o puede encapsularse dentro del vehículo de transferencia Los ligandos apropiados se seleccionan en base a sus propiedades físicas, químicas o biológicas (por ejemplo, afinidad selectiva y/o reconocimiento de marcadores o características superficiales de la célula objetivo). Los sitios de direccionamiento especifico de célula y su ligando de direccionamiento correspondiente pueden variar ampliamente. Los ligandos de direccionamiento apropiados se seleccionan a fin de explotar las características distintivas de una célula objetivo, permitiendo así que la composición distinga entre las células objetivo y las no objetivo. Por ejemplo, las composiciones de la invención pueden incluir marcadores superficiales (por ejemplo, apolipoproteína-B o apolípoproteína-E) que potencian selectivamente el reconocimiento o la afinidad con los hepatocitos (por ejemplo, por reconocimiento y unión mediados por receptor de dichos marcadores superficiales). Adicionalmente, se espera que el uso de galactosa como ligando de direccionamiento dirija las composiciones de la presente invención hacia hepatocitos parenquimales o, alternativamente, se espera que el uso de mañosa que contiene residuos de azúcar como ligando de direccionamiento dirija las composiciones de la presente invención a las células endoteliales del hígado (por ejemplo, mañosa que contiene residuos de azúcar que pueden unirse preferencialmente al receptor de asialoglicoproteína presente en los hepatocitos). (Véase Hillery AM, et al. "Drug Delivery and Targeting: For Pharmacists and Pharmaceutical Scientists" (2002) Taylor & Francis, Inc.). Por lo tanto, la presentación de dichos ligandos de direccionamiento que han sido conjugados con restos presentes en el vehículo de transferencia (por ejemplo, una nanoparticula lipídica) facilita el reconocimiento y la absorción de las composiciones de la presente invención en las células y tejidos objetivo. Los ejemplos de ligandos de direccionamiento apropiados incluyen uno o más péptidos, proteínas, aptámeros, vitaminas y oligonucleótidos.
Aplicación y Administración Tal como se usa en la presente, el término "sujeto" se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamífero), incluidos, a modo no taxativo, humanos, primates no humanos, roedores y similares, a los que se administran las composiciones y métodos de la presente invención. Típicamente, los términos "sujeto" y "paciente" se usan de forma intercambiable en la presente en referencia a un sujeto humano.
Las composiciones y métodos déla invención proporciona la administración de ARNm para tratar varios trastornos. En particular, las composiciones y métodos de la presente invención son adecuados para el tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con la deficiencia de proteínas y/o enzimas que son excretadas o secretadas por la célula objetivo en el fluido extracelular circundante (por ejemplo, ARNM que codifica hormonas y neurotransmisores). En realizaciones, la enfermedad puede implicar un defecto o deficiencia en una proteína secretada (por ejemplo, enfermedad de Fabry o ALS). En ciertas realizaciones, la enfermedad puede no ser provocada por un defecto o déficit en una proteina secretada, pero puede beneficiarse de la provisión de una proteína secretada. Por ejemplo, los síntomas de una enfermedad pueden mejorarse proporcionando las composiciones de la invención (por ejemplo, la fibrosis quística). Los trastornos para los cuales la presente invención es útil incluyen, a modo no taxativo trastornos tales como enfermedad de Huntington; enfermedad de Parkinson; distrofias musculares (tales como, por ejemplo, de Duchenne y Becker); enfermedades hemofílicas (tales como, por ejemplo, hemofilia B (FIX), hemofilia A (FVIII); atrofia muscular espinal relacionada con SMN1 (SMA); esclerosis lateral amiotrófica (ALS); galactosemia relacionada con GALT; Fibrosis quística (CF); trastornos relacionados con SLC3A1 incluida cistinuria; trastornos relacionados con COL4A5 incluido síndrome de Alport; deficiencias de galactocerebrosidasa; adrenoleucodistrofia y adrenomieloneuropatía ligadas al cromosoma X; ataxia de Friedreich; enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher; esclerosis tuberosa relacionada con TSC1 y TSC2; síndrome de Sanfilippo B (MPS IIIB); cistínosís relacionada con CTNS, los trastornos relacionados con FMR1 que incluyen síndromedel cromosoma X frágil, Temblor/síndrome de ataxia asociado con el cromosoma X frágil y síndrome de insuficiencia ovárica prematura del cromosoma X frágil; síndrome de Prader-Willi; telangiectasia hemorrágica hereditaria (AT); enfermedad de Niemann-Pick Tipo C1 ; las enfermedades relacionadas con la lipofuscinosis ceroide neuronal incluidas Lipofuscinosis ceroide neuronal infantil (JNCL), enfermedad de Batten infantil, enfermedad de Santavuori-Haltia, enfermedad de Jansky-Bielschowsky y deficiencias de PTT-1 y TPP1 ; ataxia infantil relacionada con EIF2B1 , EIF2B2, EIF2B3, EIF2B4 y EIF2B5 con hipomielinación del sistema nervioso central/sustancia blanca evanescente; Ataxia episódica relacionada con CACNA1A y CACNB4 Tipo 2; los trastornos relacionados con MECP2 incluido el síndrome de Rett clásico, encefalopatía neonatal grave relacionada con MECP2 y síndrome de PPM-X; síndrome de Rett atípico relacionado con CDKL5; enfermedad de Kennedy (SBMA); Arteriopatía cerebral autosómica dominante con infartos subcorticales y leucoencefalopatía relacionada con Notch-3 (CADASIL); trastornos convulsivos relacionados con SCN 1A y SCN 1 B; los trastornos relacionados con la Polimerasa G que incluyen el síndrome de Alpers-Hurtenlocher, la neuropatía atáxica sensorial relacionada con POLG, disartría y oftalmoparesis y oftalmoplejía externa progresiva recesiva y autosómica dominante con supresiones de ADN mitocondrial; hipoplasia suprarrenal ligada al cromosoma X; agamaglobulinemia ligada al cromosoma X; enfermedad de Wilson; y enfermedad de Fabry. En una realización, los ácidos nucleicos y, en particular, el ARNm de la invención pueden codificar proteínas o enzimas funcionales que se secretan en el espacio extracelular. Por ejemplo, las proteínas secretadas incluyen factores de coagulación, componentes de la vía de complemento, citocinas, quimiocinas, químiotaxínas, hormonas proteicas (por ejemplo, EGF, PDF), componentes proteicas del suero, anticuerpos, receptores similares a toll secretables y otros. En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención pueden incluir ARNm que codifica eritropoyetina, a1 -antitripsina, carboxipeptidasa N u hormona del crecimiento humana.
En realizaciones, la invención codifica una proteina secretada que está constituida por subunidades que son codificadas por más de un gen. Por ejemplo, la proteína secretada puede ser un heterodímero, en donde cada cadena o subunidad se codifica mediante un gen separado. Es posible que más de una molécula de ARNm se administre en el vehículo de transferencia y que el ARNm codifica unidades separadas de la proteína secretada. Alternativamente, se puede genomanipular un único ARNm para codificar más de una subunjdad (por ejemplo, en el caso de un anticuerpo Fv de cadena simple). En ciertas realizaciones, las moléculas de ARNm separadas que codifican subunidades individuales pueden administrarse en vehículos de transferencia separados. En una realización, el ARNm puede codificar anticuerpos de longitud completa (ambas cadenas ligera y pesada de las regiones variables y constantes) o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, Fv o un Fv de cadena simple (scFv) para conferir inmunidad a un sujeto. Aunque una realización de la presente invención se refiere a métodos y composiciones útiles para conferir inmunidad a un sujeto (por ejemplo, a través de la traducción de ARNm que codifica anticuerpos funcionales), las invenciones divulgadas en la presente y contempladas por la presente son ampliamente aplicables. En una realización alternativa, las composiciones de la presente invención codifican anticuerpos que pueden usarse para producir de forma crónica o transitoria un respuesta funcional en sujetos. Por ejemplo, el ARNm de la presente invención puede codificar un anticuerpo monoclonal o policlonal funcional, que tras la traducción y secreción a partir de la célula objetivo, puede ser útil para el direccionamiento y/o desactivación de un objetivo biológico (por ejemplo, un citocina estimuladora tal como el factor de necrosis tumoral). De forma similar, los ácidos nucleicos de ARNm de la presente invención pueden codificar, por ejemplo, anticuerpos anti-factor nefrítico funcionales útiles para el tratamiento de glomerulonefritis membranoproliferativa tipo II o síndrome urémico hemolítico agudo, o alternativamente pueden codificar un anticuerpos anti-factor de crecimiento endoteliar vascular (VEGF, por sus siglas en inglés) útiles para el tratamiento de enfermedades mediadas por VEGF, tales como el cáncer. En otras realizaciones, la proteína secretada es una citocina y otra proteína secretada que comprende más de una subunidad (por ejemplo, IL-12 o IL-23).
Las composiciones de la invención pueden administrarse a un sujeto. En algunas realizaciones, la composición se formula en combinación con uno o más ácidos nucleicos adicionales, portadores, ligandos de direccionamiento o reactivos estabilizantes, o en composiciones farmacéuticas donde se mezcla con excipientes adecuados. Por ejemplo, en una realización, las composiciones de la invención pueden prepararse para administrar ARNm que codifica dos o más proteínas o enzimas distintas. Las técnicas para la formulación y administración de fármacos se encuentra en "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., última edición.
Un amplio rango de moléculas que pueden ejercer efectos farmacéuticos o terapéuticos se pueden administrar a células objetivo usando composiciones y métodos de la invención. Las moléculas pueden ser orgánicas o inorgánicas. Las moléculas orgánicas pueden ser péptidos, proteínas, carbohidratos, lipidos, esteróles, ácido nucleicos (incluidos ácidos nucleicos peptídicos) o cualquier combinación de los mismos. Una formulación para administración a células objetivo puede comprender más de un tipo de molécula, por ejemplo, dos secuencias nucleotidicas diferentes, o una proteína, una enzima o un esteroide.
Las composiciones de la presente invención pueden administrarse y dosificarse de acuerdo con la práctica médica actual, tomando en cuenta la condición clínica del sujeto, el sitio y método de administración, el régimen de administración, la edad, sexo, peso corporal y otros factores relevantes del paciente para los médicos expertos en la técnica. La "cantidad efectiva" a los efectos de la presente puede determinarse mediante dichas consideraciones relevantes tales como son conocidas para los expertos en la técnica de investigación clínica experimental, farmacológica, clínica y médica. En algunas realizaciones, la cantidad administrada es efectiva para alcanzar al menos alguna estabilización, mejora o eliminación de síntomas y otras indicaciones tales como se seleccionan como medidas apropiadas de evolución, regresión o mejora de una enfermedad por los expertos en la técnica. Por ejemplo, una cantidad y régimen de dosificación adecuados es una que provoca al menos una producción de proteína transitoria.
Las vías de administración adecuadas incluyen, por ejemplo, administración oral, rectal, vaginal, transmucosal, pulmonar incluidas intratraqueal o inhalada, o intestinal; administración parenteral, incluidas intramuscular, subcutánea, inyecciones intramedulares, así como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares.
Alternativamente, las composiciones de la invención pueden administrarse en un local en lugar de sistémicamente, por ejemplo, a través de inyección de la composición farmacéutica directamente en un tejido objetivo, preferiblemente en una formulación de liberación sostenida. La administración local puede ser afectada de varias formas, dependiendo del tejido objetivo. Por ejemplo, se pueden inhalar aerosoles que contienen composiciones de la presente invención (para administración nasal, traqueal o bronquial); se pueden inyectar composiciones de la presente invención en el sitio de lesión, manifestación de la enfermedad o dolor, por ejemplo; se pueden proporcionar las composiciones en grageas para aplicación oral, traqueal o esofágica; se pueden suministrar en forma de líquido, comprimido o cápsula para administración en el estómago o intestinos, se puede suministrar en forma de supositorio para aplicación rectal o vaginal; o incluso se pueden administrar en el ojo mediante el uso de cremas, gotas o incluso inyección. Las formulaciones que contienen composiciones de la presente invención formando complejos con moléculas o ligandos terapéuticos incluso se pueden administrar quirúrgicamente, por ejemplo, en asociación con un polímero u otra estructura o sustancia que pueda permitir que las composiciones se dispersen desde el sitio de implantación hacia las células circundantes. Alternativamente, se pueden aplicar quirúrgicamente sin el uso de polímeros ni soportes.
En una realización, las composiciones de la invención se formulan de forma que son adecuadas para liberación extendida del ARNm contenido en las mismas. Dichas composiciones de liberación extendida pueden administrarse convenientemente a un sujeto a intervalos de dosificación extendidos. Por ejemplo, en una realización, las composiciones de la presente invención se administran a un sujeto dos veces al día, diariamente o cada dos días. En una realización preferida, las composiciones de la presente invención se administran a un sujeto dos veces a la semana, una vez a la semana, cada diez días, cada dos semanas, cada tres semanas o más preferiblemente cada cuatro semanas, una vez al mes, cada seis semanas, cada ocho semanas, cada dos meses, cada tres meses, cada cuatro meses, cada seis meses, cada ocho meses, cada nueve meses o anualmente. También se contemplan composiciones y vehículos liposómicos que se formulan para administración en depósito (por ejemplo, intramuscularmente, subcutáneamente, intravitrealmente) para administrar o liberar un ARNm por períodos de tiempo extendidos. Preferiblemente, los medios de liberación extendida empleados se combinan con modificaciones hechas al ARNm para potenciar la estabilidad.
También se contemplan en la presente composiciones farmacéuticas liofilizadas que comprenden una o más de las nanoparticulas liposómica divulgadas en la presente y métodos relacionados para el uso de dichas composiciones liofilizadas tales como se divulgan, por ejemplo, en la Solicitud provisional estadounidense No.61/494, 882, presentada el 8 de junio de 2011 , cuyas divulgaciones se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas liofilizadas de acuerdo con la invención pueden reconstituirse antes de la administración o pueden reconstituirse in vivo. Por ejemplo, una composición farmacéutica liofilizada puede formularse en una forma de dosificación apropiada (por ejemplo, una forma de dosificación intradérmica tal como un disco, varilla o membrana) y administrarse de tal forma que la forma de dosificación se rehidrate con el tiempo in vivo mediante los fluidos corporales del individuo.
Aunque ciertos compuestos, composiciones y métodos de la presente invención se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven solo para ilustrar los compuestos de la invención no se pretende que limiten ta misma. Cada una de las publicaciones, materiales de referencia, números de acceso y similares mencionados en la presente para describir los antecedentes de la invención y para proporcionar detalles adicionales en relación con su práctica se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad.
Los artículos "el/la" y "un/una" tales como se usan en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, deberán entenderse como incluyendo a los referentes plurales. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, más de uno o todos los miembros del grupo están presentes, se emplean o de otra forma son relevantes para un producto o proceso dado a menos que se indique los contrario o a menos que sea evidente a partir del contexto. La invención incluye realizaciones en las que exactamente un miembro el grupo está presente, se emplea, o es de otra forma relevantes para un producto o proceso dado. La invención también incluye realizaciones en las que más de uno o todos los miembros el grupo está presente, se emplean, o son de otra forma relevantes para un producto o proceso dado. Adicionalmente, se entenderá que la invención abarca todas las variaciones, combinaciones y permutaciones en las que una o más limitaciones, elementos, condiciones, términos descriptivos, etc., de una o más de las reivindicaciones indicadas se introducen en otra reivindicación dependiente en la misma reivindicación base (o, según sea relevante, cualquier otra reivindicación) a menos que se indique lo contrario o a menos que se evidente para un experto en la técnica que una contradicción o inconsistencia surgirá. Cuando los elementos se presentan como listas, (por ejemplo, en grupo de Markush o formato similar) se entenderá que cada subgrupo de los elementos es también divulgado, y cualquier elemento(s) puede ser eliminado del grupo. Se entenderá que, en general, cuando se menciona que la invención o aspectos de la invención comprende/n elementos, características, etc., específicos, ciertas realizaciones de la invención o aspectos de la invención consisten, o consisten esencialmente, en dichos elementos, características, etc. A efectos de simplificación dichas realizaciones no han sido en cada caso establecidas específicamente en tantas palabras en la presente. También se entenderá que cualquier realización o aspecto déla invención puede excluirse explícitamente de las reivindicaciones, independientemente de si la exclusión especifica está mencionada en la memoria descriptiva. Las publicaciones y otros materiales de referencia mencionados en la presente para describir los antecedentes de la invención y para proporcionar detalles adicionales en relación con su práctica se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 Depósito de producción proteica a través de administración intravenosa de composiciones polinucleotídicas ARN mensajero Eritropoyetina humana (EPO) (SEQ ID NO: 3; FIG. 3), alfa-galactosidasa humana (GLA) (SEQ ID NO: 4; FIG. 4), alfa-1 antítripsina humana (A1AT) (SEQ ID NO: 5; FIG. 5), factor IX humano (FIX) (SEQ ID NO: 6 ; FIG. 6) se sintetizaron mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN plasmídico que codificaba el gen, y posteriormente se procedió a la adición de la estructura de casquete en 5' (Capí ) (Fechter & Brownlee, J. Gen. Virology 86: 1239-1249 (2005)) y un extremo poli(A) en 3' de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud tal como se determinó mediante electroforesis en gel. Las regiones no traducidas en 5' y 3' estaban presentes en cada producto de ARNm en los siguientes ejemplos y se definen por SEQ ID NOs: 1 y 2 (FIG. 1 y FIG. 2) respectivamente.
Formulaciones de nanopartículas lipidicas Formulación 1: Se mezclaron alícuotas de 50 mg/mL de soluciones etanólicas de C12-200, DOPE, Col y DMG-PEG2K (40:30:25:5) y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 mL. Por separado, se preparó una solución amortiguada acuosa (10 mM de citrato/150 mM de NaCI, pH 4.5) de ARNm a partir de 1 mg/mL de solución concentrada. La solución lipídica se inyectó rápidamente en una solución de ARNm acuosa y se agitó para proporcionar una suspensión final en 20% de etanol. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, diafiltró con 1x PBS (pH 7.4), se concentró y se almacenó a 2-8°C.
Formulación 2: Se mezclaron alícuotas de 50 mg/mL de soluciones etanólicas de DODAP, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K (18:56:20:6) y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 mL. Por separado, se preparó una solución amortiguada acuosa (10 mM de citrato/150 mM de NaCI, pH 4.5) de ARNm de EPO a partir de 1 mg/mL de solución concentrada. La solución lipídica se inyectó rápidamente en una solución de ARNm acuosa y se agitó para proporcionar una suspensión final en 20% de etanol. Las suspensión de nanopartículas resultante se filtró, diafiltró con 1 x PBS (pH 7.4), se concentró y se almacenó a 2-8°C. Concentración final = 1.35 rng/mL de ARNm de EPO (encapsulado). Zave = 75.9 nm (Dv(50) = 57.3 nm; D (90) = 92.1 nm).
Formulación 3: Se mezclaron alícuotas de 50 mg/mL de soluciones etanólicas de HGT4003, DOPE, colesterol y D G-PEG2K (50:25:20:5) y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 mL. Por separado, se preparó una solución amortiguada acuosa (10 mM de citrato/150 rnM de NaCI, pH 4.5) de ARNm a partir de 1 mg/mL de solución concentrada. La solución lipidica se inyectó rápidamente en una solución de ARNm acuosa y se agitó para proporcionar una suspensión final en 20% de etanol. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, diafiltró con 1x PBS (pH 7.4), se concentró y se almacenó a 2-8cC.
Formulación 4: Se mezclaron alícuotas de 50 mg/mL de soluciones etanólicas de ICE, DOPE y DMG-PEG2K (70:25:5) y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 mL. Por separado, se preparó una solución amortiguada acuosa (10 mM de citrato/150 mM de NaCI, pH 4.5) de ARNm a partir de 1 mg/mL de solución concentrada. La solución lipidica se inyectó rápidamente en una solución de ARNm acuosa y se agitó para proporcionar una suspensión final en 20% de etanol. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, diafiltró con 1 x PBS (pH 7.4), se concentró y se almacenó a 2-8°C.
Formulación 5: Se mezclaron alícuotas de 50 mg/mL de soluciones etanólicas de HGT5000, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K (40:20:35:5) y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 mL. Por separado, se preparó una solución amortiguada acuosa (10 mM de citrato/150 mM de NaCI, pH 4.5) de ARNm de EPO a partir de 1 mg/mL de solución concentrada. La solución lipídica se inyectó rápidamente en una solución de ARNm acuosa y se agitó para proporcionar una suspensión final en 20% de etanol. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, diafiltró con 1 x PBS (pH 7.4), se concentró y se almacenó a 2-8°C. Concentración final = 1.82 mg/mL de ARNm de EPO (encapsulado). Zave = 105.6 nm (Dv(50) = 53.7 nm; D (90) = 157 nm).
Formulación 6: Se mezclaron alícuotas de 50 mg/mL de soluciones etanólicas de HGT5001 , DOPE, colesterol y DMG-PEG2K (40:20:35:5) y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 mL. Por separado, se preparó una solución amortiguada acuosa (10 mM de citrato/150 mM de NaCI, pH 4.5) de ARNm de EPO a partir de 1 mg/mL de solución concentrada. La solución lipídica se inyectó rápidamente en una solución de ARNm acuosa y se agitó para proporcionar una suspensión final en 20% de etanol. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, diafiltró con 1x P BS (pH 7.4), se concentró y se almacenó a 2-8°C.
Análisis de proteina producida a través de nanopartículas cargadas con ARNm administradas intravenosamente Protocolo de inyección Se llevaron a cabo estudio usando ratones CD-1 machos de aproximadamente 6-8 semanas en el inicio de cada experimento, a menos que se indique lo contrario. Se introdujeron las muestras mediante una inyección en la vena de la cola de un único bolo de un dosis total equivalente de 30-200 microgramos de ARNm encapsulado. Los ratones se sacrificaron y se perfundieron con solución salina en los puntos de tiempo indicados.
Aislamiento de tejidos orgánicos para análisis Se recogieron el hígado y el bazo de cada ratón, se partieron en tres partes y se almacenaron en formalina amortiguada neutra al 10% o se congelaron inmediatamente y se almacenaron a -80°C para el análisis.
Aislamiento de suero para análisis Todos los animales se sacrificaron mediante asfixia con CO2 48 horas después de la administración de la dosis (± 5%), posteriormente se llevó a cabo una toracotomía y extracción de la sangre cardíaca terminal. Se extrajo sangre entera (volumen máximo obtenible) a través de punción cardíaca en los animales sacrificados en tubos separadores de suero, se dejó coagular a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos, se centrifugó a 22°C ± 5°C a 9300 g durante 10 minutos y luego se extrajo el suero. Para las extracciones de sangre provisionales, se extrajeron aproximadamente 40-50µ?_ de sangre entera a través de punción de la vena facial o corte en la cola. Las muestras extraídas de animales no tratados se usaron como valor de referencia para la comparación con animales del estudio.
Análisis de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) ELISA DE EPO: La cuantificación de la proteína EPO se llevó a cabo siguiendo los procedimientos indicados para el kit de ELISA para EPO humana (Quantikine IVD, R&D Systems, No. de catálogo Dep-00). Los testigos positivos empleados consistieron en proteína eritropoyetina humana recombinante de grado ultrapuro y de cultivo tisular (R&D Systems, No. de catálogo 286-EP y 287-TC, respectivamente). La detección se monitoreó a través de absorción (450 nm) en un instrumento Molecular Device Flex Station.
ELISA DE GLA: Se llevaron a cabo procedimientos de ELISA estándares empleando IgG anti-Alfa-galactosidasa G-188 de oveja como el anticuerpo de captura con IgG anti-Alfa-galactosidasa TK-88 de conejo como el anticuerpo secundario (detección) (Shire Human Genetic Therapies). Se uso IgG anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) para la activación de la solución de sustrato de 3,3', 5,5'-tetrametilbencidina (TMB). La reacción se aplacó usando H2SO4 2N después de 20 minutos. La detección se monitoreó a través de absorción (450 nm) en un instrumento Molecular Device Flex Station. El suero de ratón no tratado y la proteina Alfa-galactosidasa humana se usaron como testigos negativo y positivo, respectivamente.
ELISA DE FIX: La cuantificación de la proteína FIX se llevó a cabo siguiendo los procedimientos indicados para el kit de ELISA para FIX humano (AssayMax, Assay Pro, No. de catálogo EF1009-1 ).
ELISA DE A 1A T: La cuantificación de la proteina A1 AT se llevó a cabo siguiendo los procedimientos indicados para el kit de ELISA para A1AT humana (Innovative Research, No. de catálogo IRAPKT015).
Análisis de transferencia Western (EPO): Los análisis de transferencia Western se llevaron a cabo usando un anticuerpo anti-hEPO (R&D Systems No. MAB2871 ) y proteina EPO humana ultrapura (R&D Systems No. 286-EP) como testigo.
Resultados El trabajo descrito en este ejemplo demuestra el uso de nanoparticulas lipídicas con ARNm encapsulado como una fuente de depósito para la producción de proteina. Dicho efecto de depósito puede lograrse en múltiples sitios dentro del cuerpo (es decir, hígado, ríñones, bazo y músculos). Las mediciones de la proteína de base exógena deseada derivada de ARN mensajero administrado a través de nanoparticulas liposómicas se lograron y cuantificaron, y se demostró la secreción de la proteína de un depósito usando ARNm de eritropoyetina humana (hEPO), alfa-galactosidasa humana (hGLA), alfa-1 antitripsina humana (hA1 AT) y Factor IX humano (hFIX). 1A. Resultados de producción de proteína EPQ humana in vivo La producción de la proteina hEPO se demostró con varias formulaciones de nanopartículas lipídicas. De cuatro sistemas lipidíeos catiónicos diferente, las nanopartículas lipídicas basadas en C12-200 produjeron la cantidad más alta de proteína hEPO después de cuatro horas de la administración intravenosa tal como se midió mediante ELISA (FIG. 7). Esta formulación (Formulación 1) resultó en 18.3 ug/mL de proteína hEPO secretada en el torrente sanguíneo. Los niveles de proteína hEPO normales en suero para humanos son 3.3-16.6 mlU/mL (Documento NCCLS C28-P; Tomo 12, No. 2). En base a una actividad específica de 120 000 lU/mg de proteina EPO, que proporcionan una cantidad de 27.5-1 38 pg/mL de proteína hEPO en individuos humanos normales. Por lo tanto, una única dosis de 30 ug de una formulación lipídica catiónica basada en C12-200 con ARNm de hEPO encapsulado proporcionó un aumento en la respectiva proteína de más de 100 000 veces que los niveles fisiológicos.
De los sistemas lipidíeos evaluados, la formulación con nanopartículas lipídicas basada en DODAP fue la menos efectiva. Sin embargo, la cantidad observada de proteina EPO humana derivada de la administración a través de nanopartículas lipídicas basadas en DODAP con ARNm de EPO encapsulado fue 4.1 ng/mL, que es aún 30 veces mayor que los niveles fisiológicos normales de la proteína EPO (Tabla 1).
TABLA 1 Valores brutos de proteina hEPO secretada para varios sistemas de nanopartículas basadas en lípidos catiónicos medidos a través de análisis ELISA (tal como se representa en la FIG. 8).
Las dosis se basan en el ARNm de hEPO encapsulado. Los valores de la proteina se representan como nanogramos de proteína EPO humana por mililitro de suero. Los cambios en el hematocrito se basan en comparación antes de la extracción (Día -1) y el Día 10.
Además, la proteína resultante se evaluó para determinar si estaba activa y funcionaba adecuadamente. En el caso de terapia de reemplazo de ARNm (MRT) en el que se emplea ARNm de hEPO, los cambios en el hematocrito se monitorearon por un período de diez días para cinco formulaciones de nanopartículas lipídicas diferentes (FIG. 8, Tabla 1 ) para evaluar la actividad proteica. Durante este período de tiempo, dos de las cinco formulaciones demostraron un aumento en el hematocrito (>1 5%), que es indicativo de la producción de proteína hEPO activa a partir de dichos sistemas.
En otro experimento, los cambios en el hematocrito se monitorearon por un periodo de 15 días (FIG. 9, Tabla 2). La formulación de nanoparticulas lipidicas (Formulación 1) se administró como una dosis única de 30 pg o como tres dosis más pequeñas de 10 pg inyectadas el día 1 , el día 3 y el día 5. De forma similar, la Formulación 2 se administró como 3 dosis de 50 pg el día 1 , el día 3 y el día 5. El C12-200 produjo un aumento considerable en el hematocrito. En general se observó un aumento de hasta -25% de cambio, que es indicativo de la producción de proteína EPO humana activa a partir de dichos sistemas.
TABLA 2 Niveles de hematocrito para cada grupo en un período de observación de 15 días (FIG. 9).
Hct = hematocrito; SEM = error estándar de la media. aLas muestras de sangre se extrajeron en tubos de hematocrito no heparinizados.
Los ratones se dosificaron con una única inyección o tres inyecciones, cada dos días. N = 4 ratones por grupo. 1 B. Resultados de producción de proteína GLA humana in vivo Se exploro un segundo sistema proteico de base exógena para demostrar el "efecto de depósito" cuando se emplean nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm. Los animales se inyectaron intravenosamente con una única dosis de 30 microgramos de ARNm de alfa-galactosídasa humana (hGLA) encapsulado usando un sistema de nanopartículas basadas en C12-200 y se sacrificaron seis horas después (Formulación 1). La cuantificación de la proteína hGLA se llevó a cabo a través de ELISA. El suero de ratón no tratado y la proteína Alfa-galactosídasa humana se usaron como testigos. La detección de la proteína alfa-galactosídasa se monitoreó por un período de 48 horas.
Se observaron niveles medibles de proteína hGLA a lo largo del experimento con un nivel máximo de 2.0 ug/mL de proteína hGLA a las seis horas (FIG. 10). Tabla 3 indica las cantidades específicas de hGLA encontradas en el suero. Se ha indicado que la actividad normal en humanos macho saludables es aproximadamente 3.05 nanomoles/hr/mL. La actividad para la Alfa-galactosidasa, un proteína alfa-galactosidasa humana recombinante, 3.56 x 106 nanomoles/hr/mg. El análisis de estos valores proporciona una cantidad de aproximadamente 856 pg/mL de proteína hGLA en individuos macho saludables normales. La cantidad de 2.0 ug/mL de proteina hGLA observada después de seis cuando se dosificaron nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de hGLA es más de 2300 veces mayor que los niveles fisiológicos normales. Además, después de 48 horas, aún se puede detectar niveles apreciables de proteina hGLA (86.2 ng/mL). Este nivel es representativo de cantidades casi 100 veces mayores de proteina hGLA con respecto a las cantidades fisiológicas aún presentes a las 48 horas.
TABLA 3 Valores brutos de proteina hGLA secretada con respecto al tiempo medidos a través de análisis ELISA (tal como se representa en la FIG. 10).
Los valores se representan como nanogramos de proteína hGLA por mililitro de suero. N = 4 ratones por grupo.
Además, la semivida de la Alfa-galactosidasa cuando se administra a 0.2 mg/kg es aproximadamente 108 minutos. La producción de la proteína GLA a través del "efecto depósito" cuando se administran nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de GLA muestra un aumento sustancial en el tiempo de residencia en sangre cuando se compara con inyección directa de la proteina recombinante desnuda. Tal como se describió anteriormente, se encuentran presentes cantidades significativas de la proteína después de 48 horas.
El perfil de actividad de la proteína a-galactosidasa producida a partir de nanoparticulas lipidicas cargadas con ARNm de GLA se midió como una función del metabolismo de 4-metilumbeliferil-a-D-galactopiranósido (4-MU-a-gal). Tal como se muestra en la FIG. 1 1 , la proteína producida a partir de estos sistemas de nanoparticulas es bastante activa y refleja los niveles de la proteína disponibles (FIG. 12, Tabla 3). Las comparaciones de AUC de la producción hGLA basada en terapia de ARNm con respecto a terapia de reemplazamiento enzimático (ERT) en ratones y humano muestran un aumento de 182 veces y 30 veces, respectivamente (Tabla 4).
TABLA 4 Comparación de valor de Cma¾ y AUCmf en pacientes con Fabrv luego de dosificación IV de 0.2 mq/kg de Alfa-galactosidasa (dosis farmacológica) con los de ratones luego de dosificación IV con Alfa-galactosidasa y ARNm de GLA. a Datos de una artículo publicado (Gregory M. Pastores et al. Safety and Pharmacokinetics of hGLA in patients with Fabry disease and end-stage renal disease. Nephrol Dial Transplant (2007) 22:1920-1925. b enfermedad renal en etapa no terminal. c Actividad de a-Galactosidasa 6 horas después de dosificación (el punto de tiempo más temprano evaluado en el estudio).
Se ha demostrado la capacidad de las nanopartículas lípídicas con ARNm de encapsulado para dirigirse a órganos que pueden actuar como depósito para la producción de una proteína deseada. Los niveles de proteína secretada observados han estado por encima de los niveles fisiológicos normales por varios órdenes de magnitud. Este "efecto depósito" es repetible. La FIG. 12 muestra nuevamente que se observa una producción de proteína sólida tras la dosificación a ratones naturales (CD-1 ) una única dosis de 30 ug de nanoparticulas lipidicas basadas en C12-200 cargadas con ARNm de hGLA {Formulación 1). En este experimento, se evaluaron los niveles de hGLA por un período de 72 horas. Se detecta un promedio máximo de 4.0 ug de proteína hGLA humana/mL de suero seis horas después de la administración. En base a un valor de ~1 ng/mL de proteína hGLA para niveles fisiológicos normales, la MRT de hGLA proporciona aproximadamente niveles de proteína 4000 veces más altos. Como anteriormente, la proteína hGLA podría detectarse por 48 hr posadministración (FIG. 12).
Un análisis de tejidos aislados de este mismo experimento proporcionó una ¡dea de la distribución de la proteína hGLA en ratones tratados con MRT de hGLA (FIG. 13). Se detectaron nivel suprafisiológicos de proteina hGLA en el hígado, bazo y ríñones de todos los ratones tratados con un máximo observado entre 12 y 24 horas posadministración. Se podrían observar valores detectables de proteína derivada de MRT tres días después de una única inyección de nanoparticulas lipidicas cargadas con hGLA.
Además, se mostró que la producción de hGLA tras la administración de las nanoparticulas de C12-200 cargadas con ARNm de hGLA exhibió una respuesta a dosis en el suero (FIG. 14A), asi como en el hígado (FIG. 14B).
Una característica inherente de la terapia de reemplazamiento de ARNm mediada por nanoparticulas lipidicas sería el perfil farmacocinético de la proteína respectiva producida. Por ejemplo, el tratamiento en base a ERT de ratones empleando Alfa-galactosidasa resulte en una semivida en plasma de aproximadamente 100 minutos. En cambio, la alfa-galactosidasa derivada de MRT tiene un tiempo de residencia en sangre de aproximadamente 72 hrs con un tiempo pico de 6 horas. Esto permite una exposición mucho mayor para que los órganos participen en la posible absorción continua de la proteína deseada. Una comparación de los perfiles PK se muestra en la FIG. 1 5 y demuestra la diferencia clara en las tasas de aclaramiento y que en ú ltima instancia se puede lograr un cambio significativo en el área bajo la curva (AUC)a través del tarifas en base a MRT.
En un experimento aparte, el MRT de hGLA se aplicó a uno modelo de enfermedad de ratón, ratones con hGLA desactivada (ratones con Fabry). Una dosis de 0.33 mg/kg de nanoparticulas lipidicas basadas en C12-200 cargadas con ARNm de hGLA (Formulación 1) se administró a ratones hembra inactivadas como una única inyección intravenosa. Se produjeron cantidades sustanciales de hGLA derivado de MRT con un pico a las 6 hr (—560 ng/mL de suero) que es aproximadamente 600 veces mayor que los niveles fisiológicos normales. Además, la proteína hGLA aún era detectable 72 hr posadministración (FIG. 16).
La cuantificación de la protema GLA derivada de MRT en los órganos vitales demostró la acumulación sustancial que se muestra en la FIG. 1 7. Se gráfica una comparación de la proteina hGLA derivada de MRT observada con respecto a los niveles fisiológicos normales indicados que se encuentran en los órganos clave (niveles normales graficado como líneas punteadas). Aunque los niveles de la proteina a las 24 horas son más altos que a las 72 horas posadminístración, los niveles de proteína hGLA detectados en el hígado, ríñones, bazo y corazones de los ratones con Fabry tratados son equivalentes a los niveles naturales. Por ejemplo, se encontraron 3.1 ng de proteína hGLA/mg de tejido en los ríñones de ratones tratados 3 días después de un único tratamiento con MRT.
En un experimento posterior, se llevó a cabo una comparación de tratamiento con Alfa-galactosidasa en base a ERT con respecto a tratamiento con hGLA en base a MRT de ratones ínactívados con Fabry machos. Se proporcionó una única dosis intravenosa de 1.0 mg/kg para cada terapia y los ratones se sacrificaron una semana después de la administración. Se monitorearon los niveles de suero de la proteína hGLA a 6 hr y 1 semana posinyección. Se analizaron el hígado, los ríñones, el bazo y el corazón para determinar la acumulación de la proteína hGLA una semana después de la administración. Además de los análisis de biodístribución, se determinó una medida de la eficacia a través de mediciones de reducciones de globotrioasílceramida (Gb3) y Nso-Gb3 en los ríñones y el corazón. La FIG. 1 8 muestra los niveles en suero de la proteína hGLA después del tratamiento con nanopartículas lipídícas cargadas con Alfa-galactosidasa o ARNm de GLA (Formulación 1) en ratones con Fabry machos. Se analizaron las muestras de suero a 6 hr y 1 semana después de la administración. Se detectó una señal sólida para ratones tratados con MRT después de 6 horas, con niveles en suero de proteina hGLA de -4.0 ug/mL. En cambios, no había Alfa-galactosidasa detectable restante en el torrente sanguíneo en este tiempo.
Los ratones con Fabry de este experimento se sacrificaron una semana después de la inyección inicial y los órganos se recogieron y analizaron (hígado, ríñones, bazo, corazón). La FIG. 19 muestra una comparación de la proteína GLA humana encontrada en cada órgano respectivo después de tratamiento con MRT de hGLA o con Alfa-galactosidasa de ERT. Los niveles corresponden a la hGLA presentes una semana después de la administración. La proteina hGLA se detectó en todos los órganos analizados. Por ejemplo, los ratones tratados con MRT resultaron en una acumulación de proteína hGLA en los ríñones de 2.42 ng proteína hGLA/mg, mientras que los ratones tratados con Alfa-galactosidasa solo tenían niveles residuales(0.37 ng/mg proteína). Esto corresponde a un nivel -6.5 veces mayor de proteína hGLA cuando se trata a través de MRT de hGLA. Tras el análisis del corazón, se encontraron 11.5 ng de proteína hGLA/mg en el cohorte tratado con MRT en comparación con solo 1.0 ng/mg de proteína Alfa-galactosidasa. Esto corresponde a una acumulación -1 1 veces mayor en el corazón para ratones tratados con MRT de hGLA con respecto a terapias en base a ERT.
Además de los análisis de biodistribucíón, se hicieron evaluaciones para determinar la eficacia a través de mediciones de niveles de globotrioasilceramida (Gb3) y liso-Gb3 en los órganos clave. Una comparación directa de la reducción de Gb3 después de un tratamiento de MRT de GLA de dosis única intravenosa de 1.0 mg/kg GLA MRT en comparación con terapia basada en ERT de Alfa-galactosidasa de una dosis equivalente proporcionó un diferencia considerable en los niveles de Gb3 en los ríñones y en el corazón. Por ejemplo, los niveles de Gb3 para MRT de GLA con respecto a Alfa-galactosidasa proporcionaron reducciones de 60.2% y 26.8%, respectivamente (FIG. 20). Además, los niveles de Gb3 en el corazón se redujeron en 92.1 % con respecto a 66.9% para MRT y Alfa-galactosidasa, respectivamente (FIG. 21 ).
Un segundo biomarcador relevante para medición de la eficacia es liso-Gb3. La MRT de GLA redujo liso-Gb3 más eficazmente que la Alfa-galactosidasa en los ríñones y el corazón (FIG. 20 y FIG. 21 , respectivamente). En particular, los ratones con Fabry tratados con MRT demostraron reducciones de de Nso-Gb3 de 86.1% y 87.9% en los ríñones y el corazón en comparación con los ratones tratados con Alfa-galactosidasa que proporcionaron una disminución de 47.8% y 61.3%, respectivamente.
Los resultados para nanoparticulas basadas en C12-200 con hGLA se extendieron a las otras formulaciones de nanoparticulas lipídicas. Por ejemplo, las nanoparticulas lipídicas basadas en HGT4003 {Formulación 3) o basadas en HGT5000 {Formulación 5) cargadas con ARNm de hGLA administradas en una única dosis IV resultan en la producción hGLA 24 horas después de la administración (FIG. 22). La producción de hGLA exhibió una respuesta a la dosis. De forma similar, se observó la producción de hGLA 6 horas y 24 horas después de la administración de nanopartículas lipídicas basadas en HGT5001 (Formulación 6) cargadas con ARNm de hGLA administradas como una única dosis IV. Se observó la producción de hGLA en el suero (FIG. 23A), así como en los órganos (FIG. 23B).
En general, la terapia de reemplazamiento de ARNm aplicada como un depósito para producción proteica produce grandes cantidad de proteina funcionalmente terapéutica, activa a niveles suprafisiológicos. Se demostró que este método proporciona una semivida de circulación sostenida de la proteína deseada y esta proteína derivada de MRT es altamente eficaz para terapia tal como se demostró con la enzima alfa-galactosidasa en ratones con Fabry. 1 C. Resultados de producción de proteína FIX humana in vivo Se llevaron a cabo estudios administrando nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de Factor IX (FIX) en ratones naturales (CD-1 ) y determinando la proteína FIX que se secreta en el torrente sanguíneo. Tras la inyección intravenosa de una única dosis de 30 ug de nanopartículas lipídicas basadas en C12-200 cargadas con ARNm de FIX (C12-200:DOPE:Col:PEG a una relación de 40:30:25:5) (dosis basada en ARNm encapsulado) (Formulación 1), se observó una producción de proteína sólida (FIG. 24).
El análisis farmacocinético a las 72 mostró que la proteína FIX derivada de MRT podría detectarse en todos los puntos de tiempo evaluados (FIG. 24). La concentración en suero pico se observó a 24 hr posinyección con un valor de ~3 ug (2995±738 ng/mL) proteina FIX/mL de suero. Esto representa otro ejemplo exitoso del efecto de depósito. 1 D. Resultados de producción de proteina A1AT humana in vivo Se llevaron a cabo estudios administrando nanopartículas lipidicas cargadas con ARNm de alfa-1-antitripsina (A1AT) en ratones naturales (CD-1 ) y determinando la proteína A1AT que se secreta en el torrente sanguíneo. Tras la inyección intravenosa de una única dosis de 30 ug de nanopartículas lipidicas basadas en C12-200 cargadas con ARNm de A1AT (dosis basada en ARNm encapsulado) (Formulación 1), se observó una producción de proteína sólida (FIG. 25).
Tal como se muestra en la FIG. 25, se podrían observar niveles detectables de proteina A1AT humana derivada de MRT de A1AT por un período de tiempo de 24 horas posadministración. Se detectó un nivel máximo en suero de -48 ug proteína A1AT/mL de suero 12 horas después de la inyección.
EJEMPLO 2 Depósito de producción proteica a través de administración pulmonar de composiciones polinucleotidicas Protocolo de inyección Todos los estudios Se llevaron a cabo estudio usando ratones CD-1 o BALB/C hembra de aproximadamente 7-10 semanas en el inicio de cada experimento. Los artículos se prueba se introdujeron a través de una única administración aerosolizada intratraqueal. Los ratones se sacrificaron y se perfundieron con solución salina en los puntos de tiempo indicados. Se recogieron los pulmones de cada ratón, se partieron en dos partes y se almacenaron en formalina amortiguada neutra al 10% o se congelaron inmediatamente y se almacenaron a -80°C para el análisis. El suero se aisló tal como se describió en el Ejemplo 1. ELISA DE EPO: tal como se describió en el Ejemplo 1.
Resultados El efecto depósito puede lograr a través de la administración pulmonar (por ejemplo, intranasal, intratraqueal, nebulización). Se logró y cuantificó la medición de la proteína de base exógena deseada derivada del ARN mensajero administrado a través de sistemas de nanopartículas.
La producción de proteína EPO humana a través de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de hEPO se evaluó en ratones CD-1 a través de una única administración intratraqueal (MicroSprayer®). Se evaluaron varias formulaciones usando varios lipidos catiónicos (Formulaciones 1, 5, 6). Todas las formulaciones resultaron en alta encapsulación de ARNm de EPO humana. Tras la administración, los animales se sacrificaron seis horas después de la administración y se extrajeron los pulmones y el suero.
La proteína EPO humana se detectó en el sitio de administración (pulmones) tras el tratamiento a través de administración por aerosol. El análisis del suero seis horas después de la administración exhibió cantidades detectables de la proteína hEPO en circulación. Estos datos (se muestran en la FIG. 26) demuestran la capacidad del pulmón para actuar como un "depósito" para la producción (y secreción) de la proteína hEPO.

Claims (1)

  1. NOVEDAD DE INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Una composición que comprende (a) al menos una molécula de ARNm, codificando al menos una porción de la misma un polipéptido secretado funcional; y (b) un vehículo de transferencia que comprende una nanopartícula lipídica. 2 - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el ARNm codifica una enzima que es anormalmente deficiente en un individuo con un trastorno de almacenamiento lisosómico. 3 - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el ARNm codifica una polipéptido de eritropoyetina funcional o a-galactosidasa funcional. A.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la molécula de ARN comprende al menos una modificación que confiere estabilidad a la molécula de ARN. 5.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la molécula de ARN comprende una modificación de la región no traducida en 5' de dicha molécula de ARN. 6 - La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dicha modificación comprende la inclusión de una estructura Capí . 7.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la molécula de ARN comprende una modificación de la región no traducida en 3' de dicha molécula de ARN. 8 - La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque dicha modificación comprende la inclusión de •un extremo poli A. 9. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende adicionalmente un agente para facilitar la transferencia de la molécula de ARN a un compartimiento intracelular de una célula objetivo. 10. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la nanopartícula lipídica comprende uno o más lípidos catiónicos. 1 1.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la nanopartícula lipídica comprende uno o más lípidos no catiónicos. 12. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la nanopartícula lipídica comprende uno o más lípidos modificados por PEG. 13. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la nanopartícula lipídica comprende C12-200. 14. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la nanoparticula lipídica comprende DLinKC2DMA, COL, DOPE y DMG-PEG-2000. 15. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la nanoparticula lipídica comprende C12-200, DOPE, COL, y DMGPEG2K. 16. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la nanoparticula lipídica comprende un lipido escindióle. 17. - El composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha composición es liofilizada. 18. - El composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha composición es una composición liofilizada reconstituida. 19. - La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque la célula objetivo se selecciona del grupo que consiste en hepatocitos, células epiteliales, células hematopoyéticas, células epitelial, células endoteliales, células pulmonares, células óseas, células madre, células mesenquimales, células neurales, células cardíacas, adipocitos, células de músculo liso vascular, cardiomiocitos, células de músculos esquelético, células beta, células pituitarias, células de recubrimiento sinovial, células ováricas, células testiculares, fibroblastos, células B, células T, reticulocitos, leucocitos, granulocitos y células tumorales. 20 - El uso de una composición que comprende (a) al menos un ARNm del cual al menos una porción codifica el polipéptido secretado funcional; y (b) un vehículo de transferencia que comprende una nanoparticula lipídica, en la elaboración de un medicamento para tratar un sujeto que tiene un deficiencia en un polipéptido funcional, en donde tras la administración de dicho medicamento, dicho ARNm se expresa en un célula objetivo para producir dicho polipéptido secretado funcional. 21 - El uso como el que se reclama en la reivindicación 20, en donde el ARNm codifica un polipéptido de eritropoyetina, a-galactosidasa, receptor LDL, Factor VIII, Factor IX, a-L-iduronidasa, iduronato sulfatasa, heparina-N-sulfatasa, a-?-acetilglucosaminidasa, galactosa 6-sultatasa, ß-galactosidasa, lipasa ácido lisosómica o arilsulfatasa-A funcional; y (b) un vehículo de transferencia, en donde tras la administración de dicho medicamento, dicho ARNm se expresa en una célula objetivo para producir un polipéptido secretado funcional. 22 - El uso como el que se reclama en la reivindicación 21 , < donde el polipéptido secretado funcional es una enzima anormalmente deficiente en un individuo con un trastorno de almacenamiento lisosómico. 23 - El uso como el que se reclama en la reivindicación 21 , en donde la molécula de ARNm comprende al menos una modificación que confiere estabilidad a la molécula de ARNm. 24.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 21 , en donde la molécula de ARNm comprende una modificación de la región no traducida en 5' de dicha molécula de ARNm. 25 - El uso como el que se reclama en la reivindicación 24, en donde dicha modificación comprende la inclusión de una estructura Capí . 26. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 21 , en donde la molécula de ARNm comprende una modificación de la región no traducida en 3' de dicha molécula de ARNm. 27. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 26, en donde dicha modificación comprende la inclusión de un extremo poli A. 28. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 21 , en donde el medicamento comprende además un agente para facilitar la transferencia de la molécula de ARNm a un compartimiento intracelular de una célula objetivo. 29. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 21 , en donde la nanopartícula lipidica comprende uno o más lípidos catiónicos. 30. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 21 , en donde la nanopartícula lipidica comprende uno o más lípidos no catiónicos. 31. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 21 , en donde la nanopartícula lipidica comprende uno o más lípidos modificados por PEG. 32. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 21 , en donde la nanopartícula lipidica comprende C12-200. 33. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 21 , en donde la nanopartícula lipidica comprende DLinKC2DMA, COL, DOPE y DMG-PEG-2000. 34. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 21 , en donde la nanopartícula lipídica comprende C12-200, DOPE, COL y DMGPEG2K. 35. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 21 , en donde la nanopartícula lipídica comprende un lípido escindible. 36. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 21 , en donde dicha composición es liofilizada. 37. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 21 , en donde dicha composición es una composición liofilizada reconstituida. 38.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 21 , en donde la célula objetivo se selecciona del grupo que consiste en hepatocitos, células epiteliales, células hematopoyéticas, células epitelial, células endoteliales, células pulmonares, células- óseas, células madre, células mesenquimales, células neurales, células cardíacas, adipocitos, células de músculo liso vascular, cardiomiocitos, células de músculos esquelético, células beta, células pituitarias, células de recubrimiento sinovial, células ováricas, células testiculares, fibroblastos, células B, células T, reticulocitos, leucocitos, granulocitos y células tumorales. 39.- El uso de una composición que comprende (a) al menos un ARNm del cual al menos una porción codifica el polipéptido secretado funcional; y (b) un vehículo de transferencia que comprende una nanopartícula lipídica, en la elaboración de un medicamento para tratar un sujeto que tiene un deficiencia en un polipéptido secretado funcional, en donde tras la administración de dicho medicamento, dicho ARNm se traduce en un célula objetivo para producir el polipéptido funcional en dicha célula objetivo a al menos un nivel mínimo terapéutico más de una hora después de la administración. 40.- El uso de una composición que comprende (a) al menos un ARNm del cual al menos una porción codifica el polipéptido secretado funcional; y (b) un vehículo de transferencia que comprende una nanopartícula lipídíca, en la elaboración de un medicamento para producir un polipéptido secretado funcional en una célula objetivo, en donde tras la administración de dicho medicamento, dicho ARNm se traduce en un célula objetivo para producir un polipéptido secretado funcional a al menos un nivel mínimo terapéutico más de una hora después de la administración. 41.- Una composición que comprende (a) al menos un ARNm del cual al menos una porción codifica el polipéptido secretado funcional; y (b) un vehículo de transferencia que comprende una nanopartícula lipídica, para usarse en el tratamiento de un sujeto que tiene un deficiencia en un polipéptido funcional, en donde tras la administración de dicha composición, dicho ARNm se expresa en un célula objetivo para producir dicho polipéptido secretado funcional. 42.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizada además porque el ARNm codifica un polipéptido de eritropoyetina, a-galactosidasa, receptor LDL, Factor VIII, Factor IX, a-L-iduronidasa, iduronato sulfatasa, heparina-N-sulfatasa, a-N- acetilglucosaminidasa, galactosa 6-sultatasa, ß-galactosidasa, üpasa ácido lisosómica o arilsulfatasa-A funcional; y (b) un vehículo de transferencia, en donde tras la administración de dicho medicamento, dicho ARNm se expresa en una célula objetivo para producir un polipéptido secretado funcional. 43.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque el polipéptido secretado funcional es una enzima anormalmente deficiente en un individuo con un trastorno de almacenamiento lisosómico. 44. - La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque la molécula de ARNm comprende al menos una modificación que confiere estabilidad a la molécula de ARNm. 45. - La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque la molécula de ARNm comprende una modificación de la región no traducida en 5' de dicha molécula de ARNm. 46. - La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada además porque dicha modificación comprende la inclusión de una estructura Capí . 47.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque la molécula de ARNm comprende una modificación de la región no traducida en 3' de dicha molécula de ARNm. 48 - La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada además porque dicha modificación comprende la inclusión de un extremo poli A. 49. - La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque el medicamento comprende además un agente para facilitar la transferencia de la molécula de ARNm a un compartimiento intracelular de una célula objetivo. 50. - La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque la nanoparticula lipídica comprende uno o más lipidos catiónicos. 51 - La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque la nanoparticula lipídica comprende uno o más lipidos no catiónicos. 52. - La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque la nanoparticula lipídica comprende uno o más lipidos modificados por PEG. 53. - La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque la nanoparticula lipídica comprende C 12-200. 54 - La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque la nanoparticula lipídica comprende DLinKC2DMA, COL, DOPE y DMG-PEG-2000. 55.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque la nanopartícula lipidica comprende C12-200, DOPE, COL y DMGPEG2K. 56. - La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque la nanopartícula lipidica comprende un lípido escindible. 57. - La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque dicha composición es liofilizada. 58. - La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque dicha composición es una composición liofilizada reconstituida. 59. - La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque la célula objetivo se selecciona del grupo que consiste en hepatocitos, células epiteliales, células hematopoyéticas, células epitelial, células endoteliales, células pulmonares, células óseas, células madre, células mesenquimales, células neurales, células cardíacas, adipocitos, células de músculo liso vascular, cardiomiocitos, células de músculos esquelético, células beta, células pituitarias, células de recubrimiento sinovial, células ováricas, células testiculares, fibroblastos, células B, células T, reticulocitos, leucocitos, granulocitos y células tumorales. 60. - Una composición que comprende (a) al menos un ARNm del cual al menos una porción codifica el polipéptido secretado funcional; y (b) un vehículo de transferencia que comprende una nanopartícula lipidica, para usarse en el tratamiento de un sujeto que tiene un deficiencia en un polipéptido secretado funcional, en donde tras la administración de dicha composición, dicho ARNm se traduce en un célula objetivo para producir el polipéptido funcional en dicha célula objetivo a al menos un nivel mínimo terapéutico más de una hora después de la administración. 61.- Una composición que comprende (a) al menos un ARNm del cual al menos una porción codifica el polipéptido secretado funcional; y (b) un vehículo de transferencia que comprende una nanopartícula lipídica, para usarse en la producción de un polipéptido secretado funcional en una célula objetivo, en donde tras la administración de dicha composición, dicho ARNm se traduce en un célula objetivo para producir un polipéptido secretado funcional a al menos un nivel mínimo terapéutico más de una hora después de la administración.
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