JP2021147353A - 組成物、脂質粒子製造用キット、物質送達方法及び検出方法 - Google Patents

組成物、脂質粒子製造用キット、物質送達方法及び検出方法 Download PDF

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Abstract

【課題】 Ｔ細胞性腫瘍細胞に目的物質を送達することができる組成物、脂質粒子製造用キット、物質送達方法及び検出方法を提供することである。【解決手段】 実施形態に従う組成物は、Ｔ細胞性腫瘍細胞に目的物質を送達するための組成物である。組成物は、物質送達キャリアを含む。物質送達キャリアは、脂質粒子と、前記脂質粒子に内包された前記目的物質とを備える。脂質粒子は、その構成成分として式（Ｉ）の第１脂質及び式（ＩＩ）の第２脂質を少なくとも含む。【選択図】図１

Description

本発明の実施形態は、組成物、脂質粒子製造用キット、物質送達方法及び検出方法に関する。
Ｔ細胞性腫瘍（Ｔ−ｃｅｌｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）は、Ｔ細胞性白血病及びＴ細胞性リンパ腫を含む悪性腫瘍性疾患である。種々の悪性腫瘍の治療及び診断のために、腫瘍細胞に特異的に治療薬又は診断薬を送達することが求められている。例えば、送達には特定の腫瘍細胞に特異的な抗体又は受容体が用いられる。しかしながら、Ｔ細胞性腫瘍細胞は正常なＴ細胞と表面抗原に差異がほとんど無く、抗体又は受容体を用いた治療が難しい。
本発明が解決しようとする課題は、Ｔ細胞性腫瘍細胞に目的物質を送達することができる組成物、脂質粒子製造用キット、物質送達方法及び検出方法を提供することである。
実施形態に従う組成物は、Ｔ細胞性腫瘍細胞に目的物質を送達するための組成物である。組成物は、物質送達キャリアを含む。物質送達キャリアは、脂質粒子と、前記脂質粒子に内包された前記目的物質とを備える。脂質粒子は、その構成成分として式（Ｉ）の第１脂質及び式（ＩＩ）の第２脂質を少なくとも含む。
図１は、第１実施形態の脂質粒子の一例を示す断面図である。 図２は、第２実施形態の物質送達キャリアの一例を示す断面図である。 図３は、第２実施形態の物質送達方法の一例を示すフローチャートである。 図４は、第２実施形態の物質送達方法の一例を示す模式図である。 図５は、第３実施形態の物質送達キャリアの一例を示す断面図である。 図６は、第３実施形態の検出方法の一例を示すフローチャートである。 図７は、第３実施形態の検出方法の一例を示す模式図である。 図８は、例１の実験結果を示すグラフである。 図９は、例１の実験結果を示すグラフである。 図１０は、例１の実験結果を示すグラフである。 図１１は、例２の実験結果を示すグラフである。 図１２は、例２の実験結果を示すグラフである。 図１３は、例３の実験結果を示すグラフである。 図１４は、例４の実験結果を示すグラフである。
以下、実施形態について、添付の図面を参照して説明する。なお、各実施形態において、実質的に同一の構成部位には同一の符号を付し、その説明を一部省略する場合がある。図面は模式的なものであり、各部の厚さと平面寸法との関係、各部の厚さの比率等は現実のものとは異なる場合がある。
（第１実施形態）
・脂質粒子
第１実施形態によれば、Ｔ細胞性腫瘍細胞内に目的物質を導入するための脂質粒子が提供される。図１に示す通り、脂質粒子１は、略球状の中空体であり、その中心の内腔２に目的物質３を内包することができる。
目的物質３は、Ｔ細胞性腫瘍細胞内に送達することが望まれる物質である。目的物質３は、脂質粒子１内に内包することができるものであれば何れの物質であってもよいが、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、他の有機化合物、無機化合物、Ｔ細胞性腫瘍の治療薬又は診断薬などであり得る。
脂質粒子１は、例えばその材料である複数の脂質の分子が非共有結合で配列してできた脂質膜から構成され得る。脂質粒子１は、その構成成分として第１脂質１ａ及び第２脂質１ｂを少なくとも含む。第１脂質１ａは下記式（Ｉ）を有する脂質化合物であり、第２脂質１ｂは下記式（ＩＩ）を有する脂質化合物である。
Figure 2021147353
脂質粒子１は、第１脂質１ａ及び第２脂質１ｂの他に更なる脂質を含んでもよい。脂質粒子１を構成する脂質分子材料の組成の中で、第１脂質１ａと第２脂質１ｂとからなる画分を以下「第１画分」と称する。また、第１脂質１ａ及び第２脂質１ｂ以外の脂質分子材料からなる画分を以下「第２画分」と称する。第２画分に含まれる脂質をまとめて以下「第３脂質１ｃ」とも称する。
第１画分及び第２画分という言葉は、脂質粒子１の構成成分の組成を表すものであって、そこに含まれる脂質の物理的な位置を示すのもではない。例えば、第１画分及び第２画分の構成成分は脂質粒子１の中でそれぞれ１つのまとまりになっている必要はなく、第１画分に含まれる脂質と第２画分に含まれる脂質とは混ざり合って存在し得る。脂質粒子１を構成する脂質材料全体に対する第１画分の配合割合は３０％以上５０％未満（モル比）であることが好ましい。
第１画分における第２脂質１ｂの配合割合は４０％以上であることが好ましい。その場合、目的物質３導入のＴ細胞性腫瘍細胞特異性、及び目的物質３の導入効率が向上し得る。また第１画分中の第２脂質１ｂの配合割合が５０％以上である場合、特に生体内、即ち、インビボにおける目的物質３の導入量が向上し得るためより好ましい。第２脂質１ｂの配合割合が６０％以上であれば更に好ましい。第２脂質１ｂの配合割合の上限は８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％であり得る。
第１画分における第１脂質１ａと第２脂質１ｂとの配合割合により、脂質粒子１の粒子径及び細胞への浸透性が変化する場合もある。例えば、第２脂質１ｂが多いほど脂質粒子１の粒子径は大きくなり得る。脂質粒子１の平均粒子径は、用途に応じて変更することが可能であり、例えば約５０ｎｍ〜約３００ｎｍに調節することが好ましい。例えばインビボで用いる場合は、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍとすることが好ましい場合がある。
脂質粒子１は、Ｔ細胞性腫瘍細胞と接触させることにより、例えば該細胞内にエンドサイトーシスにより取り込まれ得る。そして、目的物質３が該細胞内に放出され得る。脂質粒子１は第１脂質１ａ及び第２脂質１ｂを含むことにより、Ｔ細胞性腫瘍細胞により取り込まれやすく、正常な血液細胞等の他の細胞には取り込まれにくい性質を有する。したがって、脂質粒子１に目的物質３を内包してＴ細胞性腫瘍細胞に接触させる（例えば、投与する）簡単な手順により、従来のように抗体又は受容体を用いることなく目的物質３を効率よくＴ細胞性腫瘍細胞に導入することができる。故に、脂質粒子１はＴ細胞性腫瘍細胞に選択的又は特異的に目的物質３を送達することが求められる様々な用途において用いることができる。
ここで、Ｔ細胞性腫瘍は、Ｔ細胞（Ｔリンパ球）の悪性腫瘍化に起因する疾患である。Ｔ細胞性腫瘍細胞は、悪性腫瘍化したＴ細胞、例えば、Ｔ細胞由来の白血病細胞及びリンパ腫細胞等を含む。
脂質粒子１の第２画分に含まれる第３脂質１ｃの種類は限定されるものではないが、例えば、第２画分はベース脂質を含む。ベース脂質として、例えば、生体膜の主成分である脂質を用いることができる。ベース脂質は、リン脂質又はスフィンゴ脂質、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン又はセレブロシド、或いはこれらの組み合わせ等である。
例えば、ベース脂質として、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
１，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、
１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、
１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、
１，２−ジミリストイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（１４：０ ＤＡＰ）、
１，２−ジパルミトイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（１６：０ ＤＡＰ）、
１，２−ジステアロイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（１８：０ ＤＡＰ）、
Ｎ−（４−カルボキシベンジル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（オレオイロキシ）プロパン（ＤＯＢＡＱ）、
１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホクロリン（ＤＯＰＣ）、
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホクロリン（ＤＬＰＣ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＯＰＳ）、又は
コレステロール、
或いはこれらの何れかの組み合わせ等を用いることが好ましい。
上記ベース脂質として、特にカチオン性脂質又は中性脂質の脂質を用いること好ましく、その含有量によって脂質粒子１の酸解離定数を調節することができる。カチオン性脂質としてＤＯＴＡＰを用いることが好ましく、中性脂質としてＤＯＰＥを用いることが好ましい。
第２画分は、脂質粒子１の凝集を防止する脂質を含むこともまた好ましい。例えば、凝集を防止する脂質は、ＰＥＧ修飾した脂質、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ−ＰＥＧ）、オメガ−アミノ（オリゴエチレングリコール）アルカン酸モノマーから誘導されるポリアミドオリゴマー（米国特許第６，３２０，０１７号）又はモノシアロガングリオシド等を更に含むことが好ましい。
第２画分は、更に、毒性を調整するための相対的に毒性の低い脂質；脂質粒子１に配位子を結合させる官能基を有する脂質；ステロール、例えばコレステロール等の内包物の漏出を抑制するための脂質等の脂質を含んでもよい。特に、コレステロールを含ませることが好ましい。
第２画分に用いる脂質の種類及びその組成は、目的とする脂質粒子１の酸解離定数（ｐＫａ）若しくは脂質粒子１の粒子径、目的物質３の種類、或いは細胞中での安定性等を考慮して適切に選択される。
例えば、第２画分は、ＤＯＰＥと、ＤＯＴＡＰと、コレステロールと、ＤＭＧ−ＰＥＧとを含む場合、目的物質３の送達効率が特に優れているため好ましい。
脂質粒子１内には、目的物質３の他に、必要に応じて更なる成分が内包されていてもよい。更なる成分は、例えば、ｐＨ調整剤、浸透圧調整剤、遺伝子活性化剤又はＴ細胞性腫瘍細胞の他の治療薬、他の診断薬等である。ｐＨ調整剤は、例えば、クエン酸などの有機酸及びその塩等である。浸透圧調整剤は、糖又はアミノ酸等である。遺伝子活性化剤については後述する。
目的物質３及び必要に応じて他の物質を内包する脂質粒子１は、例えば、小分子を脂質粒子に封入する際に用いられる公知の方法、例えば、バンガム法、有機溶媒抽出法、界面活性剤除去法又は凍結融解法等を用いて製造することができる。例えば、脂質粒子１の材料を所望の比率でアルコール等の有機溶媒に含ませて得られた脂質混合物と、目的物質３等の内包するべき成分を含む水性緩衝液を用意し、脂質混合物に水性緩衝液を添加する。得られた混合物を撹拌して懸濁することにより目的物質３等を内包した脂質粒子１が形成される。
脂質粒子１の構成成分の配合比は、脂質混合物中の各材料の配合比を変えることで容易に調節することができる。例えば、脂質粒子１の構成成分の混合比は、脂質混合物中の各材料の混合比と略同一であり得る。また、脂質粒子１に内包する物質の量比は、水性緩衝液中の両者の量比を変えることにより容易に調節することができる。
以下、目的物質３を内包した状態の脂質粒子１を「物質送達キャリア」とも称する。
・組成物
物質送達キャリアは、適切な担体に含ませた液体の組成物として提供されてもよい。担体は、例えば、水、生理食塩水のような食塩水、グリシン水溶液又は緩衝液等である。或いは、物質送達キャリアは乾燥した粉末状の組成物として提供されてもよい。粉末状の組成物は、使用者が上記担体のような適切な液体を加えることによって使用可能となる。
組成物は、物質送達キャリアの他に保管安定性を向上させる物質を更に含んでもよい。保管安定性を向上させる物質は、限定されるものではないが、例えば、アルブミン、リポタンパク、アポリポタンパク、グロブリン等の糖タンパク等：ｐＨ調整剤、緩衝化剤、張度調整剤等；ナトリウムアセテート、ナトリウムラクテート、ナトリウムクロリド、カリウムクロリド、カルシウムクロリド等の製薬学的に許容可能であり、組成物を生理的状態に近づける関与剤；フリーラジカルによるダメージを抑制する、α−トコフェロールのような脂肪親和性フリーラジカルクエンチャー；脂質の過酸化損傷を抑制し、貯蔵安定性を改良するためのフェリオキサミンのような水溶性キレーター等の脂質保護剤等である。
物質送達キャリアを生体への投与に用いる場合、組成物は薬学的に許容され得る組成を有し、公知の方法で滅菌されていることが好ましい。
更なる実施形態によれば、脂質粒子１を製造するために用いられる脂質混合物が提供される。脂質混合物は、第１脂質１ａ及び第２脂質１ｂを少なくとも含む。脂質混合物は、第１脂質１ａ及び第２脂質１ｂを上記の何れかの所望の配合割合で含み、第２画分の脂質も含み得る。脂質混合物は、所望の目的物質３とともに脂質粒子１製造キットとして提供されてもよい。
（第２実施形態）
第２実施形態においては、Ｔ細胞性腫瘍細胞を減少又は消滅させるために脂質粒子１を用いる例について説明する。この場合、目的物質３としてＴ細胞性腫瘍細胞を減少又は消滅させるための物質が用いられ得る。以下、図２を用いてこのような目的物質３を内包する脂質粒子１、即ち、物質送達キャリア１０の一例について説明する。
・物質送達キャリア
図２に示すように、物質送達キャリア１０は、脂質粒子１と、脂質粒子１に内包されているＲＮＡ４とを備える。ＲＮＡ４は、例えば、核酸凝縮ペプチド５で凝縮された状態で脂質粒子１に内包されている。
脂質粒子１として、第１実施形態で説明した何れかの脂質粒子１を使用することができる。
ＲＮＡ４は、例えば、殺細胞遺伝子のｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）の配列を有するＲＮＡである。
本明細書において、「殺細胞遺伝子」とは、例えば、がん細胞を含むヒト細胞に殺細胞効果（主にアポトーシス）を誘導する遺伝子群の総称で、「自殺遺伝子」とも呼ばれる。
殺細胞遺伝子として、がん抑制遺伝子（ｐ５３、Ｒｂ、ＡＲＦ等）、デスリガンド受容体遺伝子（Ｆａｓ、Ｔｕｍｏｒ−ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＮＦＲ）、Ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＤＲ）４、ＤＲ５等）、アポトーシス促進遺伝子（Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｍ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ等）、アポトーシス阻害因子アンタゴニスト遺伝子（Ｓｍａｃ、ＤＩＡＢＬＯなど）、カスパーゼ遺伝子（Ｃａｓｐａｓｅ ３、Ｃａｓｐａｓｅ ６、Ｃａｓｐａｓｅ ７/、Ｃａｓｐａｓｅ ９、Ｃａｓｐａｓｅ ８、Ｃａｓｐａｓｅ １０、ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃａｓｐａｓｅ ９（ｉＣａｓｐａｓｅ ９）等）、ウイルス由来遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子）等を用いることができる。
がん抑制遺伝子のｍＲＮＡは、スプライシング前のＰｒｅ−ｍＲＮＡであってもよいし、スプライシング後の成熟ｍＲＮＡであってもよい。また、ＲＮＡ４は、転写後修飾された殺細胞遺伝子のｍＲＮＡであってもよく、例えば５’末端にＣＡＰが付加され、３’末端がポリアデニル化したものであってもよい。
ＲＮＡ４は、殺細胞遺伝子のｍＲＮＡの配列に加えて更なる配列を含んでもよい。更なる配列は、例えば転写及び発現効率を向上させるための配列であり、例えば５’末端に結合されたグロビンリーダー配列及び／又は３’末端に結合されたポリ（Ａ）配列等である。
ＲＮＡ４は、分解耐性を有するように修飾されていることが好ましい。修飾は、ＲＮａｓｅ等によりＲＮＡが分解されないようにする公知の修飾であればよく、例えば、ＲＮＡへの天然修飾ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドの使用／導入、非天然配列の使用／付加、又は天然／非天然ＣＡＰ構造の付加等である。
天然修飾ヌクレオチドは、例えば、シュードウリジン、５−メチルシチジン、１−メチルアデノシン等である。非天然ヌクレオチドは、例えば、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、又はＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）等である。
非天然配列は、例えば、人工的に作成された天然には存在しない塩基配列であり、例えば、ランダムな塩基配列、又は天然／非天然アミノ酸と核酸のハイブリッド配列等である。非天然配列は、例えばＲＮＡの末端に付加することが好ましい。
天然ＣＡＰ構造は、例えば、ＣＡＰ０（ｍ７ＧｐｐｐＮ）、ＣＡＰ１（ｍ７ＧｐｐｐＮｍ）等である。非天然ＣＡＰ構造は、例えば、ＡＲＣＡ（Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ）又はＬＮＡ−グアノシン等である。非天然ＣＡＰ構造は、例えばＲＮＡの５’末端に付加することが好ましい。
ＲＮＡ４は、脂質粒子１内に１〜約１０００分子含まれることが好ましい。
ＲＮＡ４は、そのままの状態で脂質粒子１に内包されてもよいし、核酸凝縮ペプチド５によって凝縮された状態で脂質粒子１に内包されてもよい。核酸凝縮ペプチド５を用いた場合、核酸を小さく凝縮することにより、脂質粒子１内に多くのＲＮＡ４を内包し、脂質粒子１の粒径を小さくすることができる。また、脂質粒子１外に残存するＲＮＡ４の量が減少され、それによって物質送達キャリア１０同士の凝集が防止される。その結果、ＲＮＡ４の送達効率が向上し得る。
好ましい核酸凝縮ペプチド５は、例えば、カチオン性のアミノ酸を全体の４５％以上含むペプチドである。より好ましい核酸凝縮ペプチド５は、一方の端にＲＲＲＲＲＲ（第１のアミノ酸配列）を有し、他方の端が配列ＲＱＲＱＲ（第２のアミノ酸配列）を有する。第１のアミノ酸配列と第２アミノ酸配列との間には、ＲＲＲＲＲＲ又はＲＱＲＱＲからなる中間配列を０個又は１個以上含む。また、第１のアミノ酸配列、第２のアミノ酸配列及び中間配列のうち、隣り合う２つの配列の間に２つ以上の中性アミノ酸を含む。中性アミノ酸は、例えば、Ｇ又はＹである。或いは、他方の端は第２のアミノ酸配列に変えて、ＲＲＲＲＲＲ（第１のアミノ酸配列）を有してもよい。
上記核酸凝縮ペプチド５は、好ましくは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＲＱＲＱＲＹＹＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号１）
ＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号２）
ＲＲＲＲＲＲＹＹＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号３）。
更に、次のようなアミノ酸配列を有する核酸凝縮ペプチド５を上記の何れかの核酸凝縮ペプチド５と組み合わせて用いることもできる。このペプチドは、上記核酸凝縮ペプチド５で凝縮した核酸凝集体を更に凝縮することができる。
ＧＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ
（Ｍ９）（配列番号４）
例えば、脂質粒子１に内包する前に、ＲＮＡ４を核酸凝縮ペプチド５と撹拌混合することによってＲＮＡ４を凝縮することができる。
以上に説明した効果を奏することから、目的物質３がＲＮＡ４のような核酸である場合は核酸凝縮ペプチド５を用いることが好ましいが、用いる目的物質３の種類等によっては核酸凝縮ペプチド５を用いなくともよい。
脂質粒子１には、ＲＮＡ４の他に、必要に応じてｐＨ調整剤、浸透圧調整剤、遺伝子活性化剤又はＴ細胞性腫瘍細胞の他の治療薬等を内包してもよい。
遺伝子活性化剤は、ＲＮＡ４の発現及び／又は発現した因子に起因する殺細胞作用を促進するか又は誘導する試薬である。例えば、ＲＮＡ４がｉＣａｓｐａｓｅ ９遺伝子である場合、遺伝子活性化剤としてＣｈｅｍｉｃａｌ−ｉｎｄｕｃｅｒ ｏｆ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ（ＣＩＤ）を一緒に内包することが好ましい。
・物質送達方法
以下に、第２実施形態の物質送達キャリア１０を用いた物質送達方法について説明する。物質送達方法は、図３に示すように、実施形態の物質送達キャリア１０をＴ細胞性腫瘍細胞に接触させること（接触工程Ｓ１）を含む。
Ｔ細胞性腫瘍細胞は、例えば対象の生体内に存在するものである。対象は、好ましくはヒトであるが、ヒトを除く動物であってもよい。動物は、哺乳動物であることが好ましい。対象は、Ｔ細胞性腫瘍と診断された対象、Ｔ細胞性腫瘍に罹患している又はそれが予想される対象等であってもよい。
この場合、接触工程Ｓ１は、物質送達キャリア１０を含む組成物を対象に投与することによって行われる。投与経路は特に限定されるものではなく、例えば、静脈注射、皮下注射、筋肉内注射、動脈注射、硬膜外注射、脳脊髄腔注射、胸腔内注射、腹腔内注射、局所・病巣内注射等、或いは点滴等によって全身投与する。投与スケジュールは、用途、対象の性別、年齢、体重又は病態等を考慮して選択すればよく、単回投与であってもよいし、連続的又は定期的な複数回投与であってもよい。投与によって、物質送達キャリア１０は例えば血液により運ばれ、体内のＴ細胞性腫瘍細胞６と接触する。
この時、物質送達キャリア１０の脂質粒子１の組成は、脂質粒子１の粒径が１００μｍ以下になるように設定されることが好ましい。第１画分における第２脂質１ｂの配合割合は、５０％以上であることが好ましい。６０％以上であれば更に好ましい。
図４の（ａ）に示すように、Ｔ細胞性腫瘍細胞６と接触した物質送達キャリア１０は、例えばエンドサイトーシスによりＴ細胞性腫瘍細胞６に取り込まれる。図示しないが、それによってＲＮＡ４がＴ細胞性腫瘍細胞６に導入され、Ｔ細胞性腫瘍細胞６内でＲＮＡ４が翻訳され、殺細胞因子が発現する。殺細胞因子は、その種類に従うカスケード又はシグナル伝達により、Ｔ細胞性腫瘍細胞６の細胞死を誘導する。或いは、殺細胞遺伝子の種類に応じては、Ｔ細胞性腫瘍細胞６のそれ以上の増殖が抑制される場合もある。その結果、対象内のＴ細胞性腫瘍細胞６を減少又は消滅させることが可能である。
一方で、図４の（ｂ）に示すように、物質送達キャリア１０は他の細胞７、例えば、正常な血液細胞等に接触しても取り込まれにくいため、他の細胞７は生存させることができ安全である。
以上のことから、第２実施形態に従う物質送達キャリア及び物質送達方法によれば、効率的に対象のＴ細胞性腫瘍細胞６にＲＮＡ４を送達し、Ｔ細胞性腫瘍細胞を減少及び消滅させることが可能である。故に、効率的且つ安全にＴ細胞性腫瘍を治療することが可能である。
物質送達キャリア１０は殺細胞遺伝子をＲＮＡ４の形態で導入するため、ＤＮＡの状態で導入する場合と比較して転写工程を省略することができるので、より迅速かつ高効率に殺細胞因子を発現させることが可能である。また、殺細胞因子をタンパク質の形態で導入する場合と比較して脂質粒子１の粒径を小さくすることができ導入効率が向上し得、また殺細胞因子の種類に応じて脂質粒子１に導入する薬剤を変化させる必要がないため製造が容易である。
しかしながら、殺細胞遺伝子はｍＲＮＡの形態に限定されるものではなく、ＤＮＡの状態、タンパク質の状態で用いられてもよい。或いは、殺細胞遺伝子に代えて他の治療剤を用いたＴ細胞性腫瘍細胞６の減少又は消滅に脂質粒子１を用いることも可能である。
更なる実施形態において、第２実施形態の物質送達キャリア１０及び物質送達方法は、生体外に存在するＴ細胞性腫瘍細胞６の減少又は消滅のために使用することも可能である。この場合、Ｔ細胞性腫瘍細胞６は、例えば生体から取り出されて培養されたもの、又は株化したもの等で有り得る。この場合、接触工程Ｓ１は、細胞上に脂質粒子１を含む組成物を滴下することなどによって行うことができる。
（第３実施形態）
第３実施形態においては、Ｔ細胞性腫瘍細胞を検出するために脂質粒子１を用いる例について説明する。この場合、目的物質３としてＴ細胞性腫瘍細胞を検出するための物質が用いられ得る。
図５に示すように、第３実施形態に従う物質送達キャリア２０は、目的物質３として第２実施形態のＲＮＡ４に代えて、診断薬１５を含む。脂質粒子１として、第１実施形態で説明した何れかのものを用いることができる。
診断薬１５は、例えば検出可能な第１の信号を生じる物質であり得る。診断薬１５は、脂質粒子１に内包することができるものであれば何れの物質であってもよいが、例えば光学的な第１信号を生じる物質又は核医学診断装置で検出可能な放射性同位体を含む物質を用いることができる。物質送達キャリア２０を生体内に投与する場合、診断薬１５として薬学的に許容され得る物質を選択することが好ましい。
脂質粒子１内には、診断薬１５の他に必要に応じてｐＨ調整剤、浸透圧調整剤、遺伝子活性化剤又は他のＴ細胞性腫瘍細胞の診断薬等を含んでもよい。
・物質送達方法
以下に、第３実施形態の物質送達キャリア２０を用いてＴ細胞性腫瘍細胞に診断薬１５を送達することでＴ細胞性腫瘍細胞を検出する物質送達方法について説明する。第２実施形態の物質送達方法は、図６に示すように、診断薬１５を内包する脂質粒子１（物質送達キャリア２０）を試料細胞に接触させること（接触工程Ｓ１１）、第１信号を検出すること（検出工程Ｓ１２）、検出の結果に基づいて試料細胞中のＴ細胞性腫瘍細胞の有無を決定すること（決定工程Ｓ１３）を含む。
試料細胞とは、Ｔ細胞性腫瘍細胞６を含むことが疑われるか予想される細胞群である。試料細胞は、例えば、Ｔ細胞性腫瘍と診断されたか、若しくはＴ細胞性腫瘍への罹患が疑われる対象の生体内に存在する細胞であってもよく、或いはこれらの対象から生体外に取り出された細胞集団あってもよい。或いは、試料細胞は人工的に分化又は腫瘍化させた細胞集団等であってもよい。
生体内に存在する試料細胞を用いる場合は、接触工程Ｓ１１は、物質送達キャリア２０を含む組成物を対象に投与することにより行われ得る。生体外に存在する試料細胞を用いる場合は、接触工程Ｓ１は、試料細胞に物質送達キャリア２０を含む組成物を滴下すること等により行われ得る。
図７の（ａ）に示すように、Ｔ細胞性腫瘍細胞６と接触した物質送達キャリア２０はＴ細胞性腫瘍細胞６に取り込まれる。それによって診断薬１５がＴ細胞性腫瘍細胞６に導入される。
検出工程Ｓ１２において、第１信号を検出する。第１信号９は、診断薬１５の種類に応じた所望の装置を用いて検出される。物質送達キャリア２０を生体内に投与する場合、公知のインビボイメージング法が用いられ得る。第１信号９が蛍光である場合、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＦＭＴ）技術等が用いられ得る。試料細胞が生体外の細胞である場合、検出は顕微鏡又は光学センサなどを用いて行われ得る。例えば診断薬１５が放射性同位体である場合、検出は核医学診断装置などを用いて行われ得る。
一方で、図７の（ｂ）に示すように、物質送達キャリア２０は他の細胞７に接触しても取り込まれにくいため、他の細胞７からは第１信号９は得られない。
次に、検出結果を用いて試料細胞にＴ細胞性腫瘍細胞が存在するか否かを決定する（決定工程Ｓ１３）。例えば第１信号９が得られた細胞が存在する場合、試料細胞にＴ細胞性腫瘍細胞が存在すると決定することができる。試料細胞が対象由来の細胞集団である場合は、決定工程Ｓ１３において得られた決定結果の情報は、例えば、対象がＴ細胞性腫瘍細胞に罹患しているか否かの診断に用いることができる。或いは、決定結果の情報はこのような診断の補助にも使用することができる。
更なる実施形態において、診断薬１５は、レポーター遺伝子のｍＲＮＡを含むＲＮＡであってもよい。レポーター遺伝子は、例えば、レポータータンパク質をコードする遺伝子である。レポータータンパク質は、検出可能な第１信号を生じるタンパク質である。レポータータンパク質は、細胞毒性が低く、かつ生細胞において信号の検出が可能なものであることが好ましい。
レポータータンパク質は、例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質又は青色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質；ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ又はＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼなどの発光酵素タンパク質；キサンチンオキシダーゼ又は一酸化窒素合成酵素などの活性酸素生成酵素；或いはβ−ガラクトシダーゼ又はクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼなどの発色酵素タンパク質等から選択されることが好ましい。
このＲＮＡは、第２実施形態と同様にレポーター遺伝子のｍＲＮＡに加えて更なる配列を更に含んでもよく、分解耐性を有するように修飾されていてもよく、核酸凝縮ペプチド５によって凝縮された状態で脂質粒子１に内包されていてもよい。
第３実施形態に従う脂質粒子１は、レポーター遺伝子のｍＲＮＡからのレポータータンパク質の発現及び／又はレポータータンパク質からの第１の信号の発生を助ける遺伝子活性化剤を更に内包していてもよい。
以上に説明した第３実施形態の物質送達キャリア及び検出方法によれば、効率的にＴ細胞性腫瘍細胞に診断薬１５を送達することができ、Ｔ細胞性腫瘍の検出及び診断を行うことが可能である。
［例］
以下、実施形態の物質送達キャリアを製造して使用した例について説明する。
例１ Ｔ細胞性腫瘍、正常血球細胞、乳癌細胞、脳腫瘍細胞への脂質粒子取込量の評価
・脂質粒子の調整
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のｍＲＮＡ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）とエタノール溶解脂質溶液とを用意した。エタノール溶解脂質溶液の組成を表１に示す。
Figure 2021147353
表中、「ＦＦＴ−１０」は式（Ｉ）の化合物であり、「ＦＦＴ−２０」は式（ＩＩ）の化合物である。
Figure 2021147353
表１のエタノール脂質溶液にローダミン−ＰＥ（Ａｖａｎｔｉ（登録商標）社製）を０．４ｍｏｌ添加した溶液を調製した後、ＧＦＰｍＲＮＡを含む溶液を添加してピペッティングでよく懸濁した。この溶液に、７倍量の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を添加した後、遠心式の限外ろ過装置（ＡｍｉｃｏｎＴＭＵｌｔｒａ−０．５ｍＬ、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−５０Ｋ、ミリポア）で、溶液の濃縮と１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）への溶液置換をおこなってＧＦＰｍＲＮＡを内包した脂質粒子を得た。脂質粒子に内包されたｍＲＮＡ量は、ＲＮＡ定量システムであるＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒＴＭＲＮＡ（プロメガ）で測定した。
・細胞の調整
Ｔ細胞性腫瘍細胞は、ヒト白血病細胞株：Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標））を使用した。正常血球細胞は、ヒト末梢血単核細胞：ＰＢＭＣ（ロンザ）を使用した。乳がん細胞は、ヒト乳腺腫瘍細胞株：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標））を、脳腫瘍由来細胞は、ヒト神経膠芽腫細胞株：Ｔ９８Ｇ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標））を使用した。
・脂質粒子によるｍＲＮＡの導入
Ｊｕｒｋａｔ及びＰＢＭＣは、４８ウェル培養プレートに５．０×１０５細胞／５００μＬ ＴｅｘＭＡＣＳＴＭ培地（ミルテニーバイオテク）で播種した。ＭＤＡ−ＭＤ−２３１及びＴ９８Ｇは４８ウェル培養プレートに、それぞれ１．０×１０５細胞／２５０μＬ ＤＭＥＭ培地（含１０％ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、１．０×１０５細胞／２５０μＬ ＲＰＭＩ１６４０培地（含１０％ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ（登録商標））で播種した。ＧＦＰ ｍＲＮＡを内包する脂質粒子をＪｕｒｋａｔ及びＰＢＭＣに対しては１．０μｇ加え、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１及びＴ９８Ｇに対しては０．５μｇ加えて、ピペッティングでよく混合してから、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内で培養した。
細胞に脂質粒子を添加してから２４時間後に、細胞を回収し、細胞のローダミン蛍光を蛍光活性化セルソーター：ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅＴＭ、ＢＤバイオサイエンス）で測定した。脂質粒子の細胞への取込み量は、細胞のローダミン蛍光を指標として決定した。
・結果
図８にＴ細胞性腫瘍細胞におけるローダミンの蛍光強度を示す。蛍光強度は、ＦＦＴ−１０単独の場合では約２００ＲＦＵであり、ＦＦＴ−２０単独の場合では、約１３００ＲＦＵであり、ＦＦＴ−１０及びＦＦＴ−２０を両方含む場合では、約１６００ＲＦＵであった。
図９にＴ細胞性腫瘍細胞とＰＢＭＣとにおけるローダミンの蛍光強度を比較した結果を示す。蛍光強度は、ＦＦＴ−１０単独の場合ではＴ細胞性腫瘍細胞(Ｊｕｒｋａｔ）で約２００ＲＦＵであり、ＰＢＭＣで約１０ＲＦＵであった。ＦＦＴ−２０単独の場合では、Ｔ細胞性腫瘍細胞で約１３００ＲＬＵであり、ＰＢＭＣで約２５ＲＦＵであった。ＦＦＴ−１０及びＦＦＴ−２０を両方含む場合では、Ｔ細胞性腫瘍細胞で約１６００ＲＬＵであり、ＰＢＭＣで約１００ＲＦＵであった。
何れの場合も、ＰＢＭＣよりもＴ細胞性腫瘍細胞でより多くのｍＲＮＡを内包したリポソームが取り込まれたことが示された。特に、その差はＦＦＴ−２０単独と、ＦＦＴ−１０及びＦＦＴ−２０を両方含む場合で顕著であった。加えて、ＦＦＴ−１０及びＦＦＴ−２０を両方含む場合、ｍＲＮＡを内包したリポソームの取込量が最も多かった。
図１０にＴ細胞性腫瘍細胞と乳がん細胞及び脳腫瘍細胞とを比較した結果を示す。ローダミンの蛍光強度は、ＦＦＴ−１０単独の場合ではＴ細胞性腫瘍細胞（Ｊｕｒｋａｔ）で約２００ＲＦＵであり、乳がん細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）で約２３００ＲＦＵであり、脳腫瘍細胞（Ｔ９８Ｇ）で約６００ＲＦＵであった。ＦＦＴ−２０単独の場合では、Ｔ細胞性腫瘍細胞で約１３００ＲＦＵであり、乳がん細胞で約１００ＲＦＵであり、脳腫瘍細胞で約１０００ＲＦＵであった。ＦＦＴ−１０及びＦＦＴ−２０を両方含む場合では、Ｔ細胞性腫瘍細胞で約１６００ＲＦＵであり、乳がん細胞で約５００ＲＦＵであり、脳腫瘍細胞で約１０００ＲＦＵであった。
ＦＦＴ−２０単独と、ＦＦＴ−１０及びＦＦＴ−２０を両方含む場合とで、乳がん細胞及び脳腫瘍細胞よりもＴ細胞性腫瘍細胞でｍＲＮＡを内包したリポソームが多く取り込まれたことが示唆された。ＦＦＴ−１０単独では、乳がん細胞で取り込まれる量が最も多くなった。
図９及び図１０の結果から、ＦＦＴ−２０単独と、ＦＦＴ−１０及びＦＦＴ−２０を両方含む場合にＴ細胞性腫瘍細胞でより多くのｍＲＮＡを導入できることが明らかとなった。したがって、次の実験においては、ＦＦＴ−２０単独又はＦＦＴ−１０及びＦＦＴ−２０を両方含む脂質粒子について更に評価した。
例２ Ｔ細胞性腫瘍細胞、ＰＢＭＣへの脂質粒子取込量の評価
・脂質粒子の調整
ローダミン−ＰＥ（Ａｖａｎｔｉ（登録商標）社製）と脂質とを含むエタノール溶解脂質溶液に調製した。エタノール溶解脂質溶液の組成を表２に示す。
Figure 2021147353
表２のエタノール脂質溶液を調整後、ルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を含む溶液を添加してピペッティングでよく懸濁した。この溶液に、７倍量の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を添加した後、遠心式の限外ろ過装置（ＡｍｉｃｏｎＴＭＵｌｔｒａ−０．５ｍＬ、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−５０Ｋ、ミリポア）で、溶液の濃縮と１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）への溶液置換をおこなってｍＲＮＡを内包した脂質粒子を得た。脂質粒子に内包されたｍＲＮＡ量は、ＲＮＡ定量システムであるＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒＴＭＲＮＡ（プロメガ）で測定した。
・細胞の調整
例１と同じＴ細胞性腫瘍細胞及びＰＢＭＣを使用した。
ＰＢＭＣ及びＪｕｒｋａｔは、４８ウェル培養プレートに５．０×１０５細胞／５００μＬＴｅｘＭＡＣＳＴＭ培地（ミルテニーバイオテク）で播種した。播種後、ルシフェラーゼｍＲＮＡを内包する脂質粒子を２．０μｇ加えて、ピペッティングでよく混合してから、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内で培養した。２４時間後、培養プレートを取り出して細胞を回収し、細胞への脂質粒子の取込みと、脂質粒子に内包されたｍＲＮＡの発現を調べた。
脂質粒子の細胞への取込み量は、細胞のローダミン蛍光を指標として決定した。細胞のローダミン蛍光は、蛍光活性化セルソーター：ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅＴＭ、ＢＤバイオサイエンス）で測定した。脂質粒子に内包されたルシフェラーゼｍＲＮＡの発現量は、細胞のルシフェラーゼ発光強度を指標として決定した。ルシフェラーゼ発光強度は、ＯＮＥ−ＧｌｏＴＭＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を使用して、ルミノメーター：Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００ＰＲＯ（テカン）で測定した。
・結果
ローダミン蛍光量測定結果を図１１に示す。発光強度は、Ｎｏ．４３（ＦＦＴ−２０単独）の場合ではＴ細胞性腫瘍細胞（Ｊｕｒｋａｔ）で約１３００ＲＦＵであり、ＰＢＭＣで約２５ＲＦＵであった。Ｎｏ．７８では、Ｔ細胞性腫瘍細胞で約７００ＲＦＵであり、ＰＢＭＣで約２０ＲＦＵであった。Ｎｏ．７９では、Ｔ細胞性腫瘍細胞で約５００ＲＦＵであり、ＰＢＭＣで約１５ＲＦＵであった。Ｎｏ．８０では、Ｔ細胞性腫瘍細胞で約１５００ＲＦＵであり、ＰＢＭＣで約１０ＲＦＵであった。
何れの脂質粒子においても、ＰＢＭＣと比較してＴ細胞性腫瘍細胞により多くの脂質粒子が取り込まれたことが分かった。特に、Ｎｏ．４３とＮｏ．７９とは２種の細胞間での取り込まれやすさの差が大きく、良好な特性を有することが分かった。
ルシフェラーゼ発光量測定結果を図１２に示す。発光強度は、Ｎｏ．４３（ＦＦＴ−２０単独）の場合ではＴ細胞性腫瘍細胞で約４００００ＲＬＵであり、ＰＢＭＣで約３００ＲＬＵであった。Ｎｏ．７８では、Ｔ細胞性腫瘍細胞で約２５０００ＲＬＵであり、ＰＢＭＣで約１００ＲＬＵであった。Ｎｏ．７９では、Ｔ細胞性腫瘍細胞で約２７０００ＲＬＵであり、ＰＢＭＣで約６５ＲＬＵであった。Ｎｏ．８０では、Ｔ細胞性腫瘍細胞で約５８０００ＲＬＵであり、ＰＢＭＣで約６４０ＲＬＵであった。
何れの脂質粒子においても、ＰＢＭＣと比較してＴ細胞性腫瘍細胞により多くの脂質粒子が取り込まれたことが分かった。
例３ ｉＣａｓｐａｓｅ ９ ｍＲＮＡ内包脂質粒子のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける評価
・脂質粒子の調整
ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼをコードする遺伝子（以下、「ＮａｎｏＬｕｃＴＭ遺伝子」と称する）（表３、配列番号５）のコーディング配列を含むＲＮＡ（表４、配列番号６）、及びｉＣａｓｐａｓｅ ９遺伝子（表５、配列番号７）のコーディング配列を含むＲＮＡ（表６、配列番号８）をｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ法で合成した後、 ５’末端と３’末端にＣａｐ構造とｐｏｌｙ（Ａ）配列を付加してｍＲＮＡを合成した（ＲＮＡ合成システム、Ｔ７ ｍＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｍＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ、ＣｅｌｌｓｃｒｉｐｔＴＭ）。これらのｍＲＮＡでは、遺伝子コーディング配列の５’末端側にはグロビンリーダー配列が、３’末端側にはポリＡ配列が付加されている。
Figure 2021147353
Figure 2021147353
Figure 2021147353
Figure 2021147353
例２で用いたＮｏ.４３及びＮｏ．７９の脂質粒子を用いて、例２と同様の方法で上記ｉＣａｓｐａｓｅ ９のｍＲＮＡを内包した脂質粒子を調製した。
Ｔ細胞性腫瘍細胞として、ヒト白血病細胞株：Ｊｕｒｋａｔ（ＪＲＣＢ細胞株バンク）とＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ＪＲＣＢ細胞株バンク）とを使用した。また、ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ標識Ｊｕｒｋａｔ細胞は前述のＪｕｒｋａｔ細胞にｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子を導入し作製した。正常血球細胞として、ヒト末梢血単核細胞：ＰＢＭＣ（健常者ドナー由来）を使用した。
４８ウェル培養プレートにＪｕｒｋａｔ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、或いはＰＢＭＣを５×１０５細胞／５００μＬ ＴｅｘＭＡＣＳＴＭ培地（ミルテニーバイオテク）で播種した後、ｉＣａｓｐａｓｅ ９ｍＲＮＡを内包する脂質粒子を２μｇ加えて、ピペッティングでよく混合し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内で培養した。２４時間後、培養プレートを取り出し、細胞死を誘導するウェルには、ＣＩＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｃｅｒ ｏｆ Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）（Ｂ／Ｂ Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｚｅｒ、タカラバイオ）を最終濃度が１０ｎＭとなるように添加した。
ＣＩＤ添加後、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内で細胞の培養を継続し、２４時間後に細胞を回収して、ｉＣａｓｐａｓｅ ９ ｍＲＮＡを内包する脂質粒子とＣＩＤによる細胞死の誘導を調べた。細胞死はフローサイトメトリーで測定した。
・結果
結果を図１３の（ａ）〜（ｃ）に示す。図１３のグラフの縦軸は、培養開始日の腫瘍細胞数を１とした場合の培養後の腫瘍細胞の比を示す。図１３の（ａ）に示す通り、Ｔ細胞性腫瘍細胞Ｊｕｒｋａｔにおいては、Ｎｏ．４３の脂質粒子とＣＩＤを投与した群、及びＮｏ．７９の脂質粒子とＣＩＤを投与した群で腫瘍細胞は顕著に減少し、それぞれ０．０５倍、０．１倍であった。図１３の（ｂ）に示す通り、Ｔ細胞性白血病細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭにおいてもＮｏ．４３の脂質粒子とＣＩＤを投与した群、及びＮｏ．７９の脂質粒子とＣＩＤを投与した群で腫瘍細胞は顕著に減少し、それぞれ０．３倍、０．１倍であった。図１３の（ｃ）に示す通り、ＰＢＭＣにおいては、Ｎｏ．４３の脂質粒子とＣＩＤを投与した群では細胞の減少がほとんど見られなかった（Ｎｏ．７９の脂質粒子とＣＩＤ投与および非投与群についてはデータなし）。加えて、どの細胞を用いた場合も、ｍＲＮＡを脂質粒子に内包しない場合は腫瘍細胞の減少がほとんど見られなかった。
したがって、ｉＣａｓｐａｓｅ ９ ｍＲＮＡを内包したＮｏ．４３及びＮｏ．７９の脂質粒子とＣＩＤを用いることによって、腫瘍細胞を減少させることが可能であることが示された。
例４ ｉＣａｓｐａｓｅ ９ ｍＲＮＡ内包脂質粒子のｉｎ ｖｉｖｏにおける評価
・脂質粒子の調整
例２と同じ方法で、例３に記載したＮａｎｏＬｕｃＴＭのｍＲＮＡを内包したＮｏ．４３脂質粒子（ｎＬｕｃ−４３）、例３に記載したｉＣａｓｐａｓｅ ９のｍＲＮＡを内包したＮｏ．４３脂質粒子（ｉＣａｓ−４３）、及びｉＣａｓｐａｓｅ ９のｍＲＮＡを内包したＮｏ．７９の脂質粒子（ｉＣａｓ−７９）を調製した。
・マウスへの投与と腫瘍量の測定
免疫不全マウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ ＮＳＧマウス）に、３×１０６個／匹のｆｆＬｕｃ標識Ｊｕｒｋａｔ細胞を尾静脈から投与し、投与４日後、１５日後、および２９日後に、例３に記載したＮａｎｏＬｕｃＴＭのｍＲＮＡを内包したＮｏ．４３脂質粒子（ｎＬｕｃ−４３）、例３に記載したｉＣａｓｐａｓｅ ９のｍＲＮＡを内包したＮｏ．４３脂質粒子（ｉＣａｓ−４３）、及びｉＣａｓｐａｓｅ ９のｍＲＮＡを内包したＮｏ．７９の脂質粒子（ｉＣａｓ−７９）を尾静脈から投与した。これらの、ｍＲＮＡ内包脂質粒子の投与１，２および３日後に、５０μｇ／匹のＣＩＤを腹腔内投与した。腫瘍量の評価は、マウスにルシフェリン基質を腹腔内投与し、１０分後にＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いて発光度を測定することで、生体内の腫瘍量を経時的、定量的に評価した。
・結果
結果を図１４に示す。図１４は、各測定日における腫瘍量の平均値を示す。ｎＬｕｃ−４３及びｉＣａｓ−Ｎｏ．４３を投与したマウスでは、２１日目の腫瘍量は約２６０００００（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）であった（ここで、「ｐ」はｐｈｏｔｏｎ、「ｓ」はｓｅｃ、「ｓｒ」はステラジアンの略である）。一方、ｉＣａｓ−７９を投与したマウスでは、２１日目の腫瘍量は約５０００００（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）であり、Ｎｏ．４３を用いた場合と比較して５分の１程度に抑制されていた。
インビボにおいては、インビトロの場合と異なり、脂質粒子が体内の様々な組織、例えば血管等を通してＴ細胞性腫瘍細胞に接触すること、またＴ細胞性腫瘍細胞以外の細胞の存在などが影響して、Ｎｏ．７９とＮｏ．４３との粒子径及び透過性等の違いからこのような結果の差が生じたことが考えられる。
例５ 粒子径の評価
ｍＲＮＡを内包した脂質粒子の粒子径は、ゼータサイザー（ゼータサイザーナノＺＳＰ、マルバーンパナリティカル）で測定した。精製水（大塚製薬）８９０ＬにｍＲＮＡ内包脂質粒子１０μＬを混合し、ゼータサイザーの粒子径測定モードで脂質粒子の粒子径を測定した。表７にＮｏ．４３とＮｏ．７９の粒子径測定の結果を示した。
Figure 2021147353
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
１…脂質粒子、１ａ…第１脂質、１ｂ…第２脂質、
３…目的物質、４…ＲＮＡ、５…核酸凝縮ペプチド、
６…Ｔ細胞性腫瘍細胞、７…細胞、
９…第１信号、１０、２０…物質送達キャリア、１５…診断薬、
Ｓ１、Ｓ１１…接触工程、Ｓ１２…検出工程、Ｓ１３…決定工程。

Claims (22)

  1. Ｔ細胞性腫瘍細胞に目的物質を送達するための組成物であって、
    脂質粒子と、前記脂質粒子に内包された前記目的物質とを備える物質送達キャリアを含み、
    前記脂質粒子は、その構成成分として式（Ｉ）の第１脂質及び式（ＩＩ）の第２脂質を少なくとも含む、組成物。
    Figure 2021147353
  2. 前記脂質粒子の構成成分の組成中、前記第１脂質及び前記第２脂質からなる第１画分における前記第２脂質の配合割合は４０％（モル比）以上である、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記脂質粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、凝集を防止する脂質及びコレステロールのうち少なくとも１種を更に構成成分として含む、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 前記Ｔ細胞性腫瘍細胞を減少又は消滅させるために用いられる、請求項１〜３の何れか１項に記載の組成物。
  5. 対象におけるＴ細胞性腫瘍を治療するために用いられる、請求項１〜３の何れか１項に記載の組成物。
  6. 前記目的物質が、殺細胞遺伝子のｍＲＮＡを含む、請求項１〜５の何れか１項に記載の組成物。
  7. 殺細胞遺伝子は、ｉＣａｓｐａｓｅ ９遺伝子、Ｃａｓｐａｓｅ ９遺伝子、Ｃａｓｐａｓｅ ３遺伝子、Ｃａｓｐａｓｅ ６遺伝子、Ｃａｓｐａｓｅ ７遺伝子、Ｃａｓｐａｓｅ ８遺伝子、Ｃａｓｐａｓｅ １０遺伝子、ｐ５３遺伝子、ＡＲＦ遺伝子、Ｒｂ遺伝子Ｆａｓ遺伝子、ＴＮＦ遺伝子、ＤＲ４遺伝子、ＤＲ５遺伝子、Ｂａｘ遺伝子、Ｂａｋ遺伝子、Ｂｉｍ遺伝子、Ｂｉｄ遺伝子、Ｂａｄ遺伝子、Ｎｏｘａ遺伝子、Ｐｕｍａ遺伝子、 Ｓｍａｃ遺伝子、ＤＩＡＢＬＯ遺伝子及びＨＳＶ−ＴＫ遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記Ｔ細胞性腫瘍細胞を検出するために用いられる、請求項１〜３の何れか１項に記載の組成物。
  9. 対象におけるＴ細胞性腫瘍を診断するために用いられる、請求項１〜３の何れか１項に記載の組成物。
  10. 前記目的物質が、第１信号を生ずる診断薬である、請求項８又は９に記載の組成物。
  11. 前記脂質粒子は、ｐＨ調整剤、浸透圧調整剤及び／又は遺伝子活性化剤を更に内包する、請求項１〜１０の何れか１項に記載の組成物。
  12. 式（Ｉ）の第１脂質及び式（ＩＩ）第２脂質を少なくとも含む脂質混合物を具備する、Ｔ細胞性腫瘍細胞に目的物質を送達するために用いられる脂質粒子製造用キット。
    Figure 2021147353
  13. 前記脂質混合物の組成中、前記第１脂質及び前記第２脂質からなる第１画分における前記第２脂質の配合割合は４０％（モル比）以上である、請求項１２に記載のキット。
  14. 前記目的物質を更に含む請求項１２又は１３に記載のキット。
  15. Ｔ細胞性腫瘍細胞に目的物質を送達する方法であって、
    脂質粒子と、前記脂質粒子に内包された前記目的物質とを備える物質送達キャリアをＴ細胞性腫瘍細胞に接触させる接触工程を含み、
    前記脂質粒子は、その構成成分として式（Ｉ）の第１脂質及び式（ＩＩ）の第２脂質を少なくとも含む物質送達方法。
    Figure 2021147353
  16. 前記目的物質は、殺細胞遺伝子のｍＲＮＡを含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記脂質粒子の構成成分の組成中、前記第１脂質及び前記第２脂質からなる第１画分における前記第２脂質の配合割合は４０％（モル比）以上である、請求項１５又は１６に記載の方法。
  18. 前記接触工程により、前記Ｔ細胞性腫瘍細胞が減少又は消滅する、請求項１５〜１７の何れか１項に記載の方法。
  19. 前記Ｔ細胞性腫瘍細胞は対象の生体内に存在し、
    前記接触工程は、前記物質送達キャリアを前記対象に投与することにより行われ、
    前記接触工程により前記対象のＴ細胞性腫瘍を治療する、
    請求項１５〜１８の何れか１項に記載の方法。
  20. 脂質粒子と、前記脂質粒子に内包された、第１信号を生ずる診断薬とを含む物質送達キャリアを試料細胞に接触させる接触工程、
    前記第１信号を検出する検出工程、及び
    前記検出の結果に基づいて前記試料細胞中のＴ細胞性腫瘍細胞の有無を決定する決定工程
    を含み、
    前記脂質粒子は、その構成成分として式（Ｉ）の第１脂質及び式（ＩＩ）の第２脂質を少なくとも含むＴ細胞性腫瘍細胞の検出方法。
    Figure 2021147353
  21. 前記脂質粒子の構成成分の組成中、前記第１脂質及び前記第２脂質からなる第１画分における前記第２脂質の配合割合は４０％（モル比）以上である、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記試料細胞は、対象の生体内に存在する細胞であり、
    前記検出工程の結果及び／又は前記決定工程の結果に従って、前記対象がＴ細胞性腫瘍を罹患しているか否かを診断する診断工程
    を更に含む、請求項２０又は２２に記載の方法。
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