WO2022158898A1 - Francisella novicida cas9 모듈 기반의 역전사 효소를 사용한 유전체 치환 및 삽입 기술 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Francisella novicida Cas9 모듈 기반의 역전사 효소를 사용한 유전체 치환 및 삽입 기술에 관한 것이다. 본 발명에 따른 유전자 치환 및 삽입 기술은 표적 DNA 내부 non-target strand에 형성되는 nick position이 다르기 때문에 기존 유전체 삽입 및 치환 기술을 확장할 수 있는 장점을 가진다.

Description

FRANCISELLA NOVICIDA CAS9 모듈 기반의 역전사 효소를 사용한 유전체 치환 및 삽입 기술
본 발명은 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) Cas9 모듈 기반의 역전사 효소를 사용한 유전체 치환 및 삽입 기술에 관한 것이다.
CRISPR-Cas9 system은 표적 유전자 염기서열에 따른 DNA binding domain을 매번 새로 만들 필요 없이 가이드 RNA 염기서열만 교체하여 쉽게 활용할 수 있고 제작이 용이하여 표적 유전체 교정시 효과적으로 사용되고 있다.
최근 새롭게 제시된 RT(reverse-transcriptase) 효소 기반 표적 DNA 외부 유전자 삽입 기술 (Prime editing)은 S.pyogene Cas9 (SpCas9) 모듈을 기반으로 작동하나, 비표적 삽입, 다중 유전자 표적의 어려움 등의 단점이 지적되고 있어 많은 개선의 여지를 가지고 있다.
Reverse transcriptase(RT)를 CRISPR-SpCas9 모듈에 결합하여 외부 유전자를 목표 DNA에 삽입하는 prime editing 기술의 경우 기존에 염기 치환 기술로 표적하지 못했던 병원성 mutation (pyrimidine(C,T) 내지 purine(A,G) 또는 purine(A,G) 내지 pyrimidine(C,T) transversion)까지 교정을 할 수 있다는 장점이 있기 때문에, 현재까지 보고된 병원성 돌연변이(mutation)들의 90% 이상 복구가 가능한 것으로 조사되고 있다.
그러나, 질병을 유발하는 많은 mutation 중, singe-gene disorder disease에 비해 polygenic disease가 흔한데, S.pyogene Cas9 기반의 Prime editing만으로는 이의 모든 교정이 쉽지 않다.
즉, 현재 SpCas9을 기반으로 하는 Prime editing 기술은 표적하는 target site가 여러 locus에 존재하게 될 경우 비표적 교정 이슈와 가이드 중복 이슈 때문에 multiple locus targeting이 사실상 어렵다. 또한, SpCas9 기반 Prime editing 기술은 표적 DNA 상의 PAM(NGG) 사이트로부터 3bp 거리에 유전자 삽입 및 치환이 가능하기 때문에 PAM 제한성이 있다는 점을 해소하지 않는 이상 이의 활용 측면에 상당한 제한이 있을 것으로 판단된다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 기존 prime editing 기술을 확장하여 FnCas9 기반의 prime editing 기술을 새롭게 제시하여, 비표적 특이성을 감소시키고 인체 대상 유전자 치료제 개발시 안전성을 증진시킨 새로운 기술을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들은 FnCas9(H969A)이 SpCas9(H840A)과 비교하여 표적 DNA에 nick을 형성하는 위치가 다르기 때문에(FnCas9(H969A)의 경우 PAM 으로부터 6bp 떨어지는 반면, SpCas9(H840A)의 경우 PAM 으로부터 3bp 떨어짐), 기존의 교정 기술보다 유전체 교정이 용이함(유전체 교정 확장성 증가)을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 더욱이, FnCas9이 인식하는 guide RNA scaffold 구조가 SpCas9과 다르기 때문에, FnCas9 기반 prime editing 기술을 기존 SpCas9 기반 prime editing 기술과 동시 적용함으로써 다중 유전자내 각각의 염기서열에 대해 서로 간섭없이 prime editing을 통한 외부 유전자 삽입 또는 치환이 가능하게 할 수 있다. 또한, 신규 FnCas9 모듈 기반 prime editing을 통해 polygenic 유래한 질병의 치료 및 다중 유전자 동시 교정에 응용할 수 있는 multiplexed prime editing 기술을 수행할 수 있다.
이에 본 발명은 Francisella novicida Cas9 단백질;
역전사 효소 단백질; 및
프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 포함하는 프라임 편집 복합체로서, 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)는 연장 아암 (extension arm)을 가지는 프라임 편집 복합체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 Francisella novicida Cas9 단백질; 역전사 효소 단백질; 및 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 포함하는 프라임 편집 복합체를 코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 Francisella novicida Cas9 단백질 및 역전사 효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 Francisella novicida Cas9 단백질 및 역전사 효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 Francisella novicida Cas9 단백질 및 역전사 효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 프라임 편집 복합체 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 Francisella novicida Cas9 단백질 및 역전사 효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 프라임 편집 복합체를 포함하는 유전자 교정용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 Francisella novicida Cas9 단백질 및 역전사 효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 프라임 편집 복합체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 Francisella novicida Cas9 단백질; 역전사 효소 단백질; 및 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 포함하는 프라임 편집 복합체를 포함하는 세포를 제공 하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 핵산 서열을 프라임 편집 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하여 핵산 서열에 치환, 결실, 삽입 또는 이의 조합을 제공하는 방법으로써,
상기 방법은 (i) 이중 가닥 DNA 서열을 표적 가닥 (또는 PAM 가닥) 상에서 닉킹하고, 3' 단부를 갖는 유리 단일 가닥 DNA를 생성하는 것;
(ii) 유리 단일 가닥 DNA의 3' 단부를 가이드 RNA의 프라이머 결합 부위에 혼성화시킴으로써, 폴리머라제를 프라이밍하는 것;
(iii) 3' 단부로부터 DNA의 가닥을 중합시킴으로써, 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA 플랩을 생성하는 것; 및
(iv) 표적 가닥 (또는 PAM 가닥) 상의 절단 부위의 하류에 바로 인접한 내인성 DNA 가닥을 단일 가닥 DNA 플랩으로 대체함으로써, 이중 가닥 DNA 서열에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 제공하는 것을 포함하는 것인, 핵산 서열에 치환, 결실, 삽입 또는 이의 조합을 제공하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 핵산 서열을 프라임 편집 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하여 유전자를 교정하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 핵산 서열을 프라임 편집 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하여 유전자 산물의 발현을 변경시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 핵산 서열을 프라임 편집 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하여 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 질환의 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 Francisella novicida Cas9 단백질; 역전사 효소 단백질; 및
프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 포함하는 프라임 편집 복합체, 또는 프라임 편집 복합체를 코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 이들 폴리뉴클레오티드를 포함하는 1 이상의 벡터 또는 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 (1) Francisella novicida Cas9 단백질; 역전사 효소 단백질; 및
프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 포함하는 프라임 편집 복합체, 또는 프라임 편집 복합체를 코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 이들 폴리뉴클레오티드를 포함하는 1 이상의 벡터 또는 세포, 및 (2) 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 Francisella novicida Cas9 단백질; 역전사 효소 단백질; 및
프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 포함하는 프라임 편집 복합체, 또는 프라임 편집 복합체를 코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 이들 폴리뉴클레오티드를 포함하는 1 이상의 벡터 또는 세포를 포함하는 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
이하 본 발명에 대해 구체적으로 설명한다.
본 발명에 따른 기술은 아래와 같은 특징을 가진다:
1. CRISPR-Cas9 ortholog 중 하나인 FnCas9(Francicella novicida Cas9) 모듈을 사용하여 역전사 효소(reverse transcriptase)를 결합하여 표적 DNA 염기서열에 외부 유전자를 삽입하거나 치환할 수 있는 기술(prime editing)에 해당한다.
2. FnCas9(Francicella novicida Cas9) 모듈을 사용한 외부 유전자 삽입 및 치환 기술 (prime editing)은 기존 SpCas9 에 비하여 표적 DNA 내부 non-target strand 에 형성되는 nick position이 다르기 때문에 기존 유전체 삽입 및 치환 기술을 확장할 수 있다는 장점을 가진다.
3. FnCas9(Francicella novicida Cas9) 모듈을 사용한 외부 유전자 삽입 및 치환 기술 (prime editing)은 기존 SpCas9을 사용한 prime editing 기술보다 비표적 바인딩이 적어 표적 특이성(안전성)이 높아 보다 정확한 prime editing을 수행할 수 있다.
4. FnCas9(Francicella novicida Cas9) prime editor(역전사 효소 결합)와 기존 SpCas9 prime editor를 복합하여 사용시 상호 교차 간섭이 없기 때문에 다중 유전자의 외부 유전자 삽입 및 치환이 용이하다는 장점을 가진다.
5. FnCas9 모듈을 엔지니어링 하여 다양한 PAM 염기서열 인식이 가능하거나 성질을 개선하여 효과적인 FnCas9 prime editor(FnCas9-PE)를 개발할 수 있다.
6. FnCas9(H969A)-PE를 SpCas9 nickase (H840A)와 목표 염기서열에 동시 사용하여 NTS(non-target strand) 와 TS(target strand)에 각각 nick을 생성하여 외부 유전자가 FnCas9-PE에 의하여 삽입되는 효율을 증폭할 수 있다.
본 발명은 Francisella novicida Cas9 단백질;
역전사 효소 단백질; 및
프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 포함하는 프라임 편집 복합체로서, 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)는 연장 아암 (extension arm)을 가지는 프라임 편집 복합체를 제공한다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 본 발명은 Francisella novicida Cas9 단백질;
역전사 효소 단백질; 및
프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 포함하는 프라임 편집 복합체로서,
상기 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)는 프라이머 결합 부위(Primer binding site, PBS), 편집 주형(Scaffold) 및 상동성 아암(extension arm)을 포함하는 것을 제공한다.
프라임 편집
"프라임 편집"은 게놈 편집을 위한 플랫폼으로써 Cas9 단백질을 사용하여 명시된 DNA 부위 내로 새로운 유전자 정보를 직접 기록하는 다목적의 정확한 게놈 편집 방법이며, 여기서 프라임 편집 시스템은 표적 부위를 명시하고 또한 가이드 RNA 상에 (예를 들어, 5' 또는 3' 단부에 또는 가이드 RNA의 내부 부분에) 조작된 연장부 (DNA 또는 RNA)에 의해 대체 DNA 가닥의 형태로 목적하는 편집의 합성의 주형이 되는 프라임 편집 (PE) 가이드 RNA ("PEgRNA")로 프로그램화된다. 목적하는 편집 (예를 들어, 단일 핵염기 치환)을 함유하는 대체 가닥은 편집될 표적 부위의 내인성 가닥과 동일한 서열을 공유한다. DNA 복구 및/또는 복제 기구를 통해, 표적 부위의 내인성 가닥은 목적하는 편집을 함유하는 새로 합성된 대체 가닥에 의해 대체된다. 구체적으로, Cas9 단백질-역전사 효소 단백질을 사용하여 가이드 RNA에 의해 특이적 DNA 서열을 표적화하고, 표적 부위에서 단일 가닥 닉을 생성하고, 닉킹된 DNA를 가이드 RNA와 통합된 역전사 효소 단백질의 역전사를 위한 프라이머로서 사용하는 방식을 이용한다.
프라임 편집은 표적 DNA 분자를 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)와 복합체화된 Francisella novicida Cas9 단백질과 접촉시킴으로써 작동한다
프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)는 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 연장부를 포함하고, 목적하는 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 단일 뉴클레오티드 변화, 삽입 또는 결실)를 코딩한다. Francisella novicida Cas9 단백질/연장된 gRNA 복합체는 DNA 분자와 접촉하고, 연장된 gRNA는 Francisella novicida Cas9 단백질이 표적 유전자좌에 결합하도록 가이드한다.
그리고 나서, 표적 유전자좌의 DNA의 가닥 중 하나에 닉을 도입하여, 표적 유전자좌의 가닥 중 하나에 이용가능한 3' 단부를 생성한다. 다음으로, DNA 가닥의 3' 단부 (닉에 의해 형성됨)는 역전사를 프라이밍하기 위해 (즉, "표적-프라이밍된 RT") 가이드 RNA의 연장된 부분과 상호작용한다. 특정 실시양태에서, 3' 단부 DNA 가닥은 가이드 RNA의 연장된 부분 상의 특이적 RT 프라이밍 서열, 즉 PEgRNA 상의 "역전사 효소 프라이밍 서열" 또는 "프라이머 결합 부위"에 혼성화한다. 다음으로, 프라이밍된 부위의 3' 단부로부터 프라임 편집 가이드 RNA의 5' 단부를 향해 DNA의 단일 가닥을 합성하는 역전사 효소가 도입된다. 이는 목적하는 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 단일 염기 변화, 삽입 또는 결실 또는 그의 조합)를 포함하고, 그 외에는 닉 부위의 또는 그에 인접한 내인성 DNA에 상동인 단일 가닥 DNA 플랩을 형성한다. 그리고 나서, Francisella novicida Cas9 및 가이드 RNA가 방출된다. 마지막으로, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 표적 유전자좌 내로 혼입되도록 하는 단일 가닥 DNA 플랩의 분해에 관한 것이다. 이러한 과정은 3' 단일가닥 DNA 플랩이 내인성 DNA 서열에 침입하고 혼성화하였을 때 형성되는 상응하는 5' 내인성 DNA 플랩을 제거함으로써, 목적하는 생성물 형성을 향해 구동될 수 있다. 이러한 과정은 또한 제2 가닥 닉킹"에 의해 생성물 형성을 향해 구동될 수 있다. 이 과정은 앞서 언급한 전환, 전이, 결실 및 삽입 중 적어도 하나 이상을 도입할 수 있다.
"프라임 편집 (PE) 시스템", "프라임 편집 (PE)" 또는 "PE 시스템"은
Francisella novicida Cas9 단백질, 역전사 효소, 및 프라임 편집 가이드 RNA를 포함하는 복합체, 뿐만 아니라 프라임 편집 과정을 편집된 생성물 형성을 향해 구동시키는 것을 돕기 위한 보조 요소, 예컨대 표적 DNA target-strand (TS)에 닉을 형성하는 제2 가닥 닉킹 성분 (예를 들어, 제2 가닥 sgRNA) 및 5' 내인성 DNA 플랩 제거 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FEN1)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 게놈 편집 방법에 수반되는 조성물을 지칭한다.
예시적으로 아래와 같이 PE 시스템이 구성될 수 있다:
[NLS]-[Francisella novicida Cas9(H969A)]-[링커]-[MMLV_RT(wt)] + 목적하는 PEgRNA
[NLS]-[Francisella novicida Cas9(H969A)]-[링커]-[MMLV_RT(D200N)(T330P)(L603W)(T306K)(W313F)] + 목적하는 PEgRNA
본 발명에서 Francisella novicida Cas9 단백질 및 역전사 효소 단백질이 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)와 복합체화된 경우 표적 DNA 서열에 결합할 수 있다.
본 발명에 따른
PE 시스템은 표적 또는 상보적 비-표적 가닥(non-target strand)이 닉킹되어 유리 3' 말단부를 갖는 프라이밍 서열을 가지는 것일 수 있다. 이러한 닉 부위가 PAM 서열의 5' 말단부로터 6 bp upstream (-6)인 PE 시스템일 수 있다.
본 발명에 따른 프라임 편집기(PE)는 Francisella novicida Cas9 단백질 및 역전사 효소를 포함하는 것을 의미하고 이를 별개로 또는 융합 단백질과 같은 융합 구축물로써 이용할 수 있다. 이는 PEgRNA (또는 "연장된 가이드 RNA")의 존재 하에 표적 뉴클레오티드 서열 상에서 프라임 편집을 수행할 수 있다.
Cas9
용어 "Cas9" 또는 "Cas9 뉴클레아제"는 Cas9 도메인 또는 그의 단편 (예를 들어, Cas9의 활성 또는 불활성 DNA 절단 도메인 및/또는 Cas9의 gRNA 결합 도메인을 포함하는 단백질)을 포함하는 RNA-가이드 뉴클레아제를 지칭한다.
Francisella novicida Cas9 단백질이란 닉카제 활성을 가지는 Francisella novicida 유래 Cas9 또는 이의 기능적 등가물로써 Francisella novicida 유래 뉴클레아제 활성 Cas9, 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9) 또는 Cas9 닉카제 (nCas9)일 수 있다.
뉴클레아제-불활성화된 Cas9 도메인은 상호교환가능하게 "dCas9" 단백질 (뉴클레아제-"기능상실" Cas9의 경우)로 지칭될 수 있다. 불활성 DNA 절단 도메인을 갖는 Cas9 도메인 (또는 그의 단편)을 생성하는 방법은 공지되어 있다.
예를 들어, Francisella novicida에 있어서 돌연변이 H969A는 Francisella novicida Cas9의 뉴클레아제 활성을 완전히 불활성화시킨다. 이에 따라, 본 발명에 따른 Francisella novicida는 모서열로부터 돌연변이 H969A를 포함하는 것으로 Francisella novicida Cas9(H969A)일 수 있다.
보다 구체적으로, Francisella novicida에서 유래하는 Cas9은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
"dCas9" 단백질로서 Francisella novicida Cas9(H969A)는 예를 들어 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 Francisella novicida Cas9은 변경된 PAM 특이성을 가진다. 구체적으로, 표적 DNA에 nick을 형성하는 위치가 PAM 으로부터 6-8bp 떨어진 곳에 발생하기 때문에 유전자 교정의 확장성을 크게 증대시킨다.
본 발명에 따르면 상기 Francisella novicida Cas9은 이의 전장 단백질 서열 또는 이의 단편이 사용될 수 있다. Francisella novicida Cas9 또는 그의 단편을 포함하는 단백질은 "Francisella novicida Cas9 변이체"로 지칭될 수 있으며, 위 언급된 단백질에 대한 상동성을 공유한다.
예를 들어, 서열번호 2의 Francisella novicida Cas9(H969A)에 대하여 적어도 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 96% 동일하거나, 적어도 약 97% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나, 적어도 약 99.8% 동일하거나 또는 적어도 약 99.9% 동일한 것일 수 있다.
본 발명에 따른 Francisella novicida Cas9(H969A)는 HNH 뉴클레아제 도메인 내의 탈활성화 돌연변이를 가지는 것일 수 있다.
"닉카제"는 2개의 뉴클레아제 도메인 중 하나가 불활성화된 Cas9를 지칭한다. 이 효소는 표적 DNA의 한 가닥만을 절단할 수 있다.
역전사 효소(reverse transcriptase. RT) 단백질
역전사 효소"는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제로서 특징화되는 폴리머라제의 부류를 기재한다. 모든 공지된 역전사 효소는 RNA 주형으로부터 DNA 전사체를 합성하기 위한 프라이머를 필요로 한다.
역전사 효소는 주로 mRNA를 cDNA로 전사하는데 사용되어 왔으며, 이는 이어서 추가의 조작을 위해 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 효소는 5'-3' RNA-지시된 DNA 폴리머라제 활성, 5'-3' DNA-지시된 DNA 폴리머라제 활성 및 RNase H 활성을 갖는다.
가이드 RNA와 통합된 RT 주형을 기반으로 하는 단일 가닥 DNA 플랩의 합성 동안, 오류-유발 역전사 효소는 RT 주형 서열과 미스매칭된 1개 이상의 뉴클레오티드를 도입하여, 단일 가닥 DNA 플랩의 오류성 중합을 통해 뉴클레오티드 서열에 변화를 도입할 수 있다. 이어서, 단일 가닥 DNA 플랩의 합성 동안 도입된 이들 오류는 상응하는 내인성 표적 가닥에 대한 혼성화, 내인성 대체된 가닥의 제거, 라이게이션을 통해 및 활성에 있어서 오류-유발성인 특정 역전사 효소의 특성을 지칭한다.
이러한 예시적인 역전사 효소는 예를 들어, 임의의 자연 발생 돌연변이체 RT, 조작된 돌연변이체 RT, 또는 기능을 보유하는 말단 절단된 변이체를 포함한 다른 변이체 RT를 사용할 수 있다.
보다 구체적으로, 역전사 효소는 전형적으로 RNA- 및 DNA-의존성 DNA 중합 활성을 비롯한 3가지 효소적 활성, 및 RNA-DNA 하이브리드에서 RNA의 절단을 촉매하는 RNaseH 활성을 갖는 다기능성 효소이다. 역전사 효소의 일부 돌연변이체는 RNaseH 모이어티를 무력화시켜 mRNA에 대한 의도하지 않은 손상을 방지한다. 주형으로서 mRNA를 사용하여 상보적 DNA (cDNA)를 합성하는 이들 효소가 RNA 바이러스에서 최초로 확인되었다.
후속적으로, 바이러스 입자, 세포 또는 조직으로부터 역전사 효소가 직접 단리 및 정제되었다.
(예를 들어, 문헌 [Kacian et al., 1971, Biochim. Biophys. Acta 46: 365-83; Yang et al., 1972, Biochem. Biophys. Res. Comm. 47: 505-11; Gerard et al., 1975, J. Virol. 15: 785-97; Liu et al., 1977, Arch. Virol. 55 187-200; Kato et al., 1984, J. Virol. Methods 9: 325-39; Luke et al., 1990, Biochem. 29: 1764-69 and Le Grice et al., 1991, J. Virol. 65: 7004-07] 참조, 이들 각각은 참조로 포함됨). 보다 최근에, 열안정성, 충실도 및 활성과 같은 개선된 특성에 대한 연구에서 돌연변이체 및 융합 단백질이 생성되었다.
관련 기술분야에 공지되어 있거나 또는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있는 역전사 효소의 야생형, 변이체, 및/또는 돌연변이체 형태 중 임의의 것이 본원에서 고려된다.
역전사 효소 (RT) 유전자 (또는 그 안에 함유된 유전자 정보)는 다수의 상이한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 유전자는 레트로바이러스로 감염된 진핵 세포로부터, 또는 레트로바이러스 게놈의 부분 또는 전체를 함유하는 다수의 플라스미드로부터 수득될 수 있다. 또한, RT 유전자를 함유하는 메신저 RNA-유사 RNA는 레트로바이러스로부터 수득될 수 있다. RT에 대한 공급원의 예는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MMLV 또는 MLVRT); 인간 T-세포 백혈병 바이러스 유형 1 (HTLV-1); 소 백혈병 바이러스 (BLV); 라우스 육종 바이러스 (RSV); 인간 면역결핍 바이러스 (HIV); 효모, 예컨대 사카로미세스(Saccharomyces), 뉴로스포라 (Neurospora), 드로소필라(Drosophila); 영장류; 및 설치류를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [Weiss, et al., 미국 특허 번호 4,663,290 (1987); Gerard, G. R., DNA:271-79 (1986); Kotewicz, M. L., et al., Gene 35:249-58 (1985); Tanese, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA):4944-48 (1985);
Roth, M. J., et al., J. Biol. Chem. 260:9326-35 (1985); Michel, F., et al., Nature 316:641-43 (1985); Akins, R. A., et al., Cell 47:505-16 (1986), EMBO J. 4:1267-75 (1985); 및 Fawcett, D. F., Cell 47:1007-15 (1986)]을 참조한다 (각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
야생형 RT
M-MLV 역전사 효소 및 RSV 역전사 효소를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 역전사 효소 활성을 갖는 효소는 상업적으로 입수가능하다. 특정 실시양태에서, 역전사 효소는 프라임 편집제 (PE) 시스템의 다른 성분에 트랜스로 제공된다. 즉, 역전사 효소는 개별 성분으로서 발현되거나 또는 달리 제공되며, 즉 napDNAbp와의 융합 단백질로서가 아니다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (M-MLV); 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 역전사 효소 및 조류 육종-백혈증 바이러스 (ASLV) 역전사 효소, 예컨대 비제한적으로 라우스 육종 바이러스 (RSV) 역전사 효소, 조류 골수모구증 바이러스 (AMV) 역전사 효소, 조류 적모구증 바이러스 (AEV) 헬퍼 바이러스 MCAV 역전사 효소, 조류 골수구종증 바이러스 MC29 헬퍼 바이러스 MCAV 역전사 효소, 조류 세망내피증 바이러스 (REV-T) 헬퍼 바이러스 REV-A 역전사 효소, 조류 육종 바이러스 UR2 헬퍼 바이러스 UR2AV 역전사 효소, 조류 육종 바이러스 Y73 헬퍼 바이러스 YAV 역전사 효소, 라우스 연관 바이러스 (RAV) 역전사 효소, 및 골수모구증 연관 바이러스 (MAV) 역전사 효소를 포함하나 이에 제한되지는 않는 야생형 역전사 효소가 본원에 기재된 대상 방법 및 조성물에 적합하게 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
변이체 및 오류-유발 RT
역전사 효소는 RNA 주형으로부터 상보적 DNA (cDNA) 가닥을 합성하는데 필수적이다. 역전사 효소는 상이한 생화학적 활성을 나타내는 별개의 도메인으로 구성된 효소이다. 효소는 하기와 같이 RNA 주형으로부터 DNA의 합성을 촉매한다: 어닐링된 프라이머의 존재 하에, 역전사 효소는 RNA 주형에 결합하여 중합 반응을 개시한다. RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성은 상보적 DNA (cDNA) 가닥을 합성하여, dNTP를 혼입시킨다. RNase H 활성은 DNA:RNA 복합체의 RNA 주형을 분해한다. 따라서, 역전사 효소는 (a) RNA/DNA 하이브리드를 인식하고 이에 결합하는 결합 활성, (b) RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성, 및 (c) RNase H 활성을 포함한다. 또한, 역전사 효소는 일반적으로 그의 열안정성, 프로세싱성 (dNTP 혼입 속도), 및 충실도 (또는 오류율)를 비롯한 다양한 속성을 갖는 것으로 간주된다. 본원에서 고려되는 역전사 효소 변이체는 이들 효소적 활성 (예를 들어, RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성, RNase H 활성, 또는 DNA/RNA 하이브리드-결합 활성) 또는 효소 특성 (예를 들어, 열안정성, 프로세싱성, 또는 충실도) 중 어느 하나 이상에 영향을 미치거나 이를 변화시키는 역전사 효소에 대한 임의의 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 변이체는 관련 기술분야에서 공공 도메인에서 입수가능하거나, 상업적으로 입수가능하거나, 또는 방향적 진화상 과정 (예를 들어, PACE 또는 PANCE)을 포함한 공지된 돌연변이유발 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 역전사 효소는 변이체 역전사 효소일 수 있다. 본원에 사용된 "변이체 역전사 효소"는 참조 서열 (예를 들어, 참조 야생형 서열)에 비해 1개 이상의 돌연변이 (단일 돌연변이, 역위, 결실, 삽입, 및 재배열 포함)를 포함하는 임의의 자연 발생 또는 유전자 조작된 변이체를 포함한다. RT는 자연적으로 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성, 리보뉴클레아제 H 활성, 및 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 비롯한 여러 활성을 갖는다. 집합적으로, 이들 활성은 효소가 단일 가닥 RNA를 이중 가닥 cDNA로 전환시킬 수 있게 한다. 레트로바이러스 및 레트로트랜스포손에서, 이러한 cDNA는 이어서 숙주 게놈 내로 통합될 수 있고, 이로부터 숙주-세포 전사를 통해 새로운 RNA 카피가 제조될 수 있다. 변이체 RT는 이들 활성 중 1종 이상에 영향을 미치는 (이들 활성을 감소 또는 증가시키거나, 또는 이들 활성을 모두 함께 제거하는) 돌연변이를 포함할 수 있다. 또한, 변이체 RT는 RT를 더 안정하게 또는 덜 안정하게 하고, 응집 경향을 낮추고, 정제 및/또는 검출, 및/또는 특성 또는 특징의 다른 변형을 용이하게 하는 1개 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (M-MLV); 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 역전사 효소 및 조류 육종-백혈증 바이러스 (ASLV) 역전사 효소, 예컨대 비제한적으로 라우스 육종 바이러스 (RSV) 역전사 효소, 조류 골수모구증 바이러스 (AMV) 역전사 효소, 조류 적모구증 바이러스 (AEV) 헬퍼 바이러스 MCAV 역전사 효소, 조류 골수구종증 바이러스 MC29 헬퍼 바이러스 MCAV 역전사 효소, 조류 세망내피증 바이러스 (REV-T) 헬퍼 바이러스 REV-A 역전사 효소, 조류 육종 바이러스 UR2 헬퍼 바이러스 UR2AV 역전사 효소, 조류 육종 바이러스 Y73 헬퍼 바이러스 YAV 역전사 효소, 라우스 연관 바이러스 (RAV) 역전사 효소, 및 골수모구증 연관 바이러스 (MAV) 역전사 효소를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 역전사 효소로부터 유래된 변이체 역전사 효소가 본원에 기재된 대상 방법 및 조성물에 적합하게 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
프라임 편집기의 RT는 "오류-유발" 역전사 효소 변이체일 수 있다. 관련 기술분야에 공지되고/거나 이용가능한 오류-유발 역전사 효소가 사용될 수 있다. 역전사 효소는 자연적으로 어떠한 교정 기능도 갖지 않고; 따라서 역전사 효소의 오류율은 교정 활성을 포함하는 DNA 폴리머라제보다 일반적으로 더 높다는 것이 인지될 것이다. 임의의 특정한 역전사 효소의 오류율은 그의 RNA 주형에 대한 DNA의 주형-지정 중합의 정확도를 나타내는 효소의 "충실도"의 특성이다. 고충실도를 갖는 RT는 낮은 오류율을 갖는다. 반대로, 저충실도를 갖는 RT는 높은 오류율을 갖는다. M-MLV-기반 리버스 트랜스크립타제의 충실도는 합성된 15,000 내지 27,000개 뉴클레오티드에서 1개 오류 범위의 오류율을 갖는 것으로 보고되어 있다.
따라서, 본 출원의 목적상, "오류-유발"인 것으로 간주되거나 또는 "오류-유발 충실도"를 갖는 것으로 간주되는 역전사 효소는 합성된 15,000개 뉴클레오티드에서 1개 오류 미만의 오류율을 갖는 것이다.
또한 RNaseH 도메인에서 돌연변이를 갖는 역전사 효소를 고려한다. 상기 언급된 바와 같이, 역전사 효소의 내재적 특성 중 하나는 RNA:cDNA 하이브리드의 RNA 주형을 중합과 동시에 절단하는 RNase H 활성이다. RNase H 활성은 RNA 주형이 전장 역전사의 완료 전에 분해될 수 있기 때문에 긴 cDNA의 합성에 바람직하지 않을 수 있다. RNase H 활성은 또한, 아마도 효소의 폴리머라제 활성과 그의 경쟁으로 인해, 역전사 효율을 저하시킬 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 변형된 RNaseH 활성을 포함하는 임의의 역전사 효소 변이체를 고려한다.
본원의 개시내용은 또한 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 도메인에서 돌연변이를 갖는 역전사 효소를 고려한다. 상기 언급된 바와 같이, 역전사 효소의 내재적 특성 중 하나는 RNA:cDNA 하이브리드의 주형 RNA 가닥에 의해 코딩된 바와 같이 신생 cDNA 가닥 내로 핵염기를 혼입시키는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성이다. RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성은 증가 또는 감소되어 (즉, 그의 혼입 속도의 관점에서) 효소의 프로세싱성을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 비변형된 버전에 비해 효소의 프로세싱성이 증가 또는 감소되도록 변형된 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 임의의 역전사 효소 변이체를 고려한다.
또한, 변경된 열안정성 특징을 갖는 역전사 효소 변이체가 본원에서 고려된다. 역전사 효소가 고온을 견디는 능력은 cDNA 합성의 중요한 측면이다. 상승된 반응 온도는 강한 2차 구조 및/또는 높은 GC 함량을 갖는 RNA를 변성시키는 것을 도와, 역전사 효소가 서열을 따라 판독하도록 한다. 그 결과, 보다 높은 온도에서의 역전사는 전장 cDNA 합성 및 보다 높은 수율을 가능하게 하며, 이는 프라임 편집 과정의 결과로서 3' 플랩 ssDNA의 개선된 생성으로 이어질 수 있다. 야생형 M-MLV 역전사 효소는 전형적으로 37-48℃범위의 최적 온도를 갖지만; 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 및 그 초과를 포함한 48℃초과의 보다 높은 온도에서 역전사 활성을 허용하는 돌연변이가 도입될 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 역전사 효소는 서열번호 3 내지 14으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열을 가지는 것이다. 보다 구체적으로 상기 역전사 효소는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (M-MLV) 역전사 효소이며, 서열번호 3을 가진다.
상기 서열번호 3의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 하기 돌연변이: P51L, S67K, E69K, L139P, T197A, D200N, H204R, F209N, E302K, E302R, T306K, F309N, W313F, T330P, L345G, L435G, N454K, D524G, E562Q, D583N, H594Q, L603W, E607K, 또는 D653N 중 1개 이상을 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 서열은 야생형 M-MLV RT의 변이서열일 수 있으며 구체적으로 서열번호 15의 염기서열을 가지는 것일 수 있다.
융합 단백질
본 발명에 따른 Francisella novicida Cas9 단백질; 및 역전사 효소 단백질은 융합 단백질의 형태로도 제공될 수 있다.
본원에 기재된 프라임 편집제 (PE) 시스템은 Francisella novicida Cas9 단백질; 및 역전사 효소 단백질를 임의로 링커에 의해 연결된 융합 단백질의 형태로 제공할 수 있다.
본원에서 앞서 기재된 Francisella novicida Cas9 단백질과 역전사 효소 단백질의 임의의 예시에 대한 조합이 고려되며, 임의의 링커 서열을 통해 이들이 조합될 수 있다.
링커는 "링커"는 2개의 분자 또는 모이어티, 예를 들어 뉴클레아제의 절단 도메인 및 결합 도메인을 연결하는 화학적 기 또는 분자를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 또는 복수의 아미노산 (예를 들어, 펩티드 또는 단백질)이다. 일부 실시양태에서, 링커는 유기 분자, 기, 중합체, 또는 화학적 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 링커는 5-100개 아미노산 길이, 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-150, 또는 150-200개 아미노산 길이이다. 보다 길거나 보다 짧은 링커가 또한 고려된다.
이와 관련된 예시적인 링커는 GGS (서열번호:16); GGSGGS (서열번호: 17);
GGSGGSGGS (서열식별번호: 18); SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSS (서열번호: 19); SGSETPGTSESATPES (서열번호: 20) 를 예시적으로 들 수 있다.
또한, 필요에 따라 본 발명에 따른 융합 단백질은 세포 핵으로의 단백질의 전위를 촉진하기 위한 핵 위치화 신호(Nucleus localization signal, NLS)를 포함할 수 있다.
NLS는 관련 기술분야의 임의의 공지된 NLS 서열일 수 있다. NLS는 또한 핵 국재화를 위한 임의의 추후-발견될 NLS일 수 있다. NLS는 또한 임의의 자연 발생 NLS, 또는 임의의 비-자연 발생 NLS (예를 들어, 1개 이상의 목적하는 돌연변이를 갖는 NLS)일 수 있다.
이러한 예시적인 서열은 PKKKRKV (서열번호: 21), MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC (서열번호: 22) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)
가이드 RNA는 대부분 통상적으로 Cas9 단백질과 회합되고 Cas9 단백질을 가이드 RNA의 프로토스페이서 서열에 대한 상보성을 포함하는 DNA 분자 내의 특이적 서열로 지시하는 가이드 핵산의 특정한 유형이다.
본원에 사용된 "프라임 편집 가이드 RNA" (또는"PEgRNA")는 연장 아암(arm)을 가질 수 있다.
연장 아암(arm)은 프라이머 결합 부위 및 폴리머라제 (예를 들어, 역전사 효소)를 통해 관심 유전적 변화를 함유하는 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하는 DNA 합성 주형 서열을 포함하는, PEgRNA의 3' 단부 또는 5' 단부에서의 단일 가닥 연장부, 이는 이어서 상응하는 내인성 가닥을 대체함으로써 내인성 DNA 내로 통합되어, 목적하는 유전적 변화를 제공할 수 있다.
특히, 연장 아암은 프라이머 결합 서열, 상동성 아암, 편집 주형을 가질 수 있다. 프라이머 결합 부위는 프라임 편집제 복합체에 의해 닉킹될 때 표적 부위의 내인성 DNA 가닥으로부터 형성된 프라이머 서열에 결합하여, 내인성 닉킹된 가닥 상의 3' 단부를 노출시킨다.
편집 주형은 작게는 단일 뉴클레오티드 치환일 수 있거나, 또는 DNA의 삽입 또는 역위일 수 있다. 추가로, 편집 주형은 또한 결실을 포함할 수 있으며, 이는 목적하는 결실을 함유하는 상동성 아암을 코딩함으로써 조작될 수 있다.
"상동성 아암"은 내인성 가닥을 대체함으로써 표적 DNA 부위 내로 통합될, 생성된 역전사 효소-코딩된 단일 가닥 DNA 플랩의 부분을 코딩하는 연장 아암의 부분을 지칭한다. 상동성 아암에 의해 코딩되는 단일 가닥 DNA 플랩의 부분은 표적 DNA 서열의 비-편집된 가닥에 상보적이며, 이는 내인성 가닥의 대체 및 그 자리에서의 단일 가닥 DNA 플랩의 어닐링을 용이하게 함으로써, 편집을 설치한다. 이 성분은 다른 곳에 추가로 정의된다. 상동성 아암은 정의에 의해 본원에 기재된 프라임 편집기의 폴리머라제에 의해 코딩되기 때문에 DNA 합성 주형의 일부이다.
본원에 사용된 "프라임 편집 가이드 RNA" (또는"PEgRNA")는 연장 아암에 더하여 하기 구성요소 중 적어도 하나 이상을 더 포함할 수 있다
스페이서 서열 - 표적 DNA 내의 프로토스페이서에 결합하는 PEgRNA 내의 서열 (약 20개 nt 길이를 가짐).
gRNA 코어 (또는 gRNA 스캐폴드 또는 백본 서열) - Cas9 결합을 담당하는 gRNA 내의 서열을 지칭하며, 이는 Cas9를 표적 DNA로 가이드하는데 사용되는 20 bp 스페이서/표적화 서열을 포함하지 않음.
전사 종결인자 - 가이드 RNA 또는 PEgRNA는 분자의 3'에 전사 종결 서열을 포함할 수 있음.
프라임 편집 가이드 RNA" 또는 "PEgRNA"는 본원에 기재된 프라임 편집 방법 및 조성물을 구현하기 위한 1개 이상의 추가의 서열을 포함하도록 변형된 특수화된 형태의 가이드 RNA를 지칭한다.
본원에 기재된 바와 같이, 프라임 편집 가이드 RNA는 핵산 서열의 1개 이상의 "연장된 영역" 을 포함한다. 연장된 영역은 단일 가닥 RNA 또는 DNA를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 추가로, 연장된 영역은 전통적인 가이드 RNA의 3' 단부에서 발생할 수 있다. 다른 배열에서, 연장된 영역은 전통적인 가이드 RNA의 5' 단부에서 발생할 수 있다. 또 다른 배열에서, 연장된 영역은 전통적인 가이드 RNA의 분자내 영역에서, 예를 들어 Cas9에 회합 및/또는 결합하는 gRNA 코어 영역에서 발생할 수 있다. 연장된 영역은 (a) 편집될 내인성 표적 DNA와 상동이도록 설계되었고, (b) 내인성 표적 DNA 내로 도입 또는 통합될 적어도 1개의 목적하는 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 전이, 전환, 결실 또는 삽입)를 포함하는 단일 가닥 DNA를 (프라임 편집제의 폴리머라제에 의해) 코딩하는 "DNA 합성 주형"을 포함한다. 연장된 영역은 또한 다른 기능적 서열 요소, 예컨대 비제한적으로 "프라이머 결합 부위" 및 "스페이서 또는 링커" 서열, 또는 다른 구조적 요소, 예컨대 비제한적으로 압타머, 스템 루프, 헤어핀, 토루프 (예를 들어, 3' 토루프) 또는 RNA-단백질 동원 도메인 (예를 들어, MS2 헤어핀)을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "프라이머 결합 부위"는 R-루프의 닉킹된 DNA로부터 생성된 3' 단부를 갖는 단일 가닥 DNA 서열에 혼성화하는 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, PEgRNA는 5' 연장 아암, 스페이서 및 gRNA 코어를 갖는 PEgRNA를 보여준다. 5' 연장부는 5'에서 3' 방향으로 역전사 효소 주형, 프라이머 결합 부위 및 링커를 추가로 포함한다.
특정의 다른 실시양태에서, PEgRNA는 5' 연장 아암, 스페이서 및 gRNA 코어를 갖는 PEgRNA를 보여준다. 5' 연장부는 5'에서 3' 방향으로 역전사 효소 주형, 프라이머 결합 부위 및 링커를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, PEgRNA는 5'에서 3' 방향으로 스페이서 (1), gRNA 코어 (2) 및 연장 아암 (3)을 갖는 PEgRNA를 보여준다. 연장 아암 (3)은 PEgRNA의 3' 단부에 있다. 연장 아암 (3)은 5'에서 3' 방향으로 "프라이머 결합 부위" (A), "편집 주형" (B) 및 "상동성 아암" (C)을 추가로 포함한다. 연장 아암 (3)은 또한 3' 및 5' 단부에, 동일한 서열 또는 상이한 서열일 수 있는 임의적인 변형제 영역을 포함할 수 있다. 추가로, PEgRNA의 3' 단부는 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. PEgRNA의 이들 서열 요소는 본원에 추가로 기재되고 정의된다.
또 다른 실시양태에서, PEgRNA는 5'에서 3' 방향으로 연장 아암 (3), 스페이서 (1) 및 gRNA 코어 (2)를 갖는 PEgRNA를 보여준다. 연장 아암 (3)은 PEgRNA의 5' 단부에 있다. 연장 아암 (3)은 3'에서 5' 방향으로 "프라이머 결합 부위" (A), "편집 주형" (B) 및 "상동성 아암" (C)을 추가로 포함한다. 연장 아암 (3)은 또한 3' 및 5' 단부에, 동일한 서열 또는 상이한 서열일 수 있는 임의적인 변형제 영역을 포함할 수 있다. PEgRNA는 또한 3' 단부에 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. PEgRNA의 이들 서열 요소는 본원에 추가로 기재되고 정의된다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 가이드 RNA는 ~20개의 nt 프로토스페이서 서열 및 Cas9과 결합하는 gRNA 코어 영역을 포함한다. 가이드 RNA는 5' 단부에 연장된 RNA 절편, 즉 5' 연장부를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 5' 연장부는 역전사 주형 서열, 역전사 프라이머 결합 부위, 및 임의적인 5-20개의 뉴클레오티드 링커 서열을 포함한다. RT 프라이머 결합 부위는 R-루프의 비-표적 가닥에 닉이 형성된 후에 형성된 유리 3' 단부에 혼성화하여, 역전사 효소의 5'-3' 방향으로의 DNA 중합을 프라이밍한다.
본 발명의 다른 실시양태에 다르면, 가이드 RNA는 ~20개의 nt 프로토스페이서 서열 및 Cas9와 결합하는 gRNA 코어를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 가이드 RNA는 3' 단부에 연장된 RNA 절편, 즉 3' 연장부를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 3' 연장부는 역전사 주형 서열, 및 역전사 프라이머 결합 부위를 포함한다.
RT 프라이머 결합 부위는 R-루프의 비-표적 가닥에 닉이 형성된 후에 형성된 유리 3' 단부에 혼성화하여, 역전사 효소의 5'-3' 방향으로의 DNA 중합을 프라이밍한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, 가이드 RNA는 ~20개의 nt 프로토스페이서 서열 및 Cas9와 결합하는 gRNA 코어를 포함한다. 가이드 RNA는 gRNA 코어 내의 분자간 위치에서 연장된 RNA 절편, 즉 분자내 연장부를 포함한다. 분자내 연장부는 역전사 주형 서열, 및 역전사 프라이머 결합 부위를 포함한다. RT 프라이머 결합 부위는 R-루프의 비-표적 가닥에 닉이 형성된 후에 형성된 유리 3' 단부에 혼성화하여, 역전사 효소의 5'-3' 방향으로의 DNA 중합을 프라이밍한다.
RNA 연장부의 길이는 임의의 유용한 길이일 수 있다. 다양한 실시양태에서, RNA 연장부는 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 50개 뉴클레오티드, 적어도 60개 뉴클레오티드, 적어도 70개 뉴클레오티드, 적어도 80개 뉴클레오티드, 적어도 90개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드, 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드, 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이이다.
RT 주형 서열은 또한 임의의 적합한 길이일 수 있다. 예를 들어, RT 주형 서열은 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 50개 뉴클레오티드, 적어도 60개 뉴클레오티드, 적어도 70개 뉴클레오티드, 적어도 80개 뉴클레오티드, 적어도 90개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드, 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드, 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 역전사 프라이머 결합 부위 서열은 적어도 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 50개 뉴클레오티드, 적어도 60개 뉴클레오티드, 적어도 70개 뉴클레오티드, 적어도 80개 뉴클레오티드, 적어도 90개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드, 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드, 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이이다.
다른 실시양태에서, 임의적인 링커 또는 스페이서 서열은 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 50개 뉴클레오티드, 적어도 60개 뉴클레오티드, 적어도 70개 뉴클레오티드, 적어도 80개 뉴클레오티드, 적어도 90개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드, 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드, 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이이다.
RT 주형 서열은 비-표적 가닥에 상동성이지만 (따라서, 표적 가닥의 상응하는 부위에 상보성이지만), 1개 이상의 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA 분자를 코딩한다. 적어도 1개의 뉴클레오티드 변화는 1개 이상의 단일-염기 뉴클레오티드 변화, 1개 이상의 결실, 및 1개 이상의 삽입을 포함할 수 있다.
RT 주형 서열의 합성된 단일 가닥 DNA 생성물은 비-표적 가닥과 상동성이고, 1개 이상의 뉴클레오티드 변화를 함유한다. RT 주형 서열의 단일 가닥 DNA 생성물은 상보적 표적 가닥 서열과 평형 상태로 혼성화하여, 상동 내인성 표적 가닥 서열을 대체한다. 대체된 내인성 가닥은 일부 실시양태에서 5' 내인성 DNA 플랩 종으로 지칭될 수 있다. 이러한 5' 내인성 DNA 플랩 종은 5' 플랩 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FEN1)에 의해 제거될 수 있고, 이제 내인성 표적 가닥에 혼성화된 단일 가닥 DNA 생성물은 라이게이션되어 내인성 서열과 새로 합성된 가닥 사이에 미스매치를 생성할 수 있다. 미스매치는 세포의 선천성 DNA 복구 및/또는 복제 과정에 의해 분해될 수 있다.
연장된 가이드 RNA의 다양한 실시양태에서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구는 목적하는 뉴클레오티드 변화의 설치를 발생시켜, 목적하는 생성물을 형성한다.
또 다른 실시양태에서, 목적하는 뉴클레오티드 변화는 닉 부위의 약 -5 내지 약 +5 사이, 또는 닉 부위의 약 -10 내지 약 +10 사이, 또는 닉 부위의 약 -50 내지 약 +50 사이에 편집 윈도우를 설치하고 이의 편집을 목적한다.
특히, 본원 발명에 따른 프라임 에디팅 기술은 기존 프라임 에디터와 비교하여 6-8bp 앞의 nicking 효과가 큰 장점을 이용하여 편집을 목적할 수 있다.
가이드 서열은 임의의 표적 서열을 표적화하도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 세포의 게놈 내의 서열이다.
PEgRNA는 5'에서 3' 방향으로 정렬된 3개의 주요 성분 요소, 즉 스페이서, gRNA 코어, 및 3' 단부의 연장 아암을 포함한다. 연장 아암은 5'에서 3' 방향으로 하기 구조적 요소, 즉: 프라이머 결합 부위 (A), 편집 주형 (B), 및 상동성 아암 (C)으로 추가로 나뉠 수 있다.
PEgRNA는 5'에서 3' 방향으로 정렬된 3개의 주요 성분 요소, 즉 스페이서, gRNA 코어, 및 3'단부의 연장 아암을 포함한다. 연장 아암은 5'에서 3' 방향으로 하기 구조적 요소, 즉: 프라이머 결합 부위(A), 편집 주형 (B), 및 상동성 아암 (C)으로 추가로 나뉠 수 있다.
프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)가 서열번호 23의 Francisella novicida Cas9(H969A) 결합 서열을 포함하는 것일 수 있다. 이러한 Francisella novicida Cas9(H969A) 결합 서열은 상기 서열번호 23를 기초로 하여 적어도 약 96% 동일하거나, 적어도 약 97% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나, 적어도 약 99.8% 동일하거나 또는 적어도 약 99.9% 동일한 것으로, Francisella novicida Cas9(H969A) 결합을 나타내는 서열을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 Francisella novicida Cas9 단백질; 역전사 효소 단백질; 및 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 포함하는 프라임 편집 복합체를 코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
보다 구체적으로, Francisella novicida Cas9 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 일실시양태에 따르면, 이러한 서열은 예를 들어 서열번호 24의 염기서열을 가질 수 있다.
역전사 효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 일실시양태에 따르면, 이러한 서열은 예를 들어 서열번호 25의 염기서열을 가질 수 있다.
프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. Francisella novicida Cas9 단백질; 및 역전사 효소 단백질을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 일실시양태에 따르면, 이러한 서열은 예를 들어 서열번호 26의 염기서열을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 또한 Francisella novicida Cas9 단백질 및 역전사 효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 프라이머 결합 부위, 편집 주형 및 상동성 아암을 포함하는 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명의 일실시양태에 따른 벡터의 개략적인 모식도를 도 2에 나타내었다. 구체적으로, SV40 NLS-FnCas9(H969A) nickase-linker- M-MLV RT를 이어서 융합 단백질을 제조할 수 있는 벡터를 제조하였다.
본 발명은 또한 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
재조합 벡터는 상기 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "프로모터"는 폴리머라아제와 결합되고, 다운스트림(3' 방향) 코딩 또는 비-코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다.
본 발명에서 사용되는 용어, "작동가능하게 연결된"은 유전자 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열사이의 기능적인 결합(cis)을 의미한다. 상기 유전자 발현 조절 서열은 복제원점(replication origin), 프로모터, 전사 종결 서열(terminator) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 프로모터는 특정 유전자의 전사 개시를 조절하는 전사 조절 서열 중 하나로, 통상적으로 약 100bp 내지 약 2500bp 길이의 폴리뉴클레오티드 단편일 수 있다.
상기 프로모터는 세포, 예를 들어, 진핵 세포(예를 들어, 식물 세포, 또는 동물 세포(예를 들어, 인간, 마우스 등의 포유류 세포 등) 등)에서 전사 개시를 조절할 수 있으면, 제한 없이 사용 가능하다. 예를 들어, 상기 프로모터는 CMV 프로모터(cytomegalovirus promoter;예를 들어, 인간 또는 마우스 CMV immediate-early 프로모터), U6 프로모터, EF1-alpha(elongation factor 1-a) 프로모터, EF1-alpha short(EFS) 프로모터, SV40 프로모터, 아데노바이러스 프로모터(major late promoter), pL λ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, HSV의 tk 프로모터, SV40E1 프로모터, 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory syncytial virus; RSV) 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터(metallothionin promoter), β-액틴 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 인간 IL-2(human interleukin-2) 유전자 프로모터, 인간 림포톡신(human lymphotoxin) 유전자 프로모터, 인간 GM-CSF(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor) 유전자 프로모터 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 프로모터는 CMV immediate-early 프로모터, U6 프로모터, EF1-alpha(elongation factor 1-a) 프로모터, EF1-alpha short(EFS) 프로모터 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 전사 종결 서열은 폴리아데닐화 서열(pA) 등일 수 있다. 상기 복제 원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, BBV 복제원점 등일 수 있다.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 사용되는 플라스미드(예를 들면, pcDNA 시리즈, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 등), 파지(예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, M13 등) 또는 바이러스 벡터(예를 들면, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 등) 등을 기본으로 하여 제작될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 발현벡터의 제작은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 유전체 교정용 조성물을 분리된 세포 또는 유기체에 도입하는 단계를 포함하는 형질 전환체의 제조 방법을 제공한다. 여기서 상기 유기체는 인간을 제외할 수 있다.
본 발명의 유전체 교정용 조성물은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 당 분야에서 공지된 방법에 의해 세포 또는 유기체에 도입될 수 있으며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온성 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 Francisella novicida Cas9 단백질; 역전사 효소 단백질; 및 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 포함하는 프라임 편집 복합체를 포함하는 세포를 제공한다.
본원에 기재된 조성물 중 임의의 것을 함유할 수 있는 세포는 원핵 세포 및 진핵 세포를 포함한다. 본원에 기재된 방법은 Cas9 단백질, 프라임 편집제, 및 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA) 또는 프라임 편집 복합체 시스템을 진핵 세포 (예를 들어, 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포) 내로 전달하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 세포는 시험관내의 것 (예를 들어, 배양된 세포)이다. 일부 실시양태에서, 세포는 생체내 (예를 들어, 대상체, 예컨대 인간 대상체 내)의 것이다. 일부 실시양태에서, 세포는 생체외의 것 (예를 들어, 대상체로부터 단리되고, 동일한 또는 상이한 대상체에게 다시 투여될 수 있는 것)이다.
본 개시내용의 포유동물 세포는 인간 세포, 영장류 세포 (예를 들어, 베로 세포), 래트 세포 (예를 들어, GH3 세포, OC23 세포) 또는 마우스 세포 (예를 들어, MC3T3 세포)를 포함한다. 제한 없이, 인간 배아 신장 (HEK)세포, HeLa 세포, 국립 암 연구소의 60 암 세포주 (NCI60)로부터의 암 세포, DU145 (전립선암) 세포, Lncap (전립선암) 세포, MCF-7 (유방암) 세포, MDA-MB-438 (유방암) 세포, PC3 (전립선암) 세포, T47D (유방암) 세포, THP-1 (급성 골수성 백혈병) 세포, U87 (교모세포종) 세포, SHSY5Y 인간 신경모세포종 세포 (골수종으로부터 클로닝됨) 및 Saos-2 (골암) 세포를 포함한 다양한 인간 세포주가 존재한다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 인간 배아 신장 (HEK) 세포 (예를 들어, HEK 293 또는 HEK 293T 세포) 내로 전달된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 줄기 세포 (예를 들어, 인간 줄기 세포), 예컨대, 예를 들어, 만능 줄기 세포 (예를 들어, 인간 유도된 만능 줄기 세포 (hiPSC)를 포함한 인간 만능 줄기 세포) 내로 전달된다. 줄기 세포는 배양 시 무한 기간 동안 분열하고 특화 세포를 생성하는 능력을 갖는 세포를 지칭한다. 만능 줄기 세포는 유기체의 모든 조직으로 분화할 수 있지만, 단독으로는 완전한 유기체 발생을 지속할 수 없는 줄기 세포의 유형을 지칭한다. 인간 유도된 만능 줄기 세포는 배아 줄기 세포의 정의 특성을 유지하는데 중요한 유전자 및 인자를 발현하도록 강제됨으로써 배아 줄기 세포-유사 상태로 재프로그램화된 체세포 (예를 들어, 성숙 또는 성체)를 지칭한다. 인간 유도된 만능 줄기 세포 세포는 줄기 세포 마커를 발현하고, 모든 3가지 배엽층 (외배엽, 내배엽, 중배엽)의 세포 특징을 생성할 수 있다.
본 발명은 또한 Francisella novicida Cas9 단백질 및 역전사 효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 프라임 편집 복합체 시스템을 제공한다.
본 발명은 또한 Francisella novicida Cas9 단백질 및 역전사 효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 프라임 편집 복합체 시스템을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 프라임 편집 복합체 시스템은 폴리뉴클레오티드, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 1개 이상의 벡터, 그의 1개 이상의 전사체, 및/또는 그로부터 전사된 1개 이상의 단백질을 숙주 세포에 전달하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 이러한 방법에 의해 생산된 세포, 및 이러한 세포를 포함하거나 또는 그로부터 생산된 유기체 (예컨대 동물, 식물, 또는 진균)를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 가이드 서열과 조합된 (및 임의로 그와 복합체화된) 본원에 기재된 바와 같은 염기 편집제가 세포에 전달된다.
제공된 전달 방법은 뉴클레오펙션, 미세주사, 바이오리스틱, 비로솜, 리포솜, 이뮤노리포솜, 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 DNA의 작용제-증진된 흡수를 포함한다.
본 발명은 또한 핵산 서열을 프라임 편집 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하여 핵산 서열에 치환, 결실, 삽입 또는 이의 조합을 제공하는 방법으로써,
상기 방법은 (i) 이중 가닥 DNA 서열을 표적 가닥 (또는 PAM 가닥) 상에서 닉킹하고, 3' 단부를 갖는 유리 단일 가닥 DNA를 생성하는 것;
(ii) 유리 단일 가닥 DNA의 3' 단부를 가이드 RNA의 프라이머 결합 부위에 혼성화시킴으로써, 폴리머라제를 프라이밍하는 것;
(iii) 3' 단부로부터 DNA의 가닥을 중합시킴으로써, 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA 플랩을 생성하는 것; 및
(iv) 표적 가닥 (또는 PAM 가닥) 상의 절단 부위의 하류에 바로 인접한 내인성 DNA 가닥을 단일 가닥 DNA 플랩으로 대체함으로써, 이중 가닥 DNA 서열에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 제공하는 것을 포함하는 것인, 핵산 서열에 치환, 결실, 삽입 또는 이의 조합을 제공하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
위와 같은 프라임 편집 복합체의 사용은 프라임 편집의 전반적 메커니즘을 보여주며, 이를 통해 하나 이상의 유전자의 변화, 전환, 전이, 결실 또는 삽입과 같은 목표를 달성할 수 있다.
또한, 사용하는 목적에 따라 오류-유발 RT와 함께 프라임 편집을 사용한 돌연변이유발을 할 수 있으며, 트리플렛 확장 장애를 치료하기 위한 프라임 편집을 사용할 수 있으며, 펩티드 태그부착을 위한 프라임 편집을 사용할 수 있으며, RNA 태그부착을 위한 프라임 편집을 사용할 수 있으며, 정교한 유전자 라이브러리의 생성을 위한 프라임 편집을 위해 프라임 편집을 사용할 수 있으며, 이뮤노에피토프의 삽입을 위한 프라임 편집을 사용할 수 있으며, 비편향 방식으로 오프-타겟 편집을 확인하기 위한 프라임 편집을 사용할 수 있으며, 유도성 이량체화 도메인의 삽입을 위한 프라임 편집을 사용할 수 있으며, 세포 데이터 기록을 위한 프라임 편집을 사용할 수 있으며, 생체분자 활성을 조정하기 위한 프라임 편집을 사용할 수 있으며, 레콤비나제 표적 부위를 삽입하기 위한 프라임 편집을 사용할 수 있는 등의 다양한 활용 방법에 따라 이의 사용을 목적할 수 있다.
이러한 예시는 WO 2020/191234에 나열된 활용방법에 관한 예시들을 포함한다.
본 발명은 또한 핵산 서열을 프라임 편집 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하여 유전자를 교정하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 유전자 교정은 진핵 유기체에 적용될 수 있다. 상기 진핵 유기체는 진핵 세포(예를 들어, 효모 등의 균류, 진핵 동물 및/또는 진핵 식물 유래 세포(예를 들어, 배아세포, 줄기세포, 체세포, 생식세포 등) 등), 진핵 동물(예를 들어, 척추동물 또는 무척추동물, 보다 구체적으로, 인간, 원숭이 등의 영장류, 개, 돼지, 소, 양, 염소, 마우스, 래트 등을 포함하는 포유류 등), 및 진핵 식물(예를 들어, 녹조류 등의 조류, 옥수수, 콩, 밀, 벼 등의 단자엽 또는 쌍자엽 식물 등)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 핵산 서열을 프라임 편집 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하여 유전자 산물의 발현을 변경시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 핵산 서열을 프라임 편집 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하여 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 질환의 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
이러한 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 질환의 치료 방법은 편집 시스템에 의해 교정될 수 있는 점 돌연변이 또는 다른 돌연변이 (예를 들어, 결실, 삽입, 역위, 중복 등)와 연관되거나 그에 의해 유발된 질환으로 진단된 대상체의 치료 방법을 제공하는 것을 의미할 수 있다.
실질적으로 임의의 질환-유발 유전적 결함은 프라임 편집을 사용함으로써 복구될 수 있으며, 이는 적절한 프라임 편집제 융합 단백질을 선택하는 것, 및 (a) 편집 부위를 함유하는 적절한 표적 DNA를 표적화하고, (b) 닉 부위의 바로 하류의 내인성 가닥을 치환 및 대체하는 목적하는 편집을 포함하는, 닉 부위의 3' 단부로부터의 DNA의 단일 가닥의 합성을 위한 주형을 제공하도록 설계된 적절한 PEgRNA를 설계하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 Francisella novicida Cas9 단백질; 역전사 효소 단백질; 및
프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 포함하는 프라임 편집 복합체, 또는 프라임 편집 복합체를 코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 교정용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 Francisella novicida Cas9 단백질; 역전사 효소 단백질; 및
프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 포함하는 프라임 편집 복합체, 또는 프라임 편집 복합체를 코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) Francisella novicida Cas9 단백질; 역전사 효소 단백질; 및
프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 포함하는 프라임 편집 복합체, 또는 프라임 편집 복합체를 코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드, 및 (2) 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 Francisella novicida Cas9 단백질; 역전사 효소 단백질; 및
프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 포함하는 프라임 편집 복합체, 또는 프라임 편집 복합체를 코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
이러한 대상체에서 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 질환을 예방, 개선 또는 치료를 위한 질환은 예를 들어 유전 질환, 비유전 질환, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 암, 또는 자가 면역 질환을 포함한다.
여기서, 유전 질환"은 게놈에서 하나 이상의 이상, 특히 출생시 존재하는 상태에 의해 부분적으로 또는 전적으로, 직접적으로 또는 간접적으로 유발되는 질환을 지칭한다. 이상은 돌연변이, 삽입 또는 결실일 수 있다. 이상은 유전자의 코딩 서열 또는 이의 조절 서열에 영향을 줄 수 있다. 유전 질환은 DMD, 혈우병, 낭포성 섬유증, 헌팅턴 무도병, 가족성 고콜레스테롤혈증 (LDL 수용체 결함), 간모세포종, 윌슨병(Wilson's disease), 선천성 간성 포르피린증, 간 대사의 유전성 장애, 레쉬 니한 증후군(Lesch Nyhan syndrome), 겸상 적혈구 빈혈, 지중해빈혈, 색소피부건조증, 판코니 빈혈(Fanconi's anemia), 망막색소변성증, 모세혈관확장성 실조증, 블룸 증후군(Bloom's syndrome), 망막모세포종 및 테이-삭스병(Tay-Sachs disease)일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
비유전 질환 타겟은 변이된 유전자 이외 정상 유전자를 조절하여 질병을 치료하는 것으로, 대표적으로 노인성 황반 변성(AMD)일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
여기서, 바이러스, 박테리아 감염, 또는 이들에 의한 질환은 에이즈, 조류독감, 독감, CMV 감염질환, 결핵 또는 나병 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
여기서, 암은 방광암, 골암, 혈액암, 유방암, 흑색종양, 갑상선암, 부갑상선암, 골수암, 직장암, 인후암, 후두암, 폐암, 식도암, 췌장암, 대장암, 위암, 설암, 피부암, 뇌종양, 자궁암, 두부 또는 경부암, 담낭암, 구강암, 결장암, 항문 부근암, 중추신경계 종양, 간암 및 대장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
여기서, 자가 면역 질환은 제1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 셀리악 병(Celiac disease-sprue), IgA 결핍(IgA deficiency), 크론병(Crohn's disease), 다발성 경화증, 전신성 홍반성 낭창, 쇼그렌 증후군, 피부 경화증, 다발성 근염, 만성 활동성간염, 혼합 결체 조직 질환, 원발성 담즙성 간경변, 악성 빈혈, 자가면역 갑상선염, 특발성 에디슨 병, 백반, 글루텐 감수성 장병증, 그레이브병, 중증 근무력증, 자가면역성 호중구 감소증, 특발성 혈소판 감소 자반증, 간경변증, 심상성천포창, 자가면역 불임증, 구드패스츄어 증후군, 수포성 유천포창, 원판상 홍반 루푸스, 궤양성 대장염 또는 고밀도 침착병 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
상기 내용에 있어서, 치료는 질환 또는 병태에 대해 양성 치료 반응을 제공한다. "양성 치료 반응"이란 질환 또는 병태의 개선, 및/또는 질환 또는 병태와 관련된 증상의 개선으로 의도된다.
상기 증상의 개선은 유효량, 또는 치료학적 유효량의 유전체 교정용 조성물의 투여를 포함한다. "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 유리하거나 목적하는 결과를 가져오기에 충분한 제제의 양을 가리킨다. 치료학적 유효량은 다음 중의 하나 이상에 따라 달라질 수 있다: 대상체 및 치료되는 질환 상태, 대상체의 체중 및 연령, 질환 상태의 중증도, 투여 방식 등, 이것은 당업계의 통상의 숙련가에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 비경구용일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 특히, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구로 투여될 수 있으며, 종양내 투여, 정맥내, 근육내, 피내, 피하, 복강내, 소동맥내, 심실내, 병변내, 척추강내, 국소, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 경로로 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약제학적 조성물을 1일 0.01 ug/kg 내지 100 mg/kg으로, 구체적으로는 1 ug/kg 내지 1 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 약제학적 조성물을 이용한 의약 용도를 제공하는 것이다.
여기서 상기 의약 용도는 대상체에서 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 질환을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 유전 질환, 비유전 질환, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 암, 또는 자가 면역 질환을 포함하는, 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 질환에 대한 예방, 개선 또는 치료하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 유전체 교정에 사용하기 위한, Francisella novicida Cas9 단백질; 역전사 효소 단백질; 및 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 포함하는 프라임 편집 복합체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 유전 질환, 비유전 질환, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 암, 또는 자가 면역 질환을 포함하는, 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 Francisella novicida Cas9 단백질; 역전사 효소 단백질; 및 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 포함하는 프라임 편집 복합체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 Francisella novicida Cas9 단백질; 역전사 효소 단백질; 및 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 포함하는 프라임 편집 복합체를 포함하는 조성물의 유전체 교정 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서, Francisella novicida Cas9 단백질; 역전사 효소 단백질; 및 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 포함하는 프라임 편집 복합체를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
CRISPR-Cas9 ortholog 중 하나인 FnCas9(Francicella novicida Cas9) 모듈을 사용하여 역전사 효소(reverse transcriptase)를 결합하여 표적 DNA 염기서열에 외부 유전자를 삽입하거나 치환할 수 있는 기술(prime editing)이다.
본 기술은 FnCas9(Francicella novicida Cas9) 모듈을 사용한 외부 유전자 삽입 및 치환 기술 (prime editing)은 기존 SpCas9 에 비하여 표적 DNA 내부 non-target strand 에 형성되는 nick position이 다르기 때문에 기존 유전체 삽입 및 치환 기술을 확장할 수 있는 장점이 있다.
또한 FnCas9(Francicella novicida Cas9) prime editor(역전사 효소 결합)와 기존 SpCas9 prime editor를 복합하여 사용시 상호 교차 간섭이 없기 때문에 다중 유전자의 외부 유전자 삽입 및 치환이 용이한 장점을 지니며, FnCas9 모듈을 엔지니어링 하여 다양한 PAM 염기서열 인식이 가능하거나 성질을 개선하여 효과적인 FnCas9 prime editor(FnCas9-PE)를 개발할 수 있다.
또한, FnCas9(H969A)-PE는 SpCas9 nickase (H840A) 와 목표 염기서열에 동시 사용하여 NTS(non-target strand) 와 TS(target strand)에 각각 nick을 생성하여 외부 유전자가 FnCas9-PE에 의하여 삽입되는 효율을 증폭할 수도 있다.
도 1은 FnCas9 nickase모듈과 SpCas9 nickase모듈을 이용한 prime editing 비교 모식도를 나타낸다. 도 1의 A는 Non-target strand 절단만 일으키는 SpCas9 nickase(H840A)형태의 역전사 효소(RT: reverse transcriptase) 결합 SpCas9 prime editor를 이용하여 외부 유전자(XX)를 삽입하는 방법을 나타내며, 도 1의B는 Non-target strand 절단만 일으키는 FnCas9 nickase(H969A)형태의 역전사 효소(RT: reverse transcriptase) 결합 FnCas9 prime editor를 이용하여 외부 유전자(XX)를 삽입하는 방법을 나타낸다. 이때, pegRNA의 PBS(primer binding site)와 RT template(reverse transcription template) 사이에 nick이 일어나게 된 후 상보적인 부분과 base pairing 되면서 역전사 효소가 pegRNA를 따라서 합성을 시작하게 되고 XX에 해당하는 부분의 삽입(prime editing)이 발생한다(RT(reverse transcriptase): 역전사 효소, 화살표(절단지점): nick이 발생하는 부분, 기울임 및 밑줄 표시: PAM(NGG) 염기서열, XX: 삽입되어질 외부 염기서열, 기울임 표시 : PBS)
도 2는 본 발명의 일실시양태로 CMV promoter 기반의 FnCas9 prime editior 발현 벡터의 모식도를 나타낸다. CMV promoter를 기반으로 하여 고등 동물 세포에서 발현될 수 있도록 디자인하였고, 기존의 wild type과 H969A mutant (nickase) 형태의 FnCas9 C-terminus에 reverse transcriptase를 연결하여 동시 발현될 수 있도록 벡터를 디자인한 것을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일실시양태로 U6 프로모터 기반의 FnCas9-PE를 위한 pegRNA(prime editing guide RNA) 발현 플라스미드 모식도를 나타낸다. U6 promoter를 기반으로 pegRNA가 발현될 수 있도록하고 down stream에 target 서열을 가지도록 디자인한 것을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일실시양태로 FnCas9-PE 작동을 위한 pegRNA의 구성도를 나타낸다 (표적 유전자 삽입 위치 및 priming 염기서열 삽입 위치 구성도). 구체적으로, PBS(primer binding site)와 reverse transcription template 서열을 삽입할 수 있는 위치를 FnCas9 scaffold의 down stream에 위치하도록 디자인 및 제작하였고, 표적 염기서열이 바뀜에 따라서, 표적 염기서열과 그에 해당하는 PBS+RT 시퀀스를 제한효소를 이용해 삽입하여 FnCas9-PE를 작동시킬 수 있도록 하였다.
도 5는 HEK3 target site로써 SpCas9과 FnCas9을 이용하여 editing을 위한 Targeting이 잘 되는지 확인하기 위한 HEK3 target site에 해당한다.
도 6은 SpCas9과 FnCas9이 처리된 HEK3 site의 amplicon으로부터 얻은 NGS 염기서열 분석 결과를 나타낸다. 빗금 패턴 막대 히스토그램은 SpCas9 처리된 세포의 HEK3 site에서 분석한 indel(%)를 나타내며, 검은색 막대 히스토그램은 FnCas9 처리된 세포의 HEK3 site에서 분석한 indel(%)을 나타낸다.
도 7은 FnCas9 cleavage point 및 SpCas9 시스템의 cleavage point를 확인하기 위한 c-Myc, EMX1 및 HEK3 표적 위치의 염기서열 분석 결과를 나타낸다. 검은색 선은 시퀀싱이 끝난 지점으로써 FnCas9 또는 SpCas9에 의해 잘려진 DNA 부분을 나타낸다(TS: Target strand, NTS: non-target strand)
도 8은 SpCas9을 이용한 HEK3 site prime editing 예상 염기서열 및 pegRNA 디자인을 나타낸다(SpCas9 prime editor를 이용하여 'CTT' sequence insertion이 되어 editing된 후의 표적 DNA 염기서열을 나타내며, pegRNA 내부의 PBS 와 RT의 길이는 타겟에 따라서 최적화됨).
도 9는 FnCas9을 이용한 HEK3 site prime editing 예상 염기서열 및 pegRNA 디자인을 나타낸다(FnCas9 prime editor를 이용하여 TT insertion이 되어 editing 된 후의 예측된 DNA 서열로써, SpCas9과 FnCas9의 target은 동일하나, prime editing guide RNA내 primer binding site(PBS) 및 RT(reverse transcription template)의 길이를 다변화 하여 효율 최적화 시도함).
도 10은 HEK3 target site에 SpCas9과 FnCas9을 이용하여 prime editing을 진행 후 분석한 NGS 결과를 나타낸다(SpCas9 prime editor를 control로 하였으며, 같은 target 다른 위치에 염기가 삽입되도록 prime editing 하였음). NGS 결과 SpCas9의 경우 정확한 위치에 CTT insertion(검은색 상자 표시)이 발생한 것을 확인할 수 있고 FnCas9 prime editor의 경우에도 정확한 위치에 TT insertion(검은색 상자 표시)이 발생함을 나타낸다. 또한, FnCas9 prime editor의 경우 PAM(점선 상자 표시) 6bp 앞에서부터 교정이 가능해, PAM 3bp 앞에서부터 교정이 가능한 SpCas9 prime editor 보다 앞쪽에 insertion이 발생함을 확인하였다.
도 11은 SpCas9을 이용한 NRAS site prime editing 예상 염기서열 및 pegRNA 디자인을 나타낸다(SpCas9 prime editor를 이용하여 'TT' sequence insertion이 되어 editing 된 후의 표적 DNA 염기서열을 나타내며, pegRNA 내부의 PBS 와 RT의 길이는 타겟에 따라서 최적화됨).
도 12는 NRAS 유전자를 target으로 선정해 기존의 SpCas9 prime editor로 prime editing 진행 후 NGS를 통해 확인한 결과, PAM(점선 상자 표시) 앞 3bp에 TT insertion이 발생한 것을 확인한 결과를 나타낸다
도 13은 FnCas9을 이용한 NRAS site prime editing 예상 염기서열 및 pegRNA 디자인을 나타낸다(FnCas9 prime editor를 이용하여 TT insertion이 되어 editing 된 후의 예측된 DNA 서열을 나타내며, SpCas9과 FnCas9의 target은 동일하나 FnCas9의 cleavage point에 맞게 insertion 되는 위치는 다르게 설정됨).
도 14는 NRAS 유전자를 target으로 선정해 FnCas9 prime editor를 이용하여 prime editing 진행 후 NGS로 확인한 결과, PAM(점선 상자 표시) 앞 6bp에 TT insertion이 발생한 것을 확인한 결과를 나타낸다.
도 15는 위 NRAS target site에 SpCas9과 FnCas9을 이용하여 prime editing을 진행 후 NGS의 결과를 분석한 것을 나타낸다(검은색 상자 : insertion, 점선 상자: PAM).
도 16은 FnCas9 prime editor를 이용한 Expansion된 표적 범위에 대한 개략적인 모식도를 나타낸다.
도 17은 SpCas9 nickase(H840A)와 FnCas9(H969A) nickase를 기반으로 하는 prime editing의 c-Myc 및 NRAS 유전자에 대한 표적 특이적 뉴클레오티드 삽입을 확인한 결과를 나타낸다.(기울임: PAM, 기울임 TT: 삽입서열)
도 18은 FnCas9과 reverse transcriptase 서열 사이에 링커 서열을 추가하는 경우의 insertion의 정확도 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 19는 본 발명에 따른 priming editing을 위한 3중 또는 4중 플라스미드 전달 시스템의 모식도를 나타낸다.
도 20은 FnCas9(H969A)-RT을 이용한 프라임 편집의 범위 확장 확인을 위한 표적 서열 정보를 나타낸다.
도 21은 c-Myc 유전자에 대하여 AA insertion 효율을 비교한 결과를 나타낸다. (밑줄 AA: 삽입서열, CGG: PAM)
도 22는 FnCas9 prime editor를 이용시 목적하는 위치에서의 점 돌연변이 및 insertion이 상당히 자유롭게 이루어지는 것을 확인한 결과를 나타낸다.
도 23은 FnCas9(H969A)-RT를 통하여 우수한 insertion 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 24의 A 내지 E는 FnCas9(H969A)-RT를 이용하는 경우 비표적 교정 효과가 더 적어 표적 특이성에서 우수한 성질을 나타내는 것을 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. FnCas9 기반 prime editor (FnCas9-PE) 제작
기존의 prime editor는 SpCas9 nickase(H840A)를 기반으로 하여 목표 유전자 내 non-target strand에 nick을 일으킨 후 연결된 Reverse transcriptase(RT)에 의해 외부 유전자가 삽입되도록 개발되었다.
이와 유사한 방식으로 작동하도록 FnCas9(H969A) nickase를 기반으로 하는 prime editor(FnCas9-PE)를 개발하였고, 이의 구체적인 모식도를 도 1에 나타내었다.
구체적으로, SpCas9 nickase(H840A)와 FnCas9(H969A) nickase를 기반으로 하는 Prime editing 기술의 차이로써 도 1의 A는 SpCas9 nickase(H840A) 기반 Prime editing 기술을 나타내며, 도 1의 B는 FnCas9(H969A) nickase 기반 Prime editing 기술을 나타낸다.
pegRNA의 PBS(primer binding site)와 RT template(reverse transcription template) 사이에 nick이 일어나게 된 후 상보적인 부분과 base pairing 되면서 역전사 효소가 pegRNA를 따라서 합성을 시작하게 되고 XX에 해당하는 부분의 삽입(prime editing)이 발생한다. FnCas9(H969A) nickase의 사용은 SpCas9 nickase의 사용과 달리 PAM 으로부터 6bp 떨어진 곳에 nick을 형성함으로써 기존 교정 기술과 대비하여 유전체 교정상의 교정 확장성을 증가시켰다. 또한, FnCas9이 인식하는 guide RNA scaffold 구조가 SpCas9과 다르기 때문에, FnCas9 기반 새로운 prime editing 기술을 기존 SpCas9 기반 prime editing 기술과 동시 적용함으로써 서로 간섭없이 prime editing을 통하여 다중으로 외부 유전자 삽입 또는 치환이 가능하다.
위와 같은 방법을 통해 작동하는 FnCas9(H969A) nickase를 기반으로 하는 prime editor(FnCas9-PE)을 고등 동물 세포내에서 작동할 수 있도록, FnCas9-PE 발현 벡터를 제작하였다.
구체적으로, FnCas9(H969A) nickase에 연결된 역전사효소(RT)의 발현을 인체유래세포 대상 최적화하기 위하여 human codon optimization 을 진행하였고, CMV 프로모터 기반으로 발현할 수 있는 벡터를 제작하였다.
위 제조된 FnCas9-PE 발현 벡터의 모식도를 도 2에 나타내었다.
한편, 외부 유전자 삽입을 위한 염기서열을 포함한 pegRNA (prime editing guide RNA)를 디자인은 U6 프로모터 기반으로 수행하였다.
구체적으로, U6 promoter를 기반으로 pegRNA가 발현될 수 있도록 디자인하였다 (도 3). 특히, PBS(primer binding site)와 reverse transcription template 서열을 삽입할 수 있는 위치를 FnCas9 scaffold의 down stream에 위치하도록 디자인하고, 표적 염기서열이 바뀜에 따라서 표적 염기서열과 그에 해당하는 PBS+RT 시퀀스를 제한효소를 이용해 삽입하여 FnCas9-PE를 작동시키도록 하였다(도 4). 외부 유전자 삽입을 위한 염기서열을 포함한 pegRNA (prime editing guide RNA)에 대한 구체적 제조방법은 이하 실시예에서 보다 구체적으로 설명한다.
실시예 2. FnCas9의 CRISPR-Cas9 effector로의 작동 확인
기존 SpCas9 기반 CRISPR-Cas9 모듈의 유전자 염기서열 타겟팅 여부를 직접적으로 비교하기 위하여 SpCas9 및 FnCas9에 대해 각각 표적 염기서열(HEK3 site)에 돌연변이(indel)를 유도할 수 있는 sgRNA(single-guide RNA) 발현 벡터를 디자인하고 제작하였다.
구체적으로, FnCas9-PE 발현 벡터는 상기 실시예 1에서 제조된 것을 사용하였다.
SpCas9-PE 발현 벡터는 FnCas9-PE 발현 벡터와 기본적으로 상동하며, FnCas9 nickase (H969A) 대신 SpCas9 nickase(H840A) 유전자를 사용하여 제조하였다.
HEK3 site의 표적 위치는 기존 문헌(Nature, Anzalone et al, 2019.)을 참고하여, 선정하였다. 이의 예시적인 표적 위치를 도 5에 나타내었다(서열번호 27 : GGCCCAGACTGAGCACGTGATGG).
pegRNA가 발현될 수 있도록 HEK3 site의 표적 위치를 포함하는 FnCas9 pegRNA 발현 벡터 및 SpCas9 pegRNA 발현 벡터를 각각 제조하였다.
구체적으로, U6 프로모터를 사용하여 pegRNA가 발현될 수 있는 벡터를 사용하였으며, HEK3 site의 표적 염기서열 정보 (서열번호 27 : GGCCCAGACTGAGCACGTGATGG)와 이를 기반으로 외부유전자 삽입 서열(서열번호 28: CATCACGTAAGCTCAGTCTG (PBS + RT))을 연결하여 제작하였다.
프라임 에디터 작동 이전에 FnCas9 모듈의 활성을 테스트하기 위해서
상기 제조된 각각 CRISPR-Cas9 effector(SpCas9 및 FnCas9)와 sgRNA 발현 벡터를 동시에 transfection 진행하였다.
구체적으로, 전기 천공(electroporator) 방법을 통해 tansfection을 수행하였다.
그리고나서, NGS 분석을 illumina 시퀀싱 기기를 사용하여 표적 amplicon 기반으로 수행하고, 표적 특이적(HEK3 site)인 유전체 교정 결과(indel 패턴)를 확인하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6을 통해 확인할 수 있는 바와 같이, CRISPR-Cas9 effector로 FnCas9을 사용하는 경우에 우수한 교정 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
그리고 나서, FnCas9 모듈 및 SpCas9 모듈 각각을 이용해 prime editing을 시행하기 이전에 NTS(non-target strand)에 nick이 발생하는 위치를 확인하기 위하여 in-vitro cleavage assay를 수행하였다.
즉, HEK3 site, NRAS site, AAVS1 site, EMX1 site, c-Myc site 의 Target site를 T-vector에 클로닝한 후 FnCas9 또는 SpCas9으로 in-vitro cleavage를 수행한 후, 잘린 단편들을 run-off 시퀀싱 분석을 통해 FnCas9의 cleavage point를 확인하였다.
상기 표적 서열 정보는 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure PCTKR2022001113-appb-img-000001
PAM sequences (NGG) 는 밑줄 표시함.
구체적으로 Sanger sequencing을 통하여 FnCas9 과 SpCas9의 절단 지점을 비교 분석 하였다.
그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7을 통해 확인할 수 있는 바와 같이, FnCas9은 non-target strand에 6-8nt 5'-overhang으로 cleavage가 발생함을 확인할 수 있었고, SpCas9은 3nt 5'-overhang으로 cleavage가 발생하는 것을 확인할 수 있었다.
위 결과를 통하여, CRISPR-Cas9 effector로 FnCas9을 사용하는 경우 기존 SpCas9을 사용하는 경우와 대비하여 표적 DNA에 nick을 형성하는 위치가 달리 나타남을 확인하였다.
실시예 3. FnCas9 기반 prime editing의 확인 (HEK3 표적 서열)
SpCas9 기반의 prime editing 시스템과 FnCas9 기반의 prime editing을 직접적으로 비교하기 위하여 SpCas9(H840A)-RT, FnCas9(H969A)-RT 형식의 prime editor에 대해 각각 표적 염기서열(HEK3 site)에 외부 유전자(CTT or TT)를 삽입할 수 있는 pegRNA(prime editing-guide RNA) 발현 벡터를 디자인하였다.
구체적으로, SpCas9을 이용한 HEK3 site prime editing 예상 염기서열 및 pegRNA 디자인의 모식도는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, SpCas9 prime editor를 이용하여 'CTT' sequence insertion이 되어 editing 될 수 있도록 디자인하고, pegRNA 내부의 PBS 와 RT의 길이는 타겟에 따라서 최적화하였다.
구체적으로, FnCas9-PE 발현 벡터는 상기 실시예 1에서 제조된 것을 사용하였다.
SpCas9-PE 발현 벡터는 FnCas9-PE 발현 벡터와 기본적으로 상동하며, FnCas9 nickase (H969A) 대신 SpCas9 nickase(H840A) 유전자를 사용하여 제조하였다.
HEK3 site의 표적 위치는 기존 문헌을 참고, 프라임 에디팅이 수월한 표적으로 선정하였고, 이의 예시적인 표적 위치를 도 5에 나타내었다(서열번호 27: GGCCCAGACTGAGCACGTGATGG).
한편, FnCas9을 이용한 HEK3 site prime editing 예상 염기서열 및 pegRNA 디자인의 모식도는 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, FnCas9 prime editor를 이용하여 TT insertion이 되어 editing 될 수 있도록 디자인하였다. 위 언급된 SpCas9과 FnCas9의 target은 동일하나, prime editing guide RNA내 primer binding site(PBS) 및 RT(reverse transcription template)의 길이를 다변화하여 효율 최적화를 수행하였고, 이러한 서열정보를 아래 표 2에 나타내었다.
위 실험을 위한 벡터의 제조는 앞서 실시예 1 및 2와 유사하게 진행되었다.
[표 2]
Figure PCTKR2022001113-appb-img-000002
Figure PCTKR2022001113-appb-img-000003
Figure PCTKR2022001113-appb-img-000004
(TGG: PAM, Target: 밑줄, priming template(PBS+RTT): 기울임, FnCas9의 scaffold: 밑줄+기울임으로 표시함.)
위 제조된 벡터 시스템들을 앞서 실시예 2와 유사하게 HEK293FT 세포에 각각 prime editor 와 pegRNA 발현 벡터를 동시에 transfection 진행한 뒤 NGS 분석을 통해 표적 특이적(HEK3 site)인 외부 유전자 삽입 결과를 확인하였다.
즉, 상기 표 2의 후보 pegRNA와 prime editor를 HEK293 세포에 transfection하고,
72시간 뒤 genomic DNA(gDNA) 추출을 진행한 다음, gDNA로부터 target amplicon을 얻어내고 이를 이용해 targeted amplicon sequencing (NGS)을 진행해 외부 유전자 삽입 효율을 분석하였다.
이의 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10을 통해 확인할 수 있는 바와 같이, FnCas9 prime editor를 사용하는 경우에 genomic DNA 상 표적 DNA 염기서열에 정확히 외부 유전자 'TT' 가 PAM의 6bp 앞쪽 삽입되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 반면, SpCas9 prime editor를 사용하는 경우에 PAM의 3bp 앞쪽 위치에서의 삽입이 수행되는 것을 확인하였다.
실시예 4. FnCas9 기반 prime editing의 확인 (NRAS 표적 서열)
SpCas9 기반의 prime editing 시스템과 FnCas9 기반의 prime editing을 NRAS 표적 서열에 대하여 비교 실험을 수행하였다.
구체적으로, SpCas9 기반의 prime editing 시스템과 FnCas9 기반의 prime editing의 예시적인 모식도는 각각 도 11 및 도 13에 나타내었고, 서열 정보는 아래 표 3에 나타내었다.
실험의 진행은 위 실시예 2 및 3의 방법과 유사하게 진행되었고, NGS를 통해 서열의 삽입을 확인한 결과를 도 12 및 도 14에 각각 나타내었다.
도 12 및 도 14를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, FnCas9 prime editor를 사용하는 경우에 genomic DNA 상 표적 DNA 염기서열에 정확히 외부 유전자 'TT' 가 PAM의 6bp 앞쪽 삽입되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 반면, SpCas9 prime editor를 사용하는 경우에 PAM의 3bp 앞쪽 위치에서의 삽입이 수행되는 것을 확인하였다.
또한, 도 15에서 확인할 수 있는 바와 같이, FnCas9 prime editor를 이용하여 삽입 위치의 확장성이 2배 커졌음에도 불구하고 충분한 Editing rate를 나타내는 결과를 확인하였다. 특히, 부차적으로 생긴 원치 않은 indel 형성은 SpCas9(H840A)-RT의 경우 2.5% 유도인 반면, FnCas9(H969A)-RT의 경우 1.3%를 유도하여 정확한 교정이 가능함을 확인하였다.
실시예 5. FnCas9 기반 prime editing 최적화 수행
실시예 2 내지 4를 통해 확인된 FnCas9 prime editor를 이용한 Expansion된 표적 범위에 대한 개략적인 모식도를 도 16에 나타내었다. SpCas9(H840A)는 PAM(NGG)에서 3~4bp 업스트림에 닉을 형성하고 FnCas9(H969A)는 PAM(NGG)에서 6~8bp 업스트림에 닉을 형성하는 것을 앞서는 실험들을 통해 확인하였다.
이에 따라, c-Myc 및 NRAS 유전자에 대한 표적 특이적 뉴클레오티드 삽입을 상기 실시예 3 및 4의 방법을 참고하여 수행하였고, 이의 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17을 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 표적 서열에 대한 삽입 위치가 c-Myc 및 NRAS 모두에서 사용되는 Cas9 종류에 따라 상이하게 나타남을 확인하였다.
그리고 나서, 정확성 개선을 위하여 FnCas9과 reverse transcriptase 서열 사이에 링커 서열을 추가하여 이의 insertion의 정확성 개선이 개선되는지 여부를 확인하였다.
링커 서열로는 서열번호 19의 서열을 중심으로 하여, 0.5X, 1X, 2X로 설정하여 실험을 수행하였다.
위 서열을 포함하도록 도 18과 같이 서열을 구성한 후, 이를 이용하여 실시예 4와 같이 실험을 수행하였다.
그 결과 도 18에서 확인할 수 있는 바와 같이, 1X로 링커 서열을 포함하는 경우 prime editing 효율이 최적화됨을 확인하였다.
실시예 6. FnCas9(H969A)-RT에 의한 세포내 prime editing을 위한 FnCas9(H969A)-RT 와 pegRNA 발현 벡터 제작
FnCas9(H969A)-RT 이용, 프라임 편집과 표적 서열에 대한 Nicking을 목적하는 nicking guide RNA(ngRNA)를 포함하는 시스템을 제조하였다.
nicking guideRNA의 경우 보다 프라임 에디팅 효율을 제고하려는 목적으로 이용되며, 정확하고 확장된 Insersion을 위해 nicking 지점에서 -6에서 +3 위치에서 삽입되는 것이 바람직함을 확인하였다.
본원 발명에 따른 3중 또는 4중 플라스미드 전달 시스템의 모식도를 도 19에 나타내었다.
실시예 2와 유사하게 CMV 프로모터 기반의 SpCas9(H840A)-RT, FnCas9(H969A)-RT 발현 벡터를 제작하였다. 그리고 나서, 표적 염기서열에 외부 유전자(TT)를 삽입할 수 있도록 U6 promoter 기반의 pegRNA(prime editing-guide RNA) 발현 벡터를 디자인하였다. 그리고 나서, PE2 (ngRNA 미사용), PE3 triple (FnCas9(H969A)-RT 와 FnCas9용 ngRNA사용), PE3 triple(비교) (SpCas9(H840A)-RT 와 SpCas9용 ngRNA사용), PE3-quadruple (FnCas9(H969A)-RT 와 SpCas9용 ngRNA사용) 방식의 세포내 전달을 통하여 prime editor의 발현에 의한 유전자 교정이 가능함을 확인하였다.
실시예 7. FnCas9(H969A)-RT을 이용한 프라임 편집의 범위 확장
FnCas9(H969A)-RT 및 SpCas9(H840A)-RT의 프라임 범위 확장 범위에 대한 검토를 수행하였다.
FnCas9 nickase(H969A) 모듈은 SpCas9 nickase(H840A) 모듈에 비하여 표적 유전자의 Non-target strand 쪽에 nick을 유도하는 위치가 다르기 때문에, SpCas9 nickase(H840A) 기반의 prime editing 시스템에 비해 PAM으로 인식되는 염기서열(NGG)로부터 더 멀리 떨어진 곳(SpCas9: 3-4bp, FnCas9:7-8bp)까지 역전사 효소에 의한 reverse transcription 시작점이 변하게 된다. 이러한 점을 활용하여 SpCas9 nickase(H969A) 모듈에 비하여 FnCas9 nickase(H969A) 모듈을 기반으로 prime editing을 유도할 수 있는 범위를 동일한 표적 염기서열에 대하여 도 20의 표적 서열을 기반으로 하여 조사하였다.
293FT 세포를 대상으로 하여 유전자내 동일한 표적 염기서열에 대하여 각각의 prime editing 효율을 비교하였고, SpCas9 nickase(H840A) 모듈에 의해 nick이 형성되는 지점을 기준으로 외부 유전자가 삽입(AA)되는 지점을 표시하였다 (nicking 이 형성되는 지점을 기준으로 -6 to +3bp 지점).
C-myc 유전자에 대하여 실험을 수행한 결과를 도 21에 나타내었다.
도 21을 통해 확인할 수 있는 바와 같이, AA insertion 효율을 비교한 결과 SpCas9 nickase(H969A)-RT 의 경우, nick position을 기준으로 -1 부터 +3 위치까지 10-38% 교정효율을 보였다. 반면, FnCas9 nickase(H969A)-RT의 경우 nick position을 기준으로 -6 부터 +3 위치까지 3-8% 교정효율을 보였으며, 동일한 표적내 PAM 염기서열(NGG)을 기준으로 FnCas9 nickase(H969A)-RT에 의해서 유전자 교정 범위가 크게 확장되었다.
또한, 목적하는 위치에서의 점 돌연변이 및 insertion이 상당히 자유롭게 이루어질 수 있음을 도 22의 결과를 통해 확인할 수 있었다. 구체적으로, 도 22는 FnCas9(H969A)-RT에 의해 유도된 부위 특이적(c-Myc, NRAS) 염기 삽입의 차세대 시퀀싱 결과를 나타내며, 1개의 염기 치환이나 염기 insertion 효율이 우수함을 확인하였다.
실시예 7. FnCas9(H969A)-RT의 비표적 특이성 확인
SpCas9 nickase(H840A)-RT 보다 FnCas9 nickase(H969A)-RT의 비표적 특이성을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 5의 PE3 triple (FnCas9(H969A)-RT 와 FnCas9용 ngRNA사용), PE3 triple (SpCas9(H840A)-RT 와 SpCas9용 ngRNA사용), PE3-quadruple (FnCas9(H969A)-RT 와 SpCas9용 ngRNA사용)를 이용하여 NRAS 및 c-Myc에 대한 표적 특이성을 확인하여, 그 결과를 도 23에 나타내었다.
도 23을 통해 확인할 수 있는 바와 같이, FnCas9(H969A)-RT를 통하여 우수한 insertion 효과를 확인하였고, 비표적 타겟팅이 줄어드는 것을 확인하였다.
비표적에 대한 특이성을 확인한 결과를 도 24에 SpCas9(H840A)-RT, e SpCas9(H840A)-RT와 각각 비교하여 나타내었다. 도 24를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, FnCas9(H969A)-RT에 의해 유도된 유전자(NRAS,FANCF,HBB,c-Myc,HEK3) 특이적 염기 삽입 결과에 대해 SpCas9(H840A)-RT 과 비교하였을 때, 각 유전자(NRAS,FANCF,HBB,c-Myc,HEK3) 염기서열 표적에 대한 FnCas9(H969A)-RT의 비표적 교정 효과가 더 적어 표적 특이성에서 우수한 성질을 나타내었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (28)

  1. Francisella novicida Cas9 단백질;
    역전사 효소 단백질; 및
    프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 포함하는 프라임 편집 복합체로서,
    상기 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)는 프라이머 결합 부위, 편집 주형 및 상동성 아암을 포함하는 것인, 프라임 편집 복합체.
  2. 제1항에 있어서, Francisella novicida Cas9 단백질은 서열번호 2의 Francisella novicida Cas9(H969A)에 대하여 적어도 98% 이상 동일한 것인, 프라임 편집 복합체.
  3. 제2항에 있어서, Francisella novicida Cas9 단백질은 서열번호 2의 Francisella novicida Cas9(H969A)는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 것인, 프라임 편집 복합체.
  4. 제1항에 있어서, Francisella novicida Cas9 단백질은 표적 DNA에 nick을 형성하는 위치가 PAM 으로부터 6bp 떨어진 곳인, 프라임 편집 복합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 역전사 효소는 서열번호 15의 서열을 가지는 것인, 프라임 편집 복합체.
  6. 제1항에 있어서, Francisella novicida Cas9 단백질 및 역전사 효소 단백질은 융합 단백질의 형태를 가지는 것인, 프라임 편집 복합체.
  7. 제1항에 있어서, Francisella novicida Cas9 단백질 및 역전사 효소 단백질이 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)와 복합체화 된 경우 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 것인, 프라임 편집 복합체.
  8. 제1항에 있어서, 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)의 스페이서 서열은 표적 DNA 내의 프로토스페이서에 결합하는 서열인, 프라임 편집 복합체.
  9. 제1항에 있어서, 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)의 gRNA 코어는 Cas9 결합을 담당하는 gRNA 내의 서열인, 프라임 편집 복합체.
  10. 제1항에 있어서, 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)의 연장 아암은 프라이머 결합 부위 및 역전사 효소를 통해 관심 유전적 변화를 함유하는 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하는 DNA 합성 주형 서열을 포함하는, PEgRNA의 단일 가닥 연장부인, 프라임 편집 복합체.
  11. 제1항에 있어서, 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)가 서열번호 22의 서열을 포함하는 것인, 프라임 편집 복합체.
  12. 제1항에 있어서, 표적 또는 상보적 비-표적 가닥이 닉킹되어 유리 3' 단부를 갖는 프라이밍 서열을 형성하는 것인, 프라임 편집 복합체.
  13. 제1항에 있어서, 닉 부위가 PAM 서열의 5' 단부에 대해 -6 bp인, 프라임 편집 복합체.
  14. Francisella novicida Cas9 단백질; 및 역전사 효소 단백질을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  15. Francisella novicida Cas9 단백질 및 역전사 효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  16. 프라이머 결합 부위, 편집 주형 및 상동성 아암을 포함하는 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  17. Francisella novicida Cas9 단백질; 역전사 효소 단백질; 및 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 포함하는 프라임 편집 복합체를 포함하는 세포.
  18. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 프라임 편집 복합체를 포함하는 유전자 교정용 조성물.
  19. Francisella novicida Cas9 단백질 및 역전사 효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및 프라이머 결합 부위, 편집 주형 및 상동성 아암을 포함하는 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 유전자 교정용 조성물.
  20. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 프라임 편집 복합체를 포함하는 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  21. Francisella novicida Cas9 단백질 및 역전사 효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및 프라이머 결합 부위, 편집 주형 및 상동성 아암을 포함하는 프라임 편집 가이드 RNA (PEgRNA)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  22. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 프라임 편집 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하여 유전자 산물의 발현을 변경시키는 방법.
  23. 핵산 서열을 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 프라임 편집 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하여 핵산 서열에 치환, 결실, 삽입 또는 이의 조합을 제공하는 방법으로써,
    상기 방법은 (i) 이중 가닥 DNA 서열을 표적 가닥 (또는 PAM 가닥) 상에서 닉킹하고, 3' 단부를 갖는 유리 단일 가닥 DNA를 생성하는 것;
    (ii) 유리 단일 가닥 DNA의 3' 단부를 가이드 RNA의 프라이머 결합 부위에 혼성화시킴으로써, 폴리머라제를 프라이밍하는 것;
    (iii) 3' 단부로부터 DNA의 가닥을 중합시킴으로써, 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA 플랩을 생성하는 것; 및
    (iv) 표적 가닥 (또는 PAM 가닥) 상의 절단 부위의 하류에 바로 인접한 내인성 DNA 가닥을 단일 가닥 DNA 플랩으로 대체함으로써, 이중 가닥 DNA 서열에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 제공하는 것을 포함하는 것인, 핵산 서열에 치환, 결실, 삽입 또는 이의 조합을 제공하는 방법.
  24. 유전체 교정에 사용하기 위한, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 프라임 편집 복합체를 포함하는 조성물.
  25. 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 프라임 편집 복합체를 포함하는 약제학적 조성물.
  26. 1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 프라임 편집 복합체를 포함하는 조성물의 유전체 교정 용도.
  27. 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 프라임 편집 복합체를 포함하는 프라임 편집 복합체를 포함하는 조성물의 용도.
  28. 핵산 서열을 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 프라임 편집 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 질환의 치료 방법.
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