CN115918526A - 单倍体诱导组合物及其使用方法 - Google Patents

单倍体诱导组合物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了使用突变的马铃薯糖蛋白样磷脂酶IIα(“pPLAIIα”，这里重新命名为MATRILINEAL)在植物中诱导单倍体诱导，克隆pPLAIIα以在植物中诱导单倍体诱导，和遗传工程化植物以包含突变的pPLAIIα的方法。还提供了在授粉期间向植物施用局部和喷雾化学物质、脂质和RNAi分子以便诱导单倍体产生的方法。进一步提供了在授粉期间化学处理植物以诱导单倍体同时还减少胚败育和增加结籽的方法。

Description

单倍体诱导组合物及其使用方法
本申请是申请日为2016年11月17日、申请号为201680067447.8、发明名称为“单倍体诱导组合物及其使用方法”的发明专利申请的分案申请。
要求优先权
本申请根据35U.S.C.§120要求2015年11月18日提交的美国临时申请号62/256,902和2016年2月26日提交的美国临时申请号62/300,507的权益，将其内容通过引用并入本文。
序列表
本申请附有一个序列表，所述序列表定名为80906-PCT_ST25.txt，创建于2016年11月16日，大小为约392千字节。本序列表通过引用以其全文并入本文。本序列表随同此申请经由EFS-Web提交，并且符合37C.F.R.§1.824(a)(2)-(6)和(b)。
技术领域
本申请披露的主题涉及单倍体诱导(“HI”)或其在植物中的不存在和/或存在的鉴别检测，所述植物是或不是单倍体诱导物。更具体地，本申请披露的主题涉及如下核酸，所述核酸可以用于在植物中诱导HI、和/或诱导可以修饰以便在将以另外的方式展现HI的植物中或在将不以另外的方式展现HI的植物中产生或防止HI的生物活性。甚至更具体地，本申请披露的主题涉及编码生物活性分子的核酸分子以及使用所述核酸分子来调节植物中的HI的方法。
这里提供的是在玉米的至少一个马铃薯糖蛋白样磷脂酶A2α(“PLA”)基因中发现的一系列独立的人类诱导的突变；在至少一个PLA基因中具有这些突变的玉米植物；以及通过筛选合并的和/或单独的玉米植物来产生和鉴定PLA基因中相似的和/或另外的突变的方法。本发明的玉米植物由于在至少一个PLA基因中的非转基因突变而诱导单倍性。还提供的是通过施用化学品到植物的生殖组织来诱导从头单倍体诱导的方法。还提供的是在授粉期间通过施用化学品到植物的生殖组织来提高结籽率和单倍体诱导率(“HIR”，本文中被定义为在用单倍体诱导物花粉对穗授粉之后存活的单倍体籽粒的数量除以籽粒的总数)的方法。
背景技术
授粉是一个复杂的过程。被子植物花粉粒由一个大的营养细胞和两个雄配子(精细胞)组成。落在柱头上后，花粉粒萌发花粉管，随着花粉管沿着雌蕊传导管(femaletransmitting tract)向下航行时，由在胚囊的珠孔端的两个助细胞分泌的化学引诱剂引导，花粉管展现快速尖端生长。在沿着管向下传递过程中，精子通过被称为雄性生殖单位的黏性细胞质彼此连接并且与营养核连接。在与两个助细胞之一接触后不久，花粉管破裂并且两个精子被推动穿过快要消失的助细胞细胞质以独立地与胚囊的卵子和中央细胞融合，从而完成双受精。即使在初次接触后，受精失败事件也可以通过第二个花粉管来拯救，第二个花粉管经由与宿存助细胞相互作用而使胚囊受精。
为了形成杂交种子，育种者将近交亲本品系杂交，一个充当父本，一个充当母本。开发基本上纯合的近交亲本品系的过程通常需要待选择和自花授粉(自交)多代以变得接近纯合的杂交种。这个过程耗时且昂贵。为了缩短在玉米、稻、小麦、大麦和其他作物中开发纯合近交种的时间，育种者可以选择使用单倍体诱导物品系来诱导杂交亲本的单倍体种子产生。然后将单倍体植物的染色体加倍，例如通过染色体加倍剂如秋水仙碱，以形成双单倍体纯合近交品系。
单倍体诱导(“HI”)是一类植物现象，其特征在于胚发育期间诱导物染色体的丢失。WO 2012/030893(通过引用并入本文)描述了可能负责单倍体诱导的玉米染色体1的区域。该区域中提高单倍体诱导的鉴定的标记被描述为介于48,249,509-51,199,249之间，其与具有(60,213,661)的物理位置的公共标记umc1169相关。此区域似乎不与Stock 6中的单倍体诱导区域对齐。Dong等人,(2013)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]126:1713-1720描述了位于bin 1.04中的QTL，其解释了HIR的高达66％的基因型方差。
在许多植物物种(如高粱、大麦、小麦和其他草)中观察到了单倍体诱导。在玉米中，HI似乎是染色体1区域内重排、突变和/或重组、插入或缺失的结果(除了明显的例外ig型单倍体诱导，其是在染色体3上的不定配子体1(INDETERMINATE GAMETOPHYTE1)基因中的突变的结果)。已经研究并大致鉴定出传说的HI品系。然而，尚未提出证明在玉米中HI的诱发遗传因子的实验证据。以前也未鉴定出本文中列出的与此性状相关的标记。
在玉米中，单倍体种子或胚是通过在单倍体诱导物父本(即“单倍体诱导物花粉”)与实际上人们选择的任何穗之间进行杂交而特异性产生的-所述穗可以是任何近交种、杂交种或其他种质。当单倍体诱导物花粉DNA未通过胚的第一次细胞分裂完全传递和/或维持时产生单倍体。所产生的表型不完全外显，其中一些胚珠含有单倍体胚，其他含有二倍体胚、非整倍体胚、嵌合胚或败育胚。单倍体籽粒具有仅含有母本DNA的胚加正常三倍体胚乳。在单倍体诱导后，使用表型或遗传标记筛选典型地将单倍体胚或种子从二倍体和非整倍体同胞中分离出来，并使其生长或培养成单倍体植物。然后将这些植物自然地或经由化学操作(即，秋水仙碱)转化成双单倍体(DH)植物，所述植物然后产生近交种子。
HI品系在染色体1上含有数量性状基因座(“QTL”)，其负责至少66％的单倍体诱导变异。当它渗入不同背景时，QTL以不同的比率导致单倍体诱导。种子工业中使用的所有单倍体诱导物品系都是建立的HI品系(称为Stock6)的衍生物，并且全部都具有单倍体诱导物染色体1QTL突变。在这里，我们揭示了该QTL中的关键突变，所述突变在补偿时拯救了正常的生殖。虽然这种突变的起源尚不清楚，但它存在于所有诱导物品系(包括Stock6)中。
通过使用双单倍体(DH)植物协助植物育种。DH植物的产生使得植物育种者能够获得近交品系而无需多代近交，从而减少了产生纯合植物所需的时间。DH植物为植物育种者提供了宝贵的工具，特别是用于产生近交品系、QTL定位、细胞质转换、性状渐渗以及用于高通量性状改良的F2筛选。由于一代基本上产生了纯合品系，因此节约了大量的时间，否定了对多代传统近交的需要。具体地，因为DH植物是完全纯合的，它们非常适合于数量遗传学研究。单倍体种子的产生对于双单倍体育种过程至关重要。当用来自雌核发育诱导物(如Stock 6)的花粉受精时，在母本种质上产生单倍体种子。
玉米单倍体诱导物植物产生花粉，当其与非诱导物种质杂交时，会导致单倍体种子的雌核发育(gynogenic development)。不幸的是，这个过程往往产生低频率的单倍体籽粒。低效的单倍体诱导频率是玉米双单倍体育种计划的限制因素。
发明内容
高HIR允许在感兴趣的亲本植物上形成更高频率的单倍体种子。亲本植物可以用与所希望的性状或表型观察到的性状相关的遗传标记进行预筛选，以丰富亲本植物的遗传潜力。当这些所希望的亲本植物被具有较高HIR的单倍体诱导物授粉时，获得希望的双单倍体的潜力较高，所述双单倍体具有所希望的基因型和表型。
虽然双单倍体过程导致纯合近交种的产生更快，但产生的双单倍体近交种的量可能是有限的。已知的诱导物品系包括但不限于：Stock 6、MHI(摩尔多瓦(Moldovian)单倍体诱导物)、不定配子体(“ig”)突变、KEMS、RWK、ZEM、ZMS和KMS。全部都具有相对较低的HIR。例如，Stock 6仅诱导1％-3％的单倍体种子。因此，在产生双单倍体品系的过程中，单倍体的诱导一直是限速步骤。
我们发明了通过用脂质化合物、磷脂酶抑制剂和脂肪酸去饱和酶抑制剂处理植物而在植物中诱导单倍体产生和/或提高单倍体诱导率的方式。一套这样的方法包括当与野生型(非单倍体诱导物)花粉杂交时向生殖组织施用特定的化学品。第一次，我们以化学方式触发从头单倍体诱导。这是通过在授粉期间将一定浓度的磷脂酶抑制剂甲基α-亚麻酰基氟膦酸酯(MALFP)施用于花来实现的，这导致高比率的单倍体诱导：高达9％的HIR。单独地，我们通过在授粉期间将一定浓度的花生酰基氟膦酸酯(MAFP)施用于花触发了从头单倍体诱导。单独地，我们通过在授粉期间将一定浓度的1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(也称为二硬脂酰-磷脂酰胆碱；“DSPC”)施用于花触发了从头单倍体诱导。我们还通过在授粉期间将一定浓度的α亚麻酸施用于花触发了从头单倍体诱导。我们还通过施用容易获得的化合物(包括玉米油和亚麻籽油)以及化学合成的亚油酸、油酸乙酯(OAEE)、花生四烯酸甲酯(AAME)和磷脂酶抑制剂海绵类脂(manoalide)触发了从头单倍体诱导。通过施用一定浓度的磷脂酶抑制剂甲基α-亚麻酰基氟膦酸酯(MALFP)，当将植物与单倍体诱导物品系(例如，RWK、Stock 6或ZMS)杂交时，我们还提高了单倍体诱导率。在用缓冲的DML溶液乳化的2％MALFP+表面活性剂共混物91的浓度下，我们使用RWK作为传粉者将授粉中的单倍体诱导率加倍。RWK中的典型诱导率为约10％-18％。随着MALFP施用，诱导率提高到20％-35％。我们还通过在授粉期间将一定浓度的亚油酸(LLE)、亚油酸乙酯(LLAEE)和称为甲基花生酰基氟膦酸酯(MAFP)的磷脂酶抑制剂施用于花来提高单倍体诱导率。此外，以此方式这样做也降低了胚败育比率并增加了MALFP、LLAEE、MAFP和LLE的籽粒形成比率。这些作用一起导致授粉后在穗上回收的单倍体胚的总数增加。
我们还克隆并表征了玉米中负责单倍体诱导的基因。所述基因是PLA2并且其具有花粉特异性表达。PLA2蛋白似乎定位于精细胞的细胞质，也许是内质网或高尔基体。所述基因的鉴定导致了改进单倍体诱导过程的若干新技术的发明，被定义为通过将任何穗与单倍体诱导物花粉杂交来产生单倍体胚、籽粒、种子或植物的行为。所述基因的鉴定也导致了诱导单倍体的新方法的发明。另一套方法包括通过改变诱发基因的序列(通过定向诱变、TILLING、或CRISPR/Cas9)来产生新的单倍体诱导物品系的方法。可以使用RNAi或通过在启动子、3'UTR、5'UTR或剪接位点处使用靶向诱变来下调PLA2蛋白的表达。
基于对这种突变的鉴定，我们发明了改良和改进单倍体诱导过程的方式，并且第一次，我们披露了在授粉期间经由化学处理从头产生单倍体的方法。我们展示了提高单倍体诱导率(“HIR”，即在给定的单倍体诱导的穗上发现的单倍体胚的百分比)的方法、以及提高单倍体诱导期间的籽粒存活率的方法。我们还讨论了使用遗传修饰(“GM”)或定向诱变策略来产生新的单倍体诱导物品系的方法。
单倍体诱导过程可以通过多种方法来改进。首先，人们可以努力改进平均HIR。因为HIR相对较低，HIR在大规模双单倍体(“DH”)植物生产中是速度限制性的。参见图1。除少数例外以外，HIR通常小于25％，最常见的是在10％-20％范围内，这意味着75％-90％的籽粒是二倍体。在一些低频率的情况下，在单倍体诱导期间也产生非整倍体胚。已经显示增加在单倍体诱导物杂交期间形成的单倍体数量和/或单倍体形成率而不提高胚败育率的化合物的实例包括甲基α-亚麻酰基氟膦酸酯(MALFP)、甲基花生酰基氟膦酸酯(MAFP)、亚油酸(LLA)和亚油酸乙酯(LLAEE)。其次，人们可以降低单倍体诱导期间的籽粒败育率和受精失败率，导致每个穗形成更多的籽粒。在发生成功受精之后发生籽粒败育，但是当功能性胚或胚乳不能发育时，并且因此小的无色籽粒生长，内部缺乏成熟胚。在单倍体诱导过程中，籽粒败育率很高-在穗上在10％-50％之间的受精胚珠。这限制了人们在每个穗上可以回收的单倍体籽粒的数量。当胚珠不能通过花粉粒受精时结果受精失败，并且受精失败的特征在于授粉后没有任何籽粒发育。在单倍体诱导期间，这个比率往往很高-在一些单倍体诱导的穗上有10％-70％之间的籽粒不能受精，这取决于雄花和雌花的成熟度的对齐、进行杂交的类型、以及雄株和雌株遗传学。已经显示通过减少受精失败和胚败育来提高可存活籽粒形成的比率的化合物的实例包括上述相同四种：MALFP、MAFP、LLA、和LLAEE。这四种分子，当在单倍体诱导杂交期间施用于花粉、雄花穗或其他花部分时，增加了通过提高单倍体诱导率和籽粒计数形成的单倍体数量。
最后，通过当使其自交或与来自非单倍体诱导物品系的花粉杂交时使得在穗上或在胚珠中能够发生从头单倍体诱导，人们可以通过否定对单倍体诱导物父本的需要来改进单倍体诱导物过程。这些从头单倍体诱导方法(包括施用磷脂(如DSPC)、脂肪酸(如亚麻酸(LNA))、甘油三酸酯的普通混合物(如玉米油和亚麻籽油)、或磷脂酶抑制剂(如MALFP))可以应用于任何异型杂交或自花授粉，以便在玉米中诱导单倍体。在这里，我们描述了落入这些类别中的一个或多个中的实例，所述实例构成了单倍体诱导过程中的改进或新发明。
本发明涉及用于在两个亲本植物之间的杂交中诱导单倍体胚的方法。这是通过改变亲本植物之一中磷脂酶的表达来完成的。这种改变可以通过几种方式完成：通过导致亲本植物之一表达突变的磷脂酶；或通过向亲本植物中的一个或两个施用小干扰RNA，这导致磷脂酶的抑制；或通过用突变的磷脂酶转化亲本植物之一；或通过编辑亲本植物之一的磷脂酶，例如通过定点诱变如基于CRISPR或TALEN的技术。当通过这些技术之一改变亲本植物之一中磷脂酶的表达时，则当该亲本植物用于杂交时，产生至少一个单倍体胚。
在所述方法的一个实施例中，磷脂酶是马铃薯糖蛋白样磷脂酶。在另一个实施例中，马铃薯糖蛋白样磷脂酶是pPLAIIα的直系同源物，其由包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少70％一致性的序列编码。编码马铃薯糖蛋白样磷脂酶的核苷酸序列可以是突变的，并且在一个实施例中，核苷酸序列具有产生人造终止密码子的移码突变。移码突变序列包含SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少70％一致性的序列。
其他突变是可能的并且在本发明的范围内。使用定点诱变可以用于产生更多的磷脂酶突变。根据本发明的实施例，CRISPR/Cas9、TALEN、锌指和大范围核酸酶是实现定点诱变的方法。
本发明可用于植物之间的许多类型的杂交中。在一个实施例中，杂交中使用的亲本植物是单子叶植物，例如玉米、稻、大麦和小麦。亲本植物可以是相同的单子叶植物物种，或者它们可以是不同的物种。在另一个实施例中，杂交中使用的亲本植物是双子叶植物，例如大豆、向日葵、番茄、辣椒、甜菜或球芽甘蓝。在优选的实施例中，亲本植物是玉米或稻植物。在本发明的范围内的是通过所述方法产生的单倍体胚、包含单倍体胚的单倍体种子、以及由单倍体种子生长的单倍体植物。同样在本发明的范围内的是通过将单倍体胚暴露于染色体加倍剂如秋水仙碱或氟乐灵而产生的双单倍体。
本发明涉及包含SEQ ID NO:3、或与SEQ ID NO:3直系同源的序列、或与SEQ IDNO:3具有70％一致性的序列的cDNA。在优选的实施例中，与SEQ ID NO:3直系同源的序列涵盖来自玉米、稻、小麦、大豆和向日葵的马铃薯糖蛋白样磷脂酶。具体地，与SEQ ID NO:3直系同源的序列包括稻基因Os03g27610。在更优选的实施例中，与SEQ ID NO:3直系同源的序列涵盖SEQ ID NO:23和73-81。
本发明涉及在其马铃薯糖蛋白样磷脂酶基因内含有人类诱导的非转基因突变的植物。在优选的实施例中，马铃薯糖蛋白样磷脂酶基因是pPLAIIα。在另一个实施例中，突变导致提前终止密码子在基因中被编码。在更优选的实施例中，植物是任何单子叶植物或任何双子叶植物，但特别优选的是玉米或稻。
本发明还涉及通过用包含脂质或磷脂酶抑制剂的化合物处理植物生殖组织来诱导单倍体胚和种子产生的方法。在一个实施例中，处理发生在授粉之前、授粉期间或紧接授粉之后。所处理的植物可以是任何单子叶植物或双子叶植物，但是在优选的实施例中，植物是玉米、稻、小麦、大豆、向日葵和甜菜。在另一个实施例中，脂质或磷脂酶抑制剂选自发现于表7中的组。在优选的实施例中，处理化合物包含甲基α-亚麻酰基氟膦酸酯(“MALFP”)、亚油酸乙酯(“LLAEE”)、亚油酸(“LLA”)、玉米油、二硬脂酰-磷脂酰胆碱(“DSPC”)、或甲基花生酰基氟膦酸酯(“MAFP”)。
在另一个实施例中，脂质或磷脂酶抑制剂匹配下式(I)：
Figure BDA0003761963260000081
在本发明的范围内，式(I)的W是碳(“C”)、磷(“P”)或硫(“S”)；m可以是0或1；n可以是0或1；X选自下组，该组由以下各项组成：OH、CN、O(C1-C4烷基)、卤素、C1-C4烷基、以及被一个、两个或三个卤素或羰基取代的C1-C4烷基；R1选自下组，该组由以下各项组成：H、C1-C6烷基和被一个或多个羟基基团取代的C1-C6烷基，其中任选地所述羟基基团中的一个或多个被独立地选自下组的基团酯化，该组由以下各项组成：
Figure BDA0003761963260000082
或当W是S时，R1是到W的键；每个L独立地是C2-C30碳链，所述碳链任选地包含一个或多个独立地选自以下的基团：烯基、炔基、苯基和杂芳基，并且所述碳链任选地被1-6个氧原子打断。当W是C且m是1时，则n是0；然而，当W是C且m是0时，则n是1。
在优选的实施例中，X是F、Cl、CF3、CCl3、CF2H、CCl2H、CF2CF3、CCl2CCl3、CF2Cl、CF2CH3、C(O)CH3或CN。在更优选的实施例中，卤素是F或Cl。
重要的是要注意，在R1中，C1-C6烷基包括直链、支链和环状烷基基团。在优选的实施例中，R1是被1至6个羟基基团取代的C1-C6烷基。
在一个实施例中，式(I)中的每个L独立地是C2-C30碳链，包括支链，其可以是饱和的、不饱和的或多不饱和的。在优选的实施例中，L的碳链包含1至4个独立地选自烯基、炔基、苯基和杂芳基的基团。不饱和是处于双键或三键形式。烯基或炔基可以是在碳链内，或相对于碳链在末端。苯基和/或杂芳基环可以在邻位、间位或对位在碳链中连接，或可以在碳链的末端。芳基环可以任选地被取代。在优选的实施例中，碳链被1至6个氧原子打断。如本文所使用的，“被……打断”意指碳链依次包含至少两个碳原子，接着一个氧原子。例如，-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH3是被氧原子打断的碳链。在优选的实施例中，碳链被1至2个氧原子打断。
符合L的要求的合适碳链的实例包括：(CH2)8-(CH)2-CH2-(CH)2-CH2-(CH)2-CH2-CH3；(CH2)3-(CH)2-CH2-(CH)2-CH2-(CH)2-CH2-(CH)2-(CH2)4-CH3；(CH2)7-(CH)2-(CH2)7-CH3；(CH2)8-(CH)2-CH2-苯基-CH2-(CH)2-CH2-CH3；(CH2)8-(CH)2-(CH2)2-O-CH2-(CH)2-CH2-CH3；和(CH2)8-(CH)2-CH2-苯基-O-(CH2)3-CH3。
这些化合物的处理通过以下技术中的任一种施用化合物来实现：浸渍、注射、基于喷雾的局部施用、雾化器、基于移液管的局部施用和基于刷子的局部施用、以及任何其他局部施用。优选的实施例使用喷雾或雾化器。
本发明进一步涉及在单倍体诱导期间在植物中增加结籽和减少胚败育的方法，所述方法包括在授粉之前、授粉期间或授粉之后用合适浓度的化合物处理植物生殖组织如花丝、雄花穗、花粉、穗、籽粒或其他开花组织。在一个实施例中，所述化合物选自由表7的成员组成的组。在另一个实施例中，所述化合物是甲基α-亚麻酰基氟膦酸酯(MALFP)。在另一个实施例中，所述化合物是亚油酸(LLA)、亚油酸乙酯(LLAEE)、亚麻酸(LNA)、二硬脂酰-磷脂酰胆碱(DSPC)或甲基花生酰基氟膦酸酯(MAFP)。
本发明进一步涉及提高植物中单倍体诱导率的方法，所述方法包括在紧接授粉之前、授粉期间或紧接授粉之后将脂质组合物施用于植物组织。在一个实施例中，所述植物是单子叶植物或双子叶植物；或者所述植物是玉米植物或稻植物。在另一个实施例中，脂质充当磷脂酶抑制剂和/或脂肪酸去饱和酶抑制剂。在另一个实施例中，脂质是具有特定链长和饱和度(十八个碳和两个双键)的脂肪酸(例如，LLA)或脂肪酸酯(例如，LLAEE)，其是一类在单倍体诱导物花粉中缺乏的脂肪酸链长。通过说明而非限制的方式，脂质是例如磷脂酶抑制剂甲基α-亚麻酰基氟膦酸酯(MALFP)，溶解在缓冲的DMSO溶液中(MALFP浓度在0.0001mg/mL与1g/mL之间)，或溶解在表面活性剂配制品中并且然后在缓冲的二甲基乙酰胺(DML)溶液中乳化(MALF浓度在0.0001mg/mL与1g/mL之间)。通过进一步说明而非限制的方式，脂质组合物通过浸渍、注射、喷雾、薄雾、雾化、灌注、刷涂或任何其他施用方法来施用于植物的生殖组织。在一个实施例中，将脂质组合物与花粉组合在混合物中，然后将所述混合物施用于植物组织。在另一个实施例中，将所述混合物施用于植物的生殖组织，例如玉米植物的花粉或花丝。
本发明涉及在植物中诱导从头单倍体诱导的方法，所述方法包括在授粉期间、授粉前或授粉后将脂质化合物施用至植物的至少一种生殖组织。在一个实施例中，所述植物选自下组，该组由以下各项组成：单子叶植物和双子叶植物。在另一个实施例中，所述植物选自下组，该组由以下各项组成：稻、玉米、小麦、高粱、番茄、甜菜、粟、大麦、大豆、向日葵、棉花、燕麦、烟草、蔬菜、水果和任何其他作物植物。
根据一个示例性实施例，本发明包括能够由于马铃薯糖蛋白样磷脂酶AIIα(“PLA”)基因中人类诱导的突变而诱导单倍性的玉米或稻植物，以及所述植物的种子、花粉、植物部分和后代。
根据又另一个示例性实施例，本发明包括通过以下步骤产生的能够诱导单倍体的玉米或稻植物：从亲本玉米或稻植物获得植物材料，通过用诱变剂处理所述植物材料在所述植物材料的至少一个拷贝的PLA基因中诱导至少一个突变以产生诱变的植物材料，培养所述诱变的植物材料以产生后代稻或玉米植物，分析后代稻或玉米植物以检测在至少一个拷贝的PLA基因中的至少一个突变，选择与亲本稻或玉米植物相比具有诱导单倍体能力的后代稻或玉米植物；并且重复培养后代稻或玉米植物的循环以产生具有诱导单倍体能力的另外的后代植物。
序列表中的序列简述
SEQ ID NO:1是在GRMZM2G471240-NIL中发现的未突变的磷脂酶的cDNA序列。本文中将未突变的磷脂酶等位基因重新命名为MATRILINEAL。
SEQ ID NO:2是由SEQ ID NO:1编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是在GRMZM2G471240-mtl中发现的突变的磷脂酶的cDNA核苷酸序列，包含4个碱基对插入。本文中将突变的磷脂酶等位基因重新命名为matrilineal。
SEQ ID NO:4是由SEQ ID NO:3编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是GRMZM2G471240_nil.F1引物。
SEQ ID NO:6是GRMZM2G471240_nil.R1引物。
SEQ ID NO:7是GRMZM2G471240_rwk.F1引物。
SEQ ID NO:8是GRMZM2G471240_rwk.R1引物。
SEQ ID NO:9是事件39A ID T1个体22808-3954等位基因1中TALEN诱导的MTL突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO:10是事件23A T1个体ID 22808-3924等位基因1中TALEN诱导的MTL突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO:11是事件81A T1个体ID 22808-3932、事件81A个体ID22808-3317和事件81A个体ID 22808-3303中TALEN诱导的MTL突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO:12是事件39A ID 22808-3954等位基因2中TALEN诱导的MTL突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO:13是事件23A ID 22808-3924等位基因2中TALEN诱导的MTL突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO:14是事件38A T1个体ID 22808-4108等位基因1中TALEN诱导的MTL突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO:15是事件18A T1个体ID 22807-4016中CRISPR诱导的MTL突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO:16是事件27A T1个体ID 22807-4073等位基因1中CRISPR诱导的MTL突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO:17是事件27A T1个体ID 22807-4081等位基因1中CRISPR诱导的MTL突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO:18是事件76A T1个体ID 22873-3999中CRISPR诱导的MTL突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO:19是事件32A T1个体ID 22873-3991中CRISPR诱导的MTL突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO:20是CRISPR指导RNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO:21是Os03g27610(稻PLA2直向同源物)的基因组核苷酸序列。
SEQ ID NO:22是SEQ ID NO:21的cDNA序列。
SEQ ID NO:23是由SEQ ID NO:22编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24是未突变的GRMZM2G471240-B73的核苷酸序列。
SEQ ID NO:25是未突变的GRMZM2G471240-RWK的核苷酸序列。
SEQ ID NO:26是未突变的GRMZM2G471240-ST6的核苷酸序列。
SEQ ID NO:27是由SEQ ID NO:24编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28是由SEQ ID NO:25编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29是由SEQ ID NO:26编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:30是构建体22466的表达盒的核苷酸序列，包含野生型MATRILINEAL。
SEQ ID NO:31是构建体22467的表达盒的核苷酸序列，包含野生型磷酸甘油酸变位酶。
SEQ ID NO:32是构建体22503的表达盒的核苷酸序列，包含对靶向MATRILINEAL的外显子2的茎环结构进行编码的序列。
SEQ ID NO:33是构建体22513的表达盒的核苷酸序列，包含对靶向MATRILINEAL的外显子4的茎环结构进行编码的序列。
SEQ ID NO:34是构建体22807的表达盒的核苷酸序列，包含对靶向NP2222中MATRILINEAL的CRISPR/Cas9编辑机器进行编码的序列。
SEQ ID NO:35是构建体22808的表达盒的核苷酸序列，包含对靶向NP2222中MATRILINEAL的CRISPR/Cas9编辑机器进行编码的序列。
SEQ ID NO:36是构建体22873的表达盒的核苷酸序列，包含对靶向NP2222中MATRILINEAL的CRISPR/Cas9编辑机器进行编码的序列。
SEQ ID NO:37是构建体23123的表达盒的核苷酸序列，包含对靶向NP2222中MATRILINEAL的TALEN编辑机器进行编码的序列。
SEQ ID NO:38是构建体23501的表达盒的核苷酸序列，用双指导物靶向外显子4的稻gRNA。
SEQ ID NO:39是构建体23501的表达盒的核苷酸序列，用单指导物靶向外显子4的稻gRNA。
SEQ ID NO:40是构建体23501的表达盒的核苷酸序列，用双指导物靶向外显子1的稻gRNA。
SEQ ID NO:41是构建体23501的表达盒的核苷酸序列，用单指导物靶向外显子1的稻gRNA。
SEQ ID NO:42是事件38A ID 22808-4108等位基因2中TALEN诱导的MTL突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO:43是事件27A ID 22807-4073等位基因2中CRISPR诱导的MTL突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO:44是事件27A ID 22807-4081等位基因2中CRISPR诱导的MTL突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO:45是TILLING品系1139的核苷酸序列。
SEQ ID NO:46是TILLING品系3594的核苷酸序列。
SEQ ID NO:47是TILLING品系0505的核苷酸序列。
SEQ ID NO:48是TILLING品系2658的核苷酸序列。
SEQ ID NO:49是TILLING品系1983的核苷酸序列。
SEQ ID NO:50是TILLING品系2732的核苷酸序列。
SEQ ID NO:51是TILLING品系2414的核苷酸序列。
SEQ ID NO:52是由SEQ ID NO:45编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:53是由SEQ ID NO:46编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:54是由SEQ ID NO:47编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:55是由SEQ ID NO:48编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:56是由SEQ ID NO:49编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:57是由SEQ ID NO:50编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:58是由SEQ ID NO:51编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:59是由SEQ ID NO:9编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:60是由SEQ ID NO:10编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:61是由SEQ ID NO:11编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:62是由SEQ ID NO:12编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:63是由SEQ ID NO:13编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:64是由SEQ ID NO:14编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:65是由SEQ ID NO:15编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:66是由SEQ ID NO:16编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:67是由SEQ ID NO:17编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:68是由SEQ ID NO:18编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:69是由SEQ ID NO:19编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:70是由SEQ ID NO:42编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:71是由SEQ ID NO:43编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:72是由SEQ ID NO:44编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:73是在双色高粱(Sorghum bicolor)中发现的MTL直向同源物的氨基酸序列。
SEQ ID NO:74是在粟(Setaria italica)中发现的MTL直向同源物的氨基酸序列。
SEQ ID NO:75是在大麦(Hordeum vulgare)中发现的MTL直向同源物的氨基酸序列。
SEQ ID NO:76是在二穗短柄草(Brachypodium distachyon)中发现的MTL直向同源物的氨基酸序列。
SEQ ID NO:77是在稻品种籼稻(Oryza sativa v.indica)中发现的MTL直向同源物的氨基酸序列。
SEQ ID NO:78是在小麦(Triticum aestivum)中发现的MTL直向同源物的氨基酸序列。
SEQ ID NO:79是在小果野蕉(Musa acuminata)中发现的MTL直向同源物的氨基酸序列。
SEQ ID NO:80是在油棕(Elaeis guineensis)中发现的MTL直向同源物的氨基酸序列。
SEQ ID NO:81是在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中发现的MTL直向同源物的氨基酸序列。
Figure IDA0003761963300000011
Figure IDA0003761963300000021
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附图说明
图1是用于定位RWK中单倍体诱导性状的定位方案。
图2显示了将主要QTL缩小到bin 1.04内的非常小的区间(在67.85Mb与68.42Mb之间)内的精细定位。此区域具有七个注释的基因。我们在几个品系中的这个区间内对所述基因进行了测序和组装。单倍体诱导物品系中具有最显著的突变的两个基因显示在右下方(GRMZM2G471240和GRMZM2G062320)。
图3显示了GRMZM2G471240在单倍体诱导物和非诱导物花粉和开花后花药囊(去除花粉粒的孢子体组织)中的表达差异。此基因在雄配子体中特异性表达。
图4a显示了GRMZM2G471240的剪接特异性qRT-PCR结果。在技术上一式三份地测试R1阶段花药的三个生物学重复，并且计算每个反应的平均Ct和标准偏差。使用ΔCt的log2回归将每种转录物类型的相对量与内源对照进行比较。使用两组引物来评估两种注释剪接变体中每一种与关于剪接变体不可知的引物组相比的相对丰度。与NP2222(野生型)和NP2222-HI(单倍体诱导物)两种基因型中的长转录物相比，较短的转录物变体具有相对较低的丰度。对于测试的所有三个引物对，NP2222-HI中基因的突变型拷贝的表达显著更高。
图4b显示了来自NP2222和MTLTAL-FS植物(对于编辑的mtl样等位基因而言纯合的T1植物)的新鲜花粉的五个生物学重复在技术上一式三份地在通用引物上进行测试，并且计算每个反应的平均Ct和标准偏差。使用ΔCt的log2回归将每种转录物类型的相对量与内源对照进行比较。MTLTAL-FS花粉具有比NP2222(野生型)花粉更低的转录物丰度。
图5a显示了在B73和RWK-NIL中GRMZM2G471240基因的长剪接变体的B73预测的蛋白质序列与在RWK和Stock 6(S6)中发现的mtl等位基因的预测的序列的氨基酸比对。不同的氨基酸以红色表示；匹配的氨基酸用正常的灰色文字表示，并且终止密码子用句号表示。两个点突变导致氨基酸置换，组氨酸(H)置换为酪氨酸(Y)、以及赖氨酸(K)置换为精氨酸(N)。这些改变不是保守的；很有可能这些中的一个或两个会改良单倍体诱导表型-表明等位基因系列可能会随着对变体的进一步研究而发现。
图5b显示野生型MTL和由mtl等位基因编码的突变型(截短的)MTL具有体外磷脂酶活性。通过荧光脂质体测定在使用MTL和mtl cDNA产生的重组纯化蛋白质上测量PLA2磷脂酶活性。误差条表示基于四次重复的平均值的标准误差。
图6显示mtl负责与单倍体诱导相关的多效表型。6A：诱导物和非诱导物中花粉管萌发率相似(n＝200)。6B：初始花粉管伸长也相似(n＝25)。6C：基于发芽后代中低(25％)性状传递，RWK但不是RWK-NIL易于偏分离(SD)(n＝300)。6D：MTL/0补偿品系在发芽后代中也显示出针对mtl的SD(n＝400)。6E：显示了两个单倍体诱导物-近等基因对的RNA-seq分析结果的维恩图(左图，RWK与RWK-NIL；右图，NP2222-HI与NP2222；红色文字，上调；绿色文字，下调)。发现只有60个基因在同一方向发生显著改变。
图7显示了玉米MTL基因与八种草、两种非草单子叶植物和拟南芥(阿拉伯芥(thale cress))中公共可用的MTL直向同源物的氨基酸比对。此比对包括玉米(maize)(玉蜀黍(Zea mays))、高粱(sorghum)(双色高粱(Sorghum bicolor)，与MTL具有92％序列一致性)、谷子(foxtail millet)(粟(Setaria italica)，85％一致性)、大麦(barley)(大麦(Hordeum vulgare)，78％一致性)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)(78％一致性)、籼稻和粳稻品种的稻(Indica and Japonica variety rice)(稻品种籼稻和粳稻(Oryza sativa v.indica and japonica)，Os3g27610，分别具有78％和79％一致性)、面包小麦(bread wheat)(小麦(Triticum aestivum)，55％一致性)、香蕉(banana)(小果野蕉(Musa acuminata)，57％一致性)、油棕(oil palm)(油棕(Elaeis guineesnsis)，56％一致性)、和拟南芥(Arabidopsis thaliana)(52％一致性)。
图8.稻磷脂酶的表达谱(改编自Singh,A.等人，Rice phospholipaseAsuperfamily:organization,phylogenetic and expression analysis during abioticstresses and development[稻磷脂酶A超家族：非生物胁迫和发育过程中的组织、系统发生和表达分析]，PLOS ONE[公共科学图书馆·综合]7:e30947(2012))。与MTL最接近的同系物是稻基因
Figure BDA0003761963260000161
图9.显示了编辑Os3g27610以制造单倍体诱导物品系的途径的图。人们可以靶向基因的任何部分(这里显示-靶向第一个和第四个外显子)，并期望产生移码突变，所述移码突变导致基因敲除和功能丧失并导致单倍体诱导。
图10显示了甲基α-亚麻酰基氟膦酸酯(MALFP)的原子结构。
图11显示了甲基花生酰基氟膦酸酯(MAFP)的原子结构。
图12显示了棕榈基三氟甲基酮(PACOCF3)的原子结构。
图13显示了花生酰基三氟甲基酮(AACOCF3)的原子结构。
图14显示了海绵类脂的原子结构。
图15显示了亚油酸乙酯(LLAEE)的原子结构。
图16显示了亚麻酸乙酯(LNAEE)的原子结构。
图17显示了花生四烯酸甲酯(AAME)的原子结构。
图18显示了油酸甲酯(OAME)的原子结构。
图19显示了油酸乙酯(OAEE)的原子结构。
图20显示了棕榈酸乙酯(PAEE)的原子结构。
图21显示了棕榈油酸乙酯(PLAEE)的原子结构。
图22显示了α-亚麻酸(aLNA)的原子结构。
图23显示了γ-亚麻酸(gLNA)的原子结构。
图24显示了油酸的原子结构。
图25显示了亚油酸的原子结构。
图26显示了花生四烯酸的原子结构。
图27显示了硬脂酸的原子结构。
图28显示了9(Z)-11(E)-共轭亚油酸的原子结构。
图29显示了二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)的原子结构。
图30显示了2-油酰-1-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-乙醇胺的原子结构。
图31显示了在要求保护的发明中可操作的分子的通用原子结构。
定义
虽然认为以下术语可以很好地为本领域的普通技术人员所理解，提出以下定义是为了便于解释本申请披露的主题。
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语旨在具有与本领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文采用的技术的参考文献旨在参考本领域中通常理解的技术，包括对本领域的普通技术人员而言很清楚的那些技术的变化和/或等效技术的替换。虽然认为以下术语可以很好地为本领域的普通技术人员所理解，提出以下定义是为了便于解释本申请披露的主题。
根据长期存在的专利法公约，在本申请(包括权利要求书)中使用的术语“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”是指“一个/种或多个/种”。例如，短语“一个细胞”是指一个或多个细胞，并且在一些实施例中可以是指组织和/或器官。类似地，短语“至少一个”当在本文中用于指代实体时，是指例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100个或更多个该实体，包括但不限于1与100之间的所有整数值以及大于100的整数。
除非另外指明，本说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、反应条件等的所有数字应被理解为在所有情况下用术语“约”来修饰。如本文所使用的术语“约”，当指代可测量的值例如质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的量时，意味着涵盖在一些实施例中与规定量相比±20％的变化、在一些实施例中与规定量相比±10％的变化、在一些实施例中与规定量相比±5％的变化、在一些实施例中与规定量相比±1％的变化、在一些实施例中与规定量相比±0.5％的变化、以及在一些实施例中与规定量相比±0.1％的变化，因为此类变化适合于执行所披露的方法和/或使用所披露的组合物、核酸、多肽等。因此，除非相反地指出，在本说明书和所附权利要求书中所列出的数值参数是可以取决于试图通过本申请披露的主题获得的期望特性而变化的近似值。
如本文所使用的，术语“等位基因”是指遗传基因座处的变体或替代序列形式。在二倍体中，在每一个基因座处，单个等位基因分别从每一个亲本遗传给后代个体。存在于二倍体生物体中的给定基因座的两个等位基因占据一对同源染色体上相对应的位置，虽然本领域的普通技术人员理解在任何特定个体中的等位基因不必代表存在于所述物种中的所有等位基因。
如本文所使用的，术语“和/或”当在实体列表的背景下使用时，是指实体单独存在或以组合存在。因此，例如，短语“A、B、C和/或D”包括单独地A、B、C和D，但也包括A、B、C和D的任何和所有组合和子组合(例如，AB、AC、AD、BC、BD、CD、ABC、ABD和BCD)。在一些实施例中，“和/或”所指的一个或多个元素也可以单独存在于组合和/或子组合中的单次或多次出现中。
如本文所使用的，短语“与……相关”是指两个实体之间的可识别和/或可测定的关系。例如，短语“与HI相关”是指性状、基因座、基因、等位基因、标记、表型等或其表达，它们的存在或不存在可以影响植物或其后代表现HI的范围和/或程度。因此，当标记与性状连锁并且当标记的存在指示了期望的性状或性状形式是否会和/或会以什么程度发生在包含标记的植物/种质中时，则所述标记与所述性状“相关”。类似地，当标记与等位基因连锁并且当标记的存在指示了等位基因是否存在于包含标记的植物/种质中时，则所述标记与所述等位基因“相关”。例如，“与HI相关的标记”是指其存在或不存在可以用于预测植物是否会和/或会以什么程度展现单倍体诱导的标记。
术语“包含”(comprising)与“包括”(including)、“含有”(containing)和“特征在于”(characterized by)是同义的，是包含性的或开放式的，并且不排除另外的未列举的元素和/或方法步骤。“包含”是意指所指定的元素和/或步骤存在，但是其他元素和/或步骤可以添加进来并且仍然落入相关主题的范围内的术语。
如本文所使用的，短语“由……组成”排除未具体列举的任何元素、步骤或成分。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中，而不是立即接在序言后面时，它只限制该子句中所阐述的元素；其他元件并不排除在整个权利要求之外。
如本文所使用的，短语“基本上由……组成”限制相关的披露或权利要求的范围至规定的材料或步骤，加上并不实质上影响所披露的和/或所要求保护的主题的基本和新颖特征的那些。
关于术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”，在本文中使用这三个术语之一的情况下，本申请披露和要求保护的主题可以在一些实施例中包括使用其他两个术语中的任一个。例如，如果主题在一些实施例中涉及编码包含与SEQ ID NO:2或3具有至少95％一致性的氨基酸序列的多肽的核酸。应当理解的是，所披露的主题因此还涵盖编码在一些实施例中基本上由与SEQ ID NO:2或3具有至少95％一致性的氨基酸序列组成的多肽的核酸、以及编码在一些实施例中由与SEQ ID NO:2或3具有至少95％一致性的氨基酸序列组成的多肽的核酸。类似地，还应当理解的是，在一些实施例中，用于所披露的主题的方法包括本文所披露的步骤，在一些实施例中，用于本申请披露的主题的方法基本上由披露的步骤组成，并且在一些实施例中，用于本申请披露的主题的方法由本文中披露的步骤组成。
如本文所使用的，术语“从头单倍体诱导”是指通过引入自发单倍体诱导剂来触发单倍体诱导。这样的引入可以通过局部喷雾、手动授粉、诱变或转基因方法来实现。贯穿本说明书，术语“从头单倍体诱导”、“从头HI”和“单倍体诱导从头”可互换使用。
如本文所使用的，术语“基因”是指包括DNA序列的遗传单位，所述遗传单位占据染色体上的特定位置并且含有生物体中的具体特征或性状的遗传指令。
“遗传图谱”是对给定物种内的一个或多个染色体上的基因座之间的遗传连锁关系的描述，通常以图表或表格形式描绘。
如本文所使用的，被称为“单倍体”的植物具有单组(基因组)染色体，并且单倍体植物中减少的染色体数量(n)等于配子的数量。如本文所使用的，被称为“双单倍体”的植物通过使单倍体染色体组加倍而开发。从自交到任何数量的世代的双单倍体植物获得的植物或种子仍然可以被鉴定为双单倍体植物。双单倍体植物被认为是纯合植物。如果植物是可育的，即使所述植物的整个营养部分不包含具有双组染色体的细胞，所述植物也被认为是双单倍体；也就是说，如果植物含有存活的配子，即使它是嵌合的，也将被认为是双单倍体。
如本文所使用的，术语“人类诱导的突变”是指由于直接或间接人类作用而发生的任何突变。此术语包括但不限于通过任何定向诱变方法获得的突变。
如本文所使用的，术语“标记探针”和“探针”是指可以用于检测较大序列内序列的存在或不存在的核苷酸序列或核酸分子(例如，通过核酸杂交与标记或标记基因座的全部或部分互补的核酸探针)。包含约8、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个连续核苷酸的标记探针可以用于核酸杂交。
如本文所使用的，当鉴定HI相关的基因座的存在/不存在时，术语“分子标记”可以用于指如上文所定义的遗传标记，或其用作参比点的编码产物(例如，蛋白质)。分子标记能够源自基因组核苷酸序列或表达的核苷酸序列(例如，来自RNA、cDNA等)。所述术语也指与标记序列互补或与其侧接的核苷酸序列，如用作能够扩增标记序列的探针或引物的核苷酸序列。当核苷酸序列在溶液中特异性杂交时，所述核苷酸序列是“互补的”(例如，根据沃森-克里克碱基配对原则)。此术语也指通过与标记序列互补或与其侧接的核苷酸序列(例如用作探针或能够扩增标记序列的引物的核苷酸序列)的不存在指示性状的遗传标记。
如本文所使用的，术语“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸片段”是指单链或双链的RNA或DNA的聚合物，任选地含有合成的、非天然的、和/或改变的核苷酸碱基。“核苷酸”是从其构建DNA或RNA聚合物并且由嘌呤或嘧啶碱基、戊糖、和磷酸基团组成的单体单元。核苷酸(通常以其5'-单磷酸形式发现)通过其单字母命名指代如下：“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别针对RNA或DNA)，“C”为胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”为鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”为尿苷酸，“T”为脱氧胸苷酸，“R”为嘌呤(A或G)，“Y”为嘧啶(C或T)，“K”为G或T，“H”为A或C或T，“I”为肌苷，并且“N”为任何核苷酸。
如本文所使用的，术语“核苷酸序列一致性”是指在两个多核苷酸的对应位置处存在一致的核苷酸。当进行比对以获得最大对应时(例如，在比较窗口中)，如果在两个多核苷酸中的核苷酸序列是相同的，则多核苷酸具有“一致的”序列。通常通过在比较窗口上比较这两个序列的部分来进行两个或更多个多核苷酸之间的序列比较，以鉴定并比较序列相似性的局部区域。比较窗口通常是从约20至200个连续核苷酸。多核苷酸的“序列一致性百分比”，如约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列一致性，可以在比较窗口上通过比较两个最佳比对的序列来确定，其中为了两个序列的最佳比对，与参比序列相比，在比较窗口中的多核苷酸序列的部分可以包括添加或缺失(即，空位)。在一些实施例中，通过以下方式计算百分比：(a)确定在两个序列中出现一致的核酸碱基的位置的数目；(b)将匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数；并且(c)将结果乘以100。还可以通过已知算法的计算机化实施方式或者通过目视检查进行用于比较的序列的最佳比对。易于获得的序列比较和多重序列比对算法分别是可在因特网(例如，EMBL-EBI的网站)上获得的基本局部比对搜索工具(BLAST)和ClustalW/ClustalW2/Clustal Omega程序。其他合适的程序包括但不限于，GAP、BestFit、Plot Similarity和FASTA，它们是可从Accelrys公司(美国，加利福尼亚州，圣地亚哥)获得的Accelrys GCG软件包的一部分。还参见Smith和Waterman,1981；Needleman和Wunsch,1970；Pearson和Lipman,1988；Ausubel等人,1988；以及Sambrook和Russell,2001。
适于确定百分比序列一致性和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，它描述于Altschul等人,1990中。在一些实施例中，序列一致性百分比是指进行比较的SEQ IDNo:1的最大ORF中的gDNA、cDNA或预测的蛋白质序列之一的全长上的序列一致性。在一些实施例中，确定核酸序列一致性百分比的计算在计算中并不包括所比较的核酸之一包括“N”(即，其中在该位置可以存在任何核苷酸)的任何核苷酸位置。
术语“开放阅读框”(ORF)是指编码多肽的核酸序列。在一些实施例中，ORF包含翻译起始密码子、翻译终止(termination)(即，终止(stop))密码子、以及其间的编码多肽中存在的氨基酸的核酸序列。术语“起始密码子”和“终止密码子”是指在编码序列中三个相邻的核苷酸(即，密码子)的单位，它对应地指明蛋白质合成(mRNA翻译)的起始和链终止。
马铃薯糖蛋白样磷脂酶A2α也可以称为PLA、pPLA、pPLAIIA pPLAIIα、PLA2α、或PLA2、或其他类似的变体。马铃薯糖蛋白样磷脂酶AIIα也被称为MATRILINEAL。这些术语自始至终可互换使用。包含四个碱基对移码突变的MATRILINEAL基因特此命名为matrilineal。
如本文所使用的，术语“表型”、“表型性状”或“性状”是指植物或植物细胞的一个或多个性状。表型对于裸眼或通过本领域已知的任何其他评价手段(例如，显微术、生物化学分析、或电子机械测定)是可观察的。在一些情况下，表型直接由单一基因或遗传基因座控制(即，对应于“单基因性状”)。在单倍体诱导的情况下，使用颜色标记(例如R Navajo)和其他标记(包括通过种子内颜色的存在或不存在来可视化的转基因)证明种子是否是诱导的单倍体种子。使用R Navajo作为颜色标记和使用转基因作为检测雌株上单倍体种子诱导的手段在本领域是熟知的。在其他情况下，表型是几个基因之间相互作用的结果，在一些实施例中，其也由植物和/或植物细胞与其环境相互作用引起。
如本文所使用的，术语“植物”可以是指全株植物、其任何部分、或从植物衍生的细胞或组织培养物。因此，术语“植物”可以是指全株植物、植物组分或器官(例如，叶、茎、根等)、植物组织、种子和/或植物细胞中的任何一种。
植物细胞是从植物取得的植物细胞，或者是通过培养从取自植物的细胞衍生的植物细胞。因此，术语“植物细胞”包括但不限于种子、悬浮培养物、胚、分生区、愈伤组织、叶、嫩枝、配子体、孢子体、花粉和小孢子内的细胞。短语“植物部分”是指植物的一部分，包括单细胞和细胞组织(例如植物中完整的植物细胞)、细胞团块和可以再生植物的组织培养物。植物部分的实例包括但不限于来自以下各项的单细胞和组织：花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花、果实、茎、嫩枝和种子；以及接穗、根茎、原生质体、愈伤组织等。
如本文所使用的，术语“引物”是指如下寡核苷酸，当置于诱导引物延伸产物合成的条件下(例如，在核苷酸和用于聚合的试剂(如DNA聚合酶)的存在下以及在合适的温度和pH下)时，其能够与核酸靶退火(在一些实施例中，特异性地与核酸靶退火)，允许DNA聚合酶和/或逆转录酶与其附接，从而用作DNA合成的起始点。在一些实施例中，采用一个或多个引物来扩增核酸(例如，使用聚合酶链式反应；PCR)。
如本文所使用的，术语“探针”是指可以与靶核酸序列中的互补序列形成氢键合的双链体的核酸(例如，单链核酸或双链或更高级核酸的链、或其子序列)。典型地，探针具有足够的长度以便与其互补序列形成稳定且序列特异的双链体分子，并且这样可以在一些实施例中用于检测在多个核酸中存在的感兴趣的序列。
如本文所使用的，术语“后代”和“后代植物”是指从一个或多个亲本植物通过无性或有性繁殖产生的植物。在单倍体诱导中，母本上的种子是单倍体，因此不是诱导单倍体品系的后代。单倍体种子的后代不是唯一希望的后代。还有HI种子以及单倍体诱导植物的后续植物和种子后代。单倍体种子和HI种子两者都可以是后代。后代植物可以通过克隆单一亲本植物或使单一亲本植物自交、或者通过使两个或更多个亲本植物杂交来获得。例如，后代植物可以通过克隆单一亲本植物或使单一亲本植物自交、或者通过使两个亲本植物杂交来获得，并且包括自交体以及F1或F2或甚至更远的世代。F1是产生自亲本的第一代后代(这些亲本中的至少一个第一次被用作性状的供体)，而第二代(F2)或后续代(F3、F4等)的后代是从F1、F2等的自交、互交、回交和/或其他杂交产生的标本。因此，F1可以是(并且在一些实施例中是)从两个纯育亲本(即，对于感兴趣的性状或其等位基因而言纯育的亲本中的每一个都是纯合的)之间的杂交产生的杂交种，而F2可以是(并且在一些实施例中是)从F1杂交种自花授粉产生的后代。
如本文所使用的，短语“重组”是指在相似或相同核苷酸序列的区域中，在配对染色体的两个DNA分子或染色单体之间的DNA片段的交换(“互换”)。“重组事件”在本文中被理解为在一些实施例中是指减数分裂互换。
如本文所使用的，术语“参比序列”是指用作核苷酸序列比较的基础的确定的核苷酸序列。在一些实施例中，SEQ ID NO:1–4、22–23或73–81中的任何一个可以用作参比序列，用于与从植物获得的其他序列进行比较。
如本文所使用的，术语“再生”及其语法变体是指从组织培养物中产生植物。
如本文所使用的，短语“严格杂交条件”是指多核苷酸通常在复杂的核酸混合物中与其靶子序列杂交(但基本上不与其他序列杂交)的条件。严格条件是序列依赖性的并且在不同的环境下可以是不同的。
典型地，较长的序列在较高的温度下特异性杂交。核酸杂交的延伸指南发现于Sambrook和Russell,2001中。通常，严格条件被选择为在确定的离子强度、pH下低于特定序列的热力学熔点(Tm)约5℃-10℃。Tm是50％的与靶互补的探针杂交靶序列处于平衡状态时(在靶序列过量存在时，在Tm时，50％的探针被占据处于平衡状态)的温度(在确定的离子强度、pH、和核酸浓度下)。示例性严格条件是如下那些：盐浓度小于约1.0M钠离子、典型地在pH 7.0至8.3下约0.01M至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，并且温度对于短探针(例如，10至50个核苷酸)为至少约30℃并且对于长探针(例如，大于50个核苷酸)至少约60℃。
还可以通过添加去稳定剂(如甲酰胺)来达到严格条件。另外的示例性严格杂交条件包括50％甲酰胺、5x SSC和1％SDS，在42℃下孵育；或SSC、1％SDS，在65℃下孵育；在65℃下在0.2x SSC和0.1％SDS中洗涤一次或多次。对于PCR，约36℃的温度典型地用于低严格扩增，但是取决于引物长度，退火温度可以在约32℃与48℃(或更高)之间变化。在许多的参考文献中提供了用于确定杂交参数的另外的指南(参见例如，Ausubel等人,1999)。
如本文所使用的，术语“性状”是指感兴趣的表型、促成感兴趣的表型的基因、以及与促成感兴趣的表型的基因相关的核酸序列。例如，“HI性状”是指单倍体诱导表型、以及促成单倍体诱导的基因和与单倍体诱导表型的存在或不存在相关的核酸序列(例如，HI相关的基因产物)。
如本文所使用的，术语“转基因”是指通过某些形式的人工转移技术引入生物体或一个或多个其祖先中的核酸分子。因此，人工转移技术产生“转基因生物体”或“转基因细胞”。应当理解的是，人工转移技术可以在祖先生物体(或其中的细胞和/或可以发育成祖先生物体的细胞)中发生，并且即使一种或多种自然和/或辅助育种导致了人工转移的核酸分子存在于后代个体中，具有人工转移的核酸分子或其片段的任何后代个体仍然被认为是转基因的。
如本文所使用的，术语“定向诱变”或“诱变策略”是指导致所选择的基因的有意诱变的任何诱变方法。定向诱变包括方法CRISPR、TILLING、TALEN和其他尚未发现但可以用于实现相同结果的其他方法。
如本文所使用的，单倍体诱导率(“HIR”)意指在用单倍体诱导物花粉对穗进行授粉后存活的单倍体籽粒的数量除以籽粒的总数。
特定的问题困扰着单倍体诱导：提高的胚败育率和提高的受精失败率(降低的结籽率)。出于这些原因，存在对成功确定HI的原因，并利用该知识来确定稳定或越来越多地产生单倍体植物同时减少受精失败和胚败育的方法的需求。
特别考虑到人们可以诱变启动子以潜在地改进元件用于在植物中表达转基因的效用。这些元件的诱变可以随机进行，并且在试错程序(trial-by-error procedure)中筛选诱变的启动子序列的活性。可替代地，可以鉴定为启动子提供希望的表达特征或为启动子提供表达增强活性的特定序列，并且可以经由突变将这些或类似序列引入启动子中。进一步考虑到人们可以诱变这些序列以便增强其转基因在特定物种中的表达。用于诱变编码本发明的启动子序列的DNA区段的手段是本领域技术人员熟知的。如所指示的，可以通过随机或位点特异性诱变程序对启动子或其他调节元件进行修饰。启动子和其他调节元件可以通过从编码相应的未修饰序列的序列中添加或缺失一个或多个核苷酸改变它们的结构来进行修饰。
可以根据本领域已知的任何技术进行诱变，例如但不限于合成在特定调节序列的序列内具有一个或多个突变的寡核苷酸。具体地，位点特异性诱变是通过对基础DNA的特异性诱变可用于制备启动子突变体的技术。也可以使用RNA指导的内切核酸酶(“RGEN”，例如CRISPR/Cas9)。例如，结合一个或多个前述考虑，通过将一个或多个核苷酸序列改变引入DNA中，所述技术进一步提供制备和测试序列变体的现成能力。位点特异性诱变允许通过使用编码所希望的突变的DNA序列的特定寡核苷酸序列以及足够数量的相邻核苷酸来提供足够大小和序列复杂性的引物序列以在正在详细研究的缺失连接片段的两侧形成稳定的双链体而产生突变体。典型地，长度为约17个至约75个核苷酸或更多个核苷酸的引物是优选的，其中序列连接片段的两侧上约10个至约25个或更多个残基被改变。
在根据本发明分离出包含启动子的克隆的情况下，人们可能希望界定克隆内的基本启动子区域。用于制备诱变的启动子的一种有效的靶向手段依赖于在启动子序列内鉴定推定的调节元件。这可以通过与已知以相似的组织特异性或发育独特模式表达的启动子序列进行比较来启动。在具有相似的表达模式的启动子之间共享的序列可能是转录因子结合的候选物，并且因此可能是赋予表达模式的元件。这些推定的调节元件的确认可以通过对每个推定的调节序列进行缺失分析，接着通过测定与每个构建体功能性附接的报告基因对每个缺失构建体进行功能分析来实现。因此，一旦提供了起始启动子序列，就可以容易地制备起始启动子的许多不同的缺失突变体中的任何一个。
本文中披露的发明提供了包含可以用于构建新颖嵌合调节元件的调节元件片段的多核苷酸分子。包含这些多核苷酸分子的片段和至少一个其他调节元件或片段的新颖组合可以在植物中构建和测试并且被认为是在本发明的范围内。因此，嵌合调节元件的设计、构建和使用是本发明的一个实施例。本发明的启动子包括显示与本发明的启动子序列具有同源性的、已知影响基因调节的顺式元件的同系物。
本文所述的转录调节核酸之一的功能等价片段包含至少50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个碱基对的转录调节核酸。然后，通过缺失编码mRNA的5'非翻译区的区域获得的转录调节核酸的等价片段将仅提供(未转录的)启动子区域。5'非翻译区可以通过本领域已知的方法(例如5'-RACE分析)容易地确定。因此，本文所述的一些转录调节核酸是其他序列的等价片段。
如上文所指示的，也可以随机制备本发明的启动子的缺失突变体并且然后对其进行测定。按照此策略，制备一系列构建体，每个构建体含有启动子的不同部分(亚克隆)，并且然后筛选这些构建体的活性。用于筛选活性的合适手段是将含有缺失区段的缺失启动子或内含子构建体附接至可选择的或可筛选的标记，并且仅分离表达标记基因的那些细胞。以这种方式，鉴定了许多不同的、缺失的启动子构建体，其仍然保留了希望的甚至增强的活性。由此通过比较所选择的构建体来鉴定活性所需的最小区段。然后，此区段可以用于构建用于表达外源基因的载体。
如本文所述的表达盒可以包含另外的调节元件。在此背景下的术语应被广义地理解为包含可以影响表达盒的构建或功能的所有序列。例如，调节元件可以修饰原核生物体或真核生物体中的转录和/或翻译。本文所述的表达盒可以在待表达的核酸序列的下游(在3'方向)并且任选地含有另外的调节元件，例如转录或翻译增强子。每个另外的调节元件都可以可操作地连接至待表达的核酸序列(或转录调节核苷酸序列)。另外的调节元件可以包含可以修饰或增强表达调节性质的另外的启动子、最小启动子、启动子元件或转座子元件。表达盒还可以含有一个或多个内含子、一个或多个外显子和一个或多个终止子。
此外，考虑到启动子组合来自多于一个启动子的元件可能是有用的。例如，美国专利号5,491,288披露了将花椰菜花叶病毒启动子与组蛋白启动子组合。因此，来自本文披露的启动子的元件可以与来自其他启动子的元件组合。可用于植物转基因表达的启动子包括可诱导的、病毒的、合成的、组成的(Odell Nature[自然]313:810-812(1985))、时间调节的、空间调节的、组织特异性的和空间时间调节的那些启动子。使用本文所述的调节元件，可以在转化的植物中表达许多农艺学基因。更具体地，可以将植物基因工程化以表达农艺学感兴趣的各种表型。
本发明的化合物能以不同的几何或光学异构体(非对映异构体和对映异构体)或互变异构的形式存在。本发明涵盖了所有的此类异构体和互变异构体以及它们的处于所有比例的混合物，连同同位素形式，例如氘化的化合物。本发明还涵盖了本发明的化合物的所有的盐、N-氧化物、以及准金属络合物。
单独的或作为较大基团(例如烷氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基)的一部分的每个烷基部分是直链的或支链的，并且是例如甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基或新戊基。烷基基团包括C1–C6烷基、C1–C4烷基和C1–C3烷基。
如本文所使用的，术语“烯基”是具有至少一个碳-碳双键的烷基部分，例如C2–C6烯基。具体的实例包括乙烯基和烯丙基。烯基部分可以是较大基团(例如烯氧基、烯氧基羰基、烯基羰基、烯基氨基羰基、二烯基氨基羰基)的一部分。
术语“乙酰氧基”是指-OC(＝O)CH3。
如本文所使用的，术语“炔基”是具有至少一个碳-碳三键的烷基部分，例如C2–C6炔基。具体的实例包括乙炔基和炔丙基。炔基部分可以是较大基团(例如炔氧基、炔氧基羰基、炔基羰基、炔基氨基羰基、二炔基氨基羰基)的一部分。
卤素是氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)。
卤代烷基基团(单独的或作为较大基团(例如卤代烷氧基或卤代烷硫基)的一部分)是被一个或多个相同或不同的卤素原子取代的烷基基团，并且是例如-CF3、-CF2Cl、-CH2CF3或-CH2CHF2。
羟基烷基基团是被一个或多个羟基基团取代的烷基基团，并且是例如-CH2OH、-CH2CH2OH或-CH(OH)CH3。
烷氧基烷基基团是键合到烷基上的烷氧基基团(R-O-R’)，例如-(CH2)rO(CH2)sCH3，其中r是1至6，且s是1至5。
在本说明书的上下文中，术语“芳基”是指可以是单环的、二环的或三环的环系统。此类环的实例包括苯基、萘基、蒽基、茚基或菲基。
除非另外指明，烯基和炔基(它们本身或作为另一个取代基的一部分)可以是直链的或支链的，并且可以含有2至6个碳原子，并且在适当的情况下可以是处于(E)或(Z)构型。实例包括乙烯基、烯丙基、乙炔基和炔丙基。
除非另外指明，环烷基可以是单环的或二环的，可以任选地被一个或多个C1-C6烷基基团取代，并且含有3至7个碳原子。环烷基的实例包括环丙基、1-甲基环丙基、2-甲基环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
术语“杂环基”是指含有从1至4个选自N、O和S的杂原子的环系统，其中氮原子和硫原子任选地被氧化，并且氮原子任选地被季铵化。杂环基包括杂芳基、饱和类似物以及此外它们的不饱和或部分不饱和的类似物，如4,5,6,7-四氢-苯并噻吩基、9H-芴基、3,4-二氢-2H-苯并-1,4-二氧杂环庚基、2,3-二氢-苯并呋喃基、哌啶基、1,3-二氧戊环基、1,3-二氧己环基、4,5-二氢-异噁唑基、四氢呋喃基和吗啉基。此外，术语“杂环基”包括杂环烷基,一种非芳香族的单环的或多环的环，所述环包含碳原子和氢原子以及至少一个选自氮、氧和硫的杂原子，例如氧杂环丁烷基或硫杂环丁烷基。单环杂环烷基可以含有3至7个成员。
术语“杂芳基”是指含有从1至4个选自N、O和S的杂原子的芳香族环系统，其中氮原子和硫原子任选地被氧化，所述芳香族环系统例如具有5、6、9、或10个成员并且由单环组成或由两个或更多个稠环组成。单环可以含有多达三个杂原子，并且二环系统含有多达四个杂原子，所述杂原子将优选地选自氮、氧和硫。此类基团的实例包括吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、呋喃基、噻吩基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基和四唑基。
实例
I.鉴定PLA中的移码突变
本发明鉴定了在玉米的至少一个马铃薯糖蛋白样磷脂酶AIIα(pPLAIIα)基因中发现的一系列独立的人类诱导的突变；在至少一个PLA基因中具有这些突变的玉米植物；以及通过筛选合并的和/或单独的稻和玉米植物来产生和鉴定PLA基因中相似的和/或另外的突变的方法。本发明的稻和玉米植物由于在至少一个PLA基因中的非转基因突变而诱导单倍性。
更具体地，本发明产生了新的玉米单倍体诱导品系。存在许多已知的单倍体诱导玉米品系，包括但不限于：Stock 6、MHI(摩尔多瓦单倍体诱导物)、不定配子体(“ig”)突变、KEMS、ZEM、ZMS、KMS、RWS和RWK。本发明涉及鉴定和/或选择能够或不能够诱导单倍体的种质的方法。本发明还涉及增加和进一步开发所选择的单倍体诱导种质。本发明进一步涉及改进单倍体诱导种质以增加种子产生亲本上的单倍体诱导的方法。
从杂交种或分离的母本植物产生单倍体种子的起始步骤源自于用来自单倍体诱导物的花粉在来自种子产生植物的穗上授粉。此杂交过程的结果是产生二倍体和母本单倍体(1n)籽粒。诱导的单倍体(1n)籽粒通常通过使用指示胚倍数性的颜色标记与二倍体种子区分开来。二倍体种子通常被丢弃，而单倍体籽粒或胚通常经历染色体加倍过程以产生双单倍体植物。更具体地，用一种或多种有丝分裂阻滞剂处理单倍体遗传物质，以允许一个或多个细胞中的单倍体(1n)染色体组产生同系物对。在化学处理程序之后，除去染色体加倍化学品。允许现在的双单倍体玉米成熟，并且在种植时所产生的双单倍体种子将产生纯合植物(也称为近交植物或品系)。这些近交品系是育种者用来追求杂交种开发项目的材料。
单倍体诱导性状的基因座被精细定位。虽然已定位并公布负责单倍体诱导的在染色体1上的主要QTL(Dong等人Theor.Appl.Genet[理论与应用遗传学](2013)126:1713-1720)，但是直到现在还没有鉴定负责诱导过程的确切基因/遗传元件。为了阐明单倍体诱导潜在的发育遗传学，2006年从霍恩海姆大学(University of Hohenheim)获得了Stock 6衍生品RWK(约13％HIR)，将其与近交种NP2460和NP2391杂交，并且随后与RWK回交以产生定位群体。参见图1。
这两个群体中的HIR升高与bin 1.04中的标记SM020SDQ共分离，这与最近关于称为qhir1的QTL的报道一致。参见Prigge等人,New Insights into the Genetics of inVivo Induction of Maternal Haploids,the Backbone of Doubled HaploidTechnology in Maize[玉米中双单倍体技术骨干，母体单倍体体内诱导遗传学的新见解],GENETICS[遗传学](2012)190:781-793(讨论Bin 1.04中的HI的主要QTL[qhir1]以及Bin3.02[qhir2]、Bin 3.06[qhir3]、Bin 4.03[qhir4]、Bin 5.01[qhir5]、Bin 5.04[qhir6]、Bin 7.01[qhir7]、和Bin9.01[qhir8]中的HI的次要QTL)；Liu等人,Fine mapping ofqhir8 affecting in vivo haploid induction in maize[影响玉米中体内单倍体诱导的qhir8的精细定位],THEOR.APPL.GENET[理论与应用遗传学](2015)128:2507–2515(精细定位三十五个基因到qhir8)；Hu等人,The Genetic Basis of Haploid Induction in MaizeIdentified with a Novel Genome-Wide Association Method[用新颖全基因组关联方法鉴定的玉米中单倍体诱导的遗传学基础],GENETICS[遗传学](2016)202:1267–1276(断言qhir1是两个QTL：qhir11和qhir12，并且将qhir6精细定位到1.1Mb区域)。我们进行了几轮精细定位，并将QTL缩小到就在qhir11内的67.85Mb与68.42Mb之间约0.57Mb的区域。此地区具有七个注释的基因(图2)。
使用Illumina HiSeq2000，我们对以下各项进行了测序：RWK、Stock6、以及与RWK为近等基因但在qhir11区间具有NP2391单倍型的BC3F5非诱导物“RWK-NIL”。通过比较诱导物和非诱导物种质，确定了在单倍体诱导物中存在的四个核苷酸插入不存在于非诱导物种质中，所述核苷酸插入将GRMZM2G471240的氨基酸编码框移位。因此，本发明将在诱导物种质中具有移码突变的基因鉴定为负责玉米单倍体诱导。与基因模型GRMZM2G471240相对应的候选基因编码马铃薯糖蛋白样磷脂酶AIIα(pPLAIIα)，我们将其重新命名为MATRILINEAL(MTL)以表示野生型等位基因，并且移码等位基因被称为matrilineal(mtl)。
对于每个候选基因，从两个诱导物品系(Stock6和RWK)和一个非诱导物品系(RWK-NIL)产生DNA序列。另外，公共B73基因组数据被用作第二非诱导物品系。将基因模型信息与EST/cDNA数据进行比较以确认每个基因的结构。将注释的序列数据与每个基因的四个等位基因之间的目录差异进行比较。
序列比较揭示B73和RWK-NIL等位基因彼此相似，并且RWK和Stock 6等位基因彼此相似。大多数序列差异是不改变蛋白质编码序列的单核苷酸多态性。有一些插入和一些缺失，其中大部分是在非蛋白质编码序列中。
下表1列出了在所示区间中的基因身份。此信息来自染色体1，参见例如PatrickS.Schnable等人,The B73 Maize Genome:Complexity,Diversity,and Dynamics[B73玉米基因组：复杂性、多样性和动态学],326SCIENCE[科学]1112-15(2009)，通过引用以其全文并入本文，并且列出了来自单倍体诱导基因座内的基因的其他编码的蛋白质的简述。
Figure BDA0003761963260000321
Figure BDA0003761963260000331
在完成将单倍体诱导物性状精细定位到仅含有七个基因的区间之后，我们集中在序列组装和分析中的那些。7个基因的序列在B73与RWK-NIL之间几乎相同，但是RWK和Stock6缺少GRMZM2G062320(磷酸甘油酸变位酶(PGM))，并且在GRMZM2G471240(马铃薯糖蛋白样磷脂酶AIIα(pPLAIIα))的第四个外显子中具有4个碱基对(“bp”)插入(图2)。我们发现RWK和Stock6两者在pPLAIIα的第四个外显子中都具有相同的4bp插入，并且此基因在花粉中特异性表达(参见maizegdb.org/gene_center/gene？id＝GRMZM2G471240，通过引用并入本文)。未突变的GRMZM2G471240由SEQ ID NO:1表示。包含第四个外显子中的4bp插入的GRMZM2G471240由SEQ ID NO:3表示。
大多数被鉴定的单倍体是使用taqman标记测试发现的。此标记测试利用了RWK xNP2222之间的pPLAIIα基因的差异。在我们使用RWK作为母本并且NP2222作为父本的杂交中，对于mtl等位基因而言RWK亲本是纯合的，而对于MTL等位基因而言NP2222是纯合的。二倍体后代是MTL/mtl，并且单倍体雌核发育单倍体后代是mtl/0。因此，当此测试完成时，taqman结果显示在二倍体后代中具有1个拷贝的mtl等位基因和1个拷贝的MTL等位基因，并且在单倍体后代中具有1个拷贝的mtl但没有MTL的拷贝。当进行这种类型的杂交时，授粉后12–21天之间收获穗，提取胚并取少量胚样品用于taqman标记分析。可替代地，将胚铺在固体培养基上并使其在黑暗中发芽，使得可以在2–10天之间之后取延伸的芽或根的较大样品用于标记分析。同时保存一些组织用于倍数性分析。在后一种情况下，在使用分子测试后，单倍体的较大样品可以在CyFlow Space倍数性分析仪上运行并确认为单倍体。在大多数情况下，这导致单倍体的阳性鉴定。在一些罕见的情况下，这导致了假阳性标记结果的颠覆以及名称纠正为二倍体。
我们测试单倍体的另一种方式是经由显性标记测定。在这种情况下，使用X26雄性品系。对于以显性方式起作用的标记而言此品系是纯合的。在这样的杂交中，任何品系都可以用作母本，只要它没有标记或任何抑制标记表型的基因或等位基因即可。X26品系是非诱导物，并且对于MTL而言是纯合的。使用这样的品系，授粉后12–21天之间将后代解剖并评估标记的存在，或者直接在穗上检查它们，或者收获干燥的籽粒并评估标记的存在。二倍体后代显示标记表型，因为它们具有来自X26父本的标记基因的单拷贝，然而雌核发育单倍体后代不显示标记表型。在许多对照杂交中测试了标记的外显率和X26的自发单倍体诱导率。使用这个系统我们筛选单倍体，并且然后在倍数性分析仪上测试它们以确认它们是真正的单倍体。
我们开发了PCR测试以特异性检测“野生型”和“突变型”等位基因用于筛选19种衍生自Stock 6的诱导物，包括NP2222-单倍体诱导物(NP2222-HI)(一种RWK在先正达(Syngenta)标准可转化近交品系NP2222中的BC3渐渗)。我们还筛选了九个非诱导物对照品系。
为了开发区分RWK/Stock6与RWK-NIL单倍型的PCR测试，设计了两对引物：一对应扩增RWK/Stock6移码等位基因，而另一对应扩增B73/RWK-NIL等位基因。这些对如预期的在RWK-NIL、RWK和Stock6DNA上起作用：RWK-NIL gDNA仅扩增RWK-NIL引物对。RWK和Stock6gDNA仅扩增RWK/Stock6引物对，它特异性检测移码等位基因。对PCR产物进行测序，并且序列与来自全基因组测序的序列相同。在全基因组测序中鉴定的SNP在PCR产物中被证实。下面，在图2中，每个反应中使用的DNA以大写字母表示。引物是“nil.F1/R1”和“rwk.F1/R1”。GRMZM2G471240_nil.F1：GTACGCCGTGCGCTAACA(SEQ ID NO:5)。GRMZM2G471240_nil.R1：TCGTACCTCCCTGTCTCCAC(SEQ ID NO:6)。GRMZM2G471240_rwk.F1：TACGCCGTGCGCTAACATA(SEQ ID NO:7)。GRMZM2G471240_rwk.R1：GTACCTCGCTCCCTGTCTCC(SEQ ID NO:8)。
使用“rwk.F1/R1”和“nil.F1/R1”引物对来对一系列高、低和非诱导物进行基因型分型。我们发现所有19个单倍体诱导物品系都具有4bp插入，包括Stock6(3％单倍体诱导率[“HIR”])、RWK(来源于霍恩海姆大学(University of Honheim)原种的品系，10％–15％HIR)、RWS和Z22等。相反，在所有9个非单倍体诱导物品系中发现了野生型等位基因(平均HIR为0.1％)。数据表明移码等位基因的纯合性与诱导能力相关：12/12高和7/7低诱导物扩增移码测定但不是野生型测定，而9/9非诱导物扩增野生型但不是移码测定。这表明诱导能力与GRMZM2G471240突变相关，并且pPLAIIα是qhir11的基础并且是负责这些品系中单倍体诱导的主要突变。
Figure BDA0003761963260000361
Figure BDA0003761963260000371
我们还鉴定了移码等位基因与RWK-NIL之间的许多单核苷酸多态性(“SNP”)。对于这些SNP中的许多，STOCK6和RWK序列与我们已经测序的其他近交种一致，并且因此可能代表自然变异。实际上，大多数这些SNP不改变氨基酸序列，并且因此可能不会促成单倍体诱导表型。两个SNP确实导致氨基酸改变(H107Y；K232N)，并且这些并不是高度保守的改变，因此它们可能对表型有小的贡献，但很可能它们不影响表型，因为移码导致功能丧失。
我们重新命名pPLAIIα“MATRILINEAL”(MTL；即SEQ ID NO:1)和天然的4bp插入等位基因“matrilineal”(mtl；即SEQ ID NO:3)。根据预测的蛋白质序列，4bp插入导致蛋白质的开放阅读框在氨基酸(“AA”)352处移位出氨基酸401。移码导致提前终止密码子。
在发现移码敲除突变后，通过用野生型pPLAIIα转基因补偿单倍体诱导物品系，我们直接测试了它对单倍体诱导的影响。NP2222-HI(10.2％HIR)与MATRILINEAL的野生型拷贝的异源补偿实际上消除了单倍体诱导和籽粒败育。与对照相比，HIR下降50倍，从10％下降到0.23％。它也将胚败育率降低到0.65％。还使用野生型MTL基因与GFP的转基因融合体以及突变型等位基因mtl与GFP的转基因融合体来制备全长功能性报告基因品系，以便可视化野生型MTL的亚细胞定位，而且还查看蛋白质的突变体版本是否正确定位或完全产生。这些品系也用作额外的材料来测试补偿。对于MTL-GFP转基因而言纯合的单倍体诱导物材料(NP2222-HI)也没有表现出单倍体诱导物表型。当对于MTL-GFP而言是纯合的时，NP2222-HI的诱导率下降到0.60％。此外，MTL-GFP转基因还将胚败育敲降至4.86％。最后，我们测试了与GFP融合的突变型mtl等位基因是否补偿单倍体诱导表型，而它没有。与对于突变型融合转基因mtl-GFP而言纯合的NP2222-HI相比，在NP2222-HI中单倍体诱导和胚败育率非常相似。参见表3。这代表了MATRILINEAL移码负责单倍体诱导且为其所需的确凿证据。为了应用此知识，我们证明突变或调节pPLAIIα在野生型品系中的表达导致产生新的单倍体诱导品系。
表3.单倍体诱导物、补偿和编辑的品系的繁殖特性。此表显示了NP2222背景中诱导物品系的单倍体诱导和籽粒败育率。首先列出测交数目(“穗”)，并且然后列出籽粒和胚统计数据。胚败育和单倍体诱导通常在同一个穗上一起发生。这就是为什么在由NP2222-HI父本杂交的穗中胚败育率非常高，其单倍体诱导率(HIR)为10.17％。两个WT转基因(包括一个没有GFP和一个与GFP融合)补偿了单倍体诱导表型。同时，与GFP融合的突变型mtl没有补偿。
Figure BDA0003761963260000391
使用转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)，通过在靠近mtl中4bp插入位点将小缺失引入MTL中，在近交种NP2222中产生几个mtl样等位基因(Boch,J.等人,Breaking thecode of DNA binding specificity of TAL-type III effectors[破解TAL-III型效应物的DNA结合特异性的密码],SCIENCE[科学]326:1509–1512(2009)，通过引用并入本文)。几个突变体事件是自花授粉的，并且将缺乏TALEN T-DNA插入、但在MTL中对于小缺失而言纯合的T1植物与NP2222异型杂交。MTL(在下文称为MTLTAL-FS)中对于移码缺失而言纯合的编辑的品系展现出4.0％–12.5％(平均6.65％)的HIR(表4)。118/127推定的单倍体的倍数性状态通过流式细胞术证实，并且表型评价表明这些植物是单倍体。这些结果证明，MTL中的移码足以诱导高比率的单倍体诱导。已定位表型的其他贡献者，包括邻近的qhir12(参见Liu,2016))，其可以解释MTLTAL-FS与NP2222-HI的HIR之间的差异。合理地推断，结籽率、HIR率和籽粒败育率是通过父本和母本基因型特异性相互作用由mtl设置的。
Figure BDA0003761963260000401
玉米中单倍体种子形成是由缺陷的雄配子体引发的合子后特征。此事实反映在MTL表达数据中。公共的RNA-seq谱表明野生型MTL转录物对开花期花药是特异的(参见Sekhon,R.S.等人Genome-wide atlas of transcription during maize development[玉米发育期间全基因组转录图谱],PLANT JOURNAL[植物杂志],66,553-563(2011)，通过引用并入本文)，与仅在开裂前花药中发现的发育谱一致(参见Zhai,J.等人Spatiotemporallydynamic,cell-type–dependent premeiotic and meiotic phasiRNAs in maize anthers[在玉米花药中的具有时空动态、细胞类型依赖性减数分裂前和减数分裂phasiRNA],PNAS[美国国家科学院院刊]112,3146–3151(2015)，通过引用并入本文)。我们发现野生型花粉与开花后花药囊相比具有多18倍的MTL转录物，表明所述基因是雄配子体特异性的(图3)。通过RNAi敲低MTL的尝试导致仅MTLRNAi的单倍体形成率升高(表5)。有两种注释的MTL剪接变体，反映了在外显子2的3'末端之前81个核苷酸的可变剪接位点。与NP2222相比，Mtl在NP2222-HI而不是MTLTAL-FS花粉中升高(图4)，而两种注释的剪接变体的丰度是一致的。
表5.RNAi构建体22503(SEQ ID NO:32)敲低Mtl导致单倍体诱导。
Figure BDA0003761963260000411
mtl中的移码出现在氨基酸380处，导致20个改变的氨基酸，随后是将蛋白质截短29个氨基酸的提前终止密码子(图5a)。在RWK-NIL和NP2222花粉的LS-MS谱中发现野生型MTL蛋白，但低于在三个RWK中的三个和3个NP2222-HI样品中的3个的检出限(表6)。这表明即使在花粉中产生突变型mtl转录物，也没有检测到蛋白质，证实这是功能丧失突变。突变型和野生型重组MTL两种蛋白在pPLAIIα样荧光脂质体切割测定中表现出体外磷脂酶活性(图5b)。这表明MTL基因的功能注释(即它编码磷脂酶蛋白)是正确的。
表6.在NP2222和NP2222-HI花粉样品中关闭和启动的蛋白质，包括在NP2222花粉中发现但不在NP2222-HI花粉中发现的MTL。
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*ND，未检测出
II.花粉萌发和定位实验
使用全长功能性报告基因品系来表征MTL定位。在NP2222或NP2222+mtl-GFP/mtl-GFP的花粉中没有发现信号。相反，NP2222+MTL-GFP/MTL-GFP花粉在两个精细胞的细胞质中表现出强信号。此信号发现于萌发的花粉管内的黏性配子细胞质中。在授粉后18小时用MTL-GFP花粉固定的NP2222胚囊在退化的助细胞的区域中具有与受精期间递送的SC一致的信号。这表明MTL是花粉管破裂后沉积在胚囊中的雄性生殖单位的一部分。MTL-GFP但不是mtl-GFP消除了NP2222-HI中的单倍体诱导(表3)。总的来说，这些数据表明MTL是对SC细胞质特异的磷脂酶，并且mtl中的移码危害在单倍体诱导物花粉中的MTL定位或稳定性。
将MTL鉴定为玉米单倍体诱导中的诱发基因允许对历史上与所述性状相关的多效表型进行剖析。磷脂酶突变与延迟的花粉萌发和管生长相关(参见Kim,H.J.等人Endoplasmic reticulum-and golgi-localized phospholipase A2plays criticalroles in Arabidopsis pollen development and germination[内质网和高尔基体定位的磷脂酶A2在拟南芥花粉发育和萌发中起关键作用],PLANT CELL[植物细胞]23,94-110(2011))，但这些在RWK、Stock 6和MTLTAL-FS品系中是正常的(图6A、图6B)。用NP2222-HI和MTLTAL-FS花粉授粉的穗表现出约10％-25％的受精失败，并且花粉竞争测定显示RWK易于偏分离(SD)(图6C)，与先前的报道一致(参见Xu,X.等人Gametophytic and zygoticselection leads to segregation distortion through in vivo induction of amaternal haploid in maize[配子体和合子选择通过在玉米中体内诱导母本单倍体导致偏分离],J.EXP.BOT.[实验植物学杂志]64,1083-1096(2013))。与半合子NP2222-HI+MTL/0花粉的杂交产生了针对MTL+后代的比例偏差(图6D)，表明诱导物SD归因于mt1。与胚乳增殖失败相关的单倍体诱导的持续副产物胚败育在天然和MTLTAL-FS诱导物中以相似的比率发生(表4)。总的来说，这些数据暗指与单倍体诱导相关的每个生殖缺陷中的mtl。通常提出以解释单倍体形成的两种机制是单受精和合子后基因组消除(参见Sarkar,K.R.和Coe,E.H.,Agenetic analysis of the origin of maternal haploids in maize[玉米中母本单倍体起源的遗传学分析],GENETICS[遗传学]54,453-464(1966)；Zhang,Z.等人,Chromosomeelimination and in vivo haploid production induced by Stock 6-derived inducerline in maize(Zea mays L.)[玉米(Zea mays L.)中由Stock 6衍生的诱导物品系诱导的染色体消除和体内单倍体产生],PLANT CELL REP.[植物细胞报告]27,1851-1860(2008)；以及Barret,P.,Brinkmann,M.和Beckert,M.,A major locus expressed in the malegametophyte with incomplete penetrance is responsible for in situ gynogenesisin maize[在具有不完全外显率的雄性配子体中表达的主要基因座负责玉米中的原位雌核发育]THEOR.APPL.GENET[理论与应用遗传学]117，581–594(2008))。在前者中，单倍体由中央细胞而不是卵子的受精引起，其随后经由孤雌生殖发育。在后者中，双受精先于雄性染色体消除。阐明精确的机制将需要在MTLTAL-FS授粉后仔细的胚胎学研究，连同跟踪玉米单倍体中罕见的雄性DNA持续存在的定量数据。
最近，在拟南芥中经由操纵着丝粒组蛋白3(CENTROMERIC HISTONE3)来工程化单倍体诱导，其通过杂交基因组之间的合子后着丝粒失衡引起单亲基因组消除。在玉米中复制这个的尝试是成功的(参见Ravi,M.和Chan,S.W.L.Haploid plants produced bycentromere-mediated genome elimination[由着丝粒介导的基因组消除产生的单倍体植物],NATURE[自然]464,615-618(2010))，但是这个文件是由不结合染色质的细胞质蛋白触发的单倍体诱导物系统的首个例子。因此，这项工作突出了非核精子组分在繁殖成功和忠实的基因组传递中的重要性。在草中(尤其是在最接近的同系物是花粉特异性的并且也发现于精子中的稻中)MTL的保守(参见图7)，表明这些发现将导致在重要作物植物中开发新颖的种内单倍体诱导物品系。
III.诱导从头HI的化学喷雾
在发现MTL磷脂酶(并且具体地，mtl功能丧失移码突变)触发单倍体诱导后，我们测试了磷脂酶抑制剂、脂肪酸或其他脂质化合物是否可以充当化学单倍体诱导物。
我们通过将各种化学物质施用于花、花丝、穗、雄花穗和花粉成功实现了从头单倍体诱导。这些化学物质全部都属于脂质或磷脂酶抑制剂的类别。表7概述了那些化学物质以及由于它们的施用引起的单倍体诱导率。表7中还有配制品信息和施用方式信息。从此表中可以清楚地看出，当在授粉之前、授粉期间或授粉之后施用到花丝(其是对玉米植物特异的柱头组织)、花粉、雄花穗(其在花粉散落之前包含含有花粉的雄花)、和穗上时，多种脂质化合物从头诱导单倍体。此类化合物包括混合油、脂肪酸、脂肪酸酯、磷脂和磷脂酶抑制剂。
我们测试了许多磷脂酶抑制剂，包括海绵类脂(一种没有任何脂肪酸链的磷脂酶抑制剂)。这种化学物质能够从头诱导单倍体形成。有了这个结果，我们开始测试更多的化合物。我们发现用于从头诱导的最有活性的化合物是甲基α-亚麻酰基氟膦酸酯(MALFP)(一种有效的磷脂酶抑制剂)和其他脂质修饰酶的抑制剂。此化合物含有三个亚麻酸脂肪酸链(18个碳原子和三个三键)和在头基位置的羟甲基(methyol)基团和氟原子。另一种高活性的从头单倍体诱导物化合物是甲基花生酰基氟膦酸酯(MAFP)，另一种具有略微不同的脂肪酸链结构的磷脂酶抑制剂(20个碳和四个双键)。不希望受理论束缚，MALFP和MAFP通过位于脂肪酸链结合口袋中来抑制磷脂酶，并且在一些情况下通过催化活性位点中丝氨酸氨基酸的不可逆磷酸化来抑制磷脂酶(参见Lio Y.C.,Reynolds L.J.,Balsinde J.和DennisE.A.Irreversible inhibition of Ca(2+)-independent phospholipase A2 by methylarachidonyl fluorophosphonate[通过甲基花生酰基氟膦酸酯不可逆地抑制Ca(2+)独立性磷脂酶A2].BIOCHIM BIOPHYS ACTA[生物化学与生物物理学学报]1302:55-60(1996))。一些脂肪酸(如亚油酸和亚麻酸)也可以通过位于脂肪酸链结合口袋中而不共价修饰活性位点来非竞争性地抑制磷脂酶，但是这种抑制的作用较弱。Ballou,L.R.和Cheung,W.Y.Inhibition of human platelet phospholipase A2 activity by unsaturatedfatty acids[通过不饱和脂肪酸抑制人血小板磷脂酶A2活性]PROC NATL ACAD SCI[美国国家科学院院刊]82(2):371-375(1985))。这些参考文献可能有助于解释我们的发现的原因：从头单倍体诱导不仅由磷脂酶的强抑制剂(像MALFP和MAFP)触发，而且还由脂肪酸酯触发，所述脂肪酸酯包括：具有20个碳和四个双键(多不饱和的20碳脂肪酸酯)的花生四烯酸甲酯(AAME)、以及具有18个碳和两个双键(18:2)的亚油酸(LLE)、和具有18个碳和三个双键(18:3)的亚麻酸(LNA)、和油酸乙酯(OAEE)、和花生四烯酸(其具有20个碳和四个双键)。同样认为，这些不饱和脂肪酸链，无论是处于其游离脂肪酸形式、其酯形式(其在实验室中合成并且能够穿透组织)还是处于某种其他形式，都可以充当磷脂酶的抑制剂。尽管通常不认为这些化合物的酯形式可以抑制磷脂酶(参见Ballou，同上)，但是我们发现这样的脂肪酸甲酯和脂肪酸乙酯确实可以导致从头单倍体功能。参见表7。值得注意的是，测试了饱和脂肪酸和衍生物，包括硬脂酸和棕榈酸乙酯。现有技术指出，含有饱和脂肪酸侧链的分子不会或将不能通过驻留在其活性位点中来竞争性抑制磷脂酶。参见Ballou，同上。据信此类化合物缺乏抑制磷脂酶的能力。然而，令人惊讶地，我们能够使用含有饱和脂肪酸侧链的分子从头诱导单倍体的形成。例如，棕榈酸乙酯(PAEE)诱导单倍体。参见表7。
我们还决定测试某些油和磷脂是否可以触发从头单倍体诱导，包括普通植物油。我们发现一种高活性的从头单倍体诱导物脂质混合物是玉米油(一种可以从杂货店购买的天然植物提取物)。另一种高活性脂质混合物是可以从五金店购买的亚麻籽油。低芥酸菜籽油、植物油、花生油、芝麻油或任何其他油以正确的方式施用时也很好地起作用。另一种高活性化合物是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-磷脂酰胆碱(DSPC)(也称为18:0 18:0PC)(一种具有磷脂酰胆碱头基和两个18碳饱和脂肪酸链的磷脂)。这种常见的磷脂存在于许多生物材料中，因为它是磷脂双分子层的核心和最丰富组分之一，其构成了地球上所有生物体的细胞膜。另一种单倍体诱导化合物是具有一个硬脂酰和一个油酰链的磷脂酰乙醇胺(也称为1-硬脂酰-2-油酰-sn-磷脂酰乙醇胺)，另一种常见的磷脂。其他磷脂、以及溶血磷脂(lyso-phospholipid)和其他三酰甘油酯、二酰甘油、溶血磷脂(lysophospholipid)、三萜酯或甘油脂将充当从头单倍体诱导物。这些油和磷脂通常已知不会抑制磷脂酶，但是它们可能是产生磷脂酶活性副产物的原料，包括抑制磷脂酶的特有的脂肪酸。因此，这些化合物充当从头单倍体诱导物化学物质的事实表明，这些油和磷脂可能间接抑制磷脂酶，或它们可能导致花粉的脂质或膜组成不均衡或改变，从而导致单倍体诱导。无论哪种方式，从这项工作中可以清楚地看出，除了非脂质磷脂酶抑制剂以外，大量的含脂质的化合物当施用于花时，可以充当单倍体种子的化学诱导物。
我们还测试了我们用于将这些化合物施用于花的缓冲液是否能够独立地诱导单倍体。这些缓冲液可变地包括某些表面活性剂共混物和/或盐和/或DMSO(二甲亚砜)和/或其他相关添加物。这些缓冲液不能诱导单倍体，如在表7的第121–123行可以看出。同样，如从第1行可以看出，玉米中在没有添加任何化合物的情况下从头单倍体诱导是非常罕见的。在所测试的3,073个后代中发现了两个单倍体(Kelliher等人Maternal haploids arepreferentially induced by CENH3-tailswap transgenic complementation in maize[在玉米中母本单倍体优先通过CENH3-tailswap转基因补偿来诱导],FRONTIERS IN PLANTSCIENCE[植物科学前沿]7:414(2016))。因此，发现对照诱导率为大约0.065％，其落入所报道的雌核发育单倍体诱导的背景(0.05％-0.1％)内(Chang,M.-T.和Coe,E.“Doubledhaploids”[双单倍体]，在Molecular Genetic Approaches to Maize Improvement[玉米改良的分子遗传学方法]中，编辑A.L.Kriz和B.A.Larkins(海德堡：施普林格出版社(Springer)),127–142)。
这些不同的脂质和脂肪酶抑制剂化合物的施用方式可以是非常多变的，并且仍然产生单倍体。一种这样的施用方式是将化合物溶解在添加有1％DMSO的盐溶剂中。另一种这样的溶剂是表面活性剂共混物(表8)。如从表7中明显看出，施用组织也可以变化，其中在授粉期间施用于花粉和花丝两者以及在授粉前数小时或数天施用于雄花穗可以导致单倍体形成。此外，各种浓度的化合物可以诱导单倍体，从20μM至100mM、或从0.2mg/mL直至50mg/mL。事实上，如从表7可以看出，比这广泛得多的范围能够诱导单倍体。
在两种情况下，我们还开发了新颖表面活性剂共混物以帮助特定类别的脂质能够乳化并形成微乳剂(脂滴尺寸小于某一尺寸-直径至少小于10微米并且在许多情况下直径小于1微米的水性-有机共混物)。关于两种表面活性剂共混物的组成，参见表8。共混物“91”理想地与脂肪酸一起使用，浓度为6.5份表面活性剂共混物比1份脂肪酸。但是，多种相关浓度和相关的表面活性剂共混物也可以起作用。表面活性剂共混物“92”理想地与脂肪酸酯以及油(以纯的形式或作为甘油三酸酯混合物)一起使用。理想地，这按10份表面活性剂共混物比1份酯或油的比例混合。化合物的这些共混物或相关共混物中的任何一种可能适合于用除脂肪酸、酯和油以外的相关脂质分子类别进行适当溶解或微乳剂构造。这些可以包括磷脂、二酰甘油、溶血磷脂、三萜酯或甘油脂。
典型地将这些表面活性剂共混物与活性成分混合，并且然后以某一百分比与水性缓冲液混合以制备乳剂并且理想地微乳剂。当制备乳剂时，表面活性剂共混物+活性成分在水性缓冲液中的百分比可以为从0.01％-50％的任何数。水性缓冲液可以由任何数量的物质组成。我们使用了1x PBS+1％DML和PBS+50％DML，但其他配制品也同样起作用。“PBS”代表磷酸盐缓冲盐水；“DML”代表二甲基乳酰胺。
单独使用这些缓冲液不能导致从头单倍体诱导，如在表7第121–123行可以看出。
所述化合物的施用方式可以采用任何数量的形式，包括花浸渍、花注射、显微注射、花粉浸泡、花粉薄雾、花粉喷雾、花薄雾、花喷雾、花丝浸透、花丝喷雾等。在授粉之前、授粉期间或授粉之后，我们最常使用雄花穗、花粉和花丝喷雾。当在授粉之前两天对雄花穗进行喷雾时，我们用DSPC和亚麻酸实现了从头单倍体形成。当在花粉收集和随后的授粉之前几分钟对雄花穗进行喷雾时，我们还使用DSPC实现了从头单倍体形成。类似地，当就在授粉之前或授粉期间对花粉进行喷雾时，以及还在授粉之前、授粉期间或授粉之后(包括授粉前长达两天和授粉后长达六个小时)对花丝进行喷雾时，我们使用DSPC实现了从头单倍体形成。
当使用不同的施药器时，我们还展示了从头单倍体形成，这些施药器包括人们可以在便利店购买的便宜塑料喷雾瓶；雾化器，其是用于以非常小的水滴的形式口服地递送药物的医疗装置。虽然喷雾瓶典型地产生直径为50-150微米的液滴尺寸，但雾化器能够产生小于10微米的液滴尺寸。这对于施用于花粉是有益的，因为在大多数植物中花粉尺寸范围为直径从20-200微米(玉米中大约70微米；稻中大约50微米)，并且如果来自典型喷雾瓶的液滴之一撞击花粉粒，则液滴将比花粉粒更大。花粉对水分和渗透压休克非常敏感。如果花粉粒与太大尺寸的液滴接触，则该花粉粒不能使成功的、正在生长的花粉管萌发。如果花粉粒落在太湿的柱头或花丝上的情况可能也是如此-例如，如果该花丝或柱头接受过多的脂质施用(其是微乳剂、或者仅仅是形成于水性溶液中的脂质滴或微团)。如果我们经由喷雾瓶或雾化器向花粉或花丝施用超过3mL的脂质喷雾，我们通常会得到非常低的结籽。
因此，施用方式是至关重要的，并且特别地最重要的是通常尝试向花粉或柱头或花丝或花施用尽可能少的喷雾量，并且分布尽可能少的体积的活性成分(尤其是脂质)的最佳方式是制备该脂质在水性缓冲液中的微乳剂，其中脂滴尺寸处于亚微米水平，并且然后用雾化器或类似装置分配该微乳剂，所述雾化器或类似装置能够使液滴尺寸在1-2微米范围内。这导致以“蒸汽”形式向相关组织中递送数百万的活性成分液滴，其中液滴尺寸比花粉粒本身小>100,000倍的体积(如果液滴为1微米，并且花粉粒为50微米，则液滴的直径比花粉粒小50倍。并且503＝125,000，所以液滴的体积比花粉粒小>105,000倍。对于微乳剂，脂滴尺寸的直径可以在从大约20–1000nm范围内，因此取决于表面活性剂共混物加上水性溶液中的活性成分的浓度，人们可以将每个液滴中的一个或多个脂质包递送到每个花粉粒或花丝。此外，考虑到一些脂质类型分子或磷脂酶抑制剂可以溶解在水性溶液中而不是作为微乳剂递送，我们发现各种浓度的化合物可以诱导单倍体，从20μg/mL直至50mg/mL。可能较高的浓度会从头诱导单倍体。
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表8.配制品91(“F91”)和配制品92(“F92”)的处方，其帮助活性成分如脂肪酸、油、酯和磷脂在非常小的脂滴中乳化。配制品91是一种表面活性剂共混物，与脂肪酸最佳地按1份脂肪酸比六份半配制品91混合。混合物意味着用水性缓冲液以0.001％–50％的浓度产生乳剂。配制品92也是一种表面活性剂共混物，其可以与酯或油最佳地按1份活性成分比10份配制品92混合，然后在水性缓冲液中以0.001％–50％的浓度乳化。
Figure BDA0003761963260000561
IV.通过施用脂质化合物提高HIR和恢复结籽
单倍体诱导物和非诱导物花粉(比较地)的分子概况分析(包括代谢组学和脂肪组学分析)显示单倍体诱导物花粉在某些类型的脂质类别中特别不足并且在其他类别中过多。这种不足在脂质分子的18碳链类别中尤其显著，尽管它也在20碳链类别中可见。不足在具有一个和两个双键的18碳链脂质(所谓的油酸酯和亚油酸酯)中尤其显著，并且过多尤其在具有三个双键的18碳链脂质(所谓的亚麻酸酯)发现。关于在单倍体诱导物花粉中改变的脂质类型，其非常宽泛，并且包括甘油三酸酯、二酰甘油酯、游离脂肪酸、溶血磷脂和磷脂。单倍体诱导物花粉中脂质含量的变化跨越不同水平的脂肪酸饱和度也是可变的。在看到此数据之后，我们决定在用单倍体诱导物花粉授粉期间向花施用脂质化合物来看看简单添加某些类型的脂质是否可以影响单倍体形成率或籽粒计数。我们特别感兴趣的是施用在其分子结构中含有一些18或20碳饱和脂肪酸链的化合物，所述化合物在于单倍体诱导物花粉中看起来丰度较低的那些(如油酸和亚油酸)之列。
如表10–13中所示，脂质施用也可能导致单倍体形成率、结籽率提高和籽粒败育频率降低。表10显示了使用化合物甲基α-亚麻酰基氟膦酸酯(MALFP)的九个单独的对照实验。每个实验涉及从同一父本中收集的完全相同的花粉群体，在同一天、在几乎完全相同的时间(在彼此的5分钟内)通过相同的单倍体诱导物父本植物杂交的两个穗。这两个穗接受对照缓冲液施用，或缓冲液加活性成分。测试雄株和测试雌株两者在同一温室中在相同条件下彼此相邻生长。平均而言，并且与不用MALFP的缓冲液的对照施用相比，当施用MALFP时，单倍体诱导率提高了3.6％，籽粒数增加了近42个/穗，并且每个穗回收的单倍体总数增加了11.8个单倍体/穗，胚败育频率下降了1.1％(表9)。这些全部都代表了单倍体诱导产生方案的改进。当使用配制品91用作表面活性剂共混物来溶解MALFP时，改进尤其明显。这些抑制剂与mtl具有累加效应导致更高诱导率的机制可能是，它们破坏了其他磷脂酶或脂质修饰蛋白。
收集脂肪酸乙酯LLAEE的相同类型的数据，导致单倍体诱导率提高2.4％，每个穗形成的籽粒增加43个以上，每个穗增加超过8个单倍体，并且胚败育频率降低3.7％。尽管许多这些处理涉及不同量的活性成分，但在大多数这些实验中，LLAEE导致这些单倍体形成和结籽率统计数据提高。参见表10。
收集脂肪酸亚油酸(LLA)的相同类型的数据(表11)，导致单倍体诱导率提高1.5％，每个穗的存活籽粒增加41个和每个穗单倍体增加7.6个，并且胚败育率降低2.9％。这是22个独立实验的结果，同样每个实验都由一个通过对照缓冲液授粉的穗和一个通过缓冲液加活性成分(LLE)授粉的穗组成。有趣的是，单倍体诱导物花粉中18:2的丰度下降(如通过脂质组学数据所示)。不希望受理论束缚，推测这可能导致或促成受精问题和胚败育是合理的。当我们经由喷雾施用LLA和LLAEE添加回这些时，这些分子可能抑制磷脂酶从而导致更高的HIR，并且补偿18:2从而导致更多的籽粒。
最后，收集了MAFP的类似的数据，并且看到类似的结果，包括单倍体诱导率提高1.9％，每个穗回收的单倍体数量增加6.6个，总籽粒数增加28个，以及胚败育率下降2.2％(表12)。这些化合物以及其他脂质可以用于提高单倍体诱导苗圃中单倍体胚形成的频率，并且还可以用于增加自花授粉单倍体诱导物品系背景下的结籽以便增加那些品系的更多的原种种子。
表9.MALFP对HIR、结籽、籽粒败育和回收的总单倍体的影响。
Figure BDA0003761963260000581
表10.LLAEE对HIR、结籽、籽粒败育和回收的总单倍体的影响。
Figure BDA0003761963260000582
Figure BDA0003761963260000591
表11.LLA对HIR、结籽、籽粒败育和回收的总单倍体的影响。
比较亚油酸(LLA)与对照
Figure BDA0003761963260000592
Figure BDA0003761963260000601
表12.MAFP对HIR、结籽、籽粒败育和回收的总单倍体的影响。
比较MAFP与对照
Figure BDA0003761963260000602
Figure BDA0003761963260000611
V.PLA的诱变/敲除
努力在单倍体诱导杂交期间改变单倍体诱导率或降低胚败育率，我们通过几种方法产生或获得了几个突变型品系，包括GM RNAi品系、TILLING品系、CRISPR品系和TALEN品系。首先，我们寻求pPLAIIα的定向诱变是产生新的单倍体诱导物品系的可行策略的证据。因此，针对在突变型单倍体诱导物等位基因中含有移码的相同序列，我们测试了CRISPR/CAS9和TALEN玉米定向突变策略两者。这导致产生具有新颖突变的品系，我们测试了其单倍体诱导。
CRISPR过程有三个关键组分。参见美国专利号8,697,359B1，通过引用以其全文并入本文。第一个关键组分是靶序列。第二个是Cas9，其是核酸内切酶。第三个关键组分是指导RNA(“gRNA”)，其与靶序列互补并且负责将Cas9募集到所希望的位置。靶序列的长度为18至20bp，并且最佳地应该恰好位于植物基因组中的前间区序列邻近基序(“PAM”)的5'。对于来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9，PAM序列应该是5’-NGG-3’。可以通过Pol III启动子U3(RNA开始于A)或U6(RNA开始于G)来驱动gRNA的转录。gRNA应该就在A(U3)或G(U6)之后的5'端携带靶序列。Cas9将在PAM序列的3个碱基对5'的靶序列处产生双链断裂(“DSB”)。Cas9的氨基酸序列与来自化脓性链球菌菌株SF370的Cas9相同，其中在NUC叶中的PI结构域(1099–1368)中具有两个氨基酸改变(L1164V和I1179V)。在转化实验中已经证明Cas9活性在玉米中具有大约90％的测试靶序列的突变频率。通常，明智的是在靶区域中鉴定多个候选PAM和靶序列，然后通过观察哪些序列在靶的基因组中是唯一的来寻找最佳的那个。靶植物是玉米、稻或任何单子叶植物。
按照此策略以鉴定与现有的移码突变重叠的CRISPR靶序列。精确的切割位置是与移码中的插入点距离仅两个碱基对。含有Cas9和gRNA两者的构建体被转化到玉米植物中。通常，双等位基因的或纯合的突变型植物可从所产生的多个事件中回收，但杂合的突变型植物也是有用的。使杂合植物自交，然后长出T1种子，筛选突变的纯合性，并进行异型杂交。简单地使纯合的或双等位基因的突变型T0转化体自交，并与未转化的NP2222异型杂交。分离所有异型杂交的胚用于进行倍数性分析以发现单倍体。
产生了三个不同的定向诱变构建体：CRISPR/CAS9 I、CRISPR/CAS9 II和TALEN。CRISPR/CAS9 I和CRISPR/CAS9 II之间的差异很小。所有三个构建体的靶位点基因座都是在单倍体诱导物品系中发现移码的相同区域。对于CRISPR构建体，指导RNA序列开始于核苷酸+1560:-GTCAACGTGGAGACAGGG-(即，SEQ ID NO:20)。SEQ ID NO:20的–AGG–PAM位点加下划线并用斜体字。单倍体诱导物品系中的四个碱基对的插入是在该确切位点，核苷酸+1576处。转化后，选择几个不同的CRISPR I事件(包含在SEQ ID NO:34中发现的表达构建体)、CRISPR II事件(包含在SEQ ID NO:36中发现的表达构建体)和TALEN事件(包含在SEQ IDNO:35中发现的表达构建体)，使其生长至成熟，并结出存活的种子。在T0代中，我们在靶位点处进行PCR并在亚克隆后对PCR产物进行测序。我们在那些事件中鉴定出许多独特的突变(并且许多事件是嵌合体或具有多个等位基因)。
许多植物是嵌合的，如在T1代中出现多个不同序列所证明的。在T0自花授粉后，T1植物对于靶诱变构建体以1:2:1分离，并且许多在靶基因座处具有处于双等位基因的或纯合的状态的新颖突变。我们使用TAQMAN标记在DNA水平上筛选幼苗，鉴定缺少Cas9或TALEN转基因的双等位基因，并且进行PCR测序以便在GRMZM2G471240基因序列中产生PCR产物读数碱基对+1494至+1691。然后我们测试了纯合突变体的单倍体诱导能力。关于新T1植物在mtl基因处的序列，参见SEQ ID NO:9–19和42–44。
测量推定的新品系的HIR。参见上述表4。此HIR数据来自于父本是推定的单倍体诱导物品系且母本是我们的标准近交转化品系NP2222的杂交。使用TALEN介导的或CRISPR/CAS9介导的pPLAIIa基因座的定向突变产生推定的单倍体诱导物品系。在这里显示的那些中，有十一株不同的推定诱导物植物，所述植物包含来自三个不同转化构建体的八个不同事件。事件39A是TALEN事件。事件18A和27A是CRISPR事件。后者是作为T0植物的嵌合体，并且在其自花授粉后，在T1群体中发现了多个突变，包括“双等位基因的”植物(所谓双等位基因的，我们的意思是当我们对突变的pPLAIIα的区域进行测序时，我们发现了两个不同的新颖等位基因-使得很清楚的是，基因的两个野生型拷贝已经突变，但它们以不同的方式突变，所以有两个新颖的等位基因)。因此，这11株个体植物中的每一株在pPLAIIα中具有不同的突变组合。他们都有的共同点是11株植物中没有一株具有pPLAIIα的野生型拷贝。因此，这些全部都是pPLAIIα基因的“纯合突变体”。所述突变全部都是外显子4中的移码，模仿天然的单倍体诱导物品系中的原始突变。使用这五株植物作为父本，我们在一个或几个雌穗上杂交，产生数千个胚。我们解剖那些后代并对其进行倍数性分析，并且发现后代组中的每一个都具有至少3.98％的单倍体，最多12.5％的单倍体。这表明在pPLAIIa中产生突变将导致单倍体诱导。我们认为除了移码以外，其他类型的突变也会导致单倍体诱导。那些突变可以在基因中的任何地方，并且它们可以是点突变或插入或缺失或其他类型的突变。
RNAi也被用于产生单倍体诱导物品系。对于RNAi，制备了两个发夹构建体；一个定位到外显子1与2之间的边界，并且另一个定位到外显子4(图8和图9)。将构建体转化到野生型中，并且使T0植物自交。栽培来自每个构建体的3个事件的T1种子，筛选转基因的纯合性，并在几个作为测试物的穗上进行异型杂交用于单倍体诱导。从这些异型杂交中检查了超过1500个籽粒后，我们发现这两个事件都以大约1％至2％的比率诱导单倍体。在单个穗上获得的最高单倍体诱导率为4.3％。该穗有约300个籽粒，所以我们可以得出结论，胚败育率也低于典型的高诱导物品系。这项工作证明，通过改变pPLAIIα的表达，RNAi+GM策略可以用于在其他典型的野生型品系中产生新的单倍体诱导物品系。
TILLING诱变方法也用于产生和鉴定本发明的磷脂酶突变和玉米。描述TILLING的出版物对于以下作物植物是可用的：如稻(Till等人,BMC Plant Biology[BMC植物生物学]7:19(2007))、番茄(Rigola等人,PLOS ONE[公共科学图书馆·综合]2009年3月13日)、和玉米(Till等人,BMC Plant Biol.[BMC植物生物学]2004年7月28日；4:12(2004))，这些文献全部通过引用并入本文。在基本的TILLING方法学中，植物材料(如种子)经受化学诱变，其在种子细胞的基因组内产生一系列突变。使诱变的种子生长为M1成年植物并进行自花授粉。合并来自所得的M2植物的DNA样品，并且然后筛选感兴趣的基因中的突变。一旦在感兴趣的基因中鉴定出突变，便使携带该突变的M2植物的种子生长为M3成年植物并筛选与感兴趣的基因相关的表型特征。
根据本发明可以使用具有至少一个与SEQ ID NO:1具有实质同源性的磷脂酶基因的任何玉米栽培品种。如本文所使用的，“实质同源性”意指基因的DNA序列在核苷酸水平上与SEQ ID NO:1充分相似以编码与SEQ ID NO:1等价的蛋白质，从而允许栽培品种间的等位基因差异。根据本发明的示例性实施例的一个方面，当磷脂酶基因与SEQ ID NO:1之间的同源性低至约85％时，可能存在“实质同源性”，条件是在基因的保守区域中的同源性更高(例如，至少约90％)。优选地，编码区中的百分比一致性为85％-90％、更优选地90％-95％、并且最优地为95％以上。本领域技术人员可能喜欢具有商业知名度的玉米栽培品种或具有特定所需特征以产生磷脂酶突变的玉米的栽培品种。可替代地，本领域技术人员可能喜欢具有少数多态性的玉米栽培品种，例如近交栽培品种，以便于促进对磷脂酶基因座内突变的筛选。
根据本发明的示例性实施例的一个方面，将来自稻和玉米的种子进行诱变，然后使其生长为M1植物。然后允许M1植物自花授粉，并使来自M1植物的种子生长为M2植物，然后筛选在所述M2植物的磷脂酶基因座中的突变。尽管可以筛选M1植物的突变，但是筛选M2植物的优势在于所有体细胞突变都对应于种系突变。本领域技术人员将认识到，可以诱变各种玉米植物材料(包括但不限于种子、花粉、植物组织或植物细胞)以便产生本发明的磷脂酶突变的玉米。然而，诱变的植物材料的类型可能会影响何时筛选植物DNA的突变。例如，当花粉在对未诱变的植物授粉之前进行诱变时，使由该授粉产生的种子生长为M1植物。M1植物的每个细胞都将含有在花粉中产生的突变，因此然后可以筛选这些M1植物的磷脂酶突变，而不是等到M2代。
主要产生点突变和短缺失、插入、颠换和或转换(约1至约5个核苷酸)的诱变剂(例如化学诱变剂或辐射)可以用于产生本发明的突变。符合本发明方法的诱变剂包括但不限于甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)、三乙基三聚氰胺(TEM)、N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)、丙卡巴肼、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、硫酸二乙酯、丙烯酰胺单体、美法仑、氮芥、长春新碱、二甲基亚硝胺、N-甲基-N'-硝基-亚硝基胍(MNNG)、亚硝基胍、2-氨基嘌呤、7,12-二甲基苯并蒽(DMBA)、环氧乙烷、六甲基磷酰胺、白消安、二环氧烷烃(二环氧辛烷(DEO)、二环氧丁烷(BEB)等)、2-甲氧基-6-氯-9[3-(乙基-2-氯-乙基)氨基丙基氨基]吖啶二盐酸盐(ICR-170)、和甲醛。根据本发明的各个实施例，也可以鉴定可能不是由诱变剂直接引起的核仁组织区(“NOR”)中的自发突变。
现在已知或以后设计的任何合适的植物DNA制备方法都可以用于制备玉米植物DNA用于磷脂酶突变筛选。例如参见，Chen和Ronald,Plant Molecular Biology Reporter[植物分子生物学报告]17:53-57,1999；Stewart和Via,Bio Techniques[生物技术]14:748-749,1993。此外，几种商业试剂盒是可用的，包括来自凯杰公司(Qiagen)(瓦伦西亚(Valencia)，加利福尼亚州)和Qbiogene公司(卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州)的试剂盒。
根据本发明的示例性实施例的一个方面，制备来自个体玉米植物的DNA样品，并且然后合并以便加速筛选从诱变的植物组织来源的整个植物群体的磷脂酶中的突变。合并组的大小可能取决于所使用的筛选方法的灵敏度。根据本发明的示例性实施例的一个方面，合并四个或更多个个体玉米植物的组。
根据示例性实施例的另一个方面，在合并DNA样品后，使所述库经历磷脂酶序列特异性扩增技术，例如聚合酶链式反应(PCR)。关于PCR的一般概述，参见PCR Protocols:AGuide to Methods and Applications[PCR方案：方法和应用指南](Innis,Gelfand,Sninsky,J.和White编辑),Academic Press[学术出版社],圣地亚哥,1990，将其通过引用并入本文。对磷脂酶基因座或与磷脂酶基因座紧邻的序列特异的任何引物都可以用于扩增在合并的DNA样品内的磷脂酶序列。优选地，引物被设计成扩增最有可能出现有用突变的磷脂酶基因座区域。最优选地，引物被设计成检测磷脂酶基因编码区中的突变。此外，优选的是引物避免已知的多态性位点以便易于筛选点突变。为了便于在凝胶上检测PCR产物，可以使用任何常规或以后设计的标记方法来标记PCR引物。
根据本发明的示例性实施例的一个方面，可以使用鉴定野生型和突变型序列之间的核苷酸差异的任何方法来筛选PCR扩增产物的磷脂酶突变。这些可以包括但不限于测序、变性高压液相色谱(dHPLC)、恒定变性剂毛细管电泳(CDCE)、温度梯度毛细管电泳(TGCE)(参见Li等人,Electrophoresis[电泳]23(10):1499-1511,2002)，或通过使用酶促裂解的片段化，例如用于由Colbert等人,Plant Physiology[植物生理学]126:480-484,2001所述的高通量方法中。优选地，将PCR扩增产物与内切核酸酶一起孵育，所述内切核酸酶优先裂解野生型与突变型序列之间的异源双链体中的错配。根据示例性实施例的另一个方面，使用自动化测序凝胶设备对切割产物进行电泳，并借助于标准商业图像处理程序分析凝胶图像。
诸位发明人已经确定为了实现玉米中的单倍体诱导，改变磷脂酶功能的突变是令人希望的。优选的突变包括错义、无义和剪接点改变，包括过早截短磷脂酶蛋白从信使RNA翻译的突变，例如那些在磷脂酶基因编码区内产生终止密码子的突变。此类突变包括插入、重复序列、修饰的开放阅读框(ORF)和最优选地点突变。
根据本发明的示例性实施例的又另一个方面，一旦鉴定了具有突变的磷脂酶序列的M2植物，便对突变进行分析以确定其对蛋白质的表达、翻译和/或活性的影响。根据一个示例性实施例，使用标准的测序技术对含有突变的磷脂酶片段进行测序，以便确定突变相对于总磷脂酶序列的确切位置。使用如下生物信息学工具，评价每个突变以便预测其对蛋白质功能的影响(即，完全耐受至功能丧失)，这些生物信息学例如是SIFT(从耐受至不耐受排序(Sorting Intolerant from Tolerant)；Ng等人,Nucleic Acids Research[核酸研究]31:3812-3814,2003)、PSSM(位置特异性评分矩阵(Position-Specific ScoringMatrix)；Henikoff和Henikoff,Computer Applications in the Biosciences[生物科学中的计算机应用]12:135-143,1996)和PARSESNP(Taylor和Greene,Nucleic AcidsResearch[核酸研究]31:3808-3811,2003)。例如，小于0.05的SIFT得分和PSSM得分的大的变化(例如，大约10或以上)表明突变可能对蛋白质功能具有有害的作用。
根据示例性实施例的另一个方面，如果M2植物中的突变的初始评价表明其具有有用性质并且在磷脂酶基因内的有用位置中，则继续进行对包含该突变的玉米植物的进一步表型分析。首先，将M2植物回交或异型杂交两次以产生BC1植物以便消除背景突变。然后，使回交的或异型杂交的BC1植物自花授粉，以便产生对于磷脂酶突变而言纯合的BC1F2植物。
评价这些纯合磷脂酶突变型植物的若干物理特征以确定突变是否导致玉米中有用的表型改变。与正常的(例如，野生型)亲本玉米相比或与野生型同胞对照玉米相比，评价突变型磷脂酶玉米的单倍体诱导。表13显示了通过TILLING获得的新颖突变。
表13.通过TILLING获得的新颖pPLAIIα突变及其HIR。核苷酸改变列表示从cDNA序列的起始的位置(SEQUENCE No.1)，并且变化的核苷酸在其密码子上下文中以大写表示。然后指示氨基酸改变，接着是该改变的影响(耐受或不耐受)。在不耐受的两个等位基因中，一个以1.04％(3/288)的比率诱导单倍体。
Figure BDA0003761963260000671
表13中使用的命名法指示野生型核苷酸或氨基酸，接着是其根据参考的SEQ IDNO.1的位置，接着是使用标准的遗传密码术语在该位置处的改变的核苷酸或氨基酸。
对于玉米，TILLING玉米pPLAIIα基因产生具有低单倍体诱导率的新等位基因。这使得能够产生GRMZM2G471240的等位基因系列，包括敲除。筛选此基因的两个区段的序列(最大1.5kb，其等于每个基因20个扩增子)的突变。这些序列包括含有内含子的基因组序列，加上预测的两种剪接变体的cDNA序列和编码序列。基于那些序列设计相关的和独特的扩增子序列，并且在现有的扩大M2玉米群体中进行突变筛选。在DNA序列和翻译蛋白质序列的后果方面表征鉴定的突变体。使M3种子生长并自交以产生具有推定的突变型纯合个体分离的M4品系。这些个体通过PCR测序进行鉴定，并且进行异型杂交和自交以测试这些突变型品系诱导单倍体的能力。
为了执行测交，使新品系在标记品系旁边生长，所述标记品系对于非致命颜色标记基因而言是纯合隐性的。通过评估所得的表现出颜色表型的植物的单倍体，使用正反交来测试诱导对雄性与雌性传递的特异性。如上所述通过倍数性分析证实了阳性命中。
对于SNP突变而言纯合的个体作为父本与标记品系母本杂交，并且在某些情况下导致低比率的单倍体形成(参见表18)。如上所述通过倍数性分析证实了阳性命中。具体地，导致单倍体形成的品系在cDNA序列的碱基对1077处具有G至A突变。此突变导致氨基酸356处的甲硫氨酸(M)向异亮氨酸(I)的氨基酸置换。这是一种非保守的氨基酸改变，所述改变可能会破坏蛋白质的活性，从而导致低比率的单倍体形成。在测试的288个后代中，我们发现了3个单倍体，诱导率为1％(3/288)。
VI.在稻中产生单倍体诱导品系
在稻中，与玉米pPLAIIα最接近的同系物是Os03g27610(一种具有相似的注释、基因结构和表达模式(即，在花粉中表达并在别处不存在)的稻马铃薯糖蛋白样磷脂酶
Figure BDA0003761963260000681
(图10)。SEQ ID NO:21包含Os03g27610的基因组DNA序列，SEQ ID NO:22包含cDNA序列，并且SEQ ID NO:23包含氨基酸序列。这些特征的密切一致以及这两种草之间短的进化距离表明，稻基因中的突变也可能产生单倍体诱导品系。在最近的出版物中，在花粉粒的精子核中检测到稻蛋白(Abiko等人,2013)，表明这种蛋白质参与受精和/或合子发育。
为了提高玉米中的单倍体诱导率并在稻中产生第一个单倍体诱导物品系，使用反向遗传学TILLING方法在玉米GRMZM2G471240基因和稻Os03g27610基因中获得新颖突变体。参见McCallum CM等人(2000)Targeting induced local lesions IN genomes(TILLING)for plant functional genomics[针对植物功能基因组学靶向基因组中诱导的局部损害(TILLING)],PLANT PHYSIOL.[植物生理学]123:439–42，通过引用并入本文)。TILLING提供了一种无偏方法来产生新的突变体，因为研究人员无法控制甲磺酸乙酯(EMS)诱变剂将在何处产生新的突变。产生了多样的和丰富的新等位基因并测试了它们的单倍体诱导率。
获得了十三个不同的TILLING M3品系。参见表14。PosGenomic列表示突变和改变的核苷酸位置(例如，G803A表示位置803处的碱基对G被改变为A)。影响是由突变导致的氨基酸改变或其他蛋白质改变(例如，A209T表示氨基酸209处的丙氨酸被改变为苏氨酸)。BLOSUM得分是对氨基酸改变将具有的对蛋白质构象或折叠的作用的强度的预测(负性越大，效果越严重)。“类型”表示氨基酸改变的类型(“NSM”意指非沉默突变；“PSM”意指部分沉默突变；“沉默”意指沉默突变；“剪接”意指导致异常剪接的剪接位点突变；“内含子”意指突变在内含子中)。最后，GSOR#是在USDA的遗传原种-稻属保藏中心(Genetic Stocks–Oryzacollection)的品系ID。
使这十三个品系自交得M4，并且使M4种子生长并测试纯合性。使纯合的突变型个体自交和异型杂交以测试单倍体诱导能力。使用倍数性分析仪检查所得后代中每个细胞的DNA含量(倍数性)。
非保守的改变(如剪接位点改变和具有最负性BLOSUM得分的改变)具有最大的单倍体诱导潜能。这些应该对蛋白质产物具有更多的不稳定效应，并且因此与其他等位基因相比为优越的单倍体诱导TILLING等位基因，从而每个单倍体诱导杂交产生更多的单倍体并且可能导致部分受危害的结籽。事实上，我们已经开始在一些T4自花授粉中看到这点。具有最低结籽的品系是剪接位点突变体G153A，其中每12个杂交的纯合突变型M4植物仅回收了29颗种子。其他品系已经回收了超过100颗。
表14.在稻Os03g27610中的TILLING等位基因。
Figure BDA0003761963260000691
可替代地，可以通过CRISPR/Cas9方法编辑在Os03g27610中发现的稻磷脂酶基因。如上所述，CRISPR过程有三个关键组分。第一个关键组分是靶序列。第二个是Cas9，其是核酸内切酶。第三个关键组分是指导RNA(“gRNA”)，其与靶序列互补并且负责将Cas9募集到所希望的位置。指导RNA可以处于单指导RNA(sgRNA)或双指导RNA(dgRNA)的形式。对于稻，我们产生了四个靶向稻磷脂酶基因的构建体。SEQ ID NO:38构成提供靶向Os03g27610的dgRNA的表达盒，在外显子4中非常接近天然四碱基对突变位于玉米同系物中的位置。在稻基因中，指导RNA靶位点是GAGACCGGCAGGTACGTCGAGG。SEQ ID NO:39构成提供靶向Os03g27610的dgRNA的表达盒外显子4，在与SEQ ID NO:38中靶向的相同的gRNA靶位点处。预期SEQ ID NO:38和39两者的移码突变将发生在竖条位于序列CAGGTACG|TCGAGG中的G与T之间的地方(在SEQ ID NO:22的gDNA序列的碱基对+1150处)。因此，预期这两个构建体会产生单倍体诱导物突变，所述突变在玉米单倍体诱导物插入所处的位置的下游仅7个碱基对。在大多数情况下，这些突变将是诱导小插入或缺失的移码突变，例如在切割位点处的G或T的缺失或任何其他相似的突变。SEQ ID NO:40构成提供靶向Os03g27610的dgRNA的表达盒。SEQ ID NO:41构成提供靶向Os03g27610的sgRNA的表达盒。全部两个都具有指导RNA，所述指导RNA靶向外显子1中的序列CCTCGCCGATTACTTCGACTGCA。这应该产生所述基因的大部分编码序列的敲除。产生的突变应该发生在切割位点处，在此处竖条位于序列CCTCGC|CGATTAC中的C与C之间(在SEQ ID NO:22中的cDNA序列的碱基对+215处)。因此，预期构建体40和41两者会产生高频率的含有基因敲除突变的植物，这也应该导致稻中高的单倍体诱导率。
用转化构建体转化稻植物，所述构建体包含选自由SEQ ID NO:38–41组成的组的序列。通过转化构建体中编码的CRISPR/Cas9机器，在转化体(即，T0稻植物)中产生新的磷脂酶等位基因。使T0稻植物生长并杂交(即，自花授粉)以产生T1植物。在新的磷脂酶等位基因处测试T1稻植物的纯合性。将纯合的T1稻植物与稻品系杂交，并且使用倍数性分析仪测试所得后代的单倍性。鉴定并计数不含可检测的T1 DNA的单倍体胚，并测量HIR。从杂交产生至少一个单倍体胚，并且HIR升高。优选地，HIR为至少5％。用染色体加倍剂(例如秋水仙碱)处理至少一个单倍体胚，并且从其生长双单倍体植物。
本发明的一些实施方案如下：
1.一种用于诱导单倍体种子产生的方法，所述方法包括用包含根据式(I)的化合物的组合物处理植物的生殖组织：
Figure BDA0003761963260000711
其中
(a)W是C、P或S；
(b)m和n各自独立地是0或1；
(c)X选自下组，该组由以下各项组成：OH、CN、O(C1-C4烷基)、卤素、C1-C4烷基、以及被一个、两个或三个卤素或羰基取代的C1-C4烷基；
(d)R1是：
(i)选自下组，该组由以下各项组成：H、C1-C6烷基和被一个或多个羟基基团取代的C1-C6烷基，其中任选地所述羟基基团中的一个或多个被独立地选自下组的基团酯化，该组由以下各项组成：
Figure BDA0003761963260000712
或
(ii)当W是S时，到W的键；
(e)每个L独立地是C2-C30碳链，所述碳链任选地包含一个或多个独立地选自以下的基团：烯基、炔基、苯基和杂芳基，并且所述碳链任选地被1–6个氧原子打断。
(f)条件是当W是C且m是1时，n是0；并且
(g)条件是当W是C且m是0时，n是1；
其中所述处理发生在紧接授粉之前、授粉期间或紧接授粉之后，并且其中产生了至少一个单倍体种子。
2.一种用于诱导单倍体种子产生的方法，所述方法包括用包含根据式(I)的化合物的组合物处理植物的生殖组织：
Figure BDA0003761963260000721
其中
(a)W是C或P；
(b)m和n各自独立地是0或1；
(c)X选自下组，该组由以下各项组成：OH、CN、O(C1–C4烷基)、卤素、C1–C4烷基、以及被一个、两个或三个卤素或羰基取代的C1–C4烷基；
(d)R1选自下组，该组由以下各项组成：H、C1–C4烷基和被一个或多个羟基基团取代的C1–C4烷基；
(e)L是C2–C30碳链，所述碳链任选地包含一个或多个独立地选自以下的基团：烯基和炔基，并且所述碳链任选地被1–6个氧原子打断；
(f)条件是当W是C且m是1时，n是0；并且
(g)条件是当W是C且m是0时，n是1；
其中所述处理发生在紧接授粉之前、授粉期间或紧接授粉之后，并且其中产生了至少一个单倍体种子。
3.如实施方案1–2所述的方法，其中式(I)的L选自下组，该组由以下各项组成：
(a)(CH2)8-(CH)2-CH2-(CH)2-CH2-(CH)2-CH2-CH3；
(b)(CH2)3-(CH)2-CH2-(CH)2-CH2-(CH)2-CH2-(CH)2-(CH2)4-CH3；
(c)(CH2)7-(CH)2-(CH2)7-CH3；
(d)(CH2)8-(CH)2-CH2-苯基-CH2-(CH)2-CH2-CH3；
(e)(CH2)8-(CH)2-(CH2)2-O-CH2-(CH)2-CH2-CH3；以及
(f)(CH2)8-(CH)2-CH2-苯基-O-(CH2)3-CH3。
4.一种用于在两种植物之间的杂交中诱导单倍体种子产生的方法，所述方法包括用包含脂质或磷脂酶抑制剂的组合物处理至少一种植物的生殖组织，其中所述处理发生在紧接授粉之前、授粉期间或紧接授粉之后，并且其中从所述杂交产生了至少一个单倍体种子。
5.一种用于诱导单倍体种子产生的方法，所述方法包括用包含脂质或磷脂酶抑制剂的组合物处理植物的生殖组织，其中所述处理发生在紧接授粉之前、授粉期间或紧接授粉之后，并且其中产生了至少一个单倍体种子。
6.如实施方案4或5所述的方法，其中以提高的比率诱导所述单倍体种子。
7.如实施方案4或5所述的方法，其中所述脂质或所述磷脂酶抑制剂选自由表7中列出的化合物组成的组。
8.如实施方案7所述的方法，其中所述脂质或所述磷脂酶抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：甲基α-亚麻酰基氟膦酸酯(“MALFP”)、亚油酸乙酯(“LLAEE”)、亚油酸(“LLA”)、玉米油、二硬脂酰-磷脂酰胆碱(“DSPC”)、或甲基花生酰基氟膦酸酯(“MAFP”)。
9.如实施方案4或5所述的方法，其中脂质或磷脂酶抑制剂的所述组合物包含选自表7的化合物，所述化合物以在0.0001mg/mL至100mg/mL之间、或在0.1mg/mL至50mg/mL之间、或在1mg/mL至10mg/mL之间、或为大约5mg/mL的浓度溶解或乳化在合适的配制品中。
10.如实施方案9所述的方法，其中所述合适的配制品选自下组，该组由以下各项组成：水、醇、DMSO、Tris-EDTA、EDTA、乙酸、苯、DME、甘油、己烷、乙醇、异丙醇、丙醇、缓冲盐水、甘氨酸-HCl、乙酸钠、卡可基酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、
Figure BDA0003761963260000731
磷酸盐缓冲液和磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液、巴比妥缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、配制品91、配制品92、磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)、PBS加Tween和DMSO、以及其中可以稀释或乳化脂肪酸的任何其他可用的溶剂或缓冲液。
11.如实施方案10所述的方法，其中所述合适的化合物是磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)。
12.如实施方案4或5所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。
13.如实施方案4或5所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。
14.如实施方案13所述的方法，其中所述植物是稻。
15.如实施方案13所述的方法，其中所述植物是玉米。
16.如实施方案12所述的方法，其中所述双子叶植物是向日葵或大豆。
17.如实施方案4或5所述的方法，其中所述脂质通过选自下组的技术来施加，该组由以下各项组成：浸渍、注射、基于喷雾的局部施用、雾化器、基于移液管的局部施用和基于刷子的局部施用、以及任何其他局部施用。
18.一种用于在两种植物之间的杂交中诱导单倍体胚的方法，所述方法包括：
(a)在植物中表达突变的马铃薯糖蛋白样磷脂酶；或
(b)向植物施用包含编码马铃薯糖蛋白样磷脂酶的基因的18-21个核苷酸的小干扰RNA分子；或
(c)用突变的马铃薯糖蛋白样磷脂酶转化植物；或
(d)使用基因编辑突变植物的马铃薯糖蛋白样磷脂酶序列；
其中所述植物用作两种植物之间的杂交中的亲本植物，使得所述杂交产生至少一个单倍体胚。
19.如实施方案18所述的方法，其中所述马铃薯糖蛋白样磷脂酶由包含SEQ IDNO:1的核酸序列或与SEQ ID NO:1具有70％一致性的序列编码。
20.如实施方案18所述的方法，其中所述突变的马铃薯糖蛋白样磷脂酶由包含SEQID NO:3的核酸或与SEQ ID NO:3具有70％一致性的序列编码。
21.如实施方案18所述的方法，其中步骤(d)的所述基因编辑通过定点诱变来实现。
22.如实施方案21所述的方法，其中所述定点诱变通过选自下组的技术来实现，该组由以下各项组成：CRISPR/Cas9、TALEN、锌指和大范围核酸酶。
23.如实施方案18所述的方法，其中在两种植物之间的所述杂交是在两种单子叶植物之间、或在两种双子叶植物之间、或在一种单子叶植物与一种双子叶植物之间。
24.如实施方案23所述的方法，其中所述两种单子叶植物是玉米植物、稻植物、小麦植物或大麦植物。
25.如实施方案23所述的方法，其中所述两种双子叶植物是大豆植物、向日葵植物、番茄植物、辣椒植物、菜豆植物、甜菜植物或球芽甘蓝植物。
26.如实施方案18所述的方法，其中在所述杂交中用作亲本植物的所述植物是玉米植物或稻植物。
27.如实施方案26所述的方法，其中所述玉米植物或所述稻植物提供在所述杂交中使用的花粉。
28.如实施方案18所述的方法，其中所述小干扰RNA分子包含SEQ ID NO:1的18–21个连续核苷酸。
29.一种通过如实施方案18所述的方法产生的单倍体胚。
30.一种从如实施方案29所述的单倍体胚产生的单倍体植物。
31.一种包含如实施方案29所述的单倍体胚的单倍体种子。
32.一种从如实施方案29所述的单倍体胚产生的双单倍体植物，其中所述单倍体胚暴露于染色体加倍剂。
33.如实施方案32所述的双单倍体植物，其中所述染色体加倍剂选自下组，该组由以下各项组成：秋水仙碱和氟乐灵。
34.一种包含SEQ ID NO:3、与SEQ ID NO:3直系同源的序列、或与SEQ ID NO:3具有70％一致性的序列的cDNA。
35.如实施方案34所述的cDNA，其中与SEQ ID NO:3直系同源的所述序列包含选自由SEQ ID NO:22组成的组的序列和编码SEQ ID NO:73–81中任一个的核苷酸序列。
36.一种在马铃薯糖蛋白样磷脂酶基因内含有人类诱导的非转基因突变的植物。
37.如实施方案36所述的植物，其中所述人类诱导的非转基因突变是至少一个核苷酸的插入、至少一个核苷酸的缺失、或至少一个核苷酸的置换，所述突变在所述马铃薯糖蛋白样磷脂酶基因中产生提前终止密码子。
38.如实施方案36所述的植物的一种种子、一种花粉粒、一种植物部分或后代；其中所述种子、所述花粉粒、所述植物部分或所述后代包含所述突变。
39.如实施方案37–38中任一项所述的植物，其中所述植物选自下组，该组由以下各项组成：玉米(maize)(玉蜀黍(Zea mays))、高粱(sorghum)(双色高粱(Sorghumbicolor))、粟(millet)(粟(Setaria italica))、大麦(barley)(大麦(Hordeumvulgare))、僵硬雀麦草(stiff brome)(二穗短柄草(Brachypodium distachyon))、稻(rice)(稻(Oryza sativa))、小麦(wheat)(小麦(Triticum aestivum))、香蕉(banana)(小果野蕉(Musa acuminata))、棕榈(palm)(油棕(Elaeis guineensis))、燕麦(oats)(燕麦(Avena sativa))、向日葵(sunflower)(向日葵(Helianthus annuus))、甜菜(sugar beet)(甜菜(Beta vulgaris))、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和大豆(soybean)(大豆(Glycine max))。
40.如实施方案39所述的植物，其中所述植物是玉米植物。
41.如实施方案39所述的植物，其中所述植物是稻植物。
42.如实施方案37所述的植物，其中所述马铃薯糖蛋白样磷酸酶基因包含SEQ IDNO:1、与SEQ ID NO:1直系同源的序列、或与SEQ ID NO:1具有70％一致性的序列。
43.如实施方案42所述的植物，其中所述马铃薯糖蛋白样磷脂酶基因包含SEQ IDNO:3。

Claims (2)

1.一种cDNA，其包含SEQ ID NO:3、与SEQ ID NO:3直系同源的序列、或与SEQ ID NO:3具有70％一致性的序列。
2.如权利要求1所述的cDNA，其中所述与SEQ ID NO:3直系同源的序列包含从由下列各项组成的组中选择的序列：SEQ ID NO:22，和编码SEQ ID NO:73-81中任一个的核苷酸序列。
CN202210875127.2A 2015-11-18 2016-11-17 单倍体诱导组合物及其使用方法 Pending CN115918526A (zh)

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