CN112575025B - 诱导玉米母本单倍体产生的基因ZmPLD3及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导玉米母本单倍体产生的基因ZmPLD3及应用。敲除玉米中ZmPLD3基因得到转基因纯合突变植株或其后代，用其作为父本与其他玉米材料杂交过程中能够产生玉米母本单倍体。本发明首次获得该基因的系列等位突变，并通过杂交证明了其母本单倍体诱导功能。本发明的实验证明，玉米的磷脂酶PLD3的突变能够导致玉米母本单倍体的产生，对于揭示磷脂酶在玉米母本单倍体产生过程中所起的生物学作用提供了新的思路。同时，利用本发明所获得的突变单株，具有玉米母本的单倍体诱导能力，对于选育新型高诱导率的诱导系以及提高玉米单倍体育种效率方面具有重要的意义。

Description

诱导玉米母本单倍体产生的基因ZmPLD3及应用

技术领域

本发明涉及一种诱导玉米母本单倍体产生的基因ZmPLD3及应用。

背景技术

玉米是世界重要作物之一，也是我国种植面积第一大作物，世界人口的快速增长及气候变化对选育高产多抗的优良玉米杂交品种提出了更高的要求，而优良自交系的选育对培育杂交种非常重要。与费时耗力的常规育种方法相比，以杂交诱导为基础的玉米单倍体育种方法仅需两个世代即可迅速获得纯系，极大缩短了育种进程，是重要的现代育种技术之一。常规单倍体育种的基本程序是以单倍体诱导系为父本与普通母本材料杂交获得单倍体，然后通过加倍形成双单倍体纯系。目前常见的单倍体诱导系主要是母本单倍体诱导系，而stock6是发现的第一个玉米母本诱导系，利用stock6来源的诱导系几乎在所有母本材料上都能获得一定比例的单倍体，各国育种家以此为基础选育出大量优良的诱导系，诱导率也不断提升。

随着诱导系在育种实践中的大量应用，单倍体诱导的遗传机理研究也不断深入。通过对相关基因挖掘，鉴定更多调控单倍体诱导的基因，进一步提升诱导率，对于选育新型高诱导率的诱导系以及解析单倍体诱导遗传机理方面具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种诱导玉米母本单倍体产生的基因ZmPLD3及应用。

本发明首先保护一种制备植物母本单倍体的方法，包括如下步骤：

(1)沉默或抑制目的植物基因组中ZmPLD3基因的表达或敲除ZmPLD3基因，得到转基因植株；(2)将步骤(1)所述转基因植株或其后代作为父本与其他植物杂交，得到杂交后代，即为植物母本单倍体；

所述ZmPLD3基因的基因组序列如序列表的序列1所示。

沉默或抑制目的植物基因组中ZmPLD3基因的表达或敲除ZmPLD3基因，为突变目的植物基因组中ZmPLD3基因使目的植物基因组中ZmPLD3基因表达量降低或使目的植物基因组中ZmPLD3基因发生功能缺失。

所述使目的植物基因组中ZmPLD3基因表达量降低或使目的植物基因组中ZmPLD3基因发生功能缺失是通过使目的植物基因组中ZmPLD3基因第一外显子和/或第二外显子和/或第三外显子发生突变；所述突变为缺失突变和/或插入突变和/或能够导致基因功能缺失的其他突变。

所述使目的植物基因组中ZmPLD3基因表达量降低或使目的植物基因组中ZmPLD3基因发生功能缺失是通过基因编辑技术使目的植物基因组中ZmPLD3基因第二外显子发生插入突变。

所述通过基因编辑技术使目的植物基因组中ZmPLD3基因第二外显子发生插入突变是利用CRISPR/Cas9使目的植物基因组中ZmPLD3基因自5’端第2205位碱基和2206位碱基之间插入碱基T。本发明的实施例中，所述目的植物两条同源染色体均发生上述突变。

所述CRISPR/Cas9的靶序列如序列表的序列2所示；所述CRISPR/Cas9的sgRNA序列如序列表的序列3所示。

所述利用CRISPR/Cas9使目的植物基因组中ZmPLD3基因自5’端第2205位碱基和2206位碱基之间插入碱基T包括如下步骤：将表达所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体导入目的植物中，得到转基因植物。所述CRISPR/Cas9载体具体可为将序列2所示的DNA分子插入至sgRNA-Cas9双表达载体载体的Esp3I位点中得到的重组载体。

所述步骤(2)中，还包括如下步骤：将所述杂交后代单株进行单倍体性状鉴定、叶片倍性鉴定和/或分子标记鉴定，选取任一种方法鉴定为单倍体的后代单株为植物母本单倍体。

本发明还保护用于沉默或抑制目的植物基因组中ZmPLD3基因的表达或敲除ZmPLD3基因的物质在制备植物母本单倍体中的应用。

本发明还保护下述任一应用；

(A)以上任一所述的方法在选育新型高诱导率的诱导系和/或提高玉米单倍体育种效率中的应用；

(B)以上任一所述的方法制备得到的植物母本单倍体在选育新型高诱导率的诱导系和/或提高玉米单倍体育种效率中的应用；

(C)用于沉默或抑制目的植物基因组中ZmPLD3基因的表达或敲除ZmPLD3基因的物质在选育新型高诱导率的诱导系和/或提高玉米单倍体育种效率中的应用。

本发明的实施例中，所述用于沉默或抑制目的植物基因组中ZmPLD3基因的表达或敲除ZmPLD3基因的物质为CRISPR/Cas9敲除载体；所述CRISPR/Cas9敲除载体的靶序列如序列表的序列2所示；所述CRISPR/Cas9的sgRNA序列如序列表的序列3所示。所述CRISPR/Cas9敲除载体具体可为将序列2所示的DNA分子插入至sgRNA-Cas9双表达载体载体的Esp3I位点中得到的重组载体。

以上任一所述植物为(A1)或(A2)或(A3)：

(A1)双子叶植物或单子叶植物；

(A2)禾本科植物；

(A3)玉米。

以上任一所述目的植物具体可为玉米B73。

以上任一所述其他植物具体可为玉米自交系Mo17。

本发明的基本原理如下：针对ZmPLD3基因，在其第二个外显子上设计靶位点序列，通过CRISPR/Cas9定点突变的方法，将基因的第二个外显子进行突变筛选，获得基因功能缺失的转基因突变体。将成功突变的单株进行自交后，获得的T1代种子，再种植，并以T1代植株纯合突变体的花粉对玉米自交系Mo17，获得后代。将杂交后代种于田间，根据后代单株田间的长势、分子标记及流式细胞倍性鉴定等方法验证其中是否出现母本单倍体。

本发明公开了一种诱导产生玉米母本单倍体的新基因ZmPLD3及应用。应用CRISPR/Cas9技术敲除玉米中ZmPLD3基因得到转基因纯合突变植株或其后代，用其作为父本与其他玉米材料杂交过程中能够产生玉米母本单倍体。本发明首次获得该基因的系列等位突变，并通过杂交证明了其母本单倍体诱导功能。本发明的实验证明，玉米的磷脂酶PLD3的突变能够导致玉米母本单倍体的产生，对于揭示磷脂酶在玉米母本单倍体产生过程中所起的生物学作用提供了新的思路。同时，利用本发明所获得的突变单株，具有玉米母本的单倍体诱导能力，对于选育新型高诱导率的诱导系以及提高玉米单倍体育种效率方面具有重要的意义。

附图说明

图1为ZmPLD3基因结构及CRISPR/Cas9系统敲除靶位点示意图。

图2为ZmPLD3突变基因zmpld3-1与野生型玉米ZmPLD3基因测序比对结果。

图3为T1代纯合型基因突变株系zmpld3-1与自交系Mo17杂交后代中的杂合二倍体植株和其花药及拟单倍体的植株和其花药。

图4为流式鉴定叶片倍性结果。

图5为多态性分子标记鉴定结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

sgRNA-Cas9双表达载体：记载于文献：Zhu J,Song N,Sun S,Yang W,Zhao H,SongW,Lai J.Efficiency and Inheritance of targeted mutagenesis in maize usingCRISPR-Cas9.J Genet Genomics.2016；43:25–36.；公众可以从中国农业大学获得。

B73：记载于文献：Schnable,P.S.et al.The B73 maize genome:complexity,diversity,and dynamics.Science.2009；326:1112–1115.；公众可以从中国农业大学获得。

Mo17：记载于文献：Sun S，Zhou Y，Chen J，Shi J，Zhao H，Zhao H，Song W，ZhangM，Cui Y,Dong X,Liu H,Ma X,Jiao Y,Wang B,Wei X,Stein JC,Glaubitz JC,Lu F,Yu G,Liang C,Fengler K,Li B,Rafalski A,Schnable PS,Ware DH,Buckler ES,LaiJ.Extensive intraspecific gene order and gene structural variations betweenMo17 and other maize genomes.Nature Genetics.2018；50(9):1289-1295.；公众可以从中国农业大学获得。

实施例1、诱导玉米母本单倍体产生的基因ZmPLD3及应用

野生型玉米ZmPLD3基因的基因组序列如序列表的序列1所示，其第一外显子如序列表的序列1自5’端第1-232位所示，第二外显子如序列表的序列1自5’端第336-2387位所示，第三外显子如序列表的序列1自5’端第2511-2947位所示。

一、CRISPR/Cas9系统敲除玉米ZmPLD3基因

ZmPLD3基因结构及CRISPR/Cas9系统敲除靶位点示意图见图1。

1、在玉米ZmPLD3基因的第二外显子序列上设计靶位点序列，长度为23bp。

靶位点序列：5’-CGACATCGCACAGGCGATCCAGG-3’(序列2)。

靶位点设计对应的sgRNA序列：5’-CGACAUCGCACAGGCGAUCCAGG-3’(序列3)。

将序列2所示的DNA分子插入至sgRNA-Cas9双表达载体的Esp3I位点中，得到CRISPR/Cas9敲除载体(已经测序验证)。

3、将步骤2制备的CRISPR/Cas9敲除载体导入农杆菌感受态细胞EHA105，得到重组菌EHA105/CRISPR/Cas9。再将重组菌EHA105/CRISPR/Cas9采用农杆菌侵染法(重组农杆菌进行28℃扩繁，使用扩繁后的菌液对玉米幼胚进行侵染)转化玉米B73幼胚，经过筛选、分化和生根后获得T0代转基因玉米植株。

4、采集步骤3得到的T0代转基因玉米植株叶片，并提取基因组DNA作为模板，用引物check-F和引物check-R组成的引物对进行PCR扩增，得到不同株系的扩增产物。

check-F:5’-CGCCAGGAGCTTCATCTACAT-3’；

check-R:5’-CATCATCATCTTGGTGTGGACAT-3’。

将不同株系的PCR扩增产物进行测序，根据测序结果与野生型玉米ZmPLD3基因的第二外显子相应序列进行比对，鉴定T0代转基因玉米不同株系中基因是否发生突变。

结果如下：7株T0代转基因玉米植株中，1株中的基因发生突变，具体突变形式如图2所示，即：ZmPLD3突变基因zmpld3-1与野生型玉米ZmPLD3基因的唯一差别在于在序列表的序列1自5’端第2205位碱基和2206位碱基之间插入碱基T。

将基因发生突变的植株记做阳性T0代转基因玉米。

5、将步骤4得到的得到的阳性T0代转基因玉米，收获种子后再播种自交，得到T1代转基因玉米。鉴定T1代转基因玉米的基因是否为突变的基因型，具体方法如下：以T1代转基因玉米的基因组DNA作为模板，用引物check-F和引物check-R组成的引物对进行PCR扩增，将PCR产物进行测序，根据测序结果对T1代转基因玉米的基因型进行分类。

测序结果中，(1)自靶位点序列起具有双峰特征的序列，则为杂合基因型，则为T1代转基因玉米杂合型基因突变(同源染色体的一条中基因突变,同源染色体的另一条中基因未突变)；(2)自靶位点序列起具有特异单峰特征的序列，与玉米野生型ZmPLD3基因的第二外显子序列对比，若一样，则为野生型，没有发生突变，下面分析不考虑；若有突变，则为T0代植株自交后获得的纯合突变，则为T1代转基因玉米基因突变纯合型(同源染色体的两条中ZmPLD3基因均发生突变)。

经分析，T1代转基因玉米纯合型基因突变株系有zmpld3-1，其突变类型如下：T1代转基因玉米基因突变纯合型株系zmpld3-1中两条同源染色体中均含有突变基因zmpld3-1(与野生型玉米ZmPLD3基因的唯一差别在于在序列表的序列1自5’端第2205位碱基和2206位碱基之间插入碱基T)。

二、CRISPR/Cas9系统敲除玉米ZmPLD3基因所获得突变体的单倍体诱导能力的鉴定

(1)多态性分子标记鉴定

在玉米B73参考基因组上随机设计10对分子标记，利用自交系B73和Mo17的基因组DNA作为模板，进行扩增和多态性分子标记筛选，最终获得1对分子标记，其PCR产物在B73中为400bp，而在Mo17的产物长度为300bp，具有较大差异，可以利用琼脂糖凝胶电泳进行分辨，B73的PCR产物较大，电泳速度慢，而Mo17的产物片段较小，电泳速度快，因此，B73的条带位于Mo17条带的上方(图5中，第1条泳道为Mo17带型，第2条泳道为B73带型)。若待测单株只有Mo17的条带(图5中第4、5条泳道)，则认为该单株不存在父本材料的带型，因此是母本单倍体。若杂交后代单株中同时存在B73和Mo17的条带(图5中第3条泳道)，则认为该单株是正常杂交的后代，是二倍体。

将T1代转基因玉米基因纯合突变株系zmpld3-1的花粉授予自交系Mo17，获得杂交后代；将上述所得杂交后代播种于温室，取14天幼苗叶片进行基因组DNA提取、及琼脂糖带型检测，分子标记鉴定结果如下：

T1代转基因玉米纯合型基因突变株系zmpld3-1与自交系Mo17杂交所得的195个后代中得到2个只有Mo17的条带的单株，拟定为单倍体植株。

2个拟单倍体的PCR跑胶结果如图5所示，M，marker，Mo17为Mo17带型，B73为B73带型，D为后代中杂合二倍体带型，H1、H2为后代中单倍体带型。

(2)流式鉴定叶片倍性

将上述1)杂交种后代中鉴定获得的共2个表现为单倍体带型的拟单倍体植株进行流式鉴定，方法如下：提取待测植株幼嫩叶片的细胞核，以二倍体玉米叶片作为对照；再用流式细胞仪器检测信号，首先检测二倍体细胞核信号，并将二倍体细胞核信号峰位设为400(由于二倍体细胞内的遗传物质是单倍体细胞内遗传物质的两倍，因此单倍体细胞核信号峰位在200附近出现)。若待测植株的信号峰出现在400附近，则认为其与二倍体细胞核信号强度富集，位置相同，该待测植株为二倍体。若待测植株细胞核信号峰出现在200附近，则认为该待测植株为单倍体植株。

结果如图4所示，左图为B73野生型玉米流式细胞检测结果，右图为T1代转基因玉米杂交后代中拟单倍体植株的流式细胞检测结果。

结果显示：zmpld3-1与自交系Mo17杂交后代中2个经多态性分子标记鉴定出的拟单倍体经流式细胞仪检测后，其倍性均为单倍体，记做T1代转基因玉米纯合型基因突变株系zmpld3-1拟单倍体植株。

(3)表型鉴定

对上述T1代纯合型基因突变株系zmpld3-1与自交系Mo17杂交后代中出现的2个拟单倍体植株持续观察表型，单倍体具有植株矮小，叶片较窄，株型紧凑，雄性不育等特征；二倍体则表现为植株高大，叶片宽大，披散，育性正常。以B73野生型玉米(ZmPLD3基因未突变)与自交系Mo17杂交的后代为对照。

观察结果如图3所示，左上图和左下图为T1代纯合型基因突变株系zmpld3-1与自交系Mo17杂交后代中的杂合二倍体植株和其花药；右上图和右下图为杂交后代中拟单倍体的植株和其花药。

结果显示：2个zmpld3-1与Mo17杂交后代中经多态性分子标记、流式检测鉴定出的拟单倍体后代经表型鉴定后均表现为母本单倍体植株。

因此，纯合转基因株系与Mo17杂交的后代单株中，若按照上述3种方法鉴定结果中任一种方法鉴定为单倍体，则该植株为或候选为玉米母本单倍体；若上述3种方法鉴定结果都不为单倍体，则该植株不为或候选不为玉米母本单倍体。

诱导率(％)＝(单倍体株数/测验总株数)*100％＝(2/195)*100％＝1.02％，可以看出，ZmPLD3基因突变后与其他材料杂交，在后代中可获得玉米母本单倍体。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 诱导玉米母本单倍体产生的基因ZmPLD3及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3238

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays L.)

<400> 1

atgcagcgca ggagcggcga tgtccggact ccggacgctg ggtttgcgct gctccccacg 60

cggtttacta ttcctgatct ccttcccctt cctacgcatg gctccccgtc cattgctatg 120

ctccgccatt gtccacacac ctgcagccag ccttctgcct ttaaccccac cggcaatgtc 180

agtagtcttg atttcctagc ttccttcctt ccgctctctc actcctctgt aggtgcatcc 240

ttgttcttct tgcatcgtat cgatctgtcc atgccactgg agtctgtacg tacgttgcca 300

ttatacatgg gctctgtttg cgtatgtatg tgcaggtgac ctgatatcga cgggagggat 360

ggcaaggata ctgctccatg gttcgcttca tgtcaccatc tttgaggcag aggagctgtc 420

gaactccagc aggcccagca gccaggctcc cgggttcctc cgcaagctgg ttgaggggat 480

cgaggacact gtgggcgtgg gcaagggcac cagcaagatc tacgccacca tcgggctcgg 540

caagacccgc gtcggccgca cccgcaagct caccgacgag acggccagcc cgcgctggta 600

cgagtccttc cacgtctact gcgcccacct tgcctccgac gtcgtcttca ccatccgggc 660

caagaacccc atcggcgcct ccaccgtcgg tgtcgcctac ctccccgtcc gcgatatctt 720

cgagggccac gaggtggacc gctggctcca cctctgcgac ggcggcggcg acgacaagga 780

ccgcacgccg ctcgagagcg gcgggaaggt ccacgtcagg ctccagtact tcgacatctc 840

caaggaccac agctggggca agggcgtgcg cagtggaaag taccccggcg tgccctacac 900

cttcttctcg cagcggcagg ggtgcagggt gacgctgtac caggacgcgc acgtccccga 960

cggctttgtc ccgaggatcc cactcgacgg cggccggtgc tacgaggcgc accggtgctg 1020

ggaggacatc ttcgacgcca tcagcggcgc taagcacctc atctacatca cgggttggtc 1080

ggtgtacacg gagatcacgc tactcaggga cggcgcccgc ccacccaggc ccggcagcgg 1140

cgtcacgctc ggcgagctgc tcaagaagaa agccggcgag ggcgtccgtg tgctcatgct 1200

cgtctgggac gaccgcacct ccgtcggggc gctcaagaag gacgggctca tggccaccca 1260

cgacgaggag acgatgaact acttcgaggg caccgacgta cactgcgtgc tatgcccgcg 1320

aaaccccgac gactccggga gcatcgtgca ggacctgcag atctccacca tgttcacgca 1380

ccaccagaag atcgtcgtcg tcgaccacga catgccggtg cagcggtcgc agcggcagcg 1440

gaggatcctc agcttcgtgg gcgggctgga cctctgcgac ggccgctacg acacgccatg 1500

ccactcgctg ttccggacgc tggacggcgc gcaccacgac gacttccacc agccaaactt 1560

cgccacggcc gccatcgcca agggcggacc gagggagccg tggcacgaca tccactgtcg 1620

cctcgaaggc cccgtggcgt gggacgtgct ctacaacttc gagcagcggt ggcggaagca 1680

gggcggcaag gacttgctca tccagctccg ggacctcgcc gacgagatca tcgccccgtc 1740

acccgtcacg ttcccgaacg accccgagac gtggaacgtg cagctctttc gctctatcga 1800

cggcggcgcc gcgttcgggt tcccggacac ccccgacgac gccaccaggg ccgggctcgt 1860

cagtggcaag gaccagatca tcgatcggag catccaggac gcctacatcc acgccatccg 1920

ccgcgccagg agcttcatct acattgagaa ccagtacttc ctcggcagct cctactgctg 1980

gaagcccgac gggatcaagc ccgaggacat cggtgcactg cacgtcatcc ccaaggagct 2040

gtccatgaag gtggtgagca agatcgaggc cggcgagcgg ttcgcggtct acgtcgtggt 2100

gcccatgtgg cctgagggca tcccggagag cggctccgtg caggccatcc tcgactggca 2160

gaggaggacc atggagatga tgtacaccga catcgcacag gcgatccagg ccaaggggat 2220

cgacgccaac cccagggact acctcacctt cttctgcctc ggcaaccggg aggcgaagaa 2280

gccaggggag tacgtgccca cggaggaggc tgagcctgac actggctaca tcaaggccca 2340

gcaaaacaga aggttcatga tctatgtcca caccaagatg atgatgggta atccgtccgt 2400

ccacccttac tcctagaatt actcttgatt tttcgaattc gaggcgccca tcttcttaga 2460

atatattact cttgaattat tatcaaaatc gaaatttgct gtgtgtgcag tggatgacga 2520

gtacatcatc gtggggtcgg cgaacatcaa ccagcgttcc atggacgggg cgcgggactc 2580

ggagatcgcg atgggcgcgt accagccgca ccacctggcg gcggcgagca ggccggcgag 2640

agggcaggtg cacgggttcc ggatgtcgct gtggtacgag cacctgggcg cggtggacga 2700

cgcgttcacc cggccggaca gcgtcgagtg catccgcaag gtgaacgcca tggcagacag 2760

gtactgggac ctgtacgccg gcgacgggcc tgagcgtgac ctgccggggc acctgctcac 2820

ctatcccgtc gccgtcggca ctgacggctc ggtcaatcag ctgccgggga tggagttctt 2880

cccggacacg caggcgcggg tgcttggcgc caagtccgac tacctgccgc ccattctcac 2940

cacgtaggcg tgtgctctga gcctctcaca atcttttgga tttactgttt tccccattct 3000

ggacctgaat aagagcagaa ctagtttggt attttttaaa aaagtaaata aaaggtgcac 3060

taatgcagtg tgcataatga cgaactcatt gttattttag tattgtacta tcaattagta 3120

atttttaaaa tcgttgttta cctattgctg gtttgatagt gttttggtta gcttggctaa 3180

gaaccgagga gtcgtttggt tcacatatat ttgtaatgtg atggatagtt gagaacgt 3238

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays L.)

<400> 2

cgacatcgca caggcgatcc agg 23

<210> 3

<211> 23

<212> RNA

<213> 玉米(Zea mays L.)

<400> 3

cgacaucgca caggcgaucc agg 23

Claims (9)

1.一种制备植物母本单倍体的方法，包括如下步骤：

（1）沉默或抑制目的植物基因组中ZmPLD3基因的表达或敲除ZmPLD3基因，得到转基因植株；（2）将步骤（1）所述转基因植株或其后代作为父本与其他植物杂交，得到杂交后代，即为植物母本单倍体；

所述ZmPLD3基因的基因组序列如序列表的序列1所示；

所述植物为玉米。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：沉默或抑制目的植物基因组中ZmPLD3基因的表达或敲除ZmPLD3基因，为突变目的植物基因组中ZmPLD3基因使目的植物基因组中ZmPLD3基因表达量降低或使目的植物基因组中ZmPLD3基因发生功能缺失。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述使目的植物基因组中ZmPLD3基因表达量降低或使目的植物基因组中ZmPLD3基因发生功能缺失是通过使目的植物基因组中ZmPLD3基因第一外显子和/或第二外显子和/或第三外显子发生突变；所述突变为缺失突变和/或插入突变和/或能够导致基因功能缺失的其他突变。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述使目的植物基因组中ZmPLD3基因表达量降低或使目的植物基因组中ZmPLD3基因发生功能缺失是通过基因编辑技术使目的植物基因组中ZmPLD3基因第二外显子发生插入突变。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述通过基因编辑技术使目的植物基因组中ZmPLD3基因第二外显子发生插入突变是利用CRISPR/Cas9使目的植物基因组中ZmPLD3基因自5’端第2205位碱基和2206位碱基之间插入碱基T。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9的靶序列如序列表的序列2所示；所述CRISPR/Cas9的sgRNA序列如序列表的序列3所示。

7.如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，还包括如下步骤：将所述杂交后代单株进行单倍体性状鉴定、叶片倍性鉴定和/或分子标记鉴定，选取任一种方法鉴定为单倍体的后代单株为植物母本单倍体。

8.用于沉默或抑制目的植物基因组中ZmPLD3基因的表达或敲除ZmPLD3基因的物质在制备植物母本单倍体中的应用；

所述ZmPLD3基因的基因组序列如序列表的序列1所示；

所述植物为玉米。

9.下述任一应用；

（A）权利要求1至7中任一所述的方法在选育新型高诱导率的单倍体诱导系和/或提高玉米单倍体育种效率中的应用；

（B）权利要求1至7中任一所述的方法制备得到的植物母本单倍体在选育新型高诱导率的单倍体诱导系和/或提高玉米单倍体育种效率中的应用；

（C）用于沉默或抑制目的植物基因组中ZmPLD3基因的表达或敲除ZmPLD3基因的物质在选育新型高诱导率的单倍体诱导系和/或提高玉米单倍体育种效率中的应用；所述ZmPLD3基因的基因组序列如序列表的序列1所示；

所述植物为玉米。

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