CN117016372A - 一种玉米优异种质创制的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种玉米优异种质创制的方法及其应用，属于作物育种领域。本发明要解决的技术问题是：如何缩短种质创制年限，降低DH鉴定工作量，加快种质资源创新。本发明提供一种玉米优异种质创制的方法，所述方法包括：S1)将具有目标性状的玉米与受体自交系进行杂交，获得F1；S2)以单倍体诱导系为父本、以S1)所述F1为母本进行杂交获得果穗，剥离果穗上的幼胚进行加倍诱导获得单倍体幼胚；S3)对S2)所述单倍体幼胚进行成苗处理获得单倍体植株，筛选具有目标性状的单倍体植株；S4)将S3)所述的具有目标性状的单倍体植株自交获得双单倍体植株。本方法可有效缩短种质创制年限，降低DH鉴定工作量，加快种质资源创新。
Description
技术领域
本发明属于作物育种技术领域，具体涉及一种玉米优异种质创制的方法及其应用。
背景技术
种质资源创新是保证种源安全实现种业科技自立自强，种源自主可控的重要方式之一。玉米是杂种优势利用最为充分的粮食作物，因此优异自交系的创制是玉米商业化育种的基础。长期以来，我国玉米育种通过常规育种方法进行自交系选育，即利用自交或回交的方式对遗传背景进行纯化，一般需要7代以上，且需要逐代筛选与鉴定。因此利用常规育种方法，创制优异种质周期长、工作量大，导致我国玉米育种优异种质缺乏，育种效率降低。近年来，随着玉米单倍体育种技术的发展，利用单倍体育种技术可在1-2代获得双单倍体(Doubled haploid,DH)纯系。随着高频单倍体诱导系的选育、精准单倍体鉴别标记的开发和高效加倍方法的应用，大量生产DH系已不再是限制单倍体育种技术应用的限制因素。随着大量DH系的产生，优良DH系的需进行筛选与鉴定。目前，DH系的筛选与鉴定一般采取穗行种植，多环境变换等方式进行，这项工作需要消耗大量人力、物力，因此大大限制了利用DH系创制优异种质的效率。开发一种玉米优异种质快速创制方法，可缩短种质创制年限，降低DH鉴定工作量，对加快种质资源创新具有重要意义，从而促进玉米育种技术的发展。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：如何缩短种质创制年限，降低DH鉴定工作量，加快种质资源创新。
为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供一种玉米种质创制的方法，所述方法包括：
S1)、将具有目标性状的玉米与受体自交系进行杂交，获得F1；
S2)、以单倍体诱导系为父本、以S1)所述F1为母本进行杂交获得果穗，剥离果穗上的幼胚进行鉴别和加倍获得加倍的单倍体幼胚；
S3)、对S2)所述加倍的单倍体幼胚进行成苗处理获得单倍体植株，筛选具有目标性状的单倍体植株；
S4)、将S3)所述的具有目标性状的单倍体植株自交获得双单倍体植株，完成玉米种质的创制。
进一步地，所述的方法中，S2)所述加倍处理的方法为：使用单倍体诱导剂处理所述幼胚。
进一步地，所述的方法中，所述单倍体诱导剂为秋水仙素。
进一步地，所述的方法中，S2)所述加倍处理的方法为：使用含有秋水仙素的培养基培养幼胚。
进一步地，所述的方法中，所述含有秋水仙素的培养基包含：3.0g/L MS盐、30g/L蔗糖、0.1g/L秋水仙素、2％二甲基亚砜，其余为水。
在本发明的一个实施例中，所述含有秋水仙素的培养基命名为加倍培养基，所述加倍培养基的配方为：3.0g/L MS盐、30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂、0.1g/L秋水仙素、2％DMSO(体积比100：2)，其余为水，培养基的pH为5.8。
进一步地，所述的方法中，S2)所述单倍体诱导系携带显性遗传标记或者分子标记。
进一步地，所述的方法中，S2)所述单倍体诱导系携带显性遗传标记可用于鉴别单倍体且具备较高的单倍体诱导率。
在本发明实施例中，杂合二倍体因携带父本诱导系基因组而胚部盾片表现为紫色，加倍的单倍体仅含有母本染色体因此胚部盾片不显色，根据颜色挑选出经过加倍处理的单倍体幼胚。
进一步地，所述的方法中，S3)所述单倍体植株的制备方法包括使用1/2MS培养基培养所述单倍体幼胚，获得单倍体幼苗。
在本发明的一个实施例中，所述1/2MS培养基的配方为：1.5g/L MS盐、30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂，其余为水，培养基的pH为5.8。
进一步地，所述方法中，S3)所述单倍体植株的制备方法还包括：炼苗(也叫驯化)和田间栽培。
进一步地，所述的方法中，S3)所述筛选具有目标性状的单倍体植株包括A1)和/或A2)：
A1)、分子标记辅助筛选；
A2)、胁迫条件辅助筛选。
进一步地，上述方法中，A1)所述分子标记辅助筛选为检测待测植株中是否含有抗锈病基因RppM。
在本发明的一个实施例中，所述抗锈病基因RppM通过引物序列引物序列上游引物F1:GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTGAAGCTAYCAATTGGGGCCAC，上游引物F2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGAAGCTAYCAATTGGGGCCAC和下游引物R:GCAGCGATTCCCTGAAGAAACCAT进行鉴定。以检测待测玉米第10号染色体第1608911位(参考基因组版本号：B73_RefGen_v4)脱氧核糖核苷酸的基因型是G还是A，G基因型待测玉米含有抗锈基因RppM；A基因型的待测玉米不含有抗锈基因RppM。
进一步地，上述方法中，A2)所述胁迫条件辅助筛选可为将待测单倍体植株种植于目标性状胁迫的环境中。
在本发明的一个实施例中，所述目标性状为抗锈病。所述胁迫环境为待测单倍体植株种植于海南二季度锈病高发区进行待测单倍体植株抗锈病的效果验证。
进一步地，所述的方法中，所述目标性状选自下述至少一种：抗锈病、抗青枯病、抗斑病和抗倒伏。
进一步地，所述的方法中，所述目标性状可为抗锈病性状。
第二个方面，本发明提供一种玉米育种的方法，所述方法包括上述方法中所述的S1)-S4)。
进一步地，所述的方法中，所述玉米育种的目的可包括培育抗锈病的玉米。
第三个方面，本发明提供一种培育抗锈病玉米的方法，所述方法包括上述方法中所述的S1)-S4)。
在本发明的实施例中，以制备抗锈病的玉米举例，提供了具体的操作步骤。
在本发明的实施例中，所述目标性状是抗锈病性状。
在本发明的实施例中，以所述具有目标性状的玉米为母本，以所述受体自交系为父本，杂交获得F1。
在本发明的实施例中，所述具有目标性状的玉米为玉米抗锈自交系京2416K。
在本发明的实施例中，所述受体自交系为感锈自交系京J2418。
在本发明的实施例中，所述单倍体诱导系为京科诱046，京科诱046携带显性遗传标记，即R1-nj标记。
在本发明的实施例中，加倍的单倍体幼胚携带R1-nj标记，胚部盾片显示无色。
实验证明：本发明利用优异种质进行杂交聚合，针对一个或多个性状，获得F1或F1以上世代分离群体，而后以单倍体诱导系为父本与基础群体杂交，获得单倍体籽粒或幼胚，而后结合单倍体加倍技术，对所得单倍体进行加倍，加倍处理后将单倍体成苗种植于对目标性状具有选择作用的胁迫环境中，或通过外部接种的方式对单倍体植株的目标性状进行鉴定，保留具有目标性状的单倍体植株，同时对单倍体苗提取DNA，结合分子标记对目标性状进行辅助选择，对筛选后的单倍体植株进行自交，从而快速创制具有目标形状的优异种质。
为解决优异种质创制周期长，DH系鉴定工作量大的问题提供了一个可行的方案，可大大缩短优异种质选育年限，提高单育种效率。首先组配用于生产优异DH的基础材料，基础材料亲本至少一方具有一个或多个目标性状，基础材料类型具体可为F1或F1世代以上分离群体。而后利用单倍体诱导系对分离群体进行诱导，获得单倍体。
针对后期不同的单倍体加倍方法，可分为以下两种：
1)利用携带R1-nj标记的诱导系对基础群体进行诱导后，所得杂交籽粒中，杂合二倍体籽粒盾片和糊粉层均表现为紫色，而单倍体籽粒仅糊粉层着色，其胚来自于母本，因此不着色，从而获得单倍体成熟籽粒，而后采用芽苗法对其加倍，即对所得单倍体籽粒进行催芽，待芽长至1-2cm时，切除芽鞘顶部，利用0.06％的秋水仙素溶液处理8-10小时，而后将加倍处理后芽苗进行成苗，炼苗后移栽。
2)利用携带R1-nj标记的诱导系对基础群体进行诱导，授粉后15天左右，取杂交果穗，于无菌条件下取幼胚放置于加倍培养基上进行培养，培养基具体为3.0g/L MS盐+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂+0.1g/L秋水仙素+2％DMSO，pH为5.8，连续培养处理24h后，杂合二倍体因携带父本诱导系基因组而表现为紫色，加倍的单倍体仅含有母本染色体因此不显色，将加倍的单倍体幼胚进行成苗，炼苗后移栽。
根据目标性状，将上述所得单倍体苗移栽种植于对目标性状具有选择作用的胁迫环境下进行鉴定，所述目标性状可以为抗锈、抗斑病、光周期敏感性、早熟等关键农艺性状。同时结合目标性状相关分子标记对单倍体植株进行辅助选择。从而实现在单倍体世代对目标性状进行鉴定，降低后续DH生产以及所得DH系再鉴定工作量，由于单倍体仅含有母本的1套基因组，因此中选单倍体加倍成功，所得DH在目标性状上均为纯合。因此可实现优异种质的快速创制。
常规优异种质创制需通过自交或回交的方式进行，一般需要7代以上方可获得稳定纯系，利用单倍体育种技术可在1-2代快速创制大量DH系，而常规方法是对所获得DH进行目标性状的鉴定，一般通过穗行种植，多环境变换、分子标记辅助选择等进行鉴定，工作量大，需消耗大量人力物力，且根据单一性状遗传分离规律，所获得DH群体50％-75％的DH会被淘汰掉，造成前期工作的大量浪费与后期巨大的鉴定压力。本方法利用单倍体技术创制优异DH系，保留了单倍体1-2代快速获得纯系的优势，另外在单倍体加倍世代，即对单株的目标性状进行环境鉴定与分子标记辅助选择，早代固定目标性状，可淘汰绝大部分不含有目标性状的单倍体，从而大大降低后续DH生产与鉴定的工作量，从而提升育种效率。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，如无特殊说明均设置三次重复，结果取平均值。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中玉米(Zea mays L.)单倍体诱导系京科诱046(植物新品种权授权号CNA20110155.6)，玉米自交系京2416K(植物新品种权申请号20170479.9)和玉米自交系京J2418(植物新品种权申请号20201000757)为公知材料，均由北京市农林科学院玉米研究所自选育，公众可从北京市农林科学院玉米研究所获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的蔗糖和琼脂糖均为北京吉普腾生物技术有限公司产品。
下述实施案例中的PCR扩增Mix试剂为北京艾德莱生物科技有限公司产品。
下述实施案例中的秋水仙素为北京博友航生物科技有限公司产品。
下述实施例采用Excel对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验。不同的字母代表在0.05水平差异显著，相同的字母代表在0.05水平差异不显著。
实施例1、材料选择与准备
于2021年春在北京实验基地种植玉米抗锈自交系京2416K、感锈自交系京J2418，分别种植10行，每行种植10株。以玉米抗锈自交系京2416K作为母本、以感锈自交系京J2418作为父本进行杂交获得100株玉米植株，100株玉米植株收获的果穗上的籽粒为F1代种子。
2021年冬在海南实验基地播种上述F1，种植40行，每行种植10株，得到F1基础群体。同时为保证花期相遇，单倍体诱导系京科诱046分三期播种，每期分别种植5行，每行种植10株。
实施例2、双单倍体的制备
2.1、单倍体的诱导鉴别与加倍
对实施例1的F1基础群体，在雄穗露药散粉前，去除雄穗，雌穗吐丝前，严格套袋，防止花粉污染。以单倍体诱导系京科诱046为父本，对F1进行诱导，授粉后15天，取杂交果穗，于无菌条件下剥离幼胚，并放置于加倍培养基上进行培养，加倍培养基的配方为3.0g/LMS盐+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂+0.1g/L秋水仙素+2％ DMSO(由3.0g/L MS盐、30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂、0.1g/L秋水仙素、2％ DMSO和水组成)，pH为5.8，连续培养处理24h后，杂合二倍体因携带父本诱导系基因组胚部盾片表现为紫色，单倍体仅含有母本染色体因此胚不显色，挑选出经过加倍处理的单倍体幼胚共计6024个，放置于1/2MS培养基+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂(由1.5g/L MS盐、30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂和水组成，pH为5.8)上进行成苗，胚苗长至2-3叶一心后移栽至装有草炭土的营养钵中缓苗炼苗，长至5叶一心后定植到海南基地大田中，去除死苗，共获得单倍体幼苗4174株。对获得的4174株单倍体幼苗分为两组，第一组为本发明提供的方法制备DH，第二组为常规方法制备DH。
第一组：对其中2087份单倍体幼苗，利用分子标记对单倍体抗锈基因RppM进行检测，获得998株含有抗锈基因，而后结合海南锈病高发环境，淘汰感锈单倍体11株，选择能够正常散粉的剩余987株单倍体自交，共计获得217份DH(具体操作步骤如2.2-2.3)。
第二组：将另外2087株单倍体幼苗正常移栽，对于能够正常散粉的单倍体进行自交，获得462份常规双单倍系(也称为常规DH)。
2.2、抗锈单倍体的分子标记辅助选择
第一组中2.1获得的2087份单倍体幼苗移栽前，取幼苗叶片，提取DNA，利用分子标记对抗锈病基因RppM进行检测，获得998株含有抗锈基因的单倍体幼苗。选择含有抗锈病基因的单株进行田间移栽。玉米锈病为质量性状受单基因控制，所使用抗锈材料京2416K携带抗锈病基因RppM。所用引物序列为上游引物F1:GAAGGTG ACCAAGTTCATGCTCTGAAGCTAYCAATTGGGGCCAC，上游引物F2：GAAGGT CGGAGTCAACGGATTCTGAAGCTAYCAATTGGGGCCAC和下游引物R:GCAGCG ATTCCCTGAAGAAACCAT，引物F1和F2中Y表示C或T，该引物在申请号为CN202210415127.4、发明名称为与玉米南方锈病抗性相关的KASP标记及其应用的专利中公开。玉米锈病为质量性状受单基因控制，所使用抗锈材料京2416K携带抗锈病基因RppM。利用上述标记对所得单倍体进行基因型鉴定。由于单倍体仅存在一套染色体组，检测待测玉米第10号染色体第1608911位(参考基因组版本号：B73_Re fGen_v4)脱氧核糖核苷酸的基因型是G还是A，G基因型待测玉米含有抗锈基因RppM；A基因型的待测玉米不含有抗锈基因RppM。
2.3、抗锈单倍体的田间鉴定
海南为南方锈病高发区，将2.2筛选出的含有抗锈基因的998株单倍体幼苗移栽至田间。具体地，2021年冬在海南实验基地播种上述单倍体，株距15厘米，每行种植11株。
根据田间锈病发生情况，剔除感锈单倍体11株，抗锈单倍体正常田间管理，选择能够正常散粉的剩余987株单倍体自交，自交获得双单倍体(也称为筛选DH)共计217份。
实施例3、抗锈种质评价
将实施例2制备获得的217份筛选DH和462份常规DH种植于2022年春北京小汤山基地进行播种，行距25厘米，每行5株，对所得DH进行扩繁，严格自交后收获种子。于2022年冬海南将所扩繁DH系，进行田间播种，行距25厘米，行长每个2.5米，每行11株。
同时采集DH相关表型性状，筛选抗锈优异种质。由于锈病多发生于授粉完成后，籽粒灌浆期间，而锈病也多导致叶片干枯，植株早衰，因而抑制籽粒灌浆，导致瘪粒。参考文献“江凯，杜青，秦子惠，等.玉米种质资源抗南方锈病鉴定[J].植物遗传资源学报，2013，14(04)：711-714”，将锈病发病情况分为高抗(叶片上无病斑或仅有无孢子堆的过敏性反应)、抗病(叶片上有少量孢子堆，占叶面积25％)、中抗(叶片上有中量孢子堆，占叶面积26％～50％)、感病(叶片上有大量孢子堆，占叶面积51％～75％)和高感(叶片上有大量孢子堆，占叶面积76％～100％，叶片枯死)，对常规方法创制的DH系与单倍体世代鉴定后所得DH系锈病发病情况进行鉴定，结果发现：所得462份常规DH系中，53份高抗、92份抗病、101份中抗、118份感病和98份高感。按本方法在单倍体世代利用分子标记和田间胁迫环境选择后获得217份筛选DH系中，61份高抗、110份抗病、35份中抗、11份感病和0份高感。将高抗、抗病和中抗归为抗锈病，感病和高感归为感锈病，比较发现，常规方法所得DH系中，抗病DH占比为53.25％，感病DH占比为46.75％，接近1：1；而通过本方法所得DH系中，抗病DH占比高达94.93％，感病DH占比仅为5.07％，分离比为18.7：1(表1)。总体来看，常规方法生产DH系过程中，未对抗锈目标性状进行选择，所得DH感锈病比例接近1/2，而利用本方法在DH生产过程中对目标形状进行提前选择，所得DH系感病比例仅为5.07％，且无高感DH系。由此说明，利用本方法在单倍体世代即DH生产过程中对单倍体抗锈性状进行鉴定，可筛除绝大部分感锈单株，大幅提升所得DH中，抗锈病占比，在提升优异种质创制效率的同时，更加大大降低了后续DH鉴定的工作量。
表1DH系锈病发生情况鉴定
实施例4、农艺性状评价与优异种质鉴定
另外，对实施例2制备所得DH系籽粒(常规DH和筛选DH)性状进行考察，结果发现(表2)，能够达到抗锈和感锈级别的DH在粒长、粒宽方面差异不显著；但在产量相关性状方面，对锈病达到中抗及以上的DH平均粒重和单穗粒重方面均显著高于感病DH，抗锈DH不同分组间差异不显著。当DH系对锈病表现为高感时，其在粒长、粒宽、百粒重和单穗粒重方面，均显著降低。由此说明锈病的感染，达到感病级别时，可显著降低种质单株产量，进而影响所组配品种产量。
表2锈病不同发病等级DH籽粒性状表现
同一列内，不同的字母代表在0.05水平差异显著，相同的字母代表在0.05水平差异不显著。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.一种玉米种质创制的方法，所述方法包括：
S1)、将具有目标性状的玉米与受体自交系进行杂交，获得F1；
S2)、以单倍体诱导系为父本、以S1)所述F1为母本进行杂交获得果穗，剥离果穗上的幼胚进行加倍诱导获得加倍的单倍体幼胚；
S3)、对S2)所述加倍的单倍体幼胚进行成苗处理获得单倍体植株，筛选具有目标性状的单倍体植株；
S4)、将S3)所述的具有目标性状的单倍体植株自交获得双单倍体植株，完成玉米种质的创制。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：S2)所述单倍体诱导系携带显性遗传标记。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：S2)所述加倍处理的方法为：使用单倍体诱导剂处理所述幼胚。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述单倍体诱导剂为秋水仙素。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：S3)所述筛选具有目标性状的单倍体植株包括A1)和/或A2)：
A1)、分子标记辅助筛选；
A2)、胁迫条件辅助筛选。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：所述目标性状选自下述至少一种：抗锈病、抗青枯病、抗斑病和抗倒伏。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于：所述目标性状为抗锈病性状。
8.一种玉米育种的方法，所述方法包括权利要求1-7中任一项所述的S1)-S4)。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述玉米育种的目的包括培育抗锈病的玉米。
10.一种培育抗锈病玉米的方法，所述方法包括权利要求1-7中任一项所述的S1)-S4)。
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