KR20190039597A - 세포 치료요법을 위한 항상성 활성 사이토킨 수용체 - Google Patents

세포 치료요법을 위한 항상성 활성 사이토킨 수용체 Download PDF

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Abstract

본원의 개시내용의 구현예는 면역치료요법을 위한 면역 세포의 확장을 증진시키기 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 특정 구현예에서, T-세포와 같은 면역 세포는 막관통 도메인 및 내부도메인이 이들이 작동가능하게 연결된 상응하는 외부도메인으로의 임의의 인풋과는 별도로 활성화 신호를 제공할 수 있는 항상성 활성 사이토킨 수용체를 발현한다. 특정 구현예에서, IL-7Rα로부터의 막관통 도메인 및 내부도메인은 CD34의 외부도메인과 함께 사용된다.

Description

세포 치료요법을 위한 항상성 활성 사이토킨 수용체
본 출원은 2016년 8월 26일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/380,021호에 대한 우선권을 주장하고, 이는 전문이 본원에 참조로 인용된다.
개시내용의 구현예는 적어도 세포 생물학, 분자 생물학, 면역학 및 적어도 암 의학을 포함하는 의학 분야를 포함한다.
항원-특이적 T-세포를 사용한 세포 치료요법은 임상전 모델 및 조기 단계의 임상 시험에서 가능성을 보여주었으나 큰 (bulky) 질환을 갖는 환자들은 거의 치유되지 않았다. 상기 효능의 부재는 여러 인자들 때문이고, 이들은 주입 후 제한된 생체내 T-세포 확장을 포함한다. 화학치료요법 및/또는 방사선을 사용한, T-세포 전달 전 림프구 고갈 환자들은 생체내 T-세포 확장을 크게 증진시키지만 이들 제제들은 원치 않는 부작용을 갖는다. 상기 독성제 없이 T-세포 확장을 가능하게 하기 위한 수단들이 요구된다.
본원의 개시내용은 생체내 T-세포 확장을 안전하게 증진시키기 위한 방법 및 조성물을 제공하기 위한 당업계의 요구를 충족시킨다.
개시내용의 구현예는 주입 후 생체내를 포함하는, 면역 세포 확장 및/또는 증식을 증진시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특정 경우에, T-세포는 암을 포함하는 의학 병태에 대한 치료요법으로서 사용하기 위한 생체내 T-세포의 확장을 촉진시키는 특정 항상성 활성 사이토킨 수용체 분자를 발현한다. 항상성 활성 사이토킨 수용체는 특정 구현예에서 적어도 하나의 내부도메인, 막관통 도메인 및 적어도 하나의 외부도메인을 포함한다.
제1 양상에서, 본원에서는 동종이량체화하고 관련 사이토킨에 결합할 필요 없이 다운스트림 신호전달을 촉진시키는 가공된 사이토킨 수용체 폴리펩타이드가 제공된다. 상기 가공된 사이토킨 수용체의 공통된 특징은 이들이 예를 들어, 막관통 도메인에서, 동족 사이토킨의 결합 부재하에 동종이량체화 및 따라서 신호전달을 유발하거나 촉진시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하도록 가공된다는 것이다. 이와 같이, 사이토킨 신호전달과 관련하여, 이들은 항상성 활성이다(즉, 돌연변이는 "기능 획득(gain-of-function)" 돌연변이다).
특정 경우에, 가공된 사이토킨 수용체 폴리펩타이드는 항상성 활성인데 그 이유는 상기 수용체의 막관통 도메인이 수용체가 동종이량체화하여 외부 신호, 예를 들어, 사이토킨이 막관통 도메인 및 내부도메인을 활성화시키기 위해 요구되지 않도록 하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하기 때문이다. 적어도 일부 경우에, 막관통 도메인 내 하나 이상의 돌연변이는 분자를, 이들을 통해 신호가 작용하는 목적하는 표적 분자에 보다 근접하게 위치시키는 막관통 도메인/내부도메인에 구조적 구성을 부여한다. 특정 예에서, 막관통 도메인내 돌연변이는 디설파이드 브릿지가 형성되도록 (이에 의해 폴리펩타이드의 동종이량체가 촉진됨) 하는 막관통 도메인 아미노산 서열 내 적어도 하나의 시스테인의 삽입이거나 이를 포함하고/하거나 형태적 변화를 유도하기 위한 적어도 하나의 프롤린의 삽입 (예를 들어, 분자가 수용체 분자를 통한 축에 대해 킹크하거나 트리위스트 하거나 회전하도록 하기 위해)을 포함하고, 상기 둘 다는 구조적으로 분자의 특성 및 따라서 이의 신호전달에 영향을 준다.
특정 구현예에서, 막관통 도메인은 상응하는 야생형 IL-7 사이토킨 수용체 알파 막관통도메인과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 IL-7 사이토킨 수용체 알파 막관통 도메인이다. 특정 구현예에서, 막관통 도메인이 IL-7 사이토킨 수용체 알파로부터 기원하는 경우, 상기 돌연변이는 서열 LLTISILSFFSVALLVILACVLW (서열번호 25)에 있다. 특정 양상에서, 상기 돌연변이는 적어도 하나의 시스테인을 막관통 도메인에 도입하고/하거나 돌연변이는 프롤린을 막관통 도메인에 도입한다. 막관통 도메인은 일부 경우에 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 아미노산 길이이다.
막관통 도메인의 특정 구현예에서, 도메인은 자가-이량체화하고, 특정 경우에, 막관통 도메인은 개시내용의 하나 이상의 사이토킨 수용체 내부도메인의 내인성 막관통 도메인이거나 이의 자가-활성화 유도체이다. 자가-활성화 유도체는 상응하는 야생형 막관통 도메인과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있고, 상기 하나 이상의 돌연변이는 수용체가 동종이량체화할 수 있도록 한다. 특정 경우에, 돌연변이(들)는 수용체가 막관통 및 내부도메인 성분들을 통해 동종이량체할 수 있도록 한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 돌연변이는 막관통 및 내부도메인이 구조조적으로 지향 (예를 들어, 트위스트)될 수 있도록 하여 야누스 키나제가 예를 들어, 내부도메인/폴리펩타이드를 인산화시키고 활성화시킬 수 있도록 한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 돌연변이는 막관통 도메인 및 내부도메인이 구조적으로 나선형으로 전체적으로 트위스트될 수 있도록 한다.
특정 구현예에서, 가공된 사이토킨 수용체 폴리펩타이드는 적어도 하나의 내부도메인, 적어도 하나의 막관통 도메인 및 적어도 하나의 외부도메인을 포함하고 임의로 하나 이상의 외부도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 내부도메인은 야생형이고, 즉 사이토킨 신호전달과 관련하여 기능적으로 활성이다. 특정 구현예에서, 가공된 사이토킨 수용체 폴리펩타이드는 정상 (야생형) 외부도메인을 포함하고; 상기 구현예에서, 폴리펩타이드는 동종이량체화하고 동족 사이토킨의 존재 또는 부재하에 신호를 전달한다. 또 다른 특정 구현예에서, 가공된 사이토킨 수용체 폴리펩타이드는 상기 수용체에 대해 야생형 외부도메인이 아닌 외부도메인을 포함한다. 보다 특이적 구현예에서, 외부도메인은 정상적으로 수용체가 거주하는 세포에 해로운 리간드(예를 들어, 정상적으로 세포를 하향조절하거나 세포의 아네르기를 유발하거나 세포의 아폽토시스를 유발하는 리간드)에 결합한다. 예를 들어, 상기 비-야생형 외부도메인은 예를 들어, 체크포인트 단백질에 대한 데코이 수용체일 수 있거나 수용체로서 작용할 수 있고; 예를 들어, 외부도메인은 체크포인트 단백질 PD-1에 대한 수용체를 포함한다. 일부 경우에, 비-야생형 외부도메인은 외부도메인에 결합하는 경우, 파괴를 위해 가공된 사이토킨 수용체 폴리펩타이드를 포함하는 세포를 표적화하는 항체에 대한 표적이다. 또 다른 특이적 구현예에서, 가공된 사이토킨 수용체 폴리펩타이드는 외부도메인이 없다. 특정 구현예에서, 사이토킨은 인터류킨, 예를 들어, IL-7, IL-21, IL-23, 또는 IL-12이다.
개시내용의 특이적 양상에서, 항상성 활성 사이토킨 수용체는 항상성 IL-7 수용체 활성을 유도한다. 특정 구현예에서, IL-7Rα의 막관통 도메인 내 하나 이상의 돌연변이 또는 변형은 수용체가 동종-이량체화 상태로 신호전달을 유도할 수 있게 한다. 특이적 구현예에서, 인터류킨은 IL-7이다. 특이적 구현예에서, 상기 가공된 사이토킨 수용체 폴리펩타이드는 가공된 IL-7 수용체 폴리펩타이드이다.
다른 구현예에서, 본원에서는 상기 가공된 사이토킨 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포, 상기 폴리펩타이드를 발현하는 세포, 예를 들어, 키메라 항원 수용체를 추가로 발현하는 세포 및 질환, 예를 들어, 암 (예를 들어, 혈액암 또는 고형 종양)을 치료하기 위한 상기 세포의 용도가 제공된다.
하나의 구현예에서, 가공된 사이토킨 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 있고 상기 폴리펩타이드는 하기의 작동적으로 연결된 성분들을 포함한다: a) 하나 이상의 사이토킨 수용체 내부도메인; b) 가공된 수용체의 동종이량체화를 촉진시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 막관통 도메인; 및 c) 임의로, 또는 임의로가 아닌, 성분 a) 내 상응하는 하나 이상의 사이토킨 수용체 내부도메인에 대해 내인성 세포외부 도메인이 아닌 하나 이상의 세포외부 도메인으로서, 상기 세포외부 도메인이 사이토킨 수용체로부터 유래하지 않는, 세포외부 도메인. 특정 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 세포가 있다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토킨 수용체 내부도메인은 세포 내 STAT5 경로 또는 세포 내 STAT3 경로를 통한 신호전달을 유발한다. 특이적 경우에, 사이토킨 수용체 내부도메인은 IL-7 수용체 알파, IL-21 수용체 알파, CD122, IL-23 수용체 알파, IL-12 수용체 알파, 또는 이의 조합으로부터 기원한다.
하나의 구현예에서, 세포외부 도메인은 형태가 환형이다. 세포외부 도메인은 신호 전달 활성이 없는 데코이 수용체일 수 있다. 세포외부 도메인은 세포독성 항체의 표적일 수 있다. 특정 경우에, 상기 세포외부 도메인은 적어도 70개 아미노산 및/또는 2000개 이하의 아미노산이다. 세포외부 도메인의 길이는 70-2000개 아미노산, 100-1000개 아미노산, 500-2000개 아미노산, 50-500개 아미노산, 100-750개 아미노산, 200-2000개 아미노산, 또는 500-2000개 아미노산일 수 있다. 일부 경우에, 세포외부 도메인은 CD34의 세포외부 도메인이다. 특정 구현예에서, 세포외부 도메인은 CD30, HER2, EGFR, CD19, CD34, TGF-베타 수용체, IL-4 수용체, IL-13 수용체 알파 1 및 알파 2, IL-8 수용체, IL-10 수용체, PD-1, LAG3, TIGIT, CTLA4, FAS, CD19, CD27, CD28, CD52, CD134, CD137, HER2, EGFR, NGFR, 또는 이의 조합으로부터 기원한다.
특정 구현예에서, 항상성 활성 사이토킨 수용체를 발현하는 세포(들)는 면역 세포이다. 세포는 T-세포, NK 세포, NK T-세포, αβ 세포, γδ T-세포, 점막 관련 불변 T-세포 (MAIT T-세포), 선천성 림프구 세포, 줄기 세포 또는 선조체 세포일 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 세포에 대한 항원 특이성을 부여하는 비-천연 분자를 포함한다. 세포는 추가로 적어도 하나의 추가의 가공된 수용체, 예를 들어, 또 다른 항상성 활성 사이토킨 수용체, 키메라 항원 수용체, 재조합 T-세포 수용체, 이특이적 T-세포 인게이져(engager) (BiTE 또는 T-세포 ENG), 이원-친화성 재-표적화 (DART) 단백질 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
항상성 활성 사이토킨 수용체를 발현하는 세포와 관련된 일부 구현예에서, 세포는 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 폴리뉴클레오타이드를 함유한다. 폴리뉴클레오타이드는 추가로 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터와 같은 발현 벡터로서 정의될 수 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스 벡터일 수 있다. 비-바이러스 벡터는 예를 들어, 플라스미드일 수 있다.
하나의 구현예에서, 항상성 활성 사이토킨 수용체를 발현하는 다수의 세포가 개시되어 있고, 여기서, 상기 세포는 하나 이상의 T-세포, NK 세포, NK T-세포, αβ T-세포, γδ T-세포, 점막 관련 불변 T-세포 (MAIT T-세포), 선천성 림프구 세포, 줄기 세포, 선조체 세포 또는 면역 이펙터 세포의 혼합물을 포함한다.
하나의 구현예에서, 개시내용에 의해 포함되는 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 단계를 포함하는, 세포 집단을 확장시키는 방법이 있다. 세포는 시험관내 세포, 또는 예를 들어, 사람을 포함하는 포유동물에서와 같은 생체내 세포일수 있다. 특이적 구현예에서, 사람에게 세포외부 도메인에 결합 즉시 파괴를 위해 세포를 표적화하는, 세포외부 도메인의 하나 이상의 저해제의 유효량이 제공된다. 저해제는 임의의 종류의 하나 이상의 항체일 수 있다. 특정 구현예에서, 사람은 치료요법을 필요로 하고 치료학적 유효량의 세포가 사람에게 제공된다. 특이적 양상에서, 사람은 암, 감염성 질환, 자가면역 질환, 면역결핍을 갖거나 고체-기관 이식 또는 줄기 세포 이식 전 또는 후이다.
특정 구현예에서, 항상성 활성 사이토킨 수용체는 항상성 활성 사이토킨 수용체를 발현하는 세포에 치명적인 하나 이상의 분자와 결합함에 의한 바와 같이 싱크 (sink) 또는 리간드 트랩으로서 사용되는 외부도메인을 사용한다. 상기 리간드는 면역저해성일 수 있는데 그 이유는 예를 들어, 이것이 정상적으로 신호전달 경로를 활성화시켜 면역억제에서와 같이 T-세포를 차단하기 때문이다. 일부 상기 경우에, 외부도메인은 데코이 수용체로서 해로운 리간드에 결합하지만 막관통/내부도메인은 여전히 독립적으로 양성 사이토킨 신호를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 데코이 수용체는 상응하는 리간드가 이것이 정상 상황에 있을때 처럼 T-세포를 억제하지 못하도록 한다. 데코이 수용체의 외부도메인은 예를 들어, 저해성 사이토킨에 결합할 수 있다. 데코이 수용체가 결합할 수 있는 해로운 리간드의 예는 TGF-베타, PD-L1, IL-4, IL-13, IL-8, 및 IL-10을 포함한다. 일부 구현예에서, 데코이 수용체 외부도메인은 이에 제한되지 않지만 LAG3, TIGIT, CTLA4, FAS와 같은, T-세포에 의해 정상적으로 발현되는 저해성 수용체 중 하나이다.
이전의 개시내용은 후속하는 발명의 상세한 설명이 보다 잘 이해될 수 있도록 하기 위해 본 발명의 특성 및 기술적 이점을 보다 광범위하게 명시하였다. 이후 발명의 청구항의 주요 요지를 형성하는 본 발명의 추가의 특성 및 이점이 기재된다. 본원에 기재된 개념 및 특이적 구현예는 본 발명의 동일한 목적을 수행하기 위해 다른 구조를 변형시키거나 디자인하기 위한 기반으로서 용이하게 사용될 수 있음을 당업자는 이해해야만 한다. 또한 상기 균등한 구성은 첨부된 청구항에 제시된 바와 같은 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않음을 당업자는 인지해야만 한다. 이의 구성 및 작동 방법 둘 다에 관한 본 발명의 특징인 것으로 사료되는 신규 특성은 추가의 목적 및 이점과 함께, 첨부된 도면과 연계하여 고려되는 경우 하기 기재내용으로부터 보다 잘 이해될 것이다. 그러나, 특성 각각은 단지 설명과 기재를 목적으로 제공되는 것이고 본 발명의 한계를 정의하는 것으로서 의도되지 않는 것으로 명백히 이해되어야만 한다.
본 발명의 보다 완전한 이해를 위해, 지금부터 첨부된 도면과 연계하여 하기의 기재를 참조한다.
도 1: 정상적인 IL-7 사이토킨/수용체 신호 전달의 도식.
도 2: IL7RP2 수용체에서 신호전달의 도식.
도 3: Δ34.IL7RP2 단백질에서 신호 전달의 도식.
도 4a 및 4b: STAT5는 IL7RP2-형질도입된 T-세포에서 항상성 활성이다. 도 4a는 대표적 공여자로부터의 데이터이고 도 4b는 3명의 공여자의 평균 결과이다.
도 5: IL7RP2-형질도입된, 항원-특이적 T-세포는 항원-특이적 자극 후 변형되지 않은 항원-특이적 T-세포 보다 큰 증식성 잠재력을 갖는다.
도 6a, 6b, 및 6c: Δ34.IL7RP2를 동시 발현하는 GD2.CAR T-세포는 생체내 GD2.CAR T-세포 보다 큰 확장 및 항-종양 효능을 갖는다. GD2.CAR- Δ34.IL7RP2 T-세포는 GD2.CAR T-세포와 비교하여 생체내에서 상당히 확장하였고 종양 부위에서 장기적 T-세포 지속성을 입증하였다(도 6a). LAN-1 종양은 GD2.CAR T-세포를 수용한 마우스에서 과성장하였지만 종양은 GD2.CAR-Δ34.IL7RP2 T-세포에서 제거되었다(도 6b). 이것은 GD2.CAR-Δ34.IL7RP2 T-세포를 수용한 마우스에서 상당히 증진된 생존 이점을 유도하였다(도 6c).
도 7: Δ34.IL7RP2-형질도입된 T-세포는 항원-자극의 부재하에 제한된 지속성을 갖는다.
도 8: Δ34.IL7RP2는 EphA2.CAR T-세포의 세포독성 능력 및 확장을 연장시킨다.
도 9: Δ34.IL7RP2는 생체내 EphA2.CAR T-세포의 항신경교종 활성을 증진시킨다.
도 10a, 10b, 및 10c: Δ34.IL7RP2 단백질은 IL-21Rα 세포질 도메인과 융합되어 항상성 활성 조합 사이토킨 수용체를 생성할 수 있다. Δ34.IL7RP2-링커-IL21Rα의 활성화 도식 (도 10a). Δ34.IL7RP2 및 Δ34.IL7RP2-링커-IL21Rα T-세포에 의한 STAT5의 항상성 활성화(도 10b) 및 단지 Δ34.IL7RP2-링커-IL21Rα에 의한 STAT3의 항상성 활성화 (도 10c).
도 11: IL7RP2는 NK 세포의 항원-매개된 증식을 증진시킨다.
도 12: 항상성 활성 사이토킨 수용체가 2개의 외부도메인으로 구성된 하나의 구현예의 도해.
도 13: 항상성 활성 사이토킨 수용체가 해롭거나 잠재적으로 해로운 리간드를, 수용체를 발현하는 세포에 결합시키기 위한, 데코이 수용체로서 외부도메인을 사용하는 구현예의 도해.
도 14a-14i: C7R로부터의 항상성 신호 전달은 T-세포에서 STAT5를 활성화시키지만 자율적 세포 확장을 지지하지 않는다. (14a) 가공된 C7R 동종이량체화된 수용체와 비교하여, 이종이량체화된 IL7Rα 및 γc로 구성된 천연 IL-7 수용체에 결합된 IL-7의 도식적 비교. (14b, 14c) 비-형질도입된 (NT) 세포와 상대적으로 (14b) CD4 및 (c) CD8 T-세포에서 Δ34 및 C7R (3개를 대표하는)의 형질도입 효율. (14d, 14e) Δ34 또는 C7R이 형질도입된 (14d) CD4 및 (14e) CD8 T 세포에서 인산화된 STAT5 (pSTAT5)의 대표적인 유동 세포측정 비교. 세포는 분석 전 24 내지 72시간 동안 IL-15 및 IL-7 없이 배양하였다. (14f, 14g) 다수의 공여자와 함께 14d 및 14e에서 실험을 반복하는 경우 평균 pSTAT5 MFI 값. (14h,14i) 추가의 항원 자극 없이 PBMC 활성화 후 9 내지 12일째에 개시하는 사이토킨-부재 완전한 세포 배양 배지에서 배양된 Δ34 또는 C7R 형질도입된 (14h) CD4 또는 (14i) CD8 T-세포의 정량된 시험관내 지속성. 생존 세포는 트립판-블루 배제를 사용하여 주마다 계수하였다. X-축은 IL-15 및 IL-7이 배양 배지로부터 배출된 후 일수를 지칭한다. 곡선 이하 면적(AUC) 값은 투-테일 t-시험과 비교하였다: 10.5 ± 0.6616 (CD8 Δ34), 56.37 ± 7.972 (CD8 C7R), p<0.05; 10.22 ± 1.694 (CD4 Δ34) 및 31.36 ± 2.590 (CD4 C7R), p<0.05. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 (투-테일 쌍 형성 t-시험, 14f-14i). 그래프 14f-14i는 상이한 공여자 ± SEM으로부터의 평균을 나타낸다(n=3).
도 15a-15i: C7R은 일련의 종양 챌린지 동안에 GD2-CAR T-세포 활성을 증진시킨다. (15a) LAN-1 종양 세포와의 동시 배양이 ELISA에 의해 결정된 후 24시간째에 GD2-CAR T-세포 또는 GD2-CAR.C7R T-세포에 의해 분비되는 사이토킨. (15b) LAN-1 종양 세포를 사멸시키는 T-세포의 4-시간 루시페라제 기반 세포독성 검정. (15c) 일련의 동시-배양 도식. 제1 동시-배양(CC1)은 IL-5 또는 IL-7의 부재하에, 7일 동안 0.5x106 LAN-1 GFP-FFluc 종양 세포와 함께 1x106 GD2-CAR 또는 GD2-CAR.C7R T-세포로 개시하였다. 제2 및 제3 동시-배양(CC2 및 CC3)을 위해, T-세포는 이전의 동시-배양물로부터 수거하였고 이어서 새로운 배양 배지에서 동일한 2:1의 E:T 비율로 새로운 종양 세포로 반복하였다. (15d) 일련의 동시-배양 동안에 GD2-CAR 또는 GD2-CAR.C7R T-세포의 누적 확장. 화살표는 종양 세포를 사용한 T-세포 재-자극의 시점을 지적한다. (15e) 각각 GD2-CAR T-세포 및 GD2-CAR.C7R T-세포로 CC3 후 남아있는 LAN-1 종양 세포. (15f, 15g) 증식 분석을 위해, CC1 말기에 수거된 GD2-CAR 및 GD2-CAR.C7R T-세포는 CC2 동안에 다시 챌린지되기 전 세포 추적 바이올렛으로 표지시켰다. (15f) 히스토그램 오버레이는 대표적 공여자로부터의 데이터를 나타낸다. (15g) F에서의 실험은 다수의 공여자, 및 GD2-CAR 및 GD2-CAR.C7R 증식 히스토그램으로부터 컴파일된 분열 지수와 함께 반복하였다. (15h) 생존 분석을 위해, GD2-CAR 및 GD2-CAR.C7R T-세포는 LAN-1 종양 세포로의 2 연속 종양 챌린지 후 어넥신 V와 7-AAD로 염색시켰다. 막대 그래프는 어넥신 V, 7-AAD, 둘 다에 양성이거나 양성이 아닌 T-세포 염색의 빈도를 보여준다. 어넥신 V(+)7-AAD(-) 및 어넥신 V(-)7-AAD(+) 평균 비교는 n.s였다. (15i) CC2의 종료 후, 종양은 GD2-특이적 항체로 표지시키고 CAR-T 세포로부터 자기적으로 분리하였다. 총 RNA는 T-세포로부터 단리하였고 유전자 발현 분석은 후속적으로 사람 면역학 패널 버젼 2 및 n계수기 분석 시스템 (Nanostring)을 사용하여 수행하였다. 상기 디스플레이된 히트 맵은 0.02 미만의 P 값을 갖는 log2 배수 변화를 갖는 유전자(GD2-CAR.C7R/GD2-CAR)를 보여준다. 데이터는 5 공여자로부터 생성하였다(10 쌍을 이룬 샘플). *P<0.05, **P<0.01, (투-테일 쌍 형성 t-시험, 15a, 15b, 15d, 15e, 15g, 15h). 그래프 15a, 15b, 15c, 15e, 15g, 15h는 상이한 공여자 ± SEM (n=6, 15a, 15d, 15e; n=3, 15g, 15h)으로부터의 평균을 나타낸다.
도 16a-16g: C7R은 전이성 및 두개내 악성 종양에 대한 입양 T-세포 면역치료요법을 증진시킨다. (16a) 및 (16b) 1x106 CHLA-255 FFluc 세포는 암컷 NSG 마우스에 i.v. 주사하였고 이어서 7일 후 관련 없는 CAR, GD2-CARΔ.C7R, GD2-CAR, 또는 GD2-CAR.C7R을 발현하는 1x106 T-세포를 주사하였다. (16a) 시간 경과에 따른 신경모세포종 성장의 대표적 생발광 이미지. (16b) CHLA-255 FFluc 챌린지된 마우스의 캐플란 마이어 생존 분석. (16c, 16d) T-세포 이동 및 지속성을 추적하기 위해, 병행 실험에서, 1x106 CHLA-255 세포를 NSG 마우스에 정맥내 주사하고 이어서 7일 후 GD2-CAR 또는 GD2-CAR.C7R을 동시-발현하는 1x106 GFP-FFluc T-세포를 주사하였다. (16c) T-세포의 연속 생발광 이미지. (16d) 시간 경과에 따른 T-세포의 정량된 생발광 신호. (16e) 1x105 U373 GFP-FFluc 세포는 두개내로 수컷 SCID 마우스에 주사하였다. 7일 후, EphA2-CARΔ.C7R, EphA2-CAR, 또는 EphA2-CAR.C7R을 발현하는 1x104 T-세포를 두개내로 종양으로 주사하였다. 각각의 처리 그룹으로부터 정량된 U373 GFP-FFluc 생발광은 시간 경과에 따라 나타낸다. (16f) T-세포로 처리 후 U373 GFP-FFluc 챌린지된 마우스의 캐플란 마이어 생존 분석. *P<0.05, **P<0.01 (Welch’s t-시험, D; 쌍을 이룬 투-테일 t-시험, 16g). 5마리 마우스를 모든 그룹에 대해 사용하였다. 그래프 D는 실험 레플리케이트 ± SEM으로부터의 평균을 나타낸다. D에 도시된 실험에서, GD2-CAR.C7R 그룹 내 1마리의 마우스가 종양 하중과 관련 없는 이유 때문에 5일째 이미지화 동안에 죽었고 따라고 9 내지 16일 동안 GD2-CAR.C7R에서 평균 생발광 신호는 n=4로부터 계산한다.
도 17a-17d: C7R-CAR T-세포는 iC9 자살 스위치를 사용하여 결실될 수 있다. (17a) GD2-CAR.C7R 및 iC9-CD19t 벡터로 이중으로 형질도입된 T-세포는 CD19-특이적 밀테닐 비드를 사용하여 iC9 발현에 대해 선택하였다. 세포는 이어서 24시간 동안 완전한 배양 배지에서 AP20187로 항온처리하고 이어서 어넥신 V 및 7-AAD로 염색하였다. 막대 그래프는 어넥신 V, 7-AAD, 둘 다에 양성이거나 양성이 아닌 T-세포 염색의 상대적 빈도를 보여준다. 어넥신 V(+)7-AAD(-) 및 어넥신 V(-)7-AAD(+) 비교는 n.s였다. (17b, 17c) LAN-1 종양은 1x106 T-세포를 GFP-FFluc 및 GD2-CARΔ.C7R로 형질도입하기 전 8일 동안 NSG 마우스에서 피하로 확립하였고, GD2-CAR.C7R 또는 GD2-CAR.C7R + iC9-CD19t는 정맥내로 주입하였다. GD2-CARΔ.C7R은 17b 및 17c에서 동일한 대조군으로서 사용하였다. 종양 용적은 시간 경과에 따라 측정하였다. GD2-CARΔ.C7R 그룹 내 2마리의 마우스는 종양 하중으로 인해 21일 후 안락사시키고 24일째에 나머지 3마리의 마우스의 종양 크기는 GD2-CAR.C7R 및 GD2-CAR.C7R + iC9-CD19t 그룹에서의 크기와 비교하였다. T-세포 주입 후 32일째에 평균 종양 용적: GD2-CAR.C7R에 대해 236 ± 11 mm3, GD2-CAR.C7R + iC9-ΔCD19t에 대해 196 ± 18 mm3, n.s. (p = 0.1857). (17d) 종양 부위로부터 GD2-CAR.C7R T-세포(iC9-CD19t가 존재하거나 존재하지 않는)의 생발광 신호를 시간 경과에 따라 정량하였다. 적색 화살표는 28일째에 총 3개의 용량에 대해 24시간 마다 AP20187 투여 개시를 지적한다. *P<0.05, **P<0.01 (투-테일 t-시험, 17a, 17d; Welch’s t-시험, 17b, 17c). n= 그룹 당 5마리 마우스. 17a에서 그래프는 상이한 공여자 ± SEM (n=3)으로부터의 평균을 나타낸다.
도 18a-18d: CD34-IL7R* (C7R)은 T-세포에서 안정하게 발현되고 IL7R*에 상대적으로 항상성 STAT5 활성화를 증진시킨다. (18a) IL7R* 융합 작제물 및 Δ34의 도식. 모든 IL7R* 작제물은 변형된 IL-7Rα 막관통 도메인(IL-7Rα에서 Thr244와 Ile245 사이에 시스테인, 프롤린 및 트레오닌의 삽입) 및 변형되지 않는 IL-7Rα 내부도메인을 함유한다. Δ34 작제물은 CD34의 엑토도메인 및 막관통 도메인을 함유하지만 내부도메인은 일부만을 보유한다. (18b) 형질도입된 세포는 QBEND10 (Q8에 사용되는 CD34 에피토프를 검출하는)에 대해 특이적인 항-CD34 항체로 염색시켜 NT 세포에 상대적으로 a에서의 작제물의 형질도입 효율과 비교한다. 배양된 NT 세포 상에 IL-7Rα의 백그라운드 발현으로 인해, IL7R* 형질도입은 바이시스트론 벡터에서 Q8 태그에 의해 간접적으로 검출하였다. 형질도입 효율에서의 차이는 Δ34과 IL7R* (p = 0.2951)를 비교하는 경우 및 IL7R*과 C7R (p=0.1736)을 비교하는 경우 n.s였다. (18c) 상이한 작제물의 MFI는 B와 비교하였다. Δ34와 C7R의 비교 뿐만 아니라 Δ34와 IL7R*의 MFI 비교는 n.s였다. (18d) T-세포에 의한 STAT5 인산화 비교. 세포는 분석 전 24 내지 72시간 동안 IL-15 및 IL-7의 존재 또는 부재하에 배양하였다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001 (투-테일 t-시험, 18b-18d). 그래프 18b-18d는 상이한 공여자 (n=3) ± SEM으로부터의 평균을 나타낸다.
도 19a-19b: CD4 및 CD8 선택된 T-세포 둘 다에서 C7R 및 Δ34의 효율적인 레트로바이러스 형질도입. CD34 발현은 NT-T 세포 대조군과 상대적으로 (19a) CD4 및 (19b) CD8 T-세포에서 C7R 및 Δ34 형질도입을 검출하기 위해 유동 세포측정에 의해 평가하였다. 차이는 투-테일 t-시험 (n=3)과 비교하는 경우 n.s였다
도 20a-20d: C7R 신호 전달은 배양 동안에 GD2-CAR T-세포의 표현형 조성을 변화시키지 않는다. (20a) GD2-CAR 및 GD2-CAR.C7R 벡터의 도식. GD2-CAR 작제물은 4g2a scFv, CD8 세포외 스페이서, CD8 막관통 도메인, 및 41BBζ 내부도메인에 이어서 IRES 및 절단된 NGFR로 구성된다. GD2-CAR.C7R 작제물은 IRES 및 절단된 NGFR이 2A 서열에 이어서 C7R로 대체된 것을 제외하고는 동일하다. (20b, 20c) GD2-CAR 또는 GD2-CAR.C7R을 발현하는 T-세포의 기억 표현형을 비교하였다. 막대 그래프는 CD45RO-CCR7- (말단 이펙터-유사, TE), CD45RO+CCR7- (이펙터 기억, EM), CD45RO+CCR7+ (중추 기억, CM), 또는 CD45RO-CCR7+ (순수)인 (20b) CD4 T-세포 및 (20c) CD8 T-세포의 상대적 빈도를 보여준다. GD2-CAR와 GD2-CAR.C7R 간의 차이는 CD4 및 CD8 T 세포 둘 다에서 모든 4개의 서브 기억 서브집단에 대해 n.s.였다. CD4 및 CD8 퍼센트는 GD2-CAR와 GD2-CAR.C7R T-세포 간에 비교하였다. 차이는 n.s.였다. 그래프 20b-20d는 평균 ± SEM (n=3)을 나타내고 집단은 투-테일 t-시험을 사용하여 비교하였다.
도 21a-21b: C7R은 U373 종양에 대한 두개내 EphA2-CAR T-세포 확장을 유의적으로 증가시키지 않는다. (21a, 21b) T-세포를 추적하기 위해, 1x105 U373 세포를 SCID 마우스에 두개내로 주사하고 이어서 7일 후 EphA2-CAR 또는 EphA2-CAR.C7R을 발현하는 1x104 T-세포, GFP-FFluc를 발현하는 co3을 주사한다. (21a) 생발광 이미지는 시간 경과에 따라 수집하고 정량하였다. (21b) AUC 분석을 수행하고 2개 그룹 (투-테일 t-시험) 간에 n.s.인 것으로 밝혀졌다. 그룹 당 n=5 마우스.
도 22: GD2-CAR T-세포와 비교하여 GD2-CAR.C7R T-세포에서 차등적 유전자 발현. CC2 종료 후, 종양은 GD2-특이적 항체로 표지시키고 CAR-T 세포로부터 자기적으로 분리하였다. 총 RNA는 T-세포로부터 단리하였고 유전자 발현 분석은 후속적으로 사람 면역학 패널 버젼 2 및 n계수기 분석 시스템 (Nanostring)을 사용하여 수행하였다. 디스플레이된 표는 0.02 미만의 P 값을 갖는 유전자(GD2-CAR.C7R/GD2-CAR)에서의 배수 변화를 보여준다. 데이터는 5 공여자로부터 생성하였다(10 쌍을 이룬 샘플).
도 23a-23b: LCL 종양의 34.IL7RP2-EBVST로의 처리. 도 23a에는 34.IL7RP2-EBVST로 처리된 마우스에서 루시퍼라제의 이미지가 있다. 도 23b는 34.IL7RP2-EBVST 처리된 마우스에서의 종양 성장의 측정을 보여준다.
본원 발명의 범위는 본원에 기재된 공정, 기계, 제조, 물질의 조성, 수단, 방법 및 단계의 특정 구현예로 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
발명의 상세한 설명
오랫동안 지속된 특허법 협약에 따라, 용어 "a" 및 "an"이 청구항을 포함하는 용어와 함께 본 명세서에 사용되는 경우 "하나 이상"을 지칭한다. 본원의 개시내용의 일부 구현예는 본원의 개시내용의 하나 이상의 요소, 방법 단계 및/또는 방법으로 이루어질 수 있거나 필수적으로 이들로 이루어질 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법 또는 조성물은 본원에 기재된 임의의 다른 방법 또는 조성물과 관련하여 수행될 수 있는 것으로 고려된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "사이토킨"은 염증 및 감염에 대한 면역계의 반응을 조절하고, 면역 반응에서의 세포 대 세포의 소통을 도와주는 세포 신호 전달 분자를 언급한다. 이의 예는 케모킨, 인터페론, 인터류킨, 림포킨 및 종양 괴사 인자를 포함한다.
I.일반 구현예
본원의 개시내용은 이를 필요로 하는 개체로 생체내 후속 전달을 포함하는, 이들의 확장을 증진시키기 위한 세포 면역치료요법 제제에 대한 개선에 관한 것이다. 상기 개선은 사이토킨 수용체의 적어도 하나의 내부도메인, 막관통 도메인 및 적어도 하나의 외부도메인을 포함하는 다수의 성분들로 구성된 항상성 활성 사이토킨 수용체를 사용하지만 일부 경우에 상기 외부도메인은 상기 수용체에서 부재이다. 하나의 구현예에서, 항상성 활성 사이토킨 수용체는 IL-7 사이토킨 수용체 알파 쇄의 내부도메인을 사용한다. 비-천연 키메라 IL7R-포함 수용체를 발현하도록 유전학적으로 변형된 항원 특이적 T-세포는 변형되지 않은 T-세포와 대조적으로, 동물 모델에서 뿐만 아니라 세포 배양 연구에서 강한 확장을 나타냈다.
II. 항상성 활성 사이토킨 수용체 분자
특정 구현예에서, 항상성 활성 사이토킨 수용체 (단백질에서 및/또는 핵산 형태에서), 이들의 제조 방법 및 이들을 사용하는 방법은 본원의 개시내용에 의해 포함된다. 상기 수용체는 적어도 하나의 외부도메인, 막관통 도메인 및 적어도 하나의 내부 도메인을 포함하고, 상기 내부도메인은 사이토킨 수용체로부터 유래하고 상기 엑소도메인은 막관통 및 내부도메인 성분과 동일하거나 상이한 분자로부터 유래한다. 대안적 구현예에서, 막관통 도메인 및 외부도메인은 동일한 분자로부터 기원하고 내부도메인은 상이한 분자로부터 기원하지만 상기 수용체는 상기 분자는 막관통 도메인 및/또는 내부도메인을 트위스트하는 돌연변이를 포함하기 때문에 여전히 항상성 활성이다.
특정 경우에, 상기 항상성 활성 사이토킨 수용체는 이들의 막관통 도메인 및/또는 내부도메인 성분들이, 이들이 작동적으로 연결된 엑소도메인으로부터 상응하는 신호의 접수 부재하에 활성화 신호를 전송하도록 구성되기 때문에 항상성 활성이다. 즉, 수용체의 특정 구현예에서, 상기 사이토킨 수용체 대한 어떠한 리간드 요건이 없다. 일부 경우에, 본원의 개시내용의 항상성 활성 사이토킨 수용체의 막관통 도메인 및/또는 내부도메인은 이들이 비-천연 방식 또는 상황 또는 환경에서 동종이량체화하여 상기 외부 도메인이 활성화 신호를 신호 전달 경로에서 다운스트림에 상응하는 실체로 전송하는 상태로 유지될 수 있도록 구성될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 항상성 활성 사이토킨 수용체의 막관통/내부도메인은 독립적으로 이들이 작동적으로 연결된 외부도메인에 의한 사이토킨의 결합 부재하에 양성 사이토킨 신호를 부여한다.
특정 구현예에서, 특정 항상성 활성 사이토킨 수용체는 본원의 개시내용의 방법에 사용된다.
dCD34.IL7RP2 cDNA 서열은 서열번호 2로 제공되고 상응하는 단백질 서열은 서열번호 3에 있다. 작제물 dCD34.IL7RP2는 전체 CD34 외부도메인; 시스테인, 프롤린, 트레오닌 (CPT) 삽입을 갖는 IL7R TM 도메인; 및 정상 IL7R 내부도메인을 포함한다.
IL7RP2 cDNA 서열은 서열번호 4에 제공되고, 상기 상응하는 단백질 서열은 서열번호 5에 있다. 작제물 IL7RP2는 IL7R 외부도메인; CPT 삽입을 갖는 IL7R 막관통 도메인; 및 정상 IL7R 내부도메인을 포함한다.
Q8E.IL7RP2 cDNA 서열은 서열번호 6에 제공되고, 상기 상응하는 단백질 서열은 서열번호 7에 있다. 작제물 Q8E.IL7RP2는 CD34 세포외 도메인 + CD8 스톡; CPT 삽입을 갖는 IL7R 막관통 도메인; 및 정상 IL7R 내부도메인의 단편을 갖는다.
19AA.IL7RP2 cDNA 서열은 서열번호 8에 제공되고, 상기 상응하는 단백질 서열은 서열번호 9에 있다. 19AA.IL7RP2 작제물은 IL7R 외부도메인의 19 aa (IL7R 막관통 도메인 개시 전 IL7R 엑토도메인 내 마지막 19개 아미노산으로부터 유래하는); CPT 삽입을 갖는 IL7R 막관통 도메인; 및 정상 IL7R 내부도메인을 포함한다.
A. 외부도메인
특정 구현예에서, 항상성 활성 사이토킨 수용체는 1개, 2개 또는 그 이상의 외부도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 외부도메인은 리간드와 결합할 수 있지만 신호 자체는, 예를 들어, 구조적 이유 또는 다른 이유 때문에 전송되지 않는다. 외부도메인은 특정 구현예에서 이의 상응하는 막관통 및/또는 내부도메인과 동일한 천연 분자로부터 유래하거나 유래하지 않을 수 있다. 외부도메인은 이것이 작동적으로 연결된 내부도메인과 동일한천연 분자로부터 유래하거나 유래하지 않을 수 있다.
일부 경우에, 외부도메인은 IL7-수용체 외부도메인 및 CD34 외부도메인의 3차원 기하학적구조와 유사한 환형이다. 외부도메인에 의해 제공되는 하나의 특징은 적어도 일부 데이터가 적어도 특정 외부도메인이 단백질 고발현 및 오염물 고신호 활성화 (pSTAT5 활성화와 같은)를 가능하게 함을 지적하고 있기 때문에 단백질 안정화를 제공할 수 있다.
일부 경우에, 외부도메인은 단백질을 안정화시키고 신호 전달을 증가시킬 수 있는 높은 당화를 포함한다.
일부 구현예에서, 외부도메인은 형질도입된 세포의 동정을 가능하게 한다. 예를 들어, 외부도메인이 T-세포 상에서 정상적으로 발현되지 않는 경우에, 외부도메인은 형질도입된 세포가 예를 들어, 유동 세포측정 분석 동안에 배출됨에 의해 동정될 수 있게 하고 또한 예를 들어, 집적(enrichment)을 위해 자기적으로 선택되도록 (예를 들어, 상응하는 항체에 접합된 자기 비드를 사용하여) 할 수 있다.
일부 구현예에서, 항상성 활성 사이토킨 수용체는 항상성 활성 사이토킨 수용체를 발현하는 세포에 해로운 하나 이상의 분자와 결합하는 것과 같이 싱크 또는 리간드 포집 기능을 부여하는 외부도메인을 사용한다. 특정 구현예에서, 상기 리간드는 면역억해성일 수 있는데 그 이유는 예를 들어, 이것이 정상적으로 신호전달 경로를 활성화시켜 T-세포를 차단 (면역억제)하기 때문이다. 일부 상기 경우에, 외부도메인은 데코이 수용체로서 해로운 리간드에 결합하지만 막관통/내부도메인은 여전히 독립적으로 양성 사이토킨 신호를 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 데코이 수용체는 상응하는 리간드가 이것이 정상 상황에 있을때처럼 T-세포를 억제하지 못하도록 한다. 특이적 경우에, 데코이 수용체 외부도메인은 예를 들어, 저해성 사이토킨에 결합할 수 있다. 해로운 리간드의 예는 TGF-베타, PD-L1, IL-4, IL-13, IL-8, 및 IL-10을 포함한다. 또한, 데코이 수용체 외부도메인은 이에 제한되지 않지만 LAG3, TIGIT, CTLA4, FAS와 같이, T-세포에 의해 정상적으로 발현되는 저해성 수용체의 외부도메인을 암호화할 수 있다. 특정 구현예에서, 수용체는 항상성 신호전달이고 신호전달은 추가로 지정된 유발제의 존재하에 증강된다. 또 다른 구현예에서, 외부도메인은 예를 들어, IL-4 사이토킨 수용체 또는 IL-13 사이토킨 수용체로부터 기원하지 않는 것을 포함하는, 사이토킨 수용체로부터 기원하지 않는다. 일부 경우에, 외부도메인은 scFv와 같은 항체를 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다.
특정 양상에서, 외부도메인은 세포의 파괴를 위한 표적이다. 예를 들어, 외부도메인은 수용체를 발현하는 세포의 아폽토시스를 직간접적으로 유도하는 분자를 위한 표적으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 엑소도메인은 외부도메인에 결합하는 상응하는 항체를 사용하여 표적화될 수 있고 이는 궁극적으로 세포 파괴를 유도한다.
일부 경우에, 항상성 활성 수용체는 저해성 리간드에 대해 데코이 수용체로서 작용하는 외부도메인을 갖고 또한 자살 표적화를 위한 도메인을 갖지만, 일부 경우에, 상기 데코이 수용체 외부도메인 및 자살 표적화 내부도메인은 하나이고 동일하다.
특정 구현예에서, 외부도메인은 CD30, HER2, EGFR, CD19, CD34, CD34, TGF-베타 수용체, IL-4 수용체, IL-13 수용체 알파1 및 알파 2, IL-8 수용체, IL-10 수용체, PD-1, LAG3, TIGIT, CTLA4, FAS, CD19, CD27, CD28, CD52, CD134, CD137, HER2, EGFR, 또는 NGFR의 세포외 도메인을 포함한다. 추가로, 외부도메인은 모노클로날 항체 또는 이들의 유도체 (예를 들어, 이에 제한되지 않지만 scFV), 또는 이량체화 도메인 (예를 들어, 이에 제한되지 않지만 FKBP)을 포함할 수 있다.
특정 경우에, 외부도메인은 포도칼릭신 (또한 포도칼릭신 유사 단백질 1로서 공지된); PODXL (또한, PCLP1로서 공지된); 트롬보뮤신; gp135; GCTM2; TRA-1-60; TRA-1-81; 또는 엔도글리칸 (또한 포도칼릭신 유사 단백질 2, PODXL2 또는 PCLP2로 공지되어 있음)을 포함한다.
일부 구현예에서, 수용체의 외부도메인 성분은 천연적으로 존재하는 분자로부터 기원하고 야생형이지만, 다른 경우에, 상기 외부도메인은 상응하는 야생형의 천연적으로 존재하는 분자와 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 하나 이상의 돌연변이는 추가로 예를 들어, 수용체를 안정화시키는 기능을 할 수 있다. 외부도메인이 상응하는 야생형 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 경우에, 상기 돌연변이된 버젼은 상응하는 야생형 단백질 또는 핵산 서열과 비교하여, 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성과 같은, 서열 일부 또는 전부에 걸쳐 특정 퍼센트 동일성을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 세포외 도메인은 특정 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, 세포외 도메인의 길이는 10-275개 아미노산, 10-225개 아미노산, 10-200개 아미노산, 10-175개 아미노산, 10-150개 아미노산, 10-125개 아미노산, 10-100개 아미노산, 10-50개 아미노산, 50-250개 아미노산, 50-225개 아미노산, 50-200개 아미노산, 50-175개 아미노산, 50-150개 아미노산, 50-100개 아미노산, 90-250개 아미노산, 90-225개 아미노산, 90-200개 아미노산, 90-175개 아미노산, 90-150개 아미노산, 90-125개 아미노산, 90-100개 아미노산, 100-250개 아미노산, 100-225개 아미노산, 100-200개 아미노산, 100-175개 아미노산, 100-150개 아미노산, 100-125개 아미노산, 125-250개 아미노산, 125-225개 아미노산, 125-200개 아미노산, 125-175개 아미노산, 125-150개 아미노산, 150-250개 아미노산, 150-225개 아미노산, 150-200개 아미노산, 150-175개 아미노산, 175-250개 아미노산, 175-225개 아미노산, 175-200개 아미노산, 200-250개 아미노산, 200-225개 아미노산 등이다.
대안적 구현예에서, 수용체는 외부도메인이 없다.
B. 막관통 도메인
특정 구현예에서, 항상성 활성 사이토킨 수용체는 외부도메인(들) 및 내부도메인(들)에 작동적으로 연결된 막관통 도메인을 포함한다. 막관통 도메인은 이것이 작동적으로 연결된 내부도메인과 동일한 천연 분자로부터 유래하거나 유래하지 않을 수 있다. 특정 구현예에서, 막관통 도메인은 이것이 작동적으로 연결된 외부도메인과 동일한 천연분자로부터 유래하지 않는다. 막관통 도메인은 특정 구현예에서 천연의 도메인이 아닌데 그 이유는 이것이 분자의 트위스팅을 유발하는 돌연변이를 요구하기 때문이다. 막관통 도메인은 이의 상응하는 야생형 분자와 비교하여 상기 막관통 도메인이 적어도 특정 구현예에서 자가 활성이도록 하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "자가-활성"은 이것이 작동적으로 연결된 내부도메인과 연계하여 이것이 작동적으로 연결된 외부도메인으로부터의 상응하는 활성화 신호의 부재하에 신호를 세포에 전송하는 막관통 도메인을 언급한다. 특정 구현예에서, 막관통 도메인은 동종이량체화를 유발하거나 촉진시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
특정 경우에, 막관통 도메인은 다운스트림 내부도메인이 서로 상대적으로 신호전달에 결정적인 방식으로 배향되도록 하는 것과 같은, 예를 들어, 내부도메인과 연합된 야누스 키나제가 서로 상호작용하여 서로를 교차 활성화하도록 하는, 자가-활성화를 허용하는, 수용체 상에 기능적 형태를 부여한다. 특정 양상에서, 막관통 도메인은 막관통 도메인 및 내부도메인이 이들이 천연적으로 하지 않는 경우의 비-순간적 방식으로 함께 작용하도록 하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 적어도 일부 양상에서, 돌연변이는 막관통 도메인 및 엑토도메인이 인공적으로 동종이량체화할 수 있도록 한다. 예를 들어, 막관통 도메인은 이의 각각이 막관통 도메인 및 적어도 하나의 내부도메인을 포함하는 2개의 별도의 분자의 동종이량체화를 가능하게 하는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있고, 여기서, 상기 분자의 동종이량체화는 천연적으로 발생하지 않는다. 특이적 구현예에서, 막관통 도메인에서 하나 이상의 돌연변이는 수용체 동종이량체의 막관통 도메인 및 내부도메인의 구조적 트위스팅을 유도하여 예를 들어, 자가-활성화 나선 구조를 형성한다. 특이적 구현예에서, 막관통 도메인 내 하나 이상의 돌연변이는 수직 축에 대하여 수용체 분자 (또는 이의 하나 이상의 구성성분)의 일부 또는 전부의 나선형의 트위스팅을 유도한다. 특정 돌연변이가 상기 막관통 도메인 및 내부도메인이 자가활성화하도록 하는 구조적 형태를 유도할지의 여부를 결정하는 능력은 성장 인자의 부재하에 시험된 특정 수용체를 함유하는 세포의 성장 후 STAT3 또는 STAT5 인산화에 대한 검정과 같은, 통상적인 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 기능 획득 돌연변이를 갖는 막관통 도메인 성분들은 본원의 개시내용의 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 돌연변이(들)는 예를 들어, 이의 치환, 삽입, 결실 또는 조합일 수 있다. 특이적 구현예에서, 하나 이상의 돌연변이는 적어도 하나의 시스테인 및/또는 적어도 하나의 프롤린의 내포를 포함한다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 막관통 도메인에서 기능 획득 돌연변이로서, 종양 환자 내 동정된 돌연변이를 사용한다. 적어도 일부 경우에, 돌연변이체 버젼은 막관통 도메인에 디설파이드 결합 형성을 유도하는 시스테인 삽입(들)을 포함한다. 다른 구현예에서, 그러나, 하나 이상의 돌연변이는 시스테인의 삽입이 부재이다. 예를 들어, 막관통 유도체가 사용될 수 있고 이는 시스테인 삽입(들)을 갖지 않지만(따라서, 어떠한 디설파이드 결합도 부재임) 여전히 신호전달하고, 예를 들어, 돌연변이가 막관통 도메인이 막관통 도메인의 천연 버젼과 비교하여 형태적으로 변화되도록 하여 신호전달의 유도를 가능하게 하기 때문에 항상성 활성이다. 예를 들어, 프롤린과 같은 아미노산의 삽입은 막관통 도메인을 트위스트하여 신호전달을 유도하는 "킹크"를 생성한다(문헌참조: 예를 들어, Shochat et al., 2011, J Exp Med. 2011 May 9;208(5):901-8; Zenatti et al., 2011, Nat Genet. 2011 Sep 4;43(10):932-9).
특정 구현예에서, 막관통 도메인은 IL-7Rα 수용체로부터 유래하고 상기 막관통 도메인 내 돌연변이는 서열 PILLTISILSFFSVALLVILACVLW (서열번호 1) 중에 있다. 특정 구현예에서, 돌연변이는 서열번호 1의 아미노산 서열로의 하나 이상의 시스테인 및/또는 하나 이상의 프롤린의 삽입이거나 이를 포함하고, 여기서, 상기 돌연변이는 수용체의 동종이량체화를 가능하게 하거나 촉진시킨다. 특정 경우에, 돌연변이는 시스테인, 프롤린, 트레오닌 (CPT)의 삼량체 펩타이드의 막관통 도메인으로의 삽입을 포함한다. 상기 돌연변이는 2개 분자 (예를 들어, 2개의 IL7RP 2 수용체 알파 쇄)의 시스테인 잔기들의 -SH (티올) 그룹 간의 디설파이드 결합 형성을 부여하여, 동종이량체가 이들 사이에서 형성되도록 한다(시스테인 직후 프롤린은 동종이량체가 특정 구현예에서 올바른 배향으로 트위스트되도록 하는 것을 도와준다). 특정 구현예에서, CPT 삽입의 트레오닌은 트레오닌이 아니고 또 다른 아미노산이고, 적어도 특정 경우에 다른 아미노산은 시스테인 또는 프롤린이거나 이들이 아니다.
하나 이상의 아미노산이 수용체 내 사용하기 위해 서열번호 1에 삽입되는 구현예에서, 삽입은 서열번호 1의 임의의 2개의 아미노산 사이에서 일어날 수 있다. 특정 구현예에서, 삽입은 서열번호 1에서 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 또는 제24 번째 아미노산 이후에 위치한다.
본원에 기재된 예시적 작제물에 사용되는 돌연변이된 TM 서열의 예(Δ34.IL7RP2)는 다음과 같고, 여기서, 상기 서열은 밑줄친 서열의 첨가에 의해 돌연변이된다:
PILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLW (서열번호 2)
다른 항상성 활성 IL-7 수용체에서 돌연변이된 TM 서열
1. PILNPCLTISILSFFSVALLVILACVLW (서열번호 3)
2. PTCLTISILSFFSVALLVILACVLW (서열번호 4)
3. PSANCGAISILSFFSVALLVILACVLW (서열번호 5)
4. PILLVSCPTISILSFFSVALLVILACVLW (서열번호 6)
5. PILLIISIQWLSFFSVALLVILACVLW (서열번호 7)
6. NSPSCLTISILSFFSVALLVILACVLW (서열번호 8)
7. PCLEGLTISILSFFSVALLVILACVLW (서열번호 9)
8. PILLTISILSFFWNLLVILACVLW (서열번호 10)
9. RFCPHISILSFFSVALLVILACVLW (서열번호 11)
10. IKCILSFFSVALLVILACVLW (서열번호 12)
11. PIFHPFNCGPISILSFFSVALLVILACVLW (서열번호 13)
12. PILLMCPTISILSFFSVALLVILACVLW (서열번호 14)
13. PILLTISILSFFSGPSLALLVILACVLW (서열번호 15)
14. PILRLGCVTISILSFFSVALLVILACVLW (서열번호 16)
15. PIPQGGCILSFFSVALLVILACVLW (서열번호 17)
16. LQSCILSFFSVALLVILACVLW (서열번호 18)
17. PIFPHQHCTISILSFFSVALLVILACVLW (서열번호 19)
18. PILLTISKCHLSFFSVALLVILACVLW (서열번호 20)
19. PILLTCHLISILSFFSVALLVILACVLW (서열번호 21)
20. PIFSCGPLTISILSFFSVALLVILACVLW (서열번호 22)
21. PILLPPCLTISILSFFSVALLVILACVLW (서열번호 23)
22. PILLTPPVCSVTISILSFFSVALLVILACVLW (서열번호 24)
특이적 구현예에서, 하나 이상의 막관통 도메인 돌연변이는 이량체화된 알파 쇄 (예시적 IL-7Rα에 대해)를 구조적으로 변화시켜 이들 자체가 결합된 야누스 키나제가 현재 근접하게 있도록 배향되어 교차-인산화 및 활성화를 가능하게 하고 상기 구조적 변화는 특정 구현예에서 이량체화된 쇄의 트위스팅으로부터 유래한다. (Shochat et al., 2011; Durum, 2014).
특정 구현예에서, 막관통 도메인은 상응하는 야생형 성분과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 이를 수행하는데 있어서 야생형과 비교하여 특정 퍼센트 동일성을 갖는다. 특이적 경우에, 막관통 도메인은 상응하는 야생형 막관통 도메인과 적어도 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일하다
막관통 도메인은 임의의 적합한 길이일 수 있지만, 특정 구현예에서, 이는 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 아미노산 길이이다.
C. 내부도메인
항상성 활성 사이토킨 수용체는 하나 이상의 내부도메인을 포함한다. 일부 경우에, 내부도메인은 막관통 도에인과 동일한 분자로부터 유래하지만 다른 경우에는 그 경우가 아니다. 특정 구현예에서, 내부도메인은 면역조절 사이토킨 수용체를 포함하는 사이토킨 수용체로부터 유래한다. 특정 구현예에서, 사이토킨 수용체는 STAT5, STAT3, 등을 포함하는 신호 전달 경로에서 작용한다. 본원에 개시된 내용의 수용체를 위해 유용한 면역조절 사이토킨 내부도메인은 예를 들어, IL-7Rα 수용체 알파, CD122 (IL-2 및 IL-5의 통상적인 수용체 베타), IL-21 수용체 알파, IL-23 수용체 알파, 및 IL-12 수용체 알파, 및 IL-6 수용체를 포함한다.
일부 구현예에서, 내부도메인은 목적하는 다운스트림 경로를 기준으로 선택된다. 예를 들어, 내부도메인은 JAK1, STAT5, STAT4, JAK3, STAT3 등을 통해 전송될 신호의 목적을 기준으로 선택될 수 있다.
특정 경우에, 신호전달 경로는 STAT5를 포함한다. STAT5는 이 둘 다 면역치료요법과 관련하여 T-세포를 활성화시키는데 유용한 것으로 공지된 면역자극 사이토킨 IL-15 및 IL-7의 주요 다운스트림 신호 전달 노드이다. 여러 공보는 이미 사이토킨 및 사이토킨 수용체 상호작용을 우회하고 STAT5를 직접적으로 활성화시키면서 (항상성 활성 STAT5 돌연변이체를 사용하여), CD8 T-세포 기능이 생체내 증가된 지속성 및 임상전 모델을 사용한 생체내 증진된 항-종양효능을 통해 증진됨을 보여주었다. 동일한 개념은 IL-12의 다운스트림인 STAT4와 같은 다른 공지된 면역자극 사이토킨의 다운스트림의 STAT 단백질을 활성화시키는 것으로 연장될 수 있다.
특정 구현예에서, 내부도메인은 하나 이상의 돌연변이를 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 IL7 수용체 알파 쇄로부터 유래하는 내부도메인을 포함한다. 특정 경우에, 이것은 동종이량체화를 유발하거나 촉진시키는 것을 허용하는 돌연변이를 포함하는 막관통 도메인에 작동적으로 연결된다.
일부 구현예에서, 내부도메인은 특정 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, 내부도메인의 길이는 70-250개 아미노산, 70-225개 아미노산, 70-200개 아미노산, 70-175개 아미노산, 70-150개 아미노산, 70-125개 아미노산, 70-100개 아미노산, 80-250개 아미노산, 80-225개 아미노산, 80-200개 아미노산, 80-175개 아미노산, 80-150개 아미노산, 80-100개 아미노산, 90-250개 아미노산, 90-225개 아미노산, 90-200개 아미노산, 90-175개 아미노산, 90-150개 아미노산, 90-125개 아미노산, 90-100개 아미노산, 100-250개 아미노산, 100-225개 아미노산, 100-200개 아미노산, 100-175개 아미노산, 100-150개 아미노산, 100-125개 아미노산, 125-250개 아미노산, 125-225개 아미노산, 125-200개 아미노산, 125-175개 아미노산, 125-150개 아미노산, 150-250개 아미노산, 150-225개 아미노산, 150-200개 아미노산, 150-175 개 아미노산, 175-250개 아미노산, 175-225개 아미노산, 175-200개 아미노산, 200-250개 아미노산, 200-225개 아미노산 등이다. 특정 구현예에서, 특정 길이의 이들 단편은 신호전달 활성을 보유한다.
III. 가공된 사이토킨 수용체를 포함하는 세포
본원의 개시내용의 약제학적 조성물(들)은 가공된 수용체를 암호화하는 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 것과 같이, 항상성 활성 사이토킨 수용체를 발현하는 숙주 세포를 포함하는 것으로 추가로 고려된다. 숙주 세포는 수용체를 암호화하는 벡터를 도입함에 의해 제조될 수 있다. 숙주 세포에 도입된 가공된 수용체를 암호화하는 핵산 분자 또는 벡터는 숙주의 게놈에 통합될 수 있거나 이것은 염색체 외부에서 유지될 수 있다.
숙주 세포는 임의의 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있지만 특정 구현예에서 이것은 진핵 세포이다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 세균, 곤충, 진균류, 식물 또는 동물 세포이다. 특히 숙주 세포는 포유동물 세포, 보다 바람직하게 사람 세포 또는 사람 세포주일 수 있는 것으로 고려된다. 특히, 바람직한 숙주 세포는 T-세포, NK 세포 또는 NK T-세포와 같은 면역 세포를 포함한다.
하나의 구현예에서, 숙주 세포는 가공된 사이토킨 수용체를 포함하는 T-세포이다. 일부 경우에, 가공된 사이토킨 수용체를 발현하는 세포는 또한 가공된 T-세포 수용체와 같은, 또 다른 비-천연적으로 존재하는 분자를 발현한다. 천연적으로 존재하는 T-세포 수용체는 2개의 서브유닛, α-서브유닛 및 β-서브유닛을 포함하고, 이들 각각은 각각의 T-세포 게놈에서 재조합 반응에 의해 제조되는 고유 단백질이다. TCR 라이브러리는 특정 표적 항원에 대한 이들의 선택성에 대해 스크리닝될 수 있다. "가공된 TCR"은 선택되고, 클로닝되고/되거나 후속적으로 입양 면역치료요법을 위해 사용되는 T-세포 집단으로 도입되는 표적 항원에 대해 높은 결합가 (avidity) 및 반응성을 갖는 천연 TCR을 언급한다. 일부 경우에, 가공된 사이토킨 수용체를 발현하는 세포는 또한 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현한다. 가공된 TCR과는 대조적으로, CAR은 MHC 독립적 방식으로 표적 항원에 결합하도록 가공된다. 특정 구현예에서, CAR은 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어, scFv를 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포외 결합 도메인; 막관통 도메인; 하나 이상의 세포내 동시자극 신호전달 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
IV. 수용체를 발현하는 숙주 T-세포의 치료학적 용도
본원에서 상기 암을 갖는 개체에게 상기 암에 특이적인 CAR을 발현하는 유효량의 T-세포를 투여함을 포함하는, 암을 치료하는 방법이 제공되고, 여기서, 상기 CAR T-세포는 추가로 항상성 활성 사이토킨 수용체를 발현한다. 보다 특이적 구현예에서, 암은 예를 들어, 신경모세포종을 포함하는 고형 종양이다. 또 다른 특이적 구현예에서, CAR T-세포는 항원 GD2를 표적화한다. 보다 특이적 구현예에서, 상기 항상성 활성 사이토킨 수용체는 IL-7 수용체 알파로부터 유래된 막관통 도메인을 포함하고, 여기서, 상기 막관통 도메인은 사이토킨 수용체의 동종이량체를 촉진시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
특정 암의 치료 방법에서, 상기 세포는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 막관통 도메인을 갖는 사이토킨 수용체를 포함하는 T-세포이고, 특정 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호 1의 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 치료를 위한 T-세포 내 막관통 도메인은 서열번호 2 내지 서열번호 24 중 하나의 서열을 포함한다.
항상성 활성 사이토킨 수용체를 발현하는 유효량의 세포가 이를 필요로 하는 개체에 제공된다. 상기 개체는 특정 경우에 암을 가질 수 있지만 다른 경우에는 상기 개체는 비-암성 질환의 치료를 필요로 한다. 치료학적 유효량의 세포가 개체에 제공되고 1회 또는 다중 투여로 제공될 수 있다. 일부 경우에, 본원의 개시내용의 세포 치료요법은 동시에 제공되거나 제공되지 않을 수 있는 개체를 위한 하나 이상의 다른 유형의 치료요법에 추가로 개체에 제공된다.
예를 들어, 암에 민감하거나 암을 갖는 것으로 의심되는 암 환자들 또는 환자들은 본원에 기재된 바와 같이 치료될 수 있다. 본원에 기재된 변형된 면역 세포는 개체에게 투여될 수 있고 연장된 기간 동안 보유될 수 있다. 다양한 투여 경로 중 하나가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전학적으로 변형된 세포는 면역 인지를 저해하기 위해 캡슐화되고 예를 들어, 종양 부위에 국소적으로 투여된다.
다양한 구현예에서, 발현 작제물, 핵산 서열, 벡터, 숙주 세포 및/또는 이를 포함하는 약제학적 조성물은 종양성 질환과 같은 암성 질환의 예방, 치료 또는 개선을 위해 사용된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 내용의 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 특히 예를 들어, 고형 종양을 갖는 암을 포함하는, 암의 예방, 개선 및/또는 치료에 유용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료" 또는 "치료하는"은 증상 또는 질환의 병리학 또는 병리학적 병태에 대해 임의의 이롭거나 바람직할 수 있는 효과를 포함하고 치료받은 질환 또는 병태, 예를 들어, 암의 하나 이상의 측정가능한 마커에서의 최소 감소도 포함할 수 있다. 치료는 임의로 질환 또는 병태의 증상의 감소 또는 개선, 또는 질환 또는 병태의 진행 지연을 포함할 수 있다. "치료"는 필연적으로 질환 또는 병태, 또는 이의 관련된 증상의 완전한 퇴치 또는 치유를 지적하는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같은 "예방한다" 및 유사 용어, 예를 들어, "예방된", "예방하는" 등은 질환 또는 병태, 예를 들어, 암의 발생 또는 재발 가능성을 예방하거나, 저해하거나 감소시키기 위한 접근법을 지적한다. 이것은 또한 질환 또는 병태의 발병 또는 재발을 지연시키거나 질환 또는 병태의 증상의 발생 또는 재발을 지연시키는 것을 언급한다. 본원에 사용된 바와 같은 "예방" 및 유사 용어는 또한 질환 또는 병태의 발병 또는 재발 전에 질환 또는 병태의 강도, 효과, 증상 및/또는 크기를 감소시키는 것을 포함한다.
본원에 기재된 방법 및 조성물은 이에 제한되지 않지만 αβ T-세포, γδ T-세포, NK 세포, NK T-세포, 점막 관련 불변 T-세포(MAIT T-세포), 선천성 림프구 세포 또는 이의 혼합물과 같은 광범위한 면역 세포에 적용될 수 있다. 추가로, 본 발명의 수용체는 후속적으로 상기 언급된 면역 세포로 분화되는 줄기 및/또는 선조체 세포에서 발현될 수 있다. 추가로, 모든 상기 언급된 면역 세포는 이에 제한되지 않지만 키메라 항원 수용체(CAR), 이특이적 T-세포 인게이져(engager)(BiTE 또는 T-세포 ENG), 이원-친화성 재-표적화 (DART) 단백질, 또는 αβ T-세포 수용체와 같은 2차 유전학적 변형으로 종양 세포에 재지시될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 상기 정의된 바와 같이 CAR-발현 면역 세포, 또는 종양을 표적화하는 항원 특이적 면역 세포 (예를 들어, 바이러스 특이적 T-세포 또는 종양 항원 특이적 T-세포)이다. 항상성 활성 사이토킨 수용체-발현 세포가 또한 CAR을 발현하는 예에서, CAR은 임의의 종양 항원, 예를 들어, EphA2, EphA3, HER2 (ERBB2), GD2, Glypican-3, 5T4, 8H9, αvβ6 인테그린, B 세포 성숙화 항원(BCMA) B7-H3, B7-H6, CAIX, CA9, CD19, CD20, CD22, 카파 경쇄, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD96, CD123, CD138, CD171, CEA, CLL-1, CSPG4, EGFR, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, ERBB3, ERBB4, ErbB3/4, FAP, FAR, FBP, 태아 AchR, 폴레이트 수용체 α, GD2, GD3, HLA-AI MAGE A1, HLA-A2, IL13Ra2, KDR, 람다, 루이스-Y, MCSP, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSC1, ROR1, Sp17, TAG72, TEM8, Tn-O-글리코펩타이드, VEGRR2, 암배아 항원, HMW-MAA, VEGF 수용체, TSHR, CS-1, CMA, Tn Ag, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), FLT3, CD44v6, KIT, 인터류킨-11 수용체 a (IL-11Ra), PRSS21, VEGFR2, CD24, 혈소판-유래된 성장 인자 수용체-베타 (PDGFR-베타), SSEA-4, ERBB2 (Her2/neu), 프로스타제, PAP, ELF2M, Ephrin B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gplOO, bcr-abl, 티로시나제, EphA2, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, o-아세틸-GD2, 폴레이트 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61 , CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, GloboH, NY-BR-1 , UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, LAGE-la, MAGE-Al, 레구마인(legumain), HPV E6,E7, MAGE Al, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1 , MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1 , p53, p53 돌연변이체, 프로스테인, 수르비빈 및 텔로머라제, PCTA-l/갈렉틴 8, 멜란A/MARTl, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전좌 중지점, ML-IAP, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린(Cyclin) Bl, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B 1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 사람 텔로머라제 역전사효소, RUl, RU2, 장 카복실 에스테라제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1 , FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, 및 lGLLl 및/또는 종양의 세포외 매트릭스 내에 존재하는 다른 예시적 항원, 예를 들어, 피브로넥틴의 발암태아 변이체, 테나신, 또는 종양의 괴사 영역 및 다른 종양 관련 항원 또는 예를 들어, 종양의 게놈 분석 및 또는 차등 발현 연구를 통해 동정된 종양 및 다른 종양 관련 항원 또는 작동가능한 돌연변이의 괴사 영역으로 지시될 수 있다.
또한 본원에서 (1) 상기 종양 항원을 표적화하는 키메라 항원 수용체; 및 (2) 항상성-활성 사이토킨 수용체를 발현하는 면역 세포를 개체에게 투여함을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법이 제공되고, 여기서, 상기 암은 종양 항원을 발현한다. 항상성-활성 사이토킨 수용체는 본원에 포함된 임의의 항상성-활성 사이토킨 수용체일 수 있다. 특정 구현예에서, 항상성-활성 사이토킨 수용체는 사이토킨 수용체의 동종이량체화를 촉진시켜 사이토킨 수용체가 항상성 활성이도록 하는, 인터류킨-7 (IL-7) 수용체 내부도메인 및 막관통 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 항상성-활성 사이토킨 수용체는 사이토킨 수용체의 동종이량체화를 촉진시켜 사이토킨 수용체가 항상성 활성이도록 하는, 인터류킨-21 (IL-21) 수용체 내부도메인 및 막관통 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 항상성-활성 사이토킨 수용체는 사이토킨 수용체의 동종이량체화를 촉진시켜 사이토킨 수용체가 항상성 활성이도록 하는, 인터류킨-23 (IL-23) 수용체 내부도메인 및 막관통 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 항상성-활성 사이토킨 수용체는 사이토킨 수용체의 동종이량체화를 촉진시켜 사이토킨 수용체가 항상성 활성이도록 하는, 인터류킨-12 (IL-12) 수용체 내부도메인 및 막관통 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호 1 내지 24의 임의의 서열을 포함한다. 이전 개시내용의 임의의 특정 구현예에서, 항상성-활성 사이토킨 수용체는 동족체 사이토킨이 세포외 도메인에 결합하는 경우 신호를 전송하지 않는 세포외 도메인을 포함한다. 예를 들어, 보다 구체적 구현예에서, 항상성-활성사이토킨 수용체는 IL-7 수용체 내부도메인을 포함하고 동족체 사이토킨은 IL-7이다. 이전 개시내용의 임의의 특정 구현예에서, 항상성 활성 사이토킨 수용체는 CD34로부터의 세포외 도메인인 세포외 도메인을 포함한다. 이전 개시내용의 임의의 또 다른 특정 구현예에서, 항상성 활성 사이토킨 수용체는 PD-1 또는 B7로부터의 세포외 도메인인 세포외 도메인을 포함한다.
본원에 제공된 임의의 치료 방법의 특정 구현예에서, 암은 신경모세포종이다. 본원에 제공된 방법의 특정 구체적 구현예에서, 암은 유방암, 전립선암, 폐암(예를 들어, 소세포 폐암 또는 비-소세포 폐암), 뇌암, 결장암, 두경부암, 피부암 (예를 들어, 흑색종), 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 소장암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 식도암, 침샘암 또는 갑상선암이다.
본원에 제공된 임의의 방법의 특정 구현예에서, 종양 항원은 GD2이다. 본원에 제공된 임의의 방법의 또 다른 특정 구현예에서, 종양 항원은 EphA2이다. 본원에 제공된 방법의 다른 특정 구현예에서, 종양 항원은 EphA3, HER2 (ERBB2), GD2, Glypican-3, 5T4, 8H9, αvβ6 인테그린, B 세포 성숙화 항원 (BCMA) B7-H3, B7-H6, CAIX, CA9, CD19, CD20, CD22, 카파 경쇄, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD96, CD123, CD138, CD171, CEA, CLL-1, CSPG4, EGFR, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, ERBB3, ERBB4, ErbB3/4, FAP, FAR, FBP, 태아 AchR, 폴레이트 수용체 α, GD2, GD3, HLA-AI MAGE A1, HLA-A2, IL13Ra2, KDR, 람다, 루이스-Y, MCSP, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSC1, ROR1, Sp17, TAG72, TEM8, Tn-O-글리코펩타이드, VEGFR2, 암배아 항원, HMW-MAA, VEGF 수용체, TSHR, CS-1, CMA, Tn Ag, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), FLT3, CD44v6, KIT, 인터류킨-11 수용체 a (IL-11Ra), PRSS21, VEGFR2, CD24, 혈소판-유래된 성장 인자 수용체-베타 (PDGFR-베타), SSEA-4, ERBB2 (Her2/neu), 프로스타제, PAP, ELF2M, Ephrin B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gplOO, bcr-abl, 티로시나제, EphA2, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, o-아세틸-GD2, 폴레이트 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61 , CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, GloboH, NY-BR-1 , UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, LAGE-la, MAGE-Al, 레구마인, HPV E6,E7, MAGE Al, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원1, p53, p53 돌연변이체, 프로스테인, 수르비빈 및 텔로머라제, PCTA-l/갈렉틴 8, 멜란A/MARTl, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전좌 중지점, ML-IAP, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 B l, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B 1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 사람 텔로머라제 역전사 효소, RUl, RU2, 장 카복실 에스테라제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, 또는 lGLL1이다.
일부 구현예에서, 항상성 활성 사이토킨 수용체-발현 세포는 감염성 질환, 자가면역 질환 및 고형 기관 및 줄기 세포 이식 후 동안 합병증을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 림프구 치료요법이 치료제인 또 다른 질환을 포함하는, 암 이외의 다른 의학적 병태에 대해 개체에게 제공된다. 상기 경우에, T-세포는 증진된 확장을 갖는 것이 요구되고, 따라서, 항상성 활성 사이토킨 수용체 분자는 암 징후에 대한 것들과 동일하거나 유사하지만, 상기 세포는 비-악성 종양 징후를 표적화하기 위해 특이적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 개체가 자가면역 질환을 갖는 구현예에서, 상기 세포는 예를 들어, 항원으로서 자가반응성 T-세포를 사용하여 (OPEXA 치료제에서와 같이; The Woodlands, TX) 이들의 TCR을 통한 자가반응성 T-세포에 광범위하게 특이적일 수 있다.
특정 구현예에서, 본원의 개시내용은 부분적으로, 단독으로 또는 또 다른 치료요법과 조합하여 투여될 수 있고, 적어도 일부 양상에서 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 투여될 수 있는 발현 작제물, 핵산 분자 및/또는 벡터를 함유하는 세포를 고려한다. 특정 구현예에서, 세포에 투여하기 전, 상기 핵산 분자 또는 벡터는 세포 게놈에 안정적으로 통합될 수 있다. 특이적 구현예에서, 특정 세포 또는 조직에 특이적이고 상기 세포에서 지속하는 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 담체 및 부형제는 당업계에 널리 공지되어 있다. 개시내용에 따라 제조된 조성물은 상기 동정된 질환의 예방 또는 치료 또는 지연을 위해 사용될 수 있다.
추가로, 본원의 개시내용은 본원에서 고려되고/되거나 본원에서 고려된 공정에 의해 제조되는, 항상성 활성 사이토킨 수용체, 이들을 암호화하는 핵산서열, 이들을 암호화하는 벡터(들)을 함유하는 유효량의 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암성 (종양을 포함하는) 질환의 예방, 치료 또는 개선 방법에 관한 것이다.
예시적 변형된 면역 세포의 조성물(들)의 투여를 위한 가능한 징후는 유방암, 폐암, 뇌암, 결장암, 두경부암, 피부암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 신장암, 폐암, 위암, 소장암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 식도암, 침샘암 및 갑상선암, 및 T-세포, B-세포, NK-세포 및 골수세포 또는 이들의 전구체의 혈액학적 악성 종양을 포함하는 종양 질환을 포함하는 암성 질환이다. 세포의 조성물(들)의 투여를 위한 예시적 징후는 수용체-발현 세포가 예를 들어 표적화되는 항원을 발현하는 세포를 갖는 임의의 악성 종양을 포함하는 암성 질환이다. 추가로, 비정상적으로 다른 종양항원을 발현하는 악성 종양을 포함하고 이들이 또한 표적화될 수 있다. 본원의 개시내용의 조성물(들)의 투여는 예를 들어, 소형 잔류 질환, 조기 암, 진행된 암 및/또는 전이성 암 및/또는 난치성 암을 포함하는, 암의 모든 단계 및 유형을 위해 유용하다.
본원의 개시내용은 추가로 다른 화합물, 예를 들어, 이특이적 항체 작제물, 표적화된 독소 또는 면역 세포를 통해 작용하는 다른 화합물과의 동시-투여 프로토콜을 포함한다. 본 발명의 화합물(들)의 동시-투여를 위한 임상 용법은 다른 성분의 투여와 동시에, 투여 전 및/또는 투여 후의 동시-투여를 포함할 수 있다. 특정 조합 치료요법은 화학치료요법, 방사선, 수술, 호르몬 치료요법, 또는 다른 유형의 면역치료요법을 포함한다.
구현예는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 면역 세포, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 서열, 본원에 기재된 바와 같은 벡터 및/또는 본원에 기재된 숙주를 포함하는 키트에 관한 것이다. 또한 본원 개시내용의 키트는 단독으로 또는 의학적 치료 또는 중재를 필요로 하는 개체에게 투여될 추가의 약물과 함께 상기 본원에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 포함한다.
작제물(들)로 변형된 면역 세포 (T-세포 또는 NK 세포와 같은)는 이어서 선택 조건하에 (단지 일부 경우에) 배양물에서 성장시킬 있고 작제물을 갖는 것으로서 선택되는 세포는 이어서 확장되고 추가로 예를 들어, 숙주 세포에서 작제물(들)의 존재를 결정하기 위해 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 분석될 수 있다. 일단 변형된 숙주 세포가 동정되면, 이들은 이어서 계획된 바와 같이 사용될 수 있고, 예를 들어, 배양에서 확장되거나 숙주 유기체에 도입될 수 있다.
세포의 성질에 의존하여, 세포는 다양한 방식으로, 숙주 유기체, 예를 들어, 포유동물로 도입될 수 있다. 상기 세포는 특정 구현예에서 종양 부위에 도입될 수 있지만, 대안적 구현예에서 상기 세포는 암 세포로 호밍되거나 암에 호밍되도록 변형된다. 사용되는 세포의 수는 다수의 상황, 도입 목적, 세포의 생활주기, 사용되는 프로토콜, 예를 들어, 투여 수, 세포가 증식하는 능력, 재조합 작제물의 안정성 등에 의존한다. 세포는 일반적으로 목적하는 부위에 또는 이의 부근에 주사되는 분산액으로서 적용될 수 있거나 정맥내로 전달될 수 있다. 세포는 생리학적으로 허용되는 배지에 존재할 수 있다.
투여 경로는 예를 들어, 정맥내, 피하, 복막내, 근육내, 국소 또는 종양내 투여를 포함한다. 일부 경우에, 특정 용량의 세포는 예를 들어 총 104 내지 1011와 같은 세포가 개체에 제공된다. 특정 구현예에서, 1x105세포/kg 내지 1x109세포/kg의 용량이 사용될 수 있다. 특정 용량은 1x106 세포/mL 내지 1x108 세포/mL을 포함한다.
벡터 도입은 모든 경우에 통합을 유도할 필요는 없다. 일부 상황에서, 도입된 DNA의 일시적 유지면 충분할 수 있다. 상기 방식으로는 단기 효과를 가질 수 있고, 여기서, 세포는 숙주에 도입될 수 있고 이어서 미리 결정된 시간 후에, 예를 들어, 세포가 특정 부위로 호밍될 수 있도록 된 후 가동될 수 있다.
상기 시스템은 시간 및 상황에 따라 다양할 수 있는, 발현 효율, 발현 생성물의 활성, 환자의 특정 요구 사항, 세포 손실율 또는 개별 세포의 발현 활성의 상실율 등과 같은 변수에 적용될 수 있음을 인지해야만 한다. 따라서, 각각의 개별 환자에 대해, 각각의 환자는 개체에 대해 적당한 용량을 위해 모니터링되고 환자를 모니터링하는 상기 관행은 당업계에 통상적인 것으로 예상된다.
I. 일반 벡터
본원의 개시내용의 벡터는 항상성 활성 사이토킨 수용체를 생성하고 적어도 일부 경우에 발현시키기 위해 재조합 가공을 위해 사용될 수 있다.
용어 "벡터"는 핵산 서열이 이것이 복제될 수 있는 세포로 도입하기 위해 삽입될 수 있는 캐리어 핵산 분자를 언급하기 위해 사용된다. 핵산 서열은 "외인성"일 수 있고, 이는 벡터가 도입되는 세포에 외래성이거나 서열이 세포 내 서열과 상동성이지만 서열이 본래에 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내의 위치에서는 상동성이 아님을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 코스미드, 트랜스포존, 바이러스 (박테리오파아지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및 인공 염색체 (예를 들어, YAC)를 포함한다. 당업자는 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 작제하도록 잘 구비될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Maniatis et al., 1988 and Ausubel et al., 1994, 이 둘다는 참조로 본원에 인용됨).
용어 "발현 벡터"는 전사될 수 있는 RNA를 암호화하는 핵산을 포함하는 임의의 유형의 유전학적 작제물을 언급한다. 일부 경우에, RNA 분자는 이어서 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드로 해독된다. 다른 경우에, 이들 서열은 예를 들어, 안티센스 분자 또는 리보자임의 제조에서 해독되지 않는다. 발현 벡터는 다양한 "조절 서열"을 함유할 수 있고, 상기 조절 서열은 특정 숙주 세포에서 작동적으로 연결된 암호화 서열의 전사 및 가능한 해독을 위해 필요한 핵산 서열을 언급한다. 전사 및 해독을 지배하는 조절 서열에 추가로, 벡터 및 발현 벡터는 또한 다른 기능에 작용하고 상기된 핵산 서열을 함유할 수 있다.
"프로모터"는 전사 개시 및 전사율이 조절되는 핵산 서열 영역인 조절 서열이다. 이것은 RNA 폴리머라제 및 다른 전사 인자와 같은, 조절 단백질 및 분자가 결합하여 핵산 서열의 특이적 전사를 개시하는 유전학적 요소들을 함유할 수 있다. 용어 "작동적으로 위치된", "작동적으로 결합된", "조절하에", 및 "전사 조절하에"는 프로모터가 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 조절하기 위해 핵산 서열과 관련하여 올바른 기능적 위치 및/또는 배향으로 있음을 의미한다.
프로모터는 일반적으로 RNA 합성을 위한 개시 부위가 위치하도록 기능하는 서열을 포함한다. 이의 가장 잘 알려진 예는 TATA 박스이지만 예를 들어, 포유동물 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 유전자에 대한 프로모터 및 SV40 레이트 유전자에 대한 프로모터와 같은 TATA 박스가 없는 일부 프로모터에서, 개시 부위 자체 위에 놓인 별개의 요소가 개시 위치를 고정시키는데 일조한다. 추가의 프로모터 요소는 전사 개시 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 개시 부위의 30 내지 110 bp 업스트림의 영역에 위치하지만 다수의 프로모터는 또한 개시 부위의 다운스트림에 기능성 요소를 함유하는 것으로 나타났다. 암호화 서열이 프로모터의 "조절 하에" 있도록 하기 위해, 전사 판독 프레임의 전사 개시 부위의 5’ 말단을 선택된 프로모터의 "다운스트림" (즉, 이의 3’)에 위치시킨다. "업스트림" 프로모터는 DNA의 전사를 자극하고 암호화된 RNA의 발현을 촉진시킨다.
프로모터 요소 사이의 공간은 흔히 유동적이어서 프로모터 기능은 요소들이 역위되거나 서로 상대적으로 이동하는 경우 보존된다. 프로모터에 의존하여, 개별 요소들은 협력적으로 또는 독립적으로 기능하여 전사를 활성화시킬 수 있는 것으로 나타난다. 프로모터는 핵산 서열의 전사 활성화에 관여하는 시스-작용 조절서열을 언급하는 "인핸서"와 연계하여 사용될 수 있거나 사용되지 않을 수 있다.
프로모터는 암호화 분절 및/또는 엑손의 업스트림에 위치한 5’-비-암호화 서열을 단리시킴에 의해 수득될 수 있는 바와 같이, 핵산 서열과 천연적으로 연합된 것일 수 있다. 상기 프로모터는 "내인성"으로서 언급될 수 있다. 유사하게, 인핸서는 핵산 서열과 천연적으로 연합된 것일 수 있고 상기 서열의 다운스트림 또는 업스트림에 위치한다. 대안적으로, 특정 이점은 이의 천연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 연합되어 있지 않은 프로모터를 언급하는, 재조합 또는 이종성 프로모터의 조절하에 있도록 암호화 핵산 분절을 위치시킴에 의해 획득될 수 있다. 재조합 또는 이종성 인핸서는 또한 이의 천연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 연합되어 있지 않은 인핸서를 언급한다. 상기 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 및 임의의 다른 바이러스, 원핵 세포 또는 진핵 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서, 및 "천연적으로 존재"하지 않는, 즉 상이한 전사 조절 영역 및/또는 발현을 변형시키는 돌연변이를 함유하는 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다.
천연적으로, 발현을 위해 선택된 기관, 세포 유형, 조직, 기관 또는 유기체에서 DNA 분절의 발현을 효과적으로 지시히는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것이 중요하다. 분자 생물학 분야의 당업자는 일반적으로 프로모터, 인핸서 및 단백질 발현을 위한 세포 유형의 조합을 알고 있다(문헌참조: 예를 들어 Sambrook et al. 1989, 본원에 참조로 인용됨). 사용되는 프로모터는 항상성, 조직-특이적, 유도성일 수 있고/있거나, 재조합 단백질 및/또는 펩타이드의 대량 생산에서의 이점과 같은, 도입된 DNA 분절의 고수준의 발현을 지시하기 위한 적당한 조건하에서 유용할 수 있다. 프로모터는 이종성 또는 내인성일 수 있다.
조직-특이적 프로모터 또는 요소들의 정체, 및 이들의 활성을 특징 분석하기 위한 검정은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 특이적 구현예에서, 저산소증-특이적 조절 요소들과 같은 환경-특이적 프로모터 또는 요소들이 사용된다. 조직-특이적, 혈통-특이적, 및/또는 활성화-특이적 프로모터가 사용될 수 있고, 이의 예는 활성화된 T-세포 요소들, NFAT (혈통-제한된 활성화), 조기 성장 반응 유전자(활성화), 간 X 수용체 반응 요소들(활성화), 저산소증 반응 요소들 (환경) 등을 포함한다.
벡터는 다중 클로닝 부위 (MCS)를 포함할 수 있고 상기 부위는 다중 제한 효소 부위를 함유하는 핵산 영역이고, 이중 어느 하나가 벡터를 분해하기 위한 표준 재조합 기술과 연계하여 사용될 수 있다. "제한 효소 분해"는 핵산 분자 내 특이적 위치에서만 기능하는 효소를 사용한 핵산 분자의 촉매적 절단을 언급한다. 많은 이들 제한 효소는 시판되고 있다. 상기 효소의 용도는 당업자에 의해 광범위하게 이해되고 있다. 흔히, 벡터는 MCS 내를 절단하여 외인성 서열이 벡터에 연결될 수 있도록 하는 제한 효소를 사용하여 선형화되거나 단편화된다. "연결"은 서로 연속하거나 연속하지 않을 수 있는, 2개 핵산 단편 사이의 포스포디에스테르 결합을 형성하는 공정을 언급한다. 제한 효소 및 연결 반응을 포함하는 기술은 재조합 기술 분야에서 당업자에게 널리 공지되어 있다.
스플라이싱 부위, 종결 신호, 복제 오리진 및 선택가능한 마커가 또한 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 플라스미드 벡터는 숙주 세포를 형질전시키는데 사용하기 위해 고려된다. 일반적으로, 숙주 세포와 양립할 수 있는 종으로부터 유래하는 레플리콘 및 조절 서열을 함유하는 플라스미드 벡터는 이들 숙주와 연계하여 사용된다. 벡터는 통상적으로 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 마킹 서열 및 복제 부위를 함유한다.
추가로, 숙주 미생물과 양립할 수 있는 레플리콘 및 조절 서열을 함유하는 파아지 벡터는 이들 숙주와 연계하여 형질전환 벡터로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 파아지 람다 GEMTM 11은 예를 들어, 이. 콜라이 LE392와 같은 숙주 세포를 형질전환시키기 위해 사용될 수 있는 재조합 파아지 벡터를 제조하는데 사용될 수 있다.
발현 벡터를 포함하는 세균 숙주 세포, 예를 들어, 이. 콜라이는 임의의 다수의 적합한 배지, 예를 들어, LB에서 성장시킨다. 특정 벡터에서 재조합 단백질의 발현은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 숙주 세포를 특정 프로모터에 특이적인 제제와 접촉시킴에 의해, 예를 들어, IPTG를 배지에 첨가하거나, 항온처리를 보다 높은 온도로 전환시킴에 의해 유도될 수 있다.
A. 바이러스 벡터
특정 바이러스가 수용체 매개된 세포내이입을 통해 세포를 감염시키거나 세포에 진입하고 숙주 세포 게놈내로 통합하고 바이러스 유전자를 안정하게 그리고 효율적으로 발현시키는 능력은 이들이 외래 핵산을 세포 (예를 들어, 포유동물 세포)에 전달하기 위해 매력적인 후보가 되게 하였다. 본원의 개시내용의 성분들은 헤파라나제를 암호화하는 바이러스 벡터일 수 있다. 본원의 개시내용의 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있는 바이러스 벡터의 비제한적인 예는 하기에 기재되어 있다.
1. 아데노바이러스 벡터
핵산의 전달을 위한 특정 방법은 아데노바이러스 발현 벡터의 사용을 포함한다. 아데노바이러스 벡터가 게놈 DNA로의 통합에 대해 낮은 능력을 갖고 있는 것으로 공지되어 있지만, 상기 특성은 이들 벡터에 의해 부여되는 고효율의 유전자 전달에 의해 상쇄된다. "아데노바이러스 발현 벡터"는 (a) 작제물의 팩키징을 지원하고 (b) 궁극적으로 거기에 클로닝되는 조직 또는 세포 특이적 작제물을 발현하기에 충분한 아데노바이러스 서열을 함유하는 작제물들을 포함하는 것으로 의미된다. 유전학적 구성 또는 36kb, 선형, 이중가닥 DNA 바이러스인 아데노바이러스의 지식은 대형 조각의 아데노바이러스 DNA의 7kb 이하의 외래 서열로의 치환을 가능하게 한다(문헌참조: Grunhaus and Horwitz, 1992).
2. AAV 벡터
핵산은 아데노바이러스 원조 형질감염을 사용하여 세포에 도입될 수 있다. 증가된 형질감염 효율은 아데노바이러스 커플링된 시스템을 사용한 세포 시스템에서 보고되었다(문헌참조: Kelleher and Vos, 1994; Cotten et al., 1992; Curiel, 1994). 아데노 관련 바이러스 (AAV)는 이것이 고빈도의 통합을 갖고 비분열 세포를 감염시킬 수 있음에 따라서 이것이 예를 들어, 조직 배양 (Muzyczka, 1992) 또는 생체내에서 포유동물 세포로의 유전자 전달에 유용하게 하기 때문에 본원의 개시내용의 세포에 사용하기 위해 매력적인 벡터 시스템이다. AAV는 광범위 숙죽 범위의 감염성을 갖는다(문헌참조: Tratschin et al., 1984; Laughlin et al., 1986; Lebkowski et al., 1988; McLaughlin et al., 1988). rAAV 벡터의 생성 및 용도에 관한 세부 사항은 각각 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 제5,139,941호 및 제4,797,368호에 기재되어 있다.
1. 레트로바이러스 벡터
레트로바이러스는 이들의 유전자를 숙주 게놈에 통합하고, 대량의 외래 유전학적 물질을 전달하고, 광범위한 종 및 세포 유형을 감염시키고, 특수한 세포주에 팩키징하는 이들의 능력 때문에 전달 벡터로서 유용하다(문헌참조: Miller, 1992).
헤파라나제 레트로바이러스 벡터를 작제하기 위해, 핵산 (예를 들어, 헤파라나제 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산)은 특정 바이러스 서열의 위치에서 바이러스 게놈으로 삽입되어 복제 결함인 바이러스를 생성한다. 비리온을 생산하기 위해, gag, pol, 및 env 유전자를 함유하지만 LTR 및 팩키징 성분들이 없는 팩키징 세포주가 작제되었다(문헌참조: Mann et al., 1983). 레트로바이러스 LTR 및 팩키징 서열과 함께 cDNA를 함유하는 재조합 플라스미드가 특수 세포주로 도입되는 경우 (예를 들어, 인산칼슘 침전에 의해), 팩키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체가 바이러스 입자에 팩키징되도록 하고 이어서 상기 바이러스 입자는 배양 배지로 분비된다(문헌참조: Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지는 이어서 수거되고, 임의로 농축되고 유전자 전달을 위해 사용된다. 레트로바이러스 벡터는 광범위한 다양한 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 그러나, 통합 및 안정한 발현은 숙주 세포의 분열을 요구한다(문헌참조: Paskind et al., 1975).
렌티바이러스는 복합 레트로바이러스이고, 이는 통상의 레트로바이러스 유전자 gag, pol, 및 env에 추가로, 조절 또는 구조적 기능을 갖는 다른 유전자를 함유한다. 렌티바이러스 벡터는 당업계에 널리 공지되어 있다(문헌참조: 예를 들어, Naldini et al., 1996; Zufferey et al., 1997; Blomer et al., 1997; 미국 특허 제6,013,516호 및 제5,994,136호). 렌티바이러스의 일부 예는 사람 면역결핍 바이러스: HIV-1, HIV-2 및 시미안 면역결핍 바이러스: SIV를 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 다중으로 HIV 독성 유전자를 약독화시킴에 의해 제조되었고, 예를 들어, 유전자 env, vif, vpr, vpu 및 nef를 결실시켜 벡터가 생물학적으로 안전하도록 한다.
재조합 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있고 핵산 서열의 생체내 및 생체외 유전자 전달 및 발현 둘 다를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 적합한 숙주 세포가 팩키징 기능을 갖는, 즉, rev 및 tat 뿐만 아니라 gag, pol 및 env를 갖는 2개 이상의 벡터로 형질감염된 비-분열 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스는 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 제5,994,136호에 기재되어 있다. 특정 세포 유형의 수용체를 표적화하기 위한 항체 또는 특정 리간드를 사용하여 외피 단백질에 결합시킴에 의해 재조합 바이러스를 표적화할 수 있다. 예를 들어, 목적하는 서열 (조절 영역을 포함하는)을 특정 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드를 암호화하는 또 다른 유전자와 함께 바이러스 벡터에 삽입함에 의해, 벡터는 표적-특이성이 된다.
2. 다른 바이러스 벡터
다른 바이러스 벡터는 본원의 개시내용에서 백신 작제물로서 사용될 수 있다. 백시니아 바이러스(문헌참조: Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988), 신드비스 바이러스, 사이토메갈로바이러스 및 헤르페스 심플렉스 바이러스와 같은 바이러스로부터 유래된 벡터가 사용될 수 있다. 이들은 다양한 포유동물 세포에 대해 수개의 매력적인 특성을 부여한다(문헌참조: Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).
A. 벡터 전달 및 세포 형질전환
세포의 형질감염 또는 형질전환을 위한 핵산 전달을 위해 적합한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 상기 방법은 예를 들어, 생체외 형질감염에 의한, 주사에 의한 것 등과 같은 DNA의 직접적인 전달을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 당업계에 공지된 기술의 적용을 통해 세포는 안정하게 또는 일시적으로 형질전환될 수 있다.
B. 생체외 형질전환
생체외 세팅에서 유기체로부터 제거된 진핵 세포 및 조직을 형질감염시키기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 따라서, 이것은 세포 또는 조직이 헤파라나제 또는 본원의 개시내용의 다른 핵산을 사용한 생체외 제거될 수 있고 형질감염될 수 있다. 특정 양상에서, 형질감염된 세포 또는 조직은 유기체에 위치시킬 수 있다. 바람직한 측면에서, 핵산은 형질감염된 세포에서 발현된다.
I. 조합 치료요법
개시내용의 특정 구현예에서, 임상적 양상에 대한 본원의 개시내용의 방법, 예를 들어, 항상성 활성 사이토킨 수용체-발현 세포, 예를 들어, 면역 세포, 예를 들어, 항상성 활성 사이토킨 수용체를 발현하는 T-세포를 갖는 개체로의 투여는 개체에 대한 의학적 병태 (예를 들어, 과증식성 질환, 항암제를 포함함)의 치료에 효과적인 하나 이상의 다른 제제와 조합될 수 있다. "항암"제는 예를 들어, 암 세포에서 아폽토시스를 포함하는 암 세포를 사멸시킴에 의해, 암 세포의 성장 속도를 감소시킴에 의해, 전이의 발생 정도 또는 수를 감소시킴에 의해, 종양 크기를 감소시킴에 의해, 종양 성장을 저해함에 의해, 종양 또는 암 세포로의 혈액 공급을 감소시킴에 의해, 암 세포 또는 종양에 대한 면역 반응을 촉진시킴에 의해 또는 암의 진행을 예방하거나 저해시킴에 의해 또는 암을 갖는 대상체의 수명을 증가시킴에 의해 대상체에서 암에 음성적인 영향을 미칠 수 있다. 보다 일반적으로, 이들 다른 조성물은 세포를 사멸시키거나 세포의 증식을 저해하기 위한 조합된 유효량으로 제공된다. 상기 공정은 암 세포를 발현 작제물 및 제제(들) 또는 다중 인자(들)과 동시에 접촉시킴을 포함할 수 있다. 이것은 세포를 단일 조성물 또는 2개의 제제를 포함하는 약리학적 제형과 접촉시킴에 의해 또는 세포를 2개의 별도의 조성물 또는 제형과 동시에 접촉시킴에 의해 성취될 수 있고, 여기서, 하나의 조성물은 발현 작제물을 포함하고 다른 하나는 제2 제제(들)를 포함한다.
암을 앓는 개체가 조합 치료요법을 필요로 하는 본원의 개시내용의 구현예에서, 하기 중 하나 이상은 개시내용의 치료학적 세포에 추가로 개체에 제공된다: 화학치료요법 또는 다른 약물, 패턴-관련 분자 패턴 (PAMP), 예를 들어, 톨형 수용체 (TLR) 리간드, 면역치료요법, 방사선, 수술, 호르몬 치료요법 및 이의 조합. 면역치료요법이 개체에게 제공되는 경우에, 면역치료요법은 항상성 활성 사이토킨 수용체-발현 세포의 일부일 수 있거나 일부가 아닐 수 있다. 일부 경우에, 항상성 활성 사이토킨 수용체-발현 세포는 이들 자체가 종양 항원 또는 바이러스 항원에 결합하는 것과 같은 개체에 대한 치료요법을 제공하는 다른 수용체 또는 분자를 포함한다.
화학치료요법 및 방사선치료요법 제제에 대한 종양 세포 내성은 임상 암학에서 주요 문제점을 제공한다. 현재 암 연구의 한가지 목표는 다른 치료요법과 조합함에 의해 화학- 및 방사선치료요법의 효능을 개선시키기 위한 방법을 모색하는 것이다. 본원의 개시내용과 관련하여, 세포 치료요법은 유사하게 다른 아폽토시스 촉진 또는 세포 사이클 조절제에 추가로 화학치료제, 방사선치료제 또는 면역치료제 중재와 연계하여 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
본원의 개시내용의 방법 및 조성물은 수분 내지 수주의 간격으로 하나 이상의 다른 제제 치료에 선행하거나 후속될 수 있다. 다른 제제와 본원의 개시내용의 제제가 별도로 개체에게 적용되는 구현예에서, 일반적으로 상당한 시기가 각각의 전달 시간 사이에서 만료되지 않아 제제 및 본 발명의 치료요법이 여전히 세포에 대해 유리하게 조합된 효과를 발휘할 수 있도록 보장한다. 상기 경우에, 세포를 서로 약 12 내지 24시간 내에 및 보다 바람직하게 서로 약 6 내지 12시간 내에 2개의 양상과 접촉시킬 수 있는 것이 고려된다. 일부 상황에서, 치료 시기를 상당히 연장시키는 것이 바람직할 수 있지만 수일 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)가 각각의 투여 사이에 소요된다.
치료 사이클이 필요한 만큼 반복될 것으로 예상된다. 또한, 수술적 중재 뿐만 아니라 다양한 표준 치료요법이 본 발명의 세포 치료요법과 조합하여 적용될 수 있는 것으로 고려된다.
또 다른 치료요법이 본원의 개시내용의 세포와 연계하여 제공되고 하나 또는 둘 다의 다중 투여가 요구되는 경우에, 제제의 투여는 상이한 투여 경로 및 상이한 시점에서 일어날 수 있다.
A. 화학치료요법
암 치료요법은 또한 예를 들어, 화학 및 방사선 둘 다 기반의 치료와의 다양한 조합 치료요법을 포함한다. 본원의 개시내용의 치료학적 세포와 함께 사용될 수 있는 화학치료요법의 예는 예를 들어, 아시비신; 아클라루비신; 아코다졸 하이드로클로라이드; 아크로닌; 아도젤레신; 알데슬레우킨; 알트레타민; 암보마이신; 아메탄트론 아세테이트; 암사크린; 아나스트로졸; 안트라마이신; 아스파라기나제; 아스페를린; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바티마스타트; 벤조데파; 비칼루타미드; 비산트렌 하이드로클로라이드; 비스나피드 디메실레이트; 비젤레신; 블레오마이신 설페이트; 브레퀴나르 나트륨; 브로피리민; 부설판; 칵티노마이신; 칼루스테론; 카라세미드; 카베티머; 카보플라틴; 카무스틴; 카루비신 하이드로클로라이드; 카젤레신; 세데핀골; 세레콕시브 (COX-2 저해제); 클로람부실; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클래드리빈; 크리스나톨 메실레이트; 사이클로포스파미드; 시타라빈; 다카바진; 닥티노마이신; 다우노루비신 하이드로클로라이드; 데시타빈; 덱소르마플라틴; 데자구아닌; 데자구아닌 메실레이트; 디아지쿠온; 독세탁셀; 독소루비신; 독소루비신 하이드로클로라이드; 드롤록시펜; 드롤록시펜 시트레이트; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 다우조마이신; 에다트렉세이트; 에플로미틴 하이드로클로라이드; 엘사미트루신; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 에피프로피딘; 에피루비신 하이드로클로라이드; 에르불로졸; 에소루비신 하이드로클로라이드; 에스트라무스틴; 에스트라무스틴 포스페이트 나트륨; 에타니다졸; 에토포시드; 에토포시드 포스페이트; 에토프린; 파드로졸 하이드로클로라이드; 파자라빈; 펜레티니드; 플록수리딘; 플루다라빈 포스페이트; 플루오로우라실; 플루오로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신 나트륨; 겜시타빈; 겜시타빈 하이드로클로라이드; 하이드록시우레아; 이다루비신 하이드로클로라이드; 이포스파미드; 일모포신; 이프로플라틴; 이리노테칸; 이리노테칸 하이드로클로라이드; 란레오티드 아세테이트; 레트로졸; 류프롤리드 아세테이트; 리아로졸 하이드로클로라이드; 로메트렉솔 나트륨; 로무스틴; 로속산트론 하이드로클로라이드; 마소프로콜; 메이탄신; 메클로레타민 하이드로클로라이드; 메게스트롤 아세테이트; 멜렌게스트롤 아세테이트; 멜팔란; 메노가릴; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 나트륨; 메토프린; 메투레데파; 미틴도미드; 미토카신; 미토그로민 미토길린; 미토말신; 미토마이신; 미토스퍼; 미토탄; 미톡산트론 하이드로클로라이드; 미코페놀산; 노코다졸; 노갈라마이신; 오마플라틴; 옥시수란; 파클리탁셀; 페가스파가제; 펠리오마이신; 펜타무스틴; 페플로마이신 설페이트; 퍼포스파미드; 피포브로만; 피포설판; 피록산트론 하이드로클로라이드; 플리카마이신; 플로메스탄; 포피머 나트륨; 포피로마이신; 프레드니무스틴; 프로카바진 하이드로클로라이드; 푸로마이신; 푸로마이신 하이드로클로라이드; 피라조푸린; 리보프린; 사핀골; 사핀골 하이드로클로라이드; 세무스틴; 심트라젠; 스파포세이트 나트륨; 스파소마이신; 스피로게르마늄 하이드로클로라이드; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스트렙토니그린; 스트렙토조신; 설로페누르; 탈리소마이신; 테코갈란 나트륨; 탁소테레; 테가푸르; 텔록산트론 하이드로클로라이드; 테모포핀; 테니포시드; 테록시론; 테스톨락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아조푸린; 티라파자민; 토레미펜 시트레이트; 트레스톨론 아세테이트; 트리시리빈 포스페이트; 트리메트렉세이트; 트리메트렉세이트 글루쿠로네이트; 트립토렐린; 투불로졸 하이드로클로라이드; 우라실 머스타드; 우레데파; 바프레오티드; 버테포핀; 빈블라스틴 설페이트; 빈크리스틴 설페이트; 빈데신; 빈데신 설페이트; 비네피딘 설페이트; 빈글리시네이트 설페이트; 빈레우로신 설페이트; 비노렐빈 타르트레이트; 빈로시딘 설페이트; 빈졸리딘 설페이트; 보로졸; 제니플라틴; 지노스타틴; 조루비신 하이드로클로라이드; 20-에피-1,25 디하이드록시비타민 D3; 5-에티닐우라실; 아비라테론; 아클라루비신; 아실풀벤; 아데시페놀; 아도젤레신; 알데스류킨; ALL-TK 길항제; 알트레타민; 암바무스틴; 아미독스; 아미포스틴; 아미노레불린산; 암루비신; 암사크린; 아나그렐리드; 아나스트로졸; 안드로그라폴리드; 혈관형성 저해제; 길항제 D; 길항제 G; 안타렐릭스; 항-도르살리징 형태형성 단백질-1; 항안드로겐, 전립선 암종; 항에스트로겐; 항네오플라스톤; 안티센스 올리고뉴클레오타이드; 아피디콜린 글리시네이트; 아폽토시스 유전자 조절제; 아폽토시스 조절제; 아푸린산; ara-CDP-DL-PTBA; 아르기닌 데아미나제; 아설라크린; 아타메스탄; 아트리무스틴; 악시나스타틴 1; 아식나스타틴 2; 아식나스타틴 3; 아자세트론; 아자톡신; 아자티로신; 바카틴 III 유도체; 발라놀; 바티카스타트; BCR/ABL 길항제; 벤조클로린; 벤조일스타우로스포린; 베타 락탐 유도체; 베타-알레틴; 베타글라마이신 B; 베툴린산; bFGF 저해제; 비칼루타미드; 비산트렌; 비사지리디닐스퍼민; 비스나피드; 비스트라텐 A; 비젤레신; 브레플레이트; 브로피리민; 부도티탄; 부티오닌 설폭시민; 칼시포트리올; 칼포스틴 C; 캄프토테신 유도체; 카페시타빈; 카복스아미드-아미노-트리아졸; 카복시아미도트리아졸; CaRest M3; CARN 700; 연골 유래된 저해제; 카젤레신; 카세인 키나제 저해제 (ICOS); 카스타노스퍼민; 세크로핀 B; 세트로렐릭스; 클로린; 클로로퀴녹살린 설폰아미드; 시카프로스트; 시스-포피린; 클라드리빈; 클로미펜 유사체; 클로트리마졸; 콜리스마이신 A; 콜리스마이신 B; 콤브레타스타틴 A4; 콤브레타스타틴 유사체; 코나게닌; 크람베스시딘 816; 크리스나톨; 크립토피신 8; 크립토피신 A 유도체; 쿠라신 A; 사이클로펜탄트라퀴논; 사이클로플라탐; 시페마이신; 시타라빈 옥포스페이트; 시톨리틱 인자; 시토스타틴; 다클릭시맙; 데시타빈; 데하이드로디덴민 B; 데슬로렐린; 덱사메타손; 덱시포스파미드; 덱스라족산; 덱스베라파밀; 디아지쿠온: 디뎀닌 B; 디독스; 디에틸노르스퍼민; 디하이드로-5-아자시티딘; 디하이드로탁솔, 9-; 디옥사미신; 디페닐 스피로무스틴; 독세탁셀; 도코사놀; 돌라세트론; 독시플루리딘; 독소루비신; 드롤록시펜; 드로나비놀; 두오카마이신 SA; 에브셀렌; 에코무스틴; 에델포신; 에드레콜로맙; 에플로르니틴; 엘레멘; 에미테푸르; 에피루비신; 에프리스테리드; 에스트라무스틴 유사체; 에스트로겐 효능제; 에스트로겐 길항제; 에타니다졸; 에토포시드 포스페이트; 엑세메스탄; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티니드; 필그라스팀; 피나스테리드; 플라보피리돌; 플레젤라스틴; 플루아스테론; 플루다라빈; 플루오로다우노루니신 하이드로클로라이드; 포페니멕스; 포메스탄; 포스트리에신; 포테무스틴; 가돌리늄 텍사피린; 갈륨 니트레이트; 칼록시타빈; 가니렐릭스; 겔라티나제 저해제; 겜시타빈; 글루타티온 저해제; 헵설팜; 헤레굴린; 헥사메틸렌 비스아세트아미드; 히페리신; 이반드론산; 이다루비신; 이독시펜; 이드라만톤; 일모포신; 일로마스타트; 이마티닙 (예를 들어, GLEEVEC®), 이미퀴모드; 면역자극성 펩타이드; 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 저해제; 인터페론 효능제; 인터페론; 인터류킨; 이오벤구안; 요도독소루비신; 이포메아놀, 4-; 이로플락트; 이르소글라딘; 이소벤가졸; 이소호모할리콘드린 B; 이타세트론; 야스플라키놀리드; 카할랄리드 F; 라멜라린-N 트리아세테이트; 란레오티드; 레이나마이신; 레노그라스팀; 렌티난 설페이트; 렙톨스타틴; 레트로졸; 백혈병 저해 인자; 백혈구 알파 인터페론; 류프롤리드+에스트로겐+프로게스테론; 류프로렐린; 레바미솔; 리아로졸; 선형 폴리아민 유사체; 친지성 디사카라이드 펩타이드; 친지성 백금 화합물; 리소클리나미드 7; 로바플라틴; 롬브리신; 로메트렉솔; 로니다민; 이오속산트론; 록소리빈; 루르토테칸; 루테티움 텍사피린; 리소필린; 용해 펩타이드; 마이탄신; 만노스타틴 A; 마리마스타트; 마소프로콜; 마스핀; 마트릴리신 저해제; 매트릭스 메탈로프로테이나제 저해제; 메노가릴; 메르바론; 메테렐린; 메티오니나제; 메토클로프라미드; MIF 저해제; 미페프리스톤; 밀테포신; 미리모스팀; 미토구아존; 미톨락톨; 미토마이신 유사체; 미토나피드; 미토톡신 섬유아세포 성장 인자-사포린; 미톡산트론; 모파로텐; 몰그라모스팀; 에르비툭스, 사람 만성 고나도트로핀; 모노포스포릴 지질 A + 미오박테리움 세포 벽 sk; 모피다몰; 머스타드 항암제; 미카페록시드 B; 미코세균 세포 벽 추출물; 미리아포론; N-아세틸디날린; N-치환된 벤즈아미드; 나파렐린; 나그레스팁; 날록손+펜타조신; 나파빈; 나프테르핀; 나토그라스팀; 네다플라틴; 네모루비신: 네리드론산; 닐루타미드; 니사마이신; 산화질소 조절제; 질소산화물 항산화제; 니트룰린; 오블리메르센(GENASENSE®); O6-벤질구아닌; 옥트레오티드, 오키세논; 올리고뉴클레오타이드; 오나프리스톤; 온단세트론; 온단세트론; 오라신; 경구 사이토킨 유도제; 오르마플라틴; 오사테론; 옥살리플라틴; 옥사우노마이신; 파클리탁셀; 파클리탁셀 유사체; 파클리탁셀 유도체; 팔라우아민; 팔미토일리조신; 파미드론산; 파낙시트리올; 파노미펜; 파라박틴; 파젤립틴; 페가스파가제; 펠데신; 펜토산 폴리설페이트 나트륨; 펜토스타틴; 펜트로졸; 퍼플루브론; 퍼포스파미드; 페릴릴 알콜; 페나지노마이신; 페닐아세테이트; 포스파타제 저해제; 피시바닐; 필로카핀 하이드로클로라이드; 피라루비신; 피리트렉심; 플라세틴 A; 플라세틴 B; 플라스미노겐 활성화인자 저해제; 백금 착물; 백금 화합물; 백금-트리아민 착물; 포피머 나트륨; 포피로마이신; 프레드니손; 프로필 비스-아크리돈; 프로스타글란딘 J2; 프로테아솜 저해제; 단백질 A-기반 면역 조절제; 단백질 키나제 C 저해제; 단백질 키나제 C 저해제, 미세조류; 단백질 티로신 포스파타제 저해제; 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라제 저해제; 푸르푸린스; 피라졸로아크리딘; 피리독실화된 헤모글로빈 폴리옥시에틸렌 접합체; raf 길항제; 랄티트렉세드; 라모세트론; ras 파네실 단백질 트랜스퍼라제 저해제; ras 저해제; ras-GAP 저해제; 레텔립틴 탈메틸화된; 레늄 Re 186 에티드로네이트; 리족신; 리보자임; RII 레티나미드; 로히투킨; 로무르티드; 로퀴니멕스; 루비기논 B1; 루보실; 사핀골; 사인토핀; SarCNU; 사코피톨 A; 사그라모스팀; Sdi 1 모사체; 세무스틴; 세네센스 유도된 저해제 1; 센스 올리고뉴클레오타이드; 신호 전달 저해제; 시조푸란; 소부족산; 나트륨 보로캡테이트; 나트륨 페닐아세테이트; 솔베롤; 소마토메딘 결합 단백질; 소네르민; 스파포신산; 스피카마이신 D; 스피로무스틴; 스플레노펜틴; 스폰기스타틴 1; 스쿠알라민; 스티피아미드; 스트로멜리신 저해제; 설피노신; 과활성 혈관작용 장 펩타이드 효능제; 수라디스타; 수라민; 스와인소닌; 탈리무스틴; 타목시펜 메티오디드; 타우로무스틴; 타자로텐; 테코갈란 나트륨; 테가푸르; 텔루라피릴륨; 텔로머라제 저해제; 테모포핀; 테니포시드; 테트라클로로데카옥시드; 테트라조민; 탈리블라스틴; 티오코랄린; 트롬보포이에틴; 트롬보포이에틴 모사체; 티말파신; 티모포이에틴 수용체 효능제; 티모트리난; 갑상선 자극 호르몬; 주석 에틸 에티오푸르푸린; 티라파자민; 티타노센 비클로라이드; 탑센틴; 토레미펜; 해독 저해제; 트레티노인; 트리아세틸우리딘; 트리시리빈; 트리메트렉세이트; 트립토렐린; 트로피세트론; 투로스테리드; 티로신 키나제 저해제; 티르포스틴; UBC 저해제; 우베니멕스; 비뇨생식동 유래된 성장 저해 인자; 우로키나제 수용체 길항제; 바프레오티드; 바리올린 B; 벨라레솔; 베라민; 베르딘; 베르테포핀; 비노렐빈; 빈살틴; 비탁신; 보로졸; 자노테론; 제니플라틴; 질라스코브; 및 지노스타틴 스티말라머, 또는 이전의 임의의 유사체 또는 유도체 변이체를 포함한다.
B. 방사선 치료요법
DNA 손상을 유발하고 광범위하게 사용되는 다른 인자들은 γ-선, X-선, 및/또는 방사능동위원소의 종양 세포로의 직접적인 전달로서 통상적으로 공지된 것을 포함한다. 다른 형태의 DNA 손상 인자들은 또한 예를 들어, 마이크로파 및 UV-조사가 고려된다. 상기 인자들 모두는 DNA에 대해, DNA의 전구체에 대해, DNA의 복제 및 복구에 대해 및 염색체의 어셈블리 및 유지에 대해 광범위한 손상을 일으킬 가능성이 매우 높다. X-선에 대한 투여 범위는 장 기간 (3 내지 4주) 동안 하루 50 내지 200 뢴트겐 용량 내지 2000 내지 6000 뢴트겐 단일 용량 범위이다. 방사능동위원소에 대한 용량 범위 광범위하게 다양하고 동위원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도 및 유형, 및 신생물 세포에 의한 흡수에 의존한다.
용어 "접촉된" 및 "노출된"은 세포에 적용되는 경우 본원에서는 치료제 작제물 및 화학치료제 또는 방사선치료제가 표적 세포로 전달되거나 표적 세포에 바로 인접하게 위치되는 공정을 기재하기 위해 사용된다. 세포 사멸 또는 정체를 성취하기 위해, 2개의 제제는 세포를 사멸시키거나 세포가 분열하는 것을 차단하기 위한 조합 유효량으로 세포에 전달된다.
C. 면역치료요법
하나의 구현예에서, 항상성 활성 사이토킨 수용체-특이적-발현 세포 이외의 다른 면역치료요법은 본원의 개시내용의 방법 및 조성물과 함께 사용된다. 상기 치료요법은 세포 자체일 수 있거나 아닐 수 있다.
면역치료제는 일반적으로 암 세포를 표적화하고 이를 파괴하기 위한 면역 이펙터 세포 및 분자의 사용에 의존한다. 면역 이펙터는 예를 들어, 종양 세포 표면 상에 일부 마커에 특이적인 항체일 수 있다. 단독의 항체는 치료요법의 이펙터로서 작용할 수 있거나 다른 세포를 채용하여 실제로 세포 사멸을 유도할 수 있다. 항체는 또한 약물 또는 독소 (화학치료제, 방사선핵종, 리신 A 쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)와 접합될 수 있고 단지 표적화제로서 작용할 수 있다. 대안적으로, 이펙터는 종앙 세포 표적과 직간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 갖는 림프구일 수 있다. 다양한 이펙터 세포는 T-세포, 세포독성 T-세포, NK T 세포, NK 세포, 수지상 세포 또는 대식세포를 포함한다.
면역치료요법은 따라서 본원의 세포 치료요법과 연계하여 조합된 치료요법의 일부로서 사용될 수 있다. 조합 치료요법을 위한 일반 접근법은 하기에서 논의된다. 일반적으로, 종양 세포는 표적화에 순응할 수 있는, 즉, 대다수의 다른 세포에 존재하지 않는 일부 마커를 함유해야만 한다. 많은 종양 마커가 존재하고 이들 임의의 마커는 본원의 개시내용과 관련하여 표적를 위해 적합할 수 있다. 통상의 종양 마커는 전립선 특이적 항원, 뇨 종양 관련 항원, 태아 항원, 티로시나제 (p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원, MucA, MucB, PLAP, 에스트로겐 수용체, 라미닌 수용체, erb B, p155, 흑색종 관련 항원(MAGE), 흑색종의 바람직하게 발현된 항원(PRAME), 수르비빈, CD19, CD20, CD22, k 경쇄, CD30, CD33, CD123, CD38, ROR1, ErbB2 ,ErbB3/4, ErbB 이량체, EGFr vIII, 암 배아성 항원, EGP2, EGP40, 메소텔린, TAG72, PSMA, NKG2D 리간드, B7-H6, IL-13 수용체 a2, MUC1, MUC16, CA9, GD2, GD3, HMW-MAA, CD171, Lewis Y, CLL-1, G250/CAIX, HLA-AI MAGE A1, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, 폴레이트 수용체-a, CD44v6, CD44v7/8, avb6 인테그린, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, 태아 AchR, NKG2D 리간드, CD44v6, 이원 항원, 범용, EphA2, EphA3, HER2 (ERBB2), GD2, 글리피칸-3, 5T4, 8H9, αvβ6 인테그린, B 세포 성숙화 항원(BCMA) B7-H3, B7-H6, CAIX, CA9, CD19, CD20, CD22, 카파 경쇄, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD96, CD123, CD138, CD171, CEA, CLL-1, CSPG4, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, ERBB3, ERBB4, FAP, FAR, FBP, 태아 AchR, IL11Ra, KDR, Lambda, MCSP, NCAM, PSC1, PSMA, ROR1, Sp17, SURVIVIN, TAG72, TEM1, TEM8, Tn-O-글리코펩타이드, VEGRR2, 및 HMW-MAA를 포함한다.
또 다른 유형의 면역치료요법은 PAMP를 사용한다. 이들은 선천성 면역력을 활성화시키고 이어서 본 발명의 항상성 활성 사이토킨 수용체-특이적-발현 세포를 포함하는 후천성 면역력을 활성화시키기 위해 종양으로 주사될 수 있다.
D. 유전자
또 다른 구현예에서, 2차 치료는 치료학적 폴리뉴클레오타이드가 본원의 개시내용의 임상적 구현예 전, 후 또는 이와 동시에 투여된다. 세포 증식의 유도제, 세포 증식의 저해제 또는 프로그램화된 세포사의 조절제를 포함하는 다양한 발현 생성물이 본원의 개시내용에 포함된다.
E. 수술
암을 갖는 사람의 대략 60%는 예방적, 진단적 또는 단계적, 치유적 및 일시적 수술을 포함하는, 일부 유형의 수술을 진행한다. 치유적 수술은 다른 치료요법과 연계하여 본원의 개시내용의 치료, 화학치료요법, 방사선치료요법, 호르몬 치료요법, 유전자 치료요법, 면역치료요법 및/또는 대안적 치료요법과 같은 다른 치료요법과 연계하여 사용될 수 있는 암 치료이다.
치유적 수술은 암성 조직의 전부 또는 일부를 물리적으로 제거되고, 절개되고/되거나 파괴되는 절제를 포함한다. 종양 절제는 종양 적어도 일부의 물리적 제거를 언급한다. 종양 절제에 추가로, 수술에 의한 치료는 레이져 수술, 냉동수술, 전기수술 및 현미경적으로 제어되는 수술 (Mohs’ 수술)을 포함한다. 본원의 개시내용은 피상적 암, 전암, 또는 부수적인 양의 정상 조직의 제거와 연계하여 사용될 수 있는 것으로 추가로 고려된다.
모든 암성 세포, 조직 또는 종양의 일부의 절개시, 구멍이 신체에 형성될 수 있다. 치료는 추가의 항-암 치료요법으로 상기 영역의 관류, 직접적인 주사 또는 국소적 적용에 의해 성취될 수 있다. 상기 치료는 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 마다, 또는 1, 2, 3, 4, 및 5주 마다 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 마다 반복될 수 있다. 이들 치료는 또한 다양한 용량일 수 있다.
II. 약제학적 조성물
본원의 개시내용에 따라, 용어 "약제학적 조성물"은 개체에 투여하기 위한 조성물에 관한 것이다. 본원의 개시내용의 특이적 양상에서, 약제학적 조성물은 하나 이상의 항상성 활성 사이토킨 수용체를 발현하는 다수의 면역 세포를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 약제학적 조성물은 비경구, 경피, 강내, 동맥내, 척추강내 또는 정맥내 투여를 위한 또는 암으로의 직접적인 주사를 위한 조성물을 포함한다. 특히, 상기 약제학적 조성물은 주입 또는 주사를 통해 개체에 투여되는 것으로 고려된다. 적합한 조성물의 투여는 상이한 방식, 예를 들어, 정맥내, 피하, 복막내, 근육내, 국소적 또는 피내 투여에 의해 수행될 수 있다.
본원의 개시내용의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예는 당업계에 널리 공지되어 있고 인산 완충 식염수 용액, 물, 에멀젼, 예를 들어, 오일/물 에멀젼, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액 등을 포함한다. 상기 담체를 포함하는 조성물은 널리-공지된 통상적인 방법에 의해 제형화될 수 있다. 이들 약제학적 조성물은 적합한 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다.
용량 용법은 담당의 및 임상적 인자들에 의해 결정된다. 의학 분야에서 널리 공지된 바와 같이, 임의의 한명의 환자에 대한 투여는 많은 인자들에 의존하고, 이는 환자의 크기, 체표면, 연령, 투여될 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강 및 동시에 투여되는 다른 약물을 포함한다. 투여를 위한 바람직한 용량은 1x107/m2 내지 1x1010/m2의 범위일 수 있다. 공정은 주기적 평가에 의해 모니터링될 수 있다. 항상성 활성 사이토킨 수용체-변형된 세포 (예를 들어, T-세포)는 정맥내 주입을 통해 투여될 수 있다. 용량은 1x107/m2 내지 1x1010/m2의 범위일 수 있다.
본원의 개시내용의 조성물은 국소적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다. 투여는 일반적으로 비경구, 예를 들어, 정맥내이고; DNA는 또한 예를 들어, 내부 또는 외부 표적 부위로의 바이오올리스틱 (biolistic) 전달에 의해 또는 동맥 내 부위로의 카테터에 의해 표적 부위로 직접 투여될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 약제학적 조성물은 피하로 투여되고 보다 더 바람직하게는 정맥내로 투여된다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균 수용액 또는 비-수용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예를 들어, 올리브유, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들어, 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는 식염수 및 완충 매질을 포함하는, 물, 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 데그트로스 및 염화나트륨, 락테이트화된 링거, 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충물, 전해질 보충물 (예를 들어, 링거 덱스트로스를 기반으로 하는 것들) 등을 포함한다. 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이팅제, 및 불활성 가스 등과 같은 보존제 및 다른 첨가제가 또한 존재할 수 있다. 추가로, 본원의 개시내용의 약제학적 조성물은 예를 들어, 바람직하게 사람 기원의 혈청 알부민 또는 면역글로불린과 같은 단백질성 담체를 포함할 수 있다. 본원의 개시내용의 약제학적 조성물은 항상성 활성 사이토킨 수용체 작제물 또는 상기 작제물을 암호화하는 핵산 분자 또는 벡터 (본원에 기재된 바와 같은)에 추가로, 약제학적 조성물의 의도된 용도에 의존하여, 추가의 생물학적 활성제를 포함할 수 있는 것으로 고려된다.
본원에 기재된 임의의 조성물은 항상성 활성 사이토킨 수용체를 발현하는 암을 치료하기 위한 키트 내에 포함될 수 있다. 비제한적인 예에서, 재조합 발현 벡터를 함유하는 세포 치료요법에 사용하기 위한 하나 이상의 세포를 생성하기 위해 세포 치료요법 및/또는 시약에 사용하기 위한 하나 이상의 항상성 활성 사이토킨 수용체-지시된 면역 세포가 키트 내에 포함될 수 있다. 상기 키트 성분들은 적합한 컨테이너 수단으로 제공된다.
상기 키트의 일부 성분들은 수성 매질 또는 동결건조된 형태로 팩키징될 수 있다. 키트의 컨테이너 수단은 일반적으로 적어도 하나의 바이엘, 시험 튜브, 플라스크, 병, 시린지 또는 성분이 위치될 수 있고 바람직하게 적합하게 적정될 수 있는 다른 컨테이너 수단을 포함한다. 키트에 하나 초과의 성분이 있는 경우, 키트는 또한 일반적으로 추가의 성분들이 별도로 위치할 수 있는 제2, 제3 또는 다른 추가의 컨테이너들을 포함한다. 그러나, 다양한 조합의 성분들이 바이엘에 포함될 수 있다. 키트는 또한 전형적으로 시판을 위해 밀폐된 공간에 성분들을 함유시키기 위한 수단을 포함한다. 상기 컨테이너는 목적하는 바이엘이 보유되는 주사 또는 블로우형 플라스틱 컨테이너를 포함할 수 있다.
키트의 성분들이 하나 및/또는 그 이상의 액체 용액 중에 제공되는 경우, 상기 액체 용액은 수성 용액이고, 멸균 수성 용액이 특히 유용하다. 일부 경우에, 컨테이너 수단은 자체가 시린지, 피펫, 및/또는 이로부터 제제가 신체의 감염 영역에 적용될 수 있고 동물에게 주사될 수 있고/있거나 키트의 다른 성분들에 적용될 수 있고/있거나 함께 혼합될 수 있는 다른 상기 유사 장치일 수 있다.
특정 구현예에서, 세포 치료요법을 위해 사용되어야만 하는 세포는 키트에 제공되고, 일부 경우에 상기 세포는 필수적으로 키트의 유일한 성분이다. 키트는 목적하는 세포를 만들기 위한 시약 및 재료를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 시약 및 재료는 목적하는 서열을 증폭시키기 위한 프라이머, 뉴클레오타이드, 적합한 완충액 또는 완충액 시약, 염 등을 포함하고, 일부 경우에, 시약은 본원에 기재된 바와 같은 인게이져 분자 및/또는 이에 대한 조절 요소들을 포함하는 벡터 및/또는 DNA를 포함한다.
특정 구현예에서, 개체로부터 하나 이상의 샘플을 추출하기 위해 적합한 키트 내 하나 이상의 장치가 있다. 상기 장치는 시린지, 메스 등일 수 있다.
특정 양상에서, 상기 키트는 본원의 개시내용의 세포 치료요법 및 이에 대해 세포가 면역성인 화학치료요법을 포함한다. 일부 경우에, 세포 치료요법 구현예에 추가로 키트는 또한 예를 들어, 화학치료요법, 호르몬 치료요법 및/또는 면역치료요법과 같은 제2 암 치료요법을 포함한다. 키트(들)는 개체에 대해 특정 암에 맞게 조정될 수 있고 개채에 대해 각각의 제2 암 치료요법을 포함한다.
실시예
하기의 실시예는 본원의 개시내용의 바람직한 구현예를 입증하기 위해 포함된다. 후속 실시예에 기재된 기술은 본원의 개시내용의 수행에서 잘 기능하는 것으로 본원 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내고 이의 수행을 위해 바람직한 방식을 구성하는 것이 고려될 수 있는 것으로 당업자는 인지해야 한다. 그러나, 당업자는 본원의 개시내용의 측면에서, 기재된 특정 구현예에서 많은 변화가 만들어 질 수 있고 본원의 개시내용의 취지 및 범위로부터 벗어나는 것 없이 유사한 결과를 수득할 수 있음을 인지해야 한다.
실시예 1
세포 치료요법을 위한 항상성 활성 사이토킨 수용체
본원의 실시예는 항상성 활성 사이토킨 수용체의 특정 구체적 구현예의 생성 및 활성을 입증한다. 본원의 개시내용은 비-천연의 항상성 활성 사이토킨 수용체에 관한 것이고 신호전달 성질에서 변화를 유도하는 야생형과 비교하여 변형되었다. 도 1은 정상 IL-7 사이토킨/수용체 신호전달에서 일어나는 것을 도해한다. 휴식기에, IL-7 수용체 알파(IL-7Rα) 단백질은 감마-쇄 수용체(γc) 단백질로부터 분리되어 잔류한다. 이것은 세포외 IL-7이 수용체 둘 다의 세포외 도메인에 결합하는 경우 변화하여 IL-7Rα 및 γc의 이종이량체화를 유도하고, 이는 JAK1/JAK3 신호전달을 활성화시켜 STAT5 인산화를 활성화시킨다. STAT5는 IL-7 수용체에 의해 활성화되는 주요 다운스트림 신호전달 노드 (node)이다. 도 2는 IL7RP2 수용체에서의 신호전달을 보여준다. 세포외 IL-7과 독립적으로, IL7RP2 단량체 단백질의 막관통 도메인 내 시스테인 잔기는 또 다른 IL7RP2 단량체에서 시스테인 잔기와 디설파이드 결합을 형성한다. 이것은 JAK1/JAK1 신호전달을 항상성으로 활성화시켜 STAT5 인산화를 유도하는 동종이량체 단백질의 형성을 유도한다.
따라서, 본원의 개시내용은 일부 경우에 특정 세포외 도메인 및 특정 막관통 도메인을 가져 상기 가공된 수용체가 수용체에 대한 초기 신호의 부재하에서도 항상성으로 활성이도록 하는 가공된 사이토킨 수용체의 구현예를 포함한다. 도 3에서는, Δ34.IL7RP2 단백질의 특정 예에서의 신호전달이 도해되어 있다. IL7RP2 수용체의 세포외 도메인은 CD34의 세포외 도메인으로 대체되어 Δ34.IL7RP2를 형성한다. 이것은 IL-7과 같은 세포외 사이토킨에 대한 민감성을 제거하고 STAT5를 항상성으로 활성화시키기 위해 온전한 단백질의 막관통 및 세포질 도메인을 유지한다. 도 4는 STAT5가 IL7RP2-형질도입된 T 세포에서 항상성으로 활성임을 보여준다. Δ34.IL7RP2 (SFG. Δ34.IL7RP2)를 암호화하는 발현 카세트를 갖는 레트로바이러스 벡터를 제조하였다. OKT3/CD28-활성화된 T 세포에 RD114-슈도타입 SFG.Δ34.IL7RP2 레트로바이러스 입자를 형질도입하였다. 음성 대조군으로서, T-세포에 별도로 CD34의 세포외 및 막관통도메인 및 세포질 도메인의 일부를 발현하는 비-신호전달 SFG.Δ34 벡터를 형질도입하였다. 하나의 공여자로부터의 대표적인 FAC 데이터(도 4a)에서, 항상성 STAT5 활성화는 24시간 동안 사이토킨 부재하에 휴지기의 Δ34.IL7RP2 형질도입된 T-세포 (백색)에서, SFG.Δ34가 형질도입된 T-세포(검정)에 비해 보다 높은 인산화된-STAT5 (pSTAT5)에 의해 입증된다. 3명의 공여자 n으로부터의 평균 결과는 Δ34.IL7RP2 형질도입된 T-세포에서 pSTAT5의 평균 형광 강도(MFI)가 SFG.Δ34 (도 4b) 보다 유의적으로 높음을 보여주었다.
본원의 개시내용의 변형된 사이토킨 수용체를 포함하고 또한 키메라 항원 수용체 (예를 들어)를 포함하는 세포는 사이토킨의 부재하에서도 증식하는 능력을 유지한다. 도 5에서, IL7RP2-형질도입된, 항원-특이적 T-세포는 항원-특이적 자극 후 변형되지 않은 항원-특이적 T-세포 보다 큰 증식성 잠재력을 갖는다. 바리셀라 조스터 바이러스 (VZV)-특이적 T-세포 (VZVST)는 고형 종양 항원 GD2에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR)를 사용하여 유전학적으로 변형시켰다. 상기 시스템에서 IL7RP2의 이득을 평가하였다. VZVST는 CD28.-ξ 신호전달 도메인을 갖는 GD2-CAR (SFG.GD2.CAR.CD28 ξ) 또는 SFG.GD2.CAR.CD28ξ 및 SFG.IL7RP2-mOrange (mO)을 암호화하는 레트로바이러스 벡터로 유전학적으로 변형시켰다. T-세포 집단 둘 다는 IL2의 부재하에 GD2+ LAN-1 종양 세포에 반복적으로 노출시켰다. L7RP2-형질도입된 GD2.CAR VZVST는 계속 증식하였지만 비변형된 GD2.CAR VZVST는 증식하지 않았다.
본원의 개시내용의 항상성 활성 사이토킨 수용체는 수용체가 부재인 세포와 비교하여 증가된 확장 및 암 세포 세포독성을 가능하게 한다. 도 6은 Δ34.IL7RP2를 동시 발현하는 GD2.CAR T-세포가 생체내 GD2.CAR T-세포 보다 큰 확장 및 항-종양 효능을 가짐을 입증한다. Δ34.IL7RP2가 생체내 항원-재지시된 T-세포의 확장을 증진시키는지를 평가하기 위해, OKT3/CD28-활성화된 T-세포에 OX40.CD28.ξ 신호전달 도메인을 갖는 GD2.CAR (SFG.GD2.CAR.OX40.CD28.ξ)을 암호화하는 레트로바이러스 벡터 또는 사이에 2A 서열과 함께 GD2.CAR.OX40.CD28.ξ 및 Δ34.IL7RP2를 동시 발현하는 바이시스트론 SGF 벡터를 형질감염시켰다. 추가로, T-세포 집단 둘 다에 반딧불이 루시퍼라제를 암호화하는 레트로바이러스 벡터를 형질도입하여 비침입성 생발광 이미지화를 가능하게 하였다. 8일령의 NSG 마우스의 좌측 등축 측면에, GD2+ LAN-1 종양을 2백만 GD2.CAR T 세포 또는 2백만 GD2.CAR- Δ34.IL7RP2 T-세포와 함께 정맥내 주사하였다. GD2.CAR-Δ34.IL7RP2 T-세포는 GD2.CAR T-세포와 비교하여 생체내에서 상당히 확장하였고 종양 부위에서 장기적 T-세포 지속성을 입증하였다(도 6a). LAN-1 종양은 GD2.CAR T-세포를 수용한 마우스에서 과성장하였지만 종양은 GD2.CAR-Δ34.IL7RP2 T-세포에서 제거되었다(도 6b). 이것은 GD2.CAR-Δ34.IL7RP2 T-세포를 수용한 마우스에서 상당히 증진된 생존 이점을 유도하였다(도 6c).
Δ34.IL7RP2-형질도입된 T-세포는 항원-자극의 부재하에 제한된 지속성을 갖는다. Δ34.IL7RP2가 항원 또는 사이토킨 자극의 부재하에 T-세포의 확장을 항상성으로 유도하는지를 평가하기 위해, Δ34.IL7RP2-형질도입된 T 세포를 사람 사이토킨 보충물 또는 항원 자극이 없는 완전한 배양 배지에서 배양하였다 (PBMC 단리 및 활성화 후 10일). 대조군으로서, Δ34-형질도입된 T-세포 및 비-형질도입된 (NT) T-세포는 동일한 방식으로 배양하였다. Δ34.IL7RP2-형질도입된 T-세포는 배양 처음 14일 동안에 1-배 확장하고, 이후 세포는 수축된다(도 7a). Δ34 및 NT T-세포는 배양 과정 동안에 확장하지 않고 수축되지 않았다. 이것은 Δ34.IL7RP2 단독이 T-세포에서 항상성 세포 확장을 유도할 수 없고 Δ34.IL7RP2 형질도입된 T-세포는 증식을 위해 여전히 항원을 필요로 함을 입증한다.
Δ34.IL7RP2는 EphA2.CAR T 세포의 세포독성 능력 및 확장을 연장한다. Δ34.IL7RP2가 EphA2-CAR를 통해 EphA2-발현 표적에 대해 재지시된 T 세포의 확장을 증진시키는지를 평가하기 위해, OKT3/CD28-활성화된 T 세포에, 2A 서열에 의해 절단된 CD19 분자, ΔCD19 (SFG.EphA2.41BB.ξ-2A-ΔCD19)에 연결된 41BB z와 함께 EphA2.CAR을 암호화하는 바이시스트론 SFG 벡터 또는 이 사이에 2A 서열을 갖는 SFG.EphA2.41BB.ξ 및 Δ34.IL7RP2를 동시 발현하는 바이시스트론 SFG 벡터(SFG.EphA2.41BB.ξ-2A-Δ34.IL7RP2)를 형질도입하였다. CAR T-세포가 이들이 주마다 EphA2-양성 U373 교모세포종 세포 (2 T-세포 대 1 종양 세포 비율)를 챌린지 받는 연속 사멸 검정에 적용되는 경우, SFG.EphA2.41BB.ξ-2A-Δ34.IL7RP2 T-세포는 종양 세포를 제거할 수 있고 8개 자극을 위해 증식할수 있고 (검정), SFG.EphA2.41BB.ξ-2A-ΔCD19 T-세포 (회색)는 2개 자극 후 기능부전이 되었다(도 8).
Δ34.IL7RP2는 생체내 EphA2.CAR T-세포의 항신경교종 활성을 증진시킨다. 마우스에 반딧불이 루시퍼라제 발현 U373 세포를 주사하고 7일째에 EphA2.CAR T 세포 또는 EphA2.CAR.Δ34.IL7RP2 T-세포를 종양내 주사하였다. 종양 성장에 이어서 연속 생발광 이미지화에 적용하였다. EphA2.CAR.Δ34.IL7RP2 T-세포로 처리된 모든 4마리의 마우스에서 종양이 퇴행되었고 재발하지 않았다(도 9). 대조적으로, 5마리 마우스 중 4마리만이 EphA2.CAR T-세포 치료요법 후 종양 퇴행을 가졌고 모든 4개의 반응하는 종양은 T-세포 주사 후 4주 이내에 재발하였다.
조합 항상성 활성 사이토킨 수용체는 본원의 개시내용의 구현예에 포함된다. 예를 들어, Δ34.IL7RP2 단백질은 IL-21Rα 세포질 도메인과 융합되어 항상성 활성 조합 사이토킨 수용체를 생성할 수 있다. Δ34.IL7RP2는 C-말단에서 STAT5 결합의 입체 장애를 회피하기 위해 2개의 세포질 도메인 사이에 있는 유연성 링커를 사용하여 IL-21 수용체의 세포질 도메인과 융합되어 Δ34.IL7RP2-링커-IL21Rα를 생성하였다(도 10a). STAT 활성화 능력을 평가하기 위해, T-세포(NT, Δ34.IL7RP2 형질도입된 T-세포, 또는 Δ34.IL7RP2-링커-IL21Rα 형질도입된 T-세포)는 사이토킨 없이 24시간 동안 휴식시켰다. Δ34.IL7RP2 및 Δ34.IL7RP2-링커-IL21Rα T-세포는 STAT5를 항상성으로 활성화시킬 수 있지만(도 10b), Δ34.IL7RP2-링커-IL21Rα만이 항상성 STAT3 활성을 입증하였다(도 10c). STAT3은 IL-21 수용체에 의해 활성화되는 주요 다운스트림 신호전달 노드 (node)이다.
T-세포 이외의 다른 세포는 하나 이상의 항상성 활성 사이토킨 수용체를 발현하도록 변형될 수 있다. 도 11에서, IL7RP2는 NK 세포의 항원-매개된 증식을 증진시킨다. NK 세포에 IL7RP2-IRES-mOrange (IL7RP2.mO) 벡터 또는 대조군 벡터 IRES-mOrange (empty.mO)을 형질도입하고 이어서 7일 동안 사이토킨의 부재하에 조사된 K562 표적 세포로 자극하였다. IL7RP2.mO NK 세포는 배수 증식에서 8배 증가를 입증하였고 empty.mO NK 세포는 단지 4배 증식하였다.
실시예 2
외부도메인의 특정 구현예
도 12는 다중 외부도메인이 항상성 활성 사이토킨 수용체에 사용되는 특정 예를 도해한다. 여기서, PD1 외부도메인은 Δ34.IL7RP2의 ΔCD34 외부도메인에 연결되어 있고, 상기 특정 PD1 외부도메인은 PDL1 결합을 위해 정상 PD1과 경쟁하고 (이로써 데코이 수용체로서 작용함) 이는 PD1 면역-억제를 감소시킨다. 일부 경우에, 수용체는 단일 외부도메인으로서 상기 외부도메인을 사용한다(도 13). 데코이 수용체에 대해, 수용체는 CD34 또는 이의 일부를 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 데코이 수용체에 대한 외부도메인의 다른 구현예는 CTLA4를 포함한다.
실시예 3
림프구로의 사이토킨 신호전달의 항상성 전달은 증진된 항-종양 효능을 촉진시킨다.
입양 림프구 치료요법은 백혈병 및 림프종에 대해 성공적이었지만 고형 종양에 대해서는 최소 효능을 나타냈다. 종양-특이적 T-세포에 대한 고형 종양에 의해 부과되는 문제점은 T-세포 활성화를 위해 요구되는 3개의 신호 패러다임을 조사함에 의해 이해될 수 있다: 신호 1 (항원에 의한 T-세포 수용체 활성화), 신호 2 (동시-자극), 및 신호 3 (사이토킨 활성화). 이들 신호는 함께 작용하여 생체내 입양 전달된 림프구를 확장시키고 이들의 종양 제거를 구동시킨다. 고형 종양은 종양 항원을 T-세포에 제공하는 MHCI 분자의 하향조절, 동시-자극 리간드를 발현하지 못하도록 하는 것 및 면역억제 사이토킨의 생성과 같은 기전에 의해 T-세포의 3-신호 활성화를 방지한다. 해결책은 MHCI-독립적 항원 연결 시 신호 1 및 2 및 IL-2 분비로부터의 일부 신호 3을 제공하는, 키메라 항원 수용체 (CAR)을 발현하도록 T-세포를 유전학적으로 변형시키는 것이다. 그러나, 신호 3은 상기 접근법에 의해 불완전하게 활성화되는 상태로 남아있다. 상기 결핍은 항상성으로 IL-7 사이토킨 신호전달을 전달하는 유전학적 작제물의 과발현을 통해 보정되었다. 사이토킨 지원 부재하에, 사이토킨-전달 전략은 시험관내 CAR T-세포의 항원-의존성 세포독성, 확장 및 지속성을 증진시킨다. 이것은 이종이식체 신경모세포종 및 신경모세포종 마우스 모델 (단지 예로서)을 사용하여 생체내에서 재현되었고, 고형 종양에 대한 신호 3 보충된 입양 면역치료요법의 상당히 개선된 효능을 입증한다.
실시예 4
가공된 IL-7 수용체로부터 항상성 신호전달은 종양 재지시된 T-세포에 의한 지속적 종양 제거를 촉진시킨다
서론
키메라 항원 수용체 (CAR)로 변형된 T-세포를 사용한 입양 면역치료요법이 난치성 백혈병 및 림프종에 대해 현저한 임상적 효능을 성취하였지만 이들 성공이 고형 종양에까지 적용되기에는 과제가 남아있다. 입양 전달된 T-세포의 실질적 확장 및 지속성은 지속적 항종양 효능을 위해 필요하다. 최적의 T-세포 활성화 및 확장을 위해 요구되는 3개 신호 중에서, CAR 활성화는 신호 1 (T-세포 수용체 (TCR) 활성화) 및 신호 2 (동시-자극)을 반복할 수 있지만 종양 미세환경에서는 드문 면역자극 사이토킨으로부터 유래된 양성 신호 3을 지탱할 수 없다. 이종이식체 종양 모델에서, 신호 3은 IL-2와 같은 사이토킨의 주사로 보강되어 주지할만한 부작용 업이 항-종양 활성을 증강시킨다. 그러나, 암 환자로의 사이토킨의 전신 투여는 상당한 독성을 유발하였다. 사이토킨을 분비하거나 트랜스-제공하도록 T-세포의 유전학적 변형과 같은 대안적 접근법은 분비된 사이토킨의 전신 축적으로부터 신경독성 및 사이토킨 방출 증후군을 포함하는 심한 부작용의 위험을 수반하고 사이토킨 수용체를 과발현하는 T 세포는 외인성 사이토킨에 대한 필요성을 제거하지 못한다.
본 실시예는 신호 3을 항상성 활성 IL-7 사이토킨 수용체 (C7R)를 갖는 T-세포로 선택적으로 제공하여 상기 언급된 문제점을 회피하는 전략을 제공한다. 상기 신규한 키메라 수용체는 외인성 제제 또는 전이유전자 사이토킨의 강제 발현에 의해 유발되는 비-특이적 바이스탠더 T-세포 활성화 필요 없이 신호 3을 제공한다. C7R-발현 CAR T-세포의 성장 및 생존은 항원 의존적으로 남아있지만 종양의 존재하에 이들 세포는 다중 모델 시스템에서 월등한 항-종양 활성을 갖는다.
C7R은 항상성으로 STAT5를 활성화시키고 세포외 리간드에 응답하지 않도록 가공된다
본 실시예에서, IL-7은 이 사이토킨이 종양-특이적 T-세포의 지속성을 강화하기 때문에 관심 대상이다. 특정 돌연변이를 함유하는 IL-7 수용체는 막관통 도메인에서 시스테인 및/또는 프롤린 삽입으로 인한 기능 획득을 유도하여 IL-7Rα 동종이량체화를 유발한다. 동종이량체가 형성되면, JAK1/JAK1의 교차-인산화는 IL-7의 다운스트림에 있는 코어 신호전달 노드인 STAT5를 활성화시킨다.
상기 수용체 부류가 최적의 CAR T-세포 활성을 위한 3개-신호 요건을 완료하기 위해 일정한 신호를 생성하는지를 발견하기 위해, 상당한 STAT5 활성화를 갖는 항상성 활성 IL-7 수용체 변이체 (IL7R*)를 선택하였다. 외부 리간드에 의한 수용체의 추가의 활성화를 회피하고 형질도입된 세포를 검출하는 수단을 제공하기 위해, 수용체의 본래의 세포외 도메인을 CD34로부터 유래된 엑토도메인으로 대체하였다. 엑토도메인 크기가 단백질 발현 및 기능에 영향을 주는지를 알기 위해, Q8(65개 아미노산) 및 CD34 (259개 아미노산)로부터의 엑토도메인을 사용하였다. Q8 엑토도메인은 CD8 스페이서 상부에 탑재된 CD34 에피토프를 포함하여 항-CD34 항체 클론 QBEND10에 의한 검출을 가능하게 한다. 건강한 공여자 T-세포에서 CD34-IL7R* 및 Q8-IL7R* 작제물의 레트로바이러스-매개된 발현은 Q8-IL7R* 융합 단백질 및 준최적 STAT5 활성화의 불량한 발현을 밝혔다(도 18). 대조적으로, CD34-IL7R*은 T 세포에서 강하게 발현되었고 기능적으로 활성이었다. 따라서 CD34-IL7R*이 모든 후속 연구를 위해 사용되었고, 이후 C7R (그러나 또한 본원에서 Δ34.IL7RP2로서 언급되는)로 언급된다(도 14a).
CD4 및 CD8 T-세포에서 C7R의 관련 효과를 결정하기 위해, 2개의 서브집단은 항체 코팅된 자기 비드를 사용하여 분리하였고 활성화시키고 이들을 형질도입하고 서로 별도로 T-세포 서브세트를 배양하였다. C7R은 CD4 및 CD8 T-세포 둘 다에 의해 용이하게 발현되었고(도 14b, 14c 및 도 19), 절단된 CD34 (Δ34) 분자(Quintarelli, 2007) (도 14d-14g)로 이루어진 대조군 작제물 보다 T-세포에서 STAT의 보다 큰 항상성 활성화를 생성하였다. 중요하게, C7R은 시험관내 CD4 및 CD8 T 세포의 항원-독립적 확장을 촉진시키지 않았다(도 14h,14i). C7R 형질도입된 세포는 시험관내 대조군 세포 보다 항원 및 사이토킨 고갈된 조건에서 상당히 오랫동안 지속하였고, C7R 집단은 14 내지 21일째에 수축하기 시작하였고, 모든 세포는 지속성 검정의 개시 후 70일까지 죽는다. 이것은 C7R 단독이 CAR T-세포 안전성을 위해 중요한 성질인 자가 T-세포 확장을 지속하지 않음을 확인시켜주었다.
C7R은 연속 시험관내 종양 세포 챌린지 동안에 GD2-CAR T-세포에서의 생존을 촉진시킨다
C7R이 CAR-T-세포의 항-종양 효능을 증가시킬 수 있는지를 평가하기 위해, 본원 발명자들은 GD2+ 신경모세포종 세포가 CD8α 스톡 및 막관통 도메인, 및 41BB.ζ 신호전달 내부도메인에 연결된 14g2a scFv를 포함하는 GD2-CAR을 발현하는 T-세포와 분리되도록 처리하였다(도 20a). 14g2a-기반 GD2-CAR T-세포는 신경모세포종 환자를 치료하는 임상 시험에서 안전한 프로필을 보여주었고, 완전한 퇴행은 선택된 환자에서 성취되었지만 보다 높은 효능이 요망되고 있다. GD2-CAR 단독 또는 GD2-CAR 및 C7R (GD2-CAR.C7R)을 함유하는 바이시스트론 작제물을 발현하는 T-세포를 비교하는데 있어서, C7R은 GD2-CAR T-세포의 기억 서브세트 조성 또는 CD4/CD8 퍼센트에서 유의적 차이를 유도하지 않았다(도 16b-16d). C7R은 LAN-1 종양으로 자극 후 GD2-CAR T-세포에서 IFN-γ 및 TNF-α의 분비를 증가시켰고(도15a), 이것은 4시간 세포독성 검정 동안에 T-세포 사멸의 효능에서 임의의 증가와 관련되어 있지 않다(도15b). 그러나, GD2-CAR.C7R T-세포는 시험관내 연속 동시-배양 사멸검정에서 종양으로 반복적인 챌린지 후 세포독성 및 확장을 유지하는 능력이 측정되는 경우 GD2-CAR T-세포를 유의적으로 능가하였다(도15c). GD2-CAR T-세포는 3번째 챌리지 시 실패하였고 확장하고 종양 세포를 제거하는 능력 둘 다를 상실하였다(도 15d,15e). 대조적으로, C7R을 발현하는 GD2-CAR T-세포는 모든 3개의 연속 종양 챌린지에 응답하였다. 증가된 증식 대 감소된 아폽토시스의 GD2-CAR.C7R T-세포의 개선된 세포 확장으로의 상대적 기여를 결정하기 위해, 세포 추적 바이올렛 표지화를 제1 동시-배양후 사용하였다. 종양 세포를 사용한 후속적-재자극시, GD2-CAR.C7R T-세포는 GD2-CAR만을 발현하는 T-세포 보다 큰 세포 분열을 보여주었다(도 15f,15g). C7R이 또한 T-세포 아폽토시스를 감소시키는지를 평가하기 위해, 어넥신(Annexin) V 및 7-AAD 염색을 2차 종양 재자극 후 사용하였다. 유동 세포측정 분석은 GD2-CAR.C7R T-세포와 비교하여 어넥신 V(+)/7-AAD(+) GD2-CAR T-세포의 보다 큰 집단을 보여었고(도15h), 이는 연속적 종양 챌린지에도 불구하고 C7R에 의해 생성되는 증가된 생존력을 입증한다. 이들 결과에 대한 분자적 기반을 추가로 이해하기 위해, 나노스트링 기술을 사용하여 2차 종양 재자극 후 GD2-CAR 및 GD2-CAR.C7R T 세포의 유전자 발현 분석을 수행하였다(도 15i 및 도 22). IL-7의 항-아폽토시스 효과를 매개하는 BCL2는 GD2-CAR T-세포에서 C7R에 의해 상향조절되는 상위 유전자들 중 하나였다. 세포용해 그랜자임 A (GZMA)의 상향조절, 및 세포 아폽토시스 및 활성화 유도된 세포사 (AICD)에 관여하는 아폽토시스 촉진 FAS 및 카스파제 8 (CASP8)의 하향조절이 있다(문헌참조: Krammer, 2007). 따라서, C7R은 종양 세포와의 연속적 접촉 동안에 이들의 수행능을 증진시키기 위해 GD2-CAR T-세포의 증식 및 생존 둘 다를 증강시킨다.
CAR T-세포에서 C7R 동시-발현은 이종이식체 종양 모델에 대한 이들의 항-종양 활성을 증진시킨다
이종이식체 모델에서 전이성 신경모세포종을 퇴치시키는 C7R-증진된 GD2-CAR T-세포의 능력을 시험하였다. 신경모세포종 세포는 반딧불이 루시퍼라제 (CHLA-255 FFluc)를 발현하도록 변형된 다중약물-내성 MYC-N 비-증폭된 신경모세포종 세포주 CHLA-255의 정맥내 주사에 의해 비비만 당뇨병 (NOD) 중증/조합된 면역결핍 (SCID) IL-2rγ-/- (NSG) 마우스에 접목시켰다(문헌참조: Hecczey, 2014, Blood. 2014 Oct 30;124(18):2824-33). 종양 접목 1주 후 저용량의 GD2-CAR T-세포를 사용한 처리는 부적절한 CAR을 발현하는 T-세포로 처리된 대조군 마우스와 비교하여 1주까지 메디안 생존을 증가시켰다. 절단된 내부도메인과 함께 C7R 및 비기능성 GD2-CAR(GD2-CARΔ.C7R)을 발현하는 T 세포를 투여받은 마우스는 대조군 마우스와 동일한 생존을 가졌다. (도 16a,16b). 대조적으로, 질환은 GD2-CAR.C7R T-세포가 주입된 마우스에서 제거되었다. CHLA-255 세포 보다는 차라리 T-세포가 GFP-FFluc 형질도입된 병행 실험에서, 주입된 제한된 용량으로는 GD2-CAR T-세포의 확장이 없었지만 광범위 신경모세포종 전이 부위인 간에서 T-세포 신호의 축적과 함께 GD2-CAR.C7R T-세포의 강한 확장이 나타났다(도16c,16d). 이들 결과는 GD2-CAR T-세포가 생체내 종양에 대해 지속할 수 없는 반면 C7R을 발현하는 GD2-CAR T-세포는 증식하고 생존하여 전이성 종양 제거를 매개할 수 있음을 입증하였다.
C7R이 다른 CAR-T 세포의 수행능을 증강시킬 수 있는지를 조사하기 위해, 분자는 신경모세포종을 처리하기 위해 의도된 EphA2-CAR과 동시 발현시켰다. GFP=FFluc로 유전학적으로 변형된 U373 신경모세포종 세포는 SCID 마우스에 두개내로 주사하였다. 7일 후, 104 EphA2-CAR T-세포를, 이전의 경험을 기준으로 신경교종이 퇴치될 수 없는 세포 용량으로 종양내로 투여하였다. 신경모세포종 생발광은 C7R 및 비-기능성 EphA2-CAR (EphaA2-CARΔ.C7R)을 동시-발현하는 대조군 T-세포로 처리된 마우스에서 신속하게 증가하였고, 항-종양 대조군에서의 어떠한 유의적 개선이 EphA2-CAR T-세포를 투여받은 마우스에서 나타나지 않았다(도 16e,16f). 대조적으로, 종양은 세포들이 C7R (EphA2-CAR.C7R)을 동시 발현하는 경우의 낮은 "스트레스" 용량의 EphA2-CAR T-세포들이 주입된 마우스에서 완전히 퇴치되었고 이들 마우스는 실험 결론에서 질환 부재인 채로 남아있다. 실험이 GFPFFluc가 또한 형질도입된 EphA2-CAR T-세포를 사용하여 반복되는 경우, CAR 단독을 발현하는 T-세포로부터의 생발광 신호는 주입 후 4 내지 6일째에 크게 소멸되었다. 대조적으로, EphA2-CAR.C7R T-세포는 (두개외) 신경모세포종 모델에서 관찰된 상당히 큰 확장이 부재였고, 보다 큰 T-세포 지속성에 대한 경향이 있었고, 이는 EphA2-CAR과 EphA2-CAR.C7R T-세포 간의 곡선 이하 면적 (AUC) 비교에 의해 결정된다(도 21).
GD2-CAR.C7R T-세포는 종양 제거 후 iC9를 사용하여 효율적으로 제거될 수 있다
추가의 안전성 대책으로서, 그러나, 선택적으로 T-세포를 제거할 수 있는 임상적으로 확증된 유도성 카스파제 9 (iC9) 자살 유전자(문헌참조: Di Stasi, et al., 2011)를 동시 발현하는 세포를 생성시켰다. iC9 및 GD2-CAR.C7R를 사용한 이중 형질도입 후, T-세포는 iC9 신호전달에 민감한 상태로 남아있고 이량체화 AP20187 (CID)의 화학적 유도제에 노출 24시간 이내 시험관내 아폽토시스를 진행하였다(도 17a). iC9이 종양 퇴행 후 생체내 GD2-CAR.C7R T-세포를 효율적으로 제거할 수 있는 경우 고려되었다. T-세포 활성 및 종양 성장을 동시에 평가하기 위해, 피하 LAN-1 신경모세포종 모델을 사용하였다. 종양 세포는 NSG 마우스의 좌측 등축 옆구리에 주사하고 8일 후 단독 또는 iC9과 함께 이중으로 형질도입된 1x106 GD2-CAR.C7R T-세포를 정맥내 주사하였다. 대조군 마우스에 GD2-CARΔ.C7R T-세포를 투여하였다. 모든 T-세포에 생체내 가시화를 위해 GFP-FFluc를 동시 형질도입하였다. 3주 후, LAN-1 종양은 대조군 마우스에서 과성장하였고 마우스는 안락사시켰다. GD2-CAR.C7R T-세포 및 iC9 벡터를 동시발현하는 T-세포는 GD2-CAR.C7R T-세포 단독과 유사한 항-종양 효능 및 생체내 확장을 입증하였다(도 17b,17c). 면역치료요법 후 독성을 제어하기 위해 요구되는 T-세포 제거를 모델링하기 위해, 3개 용량의 CID를 동일한 실험적 접근법 내에서 T-세포 주입 후 28일째에 개시하여 마우스에 투여하였다. CID 투여 직 후 T-세포 생발광 신호의 상실(평균 93%)이 있었고(도 17d) 신호는 종양 재발 없이 2주 후 기준선에서 유지되었고, 이 시점에서 실험을 종결하였다. 이들 결과는 C7R을 동시 발현하는 CAR-T 세포가 효능에 해로움을 주지 않고 효과적인 T-세포 제거를 허용하면서 경우에 따라 iC9과 함께 사용될 수 있음을 확인시켜 주었다.
34.IL7RP2-형질도입된 EBV-특이적 T-세포를 사용한 LCL 종양 처리는 항-종양 효능을 보여준다. LCL 종양은 암컷 NSG 마우스의 등축 좌측 옆구리로 피하 주사하였다. 8일 후, GFP-반딧불이-루시퍼라제 (GFP-Ffluc)를 동시 발현하는 5x106 EBV-특이적 T-세포 (EBVST) 또는 34.IL7RP2-형질도입된 EBVST (34.IL7RP2-EBVST)는 정맥내 주입하였다. PBS는 대조군으로서 종양 함유 마우스에 주사하였다. 도 23a에서, 마우스에서 루시페라제 신호의 이미지화는 34.IL7RP2-EBVST가 EBVST 단독에 비해 종양 부위에서 지속성을 지연시킴을 밝힌다. 또한, 도 23b에서, 종양 성장의 측정은 34.IL7RP2 EBVST가 EBVST 단독에 비해 월등한 항-종양 효능을 가짐을 보여준다.
특정 구현예의 유의성
상기 결과는 T-세포 활성화에서 신호 3이 고형 종양에 대한 CAR T-세포의 활성의 지속성을 상당히 개선시키고 항상성 활성 IL-7 수용체가 입양 면역치료요법의 증진을 위해 신호 3을 제공하기 위해 사용될 수 있음을 입증한다. T-세포가 또한 고형 악성종양과 접하게 되는 반복적인 항원 노출의 스트레스하에, C7R을 동시 발현하는 GD2-CAR T-세포만이 다중 라운드의 확장을 진행하고 항-종양 활성을 보유할 수 있다. C7R-증진된 CAR T-세포의 우수성은 생체내 2개의 상이한 CAR 및 종양 모델에 대해 나타났고, 여기서, 비유효량으로 투여된 기능성 CAR-T-세포가 C7R과 조합되는 경우 확립된 종양을 퇴치하는 능력을 지속할 수 있다.
유전자 발현 분석은 반복적인 종양 세포 챌린지 동안에 GD2-CAR T-세포의 C7R-촉진된 생존이 BCL2 전사의 증가 및 FAS 및 CASP8의 감소된 발현과 상호관련됨을 밝혔다. 이것은 C7R이 CAR T-세포 내에서 광범위 항-아폽토시스 영향을 발휘하여 ACID에 대한 이들의 민감성을 감소시킴을 시사한다. C7R로부터 다른 잠재적 이득은 GD2-CAR T-세포 단독에 비해 GD2-CAR.C7R T-세포에서 TGF-βRII의 하향 조절이 있기 때문에 종양 미세환경 (Pickup, 2013)에서 TGF-β와 같은 면역억제제에 대한 내성을 포함한다(도 22).
특정 구현예에서, C7R은 C7R이 CAR T-세포에 의한 항원-구동된 사이토킨 분비를 단지 온건하게 증진시킨다는 관찰을 토대로 사이토킨 방출 증후군의 심각성을 유의적으로 증가시키지 않는다. 추가로, C7R이 본원 발명의 정위 신경모세포종 모델에서 실질적으로 확장을 증가시키는 것 없이 EphA2-CAR T-세포를 기능적으로 증진시킨다는 관찰과 함께, 심실내 IL-13Rα2 CAR T-세포 주입(Brown, 2016)으로 성공적으로 치료받은 신경모세포종 환자에서 나타난 낮은 독성은 또한 CAR T-세포 및 C7R 조합 전략이 신경모세포종 치료를 위해 사용되는 경우 부작용에 대한 낮은 위험을 시사한다. C7R이 항원-독립적 증식을 유도할 수 있다는 증거는 없지만, NSG 모델은 생체내 사람 T-세포의 장기 운명을 평가하기 위해서는 명백한 한계를 갖는다. 그러나, 2가지 문제에 대한 부가된 보호로서, 이량체화할 수 있는 iC9-매개된 안전성 스위치의 내포가 C7R을 발현하는 CAR T-세포의 제거를 가능하게 한다.
C7R이 전이성 신경모세포종 및 정위 신경모세포종에 대해 GD2-CAR T-세포 및 EphA2-CAR T-세포에 효과적으로 적용되는 경우, C7R 분자 (단지 예로서)는 많은 다른 CAR T-세포를 증진시키기 위해 유용하다. 특정 구현예에서, 상기 동일한 접근법은 NK 및 NK T-세포의 성질을 활용하는 것들 뿐만 아니라(Pellegrini, 2009) 본래의 (Dudley, 2008) 또는 전이유전자 TCR (Obenaus, 2015)의 특이성을 기준으로 하는 것들을 포함하는 암에 대한 입양 세포 치료요법의 항-종양 활성을 증가시키고, 단, 모두가 IL-7 보충에 응답해야 한다.
재료 및 방법의 예
레트로바이러스 벡터의 생성
pSFG.ΔCD34-IL7R* (pSFG.C7R): 염기쌍 731과 732(IL7R*) 사이에 TTGTCCCAC가 삽입된 돌연변이체 IL-7Rα를 암호화하는 cDNA(문헌참조: Zenatti et al., Nat Genet. 2011;43:932-9)를 합성하였다(문헌참조: Genscript, Piscataway, NJ). pSFG.C7R은 XhoI 및 MluI-분해된 SFG 벡터 골격, IL7R* cDNA, 및 CD34의 전체 세포외 도메인(ΔCD34)을 사용한 인-퓨전(IN-Fusion) (Takara, Mountainview, CA) 클로닝에 의해 생성하였다.
pSFG.GD2-CAR, pSFG.GD2-CAR-2A-C7R (GD2-CAR.C7R), 및 pSFG.GD2Δ-CAR-2A-C7R (GD2-CARΔ.C7R): n-말단 리더 펩타이드, GD2-특이적 14g2a 단일쇄 가변 단편 (scFv), CD8 스탈크(stalk) 및 막관통 도메인, 및 41BB.ζ 내부도메인을 암호화하는 cDNA를 합성하고(문헌참조: Biobasic, Marham, ON, Canada) 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 및 절단된 (NGFR)의 업스트림에 SFG 레트로바이러스 벡터로의 인-퓨전 (Takara) 클로닝에 의해 클로닝하였다. pSFG.GD2-CAR-2A-C7R에 대해, GD2-CAR은 2A 서열 및 C7R 업스트림의 SFG 벡터에 서브클로닝하였다. pSFG.GD2Δ-CAR-2A-C7R에 대해, 2A-C7R은 연구실에서 가용한, 14g2a scFv, 짧은 IgG1 외부도메인 스페이서, CD28 막관통 도메인 및 절단된 CD28 내부도메인(RSKRSRLL; 서열번호 26)으로 이루어진 비-기능성 GD2-CAR의 다운스트림에 클로닝하였다.
pSFG.EphA2-CAR-2A-CD19t (EphA2-CAR), pSFG.EphA2-CAR-2A-C7R (EphA2-CAR.C7R), 및 pSFG.EphA2-CARΔ-2A-C7R (EphA2-CARΔ.C7R): pSFG.EphA2-CAR-2A-CD19t는 EphA2-특이적 4H5 scFv (ref 25), CD8 세포외 스페이서, CD8 막관통 도메인, 41BB.ζ 내부도메인, 2A 서열, 및 절단된 CD19 분자(CD19t)로 이루어진 EphA2-특이적 CAR을 암호화한다. pSFG.EphA2-CAR-2A-C7R은 2A-CD19t를 2A-C7R로 대체하는 인-퓨전 (Takara) 클로닝에 의해 생성하였다. pSFG.EphA2-CARΔ-2A-C7R을 위해, 2A-C7R은 외부 상에 EphA2-특이적 4H5 scFv, CD8 세포외 스페이서, CD8 막관통 도메인 및 절단된 내부도메인으로 이루어진 비-기능성 EphA2-CAR의 다운스트림에 클로닝하였다.
pSFG.iC9-2A-CD19t: 이전에 다른 곳에 기재된 바와 같이 벡터를 생성하였다(문헌참조: Di Stasi, 2011).
모든 제한 효소는 제조원(New England Biolabs (Ipswich, MA))으로부터 구입하였고 모든 클로닝된 작제물의 서열은 Seqwright (Houston, TX)에 의해 확인하였다.
T-세포 생성
건강한 공여자로부터 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)는 헬싱키 선언문에 따라 수득된 서면 동의서와 함께 베일러 칼리지(Baylor College)의 의약 IRB-승인된 프로토콜 하에 수득하였다. CD4 및 CD8 T-세포가 개별적으로 평가되는 경우, PBMC는 CD4 또는 CD8 자기 선택 비드(Miltenyi, Auburn, CA)로 표지시키고 제조업자의 지침에 따라 양성으로 선택하였다. 0일째 T-세포 활성화에 대해, 벌크 또는 선택된 T-세포는 90% RPMI 1640(Hyclone, Logan, UT), 10% 태아 소 혈청(Hyclone), 및 1% 글루타맥스(Glutamax) (Gibco, Grand Island, NY)로 이루어진 완전 배지에서 현탁시키고 활성화를 위해 OKT3 (CRL-8001, American Type Culture Collection [ATCC], Manassas, VA) 및 CD28 항체 (BD Biosciences, San Jose, CA)로 코팅된 웰에서 배양하였다. IL-15 및 IL-7 (Peprotech, Rocky Hill, NJ)은 활성화 후 1일째에 첨가하고, 세포는 2일째 레트로바이러스로 형질도입하였다. T-세포는 OKT3 및 CD28 활성화 후 9 내지 12일째에 개시되는 실험을 위해 사용하였다.
유동 세포측정
형광단-접합된 항체는 제조원(Biolegend) (San Diego, CA; CCR7, CD45RO, NGFR); (Abnova), (Taoyuan City, Taiwan; CD34); (Thermo Fisher) (Life Technologies, Frederick, MD; CD8); (eBioscience) (San Diego, CA; CD4); (Beckman Coulter) (Indianapolis, IN; CD3); (BD Biosciences)(CD8, CD4, CD3, CD34, Stat5 (pY694), Annexin V, 7-AAD)로부터 구입하였다. 표면 염색을 위해, 세포는 4도씨에서 15분 동안 항체로 항온처리하였다. 세포는 장치 (Beckman Coulter Galios (10,000 events))상에서 획득하고 분석은 Flowjo 10.0.7r2 (Tree Star, Ashland, OR)를 사용하여 수행하였다. 증식 분석은 Flowjo 9.3.2 (Tree Star)를 사용하여 수행하였다.
세포독성 검정
4-시간 루시퍼라제-기반 세포독성 검정은 최소 변형과 함께 이전에 기재된 프로토콜을 기준으로 하여 GFP-반딧불이 루시퍼라제(GFP-FFluc)를 발현하는 LAN-1 신경모세포종 세포주를 사용하여 수행하였다(문헌참조: Liu, 2013). 간략하게, 2x104 LAN-1 신경모세포종 세포는 96웰 검정 플레이트 (Corining, NY.) 내 웰당 플레이팅하였다. 24시간 후, CAR T-세포를 다양한 이펙터 대 표적 (E:T)의 비율로 첨가하였다. 웰 당 생존가능한 LAN-1 세포수는 LAN-1 세포의 연속 희석에 의해 생성된 표준 곡선을 사용하여 결정하였다. 퍼센트 세포독성을 계산하기 위해 사용되는 화학식은 다음과 같다: (비처리된 웰 중 세포 수 - 검정 웰에서 세포 수)/(비처리된 웰에서 세포 수).
연속 종양 챌린지 검정
GD2-CAR 또는 GD2-CAR.C7R이 형질도입된 0.5x106 LAN-1 세포 및 1x106 T-세포는 IL-15 및 IL-7 부재인 새로운 배양 배지를 사용하여 24웰 플레이트에서 동시 배양하였다. 7일 후, 세포는 FAC 분석을 위해 또는 트립판-블루 배제에 의한 T-세포의 정량을 위해 수거하였다. CAR T-세포는 이어서 새로운 세포 배양 배지 중에 2:1 E:T 비율로 새로운 LAN-1 세포와 함께 재플레이팅하여 2차 및 3차 종양 동시배양을 개시한다. 3차 동시 배양의 결론에서, T-세포를 계수하였고 동시 배양물은 FACS로 분석하였다.
정량적 유동 분석
항체-염색된 세포를 계수하기 위해, PBS 세척 후, 25 μL의 계수 비드(Life Technologies) 및 2 μL의 7-AAD를 첨가하였고 (죽은 세포를 배제하기 위해) 세포는 즉각적으로 분석하였다. 반응의 획득은 3000개 계수 비드의 수집물을 기반으로 하였다.
사이토킨 생성의 분석
GD2-CAR 또는 GD2-CAR.C7R을 발현하는 T-세포는 사이토킨 부재의 완전한 배양 배지 중 24-웰 플레이트에서 1:4의 E:T 비율로 LAN-1 세포와 배양하였다. IFN-γ 및 TNF-α 방출은 ELISA 키트를 사용하여 정량하였다(R&D Systems, Minneapolis, MN).
인산화된-STAT5 검정
형질도입된 T-세포는 수거하고 사이토킨 부재의 0.5x106 세포/mL의 완전한 배지 중에 재현탁시키고 이어서 48-웰 조직 배양된 플레이트에서 웰 당 0.5x106 세포로 분주하였다. 24 내지 72시간 후, 세포는 FAC 튜브에 수거하고 냉 유동 완충액 (5% FBS를 함유하는 PBS) 중에 세척하였다. 100 μL의 Fix & Perm 시약 A (Life Technologies)를 세포에 첨가하고, 약하게 볼텍싱하고 3 mL의 빙냉 메탄올을 일정한 볼텍싱과 함께 튜브에 느리게 첨가하기 전 실온에서 3분 동안 항온처리하였다. 이어서 튜브를 4도씨에서 10분 동안 항온처리하였다. 이후, 튜브를 원심분리하고 메탄올을 버리고 이어서 빙냉 유동 완충액으로 또 다른 세척 단계를 수행하였다. 100 μL의 Fix & Perm Reagent B (Life Technologies) 및 5 μL의 항-STAT5 항체를 이어서 세포에 첨가하였다. 세포를 약하게 볼텍싱함에 이어서 암실에서 30분 동안 항온처리하였다. 이후, 상기 세포를 냉 유동 완충액으로 1회 이상 세척하고 이어서 즉시 분석하였다.
세포 추적 바이올렛 증식 검정
LAN-1 종양 세포와의 단일 동시-배양 후, GD2-CAR T-세포 및 GD2-CAR.C7R T-세포는 제조업자의 지침에 따라 제조원 (Thermo Fisher)로부터 구입된 키트를 사용하여 세포 추적 바이올렛으로 표지시켰다. T-세포는 이어서 분석 전 1주 동안 종양 세포로 다시 챌린지하였다. 7-AAD는 죽은 세포를 배제하기 위해 첨가하였다.
아폽토시스 분석
세포는 어넥신 V 항체 및 7-AAD로 항온처리하고, 유동 세포측정에 의해 분석하였다. iC9와의 실험을 위해, 이량체화의 화학적 유도제(CID)인 AP20187은 제조원(Takara Clontech)으로부터 구입하였다.
세포주
LAN-1 및 U373은 ATCC로부터 구입하였고 이를 사용하여 LAN-1 GFP-FFluc 및 U373 GFP-FFluc를 생성하였다. CHLA-255 및 CHLA-255 FFluc를 확립하고 이전에 기재된 바와 같이 유지하였다(문헌참조: Liu, 2012, J Clin Invest. 2012 Jun 1; 122(6): 2221-223). 통상의 마이코플라스마 감시는 효소 기반 검정을 사용하여 수행하였고(Lonza, Rockland, ME) 세포는 기재된 실험의 1년 이내에 STR 프로파일링을 사용하여 확증하였다.
유전자 발현 분석
총 RNA는 퀴아졸(Qiazol) 시약 및 miRNeasy 마이크로 키트(Qiagen, Germantown, MD)를 사용하여 수거하였다. 유전자 발현 분석은 n계수기 분석 시스템을 사용하여 베일러 칼리지의 의약 게놈 및 RNA 프로파일링 코어에서 면역학 패널 버젼 2 (NanoString, Seattle, WA)를 사용하였다. 데이터는 nSolver 3.0 소프트웨어(NanoString)를 사용하여 분석하였다.
생체내 실험
모든 동물 실험은 베일러 칼리지의 의약 기관 동물 보호 및 사용 위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행하였다.
피하 신경모세포종 마우스 모델: 10-14주령 암컷 NSG 마우스에 등축 좌측 옆구리의 피하로 100 μL의 기저막 매트리겔(Matrigel) (Corning) 중에 2백만 LAN-1 신경모세포종 세포를 피하 이식하였다. 8일 후, 마우스는 종양 크기를 기준으로 나누어 그룹 종양 평균 및 변량이 유사하도록 하였다. 이들에게 이어서 1백만 GD2-CAR T-세포(PBMC 단리 후 10-12일째)를 정맥내 주사하였다. 종양 크기는 1주 2회 캘리퍼로 측정하고 마우스는 동일 시점에, 마우스 당 150 mg/kg의 D-루시페린(Xenogen)을 복막내 주사한지 10 내지 15분 후 IVIS® 시스템 (IVIS, Xenogen Corporation, Alameda, CA)을 사용하여 T 세포로부터의 생발광 신호에 대해 이미지화하였다. 종양 직경이 15 mm 이상이거나 종양이 마우스 체중의 10%를 초과하는 경우 마우스를 안락사시켰다.
전이성 신경모세포종 마우스 모델: 10-14주령 암컷 NSG 마우스에 1백만 반딧불이-루시퍼라제 발현 CHLA-255 세포 (CHLA-255 FFluc)를 정맥내 주사하였다. 7일 후, 마우스에게 1백만 GD2-CAR T-세포(PBMC 단리 후 10-12일째)를 정맥내 주사하였다. 병행 실험에서, 종양 성장 또는 T-세포 확장은 간접적으로 상기된 바와 같이 주당 생발광 이미지화에 의해 간접적으로 평가하였다. 종양 성장이 추적되는 실험에서, 마우스 그룹은 CHLA-255 FFluc 발광이 T-세포 주사 시점에 검출될 수 없기 때문에 종양 하중에 대해 표준화되지 않았다.
정위 신경모세포종 마우스 모델: 105 U373 교모세포종 세포는 이전에 기재된 바와 같이 8주령 수컷 ICR-SCID 마우스에서 두개 내에 확립하였다(문헌참조: Chow, 2013, Mol Ther. 2013 Mar; 21(3): 629-637). 종양 접목 7일 후, 104 T-세포는 종양으로 직접 두개내로 주사하였다. 종양 성장 또는 T-세포 확장은 상기된 바와 같이 주당 생발광 이미지화에 의해 평가하였다. 종양 성장 실험에서 마우스는 종양 하중에 대해 표준화시키고 변량에 대해서는 표준화시키지 않았다.
통계학적 분석
그래프 및 통계는 윈도우용 Prism 5.0 소프트웨어(Graphpad Software Inc., La Jolla, CA)를 사용하여 생성하였다. 측정 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로서 제공된다. 평균 값 간의 차이는 쌍 형성 2개-테일드 t-시험을 사용하여 시험하였다. 마우스 실험을 위해, 각각의 시점에서 기준선으로부터 종양 래디언스(Radiance)에서의 변화를 계산하였고 적절한 경우 투-테일드 쌍 형성 t-시험 또는 웰치(Welch's)의 t-시험을 사용하여 그룹 간에 비교하였다. 적절한 경우 동등한 변량에 대해 1-방식 ANOVA 및 바틀렛(Bartlett's)의 시험을 사용하여 유사한 종양 평균 및 변량을 보장하였다. 종양 세포 주사 시점으로부터 결정된 생존은 캐플란-마이어 (Kaplan-Meier) 방법에 의해 분석하였고 그룹 간의 생존 차이는 log-등급 시험에 의해 비교하였다.
<110> Shum, Thomas CTH Gottschalk, Stephen MG Omer, Bilal Rooney, Cliona M. <120> CONSTITUTIVELY ACTIVE CYTOKINE RECEPTORS FOR CELL THERAPY <130> BAYM.P0192WO-11707513 <150> 62/380,021 <151> 2016-08-26 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 1 Pro Ile Leu Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu 1 5 10 15 Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp 20 25 <210> 2 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 2 Pro Ile Leu Leu Thr Cys Pro Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser 1 5 10 15 Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp 20 25 <210> 3 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 3 Pro Ile Leu Asn Pro Cys Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser 1 5 10 15 Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp 20 25 <210> 4 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 4 Pro Thr Cys Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu 1 5 10 15 Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp 20 25 <210> 5 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 5 Pro Ser Ala Asn Cys Gly Ala Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val 1 5 10 15 Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp 20 25 <210> 6 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 6 Pro Ile Leu Leu Val Ser Cys Pro Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe 1 5 10 15 Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp 20 25 <210> 7 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 7 Pro Ile Leu Leu Ile Ile Ser Ile Gln Trp Leu Ser Phe Phe Ser Val 1 5 10 15 Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp 20 25 <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 8 Asn Ser Pro Ser Cys Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val 1 5 10 15 Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp 20 25 <210> 9 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 9 Pro Cys Leu Glu Gly Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val 1 5 10 15 Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp 20 25 <210> 10 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 10 Pro Ile Leu Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Trp Asn Leu Leu 1 5 10 15 Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp 20 <210> 11 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 11 Arg Phe Cys Pro His Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu 1 5 10 15 Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp 20 25 <210> 12 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 12 Ile Lys Cys Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu 1 5 10 15 Ala Cys Val Leu Trp 20 <210> 13 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 13 Pro Ile Phe His Pro Phe Asn Cys Gly Pro Ile Ser Ile Leu Ser Phe 1 5 10 15 Phe Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp 20 25 30 <210> 14 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 14 Pro Ile Leu Leu Met Cys Pro Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser 1 5 10 15 Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp 20 25 <210> 15 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 15 Pro Ile Leu Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Gly Pro Ser 1 5 10 15 Leu Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp 20 25 <210> 16 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 16 Pro Ile Leu Arg Leu Gly Cys Val Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe 1 5 10 15 Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp 20 25 <210> 17 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 17 Pro Ile Pro Gln Gly Gly Cys Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu 1 5 10 15 Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp 20 25 <210> 18 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 18 Leu Gln Ser Cys Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val Ile 1 5 10 15 Leu Ala Cys Val Leu Trp 20 <210> 19 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 19 Pro Ile Phe Pro His Gln His Cys Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe 1 5 10 15 Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp 20 25 <210> 20 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 20 Pro Ile Leu Leu Thr Ile Ser Lys Cys His Leu Ser Phe Phe Ser Val 1 5 10 15 Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp 20 25 <210> 21 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 21 Pro Ile Leu Leu Thr Cys His Leu Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser 1 5 10 15 Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp 20 25 <210> 22 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 22 Pro Ile Phe Ser Cys Gly Pro Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe 1 5 10 15 Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp 20 25 <210> 23 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 23 Pro Ile Leu Leu Pro Pro Cys Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe 1 5 10 15 Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp 20 25 <210> 24 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 24 Pro Ile Leu Leu Thr Pro Pro Val Cys Ser Val Thr Ile Ser Ile Leu 1 5 10 15 Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp 20 25 30 <210> 25 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 25 Leu Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val 1 5 10 15 Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp 20 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 26 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu 1 5

Claims (60)

  1. 가공된 사이토킨 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리펩타이드가
    a) 하나 이상의 사이토킨 수용체 내부도메인;
    b) 상기 수용체 폴리펩타이드의 동종이량체화를 촉진시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 막관통 도메인; 및
    c) 성분 a)에서 상응하는 하나 이상의 사이토킨 수용체 내부도메인에 대해 내인성 세포외 도메인이 아닌 하나 이상의 세포외 도메인으로서, 상기 세포외 도메인이 사이토킨 수용체로부터 유래하지 않은, 하나 이상의 세포외 도메인
    의 성분들을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  2. 제1항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포.
  3. 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 사이토킨 수용체 내부도메인이 상기 세포에서 STAT5 경로를 통한 신호전달을 유발하는, 세포.
  4. 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 사이토킨 수용체 내부도메인이 상기 세포에서 STAT3 경로를 통한 신호전달을 유발하는, 세포.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토킨 수용체 내부도메인이 IL-7 사이토킨 수용체 알파, IL-21 사이토킨 수용체 알파, CD122, IL-23 사이토킨 수용체 알파, IL-12 사이토킨 수용체 알파, 또는 이의 조합으로부터 유래하는, 세포.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 도메인이 자가-올리고머화하는, 세포.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 도메인이 성분 a)의 상기 하나 이상의 사이토킨 수용체 내부도메인의 내인성 막관통 도메인이거나 이의 자가-활성화 유도체인, 세포.
  8. 제7항에 있어서, 상기 자가-활성화 유도체가 상응하는 야생형 막관통 도메인과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 세포.
  9. 제8항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이가, 상기 수용체가 상기 막관통 도메인 및 내부도메인 성분들을 통해 동종이량체화될 수 있도록 하는, 세포.
  10. 제8항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이가, 상기 막관통 도메인 및 내부도메인이 구조적으로 트위스트될 수 있도록 하여 상기 내부도메인과 연합된 야누스(janus) 키나제가 교차 인산화 및 활성화를 허용하도록 배향되는, 세포.
  11. 제8항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이가, 상기 막관통 도메인 및 내부도메인이 구조적으로 나선형 방식으로 전체 트위스트될 수 있도록 하는, 세포.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 도메인이 상응하는 IL-7 사이토킨 수용체 알파 막관통 도메인과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 IL-7 사이토킨 수용체 알파 막관통 도메인인, 세포.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 도메인이 IL-7 사이토킨 수용체 알파로부터 유래하는 경우, 상기 돌연변이가 서열 PILLTISILSFFSVALLVILACVLW (서열번호 1)에 존재하는, 세포.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이가 적어도 하나의 시스테인을 상기 막관통 도메인으로 도입하는, 세포.
  15. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이가 프롤린을 상기 막관통 도메인으로 도입하는, 세포.
  16. 제6항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 도메인이 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 아미노산 길이인, 세포.
  17. 제2항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 도메인이 환형 형태(globular in form)인, 세포.
  18. 제2항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 도메인이 신호 전달 활성이 없는 데코이(decoy) 수용체인, 세포.
  19. 제18항에 있어서, 상기 데코이 수용체가 항상성-활성 사이토킨 수용체를 포함하고, 상기 세포외 도메인이 PD-1 또는 B7으로부터의 세포외 도메인이거나 이를 포함하는, 세포.
  20. 제2항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 도메인이 CD34의 세포외 도메인, 세포.
  21. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 도메인의 길이가 적어도 70개 아미노산인, 세포.
  22. 제2항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 도메인의 길이가 2000개 이하의 아미노산인, 세포.
  23. 제2항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 도메인의 길이가 70-2000개 아미노산, 100-1000개 아미노산, 500-2000개 아미노산, 50-500개 아미노산, 100-750개 아미노산, 200-2000개 아미노산, 또는 500-2000개 아미노산인, 세포.
  24. 제2항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 도메인이 PD-1, CD30, HER2, EGFR, CD19, CD34, TGF-베타 수용체, IL-4 수용체, IL-13 수용체 알파1 및 알파 2, IL-8 수용체, IL-10 수용체, LAG3, TIGIT, CTLA4, FAS, CD19, CD27, CD28, CD52, CD134, CD137, HER2, EGFR, 또는 NGFR로부터 유래하는, 세포.
  25. 제2항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 면역 세포인, 세포.
  26. 제2항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 T-세포, NK 세포, NK T-세포, αβ 세포, γδ T-세포, 점막 관련 불변 T-세포 (MAIT T-세포), 선천성 림프구 세포, 줄기 세포 또는 선조체 세포인, 세포.
  27. 제2항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 세포에 대한 항원 특이성을 부여하는 비-천연 분자를 포함하는, 세포.
  28. 제2항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 적어도 하나의 추가의 가공된 수용체를 추가로 포함하는, 세포.
  29. 제28항에 있어서, 상기 추가로 가공된 수용체가 항상성 활성 사이토킨 수용체, 키메라 항원 수용체, 재조합 T-세포 수용체, 이특이적 T-세포 인게이져(engager) (BiTE 또는 T-세포 ENG), 이원-친화성 재-표적화 (DART) 단백질 또는 이의 조합인, 세포.
  30. 제2항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 적어도 하나의 키메라 항원 수용체를 포함하는 T-세포인, 세포.
  31. 제2항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 발현 벡터로서 추가로 한정되는, 세포.
  32. 제32항에 있어서, 상기 발현 벡터가 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터인, 세포.
  33. 제33항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스 벡터인, 세포.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 도메인이 서열번호 2 내지 서열번호 24로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는, 세포.
  35. 제2항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포들이 하나 이상의 T-세포, NK 세포, NK T-세포, αβ T-세포, γδ T-세포, 점막 관련 불변 T-세포 (MAIT T-세포), 선천성 림프구 세포, 줄기 세포, 선조체 세포 또는 면역 이펙터 세포의 혼합물을 포함하는, 복수의 세포.
  36. 제2항 내지 제34항 중 어느 한 항의 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 단계를 포함하는, 세포 집단을 확장시키는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 세포가 시험관내에 있는, 방법.
  38. 제36항에 있어서, 상기 세포가 생체내에 있는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 세포가 포유동물의 생체내에 있는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 포유동물이 사람인, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 세포외 도메인에 결합 시, 파괴를 위해 상기 세포를 표적화하는, 유효량의 세포외 도메인의 하나 이상의 저해제가 상기 사람에게 제공되는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 저해제가 하나 이상의 항체인, 방법.
  43. 제35항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사람이 치료요법을 필요로 하고 치료학적 유효량의 세포가 상기 사람에게 제공되는, 방법.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사람이 암, 감염성 질환, 자가면역 질환, 면역결핍을 갖거나 고체-기관 이식 또는 줄기 세포 이식 전 또는 후인, 방법.
  45. 가공된 사이토킨 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리펩타이드가
    a) 하나 이상의 사이토킨 수용체 내부도메인;
    b) 상기 수용체 폴리펩타이드의 동종이량체화를 촉진시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 막관통 도메인; 및
    c) 성분 a)에서 상응하는 하나 이상의 사이토킨 수용체 내부도메인에 대해 내인성 세포외 도메인이 아닌 하나 이상의 세포외 도메인으로서, 상기 세포외 도메인이 사이토킨 수용체로부터 유래하지 않고, 상기 세포외 도메인이 신호 전달 활성이 없는 데코이 수용체인, 하나 이상의 세포외 도메인을 포함하고,
    여기서, 상기 막관통 도메인이 서열번호 2 내지 서열번호 24로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  46. 제45항에 있어서, 상기 세포외 도메인이 PD-1 또는 B7으로부터의 세포외 도메인이거나 이를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  47. 제45항 또는 제46항의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드.
  48. 제45항 또는 제46항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포.
  49. 개체에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 암이 종양 항원을 발현하고, 상기 방법이 (1) 상기 종양 항원을 표적화하는 키메라 항원 수용체; 및 (2) 항상성-활성 사이토킨 수용체를 발현하는 면역 세포를 상기 개체에게 투여함을 포함하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 항상성-활성 사이토킨 수용체가 상기 사이토킨 수용체의 동종이량체화를 촉진시켜 상기 사이토킨 수용체가 항상성 활성이도록 하는, 인터류킨-7 (IL-7) 수용체 내부도메인 및 막관통 도메인을 포함하는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 막관통 도메인이 서열번호 1 내지 24 중 임의의 서열을 포함하는, 방법.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항상성-활성 사이토킨 수용체가, 동족체 사이토킨이 상기 세포외 도메인에 결합하는 경우 신호를 전달지 않는 세포외 도메인을 포함하는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 항상성-활성 사이토킨 수용체가 IL-7 수용체 내부도메인을 포함하고 상기 동족체 사이토킨이 IL-7인, 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 세포외 도메인이 CD34로부터의 세포외 도메인, 방법.
  55. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 세포외 도메인이 PD-1 또는 B7으로부터의 세포외 도메인인, 방법
  56. 제49항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 교모세포종인, 방법.
  57. 제49항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 항원이 GD2인, 방법.
  58. 제49항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 항원이 EphA2인, 방법.
  59. 제49항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 항원이 EphA3, HER2 (ERBB2), GD2, Glypican-3, 5T4, 8H9, αvβ6 인테그린, B 세포 성숙화 항원 (BCMA) B7-H3, B7-H6, CAIX, CA9, CD19, CD20, CD22, 카파 경쇄, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD96, CD123, CD138, CD171, CEA, CLL-1, CSPG4, EGFR, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, ERBB3, ERBB4, ErbB3/4, FAP, FAR, FBP, 태아 AchR, 폴레이트 수용체 α, GD2, GD3, HLA-AI MAGE A1, HLA-A2, IL13Ra2, KDR, 람다, Lewis-Y, MCSP, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSC1, ROR1, Sp17, TAG72, TEM8, Tn-O-글리코펩타이드, VEGFR2, 암배아 항원, HMW-MAA, VEGF 수용체, TSHR, CS-1, CMA, Tn Ag, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), FLT3, CD44v6, KIT, 인터류킨-11 수용체 a (IL-11Ra), PRSS21, VEGFR2, CD24, 혈소판-유래된 성장 인자 수용체- 베타 (PDGFR-베타), SSEA-4, ERBB2 (Her2/neu), 프로스타제, PAP, ELF2M, Ephrin B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gplOO, bcr-abl, 티로시나제, EphA2, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, o-아세틸-GD2, 폴레이트 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, LAGE-la, MAGE-Al, 레구마인, HPV E6, E7, MAGE Al, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 프로스테인, 수르비빈 및 텔로머라제, PCTA-1/갈렉틴 8, 멜란A/MARTl, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전좌 중지점, ML-IAP, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 B l, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B 1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES 1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 사람 텔로머라제 역전사 효소, RUl, RU2, 장 카복실 에스테라제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, 또는 lGLL1인, 방법.
  60. 제49항 내지 제55항 또는 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 유방암, 전립선암, 폐암, 뇌암, 결장암, 두경부암, 피부암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경관암, 신장암, 폐암, 위암, 소장암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 식도암, 침샘암 또는 갑상선암인, 방법.
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