CN113383071A - 用于t细胞工程化的组合物和方法 - Google Patents

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金涛
杨春辉
施中东
刘丽萍
孙静
邱淑怡
曹卫
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Suzhou Genxi Biotechnology Co ltd
Genxi Biotechnology Shanghai Co ltd
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Suzhou Genxi Biotechnology Co ltd
Genxi Biotechnology Shanghai Co ltd
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Abstract

本公开涉及工程化免疫细胞及其用途。本公开提供了包含CAR或工程化TCR的工程化免疫细胞，该CAR或工程化TCR可包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域。当将本公开的工程化免疫细胞施用于受试者时，其可以抑制宿主免疫细胞例如T细胞和/或NK细胞，并增强工程化免疫细胞在体内的存活和持久性，从而表现出更有效的肿瘤杀死活性。

Description

用于T细胞工程化的组合物和方法
交叉引用
本申请要求2018年11月1日提交的中国专利申请号201811297174.3；2018年12月14日提交的中国专利申请号201811535338.1；2018年12月18日提交的中国专利申请号201811549651.0；2019年6月6日提交的中国专利申请号201910492882.0；以及2019年8月20日提交的PCT申请号PCT/CN2019/101651的优先权，其每一个通过引用全部并入本文。
背景技术
通过基因修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)来产生肿瘤特异性T淋巴细胞作为产生强大抗肿瘤作用的合成生物学形式正在受到关注。由于特异性是由抗体片段赋予的，因此CAR-T细胞不受MHC限制，因此比基于需要MHC匹配的T细胞受体的方法更实用。
尽管在癌症治疗中获得的早期CAR-T细胞临床数据已显示出有前景的成果，但对患者的风险更高，即使TCR或CAR重定向后，一些患者的T细胞仍然有效。治疗也不是足够有效，其促进了同种异体供体T细胞的修饰。然而，输注的同种异体T细胞上的内源性αβT细胞受体可以识别受体中的原发性和继发性组织相容性抗原，这导致移植物抗宿主病(GVHD)。结果，使用自体CAR-T细胞输注的大多数当前临床试验依赖于免疫耐受以防止过继细胞转移后TCR介导的正常组织的有害识别。这种方法已经取得了早期的临床成功，但是受到制造患者特异性T细胞产物的时间和费用的限制。
发明内容
本文认识到需要用于基因修饰免疫细胞(例如，T细胞)进行同种异体细胞疗法的组合物和方法。本文还认识到需要修饰免疫细胞(例如，T细胞)同时节省制造患者特异性T细胞产物的时间和费用的方法。
在一个方面，本公开提供了一种工程化免疫细胞，其包含：嵌合多肽，该嵌合多肽包含(i)能够增强工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分，和(ii)在嵌合多肽与细胞死亡激活剂接触时能够实现工程化免疫细胞的死亡的诱导型细胞死亡部分，其中增强子部分与诱导型细胞死亡部分连接，以及一种或多种嵌合多肽受体(CPR)，该一种或多种CPR包含结合部分，其中结合部分包含(i)第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域在施用于受试者时抑制或减少受试者对工程化免疫细胞的免疫应答，和(ii)能够结合至疾病相关抗原的第二抗原结合结构域，其中一种或多种CPR中的单个CPR包含(i)第一抗原结合结构域，(ii)第二抗原结合结构域，或(iii)第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域两者，其中一种或多种CPR中的每个CPR还包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CPR是一种或多种嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域结合至免疫细胞抗原。在一些实施方案中，将编码工程化免疫细胞的内源性表面标志物的基因被灭活(例如，沉默或敲除)，其中所述内源性表面标志物在表达时能够结合至第一抗原结合结构域。在一些实施方案中，工程化免疫细胞的内源性T细胞受体(TCR)被灭活。在一些实施方案中，工程化免疫细胞的内源TCR的功能被抑制剂抑制。在一些实施方案中，编码内源性TCR的亚基的基因被灭活，使得内源性TCR灭活。在一些实施方案中，编码亚基的基因是TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ或CD3ζ。在一些实施方案中，嵌合多肽不包含侧接增强子部分和诱导型细胞死亡部分的任何自切割肽。在一些实施方案中，增强子部分被配置为组成性地增强工程化免疫细胞的一种或多种活性。在一些实施方案中，增强子部分被配置为组成性地上调工程化免疫细胞的一种或多种细胞内信号传导通路。在一些实施方案中，一种或多种细胞内信号传导通路是一种或多种细胞因子信号传导通路。在一些实施方案中，增强子部分通过自寡聚化而自激活。在一些实施方案中，增强子部分通过自二聚化而自激活。在一些实施方案中，嵌合多肽是分泌型蛋白。在一些实施方案中，嵌合多肽是细胞内蛋白。在一些实施方案中，嵌合多肽是跨膜蛋白。在一些实施方案中，增强子部分或诱导型细胞死亡部分包含在跨膜蛋白的胞外域中。在一些实施方案中，增强子部分或诱导型细胞死亡部分包含在跨膜蛋白的胞内域中。在一些实施方案中，(i)增强子部分包含在跨膜蛋白的胞内域中，并且(ii)诱导型细胞死亡部分包含在跨膜蛋白的胞外域中。在一些实施方案中，(i)增强子部分包含在跨膜蛋白的胞外域中，并且(ii)诱导型细胞死亡部分包含在跨膜蛋白的胞内域中。在一些实施方案中，增强子部分是细胞因子或细胞因子受体。在一些实施方案中，增强子部分选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19，TGFRβ、同样的受体、其功能片段、其功能变体及其组合。在一些实施方案中，增强子部分用作反式激活因子或顺式激活因子。在一些实施方案中，诱导型细胞死亡部分选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8、Her2t、CD30、BCMA和EGFRt。在一些实施方案中，诱导型细胞死亡部分是EGFRt，并且细胞死亡激活剂是结合EGFRt的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，诱导型细胞死亡部分是HSV-TK，并且细胞死亡激活剂是GCV。在一些实施方案中，诱导型细胞死亡部分是iCasp9，并且细胞死亡激活剂是AP1903。在一些实施方案中，细胞死亡激活剂包含核酸、多核苷酸、氨基酸、多肽、脂质、碳水化合物、小分子、酶、核糖体、蛋白酶体、其变体或任何它们的组合。在一些实施方案中，一种或多种CPR的单个CPR包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域两者。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域通过接头连接。在一些实施方案中，接头不包含自切割肽。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域或第二抗原结合是scFv。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域从氨基末端到羧基末端排列为：(i)VL2-VH1-VL1-VH2；(ii)VH2-VL1-VH1-VL2；(iii)VL1-VH2-VL2-VH1；(iv)VH1-VL2-VH2-VL1；(v)VL2-VL1-VH1-VH2；(vi)VH2-VH1-VL1-VL2；(vii)VL1-VL2-VH2-VH1；或(viii)VH1-VH2-VL2-VL1；其中VH1是第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是第一抗原结合结构域的轻链可变结构域，VH2是第二抗原结合结构域的重链可变结构域，且VL2是第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域从氨基末端到羧基末端排列为：(i)VL2-VH2-VL1-VH1；(ii)VL2-VH2-VH1-VL1；(iii)VL1-VH1-VL2-VH2；(iv)VL1-VH1-VH2-VL2；(v)VH2-VL2-VL1-VH1；(vi)VH2-VL2-VH1-VL1；(vii)VH1-VL1-VL2-VH2；或(viii)VH1-VL1-VH2-VL2，其中VH1是第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是第一抗原结合结构域的轻链可变结构域，VH2是第二抗原结合结构域的重链可变结构域，且VL2是第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域结合至免疫细胞抗原和疾病相关抗原。在一些实施方案中，一种或多种CPR的单个CPR仅包含第一抗原结合结构域，并且一种或多种CPR的另外的单个CPR仅包含第二抗原结合结构域。在一些实施方案中，免疫细胞抗原是免疫细胞的表面蛋白或分泌型蛋白。在一些实施方案中，免疫细胞是NK细胞、T细胞、单核细胞、先天淋巴细胞、巨噬细胞或粒细胞。在一些实施方案中，免疫细胞获自外周血、脐带血或源自于干细胞。在一些实施方案中，免疫细胞抗原选自：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ和SLAMF7。在一些实施方案中，疾病相关抗原是肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原是CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白(Frizzled)、OX40、Notch-1-4、APRIL、CS1、MAGE3、密封蛋白18.2(Claudin 18.2)、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R或TROP-2。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域结合至免疫细胞抗原，该免疫细胞抗原选自：CD2、CD3、CD5、CD7和CD137，并且第二抗原结合结构域结合至CD19。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域结合至CD3，并且第二抗原结合结构域结合至CD19。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域结合至CD3，并且第二抗原结合结构域结合至CD19。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域结合至CD137，并且第二抗原结合结构域结合至CD19。在一些实施方案中，工程化免疫细胞的一种或多种内源性人白细胞抗原(HLA)基因的表达保持完整。在一些实施方案中，工程化免疫细胞的内源性HLA-1和/或HLA-II基因的表达保持完整。在一些实施方案中，工程化免疫细胞的内源性HLA-E和/或HLA-G和/或HLA-C基因的表达保持完整。在一些实施方案中，工程化免疫细胞的一种或多种内源性HLA基因的表达被上调。在一些实施方案中，工程化免疫细胞的内源性HLA-E和/或HLA-G和/或HLA-C基因的表达被上调。在一些实施方案中，工程化免疫细胞的内源性HLA-I、内源性HLA-II或两者的表达被抑制。在一些实施方案中，编码内源性HLA-I、内源性HLA-II或两者的基因被灭活。在一些实施方案中，工程化免疫细胞的HLA-E或HLA-G被过表达。在一些实施方案中，工程化免疫细胞的CD24、CD47、FASL和/或PD-1被过表达。在一些实施方案中，工程化免疫细胞是T细胞、NKT细胞或NK细胞。在一些实施方案中，工程化免疫细胞源自于干细胞。在一些实施方案中，干细胞是造血干细胞(HSC)或诱导型多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，工程化免疫细胞是自体细胞或同种异体细胞。在一些实施方案中，工程化免疫细胞获自患有病症的受试者。在一些实施方案中，工程化免疫细胞获自健康供体。
在另一方面，本公开提供了一种工程化免疫细胞，该工程化免疫细胞包含：(a)一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，该CAR包含结合部分，其中结合部分包含能够结合至免疫细胞抗原的第一抗原结合结构域和能够结合至疾病相关抗原的第二抗原结合结构域，并且其中一种或多种CAR中的每个CAR还包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；和(b)能够增强工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分，其中工程化免疫细胞的内源性T细胞受体(TCR)被灭活，并且其中与包含(a)中一种或多种CAR但不包含(b)中增强子部分的另外的工程化免疫细胞相比，工程化免疫细胞(i)通过在存在与工程化免疫细胞异源的细胞的情况下在体外保持存活至少约20天而表现出增强的持久性程度，(ii)在15天内表现出至少约10倍的增强的扩增程度，或(iii)对包含免疫细胞抗原或疾病相关抗原的靶细胞表现出增强的细胞毒性。
在一些实施方案中，工程化免疫细胞特征在于表现出(i)、(ii)和(iii)中的两个或多个。在一些实施方案中，在不存在任何外源性增强子部分的情况下测量(i)、(ii)和/或(iii)。在一些实施方案中，免疫细胞抗原选自：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CS1、TCRα、TCRβ和SLAMF7。在一些实施方案中，免疫细胞抗原是CD7。在一些实施方案中，增强子部分被配置为组成性地增强工程化免疫细胞的一种或多种活性。在一些实施方案中，增强子部分被配置为组成性地上调工程化免疫细胞的一个或多个细胞内信号传导通路。在一些实施方案中，一个或多个细胞内信号传导通路是一个或多个细胞因子信号传导通路。在一些实施方案中，增强子部分通过自寡聚化而自激活。在一些实施方案中，增强子部分通过自二聚化而自激活。在一些实施方案中，增强子部分是细胞因子或细胞因子受体。在一些实施方案中，增强子部分选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19，TGFRβ、同样的受体、其功能片段、其功能变体及其组合。在一些实施方案中，编码内源性TCR的亚基的基因被灭活，使得内源性TCR被灭活。在一些实施方案中，编码亚基的基因是TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ或CD3ζ。在一些实施方案中，工程化免疫细胞还包含诱导型细胞死亡部分，该诱导型细胞死亡部分在与细胞死亡激活剂接触时实现工程化免疫细胞的自杀。在一些实施方案中，诱导型细胞死亡部分选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8、Her2t、CD30、BCMA和EGFRt。在一些实施方案中，诱导型细胞死亡部分是EGFRt，并且细胞死亡激活剂是结合EGFRt的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，诱导型细胞死亡部分是HSV-TK，并且细胞死亡激活剂是GCV。在一些实施方案中，诱导型细胞死亡部分是iCasp9，并且细胞死亡激活剂是AP1903。在一些实施方案中，细胞死亡激活剂包含核酸、多核苷酸、氨基酸、多肽、脂质、碳水化合物、小分子、酶、核糖体、蛋白酶体、其变体或任何它们的组合。在一些实施方案中，工程化免疫细胞的一种或多种内源性人白细胞抗原(HLA)基因的表达保持完整。在一些实施方案中，工程化免疫细胞的内源性HLA-1和/或HLA-II基因的表达保持完整。在一些实施方案中，工程化免疫细胞的内源性HLA-E和/或HLA-G和/或HLA-C基因的表达保持完整。在一些实施方案中，工程化免疫细胞的一种或多种内源性HLA基因的表达被上调。在一些实施方案中，工程化免疫细胞的内源性HLA-E和/或HLA-G和/或HLA-C基因的表达被上调。在一些实施方案中，工程化免疫细胞的内源性HLA-I、内源性HLA-II或两者的表达被抑制。在一些实施方案中，将编码内源性HLA-I、内源性HLA-II或两者的基因被灭活。在一些实施方案中，工程化免疫细胞的HLA-E或HLA-G被过表达。在一些实施方案中，工程化免疫细胞的CD24、CD47、FASL和/或PD-1被过表达。在一些实施方案中，疾病相关抗原是肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域是scFv。在一些实施方案中，编码工程化免疫细胞的内源性表面标志物的基因被灭活，其中所述内源性表面标志物在表达时能够结合至第一抗原结合结构域。在一些实施方案中，内源性表面标志物是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ或SLAMF7。在一些实施方案中，工程化免疫细胞是T细胞、NKT细胞或NK细胞。在一些实施方案中，工程化免疫细胞源自于干细胞。在一些实施方案中，干细胞是造血干细胞(HSC)或诱导型多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，工程化免疫细胞是自体细胞或同种异体细胞。在一些实施方案中，工程化免疫细胞获自患有病症的受试者。在一些实施方案中，工程化免疫细胞获自于健康供体。
在另一方面，本公开提供了用于治疗疾病的药物组合物，该药物组合物包含本文所述的工程化免疫细胞和药学上可接受的载体。在另一方面，本公开提供了一种治疗或诊断受试者中的疾病的方法，该方法包括向受试者施用药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物中的工程化免疫细胞源自于同种异体免疫细胞。在一些实施方案中，源自于同种异体免疫细胞的工程化免疫细胞不会在受试者中诱导移植物抗宿主病(GvHD)。在一些实施方案中，药物组合物中的工程化免疫细胞源自于自体免疫细胞。在一些实施方案中，药物组合物中的工程化免疫细胞的内源性TCR是功能上灭活的。在一些实施方案中，与具有功能上活性的TCR的另外的免疫细胞相比，工程化免疫细胞降低了受试者中的GvHD。在一些实施方案中，该疾病是癌症。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤或白血病。
在另一方面，本公开提供了一种细胞，该细胞包含：功能上灭活的T细胞受体(TCR)和一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，其中一种或多种CAR中的每个单个CAR包含结合部分，所述结合部分包含(i)第一抗原结合结构域，当施用于受试者时，该第一抗原结合结构域抑制或减少受试者对工程化免疫细胞的免疫应答，和(ii)结合至疾病相关的抗原的第二抗原结合结构域，其中一种或多种CAR中的每个CAR还包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域通过接头连接。在一些实施方案中，接头不包含自切割肽。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域从氨基末端到羧基末端排列为：(i)VL2-VH1-VL1-VH2；(ii)VH2-VL1-VH1-VL2；(iii)VL1-VH2-VL2-VH1；(iv)VH1-VL2-VH2-VL1；(v)VL2-VL1-VH1-VH2；(vi)VH2-VH1-VL1-VL2；(vii)VL1-VL2-VH2-VH1；或(viii)VH1-VH2-VL2-VL1，其中VH1是第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是第一抗原结合结构域的轻链可变结构域，VH2是第二抗原结合结构域的重链可变结构域，且VL2是第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域从氨基末端到羧基末端排列为：(i)VL2-VH2-VL1-VH1；(ii)VL2-VH2-VH1-VL1；(iii)VL1-VH1-VL2-VH2；(iv)VL1-VH1-VH2-VL2；(v)VH2-VL2-VL1-VH1；(vi)VH2-VL2-VH1-VL1；(vii)VH1-VL1-VL2-VH2；或(viii)VH1-VL1-VH2-VL2，其中VH1是第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是第一抗原结合结构域的轻链可变结构域，VH2是第二抗原结合结构域的重链可变结构域，且VL2是第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。在一些实施方案中，编码细胞的内源性TCR的亚基的基因被灭活，从而产生功能上灭活的TCR。在一些实施方案中，编码亚基的基因是TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ或CD3ζ。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域结合至免疫细胞抗原。在一些实施方案中，免疫细胞抗原是免疫细胞的表面蛋白或分泌型蛋白。在一些实施方案中，免疫细胞是NK细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞或粒细胞。在一些实施方案中，免疫细胞抗原是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ或SLAMF7。在一些实施方案中，疾病相关抗原是肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原是CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白(Frizzled)、OX40、Notch-1-4、APRIL、CS1、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R或TROP-2。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域结合至免疫细胞抗原结合，该免疫细胞抗原选自：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ和SLAMF7，并且第二抗原结合结构域结合至CD19。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域结合至CD3，并且第二抗原结合结构域结合至CD19。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域结合至CD7，并且第二抗原结合结构域结合至CD19。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域结合至CD137，并且第二抗原结合结构域结合至CD19。在一些实施方案中，细胞还包含增强子部分，该增强子部分增强工程化免疫细胞的一种或多种活性。在一些实施方案中，增强子部分被配置为组成性地增强工程化免疫细胞的一种或多种活性。在一些实施方案中，增强子部分被配置为组成性地上调工程化免疫细胞的一个或多个细胞内信号传导通路。在一些实施方案中，一种或多种细胞内信号传导通路是一个或多个细胞因子信号传导通路。在一些实施方案中，增强子部分是细胞因子或细胞因子受体。在一些实施方案中，增强子部分选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19，TGFRβ、同样的受体、其功能片段、其功能变体及其组合。在一些实施方案中，细胞还包含在诱导型细胞死亡部分，该诱导型细胞死亡部分在诱导型细胞死亡部分与细胞死亡激活剂接触时能够实现细胞死亡。在一些实施方案中，诱导型细胞死亡部分选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8、Her2t、CD30、BCMA和EGFRt。在一些实施方案中，诱导型细胞死亡部分是EGFRt，并且细胞死亡激活剂是结合EGFRt的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，诱导型细胞死亡部分是HSV-TK，并且细胞死亡激活剂是GCV。在一些实施方案中，诱导型细胞死亡部分是iCasp9，并且细胞死亡激活剂是AP1903。
在另一方面，本公开提供了一种核酸分子，该核酸分子包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第一序列，其中所述CAR包含结合部分，该结合部分包含(i)第一抗原结合结构域，当施用于受试者时，该第一抗原结合结构域抑制或减少受试者对工程化免疫细胞的免疫应答，所述受试者连接至(ii)第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域能够结合至疾病相关的抗原，且其中一种或多种CAR中的每个CAR还包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，第一抗原结合结构域结合至抗原，所述抗原选自：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ和SLAMF7。在一些实施方案中，第二抗原结合结构域结合至CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白(Frizzled)、OX40、Notch-1-4、APRIL、CS1、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R或TROP-2。在一些实施方案中，核酸分子还包含编码增强子部分的第二序列，当在细胞中表达时，该增强子部分增强CAR的一种或多种活性。在一些实施方案中，增强子部分选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19，TGFRβ、同样的受体、其功能片段、其功能变体及其组合。在一些实施方案中，核酸分子还包含编码诱导型细胞死亡部分的第二序列，当在细胞中表达时，该诱导型细胞死亡部分在诱导型细胞死亡部分与细胞死亡激活剂接触时实现细胞的死亡。在一些实施方案中，诱导型细胞死亡部分选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8、Her2t、CD30、BCMA和EGFRt。在一些实施方案中，核酸分子还包含侧接第一序列和第二序列的第三序列，其中第三序列编码可切割的接头。在一些实施方案中，可切割接头是自切割肽。在一些实施方案中，核酸分子还包含调节序列，该调节序列调节第一序列和/或第二序列的表达。
在另一方面，本公开提供了包含本文描述的核酸分子的试剂盒。
在另一方面，本公开提供了一种产生工程化细胞的方法，该方法包括：(a)将本文所述的核酸分子递送至细胞中；和(b)在细胞中表达核酸分子，从而产生工程化细胞。
在另一方面，本公开提供了工程化免疫细胞，该工程化免疫细胞包含：增强子部分，该增强子部分能够增强工程化免疫细胞的一种或多种活性；嵌合抗原受体(CAR)，该CAR包含特异性结合CD7的抗原结合结构域，其中所述CAR还包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；其中工程化免疫细胞中的内源性CD7被灭活。在一些实施方案中，增强子部分选自：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、PD-1、PD-L1、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19和TGFRβ、同样的受体及其组合。在一些实施方案中，将工程化免疫细胞的内源性T细胞受体(TCR)灭活。在一些实施方案中，工程化免疫细胞还包含多肽，该多肽包含诱导型细胞死亡部分，该导型细胞死亡部分能够在多肽与细胞死亡激活剂接触时实现工程化免疫细胞的死亡。在一些实施方案中，增强子部分是多肽的一部分。在一些实施方案中，增强子部分不是CAR的一部分。在一些实施方案中，增强子部分是CAR的一部分。在一些实施方案中，工程化免疫细胞是T细胞、NKT细胞或NK细胞。在一些实施方案中，工程化免疫细胞源自于干细胞。在一些实施方案中，干细胞是造血干细胞(HSC)或诱导型多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，工程化免疫细胞是自体细胞或同种异体细胞。在一些实施方案中，工程化免疫细胞获自于患有病症的受试者。在一些实施方案中，工程化免疫细胞获自于健康供体。
在另一方面，本公开提供了一种产生本文所述的工程化免疫细胞的方法，该方法包括：(a)将编码(i)增强子部分和(ii)CAR的一种或多种核酸分子递送至免疫细胞中；和(b)在免疫细胞中表达一种或多种核酸分子，从而产生工程化免疫细胞。在一些实施方案中，单一核酸分子编码(i)增强子部分和(ii)CAR。在一些实施方案中，单一核酸分子包含侧接(i)增强子部分和(ii)CAR的自切割肽。在一些实施方案中，单一核酸分子不包含侧接(i)增强子部分和(ii)CAR的任何自切割肽。在一些实施方案中，(i)第一核酸分子编码增强子部分，和(ii)第二核酸分子编码CAR。
在另一方面，本公开提供了一种治疗或诊断受试者的病症的方法，其包括向受试者施用本文所述的工程化免疫细胞。在一些实施方案中，工程化免疫细胞源自于受试者的自体免疫细胞。在一些实施方案中，工程化免疫细胞源自于同种异体免疫细胞。在一些实施方案中，病症是癌症(例如，T细胞和/或NK细胞恶性肿瘤)。
在另一方面，本公开提供了一种工程化免疫细胞，该工程化免疫细胞包含：单嵌合抗原受体(CAR)，该单嵌合抗原受体(CAR)包含(i)特异性结合CD7的第一抗原结合结构域和(ii)能够结合至疾病相关的抗原的第二抗原结合结构域，所述CAR还包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中编码内源性CD7的基因在工程化免疫细胞中被灭活。在一些实施方案中，工程化免疫还包含能够增强工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分。在一些实施方案中，增强子部分选自：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、PD-1、PD-L1、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19和TGFRβ、同样的受体及其组合。在一些实施方案中，工程化免疫细胞的内源性T细胞受体(TCR)被灭活。在一些实施方案中，工程化免疫细胞还包含多肽，该多肽包含诱导型细胞死亡部分，该诱导型细胞死亡部分能够在多肽与细胞死亡激活剂接触时实现工程化免疫细胞的死亡。在一些实施方案中，增强子部分是多肽的一部分。在一些实施方案中，工程化免疫细胞是T细胞、NKT细胞或NK细胞。在一些实施方案中，工程化免疫细胞源自于干细胞。在一些实施方案中，干细胞是造血干细胞(HSC)或诱导型多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，工程化免疫细胞是自体细胞或同种异体细胞。在一些实施方案中，工程化免疫细胞获自患于有病症的受试者。在一些实施方案中，工程化免疫细胞获自于健康供体。
在另一方面，本公开提供了一种产生工程化免疫细胞的方法，该方法包括：(a)将编码单一CAR的一种或多种核酸分子递送至免疫细胞中；和(b)在免疫细胞中表达一种或多种核酸分子，从而产生工程化免疫细胞。在一些实施方案中，单一核酸分子编码单一CAR。
在另一方面，本公开提供了一种治疗或诊断受试者的病症的方法，该方法包括向受试者施用工程化免疫细胞。在一些实施方案中，工程化免疫细胞源自于受试者的自体免疫细胞。在一些实施方案中，工程化免疫细胞源自于同种异体免疫细胞。在一些实施方案中，病症是癌症(例如，T细胞和/或NK细胞恶性肿瘤)。
在另一方面，本公开提供了递送同种异体细胞疗法的方法，该方法包括：向有需要的受试者施用工程化免疫细胞的群体，该群体中的单个工程化免疫细胞包含：(a)一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，该一种或多种CAR包含结合部分，其中结合部分包含能够结合至免疫细胞抗原的第一抗原结合结构域和能够结合至疾病相关抗原的第二抗原结合结构域，当施用于受试者时，该第一抗原结合结构域抑制或减少受试者对工程化免疫细胞的免疫应答；(b)能够增强工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分，其中工程化免疫细胞的内源性T细胞受体(TCR)被灭活，并且其中工程化免疫细胞(i)通过在存在与工程化免疫细胞异源的细胞的情况下在体外保持存活至少约20而表现出增强的持久性程度，(ii)在15天内表现出至少约10倍的增强的扩增程度，或(iii)对包含免疫细胞抗原或疾病相关抗原的靶细胞表现出增强的细胞毒性。
在一些实施方案中，单独施用所述工程化免疫细胞的群体而不使用另外的增殖剂(i)通过在存在与工程化免疫细胞异源的免疫细胞的情况下在体外保持存活至少约20天产生增强的持久性程度，(ii)在15天内产生至少约10倍的增强的扩增程度，或(iii)对包含免疫细胞抗原或疾病相关抗原的靶细胞产生增强的细胞毒性。在一些实施方案中，一种或多种CAR中的每个CAR还包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中当施用于受试者时，第一抗原结合结构域抑制或减少受试者对工程化免疫细胞的免疫应答。在一些实施方案中，单个工程化免疫细胞的内源性CD7被灭活。在一些实施方案中，免疫细胞抗原是CD7。
在一些实施方案中，增强子部分被配置为组成性地增强单个工程化免疫细胞的一种或多种活性。在一些实施方案中，增强子部分被配置为组成性地上调工程化免疫细胞的一个或多个细胞内信号传导通路。在一些实施方案中，一个或多个细胞内信号传导通路是一个或多个细胞因子信号传导通路。在一些实施方案中，增强子部分通过自寡聚化而自激活。在一些实施方案中，增强子部分通过自二聚化而自激活。在一些实施方案中，增强子部分是细胞因子或细胞因子受体。在一些实施方案中，增强子部分选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19，TGFRβ、同样的受体、其功能片段、其功能变体及其组合。在一些实施方案中，编码内源性TCR的亚基的基因被灭活，使得内源性TCR被灭活。在一些实施方案中，编码亚基的基因是TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ或CD3ζ。在一些实施方案中，单个工程化免疫细胞还包含诱导型细胞死亡部分，该诱导型细胞死亡部分在与细胞死亡激活剂接触时实现工程化免疫细胞的自杀。在一些实施方案中，诱导型细胞死亡部分选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8、Her2t、CD30、BCMA和EGFRt。在一些实施方案中，诱导型细胞死亡部分是EGFRt，并且细胞死亡激活剂是结合EGFRt的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，诱导型细胞死亡部分是HSV-TK，并且细胞死亡激活剂是GCV。在一些实施方案中，诱导型细胞死亡部分是iCasp9，并且细胞死亡激活剂是AP1903。在一些实施方案中，细胞死亡激活剂包含核酸、多核苷酸、氨基酸、多肽、脂质、碳水化合物、小分子、酶、核糖体、蛋白酶体、其变体或任何它们的组合。在一些实施方案中，单个工程化免疫细胞的一种或多种内源性人白细胞抗原(HLA)基因的表达保持完整。在一些实施方案中，单个工程化免疫细胞的内源性HLA-1和/或HLA-II基因的表达保持不变。在一些实施方案中，单个工程化免疫细胞的内源性HLA-E和/或HLA-G和/或HLA-C基因的表达保持完整。在一些实施方案中，单个工程化免疫细胞的一种或多种内源性HLA基因的表达被上调。在一些实施方案中，单个工程化免疫细胞的内源性HLA-E和/或HLA-G和/或HLA-C基因的表达被上调。在一些实施方案中，单个工程化免疫细胞的内源性HLA-I、内源性HLA-II或两者的表达被抑制。在一些实施方案中，编码内源性HLA-I、内源性HLA-II或两者的基因被灭活。在一些实施方案中，工程化免疫细胞的HLA-E或HLA-G被过表达。在一些实施方案中，工程化免疫细胞的CD24、CD47、FASL和/或PD-1被过表达。
在一些实施方案中，疾病相关抗原是肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域是scFv。在一些实施方案中，单个工程化免疫细胞是T细胞、NKT细胞或NK细胞。在一些实施方案中，个体工程化免疫细胞源自于干细胞。在一些实施方案中，干细胞是造血干细胞(HSC)或诱导型多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，单个工程化免疫细胞是同种异体细胞。在一些实施方案中，单个工程化的免疫细胞获自于健康供体。
在一个方面，本公开提供一种细胞，该细胞包含：(a)一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，该一种或多种CAR包含结合部分，其中所述结合部分包含能够结合至免疫细胞抗原结合的抗原结合结构域，并且其中一种或多种CAR的每个CAR还包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；和(b)能够增强细胞的一种或多种活性的增强子部分，其中细胞的内源性T细胞受体(TCR)被灭活。
在一些实施方案中，增强子部分增强细胞的一种或多种活性。在一些实施方案中，增强子部分被配置为组成性地增强细胞的一种或多种活性。在一些实施方案中，增强子部分被配置为组成性地上调细胞的一个或多个细胞内信号传导通路。在一些实施方案中，一种或多种细胞内信号传导通路是一个或多个细胞因子信号传导通路。在一些实施方案中，增强子部分是细胞因子或细胞因子受体。在一些实施方案中，增强子部分选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19，TGFRβ、同样的受体、其功能片段、其功能变体及其组合。在一些实施方案中，方法还包括诱导型细胞死亡部分，所述诱导型细胞死亡部分在诱导型细胞死亡部分与细胞死亡激活剂接触时能够实现细胞的死亡。在一些实施方案中，诱导型细胞死亡部分选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8、Her2t、CD30、BCMA和EGFRt。在一些实施方案中，诱导型细胞死亡部分是EGFRt，并且细胞死亡激活剂是结合EGFRt的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，诱导型细胞死亡部分是HSV-TK，并且细胞死亡激活剂是GCV。在一些实施方案中，诱导型细胞死亡部分是iCasp9，并且细胞死亡激活剂是AP1903。在一些实施方案中，编码细胞的内源性表面标志物的基因被灭活，其中所述内源性表面标志物在表达时能够结合至第一抗原结合结构域。在一些实施方案中，内源性表面标志物是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ或SLAMF7。
在一个方面，本公开提供了一种用于治疗淋巴恶性肿瘤的方法，该方法包括向有需要的患者施用工程化免疫细胞的群体，其中所述群体中的单个工程化免疫细胞包含：(a)一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，该一种或多种CAR包含结合部分，其中所述结合部分包含能够结合至免疫细胞抗原结合的抗原结合结构域，并且其中所述一种或多种CAR的每个CAR还包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；和(b)能够增强工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分，其中工程化免疫细胞的内源性T细胞受体(TCR)被灭活，其中(i)在最后给予工程化免疫细胞后3周内，外周血中受影响细胞的数量或骨髓中受影响的细胞数量减少了至少50％，并且(ii)在最后给予工程化免疫细胞后3周内，外周血中的自体T细胞、粒细胞和NK细胞中任何一种或多种的数量开始增加。
在一些实施方案中，增强子部分增强工程化免疫细胞的一种或多种活性。在一些实施方案中，增强子部分被配置为组成性地增强工程化免疫细胞的一种或多种活性。在一些实施方案中，增强子部分被配置为组成性地上调工程化免疫细胞的一个或多个细胞内信号传导通路。在一些实施方案中，一个或多个细胞内信号传导通路是一个或多个细胞因子信号传导通路。在一些实施方案中，增强子部分是细胞因子或细胞因子受体。在一些实施方案中，增强子部分选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19，TGFRβ、同样的受体、其功能片段、其功能变体及其组合。在一些实施方案中，工程化免疫细胞还包含诱导型细胞死亡部分，该诱导型细胞死亡部分在诱导型细胞死亡部分与细胞死亡激活剂接触时能够实现细胞的死亡。
在一些实施方案中，诱导型细胞死亡部分选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8、Her2t、CD30、BCMA和EGFRt。在一些实施方案中，诱导型细胞死亡部分是EGFRt，并且细胞死亡激活剂是结合EGFRt的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，诱导型细胞死亡部分是HSV-TK，并且细胞死亡激活剂是GCV。在一些实施方案中，诱导型细胞死亡部分是iCasp9，并且细胞死亡激活剂是AP1903。在一些实施方案中，编码细胞的内源性表面标志物的基因被灭活，其中所述内源性表面标志物在表达时能够结合至第一抗原结合结构域。在一些实施方案中，内源性表面标志物是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ或SLAMF7。在一些实施方案中，在外周血中的受影响细胞数量或骨髓中的受影响细胞数量减少至少50％之前，外周血中的自体T细胞、粒细胞和NK细胞中的任何一种或多种的数量开始增加。在一些实施方案中，在外周血中的受影响细胞数量或骨髓中的受影响细胞数量减少至少50％之后，外周血中的自体T细胞、粒细胞和NK细胞中的任何一种或多种的数量开始增加。
通过下面的详细描述，本公开的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，其中，仅示出和描述本公开的说明性实施方案。如将会认识到的，本公开能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些都不脱离本公开。因此，附图和描述本质上应被认为是说明性的，而不是限制性的。
援引并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确地并单独地指出通过引用并入本文。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开内容相矛盾的程度而言，本说明书旨在取代和/或优先于任何此类相矛盾的材料。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体地阐述。通过参考以下详细描述将获得对本发明的特征和优点的更好理解，所述详细描述阐述了其中利用本发明的原理的说明性实施方案，并且附图(在本文也称为“图(Figure)”和“图(FIG.)”)：
图1示出了EGFRt-CD3-CD19 CAR的示例性结构。
图2示出了EGFRt-CD3-CD19通用CAR-T的示例性制备过程。
图3示出了平行CAR(FMC63-OKT3)和tEGFR开关的表达。
图4示出了平行和环CAR的表达。
图5A-图5C示出了比较UCHT1与OKT3的实验数据。
图6A-图6C示出了平行-UCHT1的抗癌功能。
图7A和图7B示出了比较平行CAR与环CAR的抗癌功能的实验数据。
图8A和图8B示出了TCR KO CD19 CAR-T细胞在皮下肿瘤模型中显示出增殖缺陷。通过皮下注射将5e5 Raji-荧光素酶细胞移植到NOG小鼠中。将1e6 WT、TCR KO CD19 CAR-T细胞输注(IV)到Raji移植的小鼠中。通过实际肿瘤大小的卡尺测量来评估肿瘤负荷。尽管两者都是基于Raji的荷瘤模型，但是皮下模型产生实体瘤，并且与静脉内模型相比，皮下模型对控制肿瘤的CAR-T细胞增殖具有更高的要求。与WT CAR-T细胞相比，TCR KO CAR-T细胞显示出增殖缺陷，与其肿瘤控制作用一致。
图9A-图9C示出了在癌细胞多轮刺激之后具有不同增强子的CAR-T细胞的增殖和杀死效果。
图10A和图10B示出了在癌细胞多轮刺激之后具有不同增强子的CAR-T细胞的增殖。
图11示出了TCR KO CD19 CAR-T细胞中增强子的体内比较。通过静脉内(IV)注射将5e5 Raji-荧光素酶细胞移植到NOG小鼠中。将具有/不具有增强子的WT、TCR KO CD19CAR-T细胞输注(IV)到Raji移植的小鼠中。通过生物发光强度(BLI)评估肿瘤负荷。
图12示出了TCR KO CD19 CAR-T细胞中增强子的体内比较。
图13示出了CD7 mRNA的示例性组织分布。
图14示出了CD2 mRNA的示例性组织分布。
图15示出了CD7 CAR-T的示例性制备。
图16示出了CD7 gRNA筛选的实验数据。
图17示出了CAR7、CAR7-mb15和CAR7-C7R的示例性结构。
图18示出了CAR7、CAR7-mb15、CAR7-C7R和对照CAR19的CAR表达，IL15Ra和CD34的表达以及CD7和CD3的敲除效率的实验数据。
图19示出了UCAR-T细胞中激活STAT5的实验数据。加入IL-2激活CAR7 T细胞的STAT5，且去除IL-2显著降低pSTAT5水平。在CAR7-C7R中，有或没有外源性IL-2时，pSTAT5的水平均处于高水平。
图20示出了UCAR-T细胞对CCRF-CEM-luc细胞系的杀死作用的实验数据。
图21示出了UCAR-T细胞对同种异体反应性T(allo-T)细胞的杀死作用的实验数据。
图22示出了UCAR-T细胞在24小时内对NK92细胞系的杀死作用。
图23A示出了几种UCAR-T细胞在体外扩增的实验数据，其中表达增强子的UCAR-T细胞存活更长的时间。图23B示出了比较去除IL-2后它们对CCRF-CEM肿瘤细胞的杀死作用的实验数据。
图24A示出了几种UCAR-T细胞的体外扩增的实验数据。图24B示出了在去除IL-2并与CCRF-CEM共培养多轮之后它们对CCRF-CEM肿瘤细胞的杀死作用的比较的实验数据，其中表达增强子的UCAR-T细胞在肿瘤抗原的刺激下显示出更强的扩增。
图25示出了在携带CCRF-CEM肿瘤的免疫缺陷小鼠中表达增强子的UCAR-T的细胞扩增的实验数据。
图26示出了表达增强子的UCAR-T细胞在小鼠中对CCRF-CEM肿瘤的杀死作用的实验数据。
图27示出了TCR KO CD7 CAR-T细胞中增强子的体内比较。
图28A和28B示出了TCR KO CD7 CAR-T细胞中增强子的体内比较。
图29示出了RQR8-CD19CAR-MBIL15、RQR8-CD19CAR-MBIL15-IL7、RQR8-CD19CAR-C7R和RQR8-CD19CAR-MBIL7的示例性结构。
图30示出了E3的设计：基于组成型活性IL7Rα的增强子+安全开关。
图31示出了CAR和增强子的表达。
图32A和图32B示出了CAR-T功能的测试。
图33A和图33B示出了增强子功能的测试。
图34A-图34C示出了增强子功能的测试。
图35A-图35C示出了通过ADCC的安全开关的测试。
图36A和图36B示出了在重复刺激之后ADCC对安全开关的测试。
图37示出了CD7-CD19双重CAR的设计的实施例。L719代表环-CAR、LHLH＝VLVH-VLVH、HLHL＝VHVL-VHVL；T197和T719是串联-CAR，EAAAK是两个LH之间的接头。SP：信号肽；H：铰链；TM：跨膜结构域。
图38A和38B示出了用不同抗体的scFv构建的CD7单一CAR的表达和CD7/CD3(TRAC)的敲除效率的实验数据(图38A)，以及CAR对CD7+细胞的杀死作用(图38B)。LH代表VLVH，且HL代表VHVL。
图39示出了环-CAR和串联-CAR的表达的实验数据。CAR7和CAR19是单一CAR对照，且Mock T是阴性对照。
图40示出了CD7和CD3的敲除效率(TRAC)和通过CAR对CD7+细胞的清除的实验数据。
图41示出了环-CAR和串联CAR对HeLa-CD19+细胞的清除的实验数据。
图42A和图42B示出了CD7单一CAR和CD7-CD19双重CAR完全杀死NK的实验数据。图42A示出了不同的CAR对体外扩增的外周血NK的清除的实验数据。图42B示出了体外扩增的NK包含约80％的CD7+细胞的实验数据；在经L719-LHLH和T197-LHLH杀死后，剩下的NK细胞是CD7细胞。
图43示出了通过CD7单一CAR和CD7-CD19双重CAR快速杀死同种异体T细胞的实验数据。
图44示出了双重CAR的体内功能的实验数据。环CAR和串联CAR对Raji肿瘤细胞均显示出有效杀死作用。
图45A和45B示出了比较两个串联CAR的实验数据。图45A显示了使用L719的实验数据：L719-LHLH作为筛选的标准对照，且CAR7、CAR19和Mock T作为其他对照。图45B显示了在CD7敲除后通过不同的CAR清除剩余的CD7+细胞的实验数据。
图46示出了两种串联CAR的实验数据，两种串联CAR显示对HeLa-CD19+细胞的清除作用与L719相似。
图47A和图47B示出了两种串联CAR的实验数据，两种串联CAR显示了对同种异体T细胞(图47A)和NK细胞(图47B)的清除作用与L719相似。
图48示出了双重CAR的体内功能筛选的实验数据。环和串联双重CAR对体内CCRF-CEM肿瘤细胞均显示出有效杀死作用。
图49示出了rapaC、L719-C7R和L719-E3的结构。
图50A-图50J示出了细胞因子信号传导对双重CAR的功能的影响的实验数据。图50A示出了L719和L719-C7R双重CAR的表达的实验数据。图50B示出了双重CAR对HeLa-CD7+细胞的杀死作用的实验数据。图50C示出了双重CAR对HeLa-CD19+细胞的杀死作用的实验数据。图50D示出了L718双重CAR-T细胞中增强子和CD7的表达的实验数据。图50E示出了L719双重CAR-T细胞的细胞毒性的实验数据。图50F示出了L719双重CAR-T细胞的细胞毒性的实验数据。图50G示出了L719双重CAR-T细胞中磷酸化STAT5和增强子的表达的实验数据。图50H示出了L719双重CAR-T细胞增殖的实验数据。图50I示出了双重CAR对HeLa-CD19+细胞的杀死作用的实验数据。图50J示出了双重CAR对HeLa-CD7+细胞的杀死作用的实验数据。
图51示出了CD137 mRNA的示例性组织分布。
图52示出了CD137-CD19 AAC/CAR的示例性结构图。
图53示出了CD137-CD19通用CAR-T的示例性制备过程。
图54A-图54C示出了显示TCR敲除自体CAR-T细胞的细胞扩增缺陷的实验数据。图54A示出了FACS数据，该FACS数据显示了输注前和输注后TCR+细胞的分数。图54B示出了图54A中的FACS数据的条形图。图54C示出了具有或不具有TCR的CAR-T细胞的扩增差异的比较。
图55A和55B示出显示C7R对TCR敲除(KO)CD7 CAR-T细胞(例如，具有靶向CD7的CAR的CAR-T细胞，也称为UCART7细胞或CAR7细胞)扩增和持久性(persistence)的实验数据。图55A示出了具有或不具有增强子C7R的TCR KO CD7 CAR-T扩增数据。图55B示出了具有或不具有增强子的TCR KO CD7 CAR-T细胞的增殖数据。
图56A-图56E示出了显示表达增强子C7R或E3(EGFRt+IL7Rα)的TCR KO CD7 CAR-T细胞的STAT5磷酸化、细胞持久性和细胞毒性实验数据。图56A示出了表达增强子的CAR-T细胞的分数的实验数据。图56B示出了TCR KO CD7 CAR-T细胞的细胞毒性。图56C示出了在不存在IL2的情况下CAR-T细胞的增殖数据。图56D示出了表达增强子并具有磷酸化的STAT5的CAR-T细胞的分数的实验数据。图56E示出了图56D的磷酸化STAT5的平均荧光指数(MFI)的条形图。
图57A和57B示出了显示UCAR-T GC197细胞(例如，具有靶向CD19和CD7的CAR的多特异性CAR-T细胞)的扩增和持久性的实验数据。图57A示出了在存在癌症抗原刺激的情况下，来自两个不同供体的表达增强子C7R的UCAR-T GC197细胞的增殖数据。图57B示出了在没有IL2或抗原刺激的情况下表达增强子C7R的UCAR-T GC197细胞的增殖数据。
图58A-图58C示出了显示UCAR-T GC197细胞的扩增和持久性的实验数据。图58A示出了显示表达CD7和增强子C7R或E3(EGFRt+IL7Rα)的CAR-T细胞的分数的实验数据。图58B示出了表达增强子C7R或E3(EGFRt+IL7Rα)的UCAR-T GC197细胞的增殖数据。图58C示出了在存在癌症抗原刺激的情况下表达增强子C7R或E3(EGFRt+IL7Rα)的UCAR-T GC197细胞的增殖数据。
图59A和图59B示出了K562-CAR19分析和自然杀死(NK)细胞杀死测定的实验数据。图59A示出了表达CAR(例如，CAR19或靶向CD19的CAR)和增强子CD47或E4(CD47+IL7Rα)的K562细胞的分数的实验数据。图59B示出了NK细胞对表达增强子CD47或E4(CD47+IL7Rα)的K562-CAR19的细胞毒性的实验数据。
图60A和图60B示出了显示UCART19细胞(例如，具有靶向CD19的CAR的CAR-T细胞，也称为CD19 CAR-T细胞或CAR19细胞)的STAT5磷酸化和细胞持久存活的实验数据。图60A示出了具有磷酸化的STAT5和CAR19的TCR KO CAR19细胞的分数的实验数据。图60B示出了表达增强子C7R、CD47或E4(CD47+IL7Rα)的TCR KO CD19 CAR的增殖数据。
图61示出了E3在L719-E3细胞中的安全开关功能。
图62示出了通过补体依赖性细胞毒性测定法(CDC测定法)在CAR7-E3和L719-E3中测试的E3的安全开关功能。
图63示出了在没有细胞因子信号传导增强或具有mbIL15、C7R或E3表达的TCR/CD7双重敲除CAR7细胞中IL2和IFNγ的表达。
图64示出了在没有细胞因子信号传导增强或具有C7R或E3表达的TCR/CD7双重敲除CD19/CD7双重CAR-L719细胞中IL2和IFNγ的表达。
图65示出了CD2 gRNA筛选。
图66示出了比较CD19 CAR-T与TCR KO CD19 CAR-T细胞的体内GvHD研究。
图67示出了CAR7-C7R治疗T急性淋巴细胞白血病(T-ALL)患者的临床数据。
图68示出了CAR7和CAR7-E3 UCAR-T细胞的体内功效的BLI成像。
图69示出了L719和L719-C7R UCAR-T细胞的体内功效的BLI成像。
具体实施方式
尽管已经在本文中示出和描述了本发明的各个实施方案，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方案仅作为实例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替换。应当理解，可以采用本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案。
如本文所用，术语“约”是指对于所确定的特定值或组成在可接受的公差范围内的值或组成，这将部分取决于如何测量或测量该值或组成，即，测量系统的局限性。例如，按照本领域的实践，“约”可以表示在1或多于1的标准偏差之内。或者，“约”可以表示给定值的至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的范围。或者，特别是关于生物系统或过程，该术语可表示数值在一个数量级内，优选地在值的5倍之内，更优选地在值的2倍之内。在本申请和权利要求书中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则应假设术语“约”表示在特定值的可接受的误差范围内。
如本文所用，术语“施用”是指使用多种方法和递送系统中的任何一种将本公开的产品物理地引入受试者中，包括静脉内、肌内、皮下、腹膜内、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。
如本文所用，术语“抗原”是指能够被选择性结合剂结合的分子或其片段。例如，抗原可以是可被选择性结合剂例如受体结合的配体。作为另一个实例，抗原可以是可被选择性结合剂例如免疫蛋白(例如抗体)结合的抗原分子。抗原也可以指能够在动物中使用以产生能够与该抗原结合的抗体的分子或其片段。在一些情况下，抗原可以结合至底物(例如细胞膜)。或者，抗原可以不与底物结合(例如，分泌的分子，例如分泌的多肽)。
如本文所用，术语“抗体(Ab)”包括但不限于特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的免疫球蛋白、或其抗原。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括恒定结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其间散布有称为构架区(FR)的更保守区。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。
如本文所用，术语“核苷酸”通常是指碱基-糖-磷酸的组合。核苷酸可以包含合成核苷酸。核苷酸可包含合成核苷酸类似物。核苷酸可以是核酸序列的单体单元(例如，脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA))。术语核苷酸可以包括核糖核苷三磷酸腺苷三磷酸(ATP)、尿苷三磷酸(UTP)、胞嘧啶三磷酸(CTP)、鸟苷三磷酸(GTP)和脱氧核苷三磷酸，例如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。此类衍生物可以包括例如[αS]dATP、7-脱氮-dGTP和7-脱氮-dATP，以及赋予包含它们的核酸分子核酸酶抗性的核苷酸衍生物。如本文所用，术语核苷酸可以指双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)及其衍生物。双脱氧核苷三磷酸的说明性实例可包括但不限于ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP和ddTTP。核苷酸可以是未标记的，或者通过众所周知的技术可检测地标记的。标记也可以用量子点进行。可检测的标记可以包括例如，放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记和酶标记。核苷酸的荧光标记可包括但不限于荧光素、5-羧基荧光素(FAM)、2′7′-二甲氧基-4′5-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、罗丹明、6-羧基罗丹明(R6G)、N,N,N′,N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、4-(4′二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)、级联蓝(Cascade Blue)、俄勒冈州绿(Oregon Green)、德克萨斯红(Texas Red)、花菁和5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)。荧光标记的核苷酸的具体实例可包括购自加利福尼亚州福斯特市珀金埃尔默公司(Perkin Elmer,Foster City,Calif.)的[R6G]dUTP、[TAMRA]dUTP、[R110]dCTP、[R6G]dCTP、[TAMRA]dCTP、[JOE]ddATP、[R6G]ddATP、[FAM]ddCTP、[R110]ddCTP、[TAMRA]ddGTP、[ROX]ddTTP、[dR6G]ddATP、[dR110]ddCTP、[dTAMRA]ddGTP和[dROX]ddTTP，购自伊利诺伊州阿灵顿高地安玛西亚(Amersham,Arlington Heights,Ill.)的FluoroLink脱氧核苷酸、FluoroLink Cy3-dCTP、FluoroLink Cy5-dCTP、FluoroLink Fluor X-dCTP、FluoroLinkCy3-dUTP和FluoroLink Cy5-dUTP；购自印第安纳州印第安纳波利斯宝灵曼(BoehringerMannheim,Indianapolis,Ind.)的荧光素-15-dATP、荧光素-12-dUTP、四甲基-罗丹明-6-dUTP、IR770-9-dATP、荧光素-12-ddUTP、荧光素-12-UTP和荧光素-15-2′-dATP；和得自俄勒冈州尤金分子探针(Molecular Probes,Eugene,Oreg.)的染色体标记的核苷酸、BODIPY-FL-14-UTP、BODIPY-FL-4-UTP、BODIPY-TMR-14-UTP、BODIPY-TMR-14-dUTP、BODIPY-TR-14-UTP、BODIPY-TR-14-dUTP、级联蓝-7-UTP、级联蓝-7-dUTP、荧光素-12-UTP、荧光素-12-dUTP、俄勒冈州绿488-5-dUTP、罗丹明绿-5-UTP、罗丹明绿-5-dUTP、四甲基罗丹明-6-UTP、四甲基罗丹明-6-dUTP、德克萨斯红-5-UTP、德克萨斯红-5-dUTP和德克萨斯红-12-dUTP。核苷酸也可以通过化学修饰来标记或标示。化学修饰的单核苷酸可以是生物素-dNTP。生物素化的dNTP的一些非限制性实例可以包括生物素-dATP(例如，生物-N6-ddATP、生物素-14-dATP)、生物素-dCTP(例如，生物素-11-dCTP、生物素-14-dCTP)和生物素-dUTP(例如，生物素-11-dUTP、生物素-16-dUTP、生物素-20-dUTP)。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用，是指任意长度的核苷酸的聚合形式，无论是单链、双链或多链形式的脱氧核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以是细胞外源的或内源的。多核苷酸可以存在于无细胞的环境中。多核苷酸可以是基因或其片段。多核苷酸可以是DNA。多核苷酸可以是RNA。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。多核苷酸可包含一种或多种类似物(例如，改变的主链、糖或核碱基)。如果存在的话，可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。类似物的一些非限制性实例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、异种核酸、吗啉代(morpholino)、锁核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸、双脱氧核苷酸、虫草素、7-脱氮-GTP、荧光团(例如，与糖连接的若丹明或荧光素)、含硫醇的核苷酸、生物素连接的核苷酸、荧光碱基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化的核苷酸、肌苷、硫代尿苷、假尿苷、二氢尿苷、queussine和怀俄苷(wyosine)。多核苷酸的非限制性实例包括基因或基因片段的编码或非编码区，由连锁分析定义的基因座(基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、包括无细胞DNA(cfDNA)和无细胞RNA(cfRNA)的无细胞的多核苷酸、核酸探针和引物。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。
如本文所用，术语“基因”是指参与编码RNA转录物的核酸(例如，诸如基因组DNA的DNA和cDNA)及其相应的核苷酸序列。如本文所用的涉及基因组DNA的术语包括中间的非编码区以及调节区，并且可以包括5'和3'末端。在某些用途中，该术语涵盖转录的序列，包括5'和3'非翻译区(5'-UTR和3'-UTR)、外显子和内含子。在某些基因中，转录区将包含编码多肽的“开放阅读框”。在该术语的一些用途中，“基因”仅包含编码多肽所需的编码序列(例如，“开放阅读框”或“编码区”)。在一些情况下，基因不编码多肽，例如核糖体RNA基因(rRNA)和转移RNA(tRNA)基因。在一些情况下，术语“基因”不仅包括转录序列，而且另外还包括非转录区，包括上游和下游调节区、增强子和启动子。基因可以指“内源基因”或在生物体基因组中其天然位置的天然基因。基因可以是指“外源基因”或非天然基因。非天然基因可以是指通常在宿主生物体中没有发现但通过基因转移引入宿主生物体中的基因。非天然基因也可以是指生物体基因组中不在其天然位置的基因。非天然基因还可以是指包含突变、插入和/或缺失的天然存在的核酸或多肽序列(例如，非天然序列)。
如本文所用，术语“内源的”是指通常在细胞或组织中正常表达的核酸分子或多肽。
如本文所用，术语“外源的”是指核酸分子或多肽不是内源性存在于细胞中或以足以实现在过表达时获得的功能作用的水平存在。因此，术语“外源的”包括在细胞中表达的任何重组核酸分子或多肽，例如外源、异源和过表达的核酸分子和多肽。
如本文所用，术语“T细胞和NK细胞共有区标志物”是指在T细胞和NK细胞上共存的标志物，包括但不限于：CD2、CD7、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD69、CD100、CD122、CD132、CD161、CD159a、CD159c、CD314。
如本文所用，术语“T细胞和/或NK细胞的标志物”是指分别存在于T细胞或NK细胞，或存在于T细胞和NK细胞两者中的标志物，包括但不限于：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD160、CD161 CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、SLAMF7。
如本文所用，术语“功能上灭活的”或“功能性灭活”是指阻止或抑制功能性基因或该基因的产物，例如mRNA或蛋白质。可以通过基因或其启动子的缺失、添加或替换，从而不发生表达，或者基因的编码序列的突变，使得诸如mRNA或蛋白质的基因产物灭活来实现灭活。功能灭活可以是完全的或部分的。基因的灭活可以涵盖所有程度的灭活，包括基因沉默、敲除、抑制和破坏。在一些实施方案中，通过CRISPR-Cas9系统引入功能灭活。
如本文可互换使用的，术语“受试者”、“个体”、“患者”是指脊椎动物，优选为哺乳动物，例如人。哺乳动物包括但不限于鼠类、猿猴、人类、农场动物、运动动物和宠物。还包括体内获得或体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”是指用于获得有益或期望结果的方法，包括但不限于治疗益处和/或预防益处。例如，治疗可以包括施用本文公开的系统或细胞群体。治疗益处是指对一种或多种治疗中的病症(例如，疾病或症状)的任何治疗上相关的改善或作用。为了预防益处，可以将组合物施用于有发生特定病症风险的受试者，或施用于报告疾病的一种或更多种生理症状的受试者，即使该病症可能尚未显现。
概述
CAR可以包含细胞外抗原识别区域，例如，scFv(单链可变片段)、跨膜区域和细胞内共刺激信号区域。CAR的细胞外结构域可以识别特定抗原，然后通过细胞内结构域转导信号，从而引起T细胞激活和增殖、细胞溶解毒性和细胞因子的分泌，从而消除靶细胞。首先可以分离、激活和基因工程化患者的自体T细胞(或异源供体)以产生CAR-T细胞，然后将其注射到同一患者中。以这种方式，可以降低移植物抗宿主病的可能性，并且抗原可以非MHC限制的方式被T细胞识别。另外，CAR-T可以治疗表达抗原的所有癌症。
本公开提供了工程化细胞(如免疫细胞)的组合物和方法，使得其可以通过双特异性或多价CAR靶向疾病相关抗原(例如，肿瘤相关抗原或肿瘤细胞标志物)和免疫细胞抗原(例如，CD3、CD7或CD137)。例如，本公开提供了工程化免疫细胞，其可以靶向肿瘤细胞标志物和免疫细胞抗原，例如CD3。内源性TCR可以被灭活(例如，被破坏、抑制、敲除或沉默)。本公开的靶向肿瘤细胞标志物和免疫细胞抗原的CAR-T可以消除阳性肿瘤细胞并清除宿主免疫细胞抗原阳性T细胞和NK细胞，从而避免宿主排斥(HVG)。在本公开中，可以敲除工程化免疫细胞的内源性TCR，并且可以预防移植物抗宿主病(GVHD)，从而制备多用途或通用CAR-T(UCAR-T)细胞。工程化免疫细胞可以源自于自体T细胞或同种异体T细胞。
此外，工程化免疫细胞可以包含细胞自杀元件(例如，诱导型细胞死亡部分)，并且CAR-T可以在任何时间被灭活/清除以减少副作用。在一些情况下，工程化免疫细胞可以进一步包含增强子部分。当将工程化免疫细胞施用于受试者时，增强子部分可以调节工程化免疫细胞的一种或多种活性。例如，增强子部分可以是细胞因子(例如，IL-5或IL-7)或细胞因子受体(例如，IL-5R或IL-7R)。增强子部分可以增强工程化免疫细胞内的信号传导通路，例如STAT5信号传导通路。在一些实施方案中，工程化免疫细胞包含靶向CD19和CD3两者的双特异性CAR。在该实施例中显示的工程化免疫细胞可进一步包含诱导型细胞死亡部分，例如截短的表皮生长因子受体(EGFRt或tEGFR，其可在本文中可互换使用；参见美国专利号9447194B2和PCT公开号WO2018038945)。
诱导型细胞死亡部分或增强子部分可通过单独的表达载体引入到免疫细胞中。在一些情况下，诱导型细胞死亡部分和增强子部分可通过包含编码两个部分的序列的表达载体被引入免疫细胞中。在一些情况下，将诱导型细胞死亡部分和增强子部分连接并且表达为嵌合多肽。
本文提供的工程化免疫细胞在细胞治疗中的应用可以治疗患者的疾病(例如，癌症)，预先大规模制备以避免GVHD和HvG，降低治疗成本，如果必要时随时使CAR-T灭活，减少免疫疗法的副作用，和确保产品安全。本文提供的工程化细胞可以称为通用CAR T细胞(UCAR-T细胞)。
嵌合抗原受体(CAR)
本文提供的细胞(例如，免疫细胞或工程化免疫细胞)可包含一种或多种CAR。CAR可以包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。细胞外结构域可包括靶标特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域可包括共刺激信号区域和ζ(ζ)链部分。共刺激信号传导区域是指CAR的包含共刺激分子的胞内结构域的部分。共刺激分子是除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子，其可能是淋巴细胞对抗原的有效应答所必需的。在CAR的细胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞质结构域和跨膜结构域之间，可以引入间隔结构域。如本文所用，术语“间隔结构域”通常是指任何寡肽或多肽，该寡肽或多肽功能是将跨膜结构域连接至多肽链中的细胞外结构域或胞质结构域。间隔结构域可以包含多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，且最优选25至50个氨基酸。
关于跨膜结构域，可以将CAR设计为包含与CAR的胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方案中，使用与CAR中的一个结构域天然相关的跨膜结构域。在一些情况下，可以通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
跨膜结构域可以源自于天然或合成来源。在来源是天然的情况下，结构域可源自于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在本公开中特别使用的跨膜区域可以源自于α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的(例如，至少包含其跨膜区域)、或源自于免疫球蛋白，例如IgG4。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。优选地，在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短寡肽或多肽接头，优选长度在2至10个氨基酸之间，可以形成CAR的跨膜结构域和胞质信号传导结构域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸二联体提供了特别合适的接头。
本公开的CAR的胞质结构域或另外细胞内信号传导结构域可负责激活其中已经放置了CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的特定功能。T细胞的效应子功能例如可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白质的转导效应子功能信号并指导细胞执行特定功能的部分。尽管通常可以使用整个细胞内信号传导结构域，但是在许多情况下，不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，只要其转导效应子功能信号，就可以使用此类截短部分代替完整链。因此，术语细胞内信号传导结构域旨在包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于本公开的CAR的细胞内信号传导结构域的实例包括在抗原受体接合后协同作用以启动信号转导的TCR和共受体的胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体以及具有相同功能能力的任何合成序列。
仅通过TCR产生的信号可能不足以完全激活T细胞，并且可能包含次级或共刺激信号。因此，可以说T细胞激活是由两种不同类别的胞质信号序列介导的：通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些(初级胞质信号序列)和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质信号序列)。
初级胞质信号序列可以刺激或抑制方式调节TCR复合物的初级激活。以刺激方式起作用的初级胞质信号序列可能包含信号基序，这些基序已知为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。在本公开中特别有用的包含初级胞质信号转导序列的ITAM的实例包括那些源自于TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。特别优选地，本公开的CAR中的胞质信号传导分子包含源自于CD3-ζ的胞质信号序列。
在一些实施方案中，可以将CAR的胞质结构域设计成包含CD3-ζ信号传导结构域本身，或者与在本公开的CAR的上下文中有用的任何其他期望的胞质结构域(多种)组合。例如，CAR的胞质结构域可包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导区域。共刺激信号传导区域是指CAR的包含共刺激分子的胞内结构域的部分。共刺激分子是淋巴细胞对抗原做出有效应答可能需要的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3，和与CD83特异性结合的配体等。因此，虽然在某些情况下以4-1BB作为共刺激信号传导元件来举例说明本公开，但是其他共刺激元件也在本发明的范围内。
本公开的CAR的胞质信号传导部分内的胞质信号传导序列可以以随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头(优选长度在2至10个氨基酸之间)可以形成连接。甘氨酸-丝氨酸二联体提供了特别合适的接头。
在一些实施方案中，将胞质结构域设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在另一个实施方案中，将胞质结构域设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在另一个实施方案中，将胞质结构域设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域以及CD28和4-1BB的信号传导结构域。
本文提供的CAR可包含一个或多个抗原结合结构域。在一些情况下，本文提供的CAR包含可以靶向免疫细胞抗原(例如，以抑制T细胞或NK细胞的杀死活性)和疾病相关抗原(例如，肿瘤相关抗原)两者的抗原结合结构域。例如，靶向免疫细胞抗原和癌症抗原两者的抗原结合结构域包括但不限于CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD69、CD100、CD122、CD132、CD137、CD161、CD159a、CD159c、CD279、CD314、CD319(CS1)和TCR。
在一些情况下，本文提供的CAR包含两个抗原结合结构域使得一个单个CAR是靶向两个不同抗原的双特异性CAR。对于双特异性CAR，一个抗原结合结构域可以靶向免疫细胞抗原，且另一个抗原结合结构域可以靶向疾病相关抗原。双特异性CAR的两个抗原结合结构域可以具有串联结构、平行结构或环结构。
例如，CAR可以靶向肿瘤细胞标志物和CD3。CAR可以具有式I的结构：L-scFv1-I-scFv2-H-TM-C-CD3ζ(I)，其中每个“-”独立地为肽接头或肽键；L任选地是信号肽序列；I是柔性接头；H任选地为铰链区；TM是跨膜结构域；C是共刺激结构域；CD3ζ是源自于CD3ζ的胞质信号传导序列；scFv1和scFv2之一是靶向肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域，且另一个是靶向CD3的抗原结合结构域。CAR可以具有式II或II’的结构：L-VL-scFv-VH-H-TM-C-CD3ζ(II)、L-VH-scFv-VL-H-TM-C-CD3ζ(II')，其中每个“-”独立地为肽接头或肽键；如上所述的元素L、H、TM、C和CD3ζ；scFv是靶向肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域，VH是抗CD3抗体重链可变区，且VL是抗CD3抗体的轻链可变区，或scFv是靶向CD-3的抗原结合结构域，VH是抗肿瘤细胞标志物抗体重链可变区，且VL是抗肿瘤细胞标志物抗体轻链可变区。
在一些情况下，CAR可包含EGFRt-CD3 scFv-CD19 scFv-铰链-TM-CD28/41BB-CD3ζ的结构，其中EGFRt是截短的EGFR，作为安全开关(例如，诱导型细胞死亡部分)，CD3 scFv是通过GS接头连接的单克隆抗体OKT3或UCHT1的重链和轻链可变区的svFCv片段，且CD19scFv片段是通过GS接头连接的单克隆FMC63抗体的重链和轻链可变区。CAR的结构还可包含铰链、跨膜区、CD28或41BB的共刺激信号传导区和/或CD3ζ细胞内结构域。在本公开中，可将EGFRt-CD3 scFv-CD19 scFv-铰链-TM-CD28/41BB-CD3ζ的核酸构建体插入载体(例如，慢病毒载体)中。该载体可以包装在293T细胞中。可以从PBMC中分选T细胞，并在激活后通过CRISPR/CAS技术敲除TCR和PD-1基因。然后可以用载体感染T细胞以表达CAR。制备的CAR-T细胞可用于通过流式细胞术检测CAR的感染效率和基因编辑效率。
上述实例的免疫细胞标志物，例如CD3，可以用其他免疫细胞标志物，例如CD7和CD137代替。
在一些情况下，CAR包含以串联形式排列的两个抗原结合结构域。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域从氨基末端到羧基末端排列为：(i)VL2-VH2-VL1-VH1；(ii)VL2-VH2-VH1-VL1；(iii)VL1-VH1-VL2-VH2；(iv)VL1-VH1-VH2-VL2；(v)VH2-VL2-VL1-VH1；(vi)VH2-VL2-VH1-VL1；(vii)VH1-VL1-VL2-VH2；或(viii)VH1-VL1-VH2-VL2，其中VH1是第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是第一抗原结合结构域的轻链可变结构域，VH2是第二抗原结合结构域的重链可变结构域，且VL2是第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。例如，CAR可以具有由下式IV或IV’表示的结构：L3-scFv1-R-scFv2-H3-TM3-C3-CD3ζ(IV)；L3-scFv2-R-scFv1-H3-TM3-C3-CD3ζ(IV’)，其中每个“-”独立地为肽接头或肽键；L3是任选的信号肽序列；scFv1是靶向肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域；R是刚性或柔性接头；scFv2是靶向T细胞和NK细胞共有标志物的抗原结合结构域(例如，抗体单链可变区序列)；H3是任选的铰链区域；TM3是跨膜结构域；C3是共刺激结构域；CD3ζ是源自于CD3ζ的胞质信号传导序列。
在一些情况下，CAR包含两个以环形式排列的抗原结合结构域。在一些情况中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域从氨基末端到羧基末端排列为：(i)VL2-VH1-VL1-VH2；(ii)VH2-VL1-VH1-VL2；(iii)VL1-VH2-VL2-VH1；(iv)VH1-VL2-VH2-VL1；(v)VL2-VL1-VH1-VH2；(vi)VH2-VH1-VL1-VL2；(vii)VL1-VL2-VH2-VH1；或(viii)VH1-VH2-VL2-VL1，其中VH1是第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是第一抗原结合结构域的轻链可变结构域，VH2是第二抗原结合结构域的重链可变结构域，且VL2是第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。例如，CAR可以具有下式VI、VI’、VI’或VI”’结构：L8-VL1-VH2-I-VL2-VH1-H8-TM8-C8-CD3ζ(VI)；L8-VH1-VL2-I-VH2-VL1-H8-TM8-C8-CD3ζ(VI’)；L8-VL2-VH1-I-VL1-VH2-H8-TM8-C8-CD3ζ(VI’)；L8-VH2-VL1-I-VH1-VL2-H8-TM8-C8-CD3ζ(VI”)，其中每个“-”独立地为肽接头或肽键；L8是任选的信号肽序列；VH1是抗肿瘤细胞标志物抗体重链可变区，且VL1是抗肿瘤细胞标志物抗体轻链可变区；VH2是抗T细胞和NK细胞共有标志物(例如CD7或CD2)抗体重链可变区；且VL2是抗T细胞和NK细胞共有标志物(例如CD7或CD2)抗体轻链可变区；I是柔性连接；H8是任选的铰链区域；TM8是跨膜结构域；C8是共刺激结构域；CD3ζ是源自于CD3ζ的胞质信号传导序列。
在一些情况下，包含两个抗原结合结构域的CAR以平行形式排列。平行形式可以包含具有第一抗原结合结构域的第一CAR的完整构建体，该第一CAR的完整构建体与具有第二抗原结合结构域的第二CAR的完整构建体连接。平行形式的实例可以是tEGFR-CD19 scFv-CD28-CD3ζ-CD3 scFv-41BB-CD3ζ。此处示出的tEGFR可以用作安全开关，其可以被本公开中所描述的其他安全开关代替。如本文所述，CD19 scFv和CD3 scFv是抗原结合结构域的两个实例，其可以被本公开中描述的各种抗原结合结构域代替。CD28可以是跨膜结构域的实例，并且可以被本文所述的其他跨膜结构域代替。41BB可以是共刺激结构域的实例，并且可以用本文所述的其他共刺激结构域代替。在一些情况下，使用接头连接第一CAR和第二CAR。接头可以是可切割的接头。可切割的接头可以是自切割肽，例如2A自切割肽。
在本公开中还考虑了编码CAR或双特异性CAR的核酸分子。核酸可包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第一序列，其中CAR可包含结合部分，该结合部分包含(i)第一抗原结合结构域，当施用于与受试者时，该第一抗原结合结构域抑制或减少受试者对工程化免疫细胞的免疫应答，该受试者连接至(ii)能够结合至疾病相关的抗原的第二抗原结合结构域，且其中一种或多种CAR中的每个CAR还可包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。第一抗原结合结构域可以靶向选自以下的免疫细胞抗原：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ和SLAMF7。第二抗原结合结构域可以靶向疾病相关抗原，例如CD19。疾病相关抗原的其他非限制性实例包括BCMA、VEGFR2、CD19、CD20、CD30、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CD86、CD81、CD123、cd171、CD276、B7H4、CD133、EGFR、GPC3；PMSA、CD3、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2、ErbB3 HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、CD44V6、CEA、CA125、CD151、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、HVEM、MAGE-A、间皮素、NY-ESO-1、PSMA、RANK、ROR1、TNFRSF4、CD40、CD137、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、TCRa、TCRp、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robl、Frizzled、OX40、CD79b、、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R和Notch-1-4.
核酸分子还可包含编码增强子部分的第二序列，当在细胞中表达时，该增强子部分可增强CAR的一种或多种活性。增强子部分可以选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19，TGFRβ、同样的受体、其功能片段、其功能变体及其组合。核酸分子还包含编码诱导型细胞死亡部分的第二序列，当在细胞中表达时，该诱导型细胞死亡部分可在诱导型细胞死亡部分与细胞死亡激活剂接触时实现细胞的死亡。诱导型细胞死亡部分可选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8和EGFRt。
核酸分子还可包含侧接于第一序列和第二序列的第三序列，其中第三序列可以编码可切割的接头。可切割的接头可以是自切割肽。
核酸分子还可包含调节第一序列和/或第二序列的表达的调节序列。
在本公开中还考虑了包含本文所述核酸分子的试剂盒。
在一些情况下，可以将编码本文所述的CAR的核酸递送至免疫细胞中以表达CAR，产生工程化细胞。
源细胞
本公开提供了工程化细胞，例如工程化免疫细胞。工程化免疫细胞可以从分离自受试者的样品中的细胞(例如，免疫细胞)制备。工程化免疫细胞可以从细胞系细胞制备。用于制备工程化免疫细胞的免疫细胞可以是T细胞、B细胞、自然杀死(NK)细胞或巨噬细胞。用于制备工程化免疫细胞的免疫细胞可以是先天淋巴细胞(ILC)。
用于制备工程化免疫细胞的免疫细胞可以是干细胞。干细胞可以是造血干细胞(HSC)或诱导型多能干细胞(iPSC)。
免疫细胞可以包含T细胞受体(TCR)。TCR可以是免疫细胞的内源性TCR。在一些情况下，内源性TCR可能被灭活。例如，编码TCR亚基的基因可以被灭活。例如，免疫细胞可以是具有受损的TCR的αβT细胞，使得免疫细胞可以避免GVHD。又例如，内源性TCR的功能可以被抑制剂抑制，例如TCR衍生的肽，源自于融合的氨基酸序列的肽和各种病毒的其他蛋白质区域、抗体和小分子抑制剂。可以衍生TCR抑制肽的病毒包括但不限于：严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)、松鼠猴疱疹病毒(HVS)、人疱疹病毒6(HHV-6)、拉沙病毒(LASV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、莫佩亚病毒(MOPV)、塔卡里伯病毒(TACV)、弗云德鼠白血病病毒(MLV)、1型人类T淋巴细胞病毒(HTLV-1)、蜘蛛猴疱疹病毒(HVA)、马尔堡病毒(MARV)、苏丹埃博拉病毒(SEBOV)和扎伊尔埃博拉病毒(ZEBOV)。
在一些情况下，免疫细胞可以是包含可能不引起GVHD应答的TCR的T细胞。例如，免疫细胞可以是具有TCR的αβT细胞，该αβT细胞可以识别特异性抗原，例如病毒特异性抗原、肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)。又例如，免疫细胞可以是γδT细胞或自然杀死T(NKT)细胞。又例如，免疫细胞可以是由抗原特异性T细胞(例如，抗原特异性细胞毒性T细胞)产生的诱导型多能干细胞。免疫细胞可以是脐带血T细胞。
免疫细胞可以包含细胞表面标志物。细胞表面标志物可以是免疫细胞抗原。用于制备工程化免疫细胞的编码免疫细胞的免疫细胞抗原的基因可以被灭活。免疫细胞抗原的实例包括但不限于CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ和SLAMF7。例如，在一些情况下，编码免疫细胞的CD7的基因被灭活。在一些情况下，编码免疫细胞的CD3的基因被灭活。在一些情况下，编码免疫细胞的CD137的基因被灭活。
可以从受试者的样品中分离免疫细胞。受试者可以是健康供体。受试者可以患有病症(例如，诸如癌症的疾病)。样品可以是体液或组织，包括但不限于外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在一些情况下，样品包含NK细胞、NKT细胞、T细胞或T细胞祖细胞。例如，在一些情况下，样品是脐带血样品、外周血样品(例如单核细胞部分)或来自受试者的包含多能细胞的样品。在一些方面，可以培养来自受试者的样品以产生诱导型多能干(iPS)细胞，并且这些细胞用于产生NK细胞、NKT细胞或T细胞。细胞样品可以直接从受试者培养，或者可以在使用前冷冻保存。在一些方面，获得细胞样品包括收集细胞样品。在其他方面，样品是通过第三方获得的。在另外的方面，可以对来自受试者的样品进行处理以纯化或富集样品中的T细胞或T细胞祖细胞。例如，可以对样品进行梯度纯化、细胞培养物选择和/或细胞分选(例如，通过荧光激活的细胞分选(FACS))。
免疫细胞可以是NK细胞。NK细胞可以获自外周血、脐带血或本文所述的其他来源。NK细胞可以源自于诱导型多能干细胞。
在一些实施方案中，对于给定因子，可以在本文提供的方法中使用的细胞可以是阳性的或阴性的。在一些实施方案中，本文提供的方法中利用的细胞可以是CD3+细胞、CD3-细胞、CD5+细胞、CD5-细胞、CD7+细胞、CD7-细胞、CD14+细胞、CD14-细胞、CD8+细胞、CD8-细胞、CD103+细胞、CD103-细胞、CD11b+细胞、CD11b-细胞、BDCA1+细胞、BDCA1-细胞、L-选择素(selectin)+细胞、L-选择素-细胞、CD25+、CD25-细胞、CD27+、CD27-细胞、CD28+细胞、CD28-细胞、CD44+细胞、CD44-细胞、CD56+细胞、CD56-细胞、CD57+细胞、CD57-细胞、CD62L+细胞、CD62L-细胞、CD69+细胞、CD69-细胞、CD45RO+细胞、CD45RO-细胞、CD127+细胞、CD127-细胞、CD132+细胞、CD132-细胞、IL-7+细胞、IL-7-细胞IL-15+细胞、IL-15-细胞、凝集素样受体G1阳性细胞、凝集素样受体G1阴性细胞或其分化的或去分化的细胞。细胞表达的因子的实例不旨在是限制性的，并且本领域技术人员将理解，对于本领域已知的任何因子，细胞可以是阳性或阴性的。在一些实施方案中，细胞对于两种或多种因子可以是阳性的。例如，细胞可以是CD4+和CD8+。在一些实施方案中，细胞对于两种或多种因子可以是阴性的。例如，细胞可以是CD25-、CD44-和CD69-。在一些实施方案中，细胞对于一种或多种因子可以是阳性的，而对于一种或多种因子可以是阴性的。例如，细胞可以是CD4+和CD8-。在一些方面，本文提供的细胞标志物可用于选择、富集或消减细胞群。在一些方面，富集包括选择单核细胞部分。在一些方面，富集包括从单核细胞部分分选免疫细胞群。在一些实施方案中，可以针对具有或不具有一种或多种给定因子来选择细胞(例如，可以基于一种或多种因子的存在或不存在来分离细胞)。在一些实施方案中，所选择的细胞也可以在体外转导和/或扩增。所选择的细胞可以在输注之前在体外扩增。在一些实施方案中，可以用本文提供的载体转导选择的细胞。应当理解，本文公开的任何方法中使用的细胞可以是本文公开的任何细胞的混合物(例如，两种或多种不同的细胞)。例如，本公开的方法可以包括细胞，并且细胞是CD4+细胞和CD8+细胞的混合物。在另一个实例中，本公开的方法可以包括细胞，并且细胞是CD4+细胞和幼稚细胞的混合物。在一些情况下，细胞可以是由CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L+(L-选择素)、CD27+、CD28+和IL-7Rα+组成的干记忆TSCM细胞，干记忆细胞可以还表达CD95、IL-2Rβ、CXCR3和LFA-1，并显示出许多干记忆细胞特有的功能属性。本文提供的细胞也可以是包含L-选择素和CCR7的中枢记忆TCM细胞，其中中枢记忆细胞可以分泌例如IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4。细胞也可以是包含L-选择素或CCR7的效应记忆TEM细胞，并产生例如效应细胞因子，例如IFNγ和IL-4。在一些情况下，可以将细胞群引入受试者中。例如，细胞群可以是T细胞和NK细胞的组合。在其他情况下，群可以是幼稚细胞(
Figure BDA0003141784850000441
cell)和效应细胞的组合。细胞群可以是TIL。
源免疫细胞可以是T细胞。T细胞可以是αβT细胞或γδT细胞。T细胞可从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织、和肿瘤。在本公开的某些实施方案中，可以使用各种T细胞系。在本公开的某些实施方案中，T细胞可以使用本领域技术人员已知的许多技术(FicollTM分离)从采集自受试者的血液单位中获得。在一些实施方案中，来自个体循环血液的细胞是通过单采血液成分法(apheresis)获得的。单采血液成分法产品通常包含淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施方案中，可以洗涤通过单采血液成分法收集的细胞以除去血浆部分并将细胞置于适当的缓冲液或介质中以用于随后的处理步骤。在本公开的一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在替代实施方案中，洗涤溶液缺少钙，且可能缺少镁，或者可能缺少许多(如果不是全部的话)二价阳离子。在不存在钙的情况下的初始激活步骤可能导致放大的激活。洗涤步骤可以通过诸如使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics细胞回收器5)的方法、根据制造商的说明书来完成。在洗涤后，可以将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，诸如例如无Ca2+，无Mg2+的PBS、勃脉力(PlasmaLyte)A或具有或不具有缓冲液的其他盐溶液。或者，可以除去单采血液成分法样品的不期望的组分，并将细胞直接重悬浮在培养基中。
在另一个实施方案中，例如通过裂解红细胞和消耗单核细胞(例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析)，从外周血淋巴细胞中分离T细胞。T细胞的特定亚群可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离，例如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，在一个实施方案中，通过与抗CD3/抗CD28(即，3×28)-缀合的珠，例如
Figure BDA0003141784850000451
M-450CD3/CD28 T孵育足以阳性选择所需T细胞的时间段来分离T细胞。在一个实施方案中，该时间段为约30分钟。在另外的实施方案中，该时间段的范围为30分钟到36小时或更长时间，以及其间的所有整数值。在另一个实施方案中，该时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在另一个优选的实施方案中，该时间段是10至24小时。在一些实施方案中，孵育时间段是24小时。为了从白血病患者中分离出T细胞，使用更长的孵育时间(例如24小时)可以提高细胞产量。与其他细胞类型相比，在T细胞较少的任何情况下，可以使用更长的孵育时间来分离T细胞。此外，使用更长的孵育时间可以提高捕获CD8+T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长T细胞与CD3/CD28珠结合的时间和/或通过增加或降低珠与T细胞的比率(如本文进一步所述)，可以在培养开始时或该过程期间的其他时间点优先选择支持或反对的T细胞的亚群。另外，通过增加或减少珠或其他表面上抗CD3和/或抗CD28抗体的比例，可以在培养开始时或其他期望的时间点优先选择支持或反对的T细胞的亚群。在一些情况下，也可以使用多轮选择。在一些实施方案中，执行选择程序并在激活和扩增过程中使用“未选择的”细胞可能是有用的。“未选择的”细胞也可以进行更多各轮的选择。
通过阴性选择富集的T细胞群体可以通过针对阴性选择细胞特有的表面标志物的抗体的组合来完成。示例性方法可以是通过阴性磁性免疫粘附或流式细胞术进行的细胞分选和/或选择，其使用针对存在于阴性选择细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方案中，可能需要富集或阳性选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。或者，在某些实施方案中，通过抗C25缀合珠或其他类似的选择方法来耗尽T调节细胞。
为了通过阳性或阴性选择分离期望的细胞群，可以改变细胞和表面(例如颗粒，例如珠)的浓度。在某些实施方案中，可能期望显著减小珠和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用了20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方案中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在另外的实施方案中，使用大于100百万个细胞/ml。在另外的实施方案中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50百万个细胞/ml的细胞浓度。在另一个实施方案中，使用75、80、85、90、95或100百万个细胞/ml的细胞浓度。在另外的实施方案中，可以使用125或150百万个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致增加的细胞产量、细胞激活和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度可允许更有效地捕获可能弱表达目标靶抗原的细胞(例如CD28阴性T细胞)，或者来自存在许多肿瘤细胞的样品(例如，白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。此类细胞群可能具有治疗价值，并且将是期望获得的。例如，使用高浓度的细胞可允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在相关的实施方案中，可以使用较低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如颗粒，例如珠)的混合物，使颗粒和细胞之间的相互作用最小化。该方法可以选择表达大量待与颗粒结合的期望抗原的细胞。例如，稀释浓度的CD4+T细胞表达更高水平的CD28，并且比CD8+T细胞更有效地被捕获。在一些实施方案中，使用的细胞的浓度为5×106/ml。在其他实施方案中，使用的浓度可为约1×105/ml至1×106/ml，并且介于两者之间的任何整数值。在其他实施方案中，可以在旋转器上以2-10℃或在室温下以不同的速度将细胞孵育不同的时间长度。
用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论的束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过去除细胞群中的粒细胞和某种程度上去除单核细胞提供了更均匀的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。尽管许多冷冻溶液和参数是本领域已知的，并且在该上下文中将是有用的，但一种方法涉及使用包含20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或包含10％葡聚糖40和5％葡萄糖，20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基、或31.25％勃脉力-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO或包含例如羟乙基淀粉(Hespan)和勃脉力A的其他合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃，并储存在液氮储存罐的气相中。可以使用其他受控冷冻的方法以及在-20℃或在液氮中立即进行非受控冷冻。
在一些实施方案中，如本文所述将冷冻保存的细胞解冻并洗涤，并在使用本公开的方法激活之前使其在室温下静置一小时。
在一些实施方案中、在任何数量的相关治疗方式之前，从受试者的血液样品或单采血液成分中分离细胞，包括但不限于用试剂诸如那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒剂的试剂、化学疗法、放射、免疫抑制剂如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酯和FK506、抗体，或其他免疫消融剂(immunoablative agent)如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228和放射来处理。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢素和FK506)或抑制其对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu et al.,Cell 66:807-815,1991；Henderson et al.,Immun.73:316-321,1991；Bierer et al.,Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993)。在另外的实施方案中，分离出患者的细胞并冷冻，以随后与骨髓或干细胞移植，使用化学治疗剂(例如氟达拉滨)的T细胞消融疗法、外束放射治疗(XRT)、环磷酰胺或抗体(诸如OKT3或CAMPATH)联合使用(例如，在之前、同时或之后)。在另一个实施方案中，细胞在B细胞消融疗法之前被分离并且可以被冷冻以随后用于以后的治疗，例如与CD20反应的试剂例如利妥昔单抗。
工程化免疫细胞
本文提供的工程化免疫细胞可以表现出对肿瘤细胞的增强活性，但是具有降低的副作用，例如GVHD。工程化免疫细胞可以靶向疾病相关抗原(例如，肿瘤相关抗原或肿瘤细胞标志物)，同时抑制宿主免疫细胞。可以使工程化免疫细胞的一种或多种内源基因(例如，编码TCR的亚基的基因或编码细胞表面标志物的基因)灭活。在一些情况下，工程化免疫细胞包含各自靶向不同抗原的第一CAR和第二CAR。在一些情况下，工程化免疫细胞包含具有第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的CAR。
工程化免疫细胞可以包含一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，该一种或多找CAR包含结合部分。结合部分可包含能够结合免疫细胞抗原的第一抗原结合结构域和能够结合疾病相关抗原的第二抗原结合结构域。一种或多种CAR中的每个CAR还可包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。工程化免疫细胞还可包含能够增强工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分。工程化免疫细胞的内源性T细胞受体(TCR)可被灭活。在一些情况中，与包含一种或多种CAR但不包含增强子部分的其他工程化免疫细胞相比，工程化免疫细胞可(i)在存在与工程化免疫细胞异源的细胞的情况下通过在体外保持存活至少约20天而表现出来增强的持久性程度，(ii)在15天内表现出至少约10倍的增强的扩增程度，或(iii)对包含免疫细胞抗原或疾病相关抗原的靶细胞表现出增强的细胞毒性。在一些情况下，工程化免疫细胞的特征可在于表现出(i)增强的持久性程度，(ii)增强的扩增程度，和(iii)增强的细胞毒性中的两种或多种。(i)、(ii)和/或(iii)特征可以在不存在任何外源性增强子部分(如外源性细胞因子)的情况下测量。
工程化免疫细胞可以包含多特异性CAR。在一些情况下，工程化免疫细胞包含靶向免疫细胞抗原和疾病相关抗原的双特异性CAR。双特异性CAR的两个抗原结合结构域可以如本公开中描述的任何形式排列，例如平行形式、环形式和串联形式。例如，本文所述的工程化免疫细胞可包含单个嵌合抗原受体(CAR)，该CAR包含(i)特异性结合CD7的第一抗原结合结构域和(ii)能够结合疾病相关抗原的第二抗原结合结构域。CAR还可包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在各种情况下，编码内源CD7的基因可以在工程化免疫细胞中灭活(例如，沉默或敲除)。
免疫细胞抗原可选自：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ和SLAMF7。在一些情况下，免疫细胞抗原是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD69、CD100、CD122、CD132、CD137、CD161、CD159a、CD159c、CD279、CD314、CD319(CS1)、TCRα或TCRβ。在一些情况下，免疫细胞抗原是CD2、CD3、CD5、CD7或CD137。在一些情况下，免疫细胞抗原是CD7。增强子部分可以被配置为组成性地增强工程化免疫细胞的一种或多种活性。可将增强子部分配置为组成性地上调工程化免疫细胞的一种或多种细胞内信号传导通路。一种或多种细胞内信号传导通路可以是一种或多种细胞因子信号传导通路。增强子部分可以通过自寡聚而自激活。增强子部分可以通过自二聚化而自激活。
增强子部分可以是细胞因子或细胞因子受体。增强子部分可以选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19，TGFRβ、同样的受体、其功能片段、其功能变体及其组合。
在一些情况下，可以使编码工程化免疫细胞的内源性TCR的亚基的基因灭活，从而使内源性TCR灭活。编码亚基的基因可以是TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ或CD3ζ。
工程化免疫细胞还可包含诱导型细胞死亡部分，该诱导型细胞死亡部分可在与细胞死亡激活剂接触时实现工程化免疫细胞的自杀。诱导型细胞死亡部分可选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8和EGFRt。在一些情况下，诱导型细胞死亡部分是EGFRt，并且细胞死亡激活剂是结合EGFRt的抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，诱导型细胞死亡部分是HSV-TK，并且细胞死亡激活剂是GCV。在一些情况下，诱导型细胞死亡部分是iCasp9，并且细胞死亡激活剂是AP1903。细胞死亡激活剂可包含核酸、多核苷酸、氨基酸、多肽、脂质、碳水化合物、小分子、酶、核糖体、蛋白酶体、其变体或其任何组合。
工程化免疫细胞的一种或多种内源性人白细胞抗原(HLA)基因的表达可保持完整。在一些情况下，工程化免疫细胞的内源性HLA-I和/或HLA-II基因的表达可保持完整。工程化免疫细胞的内源性HLA-E和/或HLA-G和/或HLA-C基因的表达可保持完整。
工程化免疫细胞的一种或多种内源性HLA基因的表达可被上调。在一些情况下，工程化免疫细胞的内源性HLA-E和/或HLA-G和/或HLA-C基因的表达被上调。
工程化免疫细胞的一种或多种内源性HLA基因的表达可以被敲除或部分敲除。例如，HLA-I/HLA-II或两者均可被敲除。在一些情况下，HLA-1、HLA-2或两者可以被部分敲除。在一些情况下，HLA-I/II可被部分敲除。在一些情况下，内源性HLA可以被敲除以降低T细胞杀死活性，但保持抗NK杀死功能。例如，HLA-A/B可以被敲除，同时将HLA-C/E保留在工程化免疫细胞中。在一些情况下，HLA-A、HLA-B或两者都被敲除。在一些情况下，HLA-C、HLA-E或两者均保持完整。在一些情况下，工程化免疫细胞的杀死/吞噬细胞抑制剂可以过表达。在一些其他情况下，内源性HLA可以用杀死/吞噬细胞抑制剂的共表达而被敲除。例如，HLA-1、HLA-II或两者可以用杀死/吞噬细胞抑制剂的共表达被敲除。杀死/吞噬细胞抑制剂可以抑制对工程化免疫细胞的免疫应答。杀死/吞噬细胞抑制剂包括但不限于CD47、CD24、FASL、PDL1或其功能结构域。
本文所述的疾病相关抗原可以是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域可以是抗体或其片段，例如，scFv或单结构域抗体。
可将编码工程化免疫细胞的内源性表面标志物的基因灭活，其中所述内源性表面标志物在表达时能够与第一抗原结合结构域结合。内源性表面标志物可以是CAR靶向的抗原。在各种实施方案中，当工程化免疫细胞的CAR靶向由工程化免疫细胞内源表达的抗原时，内源抗原或编码这种抗原的基因可以被灭活(例如，破坏、抑制、沉默或敲除)。可以使用本文描述的各种基因编辑方法。内源性表面标志物可以是例如，CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ和SLAMF7。
本文提供的工程化免疫细胞可以包含嵌合多肽，该嵌合多肽包含(i)能够增强工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分，和(ii)当嵌合多肽与细胞死亡激活剂接触时能够实现工程化免疫细胞死亡的诱导型细胞死亡部分，其中增强子部分与诱导型细胞死亡部分连接。在一些情况下，增强子部分和诱导型部分可以通过接头连接。接头可以是可切割接头，例如自切割肽。工程化免疫细胞还可包含一种或多种嵌合多肽受体(CPR)，该一种或多种CPR包含结合部分，其中结合部分包含(i)第一抗原结合结构域，当施用于受试者时该第一抗原结合结构域抑制或降低受试者对工程化免疫细胞的免疫应答和(ii)能够与疾病相关抗原结合的第二抗原结合结构域。一种或多种CPR中的单个CPR可包含(i)第一抗原结合结构域，(ii)第二抗原结合结构域，或(iii)第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域两者。一种或多种CPR的CPR还可包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些情况下，工程化免疫细胞中的一种或多种CPR是一种或多种嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。在一些情况下，工程化免疫细胞包含CAR和工程化TCR两者。工程化TCR可以是TCR融合蛋白。例如，TCR融合蛋白可包含与TCR复合物的一个或多个亚基融合的异源抗原结合结构域。在一些情况下，TCR融合蛋白可以包含TCR亚基，该TCR亚基包含TCR胞外结构域和TCR胞内结构域的至少一部分；和包含抗原结合结构域的抗体结构域，其中TCR亚基和抗体结构域连接。当在T细胞中表达时，TCR融合蛋白可以并入TCR复合物中。在一些情况下，TCR融合蛋白还可包含TCR跨膜结构域。TCR胞外结构域、TCR胞内结构域或TCR跨膜结构域可源自于TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ε、CD3γ、CD3δ或CD3ζ。在一些情况下，包括工程化TCR的工程化免疫细胞的内源性TCR被灭活。在一些情况下，包含灭活的内源性TCR的工程化免疫细胞可能不引起GVHD。例如，可以使编码内源性TCR亚基的基因灭活。对于另一个实例，可以将编码内源性TCR亚基的基因突变，使得可以不形成内源性TCR。
本文提供的工程化免疫细胞可以包含嵌合多肽，该嵌合多肽包含(i)能够增强工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分，和(ii)当嵌合多肽与细胞死亡激活剂接触时能够实现工程化免疫细胞死亡的诱导型细胞死亡部分。在一些情况下，增强子部分与诱导型细胞死亡部分连接。一种或多种嵌合抗原受体(CAR)可包含结合部分。结合部分可包含(i)第一抗原结合结构域，当施用于受试者时该第一抗原结合结构域抑制或降低受试者对工程化免疫细胞的免疫应答，和(ii)能够与疾病相关抗原结合的第二抗原结合结构域。在一些情况下，一种或多种CAR中的单个CAR包含(i)第一抗原结合结构域或(ii)第二抗原结合结构域。在一些情况下，一种或多种CAR的单个CAR包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域两者。在一些情况下，一种或多种CAR中的每个CAR还包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
工程化免疫细胞的第一抗原结合结构域可以结合免疫细胞抗原。在一些情况下，工程化免疫细胞的内源性T细胞受体(TCR)被灭活。可以使用各种方法来灭活内源性TCR。例如，可将编码内源性TCR的亚基的基因灭活，使得内源性TCR灭活。编码亚基的基因可以是TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ或CD3ζ。
嵌合多肽可以包含或不包含侧接增强子部分和诱导型细胞死亡部分的任何自切割肽。增强子部分可以被配置为组成性地增强工程化免疫细胞的一种或多种活性。可将增强子部分配置为组成性地上调工程化免疫细胞的一种或多种细胞内信号传导通路。一种或多种细胞内信号传导通路可以是一种或多种细胞因子信号传导通路。增强子部分可以通过自寡聚而自激活。增强子部分可以通过自二聚化而自激活。
本文所述的嵌合多肽可以是分泌型蛋白质。嵌合多肽可以是细胞内蛋白。嵌合多肽可以是跨膜蛋白。增强子部分或诱导型细胞死亡部分可包含在跨膜蛋白的胞外结构域中。增强子部分或诱导型细胞死亡部分包含在跨膜蛋白的胞内结构域中。增强子部分可以包含在跨膜蛋白的胞内结构域中，且诱导型细胞死亡部分可以包含在跨膜蛋白的胞外结构域中。增强子部分可以包含在跨膜蛋白的胞外结构域中，且诱导型细胞死亡部分可以包含在跨膜蛋白的胞内结构域中。增强子部分可以是细胞因子或细胞因子受体。例如，增强子部分可以选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19，TGFRβ、同样的受体、其功能片段、其功能变体及其组合。诱导型细胞死亡部分可选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8和EGFRt。在一些情况下，诱导型细胞死亡部分是EGFRt，并且细胞死亡激活剂是结合EGFRt的抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，诱导型细胞死亡部分是HSV-TK，并且细胞死亡激活剂是GCV。在一些情况下，诱导型细胞死亡部分是iCasp9，并且细胞死亡激活剂是AP1903。细胞死亡激活剂可包含核酸、多核苷酸、氨基酸、多肽、脂质、碳水化合物、小分子、酶、核糖体、蛋白酶体、其变体或其任何组合。
工程化免疫细胞可以是CAR-T细胞。CAR-T细胞可以表达靶向肿瘤细胞标志物和CD3的CAR。内源性CD3基因的表达可以在CAR-T细胞中沉默。CAR可以是靶向肿瘤细胞标志物和CD3的单个CAR。CAR可以包括靶向肿瘤细胞标志物的第一CAR和靶向CD3的第二CAR。CAR-T细胞可以具有以下特征中的一种或多种：(a)PD-1基因的表达在CAR-T细胞中沉默；(b)TCR基因的表达在CAR-T细胞中沉默；(c)CAR-T细胞表达外源细胞自杀元件(例如，诱导型细胞死亡部分)。
工程化免疫细胞可以表达CAR和/或外源TCR，并且CAR和/或外源TCR靶向肿瘤细胞标志物。工程化免疫细胞可包含增强的细胞因子相关信号传导通路。细胞因子相关信号传导通路可包括选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21或其组合的细胞因子的相关信号传导通路。增强细胞因子相关信号传导通路可以包括引入编码细胞因子和/或其受体的基因、上调编码细胞因子和/或其受体的基因、或外源添加细胞因子、所导入的细胞因子受体或其组合。工程化免疫细胞可以是CAR-T细胞，该CAR-T细胞具有选自以下的一种或多种特征：(a)内源性TCR被沉默的基因表达；(b)表达用于细胞自杀的元件；(c)内源性HLA-I和HLA-II基因的正常表达；(d)内源性HLA-E和/或HLA-G的正常表达或过表达。
工程化免疫细胞可以包含靶向肿瘤细胞标志物的CAR或外源TCR。工程化免疫细胞可以包含靶向T细胞或NK细胞的物质。例如，工程化免疫细胞可以包含靶向T细胞和/或NK细胞的CAR。工程化免疫细胞可以包含靶向(i)肿瘤细胞标志物和(ii)T细胞和/或NK细胞标志物两者的双特异性CAR。在一些情况下，该物质是抗体。靶向T细胞和NK细胞两者的抗体可以是H-69、3A1e、3A1f、T3-3A1、RFT2、SDZ214-380(SDZCHH380)、CD7-6B7、124-1D1、4H9、RPA-2.10、TS1/8、OKT11、AB75、3E11、BH1或Lo-CD2a。
本文提供的CAR-T细胞可以是通用CAR-T细胞。CAR-T细胞可以表达靶向肿瘤细胞标志物的嵌合抗原受体CAR，并且T细胞受体与PD-1的结合受到抑制。CAR-T细胞可以靶向肿瘤细胞标志物和免疫细胞标志物，例如CD2或CD7。本文提供的CAR-T细胞中的内源性TCR表达可以通过基因编辑技术敲除。在敲除CAR-T细胞的内源性TCR后，正常细胞在同种异体输注过程中可能不会被CAR-T细胞识别并杀死。GVHD反应可以受到抑制。此外，通过CD19靶向肿瘤细胞，同时通过CD2或CD7消除宿主T细胞和/或NK细胞可以避免宿主对移植物(HVG)和/或NK杀死，并提高同种异体CAR-T细胞在受体中的存活率和抗肿瘤作用。CAR-T还可包含自杀基因开关(例如，诱导型细胞死亡部分)。可以通过打开自杀基因开关(例如，激活剂与诱导型细胞死亡部分的结合)来灭活或去除CAR-T细胞，以减少CAR-T细胞疗法的副作用。例如，本文提供的CAR可以具有CD19 scFv-CD7 scFv-铰链-TM-CD28/41BB-CD3ζ的结构，其中CD7 scFv片段是单克隆3A1e抗体，重链和轻链可变区通过GS接头连接，且CD19 scFV片段是通过GS接头连接的单克隆FMC63抗体的重链和轻链可变区。CAR还可以包括串联的铰链区和跨膜区、人CD28和/或41BB细胞内共刺激元件，以及人CD3细胞内结构域。在本公开的一些情况下，可以将CAR构建体CD19 scFv-CD7 scFv-铰链-TM-CD28/41BB-CD3ζ的基因片段插入慢病毒载体，并且可以将重组载体包装到293T中的病毒颗粒中。为了制备通用的CAR-T细胞，可以从外周血单核细胞中分离T细胞，并在激活后，可通过诸如CRISPR/CAS技术的基因编辑技术敲除一些内源性基因(例如CD7、TCR和PD-1基因)。接下来，T细胞可以用包含本文所述的CAR构建体的病毒颗粒感染以表达CAR。制备的CAR-T细胞可用于通过流式细胞术检测CAR的感染效率和基因编辑效率。
工程化免疫细胞可具有本文所述的一种或多种特征：(a)工程化免疫细胞的内源性CD7或CD2基因的表达被沉默；(b)工程化免疫细胞的PD-1基因表达被沉默；(c)使工程化免疫细胞的TCR基因表达被沉默；(d)工程化免疫细胞表达细胞因子或细胞因子受体复合物，并且pSTAT5信号传导水平被上调；(e)工程化免疫细胞表达外源诱导型细胞死亡部分；(f)工程化免疫细胞中的第一CAR和/或第二CAR与诱导型细胞死亡部分共表达。
工程化免疫细胞可以包含两种不同的CAR，其各自具有靶向不同抗原的不同抗原结合结构域。工程化免疫细胞可以包含单个CAR，其还包含靶向两种不同抗原的两种抗原结合结构。在一些情况下，第一CAR和/或第二CAR通过自切割元件与诱导型细胞死亡部分和/或增强子部分连接。在一些情况下，增强子部分是细胞因子或细胞因子复合物。细胞因子或细胞因子复合物的实例包括IL2、IL7、IL15、膜结合的IL15(mbIL15或mb15)和组成型激活细胞因子受体，例如IL7受体(C7R)。如本文所用，“mbIL”和“mb”可互换使用，指膜结合的白介素因子，例如，bIL7或mb7，以及mbIL17或mb17。
本文所述的工程化免疫细胞可能具有以下特征：(a)工程化免疫细胞表达CAR和/或外源性TCR，并且CAR和/或外源性TCR靶向肿瘤细胞标志物；和(b)细胞因子相关信号传导通路被增强。工程化免疫细胞可以是(i)嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)；(ii)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)；或(iii)外源性T细胞受体(TCR)T细胞(TCR-T细胞)。工程化免疫细胞可以是CAR-T细胞，优选通用CAR-T细胞(UCAR-T细胞)。如本文所用，“细胞因子相关信号传导通路”是指由细胞因子与相应受体结合，将细胞外信号转化为细胞内信号，然后细胞内信号被信号级联放大、分散和调节所引发的信号传导通路。可以产生一系列细胞应答。在一些情况下，细胞因子相关信号传导通路包括选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、25或其组合的细胞因子的相关信号传导通路。
工程化免疫细胞可以包含双特异性CAR(或双重CAR)。例如，双特异性CAR可包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域两者。第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可通过接头连接。接头可以不包含自切割肽。第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域可以是scFv。
第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可从氨基末端到羧基末端排列为：(i)VL2-VH1-VL1-VH2；(ii)VH2-VL1-VH1-VL2；(iii)VL1-VH2-VL2-VH1；或(iv)VH1-VL2-VH2-VL1，其中VH1是第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是第一抗原结合结构域的轻链可变轻链结构域，VH2是第二抗原结合结构域的重链可变结构域，且VL2是第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。
第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可从氨基末端到羧基末端排列为：(i)VL2-VH2-VL1-VH1；(ii)VL2-VH2-VH1-VL1；(iii)VL1-VH1-VL2-VH2；或(iv)VL1-VH1-VH2-VL1，其中VH1是第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是第一抗原结合结构域的轻链可变轻链结构域，VH2是第二抗原结合结构域的重链可变结构域，且VL2是第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可与免疫细胞抗原和疾病相关抗原结合。
在一些情况下，工程化免疫细胞可以不包含双特异性CAR。例如，工程化免疫细胞的单个CAR可以仅包含第一抗原结合结构域，且工程化免疫细胞的另外的单个CAR可以仅包含第二抗原结合结构域。
免疫细胞抗原可以是免疫细胞的表面蛋白或分泌型蛋白。免疫细胞可以是NK细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞或粒细胞。免疫细胞抗原可选自：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ和SLAMF7。
疾病相关抗原可以是肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原可以是CD19或本文所述的其他抗原。在一些情况下，第一抗原结合结构域可与选自CD2、CD3、CD5、CD7和CD137的免疫细胞抗原结合，并且第二抗原结合结构域可与CD19结合。在一些情况下，第一抗原结合结构域可与CD3结合，并且第二抗原结合结构域可与CD19结合。在一些情况下，第一抗原结合结构域可与CD7结合，并且第二抗原结合结构域可与CD19结合。在一些情况下，第一抗原结合结构域可与CD137结合，并且第二抗原结合结构域可与CD19结合。工程化免疫细胞的一种或多种内源性人白细胞抗原(HLA)基因的表达可保持完整。工程化免疫细胞的内源性HLA-I和/或HLA-II基因的表达可保持完整。工程化免疫细胞的内源性HLA-E和/或HLA-G和/或HLA-C基因的表达可保持完整。工程化免疫细胞的一种或多种内源性HLA基因的表达可被上调。工程化免疫细胞的内源性HLA-E和/或HLA-G和/或HLA-C基因的表达可被上调。
在各种实施方案中，工程化免疫细胞是T细胞、NKT细胞或NK细胞。在一些情况下，工程化免疫细胞源自干细胞。干细胞可以是造血干细胞(HSC)或诱导型多能干细胞(iPSC)。
本文提供的细胞(例如，工程化免疫细胞)可以包含一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，该一种或多种CAR包含结合部分，其中所述结合部分可包含能够结合免疫细胞抗原的抗原结合结构域。一种或多种CAR中的每个CAR还可包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。细胞还可包含能够增强细胞的一种或多种活性的增强子部分，其中细胞的内源性T细胞受体(TCR)可被灭活。
增强子部分可以增强细胞的一种或多种活性。增强子部分可以被配置为组成性地增强细胞的一种或多种活性。可将增强子部分配置为组成性地上调细胞的一种或多种细胞内信号传导通路。例如，一种或多种细胞内信号传导通路可以是一种或多种细胞因子信号传导通路。增强子部分可以是细胞因子或细胞因子受体。增强子部分可以选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19，TGFRβ、同样的受体、其功能片段、其功能变体及其组合。
细胞还可包含在诱导型细胞死亡部分，该诱导型细胞死亡部分在诱导型细胞死亡部分与细胞死亡激活剂接触时能够实现细胞死亡。诱导型细胞死亡部分可选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8、Her2t、CD30、BCMA和EGFRt。例如，诱导型细胞死亡部分可以是EGFRt，并且细胞死亡激活剂可以是结合EGFRt的抗体或其抗原结合片段。又例如，诱导型细胞死亡部分可以是HSV-TK，并且细胞死亡激活剂可以是GCV。又例如，诱导型细胞死亡部分可以是iCasp9，并且细胞死亡激活剂可以是AP1903。
可将编码细胞的内源性表面标志物的基因灭活，其中所述内源性表面标志物在表达时可以能够与第一抗原结合结构域结合。内源性表面标志物可以是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ或SLAMF7。
抗原结合结构域
工程化免疫细胞可以包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域。在一些情况下，工程化免疫细胞的单一或单个CAR包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域两者。在一些情况下，工程化免疫细胞的两个CAR包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，其中每个CAR仅包含一个抗原结合结构域。在一些情况下，两个工程化免疫细胞包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，每个工程化免疫细胞仅包含一种类型的抗原结合结构域。在一些情况下，第一抗原结合结构域可以靶向免疫细胞抗原，且第二抗原结合结构域可以靶向疾病相关抗原。抗原结合结构域可以是Fab、F(ab’)2、单结构域抗体、单链Fv(scFv)、centyrin、darpin或具有抗原结合特异性的其他多肽。
抗原结合结构域可以靶向免疫细胞抗原。免疫细胞抗原的实例包括但不限于CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ和SLAMF7。在一些情况下，免疫细胞抗原是在T细胞和NK细胞两者上表达的细胞标志物，包括但不限于CD2、CD7、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD69、CD100、CD122、CD132、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD178(ICOS)、CD161、CD159a、CD159c和CD314。
CD3是存在于T淋巴细胞表面上的标志物。存在三种亚型，CD3δ、CD3ε和CD3γ。CD3δ和CD3ε的分子量为20kDa，且CD3γ的分子量为26kDa，其在T淋巴细胞、胸腺细胞和NK细胞膜的表面上表达。CD3可以在61％至85％的正常外周血淋巴细胞中和在60％至85％的胸腺细胞中表达。CD3属于免疫球蛋白超家族。CD3是T淋巴细胞受体(TCR)复合物的组分，并与α-β和γ/δT淋巴细胞受体(TCR)形成复合物，TCR可能是在TCR与肽/MHC结合后传导TCR信号的主要膜蛋白。TCR对于细胞表面表达、抗原识别和信号传导是必不可少的。CD3是T淋巴细胞的表面特异性分子，通过CD3可以募集具有杀死作用的T淋巴细胞。CD3的单克隆抗体可以诱导或阻止T淋巴细胞激活。抗CD3抗体在抗CD28抗体或IL-2的存在下诱导T淋巴细胞凋亡。CD3是外周血中成熟T淋巴细胞的标志物之一。测定CD3+T淋巴细胞，以评估免疫缺陷(T淋巴细胞缺陷)、白血病、淋巴瘤(T淋巴细胞类型)的分类诊断。抗CD3单克隆抗体可用于器官移植或骨髓移植的免疫抑制疗法，也可用于严重自身免疫疾病的免疫调节治疗以去除T淋巴细胞。
在一些情况下，抗原结合结构域可以靶向CD7。CD7是跨膜蛋白，并且是免疫球蛋白超家族的成员。CD7蛋白在成熟的T细胞和NK细胞及它们的前体细胞的表面上表达。CD7可以结合其配体K12/SECTM1，并对T细胞激活起共刺激作用。在小鼠中，CD7敲除的T细胞前体可以发育为正常T细胞，而对T细胞效应子功能仅具有轻微影响。大于90％的T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)可以表达CD7，因此CD7可以是T-ALL的标志物。此外，CD7还可以在NK淋巴瘤、T细胞淋巴瘤/白血病、慢性髓细胞性白血病、急性髓系白血病和富含淋巴细胞的胸腺瘤中表达。CD7表达的示例性组织分布在图13中示出。
在一些情况下，抗原结合结构域可以靶向CD2。与CD7相似，CD2粘附分子可能在所有外周血T细胞和自然杀死细胞上表达，但在B淋巴细胞上不表达。CD2胞外结构域包含介导同二聚化的免疫球蛋白样结构域。CD2与CD58(LFA-3)或CD48的结合可以帮助T细胞粘附至抗原呈递细胞，从而触发T细胞受体的信号转导以进行抗原结合。CD2的功能可能类似于其他T细胞共刺激受体(例如CD28)。CD2基因敲除小鼠可以具有正常的免疫功能。CD2在T-ALL、T细胞淋巴瘤/白血病、急性早幼粒细胞白血病(微粒变体)、系统性肥大细胞增多症、肥大细胞疾病、胸腺瘤、和急性髓系淋巴瘤和NK细胞白血病的细胞中表达。CD2表达的示例性组织分布在图14中示出。
抗原结合结构域可以靶向CD137。CD137，也称为4-1BB，是TNF受体超家族的成员。Cd137蛋白可以是激活诱导的共刺激受体，其可以在激活的T细胞、NK细胞、树突细胞、粒细胞和其他免疫细胞类型以及某些肿瘤细胞中广泛表达。在激活的T细胞和NK细胞中发现CD137表达，而在幼稚T细胞和灭活的T细胞和NK细胞中几乎没有表达。在T细胞中，CD137可以通过TRAF2启动NF-κB通路，并参与T细胞增殖、细胞因子分泌和抗细胞凋亡。在临床应用中，CD137可用作反应性T细胞的标志物。CD137天然配体或激动性抗体对CD137信号传导通路的激活可以增加细胞因子分泌和细胞毒性淋巴细胞的抗肿瘤活性。用特异性抑制性CD137抗体抑制反应性T细胞可减少移植排斥中的自体排斥或降低由同种异体来源的自身反应性T细胞引起的GVHD应答。CD137表达可以通过TCR信号传导和细胞因子IL-2/IL-15的下游信号传导来调节。CD137分子的敲除可能对未激活状态的成熟T细胞的功能没有影响。可以将工程化免疫细胞的内源性CD137敲除，以免自相残杀(fratricide)。可以使工程化免疫细胞的内源性TCR灭活以预防GVHD。CD137表达的示例性组织分布在图51中示出。
抗原结合结构域可以靶向疾病相关抗原，例如肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原的实例包括但不限于BCMA、VEGFR2、CD19、CD20、CD30、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CD86、CD81、CD123、cd171、CD276、B7H4、CD133、EGFR、GPC3；PMSA、CD3、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2、ErbB3 HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、CD44V6、CEA、CA125、CD151、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、HVEM、MAGE-A、间皮素、NY-ESO-1、PSMA、RANK、ROR1、TNFRSF4、CD40、CD137、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、TCRa、TCRp、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robl、Frizzled、OX40、CD79b、、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R和Notch-1-4.在一些情况下，肿瘤相关抗原包括CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白(Frizzled)、OX40、Notch-1-4、APRIL、CS1、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R或TROP-2。
在一些情况下，肿瘤相关抗原是CD19。CD19是B细胞表面上的95kDa糖蛋白，其从B细胞的早期发育开始表达直至分化为浆细胞。CD19是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员，并且作为B细胞表面信号转导复合物的组成元素之一，参与B细胞受体信号转导过程的调节。在CD19缺陷小鼠模型中，外周淋巴组织中的B细胞数量可以显著减少，对疫苗和促细胞分裂剂的应答也可以降低，伴随血清Ig水平的降低。通常可以认为，CD19的表达限于B细胞谱系，并且不限于多能造血干细胞的表面。CD19也可以在大多数B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、ALL、CLL、毛细胞白血病和某些急性髓系白血病细胞的表面上表达。CD19可以作为治疗白血病/淋巴瘤中的免疫疗法的靶标。CD19可能在除B细胞以外的大多数正常细胞(包括多能造血干细胞)表面上不能表达。该功能可使CD19成为自身免疫性疾病的安全治疗靶标，因为可以使不可逆的骨髓毒性损伤的风险最小化。
本文提供的抗原结合结构域可以具有显示为VH-VL或VL-VH的结构，其中VH是抗体的重链可变区；VL是抗体的轻链可变区；“-”是接头肽(或柔性接头)或肽键。在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包括D19。在一些实施方案中，靶向CD19的抗原结合结构域包含单克隆FMC63抗体的重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，接头肽或柔性接头的序列包含2-6个，优选3-4个连续的(GGGGS)氨基酸序列。在一些实施方案中，VL1的氨基酸序列如SEQ ID NO.:87所示，且VH1的氨基酸序列如SEQ ID NO.:88所示。靶向CD19的CAR的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO.:89所示。在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向免疫细胞抗原。在一些实施方案中，免疫细胞抗原靶向CD7。在一些其他实施方案中，免疫细胞抗原靶向CD2。在一些实施方案中，CD7的单克隆抗体选自：TH-69、3A1e、3A1f、T3-3A1、RFT2、CD7-6B7、124-1D1、4H9、SDZ214-380、或其组合。在一些其他实施方案中，抗CD2的单克隆抗体选自：RPA-2.10、TS1/8、OKT11、AB75、3E11、BH1或其组合。在一些实施方案中，VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.:90所示，且VH的氨基酸序列如SEQID NO.:91所示。
增强子部分
本文提供的工程化免疫细胞可包含增强子部分。增强子部分可以调节工程化免疫细胞的一种或多种活性，例如，增强或上调一种或多种信号传导通路以增强或上调工程化免疫细胞的效应子功能。信号传导通路可以是细胞因子相关信号传导通路。增强子部分可以是细胞因子。增强子部分可以是细胞因子受体。
细胞因子相关信号传导通路可包括细胞因子相关信号传导通路。细胞因子的实例包括但不限于IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21和IL25。在一些情况下，细胞因子相关信号传导通路包括两种或多种细胞因子相关信号传导通路，其中细胞因子包括：IL-2和IL-7、IL-2和IL-15。IL-7和IL-15、IL15和IL21。细胞应答可包括调节下游基因表达、改变细胞内酶活性、改变细胞骨骼结构、改变DNA合成、促进基因转录、调节免疫细胞分化、增殖和对细胞死亡的抵抗力。在一些情况下，细胞因子相关信号传导通路被增强，包括：引入或上调编码细胞因子和/或其受体的基因、外源添加细胞因子、引入细胞因子受体、或其组合。在一些情况下，上调编码细胞因子和/或其受体的基因包括上调编码基因的转录和/或翻译水平。在一些情况下，可以通过以下方法中的一种或多种实现增强的细胞因子相关信号转导通路：在免疫细胞中表达编码细胞因子和/或其受体的基因、增加免疫细胞中编码细胞因子和/或其受体的基因的拷贝数、工程化编码基因的调节序列(例如启动子)以提高转录速度(例如转录起始速率)、修饰携带编码基因的信使RNA的翻译调节区以增强翻译强度、修饰编码基因本身以增强mRNA稳定性、蛋白质稳定性并释放蛋白质反馈抑制。
细胞因子相关的信号传导通路可通过细胞因子及其受体的膜表达、细胞因子的分泌、细胞因子和/或其受体的转录调节的增强或其组合来增强。膜表达的细胞因子及其受体可包括：IL-15及其受体(例如，mbIL15融合蛋白)、IL-7及其受体(例如，mbIL7融合蛋白)、IL-17及其受体(例如，mbIL17融合蛋白)、IL-2及其受体(例如，mbIL2融合蛋白)、IL-21及其受体(例如，mbIL21融合蛋白)、构建激活的IL-7受体(C7R)或其组合。在一些情况下，工程化免疫细胞中包含的增强子部分是分泌型细胞因子。分泌型细胞因子可以以各种机制起作用，例如，分泌型细胞因子可以是反式激活因子或顺式激活因子。分泌型细胞因子可包括IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21或其组合。在一些情况下，增强子是膜结合蛋白，例如mbIL15、mbIL7、mbIL21和mbIL2。在一些情况下，增强子部分是组成型活性细胞因子受体下游信号传导蛋白，例如STAT5和STAT3。在一些情况下，增强子部分是组成型活性细胞因子受体，例如组成型活性IL-7受体(C7R)或其衍生物。例如，组成型活性细胞因子受体可以是工程化蛋白(例如，在本公开中称为“E3”)，其中C7R的胞外域被安全开关(例如，EGFRt或人表皮生长因子受体2的截短形式)替代(Her2t；参见美国专利申请公开号20170267742A1)或本公开中描述的其他肽。又例如，组成型活性细胞因子受体可以是工程化蛋白(例如，在本公开中称为“E4”)，其中C7R的胞外域被免疫细胞抑制剂(例如CD47、CD24)或其他肽替代，该免疫细胞抑制剂抑制杀死或吞噬性免疫细胞功能并保护治疗性细胞(例如，本文所述的工程化免疫细胞)。在一些情况下，细胞因子可以是趋化因子，例如CCL21和CCL19。可以使用的趋化因子的其他非限制性实例包括CCL27、CCL28、CCL20、CXCL9、CXCLIO、CXCLl l、CXCL16、CXCL13、CXCL5、CXCL6、CXCL8、CXCL12、CCL2、CCL8、CCL13、CCL25、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL14、CCL15、CCL16、CCL23、CX3CL1、XCL1、XCL2、CCL1、CCL17、CCL22、CCL11、CCL24、CCL26、CXCLl、CXCL2、CXCL3和CXCL7。在一些情况下，增强子部分是CCR7的配体，其可以起到增强T细胞、NK细胞或树突细胞的浸润的作用。CCR7配体包括但不限于CCL21和CCL19。在一些情况下，增强子部分包含趋化因子CCL21和CCL19的共表达，用于治疗性用途以治疗淋巴瘤或其他实体瘤。
在一些情况下，工程化免疫细胞用作治疗液体肿瘤的治疗剂，并且在这种情况下，增强子部分可以包含本文所述的任何形式的任何细胞因子。在一些情况下，工程化免疫细胞用作治疗实体瘤的治疗剂，并且在这种情况下，增强子部分可以包含任何形式的任何细胞因子，并且还包含一种或多种趋化因子。
在一些情况下，可以使用两种细胞因子来增强工程化免疫细胞中细胞因子相关信号传导通路，包括IL-2和IL-7、IL-2和IL-15、IL-7和IL-15以及IL15和IL21。细胞因子相关信号传导通路的增强可包括选自mbIL融合蛋白、组成型活性IL-7受体(C7R)、白介素或其组合组成的组的多肽的表达。
本文所述的增强子部分可以是白介素15(IL-15)或IL-15受体。IL-15是由114个氨基酸组成的14-15kD糖蛋白，属于四个螺旋束细胞因子家族。IL-15在结构上与白介素2(IL-2)同源。IL-15受体包含高亲和力的IL-15受体α链、IL2/15受体β链和共同的γ链。因此，IL-15可能具有一些与IL-2相似的功能，例如刺激T细胞的激活和增殖、增强NK细胞杀死活性和促进免疫球蛋白的B细胞产生。最近研究发现，IL-15可能在NK细胞、NKT细胞和肠上皮细胞的分化、增殖和激活中起作用。IL-15和IL-17可能在CD8+记忆T细胞的调节中起作用。研究还表明，IL-15可以通过一种机制来调节CD8+记忆T细胞的增殖和NK细胞的生存周期，其中表达IL-15α链受体的细胞可以向表达15β链和公共的γ链的细胞呈递IL-15。IL-15也可以在非免疫系统中起作用，例如调节骨骼肌合成代谢。本文所述的增强子部分可以是白介素7(IL-7)。IL-7可以促进前-B细胞、祖-B细胞(pro-B cell)、B细胞和T细胞的生长。它还可以促进B细胞和T细胞的生长和抗细胞凋亡。IL-7可以在胸腺的早期分化和增殖以及树突细胞的发育和分化中起作用。然而，IL-7可能对抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的杀死活性没有增强的作用。它可以首先从胸腺转移到外周血，然后诱导胸腺细胞或外周血淋巴细胞产生淋巴因子，激活并增强LAK细胞的淋巴因子激活的杀死细胞活性。CD8+亚群可以是IL-7的主要效应细胞，且IL-7也可以支持记忆CD8+T细胞扩增和存活。IL-7可以促进骨髓组织产生。IL-7不仅可以刺激髓样前体细胞和巨核细胞产生集落形成单位和血小板，还可以使身体从环磷酰胺的免疫抑制中恢复。在较高浓度下，它还可以诱导增强巨噬细胞的细胞毒性，作为用于产生CTL细胞、NK细胞和激活的单核细胞的协同因子，诱导单核细胞-巨噬细胞以分泌各种细胞因子并促进炎性因子(例如巨噬细胞炎性蛋白α(MIP-α)、MIP-β、IL-8和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等)的表达。通过激活炎症细胞产生的大量炎性因子，IL-7不仅可以调节炎性过程的各组分之间的相互作用，而且还可以增强炎性细胞因子受体(CCR)，例如CCR1、CCR2和CCR5。另外，IL-7可以在诱导免疫应答中起作用。IL-7可以诱导I型免疫应答并增加IFN-γ和IL2的产生。IL-7可以与IL12协同作用以诱导IFN-γ和T细胞增殖。IL-7和转化生长因子β(TGFβ)可以发挥调节作用，并且可以是免疫调节机制的一部分。IL-7不仅可以促进T细胞的免疫重建，而且还可以诱导T细胞周期的上调和BCL-2表达，这扩大循环T细胞受体池(pool)的多样性和持久性，并增加CD4+和CD8+T细胞的数量。此外，对于HIV抗原，扩增的T细胞还可以分泌IL2和IFN-γ，并具有良好的抗病毒功能。因此，IL-7可以逆转HIV特异性T淋巴细胞在增殖、细胞因子分泌和细胞功能方面的缺陷。
增强部分可以调节(例如，激活)信号转导物和转录5(STAT5)介导的信号传导通路的激活物。STAT5可广泛存在于细胞质中。当细胞因子(例如IL2、IL7、IL15和IL21)与细胞因子受体结合时，偶联受体的JAK被激活，从而使STAT5蛋白C端的Tyr残基磷酸化。磷酸化的STAT5可以通过其SH2区域形成同源或异源二聚体。同源或异二聚体可以转移至细胞核并与靶基因结合，从而调节靶基因的表达，靶基因包括细胞调节因子和抗细胞凋亡基因。STAT5的激活可以在维持正常细胞功能以及调节细胞增殖和分化中起作用。因此，调节STAT5信号传导通路的活性可以调节本文所述的CAR-T细胞的存活和持久性。
通过将编码增强子部分的核酸分子递送到细胞中，可以将增强子部分引入细胞(例如，免疫细胞或工程化免疫细胞)。核酸分子可以是载体。增强子部分可以是融合构建体的一部分。融合蛋白或相应的核酸构建体可具有由选自以下的分子式表示的结构：S-2A-L1-scFv-H-TM-C-CD3ζ-2A-L2-IL15-IL15Ra(A)；S-2A-L1-scFv-H-TM-C-CD3ζ-2A-L2-IL15-IL15Ra-2A-L3-IL7(B)；S-2A-L1-scFv-H-TM-C-CD3ζ-2A-L2-C7R(C)；S-2A-L1-scFv-H-TM-C-CD3ζ-2A-L2-IL7-IL7Ra(D)；其中：每个“-”独立地是接头肽或肽键；S是安全开关；2A是任选的自切割肽；L1、L2和L3各自独立地为空或信号肽序列；C7R如上所述；scFv是抗原结合结构域；H为空或铰链区；TM是跨膜结构域；C是共刺激信号传导分子；CD3ζ是源自于CD3ζ的胞质信号传导序列；IL15是白介素15，IL15Ra是IL-15受体α；IL7是白介素7，IL7Ra是IL-7受体α；C7R是组成性地激活的IL-7受体。
增强子部分可以是嵌合多肽的一部分。例如，增强子部分可以与诱导型细胞死亡部分连接。增强子部分可以通过接头与诱导型细胞死亡部分连接。接头可能不会被切割。接头可以不包含自切割肽。在一些其他情况下，增强子部分和诱导型细胞死亡部分可以在细胞中由相同核酸分子表达，并且可以被切割以形成两个多肽。
诱导型细胞死亡部分
本文所述的工程化免疫细胞可包含诱导型细胞死亡部分，也称为“自杀基因开关”、“自杀开关”、“安全开关”或“细胞自杀元件”。诱导型细胞死亡部分可用于在外源因子(例如，药物)的作用下体内有效地去除工程化免疫细胞(例如，CAR-T细胞)。本文所述的诱导型细胞死亡部分可以是rapaCasp9、iCasp9、CD20(及其模拟表位)、RQR8、Her2t、CD30、BCMA、EGFRt、HSV-TK、mTMPK等。iCasp9、CD20(及其模拟表位)、RQR8和HSV-TK可能具有相同的清除T细胞的能力，但rapaCasp9、iCasp9、RQR8和CD20(及其模拟表位)可以比HSV-TK更快。
在一些情况下，诱导型细胞死亡部分在使所述诱导型细胞死亡部分与细胞死亡激活剂接触时能够实现所述细胞的死亡。诱导型细胞死亡部分可以是例如，rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8或EGFRt。在一些情况下，诱导型细胞死亡部分是EGFRt，并且所述细胞死亡激活剂是结合EGFRt的抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，诱导型细胞死亡部分是HSV-TK，并且所述细胞死亡激活剂是GCV。在一些情况下，诱导型细胞死亡部分是iCasp9，并且所述细胞死亡激活剂是AP1903。
诱导型细胞死亡部分可以与增强子部分连接，并且可以如上所述作为嵌合多肽在细胞中共表达。
移植物抗宿主病(GVHD)
为了制备用于治疗恶性和传染性疾病的“现成(off the shelf)”同种异体T细胞，通过输注T细胞的细胞疗法可以设计为重建针对病原体和恶性肿瘤的免疫力。在体外用足够数量的T细胞生产具有肿瘤靶向特性的T细胞所需的时间量通常可能与患者的治疗窗不相容。此外，来自患有晚期疾病的患者的自体T细胞可能具有受损功能并且对期望抗原具有耐受性。
为了解决这些问题，可以向患者施用同种异体T细胞，但需要通过识别输注细胞上不同的主要或次要组织相容性抗原来阻止通过宿主T细胞的免疫介导的排斥反应。输注表达TCRα和β链以及HLA-A分子的T细胞可能不会引起GVHD和HVG。因此，用CRISPR/CAS9编辑以删除TCRα链和HLA-A分子的T细胞可作为通用效应子供体细胞的来源。
尽管敲低β-2-微球蛋白(B2M)可防止供体CAR-T细胞受到宿主T细胞的攻击。供体CAR-T细胞可被宿主NK细胞攻击并影响CAR-T细胞的存活。因此，本公开提供了靶向肿瘤细胞和宿主T细胞和/或NK细胞的工程化免疫细胞。本文所述的工程化免疫细胞可以清除宿主T细胞和/或NK细胞，并增强CAR-T细胞的存活、持久性和扩增能力，从而更有效地对抗肿瘤细胞。
基因编辑
在本公开中可以使用各种基因编辑方法来制造工程化免疫细胞，包括CRISPR、RNA干扰技术、TALEN(转录激活物样(TAL)效应子核酸酶)和锌指核酸酶(ZFN)。
在一些情况下，CRISPR/Cas9系统用于编辑免疫细胞的基因。例如，CRISPR/Cas9系统可用于敲除免疫细胞的内源性TCR或细胞表面标志物(例如CD7)，以产生用于T细胞疗法的工程化免疫细胞。CRISPR/Cas9(聚簇规律间隔的短回文重复序列)/Cas(CRISPR相关)系统是对病毒或外源质粒具有抗性的原核生物特有的天然免疫系统。II型CRISPR/Cas系统已作为直接基因组导向的基因组编辑工具应用于许多真核生物和原核生物体中。CRISPR/Cas9系统的发展彻底改变了人们编辑DNA序列和调节靶基因表达水平的能力，为生物体的精确基因组编辑提供强大的工具。简化的CRISPR/Cas9系统可包含Cas9蛋白和gRNA。作用原理是gRNA通过其自身的Cas9手柄(handle)与Cas9蛋白形成Cas9-gRNA复合物，并且通过碱基互补配对原理，Cas9-gRNA复合物中的gRNA的碱基互补配对序列与靶基因的靶序列配对。Cas9使用其自身的核酸内切酶活性来切割靶DNA序列。与传统的基因组编辑技术相比，CRISPR/Cas9系统具有几个明显的优势：易用、简单、低成本、可编程性以及同时编辑多个基因的能力。
药物组合物
本公开还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本文所述的工程化免疫细胞和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物是液体组合物。药物组合物可以例如通过注射施用给受试者。制剂中工程化免疫细胞的浓度可为至少约102、103、104、105、106、107、108、109或更多细胞/ml。在一些情况下，制剂中工程化免疫细胞的浓度可为1x103-1x108细胞/ml，或1x104-1x107细胞/ml。
本公开的药物组合物可以包含本文所述的工程化免疫细胞，结合一种或多种药学或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。此类组合物可以包含缓冲剂，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)和防腐剂。本公开的组合物可以被配制用于静脉内施用。
本公开的药物组合物可以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。尽管可以通过临床试验确定适当的剂量，但是施用的量和频率将由诸如患者的病症以及患者的疾病的类型和严重性等因素来确定。
当指示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，可以由医生考虑到患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及病症的个体差异确定要待施用的本公开组合物的精确量。通常可以指出，包含本文所述的工程化免疫细胞(例如，CAR-T细胞)的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重，或在一些情况下以105至106个细胞/kg体重、包括这些范围内的所有整数值的剂量施用。T细胞组合物也可以这些剂量多次施用。可以通过使用输注技术来施用细胞。通过监视患者的疾病征兆并相应地调整治疗，可以容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。
可以任何方便的方式进行主题组合物的施用，包括通过气溶胶吸入、注射、摄入、输血、植入或移植。本文所述的组合物可以皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一些实施方案中，本公开的T细胞组合物通过皮内或皮下注射施用于患者。在一些其他实施方案中，本公开的T细胞组合物优选通过静脉内注射施用。T细胞的组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。
治疗学
本公开提供了用编码本文所述的表达盒的慢病毒载体(LV)转导的工程化免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)的治疗应用。转导的T细胞或NK细胞可以靶向肿瘤细胞标志物(例如,CD19)和激活的T细胞和/或NK细胞共有标志物(例如，CD3、CD7、CD137等)。工程化免疫细胞可用于同种异体肿瘤治疗，并可大规模制备。
因此，本公开还提供了一种刺激T细胞介导的对受试者(例如，哺乳动物)的靶细胞群体或组织的免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用公开的工程化免疫细胞(例如，CAR-T细胞)的步骤。
在一些实施方案中，本公开提供了一种类型的细胞疗法，该细胞疗法包括将本公开的工程化的通用CAR-T细胞直接施用给有需要的患者。本公开的CAR-T细胞可通过基因编辑技术在细胞中敲除或沉默内源性TCR表达。内源性TCR的灭活可以防止TCR在同种异体输注期间杀死正常细胞。可以预防GVHD反应。靶向肿瘤细胞标志物(例如CD19)和激活的T细胞和/或NK细胞的标志物(例如CD137)的CAR-T细胞可以在清除肿瘤细胞的同时去除激活的T细胞和/或NK细胞。另外，还可以预防宿主对移植物应答(HVG)。本文提供的细胞疗法还可以改善受试者中同种异体CAR-T细胞的存活和抗肿瘤作用。
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗或诊断受试者中的疾病的方法，该方法包括向所述受试者施用本文所述的药物组合物。
所述药物组合物中的工程化免疫细胞可以源自于同种异体免疫细胞。源自所述同种异体免疫细胞的工程化免疫细胞可能不会在所述受试者中诱导移植物抗宿主病(GvHD)。所述药物组合物中的工程化免疫细胞可以源自于自体免疫细胞。
所述药物组合物中的所述工程化免疫细胞的内源性TCR可以是功能上灭活的。与具有功能上活性的TCR的另外的免疫细胞相比，工程化免疫细胞可以降低所述受试者中的GVHD。该疾病可以是癌症。癌症可以是例如，淋巴瘤或白血病。
本公开的CAR-T细胞可以经历稳健的体内细胞扩增并且可以被扩展。CAR介导的免疫应答可以是过继性免疫疗法的步骤的一部分，其中CAR修饰的T细胞可以诱导对CAR中的抗原结合结构域具有特异性的免疫应答。例如，抗CD19 CAR-T细胞引起针对表达CD19的细胞的特异性免疫应答。
本文提供的工程化免疫细胞可用于治疗癌症。可以治疗的癌症包括尚未血管化或尚未充分血管化的肿瘤，以及已血管化的肿瘤。癌症可以包括非实体瘤(例如，血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)，或者可以包括实体瘤。用本公开的CAR治疗的癌症类型包括但不限于上皮癌、胚细胞瘤和肉瘤，某些白血病或淋巴样恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤以及恶性肿瘤，例如肉瘤、上皮癌和黑素瘤。还包括成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症。
血液癌症是血液或骨髓的癌症。血液学(或血源性)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(例如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞、早幼粒细胞性、粒单核细胞、单核细胞和红白血病)、慢性白血病(例如，慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病)白血病、慢性髓细胞白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级别形式)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和脊髓发育不良。
实体瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织肿块。实体瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤因形成它们的细胞类型而命名(例如肉瘤、上皮癌和淋巴瘤)。实体瘤如肉瘤和上皮癌的实例包括纤维肉瘤、粘肉肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴样恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞上皮癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺上皮癌、甲状腺髓样上皮癌、乳头状甲状腺上皮癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺上皮癌、乳头状上皮癌、乳头状腺癌、髓样上皮癌、支气管上皮癌、肾细胞上皮癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸瘤、精原细胞瘤、膀胱上皮癌、黑素瘤和中枢神经系统肿瘤(例如，神经胶质瘤(例如，脑干胶质瘤和混合胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤)、星形细胞瘤、中枢神经系统淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤(menangioma)、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移)。
在一些实施方案中，本公开的CAR的抗原结合部分部分被设计成治疗特定的癌症。例如，设计用于靶向CD19的CAR可用于治疗癌症和疾病，包括但不限于前-BALL(儿科适应症)、成人ALL、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、同种异体骨髓移植后补救等。在一些实施方案中，可以将CAR设计为靶向CD22以治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症和病症包括但不限于前BALL(儿科适应症)、成人ALL、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、同种异体骨髓移植后补救等，可使用靶向CD19、CD20、CD22和ROR1的CAR的组合治疗。在一些实施方案中，可以将CAR设计为靶向间皮素以治疗间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌等。在一些实施方案中，可以将CAR设计为靶向CD33/IL3Ra以治疗急性骨髓性白血病等。在一些实施方案中，可以将CAR设计为靶向c-Met以治疗三阴性乳腺癌、非小细胞肺癌等。在一些实施方案中，可以将CAR设计为靶向PSMA以治疗前列腺癌等。在一些实施方案中，可以将CAR设计为靶向糖脂F77以治疗前列腺癌等。在一些实施方案中，可以将CAR设计为靶向EGFRvIII以治疗胶质母细胞瘤等。在一些实施方案中，可以将CAR设计为靶向GD-2以治疗神经母细胞瘤、黑素瘤等。在一些实施方案中，可以将CAR设计为靶向NY-ESO-1 TCR以治疗骨髓瘤、肉瘤、黑素瘤等。在一些实施方案中，可以将CAR设计为靶向MAGE A3 TCR以治疗骨髓瘤、肉瘤、黑素瘤等。
本公开不应被解释为仅限于本文公开的抗原靶标和疾病。相反，本公开应当被解释为包括与疾病相关的任何抗原靶标，其中可以使用CAR来治疗该疾病。
本文公开的细胞疗法可以与一种或多种另外的治疗剂共同配制和/或共同施用，另外的治疗剂例如一种或多种抗癌剂、细胞毒性或细胞抑制剂、激素治疗、疫苗和/或其他免疫疗法。在一些实施方案中，将工程化免疫细胞与其他治疗性治疗形式组合施用，其他治疗性治疗形式包括手术、放射、冷冻手术和/或热疗。此类组合疗法可以有利地利用较低剂量的所施用的治疗剂，从而避免与各种单一疗法相关的可能的毒性或并发症。
在某些实施方案中，本文所述的方法和组合物与一种或多种抗体分子、化学疗法、其他抗癌疗法(例如，靶向抗癌疗法或溶瘤药物)、细胞毒素剂，基于免疫的疗法(例如，细胞因子)、手术和/或放射程序联合施用。可与之联合施用的示例性细胞毒素剂包括抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢药、有丝分裂抑制剂、烷基化剂、蒽环类药物、长春花生物碱、嵌入剂、能够干扰信号转导通路的试剂、促进细胞凋亡的试剂、蛋白酶体抑制剂和放射(例如局部或全身放射)。
在某些实施方案中，联合疗法与标准的癌症护理化疗剂联合使用，该标准的癌症护理化疗剂包括但不限于阿那曲唑
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比卡鲁胺
Figure BDA0003141784850000742
硫酸博莱霉素
Figure BDA0003141784850000743
白消安
Figure BDA0003141784850000744
白消安注射液
Figure BDA0003141784850000745
卡培他滨
Figure BDA0003141784850000746
N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂
Figure BDA0003141784850000747
卡莫司汀
Figure BDA0003141784850000748
苯丁酸氮芥
Figure BDA0003141784850000749
顺铂
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克拉屈滨
Figure BDA00031417848500007411
环磷酰胺(
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或
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)、阿糖孢苷、阿糖胞苷
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阿糖孢苷脂质体注射液
Figure BDA0003141784850000753
达卡巴嗪
Figure BDA0003141784850000754
更生霉素(放线菌素D、Cosmegan)、盐酸柔红霉素
Figure BDA00031417848500007552
枸橼酸柔红霉素脂质体注射液
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地塞米松、多西他赛
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盐酸阿霉素
Figure BDA0003141784850000757
依托泊苷
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磷酸氟达拉滨
Figure BDA0003141784850000759
5-氟尿嘧啶
Figure BDA00031417848500007510
氟他胺
Figure BDA00031417848500007511
替扎西滨(tezacitibine)、吉西他滨(二氟脱氧胞苷)、羟基脲
Figure BDA00031417848500007512
伊达比星
Figure BDA00031417848500007513
异环磷酰胺
Figure BDA00031417848500007514
伊立替康
Figure BDA00031417848500007515
L-天冬酰胺酶
Figure BDA00031417848500007516
亚叶酸钙、美法仑
Figure BDA00031417848500007517
6-巯基嘌呤
Figure BDA00031417848500007518
甲氨蝶呤
Figure BDA00031417848500007519
米托蒽醌
Figure BDA00031417848500007520
吉妥单抗、紫杉醇
Figure BDA00031417848500007521
nab-紫杉醇
Figure BDA00031417848500007522
phoenix(钇90/MX-DTPA)、喷司他丁、含卡莫司汀植入物的聚苯丙生20
Figure BDA00031417848500007523
枸橼酸他莫昔芬
Figure BDA00031417848500007524
替尼泊苷
Figure BDA00031417848500007525
6-硫鸟嘌呤、噻替哌、替拉扎明
Figure BDA00031417848500007526
注射用盐酸拓扑替康
Figure BDA00031417848500007527
长春花碱
Figure BDA00031417848500007528
长春新碱
Figure BDA00031417848500007529
和长春瑞滨
Figure BDA00031417848500007530
烷基化剂的实例包括但不限于，氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸酯、亚硝基脲和三氮烯：尿嘧啶氮芥(Aminouracil
Figure BDA00031417848500007531
Figure BDA00031417848500007532
Figure BDA00031417848500007533
氮芥
Figure BDA00031417848500007534
环磷酰胺(
Figure BDA00031417848500007535
RevimmuneTM)、异环磷酰胺
Figure BDA00031417848500007536
美法仑
Figure BDA00031417848500007537
苯丁酸氮芥
Figure BDA00031417848500007538
哌泊溴烷
Figure BDA00031417848500007539
曲他胺
Figure BDA00031417848500007540
Figure BDA00031417848500007541
三亚乙基硫代磷酰胺、替莫唑胺
Figure BDA00031417848500007542
噻替哌
Figure BDA00031417848500007543
白消安
Figure BDA00031417848500007544
卡莫司汀
Figure BDA00031417848500007545
洛莫司汀
Figure BDA00031417848500007546
链脲菌素
Figure BDA00031417848500007547
和达卡巴嗪
Figure BDA00031417848500007548
另外的示例性烷基化剂包括但不限于，奥沙利铂
Figure BDA00031417848500007549
替莫唑胺(
Figure BDA00031417848500007550
和
Figure BDA00031417848500007554
)；放线菌素(也称为放线菌素-D、
Figure BDA00031417848500007551
)；美法仑(也称为L-PAM、L-沙可来新和苯丙氨酸氮芥、
Figure BDA0003141784850000761
)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)、
Figure BDA0003141784850000762
)；卡莫司汀
Figure BDA0003141784850000763
苯达莫司汀
Figure BDA0003141784850000764
白消安(
Figure BDA00031417848500007636
和
Figure BDA0003141784850000765
)；卡铂
Figure BDA0003141784850000766
洛莫司汀(也称为CCNU、
Figure BDA0003141784850000767
)；顺铂(也称为CDDP、
Figure BDA0003141784850000768
和
Figure BDA0003141784850000769
)；苯丁酸氮芥
Figure BDA00031417848500007610
环磷酰胺(
Figure BDA00031417848500007637
和
Figure BDA00031417848500007611
)；达卡巴嗪(也称为DTIC、DIC和咪唑甲酰胺、
Figure BDA00031417848500007612
)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)、
Figure BDA00031417848500007613
)；异环磷酰胺
Figure BDA00031417848500007614
异环磷酰胺普雷德氮芥(Prednumustine)；丙卡巴肼
Figure BDA00031417848500007615
氮芥(也称为氮芥(nitrogenmustard、mustine)和盐酸氮芥(mechloroethamine hydrochloride)、
Figure BDA00031417848500007616
)；链脲菌素
Figure BDA00031417848500007617
噻替哌(也称为硫代磷酰胺、TESPA和TSPA、
Figure BDA00031417848500007618
)；环磷酰胺
Figure BDA00031417848500007619
Figure BDA00031417848500007620
和盐酸苯达莫司汀
Figure BDA00031417848500007621
蒽环类药物的实例包括例如，阿霉素
Figure BDA00031417848500007622
Figure BDA00031417848500007623
博来霉素
Figure BDA00031417848500007624
柔红霉素(盐酸柔红霉素、道诺霉素和盐酸红比霉素、
Figure BDA00031417848500007625
)；柔红霉素脂质体(枸橼酸柔红霉素脂质体、
Figure BDA00031417848500007626
)；米托蒽醌(DHAD、
Figure BDA00031417848500007627
)；表柔比星(EllenceTM)；去甲氧基柔红霉素
Figure BDA00031417848500007628
丝裂霉素C
Figure BDA00031417848500007629
格尔德霉素；除莠霉素；拉维霉素；和去乙酰基拉维霉素。
可以与本文所述的细胞疗法组合使用的长春花生物碱的实例包括但不限于，酒石酸长春瑞滨
Figure BDA00031417848500007630
长春新碱
Figure BDA00031417848500007631
和长春地辛
Figure BDA00031417848500007632
)；长春碱(也称硫酸长春碱、长春花碱和VLB、
Figure BDA00031417848500007633
和
Figure BDA00031417848500007638
)；和长春瑞滨
Figure BDA00031417848500007634
可以与本文所述的细胞疗法联合使用的蛋白酶体抑制剂的实例包括但不限于硼替佐米
Figure BDA00031417848500007635
卡非佐米(PX-171-007、(S)-4-甲基-N-((S)-1-((((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基))-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰胺基)-4-苯基丁酰胺基)-戊酰胺)；marizomib(NPI-0052)；枸橼酸艾沙佐米(MLN-9708)；德兰佐米(CEP-18770)；0-甲基-N-[((2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰基-O-甲基-N-[(1S)-2-[[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)；达诺瑞韦(RG7227、CAS 850876-88-9)；伊沙佐米(MLN2238、CAS1072833-77-2)；(S)-N-[(苯基甲氧基)羰基]-L-亮氨酰-N-(1-甲酰基-3-甲基丁基)-L-亮氨酰胺(MG-132、CAS 133407-82-6)。
在一些实施方案中、细胞疗法可以与酪氨酸激酶抑制剂(例如，受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂)联合使用。示例性酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于，表皮生长因子(EGF)通路抑制剂(例如，表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂)、血管内皮生长因子(VEGF)通路抑制剂(例如，血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂(例如，VEGFR-1抑制剂、VEGFR-2抑制剂、VEGFR-3抑制剂)、血小板衍生生长因子(PDGF)通路抑制剂(例如，血小板衍生生长因子受体)(PDGFR)抑制剂(例如，PDGFR-β抑制剂))、RAF-1抑制剂、KIT抑制剂和RET抑制剂。在一些实施方案中、与刺猬(hedgehog)抑制剂联合使用的抗癌剂选自：阿西替尼(AG013736)、博舒替尼(SKI-606)、西地尼布(RE-CENTIN、AZD2171)、达沙替尼(BMS-354825)、厄洛替尼
Figure BDA0003141784850000771
吉非替尼
Figure BDA0003141784850000772
伊马替尼(
Figure BDA0003141784850000773
CGP57148B、STI-571)、拉帕替尼
Figure BDA0003141784850000774
来他替尼(CEP-701)、来那替尼(HKI-272)、尼洛替尼
Figure BDA0003141784850000775
司马沙尼(塞玛替尼、SU5416)、舒尼替尼(
Figure BDA0003141784850000776
SU11248)、妥布尼
Figure BDA0003141784850000777
凡德他尼(
Figure BDA0003141784850000778
ZD6474)、瓦他拉尼(PTK787、PTK/ZK)、曲妥珠单抗
Figure BDA0003141784850000779
贝伐单抗
Figure BDA00031417848500007710
利妥昔单抗
Figure BDA00031417848500007711
西妥昔单抗
Figure BDA00031417848500007712
帕尼单抗
Figure BDA00031417848500007713
兰尼单抗
Figure BDA00031417848500007714
尼洛替尼
Figure BDA00031417848500007715
索拉非尼
Figure BDA00031417848500007716
阿仑单抗
Figure BDA00031417848500007717
吉姆单抗奥唑米星
Figure BDA00031417848500007718
ENMD-2076、PCI-32765、AC220、多韦替尼乳酸盐(TKI258、CHIR-258)、BIBW 2992(TOVOKTM)、SGX523、PF-04217903、PF-02341066、PF-299804、BMS-777607、ABT-869、MP470、BIBF 1120
Figure BDA00031417848500007719
AP24534、JNJ-26483327、MGCD265、DCC-2036、BMS-690154、CEP-11981、替沃扎尼(AV-951)、OSI-930、MM-121、XL-184、XL-647、XL228、AEE788、AG-490、AST-6、BMS-599626、CUDC-101、PD153035、培利替尼(EKB-569)、凡德他尼(zactima)、WZ3146、WZ4002、WZ8040、ABT-869(linifanib)、AEE788、AP24534(帕纳替尼)、AV-951(替沃扎尼)、阿昔替尼、BAY 73-4506(瑞戈非尼)、丙氨酸布立尼布(BMS-582664)、布立尼布(BMS-540215)、西地尼布(AZD2171)、CHIR-258(多韦替尼)、CP 673451、CYC116、E7080、Ki8751、马赛替尼(AB1010)、MGCD-265、二磷酸莫替沙尼(AMG-706)、MP-470、OSI-930、盐酸帕唑帕尼、PD173074、甲苯磺酸索拉非尼(Bay 43-9006)、SU 5402、TSU-68(SU6668)、瓦他拉尼、XL880(GSK1363089、EXEL-2880)。刺猬抑制剂的其他实例包括但不限于，vismodegib(2-氯-N-[4-氯-3-(2-吡啶基)苯基]-4-(甲磺酰基)-苯甲酰胺、GDC-0449)；1-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-3-((3-(4-氟苯基)-3,4-二氢-4-氧代-2-喹唑啉基)甲基)-脲(CAS 330796-24-2)；N-[(2S,3R,3′R,3aS,4′aR,6S,6′aR,6′bS,7aR,12′aS,12′bS)-2′,3′,3a,4,4′,4′a,5,5′,6,6′,6′a,6′b,7,7′,7a,8′,10′,12′,12′a,12′b-二十氢-3,6,11′,12′b-四甲基螺[呋喃[3,2-b]吡啶-2(3H),9′(1′H)-萘[2,1-a]薁]-3'-基]-甲磺酰胺(IPI926,CAS 1037210-93-7)；和4-氟-N-甲基-N-[1-[4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-酞嗪基]-4-哌啶基]-2-(三氟甲基)-苯甲酰胺(LY2940680,CAS1258861-20-9)；和Erismodegib(LDE225)。选择的酪氨酸激酶抑制剂选自舒尼替尼、厄洛替尼、吉非替尼或盐酸索拉非尼厄洛替尼
Figure BDA0003141784850000781
linifanib(N-[4-(3-氨基-1H-吲唑-4-基)苯基]-N'-(2-氟-5-甲基苯基)脲，也称为ABT 869，可从Genentech获得)；苹果酸舒尼替尼
Figure BDA0003141784850000782
博舒替尼(4-[((2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基]喹啉-3-腈，也称为SKI-606，在美国专利号6,780,996中描述)；达沙替尼
Figure BDA0003141784850000783
帕唑帕尼
Figure BDA0003141784850000784
索拉非尼
Figure BDA0003141784850000785
凡德他尼(ZD6474)；和伊马替尼或甲磺酸伊马替尼(
Figure BDA0003141784850000789
和
Figure BDA0003141784850000786
)。
在某些实施方案中，细胞疗法可以与血管内皮生长因子(VEGF)受体抑制剂联合使用，包括但不限于贝伐单抗
Figure BDA0003141784850000787
阿昔替尼
Figure BDA0003141784850000788
丙氨酸布立尼布(BMS-582664、(S)—((R)-1-(4-(4-氟-2-甲基-1H-吲哚-5-基氧基)-5-甲基吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基氧基)丙-2-基)2-氨基丙酸酯)；索拉非尼
Figure BDA0003141784850000791
帕唑帕尼
Figure BDA0003141784850000792
苹果酸舒尼替尼
Figure BDA0003141784850000793
西地尼布(AZD2171、CAS 288383-20-1)；尼达尼布(BIBF1120、CAS 928326-83-4)；Foretinib(GSK1363089)；替拉替尼(BAY57-9352、CAS 332012-40-5)；阿帕替尼(YN968D1、CAS 811803-05-1)；伊马替尼
Figure BDA0003141784850000794
帕纳替尼(AP24534、CAS 943319-70-8)；Tivozanib(AV951、CAS 475108-18-0)；瑞戈非尼(BAY73-4506、CAS 755037-03-7)；瓦他拉尼二盐酸盐(PTK787、CAS 212141-51-0)；布立尼布(BMS-540215、CAS 649735-46-6)；凡德他尼(
Figure BDA0003141784850000795
或AZD6474)；二磷酸莫替沙尼(AMG706、CAS 857876-30-3、N-(2,3-二氢-3,3-二甲基-1H-吲哚-6-基)2-[(4-吡啶基甲基)氨基]-3-吡啶甲酰胺，在PCT公开号WO 02/066470中描述)；多韦替尼二乳酸(TKI258、CAS852433-84-2)；Linfanib(ABT869、CAS 796967-16-3)；卡博替尼(XL184、CAS 849217-68-1)；来他替尼(CAS 111358-88-4)；N-[5-[[[5-(1,1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫代]-2-噻唑基]-4-哌啶甲酰胺(BMS38703、CAS345627-80-7)；(3R,4R)-4-氨基-1((4-((3-甲氧基苯基)氨基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-5-基)甲基)哌啶-3-醇(BMS690514)；N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氢-2-甲基环戊[c]吡咯-5-基]甲氧基]-4-氨基喹唑啉(XL647、CAS 781613-23-8)；4-甲基-3-[[1-甲基-6-(3-吡啶基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基]氨基]-N-[3-(三氟甲基)苯基]-苯甲酰胺(BHG712、CAS 940310-85-0)；和阿柏西普
Figure BDA0003141784850000796
。
在一些实施方案中，本文描述的细胞疗法可以与PI3K抑制剂联合使用。PI3K抑制剂可以是PI3K的δ和γ亚型的抑制剂。PI3K抑制剂的实例包括但不限于，4-[2-(1H-吲唑-4-基)-6-[[4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基]甲基]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基]吗啉；2-甲基-2-[4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基]丙腈；4-(三氟甲基)-5-(2,6-二吗啉代嘧啶-4-基)吡啶-2-胺；陶扎色替(VX680或MK-0457、CAS 639089-54-6)；(5Z)-5-[[4-(4-吡啶基)-6-喹啉基]亚甲基]-2,4-噻唑烷二酮(GSK1059615、CAS958852-01-2)；(1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR)-5-(乙酰氧基)-1-[(二-2-丙烯基氨基)亚甲基]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-八氢-11-羟基-4-(甲氧基甲基)-4a,6a-二甲基-环戊[5,6]萘[1,2-c]吡喃-2,7,10(1H)-三酮(PX866、CAS 502632-66-8)；8-苯基-2-(吗啉-4-基)-苯并二氢吡喃-4-酮(LY294002、CAS 154447-36-6)；2-氨基-8-乙基-4-甲基-6-(1H-吡唑-5-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(SAR 245409或XL 765)；1,3-二氢-8-(6-甲氧基-3-吡啶基)-3-甲基-1-[4-(1-哌嗪基)-3-(三氟甲基)苯基]-2H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮、(2Z)-2-丁烯二酸酯(1:1)(BGT 226)；5-氟-3-苯基-2-[(1S)-1-(9H-嘌呤-6-基氨基)乙基]-4(3H)-喹唑啉酮(CAL101)；2-氨基-N-[3-[N-[3-[(2-氯-5-甲氧基苯基)氨基]喹喔啉-2-基]氨磺酰基]苯基]-2-甲基丙酰胺(SAR 245408或XL 147)；和(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)(BYL719)。
在一些实施方案中、本文描述的细胞疗法可以与mTOR抑制剂联合使用，例如，一种或多种mTOR抑制剂选自雷帕霉素、替西罗莫司
Figure BDA0003141784850000801
AZD8055、BEZ235、BGT226、XL765、PF-4691502、GDC0980、SF1126、OSI-027、GSK1059615、KU-0063794、WYE-354、Palomod529(P529)、PF-04691502或PKI-587、地磷莫司(正式称为deferolimus、(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23、29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六烷-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基次膦酸酯，也称为AP23573和MK8669，并且在PCT公开号WO 03/064383中描述)；依维莫司(
Figure BDA0003141784850000802
或
Figure BDA0003141784850000804
)；雷帕霉素(AY22989、
Figure BDA0003141784850000803
)；simapimod(CAS164301-51-3)；emsirolimus、(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶基[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502、CAS 1013101-36-4)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉鎓-4-基)甲氧基]丁基]-L-精氨酰基甘氨酰基-L-α-天冬氨酰L-丝氨酸-，内盐(SF1126、CAS 936487-67-1)、(1r,4r)-4-(4-氨基-5-(7-甲氧基-1H-吲哚-2-基)咪唑并[1,5-f][1,2,4]三嗪-7-基)环己烷甲酸(OSI-027)；和XL765中的一种或多种。
在一些实施方案中，细胞疗法可以与BRAF抑制剂例如GSK2118436、RG7204、PLX4032、GDC-0879、PLX4720和甲苯磺酸索拉非尼(Bay 43-9006)联合使用。在另外的实施方案中，BRAF抑制剂包括但不限于，瑞戈非尼(BARG73-4506、CAS 755037-03-7)；tuvizanib(AV951、CAS 475108-18-0)；维罗非尼(
Figure BDA0003141784850000811
PLX-4032、CAS 918504-65-1)；康奈非尼(还称为LGX818)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯基-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265、CAS 927880-90-8)；5-[1-(2-羟乙基)-3-(吡啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]-2,3-二氢茚-1-酮肟(GDC-0879、CAS 905281-76-7)；5-[2-[4-[2-(二甲基氨基)乙氧基]苯基]-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑-4-基]-2,3-二氢-1H-茚-1-酮肟(GSK2118436或SB590885)；(+/-)-甲基(5-(2-(5-氯-2-甲基苯基)-1-羟基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基)氨基甲酸酯(还称为XL-281和BMS908662)和N-(3-(5-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺(还称为PLX4720)。
在一些实施方案中，本文描述的细胞疗法可以与MEK抑制剂联合使用。可以与以下联合使用任何MEK抑制剂，包括但不限于，司美替尼(5-[(4-溴-2-氯苯基)氨基]-4-氟-N-(2-羟基乙氧基)-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-甲酰胺、还称为AZD6244或ARRY 142886)；ARRY-142886曲美替尼二甲亚砜(GSK-1120212、CAS 1204531-25-80)；G02442104(还称为GSK1120212)、RDEA436；N-[3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-6-甲氧基苯基]-1-[(2R)-2,3-二羟丙基]-环丙烷磺酰胺(还称为RDEA119或BAY869766)；RDEA119/BAY869766、AS703026；G00039805(还称为AZD-6244或司美替尼)、BIX 02188；BIX 02189；2-[(2-氯-4-碘代苯基)氨基]-N-(环丙基甲氧基)-3,4-二氟苯甲酰胺(还称为CI-1040或PD184352)；CI-1040(PD-184352)、N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘代苯基)氨基]-苯甲酰胺(还称为PD0325901)；PD03259012'-氨基-3'-甲氧基黄酮(还称为PD98059、可从Biaffin GmbH&Co.,KG,Germany获得)；PD98059、2,3-双[氨基[(2-氨基苯基)硫代]亚甲基]-丁二腈(还称为U0126)；U0126、XL-518(还称为GDC-0973、Cas No.1029872-29-4、可从ACC Corp.获得)；GDC-0973(甲酮、[3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]苯基][3-羟基-3-(25)-2-哌啶基-1-氮杂环丁烷基]-)、G-38963；和G02443714(还称为AS703206)、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。MEK抑制剂的其他实例包括但不限于，benimetinib(6-(4-溴-2-氟苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-羧酸(2-羟基乙氧基)-酰胺，还称为MEK162、CAS 1073666-70-2)；2,3-双[氨基[(2-氨基苯基)硫代]亚甲基]-丁二腈(还称为U0126，并在美国专利号2,779,780中描述)；(3S,4R,5Z,8S,9S,11E)-14-(乙氨基)-8,9,16-三羟基-3,4-二甲基-3,4,9,19-四氢-1H-2-苯并噁环十四烷-1,7(8H)-二酮](还称为E6201)；维罗非尼(PLX-4032、CAS 918504-65-1)；(R)-3-(2,3-二羟丙基)-6-氟-5-(2-氟-4-碘代苯基氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-4,7(3H、8H)-二酮(TAK-733、CAS 1035555-63-5)；pimasertib(AS-703026、CAS 1204531-26-9)；2-(2-氟-4-碘代苯基氨基)-N-(2-羟基乙氧基)-1,5-二甲基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺(AZD 8330)；和3,4-二氟-2-[((2-氟-4-碘苯基)氨基]-N-(2-羟基乙氧基)-5-[(3-氧代-[1,2]恶嗪烷-2-基)甲基]苯甲酰胺(CH 4987655或Ro 4987655)。
在一些实施方案中，本文所述的细胞疗法可以与JAK2抑制剂例如CEP-701、INCB18424、CP-690550(托法替尼)联合使用。实例JAK抑制剂包括但不限于，鲁索替尼(ruxolitinib)；托法替尼(CP690550)；阿昔替尼(AG013736、CAS 319460-85-0)；5-氯-N2-[(1S)-1-(5-氟-2-嘧啶基)乙基]-N4-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-12,4-嘧啶二胺(AZD1480、CAS 935666-88-9)；(9E)-15-[2-(1-吡咯烷基)乙氧基]-7,12,26-三氧杂-19,21,24-三氮杂四环[18.3.1.12,5.114,18]-二十六碳-1(24),2,4,9,14,16,18(25),20,22-壬烯(SB-1578、CAS 937273-04-6)；momelotinib(CYT 387)；巴瑞替尼(INCB-028050或LY-3009104)；帕西替尼(SB1518)；(16E)-14-甲基-20-氧杂-5,7,14,27-四氮杂四环[19.3.1.12,6.18,12]二十七烷-1(25),2,4,6(27),8,10,12(26),16,21,23-癸烯(SB 1317)；甘多替尼(LY2784544)；和N,N-ci环丙基-4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-6-乙基-1,6-二氢-1-甲基咪唑[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-7-羧酰胺(BMS 911543)。
在一些实施方案中，本文公开的组合疗法包括紫杉醇或紫杉醇药剂，例如，
Figure BDA0003141784850000831
蛋白质结合的紫杉醇(例如，
Figure BDA0003141784850000832
)。示例性紫杉醇药剂包括但不限于，纳米颗粒白蛋白结合的紫杉醇(ABRAX-ANE、由Abraxis Bioscience销售)、二十二碳六烯酸结合的紫杉醇(DHA-紫杉醇、Taxoprexin、由Protarga销售)、聚谷氨酸结合的紫杉醇(PG-紫杉醇、聚谷氨酸紫杉醇、CT-2103、XYOTAX、由Cell Therapeutic销售)、肿瘤激活的前药(TAP)、ANG105(与紫杉醇的三个分子结合的血管抑肽-2、由Im-munoGen销售)、紫杉醇-EC-1(与erbB2识别肽EC-1结合的紫杉醇；参见Li等人，Biopolymers(2007)87:225-230)和葡萄糖缀合的紫杉醇(例如，琥珀酸2'-紫杉醇甲基2-吡喃葡萄糖酯)。
方法
本公开提供了用于产生工程化细胞的方法。在一些方面，该方法可以包括(a)将表达嵌合多肽的核酸分子递送到细胞中；和(b)在细胞中表达核酸分子，从而产生工程化细胞。嵌合多肽可以是如本文所述的嵌合抗原受体。
本公开还提供了用于施用如本文所述的工程化细胞的方法。工程化细胞可以是工程化免疫细胞。工程化免疫细胞可以是T细胞。工程化免疫细胞可以源自于自体T细胞。工程化免疫细胞可以源自于同种异体T细胞。
在一些方面，本文提供了用于施用包含嵌合多肽的工程化免疫细胞的方法，该嵌合多肽包括(i)能够增强工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分，和(ii)当嵌合多肽与细胞死亡激活剂接触时能够实现工程化免疫细胞死亡的诱导型细胞死亡部分。增强子部分可以与诱导型细胞死亡部分连接。工程化免疫细胞还可包含一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，该CAR包含结合部分。结合部分可包含第一抗原结合结构域，当施用于受试者时该第一抗原结合结构域抑制或降低受试者对工程化免疫细胞的免疫应答。结合部分还可包含能够结合疾病相关抗原的第二抗原结合结构域。一种或多种CAR中的单个CAR可包含(i)第一抗原结合结构域，(ii)第二抗原结合结构域，或(iii)第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域两者。一种或多种CAR中的每个CAR还可包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
在一些方面，本文提供了施用工程化免疫细胞的方法，该工程化免疫细胞包含一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，该CAR包含结合部分。结合部分可包含能够结合免疫细胞抗原的第一抗原结合结构域和能够结合疾病相关抗原的第二抗原结合结构域。一种或多种CAR中的每个CAR还可包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。工程化免疫细胞还可包含能够增强工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分。在一些情况下，可将工程化免疫细胞的内源性T细胞受体(TCR)灭活。与包含一种或多种CAR但没有增强子部分的其他工程化免疫细胞相比，工程化免疫细胞可(i)在存在工程化免疫细胞异源的细胞(例如，癌细胞、免疫细胞或两者)的情况下通过在体外保持存活至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500或更多天而表现出增强的持久性程度，(ii)在15天内表现出至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、200倍、250倍、300倍或更多倍的增强的扩增程度，或(iii)对包含免疫细胞抗原或疾病相关抗原的靶细胞表现出增强的细胞毒性。在一些情况下，工程化免疫细胞可在30天内表现出至少约50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、160倍、170倍、180倍、190倍、200倍、210倍、220倍、230倍、240倍、250倍、260倍、270倍、280倍、290倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍或更多倍的增强的扩增程度。在一些情况下，工程化免疫细胞可在60天内表现出至少约100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1,000倍、2,000倍、3,000倍、4,000倍、5,000倍、6,000倍、7,000倍、8,000倍、9,000倍、10,000倍、20,000倍、30,000倍、40,000倍、50,000倍、60,000倍、70,000倍、80,000倍、90,000倍、100,000倍、200,000倍、300,000倍、400,000倍、500,000倍、600,000倍、700,000倍、800,000倍、900,000倍、1,000,000倍或更多倍的增强的扩增程度。可以在刺激存在下，例如通过癌抗原或癌细胞的刺激，测量存活力或扩增。可以在多轮或重复刺激的存在下测量存活力或扩增。
在一些方面，本文提供了施用包含功能上灭活的T细胞受体(TCR)的细胞(例如，工程化免疫细胞)的方法。该细胞还可包含一种或多种嵌合抗原受体(CAR)。一种或多种CAR中的每个单个CAR可包含结合部分。结合部分可包含(i)第一抗原结合结构域，当施用于受试者时该第一抗原结合结构域抑制或降低受试者对工程化免疫细胞的免疫应答，和(ii)与疾病相关抗原结合的第二抗原结合结构域。一种或多种CAR中的每个CAR还可包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
在一些方面，本文提供了施用工程化免疫细胞的方法，所述工程化免疫细胞包含能够增强工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分。工程化细胞还可包含嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体(CAR)包含特异性结合CD7的抗原结合结构域。CAR还可包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。工程化免疫细胞中的内源性CD7可以被灭活。在一些实施方案中，工程化细胞可以包含CAR，所述CAR包含特异性结合免疫细胞抗原的抗原结合结构域。免疫细胞抗原可以是本文所述的任何免疫细胞抗原，例如CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ和SLAMF7。抗原结合结构域结合的工程化细胞的内源性免疫细胞抗原可以在工程化细胞中被灭活。
在一些方面，本文提供了施用包含单一嵌合抗原受体(CAR)的工程化免疫细胞的方法，所述嵌合抗原受体包含(i)特异性结合CD7的第一抗原结合结构域和(ii)能够结合疾病相关抗原的第二抗原结合结构域。CAR还可包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。编码内源性CD7的基因可以在工程化免疫细胞中被灭活。
本公开还提供了治疗或诊断受试者中的疾病的方法。在一些情况下，该方法包括将包含工程化免疫细胞的药物组合物施用给受试者。药物组合物中的工程化免疫细胞可以源自于同种异体免疫细胞。源自同种异体免疫细胞的工程化免疫细胞可能不会在受试者中诱导移植物抗宿主病(GVHD)。药物组合物中的工程化免疫细胞可以源自于自体免疫细胞。在一些情况下，药物组合物中的工程化免疫细胞的内源性TCR是功能上灭活的。与具有功能活性的TCR的免疫细胞相比，工程化免疫细胞可以降低受试者中的GVHD。该疾病可以是癌症。例如，癌症可以是淋巴瘤或白血病。
本公开还提供了递送同种异体细胞疗法的方法，包括向有需要的受试者施用工程化免疫细胞群体。群体中的单个工程化免疫细胞可以包含一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，该一种或多种CAR包含结合部分。结合部分可包含能够结合免疫细胞抗原的第一抗原结合结构域。结合部分还可包含能够结合疾病相关抗原的第二抗原结合结构域。当施用于受试者时，第一抗原结合结构域可以抑制或降低受试者对工程化免疫细胞的免疫应答。工程化免疫细胞还可包含能够增强工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分。工程化免疫细胞的内源性T细胞受体(TCR)可被灭活例如，可以使编码TCR的亚基的基因灭活。本文所述的各种基因编辑方法可用于使T细胞的内源性TCR灭活。
在一些实施方案中，本文提供的方法可包括细胞群体的激活。在一些情况下，用于制备工程化免疫细胞的细胞可以在制备工程化免疫细胞之前被激活。在一些情况下，工程化免疫细胞可以被激活。如本文所用，激活可以指细胞从静止状态转变为活性状态的过程。该过程可包括对抗原的应答、迁移和/或表型或遗传改变为功能活性状态。在一些方面，激活可以指T细胞激活的逐步过程。在一些情况下，T细胞可能需要一个或多个信号来被激活。例如，T细胞可能需要至少两个信号来被完全激活。第一信号可在TCR与抗原-MHC复合物接合后出现，且第二信号可通过共刺激分子的接合而出现。在体外，抗CD3抗体(或其功能变体)可以模拟第一信号，且抗CD28抗体(或其功能变体)可以模拟第二信号。
在一些方面，本文提供的方法可包括细胞群体的激活。激活可以通过使细胞群体与表面接触来进行，该表面具有附着于其上的可以刺激CD3 TCR复合物相关信号的试剂和可以刺激细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，T细胞群体可以例如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段、或固定化在表面上的抗CD2抗体接触，或通过与有时与钙离子载体结合的蛋白激酶C激活剂(例如苔藓抑素)接触而体外刺激。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，可以使用结合辅助分子的配体。例如，可以在可刺激T细胞增殖的条件下使细胞群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。在一些情况下，4-1BB可用于刺激细胞。例如，可用4-1BB和IL-21或另一种细胞因子刺激细胞。为了激活CD4 T细胞或CD8 T细胞，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。例如，提供信号的试剂可以在溶液中或与固相表面缀合。颗粒与细胞的比例可取决于相对于靶细胞的粒度。在另外的实施方案中，细胞(例如T细胞)可以与试剂包被的珠结合，其中珠和细胞可以随后被分离，并任选地培养。每个珠可以用抗CD3抗体或抗CD28抗体包被，或者在一些情况下用两者的组合包被。在替代实施方案中，在培养之前，不分离试剂包被的珠和细胞，而是一起培养。细胞表面蛋白可通过使顺磁珠(3x28个珠)接触T细胞而缀合，抗CD3抗体和抗CD28抗体可附着至顺磁珠。在一个实施方案中，将细胞和珠(例如，1:1的比例的
Figure BDA0003141784850000871
M-450CD3/CD28 T顺磁珠)在缓冲液中组合，该缓冲液例如为磷酸盐缓冲盐水(PBS)(例如，没有诸如钙和镁的二价阳离子)。可以使用任何细胞浓度。可以将混合物培养约数小时(例如约3小时)至约14天，或两者之间的任何小时整数值。在另一个实施方案中，可以将混合物培养约21天或培养至多或至多约21天。适用于T细胞培养的条件可包括适当的培养基(例如，最低必需培养液或RPMI培养基1640或X-vivo 5，(Lonza))，其可以包含增殖和存活力所需的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白介素2(IL-2)、胰岛素、IFN-g、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-21、IL-15、TGFβ和TNFα或细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于，表面活性剂、人血浆蛋白粉和还原剂，例如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、A1 M-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 1、and X-Vivo 20、优化剂(Optimizer)，具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素(无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或确定的激素集，和/或足以使T细胞生长和扩增的量的细胞因子。抗生素(例如青霉素和链霉素)可以仅包括在实验培养物中，可能不包括在要输注至受试者体中的细胞培养物中。靶细胞可以维持在支持生长的必要条件下；例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。在一些情况下，已经暴露于不同刺激时间的T细胞可以表现出不同的特性。在一些情况下，可以使用抗人CD3、CD28、CD2或其任何组合的可溶性单特异性四聚体抗体。在一些实施方案中，激活可以利用激活部分、共刺激剂及其任何组合。在一些方面，激活部分结合：CD3/T细胞受体复合物和/或提供共刺激。在一些方面，激活部分是抗CD3抗体和/或抗CD28抗体中的任何一种。在一些方面，固相是珠、板和/或基质中的至少一种。在一些方面，固相是珠。替代地或附加地，激活部分可以不与底物缀合，例如，激活部分可以在介质中自由漂浮。
在一些情况下，可以通过与组织或细胞共培养来激活或扩增细胞群体。细胞可以是抗原呈递细胞。人工抗原呈递细胞(aAPC)可以表达T细胞受体和共刺激分子的配体，并可以激活和扩增T细胞以转移，同时在一些情况下提高其效能和功能。可以对aAPC工程化以表达用于T细胞激活的任何基因。可以对aAPC工程化以表达用于T细胞扩增的任何基因。aAPC可以是珠、细胞、蛋白质、抗体、细胞因子或任何组合。aAPC可以向可以经历基因组移植的细胞群体递送信号。例如，aAPC可以递送信号1、信号2、信号3或任何组合。信号1可以是抗原识别信号。例如，信号1可以是TCR通过肽-MHC复合物的连接，或者是针对CD3的激动性抗体的结合，其可导致CD3信号转导复合物的激活。信号2可以是共刺激信号。例如，共刺激信号可以是分别与ICOS-L、CD70和4-1BBL结合的抗CD28、诱导型共刺激物(ICOS)、CD27和4-1BB(CD137)。信号3可以是细胞因子信号。细胞因子可以是任何细胞因子。细胞因子可以是IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21或其任何组合。在一些情况下，人工抗原呈递细胞(aAPC)可用于激活和/或扩增细胞群体。在一些情况下，人工制品可能不会诱导同种异型特异性。在一些情况下，aAPC可能不表达HLA。可以对aAPC进行基因修饰以稳定表达可用于激活和/或刺激的基因。在一些情况下，K562细胞可用于激活。K562细胞也可以用于扩增。K562细胞可以是人红白血病细胞系。可以将K562细胞工程化以表达目标基因。K562细胞可以不内源性表达HLAI类、II类或CD1d分子，但可表达ICAM-1(CD54)和LFA-3(CD58)。可以将K562工程化以向T细胞递送信号1。例如，可以将K562细胞工程化以表达HLA I类。在一些情况下，可以将K562细胞工程化以表达另外的分子，例如B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗-CD3 mAb、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、膜结合的IL-15、膜结合的IL-17、膜结合的IL-21、膜结合的IL-2、截短的CD19或任何组合。在一些情况下，除了CD80和CD83之外，工程化K562细胞还可以表达抗CD3 mAb的膜形式、克隆OKT3。在一些情况下，除了CD80和CD83之外，工程化K562细胞还可以表达抗CD3 mAb的膜形式、克隆OKT3、抗-CD28 mAb的膜形式。
aAPC可以是珠。球形聚苯乙烯珠可用抗CD3和抗CD28的抗体包被，并用于T细胞激活。珠可具有任何尺寸。在一些情况下，珠可以是3和6微米或可以是约3和6微米。珠的尺寸可以是4.5微米或可以是约4.5微米。可以任何细胞与珠的比例使用珠。例如，可以使用每毫升一百万个细胞的三比一的珠与细胞比。aAPC也可以是刚性球形颗粒、聚苯乙烯乳胶微珠、磁性纳米粒或微粒、纳米尺寸的量子点、4，聚(乳酸-co-乙醇酸)(PLGA)微球、非球形颗粒、5，碳纳米管束、6，椭球PLGA微粒、7，纳米蠕虫(nanoworm)、含流体脂质双层的系统、8，2D支持的脂质双层(2D-SLB)、9，脂质体、10，RAFT体(RAFTsome)/微结构域脂质体、11，SLB颗粒或其任何组合。在一些情况下，aAPC可以扩增CD4 T细胞。例如，可以将aAPC工程化以模拟HLAII类限制性CD4T细胞的抗原加工和递送通路。可以将K562工程化以表达HLA-D、DPα、DPβ链、Ii、DMα、DMβ、CD80、CD83或其任何组合。例如，可以用HLA限制肽对工程化K562细胞进行脉冲，以扩增HLA限制的抗原特异性CD4 T细胞。在一些情况下，可以将aAPC与外源引入的细胞因子结合使用，以进行T细胞激活、扩增或任何组合。将基因组移植的细胞施用到受试者中后，细胞也可以在体内扩增，例如在受试者的血液中。
在一些实施方案中，本文提供的方法可以包括细胞群体的转导。在一些实施方案中，方法包括引入编码细胞受体(如嵌合抗原受体和/或T细胞受体)的多核苷酸。在一些情况下，可以进行细胞的转染。
在一些实施方案中，产生了包含编码细胞受体例如CAR和/或TCR的多核苷酸的病毒上清液。在一些实施方案中，病毒载体可以是逆转录病毒载体、慢病毒载体和/或腺相关病毒载体。包装细胞可用于形成能够感染宿主细胞的病毒颗粒。此类细胞可以包括293细胞(例如，用于包装腺病毒)和Psi2细胞或PA317细胞(例如，用于包装逆转录病毒)。病毒载体可以通过产生将核酸载体包装到病毒颗粒的细胞系来产生。载体可以包含包装和随后整合到宿主所需的最小病毒序列。载体可包含被待表达的多核苷酸的表达盒替代的其他病毒序列。缺失的病毒功能可以通过包装细胞系反式提供。例如，AAV载体可以包含来自AAV基因组的ITR序列，该ITR序列是包装和整合到宿主基因组中所需要的。病毒DNA可以包装在细胞系中，该细胞系可以包含编码其他AAV基因(即rep和cap)的辅助质粒，而缺少ITR序列。该细胞系也可以用腺病毒作为辅助病毒而感染。辅助病毒可促进AAV载体的复制和辅助质粒中AAV基因的表达。腺病毒的污染可以通过例如腺病毒比AAV更敏感的热处理来减少。可以使用将核酸递送至细胞的另外方法，例如，如通过引用并入本文的US20030087817中所述。
在一些实施方案中，宿主细胞可以用本文所述的一种或多种载体瞬时或非瞬时转染。细胞可以如它在受试者中自然发生的那样被转染。细胞可以取自或源自于受试者并被转染。细胞可以源自于从受试者获得的细胞，例如细胞系。在一些实施方案中，本文所述的一种或多种载体转染的细胞用于建立包含一个或多个载体衍生序列的新细胞系。用于真核宿主细胞的载体的非限制性实例包括但不限于：pBs、pQE-9(Qiagen)、噬菌体脚本(phagescript)、PsiX174、pBluescript SK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR54O、pRIT5(Pharmacia)。真核的：pWL-neo、pSv2cat、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPv、pMSG、pSVL(Pharmiacia)。此外，可以使用任何其他质粒和载体，只要它们在选择的宿主中是可复制的和可存活的即可。可将任何载体和可商购的那些(及其变体或衍生物)工程化以包括用于该方法的一个或多个重组位点。此类载体可以从例如，向量实验有限公司(Vector Laboratories Inc.)、英杰公司(Invitrogen)、普洛麦格(Promega)、安诺伦(Novagen)、NEB、科莱诗(Clontech)、柏林格曼海姆(Boehringer Mannheim)、法玛西亚(Pharmacia)、依皮森特(EpiCenter)、奥利金科技有限公司(OriGenes Technologies Inc.)、斯特拉塔基因(Stratagene)、珀金埃尔默(PerkinElmer)、帕哈密跟(Pharmingen)和研究遗传公司(Research Genetics)获得。其他目标载体包括真核表达载体，例如pFastBac、pFastBacHT、pFastBacDUAL、pSFV和pTet-Splice(Invitrogen)、pEUK-C1、pPUR、pMAM、pMAMneo、pBI101、pBI121、pDR2、pCMVEBNA和pYACneo(科莱诗)、pSVK3、pSVL、pMSG、pCH110和pKK232-8(法玛西亚有限公司)、p3'SS、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMClneo、and pOG44(斯特拉塔基因有限公司)和pYES2、pAC360、pBlueBa-cHis A、B和C、pVL1392、pBlueBac111、pCDM8、pcDNA1、pZeoSV、pcDNA3 pREP4、pCEP4和pEBVHis(英杰公司)及其变体或衍生物。其他载体包括pUC18、pUC19、pBlueScript、pSPORT、粘粒、噬菌粒、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)、P1(大肠杆菌(Escherichia coli)噬菌体)、pQE70、pQE60、pQE9(quagan)、pBS载体、PhageScript载体、BlueScript载体、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A(斯特拉塔基因)、pcDNA3(英杰公司)、pGEX、pTrsfus、pTrc99A、pET-5、pET-9、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(法玛西亚)、pSPORT1、pSPORT2、pCMVSPORT2.0和pSYSPORT1(英杰公司)及其变体或衍生物。另外的目标载体还可包括来自英杰公司的pTrxFus、pThioHis、pLEX、pTrcHis、pTrcHis2、pRSET、pBlueBa-cHis2、pcDNA3.1/His、pcDNA3.1(-)/Myc-His、pSecTag、pEBVHis、pPIC9K、pPIC3.5K、pA081S、pPICZ、pPICZA、pPICZB、pPICZC、pGAPZA、pGAPZB、pGAPZC、pBlue-Bac4.5、pBlueBacHis2、pMelBac、pSinRep5、pSinHis、pIND、pIND(SP1)、pVgRXR、pcDNA2.1、pYES2、pZEr01.1、pZErO-2.1、pCR-Blunt、pSE280、pSE380、pSE420、pVL1392、pVL1393、pCDM8、pcDNA1.1、pcDNA1.1/Amp、pcDNA3.1、pcDNA3.1/Zeo、pSe、SV2、pRc/CMV2、pRc/RSV、pREP4、pREP7、pREP8、pREP9、pREP10、pCEP4、pEBVHis、pCR3.1、pCR2.1、pCR3.1-Uni和pCRBac；来自法玛西亚的X ExCell、X gt11、pTrc99A、pKK223-3、pGEX-1X T、pGEX-2T、pGEX-2TK、pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、pGEX-4T-3、pGEX-3X、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2、pGEX-5X-3、pEZZ18、pRIT2T、pMC1871、pSVK3、pSVL、pMSG、pCH110、pKK232-8、pSL1180、pNEO和pUC4K；来自安诺伦的pSCREEN-lb(+)、pT7Blue(R)、pT7Blue-2、pCITE-4-abc(+)、pOCUS-2、pTAg、pET-32L1C、pET-30LIC、pBAC-2cp LIC、pBACgus-2cp LIC、pT7Blue-2 LIC、pT7Blue-2、X SCREEN-1、XB1ueSTAR、pET-3abcd、pET-7abc、pET9abcd、pET11 abcd、pET12abc、pET-14b、pET-15b、pET-16b、pET-17b-pET-17xb、pET-19b、pET-20b(+)、pET-21abcd(+)、pET-22b(+)、pET-23abcd(+)、pET-24abcd(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28abc(+)、pET-29abc(+)、pET-30abc(+)、pET-31b(+)、pET-32abc(+)、pET-33b(+)、pBAC-1、pBACgus-1、pBAC4x-1、pBACgus4x-1、pBAC-3cp、pBACgus-2cp、pBACsurf-1、plg、Signal plg、pYX、Vecta-Neo、Selecta Vecta-Hyg和Selecta Vecta-Gpt；来自科莱诗的pLexA、pB42AD、pGBT9、pAS2-1、pGAD424、pACT2、pGAD GL、pGAD GH、pGAD10、pGilda、pEZM3、pEGFP、pEGFP-1、pEGFPN、pEGFP-C、pEBFP、pGFPuv、pGFP、p6xHis-GFP、pSEAP2-Basic、pSEAP2-对照、pSEAP2-启动子、pSEAP2-增强子、p I3gal-基础(Basic)、pl3gal-对照、p I3gal-启动子、p I3gal-增强子、pCMV、pTet-Off、pTet-On、pTK-Hyg、pRetro-Off、pRetro-On、pIRES1neo、pIRES1hyg、pLXSN、pLNCX、pLAPSN、pMAMneo、pMAMneo-CAT、pMAMneo-LUC、pPUR、pSV2neo、pYEX4T-1/2/3、pYEX-S1、pBacPAK-His、pBacPAK8/9、pAcUW31、BacPAK6、pTriplEx、2Xgt10、Xgt11、pWE15和XTriplEx；来自斯特拉塔基因的λZAP II、pBK-CMV、pBK-RSV、pBluescript II KS+/-、pBluescript II SK+/-、pAD-GAL4、pBD-GAL4 Cam、pSurfscript、λFIX Ii、λDASH、λEMBL3、λEMBL4、SuperCos、pCR-Scrigt Amp、pCR-Script Cam、pCR-Script Direct、pBS+/-、pBC KS+/-、pBC SK+/-、Phag-escript、pCAL-n-EK、pCAL-n、pCAL-c、pCAL-kc、pET-3abcd、pET-llabcd、pSPUTK、pESP-1、pCMVLacI、pOPRSVI/MCS、pOPI3 CAT、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMClneo、pMClneo Poly A、pOG44、p0G45、pFRTI3GAL、pNE0I3GAL、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415和pRS416、pPC86、pDBLeu、pDBTrp、pPC97、p2.5、pGAD1-3、pGAD10、pACt、pACT2、pGADGL、pGADGH、pAS2-1、pGAD424、pGBT8、pGBT9、pGAD-GAL4、pLexA、pBD-GAL4、pHISi、pHISi-1、placZi、pB42AD、pDG202、pJK202、pJG4-5、pNLexA、pYESTrp，及其变体或衍生物。在一些实施方案中，载体可以是微环载体。本文提供的载体可用于递送编码CAR和/或TCR的多肽。
转导和/或转染可以通过以下任何一种方法进行：非病毒转染、基因枪、化学转染、电穿孔、核转染、热休克转染、脂质转染、显微注射或病毒转染。在一些实施方案中，提供的方法包括病毒转导，并且病毒转导包括慢病毒。病毒颗粒可用于将包含编码细胞受体的多肽序列的病毒载体离体或体内递送到细胞中。在一些情况下，如本文公开的病毒载体可以pfu(噬菌斑形成单位)为单位被测量。在一些情况下，本公开的组合物和方法的重组病毒或病毒载体的pfu可为约108至约5×1010pfu。在一些情况下，本公开的重组病毒为至少约1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010和5×1010pfu。在一些情况下，本公开的重组病毒为至多约1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010和5×1010pfu。在一些方面，本公开的病毒载体可以作为载体基因组被测量。在一些情况下，本公开的重组病毒是1×1010至3×1012载体基因组，或1×109至3×1013载体基因组，或1×108至3×1014载体基因组，或至少约1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017和1×1018载体基因组，或者是1×108至3×1014载体基因组，或者至多约1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017和1×1018载体基因组。在一些情况下，本文提供的病毒载体可以使用感染复数(MOI)来测量。在一些情况下，MOI可以指载体或病毒基因组与核酸可以被递送到的细胞的比例或倍数。在一些情况下，MOI可为1×106。在一些情况下，MOI可为1×105至1×107。在一些情况下，MOI可为1×104至1×108。在一些情况下，本公开的重组病毒为至少约1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017和1×1018MOI。在一些情况下，本公开的重组病毒为1×108至3×1014MOI，或至多约1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017和1×1018MOI。在一些情况下，病毒载体以每个细胞约1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、1×106、2×106、3×106 4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107，或至多约9×109个基因组拷贝/病毒颗粒的感染复数(MOI)被引入。
用本文所述的任何核酸递送平台的细胞的转染(例如转导)效率可以为或可为约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或大于99.9％。在一些实施方案中，方法可以包括将感染剂添加到包含细胞群体的组合物中。感染剂可包含聚凝胺。在一些方面，感染剂可以增强病毒感染的效率。感染因子可将病毒感染性提高约100至1,000倍。可以浓度为每毫升约5ug至10ug的聚凝胺添加到组合物中。
在一些实施方案中，本文提供的方法可以包括将细胞受体引入细胞的非病毒方法。非病毒方法可以包括但不限于：CRISPR相关蛋白(Cas蛋白，例如Cas9)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活类效应因子核酸酶(TALEN)，Argonaute核酸酶和大范围核酸酶。核酸酶可以是天然存在的核酸酶，基因修饰的和/或重组的。也可以使用基于转座子的系统(例如PiggyBac，睡美人(Sleeping beauty))进行非病毒方法。
在一些实施方案中，本文提供的方法可以利用PiggyBac系统将外源多肽引入细胞。PiggyBac系统包含两个组件，转座子和转座酶。PiggyBac转座酶促进转座子特异性整个到随机分散在基因组中的“TTAA”位点处。基因组中预期的“TTAA”的频率在DNA序列的每256个碱基对中约为1。与其他转座子不同，PB转座酶还能够以完全无缝的方式切除转座子，不留下序列或突变。此外，PiggyBac提供很大的载货容量(已证明超过200kb)，而没有已知的上限。PB性能水平可通过密码子优化策略、突变、缺失、添加、取代或其任何组合来提高。在一些情况下，PB可能具有更大的携带容量(cargo)(大约9.1-14.3kb)，更高的转座活性，并且其无足迹的特性使其成为基因编辑工具具有吸引力。在一些方面，PB可包括一些特征：高效转座；大的携带容量；长期稳定表达；转基因以单拷贝整合；通过非侵入性标记而不是诸如PCR的传统方法在体内追踪靶基因；易于确定整合位点及其组合。
在一些方面，本文提供的方法可以利用睡美人(SB)系统将编码细胞受体的多肽引入细胞。SB通过体外进化从鲑鱼基因组中发现的古代Tc1/mariner转座子化石工程化。SBITR(230bp)包含长度为32bp的不完全直接重复序列(DR)，其可以用作转座酶的识别信号。ITR中DR元素之间的结合亲和力和间隔参与转座活动。SB转座酶可以是39kDa蛋白质，具有DNA结合多肽、核定位信号(NLS)和催化结构域，特征是保守氨基酸基序(DDE)。诱变SB转座酶的一级氨基酸序列的各种筛选导致高活性转座酶形式(version)。在一些情况下，可以使用改性的SB。改性的SB可以在原始SB转座子的ITR内包含突变、缺失和添加。改性的SB可以包括：pT2、pT3、pT2B、pT4、SB100X及其组合。改性的SB的非限制性实例可选自：SB10、SB11(比SB10高3倍)、SB12(比SB10高4倍)、HSB1-HSB5(比SB10高多达10倍)、HSB13-HSB17(HSB17比SB10高17倍)、SB100X(比SB10高100倍)、SB150X(比SB10高130倍)及其任何组合。在一些情况下，SB100X与原始重建转座酶(SB10)相比具有100倍高活性。在一些方面，SB转座切除在携带位点留下足迹(3bp)。整合发生在基因组的TA二核苷酸中，并导致由宿主修复机制产生的靶位点重复。在一些情况下，SB似乎拥有几乎无偏差的、接近随机的整合分布。转座子整合可以在野生型系统中被人工靶向(约10％)到预定的基因组基因座，然而在本文提供的嵌合系统中，SB转座子整合可以被定向到预定的基因座，效率超过10％。
在一些方面，可以采用非病毒方法将外源多核酸引入细胞群体。在一些方面，非病毒载体或核酸可以在不使用病毒的情况下被递送，并且可以根据核酸的量进行测量。通常，任何合适量的核酸可以用于本公开的组合物和方法。在一些情况下，核酸可以是至少约1pg、10pg、100pg、1pg、10pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1μg、10μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1ng、10ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1mg、10mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、2g、3g、4g或5g。在一些情况下，核酸可至多为约1pg、10pg、100pg、1pg、10pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1μg、10μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1ng、10ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1mg、10mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、2g、3g、4g或5g。
在一些实施方案中，将CAR和/或TCR序列引入细胞的非病毒方法可包括电穿孔。电穿孔可以使用例如
Figure BDA0003141784850000971
转染系统(赛默飞世尔科学(ThermoFisher Scientific))或
Figure BDA0003141784850000972
核转染(
Figure BDA0003141784850000973
Biosystems)进行。可以调节电穿孔参数以优化转染效率和/或细胞存活力。电穿孔设备可以具有多种电波形式的脉冲设置，例如指数衰减、时间常数和方波。每种细胞类型具有唯一的最佳场强(E)，这取决于所施加的脉冲参数(例如电压、电容和电阻)。施加最佳场强通过诱导跨膜电压引起电通透，这使核酸穿过细胞膜。在一些情况下，可以调节电穿孔脉冲电压、电穿孔脉冲宽度、脉冲数、细胞密度和尖端类型，以优化转染效率和/或细胞存活力。
在一些实施方案中，可以改变电穿孔脉冲电压以优化转染效率和/或细胞存活力。在一些情况下，电穿孔电压可以小于约500伏。在一些情况下，电穿孔电压可为至少约500伏、至少约600伏、至少约700伏、至少约800伏、至少约900伏、至少约1000伏、至少约1100伏、至少约1200伏、至少约1300伏、至少约1400伏、至少约1500伏、至少约1600伏、至少约1700伏、至少约1800伏、至少约1900伏、至少约2000伏、至少约2100伏、至少约2200伏、至少约2300伏、至少约2400伏、至少约2500伏、至少约2600伏、至少约2700伏、至少约2800伏、至少约2900伏或至少约3000伏。在一些情况下，最佳转染效率和/或细胞存活力所需的电穿孔脉冲电压可以是细胞类型特异性的。例如，对于巨噬细胞，1900伏的电穿孔电压可能是最佳的(例如，提供最高的生存力和/或转染效率)。在另一个实例中，对于Jurkat细胞或原代人细胞例如T细胞，约1350伏的电穿孔电压可能是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在一些情况下，对于给定的细胞类型，电穿孔电压的范围可能是最佳的。例如，对于人578T细胞，约1000伏至约1300伏的电穿孔电压可能是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在一些情况下，原代细胞可以是原代淋巴细胞。在一些情况下，原代细胞群体可以是淋巴细胞群体。
在一些实施方案中，可以改变电穿孔脉冲宽度以优化转染效率和/或细胞存活力。在一些情况下，电穿孔脉冲宽度可以小于约5毫秒。在一些情况下，电穿孔宽度可为至少约5毫秒、至少约6毫秒、至少约7毫秒、至少约8毫秒、至少约9毫秒、至少约10毫秒、至少约11毫秒、至少约12毫秒、至少约13毫秒、至少约14毫秒、至少约15毫秒、至少约16毫秒、至少约17毫秒、至少约18毫秒、至少约19毫秒、至少约20毫秒、至少约21毫秒、至少约22毫秒、至少约23毫秒、至少约24毫秒、至少约25毫秒、至少约26毫秒、至少约27毫秒、至少约28毫秒、至少约29毫秒、至少约30毫秒、至少约31毫秒、至少约32毫秒、至少约33毫秒、至少约34毫秒、至少约35毫秒、至少约36毫秒、至少约37毫秒、至少约38毫秒、至少约39毫秒、至少约40毫秒、至少约41毫秒、至少约42毫秒、至少约43毫秒、至少约44毫秒、至少约45毫秒、至少约46毫秒、至少约47毫秒、至少约48毫秒、至少约49毫秒或至少约50毫秒。在一些情况下，最佳转染效率和/或细胞存活力所需的电穿孔脉冲宽度可能是细胞类型特异性的。例如，对于巨噬细胞，30毫秒的电穿孔脉冲宽度可能是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在另一个实例中，对于Jurkat细胞，约10毫秒的电穿孔宽度可能是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在一些情况下，对于给定的细胞类型，电穿孔宽度的范围可能是最佳的。例如，对于人578T细胞，约20毫秒至约30毫秒的电穿孔宽度可能是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。
在一些实施方案中，可以改变电穿孔脉冲的数量以优化转染效率和/或细胞存活力。在一些情况下，电穿孔可包含单个脉冲。在一些情况下，电穿孔可包含多于一个脉冲。在一些情况下，电穿孔可包括2个脉冲、3个脉冲、4个脉冲、5个脉冲、6个脉冲、7个脉冲、8个脉冲、9个脉冲或10个或更多个脉冲。在一些情况下，最佳转染效率和/或细胞存活力所需的电穿孔脉冲数可能是细胞类型特异性的。例如，对于巨噬细胞，使用单个脉冲的电穿孔可能是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在另一个实例中，对于原代细胞，使用3个脉冲的电穿孔可能是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在一些情况下，对于给定的细胞类型，电穿孔宽度的范围可能是最佳的。例如，对于人细胞，使用约1至约3个脉冲的电穿孔可能是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。
在一些情况下，可以改变电穿孔的起始细胞密度以优化转染效率和/或细胞存活力。在一些情况下，电穿孔的起始细胞密度可以小于约1×105个细胞。在一些情况下，电穿孔的起始细胞密度可为至少约1×105个细胞、至少约2×105个细胞、至少约3×105个细胞、至少约4×105个细胞、至少约5×105个细胞、至少约6×105个细胞、至少约7×105个细胞、至少约8×105个细胞、至少约9×105个细胞、至少约1×106个细胞、至少约1.5×106个细胞、至少约2×106个细胞、至少约2.5×106个细胞、至少约3×106个细胞、至少约3.5×106个细胞、至少约4×106个细胞、至少约4.5×106个细胞、至少约5×106个细胞、至少约5.5×106个细胞、至少约6×106个细胞、至少约6.5×106个细胞、至少约7×106个细胞、至少约7.5×106个细胞、至少约8×106个细胞、至少约8.5×106个细胞、至少约9×106个细胞、至少约9.5×106个细胞、至少约1×107个细胞、至少约1.2×107个细胞、至少约1.4×107个细胞、至少约1.6×107个细胞、至少约1.8×107个细胞、至少一个约2×107个细胞、至少约2.2×107个细胞、至少约2.4×107个细胞、至少约2.6×107个细胞、至少约2.8×107个细胞、至少约3×107个细胞、至少约3.2×107个细胞、至少约3.4×107个细胞、至少约3.6×107个细胞、至少约3.8×107个细胞、至少约4×107个细胞、至少约4.2×107个细胞、至少约4.4×107个细胞、至少约4.6×107个细胞、至少约4.8×107个细胞、或至少约5×107个细胞。在一些情况下，最佳转染效率和/或细胞存活力所需的电穿孔起始细胞密度可能是细胞类型特异性的。例如，对于巨噬细胞，1.5×106个细胞的电穿孔的起始细胞密度可能是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在另一个实例中，对于人细胞，5×106个细胞的电穿孔的起始细胞密度可能是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在一些情况下，对于给定的细胞类型，电穿孔的起始细胞密度范围可能是最佳的。例如，对于诸如T细胞的人细胞，电穿孔的起始细胞密度在5.6×106和5×107个细胞之间可能是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。
提供了一种用于治疗淋巴恶性肿瘤的方法。该方法可以包括向有需要的患者施用工程化免疫细胞群体。群体中的单个工程化免疫细胞可以包含一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，该一种或多种CAR包含结合部分，其中该结合部分可以包含能够结合免疫细胞抗原的抗原结合结构域，并且其中一种或多种CAR中的每个CAR还可包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。群体中的单个工程化免疫细胞还可包含能够增强工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分。工程化免疫细胞的内源性T细胞受体(TCR)可能被灭活。在一些情况下，患者外周血中受影响的细胞数或骨髓中受影响的细胞数可以在最后给予工程化免疫细胞后的一段时间(例如，3周)内减少至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些情况下，最后给予工程化免疫细胞后的一段时间可为约1周、2周、3周、4周、5周或更长时间。患者的外周血中自体T细胞、粒细胞和NK细胞中任何一种或多种的数量可以在最后给予工程化免疫细胞后的一段时间(例如，3周)内开始增加。在一些情况下，最后给予工程化免疫细胞后的一段时间可为约1周、2周、3周、4周、5周或更长时间。
增强子部分可以增强工程化免疫细胞的一种或多种活性。增强子部分可以被配置为组成性地增强工程化免疫细胞的一种或多种活性。可将增强子部分配置为组成性地上调工程化免疫细胞的一种或多种细胞内信号传导通路。一种或多种细胞内信号传导通路可以是一种或多种细胞因子信号传导通路。增强子部分可以是细胞因子或细胞因子受体。增强子部分可以选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19，TGFRβ、同样的受体、其功能片段、其功能变体及其组合。
工程化免疫细胞还可包含在诱导型细胞死亡部分与细胞死亡激活剂接触时能够实现细胞死亡的诱导型细胞死亡部分。诱导型细胞死亡部分可选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8、Her2t、CD30、BCMA和EGFRt。例如，诱导型细胞死亡部分可以是EGFRt，并且细胞死亡激活剂可以是结合EGFRt的抗体或其抗原结合片段。又例如，诱导型细胞死亡部分可以是HSV-TK，并且细胞死亡激活剂可以是GCV。又例如，诱导型细胞死亡部分可以是iCasp9，并且细胞死亡激活剂可以是AP1903。
编码细胞内源性表面标志物的基因可以被灭活。内源性表面标志物在表达时能够与第一抗原结合结构域结合。内源性表面标志物可以是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ或SLAMF7。
可以在外周血中受影响的细胞数量或骨髓中受影响的细胞数量减少至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多之前，患者的外周血中自体T细胞、粒细胞和NK细胞中任何一种或多种的数量开始增加。可以在外周血中的受影响的细胞数量或骨髓中受影响的细胞数量减少至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多之后，外周血中自体T细胞、粒细胞和NK细胞中任何一种或多种的数量开始增加。
实施例
实施例1具有TCR敲除的表达CD3+CD19双重CAR和EGFRt开关的U-CAR T细胞的研究
一般材料和方法
从供体血液中分离外周血单核细胞(PBMC)和扩增T细胞
通过使用Histopaque-1077(西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich))通过密度梯度离心从供体血液中分离外周血单核细胞(PBMC)。然后富集T细胞，通过与抗CD3/抗CD28偶联的磁珠激活、培养和扩增。
细胞系和PBMC的培养
Raji细胞(伯基特淋巴瘤细胞，ATCC-CCL86)；
K562细胞(人红白血病细胞系，ATCC-CCL243)；
Raji-ffluc细胞系(通过筛选用具有萤火虫荧光素酶的慢病毒转染的Raji细胞获得)；
293T细胞(ATCC-CRL3216)。
在RPMI1640培养基中培养Raji细胞、K562细胞和Raji-ffluc细胞系，并且在DMEM培养基中培养293T细胞。RPMI1640和DMEM均补充有10％(v/v)的胎牛血清和100U/ml的青霉素和链霉素、2mM的谷氨酰胺和1mM的丙酮酸钠。所有细胞均在37℃、5％CO2的孵化器中培养。
将T细胞和获得的CAR-T细胞在X-vivo15培养基(含有5％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1mM的丙酮酸钠和300IU/ml的rhIL2)中培养。CAR-T细胞的培养基进一步补充rhIL-2(赛默飞世尔科学)，每两天一次，终浓度为300Iu/ml。所有细胞均在37℃、5％CO2的孵化器中培养。1.1CAR的设计和病毒包装
嵌合抗原受体的结构是EGFRt-CD3 scFv-CD19 scFv-铰链-TM-CD28-CD3ζ(串联)、tEGFR-CD19 scFv-CD28-CD3ζ-CD3 scFv-41BB-CD3ζ(平行)、tEGFR-CD3 scFv-CD19scFv41BB-CD3ζ(串联)和CD19VL-CD3VL-CD3VH-CD19VH-41BB-CD3ζ(环)，其中EGFRt(或tEGFR)是作为开关的截短的EGFR，CD3 scFv片段是单克隆抗体OKT3或UCHT1(通过GS接头连接)的重链和轻链可变体区，CD 19scFv片段是包含用于CAR检测的信标序列的单克隆抗体FMC63(通过GS接头连接)的重链和轻链可变区，并且还包括串联的铰链区、跨膜区、人CD 28细胞内共刺激元件和人CD3ζ细胞内区域。嵌合抗原受体的示例性构建体在图1中示出。
EGFRt-OKT3-FMC63-CD28z的氨基酸序列(SEQ ID NO.:1)如下所示：
Figure BDA0003141784850001032
Figure BDA0003141784850001031
在EGFRt-OKT3-FMC63-CD28z的氨基酸序列中，下划线部分是安全开关信号肽区，斜体部分是tEGFR，斜体下划线部分是tEGFR TM，曲线下划线部分是P2A，斜体曲线下划线部分是CAR信号肽，粗体部分是OKT3 Vh，虚线下划线部分是连接肽，粗体下划线部分是OKT3Vl，粗斜体部分是FMC63 Vl，粗斜体下划线部分是FMC63 Vh，加框部分是CD28铰链区跨膜区和共刺激结构域，且加框斜体部分是CD3z。
EGFRt-OKT3-FMC63-CD28z的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2中所示。
SEQ ID NO.:2:ATGTTGCTCCTTGTGACGAGCCTCCTGCTCTGCGAGCTGCCCCATCCAGCCTTCCTCCTCATCCCGCGGAAGGTGTGCAATGGCATAGGCATTGGCGAGTTTAAAGATTCTCTGAGCATAAATGCTACGAATATTAAGCATTTCAAGAATTGTACTTCTATTAGTGGCGACCTCCATATTCTTCCGGTTGCCTTCAGGGGTGACTCTTTCACCCACACACCTCCATTGGATCCACAAGAACTTGACATCCTGAAGACGGTTAAAGAGATTACAGGCTTCCTCCTTATCCAAGCGTGGCCCGAGAACAGAACGGACTTGCACGCCTTTGAGAACCTCGAAATAATACGGGGTCGGACGAAGCAACACGGCCAATTTAGCCTTGCGGTTGTTAGTCTGAACATTACTTCTCTCGGCCTTCGCTCTTTGAAAGAAATCAGCGACGGAGATGTCATCATTAGTGGAAACAAGAACCTGTGCTACGCGAACACAATCAACTGGAAGAAGCTCTTCGGTACTTCAGGCCAAAAGACAAAGATTATTAGTAACAGAGGAGAGAATAGCTGTAAGGCTACCGGACAAGTTTGTCACGCCTTGTGTAGTCCAGAGGGTTGCTGGGGACCGGAACCAAGGGATTGCGTCAGTTGCCGGAACGTGAGTCGCGGACGCGAGTGTGTGGATAAGTGCAATCTTCTGGAAGGGGAACCGCGAGAGTTTGTAGAAAATTCCGAATGTATACAGTGTCATCCCGAGTGTCTTCCACAAGCAATGAATATCACATGTACAGGGAGGGGTCCTGATAACTGTATCCAATGTGCACACTACATAGATGGTCCTCACTGTGTAAAGACGTGCCCCGCCGGAGTAATGGGTGAAAACAACACCCTCGTGTGGAAGTACGCCGATGCCGGGCATGTCTGTCATTTGTGTCATCCCAACTGCACATATGGCTGTACCGGTCCTGGATTGGAGGGCTGTCCAACAAACGGGCCGAAAATACCGAGTATCGCAACAGGCATGGTGGGAGCACTTTTGCTTCTCCTCGTTGTCGCCCTGGGCATCGGCTTGTTCATGCGAGCTAAACGAGGCTCAGGCGCGACGAACTTTAGTTTGCTGAAGCAAGCTGGGGATGTAGAGGAAAATCCGGGTCCCATGGCCCTTCCAGTGACAGCCTTGTTGTTGCCACTTGCTCTGCTGCTCCACGCTGCGCGGCCACAGGTCCAGTTGCAGCAGTCAGGCGCCGAATTGGCGCGACCAGGGGCAAGCGTAAAGATGAGCTGTAAGGCATCCGGGTACACGTTCACTCGCTATACCATGCATTGGGTTAAACAACGGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGGTATATCAACCCATCCCGGGGCTACACTAACTATAATCAAAAGTTTAAAGATAAAGCAACCCTTACGACCGACAAATCATCTTCTACCGCATACATGCAGCTCAGCTCCCTCACCAGTGAAGATTCTGCCGTTTATTATTGTGCACGATACTATGACGATCACTATTGCCTGGACTACTGGGGTCAAGGCACCACACTTACTGTCAGTTCCGGAAGTACCAGTGGGGGAGGTTCTGGCGGTGGCAGCGGGGGTGGGGGTAGCTCACAAATCGTGCTGACCCAGAGTCCCGCTATCATGAGCGCCTCCCCAGGGGAAAAGGTGACGATGACATGCTCAGCCAGCTCCAGTGTATCCTACATGAATTGGTATCAACAGAAGAGTGGGACGTCACCCAAAAGATGGATTTATGACACCAGCAAATTGGCCAGCGGAGTACCAGCGCATTTCAGAGGCAGTGGGAGTGGAACATCTTATTCTCTCACCATTAGCGGCATGGAAGCAGAGGATGCAGCAACGTACTATTGTCAACAATGGAGCTCTAATCCCTTTACGTTCGGCAGCGGCACTAAGCTCGAAATTAATAGGGGTGGCGGCGGCTCCGGCGGTGGCGGGTCTGGAGGTGGGGGCAGTGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAGACTACAAAGACGATGACGACAAGATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
EGFRt-UCHT1-FMC63-CD28z的氨基酸序列(SEQ ID NO.:3)如下所示：
Figure BDA0003141784850001061
Figure BDA0003141784850001071
在EGFRt-UCHT1-FMC63-CD28z的氨基酸序列中，下划线部分是安全开关信号肽(GMCSFR-L)，斜体部分是tEGFR，斜体下划线部分是tEGFR TM，曲线下划线部分是P2A，斜体曲线下划线部分是CAR信号肽(CD8 L)，粗体部分是UCHT1 VL，虚线下划线部分是连接肽，粗体下划线部分是UCHT1 VH，粗斜体部分是FMC63 VH，粗斜体下划线部分是FMC63 VL，加框部分是CD28铰链区跨膜区和共刺激结构域，且加框斜体部分是CD3z。
EGFRt-UCHT1-FMC63-CD28z的核苷酸序列如SEQ ID NO.:4中所示。
SEQ ID NO:4:ATGCTGCTGCTCGTGACATCCCTCTTATTATGCGAACTCCCTCACCCCGCTTTTCTGCTGATCCCCAGAAAGGTGTGCAACGGCATCGGCATTGGAGAGTTCAAGGATTCTTTAAGCATCAACGCTACCAACATCAAACATTTCAAGAACTGTACCTCCATTTCCGGCGATTTACACATCCTCCCCGTTGCCTTTCGTGGCGATAGCTTCACACACACACCCCCTCTGGACCCTCAAGAACTGGACATTTTAAAGACCGTGAAGGAGATCACTGGTTTTTTACTGATCCAAGCTTGGCCCGAAAATAGGACAGATCTCCACGCTTTCGAGAATTTAGAGATCATTCGTGGCAGAACCAAGCAGCACGGACAGTTCTCTTTAGCCGTCGTGTCTTTAAATATCACCTCTTTAGGTTTAAGATCTTTAAAAGAGATCAGCGATGGCGACGTCATCATCTCCGGCAACAAGAACCTCTGTTACGCCAACACCATTAATTGGAAAAAGCTGTTTGGCACCTCCGGACAGAAGACCAAGATCATCAGCAACAGAGGCGAGAACAGCTGCAAAGCTACCGGCCAAGTTTGCCACGCTCTGTGTAGCCCCGAAGGCTGCTGGGGACCCGAACCTCGTGACTGTGTGAGCTGTAGGAACGTGTCTCGTGGTCGTGAGTGTGTGGATAAGTGCAATTTACTCGAGGGCGAGCCCAGAGAGTTTGTGGAAAATAGCGAGTGCATCCAGTGCCACCCCGAATGTCTGCCCCAAGCTATGAACATTACTTGTACTGGTCGTGGCCCCGATAACTGTATCCAGTGCGCTCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACATGCCCCGCTGGCGTGATGGGAGAAAACAACACACTGGTGTGGAAGTATGCCGATGCCGGCCACGTCTGTCATCTGTGCCACCCTAACTGTACCTACGGCTGTACCGGACCCGGACTGGAGGGCTGTCCCACCAACGGACCCAAGATCCCTAGCATCGCCACCGGCATGGTGGGAGCCTTACTGCTGTTACTGGTGGTGGCTCTGGGCATTGGTTTATTCATGAGGGCCAAGAGAGGATCCGGCGCCACCAACTTTTCTTTACTGAAACAAGCTGGAGACGTCGAGGAAAACCCCGGACCCATGGCTCTCCCCGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTCGCTTTATTACTGCACGCCGCTAGGCCCGATATTCAGATGACCCAAAGCCCTAGCTCTTTATCCGCCAGCGTCGGAGATAGAGTCACAATCACTTGTAGAGCCAGCCAAGATATTCGTAATTATCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGTAAAGCCCCCAAGCTGCTCATCTATTACACCTCTCGTCTGGAGAGCGGCGTGCCTTCCAGATTCAGCGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTATACACTCACCATTAGCTCTTTACAGCCCGAAGATTTCGCTACCTACTACTGCCAGCAAGGTAATACTTTACCTTGGACCTTCGGCCAAGGTACCAAGGTCGAAATCAAGGGCGGCGGCGGATCCGGCGGCGGTGGATCTGGTGGCGGCGGCTCCGAAGTCCAGCTGGTCGAATCCGGAGGCGGACTGGTCCAGCCCGGTGGATCCCTCAGACTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTATTCCTTCACCGGCTACACCATGAACTGGGTGAGACAAGCTCCCGGCAAAGGACTGGAATGGGTGGCCCTCATCAACCCCTACAAGGGCGTGTCCACATATAATCAAAAGTTTAAGGACAGATTCACCATCAGCGTCGACAAGTCCAAGAACACCGCTTATTTACAGATGAACTCTTTAAGAGCTGAGGATACCGCCGTGTACTATTGTGCTAGGTCCGGCTACTACGGCGACAGCGACTGGTATTTTGACGTCTGGGGACAAGGTACCCTCGTGACAGTGAGCAGCGGCGGTGGCGGTTCTGGCGGCGGAGGCTCCGGAGGAGGCGGCAGCGAGGTGAAGCTGCAAGAAAGCGGACCCGGTCTCGTGGCTCCCTCCCAATCTTTATCCGTGACTTGTACCGTGTCCGGAGTCTCTTTACCCGACTACGGCGTGAGCTGGATTAGACAGCCCCCCAGAAAAGGTTTAGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGATCCGAGACCACATACTACAACAGCGCTTTAAAGTCTCGTCTGACAATCATCAAAGACAATTCCAAAAGCCAAGTTTTCCTCAAGATGAACTCTTTACAGACCGACGACACAGCCATTTACTACTGCGCCAAGCATTATTACTACGGCGGCAGCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGTACAAGCGTCACAGTGAGCTCCGGCAGCACATCCGGAAGCGGAAAGCCCGGCAGCGGAGAGGGCAGCACAAAGGGAGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCTTTAAGCGCCTCTTTAGGAGATAGGGTGACCATTAGCTGCAGAGCCTCCCAAGACATCAGCAAGTATCTCAATTGGTACCAGCAAAAGCCCGATGGCACCGTCAAGCTGCTGATCTACCACACCTCTCGTCTCCATTCCGGCGTGCCCAGCAGATTTAGCGGAAGCGGATCCGGAACAGACTATTCTTTAACAATCAGCAATTTAGAGCAAGAAGACATCGCCACATATTTCTGCCAACAAGGTAACACTTTACCCTACACCTTCGGAGGCGGCACCAAACTGGAGATTACAGCGGCCGCAGACTACAAAGACGATGACGACAAGATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
将CAR基因克隆到FUW慢病毒载体主链中EF1α(EF-1α)的启动子下以形成Fuw-EF1α-CAR。通过使用Lipofectamine3000将Fuw-EF1α-CAR、慢病毒包膜质粒pMD2.G(Addgene，质粒#12259)和慢病毒包装质粒psPAX2(Addgene，质粒#12260)转染到293T细胞中，以制备完整的慢病毒表达载体。在48和72小时收集上清液，并进行超速离心(Merck Millipore)以浓缩。浓缩的病毒准备用于T细胞的转染。
结果表明，成功构建了慢病毒载体，并按预期那样检测到EGFRt和CD19+CD3 CAR两者的表达。
1.2CRISPR的设计与构建
首先，在http://crispr.mit.edu设计靶向TCR保守区的第一个外显子的gRNA序列，并选择得分高于80的两个gRNA序列以获得更高的敲除效率。对于gRNA引物，正向引物包含T7启动子，随后是20bp的靶序列，反向引物具有20bp的互补序列。pX330质粒用作PCR模板。纯化后，将T7-PCR产物进一步用作MEGAshortscript T7试剂盒的模板以获得RNA。用MEGAclear柱纯化RNA，并用无RNA的水洗脱。Cas9质粒购自Addgene。
gRNA靶向序列如下：
TRAC-gRNA：TGTGCTAGACATGAGGTCTA，SEQ ID NO:5；
同时，通过Surveyor测定法TIDE分析gRNA的敲除效率。
1.3CAR-T细胞的制备
细胞分离和激活
单采血液成分法后，使用Histopaque-1077(西格玛-奥德里奇)通过密度梯度离心分离单核细胞。然后富集T细胞，通过与抗CD3/抗CD28偶联的磁珠激活、培养和扩增。
将具有5％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1mM的丙酮酸钠和300IU/ml的rhIL2的X-vivo 15用作CAR-T细胞培养基。将细胞孵育并在37℃、5％CO2下培养。
表达CD 19的细胞系：Raji(伯基特淋巴瘤细胞系，ATCC-CCL86)；K562细胞(人红白血病细胞系，ATCC-CCL243)；通过筛选用具有萤火虫荧光素酶的慢病毒转染的Raji细胞获得Raji-ffluc细胞系。
表达CD3的细胞系：Jurkat细胞。
所有细胞都在RPMI1640培养基中培养，且293T细胞(ATCC-CRL3216)在DMEM培养基中培养。RPMI1640和DMEM均补充有10％(v/v)的胎牛血清和100U/ml的青霉素和链霉素、2mM的谷氨酰胺和1mM的丙酮酸钠。
电穿孔
富集并激活T细胞后两天，将抗CD3/抗CD28磁珠和细胞收集到试管中，并以300g离心5分钟，然后用DPBS洗涤两次，并以1-3×108/ml的细胞密度重新悬浮在opti-mem中。基于细胞密度(每个细胞30μg/ml)计算所需的cas9/gRNA的量。将Cas9和gRNA以1:1混合，并在室温下孵育10分钟，然后转移至电穿孔缓冲液中以与细胞进一步混合，通过4D-NucleofectorSystem N(龙沙(Lonza))系统进行电穿孔。然后将细胞重悬于预热的培养基中达到1-2×106/ml的密度，转移到平板上，然后在37℃，5％CO2的孵化器中培养。
慢病毒转染
电穿孔后1天，通过慢病毒载体以2-8的MOI转染细胞，转移到烧瓶中，并在37℃、5％CO2下培养。
细胞增殖与CAR阳性比的检测
转染后3天，检测细胞数和CAR阳性细胞，并计算T细胞中CAR的阳性比。还检测CD3和PD1的阳性比，以确定敲除效率。然后将细胞在孵化器中连续培养，每2-3天更换一半培养基，直到第14天，此时细胞准备冷冻保存。示例性工作流程在图2中示出。
图3显示了表达带有或不带有特定标志物的双重CAR的工程化免疫细胞或对照细胞的流式细胞术数据。例如，CD3可以是指示内源性TCR敲除效率的标志物，且3CAR(靶向CD3的CAR)可以是指示靶向CD3的CAR-T细胞的标志物，19CAR(靶向CD19的CAR)可以是指示靶向CD19的CAR-T细胞的标志物，且EGFR可以是指示表达EGFRt的CAR-T的标志物。图4显示了表达带有或不带有特定标志物的双重CAR的工程化免疫细胞或对照细胞的另一流式细胞术数据。在图4中，靶向CD19的CAR是单克隆抗体FMC63的scFv，且靶向CD3的CAR是单克隆抗体OKT3或UCHT1的scFv。结果表明，在制备的EGFRt-CD3-CD19 CAR-T细胞中，EGFR和CAR的阳性比以及CD3的阴性比高，表明成功制备具有安全开关(例如，EGFRt)的基因敲除双重CAR-T细胞(例如，平行-EGFRt)。
1.4细胞因子的释放
将实施例1.3中制备的双CAR-T细胞和CD19阳性肿瘤细胞(Raji)、CD3阳性肿瘤细胞(Jurkat)或原代同种异体PBMC(每种100ul)以1:1比例在RPMI培养基中混合达到每种细胞的密度为1×106/ml，然后在96孔板中培养过夜。然后收集培养基并进行离心，并通过细胞因子珠阵列试剂盒(CBA试剂盒，BD生物科学(BC Biosciences))检测释放的细胞因子IFN-γ和IL-2。
结果表明，EGFRt-CD3-CD19 CAR-T细胞与Raji、Jurkat或原代同种异体PBMC共同孵育产生大量IFN-γ和IL-2，表明CAR-T对CD19阳性或CD3阳性靶细胞的功能。
1.5体外杀死活性
通过将荧光素酶基因导入靶细胞，然后进行筛选，获得稳定转染的细胞系。在加入荧光素后，荧光素酶可与荧光素反应以产生荧光。通过检测荧光的强度，可以测量荧光素酶的活性，并且可以检测细胞的存活，从而评估CART细胞的杀死效果。
图5A显示了CAR-T细胞的细胞毒性的条形图，包括靶向具有单克隆抗体OKT3或UCHT1的scFv的CD3的CAR-T细胞、靶向CD19和CD3的双特异性CAR-T细胞(para193-O和para193-U)，具有内源性TCR敲除的CD19 CAR(TCR KO CD19 CAR)，和具有内源性TCR敲除的T细胞对照(TCR KO T细胞对照)，以1:1E:T(效应CAR-T细胞与靶癌细胞)比例朝向CD19+NALM6-Luc细胞和CD3+Jurkat-Luc细胞进行分别6小时和24小时。图5B显示了从Jurkat细胞和CAR-T细胞以1:1E:T比例共培养的第1天至第3天测量的CAR-T细胞对Jurket细胞的细胞毒性。图5C显示了从NALM6细胞和CAR-T细胞以1:1E:T比例共培养的第1天至第3天测量的CAR-T细胞对表达CD3的T细胞的细胞毒性。
还测试了靶向CD19和CD3的双特异性CAR-T细胞(例如，与来自单克隆抗体UCHT1的scFv平行形式的双特异性CAR-T细胞：GC193-para-U)针对NALM6-LucG、Jurkat-LucG、Raji、同种异体NT细胞(未处理的T细胞)和自体NT细胞的细胞毒性。图6A显示了在不同的效应子：靶标比例下，CAR-T细胞对NALM6细胞的40小时细胞毒性。图6B显示了在不同的效应子：靶标比例下，CAR-T细胞对Jurkat细胞的6小时细胞毒性。图6C显示了CAR-T细胞对Jurkat、同种异体NT细胞、自体NT细胞、Raji细胞和NALM6细胞的40小时细胞毒性。图7A显示了平行或环形式的双特异性CAR-T细胞对NALM6细胞的16小时细胞毒性。CD19-CD3双特异性CAR-T细胞显示出与单个CD19CAR-T细胞相当的抗肿瘤功效。图7B显示了平行或环形式的双特异性CAR-T细胞对Jurkat细胞的16小时细胞毒性。CD3-CD3双特异性CAR-T细胞显示出与单个CD19 CAR-T细胞相当的抗肿瘤功效。结果表明EGFRt-CD3-CD19 CAR-T细胞显著杀死Nalm6、Raji、Jurkat和原代同种异体PBMC，表明CAR-T对CD19阳性或CD3阳性靶细胞的功能，及其同时靶向两者CD19+癌细胞和CD3+杀死T细胞的能力。
1.6 体内功效
选择6-12周的NOD-Prkdcscid Il2rgnull(NPG)小鼠，并腹膜内注射2×105个Raji-ffluc细胞或Jurkat-ffluc细胞，50μL的DPBS和50μL的人工基底膜基质(matrigelmatrix)(Corning)。两天后，测量小鼠的肿瘤移植物负荷，并基于肿瘤负荷将小鼠分为4组。一天后，分别向每只小鼠注射200μL的DPBS、5×106的NT细胞和5×106的EGFRt-CD3-CD19CAR-T细胞。在CAR-T治疗后7天，进一步评估小鼠的肿瘤负荷。然后给每只小鼠腹膜内注射3mg d-萤光素进行4分钟反应，然后通过使用Xenogen IVIS成像系统进行30秒曝光拍照。
结果表明，对于来自Raji-ffluc和Jurkat-ffluc细胞肿瘤，与NT细胞相比，EGFRt-CD3-CD19 CAR-T显著降低了肿瘤负荷，表明EGFRt-CD3-CD19 CAR-T可以在体内清除CD19阳性或CD3阳性靶细胞。
1.7体内GVHD研究
首先用亚致死剂量的辐射(175cGy)对小鼠进行全身性治疗。然后将CAR-T细胞重悬于PBS中，并注入到治疗小鼠的胸腔。通过使用GVHD临床标准每周观察小鼠2-3次，包括体重减轻、弓背、活动、皮毛质地和皮肤完整性。
结果表明，没有TCR基因敲除的小鼠表现出GVHD症状，然而，在EGFRt-CD3-CD19CAR-T+TCR双重基因敲除组中未检测到GVHD。
图66显示了比较CD19 CAR-T与TCR KO CD19 CAR-T细胞的体内GvHD研究。将2e7CD19 CAR-T或TCR KO CD19 CAR-T细胞输注到各带有Raji肿瘤的NOG小鼠中，以比较GvHD应答。与TCR KO CAR-T细胞相比，CD19 CAR-T组的小鼠显示出显著的CAR-T扩张，并伴有严重的体重减轻(>20％)、弓背、皮毛褶皱和早期死亡。在任何TCR KO CD19 CAR-T输注的小鼠中均未检测到GVHD。
1.8体外HVG研究
将EGFRt-CD3-CD19 CAR-T+TCR敲除和EGFRt-CD3-CD19CAR-T+TCR/B2M双重敲除细胞与NK细胞1:1孵育过夜，以检测细胞凋亡和细胞因子释放(IFN-γ)。
结果表明，与对照组相比，EGFRt-CD3-CD19 CAR-T+TCR敲除组几乎没有细胞凋亡，并且释放的细胞因子显著更少，表明本公开的产物不会引起通过NK细胞的HVG反应。同时，TCR/B2M双重敲除细胞被NK细胞显著杀死，不能长期存活。
HVG还可以诱导抗HLA完整的CAR-T细胞的同种异体T细胞。图6C显示了双重CAR-T细胞可在40小时内靶向同种异体T细胞，从而防止CAR-T被宿主同种异体T细胞排斥，这通常需要72小时。
1.9EGFRt基因介导的CAR-T细胞的清除
NK细胞作为效应细胞从PBMC中分离，并以10μg/mL的终浓度在含有或不含有西妥昔单抗的情况下、与CD19-28z CART或EGFRt-CD3-CD19 CAR-T进行1:1共培养。4小时和24小时后，通过流式细胞术检测CD3和CAR的表达。
ADCC百分比＝(1-单克隆抗体组CAR阳性比/无抗体组CAR阳性比)*100％
结果表明，在西妥昔单抗存在下，4小时和24小时后，NK细胞显著清除了EGFRt-CD3-CD19 CAR-T细胞，但未能清除CD19-28z CART。在没有西妥昔单抗的情况下，NK不能杀死任何一种细胞。这表明西妥昔单抗起着安全开关的作用，其与EGFRt-CD3-CD19 CAR-T结合，并允许NK介导ADCC功能，从而清除CART细胞。
实施例2具有TCR敲除的表达CAR19和增强子的U-CAR-T细胞研究
在该实施例中，通过皮下注射将5×105个Raji荧光素酶细胞移植到NOG小鼠中，并生长直至达到100mm3。将1×106野生型或TCR KO CD19 CAR-T细胞静脉内输注(IV)到Raji移植小鼠中。通过卡尺测量实际肿瘤大小来评估肿瘤负荷。通过流式细胞术分析测量外周血中的CAR-T细胞的扩增。图8A显示了CAR-T治疗后的肿瘤负荷。TCR完整的CD19 CAR-T细胞能够消除肿瘤，但TCR KO CD19 CAR-T无法控制Raji肿瘤生长。尽管两者都是基于Raji的荷瘤模型，但是皮下模型产生实体瘤，并且与静脉内模型相比，皮下模型对控制肿瘤的CAR-T细胞增殖具有更高的要求。图8B显示了外周血中的CAR-T增殖。与WT CAR-T细胞相比，TCR KOCAR-T细胞显示出增殖缺陷，CAR-T细胞扩增的峰值比WT细胞低得多，这与它们的肿瘤控制作用是一致的。
图9A-图9C显示了具有TCR敲除的CD19 CAR-T细胞的增殖。图9A显示了通过NALM6细胞重复刺激和残留肿瘤细胞测量的实验时间线。图9B显示了与没有TCR敲除的CD19 CAR-T细胞和具有TCR敲除但没有增强子表达的CD19 CAR-T细胞相比，具有TCR敲除的CD19 CAR-T细胞和不同增强子表达的增殖数据。根据图9A中的实验时间线，用箭头指示NALM6细胞的添加。图9B显示了如通过根据图9A中的实验时间线、在指定日测量的残留肿瘤细胞的量所指示的各种CD19 CAR-T细胞的清除活性。在受到NALM6细胞多轮或反复刺激下，与本实验中测试的其他细胞相比，具有TCR敲除和C7R或IL7的CD19CAR-T细胞表现出持续的扩增和增强的扩增能力。
图10A和10B显示了比较工程化CAR-T细胞的扩增能力的其他增殖数据。图10A显示了与没有增强子表达的细胞相比，具有TCR敲除和两种不同的增强子(C7R和IL2)的CD19CAR-T细胞的增殖数据。结果显示，在受到NALM6细胞的多轮或反复刺激下，与没有任何增强子表达的细胞相比，具有TCR敲除和C7R或IL2的CD19 CAR-T细胞表现出持续的扩增和增强的扩增能力。图10B显示了与没有增强子表达的细胞相比，具有TCR敲除和两种不同的增强子(C7R和mbIL15)的CD7 CAR-T细胞的增殖数据。结果显示，在受到CCRF-CEM细胞的多轮或反复刺激下，与没有任何增强子表达的细胞相比，具有TCR敲除和C7R或mbIL15的CD7 CAR-T细胞表现出持续的扩增和增强的扩增能力。表达C7R的细胞比表达mbIL15的细胞表现出更好的扩增能力。
图11显示了TCR KO CD19 CAR-T细胞中增强子的体内比较的实例。在该实施例中，通过静脉内(IV)注射将5×105个Raji荧光素酶细胞移植到NOG小鼠中，并生长5天。将具有/不具有增强子的TCR KO CD19 CAR-T细胞(具有TCR敲除的CD19 CAR-T细胞)以及载体(vehicle)和T细胞对照静脉内输注(IV)到Raji移植的小鼠中。通过生物发光强度(BLI)评估肿瘤负荷。与没有表达增强子或表达mbIL15的细胞或其他对照细胞相比，表达增强子C7R、IL7的TCR KO CD19CAR-T细胞表现出更好的肿瘤控制。图12显示了指示通过BLI评估的肿瘤负荷的NOG小鼠的相应图像。
实施例3具有TCR和CD 7双重敲除的表达CAR7和增强子的U-CAR-T细胞，以及具有 TCR和CD 2双重敲除的表达CD2 CAR和增强子的U-CAR-T细胞的研究
一般材料和方法
从供体血液中分离外周血单核细胞(PBMC)和扩增T细胞
通过使用Histopaque-1077(西格玛-奥德里奇)密度梯度离心从供体血液中分离外周血单核细胞(PBMC)。然后富集T细胞，通过与抗CD3/抗CD28偶联的磁珠激活、培养和扩增。
细胞系和T细胞培养
CCRF-CEM(T淋巴母细胞，
Figure BDA0003141784850001171
)TM
CCRF-CEM-luc细胞(通过筛选用具有萤火虫荧光素酶的慢病毒转染的CCRF-CEM细胞获得的)；
K562细胞(人红白血病细胞系，ATCC-CCL243)；
293T细胞(ATCC-CRL3216)；
NK92细胞(ATCC-CRL2407)。
在RPMI1640培养基中培养CCRF-CEM-luc细胞系，并在DMEM培养基中培养293T细胞。RPMI1640和DMEM均补充有10％(v/v)的胎牛血清和100U/ml的青霉素和链霉素、2mM的谷氨酰胺和1mM的丙酮酸钠。所有细胞均在37℃、5％CO2的孵化器中培养。
在补充有10％(v/v)胎牛血清、2mM的谷氨酰胺、1mM的丙酮酸钠、1％的NEAA、0.1mM的巯基乙醇和200IU/ml的rhIL2的RPMI1640培养基中培养NK92细胞。
将T细胞和获得的CAR-T细胞在X-vivo15培养基(含有5％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1mM的丙酮酸钠和300IU/ml的rhIL2)中培养。CAR-T细胞的培养基进一步补充rhIL-2(赛默飞世尔科学)，每两天一次，终浓度为300Iu/ml。所有细胞均在37℃、5％CO2的孵化器中培养。
3.1CRISPR的设计与构建
在网站http：//crispr.mit.edu,www.idtdna.com和https：//www.synthego.com上评估基因编辑效率和脱靶风险后，选择用于基因编辑的CD7和TCR gRNA。本公开中使用的gRNA和HiFi-Cas9蛋白购自集成DNA技术有限公司(Integrated DNA Technologies,Inc(IDT))。
为了基因编辑，将3μg的Cas9蛋白和1.5μg的gRNA以20μl混合，并在37℃或室温下孵育15分钟以形成核糖核蛋白(RNP)。然后通过Lonza 4D核转染将RNP转染到T细胞中。基因敲除效率由如流式细胞术(FACS)检测的表达蛋白质的细胞比例来确定。
我们之前的研究表明TRAC-gRNA1对TCR具有更高的敲除效率(该序列如SEQ IDNO.:20所示)。当一起使用CD7的gRNA和TRAC-gRNA以同时敲除CD7和TCR时，四个CD7-gRNA中的三个显示出高效率(如图16所示)。选择CD7-gRNA1(SEQ ID NO.:34)作为敲除CD7的gRNA。
TRAC-gRNA1：TTCGGAACCCAATCACTGAC，SEQ ID NO 20；
CD7-gRNA1：GAGGTCAATGTCTACGGCTC，SEQ ID NO 25。
CD2的gDNA设计如下，且CD2 gRNA2显示出最高的CD2敲除效率(如图65所示)。
CD2-gRNA1：CAAAGAGATTACGAATGCCT
CD2-gRNA2：GTGCCACAAAGACCATCAAG
CD2-gRNA3：AGAGGGTCATCACACACAAG
CD2-gRNA4：CTTGTAGATATCCTGATCAT
3.2CAR和细胞因子的设计以及病毒的包装
嵌合抗原受体和细胞因子的结构为：CAR7、CAR7-mb15和CAR7-C7R(如图17所示)。核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.:35-40所示。
CAR7(SEQ ID NO 35)：
atggcactccctgtaactgcacttcttttgccacttgccttgctcctgcacgcagcgcggccggacatcgagctgacccagagccccgccatcatgagcgccagcctgggcgaggagatcaccctgacctgcagcgccagcagcagcgtgagctacatgcactggtaccagcagaagagcggcaccagccccaagctgctgatctacagcaccagcaacctggccagcggcgtgcccagcaggttcagcggcagcggcagcggcaccttctacagcctgaccatcagcagcgtggaggccgaggacgccgccgactactactgccaccagtggagcagctacaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagaggggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagccaggtgaagctgcaggagagcggcggcggcctggtgaagcccggcggcagcctgaagctgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagcagctacgccatgagctgggtgaggcagacccccgagaagaggctggagtgggtggccaccatcagcagcggcggcagctacacctactaccccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaacgccaagaacaccctgtacctgcagatgagcagcctgaggagcgaggacaccgccatgtactactgcgccaggcaggacggctactaccccggctggttcgccaactggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagctccggaacaacgacaccagcaccacggccacccactcctgctccgacaattgcgtctcagcccctttcccttcgacccgaagcttgtcgccctgctgcgggaggagcggtccacacgcgcgggcttgacttcgcttgcgacatctacatttgggcacccttggccgggacatgcggcgtcttgctcctgagtctggttataacgctgtattgtaagcgaggtcggaagaagcttttgtatatctttaaacagccctttatgaggcccgtacaaaccacacaagaggaggatgggtgctcatgcagatttcctgaagaggaagagggcggttgcgaacttagagtcaaattcagccgctccgcagatgcacctgcttataaacagggtcagaatcaattgtataatgaacttaatctcgggaggcgcgaggagtatgatgtgctggacaagcgacggggtcgagacccagagatgggcggtaaaccccgccgaaagaacccccaggagggactgtataatgagctgcaaaaggacaaaatggcagaagcctattccgaaatagggatgaagggagagcggcggcgaggtaagggacatgacggtctttatcaaggtcttagtactgcaactaaggacacctatgacgcgctgcatatgcaggctctcccacctagataa
CAR7(SEQ ID NO 36)：
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CAR7-mb15(SEQ ID NO 37)：
atggcactccctgtaactgcacttcttttgccacttgccttgctcctgcacgcagcgcggccggacatcgagctgacccagagccccgccatcatgagcgccagcctgggcgaggagatcaccctgacctgcagcgccagcagcagcgtgagctacatgcactggtaccagcagaagagcggcaccagccccaagctgctgatctacagcaccagcaacctggccagcggcgtgcccagcaggttcagcggcagcggcagcggcaccttctacagcctgaccatcagcagcgtggaggccgaggacgccgccgactactactgccaccagtggagcagctacaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagaggggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagccaggtgaagctgcaggagagcggcggcggcctggtgaagcccggcggcagcctgaagctgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagcagctacgccatgagctgggtgaggcagacccccgagaagaggctggagtgggtggccaccatcagcagcggcggcagctacacctactaccccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaacgccaagaacaccctgtacctgcagatgagcagcctgaggagcgaggacaccgccatgtactactgcgccaggcaggacggctactaccccggctggttcgccaactggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagctccggaacaacgacaccagcaccacggccacccactcctgctccgacaattgcgtctcagcccctttcccttcgacccgaagcttgtcgccctgctgcgggaggagcggtccacacgcgcgggcttgacttcgcttgcgacatctacatttgggcacccttggccgggacatgcggcgtcttgctcctgagtctggttataacgctgtattgtaagcgaggtcggaagaagcttttgtatatctttaaacagccctttatgaggcccgtacaaaccacacaagaggaggatgggtgctcatgcagatttcctgaagaggaagagggcggttgcgaacttagagtcaaattcagccgctccgcagatgcacctgcttataaacagggtcagaatcaattgtataatgaacttaatctcgggaggcgcgaggagtatgatgtgctggacaagcgacggggtcgagacccagagatgggcggtaaaccccgccgaaagaacccccaggagggactgtataatgagctgcaaaaggacaaaatggcagaagcctattccgaaatagggatgaagggagagcggcggcgaggtaagggacatgacggtctttatcaaggtcttagtactgcaactaaggacacctatgacgcgctgcatatgcaggctctcccacctagacgagctaaacgaggctcaggcgcgacgaactttagtttgctgaagcaagctggggatgtagaggaaaatccgggtcccatggattggacttggattttgttcctcgttgccgcagcgactcgcgtccatagtaattgggtgaacgtaattagtgacttgaaaaaaattgaggaccttatacaaagtatgcatatcgatgcaacactgtacacggagtccgacgtgcacccaagctgcaaggtcaccgcaatgaaatgctttttgctcgaattgcaagttatctcacttgagtcaggggacgcttcaatccatgatactgtggagaatttgataatcctggcgaacaatagccttagttcaaatggcaacgtcactgagtcaggctgcaaggaatgtgaggaattggaagaaaaaaatatcaaggaatttttgcaatcttttgttcacatagttcagatgttcattaacactagttccgggggcggcagtggaggtggcggtagcggcgggggtggctctggtggaggcggctctgggggcggaagtctgcagataacatgccccccacctatgagtgttgaacatgctgatatctgggttaaatcttactccctttacagtcgagaaaggtacatttgcaactccggctttaaacgcaaagccgggactagttcactgactgaatgtgtattgaataaagcgacaaatgtcgcacactggactaccccttccctcaaatgcattcgcgatcctgccttggtgcatcagcgaccagcaccgccgtccacggtaactaccgcaggagtaacaccgcagcccgagagcctttccccctcaggcaaagagccggccgcatcctccccatcttccaataataccgcagctaccaccgcagcaatcgtacccggatcccagctgatgcccagcaaaagtccgagtactggaacgactgaaatctccagtcacgagtcttctcatggaactccgagtcaaactacagcaaagaattgggagctgactgcttccgcttcacaccagccgccaggcgtttatcctcagggacactcagataccacggtggcgattagcacaagcaccgtcctcctgtgtgggctgagtgcagtgtcacttctcgcctgctaccttaagtccagacagacaccccctttggcaagcgttgaaatggaagccatggaagccttgcctgtcacatgggggacttcatcccgcgatgaagacttggagaactgctcacaccatctt
CAR7-mb15(SEQ ID NO 38)：
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL
CAR7-C7R(SEQ ID NO 39)：
atggcactccctgtaactgcacttcttttgccacttgccttgctcctgcacgcagcgcggccggacatcgagctgacccagagccccgccatcatgagcgccagcctgggcgaggagatcaccctgacctgcagcgccagcagcagcgtgagctacatgcactggtaccagcagaagagcggcaccagccccaagctgctgatctacagcaccagcaacctggccagcggcgtgcccagcaggttcagcggcagcggcagcggcaccttctacagcctgaccatcagcagcgtggaggccgaggacgccgccgactactactgccaccagtggagcagctacaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagaggggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagccaggtgaagctgcaggagagcggcggcggcctggtgaagcccggcggcagcctgaagctgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagcagctacgccatgagctgggtgaggcagacccccgagaagaggctggagtgggtggccaccatcagcagcggcggcagctacacctactaccccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaacgccaagaacaccctgtacctgcagatgagcagcctgaggagcgaggacaccgccatgtactactgcgccaggcaggacggctactaccccggctggttcgccaactggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagctccggaacaacgacaccagcaccacggccacccactcctgctccgacaattgcgtctcagcccctttcccttcgacccgaagcttgtcgccctgctgcgggaggagcggtccacacgcgcgggcttgacttcgcttgcgacatctacatttgggcacccttggccgggacatgcggcgtcttgctcctgagtctggttataacgctgtattgtaagcgaggtcggaagaagcttttgtatatctttaaacagccctttatgaggcccgtacaaaccacacaagaggaggatgggtgctcatgcagatttcctgaagaggaagagggcggttgcgaacttagagtcaaattcagccgctccgcagatgcacctgcttataaacagggtcagaatcaattgtataatgaacttaatctcgggaggcgcgaggagtatgatgtgctggacaagcgacggggtcgagacccagagatgggcggtaaaccccgccgaaagaacccccaggagggactgtataatgagctgcaaaaggacaaaatggcagaagcctattccgaaatagggatgaagggagagcggcggcgaggtaagggacatgacggtctttatcaaggtcttagtactgcaactaaggacacctatgacgcgctgcatatgcaggctctcccacctagaggctcaggcgcgacgaactttagtttgctgaagcaagctggggatgtagaggaaaatccgggtcccatgttggtgcgccgaggcgcacgagcaggacctcggatgccgcgaggctggacagccctctgtctcctctctttgcttccatccgggttcatgagtctcgacaataatggtacggcaaccccggaactcccgacccaaggaacctttagtaacgtttcaaccaatgtgtcctatcaggagacaacaaccccttctacactgggcagtaccagcttgcatcccgtcagccaacacggcaacgaggcaacaactaacatcacagagactacggtcaagtttactagtacttccgtaatcacgtctgtgtacgggaatacaaattcatcagttcagagtcaaacgtcagttatatctacagtcttcactactcccgcgaatgtatccaccccagaaaccaccctcaaaccttctcttagtccaggaaatgttagcgatttgtcaacgacgagcacgagtttggcgactagtccaacgaaaccgtacacttccagcagtcccatactgtccgacattaaggcagaaataaaatgttctgggatcagggaggtcaagcttacgcagggaatatgtcttgagcaaaataagacgtcctcatgcgcagaattcaagaaagatcgcggcgaaggtctggccagagtcctctgtggagaggagcaggcggatgctgacgcaggagcgcaggtttgtagtctcctgctcgcgcaaagtgaagttaggccccaatgtctcttgttggtactggctaaccgaactgaaattagcagcaagcttcaactcatgaaaaaacaccagagtgatttgaaaaaacttgggatacttgacttcacggagcaagacgttgcgtctcaccaatcctactcacagaaaaccccgatactgttgacatgccccaccatatcaatcttgtctttcttcagtgtggctcttctggtgatcttggcgtgcgtgctgtggaaaaaaaggattaaaccgatcgtttggcctagtctgccggatcacaaaaagacactggagcacctctgcaagaagccacgaaaaaacctgaatgtgagctttaaccccgagtcttttttggactgtcagatacaccgagtcgacgatatacaggcaagagatgaggttgagggtttcctgcaagacacattcccgcaacaactcgaagaatccgagaaacagcgccttggtggagatgtccagtctccgaactgtccgagcgaggacgtagtaattaccccagaaagcttcggtcgagatagtagccttacgtgtctcgccgggaacgtgtcagcgtgtgacgcgcctattctttcaagttcacgcagtttggactgtcgagaatcagggaaaaacggacctcacgtgtatcaggatctccttctcagcctgggcacgacaaacagtaccttgcctcctccgttttccctgcagtcaggtattctgacgctcaatccagtcgcacaagggcaacctatcctgacctccttgggttctaaccaggaagaggcatacgtcactatgtccagcttctatcagaatcag
CAR-C7R(SEQ ID NO 40)：
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLVRRGARAGPRMPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
构建成单一或双重CAR的两个CD2 scFv的氨基酸序列如下：
CD2 scFv1 VH：
QLQQPGAELVRPGSSVKLSCKASGYTFTRYWIHWVKQRPIQGLEWIGNIDPSDSETHYNQKFKDKATLTVDKSSGTAYMQLSSLTSEDSAVYYCATEDLYYAMEYWGQGTSVTVSS
CD2 scFv1 VL：
DIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMTCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAVYYCHQYLSSHTFGGGTKLEIKR
CD2 scFv2 VH：
QVQLQQPGTELVRPGSSVKLSCKASGYTFTSYWVNWVKQRPDQGLEWIGRIDPYDSETHYNQKFTDKAISTIDTSSNTAYMQLSTLTSDASAVYYCSRSPRDSSTNLADWGQGTLVTVSS
CD2 scFv2 VL：
DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTFGAGTKLELRR
将CAR基因克隆到FUW慢病毒载体主链中的EF1α(EF-1α)启动子下以形成Fuw-EF1α-CAR。通过使用Lipofectamine3000将Fuw-EF1α-CAR，慢病毒包膜质粒pMD2.G(Addgene，质粒#12259)和慢病毒包装质粒psPAX2(Addgene，质粒#12260)转染到293T细胞中，以制备完整的慢病毒表达载体。在48和72小时收集上清液，并进行超速离心(Merck Millipore)以浓缩。
3.3UCAR-T细胞的制备
整个制备过程在图15中示出。
细胞分离和激活
单采血液成分法后，使用Histopaque-1077(西格玛-奥德里奇)通过密度梯度离心分离单核细胞。然后富集T细胞，通过与抗CD3/抗CD28偶联的磁珠激活、培养和扩增。
将具有5％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1mM的丙酮酸钠和300IU/ml的rhIL2的X-vivo 15用作UCAR-T细胞培养基。将细胞孵育并在37℃、5％CO2下培养。
电穿孔和慢病毒感染
富集并激活T细胞后两天，将抗CD3/抗CD28磁珠去除并将细胞收集到试管中，并以300g离心5分钟，然后用DPBS洗涤两次，并以50×106/ml的细胞密度重新悬浮在opti-mem中。基于细胞密度计算所需的cas9/gRNA RNP的量，然后与细胞混合并转移至4D-Nucleofector System N(Lonza)系统进行电穿孔。然后，将细胞重悬于预热的培养基中达到2×106/ml的密度。将细胞进一步以2-8的MOI进行慢病毒转染，转移至烧瓶中，并在37℃、5％CO2的孵化器中培养。
细胞增殖与CAR阳性比检测
转染后3天，检测细胞数和CAR阳性细胞，并计算T细胞中CAR的阳性比。还检测TCR(或CD3)和CD7的阳性比，以确定敲除效率。然后，将细胞在孵化器中连续培养10天，然后将细胞准备冷冻保存。
结果表明(图18)通过流式细胞术成功检测到CAR7、CAR7-mb15和CAR7-C7R的CAR、IL15Rα或C7R(CD34)的表达，且阳性比高于30％。CD3/CD7的阴性比高达约98％，表明成功地制备了TCR敲除增强型和通用型UCAR-T细胞。
如19所示，在去除外源性IL-2后，CAR7的pSTAT5水平下降至基础水平。然而，CAR7-C7R T细胞(CD34+细胞)或添加了外源性IL2的CAR7-T细胞中pSTAT5处于非常高的水平，表明C7R的表达和外源添加的IL-2均可增强STAT5信号通路的激活。
3.4体外杀死作用
通过将荧光素酶基因导入靶细胞CCRF-CEM，然后进行筛选，获得稳定转染的CCRF-CEM-luc细胞系。在加入荧光素后，荧光素酶可与荧光素反应以产生荧光。通过检测荧光的强度，可以测量荧光素酶的活性，并且可以检测细胞的存活，从而评估UCAR-T细胞的杀死效果。
将实施例3.3中制备的UCAR-T细胞与CD-7阳性T细胞CCRF-CEM-luc(每种100ul)以1:1的比例在RPMI培养基中混合达到每种细胞的密度为1×106/ml，然后在96孔板中培养一定时间。然后收集培养基并进行离心，并通过细胞因子珠阵列试剂盒(CBA试剂盒，BD生物科学)检测细胞因子IFN-γ和IL-2。另外，将荧光素底物添加到细胞培养物中以检测UCAR-T细胞的杀死作用。结果表明，UCAR-T在24小时内对CCRF-CEM肿瘤具有显著的杀3作用(图20)。
UCAR-T对同种异体T细胞的杀死作用：用CFSE标记同种异体T细胞，并与CAR-T孵育预定时间段。然后通过流式细胞术分析CFSE阳性细胞的数量变化。结果表明，CAR-T细胞在24小时内有效杀死同种异体T细胞，这比同种T细胞介导的HVG发生的时间短得多，因此CAR7可以有效保护CAR-T细胞免受同种异体T细胞杀死(图21)。
UCAR-T对NK肿瘤细胞系(NK92)的24小时杀死作用：NK92用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记，并与UCAR-T孵育预定时间段。然后通过流式细胞术分析CFSE阳性细胞数目的变化，从而计算UCAR-T对NK92肿瘤细胞系的体外杀死作用(图22)。
3.5CAR-T细胞的增殖
从CAR-T中除去IL-2。将CAR-T细胞连续培养2周，并每周计数两次以测量增殖。
图23A和23B中的结果显示CAR7-mb15和CAR7-C7R CAR-T细胞比CAR7 CAR-T细胞具有更强的增殖率，并且在没有IL-2的情况下，它们在2周内仍具有更高的存活率。CAR7-C7R比CAR7-mb15显示出更好的存活率。体外杀死测定表明，UCAR-T细胞在7小时内对T-ALL细胞系CCRF-CEM具有优异的杀死作用。
3.6细胞体外再激活
从UCAR-T中除去IL-2。每周两次以1:1的效应子：靶标比添加CCRF-CEM，并每周计数两次以测量增殖。
图24A和24B显示，在添加CCRF-CEM之后，CAR7-mb15和CAR7-C7R UCAR-T细胞比CAR7 UCAR-T显示出显著更强的增殖，并且CAR7-C7R UCAR-T细胞比CAR7-mbIL15 UCAR-T细胞增殖更好。在反复刺激后，UCAR-T细胞仍显示出显著的清除肿瘤细胞的能力，表明在反复抗原刺激后，细胞因子相关的信号传导通路增强的UCAR-T细胞具有更高的增殖率，并且可以更好地存活。
3.7UCAR-T细胞在荷瘤小鼠中的增殖和功效
选择6-12周的NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull(NOG)小鼠，并腹膜内注射2×106个CCRF-CEM-luc细胞。两天后，测量小鼠的肿瘤移植物负荷，并基于肿瘤负荷将小鼠分为5组。肿瘤植入后6天，向每只小鼠静脉内注射1×106个UCAR-T或对照，并且每1-2周进一步评估肿瘤负荷。给每只小鼠腹膜内注射3mg D-萤光素进行4分钟反应，然后使用Xenogen IVIS成像系统进行30秒曝光(BLI)拍照。每周计数外周血中的UCAR-T细胞数。
图25显示了CAR7-mb15和CAR7-C7R UCAR-T具有显著的扩增，且CAR7 UCAR-T没有显示任何显著的扩增。图26显示了BLI成像的结果，并且可以看出CAR7-mb15和CAR7-C7RUCAR-T细胞比CAR7 UCAR-T细胞对肿瘤清除具有更好的效果。
图27显示了用载体对照或具有TCR敲除和具有或没有增强子表达的CAR7 UCAR-T细胞处理的小鼠的BLI图像。与载体对照和没有任何增强子表达的TCR KO CAR7 UCAR-T细胞相比，具有TCR敲除且表达C7R或mbIL15的CAR7 UCAR-T细胞对肿瘤清除表现出更好的效率。表达C7R的CAR7细胞比表达mbIL15的细胞具有更好的肿瘤控制和小鼠存活率，如本文所用，“CAR7”、“CAR7 UCAR-T”或“CD7 CAR-T”可互换使用，以指示包含靶向CD7的CAR的工程化CAR-T细胞。
图28A BLI成像显示CD7 CAR-T细胞在清除肿瘤细胞中的体内功能。与载体对照和没有表达任何增强子的TCR KO CD7 CAR-T细胞相比，表达C7R或mbIL15的TCR KO CD7 CAR-T细胞表现出在体内对肿瘤清除的效率更好。图28B显示了用有或没有增强子表达的TCR KOCD7 CAR-T和媒介物对照治疗的NOG小鼠的动物存活数据。在CAR-T细胞输注后数天测量存活小鼠的百分比。与用没有增强子表达的CAR-T细胞或媒介物对照治疗的小鼠相比，用具有C7R或mbIL15表达的TCR KO CD7 CAR-T治疗的小鼠具有更好的存活率。表达C7R的CAR7细胞比表达mbIL15的细胞具有更好的肿瘤控制和小鼠存活率
图55A显示了CAR-T细胞的扩增数据。与没有C7R或任何增强子表达的对照细胞相比，在T细胞培养基中培养新鲜制备的表达C7R的CD7 CAR-T细胞而不补充IL2或不进行抗原刺激，表达C7R的CD7CAR-T细胞保持更好的扩增并在培养基中持续。图55B显示了在刺激存在下CAR-T细胞的增殖。通过CCRF-CEM(CD7+T-ALL细胞)反复刺激CD7 CAR-T(或UCART7)、表达mbIL15或C7R的CD7 CAR-T。表达C7R的CD7 CAR-T显示出最佳的持久性和增殖。当在刺激的第6轮(CC6)去除抗原刺激时，表达mbIL15/C7R的CD7 CAR-T停止增殖。如本文所用，“CC”表示与癌细胞的共培养。
3.8体内GVHD研究
首先用亚致死剂量的辐射(175cGy)对小鼠进行全身性治疗。然后将CAR-T细胞重悬于PBS中，并注入到治疗小鼠的胸腔。通过使用GVHD临床标准每周观察小鼠2-3次，包括体重减轻、弓背、活动、皮毛质地和皮肤完整性。
结果显示，没有TCR基因敲除的组中的小鼠均显示出GVHD的症状，然而在TCR基因敲除的组中未检测到GVHD。
3.9TCR敲除的影响
图54A-C显示了在CAR-T细胞中TCR敲除的作用。在一项由研究人员启动的临床试验中，间皮素CAR-T细胞中的TCR表达受损，从而避免了TCR相关的不良事件。然而，TCR KOCAR-T细胞在输注到患者中后出乎意料地显示出显著的扩增缺陷。图54A显示了输注后13天时自体间皮素(MSLN)CAR+T细胞(右)和患者外周血CAR-T细胞中CAR+T细胞(左)的TCR KO效率的实例。图54B显示了自体MSLN CAR-T产物中的TCR破坏效率是高效的，产物中剩余少于5％的TCR+细胞。然而，在输注到患者中之后，外周血中检测到的大多数CAR-T细胞均为TCR+细胞。图54C显示了在癌症患者中，TCR+细胞比TCR-细胞显示出多40至约1000倍的扩增。因此，即使在自体CAR-T应用中，其中没有来自同种异体杀死细胞的细胞存活和扩增压力，TCR破坏也极大地损害CAR-T细胞的扩增。
3.10构建体设计序列
CD7CAR-mbIL15构建体设计：CD7CAR-mbIL15氨基酸序列(mbIL15＝IgE信号肽+IL15+IL15Rα)
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL
CD7CAR-C7R构建体设计：CD7CAR-C7R氨基酸序列(C7R＝CD34胞外域+组成型活性IL7Rα)
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实施例4：表达增强子以及安全开关的U-CAR T细胞的研究
4.1CAR的设计和病毒包装
嵌合抗原受体的结构为：
1)RQR8-CD19CAR-mbIL15；
2)RQR8-CD19CAR-mbIL15-IL7；
3)RQR8-CD19CAR-C7R；
4)RQR8-CD19CAR-mbIL7；
其中RQR8是安全开关，并且CD19CAR片段是单克隆抗体FMC63的重链和轻链可变区(通过GS接头连接)，还包括串联的铰链区和跨膜区，人CD 28细胞内共刺激元件和人CD3ζ细胞内区域；mbIL15由串联的IL15+IL15Rα组成；C7R是由CD34细胞外结构域和IL7受体跨膜和细胞内结构域组成的组成型激活的IL7受体；IL7由IL7信号肽和成熟肽组成；mbIL7由串联的IL7+IL7Ra组成。本文描述的构建体的实例在图29中示出。
RQR8的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.：7)：
MGTSLLCWMALCLLGADHADACPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV
RQR8的DNA序列如下所示(SEQ ID NO.：8)：
ATGGGCACCTCTCTGCTGTGCTGGATGGCTCTGTGTCTGCTGGGCGCTGACCATGCTGATGCTTGCCCCTATTCCAACCCCTCTCTGTGCTCCGGAGGAGGAGGATCCGAACTGCCTACCCAAGGCACCTTCAGCAACGTGTCCACCAACGTGAGCCCCGCTAAGCCTACCACCACCGCTTGCCCTTACTCCAATCCCAGCCTCTGCTCCGGAGGCGGAGGATCCCCCGCCCCCAGACCTCCTACACCCGCTCCCACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGACCCGAAGCTTGCAGACCCGCTGCCGGAGGAGCTGTGCATACAAGAGGACTGGATTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCTGGCACATGTGGCGTGCTGCTGCTGTCTCTGGTCATTACACTGTACTGCAACCATAGAAATAGAAGAAGGGTGTGCAAGTGTCCCAGACCCGTGGTGGGCAGCGGAGAAGGAAGAGGCTCTCTGCTGACATGCGGAGACGTGGAAGAGAACCCCGGCCCC
CD19CAR的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.：9)：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAADYKDDDDKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CD19CAR的DNA序列如下所示(SEQ ID NO.:10)：
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAGACTACAAAGACGATGACGACAAGATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
mbIL15的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.：11)：
Figure BDA0003141784850001342
Figure BDA0003141784850001341
在mbIL15的氨基酸序列中，下划线部分是信号肽区域，斜体部分是IL-15，粗体部分是连接区域，且虚线下划线部分是IL-15受体α。
mbIL15的DNA序列如下所示(SEQ ID NO.:12)：
ATGGATTGGACTTGGATTTTGTTCCTCGTTGCCGCAGCGACTCGCGTCCATAGTAATTGGGTGAACGTAATTAGTGACTTGAAAAAAATTGAGGACCTTATACAAAGTATGCATATCGATGCAACACTGTACACGGAGTCCGACGTGCACCCAAGCTGCAAGGTCACCGCAATGAAATGCTTTTTGCTCGAATTGCAAGTTATCTCACTTGAGTCAGGGGACGCTTCAATCCATGATACTGTGGAGAATTTGATAATCCTGGCGAACAATAGCCTTAGTTCAAATGGCAACGTCACTGAGTCAGGCTGCAAGGAATGTGAGGAATTGGAAGAAAAAAATATCAAGGAATTTTTGCAATCTTTTGTTCACATAGTTCAGATGTTCATTAACACTAGTTCCGGGGGCGGCAGTGGAGGTGGCGGTAGCGGCGGGGGTGGCTCTGGTGGAGGCGGCTCTGGGGGCGGAAGTCTGCAGATAACATGCCCCCCACCTATGAGTGTTGAACATGCTGATATCTGGGTTAAATCTTACTCCCTTTACAGTCGAGAAAGGTACATTTGCAACTCCGGCTTTAAACGCAAAGCCGGGACTAGTTCACTGACTGAATGTGTATTGAATAAAGCGACAAATGTCGCACACTGGACTACCCCTTCCCTCAAATGCATTCGCGATCCTGCCTTGGTGCATCAGCGACCAGCACCGCCGTCCACGGTAACTACCGCAGGAGTAACACCGCAGCCCGAGAGCCTTTCCCCCTCAGGCAAAGAGCCGGCCGCATCCTCCCCATCTTCCAATAATACCGCAGCTACCACCGCAGCAATCGTACCCGGGTCCCAGCTGATGCCCAGCAAAAGTCCGAGTACTGGAACGACTGAAATCTCCAGTCACGAGTCTTCTCATGGAACTCCGAGTCAAACTACAGCAAAGAATTGGGAGCTGACTGCTTCCGCTTCACACCAGCCGCCAGGCGTTTATCCTCAGGGACACTCAGATACCACGGTGGCGATTAGCACAAGCACCGTCCTCCTGTGTGGGCTGAGTGCAGTGTCACTTCTCGCCTGCTACCTTAAGTCCAGACAGACACCCCCTTTGGCAAGCGTTGAAATGGAAGCCATGGAAGCCTTGCCTGTCACATGGGGGACTTCATCCCGCGATGAAGACTTGGAGAACTGCTCACACCATCTTTGA
IL7的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.：13)：
MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
IL7的DNA序列如下所示(SEQ ID NO.：14)：
GAATTCGGCAGCGGCGTCAAGCAGACACTGAACTTCGATCTGCTGAAGCTGGCCGGAGACGTCGAGAGCAACCCCGGCCCTATGTTCCACGTGAGCTTTAGATACATCTTCGGACTGCCCCCTCTGATTCTGGTGCTGCTGCCCGTGGCCAGCAGCGACTGCGATATCGAGGGCAAGGACGGCAAGCAGTATGAGTCCGTGCTGATGGTCTCCATCGATCAGCTGCTGGACAGCATGAAGGAGATCGGCTCCAACTGCCTCAACAACGAGTTCAACTTTTTCAAGAGGCACATCTGCGACGCCAACAAGGAGGGCATGTTTCTGTTTAGAGCCGCTAGAAAGCTGAGGCAGTTTCTGAAGATGAACAGCACCGGCGACTTTGATCTGCATCTGCTGAAAGTGAGCGAGGGCACCACCATTCTGCTGAACTGCACCGGCCAAGTGAAAGGAAGAAAGCCCGCCGCTCTGGGCGAGGCTCAGCCTACCAAGTCTCTGGAAGAGAACAAGTCTCTGAAGGAGCAGAAGAAGCTCAACGATCTGTGCTTCCTCAAGAGGCTGCTGCAAGAGATCAAGACATGCTGGAACAAGATCCTCATGGGCACCAAGGAACACTG
C7R的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.:15)：
Figure BDA0003141784850001362
Figure BDA0003141784850001361
在组成性地激活的IL-7受体(C7R)的氨基酸序列中，下划线部分是CD34细胞外区域，斜体部分是IL-7受体α跨膜区域，粗体部分是IL-7受体α细胞内区域。
C7R的DNA序列如下所示(SEQ ID NO.:16)：
GGAAGCGGCGCCACAAACTTTTCTCTGCTGAAGCAAGCCGGCGACGTCGAAGAGAACCCCGGCCCTATGCTGGTGAGGAGAGGCGCTAGGGCTGGACCCAGAATGCCCAGAGGCTGGACCGCTCTGTGTCTGCTGTCTCTGCTGCCCAGCGGCTTCATGAGCCTCGATAATAACGGCACCGCTACCCCCGAGCTGCCCACACAAGGCACCTTCTCCAATGTGAGCACCAACGTGTCCTACCAAGAGACCACCACCCCTTCCACACTGGGAAGCACATCTCTGCATCCCGTCTCCCAGCACGGCAATGAAGCCACCACAAACATCACCGAGACCACCGTGAAGTTCACCAGCACCTCCGTCATTACCAGCGTGTACGGCAACACCAATAGCTCCGTGCAAAGCCAGACATCCGTGATTTCCACCGTGTTTACCACCCCCGCCAATGTCAGCACACCCGAGACAACACTGAAACCTTCTCTGTCCCCCGGAAACGTGAGCGATCTGAGCACAACCAGCACCAGCCTCGCCACCAGCCCCACAAAGCCTTACACAAGCAGCAGCCCCATTCTGAGCGACATCAAGGCCGAAATCAAGTGCTCCGGAATTAGAGAGGTCAAGCTGACCCAAGGAATCTGTCTGGAGCAGAATAAGACCAGCAGCTGCGCCGAGTTCAAGAAAGACAGAGGCGAAGGACTGGCCAGAGTGCTCTGCGGCGAGGAACAAGCCGATGCCGATGCCGGAGCTCAAGTGTGCAGCCTCCTCCTCGCTCAGAGCGAGGTCAGACCCCAATGTCTGCTGCTCGTGCTGGCCAATAGGACCGAGATCTCCTCCAAACTGCAGCTGATGAAGAAGCACCAGAGCGACCTCAAGAAGCTCGGCATCCTCGACTTTACCGAGCAAGACGTGGCCTCCCATCAATCCTATAGCCAGAAGACCCCCATTCTGCTGACATGTCCCACAATCAGCATCCTCAGCTTCTTCAGCGTCGCTCTGCTCGTCATTCTGGCTTGTGTGCTGTGGAAGAAGAGGATCAAGCCTATTGTGTGGCCCTCTCTGCCCGACCACAAGAAGACCCTCGAACACCTCTGCAAGAAACCTAGAAAGAACCTCAACGTGAGCTTCAACCCCGAGTCCTTTCTGGACTGTCAAATCCATAGGGTGGATGACATCCAAGCTAGAGACGAGGTCGAGGGCTTTCTGCAAGACACCTTCCCTCAGCAGCTGGAAGAAAGCGAGAAGCAAAGACTGGGCGGAGATGTGCAGTCCCCTAATTGCCCCTCCGAGGACGTGGTGATTACCCCCGAGAGCTTCGGAAGAGACAGCTCTCTGACATGTCTGGCCGGAAATGTGTCCGCTTGCGATGCCCCTATTCTGAGCAGCTCCAGATCTCTGGACTGCAGAGAGTCCGGCAAGAACGGCCCTCATGTGTACCAAGATCTGCTGCTGTCTCTGGGAACCACAAACTCCACACTGCCTCCCCCCTTTAGCCTCCAGTCCGGCATTCTGACACTGAACCCCGTGGCTCAAGGCCAACCTATCCTCACATCCCTCGGCTCCAATCAAGAGGAAGCCTACGTGACCATGAGCTCCTTCTATCAGAACCAGTGA
mbIL7的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.:17)：
Figure BDA0003141784850001382
Figure BDA0003141784850001381
在mbIL7的氨基酸序列中，下划线部分是信号肽区域，斜体部分是IL-7，粗体部分是连接区域，且虚线下划线部分是IL-7受体α。
mbIL7的DNA序列如下所示(SEQ ID NO.:18)：
ATGGCTCTGCCTGTTACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACTGTGACATCGAGGGCAAAGACGGCAAGCAGTACGAGAGCGTGCTGATGGTGTCCATCGACCAGCTGCTGGACAGCATGAAGGAAATCGGCAGCAACTGCCTGAACAACGAGTTCAACTTCTTCAAGCGGCACATCTGCGACGCCAACAAAGAAGGCATGTTCCTGTTCAGAGCCGCCAGAAAGCTGCGGCAGTTCCTGAAGATGAACAGCACCGGCGACTTCGACCTGCATCTGCTGAAAGTGTCTGAGGGCACCACCATCCTGCTGAATTGCACCGGCCAAGTGAAGGGCAGAAAGCCTGCTGCTCTGGGAGAAGCCCAGCCTACCAAGAGCCTGGAAGAGAACAAGTCCCTGAAAGAGCAGAAGAAGCTGAACGACCTCTGCTTCCTGAAGCGGCTGCTGCAAGAGATCAAGACCTGCTGGAACAAGATCCTGATGGGCACCAAAGAGCACGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGAAGCGGCGGAGGCGGTAGCGGTGGCGGAGGAAGTGGTGGCGGATCTGAATCTGGCTACGCCCAGAACGGCGACCTGGAAGATGCCGAGCTGGACGACTACAGCTTCAGCTGCTACAGCCAGCTGGAAGTGAACGGCAGCCAGCACTCTCTGACCTGCGCCTTTGAAGATCCCGACGTGAACATCACCAACCTTGAGTTCGAGATTTGTGGCGCCCTGGTGGAAGTCAAGTGCCTGAATTTCCGGAAGCTGCAAGAAATCTACTTTATCGAGACAAAGAAGTTCCTGCTGATCGGCAAGAGCAACATCTGTGTGAAAGTGGGCGAGAAAAGCCTGACCTGCAAGAAGATCGACCTGACCACCATCGTGAAGCCCGAGGCTCCTTTCGATCTGAGCGTGGTGTATAGAGAGGGCGCCAACGACTTCGTGGTCACCTTCAACACCAGCCACCTCCAAAAGAAATACGTGAAGGTGCTGATGCACGACGTGGCCTACCGGCAAGAGAAGGACGAGAACAAATGGACCCACGTGAACCTGAGCAGCACCAAGCTGACCCTGCTGCAGAGAAAACTGCAGCCTGCCGCTATGTACGAGATCAAAGTGCGGAGCATCCCCGACCACTACTTTAAAGGCTTTTGGAGCGAGTGGTCCCCTAGCTACTACTTCAGAACCCCTGAGATCAACAACTCCAGCGGCGAGATGGACCCCATTCTGCTGACAATCAGCATCCTGAGCTTTTTCAGCGTGGCCCTGCTGGTCATCCTGGCCTGTGTGCTGTGGAAGAAGCGGATCAAGCCCATCGTGTGGCCCAGCCTGCCTGACCACAAGAAAACCCTGGAACACCTGTGCAAGAAGCCCCGGAAAAACCTGAACGTGTCCTTCAATCCCGAGAGCTTCCTGGACTGCCAGATCCACAGAGTGGACGACATCCAGGCCAGGGACGAAGTGGAAGGATTTCTGCAGGACACATTCCCTCAGCAGCTCGAAGAGAGCGAGAAGCAAAGACTCGGAGGCGACGTGCAGAGCCCTAATTGCCCTTCTGAGGACGTGGTCATCACCCCAGAGAGCTTCGGCAGAGATAGCAGCCTGACATGTCTGGCCGGCAATGTGTCCGCCTGTGATGCCCCTATCCTGTCCTCTAGCAGAAGCCTGGATTGCAGAGAGAGCGGCAAGAACGGCCCTCACGTGTACCAGGATCTGCTCCTGTCTCTGGGCACCACAAACAGCACACTGCCTCCACCATTCAGCCTGCAGAGCGGCATCCTGACACTGAACCCTGTTGCTCAGGGCCAGCCTATCCTGACAAGCCTGGGCAGCAATCAAGAAGAGGCCTACGTCACCATGAGCAGCTTCTACCAGAACCAG
将上述CAR基因克隆到FUW慢病毒载体主链中EF1α(EF-1α)启动子下以形成Fuw-EF1α-CAR。通过使用Lipofectamine3000将Fuw-EF1α-CAR、慢病毒包膜质粒pMD2.G(Addgene，质粒#12259)和慢病毒包装质粒psPAX2(Addgene，质粒#12260)转染到293T细胞中，以制备完整的慢病毒表达载体。在48和72小时收集上清液，并进行超速离心(MerckMillipore)以浓缩。浓缩的病毒准备用于T细胞的转染。
结果表明，通过流式细胞术成功检测RQR8-CD19CAR-MBIL15、RQR8-CD19CAR-MBIL15-IL7、RQR8-CD19CAR-C7R细胞的RQR8、CAR、IL15Ra或C7R的表达；通过ELISA检测IL-7的分泌。成功构建慢病毒载体。所有结构都可以同时表达而不会互相干扰。
4.2CRISPR的设计与构建
首先，在http://crispr.mit.edu设计靶向TCR保守区的外显子的gRNA序列，并选择得分高于80的两个gRNA序列以获得更高的敲除效率。对于gRNA引物，正向引物包含T7启动子，随后是20bp的靶序列，反向引物具有20bp的互补序列。质粒用作PCR模板。纯化后，将T7-PCR产物进一步用作MEGAshortscript T7试剂盒的模板以获得RNA。用MEGAclear柱纯化RNA，并用无RNA的水洗脱。Cas9质粒购自Addgene。
gRNA靶向序列如下：
TRAC-gRNA：TGTGCTAGACATGAGGTCTA，SEQ ID NO.:5
同时，通过T7E1、TIDE和流式细胞仪分析gRNA的敲除效率。
结果表明，成功地敲除了TCR基因，敲除效率高于90％。
4.3CAR-T细胞的制备
细胞分离和激活
单采血液成分法后，使用Histopaque-1077(西格玛-奥德里奇)通过密度梯度离心分离单核细胞。然后富集T细胞，通过与抗CD3/抗CD28偶联的磁珠激活、培养和扩增。
将具有5％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1mM的丙酮酸钠和300IU/ml的rhIL2的X-vivo 15用作CAR-T细胞培养基。将细胞孵育并在37℃、5％CO2下培养。
表达CD 19的细胞系：Raji(伯基特淋巴瘤细胞系，ATCC-CCL86)；K562细胞(人红白血病细胞系，ATCC-CCL243)；通过筛选用具有萤火虫荧光素酶的慢病毒转染的Raji细胞获得Raji-ffluc细胞系。
所有细胞都在RPMI1640培养基中培养，且293T细胞(ATCC-CRL3216)在DMEM培养基中培养。RPMI1640和DMEM均补充有10％(v/v)的胎牛血清和100U/ml的青霉素和链霉素、2mM的谷氨酰胺和1mM的丙酮酸钠。
电穿孔
富集并激活T细胞两天后，将抗CD3/抗CD28磁珠去除，并将细胞收集到试管中。根据需要将Cas9和gRNA混合，在室温下孵育，然后转移至电穿孔缓冲液中以与细胞进一步混合，通过4D-Nucleofector System N(Lonza)系统进行电穿孔。然后将细胞重悬于预热的培养基中达到1-2×106/ml的密度，转移到平板上，在37℃，5％CO2的孵化器中培养。
慢病毒转染
电穿孔后1天，通过慢病毒载体以2-8的MOI转染细胞，转移到烧瓶中，并在37℃、5％CO2下培养。
细胞增殖与CAR阳性比的检测
转染后3天，检测细胞数和CAR阳性细胞，并计算T细胞中CAR的阳性比。还检测CD3的阳性比，以确定敲除效率。然后将细胞在孵化器中连续培养，每2-3天更换一半培养基，直到第14天，此时细胞准备冷冻保存。
结果表明，通过流式细胞术成功检测RQR8-CD19CAR-mbIL15、RQR8-CD19CAR-mbIL15-IL7、RQR8-CD19CAR-C7R CAR-T的RQR8、CAR、IL15Ra或C7R表达；通过ELISA检测IL-7的分泌。CD3阴性比高于90％，表明成功构建了具有增强的细胞因子相关信号传导通路和安全开关的TCR敲除的CAR-T，并且每个元素都不相互干扰。
4.4细胞因子的释放
将实施例3中制备的CAR-T细胞和CD19阳性肿瘤细胞(Raji,NALM6)(每种100ul)以1:1比例在RPMI培养基中混合达到每种细胞的密度为1×106/ml，然后在96孔板中培养过夜。收集培养基并进行离心，并通过细胞因子珠阵列试剂盒(CBA试剂盒，BD生物科学)检测释放的细胞因子IFN-γ和IL-2。
结果显示，与常规CAR-T相比，RQR8-CD19CAR-MBIL15、RQR8-CD19CAR-MBIL15-IL7、RQR8-CD19CAR-C7R CAR-T细胞与Raji、NALM6的孵育产生大量的IFN-γ和IL-2，表明细胞因子相关的信号传导通路增强的CART针对CD19阳性靶细胞的功能，通过细胞因子相关的信号传导通路增强的CART的分泌细胞因子增加。
4.5CAR-T细胞与靶细胞共培养后CD107a的表达
将2*105CAR-T/N细胞和2*105靶细胞(Raji，NALM6)/对照细胞(K562)添加到v型底部96孔板中，并重悬于不含IL-2的200μl的X-VIVO完全培养基中。将1μl的BD GolgiStop(含莫能菌素)添加到每1ml培养基中，并将2μl的CD107a抗体(1:50)添加到每个孔中。然后，将细胞在37℃下培养4小时，并进一步进行收集。
将样品离心以去除培养基，用PBS洗涤一次，然后在400g、4℃下离心5分钟。去除上清液，并将特异性表面抗体CAR、CD3、CD4和CD8添加到每个试管中。然后，将细胞重悬于100μl中，并在黑暗中置于冰上30分钟。
每个管用3mL的PBS洗涤一次，然后将样品以400g、离心5分钟。小心地去除上清液，并将沉淀重悬浮在PBS中。通过流式细胞仪检测CAR、CD3、CD4、CD8和CD107a。
结果显示，RQR8-CD19CAR-MBIL15、RQR8-CD19CAR-MBIL15-IL7、RQR8-CD19CAR-C7RCAR-T细胞与Raji、NALM6的孵育产生大量CD107a，表明细胞因子相关信号传导通路增强的CART针对体外CD19阳性靶细胞的功能。
4.6体外杀死活性
通过将荧光素酶基因导入靶细胞，然后进行筛选，获得稳定转染的细胞系。将实施例3中制备的CAR-T细胞与CD19阳性肿瘤细胞(Raji-luc，NALM6-luc)以不同的效应子:靶标比例混合。在加入荧光素后，荧光素酶可与荧光素反应以产生荧光。通过检测荧光的强度，可以测量荧光素酶的活性，并且可以检测细胞的存活，从而评估CART细胞的杀死效果。
结果显示，RQR8-CD19CAR-MBIL15、RQR8-CD19CAR-MBIL15-IL7、RQR8-CD19CAR-C7RCAR-T细胞可显著杀死Raji和NALM6，并且细胞因子相关的信号传导通路增强的CART显示出更显著的杀死作用，其与效应子:靶目标比例相关。
4.7CAR-T细胞的增殖
从CAR-T中除去IL-2。将CAR-T细胞连续培养2周，并每周计数两次以测量增殖。
结果显示，RQR8-CD19CAR-MBIL15、RQR8-CD19CAR-MBIL15-IL7、RQR8-CD19CAR-C7RCAR-T细胞比CD19 CAR-T细胞具有更强的增殖率。在没有IL-2的情况下，它们在2周之后仍具有更高的存活率。CFSE显示某些增殖，且CD19 CAR-T在2周后无法存活。
4.8细胞体外再激活
从CAR-T中除去IL-2。每周两次以2:1的效应子:靶标比例添加K562-CD19。将细胞培养2周并每周计数两次以测量细胞增殖
结果显示，在添加K562-CD19之后，RQR8-CD19CAR-MBIL15、RQR8-CD19CAR-MBIL15-IL7、RQR8-CD19CAR-C7R CAR-T细胞比CD19 CAR-T显示出显著更强的增殖率。在刺激后，细胞存活率高于CD19 CAR-T，表明细胞因子相关的信号传导通路增强的CART具有较高的增殖率，并且可以更好地存活。
4.9体内功效
选择6-12周的NOD-Prkdcscid Il2rgnull(NOG)小鼠，并腹膜内注射2×105个Raji-ffluc细胞，50μL的DPBS和50μL的人工基底膜基质(Corning)。两天后，测量小鼠的肿瘤移植物负荷，并基于肿瘤负荷将小鼠分为4组。一天后，分别向每只小鼠注射200μL的DPBS、5×106的NT细胞、5×106的CD19 CAR-T细胞、RQR8-CD19CAR-MBIL15、RQR8-CD19CAR-MBIL15-IL7、RQR8-CD19CAR-C7R CAR-T细胞。在CAR-T治疗后7天，进一步评估小鼠的肿瘤负荷。给每只小鼠腹膜内注射3mg d-萤光素进行4分钟反应，然后通过使用Xenogen IVIS成像系统进行30秒曝光拍照。
结果表明，两周后，与NT和CD19 CAR-T细胞相比，RQR8-CD19CAR-MBIL15、RQR8-CD19CAR-MBIL15-IL7和RQR8-CD19CAR-C7R CAR-T细胞显著降低了肿瘤负荷，并且在外周血中仍可检测到T细胞。细胞因子相关的信号传导通路增强的CART组中的小鼠整体上具有更长的生存期。
4.10体内GVHD研究
首先用亚致死剂量的辐射(175cGy)对小鼠进行全身性治疗。然后将CAR-T细胞重悬于PBS中，并注入到治疗小鼠的胸腔。通过使用GVHD临床标准每周观察小鼠2-3次，包括体重减轻、弓背、活动、皮毛质地和皮肤完整性。
结果显示，没有TCR敲除的组中的小鼠全部显示出GVHD反应的症状，并且在TCR单敲除的CAR-T细胞组中未检测到GVHD反应。
4.11 11 RQR8基因介导的CAR-T细胞的清除
NK细胞作为效应细胞从PBMC中分离，并以10μg/mL的终浓度在含有或不含有利妥昔单抗(Rutiximab)的情况下与CAR-T进行1:1共培养。4小时和24小时后，通过流式细胞术检测表达CAR。
ADCC百分比＝(1-单克隆抗体组CAR阳性比/无抗体组CAR阳性比)*100％
结果显示，在利妥昔单抗(Rutiximab)存在下，在4小时和24小时后，NK细胞显著清除RQR8-CD19CAR-MBIL15、RQR8-CD19CAR-MBIL15-IL7和RQR8-CD19CAR-C7R CAR-T细胞，但无法清除CD19CAR-T。在没有利妥昔单抗(Rutiximab)的情况下，NK不能杀死任何一种细胞。这表明利妥昔单抗(Rutiximab)可以起着安全开关的作用，其与RQR8结合，并允许NK介导ADCC功能，从而清除CART细胞。
实施例5表达E3的U-CAR T细胞的研究
图30显示了表达增强子E3的CAR-T细胞的示例性设计。在E3中，C7R的胞外域被安全开关替代，例如EGFRt或Her2t或本公开中描述的其他肽。
图31显示了表达CD19 CAR和增强子C7R或E3的CAR-T细胞的部分的流式细胞术数据。
图32A和图32B显示了CAR-T细胞对表达CD19抗原的HeLa细胞的体外杀死活性。图32A显示了与仅靶标或T细胞对照相比，表达C7R或E3的CD19 CAR-T细胞的体外杀死活性。在该实验中，效应子:靶比例为5:1。图32B显示了与仅靶标或T细胞对照相比，表达C7R或E3的CD19 CAR-T细胞的体外杀死活性。在该实验中，效应子:靶比例为1:1。
图33A和图33B显示了在测试的工程化细胞中磷酸化的STAT5(pSTAT5)和CD19 CAR的表达。图33A显示了表达CD19 CAR和pSTAT5的CAR-T细胞的部分的流式细胞术数据。图33B显示了图33A中的数据的pSTAT5的相应平均荧光指数(MFI)。
图34A-图34C显示了与没有增强子的CD19 CAR-T相比，表达C7R或E3的CD19 CAR-T细胞的增殖数据。图34A显示了三种不同细胞的细胞因子非依赖性增殖。图34B显示了在重复的NALM6刺激下的增殖。图34C显示了在通过NALM6刺激之前和之后CAR-T细胞的百分比。CAR刺激富集了CAR+细胞。
图35A显示了在存在或不存在西妥昔单抗(CTX，抗EGFR抗体)的情况下，以不同的效应子:靶标比例、与NK细胞共培养的CAR-T细胞的部分的流式细胞术数据。数据显示，在存在CTX的情况下，表达E3的CD19 CAR-T可以通过NK细胞介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)被NK细胞有效杀死，表明E3起到有效的安全开关作用，并且已经被有效关闭。图35B显示了NK细胞对其他细胞的总杀死活性。图35C显示了NK细胞对CAR-T细胞的杀死活性。
图36A和36B显示了在重复刺激之后通过ADCC进行的安全开关的测试。图36A显示了在存在或不存在CTX的情况下，以不同的效应子:靶标比例、与NK细胞共培养的CAR-T细胞的部分的流式细胞术数据。重复刺激该实施例中所示的细胞。图36B显示了NK细胞对CAR-T细胞的杀死活性。
图56A显示了在细胞培养的第12天表达CD7 CAR和增强子C7R或E3(EGFRt+IL7Rα)的TCR KO CD7 CAR-T细胞的部分的流式细胞术数据。图56B显示了表达CD7 CAR和增强子C7R或E3(EGFRt+IL7Rα)的TCR KO CD7 CAR-T细胞对CCRF-CEM细胞的6小时细胞毒性。在该实验中测试的效应子:靶标比例为5:1和1:1。图56C显示了表达C7R或E3(EGFRt+IL7Rα)的TCR KO CD7 CART细胞的增殖。在不补充IL2的T细胞培养基中培养CAR-T细胞，并监测细胞扩增的倍数。结果显示，表达C7R或E3的TCR KO CD7 CART细胞显示出比对照T细胞更好的细胞扩增和细胞稳定性。E3(EGFRt+IL7Rα)具有更好的增强子表达，因此比C7R保持更好的细胞持久性和扩增。图56D显示了表达磷酸化的STAT5(pSTAT5)和C7R或E3的TCR KO CD7 CAR-T细胞的部分的流式细胞术数据。pSTAT5在表达C7R或E3的TCR KO CD7 CAR-T细胞中高度上调。CAR19加IL2刺激用作pSTAT5的阳性对照。图56E显示了图56D中的数据的pSTAT5的相应平均荧光指数(MFI)。
构建体设计顺序：C7R的胞外域(etcodomain)可被安全开关替代，例如截短的EGFR或截短的Her2。
CD7CAR-E3氨基酸序列(E3＝EGFRt+组成型活性IL7RαTM和胞内域)。
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
CD7CAR-E3(E3＝Her2t+组成型活性IL7RαTM和胞内域)
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTGGGSGGGSPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
图68显示了在CCRF-CEM(T-ALL)鼠异种移植模型中CAR7和CAR7-E3 UCAR-T的体内功效的BLI成像。每只小鼠静脉内接种3×105个CCRF-CEM细胞。四天后，静脉内输注CAR-T细胞(每只小鼠1×106个细胞)。BLI成像表明CAR7-E3 UCAR-T细胞比CAR7 UCAR-T细胞具有更好的肿瘤清除效果。
实施例6表达双重CAR的U-CAR T细胞的研究
一般材料和方法
从供体血液中分离外周血单核细胞(PBMC)和扩增T细胞
使用Histopaque-1077(西格玛-奥德里奇)通过密度梯度离心机从供体血液中分离外周血单核细胞(PBMC)。然后富集T细胞，通过与抗CD3/抗CD28偶联的磁珠激活、培养和扩增。
细胞系和PBMC的培养
Raji细胞(伯基特淋巴瘤细胞，ATCC-CCL86)；
K562细胞(人红白血病细胞系，ATCC-CCL243)；
Raji-ffluc细胞系(通过筛选用具有萤火虫荧光素酶的慢病毒转染的Raji细胞获得)；
293T细胞(ATCC-CRL3216)；
CCRF-CEM细胞(ATCC-CCL119)；
PBNK：通过使用CD56微珠从PBMC中分选的外周血NK，并在NK无血清培养基试剂盒II(Cyagen Biosciences)+10％FBS+900IU/ml IL2(PeproTech)中培养；
NK92细胞(ATCC-CRL2407)；
NK92-ffluc细胞(通过筛选用具有萤火虫荧光素酶的慢病毒转染的NK92细胞获得)；
在RPMI1640培养基中培养Raji细胞、Raji-ffluc细胞系和K562细胞，在DMEM培养基中培养293T细胞。RPMI1640和DMEM均补充有10％(v/v)的胎牛血清和100U/ml的青霉素和链霉素、2mM的谷氨酰胺和1mM的丙酮酸钠。所有细胞均在37℃、5％CO2的孵化器中培养。
在补充有10％(v/v)胎牛血清、2mM的谷氨酰胺、1mM的丙酮酸钠、1％的NEAA、0.1mM的巯基乙醇和200IU/ml的rhIL2的RPMI1640培养基中培养NK92细胞。
将T细胞和获得的CAR-T细胞在X-vivo15培养基(含有5％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1mM的丙酮酸钠和300IU/ml的rhIL2)中培养。CAR-T细胞的培养基进一步补充rhIL-2(赛默飞世尔科学)，每两天一次，终浓度为300Iu/ml。所有细胞均在37℃、5％CO2的孵化器中培养。
6.1CRISPR的设计与构建
在网站http：//crispr.mit.edu,www.idtdna.com和https：//www.synthego.com评估基因编辑效率和脱靶风险后，选择用于基因编辑的CD7、CD2、TCR gRNA。本公开中使用的gRNA由集成DNA技术有限公司(Integrated DNA Technologies,Inc(IDT))合成或通过体外转录制备(参见Shi等人,2017,J Vis Exp.doi:10.3791/55267)。HiFi-Cas9从IDT购买。
为了基因编辑，将3μg的Cas9蛋白和1.5μg的gRNA以20μl混合，并在37℃或室温下孵育15分钟以形成核糖核蛋白(RNP)。然后通过Lonza 4D核转染将RNP转染到T细胞中。基因敲除效率由如流式细胞术检测的表达蛋白质的细胞比例来确定。
使用的gRNA靶向序列如下：
TRAC-gRNA1：TTCGGAACCCAATCACTGAC,SEQ ID NO:20
TRAC-gRNA2：TCAGGGTTCTGGATATCTGT,SEQ ID NO:21
TRAC-gRNA3：AAGTTCCTGTGATGTCAAGC,SEQ ID NO:22
CD7-gRNA1：GAGGTCAATGTCTACGGCTC,SEQ ID NO:25
CD7-gRNA2：ATCACGGAGGTCAATGTCTA,SEQ ID NO:26
CD7-gRNA3：GTAGACATTGACCTCCGTGA,SEQ ID NO:27
CD7-gRNA4：GGAGCAGGTGATGTTGACGG,SEQ ID NO:28
CD2-gRNA1：CAAAGAGATTACGAATGCCT,SEQ ID NO:29
CD2-gRNA2：GTGCCACAAAGACCATCAAG,SEQ ID NO:30
CD2-gRNA3：AGAGGGTCATCACACACAAG,SEQ ID NO:31
CD2-gRNA4：CTTGTAGATATCCTGATCAT,SEQ ID NO:32
筛选后，发现每个基因具有高敲除效率的gRNA，敲除两个基因TCR/CD7或TCR/CD2时也观察到了高效率，其中TRAC-gRNA2和CD7-gRNA1是具有高敲除效率的gRNA。图16显示了使用不同的CD7-gRNA与TRAC-gRNA1的CD7敲除的效率，并且CD7-gRNA1和CD7-gRNA4明显更好，随后的实验中使用了CD7-gRNA1。
6.2CD7 CAR的设计和病毒包装
CD7单个CAR的scFv源自于TH69、3A1e和SDZCHH380抗体。CAR中的scFv设计为3A1e-LH、TH69-LH、SDZ-LH、SDZ-HL。CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:75-78所示。
3A1e-LH(SEQ ID NO 75)
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
TH69-LH(SEQ ID NO 76)
MALPVTALLLPLALLLHAARPAAYKDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGLTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGFTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARDEVRGYLDVWGAGTTVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
SDZ-LH(SEQ ID NO 77)
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWTTPPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYNGEPTYADDFKGRFDFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARRGYYYGSRYGAMDYWGQGTSVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
SDZ-HL(SEQ ID NO 78)
MALPVTALLLPLALLLHAARPQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYNGEPTYADDFKGRFDFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARRGYYYGSRYGAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWTTPPWTFGGGTKLEIKSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
将CAR基因克隆到FUW慢病毒载体主链中EF1α(EF-1α)启动子下以形成Fuw-EF1α-CAR。通过使用Lipofectamine3000或PEI将Fuw-EF1α-CAR，慢病毒包膜质粒pMD2.G(Addgene，质粒#12259)和慢病毒包装质粒psPAX2(Addgene，质粒#12260)转染到293T细胞中，以制备完整表达载体。在48和72小时收集上清液，并进行超速离心(Merck Millipore)以浓缩。浓缩的病毒准备转染T细胞。
6.3CAR-T细胞的制备
细胞分离和激活
单采血液成分法后，使用Histopaque-1077(西格玛-奥德里奇)通过密度梯度离心分离单核细胞。然后富集T细胞，通过与抗CD3/抗CD28偶联的磁珠激活、培养和扩增。
将具有5％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1mM的丙酮酸钠和300IU/ml的rhIL2的X-vivo 15用作CAR-T细胞培养基。将细胞孵育并在37℃、5％CO2下培养。
表达CD 19的细胞系：Raji(伯基特淋巴瘤细胞系，ATCC-CCL86)；K562(ATCC-CCL243)；通过筛选用具有萤火虫荧光素酶的慢病毒转染的细胞获得Raji-ffluc和NK92细胞系。
表达CD7和CD2的细胞系：Jurkat细胞、CCRF-CEM和NK92细胞。
所有细胞都在RPMI1640培养基中培养，且293T细胞(ATCC-CRL3216)在DMEM培养基中培养。RPMI1640和DMEM均补充有10％(v/v)的胎牛血清和100U/ml的青霉素和链霉素、2mM的谷氨酰胺和1mM的丙酮酸钠。
电穿孔和慢病毒感染
富集并激活T细胞后两天，将抗CD3/抗CD28磁珠去除并将细胞收集到试管中，并以300g离心5分钟，然后用DPBS洗涤两次，并以50×106/ml的细胞密度重新悬浮在opti-mem中。基于细胞密度计算所需的cas9/gRNA RNP的量，然后与细胞混合转移至4D-Nucleofector System N(Lonza)系统进行电穿孔。然后，将细胞重悬于预热的培养基中达到1-2×106/ml的密度。将细胞进一步以2-8的MOI进行慢病毒转染，转移至烧瓶中，并在37℃、5％CO2的孵化器中培养。
细胞增殖与CAR阳性比检测
转染后3天，检测细胞数和CAR阳性细胞，并计算T细胞中CAR的阳性比。还检测TCR(或CD3)和CD7的阳性比，以确定敲除效率。然后将细胞在孵化器中连续培养，每2-3天更换一半培养基，直到第10天，此时细胞准备冷冻保存。
6.4CD7 CAR结构的筛选
如38A所示，成功检测到抗CD7 CAR的表达，其中TH69-LH显示最强表达，其次是3A1e-LH，然后是SDZ-LH和SDZ-HL。在功能方面，如图38B所示，3A1e-LH、CAR均对CD7阳性T细胞显示最佳杀死作用，而TH69-LH、SDZ-LH和SDZ-HL CAR效果较差。因此，在双重CAR中，选择3Ale的scFv用于CD7 CAR。
6.5CD19-CD7双重CAR结构的设计
靶向CD19和CD7的CD19-CD7双重CAR的结构如图37和以下所示：
环：L719-LHLH和L719-HLHL，序列如SEQ ID NO 79和80所示；
L719-LHLH(SEQ ID NO.79)
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
L719-HLHL(SEQ ID NO.80)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
串联：T197-LHLH、T197-LHLH-EAAAK3(通过使用具有三连接的EAAAK的接头)、T719-LHLH、T719-LHHL，序列如SEQ ID NO 81-84所示；
T197-LHLH(SEQ ID NO.81)
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
T197-LHLH-(EAAAK)3(SEQ ID NO.82)
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSEAAAKEAAAKEAAAKDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
T719-LHLH(SEQ ID NO.83)
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
T719-LHHL(SEQ ID NO.84)
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
与组成性地激活的IL7受体C7R连接的环双重CAR：L719-C7R，氨基酸序列如SEQ IDNO 85所示。
L719-C7R(SEQ ID NO 85)
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLVRRGARAGPRMPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ*
6.6对双重CAR结构-1的测试
1)双重CAR的表达和敲除效率
我们比较了两个环CAR(L719-LHLH和L719-HLHL)和两个串联CAR(T197-LHLH和T197-LHLH-(EAAAK3)3)，其中CAR7和CAR19用作单个CAR对照，且模拟物T为阴性对照。如39所示，两个环双重CAR的表达呈对角线分布，表明双重CAR的成功表达。串联双重CAR的CD19CAR表现出强表达，然而，CD7 CAR被微弱检测到。图40显示了CD7和CD3(TRAC)的敲除效率，并且可以看出，在模拟物T和CAR19中，敲除效率高达98％。在包括CD7单个CAR和CD7/CD19双重CAR的其他两组中，CD7+细胞的比例显著低于模拟物T和CAR 19组中的比例，表明CD7 CAR的功能。
2)双重CAR对CD19+细胞和CD7+细胞的体外杀死作用
首先，我们比较不同CAR对CD 19靶标的杀死作用。xCELLigence实时细胞分析仪(RTCA)实验表明，两个环CAR和两个串联CAR对HeLa-CD19+细胞均具有有效的杀死作用，类似于CD19单个CAR(CAR19)(图41)。
随后，我们比较了不同CAR对来自外周血的CD7+NK细胞的杀死作用(图42A)。用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记体内扩增的PBNK细胞(CD7+细胞比例为约80％)，并与CAR-T细胞一起孵育1天。然后，对细胞进行流式细胞术以分析CFSE阳性细胞比例的变化。图42A显示了双重CAR和CD7单个CAR对NK细胞具有显著的杀死作用，且CD19单个CAR和模拟物T没有显示任何杀死作用。图42B显示了NK中的CD7+细胞在与双重CAR(L719-LHLH和T197-LHLH)共培养后几乎消失，表明CAR7和双重CAR完全杀死NK中的CD7+细胞。
此外，我们比较了不同CAR对同种异体T细胞(CD7+)的杀死作用(图43)。结果表明，同种异体T细胞被CAR7和双重CAR完全杀死，而CAR19对同种异体T细胞没有显示任何杀死作用。
3)双重CAR在体内清除CD19+Raji肿瘤
每只小鼠静脉内接种3×105个肿瘤细胞。6天后，静脉内输注CAR-T细胞(每只小鼠3×106个细胞)。BLI成像表明环CAR和串联CAR均在一定程度上清除了Raji肿瘤，并且L719-LHLH显示出最佳的体内肿瘤控制(图44)。
6.7对双重CAR结构-2的测试
另外两个串联双重CAR结构：设计T719-LHLH和T719-LHHL并与环CAR(L719-LHLH，也称为L719)进行比较。
图45A和45B显示成功地表达新的串联双重CAR(图45A)，并且对基因敲除后的剩余的CD7+细胞也具有显著的杀死作用(图45B)。
实时细胞分析(RTCA)显示(图46)，串联双重CAR具有与L719类似的对HeLa-CD19细胞的杀死作用。
图47A和47B表明，在24小时内，串联双重CAR也具有与L719类似的对同种异体T细胞和NK细胞的强杀死作用。
图48显示了L719和串联(T719-LHLH和T719-LHHL)双重CAR都在体内极大地清除了CCRF-CEM肿瘤(NOG小鼠中的CCRF-CEM静脉内模型)。
6.8细胞因子的释放
将实施例6.3中制备的双CAR-T细胞和CD19阳性肿瘤细胞(Raji)、CD7阳性肿瘤细胞(Jurkat)或原代同种异体PBMC或NK(每种100ul)以1:1比例在RPMI培养基中混合达到每钟细胞的密度为1×106/ml，然后在96孔板中培养过夜。然后收集培养基并进行离心，并通过细胞因子珠阵列试剂盒(CBA试剂盒，BD生物科学)检测释放的细胞因子IFN-γ和IL-2。
结果表明，将CD19-CD7 CAR-T细胞与Raji、Jurka、原代同种异体PBMC或NK细胞一起孵育产生大量的IFN-γ和IL-2，表明CAR-T对CD19阳性或CD7阳性靶细胞的功能。
6.9体内GVHD研究
首先用亚致死剂量的辐射(175cGy)对小鼠进行全身性治疗。然后将CAR-T细胞重悬于PBS中，并注入到治疗小鼠的胸腔。通过使用GVHD临床标准每周观察小鼠2-3次，包括体重减轻、弓背、活动、皮毛质地和皮肤完整性。
结果表明，没有TCR基因敲除的小鼠表现出GVHD症状，然而，在CD7-CD19 CAR-T+TCR/CD7双重敲除组中未检测到GVHD。
6.10体外HVG研究
CD7 CAR可以有效且快速地清除CD7+细胞，且体外实验表明，同种异体T细胞对表达CD7 CAR的CAR-T细胞没有表现出显著的排斥，但对仅表达CAR19的CAR-T细胞表现出强烈的排斥。
与不含CD7 CAR的CAR-T细胞相比，同种异体NK细胞对表达CD7 CAR的CAR-T细胞显示显著减少的排斥。
6.11AP1903或雷帕霉素清除CAR-T细胞
将10nM的AP1903或雷帕霉素添加到rapaCasp9-L719 CAR-T细胞(序列如SEQ IDNO:86所示)的培养基中。在1、6和24小时后，通过流式细胞术检测CAR-T细胞的细胞凋亡和存活。
结果显示，AP1903和雷帕霉素可快速清除rapaCasp9-L719 CAR-T细胞，但无法清除CD19对照CART，表明安全开关的特异性。
rapaC9-L719(SEQ ID NO.86)
MASRILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISKLEYSGGGSLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGGSGGGGSGGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKRGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
通过24小时补体依赖性细胞毒性测定(CDC测定)确定L719-E3细胞中E3的安全开关功能。简言之，将TCR/CD7双敲除L719-E3细胞或L718-E2细胞在含有0％、5％或25％供体血清的培养基中孵育。通过添加5或50ug/ml的西妥昔单抗(CTX)检查24小时CDC效果。靶向CD20的利妥昔单抗(RTX)被用作阴性对照。如图61所示，在血清存在下西妥昔单抗特异性裂解L719-E3细胞(图61A)并且在没有EGFRt或CD20胞外结构域的L719-E2细胞中未观察到CDC作用(图61B)。
通过补体依赖性细胞毒性测定(CDC测定)进一步测定TCR/CD7双敲除CAR7-E3细胞或L719-E3细胞中E3的安全开关功能。将细胞在含有0％、5％或25％豚鼠血清的培养基中孵育。然后在5ug/ml的西妥昔单抗存在下检测CDC作用。如图62A所示，CDC效应对应于血清(补体)的浓度，并且对于表达CAR7-E3细胞的E3而不是对照T细胞具有特异性。在存在5ug/ml的西妥昔单抗或赫赛汀的情况下，还检测了L719-E3细胞的CDC效应。如62B所示，仅在西妥昔单抗存在下才观察到CDC效应。
6.12细胞因子受体C7R或E3增强的双重CAR的功能
为了进一步提高通用CAR-T细胞的体内存活，将组成型信号因子IL7受体(C7R)或E3通过2A连接到L719双重CAR上，以激活pSTAT5信号传导通路。图50A显示了在L719和L719-C7R双重CAR-T细胞中CD19和CD7抗原结合结构域的表达。图50B显示了具有或不具有C7R表达的L719双重CAR-T细胞对表达CD7(HeLa-CD7)的HeLa细胞的细胞毒性。图50C显示了具有或不具有C7R表达的L719双重CAR-T细胞对表达CD19(HeLa-CD19)的HeLa细胞的细胞毒性。在图50B和50C中测试的效应子:靶标比例为4:1。图50B和50C显示了L719和L719-C7R均有效杀死HeLa-CD7和HeLa-CD19。图50D显示了表达增强子(C7R或E3)和CD7的L719双重CAR-T细胞的部分的流式细胞术数据。图50E显示了表达C7R或E3的L719双重CAR-T细胞对NALM6细胞的6小时细胞毒性数据。在该实验中测试的效应子:靶标比例为5:1和1:1。图50F显示了表达C7R或E3的L719双重CAR-T细胞对CCRF-CEM细胞的6小时细胞毒性数据。在该实验中测试的效应子:靶标比例为5:1和1:1。图50G显示了表达磷酸化的STAT5(pSTAT5)和C7R或E3的L719双重CAR-T细胞部分的流式细胞术数据。pSTAT5在表达C7R或E3的L719双重CAR-T细胞中高度上调。CAR19加IL2刺激用作pSTAT5的阳性对照。未工程化的T细胞用作pSTAT5的阴性对照。图50H显示了去除IL-2后表达C7R或E3的L719双重CAR-T细胞的增殖。通过NALM6细胞的两轮刺激处理CAR-T细胞。
图50I显示了表达E3的L719双重CAR-T细胞(L719-E3)对表达HeLa细胞的CD19(HeLa-CD19)的细胞毒性。将L719-E3细胞与仅包括靶细胞、未转导的TCR/CD7双敲除细胞(NT-DKO)和CD19 CAR-T细胞的对照组进行比较，并且L719-E3对HeLa-CD19细胞显示出更好的细胞毒性。在该实验中测试的效应子:靶比例为5:1。图50J显示了表达E3的L719双重CAR-T细胞(L719-E3)对表达HeLa细胞的CD7(HeLa-CD7)的细胞毒性。将L719-E3细胞与仅包括靶细胞、未转导的TCR/CD7双敲除细胞(NT-DKO)和CD19 CAR-T细胞的对照组进行比较，并且L719-E3对HeLa-CD7细胞显示出更好的细胞毒性。在该实验中测试的效应子:靶比例为5:1。
图63显示了在没有细胞因子信号传导增强的情况下、或在具有mbIL15、C7R或E3表达的情况下，TCR/CD7双敲除CAR7细胞中IL2和IFN-γ的表达。CCRF-CEM细胞以1:1效应子:靶细胞的比例刺激细胞24小时。收集上清液并通过细胞因子珠阵列测量IL12和IFNγ表达。如图63所示，表达C7R和E3的CAR7细胞显示出增强的IL-2产生。
图64显示了在没有细胞因子信号传导增强的情况下、或在具有C7R或E3表达的情况下，TCR/CD7双敲除CD19/CD7双重CAR-L719细胞中IL2和IFN-γ的表达。
CCRF-CEM细胞以1:2效应子:靶细胞的比例刺激细胞24小时。收集上清液并通过细胞因子珠阵列测量IL12和IFNγ表达。如图64所示，表达C7R的CAR7细胞显示出增强的IL-2产生。
6.13如本文所述用于构建CAR的其他序列
FMC63 scFv VL(SEQ ID NO 87)
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT
FMC63 scFv VH(SEQ ID NO 88)
EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
FMC63 CD19CAR(SEQ ID NO 89)
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
3A1e CD7 scFv VL(SEQ ID NO 90)
DIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGGGTKLEIKR
3A1e CD7 scFv VH(SEQ ID NO 91)
QVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSS
6.14CD19和CD7双特异性CAR-T细胞的增殖
图57A显示了表达C7R(GC197-C7R)的CD19和CD7双重特异性CAR-T细胞的增殖。从两个不同的T细胞供体制备工程化双特异性CAR-T细胞。来自两个供体的CAR-T细胞响应于重复的癌症抗原刺激均表现出优异的持久性和增殖性。图57B显示了GC197-C7R细胞在没有刺激时的增殖。将新鲜制备的GC197-C7R在没有补充IL2或抗原刺激的T细胞培养基中培养，与对照T细胞相比，GC197-C7R保持更好的扩增在培养基中持续。
图58A显示了在细胞培养的第12天，CD197 CAR和增强子在GC197-C7R和GC197-E3中的表达。图58B显示了在没有刺激的情况下表达C7R(GC197-C7R)或E3(GC197-E3)的GC197细胞的增殖。在不补充IL2的T细胞培养基中培养GC197-C7R或GC197-E3细胞，并监测细胞扩增和持久性的倍数。图58C显示了在抗原刺激的存在下GC197-C7R和GC197-E3的增殖。用Nalm6(CD19+B-ALL细胞系)重复刺激细胞，并监测细胞扩增的倍数。数据显示，无论有或没有细胞因子或抗原刺激，GC197-C7R/E3均显示出相当优异的细胞扩增和细胞稳定性。
6.15体内功效
图69显示了在Nalm6(B-ALL)鼠异种移植模型中L719和L719-C7R UCAR-T的体内功效的BLI成像。每只小鼠静脉内接种1×106个Nalm6细胞。四天后，静脉内输注CAR-T细胞(高剂量：1×106或低剂量：每只小鼠3×105个细胞)。BLI成像表明L719-C7R UCAR-T细胞比L719UCAR-T细胞具有更好的肿瘤清除效果。
实施例7具有CD137和CD19双重CAR的U-CAR T细胞的研究一般材料和方法
从供体血液中分离外周血单核细胞(PBMC)和T细胞的扩增
使用Histopaque-1077(西格玛-奥德里奇)通过密度梯度离心机从供体血液中分离外周血单核细胞(PBMC)。然后富集T细胞，通过与抗CD3/抗CD28偶联的磁珠激活、培养和扩增。
PBMC和外周血原代NK(PBNK)细胞的细胞系和培养
Raji细胞(伯基特淋巴瘤细胞，ATCC-CCL86)；
K562细胞(人红白血病细胞系，ATCC-CCL243)；
Raji-ffluc细胞系(通过筛选用具有萤火虫荧光素酶的慢病毒转染的Raji细胞获得的)；
293T细胞(ATCC-CRL3216)；
NK92细胞(ATCC-CRL2407)；
NK92-ffluc细胞(通过筛选用具有萤火虫荧光素酶的慢病毒转染的NK92细胞获得的)
在RPMI1640培养基中培养Raji细胞、K562细胞和Raji-ffluc细胞系，并且在DMEM培养基中培养293T细胞。RPMI1640和DMEM均补充有10％(v/v)的胎牛血清和100U/ml的青霉素和链霉素、2mM的谷氨酰胺和1mM的丙酮酸钠。所有细胞均在37℃，5％CO2的孵化器中培养。
在补充有10％(v/v)胎牛血清、2mM的谷氨酰胺、1mM的丙酮酸钠、1％的NEAA、0.1mM的巯基乙醇和200IU/ml的rhIL2的RPMI1640培养基中培养NK92细胞和NK92-ffluc细胞。通过使用CD56微珠从PBMC中分选PBNK，然后在上述培养基中培养，并在表达4-1BBL-mbIL15的K562的刺激下扩增。
将T细胞和获得的CAR-T细胞在X-vivo15培养基(含有5％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1mM的丙酮酸钠和300IU/ml的rhIL2)中培养。CAR-T细胞的培养基补充rhIL-2(赛默飞世尔科学)，每两天一次，终浓度为300Iu/ml。所有细胞均在37℃、5％CO2的孵化器中培养。
7.1CD19-CD137双重CAR的设计和病毒包装
CD19 CAR的结构是SP-CD19 scFv VL-接头-CD19 scFv VH-铰链-TM-4-1BB-CD3ζ；且靶向双重CAR(CD19-CD7双重-CAR)的CD19和CD137的环是SP-CD19 scFv VL–接头-CD137scFv VH-接头-CD137scFv VL-接头-CD19 scFv VH-铰链-TM-4-1BB-CD3ζ(如图52所示)。CD19-CD137-环-CAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.:41所示。
CD19-CD137-环-CAR(SEQ ID NO 41)：
ATGGCACTCCCTGTAACTGCACTTCTTTTGCCACTTGCCTTGCTCCTGCACGCAGCGCGGCCGGATATTCAAATGACACAAACTACCAGCTCCCTTTCAGCATCTTTGGGCGATAGAGTAACTATAAGTTGCCGCGCGTCCCAAGACATCTCTAAGTACCTTAACTGGTATCAACAAAAACCGGACGGGACGGTCAAACTGTTGATCTATCACACATCCAGATTGCACTCAGGCGTGCCGAGCAGGTTCAGTGGGAGTGGGTCAGGAACGGATTACAGCTTGACGATTAGTAACCTGGAGCAAGAAGACATTGCCACCTACTTCTGCCAGCAAGGTAACACTCTCCCATATACGTTCGGGGGTGGCACCAAGCTGGAAATCACTGGCGGCGGAGGATCCGAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGAGAGCCTGAGGATCAGCTGCAAGGGCAGCGGCTACAGCTTCAGCACCTACTGGATCAGCTGGGTGAGGCAGATGCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAAGATCTACCCCGGCGACAGCTACACCAACTACAGCCCCAGCTTCCAGGGCCAGGTGACCATCAGCGCCGACAAGAGCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCAGCGACACCGCCATGTACTACTGCGCCAGGGGCTACGGCATCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCAGCACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGCTCTACCAAGGGCATGAGCTACGAGCTGACCCAGCCCCCCAGCGTGAGCGTGAGCCCCGGCCAGACCGCCAGCATCACCTGCAGCGGCGACAACATCGGCGACCAGTACGCCCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCGTGCTGGTGATCTACCAGGACAAGAACAGGCCCAGCGGCATCCCCGAGAGGTTCAGCGGCAGCAACAGCGGCAACACCGCCACCCTGACCATCAGCGGCACCCAGGCCATGGACGAGGCCGACTACTACTGCGCCACCTACACCGGCTTCGGCAGCCTGGCCGTGTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGACCGTGCTGGGGGGAGGCGGCAGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCCGGGCCCGGTCTCGTGGCACCTTCCCAGTCACTGTCCGTGACCTGCACCGTATCTGGGGTAAGTCTGCCGGATTATGGGGTTTCATGGATCCGGCAACCTCCGAGGAAAGGGTTGGAATGGCTGGGAGTCATCTGGGGAAGCGAGACAACTTATTATAATTCTGCTTTGAAGAGCCGCTTGACGATAATCAAGGACAACAGTAAGAGTCAGGTTTTCTTGAAGATGAATTCTCTTCAGACAGATGACACCGCTATTTATTATTGTGCAAAACATTATTATTACGGAGGATCCTACGCGATGGACTATTGGGGACAGGGTACCTCTGTTACGGTGTCCTCATCCGGAACAACGACACCAGCACCACGGCCACCCACTCCTGCTCCGACAATTGCGTCTCAGCCCCTTTCCCTTCGACCCGAAGCTTGTCGCCCTGCTGCGGGAGGAGCGGTCCACACGCGCGGGCTTGACTTCGCTTGCGACATCTACATTTGGGCACCCTTGGCCGGGACATGCGGCGTCTTGCTCCTGAGTCTGGTTATAACGCTGTATTGTAAGCGAGGTCGGAAGAAGCTTTTGTATATCTTTAAACAGCCCTTTATGAGGCCCGTACAAACCACACAAGAGGAGGATGGGTGCTCATGCAGATTTCCTGAAGAGGAAGAGGGCGGTTGCGAACTTAGAGTCAAATTCAGCCGCTCCGCAGATGCACCTGCTTATAAACAGGGTCAGAATCAATTGTATAATGAACTTAATCTCGGGAGGCGCGAGGAGTATGATGTGCTGGACAAGCGACGGGGTCGAGACCCAGAGATGGGCGGTAAACCCCGCCGAAAGAACCCCCAGGAGGGACTGTATAATGAGCTGCAAAAGGACAAAATGGCAGAAGCCTATTCCGAAATAGGGATGAAGGGAGAGCGGCGGCGAGGTAAGGGACATGACGGTCTTTATCAAGGTCTTAGTACTGCAACTAAGGACACCTATGACGCGCTGCATATGCAGGCTCTCCCACCTAGATAA
将CAR基因克隆到FUW慢病毒载体主链中EF1α(EF-1α)启动子下以形成Fuw-EF1α-CAR。通过使用Lipofectamine3000将Fuw-EF1α-CAR，慢病毒包膜质粒pMD2.G(Addgene，质粒#12259)和慢病毒包装质粒psPAX2(Addgene，质粒#12260)转染到293T细胞中，以制备完整的慢病毒表达载体。在48和72小时收集上清液，并进行超速离心(Merck Millipore)以浓缩。浓缩的病毒准备转染T细胞。
结果表明，成功构建了慢病毒载体，并如期望的检测到双重CAR的抗-CD19和抗-CD19/CD137的表达。
7.2CRISPR的设计与构建
在网站http：//crispr.mit.edu,www.idtdna.com和https：//www.synthego.com上评估基因编辑效率和脱靶风险后，选择用于基因编辑的CD137和TCR gRNA。本公开中使用的gRNA通过集成DNA技术有限公司(Integrated DNA Technologies,Inc(IDT))合成。HiFi-Cas9从IDT购买。
为了基因编辑，将3μg的Cas9蛋白和1.5μg的gRNA以20μl混合，并在37℃或室温下孵育15分钟以形成核糖核蛋白(RNP)。然后通过Lonza 4D核转染将RNP转染到T细胞中。基因敲除效率由如流式细胞术检测的表达蛋白质的细胞比例来确定。
使用的gRNA靶向序列如下：
TRAC-gRNA1：TTCGGAACCCAATCACTGAC，SEQ ID NO:20
TRAC-gRNA2：TCAGGGTTCTGGATATCTGT，SEQ ID NO:21
TRAC-gRNA3：AAGTTCCTGTGATGTCAAGC，SEQ ID NO:22
CD137-gRNA1：AACGTGGCATCTGTCGACCC,SEQ ID NO:45
CD137-gRNA2：GCGCTGGAGAAACTATTTGG，SEQ ID NO:46
CD137-gRNA3：ACATTTAACGATCAGAAACG，SEQ ID NO:47
CD137-gRNA4：GGTCCTTTGTCCACCTGCGC，SEQ ID NO:48
CD137-gRNA5：GAGAAACTATTTGGAGGACA，SEQ ID NO:49
CD137-gRNA6：GGAGAAACTATTTGGAGGAC，SEQ ID NO:50
筛选后，发现每个基因具有高敲除效率的gRNA，敲除两个基因TCR/Cd137时也观察到了高效率。
7.3CAR-T细胞的制备
细胞分离和激活
单采血液成分法后，使用Histopaque-1077(西格玛-奥德里奇)通过密度梯度离心分离单核细胞。然后富集T细胞，通过与抗CD3/抗CD28偶联的磁珠激活、培养和扩增。
将具有5％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1mM的丙酮酸钠和300IU/ml的rhIL2的X-vivo 15用作CAR-T细胞培养基。将细胞孵育并在37℃、5％CO2下培养。
通过使用抗CD3/抗CD28磁珠激活同种异体T细胞。
通过将K562细胞与PBNK共培养来激活同种异体PBNK细胞。
通过流式细胞术测定激活之前和之后CD137在细胞表面上的表达。
电穿孔和慢病毒感染
富集并激活T细胞后两天，将抗CD3/抗CD28磁珠去除并将细胞收集到试管中，并以300g离心5分钟，然后用DPBS洗涤两次，并以50×106/ml的细胞密度重新悬浮在opti-mem中。基于细胞密度计算所需的cas9/gRNA RNP的量，然后与细胞混合转移至4D-Nucleofector System N(Lonza)系统进行电穿孔。然后，将细胞重悬于预热的培养基中达到1-2×106/ml的密度。将细胞进一步以2-8的MOI进行慢病毒转染，然后转移至烧瓶中，并在37℃、5％CO2的孵化器中培养。
细胞增殖与CAR阳性比检测
转染后4天，检测细胞数和CAR阳性细胞，并计算T细胞中CAR的阳性比。还检测TCR(或CD3)和CD137的阳性比，以确定敲除效率。然后将细胞在孵化器中连续培养，每2-3天更换一半培养基，直到第10天，此时细胞准备冷冻保存。示例性工作流程在图53所示。
结果表明，在制备的CD19-CD137 CAR-T细胞中，CAR的阳性比和CD3的阴性比均较高。
7.4体外杀死作用及细胞因子的释放
将实施例7.3中制备的双重CAR-T细胞和CFSE标记的CD19阳性肿瘤细胞(Raji)和CD137阳性细胞(激活的同种异体T细胞或激活的同种异体PBNK或NK92)(每种100ul)以1:1比例混合在RPMI培养基中达到每种细胞的密度为1×106/ml，然后在96孔板中培养过夜至1周。通过流式细胞术检测CAR-T细胞和CFSE标记的靶细胞的数量，从而确定CAR-T细胞与靶细胞在共培养过程中的杀死作用。此外，还收集共培养基并进行离心，并通过细胞因子珠阵列试剂盒(CBA试剂盒，BD生物科学)检测释放的细胞因子IFN-γ和IL-2。
结果表明，将CD19-CD137 CAR-T细胞与Raji、异体-T或异体-NK细胞一起孵育产生大量的IFN-γ和IL-2，表明CAR-T对CD19阳性或CD137阳性靶标细胞的功能。流式细胞仪结果还表明，异体-T和异体-NK对CD19-CD137双重CAR T细胞的杀死作用显著小于对CD19单个CAR T细胞的杀死作用。
其他实验表明，CD19-CD137双重CAR T细胞仅清除CD137阳性细胞和NK细胞，但未显示出对CD137阴性灭活的T细胞或NK细胞的任何显著杀死作用，表明CD137 CAR的特异性。
7.5体内功效
选择6-12周的NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull(NOG)小鼠，并静脉内注射2×105个Raji-ffluc细胞和异体-T细胞。5天后，测量小鼠的肿瘤移植物负荷，并基于肿瘤负荷将小鼠分为4组。一天后，分别向每只小鼠注射200μL的DPBS、0.5×106的CD19 CAR-T细胞和0.5×106的CD19-CD137 CAR-T细胞。在CAR-T治疗后每7天，进一步评估小鼠的肿瘤负荷。给每只小鼠腹膜内注射3mg d-萤光素进行4分钟反应，然后使用Xenogen IVIS成像系统进行30秒曝光拍照。
结果显示，与CD19 CAR-T细胞相比，CD19-CD137 CAR-T显著降低了肿瘤负荷，并且CD19-CD137 CAR-T细胞显示出比CD19 CAR-T细胞显著更好的体内扩增，表明CD19-CD137CAR-T细胞更好存活，并且在体内清除CD19阳性肿瘤细胞的能力更强。
7.6体内GVHD研究
首先用亚致死剂量的辐射(175cGy)对小鼠进行全身性治疗。然后将CAR-T细胞重悬于PBS中，并注入到治疗小鼠的胸腔。通过使用GVHD临床标准每周观察小鼠2-3次，包括体重减轻、弓背、活动、皮毛质地和皮肤完整性。
结果表明，没有TCR基因敲除的小鼠都表现出GVHD症状，然而，在TCR/CD137双重敲除CD19-CD137 CAR-T细胞组中未检测到GVHD。
7.7如本文所述用于构建CAR的其他序列
4-1BB-L(SEQ ID NO:51)
MEYASDASLDPEAPWPPAPRARACRVLPWALVAGLLLLLLLAAACAVFLACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
4-1BB PF-05082566scFv VH(SEQ ID NO:52)
EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFSTYWISWVRQMPGKGLEWMGKIYPGDSYTNYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGYGIFDYWGQGTLVTVSS
4-1BB PF-05082566scFv VL(SEQ ID NO:53)
MSYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQSPVLVIYQDKNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCATYTGFGSLAVFGGGTKLTVL
4-1BB BMS-663513scFv VH(SEQ ID NO:54)
QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS GYYWSWIRQS PEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTIS VDTSKNQFSL KLSSVTAADT AVYYCARDYG PGNYDWYFDLWGRGTLVTVSS
4-1BB BMS-663513scFv VL(SEQ ID NO:55)
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPPALTF CGGTKVEIKR
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AAC VH-VL(SEQ ID NO:58)
ATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGGCCCGAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGAGAGCCTGAGGATCAGCTGCAAGGGCAGCGGCTACAGCTTCAGCACCTACTGGATCAGCTGGGTGAGGCAGATGCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAAGATCTACCCCGGCGACAGCTACACCAACTACAGCCCCAGCTTCCAGGGCCAGGTGACCATCAGCGCCGACAAGAGCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCAGCGACACCGCCATGTACTACTGCGCCAGGGGCTACGGCATCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCAGCACCAGCGGCAGCGGCAAGCCCGGCAGCGGCGAGGGCAGCACCAAGGGCATGAGCTACGAGCTGACCCAGCCCCCCAGCGTGAGCGTGAGCCCCGGCCAGACCGCCAGCATCACCTGCAGCGGCGACAACATCGGCGACCAGTACGCCCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCGTGCTGGTGATCTACCAGGACAAGAACAGGCCCAGCGGCATCCCCGAGAGGTTCAGCGGCAGCAACAGCGGCAACACCGCCACCCTGACCATCAGCGGCACCCAGGCCATGGACGAGGCCGACTACTACTGCGCCACCTACACCGGCTTCGGCAGCCTGGCCGTGTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGACCGTGCTGAGCGGCACCACCACCCCCGCCCCCAGGCCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGAGGCCCGAGGCCTGCAGGCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCAGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGAGGGGCAGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCCGCCTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGCAGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCAGGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGGTGA
FMC63 VH(SEQ ID NO:59)
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FMC63 VL(SEQ ID NO:60)
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT
FMC63 CD19 CAR(SEQ ID NO:61)
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实施例8表达E4的U-CAR T细胞的研究
图59A显示了表达增强子CD47(CAR19-CD47)或E4(CAR19-E4)的CD19 CAR-T细胞部分的流式细胞术数据。在E4设计中，C7R的胞外域被免疫细胞抑制剂(例如CD47、CD24或抑制杀死性或吞噬性免疫细胞功能并保护治疗性细胞的其他肽)的胞外结构域替代。CAR19-CD47或CAR19-E4在K562细胞中表达，其缺乏MHCI/II表达，并且由于缺乏MHC表达而对NK细胞杀死非常敏感。通过流式细胞术分析CAR19和CD47的表达。图59B显示了NK细胞对CAR19-CD47和CAR19-E4细胞的杀死活性。CD47和E4两者能够减少NK细胞对K562细胞的杀死程度。数据表明，E4可以保护MHCI阴性细胞免受NK细胞的杀死，E4可以用于保护MHCI KO CAR-T细胞。
图60A显示了表达CD19和磷酸化STAT5(pSTAT5)的TCR KO CD19 CAR-T细胞的部分的流式细胞术数据。CAR19-CD47或CAR19-E4在TCR敲除的T细胞中表达，可用于CAR表达和STAT5磷酸化。CAR19-E2和CAR19-CD47加IL2刺激用作阳性对照。E4介导pSTAT5的上调。图60B显示了表达增强子CD47(CAR19-CD47)或E4(CAR19-E4)的TCR KO CD19 CAR-T细胞的增殖。在没有IL12补充的情况下，比较了表达TCR敲除T细胞的CAR19-CD47、CAR19-E4、CAR19-C7R的细胞增殖和的细胞存活率。在培养基中去除IL2后，E4可以介导更强的细胞增殖以及维持细胞数量。在没有IL2添加的情况下，E4维持更好的CAR-T细胞稳定性。E4可以保护治疗细胞，例如具有HLA-I KO的细胞，免于NK细胞杀死或被吞噬细胞和T杀死细胞杀死。
构建体设计的序列：C7R的胞外结构域可以被免疫细胞抑制剂(例如截短的CD47、CD24)替代，其可以抑制杀死性或吞噬性免疫细胞功能，并保护CAR-T/NK细胞免受患者免疫系统的攻击。
CD7CAR-E4氨基酸序列：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNEPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ.
实施例9CAR7-C7R用于治疗T急性淋巴细胞白血病(T-ALL)患者的临床数据
该实施例提供了使用CAR7-C7R的临床研究设计和临床数据。患者被征募肿瘤负荷，其中38.2％的骨髓细胞为T-ALL细胞。在输注CAR7-C7R细胞之前，用预条件方案治疗患者。预条件方案使用化疗药物包括氟达拉滨、环磷酰胺和依托泊苷，用于淋巴细胞耗竭。预条件方案可以提供更好的CAR-T移植和肿瘤清除。淋巴细胞耗竭方案完成后两天，将CAR7-C7R细胞以1.5×107/kg的剂量静脉内输注到患者体内。CAR7-C7R快速消除癌细胞(T-ALL细胞)并在7-10天左右扩增到峰值，而不影响诸如粒细胞和单核细胞的先天免疫细胞亚群。一旦外周血和骨髓中的癌细胞被完全清除，CAR7-C7R细胞就会迅速恢复至最低水平，这使患者自身的免疫系统在癌细胞清除后立即开始恢复。然后，T细胞和NK细胞逐渐恢复到正常水平。
图67显示了CAR7-C7R用于治疗T急性淋巴细胞白血病(T-ALL)患者的临床数据。在临床研究中使用的CAR7-C7R的构建体显示在图17中。图67A显示了外周血中T-ALL消除的动力学。T-ALL细胞在7-10天之内被迅速清除。通过流式细胞术测量外周血中的T-ALL细胞浓度。图67B和C显示了CAR7-C7R细胞扩增动力学，其中图67B显示了外周血中CAR7-C7R细胞浓度，且图67C显示了外周血细胞的CAR7-C7R DNA拷贝/ug DNA。图67D和图67E显示了骨髓和外周血中粒细胞和淋巴细胞(T细胞和NK细胞)的恢复。
尽管已经在本文中示出和描述了本发明的优选实施例，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施例仅作为实例提供。并非意图通过说明书中提供的具体实例来限制本发明。尽管已经参考前述说明书描述了本发明，但是本文中的实施方案的描述和图示并不意味着以限制性的意义来解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文所阐述的具体描述、构造或相对比例，其取决于各种条件和变量。应该理解的是，本文描述的本发明的实施方案的各种替代方案可以用于实施本发明。因此，可以预期的是，本发明还应涵盖任何这样的替代、修改、变化或等同形式。所附权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (259)

1.一种工程化免疫细胞，其包含：
嵌合多肽，其包含(i)能够增强所述工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分，和(ii)当所述嵌合多肽与细胞死亡激活剂接触时能够实现所述工程化免疫细胞的死亡的诱导型细胞死亡部分，其中所述增强子部分与所述诱导型细胞死亡部分连接，和
一种或多种嵌合多肽受体(CPR)，其包含结合部分，其中所述结合部分包含(i)第一抗原结合结构域，当施用于受试者时，所述第一抗原结合结构域抑制或降低所述受试者对所述工程化免疫细胞的免疫应答，和(ii)能够结合至疾病相关抗原的第二抗原结合结构域，其中所述一种或多种CPR的单个CPR包含(i)所述第一抗原结合结构域，(ii)所述第二抗原结合结构域，或(iii)所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域两者，其中所述一种或多种CPR的每个CPR还包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
2.根据权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述一种或多种CPR是一种或多种嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。
3.根据权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域结合至免疫细胞抗原。
4.根据权利要求2所述的工程化免疫细胞，其中编码所述工程化免疫细胞的内源性表面标志物的基因被灭活，其中所述内源性表面标志物在表达时能够结合至所述第一抗原结合结构域。
5.根据权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞的内源性T细胞受体(TCR)被灭活。
6.根据权利要求5所述的工程化免疫细胞，其中编码所述内源性TCR的亚基的基因被灭活，使得所述内源性TCR被灭活。
7.根据权利要求6所述的工程化免疫细胞，其中编码所述亚基的所述基因是TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ或CD3ζ。
8.根据权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述嵌合多肽不包含侧接所述增强子部分和所述诱导型细胞死亡部分的任何自切割肽。
9.根据权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分被配置为组成性地增强所述工程化免疫细胞的所述一种或多种活性。
10.根据权利要求9所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分被配置为组成性地上调所述工程化免疫细胞的一个或多个细胞内信号传导通路。
11.根据权利要求10所述的工程化免疫细胞，其中所述一个或多个细胞内信号传导通路是一个或多个细胞因子信号传导通路。
12.根据权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分通过自寡聚化而自激活。
13.根据权利要求12所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分通过自二聚化而自激活。
14.根据权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述嵌合多肽是分泌型蛋白。
15.根据权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述嵌合多肽是细胞内蛋白。
16.根据权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述嵌合多肽是跨膜蛋白。
17.根据权利要求16所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分或所述诱导型细胞死亡部分包含在所述跨膜蛋白的胞外域中。
18.根据权利要求16所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分或所述诱导型细胞死亡部分包含在所述跨膜蛋白的胞内域中。
19.根据权利要求16所述的工程化免疫细胞，其中(i)所述增强子部分包含在所述跨膜蛋白的胞内域中，和(ii)所述诱导型细胞死亡部分包含在所述跨膜蛋白的胞外域中。
20.根据权利要求16所述的工程化免疫细胞，其中(i)所述增强子部分包含在所述跨膜蛋白的胞外域中，和(ii)所述诱导型细胞死亡部分包含在所述跨膜蛋白的胞内域中。
21.根据权利要求1所述的工程化免疫细胞，所述增强子部分是细胞因子或细胞因子受体。
22.根据权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19，TGFRβ、同样的受体、其功能片段、其功能变体及其组合。
23.根据权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分用作反式激活因子或顺式激活因子。
24.根据权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述诱导型细胞死亡部分选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8、Her2t、CD30、BCMA和EGFRt。
25.根据权利要求24所述的工程化免疫细胞，其中所述诱导型细胞死亡部分是EGFRt，并且所述细胞死亡激活剂是结合EGFRt的抗体或其抗原结合片段。
26.根据权利要求24所述的工程化免疫细胞，其中所述诱导型细胞死亡部分是HSV-TK，并且所述细胞死亡激活剂是GCV。
27.根据权利要求24所述的工程化免疫细胞，其中所述诱导型细胞死亡部分是iCasp9，并且所述细胞死亡激活剂是AP1903。
28.根据权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述细胞死亡激活剂包含核酸、多核苷酸、氨基酸、多肽、脂质、碳水化合物、小分子、酶、核糖体、蛋白酶体、其变体或任何它们的组合。
29.根据权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述一种或多种CPR的所述单个CPR包含所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域两者。
30.根据权利要求29所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域通过接头连接。
31.根据权利要求30所述的工程化免疫细胞，其中所述接头不包含自切割肽。
32.根据权利要求29所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合是scFv。
33.根据权利要求29所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域从氨基末端到羧基末端排列为：
(i)VL2-VH1-VL1-VH2；
(ii)VH2-VL1-VH1-VL2；
(iii)VL1-VH2-VL2-VH1；
(iv)VH1-VL2-VH2-VL1；
(v)VL2-VL1-VH1-VH2；
(vi)VH2-VH1-VL1-VL2；
(vii)VL1-VL2-VH2-VH1；或
(viii)VH1-VH2-VL2-VL1；
其中VH1是所述第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是所述第一抗原结合结构域的轻链可变轻链结构域，VH2是所述第二抗原结合结构域的重链可变结构域，且VL2是所述第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。
34.根据权利要求29所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域从氨基末端到羧基末端排列为：
(i)VL2-VH2-VL1-VH1；
(ii)VL2-VH2-VH1-VL1；
(iii)VL1-VH1-VL2-VH2；
(iv)VL1-VH1-VH2-VL2；
(v)VH2-VL2-VL1-VH1；
(vi)VH2-VL2-VH1-VL1；
(vii)VH1-VL1-VL2-VH2；或
(viii)VH1-VL1-VH2-VL2，
其中VH1是所述第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是所述第一抗原结合结构域的轻链可变轻链结构域，VH2是所述第二抗原结合结构域的重链可变结构域，且VL2是所述第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。
35.根据权利要求30所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合至所述免疫细胞抗原和所述疾病相关抗原。
36.根据权利要求29所述的工程化免疫细胞，其中所述一种或多种CPR的所述单个CPR仅包含所述第一抗原结合结构域，并且所述一种或多种CPR的另外的单个CPR仅包含所述第二抗原结合结构域。
37.根据权利要求30所述的工程化免疫细胞，其中所述免疫细胞抗原是免疫细胞的表面蛋白或分泌型蛋白。
38.根据权利要求37所述的工程化免疫细胞，其中所述免疫细胞是NK细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞或粒细胞。
39.根据权利要求37所述的工程化免疫细胞，其中所述免疫细胞获自于外周血、脐带血或源自于干细胞。
40.根据权利要求37所述的工程化免疫细胞，其中所述免疫细胞抗原选自：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ和SLAMF7。
41.根据权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述疾病相关抗原是肿瘤相关抗原。
42.根据权利要求41所述的工程化免疫细胞，其中所述肿瘤相关抗原是CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRα、TCRβ、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、CS1、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R或TROP-2。
43.根据权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域结合至免疫细胞抗原结合，所述免疫细胞抗原结合选自：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ和SLAMF7，并且所述第二抗原结合结构域结合至CD19。
44.根据权利要求43所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域结合至CD3，并且所述第二抗原结合结构域结合至CD19。
45.根据权利要求43所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域结合至CD7，并且所述第二抗原结合结构域结合至CD19。
46.根据权利要求43所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域结合至CD137，并且所述第二抗原结合结构域结合至CD19。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞的一种或多种内源性人白细胞抗原(HLA)基因的表达保持完整。
48.根据权利要求47所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞的内源性HLA-I和/或HLA-II基因的表达保持完整。
49.根据权利要求47所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞的内源性HLA-E和/或HLA-G和/或HLA-C基因的表达保持完整。
50.根据权利要求1-46中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞的一种或多种内源性HLA基因的表达被上调。
51.根据权利要求50所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞的内源性HLA-E和/或HLA-G和/或HLA-C基因的表达被上调。
52.根据权利要求1-46中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞的内源性HLA-I、内源性HLA-II或两者的表达被抑制。
53.根据权利要求1-46中任一项所述的工程化免疫细胞，其中编码内源性HLA-I、内源性HLA-II或两者的基因被灭活。
54.根据权利要求1-46中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞的HLA-E或HLA-G被过表达。
55.根据权利要求1-46中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞的CD24、CD47、FASL和/或PD-1被过表达。
56.根据权利要求1-55中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞是T细胞、NKT细胞或NK细胞。
57.根据权利要求56所述的工程化免疫细胞，其中所述T细胞是αβT细胞或γδT细胞。
58.根据权利要求1-55中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞源自于干细胞。
59.根据权利要求58所述的工程化免疫细胞，其中所述干细胞是造血干细胞(HSC)或诱导型多能干细胞(iPSC)。
60.根据权利要求1-59中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞是自体细胞或同种异体细胞。
61.根据权利要求1-59中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞获自于患有病症的受试者。
62.根据权利要求1-59中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞获自于健康供体。
63.一种工程化免疫细胞，包含：
(a)一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，其包含结合部分，其中所述结合部分包含能够结合至免疫细胞抗原的第一抗原结合结构域和能够结合至疾病相关抗原的第二抗原结合结构域，其中所述一种或多种CAR中的每个CAR还包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；和
(b)能够增强所述工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分，
其中所述工程化免疫细胞的内源性T细胞受体(TCR)被灭活，且
其中与包含(a)中所述一种或多种CAR但不包含(b)中所述增强子部分的另外的工程化免疫细胞相比，所述工程化免疫细胞(i)在存在与所述工程化免疫细胞异源的细胞的情况下通过在体外保持存活至少约20天而表现出增强的持久性程度，(ii)在15天内表现出至少约10倍的增强的扩增程度，或(iii)对包含所述免疫细胞抗原或所述疾病相关抗原的靶细胞表现出增强的细胞毒性。
64.根据权利要求63所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞特征在于表现出(i)、(ii)和(iii)中的两个或多个。
65.根据权利要求63所述的工程化免疫细胞，其中在不存在任何外源性增强子部分的情况下测量(i)、(ii)和/或(iii)。
66.根据权利要求63所述的工程化免疫细胞，其中所述免疫细胞抗原选自：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ和SLAMF7。
67.根据权利要求66所述的工程化免疫细胞，其中所述免疫细胞抗原是CD7。
68.根据权利要求63所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分被配置为组成性地增强所述工程化免疫细胞的所述一种或多种活性。
69.根据权利要求68所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分被配置为组成性地上调所述工程化免疫细胞的一个或多个细胞内信号传导通路。
70.根据权利要求69所述的工程化免疫细胞，其中所述一个或多个细胞内信号传导通路是一个或多个细胞因子信号传导通路。
71.根据权利要求63所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分通过自寡聚化而自激活。
72.根据权利要求71所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分通过自二聚化而自激活。
73.根据权利要求63所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分是细胞因子或细胞因子受体。
74.根据权利要求63所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19，TGFRβ、同样的受体、其功能片段、其功能变体及其组合。
75.根据权利要求63所述的工程化免疫细胞，其中编码所述内源性TCR的亚基的基因被灭活，使得所述内源性TCR被灭活。
76.根据权利要求75所述的工程化免疫细胞，其中编码所述亚基的所述基因是TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ或CD3ζ。
77.根据权利要求63所述的工程化免疫细胞，其还包含诱导型细胞死亡部分，所述诱导型细胞死亡部分在与细胞死亡激活剂接触时实现所述工程化免疫细胞的自杀。
78.根据权利要求77所述的工程化免疫细胞，其中所述诱导型细胞死亡部分选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8、Her2t、CD30、BCMA和EGFRt。
79.根据权利要求78所述的工程化免疫细胞，其中所述诱导型细胞死亡部分是EGFRt，并且所述细胞死亡激活剂是结合EGFRt的抗体或其抗原结合片段。
80.根据权利要求78所述的工程化免疫细胞，其中所述诱导型细胞死亡部分是HSV-TK，并且所述细胞死亡激活剂是GCV。
81.根据权利要求78所述的工程化免疫细胞，其中所述诱导型细胞死亡部分是iCasp9，并且所述细胞死亡激活剂是AP1903。
82.根据权利要求77所述的工程化免疫细胞，其中所述细胞死亡激活剂包含核酸、多核苷酸、氨基酸、多肽、脂质、碳水化合物、小分子、酶、核糖体、蛋白酶体、其变体或任何它们的组合。
83.根据权利要求63所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞的一种或多种内源性人白细胞抗原(HLA)基因的表达保持完整。
84.根据权利要求83所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞的内源性HLA-I和/或HLA-II基因的表达保持完整。
85.根据权利要求83所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞的内源性HLA-E和/或HLA-G和/或HLA-C基因的表达保持完整。
86.根据权利要求63所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞的一种或多种内源性HLA基因的表达被上调。
87.根据权利要求86所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞的内源性HLA-E和/或HLA-G和/或HLA-C基因的表达被上调。
88.根据权利要求63-82中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞的内源性HLA-1、内源性HLA-II或两者的表达被抑制。
89.根据权利要求63-82中任一项所述的工程化免疫细胞，其中编码内源性HLA-1、内源性HLA-II或两者的基因被灭活。
90.根据权利要求63-82中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞的HLA-E或HLA-G被过表达。
91.根据权利要求63-82中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞的CD24、CD47、FASL和/或PD-1被过表达。
92.根据权利要求63所述的工程化免疫细胞，其中所述疾病相关抗原是肿瘤相关抗原。
93.根据权利要求63所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合结构域是scFv。
94.根据权利要求63所述的工程化免疫细胞，其中编码所述工程化免疫细胞的内源性表面标志物的基因被灭活，其中所述内源性表面标志物在表达时能够结合至所述第一抗原结合结构域。
95.根据权利要求94所述的工程化免疫细胞，其中所述内源性表面标志物是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ或SLAMF7。
96.根据权利要求63-95中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞是T细胞、NKT细胞或NK细胞。
97.根据权利要求63-95中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞源自于干细胞。
98.根据权利要求97所述的工程化免疫细胞，其中所述干细胞是造血干细胞(HSC)或诱导型多能干细胞(iPSC)。
99.根据权利要求63-95中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞是自体细胞或同种异体细胞。
100.根据权利要求63-95中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞获自患有病症的受试者。
101.根据权利要求63-95中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞获自于健康供体。
102.一种用于治疗疾病的药物组合物，其包含根据权利要求1-101中任一项所述的所述工程化免疫细胞和药学上可接受的载体。
103.一种治疗或诊断受试者中的疾病的方法，其包括向所述受试者施用权利要求102所述的药物组合物。
104.根据权利要求103所述的方法，其中所述药物组合物中的所述工程化免疫细胞源自于同种异体免疫细胞。
105.根据权利要求104所述的方法，其中源自于所述同种异体免疫细胞的所述工程化免疫细胞不会在所述受试者中诱导移植物抗宿主病(GvHD)。
106.根据权利要求103所述的方法，其中所述药物组合物中的所述工程化免疫细胞源自于自体免疫细胞。
107.根据权利要求103-106中任一项所述的方法，其中所述药物组合物中的所述工程化免疫细胞的内源性TCR是功能上灭活的。
108.根据权利要求107所述的方法，其中与具有功能上活性的TCR的另外的免疫细胞相比，所述工程化免疫细胞降低了所述受试者中的GvHD。
109.根据权利要求102-108中任一项所述的方法，其中所述疾病是癌症。
110.根据权利要求109中任一项所述的方法，其中所述癌症是淋巴瘤或白血病。
111.一种细胞，包含：
功能上灭活的T细胞受体(TCR)，和
一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，其中所述一种或多种CAR中的每个单个CAR包含结合部分，所述结合部分包含(i)第一抗原结合结构域，当施用于受试者时，所述第一抗原结合结构域抑制或减少所述受试者对所述工程化免疫细胞的免疫应答，和(ii)结合至疾病相关的抗原的第二抗原结合结构域，其中所述一种或多种CAR中的每个CAR还包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
112.根据权利要求111所述的细胞，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域通过接头连接。
113.根据权利要求112所述的细胞，其中所述接头不包含自切割肽。
114.根据权利要求111-113中任一项所述的细胞，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域从氨基末端到羧基末端排列为：
(i)VL2-VH1-VL1-VH2；
(ii)VH2-VL1-VH1-VL2；
(iii)VL1-VH2-VL2-VH1；
(iv)VH1-VL2-VH2-VL1；
(v)VL2-VL1-VH1-VH2；
(vi)VH2-VH1-VL1-VL2；
(vii)VL1-VL2-VH2-VH1；或
(viii)VH1-VH2-VL2-VL1，
其中VH1是所述第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是所述第一抗原结合结构域的轻链可变轻链结构域，VH2是所述第二抗原结合结构域的重链可变结构域，且VL2是所述第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。
115.根据权利要求111-113中任一项所述的细胞，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域从氨基末端到羧基末端排列为：
(i)VL2-VH2-VL1-VH1；
(ii)VL2-VH2-VH1-VL1；
(iii)VL1-VH1-VL2-VH2；
(iv)VL1-VH1-VH2-VL2；
(v)VH2-VL2-VL1-VH1；
(vi)VH2-VL2-VH1-VL1；
(vii)VH1-VL1-VL2-VH2；或
(viii)VH1-VL1-VH2-VL2，
其中VH1是所述第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是所述第一抗原结合结构域的轻链可变轻链结构域，VH2是所述第二抗原结合结构域的重链可变结构域，且VL2是所述第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。
116.根据权利要求111-115中任一项所述的细胞，其中编码所述细胞的内源性TCR的亚基的基因被灭活，从而产生所述功能上灭活的TCR。
117.根据权利要求116所述的细胞，其中编码所述亚基的所述基因是TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ或CD3ζ。
118.根据权利要求111-117中任一项所述的细胞，其中所述第一抗原结合结构域结合至免疫细胞抗原。
119.根据权利要求118所述的细胞，其中所述免疫细胞抗原是免疫细胞的表面蛋白或分泌型蛋白。
120.根据权利要求119所述的细胞，其中所述免疫细胞是NK细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞或粒细胞。
121.根据权利要求118-120中任一项所述的细胞，其中所述免疫细胞抗原是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ或SLAMF7。
122.根据权利要求111-121中任一项所述的细胞，其中所述疾病相关抗原是肿瘤相关抗原。
123.根据权利要求122所述的细胞，其中所述肿瘤相关抗原是CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRα、TCRβ、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、CS1、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R或TROP-2。
124.根据权利要求111所述的细胞，其中所述第一抗原结合结构域结合至免疫细胞抗原，所述免疫细胞抗原选自：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ和SLAMF7，并且所述第二抗原结合结构域结合至CD19。
125.根据权利要求124所述的细胞，其中所述第一抗原结合结构域结合至CD3，并且所述第二抗原结合结构域结合至CD19。
126.根据权利要求124所述的细胞，其中所述第一抗原结合结构域结合至CD7，并且所述第二抗原结合结构域结合至CD19。
127.根据权利要求124所述的细胞，其中所述第一抗原结合结构域结合至CD137，并且所述第二抗原结合结构域结合至CD19。
128.根据权利要求111-127中任一项所述的细胞，其还包含增强子部分，所述增强子部分增强工程化免疫细胞的一种或多种活性。
129.根据权利要求128所述的细胞，其中所述增强子部分被配置为组成性地增强所述工程化免疫细胞的所述一种或多种活性。
130.根据权利要求128所述的细胞，其中所述增强子部分被配置为组成性地上调所述工程化免疫细胞的一个或多个细胞内信号传导通路。
131.根据权利要求128所述的细胞，其中所述一个或多个细胞内信号传导通路是一个或多个细胞因子信号传导通路。
132.根据权利要求131所述的细胞，其中所述增强子部分是细胞因子或细胞因子受体。
133.根据权利要求128-132中任一项所述的细胞，其中所述增强子部分选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19，TGFRβ、同样的受体、其功能片段、其功能变体及其组合。
134.根据权利要求111-133中任一项所述的细胞，其还包含诱导型细胞死亡部分，所述诱导型细胞死亡部分在所述诱导型细胞死亡部分与细胞死亡激活剂接触时能够实现所述细胞的死亡。
135.根据权利要求134所述的细胞，其中所述诱导型细胞死亡部分选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8、Her2t、CD30、BCMA和EGFRt。
136.根据权利要求135所述的细胞，其中所述诱导型细胞死亡部分是EGFRt，并且所述细胞死亡激活剂是结合EGFRt的抗体或其抗原结合片段。
137.根据权利要求135所述的细胞，其中所述诱导型细胞死亡部分是HSV-TK，并且所述细胞死亡激活剂是GCV。
138.根据权利要求135所述的细胞，其中所述诱导型细胞死亡部分是iCasp9，并且所述细胞死亡激活剂是AP1903。
139.根据权利要求111-138中任一项所述的细胞，其中编码所述细胞的内源性表面标志物的基因被灭活，其中所述内源性表面标志物在表达时能够结合至所述第一抗原结合结构域。
140.根据权利要求139所述的细胞，其中所述内源性表面标志物是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ或SLAMF7。
141.一种核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第一序列，其中所述CAR包含结合部分，所述结合部分包含(i)第一抗原结合结构域，当施用于受试者中时，所述第一抗原结合结构域抑制或减少所述受试者对所述工程化免疫细胞的免疫应答，所述受试者连接至(ii)第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域能够结合至疾病相关的抗原，且其中所述一种或多种CAR中的每个CAR还包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
142.根据权利要求141所述的核酸分子，其中所述第一抗原结合结构域结合至抗原，所述抗原选自：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ和SLAMF7。
143.根据权利要求141或142所述的核酸分子，其中所述第二抗原结合结构域结合至CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRα、TCRβ、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白(Frizzled)、OX40、Notch-1-4、APRIL、CS1、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R或TROP-2。
144.根据权利要求141-143中任一项所述的核酸分子，其还包含编码增强子部分的第二序列，当在细胞中表达时，所述增强子部分增强所述CAR的一种或多种活性。
145.根据权利要求144所述的核酸分子，其中所述增强子部分选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19，TGFRβ、同样的受体、其功能片段、其功能变体及其组合。
146.根据权利要求141-143中任一项所述的核酸分子，其还包含编码诱导型细胞死亡部分的第二序列，当在细胞中表达时，所述诱导型细胞死亡部分在所述诱导型细胞死亡部分与细胞死亡激活剂接触时实现所述细胞的死亡。
147.根据权利要求146所述的核酸分子，其中所述诱导型细胞死亡部分选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8、Her2t、CD30、BCMA和EGFRt。
148.根据权利要求141-147中任一项所述的核酸分子，其还包含侧接所述第一序列和所述第二序列的第三序列，其中所述第三序列编码可切割接头。
149.根据权利要求148所述的核酸分子，其中所述可切割接头是自切割肽。
150.根据权利要求141-149中任一项所述的核酸分子，其还包含调节所述第一序列和/或所述第二序列的表达的调节序列。
151.一种试剂盒，其包含根据权利要求141-150中任一项所述的核酸分子。
152.一种产生工程化细胞的方法，其包括(a)将权利要求141-150中任一项所述的所述核酸分子递送到细胞中；和(b)在所述细胞中表达所述核酸分子，从而产生所述工程化细胞。
153.一种工程化免疫细胞，其包含：
增强子部分，其能够增强所述工程化免疫细胞的一种或多种活性；
嵌合抗原受体(CAR)，其包含特异性结合CD7的抗原结合结构域，其中所述CAR还包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；
其中所述工程化免疫细胞的内源性CD7被灭活。
154.根据权利要求153所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分选自：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、PD-1、PD-L1、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19和TGFRβ、同样的受体及其组合。
155.根据权利要求153或154所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞的内源性T细胞受体(TCR)被灭活。
156.根据权利要求153-155中任一项所述的工程化免疫细胞，其还包含多肽，所述多肽包含能够在使所述多肽与细胞死亡激活剂接触时能够实现所述工程化免疫细胞的死亡的诱导型细胞死亡部分。
157.根据权利要求156所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分是所述多肽的一部分。
158.根据权利要求153-157中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分不是所述CAR的一部分。
159.根据权利要求153-157中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分是所述CAR的一部分。
160.根据权利要求153-159中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞是T细胞、NKT细胞或NK细胞。
161.根据权利要求153-159中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞源自于干细胞。
162.根据权利要求161所述的工程化免疫细胞，其中所述干细胞是造血干细胞(HSC)或诱导型多能干细胞(iPSC)。
163.根据权利要求153-159中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞是自体细胞或同种异体细胞。
164.根据权利要求153-159中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞获自于患有病症的受试者。
165.根据权利要求153-159中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞获自于健康供体。
166.一种产生根据权利要求153-165中任一项所述的工程化免疫细胞的方法，其包括：(a)将编码(i)所述增强子部分和(ii)所述CAR的一种或多种核酸分子递送至免疫细胞中；和(b)在所述免疫细胞中表达所述一种或多种核酸分子，从而产生所述工程化免疫细胞。
167.根据权利要求166所述的方法，其中单一核酸分子编码(i)所述增强子部分和(ii)所述CAR。
168.根据权利要求167所述的方法，其中所述单一核酸分子包含侧接(i)所述增强子部分和(ii)所述CAR的自切割肽。
169.根据权利要求167所述的方法，其中所述单一核酸分子不包含侧接(i)所述增强子部分和(ii)所述CAR的自切割肽。
170.根据权利要求166所述的方法，其中(i)第一核酸分子编码所述增强子部分，和(ii)第二核酸分子编码所述CAR。
171.一种在受试者中治疗或诊断病症的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求153-165中任一项所述的所述工程化免疫细胞。
172.根据权利要求171所述的方法，其中所述工程化免疫细胞源自于所述受试者的自体免疫细胞。
173.根据权利要求171所述的方法，其中所述工程化免疫细胞源自于同种异体免疫细胞。
174.根据权利要求171-173中任一项所述的方法，其中所述病症是癌症。
175.一种工程化免疫细胞，其包含：
单嵌合抗原受体(CAR)，所述单嵌合抗原受体(CAR)包含(i)特异性结合CD7的第一抗原结合结构域和(ii)能够结合至疾病相关的抗原的第二抗原结合结构域，所述CAR还包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，
其中编码内源性CD7的基因在所述工程化免疫细胞中被灭活。
176.根据权利要求175所述的工程化免疫细胞，其还包含能够增强所述工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分。
177.根据权利要求176所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分选自：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、PD-1、PD-L1、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19和TGFRβ、同样的受体及其组合。
178.根据权利要求175-177中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞的内源性T细胞受体(TCR)被灭活。
179.根据权利要求175-178中任一项所述的工程化免疫细胞，其还包含多肽，所述多肽包含诱导型细胞死亡部分，该诱导型细胞死亡部分能够在所述多肽与细胞死亡激活剂接触时实现所述工程化免疫细胞的死亡。
180.根据权利要求179所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分是所述多肽的一部分。
181.根据权利要求175-180中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞是T细胞、NKT细胞或NK细胞。
182.根据权利要求175-180中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞源自于干细胞。
183.根据权利要求182所述的工程化免疫细胞，其中所述干细胞是造血干细胞(HSC)或诱导型多能干细胞(iPSC)。
184.根据权利要求175-180中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞是自体细胞或同种异体细胞。
185.根据权利要求175-180中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞获自于患有病症的受试者。
186.根据权利要求175-180中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞获自于健康供体。
187.一种产生根据权利要求175-186中任一项所述的工程化免疫细胞的方法，其包括(a)将编码所述单一CAR的一种或多种核酸分子递送至免疫细胞中；和(b)在所述免疫细胞中表达所述一种或多种核酸分子，从而产生所述工程化免疫细胞。
188.根据权利要求187所述的方法，其中单一核酸分子编码所述单一CAR。
189.一种在受试者中治疗或诊断病症的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求175-186中任一项所述的所述工程化免疫细胞。
190.根据权利要求189所述的方法，其中所述工程化免疫细胞源自于所述受试者的自体免疫细胞。
191.根据权利要求189所述的方法，其中所述工程化免疫细胞源自于同种异体免疫细胞。
192.根据权利要求189-191中任一项所述的方法，其中所述病症是癌症。
193.一种递送同种异体细胞疗法的方法，包括：向有需要的受试者施用工程化免疫细胞的群体，所述群体中的单个工程化免疫细胞包含：
(a)一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，其包含结合部分，其中所述结合部分包含能够结合至免疫细胞抗原的第一抗原结合结构域和能够结合至疾病相关抗原的第二抗原结合结构域，当施用于所述受试者时，所述第一抗原结合结构域抑制或降低受试者对所述工程化免疫细胞的免疫应答；
(b)能够增强所述工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分，
其中所述工程化免疫细胞的内源性T细胞受体(TCR)被灭活，且
其中与包含(a)中所述一种或多种CAR但不包含(b)中所述增强子部分的另外的工程化免疫细胞相比，所述工程化免疫细胞(i)通过在存在与所述工程化免疫细胞异源的细胞的情况下在体外保持存活至少约20天而表现出增强的持久性程度，(ii)在15天内表现出至少约10倍的增强的扩增程度，或(iii)对包含所述免疫细胞抗原或所述疾病相关抗原的靶细胞表现出增强的细胞毒性。
194.根据权利要求193所述的方法，其中单独施用所述工程化免疫细胞的群体而不使用另外的增殖剂(i)通过在存在与所述工程化免疫细胞异源的细胞的情况下在体外保持存活至少约20天产生增强的持久性程度，(ii)在15天内产生至少约10倍的增强的扩增程度，或(iii)对包含所述免疫细胞抗原或所述疾病相关抗原的靶细胞产生增强的细胞毒性。
195.根据权利要求194所述的方法，其中所述另外的增殖剂是细胞因子。
196.根据权利要求193-195中任一项所述的方法，其中所述一种或多种CAR中的每个CAR还包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中当施用于受试者时，所述第一抗原结合结构域抑制或减少所述受试者对所述工程化免疫细胞的免疫应答。
197.根据权利要求193-196中任一项所述的方法，其中所述单个工程化免疫细胞的内源性CD7被灭活。
198.根据权利要求193-197中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是CD7。
199.根据权利要求193-198中任一项所述的方法，其中所述增强子部分被配置为组成性地增强所述单个工程化免疫细胞的所述一种或多种活性。
200.根据权利要求193-199中任一项所述的方法，其中所述增强子部分被配置为组成性地上调所述工程化免疫细胞的一个或多个细胞内信号传导通路。
201.根据权利要求200所述的方法，其中所述一个或多个细胞内信号传导通路是一个或多个细胞因子信号传导通路。
202.根据权利要求193-201中任一项所述的方法，其中所述增强子部分通过自寡聚化自激活。
203.根据权利要求193-201中任一项所述的方法，其中所述增强子部分通过自二聚化自激活。
204.根据权利要求193-203中任一项所述的方法，其中所述增强子部分是细胞因子或细胞因子受体。
205.根据权利要求193-204中任一项所述的方法，其中所述增强子部分选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19，TGFRβ、同样的受体、其功能片段、其功能变体及其组合。
206.根据权利要求193-205中任一项所述的方法，其中编码所述内源性TCR的亚基的基因被灭活，使得所述内源性TCR被灭活。
207.根据权利要求206所述的方法，其中编码所述亚基的所述基因是TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ或CD3ζ。
208.根据权利要求193-207中任一项所述的方法，其中所述单个工程化免疫细胞还包含诱导型细胞死亡部分，所述诱导型细胞死亡部分在与细胞死亡激活剂接触时实现所述工程化免疫细胞的自杀。
209.根据权利要求208所述的方法，其中所述诱导型细胞死亡部分选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8、Her2t、CD30、BCMA和EGFRt。
210.根据权利要求209所述的方法，其中所述诱导型细胞死亡部分是EGFRt，并且所述细胞死亡激活剂是结合EGFRt的抗体或其抗原结合片段。
211.根据权利要求209所述的方法，其中所述诱导型细胞死亡部分是HSV-TK，并且所述细胞死亡激活剂是GCV。
212.根据权利要求209所述的方法，其中所述诱导型细胞死亡部分是iCasp9，并且所述细胞死亡激活剂是AP1903。
213.根据权利要求208所述的方法，其中所述细胞死亡激活剂包含核酸、多核苷酸、氨基酸、多肽、脂质、碳水化合物、小分子、酶、核糖体、蛋白酶体、其变体或任何它们的组合。
214.根据权利要求193-213中任一项所述的方法，其中所述单个工程化免疫细胞的一种或多种内源性人白细胞抗原(HLA)基因的表达保持完整。
215.根据权利要求214所述的方法，其中所述单个工程化免疫细胞的内源性HLA-I和/或HLA-II基因的表达保持完整。
216.根据权利要求214所述的方法，其中所述单个工程化免疫细胞的内源性HLA-E和/或HLA-G和/或HLA-C基因的表达保持完整。
217.根据权利要求214所述的方法，其中所述单个工程化免疫细胞的一种或多种内源性HLA基因的表达被上调。
218.根据权利要求214所述的方法，其中所述单个工程化免疫细胞的内源性HLA-E和/或HLA-G和/或HLA-C基因的表达被上调。
219.根据权利要求193-213中任一项所述的方法，其中所述单个工程化免疫细胞的内源性HLA-I、内源性HLA-II或两者的表达被抑制。
220.根据权利要求193-213中任一项所述的方法，其中编码内源性HLA-I、内源性HLA-II或两者的基因被灭活。
221.根据权利要求193-213中任一项所述的方法，其中所述工程化免疫细胞的HLA-E或HLA-G被过表达。
222.根据权利要求193-213中任一项所述的方法，其中所述工程化免疫细胞的CD24、CD47、FASL和/或PD-1被过表达。
223.根据权利要求193-222中任一项所述的方法，其中所述疾病相关抗原是肿瘤相关抗原。
224.根据权利要求193-223中任一项所述的方法，其中所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合结构域是scFv。
225.根据权利要求193-224中任一项所述的方法，其中所述单个工程化免疫细胞是T细胞、NKT细胞或NK细胞。
226.根据权利要求193-224中任一项所述的方法，其中所述个体工程化免疫细胞源自于干细胞。
227.根据权利要求226所述的方法，其中所述干细胞是造血干细胞(HSC)或诱导型多能干细胞(iPSC)。
228.根据权利要求193-224中任一项所述的方法，其中所述单个工程化免疫细胞是同种异体细胞。
229.根据权利要求193-224中任一项所述的方法，其中所述单个工程化免疫细胞获自于健康供体。
230.一种细胞，其包含：
(a)一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，其包含结合部分，其中所述结合部分包含能够结合至免疫细胞抗原的抗原结合结构域，其中所述一种或多种CAR中的每个CAR还包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；和
(b)能够增强所述细胞的一种或多种活性的增强子部分，
其中所述细胞的内源性T细胞受体(TCR)被灭活。
231.根据权利要求230所述的细胞，其中所述增强子部分增强所述细胞的一种或多种活性。
232.根据权利要求230所述的细胞，其中所述增强子部分被配置为组成性地增强所述细胞的所述一种或多种活性。
233.根据权利要求230所述的细胞，其中所述增强子部分被配置为组成性地上调所述细胞的一个或多个细胞内信号传导通路。
234.根据权利要求230所述的细胞，其中所述一个或多个细胞内信号传导通路是一个或多个细胞因子信号传导通路。
235.根据权利要求230所述的细胞，其中所述增强子部分是细胞因子或细胞因子受体。
236.根据权利要求230所述的细胞，其中所述增强子部分选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19，TGFRβ、同样的受体、其功能片段、其功能变体及其组合。
237.根据权利要求230-236中任一项所述的细胞，其还包含诱导型细胞死亡部分，所述诱导型细胞死亡部分在所述诱导型细胞死亡部分与细胞死亡激活剂接触时能够实现所述细胞的死亡。
238.根据权利要求237所述的细胞，其中所述诱导型细胞死亡部分选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8、Her2t、CD30、BCMA和EGFRt。
239.根据权利要求237所述的细胞，其中所述诱导型细胞死亡部分是EGFRt，并且所述细胞死亡激活剂是结合EGFRt的抗体或其抗原结合片段。
240.根据权利要求237所述的细胞，其中所述诱导型细胞死亡部分是HSV-TK，并且所述细胞死亡激活剂是GCV。
241.根据权利要求237所述的细胞，其中所述诱导型细胞死亡部分是iCasp9，并且所述细胞死亡激活剂是AP1903。
242.根据权利要求230-241中任一项所述的细胞，其中编码所述细胞的内源性表面标志物的基因被灭活，其中所述内源性表面标志物在表达时能够结合至所述第一抗原结合结构域。
243.根据权利要求242所述的细胞，其中所述内源性表面标志物是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ或SLAMF7。
244.一种用于治疗淋巴恶性肿瘤的方法，其包括向有需要的患者施用工程化免疫细胞的群体，其中所述群体中的单个工程化免疫细胞包含：
(a)一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，其包含结合部分，其中所述结合部分包含能够结合至免疫细胞抗原的抗原结合结构域，其中所述一种或多种CAR中的每个CAR还包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；和
(b)能够增强所述工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分，
其中所述工程化免疫细胞的内源性T细胞受体(TCR)被灭活，
其中(i)在最后给予所述工程化免疫细胞后的3周内，外周血中受影响的细胞数或骨髓中受影响的细胞数减少至少50％，和(ii)在最后给予所述工程化免疫细胞后的3周内，外周血中的自体T细胞、粒细胞和NK细胞中的任何一种或多种的数量开始增加。
245.根据权利要求244所述的方法，其中所述增强子部分增强所述工程化免疫细胞的一种或多种活性。
246.根据权利要求244所述的方法，其中所述增强子部分被配置为组成性地增强所述工程化免疫细胞的所述一种或多种活性。
247.根据权利要求244所述的方法，其中所述增强子部分被配置为组成性地上调所述工程化免疫细胞的一个或多个细胞内信号传导通路。
248.根据权利要求244所述的方法，其中所述一个或多个细胞内信号传导通路是一个或多个细胞因子信号传导通路。
249.根据权利要求244所述的方法，其中所述增强子部分是细胞因子或细胞因子受体。
250.根据权利要求244所述的方法，其中所述增强子部分选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19，TGFRβ、同样的受体、其功能片段、其功能变体及其组合。
251.根据权利要求244-250中任一项所述的方法，其中所述工程化免疫细胞还包含诱导型细胞死亡部分，所述诱导型细胞死亡部分在所述诱导型细胞死亡部分与细胞死亡激活剂接触时能够实现所述细胞的死亡。
252.根据权利要求251所述的方法，其中所述诱导型细胞死亡部分选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8、Her2t、CD30、BCMA和EGFRt。
253.根据权利要求251所述的方法，其中所述诱导型细胞死亡部分是EGFRt，并且所述细胞死亡激活剂是结合EGFRt的抗体或其抗原结合片段。
254.根据权利要求251所述的方法，其中所述诱导型细胞死亡部分是HSV-TK，并且所述细胞死亡激活剂是GCV。
255.根据权利要求251所述的方法，其中所述诱导型细胞死亡部分是iCasp9，并且所述细胞死亡激活剂是AP1903。
256.根据权利要求244-255中任一项所述的方法，其中编码所述细胞的内源性表面标志物的基因被灭活，其中所述内源性表面标志物在表达时能够结合至所述第一抗原结合结构域。
257.根据权利要求256所述的方法，其中所述内源性表面标志物是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ或SLAMF7。
258.根据权利要求244所述的方法，其中在外周血中的受影响细胞数量或骨髓中的受影响细胞数量减少至少50％之前，外周血中的自体T细胞、粒细胞和NK细胞中的任何一种或多种的数量开始增加。
259.根据权利要求244所述的方法，其中在外周血中的受影响细胞数量或骨髓中的受影响细胞数量减少至少50％之后，外周血中的自体T细胞、粒细胞和NK细胞中的任何一种或多种的数量开始增加。
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