CN113603778A

CN113603778A - 一种封闭抗体及其在制备靶向t细胞表达抗原的car-t细胞中的应用

Info

Publication number: CN113603778A
Application number: CN202110902776.2A
Authority: CN
Inventors: 余宙; 叶晶; 徐南; 谭静雯; 康立清
Original assignee: Shanghai Unicar Therapy Bio Medicine Technology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Unicar Therapy Bio Medicine Technology Co Ltd
Priority date: 2021-08-06
Filing date: 2021-08-06
Publication date: 2021-11-05
Also published as: WO2023010961A1

Abstract

本发明提供一种封闭抗体及其在制备靶向T细胞表达抗原的CAR‑T细胞中的应用。该封闭抗体的重链可变区和轻链可变区分别与待封闭的CAR‑T细胞的scFv的重链可变区和轻链可变区相同；所述待封闭的CAR‑T细胞的scFv靶向T细胞表达抗原。本发明还提供一种含该封闭抗体和待封闭的CAR‑T细胞的药物组合物，一种结合有本发明的封闭抗体的靶向T细胞表达抗原的CAR‑T细胞及其制备方法。本发明采用与嵌合抗原受体(CAR)相同结合域的游离抗体，阻断(封闭)CAR‑T细胞与T细胞表面抗原的结合以克服靶向T细胞表达抗原的CAR‑T细胞的自相残杀问题。本发明的方法简易、安全、有效，为临床治疗肿瘤提供了新思路。

Description

一种封闭抗体及其在制备靶向T细胞表达抗原的CAR-T细胞中的应用

技术领域：

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种封闭抗体及其在制备靶向T细胞表达抗原的CAR-T细胞中的应用。

背景技术：

急性淋巴细胞白血病(ALL)是一种常见的恶性血液疾病，因造血干细胞增殖和分化能力不平衡导致淋巴细胞的成熟和功能异常，其中儿童群体发病率占据15％。T急性淋巴细胞白血病(T-ALL)具有高度的侵袭性特征，30％患者会恶化为复发或难治性T-ALL(r/rT-ALL)，且获得三年无事件生存期的复发患者不足15％。一般来说T细胞恶性肿瘤的恶性程度高于B细胞恶性肿瘤，这也为T-ALL的治疗带来更大的挑战。目前奈拉滨(Nelarabine)是唯一由FDA批准的用于r/rT-ALL的药物，但是临床数据显示单药用药情况下中位生存期仅为8个月。因此亟需新的治疗药物和治疗手段改善T-ALL治疗现状。

采用嵌合抗原受体(CAR)修饰T细胞的过继性免疫疗法是攻克血液疾病领域尤其是B-ALL的突破性里程碑，目前已经有针对CD19、BCMA、CD20、CD22等明星靶点的CAR-T细胞制剂进入临床实验甚至用于治疗25岁以下难治复发性B细胞急性淋巴白血病(r/r B-ALL)的靶向CD19抗原的CAR-T细胞制剂tisagenlecleucel(商品名:Kymriah)被FDA批准上市，为T细胞恶性肿瘤的靶向免疫治疗提供了新的思路和理论基础。

目前CD1a、CD5、CD7(Gomes-Silva,D.,et al.,CD7 CAR T Cells for theTherapy of Acute Myeloid Leukemia.Mol Ther,2019.27(1):p.272-280。Gomes-Silva,D.,et al.,CD7-edited T cells expressing a CD7-specific CAR for the therapy ofT-cell malignancies.Blood,2017.130(3):p.285-296。Cooper,M.L.and J.F.DiPersio,Chimeric antigen receptor T cells(CAR-T)for the treatment of T-cellmalignancies.Best Pract Res Clin Haematol,2019.32(4):p.101097)是T-ALL主要的研究靶标，但CD1a分子仅短暂表达在皮质胸腺细胞(cortical thymocytes)，CD5分子表达水平低不利于CART细胞的靶向识别。而CD7分子是一个大小为40kDa的单链糖蛋白分子，属于免疫球蛋白超家族，类似于CD28分子，是与T细胞激活及有丝分裂相关的共刺激分子，在进入胸腺直到外周血一直处于稳定高表达状态。临床数据显示肿瘤细胞表面的CD7分子表达量始终高于正常T细胞，是CAR-T细胞制剂免疫疗法的理想靶标。

相对治疗B细胞白血病的CAR-T细胞制剂，开发靶向CD7抗原的CAR-T细胞制剂难点之一T肿瘤细胞和正常T淋巴细胞共同表达CD7抗原分子，导致靶向CD7抗原的CAR-T细胞会同时攻击正常T淋巴细胞和T肿瘤细胞，在体外无法制备得到满足临床需求的CD7靶向CART细胞。目前主要报道的策略是基因编辑敲除CD7分子或者内质网滞留CD7分子(Gomes-Silva,D.,et al.,CD7-edited T cells expressing a CD7-specific CAR for thetherapy of T-cell malignancies.Blood,2017.130(3):p.285-296。Png,Y.T.,et al.,Blockade of CD7 expression in T cells for effective chimeric antigen receptortargeting of T-cell malignancies.Blood Adv,2017.1(25):p.2348-2360)，获得CD7阴性的T细胞，但是这两种技术会引入“脱靶(off-target)”等不可控的风险因素，且T淋巴细胞膜表面CD7分子的缺失是否会影响尚未被挖掘的生物功能尚不可知。这似乎表明需要创新方法，例如CRISPR/Cas9基因组编辑或蛋白质表达阻断剂，在CAR转导之前破坏T细胞中的靶抗原，以避免广泛的自身抗原驱动的自相残杀。

除CD7外，CD3、CD4、CD8、CD38、CD34、nTdT、CD99、CD1a、CD10、cyCD3、CD5和CD2也在T细胞表面上有表达。

发明内容：

为了避免经过CAR改造后的T细胞受到自身抗原驱动的自相残杀，本发明公开了一种不同于基因编辑敲除T细胞表达抗原或者内质网滞留T细胞表达抗原的技术原理。该技术原理是采用与嵌合抗原受体(CAR)相同结合域的游离抗体，阻断(封闭)CAR-T细胞与T细胞表面抗原的结合以克服靶向T细胞表达抗原的CAR-T细胞在制备和使用过程中的自相残杀问题，达到了良好的效果。通过封闭T细胞表面抗原，比如CD7分子的方法所制备获得的CAR-T细胞可以稳步扩增，同时具备特异靶向杀伤肿瘤细胞的功能。本发明的方法简易、安全、有效，为临床治疗T-ALL提供了新思路。

本发明提供一种封闭抗体，其特征在于，所述封闭抗体的重链可变区和轻链可变区分别与待封闭的CAR-T细胞的scFv的重链可变区和轻链可变区相同；所述待封闭的CAR-T细胞的scFv靶向T细胞表达抗原。

进一步地，所述T细胞表达抗原选自CD7、CD3、CD4、CD8、CD38、CD34、nTdT、CD99、CD1a、CD10、cyCD3、CD5和CD2中的一种或多种。

进一步地，所述T细胞表达抗原为CD7；所述待封闭的CAR-T细胞的scFv为CD7scFv；所述封闭抗体的重链可变区包含与所述CD7 scFv的重链可变区的氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；所述封闭抗体的轻链可变区包含与所述CD7 scFv的轻链可变区的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。

进一步地，所述CD7 scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示或如SEQ ID NO.21所示；所述CD7 scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示或如SEQ ID NO.23所示。

进一步地，所述CD7 scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；所述CD7 scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；所述封闭抗体的重链可变区包含与所述CD7 scFv的重链可变区的氨基酸序列具有至少62.96％同源性的氨基酸序列；所述封闭抗体的轻链可变区包含与所述CD7 scFv的轻链可变区的氨基酸序列具有至少53.66％同源性的氨基酸序列。

SEQ ID NO.15与SEQ ID NO.21之间存在62.96％的同源性；SEQ ID NO.17与SEQID NO.23之间存在53.66％的同源性。

进一步地，所述封闭抗体的重链可变区的氨基酸序列选自如下a1)-a4)任意一种的氨基酸序列：

a1)SEQ ID NO.15；a2)SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列经过添加、缺失、修饰和/或保守性置换至少1个氨基酸残基获得的氨基酸序列；a3)SEQ ID NO.21；a4)SEQ ID NO.21所示的氨基酸序列经过添加、缺失、修饰和/或保守性置换至少1个氨基酸残基获得的氨基酸序列；

所述封闭抗体的轻链可变区的氨基酸序列选自如下b1)-b4)任意一种的氨基酸序列：

b1)SEQ ID NO.17；b2)SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列经过添加、缺失、修饰和/或保守性置换至少1个氨基酸残基获得的氨基酸序列；b3)SEQ ID NO.23；b4)SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列经过添加、缺失、修饰和/或保守性置换至少1个氨基酸残基获得的氨基酸序列。

进一步地，所述封闭抗体包含所述轻链可变区、所述重链可变区、连接序列linker、Fc区和His标签；所述Fc区为人源lgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc段。

进一步地，所述连接序列linker可为任意一种所有曾经出现在抗体的轻链可变区和重链可变区之间起到连接作用的氨基酸片段。

进一步地，所述连接序列linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示、如SEQ IDNO.26所示、如SEQ ID NO.27所示或如SEQ ID NO.28所示。

本发明还提供一种靶向T细胞表达抗原的CAR-T细胞，所述靶向T细胞表达抗原的CAR-T细胞上结合有如上所述的封闭抗体。

另一方面，本发明还公开了如上所述的靶向T细胞表达抗原的CAR-T细胞的制备方法，将所述封闭抗体添加至所述待封闭的CAR-T细胞的培养体系中，防止所述待封闭的CAR-T细胞在培养中的自我损伤，得到所述靶向T细胞表达抗原的CAR-T细胞。

进一步地，包括以下步骤：

步骤一、制备所述待封闭的CAR-T细胞；

步骤二、制备所述封闭抗体；

步骤三、加入所述步骤二得到的封闭抗体到培养基中，使得所述封闭抗体在所述培养基中的浓度为0.5-3μg/mL，得到添加有封闭抗体的培养基；采用所述添加有封闭抗体的培养基培养所述步骤一得到的待封闭的CAR-T细胞，得到所述靶向T细胞表达抗原的CAR-T细胞。

进一步地，所述添加有封闭抗体的培养基中所述封闭抗体在所述培养基中的浓度为0.72-2.88μg/mL，优选地，为0.72μg/mL。

本发明还提供一种含封闭抗体和待封闭的CAR-T细胞的药物组合物，包含如上所述的封闭抗体和所述待封闭的CAR-T细胞。

第三方面，本发明还公开了一种应用，如上所述的封闭抗体、如上所述的靶向T细胞表达抗原的CAR-T细胞，和/或如上所述含封闭抗体和待封闭的CAR-T细胞的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

进一步地，所述肿瘤为免疫系统引发的肿瘤。

进一步地，所述免疫系统引发的肿瘤为急性淋巴细胞白血病、髓系白血病，骨髓瘤，淋巴瘤中的一种或者多种。

进一步地，所述急性淋巴细胞白血病为T急性淋巴细胞白血病。

如本文所用，术语“scFv”抗体即单链Fv抗体，其中重链可变区和轻链可变区(直接地或通过连接序列linker)连接在一起以形成连续的多肽。连接序列linker是一种多肽，也称为肽接头。

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“抗原结合片段”或“fab段”或“fab”由轻链的可变区(VL)、轻链的恒定区(CL)、重链的可变区(VH)、重链的恒定区1(CH1)结构域组成，可与抗原结合。

如本文所用，术语“治疗”、“疗法”和“医治”可以互换使用。术语“治疗”包括控制疾病、病症、病况的进展和相关症状，优选减少疾病、病症、病况或减轻疾病、病症、病况的一种或多种症状的影响。此术语包括治愈疾病或完全消除症状。此术语包括症状得到缓解。此术语还包括但不限于非治愈性的姑息性治疗。术语“治疗”包括给受试者施用治疗有效量的包含本发明的重组蛋白或融合蛋白的药物组合物，以预防或延迟、减轻或缓解疾病、病症、病况的进展或疾病、病症、病况的一种或多种症状的影响。

如本文所用，术语“施用”是指将治疗有效量的包含本发明的重组蛋白或融合蛋白的药物组合物递送至受试者。施用可以全身施用也可以局部施用。施用可以通过施用装置进行，例如注射器。施用方式包括但不限于包埋、鼻吸、喷雾、注射等。施用途径包括吸入、鼻内、口服、静脉内、皮下或肌内施用等。

目前制备抗靶向T细胞表达抗原的CAR-T细胞报道的主要是两种方式，一种方式是利用CRISPR/Cas9技术对T细胞中的CD7等T细胞表面抗原表达进行敲除操作。虽然CRISPR/Cas9技术可以对多种细胞进行有效的基因编辑，但是，该技术也会带来诸多风险，如除靶标基因的编辑(disrup the target antigen)后的影响不确定外，还会产生脱靶效应。因此在表型研究中，一是很难确定观察到的表型变化是否是由靶基因的预期修饰引起的，二是无法评估脱靶引起的基因组其他序列的随机突变的影响大小(Kimberland,M.L.,et al.,Strategies for controlling CRISPR/Cas9 off-target effects and biologicalvariations in mammalian genome editing experiments.Journal of biotechnology,2018.284。Khalaf,K.,et al.,CRISPR/Cas9 in Cancer Immunotherapy:Animal Modelsand Human Clinical Trials.Genes,2020.11(8)。Cai,W.,et al.,SpatiotemporalDelivery of CRISPR/Cas9 Genome Editing Machinery Using Stimuli-ResponsiveVehicles.Angewandte Chemie(International ed.in English),2020)。另一种方式是Png等利用抑制高尔基体转运的方法研发设计了PEBL-CART细胞，该CAR-T细胞可以将CD7保留在细胞内，且该研究证明，抑制高尔基体转运的方法对CAR-T细胞的功能和增殖没有影响(Png,Y.T.,et al.,Blockade of CD7 expression in T cells for effective chimericantigen receptor targeting of T-cell malignancies.Blood Adv,2017.1(25):p.2348-2360)，但是可能是因为CD28分子弥补了CD7分子的缺失，所以CD28分子功能受损的情况下CD7信号传递是否仍无足轻重尚未有人报道(Lee,D.M.,et al.,Immunologiccharacterization of CD7-deficient mice.Journal of immunology(Baltimore,Md.:1950),1998.160(12):p.5749-5756)。另外除此之外，以上两种技术显著增加了细胞制备难度，因为T细胞除接受CAR基因的转导外，还需要额外进行引导序列或抑制高尔基体转运序列的转导。

目前暂无研究报道采用抗体封闭技术进行抗CD7 CAR-T细胞等靶向T细胞表达抗原的CAR-T细胞的培养。本发明创新性地在靶向T细胞表达抗原的CAR-T细胞制备培养过程中添加了与CAR上scFv具有相同重链可变区和轻链可变区的封闭抗体。

本发明的试验结果显示，CD7封闭抗体可以有效封闭T细胞表面的CD7分子，且不会影响T细胞的扩增、CD8占比和T细胞亚型，包括初始T细胞(Tnaive，又称为Tn)、中央记忆T细胞(Tcm)，效应记忆T细胞(Tem)、效应T细胞(Teff)等亚型。通过该策略可以有效的防止CAR-T细胞的自相残杀，转导后的CAR-T细胞可以稳健的扩增，快速产生大量的抗CD7 CAR-T细胞，培养10天后可以扩增44.1倍，按照CD19上市产品的生产规模计算(Vairy,S.,et al.,CTL019(tisagenlecleucel):CAR-T therapy for relapsed and refractory B-cellacute lymphoblastic leukemia.Drug design,development and therapy,2018.12:p.3885-3898。Mohty,M.,et al.,CD19 chimeric antigen receptor-T cells in B-cellleukemia and lymphoma:current status and perspectives.Leukemia,2019.33(12):p.2767-2778。Maude,S.L.,et al.,Tisagenlecleucel in Children and Young Adultswith B-Cell Lymphoblastic Leukemia.The New England journal of medicine,2018.378(5):p.439-448)，完全可以满足临床应用需求。且CD7封闭抗体不会影响抗CD7CAR-T细胞的转导效率，对T细胞恶性肿瘤可以产生强大而特异的细胞毒性作用，包括细胞因子分泌、靶细胞毒性等，使得抗CD7 CAR-T细胞制备具有生产可行性。相对于未添加CD7封闭抗体培养组，CD7封闭抗体添加组的细胞CD8比例上升、调节性T细胞比例下降、干性T细胞比例升高。有报道显示，CAR-T细胞的干性与CAR-T在体扩增和维持具有一定的相关性，因此本发明认为CD7封闭抗体后的抗CD7 CAR-T细胞可能具有更好的体内扩增和维持能力。

除此之外，本发明未对T细胞的天然受体进行任何改造，只是在培养体系中加入适量的封闭抗体即可，因此，理论上抗CD7 CAR-T细胞仍保留对病毒抗原的免疫作用。而在之前抗CD7 CAR-T细胞的研究中，不排除由于额外转导序列或转导后引起的脱靶效应可能长期留存在于患者体内而导致的不可控的临床风险问题。但本发明所涉及的采用封闭抗体制备的CAR-T细胞在制备后期，可以通过清洗的方式有效去除培养过程中添加的封闭抗体，并可以通过流式细胞术检测细胞表面抗体的His标签或者人源Fc段的百分比，同时通过ELISA检测清洗液中残留抗体浓度来设置质量管控标准。

对于抗CD7 CAR-T细胞的临床应用也面临着诸多疑惑，如患者体内缺乏CD7封闭抗体，是否会在体内诱发自相残杀？值得注意的是，首先，并不是所有外周T细胞均表达CD7,部分CD4记忆和CD8效应亚群细胞不表达CD7，因此，CD7阴性细胞亚群就可以通过“阴性选择”幸免存活下来，这就减弱了T细胞再生障碍的程度。其次，即使外周T细胞中会表达CD7，但相对于T-ALL细胞，其表达丰度是不一样的。Png等发现，T-ALL细胞中CD7的平均荧光强度始终高于正常T细胞的平均荧光强度。再次，抗CD7 CAR-T细胞可以作为一种临时的“桥接移植”方法，短期内起到快速消除肿瘤细胞的目的。

本发明提出了一种抗体封闭法即通过添加重组CD7抗体制备抗CD7 CAR-T细胞的创新方法，与CRISPR/Cas 9基因编辑技术和蛋白滞留技术相比，此方法更简单、安全、可控。并且研究的结果表明，加入重组CD7封闭抗体可以增加细胞活率和细胞扩增能力，更重要的是，改善细胞表型(提高CD8⁺T细胞比例，降低耗竭标记物表达，提高Tn细胞群比例)，提高抗肿瘤活性和持久性，为临床治疗T细胞恶性肿瘤提供了一种简单、安全、经济有效的可行策略来制备足够有效且持久的抗CD7 CAR-T细胞。

总之，本发明是首次采用针对CD7的抗体封闭方法，成功制备了临床级的抗CD7CAR-T细胞制剂，并证明了采用CD7封闭抗体进行抗CD7 CAR-T细胞制备具有可行性和有效性，并且相对于其他已报道的解决策略具有较低的临床风险。这些发现表明，进一步的努力可以将这些观察结果转化为专门用于动物模型，以及临床治疗儿童和成人T-ALL。本发明的方法简易、安全、有效，为临床治疗肿瘤提供了新思路。

附图说明：

图1是CAR示意图及鉴定结果。其中，(a)第三代抗CD7 CAR 1、抗CD7 CAR 2和抗CD19 CAR结构示意图。(b-d)CAR目的质粒PUT493(b)、PUT642(c)、PUT643(d)示意图。(e)PUT642和PUT643目的质粒均使用ApaⅠ酶进行酶切后的凝胶电泳图，M：标记物；Ⅰ：PUT642质粒；Ⅱ：PUT643质粒。

图2是CAR转导效率。四质粒慢病毒包装系统构建的抗CD7 CAR-T 1细胞的转导效率(a)、抗CD7 CAR-T 2细胞的转导效率(b)、抗CD19 CAR-T细胞的转导效率(c)。

图3是CAR-T细胞培养状态及凋亡情况。其中，(a)在第7天，显微镜下观察的4个细胞组(mock、抗CD19 CAR-T细胞、抗CD7 CAR-T 1细胞和抗CD7 CAR-T 2细胞)的培养状态。红色箭头代表细胞碎片或死亡细胞。比例尺:100μm。(b)在第8天，4个细胞组(mock、抗CD19CAR-T细胞、抗CD7 CAR-T 1细胞和抗CD7 CAR-T 2细胞)通过流式细胞术检测的细胞凋亡情况。数据通过FlowJo和GraphPad Prism进行分析和可视化。

图4是CAR-T细胞表型检测。其中，(a)上图为第1天以及第14天mock T细胞(空白T细胞)、抗CD19 CAR-T细胞表面CD7抗原表达的情况；下图为抗CD7 CAR-T 1细胞从第2天到第14天的CD7抗原分子的表达结果。(b)细胞表面激活标记物CD25和PD1的流式检测结果，使用GraphPad Prism进行two-way ANOVA差异性分析，采用Tukey法进行多重比较(P<0.001(***)，P<0.01(**)，P<0.05(*)，n＝3)。(c)三名健康供试者细胞样本在第2天和第8天CD8⁺T细胞比例的检测结果。

图5是抗体示意图及鉴定结果。其中，(a)重组CD7抗体质粒示意图。上图为PUT644抗体示意图，下图为PUT645抗体示意图。(b)重组CD7抗体结构示意图。(c)PUT644和PUT645目的质粒分别使用HincⅡ和NcoⅠ酶进行酶切后的凝胶电泳图，M：标记物；Ⅰ：PUT644质粒；Ⅱ：PUT645质粒。

图6是抗体纯化图谱。其中，PUT644抗体上清(a)与PUT645上清(b)经过镍柱后首先出现不与亲和填料结合的杂质蛋白峰，加入洗脱梯度时出现结合力较弱的杂质蛋白峰，然后出现的单峰(箭头所指处)即目的蛋白峰。

图7是抗体纯化及浓缩后鉴定结果。其中，(a)抗体上清通过ELISA检测的浓度结果(error bar＝mean±SD，n＝4)。(b)两种抗体浓缩液的SDS-PAGE鉴定结果。(Ⅰ，蛋白标记物；Ⅱ，纯化的PUT644抗体；Ⅲ，纯化的PUT645抗体。红色方框为55kDa左右大小的蛋白)

图8是抗体浓度摸索实验结果。

图9是PUT644和PUT645抗体结合效率比较。其中，(a)两种抗体(PUT644和PUT645)在终浓度为0.72μg/mL的孵育体系下与Raji细胞的结合效率。(b)上图为T细胞未加入抗体孵育时CD7分子的表达情况，下图为两种抗体在终浓度为0.72μg/mL的孵育体系下与T细胞的结合效率。

图10是抗体对T细胞表型及扩增的影响鉴定。其中，(a)mock+PUT644组与mock组的CD8⁺T细胞在第2天至第12天中的占比变化，使用GraphPad Prism进行two-way ANOVA差异性分析，采用Tukey法进行多重比较(error bar＝mean±SD,P>0.05(ns)，n＝3)。(b)mock+PUT644组与mock组在第2天至第10天的扩增情况，使用GraphPad Prism进行two-way ANOVA差异性分析，采用Sidak法进行多重比较(error bar＝mean±SD,P>0.05(ns)，n＝3)。(c)mock+PUT644组与mock组在第9天和第11天的激活标记物CD25和PD1的表达情况,使用GraphPad Prism进行two-way ANOVA差异性分析，采用Sidak法进行多重比较(error bar＝mean±SD,P>0.05(ns)，n＝3)。(d)通过T-SNE降维分析CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的亚群，初始T细胞(Tn,CD45RA⁺CCR7⁺)，中央记忆T细胞(Tcm,CD45RA^-CCR7⁺)，效应记忆T细胞(Tem,CD45RA^-CCR7^-)和效应T细胞(Teff,CD45RA⁺CCR7^-)。不同的颜色代表不同的群体。数据在https://premium.cytobank.org/cytobank/login进行分析。

图11是加入抗体对抗CD7 CAR-T细胞扩增的影响。其中，(a-c)三个健康患者来源的T细胞制备的抗CD7 CAR-T细胞在加抗体和不加抗体两种培养体系下的扩增曲线；(d)三名健康供试者细胞样本从第2天(D2)到第12天(D12)的倍增时间(DT)。DT＝240×[lg2/(lgN_D12-lgN_D2)](N_D12：第12天的细胞总数；N _D2：第2天的细胞总数)。

图12是加入抗体对抗CD7 CAR-T细胞培养状态的影响。其中，(a)在第8天，收获抗CD7 CAR-T 1组以及CAR-T 1+PUT644组细胞，用于流式凋亡实验检测(Annexin V和PI)。“I”代表晚期凋亡细胞；“Ⅱ”代表活细胞；“Ⅲ”代表早期凋亡细胞。(b)使用显微镜观察培养至第10天的抗CD7 CAR-T 1组以及CAR-T 1+PUT644细胞组的培养状态。比例尺:100μm。

图13是加入抗体对抗CD7 CAR-T细胞亚型的影响。在第13天流式检测加抗体组(CAR-T 1+PUT644)以及不加抗体组(抗CD7 CAR-T 1)的细胞亚群的差异。

图14是加入抗体对抗CD7 CAR-T细胞细胞因子释放的影响。其中，第8天(D8)和第10天(D10)收集培养液上清用于流式检测细胞因子IFN-γ、TNF、IL-10、IL-6、IL-4。C＝10⁶×(c_D10×V_D10-c_D8×v_D8)/N_D10(C:细胞因子浓度(pg/10⁶细胞)；c_D8：第8天细胞培养上清中细胞因子浓度(pg/ml)；c_D10：第10天细胞培养上清中细胞因子浓度(pg/ml)；V_D8:第8天细胞培养体积；V_D10:第10天细胞培养体积；N_D10：第10天细胞总数)。数据为三次测量的平均值(±SD)，使用GraphPad Prism进行two-way ANOVA差异性分析，采用Sidak法进行多重比较分析(P<0.001(***)，P<0.05(*)，P>0.05(ns)，n＝3)。

图15是加入抗体对抗CD7 CAR-T细胞耗竭程度的影响。第13天，用流式细胞术检测细胞耗竭标记物CTLA4、LAG3和TIM3的平均荧光强度(MFI)，用Python分析三次测量的平均值(±SD)。使用GraphPad Prism对抗CD7 CAR-T 1细胞组与CAR-T 1+PUT644组的TIM3、LAG3、CTLA4进行two-way ANOVA差异性分析，采用Sidak法进行多重比较分析(P<0.001(***)，P<0.05(*)，P>0.05(ns)，n＝3)。

图16是加入抗体对抗CD7 CAR-T细胞中CD8⁺T细胞比例的影响。其中，(a)CD8⁺T细胞百分比结果相对于第2天的检测结果归一化，数据以南丁格尔玫瑰图显示；(b)在第11天，收集细胞用于检测CD3/CD4/CD8/TIM3/LAG3标记物。数据显示为三次测量的平均值(±SD)，使用GraphPad Prism进行two-way ANOVA差异性分析，采用Sidak法进行多重比较分析(P<0.001(***)，P<0.05(*)，n＝3)。

图17是GFP⁺靶细胞稳定株流式鉴定结果。

图18是流式杀伤结果。GFP⁺Jurkat细胞与mock T细胞或CAR-T 1+PUT644组细胞以1:1E:T比例共孵育18h后存活的靶细胞(7AAD^-GFP⁺)相对比例。

图19是LDH杀伤实验结果。其中，(a)靶细胞表面CD7抗原表达率；(b-d)来自三名健康供试者的T细胞在新策略下制备的抗CD7 CAR-T细胞(CAR-T 1+PUT644组)对CD7阳性靶细胞Jurkat的杀伤效率，mock组作为对照组。使用GraphPad Prism进行two-way ANOVA差异性分析，采用Sidak法进行多重比较分析(P<0.001(***)，P<0.01(**)，n＝3)。

图20是细胞因子释放实验检测结果。

以上附图中的“anti-”均指“抗”，比如“anti-CD7 CAR-T 1”即“抗CD7 CAR-T 1”，以此类推。

具体实施方式

为了促进对本发明的理解，以下将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述本发明。然而，应当理解的是，这些具体实施方式不意图限制本发明的范围。所描述的实施方式中的任何改变和进一步的修改，以及本发明的任何进一步应用，均为本领域技术人员通常会想到的。

以下列出了本实施例所使用到的部分实验仪器、材料和试剂的来源，其他未列出的均为常规实验仪器、材料和试剂，可通过商业途径购买到。

材料名称	生产厂家
		100kd超滤管	密理博(Millipore)
1.2μm滤器	赛多利斯(Sartorius)
		切向流膜包	赛多利斯(Sartorius)
His标签蛋白纯化预装柱	上海翊圣生物
		16号管	马斯特菲(Masterflex)

实施例1制备重组慢病毒载体

本实施例涉及抗CD7 CAR和抗CD19 CAR重组慢病毒载体的构建。

1、构建加载有抗CD7 CAR基因的重组质粒和加载有抗CD19 CAR基因的重组质粒

(1)酶切：将pUT-Bacbone质粒与EcoR I、BamH I两种限制性核酸内切酶按照表1混合。

(2)回收线性质粒：进行凝胶电泳(120V，20min)后使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收并纯化7000bp大小的线性质粒。

表1：酶切反应体系(50μL)

(3)合成目的基因：设计引物CART-F(SEQ ID NO.19)和CART-R(SEQ ID NO.20)，加入抗CD7 CAR基因(或者抗CD19 CAR基因)的合成体系中，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出约1500bp的目的片段。具体见表2。

其中，抗CD7 CAR基因包含依次串联的CD8 leader膜受体信号肽、抗CD7 scFv区、CD8α嵌合受体铰链区Hinge和CD8α嵌合受体跨膜区TM、OX40共刺激结构域、CD28共刺激结构域，以及CD3ζ胞内信号肽。抗CD19 CAR基因包含依次串联的CD8 leader膜受体信号肽、抗CD19 scFv区、CD8α嵌合受体铰链区Hinge和CD8α嵌合受体跨膜区TM、OX40共刺激结构域、CD28共刺激结构域，以及CD3ζ胞内信号肽。这些结构域对应的氨基酸序列和核酸序列见表3。

表2：PCR反应体系

表3：抗CD7 CAR基因和抗CD19 CAR基因所含结构域的序列编号

(4)混匀，瞬时离心，放入PCR仪中按表4运行程序。

表4：PCR循环条件

(5)回收目的基因片段：PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳(120V，20min)后使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收并纯化目的片段。

(6)合成目的质粒：将回收纯化后的载体线性质粒和目的基因片段按照无缝克隆试剂盒同源重组(表5)，最终获得嵌入目的基因的目的质粒反应液。

表5：重组反应体系

(7)质粒转化

1)取10μL反应液加入100μL TOP10感受态细胞中，轻轻吹打混匀。

2)冰上孵育30min后迅速转移至42℃恒温水浴锅。

3)热激90s后转移至冰上继续孵育3min。

(8)涂布培养

1)900μL无抗性的LB培养基重悬质粒转化后的细胞，37℃，220rpm培养1h。

2)取100μL转化菌液至含有氨苄青霉素抗性的LB固态琼脂平皿中，使用玻璃涂棒均匀涂布。

3)皿倒置，37℃恒温培养16h。

(9)阳性单菌落接种

1)5mL含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基重悬阳性单菌落。

2)混合均匀，放置摇床，37℃，220rpm，培养16h。

(10)质粒确认

1)使用质粒小量提取试剂盒提取接种后菌群的质粒(同时保存甘油菌)。

2)送质粒测序公司检测。

3)根据Align软件比对判断与构建的目的质粒是否完全一致。若一致说明重组质粒构建成功。

4)采用小抽试剂盒获得目的质粒，进行酶切电泳验证。

2、抽提加载有抗CD7 CAR基因的重组质粒和加载有抗CD19 CAR基因的重组质粒

(1)中抽接种

1)200mL含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基重悬检定合格的阳性克隆菌种(甘油菌)。

2)培养瓶封口，放置摇床，37℃，220rpm培养16h。

(2)收获菌群：收集过夜培养的接种菌群，8000rpm离心5min，弃上清。

(3)清洗菌群：加入40mL PBS重悬，8000rpm离心5min，弃上清。

(4)裂解菌群：离心管中加入已经添加了RnaseA的RES-EF重悬液8mL，涡旋混合均匀，接着加入8mL裂解液LYS-EF，室温静置。

(5)蛋白析出：待液体清亮粘稠，加入8mL中和液NEU-EF，同上颠倒离心管，蛋白逐渐析出。

(6)抽提质粒

1)在中抽过滤吸附柱中缓慢加入12mL润洗液EQU-EF，待润洗液滴尽后缓慢加入样本上清。

2)样本吸附结束后依次加入5mL清洗液1(FIL-EF)、35mL的清洗液2(ENDO-EF)和8mL清洗液3(WASH-EF)。

3)清洗结束后将中抽过滤吸附柱转移至新的离心管，缓慢滴加5mL洗脱液(ELU-EF)洗脱。

(7)提纯质粒

1)加入异丙醇3.5mL，涡旋。-20℃静置20min。

2)取出，12000rpm离心10min，弃去上清。

3)加入70％乙醇2mL，12000rpm离心5min，弃去上清。

4)重复3)步骤一次。

5)12000rpm空离1min，晾干。

(8)检测质粒浓度

1)加入500μL TE-EF混合均匀，放置4℃冰箱过夜。

2)涡旋仪混合均匀后取部分使用浓度测定仪测定质粒浓度和OD_260/280值，剩余放置-20℃保存。

3、四质粒表达体系重组慢病毒载体包装

(1)配制转染试剂

1)准备15mL离心管，加入2mL CaCl₂、3种包装质粒(13μg pPac-R、20μg pPac-GP、5μg pEnv-G)和20μg目的质粒(加载有抗CD7 CAR基因的重组质粒或加载有抗CD19 CAR基因的重组质粒)，补加细菌内毒素检查用水至4mL。

2)边涡旋边加入4mL HBS，添加完毕后再持续震荡20s，待用。

(2)从培养箱中取出HEK 293T细胞[美国组织培养库(ATCC)]，更换4％DMEM完全培养基(500mL DMEM培养基加入20mL FBS混匀制得)9mL。

(3)加入混合的转染试剂1mL，混合均匀。

(4)转染6h更换10mL 4％DMEM完全培养基，转染24h后补加10mL 4％DMEM完全培养基。

4、重组慢病毒载体过滤浓缩

(1)转染48h后收集上清液(含有重组慢病毒载体)于无菌玻璃瓶中，连接蠕动泵使上清液通过1.2μm的滤器，接着在过滤后的上清液中加入核酸酶，混合均匀，放置4℃过夜保存。

(2)取出加入核酸酶后的上清液，连接蠕动泵安装切向流膜包，设置流速200mL/min浓缩样品至30mL时结束浓缩。

(3)浓缩结束后使用30mL HBSS置换膜包及管路中的残留的上清液，置换出的上清液与浓缩后的慢病毒载体混合后，除菌过滤分装，保存在4℃备用。

实施例2CAR-T细胞的制备及扩增

1、T细胞的分离

(1)外周血单个核细胞(PBMC)分离

1)准备50mL离心管，按照体积比1:2混合血液与PBS，达到稀释血液效果。

2)将稀释后的血液沿着离心管的管壁缓慢加入1.5倍血液体积的单个核细胞分离液中。

3)离心管缓慢转移至离心机，800G，离心20min。

4)移液枪吸取中间白膜层，加入30mL PBS，混合均匀，1500rpm离心5min。

5)弃去上清，加入1mL PBS重悬，使用血球计数板法计数。

(2)CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞分离

1)计数后重新加入3mL PBS重悬，1500rpm离心5min。

2)弃去上清，按照每1x10⁷细胞加入CD4分离磁珠和CD8分离磁珠各10μL以及80μL分选液，混合均匀，放置4℃避光孵育10-15min。

3)孵育结束后加入30mL PBS，混合均匀，1500rpm离心5min。

4)弃去上清，3mL分选液重悬进行阳性分选。

2、重组慢病毒载体转导

(1)T细胞激活

1)预先过夜包被CD3和CD28抗体于培养瓶，待用。

2)将分选得到的T细胞计数后，使用AIM V完全培养基(500mL AIM V培养基加入25mL FBS和1mL IL-2细胞因子混匀制得)调整细胞密度为1x10⁶/mL。

3)弃去包被液，加入细胞悬液，放置恒温培养箱激活24h，此时记录为培养第一天(D 1)。

(2)T细胞转导

1)轻轻吹打细胞并收集至离心管中，1500rpm离心5min，弃去上清。

2)重新加入AIM V完全培养基调整密度为1x10⁶/mL。

3)加入慢病毒载体，37℃，5％CO₂培养箱中转导48h。

3、CAR-T细胞培养

(1)收集转导后细胞，1500rpm离心5min，弃去上清，加入3mL PBS洗涤一遍。

(2)AIM V完全培养基重悬计数，调整细胞密度为5x10⁵/mL。

(3)每隔1-2天观察细胞状态，使用显微镜拍照、计数，为细胞补液以维持细胞密度为5x10⁵/mL。

4、流式细胞术检测

(1)细胞凋亡检测

1)细胞悬液1500rpm离心3min，弃去上清后加入195μL Annexin V-FITC结合液重悬。

2)加入5μL Annexin V-FITC和10μL碘化丙啶(PI)抗体试剂，混合均匀。

3)室温孵育20min后流式细胞仪检测。

(2)CD4/CD8/CD7/CAR检测

1)细胞悬液，1500rpm离心3min，弃去上清，加入100μL PBS重悬。

2)加入抗体试剂CD4/CD8/CD7/PL各1μL混合均匀。

3)4℃孵育45min，加入1mL PBS洗涤2遍。

4)弃去上清，200μL PBS重悬，待测。

(3)激活标记物检测

1)细胞悬液1500rpm离心3min，弃去上清，加入100μL PBS重悬。

2)加入抗体试剂CD25/CD279各1μL混合均匀。

3)室温孵育20min，加入1mL PBS洗涤2遍。

4)弃去上清，200μL PBS重悬，待测。

实施例3抗CD7抗体的制备及表征

1、抗CD7重组抗体质粒的构建及抽提

方法同实施例1的质粒构建和抽提，但目的片段替换为抗CD7抗体编码核酸片段。

2、抗CD7抗体的表达

(1)配制转染试剂

1)准备15mL离心管，加入2mL CaCl₂、58μg目的质粒，补加细菌内毒素检查用水至4mL。

2)边涡旋边加入4mL HBS，添加完毕后再持续震荡20s，待用。

(2)按照实施例1四质粒表达体系重组慢病毒载体包装中的(2)-(4)进行转染。

3、抗体的亲和层析纯化

(1)安装His标签蛋白纯化预装柱。

(2)平衡层析柱：5倍柱体积的裂解液(Lysis buffer)以5mL/min流速平衡层析柱。

(3)准备样品

1)收集HEK 293T细胞培养液上清于无菌玻璃瓶。

2)连接蠕动泵，上清液通过1.2μm的滤器。

3)收集过滤液待用。

(4)上样：连接样品、低浓度咪唑溶液、结合缓冲液的玻璃瓶，将样品上样至层析柱。

(5)洗脱液(Wash buffer)平衡柱子。

(6)洗脱：连接高浓度咪唑玻璃瓶，收集阳性峰所在位置的洗脱液于无菌收集管中。

(7)清洗管路

1)使用更高浓度的咪唑溶液去除杂质蛋白。

2)使用3倍柱体积的裂解液(Lysis buffer)和5倍柱体积的去离子水清洗树脂。

3)使用5倍柱体积的20％乙醇平衡树脂。

(8)保持树脂于20％乙醇的1x PBS中，置于4℃保存。

4、抗体浓缩

(1)纯化后抗体上清转移至无菌玻璃瓶中，使用超滤管，将抗体蛋白浓度浓缩到至少20μg/ml。

(2)使用0.22μm滤器除菌过滤，收集滤液，4℃保存备用。

5、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验

(1)安装胶板

(2)配制10％蛋白胶

1)在50mL离心管中加入3.4mL下层缓冲溶液和下层分离液以及60μL硫酸铵，混合均匀，加入下层胶中。

2)缓慢加入1mL无水乙醇液封，室温静置20min。

3)待下层胶凝固后弃去胶上层水。

4)取另一支50mL离心管，加入1.2mL上层缓冲液和上层分离液以及60μL硫酸铵，混合均匀，加入上层胶中。

5)插入10孔梳子排去气泡，在水平面静置。

6)待上层胶凝固后拔出梳子。

(3)样本处理：样本与上样液(Loading Buffer)按照比例1:1混合均匀，置于95℃热水中加热5min使蛋白变性。

(4)上样：分别吸取10μL样本和标记物加入孔中。

(5)跑胶：连接电泳仪，设置参数(电压：100V；时间：20min)，结束后更改参数(电压：80V；时间：110min)，继续跑至条带展开。

(6)拆胶：电泳结束后关掉电源，取出蛋白胶放置去离子水中，换洗一遍后拆出蛋白胶。

(7)染色：将胶放入考马斯亮蓝溶液中，加热1min后摇床染色1h。

(8)脱色

1)加入去离子水洗涤3次。

2)加入脱色液，加热1min，摇床室温脱色10min。

3)弃去脱色液，重复2)步骤2次。

4)将胶置于去离子水中，摇床上室温过夜脱色。

6、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体浓度

采用His检测试剂盒(ELISA)进行。

(1)加入50μL标准品和样本。

(2)加入50μL抗His的单克隆抗体，室温下孵育30min。

(3)加入260μL洗液洗板4次。

(4)加入100μL抗体检测试剂，室温孵育30min。

(5)重复上述(3)步骤。

(6)加入100μL TMB底物，室温孵育10-15min.

(7)加入50μL终止液终止反应。

(8)酶标仪读取OD₄₅₀值。

(9)根据标曲计算样本浓度。

7、T细胞培养及计数

(1)设置三组相同起始量的T细胞组，使用的培养基均为AIM V完全培养基，其中第一组加入PUT644抗体至终浓度为0.72μg/mL，第二组加入PUT645抗体至终浓度为0.72μg/mL，第三组不加任何抗体。抗CD7 scFv 1(克隆号m3A1e)或抗CD7 scFv 2(克隆号m3A1f)连接人源的1型免疫球蛋白(IgG1)的Fc段，最后末端加入His标签以便纯化，两种抗体依次命名为PUT644和PUT645。

(2)每隔1-2天计数，为细胞补加培养基以维持细胞密度为5x10⁵/mL。PUT644和PUT645抗体随培养基供给，单次补充抗体至少可以封闭两天。因此每隔1-2天计数，为细胞补加培养基以维持细胞密度可以保证第一组和第二组中的T细胞上的CD7被PUT644或PUT645抗体封闭。

8、流式细胞术检测

(1)抗体与CD7抗原的结合效率鉴定

1)取1x10⁶/mL细胞加入抗体浓缩液至终浓度为2.88μg/mL、1.44μg/mL、0.72μg/mL，混合均匀。

2)室温孵育2h后用PBS洗涤一遍，弃去上清。

3)接着加入100μL PBS，后加入1μL流式抗体抗人(抗human)Fc，混合均匀，室温孵育20min。

4)加入PBS洗涤两遍。

5)加入200μL PBS重悬，上机检测。

(2)CD4/CD8/CD7/CAR检测：方法同实施例2第4部分流式细胞术检测中的(2)

(3)激活标记物检测：方法同实施例2第4部分流式细胞术检测中的(3)

(4)细胞T亚型检测

1)收集细胞悬液，1500rpm离心3min。

2)弃去上清后加入100μL PBS重悬。

3)加入抗体试剂CD4/CD8各1μL以及抗体试剂CCR7/CD45RA/CD25/CD127各2μL混合均匀。

4)室温孵育20min。

5)使用PBS洗涤2遍，弃去上清。

6)加入200μL PBS重悬上机检测。

实施例4抗体对抗CD7 CAR-T细胞的扩增及表型的影响

1、抗CD7 CAR-T细胞培养

设置两组相同起始量的抗CD7 CAR-T细胞组，每隔1天使用显微镜观察细胞状态并拍照、计数，加入AIM V完全培养基维持细胞密度为5x10⁵/mL培养。加入终浓度为0.72μg/mL的PUT644抗体的组命名为“CAR-T 1+PUT644”。未加入抗体的细胞组命名为“抗CD7 CAR-T1”。

2、流式细胞术检测

(1)细胞凋亡检测：方法同实施例2的4、流式细胞术检测(1)。

(2)CD4/CD8/CD7/CAR检测：方法同实施例2的4、流式细胞术检测(2)。

(3)T细胞亚型检测：方法同实施例3中的8、流式细胞术检测(4)。

(4)T细胞耗竭程度检测

1)收集细胞悬液，1500rpm离心3min。

2)弃去上清，加入100μL PBS重悬。

3)加入抗体试剂CD4/CD8各1μL以及抗体试剂TIM3/LAG3/CTLA4各2μL混合均匀。

4)室温孵育20min。

5)加入1mL PBS洗涤2遍(离心条件：1500rpm，3min)，弃去上清。

6)加入200μL PBS重悬上机检测。

(5)细胞因子检测

1)样本处理：收集细胞悬液上清于1.5mL EP管中。

2)标准品准备：2mL标准品稀释液稀释标准品，室温静置15min。接着使用标准品稀释液2倍梯度稀释标准品(最高浓度至空白稀释液共10个梯度)。

3)在新的EP管中加入50μL标准品或者样本，接着加入50μL捕获微球以及50μL检测抗体，涡旋仪混合均匀，室温孵育3h。

4)加入洗脱液(Wash Buffer)1mL，洗涤两遍后弃去上清。

5)加入200μL洗脱液(Wash Buffer)后涡旋混匀。

6)上机检测细胞因子IL-2/IL-4/IL-6/IL-10/IFN-γ/TNF。

实施例5加入抗体培养的抗CD7 CAR-T细胞的功能研究

1、绿色荧光蛋白(GFP)质粒构建及抽提

方法同实施例1的质粒构建和抽提，但目的片段替换为GFP。

2、靶细胞培养

Jurkat细胞(CD7阳性白血病细胞系，购自ATCC)或者Raji细胞(CD7阴性白血病细胞系，购自ATCC)使用1640完全培养基(500mL 1640培养基加入20mL FBS混匀制得)调整细胞密度为5x10⁵/mL培养。后续每2-4天以1：5-10比例补液传代。GFP+Raji细胞购自Biocytogen。

3、电转法构建稳定高表达GFP+Jurkat细胞株

(1)预热：孔板、1640完全培养基、FBS 37℃预热。

(2)取Jurkat细胞悬液于50mL离心管中，1500rpm离心5min。

(3)PBS重悬洗涤2次(离心条件：1200rpm，5min)。

(4)弃去上清，1640培养基重悬，计数，调整细胞密度为5x10⁷/mL。

(5)设置电转程序：调用电转仪预设的用于电转Jurkat细胞的程序。

(6)使用移液枪按照体系将Jurkat细胞与GFP质粒混合均匀，转移至4mm规格电转杯中，点击“Ω”，显示“OK”后，点击“开始”。

(7)电转后细胞补充预热的1640培养基并转移至预热的孔板，维持5x10⁷/mL密度培养。

4、筛选稳定高表达GFP+Jurkat细胞株

(1)密度为5x10⁵/mL的细胞中加入嘌呤霉素(Puromycin)试剂使得终浓度为2μg/mL。

(2)若产生大量死细胞，收集细胞，用PBS重悬洗涤2次(离心条件：1200rpm，5min)。

(3)弃去上清，培养基重悬计数，调整密度至5x10⁵/mL，加入嘌呤霉素使终浓度为2μg/mL继续筛选。

(4)重复上述“(1)-(3)”直至显微镜下观察到在加嘌呤霉素下细胞没有大量死亡。

(5)流式检测GFP表达，确定高表达GFP的Jurkat细胞株则为构建成功的稳定细胞株。

(6)后续每2-4天以1：5-10比例补液传代，维持培养，待做实验。

5、抗CD7 CAR-T细胞对Jurkat细胞的体外LDH杀伤实验

本部分中，除已特别说明的试剂和常规试剂外，均来自LDH杀伤试剂盒。

(1)分别收集靶细胞和效应细胞悬液于离心管中，1500rpm离心5min。

(2)弃去上清，分别加入3mL PBS重悬，1200rpm离心5min。

(3)重复上述(2)步骤。

(4)各加入1mL AIM V完全培养基重悬，血球计数板法计数。

(5)每孔固定加入靶细胞1x10⁴，按照效靶比(5:1、2.5：1)加入对应数量的效应细胞，效应细胞和靶细胞体积均为50μL。

(6)按照体系计算需要2mL密度为1x10⁶/mL的效应细胞以及2mL密度为2x10⁵/mL的靶细胞，根据(4)步骤的计数结果通过补加AIM V完全培养基完成配制。

(7)铺板：示例图见表6(每组3复孔)。

表6：LDH杀伤实验排版示例a

LDH杀伤实验排版示例b

注：效1，E:T为5:1的效应细胞(在LDH杀伤实验排版示例a中为mock组；在LDH杀伤实验排版示例b中为CAR-T 1+PUT644组)50μL；效2，E:T为2.5:1的效应细胞(在LDH杀伤实验排版示例a中为mock组；在LDH杀伤实验排版示例b中为CAR-T 1+PUT644组)50μL；靶1：Raji细胞50μL；靶2：Jurkat细胞50μL；培，AIM V完全培养基；NA：空孔；本发明中的mock组均指未加入封闭抗体、未进行CAR修饰的T细胞组。

(8)96孔板用封口膜封住后放置离心机中，250g，升3降1离心5min，放入37℃恒温培养箱中孵育24h。

(9)在检测前40min向([1]x[D-F])孔中各加入10μL裂解液(Lysis buffer)。

(10)37℃溶解检测缓冲液(Assay Buffer)，溶解后放置实验室至温度降至室温，取12mL加入到底物Substrate Mix中，轻轻颠倒摇晃使底物溶解。

(11)96孔板用封口膜封住，放置离心机中，250G，升3降1离心5min。

(12)取上清50μL至新的96孔板。

(13)每孔加入50μL底物，避光孵育10-15min。

(14)使用酶标仪检测吸光度OD₄₉₀。

(15)杀伤效率计算公式：细胞毒性％＝(实验孔-效应细胞孔-靶细胞孔+培养基背景孔)/(靶细胞最大孔-体积校正孔-靶细胞孔+培养基背景孔)x 100(注：实验孔，[2-3]x[A-C]或[5-6]x[A-C]；效应细胞孔，[1]x[A-C]或[4]x[A-C]；靶细胞孔，[2]x[D]或者[2]x[E]；培养基背景孔，[2]x[F]；靶细胞最大孔，[1]x[D]或者[1]x[E]；体积校正孔，[1]x[F])

6、抗CD7 CAR-T细胞对Jurkat细胞的体外流式杀伤实验

(1)方法同本实施例第5部分(抗CD7 CAR-T细胞对Jurkat细胞的体外LDH杀伤实验)中的(1)-(4)步骤收集靶细胞和效应细胞并计数。

(2)设置E:T为1:1，96孔板每孔加入靶细胞1x10⁴，效应细胞每孔加入1x10⁴，体积均为50μL。

(3)按照体系计算需要1mL密度为2x10⁵的效应细胞以及2mL密度为2x10⁵的靶细胞，根据(1)步骤的计数结果通过补加AIM V完全培养基完成配制。

(4)铺板：以表7为例。

表7：流式杀伤实验排版示例a

流式杀伤实验排版示例b

注：效，E:T为1:1的效应细胞(在流式杀伤实验排版示例a中为mock组；在流式杀伤实验排版示例b中为CAR-T 1+PUT644组)50μL；靶1：Raji细胞50μL；靶2：Jurkat细胞50μL；培，AIM V完全培养基。

(5)96孔板用封口膜封住后放置离心机中，250G，升3降1离心5min，放入37℃恒温培养箱中孵育18h。

(6)收集细胞至1.5mL EP管中，1200rpm离心3min，弃去上清。

(7)加入100μL PBS后加入1μL 7-AAD，混合均匀，室温避光孵育5min。

(8)加入100μL PBS重悬，上机检测。

7、抗CD7 CAR-T细胞与Jurkat细胞共孵育后细胞因子释放实验

(1)方法同本实施例第5部分(抗CD7 CAR-T细胞对Jurkat细胞的体外LDH杀伤实验)中的(1)-(4)步骤收集靶细胞和效应细胞并计数

(2)设置E:T为10:1时，96孔板每孔加入靶细胞总数为1x10⁴，效应细胞总数为1x10⁵，体积均为50μL。

(3)按照体系计算需要3mL密度为2x10⁶的效应细胞以及2mL密度为2x10⁵个的靶细胞，根据(1)步骤的计数结果通过补加AIM V完全培养基完成配制。

(4)准备一个新的5mL离心管，加入1.5mL AIM V完全培养基和1.5mL(3)步骤配制的效应细胞，作为E:T为5:1时的效应细胞的悬液。

(5)准备一个新的5mL离心管，加入1.5mL AIM V完全培养基和1.5mL(4)步骤配制的效应细胞，混合均匀，作为E:T为2.5:1时的效应细胞的悬液。

(6)铺板：示例图见表8。

表8：细胞因子释放实验排版示例a

细胞因子释放实验排版示例b

注：效1，E:T为10:1的效应细胞(在细胞因子释放实验排版示例a中为mock组；在细胞因子释放实验排版示例b中为CAR-T 1+PUT644组)50μL；效2，E:T为5:1的效应细胞(在细胞因子释放实验排版示例a中为mock组；在细胞因子释放实验排版示例b中为CAR-T 1+PUT644组)50μL；效3，E:T为2.5:1的效应细胞(在细胞因子释放实验排版示例a中为mock组；在细胞因子释放实验排版示例b中为CAR-T 1+PUT644组)50μL；靶1：Raji细胞50μL；靶2：Jurkat细胞50μL；培，AIM V完全培养基；NA：空孔。

(7)96孔板用封口膜封住，放置离心机中，250G，升3降1离心5min。

(8)离心后撕去封口膜放入37℃恒温培养箱中孵育24h。

(9)同上述(7)步骤离心，收集上清于1.5mL EP管中。

(10)按照实施例3的第2部分流式细胞术检测中的(5)步骤检测细胞因子IFN-γ和TNF。

实施例6抗CD7 CAR在T细胞表面表达诱导“自伤”现象

1、CAR示意图及鉴定结果

为了获得能够特异性靶向CD7抗原的CAR，本发明设计了第三代抗CD7 CAR，骨架从5’端到3’端依次包含抗CD7 scFv 1(克隆号m3A1e)或抗CD7 scFv 2(克隆号m3A1f)、CD8α铰链和跨膜域(即CD8α嵌合受体铰链区Hinge和CD8α嵌合受体跨膜区TM)、共刺激分子CD28(即CD28共刺激结构域)和OX40(即OX40共刺激结构域)以及CD3ζ胞内信号肽，分别命名为抗CD7CAR 1和抗CD7 CAR 2。为了更好的表征抗CD7 CAR，本发明选择抗CD19 CAR(该质粒来源于上海优卡迪生物医药科技有限公司)作为CAR对照，结构中除scFv为抗CD19 scFv外，其余结构与抗CD7 CAR相同。载体示意图如下(图1a-图1d)：图谱中PUT642/PUT643/PUT493分别为包含抗CD7 CAR 1/抗CD7 CAR 2/抗CD19 CAR序列的目的质粒。为验证PUT642和PUT643质粒，使用ApaⅠ酶酶切后进行凝胶电泳，结果如下(图1e)。其中Ⅰ泳道图上可见大小约1682bp和7028bp大小的条带，Ⅱ泳道图上可见大小约1700bp和7028bp大小的条带，均与预期大小吻合，提示两种抗CD7 CAR目的质粒构建成功。

2、抗CD7 CAR-T及抗CD19 CAR-T细胞转导效率

为了避免因重组而产生复制性病毒，提高安全和稳定性，本发明采用四质粒包装系统转染细胞，获得了带目的基因的慢病毒载体，后转导至T细胞中，第八天检测CAR的表达水平。结果显示，抗CD7 CAR-T 1的转导效率为51.2％，抗CD7 CAR-T 2的转导效率为25.7％，抗CD19 CAR-T的转导效率为31.3％(图2)。

3、CAR-T细胞培养状态及流式凋亡检测结果

为了证实抗CD7 CAR-T细胞扩增困难这一现象，本发明对细胞培养过程中的状态进行观察，显微镜下发现两组抗CD7 CAR-T细胞组存在大量的死细胞甚至细胞碎片，而mockT细胞(未加入封闭抗体、未进行CAR修饰的T细胞)以及抗CD19 CAR-T细胞组细胞圆亮，背景干净，基本没有死细胞(图3a)。为了进一步的确认，本发明收集各组细胞检测细胞凋亡情况，结果发现抗CD7 CAR-T细胞组的凋亡细胞比例均高于mock T细胞组以及抗CD19 CAR-T细胞组(图3b)。

4、CAR-T细胞表型检测结果

为了验证细胞的异常培养状态源于抗CD7 CAR-T细胞对CD7分子的识别，本发明检测了T细胞表面的CD7抗原表达情况，流式结果发现抗CD7 CAR-T细胞组CD7分子的峰图随着培养时间逐渐左移，而mock组和抗CD19 CAR-T细胞组基本不变(图4a)。

理论上CAR-T细胞受到靶细胞刺激后激活程度会增加，所以本发明检测了与细胞激活相关的细胞表面标记物CD25和PD1，与抗CD19 CAR-T细胞组相比，抗CD7 CAR-T细胞组的激活标记物显著增加(图4b)。

除此之外，与mock组和抗CD19 CAR-T组截然不同的是，抗CD7 CAR-T细胞组的CD8⁺T细胞的比例呈现下降的趋势(图4c)。

实施例7抗CD7抗体的制备及表征

1、抗体示意图及鉴定结果

为了制备能够有效封闭CD7抗原的抗体，本发明构建了新的重组抗体质粒，结构如图5a。抗体识别域与CAR相同，后连接人源的1型免疫球蛋白(IgG₁)的FC段，最后末端加入His标签以便纯化，两种抗体分别命名为PUT644和PUT645(图5b)，理论大小分别为54.2KDa和55.1KDa。为验证PUT644和PUT645质粒，分别使用HincⅡ酶和Nco Ⅰ酶酶切后进行凝胶电泳，结果如下(图5c)。其中Ⅰ泳道图上可见大小约2066bp和5703bp大小的条带，Ⅱ泳道图上可见大小约3030bp和4757bp大小的条带，均与预期大小吻合，提示两种抗CD7 CAR目的质粒构建是正确的。

2、抗体纯化及物理表征结果

抗体质粒转导HEK 293T工具细胞后收集上清，通过金属离子镍(Ni)与His标签特异性结合的亲和层析法纯化上清，其中箭头所指为目的蛋白峰，具体见图谱(图6)。

为了进一步提高浓度，图7a为本发明采用超滤浓缩方式浓缩蛋白液后的ELISA检测结果，结果表明纯化后浓度分别达到了24.09μg/mL和23.51μg/mL。从SDS-PAGE结果(图7b)也可以看出，纯化浓缩后集中在55KDa左右的条带为目的蛋白条带，且无明显杂带。

3、抗体与CD7抗原的结合效率

除本实施例第2部分对抗体的物理学鉴定外，本发明同时考察了抗体的生物学性质，即与CD7抗原的结合效率。首先本发明设置了三个浓度梯度，分别与相同细胞数量的T细胞在相同的孵育体系下孵育，结果发现，抗体PUT644在三种浓度下结合效率相似，而抗体PUT645在1.44μg/mL和0.72μg/mL浓度下结合率相似，但相对于2.88μg/mL浓度，其荧光峰有明显左偏移(具体见图8)。

两种抗体分别设置相同三个实验梯度(2.88μg/mL、1.44μg/mL、0.72μg/mL)与T细胞结合，通过检测结合在T细胞表面的抗体的百分比来反应抗体的结合效率。

接着本发明选择浓度值0.72μg/mL作为实验浓度进一步考察抗体的结合特性。实验结果如下图9，原CD7⁺T细胞占比为93.4％，加入终浓度为0.72μg/mL的抗体PUT644孵育之后，流式抗体检测PUT644的Fc段发现带有抗体的T细胞占93.0％，而与相同终浓度的抗体PUT645孵育之后仅为88.6％。表明抗体能够与T细胞表面CD7抗原特异性结合，且相同浓度下抗体PUT644与T细胞结合效率更高。而相同的处理方式之后，很明显CD7^-的Raji细胞表面均没有结合(检测值均小于1)。

4、抗体对T细胞扩增及表型的影响

由于CD7抗原是与细胞激活相关的分子，因此本发明继续探讨了抗体的加入是否对细胞的生长产生影响，主要是从细胞的扩增、细胞亚型以及细胞的激活状态进行考察。因为抗CD7 CAR-T细胞特殊的CD4/CD8比例变化，所以本发明也对此进行了检测分析。图10a为加抗体培养的T细胞组(mock+PUT644)与不加抗体培养的T细胞组(mock)在D2到D12之间的CD8⁺T细胞比例的变化趋势图。为了更好的对比，我们将D2的检测结果归一化为100％，可以看出，抗体的添加不会影响T细胞中CD8细胞群的比例。图10b为同样两组细胞从D2到D12之间的扩增曲线，结果表明抗体对细胞的扩增没有影响。图10c为细胞的激活标记物CD25与PD1的检测结果，mock+PUT644组与mock组的激活标记物没有显著的差异。流式降维分析法T-SNE对细胞亚群Tn、Tcm、Tem、Teff以及Treg的分析结果也表明两组细胞亚群几乎没有变化。

实施例8抗体对抗CD7 CAR-T细胞的扩增及表型的影响

1、抗体对抗CD7 CAR-T细胞扩增的影响

为了研究纯化浓缩后的抗体是否能够改善细胞培养状态，提高扩增。本发明将未加抗体组细胞命名为抗CD7 CAR-T 1，加抗体组细胞命名为CAR-T 1+PUT644。绘制细胞扩增曲线(图11)，结果发现两组细胞的扩增曲线从第六天开始出现差异，并且抗体的加入提高了抗CD7 CAR-T细胞的数量，最高可以扩增83.5倍(从2x10⁶到1.67x10⁸)。

细胞的倍增时间是判断细胞生长速率的重要指标之一，所以本发明计算两组细胞从D2到D12的倍增时间，结果发现，相较于抗CD7 CAR-T 1细胞组，CAR-T 1+PUT644细胞组的倍增时间最多可缩短56.75％((DT(抗CD7 CAR-T 1)vs DT(CAR-T 1+PUT644)＝123.47h vs53.41h)。

2、抗体对抗CD7 CAR-T细胞培养状态的影响

接着为了验证细胞扩增的提高是否是因为抗体的加入阻断了细胞间的“自伤”，本发明收获部分培养的细胞用于凋亡实验的检测，结果发现抗体加入培养体系后处于早期凋亡和晚期凋亡阶段的细胞都显著降低。在显微镜下观察也发现CAR-T 1+PUT644细胞组的死细胞和细胞碎片明显减少，背景杂质与凋亡检测结果一致(图12)。

3、抗体对抗CD7 CAR-T细胞亚型的影响

为了进一步分析在两种不同培养条件下细胞亚型变化，我们用流式细胞术检测了细胞表面相关标记物，发现相对于抗CD7 CAR-T 1组细胞，CAR-T 1+PUT644组细胞Tn细胞群比例提高，同时还降低了Treg和Teff的细胞群的比例，尤其是Treg细胞亚群在CAR-T 1+PUT644组降低了64.62％(抗CD7 CAR-T 1组vs CAR-T 1+PUT644组＝36.80％vs 13.02％)，结果如图13。

基于两组细胞的细胞亚型差异，本发明紧接着检测了培养体系中的细胞因子。结果发现，加抗体阻断的情况下，CAR-T 1+PUT644组的培养上清中的细胞因子IFN-γ、IL-10和IL-6显著降低(P＝0.0110，P<0.0001，P<0.0001)，对TNF和IL-4没有影响(P＝0.9817，P＝0.9988)，具体见图14。

4、抗体对抗CD7 CAR-T细胞耗竭程度的影响

除了细胞亚型的差异外，本发明还发现细胞表面的耗竭标记物也存在差异，尤其是TIM3和LAG3，抗CD7抗体的加入显著降低了细胞表面这两种标记物的表达量，TIM3的平均免疫荧光强度(MFI)从8859.0降至5991.0(P<0.0001)，同样LAG3的平均免疫荧光强度也从1727.0降至753.3(P＝0.0107)。但是对CTLA4的影响不大(P＝0.9826)，结果如图15。

因为CD8⁺T细胞群比例在转导抗CD7 CAR后异常降低，所以本发明对加了抗体的CART 1+PUT644组进行了10天的检测。为了更好的比较，我们将第2天的比例归一化为100％，结果发现，PUT644抗体的加入缓解了CD8⁺T细胞群的减少甚至有恢复的趋势(图16a)。为进一步探究其中可能的机制，我们发现晚期耗竭状态的TIM3和LAG3双阳(TIM3⁺LAG3⁺)的细胞群比例在两组T细胞之间存在显著性差异，更值得注意的是，PUT644抗体的加入虽然同时降低了CD4⁺T细胞群和CD8⁺T细胞群中TIM3⁺LAG3⁺细胞比例，但是CD8⁺TIM3⁺LAG3⁺细胞群下降比例更为显著(图16b)。

实施例9加入抗体培养的抗CD7 CAR-T细胞的功能研究

1、构建并筛选高表达GFP的Jurkat稳定株

本发明采用电转的方式构建高表达GFP的细胞株，并加入嘌呤霉素(Puromycin)筛选获得稳定株，流式检测Jurkat稳定株的GFP表达情况，结果显示Jurkat细胞中GFP表达率达到90.4％(图17)。

2、抗CD7 CAR-T细胞对Jurkat细胞的体外流式杀伤实验

用流式细胞术检测存活的靶细胞(7AAD^-GFP⁺)，图18结果表明靶细胞和效应细胞按照1:1比例共孵育后，mock组的靶细胞比例基本不变，仍维持在50％左右，而CAR-T 1+PUT644组相对于mock组来说从51.7％下降至16.1％，说明CAR-T细胞能够有效靶向并杀伤CD7⁺靶细胞。

3、抗CD7 CAR-T细胞对Jurkat细胞的LDH体外杀伤实验

在LDH杀伤实验前，本发明检测了靶细胞Jurkat和Raji表面CD7抗原的表达情况，根据图19a结果，Raji细胞和Jurkat细胞的CD7阳性率分别为1.07％和98.9％，我们选择Jurkat细胞作为阳性靶细胞。

LDH杀伤结果显示在5:1和2.5:1的效靶比下，CAR-T 1+PUT644细胞组均有明显的杀伤作用，而mock组没有，具体见图19b-图19d。

4、抗CD7 CAR-T细胞与Jurkat细胞共孵育后细胞因子释放实验

为了验证抗CD7 CAR-T细胞释放杀伤性细胞因子IFN-γ和TNF的能力，效应细胞和靶细胞按照比例10：1，5：1，2.5：1共孵育24h，上清的检测结果如图20。图20为CAR-T 1+PUT644组细胞与mock组杀伤上清中TNF和IFN-γ的浓度(pg/ml)检测情况。数据表明相对于mock组，CAR-T 1+PUT644组释放了大量杀伤性细胞因子IFN-γ和TNF，并且释放量与效靶比成正相关。

本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。此外，本文所述的任何理论、机制、证明或发现旨在进一步增强对本发明的理解，并且不意图以任何方式将本发明限制到这样的理论、机制、证明或发现。尽管已经在附图和前面的描述中详细地示出和描述了本发明，但是本发明应当被认为是说明性的而不是限制性的。

序列表

<110> 上海优卡迪生物医药科技有限公司

<120> 一种封闭抗体及其在制备靶向T细胞表达抗原的CAR-T细胞中的应用

<130> YXSC-WHYY-NP-21-101032

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

atggccctgc ccgtgaccgc tcttctactg cctctggcgc tcttgttaca cgccgcaaga 60

cca 63

<210> 3

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Glu Ile Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Thr Phe Gly

85 90 95

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp

100 105 110

Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu

115 120 125

Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu

130 135 140

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp

145 150 155 160

Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser

165 170 175

Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe

180 185 190

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser

195 200 205

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Asp

210 215 220

Gly Tyr Tyr Pro Gly Trp Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

225 230 235 240

Thr Val Ser Ser

<210> 4

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

gacatcgagc tcactcagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga ggagatcacc 60

ctaacctgca gtgccagctc gagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120

acttctccca aactcttgat ttatagcaca tccaacctgg cttctggagt cccttctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gaccttttat tctctcacaa tcagcagtgt ggaggctgaa 240

gatgctgccg attattactg ccatcagtgg agtagttaca cgttcggagg gggcaccaag 300

ctggaaatca aacggggtgg cggtggctcg aactggagcc atccgcagtt tgaaaaaggt 360

ggcggcggat ctcaggtgaa gctgcaggag tcagggggag gcttagtgaa gcctggaggg 420

tccctgaaac tctcctgtgc agcctctgga ttcactttca gtagctatgc catgtcttgg 480

gttcgccaga ctccggagaa gaggctggag tgggtcgcaa ccattagtag tggtggtagt 540

tacacctact atccagacag tgtgaagggg cgattcacca tctccagaga caatgccaag 600

aacaccctgt acctgcaaat gagcagtctg aggtctgagg acacggccat gtattactgt 660

gcaagacagg atggttacta cccgggctgg tttgctaact gggggcaagg gaccacggtc 720

accgtctcct ca 732

<210> 5

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr

35 40 45

<210> 6

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

accacgacac ccgcccccag accgccaaca cctgcgccta ctatcgccag ccagccactg 60

agtctccggc ccgaggcatg ccgacccgct gctggcggag ccgtgcacac aaggggtttg 120

gacttcgcat gtgatattta c 141

<210> 7

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 7

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 8

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 8

atctgggccc ccctggctgg cacctgcggc gtgctcctct taagcctggt tataacgttg 60

tactgt 66

<210> 9

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 9

Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His

1 5 10 15

Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln

20 25 30

Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile

35 40

<210> 10

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 10

gccctgtacc ttctaagacg agaccagagg ttaccccctg atgcacacaa gccacccggc 60

ggcggtagct tccggacccc tatccaagag gaacaggctg atgcacactc aactctggcc 120

aagatt 126

<210> 11

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 11

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 12

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 12

agaagcaagc gcagtcgact gttgcactcc gactacatga acatgacccc ccgtaggccc 60

ggcccaacac ggaaacatta tcagccttac gcccctccaa gggatttcgc tgcatacaga 120

tct 123

<210> 13

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 13

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 14

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 14

agagtgaagt tcagcaggtc cgccgacgca cccgcctacc agcagggcca aaaccagctg 60

tacaatgagc ttaaccttgg gcggcgtgaa gaatacgatg ttctcgataa gaggcgagga 120

cgggatcctg agatgggagg taaaccccgc cggaagaacc cacaagaggg gctgtataat 180

gagctccaga aggacaagat ggctgaagcc tactcagaga tcggaatgaa gggagagagg 240

cgcagaggga aaggccacga cggcctgtac cagggcctca gcaccgccac gaaggatact 300

tatgatgcat tacacatgca agcgctgcct ccaaga 336

<210> 15

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 15

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Glu Ile Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Thr Phe Gly

85 90 95

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 16

<211> 315

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 16

gacatcgagc tcactcagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga ggagatcacc 60

ctaacctgca gtgccagctc gagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120

acttctccca aactcttgat ttatagcaca tccaacctgg cttctggagt cccttctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gaccttttat tctctcacaa tcagcagtgt ggaggctgaa 240

gatgctgccg attattactg ccatcagtgg agtagttaca cgttcggagg gggcaccaag 300

ctggaaatca aacgg 315

<210> 17

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 17

Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Asp Gly Tyr Tyr Pro Gly Trp Phe Ala Asn Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 18

caggtgaagc tgcaggagtc agggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120

ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtagtta cacctactat 180

ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240

ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagacaggat 300

ggttactacc cgggctggtt tgctaactgg gggcaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 19

atggccctgc ccgtgaccgc t 21

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 20

tcttggaggc agcgcttgca tg 22

<210> 21

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 21

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Ser Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 22

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 22

gacatcgagc tcactcagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagcgtcagt 60

ctttcctgca gggccagcca aagtattagc aacaacctac actggtatca acaaaaatca 120

catgagtctc caaggcttct catcaagtct gcttcccagt ccatctctgg gatcccctcc 180

aggttcagtg gcagtggatc agggacagat ttcactctca gtatcaacag tgtggagact 240

gaagattttg gaatgtattt ctgtcaacag agtaacagct ggccgtacac gttcggaggg 300

gggacaaagt tggaaataaa acgg 324

<210> 23

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 23

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Lys Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Val Tyr Tyr Asp Leu Tyr Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 24

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 24

caggtccagc tgcaggagtc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120

cctggacaag gccttgagtg gattggaaag attaatccta gcaacggtcg tactaactac 180

aatgagaagt tcaagagcaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaggggga 300

gtctactatg acctttatta ctatgctctg gactactggg gccaaggcac cacggtcacc 360

gtctcctca 369

<210> 25

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 25

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 26

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 26

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 27

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 27

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Thr Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 28

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 28

Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly

1 5 10 15

Gly Gly Ser

Claims

1.一种封闭抗体，其特征在于，所述封闭抗体的重链可变区和轻链可变区分别与待封闭的CAR-T细胞的scFv的重链可变区和轻链可变区相同；所述待封闭的CAR-T细胞的scFv靶向T细胞表达抗原。

2.如权利要求1所述的封闭抗体，其特征在于，所述T细胞表达抗原选自CD7、CD3、CD4、CD8、CD38、CD34、nTdT、CD99、CD1a、CD10、cyCD3、CD5和CD2中的一种或多种。

3.如权利要求2所述的封闭抗体，其特征在于，所述T细胞表达抗原为CD7；所述待封闭的CAR-T细胞的scFv为CD7 scFv；所述封闭抗体的重链可变区包含与所述CD7 scFv的重链可变区的氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；所述封闭抗体的轻链可变区包含与所述CD7 scFv的轻链可变区的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。

4.如权利要求3所述的封闭抗体，其特征在于，所述CD7 scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示或如SEQ ID NO.21所示；所述CD7 scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示或如SEQ ID NO.23所示。

5.如权利要求3所述的封闭抗体，其特征在于，所述封闭抗体的重链可变区的氨基酸序列选自如下a1)-a4)任意一种的氨基酸序列：

6.如权利要求1所述的封闭抗体，其特征在于，所述封闭抗体包含所述轻链可变区、所述重链可变区、连接序列linker、Fc区和His标签；所述Fc区为人源lgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc段。

7.如权利要求6所述的封闭抗体，其特征在于，所述连接序列linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示、如SEQ ID NO.26所示、如SEQ ID NO.27所示或如SEQ ID NO.28所示。

8.一种靶向T细胞表达抗原的CAR-T细胞，其特征在于，所述靶向T细胞表达抗原的CAR-T细胞上结合有如权利要求1所述的封闭抗体。

9.如权利要求8所述的靶向T细胞表达抗原的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，将所述封闭抗体添加至所述待封闭的CAR-T细胞的培养体系中，防止所述待封闭的CAR-T细胞在培养中的自我损伤，得到所述靶向T细胞表达抗原的CAR-T细胞。

10.如权利要求9所述的靶向T细胞表达抗原的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、制备所述待封闭的CAR-T细胞；

步骤二、制备所述封闭抗体；

11.如权利要求10所述的靶向T细胞表达抗原的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述添加有封闭抗体的培养基中所述封闭抗体在所述培养基中的浓度为0.72-2.88μg/mL。

12.一种含封闭抗体和待封闭的CAR-T细胞的药物组合物，其特征在于，包含如权利要求1所述的封闭抗体和所述待封闭的CAR-T细胞。

13.一种应用，其特征在于，如权利要求1-7任一项所述的封闭抗体、如权利要求8所述的靶向T细胞表达抗原的CAR-T细胞，和/或如权利要求12所述含封闭抗体和待封闭的CAR-T细胞的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为免疫系统引发的肿瘤。

15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述免疫系统引发的肿瘤为急性淋巴细胞白血病、髓系白血病，骨髓瘤，淋巴瘤中的一种或者多种。

16.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述急性淋巴细胞白血病为T急性淋巴细胞白血病。