CN102875685B - 嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物与新医药技术领域。公开了一种嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ及其用途。该嵌合抗原受体由人凝血因子Ⅶ轻链（human factor VII light chain，hFVIIL）、CD8的hinge区和跨膜区及OX40和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。该嵌合抗原受体能用于修饰T细胞，修饰后的T细胞用于肿瘤的治疗。
Description
技术领域
本发明属于生物与新医药技术领域。具体说是一种嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ的制备及其用他途。其制备涉及利用分子生物学技术将编码人凝血因子Ⅶ轻链（human factor VII light chain，hFVIIL）、CD8的跨膜区和胞内区及OX40和CD3ζ的胞内信号结构域的核苷酸序列依次连接起来，得到编码嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ的融合基因片段，并在其5’末端插入信号肽Ig κ的编码序列。然后将该基因片段插入慢病毒表达载体，包装成慢病毒。利用该慢病毒感染人T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。这种T细胞能够识别肿瘤细胞表面的组织因子，用于肿瘤治疗。
背景技术
嵌合抗原受体是模拟T细胞受体功能的人工受体，由抗原识别结构域（配体或单链抗体）和T细胞的一系列信号结构域依次连接而成。利用嵌合抗原受体修饰T细胞能够将配体或抗体的特异性识别作用与T细胞的效应功能联合起来，进行肿瘤靶向免疫治疗。此疗法是对人体自身T细胞加以改造后用于治疗，相对于放、化疗，其毒副作用较弱。由于嵌合抗原受体修饰的T细胞通过其抗原识别结构域识别肿瘤细胞表面抗原，然后启动杀伤作用，因此其治疗具有靶向性。由于该种T细胞通过其嵌合抗原受体直接识别肿瘤细胞表面抗原，然后通过其信号结构域直接将识别信号传递至胞内，激活T细胞的杀伤活性，因此可以绕开常规细胞免疫的主要组织相容复合体(MHC)限制性，从而有效克服肿瘤细胞MHC表达量低造成的免疫逃逸，并可以靶向非蛋白质肿瘤抗原。
组织因子（TF）高表达于多种恶性肿瘤细胞（肺癌、乳腺癌、肝癌等）及肿瘤血管内皮细胞，而在正常细胞及正常血管内皮细胞不表达或低表达。因此， TF是肿瘤靶向治疗的潜在位点。凝血因子Ⅶ是TF的天然配体，其与TF结合的亲和力（以Kd值表示）可达10-12 M，而目前报道的抗TF抗体与TF的亲和力仅为10-8-10-9 M。正常生理情况下，活化的凝血因子Ⅶ由N端的轻链和C端的重链两部分构成，轻链主要负责受体结合活性，重链主要负责凝血酶活性。因此，人凝血因子Ⅶ轻链（human factor Ⅶ light chain，hFⅦL）可以作为针对组织因子的抗肿瘤药物的靶向载体。
嵌合抗原受体靶点识别结构域的灵活性及其与T细胞表面的空间距离，对于嵌合抗原受体修饰T细胞的特异杀伤活性至关重要。CD8是CD8+ T细胞表面的一个天然Marker，其hinge区是一个柔性区域。因此，其hinge区和跨膜区可以用来连接嵌合抗原受体的靶点识别结构域和胞内信号结构域。
CD3分子通过盐桥与T细胞受体（TCR）相连，其胞内段含有三个免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM），TCR识别并结合由MHC分子提呈的抗原肽后，导致CD3的ITAM的酪氨酸残基磷酸化，进而激活T细胞。因此，CD3分子是T细胞活化过程中的重要分子，其胞内结构域是T细胞活化所必需的。
OX40是T细胞的共刺激分子，它与T细胞中的受体结合后可以有效阻止T细胞的凋亡，增强细胞因子的生产，对维持T细胞的杀伤活性，提升T细胞的存活能力具有重要作用。因此，在嵌合抗原受体中加入共刺激分子OX40对于增强嵌合抗原受体修饰T细胞的存活能力，增强其肿瘤细胞杀伤活性具有重要作用。
发明内容
本发明提供一种嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ，它是一种融合蛋白。该嵌合抗原受体由人凝血因子Ⅶ轻链、CD8的hinge区和跨膜区及OX40和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。该嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。该嵌合抗原受体含有针对人组织因子的人凝血因子Ⅶ轻链，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。该嵌合抗原受体以CD8的hinge区和跨膜区及OX40和CD3ζ的胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。
该嵌合抗原受体的编码基因能够被转移至T细胞内，用于修饰T细胞；利用该嵌合抗原受体修饰的T细胞，能够通过识别肿瘤细胞表面的组织因子，杀死肿瘤细胞，进行肿瘤治疗。
本发明通过基因合成技术合成由编码CD8的跨膜区和胞内区及OX40和CD3ζ胞内信号结构域的核苷酸序列构成的融合基因片段CD8-OX40-CD3ζ。通过巢式PCR在人凝血因子Ⅶ轻链的5’端加上Ig κ信号肽编码序列，得到融合基因序列IGK-hFⅦL。然后通过重叠延伸PCR技术将融合基因片段IGK-hFⅦL和CD8-OX40-CD3ζ拼接成编码嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ的融合基因片段，命名为IGK-hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ。然后将该融合基因片段插入慢病毒表达载体中，包装成携带IGK-hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ编码基因的慢病毒。利用该慢病毒感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。通过LDH细胞毒性分析实验证明该嵌合抗原受体修饰的T细胞对肿瘤细胞具有特异杀伤作用。因此本发明所述的嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ可在肿瘤治疗中应用。
附图说明
图1 是本发明所述的在人凝血因子Ⅶ轻链（hFⅦL）编码基因的5’端加上Ig κ信号肽编码序列的3次巢式PCR扩增电泳图，图中，1泳道：DNA分子量标记；2泳道：用P1和P4进行第一次巢式PCR的扩增产物（482 bp）；3泳道：用引物P2和P4进行第二次巢式PCR的扩增产物（509 bp）；4泳道：用引物P3和P4进行第三次巢式PCR扩增得到的融合基因片段IGK-hFⅦL（537 bp）；
图2 是本发明所述编码嵌合抗原受体IGK-hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ的融合基因全长序列扩增电泳图，图中，1泳道：DNA分子量标记；2泳道：编码IGK-hFⅦL的DNA片段（537 bp）；3泳道：编码CD8-OX40-CD3ζ的DNA片段（661 bp）；4泳道：编码嵌合抗原受体IGK-hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ的融合基因片段（1198 bp）。
图3 是本发明所述的慢病毒表达质粒（pLVX-IGK-hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ）的示意图，其中，逆时针序列为正向基因片段，顺时针为反向基因片段。
图4 是本发明所述慢病毒表达质粒pLVX-IGK-hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ的限制性内切酶酶切片段电泳鉴定图，其中，1泳道：DNA分子量标记；2泳道：慢病毒表达质粒pLVX-IGK-hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ（9390bp）；3泳道：用限制性内切酶EcoR I和Xba I双酶切慢病毒表达质粒pLVX-IGK-hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ后所得到的编码IGK-hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ的DNA片段（1198 bp）和载体片段（8192 bp）；
图5 是流式检测嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ在T细胞中的表达效率图。
图6 是Western blot检测人肺癌细胞NCI-H292、人乳腺癌MDA-MB-231、人结肠癌HCT-116、人肺癌A549、人成纤维细胞BJ和人乳腺癌细胞MCF-7中组织因子的表达量。
图7 是本发明所述的嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ修饰的T细胞对人肺癌细胞NCI-H292杀伤作用的LDH实验分析图，其中, 
：嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ修饰的T细胞实验组；
：不加修饰的T细胞实验组。
图8 是本发明所述的嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ修饰的T细胞对人乳腺癌细胞MCF-7杀伤作用的LDH细胞毒性分析图，其中, 
：效应细胞与靶细胞的数目比为10:1；
：效应细胞与靶细胞的数目比为3:1；CAR-T：嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ修饰的T细胞实验组；GFP-T：对照病毒修饰的T细胞实验组；T：不加修饰的T细胞实验组。
具体实施方式
实施例1：嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ的慢病毒表达载体的构建
（一）融合基因片段IGK-hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ的制备
P1: 5’-GCCAGCGTGATCATGAGCCGCGGCGCCAACGCGTTCCTGGAGGAGCTG -3’
Ig κ信号肽hFⅦL
P 2: 5’-GCAGATCTTCAGCTTCCTGCTGATCAGCGCCAGCGTGATCATGAGCCGC-3’
Igκ信号肽
P 3: 5’-ATATCTCGAGCCACCATGGACTTCCAGGTGCAGATCTTCAGCTTCCTGC-3’
EcoR IIg κ信号肽
P 4: 5’-GTGGTCGCGGCGCTGGCGTCGTGGTTCGGCCTTGGGGTTTGCTGGCATT-3’
CD8 hingehFⅦL
P 5: 5’-AATGCCAGCAAACCCCAAGGCCGAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCAC-3’
hFⅦLCD8 hinge
P 6: 5’-AATT TCTAGATCAGCGAGGGGGCAGGGCCTGCATGTG-3’
Xba ICD3ζ
以上引物由华大基因科技有限公司合成。
以编码人凝血因子Ⅶ的cDNA片段（NM_000131，购自广州复能基因有限公司）为模板，用引物P1和P4进行第一次PCR扩增，得到长482 bp的DNA片段。PCR反应条件参照Primer star DNA聚合酶（购自Takara公司）的说明书，反应体系（50ul）如下：
双蒸水：31.5ul
5×反应buffer：10ul
dNTP Mix：4ul
P1（10mM）:1ul
P4（10mM）:1ul
人凝血因子Ⅶ cDNA (100ng/ul)：2ul
Primer star DNA聚合酶：0.5ul
将上述第一次PCR的产物跑1.5%琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒（购自天根生化科技有限公司）进行DNA片段回收，具体方法见说明书。
分别用P2/P4和P3/P4两对引物，以前一次PCR产物为模板重复上述PCR操作，最终得到长度为537 bp的DNA片段，该DNA片段依次包含编码Ig κ信号肽和人凝血因子Ⅶ轻链的编码序列，并在5’端加上EcoRI的酶切位点。将该DNA片段命名为IGK-hFⅦL（见图1）。
（二）融合基因片段IGK-hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ的制备
构建含有CD8的跨膜区和胞内区及OX40和CD3ζ胞内信号结构域编码序列的质粒pUC57-CD8-OX40-CD3ζ（CD8-OX40-CD3ζ的DNA编码序列见序列表SEQ ID NO.5），以其为模板，以引物P5和P6进行PCR扩增，得到长661 bp的DNA片段，P6中引入Xba I的酶切位点。PCR反应条件参照Primer star DNA聚合酶（购自Takara公司）的说明书，反应体系（50ul）如下：
双蒸水：31.5ul
5×反应buffer：10ul
dNTP Mix：4ul
P5（10mM）:1ul
P6（10mM）:1ul
pUC57-CD8-OX40-CD3ζ(100ng/ul)：2ul
Primer star DNA聚合酶：0.5ul
将上述PCR产物跑1%琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒（购自天根生化科技有限公司）进行DNA片段回收，具体方法按说明书进行。得到编码CD8的跨膜区和胞内区及OX40和CD3ζ胞内信号结构域的DNA片段，命名为CD8-OX40-CD3ζ。
以回收得到的IGK-hFⅦL和CD8-OX40-CD3ζDNA片段为模板，用引物P4和P6进行重叠延伸PCR扩增得到长度1198 bp，含有Ig κ信号肽、人凝血因子Ⅶ轻链、CD8的跨膜区和胞内区及OX40和CD3ζ胞内信号结构域的DNA片段，命名为IGK-hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ（见图2）。PCR反应条件参照Primer star DNA聚合酶（Takara公司）的说明书，反应体系（50ul）如下：
双蒸水：31.5ul
5×反应buffer：10ul
dNTP Mix：4ul
P3（10mM）：1ul
P6（10mM）：1ul
IGK- hFⅦL DNA片段(100ng/ul)：1ul
CD8-OX40-CD3ζDNA片段(100ng/ul)：1ul
Primer star DNA聚合酶：0.5ul
（三）将融合基因片段IGK-hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ插入慢病毒表达载体pLVX-IRES-puro
将融合基因片段IGK-hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ和慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen（购自Clontech公司）用限制性内切酶EcoR I和Xba I（购自Fermentas公司）分别进行双酶切，具体方法见说明书。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后用琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒（购自天根生化科技有限公司）进行DNA片段回收，具体方法按说明书进行。将回收的融合基因片段和载体片段通过T4连接酶（购自Fermentas公司）进行连接，具体方法见说明书。将连接产物转化E.coli DH5α，37℃培养后挑取单克隆，37℃培养12 h后用质粒提取试剂盒（购自天根生化科技有限公司）提取质粒，具体方法见说明书。提取的质粒经限制性内切酶EcoR I和Xba I双酶切鉴定（见图3）。将鉴定正确的质粒送华大基因科技有限公司对插入的融合基因片段进行测序。将测序结果正确的重组质粒命名为pLVX-hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ（见图4）。
实施例2：嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ修饰的T细胞的制备
（一）慢病毒的包装制备
用QIAGEN公司的质粒提取试剂盒（Catalog no. 12662）分别提取慢病毒表达质粒pLVX-hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ和辅助质粒psPAX2、pMD2.G。三种质粒以4:3:1的比例用lipo2000转染试剂（购自Invitrogen公司）进行转染，具体方法见lipo2000转染试剂说明书。转染48小时后，将含有病毒的细胞培养上清吸入EP管中，4 ℃ 2000 g离心10min，转移上清至新EP管中，4.5 μm滤器过滤后-80 ℃保存。
（二）T细胞的制备
取10 ml健康人的新鲜血液，用淋巴细胞分离液（购自Mediatech公司）分离外周血单核细胞，具体方法见说明书。用含有300 IU/ml的IL-2、50 ng/ml的OKT-3和5% 人AB血清（购自Invitrogen公司）的AIM-V培养基（购自Invitrogen公司）诱导培养48 h，得到T细胞。
（三）慢病毒感染T细胞及感染后T细胞的扩增培养
从-80℃取出2 ml病毒液，加入终浓度为8 μg/ml的聚凝胺（购自Sigma公司），用该病毒液重悬1×106个上述诱导培养的T细胞。将细胞悬液加入24孔板的1个孔中，1000g，32℃，离心1 h。37℃，5% CO2培养箱内培养8 h后，1000g，32℃，再次离心1 h。吸弃1.4 ml培养上清，加入1.4 ml新鲜的含有300 IU/ml的IL-2、50 ng/ml的OKT-3和5% 人AB血清的AIM-V培养基，继续培养。每2-3天检测一次细胞浓度，当细胞浓度达到2×106个/ml时，1000g，32℃，离心1 h。吸取1 ml细胞悬液，加入另一个孔中，分别向两个孔中加入1 ml新鲜的含有300 IU/ml的IL-2和5%人AB血清的AIM-V培养基，继续扩大培养。如此反复，直至细胞扩增至足够的用量。
（四）流式细胞术检测嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ在T细胞内的表达效率
取1×106个上述慢病毒感染后并扩增的T细胞和未感染的T细胞，1000rpm离心5 min，重悬于80 μl PBS中，加入20 μl FITC标记的山羊抗人IgG, F(ab')2抗体（构自eBioscience），4℃孵育30 min，PBS洗涤细胞两次，1 ml PBS重悬细胞，流式细胞仪检测嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ在T细胞表面的表达效率为45.2%（见图5）。
实施例3：嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ修饰的T细胞的抗肿瘤作用
（一）Western Blot检测人肿瘤细胞表面组织因子的表达量
取对数生长期的人肺癌细胞NCI-H292、人乳腺癌MDA-MB-231、人结肠癌HCT-116、人肺癌A549、人成纤维细胞BJ和人乳腺癌细胞MCF-7，PBS洗细胞3次，用细胞刮刀刮下细胞，4℃，3000 rpm离心5 min收集细胞沉淀，加入300 μl lysis buffer(20 mM Tris-HCl，PH7.9，150 mM NaCl，10 mM KCl，0.5 mM EDTA，0.5% NP-40，10% Glycerol，1.5 mM MgCl2，0.5 mM PMSF，2 mM DTT，2.5 mM CaCl2)，冰上裂解10 min，涡旋振荡，2 min/次，共5次，17000g 4℃离心5 min，吸取上清。取适量上清液，用山羊抗人组织因子的单克隆抗体进行western blot检测，以β-actin为内参。结果显示组织因子在人肺癌细胞NCI-H292、人乳腺癌MDA-MB-231细胞内高表达，在人结肠癌HCT-116、人肺癌A549、人成纤维细胞BJ低表达，在人乳腺癌细胞MCF-7中不表达（见图6）。
（二）LDH释放分析检测嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ修饰的T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性
分别取5×104个人肺癌NCI-H292细胞（高表达组织因子）和人成纤维细胞BJ接种于96孔板，过夜培养后，分别向两种细胞培养孔中按效应细胞（E）：靶细胞（T）=10、3的比例加入嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ修饰的T细胞（CAR-T），对照病毒修饰的T细胞(GFP-T)和未加修饰的T细胞(T)。共孵育5 h后，按照LDH细胞毒性分析试剂盒（购自Cayman Chemical公司）说明书进行操作，检测嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ修饰的T细胞对人肺癌NCI-H292细胞的特异杀伤活性。结果显示嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ修饰的T细胞（CAR-T）与对照组T细胞（GFP-T组和T细胞组）相比，在效靶比为10:1和3:1的情况下，对高表达TF的人肺癌NCI-H292细胞都具有更强的杀伤作用，且这种差异具有显著性（p<0.05）（见图7）；对低表达TF的人成纤维细胞BJ的杀伤作用无显著性差异（p>0.05）（见图8）。因此嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ修饰的T细胞对高表达TF的肿瘤细胞具有特异杀伤活性。
Claims (3)
1.一种嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ，其特征在于：该嵌合抗原受体由肽人凝血因子Ⅶ轻链、CD8的hinge区和跨膜区及OX40和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成；该嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ，其特征在于：该嵌合抗原受体含有针对人组织因子的人凝血因子Ⅶ轻链，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。
3.如权利要求1所述的嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ，其特征在于：该嵌合抗原受体以CD8的hinge区和跨膜区及OX40和CD3ζ的胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。
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| Publication number | Publication date |
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| CN102875685A (zh) | 2013-01-16 |
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