CN110183537A - 一种egfr特异性嵌合抗原受体、编码基因、car-t细胞及其制备方法、重组细胞和应用 - Google Patents

一种egfr特异性嵌合抗原受体、编码基因、car-t细胞及其制备方法、重组细胞和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种EGFR特异性嵌合抗原受体及其编码基因，通过向现有的CAR质粒的scFv中构建入与EGFR胞外结构域特异性结合抗体的编码基因的核酸序列所合成得到。本发明还公开了一种EGFR特异性的CAR‑T细胞及其制备方法，通过在T细胞上表达本发明的EGFR特异性嵌合抗原受体而制得。本发明还公开了一种重组细胞，能够表达本发明的EGFR特异性嵌合抗原受体的免疫效应细胞。本发明还公开了上述产品的应用。本发明的CAR‑T细胞对EGFR具有特异识别性，可以靶向杀伤EGFR阳性癌细胞并促进EGFR阳性癌细胞杀伤细胞因子的释放。

Description

一种EGFR特异性嵌合抗原受体、编码基因、CAR-T细胞及其制 备方法、重组细胞和应用
技术领域
本发明涉及生物与医药技术领域，尤其涉及一种EGFR特异性嵌合抗原受体、编码基因、CAR-T细胞及其制备方法、重组细胞和应用。
背景技术
据2018全球癌症年报统计，乳腺癌依旧是女性中发病率的癌症类型，仅在2018年，全球就预计新增208100个乳腺癌病例，死于乳腺癌的女性患者达到630000例。据2018《中国肿瘤登记年报》统计，我国乳腺癌新发病例约为279000例，死亡病例约为66000例。预计2021年，我国乳腺癌患者将达250万。乳腺癌严重危害患者生命和生活质量，同时治疗费用及相关社会经济问题给个人和国家带来沉重负担。但由于特定历史、经济等原因，我国医药产业基础弱于欧美，创新型药物及治疗手段长期依赖于进口和模仿。随着知识产权的保护及限制，模仿不可能称为我国医药发展的长期目标。因而建立具有自主知识产权的创新型药物、创新型疗法成为我国现阶段医药发展的当务之急。
乳腺癌在不同患者中差异很大，差异体现在临床诊断、形态发生和分子分型中。按照组织分期、肿瘤体积、淋巴结浸润、受体特征和信号通路等，乳腺癌可以被分成多种类型。根据ERα、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体-2(HER2)的表达情况，可以将乳腺癌分为ERα+、HER2+和三阴性乳腺癌(TNBC)三种类型。针对ERα+、HER2+乳腺癌临床采用内分泌疗法或特异性的靶向治疗药物，效果良好，而针对三阴性乳腺癌尚无特异性靶向治疗药物，化疗和放疗是手术后主要干预手段，但预后较差。随着对三阴性乳腺癌研究的深入，已有研究证明EGFR在45％—70％三阴性乳腺癌中高表达，且EGFR表达高低与乳腺肿瘤大小和预后直接相关。在乳腺癌中，EGFR表达紊乱大部分归因于EGFR异常过表达，而EGFR突变率较低。大量研究显示，EGFR在中国、日本、韩国、欧洲、澳洲、美洲三阴性乳腺癌患者中突变率极低。所以野生型EGFR几乎可以作为全球通用EGFR阳性乳腺癌直接治疗靶点，目前临床中针对于EGFR阳性乳腺癌治疗药物有单克隆抗体类和小分子抑制剂类，且60％以上的病人对上述药物有反应。但由于二次突变、其他激酶改变及反馈调节等原因，在抗EGFR治疗过程中会出现耐药、不敏感等现象。因此，为EGFR阳性乳腺癌患者寻找新的治疗方案和可替代手段，对推动乳腺癌治疗有着重要科学价值和社会意义。
表皮生长因子受体EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)是上皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体。EGFR属于ErbB受体家族的一种，该家族包括EGFR(ErbB-1)，HER2/c-neu(ErbB-2)，HER3(ErbB-3)和HER4(ErbB-4)。EGFR也被称作HER1、ErbB1，突变或过表达一般会引发肿瘤。EGFR属于酪氨酸激酶型受体，分子量170KDa。EGFR位于细胞膜表面，靠与配体结合来激活。
近些年来，细胞免疫疗法在癌症治疗方面显示出广泛的潜力。特别是嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)技术备受临床研究青睐，尤其在血液系统恶性肿瘤中得到广泛研究。CAR-T,全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，和其它免疫疗法类似，它的基本原理是利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞。嵌合抗原受体(CAR)由胞外抗原结合域、跨膜结合域和胞内信号传导结构域组成。CAR-T细胞治疗技术是指通过CAR结构在体外进行基因重组得到重组质粒再在体外将其导入到患者的T细胞内，从而获得能够表达上述嵌合抗原受体的CAR-T细胞，然后经过纯化和体外大规模扩增后，通过将上述CAR-T细胞输回患者体内行驶杀灭肿瘤细胞的功能。
在结构上,CARs包括单链抗体(scFv)区域、跨膜区域、胞内的T细胞活化信号域(通常是CD3ζ链)和协同刺激信号域(CD28、4-1BB、OX40等)。不同于一般T细胞通过T细胞受体(TCR)识别抗原，CAR-T细胞不受主要组织相容性复合体的限制，直接通过胞外的scFv识别肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原(TAA),从而杀伤肿瘤。第一代CAR仅有来自CD3ζ链的活化信号，当scFv识别到TAA后将信号转入胞内，由CD3ζ信号引发T细胞的激活。为提高CAR-T细胞的寿命及功能，在第二代、第三代CAR中加入的协同刺激信号进一步增强了T的增殖能力、肿瘤细胞杀伤能力和分泌细胞因子的能力(IL-2、TNFα、IFN-γ等)。第四代CARs已纳入细胞因子或共刺激配体，以进一步提高其抗肿瘤能力。CAR-T细胞疗法在血液肿瘤治疗中取得的空前成功激励着人们把这一技术扩展应用到实体瘤上，越来越多的针对实体瘤抗原的CAR-T细胞疗法临床试验相继开展。到目前为止，第三代、第四代CAR-T疗法在结直肠癌、肺癌、恶性胸膜间皮瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌实体瘤临床前和临床实验阶段中也取得了很好的效果。在乳腺癌的应用基础研究中，针对AXL受体酪氨酸激酶(AXL)、杀伤细胞凝集素样受体K1(NKG2D)、ANTXR细胞粘附分子1(TEM8/ANTXR1)、表皮生长因子受体2(HER2)、表皮生长因子受体3(HER3)、整合素αvβ3(αvβ3)靶点的CAR-T疗法也取得了良好效果。随着生物医药产业对这一领域的重视程度越来越高，基于CAR-T细胞针对实体肿瘤疗法的基础和临床试验数量持续增加，未来10年实体肿瘤治疗将迎来免疫疗法新纪元，所以通过改变scFv单克隆抗体的重链及可变轻链可以使CAR-T靶向肿瘤特异性抗原治疗乳腺癌，已经具备很强的理论和实践基础。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的一个目的是提供一种EGFR特异性嵌合抗原受体。
本发明提供一种EGFR特异性嵌合抗原受体，包括EF1a启动子、EGFRscFv、铰链区、跨膜区域、协同刺激信号域、信号传导结构域；其中，所述的EGFR是表皮生长因子受体家族成员之一；所述的EGFRscFv表示EGFR单链抗体区，是针对EGFR靶点具有特异性的抗原结合域，编码所述的EGFRscFv的基因的核酸序列为SEQ ID NO:3；
所述的SEQ ID NO:3具体为：
GATATTGTATTGACCCAGCCCCCTTCCGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGGGGGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAGGAGTGCCGACATCGGAGCAAATTATGTATACTGGTACCAGCAACTTCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATTCTATTAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAACATGGGATGACAGCCTGGGTGGCTGGGCATTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCGggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctCAGGTGCAGCTACAGGAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTGTACGGTGGGTCCTTCAGTGATTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAGAAATCAGTCATAGCGGAAGTACCGGCTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCGCCATATCAGTTGACACGCCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAACTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTCTATATTATTGTGCGAGACTGACAACAGTGGTTGGGGGCAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCG。
本发明的EGFRscFv是采用常规生物合成方法进行合成，通过向现有的CAR质粒的scFv中构建入特异性强的EGFR胞外结构域结合抗体的编码基因的核酸序列所合成得到，所述特异性强的EGFR胞外结构域结合抗体的编码基因的核酸序列为SEQ ID NO:3。
本发明的另一个目的是提供一种编码本发明的EGFR特异性嵌合抗原受体的基因。所述的编码基因为EF1a-EGFRscFv-CDα Hinge-CD28 TM-41-BB-CD3ζ。
进一步地，所述编码基因的各部分核酸序列如下：
所述的EF1a为构建核苷酸序列的启动子，所述的EF1a的核酸序列为SEQ ID NO:2；
所述的SEQ ID NO:2具体为：
gagtaattcatacaaaaggactcgcccctgccttggggaatcccagggaccgtcgttaaactcccactaacgtagaacccagagatcgctgcgttcccgccccctcacccgcccgctctcgtcatcactgaggtggagaagagcatgcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacgcccctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcttgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtga。
所述的CDα Hinge为铰链区，编码所述的CDα Hinge的基因的核酸序列为SEQ IDNO:4；所述的SEQ ID NO:4具体为：
accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat。
所述的CD28 TM为CD28细胞内跨膜区域，编码所述的CD28 TM的基因的核酸序列为SEQ ID NO:5；所述的SEQ ID NO:5具体为：
ttctgggtgctggtcgttgtgggcggcgtgctggcctgctacagcctgctggtgacagtggccttcatcatcttttgggtgaggagcaagcggagcagactgctgcacagcgactacatgaacatgaccccccggaggcctggccccacccggaagcactaccagccctacgcccctcccagggatttcgccgcctaccggagc。
所述的41-BB是机体特异性免疫应答中的协同刺激信号域，编码所述的41-BB的基因的核酸序列为SEQ ID NO:6；所述的SEQ ID NO:6具体为：
aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg。
所述的CD3ζ为信号传导结构域，编码所述的CD3ζ的基因的核酸序列酸序列为SEQID NO:7；所述的SEQ ID NO:7具体为：
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc。
进一步地，所述编码基因的核酸序列为SEQ ID NO:1；所述的SEQ ID NO:1具体为：
gccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgattcgaagccaccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgGATATTGTATTGACCCAGCCCCCTTCCGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGGGGGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAGGAGTGCCGACATCGGAGCAAATTATGTATACTGGTACCAGCAACTTCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATTCTATTAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAACATGGGATGACAGCCTGGGTGGCTGGGCATTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCGggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctCAGGTGCAGCTACAGGAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTGTACGGTGGGTCCTTCAGTGATTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAGAAATCAGTCATAGCGGAAGTACCGGCTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCGCCATATCAGTTGACACGCCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAACTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTCTATATTATTGTGCGAGACTGACAACAGTGGTTGGGGGCAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatttctgggtgctggtcgttgtgggcggcgtgctggcctgctacagcctgctggtgacagtggccttcatcatcttttgggtgaggagcaagcggagcagactgctgcacagcgactacatgaacatgaccccccggaggcctggccccacccggaagcactaccagccctacgcccctcccagggatttcgccgcctaccggagcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcTAAtctagaccgcgtctggaacaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggaattaattctgcagtcgagacctagaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgattgtgcctggctagaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaagaggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattagcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatgggatggatgacccggagagagaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccggagtacttcaagaactgctgatatcgagcttgctacaagggactttccgctggggactttccagggaggcgtggcctgggcgggactggggagtggcgagccctcagatcctgcatataagcagctgctttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtagtagttcatgtcatcttattattcagtatttataacttgcaaagaaatgaatatcagagagtgagaggccttgacattgctagcgttttaccgtcgacctctagctagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggt。
本发明的另一个目的是提供一种EGFR特异性的CAR-T细胞的制备方法。所述制备方法包括在T细胞上表达如权利要求1所述的EGFR特异性嵌合抗原受体的步骤。
进一步地，所述的EGFR特异性的CAR-T细胞的制备方法包括如下步骤：采用三质粒包装系统进行慢病毒包装，三质粒分别为慢病毒包装质粒Pmd2.G、载体质粒PSPAX2、权利要求1所述的嵌合抗原受体，用293T细胞作为慢病毒的包装细胞，培养，收集病毒液，将此病毒液浓缩后，感染T细胞，即可获得针对EGFR靶点的CAR-T细胞，命名为EGFR-CAR-T细胞。
本发明的另一个目的是提供一种EGFR特异性的CAR-T细胞。所述的EGFR特异性的CAR-T细胞是采用上述所述的一种EGFR特异性的CAR-T细胞的制备方法制备得到。
本发明所述一种EGFR特异性的CAR-T细胞是指特异性识别EGFR靶点的CAR-T细胞。
本发明的另一个目的是提供一种重组细胞。所述重组细胞为能够表达权利要求1所述嵌合抗原受体的免疫效应细胞。
本发明的另一个目的是提供如上所述的EGFR特异性嵌合抗原受体或如上所述的EGFR特异性嵌合抗原受体的编码基因或如上所述的EGFR特异性的CAR-T细胞或如上所述的重组细胞在制备杀伤EGFR阳性癌细胞的产品中的应用。
进一步的，如上所述的EGFR特异性嵌合抗原受体或如上所述的EGFR特异性嵌合抗原受体的编码基因或如上所述的EGFR特异性的CAR-T细胞或如上所述的重组细胞在制备杀伤EGFR阳性三阴性乳腺癌细胞的产品中的应用。
在本发明中，“EF1a”是一种构建核苷酸序列的启动子，属于广泛表达的类型。启动子是基因的一个组成部分，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子是基因转录水平表达调控的重要和关键元件，在基因的调控方面起着决定性作用。EF1a长度约1200bp，它驱动能力较强，是目前分子平台上用的较多的广泛表达启动子。
“scFv”，是识别肿瘤相关特异性抗原的单链抗体片段，全称single-chainantibody fragment。scFv是指这样的抗体片段：其是包含通过接头(linker)连接的重链可变区(variable region of heavy chain，VH)和轻链可变区(variable region of lightchain，VL)的重组蛋白,接头使得这两个结构域相关联，以最终形成抗原结合位点。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。
“CDα Hinge”为嵌合受体铰链，起定位及连接作用。
术语“跨膜区域”和“跨膜部分”为等同概念，具有本领域技术人员通常已知的含义，指扩膜蛋白中连接蛋白的胞外区和胞内区的部分，其跨越细胞膜，通常为α-螺旋结构。构成蛋白质跨膜部分的氨基酸大部分是疏水性氨基酸。构成本发明的EGFR特异性的嵌合抗原受体的跨膜区域选自CD分子的跨膜部分。本发明优选的跨膜区域为CD28 TM，CD28 TM是CD28细胞内跨膜结构域，连接胞外结构域及胞内结构域，CD28是粘附分子免疫球蛋白超家族的一员，转导增殖信号并诱导细胞因子的产生，抑制肿瘤生长。
“41-BB”分子是肿瘤坏死因子受体(Tumor necrosis factor receptor,TNFR)超家族的成员，是除CD28/B7之外的另一重要的介导T细胞活化的共刺激分子。主要分布在活化的CD4阳性T细胞、CD8阳性T细胞和NK细胞表面，产生共刺激信号能够促进CD4阳性T细胞、CD8阳性T细胞和NK细胞增殖、分化及细胞因子的产生。41-BB分子的胞浆功能区含有5个氨基酸的保守序列，可介导T细胞活化的第二信号。本发明所述的41-BB分子的胞浆功能区是指能够介导T细胞活化的41-BB分子的胞浆区的全部或一部分。优选地，所述的41-BB分子的胞浆功能区包含或由SEQ ID NO:6所示核酸序列编码的氨基酸组成。
“CD3ζ”为信号转导域，当胞外区和目标抗原结合时，就会向胞内传导TCR样信号，激活T细胞，发挥靶向性杀伤肿瘤细胞的作用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明通过改变第三代CAR质粒的scFv单链抗体的重链及可变轻链，获得本发明的嵌合抗原受体对EGFR具有特异性，其在T细胞上表达之后所得到的CAR-T细胞针对EGFR靶点具有特异识别性，该CAR-T细胞可以靶向EGFR抗原从而治疗EGFR阳性癌细胞。该EGFR特异性的CAR-T细胞对EGFR阳性的癌细胞杀伤细胞因子释放量大，对EGFR高表达的癌细胞系的毒性大。在本发明的一些优选方案中，EGFR阳性三阴性乳腺癌细胞系的EGFR表达量高于非三阴性乳腺癌细胞系，本发明的EGFR特异性的CAR-T细胞对EGFR阳性三阴性乳腺癌细胞系细胞得毒性更大，可以高效的杀伤EGFR阳性三阴性乳腺癌细胞。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以一些实施例来详细说明。本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本实发明的不当限定。在附图中：
图1为第三代CAR质粒模式图；
图2为EGFR-CAR质粒结构图一；
图3为EGFR在乳腺癌细胞中的表达结果图；其中，图3A为定时定量PCR；图3B为蛋白质免疫印迹印迹；图3C为流式细胞法检测EGFR在MCF7、HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231中的表达量结果图；
图4为流式细胞法检测T细胞表型和亚群组成结果图；
图5为Con-CAR质粒结构图；
图6为EGFR-CAR质粒结构图二；
图7为Con-CAR质粒和限制性酶切产物琼脂糖凝胶电泳图；
图8为EGFR-CAR质粒和限制性酶切产物琼脂糖凝胶电泳图；
图9为蛋白质免疫印迹法检测外源CD3ζ在未转染T细胞、Con-CAR-T、EGFR-CAR-T中的表达结果图；
图10为流式细胞法检测CAR-T细胞与GFP、EGFR-GFP结合结果图；
图11为3种阳性乳腺癌细胞系(HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231)的EGFR被抑制后的三阴性乳腺癌中的EGFR的表达结果图；
图12为未转染T细胞(Non-transduced T cell)、Con-CAR-T细胞和EGFR-CAR-T细胞对EGFR阳性或阴性乳腺癌细胞杀伤细胞因子释放的实验结果柱形图；
图13为为未转染T细胞(Non-transduced T cell)、Con-CAR-T细胞和EGFR-CAR-T细胞对EGFR阳性或阴性乳腺癌细胞的细胞杀伤效果图。
具体实施方式
以下实施例所用的材料来源说明如下：
1.慢病毒表达质粒Lenti-EF1a-scFv-3rd-CAR，慢病毒包装质粒pMD2G，载体质粒PSPAX2购自爱康得生物医学技术有限公司。
2.EGFR-CAR质粒由爱康得生物医学技术有限公司合成。
3.T4DNA ligase、Free H2O购Biolabs。
4.感受态细胞购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
5.胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自Axygen。
6.293T细胞、MCF7细胞、HS578T细胞、MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞购自ATCC。
7.FBS、DMEM、1640培养基、PBS、Opti-MEM孵育试剂、lipofectamine 2000、SuperCultureTML500培养基购自Gibco。
8.细胞裂解液RIPA、蛋白酶抑制剂购自碧云天。
9.化学发光超敏显色试剂盒、Fc blocker封闭剂、蛋白Marker、Lipo2000转染试剂、Lenti-X慢病毒浓缩液购自Thermo。
10.脱脂奶粉购自BD。
11.PVDF膜购自Millipore。
12.Anti-CD3zeta antiboby购自abcam。
13Anti-EGFR antiboby购自CST。
14.CD3-PE-Cy7、CD4-PE、CD8-APC-Cy7、PE-Cy7、PE、APC-Cy7购自Biogems。
15.高压蒸汽灭菌锅购自致微。
16.鼓风干燥箱购自上海一恒。
17.酶标仪、流式细胞仪购自ThermoFisher。
18.PCR仪购自Eppendorf。
19.常温高速离心机、台式低速离心机购自Eppendorf。
20.水平电泳仪、蛋白电泳仪购自君意东方。
21.水浴锅购自力辰科技。
22.细胞计数器购自Countstar。
23.制冰机购自雪科。
24.摇床购自精骐。
25.生物安全柜、CO2细胞培养箱、超低温冰箱购自ThermoFisher。
26.移液器、电动助吸器购自Eppendorf。
27.注射器、0.45μm滤膜、各规格的培养皿、培养瓶、多孔培养板、各种规格离心管购自Corning。
28.淋巴细胞分离液购自sigma。
29.96孔板,规格96孔购自corning。
应当解释的，本发明实施例所涉及的材料为标明其来源的均是可以通过常规商业途径购买获得。
对本文中的以下的英文名称进行解释：
本发明提供一种EGFR-CAR-T细胞的构建方法，包括以下步骤：
1)通过淋巴细胞分离液结合低密度离心法从健康人血液中分离出单个核细胞；
2)将步骤1)所得的单个核细胞进行活化扩增，在含有50um CD3/CD28、IL-2的SuperCultureTML500培养，一周后细胞扩增量为起始量的120倍，通过流式细胞法检测CD3、CD4、CD8阳性比例在T细胞合理范围内(CD3：61％～85％、CD4：28％～58％、CD8：19％～48％、CD4/CD8：0.9～2.0/1)，以确定得到高纯度T淋巴细胞；
3)将特异性强的EGFR胞外结构域结合抗体的核酸序列构建入第三代CAR质粒编码基因的scFv片段中，具体操作如下：
采用常规生物合成方法进行合成，委托爱康得生物医学技术有限公司分别按EF1a启动子核酸序列、EGFR单链抗体区核酸序列、CDα Hinge铰链区核酸序列、CD28 TM-跨膜区域核酸序列、41-BB协同刺激信号域核酸序列、CD3ζ信号传导结构域核酸序列合成，命名为EF1a-EGFRscFv-CDα Hinge-CD28 TM-41-BB-CD3ζ，该基因编码的质粒命名为EGFR-CAR；
其中，第三代CAR质粒模式图如图1所示；EGFR胞外结构域结合抗体的核酸序列为SEQ ID NO:3；EF1a-EGFRscFv-CDα Hinge-CD28 TM-41-BB-CD3ζ基因编码的EGFR-CAR质粒结构图如图2所示；
4)采用三质粒包装系统进行慢病毒包装，三质粒分别为慢病毒包装质粒Pmd2.G、载体质粒PSPAX2、步骤3)中所得的CAR质粒，用293T细胞作为慢病毒的包装细胞，培养，收集病毒液，将此病毒液浓缩后，感染T细胞，即可获得EGFR-CAR-T细胞。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。应当理解这些实施例仅用于说明性目的并且不应被理解为以任何方式限制本发明。
实施例1
分离并得到健康成人外周血的单个核细胞，具体步骤如下：
1)经手臂静脉采集健康成人的外周血，采血后立即低温4℃保存。
2)在20℃，250g离心力下直接用50ml采血管取40ml外周血离心10min，用移液管将上层血浆用转移到干净的15ml离心管中。
3)向步骤2)得到的下层沉淀物中加入等量PBS进行稀释，颠倒混匀。
4)取另一干净的50mL离心管，加入25mL经过充分混匀的淋巴细胞分离液，用移液管将步骤3得到的溶液小心滴加到淋巴细胞分离液的上层。
5)将步骤4)所得混合物在20℃，800g下离心30min，可以看到离心管内液体分为四层：最上方为血浆和缓冲液层，第二层为白色雾状层，第三层为较为清澈的淋巴细胞分离液层，最下层为红细胞及粒细胞层。单个核细胞富集于第二层。
6)用移液管将步骤5)所得的第二层液体全部转移至另一离心管中，加入三倍体积的PBS溶液，颠倒混匀，然后在20℃，400g条件下离心10min，用移液管吸除上清，得到外周血单个核细胞。
应当解释的，上述实验中的健康成人外周血免疫细胞的分离和冻存需在5小时内完成。
实施例2
进行T细胞扩增培养及鉴定，具体步骤如下：
1)将实施例1得到的单个核细胞群体进行活化扩增，在含有50um抗人CD3/CD28、IL-2及10％自体血清的10ml SuperCultureTML500培养基中，37℃含5％CO2的培养箱中培养2周。
2)4℃，400g条件下离心10min，收集细胞，用1ml含0.5％BSA的PBS重悬细胞，短暂离心两遍，离心时间大约2秒，弃上清。
3)将步骤2)所得细胞重悬在95ul含0.5％BSA的PBS，并加入5ul Fc blocker，冰域30min。
4)向步骤3)所得细胞溶液中加入300ul 0.5％BSA的PBS，100ul一管，分装两管。
5)向步骤4)的一管中加入5ul CD3-PE-Cy7、5ul CD4-PE、5ul CD8-APC-Cy7，另一管中加入5ul control PE-Cy7、5ul control PE、5ul APC-Cy7，4℃震荡一小时。
6)向步骤5)的每一管中分别加入1ml含0.5％BSA的PBS，4℃，400g条件下离心10min，洗两次。
7)用200ul 0.5％BSA的PBS将步骤6)的细胞重悬，流式细胞法测CD3、CD4、CD8表达量，鉴定T细胞的培养。
如图4所示，通过流式细胞法检测T细胞表型和亚群组成，分别用抗CD3-PE-Cy7、抗CD4-PE、抗CD8-APC-Cy7标记，检测CD3、CD4、CD8阳性比例分别为80.6％、57.9％、34.5％，各项指标在T细胞合理范围内(CD3：61％～85％、CD4：28％～58％、CD8：19％～48％、CD4/CD8：0.9～2.0/1)，所以确定得到高纯度T淋巴细胞。
实施例3
进行EGFR-CAR-T细胞构建，具体步骤如下：
1)将EGFR胞外结构域结合抗体的核酸序列构建入第三代CAR质粒scFv，命名为EGFR-CAR。
其中，第三代CAR质粒模式图如图1所示，特异性强的EGFR胞外结构域结合抗体的核酸序列为SEQ ID NO:3，构建完成后的EGFR-CAR质粒结构图如图2所示。EGFR-CAR质粒采用常规生物合成方法进行合成，由爱康得生物医学技术有限公司合成。
2)取指数生长期的293T细胞，将其传至大皿中，细胞数在70％-80％，37℃5％CO2培养箱培养12小时。
3)取1.5ml的EP管，将CAR、pMD2.G、psPAX2慢病毒质粒与50ul Lipo2000共同加入200ul Opti-MEM中混匀后放入37℃培养箱孵育15min。
4)将步骤3)的混合物加入大皿中，补足完全培养基至6ml。
5)在6-8小时后更换新鲜完全培养基，37℃培养箱培养48h。
6)将步骤5)中培养48小时后的病毒液收集入15ml离心管中，4℃，500g条件下离心10min或者通过0.45um过滤器过滤，收集上清液。
7)将步骤6)中的上清液转移至15ml离心管中，并将1体积的Lenti-X慢病毒浓缩液与3体积的上清液混合。将混合物置于摇床，4℃震荡12小时。
8)将步骤7)中震荡结束后的混合物取出，1500g，4℃离心45min，弃上清，留灰白色沉淀。
9)使用PBS轻轻地将沉淀重悬于原始体积的1/10至1/100。
10)将病毒Con-CAR、EGFR-CAR分装置于-80℃进行保存或直接感染人源T细胞，获得Con-CAR-T、EGFR-CAR-T细胞。
对本实施例中的Con-CAR质粒和EGFR-CAR质粒进行鉴定，结果如下：
如图5所示，图5为实施例3中的Con-CAR质粒结构图，Con-CAR质粒表示未作任何处理的第三代CAR质粒。
如图6所示，图6为实施例3中的EGFR-CAR质粒结构图。
如图7所示，图7表示为实施例3中的Con-CAR质粒和限制性酶切产物琼脂糖凝胶电泳图，其中，图7中1表示Con-CAR质粒(8533bp)，2表示Con-CAR质粒由Ncol酶切产物，7201bp和1332bp。
如图8所示，图8表示为实施例3中的EGFR-CAR质粒和限制性酶切产物琼脂糖凝胶电泳图，其中，图8中3表示EGFR-CAR质粒(9247bp)，4表示EGFR-CAR质粒由KpnI酶切产物，7056bp和2191bp。
对本实施例中的Con-CAR-T和EGFR-CAR-T细胞采用蛋白质免疫印迹法进行鉴定，结果如下：
如图9所示，蛋白质免疫印迹检测CD3ζ，确定外源CAR在T细胞中有效表达，图中β-actin为参照。
采用流式细胞法检测本实施例中的未转染T细胞(Non-transduced T)、Con-CAR、EGFR-CAR与EFGR的结合情况，如图10所示，其中，图中GFP是绿色荧光蛋白，EGFR-GFP是绿色荧光蛋白标记过的EGFR，结果显示，与未转染T细胞(Non-transduced T)、Con-CAR-T细胞相比，EGFR-CAR-T细胞与EGFR抗原有很高结合效率，从而确定针对EGFR靶点的CAR-T细胞构建成功。
实施例4
用ELISA法检测细胞因子(IFN-γ/IL-2/IL-4)释放，具体步骤如下：
1)将1×104个乳腺癌细胞HS578T、1×104个乳腺癌细胞MDA-MB-468、1×104个乳腺癌细胞MDA-MB-231、1×104个乳腺癌细胞MCF7分别铺入4个96孔板中，在37℃含5％CO2培养箱中培养12小时。
2)步骤2所得的4种乳腺癌细胞弃上清，得4种靶细胞。将3种效应细胞未转染T细胞(Non-transduced T cell)、Con-CAR-T cell、EGFR-CAR-T cell分别与靶4种细胞HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MCF7按5:1、10:1、20:1的比例混合，在37℃含5％CO2培养箱培养24小时。
3)提前拿出试剂盒，室温放置20min。
4)在酶标板中加入100ulCytokine standard为标准品孔、100ul Dilutionbuffer R(1×)为空白对照孔、100ul步骤2所得细胞培养上清液为样本孔，盖上封板膜，室温孵育2h。
5)洗板:在滤纸上扣去孔内液体，加入300ul 1×Washing buffer，放置1min后弃去孔内液体，重复3次。
6)加检测抗体:加入100ul Biotinylated antibody，盖上封板膜，室温孵育1h。
7)洗板:在滤纸上扣去孔内液体，加入300ul 1×Washing buffer，放置1min后弃去孔内液体，重复3次。
8)加酶:每孔加入100ul Streptavidin-HRP，盖上封板膜,室温孵育30min。
9)洗板:在滤纸上扣去孔内液体，加入300ul 1×Washing buffer，放置1min后弃去孔内液体，重复3次。
10)显色:每孔加入100ul TMB,室温避光孵育10-20min，根据孔内颜色的深浅来判定终止反应。
11)终止反应:步骤10)中的孔内颜色呈深蓝色的时候，立即加入100ul Stopsolution终止反应。
12)读板：终止后10min之内，上酶标仪用检测波长450nm/610nm/630nm进行读取OD值。
实施例5
用LDH法检测EGFR CAR-T细胞对三阴性乳腺癌细胞的杀伤效果，具体步骤如下：
1)将1×104个EGFR阳性乳腺癌细胞HS578T、1×104个EGFR阳性乳腺癌细胞MDA-MB-468、1×104个EGFR阳性乳腺癌细胞MDA-MB-231、1×104个EGFR阴性乳腺癌细胞MCF7分别铺入96孔板中，37℃含5％CO2培养箱培养过夜。
2)弃上清，得4种乳腺癌靶细胞，将3种效应细胞未转染T细胞(Non-transduced Tcell)、Con-CAR-T cell、EGFR-CAR-T cell与分别于4中饭乳腺癌靶细胞HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MCF7按5∶1、10∶1、20∶1的比例混合，在37℃含5％CO2培养箱培养24小时。将给培养孔分成如下几组：包括无细胞的培养液孔(背景空白对照孔)，未加入CAR-T细胞的对照细胞孔(样品对照孔)，未加入CAR-T细胞的用于后续裂解的细胞孔(样品最大酶活性对照孔)，以及CAR-T细胞处理的细胞孔(处理样品孔)。
3)到预定的检测时间点前1小时，从细胞培养箱取出细胞培养板，在步骤2)的样品最大酶活性对照孔中加入LDH释放试剂，加入量为原有培养液体积的10％。加入LDH释放试剂后，反复吹打数次混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育。
4)步骤3)到达预定时间后，将细胞培养板取出。分别取各孔的上清液120ul，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。使用酶标仪读取OD值(吸光度值).
5)靶细胞裂解百分数计算公式：Lysis％＝(ODeach well-ODmini lysis)/ODmaxi lysis×100％；
其中，Lysis％表示靶细胞裂解百分数，ODeach well表示每个孔的吸光度值，ODmini lysis表示只有乳腺癌细胞没加CAR-T的孔的吸光度值，ODmaxi lysis表示样品最大酶活性对照孔的吸光度值。
实施例6
筛选EGFR高表达的乳腺癌细胞系，具体步骤如下：
如图3所示，通过实时定量PCR(图3A)、蛋白质免疫印迹(图3B)、流式细胞法检测EGFR在MCF7、HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231中的表达量(图3C)可知，与非三阴性乳腺癌MCF7相比，三阴性乳腺癌细胞系HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231的EGFR表达量较高。
实施例7
EGFR-CAR-T细胞对EGFR阳性或阴性乳腺癌细胞杀伤细胞因子释放实验
将未转染T细胞(Non-transduced T cell)、Con-CAR-T cell和EGFR-CAR-T cell分别与4种乳腺癌细胞系(HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MCF7)及被抑制EGFR表达的该4种乳腺癌细胞(HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MCF7)按效应细胞与靶细胞10:1的比例混合培养24小时，用ELISA法(INF-γ、IL-2、IL-4)检测细胞因子产物。
如图11所示，图11表示3种阳性乳腺癌细胞系(HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231)的EGFR被抑制后的三阴性乳腺癌中的EGFR的表达。其中，A为蛋白质免疫印迹图，β-actin为参照。B为流式细胞法检测三阴性乳腺癌转染si-Control、si-EGFR，48小时后的EGFR表达量；其中，si-Control表示对照小干扰RNA，si-EGFR表示抑制EGFR表达的小干扰RNA。
如图12所示，图12为本实施例中未转染T细胞(Non-transduced T cell)、Con-CAR-T cell和EGFR-CAR-T cell对EGFR阳性或阴性乳腺癌细胞杀伤细胞因子释放的实验结果柱形图。结果显示，与EGFR低表达乳腺癌细胞系MCF7相比，EGFR高表达乳腺癌细胞系与EGFR-CAR细胞混合培养后，细胞因子产物(INF-γ、IL-2、IL-4)的释放量更大。对于同一个乳腺癌细胞系，EGFR-CAR细胞得EGFR被抑制后的细胞因子(INF-γ、IL-2、IL-4)释放量显著低于EGFR未被抑制组。
以上结果说明，本发明的EGFR-CAR细胞对EGFR靶点具有特异识别性，并能促进细胞因子大量释放。
实施例8
CAR-T细胞对EGFR阳性或阴性乳腺癌细胞的杀伤作用
将未转染T细胞(Non-transduced T cell)、Con-CAR-T cell和EGFR-CAR-T cell分别与4种乳腺癌细胞系(HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MCF7)及及被抑制EGFR表达的该4种乳腺癌细胞(HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MCF7)按效应细胞与靶细胞5：1、10:1、20:1的比例混合培养24小时，用LDH法检测细胞毒性。
如图13所示，与EGFR低表达乳腺癌细胞系MCF7相比，EGFR-CAR细胞对EGFR高表达乳腺癌细胞系(HS578T、MDA-MB-468、MDA-MB-231)细胞毒性更大。而当EGFR高表达乳腺癌系EGFR被siRNA抑制后，EGFR-CAR细胞对EGFR抑制表达组的细胞毒性显著低于EGFR未被抑制组。因而可知，本发明的EGFR-CAR-T细胞对EGFR靶点具有特异识别性，可以靶向EGFR阳性的癌细胞，
本发明，通过改变第三代CAR质粒的scFv单链抗体的重量级可变轻链，获得本发明的嵌合抗原受体对EGFR具有特异性，其在T细胞上表达之后所得到的CAR-T细胞针对EGFR靶点具有特异识别性，可以靶向EGFR阳性癌细胞，可以促进EGFR阳性癌细胞杀伤细胞因子的释放，并且杀伤EGFR阳性癌细胞。
在本发明的一些优选方案中，EGFR阳性三阴性乳腺癌细胞系的EGFR表达量高于非三阴性乳腺癌细胞系，本发明的EGFR特异性的CAR-T细胞对EGFR阳性三阴性乳腺癌细胞系细胞得毒性更大，可以高效的杀伤EGFR阳性三阴性乳腺癌细胞，并促进EGFR阳性三阴性乳腺癌细胞杀伤细胞因子的释放。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出的实施例。
发明名称：一种EGFR特异性嵌合抗原受体、编码基因、CAR-T细胞及其制备方法、重组细胞和应用
SEQ ID NO:1：
gccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgattcgaagccaccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgGATATTGTATTGACCCAGCCCCCTTCCGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGGGGGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAGGAGTGCCGACATCGGAGCAAATTATGTATACTGGTACCAGCAACTTCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATTCTATTAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAACATGGGATGACAGCCTGGGTGGCTGGGCATTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCGggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctCAGGTGCAGCTACAGGAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTGTACGGTGGGTCCTTCAGTGATTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAGAAATCAGTCATAGCGGAAGTACCGGCTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCGCCATATCAGTTGACACGCCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAACTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTCTATATTATTGTGCGAGACTGACAACAGTGGTTGGGGGCAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatttctgggtgctggtcgttgtgggcggcgtgctggcctgctacagcctgctggtgacagtggccttcatcatcttttgggtgaggagcaagcggagcagactgctgcacagcgactacatgaacatgaccccccggaggcctggccccacccggaagcactaccagccctacgcccctcccagggatttcgccgcctaccggagcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcTAAtctagaccgcgtctggaacaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggaattaattctgcagtcgagacctagaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgattgtgcctggctagaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaagaggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattagcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatgggatggatgacccggagagagaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccggagtacttcaagaactgctgatatcgagcttgctacaagggactttccgctggggactttccagggaggcgtggcctgggcgggactggggagtggcgagccctcagatcctgcatataagcagctgctttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtagtagttcatgtcatcttattattcagtatttataacttgcaaagaaatgaatatcagagagtgagaggccttgacattgctagcgttttaccgtcgacctctagctagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggt
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SEQ ID NO:3：GATATTGTATTGACCCAGCCCCCTTCCGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGGGGGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAGGAGTGCCGACATCGGAGCAAATTATGTATACTGGTACCAGCAACTTCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATTCTATTAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAACATGGGATGACAGCCTGGGTGGCTGGGCATTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCGggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctCAGGTGCAGCTACAGGAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTGTACGGTGGGTCCTTCAGTGATTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAGAAATCAGTCATAGCGGAAGTACCGGCTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCGCCATATCAGTTGACACGCCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAACTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTCTATATTATTGTGCGAGACTGACAACAGTGGTTGGGGGCAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCG
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Claims (10)

1.一种EGFR特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述EGFR特异性嵌合抗原受体包括EF1a启动子、EGFRscFv、铰链区、跨膜区域、协同刺激信号域、信号传导结构域；其中，所述的EGFRscFv表示EGFR单链抗体区，是针对EGFR靶点具有特异性的抗原结合域，编码所述的EGFRscFv的基因的核酸序列为SEQ ID NO:3。
2.一种编码如权利要求1所述的EGFR特异性嵌合抗原受体的基因，其特征在于，该基因为EF1a-EGFRscFv-CDαHinge-CD28 TM-41-BB-CD3ζ。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述的EF1a为构建核苷酸序列的启动子，所述的EF1a的核酸序列为SEQ ID NO:2；
所述的CDαHinge为铰链区，编码所述的CDαHinge的基因的核酸序列为SEQ ID NO:4；
所述的CD28 TM为CD28细胞内跨膜区域，编码所述的CD28 TM的基因的核酸序列为SEQID NO:5；
所述的41-BB是机体特异性免疫应答中的协同刺激信号域，编码所述的41-BB的基因的核酸序列为SEQ ID NO:6；
所述的CD3ζ为信号传导结构域，编码所述的CD3ζ的基因的核酸序列酸序列为SEQ IDNO:7。
4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核酸序列为SEQ IDNO:1。
5.一种EGFR特异性的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括在T细胞上表达如权利要求1所述的EGFR特异性嵌合抗原受体的步骤。
6.根据权利要求5所述的EGFR特异性的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：采用三质粒包装系统进行慢病毒包装，三质粒分别为慢病毒包装质粒Pmd2.G、载体质粒PSPAX2、权利要求1所述的嵌合抗原受体质粒，用293T细胞作为慢病毒的包装细胞，培养，收集病毒液，将此病毒液浓缩后，感染T细胞，即可获得针对EGFR靶点的CAR-T细胞，命名为EGFR-CAR-T细胞。
7.一种EGFR特异性的CAR-T细胞，其特征在于，采用权利要求5-6任意一项所述的制备方法制备得到。
8.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为能够表达权利要求1所述嵌合抗原受体的免疫效应细胞。
9.权利要求1所述的EGFR特异性嵌合抗原受体或权利要求2-4任意一项所述的EGFR特异性嵌合抗原受体的编码基因或权利要求7所述的EGFR特异性的CAR-T细胞或权利要求8所述的重组细胞在制备杀伤EGFR阳性癌细胞的产品中的应用。
10.根据权利要求1所述的EGFR特异性嵌合抗原受体或权利要求2-4任意一项所述的EGFR特异性嵌合抗原受体的编码基因或权利要求7所述的EGFR特异性的CAR-T细胞或权利要求8所述的重组细胞在制备杀伤EGFR阳性三阴性乳腺癌细胞的产品中的应用。
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