JP4587626B2 - Ｔｅｋアンタゴニスト - Google Patents

Description

【０００１】
関連出願に関する参照
本出願は、本明細書に援用される、１９９９年６月７日に提出された、米国仮特許出願第６０／１３７，８８９号の恩典を請求する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、Ｔｅｋアンタゴニスト、および哺乳動物において、血管形成または他のＴｅｋ仲介反応を阻害するための、Ｔｅｋアンタゴニストの使用に関する。
【０００３】
発明の背景
Ａ．血管形成
新しい血管の生成である血管形成は、空間的および時間的に制御された過程であり、該過程において、内因性陽性および陰性制御分子に反応し、内皮細胞が増殖し、移動し、そして集まって管を形成する。血管形成は、正常および病理的生理において、重要な役割を果たす。
【０００４】
正常な生理学的条件下では、血管形成は、胎児および胚発生、創傷治癒、器官再生、並びに子宮内膜、黄体、および胎盤の形成を含む、メス生殖リモデリング過程に関与する。血管形成は、正常な条件下では、特に動物成体で、厳格に制御され、そして制御コントロールの混乱は、病的血管形成につながる可能性がある。
【０００５】
病的血管形成は、炎症性疾患、一定の目の障害、および癌の徴候および／または進行に関連付けられてきている。特に、いくつかの証拠の情報は、血管形成が、固形腫瘍の増殖および持続、およびその転移に必須であるという概念を支持する（例えば、Ｆｏｌｋｍａｎ， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ２８５：１１８２， １９７１； Ｆｏｌｋｍａｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３３９：５８， １９８９； Ｋｉｍら， Ｎａｔｕｒｅ ３６２：８４１， １９９３； Ｈｏｒｉら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５１：６１８０， １９９１を参照されたい）。したがって、血管形成阻害剤は、癌の予防（例えば悪性前状態の処置）、介入（例えば小さい腫瘍の処置）、および後退（例えば大きい腫瘍の処置）に関し、試験されている（例えば、Ｂｅｒｇｅｒｓら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：８０８， １９９９を参照されたい）。
【０００６】
いくつかの抗−血管形成剤が、現在開発中であり、そして治療薬として試験されているが、病理的血管形成に依存する疾患過程の予防、抑止、および緩和のため、血管形成を阻害するさらなる方法に対する必要性がある。
【０００７】
Ｂ．Ｔｅｋポリペプチド
受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、巨大で、そして進化的に保存されるタンパク質ファミリーであり、細胞外シグナルの細胞質への伝達に関与する。血管形態形成および維持に関与すると考えられるＲＴＫの中に、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体およびＴｅｋがある（Ｈａｎａｈａｎ， Ｓｃｉｅｃｎｅ ２７７：４８， １９９７を参照されたい）。
【０００８】
Ｔｉｅ２およびｏｒｋとも呼ばれてきたＴｅｋは、主に血管内皮に発現するＲＴＫである。ヒトＴｅｋ（ｏｒｋ）の分子クローニングは、Ｚｉｅｇｌｅｒ、米国特許第５，４４７，８６０号に記載されてきている。４つのＴｅｋリガンド、アンギオポエチン−１、アンギオポエチン−２、アンギオポエチン−３、およびアンギオポエチン−４（Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３、およびＡｎｇ４）が記載されてきている（Ｄａｖｉｓら， Ｃｅｌｌ ８７：１１６１， １９９６； Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：５５， １９９７； Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：１９０４， １９９９）。これらのリガンドは、別個の発現パターンおよびＴｅｋに関する活性を有する。「Ｔｉｅリガンド相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）」と称されるＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８、およびＮＬ４が、米国特許第６，０５７，４３５号に記載される。
【０００９】
Ｔｅｋノックアウトマウスは、血管形成に欠損を有し、そして胚発生中に死に（Ｄｕｍｏｎｔ， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ８：１８９７， １９９４； Ｓａｔｏ， Ｎａｔｕｒｅ ３７６：７０， １９９５を参照されたい）、Ｔｅｋが胚血管系の発生に役割を果たすことが示唆される。
【００１０】
Ｐｅｔｅｒｓらは、６つのヒスチジンタグに融合させたネズミＴｅｋの全細胞外部分からなる、ＥｘＴｅｋ．６Ｈｉｓと称される可溶性Ｔｅｋ（Ｔｉｅ２）阻害剤を記載してきている（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １９９（８）：２０７２， １９９７； ＷＯ ９８／１８９１４）。ＥｘＴｅｋ．６Ｈｉｓは、ラット皮膚ウィンドウチャンバーモデルにおいて、増殖および腫瘍新血管新生を阻害し、そしてラット角膜マイクロポケットアッセイにおいて、腫瘍細胞馴化培地により刺激される血管形成を遮断した。Ｐｅｔｅｒｓらはまた、ネズミＴｅｋ細胞外ドメインを発現する、ＡｄＥｘＴｅｋと称される複製不全アデノウイルスベクターも記載してきている（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：８８２９， １９９８； ＷＯ ９８／１８９１４）。ＡｄＥｘＴｅｋは、ネズミ乳癌およびネズミ黒色腫の増殖および転移を阻害した。
【００１１】
ＥｘＴｅｋ．６ＨｉｓおよびＡｄＥｘＴｅｋは、抗−血管形成剤として有用であることが判明する可能性があるが、さらなるそして改善されたＴｅｋアンタゴニスト、並びにＴｅｋアンタゴニストを用い、血管形成または他のＴｅｋ仲介反応を阻害する、さらなるそして改善された方法に対する必要性がある。
【００１２】
発明の概要
本発明は、Ｔｅｋアンタゴニスト、並びにＴｅｋアンタゴニストを用い、血管形成または他のＴｅｋ仲介反応を阻害するような処置が必要な哺乳動物において、血管形成または他のＴｅｋ仲介反応を阻害する方法を提供する。本発明は、部分的に、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩ）モチーフを含む領域のすべてまたは一部を欠いた、Ｔｅｋ細胞外ドメインの断片が、全長Ｔｅｋ細胞外ドメインを含むポリペプチドより、Ｔｅｋリガンドに対するより高い結合親和性を有する可能性があるという予期されない結果に基づく。
【００１３】
いくつかの好ましい態様において、Ｔｅｋアンタゴニストは、Ｔｅｋ細胞外ドメインの断片を含むポリペプチドであって、該断片がフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩ）モチーフを含む領域のすべてまたは一部を欠き、そして該ポリペプチドが少なくとも１つのＴｅｋリガンドに結合する能力を保持する、前記ポリペプチドである。好ましい態様において、該断片は、Ｔｅｋ細胞外ドメインの少なくとも残基４７３−７４５を欠き；より好ましい態様において、Ｔｅｋリガンドは、アンギオポエチン−１、アンギオポエチン−２、またはアンギオポエチン−４である。最も好ましい態様において、Ｔｅｋアンタゴニストは、全長Ｔｅｋ細胞外ドメインを含むポリペプチドより、Ｔｅｋリガンドに対するより高い結合親和性を有するポリペプチドである。
【００１４】
本発明はまた、本発明にしたがったポリペプチドをコードする核酸、およびポリペプチドの発現を可能にする条件下で、組換え宿主細胞において、こうした核酸を発現させることにより産生されるポリペプチドも含む。
【００１５】
いくつかの好ましい態様において、Ｔｅｋアンタゴニストは、可溶性Ｔｅｋ多量体であり、好ましくは、二量体または三量体であり、そして最も好ましくは、Ｆｃポリペプチドまたはロイシンジッパーを含む。Ｔｅｋは、好ましくはヒトＴｅｋである。いくつかの好ましい態様において、可溶性Ｔｅｋ多量体は、Ｔｅｋ細胞外ドメインの断片を含み、該断片はフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩ）モチーフを含む領域のすべてまたは一部を欠き、そして該ポリペプチドは少なくとも１つのＴｅｋリガンドに結合する能力を保持する。いくつかの好ましい態様において、可溶性Ｔｅｋ多量体は、配列番号２の残基２３−４７２または２３−７０４を含む。
【００１６】
本発明はまた、本発明にしたがったポリペプチドに特異的に結合する、抗体または抗体断片、並びに、本発明にしたがったポリペプチドに対するＴｅｋリガンドの結合を競合的に阻害することが可能な、抗体または抗体断片も含む。抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、トランスジェニック抗体、およびヒト抗体からなる群より選択される。
【００１７】
本発明はまた、血管形成または他のＴｅｋ仲介反応を阻害するような処置が必要な哺乳動物において、血管形成または他のＴｅｋ仲介反応を阻害する方法であって、該哺乳動物に、阻害に有効な量のＴｅｋアンタゴニストを投与することを含む、前記方法も提供する。Ｔｅｋアンタゴニストは、好ましくは、Ｔｅｋ細胞外ドメインの断片、可溶性Ｔｅｋ多量体、あるいは抗体または抗体断片である。いくつかの好ましい態様において、Ｔｅｋアンタゴニストは、薬学的に許容しうるキャリアーを含む組成物中で投与される。
【００１８】
可溶性Ｔｅｋ多量体は、好ましくは、血管形成に仲介される疾患または異常を有する哺乳動物に投与され、より好ましくは、固形腫瘍、あるいは目の新血管新生により特徴付けられる、疾患または異常を有する哺乳動物に投与される。
【００１９】
いくつかの態様において、該方法はさらに、第二の化学療法剤で、または放射線照射で、該哺乳動物を処置することを含む。第二の化学療法剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、ビンカアルカロイドおよび他の植物由来化学療法剤、ニトロソ尿素、抗腫瘍抗生物質、抗腫瘍酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、白金類似体、副腎皮質抑制剤、ホルモン、ホルモンアゴニスト、ホルモンアンタゴニスト、抗体、免疫療法剤、血液細胞因子、放射線治療、および生物学的反応修飾剤からなる群より選択されてもよく、そしてより好ましくは、シスプラチン、シクロホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、ブレオマイシン、カルボプラチン、フルオロウラシル、５−フルオロデオキシウリジン、メトトレキセート、タキソール、アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、およびビンブラスチン、リンホカインおよびサイトカイン、例えばインターロイキン、インターフェロン（アルファ、ベータ、またはデルタを含む）、並びにＴＮＦ、クロラムブシル、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ビンデシン、エトポシド、テニポシド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ヒドロキシ尿素、メチルヒドラジン、ミトーテン、タモキシフェン、およびフルオキシメステロン、Ｆｌｔ３リガンド、ＣＤ４０リガンド、インターロイキン−２、インターロイキン−１２、４−１ＢＢリガンド、抗４−１ＢＢ抗体、ＴＮＦアンタゴニストおよびＴＮＦ受容体アンタゴニスト、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ１４８アゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニスト、およびＶＥＧＦ受容体アンタゴニストからなる群より選択されてもよい。
【００２０】
本発明はさらに、Ｔｅｋに対するＴｅｋリガンドの結合を阻害するような処置が必要な哺乳動物において、Ｔｅｋに対するＴｅｋリガンドの結合を阻害する方法であって、該哺乳動物に、阻害に有効な量のＴｅｋアンタゴニストを投与することを含む、前記方法に関する。Ｔｅｋアンタゴニストは、好ましくは、Ｔｅｋ細胞外ドメインの断片、可溶性Ｔｅｋ多量体、あるいは抗体または抗体断片である。
【００２１】
本発明はまた、こうした処置が必要な哺乳動物において、血管形成を阻害するための、またはこうした処置が必要な哺乳動物において、Ｔｅｋに対するＴｅｋリガンドの結合を阻害するための医薬品調製のためのＴｅｋアンタゴニストの使用に関する。Ｔｅｋアンタゴニストは、好ましくは、Ｔｅｋ細胞外ドメインの断片、可溶性Ｔｅｋ多量体、あるいは抗体または抗体断片である。
【００２２】
これらおよび本発明の他の側面は、以下の図および詳細な説明を参照した際、明らかになるであろう。
発明の詳細な説明
本発明は、Ｔｅｋアンタゴニスト、および哺乳動物において、Ｔｅｋアンタゴニストを用い、血管形成または他のＴｅｋ仲介反応を阻害する方法に関する。Ｔｅｋアンタゴニストは、リガンド結合および情報伝達を含む、Ｔｅｋの１つまたはそれより多くの生物学的活性に干渉する化合物または組成物であり、そして以下に例示されるものなどの方法を用い、性質決定することが可能である。Ｔｅｋアンタゴニストには、Ｔｅｋ細胞外ドメインの断片、可溶性Ｔｅｋ多量体、並びに抗体および抗体断片が含まれる。ヒトＴｅｋ（ｏｒｋ、Ｔｉｅ２）をコードするｃＤＮＡの分子クローニングは、米国特許第５，４４７，８６０号に記載される。
【００２３】
Ａ．本明細書に用いられる略語および専門用語
「４−１ＢＢ」および「４−１ＢＢリガンド」（４−１ＢＢ−Ｌ）は、とりわけ、米国特許第５，６７４，７０４号に記載されるポリペプチドであり、その可溶性型を含む。
【００２４】
「ｂＦＧＦ」は、塩基性線維芽細胞増殖因子である。
「ＢＳＡ」は、ウシ血清アルブミンである。
「ＣＤ４０リガンド」（ＣＤ４０Ｌ）は、とりわけ、米国特許第５，７１６，８０５号に記載されるポリペプチドであり、その可溶性型を含む。
【００２５】
「ＣＨＯ」はチャイニーズ・ハムスター（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ）卵巣細胞株である。
「ＤＭＥＭ」は、商業的に入手可能な細胞培地である、ダルベッコの修飾イーグル培地である。
【００２６】
「ＥＬＩＳＡ」は、酵素結合免疫吸着アッセイである。
「Ｆｌｔ３Ｌ」は、とりわけ、米国特許第５，５５４，５１２号に記載されるポリペプチドであり、その可溶性型を含む。
【００２７】
「ＨMＶＥＣ−ｄ」は、初代皮膚ヒト微小血管内皮細胞である。
「ＨＲＭＥＣ」は、初代ヒト腎臓微小血管内皮細胞である。
「ＨＵＶＥＣ」は、ヒト臍静脈内皮細胞株である。
【００２８】
「ｍＡｂ」は、モノクローナル抗体である。
「ＭＳＡ」は、マウス血清アルブミンである。
「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝生理食塩水である。
【００２９】
「ＰＥ」は、フィコエリトリンである。
「ＰＭＡ」は、ホルボール１２−ミリステート−１３−アセテートである。
「ＲＴＫ」は、受容体チロシンキナーゼである。
【００３０】
「ＴＮＦ」は、腫瘍壊死因子である。「ＴＮＦＲ／Ｆｃ」は、ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合ポリペプチドである。
「ＴＲＡＩＬ」は、とりわけ、米国特許第５，７６３，２２３号に記載される、ＴＮＦファミリー中のＩＩ型膜貫通ポリペプチドであるＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドであり、その可溶性型を含む。
【００３１】
「ＶＥＧＦ」は、血管内皮増殖因子である。
Ｂ．可溶性Ｔｅｋポリペプチド
本発明の１つの側面において、可溶性Ｔｅｋポリペプチドは、血管形成を阻害する、またはＴｅｋに対するＴｅｋリガンドの結合を阻害する、Ｔｅｋアンタゴニストとして用いられる。
【００３２】
可溶性ポリペプチドは、発現される細胞から分泌されることが可能である。ポリペプチドの可溶性型の使用は、いくつかの適用に好都合である。ポリペプチドが分泌されるため、組換え宿主細胞からのポリペプチドの精製が促進され、そして可溶性タンパク質は、一般的に非経口投与に適している。分泌された可溶性ポリペプチドは、例えば遠心分離などにより、望ましいポリペプチドを発現する、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細胞を培地から分離し、そして望ましいポリペプチドの存在に関し培地（上清）をアッセイすることにより、同定する（そして非可溶性膜結合対応物と区別する）ことが可能である。培地中に望ましいポリペプチドが存在することにより、該ポリペプチドが細胞から分泌され、そしてしたがって該ポリペプチドの可溶性型であることが示される。可溶性ポリペプチドは、いくつかの慣用技術のいずれにより、調製してもよい。望ましい可溶性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ポリペプチドの産生のため、発現ベクターにサブクローニングしてもよいし、または、望ましいコードＤＮＡ断片を、化学的に合成してもよい。
【００３３】
可溶性Ｔｅｋポリペプチドは、Ｔｅｋ細胞外ドメインのすべてまたは一部を含むが、一般的に、細胞表面でのポリペプチドの保持を引き起こすであろう膜貫通ドメインを欠く。可溶性ポリペプチドは、該ポリペプチドが産生される細胞から分泌される限り、膜貫通ドメインの一部、あるいは細胞質ドメインのすべてまたは一部を含んでもよい。可溶性Ｔｅｋポリペプチドは、最初に合成される際、好都合に、細胞からの分泌を促進する、天然または異種性シグナルペプチドを含むが、シグナル配列は、分泌に際し、切断される。用語「Ｔｅｋ細胞外ドメイン」は、天然Ｔｅｋ細胞外ドメインのすべてまたは一部と共に、限定されるわけではないが：（ａ）断片、（ｂ）変異体（ｖａｒｉａｎｔ）、（ｃ）誘導体、および（ｄ）融合ポリペプチドを含む関連型を含むよう意図される。これらの関連型が血管形成または他のＴｅｋ仲介反応を阻害する能力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、以下に例示されるものなどの方法を用い、または当該技術分野に知られる他のアッセイを用い、決定してもよい。
【００３４】
可溶性Ｔｅｋポリペプチドの例は、以下の実施例に提供される。実施例に記載されるように、本発明の発明者らは、予期せぬことに、Ｔｅｋ細胞外ドメインの特定の断片が、全長Ｔｅｋ細胞外ドメインよりよくＴｅｋリガンドに結合し、これらの断片はしたがって、Ｔｅｋ（例えば細胞表面に見られるＴｅｋ）に対するＴｅｋリガンドの結合を遮断するアンタゴニストとして用いることが可能であり、そしてこれらの断片に対する抗体もまた、Ｔｅｋに対するＴｅｋリガンドの結合を遮断するアンタゴニストとして用いることが可能であることを発見した。本発明のいくつかの態様において、可溶性Ｔｅｋポリペプチドの多量体型（「可溶性Ｔｅｋ多量体」）を、Ｔｅｋに対するＴｅｋリガンドの結合を遮断し、血管形成または他のＴｅｋ仲介反応を阻害するアンタゴニストとして用いる。
【００３５】
Ｃ．可溶性Ｔｅｋ多量体
可溶性Ｔｅｋ多量体は、二量体、三量体、またはより高次の多量体を含む、共有結合または非共有結合多量体である。多量体は、異なる可溶性Ｔｅｋポリペプチド上のシステイン残基間に形成されるジスルフィド結合により連結されてもよい。本発明の１つの態様は、可溶性Ｔｅｋポリペプチドに融合したペプチド部分間の共有または非共有相互作用を介して連結された、多数の可溶性Ｔｅｋポリペプチドを含む多量体に関する。こうしたペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）、または多量体化を促進する特性を有するペプチドであってもよい。以下により詳細に記載されるように、そこに結合する可溶性Ｔｅｋポリペプチドの多量体化を促進することが可能なペプチドの中に、ロイシンジッパーおよび抗体由来の一定のポリペプチドがある。特定の態様において、多量体は、２つないし４つの可溶性Ｔｅｋポリペプチドを含む。
【００３６】
いくつかの態様において、可溶性Ｔｅｋ多量体は、免疫グロブリン由来のポリペプチドを用いて調製する。抗体由来ポリペプチドの多様な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合している一定の異種性ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１０５３５， １９９１）； Ｂｙｒｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７， １９９０）；並びにＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈおよびＡｒｕｆｆｏ（“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，中， Ｓｕｐｐｌ．４， １０．１９．１−１０．１９．１１ページ， １９９２）に記載されている。
【００３７】
本発明の１つの好ましい態様は、可溶性ＴｅｋをＦｃポリペプチドに融合させることにより生成される２つの融合タンパク質を含むＴｅｋ／Ｆｃ二量体に関する。Ｔｅｋ／Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を適切な発現ベクターに挿入する。該組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞でＴｅｋ／Ｆｃ融合タンパク質を発現し、そして抗体分子によく似た形で集合させ、その結果、鎖間ジスルフィド結合がＦｃ部分間に形成され、二価分子を生じるのを可能にする。本明細書において、「Ｆｃポリペプチド」という用語は、抗体のＦｃ領域由来のポリペプチドの天然および突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）型を含む。二量体化を促進するヒンジ領域を含むこうしたポリペプチドの一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）型もまた含まれる。
【００３８】
ＰＣＴ出願ＷＯ ９３／１０１５１に記載される１つの適切なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ−末端ヒンジ領域から天然Ｃ−末端に渡る一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号およびＢａｕｍら， ＥＭＢＯ Ｊ． １３：３９９２， １９９４に記載されるＦｃ突然変異タンパク質である。本突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化し、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化し、そしてアミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化していることを除けば、ＷＯ ９３／１０１５１に示される天然Ｆｃ配列のものと同一である。該突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対し、減少した親和性を示す。Ｆｃ部分を含む融合ポリペプチド、およびそれから形成される多量体型は、プロテインＡまたはプロテインＧカラム上のアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製という利点を提供し、そしてＦｃ融合ポリペプチドは、非修飾ポリペプチドより、長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期を提供する可能性があり、これは、療法的適用に有用である。
【００３９】
他の態様において、可溶性Ｔｅｋポリペプチドを、抗体重鎖または軽鎖の可変部に対し置換してもよい。融合タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖両方で作成されている場合、４つもの可溶性Ｔｅｋポリペプチドを持つ可溶性Ｔｅｋ多量体を形成することが可能である。
【００４０】
あるいは、可溶性Ｔｅｋ多量体はペプチドリンカー（スペーサー）、または多量体化を促進する特性を有するペプチドを含むまたは含まない多数の可溶性Ｔｅｋポリペプチドを含む融合タンパク質である。適切なペプチドリンカーの中に、米国特許第４，７５１，１８０号、第４，９３５，２３３号、および第５，０７３，６２７号に記載されるものがある。望ましいペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列は、当該技術分野に知られる、いかなる慣用的技術を用い、ＴｅｋをコードするＤＮＡ配列の間に、そして該ＤＮＡ配列と同じ読み枠で挿入してもよい。例えば、リンカーをコードする化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを、可溶性Ｔｅｋをコードする配列間に連結してもよい。特定の態様において、融合タンパク質は、ペプチドリンカーにより分離された、２ないし４つの可溶性Ｔｅｋポリペプチドを含む。
【００４１】
可溶性Ｔｅｋ多量体を調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を伴う。ロイシンジッパードメインは、該ドメインが見られるタンパク質の多量体化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、元々、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質で同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４０：１７５９， １９８８）、そして以来、多様な異なるタンパク質で見出されてきている。既知のロイシンジッパーの中に、二量体化または三量体化する天然発生ペプチドおよびその誘導体がある。可溶性多量体タンパク質を産生するのに適したロイシンジッパードメインの例は、ＰＣＴ出願ＷＯ ９４／１０３０８に記載され、そして肺界面活性物質プロテインＤ（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパードメインが、Ｈｏｐｐｅら， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３４４：１９１， １９９４に記載される。修飾ロイシンジッパーに融合している異種性タンパク質の安定した三量体化を可能にする、該修飾ロイシンジッパーの使用が、Ｆａｎｓｌｏｗら， Ｓｅｍｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：２６７， １９９４に記載されている。ロイシンジッパーペプチドに融合している可溶性Ｔｅｋポリペプチドを含む組換え融合タンパク質を適切な宿主細胞で発現し、そして形成される可溶性Ｔｅｋ多量体を培養上清から回収する。
【００４２】
いくつかの適用には、本発明の可溶性Ｔｅｋ多量体は、単量体型の使用より、特定の利点を提供すると考えられ、リガンドおよび受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の間の天然の相互作用を模倣するという利点が含まれる。一般的に、二量体リガンドが結合し、そしてＲＴＫの二量体化を引き起こすであろう（ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｅｒら， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０：２５１， １９９４）。この高親和性結合は、ＲＴＫのトランスリン酸化および情報伝達過程の開始を引き起こす。可溶性Ｔｅｋ多量体の結合は、可溶性Ｔｅｋ単量体よりも高い親和性で起こる可能性がある。Ｆｃ融合ポリペプチドは、この型が、典型的には、非修飾ポリペプチドに比較した際、増加したｉｎ ｖｉｖｏ半減期を示すというさらなる利点を提供する。
【００４３】
本発明は、血管形成または他のＴｅｋ仲介反応を阻害する能力を保持する、多様な型の可溶性Ｔｅｋ多量体の使用を含む。「可溶性Ｔｅｋ多量体」という用語は、天然Ｔｅｋ細胞外ドメインのすべてまたは一部を含む多量体と共に、限定されるわけではないが：可溶性Ｔｅｋの（ａ）断片、（ｂ）変異体、（ｃ）誘導体、および（ｄ）融合ポリペプチドを含む関連型を含むよう意図される。これらの関連型が血管形成または他のＴｅｋ仲介反応を阻害する能力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、実施例に例示されるものなどの方法を用い、または当該技術分野に知られる他のアッセイを用い、決定することが可能である。
【００４４】
本発明を実施するのに有用な可溶性Ｔｅｋポリペプチドおよび可溶性Ｔｅｋ多量体の中には、リガンドに結合するおよび／または血管形成または他のＴｅｋ仲介反応を阻害する能力を保持するＴｅｋ変異体がある。こうしたＴｅｋ変異体には、天然Ｔｅｋに実質的に相同であるが、1つまたはそれより多くの欠失、挿入または置換のため、天然Ｔｅｋのものと異なるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドが含まれる。特定の態様には、限定されるわけではないが、天然Ｔｅｋ配列と比較した際、アミノ酸残基の１ないし１０の欠失、挿入または置換を含む、Ｔｅｋポリペプチドが含まれる。Ｔｅｋポリペプチドの変異体として含まれるのは、対立遺伝子型（ａｌｌｅｌｉｃ ｆｏｒｍ）および選択的スプライシング型などの天然発生であるものと共に、Ｔｅｋポリペプチドのアミノ酸配列またはＴｅｋポリペプチドをコードする核酸のヌクレオチド配列を修飾することにより、構築されている変異体である。
【００４５】
一般的に、天然ポリペプチドに存在する、１つまたはそれより多くのアミノ酸に関する置換は、保存的に作成されるべきである。保存的置換の例には、単数または複数の活性ドメインの外側のアミノ酸の置換、およびＴｅｋの二次および／または三次構造を改変しないアミノ酸の置換が含まれる。さらなる例には、１つの脂肪族残基を互いに、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａを互いに置換するもの、あるいはＬｙｓおよびＡｒｇ；ＧｌｕおよびＡｓｐ；またはＧｌｎおよびＡｓｎ間といった、１つの極性残基から別のものへの置換、あるいは芳香族残基の別のものでの置換、例えばＰｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを互いに置換するものが含まれる。他のこうした保存的置換、例えば、同様の疎水性特性を有する領域全体の置換が、周知である。
【００４６】
全長Ｔｅｋ細胞外ドメインの天然配列は、配列番号１の残基２３−７４５として示される。いくつかの好ましい態様において、Ｔｅｋ変異体は、天然Ｔｅｋのアミノ酸配列に、アミノ酸配列で、少なくとも約７０％同一であり；いくつかの好ましい態様において、Ｔｅｋ変異体は、天然Ｔｅｋのアミノ酸配列に、アミノ酸配列で、少なくとも約８０％同一である。いくつかの好ましい態様において、Ｔｅｋ変異体は、天然Ｔｅｋのアミノ酸配列に、アミノ酸配列で、少なくとも約９０％同一であり；いくつかの好ましい態様において、Ｔｅｋ変異体は、天然Ｔｅｋのアミノ酸配列に、アミノ酸配列で、少なくとも約９５％同一である。いくつかの好ましい態様において、Ｔｅｋ変異体は、天然Ｔｅｋのアミノ酸配列に、アミノ酸配列で、少なくとも約９８％同一であり；いくつかの好ましい態様において、Ｔｅｋ変異体は、天然Ｔｅｋのアミノ酸配列に、アミノ酸配列で、少なくとも約９９％同一である。同一性パーセントは、ポリペプチドおよび核酸どちらの場合でも、視覚的検査により決定してもよい。同一性パーセントはまた、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ ２：４８２， １９８１）に改訂されたような、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３， １９７０）の並列法を用いて決定してもよい。好ましくは、同一性パーセントは、コンピュータープログラム、例えば、遺伝学コンピューターグループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：３８７， １９８４も参照されたい）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン１０．ｘを用いることにより、決定する。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、およびアミノ酸に関する、ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８， １９７９に記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：６７４５， １９８６の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対する３０（アミノ酸）または５０（ヌクレオチド）のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに１（アミノ酸）または３（ヌクレオチド）のペナルティ；（３）末端ギャップに対するペナルティなし；および（４）長いギャップに対する最大ペナルティなし、が含まれる。配列比較の当業者に用いられる他のプログラムもまた、用いてもよい。Ｔｅｋ断片に関しては、同一性パーセントは、断片に存在するＴｅｋ部分に基づき、計算する。
【００４７】
本発明はさらに、結合する天然パターン糖鎖付加を含むまたは含まない可溶性Ｔｅｋポリペプチドの使用を含む。酵母または哺乳動物発現系（例えばＣＯＳ−１またはＣＯＳ−７細胞）で発現されたＴｅｋは、発現系の選択に応じ、分子量および糖鎖付加パターンにおいて、天然Ｔｅｋポリペプチドと同様である可能性も、または有意に異なる可能性もある。細菌発現系、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）でのＴｅｋポリペプチドの発現は、非糖鎖付加分子を提供する。異なる宿主細胞はまた、異なってポリペプチドをプロセシングし、多様なＮ−またはＣ−末端を持つポリペプチドの混成混合物を生じる可能性もある。
【００４８】
他の化学部分、例えば、グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基およびそれらに匹敵するものと、共有または凝集結合体を形成することにより、可溶性Ｔｅｋポリペプチドの一次アミノ酸構造を修飾し、誘導体を生成してもよい。Ｔｅｋの共有誘導体は、Ｔｅｋアミノ酸側鎖に、またはＴｅｋポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端で、特定の官能基を連結させることにより、調製してもよい。
【００４９】
本発明を実施するのに有用な可溶性Ｔｅｋの融合ポリペプチドはまた、新規多機能実体（ｅｎｔｉｔｉｅｓ）を提供するために添加された他のポリペプチドとＴｅｋポリペプチドの共有または凝集結合体も含む。
【００５０】
Ｄ．Ｔｅｋポリペプチドの組換え体産生
本発明に用いられる、可溶性Ｔｅｋポリペプチド、断片、および融合ポリペプチドを含むＴｅｋポリペプチドは、組換え発現系を用い、調製してもよい。Ｔｅｋポリペプチドをコードする組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞（「組換え宿主細胞」）を、Ｔｅｋの発現を促進する条件下で培養し、そして該Ｔｅｋを回収する。Ｔｅｋポリペプチドはまた、トランスジェニック植物または動物において、あるいは化学的合成により、産生してもよい。
【００５１】
本発明は、本発明に用いられるＴｅｋポリペプチドをコードする核酸分子を含み：（ａ）配列番号２の残基２３−４７３およびＴｅｋリガンドに結合するその断片をコードする核酸；（ｂ）（ａ）の核酸に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であり、そして少なくとも１つのＴｅｋリガンドに結合することが可能なポリペプチドをコードする核酸；および（ｃ）（ａ）の核酸に中程度のストリンジェンシーでハイブリダイズし、そして少なくとも１つのＴｅｋリガンドに結合することが可能なポリペプチドをコードする核酸を含む。
【００５２】
遺伝暗号の縮重のため、同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にかなりの変動がある可能性がある。本発明の態様として含まれるのは、中程度にストリンジェントな条件（例えば５ Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）の前洗浄溶液および５０℃、５ Ｘ ＳＳＣ、一晩のハイブリダイゼーション条件）下で、ＴｅｋをコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズすることが可能な核酸配列である。当業者は、中程度のハイブリダイゼーションストリンジェンシーを構成する塩および温度のさらなる組み合わせを決定することが可能である（本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９； Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８２；およびＡｕｓｕｂｅｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， １９８９およびその後の版も参照されたい）。より高いストリンジェンシーの条件は、ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション後洗浄のより高い温度、および／またはより低い塩濃度を含む。核酸の同一性パーセントは、ポリペプチドに関し上述される方法を用い、すなわち、視覚的検査を含む方法およびＧＡＰなどのコンピュータープログラムの使用により、決定することが可能である。
【００５３】
組換えＴｅｋの産生に、いかなる適切な発現系を使用してもよい。組換え発現ベクターは、適切な転写および翻訳制御ヌクレオチド配列、例えば、哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子由来のものなどに、機能可能であるように連結されている、ＴｅｋポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。ヌクレオチド配列は、制御配列が、Ｔｅｋ ＤＮＡ配列に機能的に関連する場合、機能可能であるように連結されている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列は、該プロモーターヌクレオチド配列が、Ｔｅｋ ＤＮＡ配列の転写を調節する場合、Ｔｅｋ ＤＮＡ配列に機能可能であるように連結されている。制御配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、並びに転写および翻訳の開始および終結を調節する適切な配列が含まれる。適切なシグナルペプチド（天然または異種性）をコードする配列を、発現ベクターに取り込んでもよい。シグナルペプチド（分泌リーダー、リーダーペプチド、またはリーダーを含む、多様な名称により言及される）のＤＮＡ配列を、インフレームでＴｅｋ配列に融合させ、Ｔｅｋポリペプチドがまず、該シグナルペプチドを含む融合タンパク質として翻訳されるようにしてもよい。意図される宿主細胞で機能するシグナルペプチドは、Ｔｅｋポリペプチドの細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドは、細胞からのＴｅｋの分泌に際し、Ｔｅｋポリペプチドから切断される。
【００５４】
Ｔｅｋポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、原核生物、酵母、並びに昆虫および哺乳動物細胞を含む、より高次の真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主での使用に適したクローニング用および発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら， Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ニューヨーク州エルセビア， １９８５に記載されている。
【００５５】
原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば大腸菌またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）が含まれる。形質転換に適した原核宿主細胞には、例えば、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、並びにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）内の多様な他の種が含まれる。大腸菌などの原核宿主細胞において、組換えポリペプチドの該原核宿主細胞における発現を容易にするため、ＴｅｋポリペプチドはＮ−末端メチオニン残基を含んでもよい。Ｎ−末端Ｍｅｔは、発現された組換えポリペプチドから切断してもよい。
【００５６】
原核宿主細胞に用いるための発現ベクターは、一般的に、１つまたはそれより多くの表現型選択可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を与える、または独立栄養必要条件を供給するタンパク質をコードする遺伝子である。原核宿主細胞に有用な発現ベクターの例には、クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）など、商業的に入手可能なプラスミド由来のものが含まれる。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含み、そしてしたがって、形質転換細胞を同定する簡単な手段を提供する。適切なプロモーターおよびＤＮＡ配列をｐＢＲ３２２ベクター中に挿入する。他の商業的に入手可能なベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、スウェーデン・ウプサラ）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ、米国ウィスコンシン州マディソン）が含まれる。
【００５７】
組換え原核宿主細胞発現ベクターに通常用いられるプロモーター配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら， Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５， １９７８； Ｇｏｅｄｄｅｌら， Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４， １９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８：４０５７， １９８０； ＥＰ−Ａ−３６７７６）およびｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ｐ．４１２， １９８２）が含まれる。特に有用な原核宿主細胞発現系は、ファージλＰ_LプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ熱不安定性リプレッサー配列を使用する。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能な、λＰ_Lプロモーターの誘導体を組み込んだプラスミドベクターには、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ９、ＡＴＣＣ ３７０９２に常住）およびｐＰＬｃ２８（大腸菌ＲＲ１、ＡＴＣＣ ５３０８２に常住）が含まれる。
【００５８】
Ｔｅｋポリペプチドはまた、好ましくはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））由来の酵母宿主細胞において発現してもよい。酵母の他の属、例えばピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）またはクロイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）もまた使用してもよい。酵母ベクターは、しばしば、２μ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択可能マーカー遺伝子を含むであろう。酵母ベクターに適したプロモーター配列には、とりわけ、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５５：２０７３， １９８０）または、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどの他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら， Ｊ． Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ． ７：１４９， １９６８； Ｈｏｌｌａｎｄら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７：４９００， １９７８）のプロモーターが含まれる。酵母発現に用いるのに適した他のベクターおよびプロモーターはＨｉｔｚｅｍａｎ， ＥＰＡ−７３，６５７にさらに記載されている。別の代替物は、Ｒｕｓｓｅｌｌら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５８：２６７４， １９８２）およびＢｅｉｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ ３００：７２４， １９８２）に記載されるグルコース抑制可能ＡＤＨ２プロモーターである。大腸菌での選択および複製のため、ｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列（Ａｍｐ^r遺伝子および複製起点）を上述の酵母ベクターに挿入することにより、酵母および大腸菌両方において複製可能なシャトルベクターを構築してもよい。
【００５９】
酵母α−因子リーダー配列を使用し、組換えポリペプチドを直接分泌させてもよい。α−因子リーダー配列は、しばしば、プロモーター配列および構造遺伝子配列の間に挿入される。例えば、Ｋｕｒｊａｎら， Ｃｅｌｌ ３０：９３３， １９８２； Ｂｉｔｔｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：５３３０， １９８４を参照されたい。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を促進するのに適した他のリーダー配列が当業者に知られる。リーダー配列を、その３’端近傍に、１つまたはそれより多くの制限部位を含むよう修飾してもよい。これは、リーダー配列が構造遺伝子に融合するのを容易にするであろう。
【００６０】
酵母形質転換プロトコルが当業者に知られる。こうしたプロトコルの１つがＨｉｎｎｅｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５：１９２９， １９７８に記載される。Ｈｉｎｎｅｎらのプロトコルは、Ｔｒｐ⁺形質転換体を選択培地中で選択し、ここで該選択培地は０．６７％酵母窒素基剤、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０ μｇ／ｍｌアデニンおよび２０ μｇ／ｍｌウラシルからなる。
【００６１】
ＡＤＨ２プロモーター配列を含むベクターにより形質転換された酵母宿主細胞は、発現を誘導するため「リッチ」培地中で増殖させてもよい。リッチ培地の例は、８０ μｇ／ｍｌアデニンおよび８０ μｇ／ｍｌウラシルを補った、１％酵母抽出物、２％ペプトン、および１％グルコースからなるものである。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除（ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、培地からグルコースが枯渇したとき起こる。
【００６２】
昆虫宿主細胞培養系もまた、可溶性Ｔｅｋポリペプチドを含む、組換えＴｅｋポリペプチドを発現するのに使用してもよい。昆虫細胞において異種性タンパク質を産生するためのバキュロウイルス系がＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７， １９８８に概説されている。
【００６３】
哺乳動物細胞は、宿主細胞としての使用に特に好ましい。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら， Ｃｅｌｌ ２３：１７５， １９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、およびＭｃＭａｈａｎら（ＥＭＢＯ Ｊ． １０：２８２１， １９９１）に記載されるようなアフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）由来であるＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株が含まれる。療法ポリペプチドの産生には、動物タンパク質を含まない培地中で増殖するよう適応されてきている、哺乳動物宿主細胞株を使用するのが、特に好都合である。
【００６４】
哺乳動物細胞内にＤＮＡを導入するための確立された方法が記載されてきている（Ｋａｕｆｍａｎ， Ｒ．Ｊ．， Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ， １９９０， ｐｐ．１５−６９）。商業的に入手可能な試薬、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓを用いた、さらなるプロトコルを用い、細胞をトランスフェクションしてもよい（Ｆｅｌｇｎｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：７４１３， １９８７）。さらに、エレクトロポレーションを用い、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版． Ｖｏｌ．１−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９におけるもののような、慣用法を用い、哺乳動物細胞をトランスフェクションしてもよい。安定形質転換体の選択は、例えば細胞傷害性薬剤に対する耐性など、当該技術分野に知られる方法を用い、行ってもよい。Ｋａｕｆｍａｎら， Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：４８７， １９９０は、いくつかの選択計画、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）耐性を記載する。ＤＨＦＲ選択に適した宿主株は、ＤＨＦＲ不全であるＣＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１であってもよい（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６， １９８０）。ＤＨＦＲ ｃＤＮＡを発現しているプラスミドをＤＸ−Ｂ１１株に導入してもよく、そしてプラスミドを含む細胞のみを適切な選択培地中で増殖させることが可能である。発現ベクターに組み込んでもよい選択可能マーカーの他の例には、Ｇ４１８およびハイグロマイシンＢなどの抗生物質に対する耐性を与えるｃＤＮＡが含まれる。該ベクターを宿する細胞を、これらの化合物に対する耐性に基づき選択してもよい。
【００６５】
哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳調節配列は、ウイルスゲノムより切り出されてもよい。通常用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびヒト・サイトメガロウイルス由来である。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライシング、およびポリアデニル化部位を用い、哺乳動物宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝要素を提供してもよい。ウイルス初期および後期プロモーターは、どちらもウイルス複製起点をも含む可能性がある断片として容易にウイルスゲノムから得られるため、特に有用である（Ｆｉｅｒｓら， Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３， １９７８； Ｋａｕｆｍａｎ， Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １９９０）。ＳＶ４０ウイルス複製起点部位に位置するＨｉｎｄ ＩＩＩ部位からＢｇｌ Ｉ部位に渡るおよそ２５０ ｂｐの配列が含まれていれば、より小さいまたはより大きいＳＶ４０断片もまた用いてもよい。
【００６６】
哺乳動物発現ベクターからの異種性遺伝子の発現を改善することが示されたさらなる調節配列には、ＣＨＯ細胞由来の発現増大配列要素（ＥＡＳＥ）（Ｍｏｒｒｉｓら， Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９７， ｐｐ．５２９−５３４）並びにアデノウイルス２由来の三分割（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー（ＴＰＬ）およびＶＡ遺伝子ＲＮＡ（Ｇｉｎｇｅｒａｓら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７：１３４７５， １９８２）などの要素が含まれる。ウイルス起源の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列により、二シストロン性ｍＲＮＡが効率的に翻訳されることが可能になる（ＯｈおよびＳａｒｎｏｗ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：２９５， １９９３； Ｒａｍｅｓｈら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：２６９７， １９９６）。選択可能マーカー（例えばＤＨＦＲ）遺伝子が続く、二シストロン性ｍＲＮＡの一部としての異種性ｃＤＮＡの発現は、宿主のトランスフェクション可能性および異種性ｃＤＮＡの発現を改善することが示されてきている（Ｋａｕｆｍａｎ， Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １９９０）。二シストロン性ｍＲＮＡを使用する典型的な発現ベクターは、Ｍｏｓｓｅｒら， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２：１５０， １９９７に記載されるｐＴＲ−ＤＣ／ＧＦＰ、およびＭｏｒｒｉｓら， Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９７， ｐｐ．５２９−５３４に記載されるｐ２Ａ５Ｉである。
【００６７】
有用な高発現ベクター、ｐＣＡＶＮＯＴがＭｏｓｌｅｙら， Ｃｅｌｌ ５９：３３５， １９８９に記載されてきている。哺乳動物宿主細胞において用いるための他の発現ベクターは、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３：２８０， １９８３）に開示されるように構築してもよい。Ｃ１２７ネズミ乳腺上皮細胞における哺乳動物ｃＤＮＡの安定した高レベル発現に有用な系を、実質的にＣｏｓｍａｎら（Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２３：９３５， １９８６）に記載されるように構築してもよい。Ｃｏｓｍａｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８， １９８４に記載される有用な高発現ベクター、ＰＭＬＳＶ Ｎ１／Ｎ４はＡＴＣＣ ３９８９０として寄託されている。さらなる有用な哺乳動物発現ベクターが、当該技術分野に知られる。
【００６８】
Ｔｅｋポリペプチドを産生するのに使用してもよいシグナルペプチドに関し、望ましいならば、天然Ｔｅｋシグナルペプチドを異種性シグナルペプチドまたはリーダー配列に置き換えてもよい。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、組換えＴｅｋを産生しようとする宿主細胞の種類などの要因に依存する可能性がある。哺乳動物宿主細胞で機能する異種性シグナルペプチドの例には、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されるインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列、Ｃｏｓｍａｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８（１９８４）に記載されるインターロイキン−２受容体のシグナル配列；ＥＰ ３６７，５６６に記載されるインターロイキン−４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載されるＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド；およびＥＰ ４６０，８４６に記載されるＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチドが含まれる。
【００６９】
突然変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む組換えＤＮＡ技術を用い、当業者は、アミノ酸残基または配列の多様な付加または置換、あるいは末端または内部残基または配列の欠失を含む、ＴｅｋポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を産生することが可能であり、これらには、Ｔｅｋ断片、変異体、誘導体、および融合タンパク質が含まれる。
【００７０】
マウス（ｍｉｃｅ）、ヤギ（ｇｏａｔｓ）、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）、およびブタ（ｐｉｇｓ）を含む、トランスジェニック動物、並びに、タバコ（ｔｏｂａｃｃｏ）、トマト（ｔｏｍａｔｏ）、マメ（ｌｅｇｕｍｅｓ）、草（ｇｒａｓｓｅｓ）、および穀物（ｇｒａｉｎｓ）を含む、トランスジェニック植物もまた、可溶性Ｔｅｋポリペプチドを含む、Ｔｅｋポリペプチドの産生のためのバイオリアクターとして用いてもよい。トランスジェニック動物の場合、乳および／または他の体液中の可溶性Ｔｅｋの発現を促進する、シス−作用制御配列に機能可能であるように連結されたＴｅｋコード配列を含むキメラＤＮＡを構築することが、特に好都合である（例えば、米国特許第５，８４３，７０５号；米国特許第５，８８０，３２７号を参照されたい）。トランスジェニック植物の場合、特定の細胞種、組織、または器官中で、Ｔｅｋを産生することが、特に好都合である（例えば、米国特許第５，６３９，９４７号；米国特許第５，８８９，１８９号を参照されたい）。
【００７１】
当業者は、発現された可溶性Ｔｅｋポリペプチドを精製するための方法は、使用した宿主系、および該組換えポリペプチドが分泌されるかどうかに応じて異なるであろうことを認識するであろう。可溶性Ｔｅｋポリペプチドは、１つまたはそれより多くの濃縮、塩析、イオン交換、疎水性相互作用、アフィニティー精製、ＨＰＬＣ、またはサイズ排除クロマトグラフィー工程を含む、当該技術分野に知られる方法を用いて、精製してもよい。Ｆｃ部分を含む融合ポリペプチド（およびそこから形成される多量体）は、プロテインＡまたはプロテインＧカラム上のアフィニティークロマトグラフィーによる、容易な精製という利点を提供する。
【００７２】
Ｅ．Ｔｅｋ抗体
本発明の１つの側面は、Ｔｅｋ細胞外ドメインの抗原性エピトープに関する。こうしたエピトープは、以下により詳細に記載される、抗体、および特に遮断モノクローナル抗体を作成するのに有用である。こうしたエピトープまたはその変異体は、固相合成、ポリペプチドの化学的または酵素的切断などの、当業に周知の技術を用い、あるいは組換えＤＮＡ技術を用い、産生してもよい。以下に例示されるように、本発明の発明者らは、Ｔｅｋ細胞外ドメインが、少なくとも３つのエピトープを有し、そしてＴｅｋ細胞外ドメインの欠失型に対して生成された抗体が、Ｔｅｋに対する結合に関し、Ｔｅｋリガンドと競合することが可能であることを決定してきている。
【００７３】
請求される発明は、Ｔｅｋポリペプチドと免疫反応性である組成物および抗体の使用を含む。こうした抗体は、Ｔｅｋポリペプチドに「特異的に結合する」、すなわち、該抗体は、非特異的結合と比較した際、抗体の抗原結合部位を介して結合する。「抗体（単数及び複数）」という用語は、本明細書において、最も広い意味で用いられ、そして非限定的に、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）モノクローナルおよびポリクローナル抗体と共に、断片、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２断片、一本鎖抗体、例えばｓｃＦｖ、および多様な鎖の組み合わせが含まれる。本発明の抗体は、好ましくはヒト化されており、そしてより好ましくはヒト抗体である。抗体は、非限定的に、天然またはトランスジェニック免疫レパートリーを有する動物の免疫感作、ファージディスプレー、ハイブリドーマおよび組換え細胞培養、並びにトランスジェニック植物および動物バイオリアクターを含む、多様な周知の方法を用い、調製してもよい。
【００７４】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体はどちらも、慣用的技術により調製することが可能である。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ． Ｋｅｎｎｅｔら（監修）， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク（１９８０）；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｄ（監修）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）を参照されたい。
【００７５】
本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本明細書に意図される。こうしたハイブリドーマは、慣用的技術により産生しそして同定してもよい。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物をポリペプチドで免疫感作し、免疫感作された動物から脾臓細胞を採取し、前記脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し、そして該ポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。ハイブリドーマに産生されたモノクローナル抗体は、慣用的技術により回収してもよい。
【００７６】
本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、元来マウスまたは他の非ヒト種で産生された抗体の「ヒト化」型が含まれる。ヒト化抗体は、典型的には、非ヒト（例えばネズミ）抗体の可変領域、または少なくともその相補性決定領域（ＣＤＲ）、およびヒト抗体に由来する、残った免疫グロブリン部分を含む、操作された抗体である。キメラおよび工学技術で作成されるさらなるモノクローナル抗体の産生法には、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３， １９８８）； Ｌｉｕら（ＰＮＡＳ ８４：３４３９， １９８７）； Ｌａｒｒｉｃｋら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４， １９８９）；およびＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ（ＴＩＰＳ １４：１３９， Ｍａｙ １９９３）に記載されるものが含まれる。こうしたヒト化抗体は、既知の技術により調製することが可能であり、そして抗体がヒトに投与された際、減少した免疫原性という利点を提供する。
【００７７】
本発明の抗体を産生するのに、ヒト抗体を非ヒト動物で生成するために開発されてきている方法を使用してもよい。抗体は、部分的にヒトであってもよく、または好ましくは、完全にヒトであってもよい。例えば、１つまたはそれより多くのヒト免疫グロブリン鎖をコードする遺伝子成分が導入されている、トランスジェニックマウスを使用してもよい。こうしたマウスは、多様な点で、遺伝的に改変されていてもよい。遺伝子操作は、免疫感作に際し、該動物により産生される、少なくともいくつかの、そして好ましくは実質的にすべての抗体における、内因性免疫グロブリン鎖を置き換えた、ヒト免疫グロブリンポリペプチド鎖を生じる可能性がある。
【００７８】
１つまたはそれより多くの内因性免疫グロブリン遺伝子が、多様な手段により不活性化されているマウスが調製されてきている。ヒト免疫グロブリン遺伝子が、マウスに導入され、不活性化マウス遺伝子を置き換えてきている。該動物で産生される抗体は、該動物に導入されたヒト遺伝子成分にコードされるヒト免疫グロブリンポリペプチド鎖を取り込む。抗体（ときに、「トランスジェニック抗体」と呼ばれる）を作成するためのこうしたトランスジェニック動物の産生および使用のための技術の例は、本明細書に援用される、米国特許第５，８１４，３１８号、第５，５６９，８２５号、および第５，５４５，８０６号に記載される。
【００７９】
Ｅ．療法的方法
開示されるポリペプチド、組成物、および方法は、血管形成または他のＴｅｋ仲介反応を阻害するような処置が必要な哺乳動物において、血管形成または他のＴｅｋ仲介反応を阻害するのに用いられる。「Ｔｅｋ仲介反応」という用語は、少なくとも部分的に、Ｔｅｋに対するＴｅｋリガンドの結合により引き起こされる、あるいは、完全にまたは部分的に、Ｔｅｋに対する結合からＴｅｋリガンドを遮断することにより、阻害するまたは抑制することが可能な、いかなる細胞、生理学的、または他の生物学的反応も含む。血管形成に仲介される疾患または異常の発生または再発を防ぐため、あるいは血管形成に仲介される疾患または異常を有する哺乳動物を処置するため、処置を好都合に投与する。血管形成に仲介される疾患および処置には、限定されるわけではないが、目の障害、悪性または転移性異常、および炎症性疾患が含まれる。
【００８０】
本発明にしたがって処置することが可能な目の障害の中には、限定されるわけではないが、糖尿病性網膜症（糖尿病の主な合併症）、未熟児網膜症（この破壊的な目の異常は、しばしば、慢性の視覚的問題を導き、そして盲目の高リスクを有し、未成熟幼児の看護中、重症の合併症である）、新血管新生緑内障、網膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、ブドウ膜炎、黄斑変性、および角膜移植新血管新生を含む、目の新血管新生により特徴付けられる、目の疾患である。他の目の炎症性疾患、目の腫瘍、および脈絡膜または虹彩新血管新生に関連する疾患もまた、本発明にしたがって、処置してもよい。
【００８１】
本発明はまた、悪性および転移性状態、例えば固形腫瘍を処置するのに用いてもよい。固形腫瘍には、原発性および転移性肉腫および癌腫両方が含まれる。
本発明はまた、非限定的に、関節炎、リウマチ、および乾癬を含む、炎症性疾患を処置するのに用いてもよい。
【００８２】
本発明にしたがって処置してもよい他の疾患および異常には、良性腫瘍および新生物発生前の状態、心筋血管形成、血友病関節、強皮症、血管接着、アテローム性動脈硬化斑新血管新生、毛細血管拡張症、および創傷顆粒化が含まれる。
【００８３】
Ｔｅｋ細胞外ドメインの断片を含むポリペプチド、可溶性Ｔｅｋ多量体、およびＴｅｋ細胞外ドメインに結合する抗体に加え、他の型のＴｅｋアンタゴニストもまた、療法的効果を達成するため、投与してもよい。Ｔｅｋアンタゴニストの他の型の例には、他の抗体、例えばＴｅｋリガンドに対する抗体、Ｔｅｋに対して、あるいは１つまたはそれより多くのＴｅｋリガンドに対して向けられる、アンチセンス核酸、リボザイム、突然変異タンパク質、アプタマー、および小分子が含まれる。
【００８４】
本発明にしたがった方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルで試験し、望ましい予防的または療法的活性を確認すると共に、ヒトへの投与前に、最適療法投薬量を決定してもよい。
【００８５】
特定の処置法で有効であるであろう、特定のＴｅｋアンタゴニストの量は、年齢、処置しようとする異常の種類および重症度、体重、望ましい処置期間、投与方法、並びに他のパラメーターに応じる。有効投薬量は、医師または他の認可された医学的専門家により決定される。典型的な有効投薬量は、約０．０１ ｍｇ／ｋｇ体重ないし約１００ ｍｇ／ｋｇ体重である。いくつかの好ましい態様において、投薬量は約０．１−５０ ｍｇ／ｋｇであり；いくつかの好ましい態様において、投薬量は約０．５−１０ ｍｇ／ｋｇである。局所投与のための投薬量は、典型的には、全身投与の場合より低い。いくつかの態様において、単回投与が十分であり；いくつかの態様において、Ｔｅｋアンタゴニストは、１日またはそれより多い日数に渡り、多数の用量で投与される。
【００８６】
Ｔｅｋアンタゴニストは、典型的には、１つまたはそれより多くの薬学的に許容しうるキャリアーを含む、薬剤組成物の形で投与される。薬学的に許容しうるキャリアーには、投与経路のため、薬学的に許容しうる希釈剤、充填剤、アジュバント、賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）、およびビヒクルが含まれ、そして、適切な分散、湿潤、および懸濁剤を用いて処方した、水性または油脂性懸濁物であってもよい。
【００８７】
薬学的に許容しうるキャリアーは一般的に無菌であり、そして発熱性病原体を含まず、そして水、油、溶媒、塩、糖および他の炭水化物、乳化剤、緩衝剤、抗真菌剤、およびキレート化剤を含んでもよい。特定の薬学的に許容しうるキャリアーおよびキャリアーに対する活性化合物の比は、組成物の可溶性および化学的特性、投与様式、および標準的薬学的実施により、決定される。
【００８８】
Ｔｅｋアンタゴニストを、指示に適した方式で、患者に投与する。したがって、例えばＴｅｋアンタゴニスト、またはその薬剤組成物は、静脈内、経皮、皮内、腹腔内、筋内、鼻腔内、硬膜外、経口、局所、皮下、腔内、移植物からの持続放出、蠕動経路により、あるいは、他のいかなる適切な技術により、投与してもよい。非経口投与が好ましい。
【００８９】
請求される発明の一定の態様において、処置はさらに、哺乳動物を、１つまたはそれより多くのさらなる化学療法剤で処置することを含む。単数または複数のさらなる化学療法剤は、Ｔｅｋアンタゴニストの投与前に、該投与と同時に、または該投与後に投与してもよい。処置される哺乳動物が固形腫瘍を有する場合、１つより多くの化学療法剤の使用が特に好都合である。請求される発明のいくつかの態様において、処置はさらに、哺乳動物を放射線照射で処置することを含む。近接照射療法および遠隔放射線療法を含む、放射線照射は、単数または複数の第二の化学療法剤および／またはＴｅｋアンタゴニストの投与前に、該投与と同時に、または該投与後に投与してもよい。
【００９０】
処置される哺乳動物が固形腫瘍を有する場合、該方法は、好ましくは、Ｔｅｋアンタゴニストに加え、アルキル化剤、代謝拮抗剤、ビンカアルカロイドおよび他の植物由来化学療法剤、ニトロソ尿素、抗腫瘍抗生物質、抗腫瘍酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、白金類似体、副腎皮質抑制剤、ホルモン、ホルモンアゴニストおよびアンタゴニスト、抗体、免疫療法剤、血液細胞因子、放射線治療、および生物学的反応修飾剤からなる群より選択される、１つまたはそれより多くの化学療法剤の投与を含む。
【００９１】
いくつかの好ましい態様において、該方法は、Ｔｅｋアンタゴニストに加え、シスプラチン、シクロホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、ブレオマイシン、カルボプラチン、フルオロウラシル、５−フルオロデオキシウリジン、メトトレキセート、タキソール、アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、およびビンブラスチン、リンホカインおよびサイトカイン、例えばインターロイキン、インターフェロン（アルファ、ベータ、またはデルタを含む）、並びにＴＮＦ、クロラムブシル、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ビンデシン、エトポシド、テニポシド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ヒドロキシ尿素、メチルヒドラジン、ミトーテン、タモキシフェン、およびフルオキシメステロンからなる群より選択される、１つまたはそれより多くの化学療法剤の投与を含む。
【００９２】
いくつかの好ましい態様において、該方法は、Ｔｅｋアンタゴニストに加え、Ｆｌｔ３リガンド、ＣＤ４０リガンド、インターロイキン−２、インターロイキン−１２、４−１ＢＢリガンド、抗４−１ＢＢ抗体、ＴＮＦアンタゴニストおよびＴＮＦ受容体アンタゴニスト、ＴＲＡＩＬ、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＶＥＧＦ受容体（Ｆｌｔ１およびＦｌｋ１またはＫＤＲとしても知られる、ＶＥＧＦ−Ｒ１およびＶＥＧＦ−Ｒ２を含む）アンタゴニスト、およびＣＤ１４８（ＤＥＰ−１、ＥＣＲＴＰ、およびＰＴＰＲＪとも称される、Ｔａｋａｈａｓｈｉら， Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｎｅｐｈｒｏｌ． １０：２１３５−４５， １９９９を参照されたい）アゴニストからなる群より選択される、それらの多様な可溶性型を含む、１つまたはそれより多くの化学療法剤の投与を含む。
【００９３】
いくつかの好ましい態様において、本発明のＴｅｋアンタゴニストは、ＢｒｏｗｄｅｒらおよびＫｌｅｍｅｎｔら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６０：１８７８， ２０００； Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０５（８）：Ｒ１５， ２０００； Ｂａｒｉｎａｇａ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：２４５， ２０００も参照されたい）に記載されるものなど、「メトロノーム療法」の構成要素として、または該療法と組み合わせて用いられる。
【００９４】
本発明のポリペプチド、組成物、および方法は、最前線の処置として、初期療法後に残った疾患の処置のため、または化学療法、手術、放射線照射、および当該技術分野に知られる他の療法的方法を含む、他の療法の付属物として、用いてもよい。
【００９５】
【実施例】
以下の実施例は、特定の態様を例示することを意図し、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００９６】
実施例１
可溶性Ｔｅｋ／Ｆｃ融合ポリペプチドの組換え産生
ヒト受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）Ｔｅｋ（ｏｒｋ、Ｔｉｅ２）をコードするｃＤＮＡの分子クローニングは、米国特許第５，４４７，８６０号に記載される。Ｔｅｋ ｃＤＮＡ（ブダペスト条約の条件下で、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに１９９２年５月２８日に寄託、寄託番号第ＡＴＣＣ ６９００３号）は１１２４アミノ酸をコードし、シグナルペプチド、Ｎ−末端細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＣ−末端細胞質ドメインを含む。配列解析に基づき、シグナルペプチドは、残基１−１８を含むと予測され、Ｎ−末端細胞外ドメインは、残基１９−７４５を含むと予測され、膜貫通ドメインは、残基７４６−７７２を含むと予測され、そしてＣ−末端細胞質ドメインは、残基７７３−１１２４を含むと予測される。細胞外ドメインには、２つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ループ、３つのＥＧＦ様システインリピートを含む領域（残基２１１−３４０の間）、およびフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩ）モチーフを含む領域（残基４４０−７３３）が含まれる。Ｔｅｋ ｃＤＮＡを用い、多様なＴｅｋ／Ｆｃ融合ポリペプチドの産生のための組換え発現ベクターを構築した。
【００９７】
Ｆｃに融合した全長Ｔｅｋ細胞外ドメインをコードする核酸を構築するため、Ｔｅｋリーダー（シグナルペプチド）および細胞外ドメインを含む、Ｔｅｋ由来のＮ−末端７４５アミノ酸をコードする核酸を、ヒトＩｇＧ１由来の２３２アミノ酸Ｆｃ部分をコードする核酸に融合させた。本構築物にコードされるＴｅｋ／Ｆｃ融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１として示される。配列番号１において、残基１−１８は、予測されるシグナルペプチド（細胞からの分泌に際し、切断されると予測される；実際の切断部位は、Ｎ−末端配列解析により同定した。以下を参照されたい）であり、残基１９−７４５は、Ｔｅｋ細胞外ドメインであり、そして残基７４６−９７７は、Ｆｃ部分である。哺乳動物発現ベクターへの挿入、並びに、哺乳動物宿主細胞での発現および該細胞からの分泌に際し、本構築物は、Ｔｅｋ７４５／Ｆｃと称されるポリペプチドを産生した。予測されるシグナルペプチド切断部位に基づき、Ｔｅｋ７４５／Ｆｃのアミノ酸配列は、配列番号１の残基１９−９７７であると予測された。
【００９８】
Ｆｃに融合したＴｅｋ細胞外ドメインの断片をコードする核酸を構築するため、Ｔｅｋリーダー（シグナルペプチド）および欠失細胞外ドメインを含む、Ｔｅｋ由来のＮ−末端４７２アミノ酸をコードする核酸を、ヒトＩｇＧ１由来の２３２アミノ酸Ｆｃ部分をコードする核酸に融合させた。本構築物にコードされるＴｅｋ／Ｆｃ融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２として示される。配列番号２において、残基１−１８は、予測されるシグナルペプチド（細胞からの分泌に際し、切断されると予測される；実際の切断部位は、Ｎ−末端配列解析により同定した。以下を参照されたい）であり、残基１９−４７２は、Ｔｅｋ細胞外ドメインの断片であり、そして残基４７３−７０４は、Ｆｃ部分である。哺乳動物発現ベクターへの挿入、並びに、哺乳動物宿主細胞での発現および該細胞からの分泌に際し、本構築物は、Ｔｅｋ４７２／Ｆｃと称されるポリペプチドを産生した。予測されるシグナルペプチド切断部位に基づき、Ｔｅｋ４７２／Ｆｃのアミノ酸配列は、配列番号２の残基１９−７０４であると予測された。
【００９９】
各Ｔｅｋ／Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする核酸を、哺乳動物発現ベクターに挿入し、そして各ベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクションした。増幅後、安定トランスフェクションＣＨＯ細胞株を、組換え融合ポリペプチドの発現および分泌を促進する条件下で培養し、そしてＴｅｋ／Ｆｃ融合ポリペプチドを培地から回収し、そして単離した。Ｎ−末端配列解析は、Ｔｅｋ７４５／Ｆｃと称される分泌ポリペプチドが、配列番号１の残基２３（アラニン）に対応するＮ−末端を有することを決定した。Ｎ−末端配列解析は、Ｔｅｋ４７２／Ｆｃと称される分泌ポリペプチドが、配列番号２の残基２３（アラニン）に対応するＮ−末端を有することを決定した。
【０１００】
Ｔｅｋ／Ｆｃ融合ポリペプチドの抗−血管形成活性は、実施例２−６に記載される、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ系で、立証される。
実施例２
創傷閉鎖アッセイにおけるＴｅｋ／Ｆｃの活性
平面内皮細胞移動（創傷閉鎖）アッセイを用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、Ｔｅｋ／Ｆｃによる血管形成の阻害を定量化した。本アッセイにおいて、内皮細胞移動は、培養細胞単層中の円状創傷の閉鎖速度として測定する。創傷閉鎖の速度は直線であり、そしてｉｎ ｖｉｖｏで、血管形成を刺激し、そして阻害する剤により、動的に制御される。
【０１０１】
Ｍａｒｔｉｎら， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ３３：２６１， １９９７に記載されるように、初代ヒト腎臓微小血管内皮細胞、ＨＲＭＥＣを単離し、培養し、そして融解後、第三継代で用いた。複製円状損傷、「創傷」（直径６００−８００ ミクロン）は、シリコンで先端を覆ったドリルを押し付け、集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）ＨＲＭＥＣ単層中に生成した。創傷を与える時点で、培地（ＤＭＥＭ ＋ １％ ＢＳＡ）に、２０ ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡ（ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート）、１０μｇ／ｍｌ Ｔｅｋ４７２／Ｆｃ、または２０ ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡおよび０．００１−１０μｇ／ｍｌ Ｔｅｋ４７２／Ｆｃの組み合わせを補った。残った創傷面積を、顕微鏡および画像解析ソフトウェア（Ｂｉｏｑｕａｎｔ、テネシー州ナッシュビル）を用い、時間（０−１２時間）の関数として測定した。時間に渡りプロットした、残った創傷面積の線形回帰により、各剤および剤の組み合わせに関し、相対移動速度を計算した。結果を図１に示す。Ｔｅｋ４７２／Ｆｃは、ＰＭＡ誘導内皮移動を用量反応方式で阻害し、１０μｇ／ｍｌで、移動速度を未刺激レベルに減少させた。
【０１０２】
実施例３
角膜ポケットアッセイにおけるＴｅｋ／Ｆｃの活性
マウス角膜ポケットアッセイを用い、ｉｎ ｖｉｖｏで、Ｔｅｋ／Ｆｃによる血管形成の阻害を定量化した。本アッセイにおいて、血管形成または抗−血管形成活性に関し、試験しようとする剤を、ハイドロン（ｈｙｄｒｏｎ）ペレット中の遅延放出型で固定し、これを麻酔したマウスの角膜上皮中に生成したマイクロポケットに移植する。血管新生（ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）は、血管新生角膜縁から、通常は無血管の角膜への、血管内部成長の出現、密度、および度合いとして測定する。
【０１０３】
ハイドロンペレットは、Ｋｅｎｙｏｎら， Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｍｏｌ． ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７：１６２５， １９９６に記載されるように、ｂＦＧＦ（９０ ｎｇ／ペレット）、ｂＦＧＦおよびＩｇＧ（１１μｇ／ペレット、コントロール）、またはｂＦＧＦおよびＴｅｋ４７２／Ｆｃ（１２．８μｇ）と共に、スクラルフェートを取り込んだ。ペレットは、６−８週齢オスＣ５７ＢＬマウスの外側（ｌａｔｅｒａｌ）角膜縁に対し内側（ｍｅｄｉａｌ）に１ｍｍ、微小切開することにより生成した、角膜支質（ｓｔｒｏｍａｌ）マイクロポケット中に移植した。５日後、ｂＦＧＦに対する新血管新生反応のピーク時に、Ｚｅｉｓｓスリットランプを用い、ペレットを含む経線の極軸から３５−５０°の初期角で、角膜の写真を撮影した。画像をデジタル化し、そして減法混色の原色フィルター（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｃｏｌｏｒ ｆｉｌｔｅｒｓ）（Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ４．０）によりプロセシングし、ヘモグロビン含量により、確立された微小血管の輪郭を描いた。画像解析ソフトウェア（Ｂｉｏｑｕａｎｔ、テネシー州ナッシュビル）を用い、血管新生された角膜画像の割合、血管新生された領域内の血管密度、および総角膜内の血管密度を計算した。結果を図２に示す。Ｔｅｋ４７２／Ｆｃ（５０ ｐｍｏｌ）は、ｂＦＧＦ（３ ｐｍｏｌ）誘導角膜血管生成を阻害し、ＦＧＦのみにより誘導されるものの３０％に、血管密度を減少させた。
【０１０４】
実施例４
ネズミ移植モデルにおけるＴｅｋ／Ｆｃによる新血管新生の阻害
１匹のマウスドナーから別の遺伝的に類似のマウスの耳皮膚への異所性（ｈｅｔｅｒｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ）移植心臓組織の生存は、生存および心筋機能のためのエネルギーを促進するため、移植された心臓および周囲の組織による適切な新血管新生を必要とする。移植部位での不適切な血管系は、心臓に対する過剰な虚血、組織損傷、および組織移植の失敗を引き起こす。内皮細胞移動および血管形成に関与するアンギオポエチンおよび内皮特異的因子に拮抗する剤は、移植部位での血管形成を減少させ、それにより、移植組織機能および最終的にそれ自体の移植を制限することが可能である。
【０１０５】
新血管新生に対するＴｅｋ／Ｆｃのアンタゴニスト効果を立証するため、ネズミ異所性心臓同系移植モデルを利用し、以下の研究を行った。すべての実験において、メスＢＡＬＢ／ｃ（＝１２週齢）レシピエントは、同一系統のドナーマウスから、新生心臓移植片を受けた。
【０１０６】
Ａ．５００μｇ／日用量でのＴｅｋ／Ｆｃ
３つの実験の各々で、ドナー心臓組織を、第０日に、レシピエントの左耳介に移植し、そしてマウスを２群に分けた。コントロール群は、ヒトＩｇＧ（ＨｕＩｇＧ）を、一方他の群は、ヒトＴｅｋ４７２／Ｆｃを、共に１日５００μｇ、腹腔内投与された。すべての処置は第０日に開始し、そして連続５日間続いた。移植片の機能性は、移植後、第７日および第１４日に、可視拍動活性をモニターすることにより、決定した。表１は、３つの実験からの累積的結果を示す。
【０１０７】
表１
第７日および第１４日での機能する移植
【０１０８】
【表１】

【０１０９】
Ｈｕ ＩｇＧを投与された８匹のマウスはすべて、第７日および第１４日に、機能する移植片を有し、１００％移植を示した。Ｔｅｋ４７２／Ｆｃ処置マウスは、最初に機能する活性をまったく示さず、減少した移植を示し、第７日で機能する移植片はわずか３６％であった。Ｔｅｋ４７２／Ｆｃ処置を止めて１０日後の第１４日までに、マウスの８２％が機能する移植片を有した。
【０１１０】
Ｔｅｋ／Ｆｃを投与されたマウスの移植心臓に対する組織学的研究は、コントロールタンパク質ＩｇＧを投与されたマウス由来の移植心臓で観察されるものに比較した際、血管漏出を示す、移植部位での浮腫の増加、および減少した宿主およびドナー組織血管系染色（因子ＶＩＩＩ）を示した。
【０１１１】
本実験は、Ｔｅｋ４７２／Ｆｃでの処置が、心臓同系移植機能をひどく損ない、そして療法の５日過程後、第７日で、マウスの６４％の組織の移植を妨げたことを示した。
【０１１２】
Ｂ．Ｔｅｋ／Ｆｃ用量力価測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）
３つの異なる用量のＴｅｋ／Ｆｃを、上述の心臓同系移植モデルで試験した。各試験群は、４匹のメスＢＡＬＢ／ｃマウスを含んだ。コントロール群は、連続５日間、１日当たり５００μｇ、ヒトＩｇＧ（Ｈｕ ＩｇＧ）を腹腔内投与された。Ｔｅｋ／Ｆｃ群は、連続５日間、１日当たり９０、２５０、または５００μｇ、ヒトＴｅｋ４７２／Ｆｃを腹腔内投与された。移植片の機能性は、移植後、第７、１１、１４、１７、および２１日に、可視拍動活性をモニターすることにより、決定した。結果を表２に示す。
【０１１３】
表２
Ｔｅｋでの用量力価決定後の機能する移植
【０１１４】
【表２】

【０１１５】
^*すべての結果は、拍動心臓移植片を持つマウスのパーセントとして報告される。
移植に対する影響が観察されないＨｕ ＩｇＧコントロールに比較した際、２５０μｇおよび５００μｇ用量のＴｅｋ／Ｆｃ両方で、同様の度合いの心臓同系移植破損が観察された。移植における、かなり有意でないが、小さい減少が、９０μｇ用量で観察された。
【０１１６】
実施例５
Ｔｅｋ４７２／Ｆｃでの腫瘍の処置
Ｔｅｋ４７２／Ｆｃを単独で、そしてＦｌｔ３Ｌと組み合わせて投与し、８７線維肉腫またはＢ１０．２線維肉腫腫瘍を持つマウスを処置した。Ｂ１０．２および８７腫瘍は、進行性表現型であり、すなわち、これらは正常マウス中で、進行性に増殖する。Ｂ１０．２線維肉腫は、Ｃ５７ＢＬマウスにおいて、５ ｍｇのメチルコラントレンを含む、パラフィンペレットの皮下移植により誘導した（ＬｙｎｃｈおよびＭｉｌｌｅｒ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２１：１４０３， １９９１）。８７線維肉腫は、ＵＶＢ照射へのＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスの慢性曝露により誘導される進行性腫瘍変異体である。これらの実験用に、マウスに腫瘍を接種するため、５ ｘ １０⁵細胞を腹部に皮内注射した（第０日）（本明細書に援用されるＢｏｒｇｅｓら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３：１２８９， １９９９もまた参照されたい）。
【０１１７】
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス中の８７線維肉腫腫瘍を、ＭＳＡ（ネズミ血清アルブミン、コントロール）、Ｔｅｋ／Ｆｃ（３１２μｇ／日、腫瘍細胞注射後、第４−１９日）、Ｆｌｔ３Ｌ（１０μｇ／日、腫瘍細胞注射後、第１−１９日）、またはＴｅｋ／ＦｃおよびＦｌｔ３Ｌの組み合わせ（Ｔｅｋ／Ｆｃは３１２μｇ／日、腫瘍細胞注射後、第４−１９日；Ｆｌｔ３Ｌは１０μｇ／日、第１−１９日）で処置した。各処置群は、１０匹のマウスからなった。腫瘍頻度および腫瘍サイズは、５週間、毎週測定した。結果を図３に示す。Ｔｅｋ／ＦｃおよびＦｌｔ３Ｌの組み合わせで処置したマウスは、最も遅い腫瘍増殖速度を示した。第６週に、Ｆｌｔ３Ｌを加えたＴｅｋ／Ｆｃ群のさらなる動物が腫瘍を拒絶し、腫瘍頻度は６８％に減少した。本実験の結果に基づき、Ｔｅｋ／ＦｃおよびＦｌｔ３Ｌの組み合わせを用い、あらかじめ存在するＢ１０．２線維肉腫腫瘍を処置した。
【０１１８】
Ｃ５７ＢＬ／１０マウス中のＢ１０．２線維肉腫腫瘍を、ＭＳＡ（コントロール）、Ｔｅｋ／Ｆｃ（６２５μｇ／日、腫瘍細胞注射後、第７−３２日）、Ｆｌｔ３Ｌ（１０μｇ／日、腫瘍細胞注射後、第７−２６日）、またはＴｅｋ／ＦｃおよびＦｌｔ３Ｌの組み合わせ（Ｔｅｋ／Ｆｃは３１２または６２５μｇ／日、腫瘍細胞注射後、第７−３２日；Ｆｌｔ３Ｌは１０μｇ／日、第７−２６日）で処置した。各処置群は、１０匹のマウスからなった。腫瘍頻度および腫瘍サイズは、６週間、毎週測定した。結果を図４に示す。Ｔｅｋ／ＦｃおよびＦｌｔ３Ｌの組み合わせで処置したマウスは、減少した腫瘍増殖速度を示し；Ｆｌｔ３Ｌと組み合わせ６２５μｇ／日 Ｔｅｋ／Ｆｃで処置したマウスが、最も遅い腫瘍増殖速度を示した。
【０１１９】
実施例６
アンギオポエチンに対するＴｅｋ／Ｆｃ融合ポリペプチドの結合
Ｔｅｋ７４５／ＦｃおよびＴｅｋ４７２／Ｆｃ両方を、時間分解蛍光に基づく固相プレート結合アッセイを用い、ヒトＴｅｋリガンド、アンギオポエチン２（Ａｎｇ２）に結合する能力に関し、調べた。２つの異なる型の可溶性Ｔｅｋ／Ｆｃを用いた、ヒトＡｎｇ２に対する結合の比較により、Ｔｅｋ４７２／Ｆｃは、Ｔｅｋ７４５／Ｆｃよりも、Ａｎｇ２に有意によりよく結合する（２１倍よい）ことが明らかになった。
【０１２０】
低蛍光８ ｘ １２片マイクロタイタープレートウェル（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｗａｌｌａｃ、オハイオ州アクロン）を、５００ ｎｇ／ｍｌ（１００μｌ）のヒトＡｎｇ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と、２−８℃で一晩インキュベーションした。その後、１００μｌの１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を室温で１時間添加することにより、ウェルをブロッキングした。４ Ｘ ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０ ０．０５％）洗浄後、Ｔｅｋ７４５／Ｆｃ、Ｔｅｋ４７２／Ｆｃ、またはＴＮＦＲ／Ｆｃ（コントロール／Ｆｃ）を含む試料を、３倍希釈中の３０μｇ／ｍｌから始まり、２つ組で、希釈剤（１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ）中で、力価測定した。試料を穏やかに攪拌しながら室温で１時間結合させ、そしてその後、未結合成分をＰＢＳ−Ｔで４回、洗い流した。結合Ｔｅｋ／Ｆｃは、アッセイ緩衝液中で１００ ｎｇ／ｍｌに希釈した、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ユーロピウム結合体（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｗａｌｌａｃ）をウェルに添加し、そして室温で３０分間インキュベーションすることにより、検出した。未結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ユーロピウムは、４ Ｘ ＰＢＳ−Ｔ洗浄により、除去した。洗浄後、１５０μｌの亢進溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｗａｌｌａｃ）を各ウェルに添加し、そしてプレートを室温で、最低５分間、インキュベーションした。結合は、ユーロピウム−由来蛍光を測定するソフトウェアおよび励起／発光装置を備えたＶｉｃｔｏｒ ＩＩ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌカウンター上で、各ウェルから発光される蛍光を読み取ることにより、決定した。蛍光カウントとして表される結果を、図５に示す。
【０１２１】
ＴＮＦＲ／Ｆｃコントロールは、ヒトＡｎｇ２に対し、検出可能な結合（バックグラウンドに関し観察されるものを超えるもの）を示さなかった。Ｔｅｋ４７２／ＦｃおよびＴｅｋ７４５／Ｆｃは共に、濃度依存方式でヒトＡｎｇ２に結合したが、Ｔｅｋ４７２／Ｆｃはより高い結合親和性を有した。Ｔｅｋ４７２／Ｆｃは、質量濃度に基づき、Ｔｅｋ７４５／Ｆｃより、２０倍よく結合した。より低い濃度のＴｅｋ４７２／Ｆｃで観察された結合レベルと同じレベルを達成するのに、はるかに高い濃度のＴｅｋ７４５／Ｆｃが必要であった。ＢＣ４０Ｋ（ｈｕＡＮＧ−２結合の４０，０００蛍光カウントを達成するのに必要とされるＴｅｋ／Ｆｃの濃度）は、Ｔｅｋ４７２／Ｆｃに関するＢＣ４０Ｋが９９４ ｎｇ／ｍｌであったのと比較し、Ｔｅｋ７４５／Ｆｃに関し、２０，５９６ ｎｇ／ｍｌであった。
【０１２２】
実施例７
Ｔｅｋ−特異的に結合するモノクローナル抗体
Ａ．Ｔｅｋ４７２／Ｆｃに対する抗体
「組換えＴｉｅ２細胞外ドメイン−Ｆｃ融合体」に対する抗体は、Ｈｏｌｍｅｓら、ＷＯ ００／１８４３７に記載されてきている。対照的に、本発明の発明者らは、欠失Ｔｅｋ細胞外ドメイン融合ポリペプチドＴｅｋ４７２／Ｆｃに対する抗体を作成した。実施例６に示されるように、Ｔｅｋ４７２／Ｆｃは、Ｔｅｋ７４５／Ｆｃよりも高い親和性で、Ｔｅｋリガンドに結合する。
【０１２３】
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、実施例１に記載されるＴｅｋ／Ｆｃ融合ポリペプチド、Ｔｅｋ４７２／Ｆｃで免疫感作した。脾臓細胞を収集し、そして標準的方法を用い、ハイブリドーマを調製するのに用いた。ハイブリドーマ上清を、ＥＬＩＳＡを用いて、（ａ）Ｔｅｋ４７２／Ｆｃおよび（ｂ）ヒトＴｅｋを発現するＣＶ１細胞に結合する能力に関し、スクリーニングした。陽性を２回クローニングし、モノクローナル性を保証し、その後、アイソタイプを決定し、そしてＴｅｋに対する反応性に関し、再アッセイした。
【０１２４】
さらなる実験のため、３つの抗体を選択した：Ｍ５３０（ＩｇＧ２ｂアイソタイプ）、Ｍ５３１（ＩｇＧ２ｂアイソタイプ）、およびＭ５３２（ＩｇＧ１アイソタイプ）。Ｍ５３０およびＭ５３１は、同一エピトープを認識するようであり、そしてＭ５３２は、第二の（異なる）エピトープを認識する。したがって、Ｍ５３０およびＭ５３２を、多様な免疫アッセイで、抗体対（例えば捕捉および検出のため）として用いた。Ｍ５３０は、（免疫沈降および固相プレート結合アッセイにより）Ｔｅｋ７４５／Ｆｃ、Ｔｅｋ４７２／Ｆｃに結合し、そしてヒト内皮細胞の表面上に発現されるような天然発生Ｔｅｋに結合することが示された。Ｍ５３０抗体は、以下の実施例８に記載される、結合およびエピトープマッピング研究で、さらに性質決定した。
【０１２５】
Ｂ．さらなるＴｅｋ抗体
まだクラスター形成されていない、推定上の内皮細胞−特異的抗体のワークショップパネルを、ヒト白血球分化抗原（ＨＬＤＡ）ワークショップから得た。いくつかの抗体は、ヒト内皮細胞でマウスを免疫感作することにより、生成した。パネル中の１つの抗体は、ヒトＴｅｋと反応することが知られた。これらの抗体は、以下の実施例８に記載される、結合およびエピトープマッピング研究で、さらに性質決定した。
【０１２６】
実施例８
Ｔｅｋおよびヒト微小血管内皮細胞に対するＴｅｋ抗体結合
Ａ．全長Ｔｅｋ細胞外ドメインおよび内皮細胞に対する抗体結合
固相結合アッセイ（時間分解蛍光、実施例６に記載されるようなもの）を用い、実施例７Ａに記載されるｈｕＴｅｋモノクローナル抗体Ｍ５３０、および実施例７Ｂに記載される８つのモノクローナル抗体（内皮細胞−特異的抗体、ＷＳ＃７００９８、＃７００９９、＃７０１００、＃７０１０１、＃７０１０４、＃７０１０８、＃７０１１２、および推定上のＴｅｋ−特異的抗体＃７０６３７）は、全長Ｔｅｋ細胞外融合ポリペプチドＴｅｋ７４５／Ｆｃに特異的に結合した。ＩｇＧ１陰性コントロールｍＡｂ（ＭＯＰＣ２１）は、バックグラウンド以上には、Ｔｅｋ７４５／Ｆｃに結合しなかった。２つの他の内皮細胞−特異的ワークショップ抗体（ＷＳ＃７０１１０および＃７０１１５）は、Ｔｅｋ７４５／Ｆｃに検出可能には結合しなかった。
【０１２７】
フローサイトメトリーを用い、実施例７Ａに記載されるヒトＴｅｋモノクローナル抗体Ｍ５３０、Ｍ５３１、およびＭ５３２並びに実施例７Ｂに記載される８つのモノクローナル抗体（内皮細胞−特異的抗体、ＷＳ＃７００９８、＃７００９９、＃７０１００、＃７０１０１、＃７０１０４、＃７０１０８、＃７０１１２、およびＴｅｋ−特異的抗体＃７０６３７）は、ヒト内皮細胞上に発現されるような、天然発生Ｔｅｋ（成人皮膚およびＨＵＶＥＣに由来するヒト微小血管内皮細胞両方）に結合することが示された。
【０１２８】
Ｂ．ＦＮ３モチーフを欠く、Ｔｅｋ細胞外ドメインに対する抗体結合
実施例７Ａに記載されるモノクローナル抗体Ｍ５３０、並びに実施例７Ｂに記載される７つのモノクローナル抗体（内皮細胞−特異的抗体、ＷＳ＃７００９８、＃７００９９、＃７０１００、＃７０１０１、＃７０１０４、＃７０１０８、および＃７０１１２）は、欠失Ｔｅｋ細胞外融合ポリペプチド、Ｔｅｋ４７２／Ｆｃに特異的に結合した。ワークショップ抗体＃７０６３７（Ｔｅｋ７４５／Ｆｃに結合する）、＃７０１１０、および＃７０１１５は、Ｔｅｋ４７２／Ｆｃに結合しなかった。
【０１２９】
Ｃ．Ｔｅｋリガンドによる抗体結合の競合的阻害
アンギオポエチン−１（Ａｎｇ１、Ｄａｖｉｓら， Ｃｅｌｌ ８７：１１６１， １９９６）およびアンギオポエチン−２（Ａｎｇ２、Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：５５， １９９７）は、２つの緊密に関連したＴｅｋリガンドである。Ａｎｇ１およびＡｎｇ２は共に、ヒトＴｅｋに同様の親和性で結合する。Ａｎｇ１の存在下で、ＥＣ培養に、モル過剰のＡｎｇ２を添加すると、内皮細胞に対するＡｎｇ１結合の競合を介し、内皮細胞上のＴｅｋのＡｎｇ１誘導活性化が阻害されることが示されてきている（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：５５， １９９７）。組換えヒトアンギオポエチン−２調製は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．（ミネソタ州ミネアポリス）から得た。製造者にしたがうと、アンギオポエチン−２調製は、還元および非還元条件下両方で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中、６６ ｋＤａタンパク質として移動する。Ｎ−末端アミノ酸配列決定に基づき、該調製は２つのペプチド：Ｎ−末端としてＡｓｐ６８を有する主なポリペプチド（総量の７５％）およびＮ−末端としてＴｙｒ１９を有する重要でないポリペプチド（総量の２５％）を含む。
【０１３０】
本Ａｎｇ−２調製が、皮膚ヒト微小血管内皮細胞上に発現されるＴｅｋに対するＴｅｋ抗体の結合を競合的に阻害する能力を、フローサイトメトリーを用いて試験した。
【０１３１】
各ｍＡｂを２つ組で、１２ ｘ ７５ ｍｍファルコン試験管中で、５μｇ／ｍｌで、５００，０００ ＨＭＶＥＣ−ｄに添加し、そして結合培地中で、４℃で１５分間インキュベーションした。２つ組の一方の組に、ヒトＡｎｇ２を、１０μｇ／ｍｌ（５倍モル過剰）で、さらに３０分間添加した。結合Ｔｅｋ ｍＡｂを持つ細胞を、その後、２０体積のＰＢＳ−含有洗浄緩衝液中で洗浄した。洗浄工程後、細胞に、Ｆ（ａｂ２）ヒツジ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ蛍光結合体を添加し、その後、４℃で３０分間インキュベーションし、そしてさらに２０体積で洗浄することにより、結合マウスｍＡｂを検出した。Ｔｅｋ ｍＡｂの結合は、単一レーザーＦＡＣＳＣＡＮ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サニーベール）上でのフローサイトメトリー解析により、測定した。抗体結合の阻害パーセントは、式：
ＭＦＩ（Ａｎｇ２なし）−ＭＦＩ（＋Ａｎｇ２）／ＭＦＩ（Ａｎｇ２なし） ｘ １００
を用いて計算した。結果を表３に示す。
【０１３２】
表３
Ａｎｇ２によるＴｅｋ抗体結合の阻害
【０１３３】
【表３】

【０１３４】
これらの結果であるＡｎｇ２によるＴｅｋ抗体結合の阻害は、Ｍ５３０、＃７００９８、＃７００９９、＃７０１０１、＃７０１０８、および＃７０１１２抗体は、Ｔｅｋリガンド結合部位で、またはその近傍で結合することを示唆する。ｍＡｂ Ｍ５３０、ＷＳ＃７００９９および＃７０１１２もまた、組換えヒトＴｅｋ４７２／Ｆｃに対するＡｎｇ２結合（１００ ｎｇ／ｍｌ）を阻害することが可能であり、ｍＡｂ Ｍ５３０および＃７０１１２に関し、１０μｇ／ｍｌ以上の濃度で、そしてｍＡｂ ７００９９に関し、３μｇ／ｍｌ以上の濃度で、５０％以上阻害可能であった。
【０１３５】
本実施例に記載される結合結果と組み合わせ、ヒトＴｅｋ細胞外ドメイン中の少なくとも３つの抗体エピトープが明示され、そして免疫原／標的として、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩ）モチーフを含む領域のすべてまたは一部を欠くＴｅｋ細胞外ドメインの断片を用い、抗体を調製する有用性が例示される。
【０１３６】
本明細書に引用される刊行物の相当する開示は、特に本明細書に援用される。上に示される実施例は、包括的であることも、または本発明の範囲を制限することも意図しない。当業者は、上の解説を考慮し、変動および修飾および変動が可能であることを理解するだろうし、そしてこうした修飾および変動は、本発明の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、創傷閉鎖アッセイにおける内皮細胞移動のＴｅｋ４７２／Ｆｃによる阻害を示す。
【図２】 図２は、角膜ポケットアッセイにおける血管形成のＴｅｋ４７２／Ｆｃによる阻害を示す。
【図３】 図３は、８７線維肉腫腫瘍を持つマウスにおける、Ｔｅｋ４７２／Ｆｃ、Ｆｌｔ３Ｌ、並びにＴｅｋ４７２／ＦｃおよびＦｌｔ３Ｌの組み合わせでの処置後の腫瘍増殖を示す。
【図４】 図４は、Ｂ１０．２線維肉腫腫瘍を持つマウスにおける、Ｔｅｋ４７２／Ｆｃ、Ｆｌｔ３Ｌ、並びにＴｅｋ４７２／ＦｃおよびＦｌｔ３Ｌの組み合わせでの処置後の腫瘍増殖を示す。
【図５】 図５は、ヒトアンギオポエチン−２に対するＴｅｋ４７２／ＦｃおよびＴｅｋ７４５／Ｆｃの結合を示す。
【配列表】

Claims (28)

1. 配列番号１の残基１９−７４５として示されるＴｅｋ細胞外ドメインの断片、または９０％の配列同一性を有するその変異体を含むポリペプチドであって、該ポリペプチドがフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩ）モチーフを含む配列番号１の残基４７３−７４５を欠き、そして該ポリペプチドが、全長Ｔｅｋ細胞外ドメインより、Ｔｅｋリガンドに対するより高い結合親和性を有する、前記ポリペプチド。
2. Ｔｅｋ細胞外ドメインの断片またはその変異体が：
   （ａ）配列番号２の残基２３−４７２に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；
   （ｂ）配列番号２の残基２３−４７２に少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；
   （ｃ）配列番号２の残基２３−４７２に少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
   （ｄ）配列番号２の残基２３−４７２；および
   （ｅ）配列番号２の残基１９−４７２；
   からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１のポリペプチド。
3. Ｔｅｋリガンドが、アンギオポエチン−１、アンギオポエチン−２、またはアンギオポエチン−４である、請求項１または請求項２のポリペプチド。
4. Ｔｅｋリガンドが、アンギオポエチン−２である、請求項１または２のポリペプチド。
5. 請求項１−４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
6. （ａ）請求項２（ｄ）に記載のポリペプチドをコードする核酸；および
   （ｂ）（ａ）の核酸に少なくとも９０％、９５％、９８％、または９９％同一であり、そして、全長Ｔｅｋ細胞外ドメインより、Ｔｅｋリガンドに対するより高い結合親和性を有するポリペプチドをコードする核酸；
   からなる群より選択される、核酸。
7. 請求項６の核酸にコードされるポリペプチド。
8. さらにシグナルペプチド配列をコードする、請求項５または請求項６の核酸。
9. 配列番号２をコードする、請求項８の核酸。
10. ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、組換え宿主細胞において、請求項５、６、８または９のいずれか１項に記載の核酸を発現させることを含む方法により、産生されたポリペプチド。
11. 方法が、請求項８または請求項９に記載の核酸を発現させることを含み、そして宿主細胞から分泌されたポリペプチドを収集することをさらに含む、請求項１０のポリペプチド。
12. 請求項１−４、７、１０または１１のいずれか１項に記載の、少なくとも１つのポリペプチドを含む、可溶性Ｔｅｋ多量体。
13. 多量体が、二量体または三量体である、請求項１２の可溶性Ｔｅｋ多量体。
14. 多量体が、Ｆｃポリペプチドまたはロイシンジッパーを含む、請求項１２の可溶性Ｔｅｋ多量体。
15. 配列番号２の残基２３−４７２を含む、請求項１２の可溶性Ｔｅｋ多量体。
16. 配列番号２の残基２３−７０４を含む、請求項１４の可溶性Ｔｅｋ多量体。
17. 請求項１−４、７、１０もしくは１１のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項１２−１６のいずれか１項に記載の可溶性Ｔｅｋ多量体を含む、医薬組成物。
18. 哺乳動物における血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を阻害するための、請求項１７の医薬組成物。
19. ＴｅｋがヒトＴｅｋである、請求項１８の医薬組成物。
20. 哺乳動物における血管形成を阻害するための医薬組成物であって、請求項１６に記載の可溶性Ｔｅｋ多量体を含む、前記医薬組成物。
21. 血管形成に仲介される疾患または異常を有する哺乳動物を治療するための、請求項１７−２０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
22. 疾患または異常が、目の新血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）により特徴付けられる、請求項２１の医薬組成物。
23. 疾患または異常が固形腫瘍である、請求項２１の医薬組成物。
24. さらに、第二の化学療法剤と組み合わせてなる、請求項１７−２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
25. 第二の化学療法剤が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、ビンカアルカロイドおよび他の植物由来化学療法剤、ニトロソ尿素、抗腫瘍抗生物質、抗腫瘍酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、白金類似体（ａｎａｌｏｇ）、副腎皮質抑制剤、ホルモン、ホルモンアゴニスト、ホルモンアンタゴニスト、抗体、免疫療法剤、血液細胞因子、放射線治療、および生物学的反応修飾剤からなる群より選択される、請求項２４の医薬組成物。
26. 第二の化学療法剤が、シスプラチン、シクロホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、ブレオマイシン、カルボプラチン、フルオロウラシル、５−フルオロデオキシウリジン、メトトレキセート、タキソール、アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、およびビンブラスチン、リンホカインおよびサイトカイン、例えばインターロイキン、インターフェロン（アルファ、ベータ、またはデルタを含む）、並びにＴＮＦ、クロラムブシル、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ビンデシン、エトポシド、テニポシド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ヒドロキシ尿素、メチルヒドラジン、ミトーテン、タモキシフェン、およびフルオキシメステロンからなる群より選択される、請求項２４の医薬組成物。
27. 第二の化学療法剤が、Ｆｌｔ３リガンド、ＣＤ４０リガンド、インターロイキン−２、インターロイキン−１２、４−１ＢＢリガンド、抗４−１ＢＢ抗体、ＴＮＦアンタゴニストおよびＴＮＦ受容体アンタゴニスト、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ１４８アゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニスト、およびＶＥＧＦ受容体アンタゴニストからなる群より選択される、請求項２４の医薬組成物。
28. 哺乳動物におけるＴｅｋに対するＴｅｋリガンドの結合を阻害するための医薬組成物であって、阻害に有効な量のＴｅｋアンタゴニストであって、以下：（ａ）請求項１−４、７、１０または１１のいずれか１項に記載のポリペプチド；（ｂ）請求項１２−１６のいずれか１項に記載の可溶性Ｔｅｋ多量体；並びに（ｃ）配列番号２の残基２３−７０４からなる可溶性Ｔｅｋ多量体；からなる群より選択される、前記Ｔｅｋアンタゴニストを含む、前記医薬組成物。

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