JPH06315382A - Ｔｉｅ−２受容体をコードするｄｎａ及びｔｉｅ−２受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ＴＩＥ−２受容体をコードするＤＮＡ及びＴ
ＩＥ−２受容体を提供する。 【構成】 ＴＩＥ−２受容体は１１０３個のアミノ酸残
基からなり、細胞外イムノグロブリン様ドメイン、ＥＧ
Ｆホモロジードメイン、フィブロネクチンタイプIII リ
ピートドメイン、トランスメンブレンドメイン及びチロ
シンキナーゼドメインを含む。前駆体は１１２３個のア
ミノ酸残基からなる。 【効果】 造血機構の解明等に有効と考えられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＴＩＥ−２受容体をコ
ードするＤＮＡ及びＴＩＥ−２受容体に関する。ＴＩＥ
受容体とは、細胞外ドメインがリガンドと結合すると、
細胞内のチロシンキナーゼ活性を有するドメインが活性
化する受容体の一種であり、その酵素活性と特異なドメ
イン構造に注目して、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ
−Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌｉｋｅ ｄｏｍａ
ｉｎ−ＥＧＦ（上皮増殖因子：ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇ
ｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｏｍ
ａｉｎから命名されたものである。

【０００２】

【従来の技術】細胞の増殖や分化は、タンパク性の増殖
因子とそれに対する受容体との結合によって引き起こさ
れ、これらの受容体には、多くの場合チロシンキナーゼ
が関与していることが知られている。一般に、受容体型
チロシンキナーゼは、その細胞外ドメインの構造の違い
から４種のタイプに分類されてきた。また、それらの各
タイプがそれぞれ類縁遺伝子群を構成しており、細胞増
殖因子受容体として多数のものが公知となっている。受
容体型チロシンキナーゼは、リガンドの結合によってチ
ロシンキナーゼが活性化され、細胞内に情報を伝達する
働きを担っている（A. Ullrich and J. Schlessinger,
Cell 61, 203-212, 1990）。細胞内に存在するキナーゼ
ドメインは約２５０個のアミノ酸残基から構成されてお
り、分子間で非常に高い相同性を有している。また、そ
の中にはチロシンキナーゼ間でよく保存されたアミノ酸
配列が存在し（S. K. Hanks et al. Science 241, 42-5
2, 1988 ）、その配列からＤＮＡの塩基配列を予想する
ことができる。こうして予想された塩基配列をプライマ
ーに用いたＲＴ−ＰＣＲ法を利用して、様々な受容体型
チロシンキナーゼが単離されてきた（Wilks A. F.Metho
ds in Enzymology 200, 533-546, 1991 ）。

【０００３】受容体型チロシンキナーゼの一種であるｃ
−ｋｉｔ受容体は造血幹細胞表面に発現しており、造血
幹細胞増殖因子の受容体であることが分かっている（Wi
tleO. N., et al. Cell 63, 5, 1991）。更に、1992年
にPartanenらによって単離されたヒトＴＩＥ受容体も、
巨核芽球系細胞株や血管内皮細胞に特異的に発現がみら
れることから、造血に関与すると考えられている（Part
anen et al, Mol. Cel. Biol.: 12, 1698-1707, 199
2）。また、このヒトＴＩＥ受容体は、前記した従来の
４種のタイプのいずれにも属さない全く新規な構造の細
胞外ドメインを持っていることが明らかとなり、この新
規なタイプに属する新たな類縁遺伝子群の存在が予想さ
れている。この新しいヒトＴＩＥ受容体類縁遺伝子群に
属する遺伝子は、同様の機能、すなわち造血に関与する
受容体タンパク質をコードすることが考えられる。

【０００４】一方、前述のＲＴ−ＰＣＲ法により、マウ
ス心臓よりｔｅｋ遺伝子が単離され（Dumont et al, On
cogene 7: 1471-1480, 1992 ）、そしてマウスＥＳ細胞
よりｈｙｋ受容体遺伝子が単離されている（Horita et
al, B.B.R.C. 189: 1747-1753, 1992 ）。どちらの遺伝
子もチロシンキナーゼをコードしていたが、ｔｅｋ遺伝
子は、細胞外ドメインが全く欠けていた。また、ｈｙｋ
受容体遺伝子は、ヒトＴＩＥ受容体遺伝子の類縁遺伝子
であると考えられ、広範な組織で発現がみられている
が、造血への関与は不明である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】前記のように、造血に
関わる因子はいくつか明らかとなっており、受容体型チ
ロシンキナーゼである前記のｃ−ｋｉｔ受容体もその一
種であることが知られているが、造血の機構はほとんど
明らかとはなっていない。また、未知の因子の存在も予
想されている。造血の機構を明らかにするためには in
vivoでの実験系が必要となる。その場合には、実験動物
として取り扱いの容易なマウスを使用することが望まし
い。

【０００６】しかしながら、前記したように、前記のヒ
トＴＩＥ受容体に相当するマウスＴＩＥ受容体及び類縁
遺伝子によりコードされる受容体の構造は全く明らかに
されていない。そこで、本発明者らは相同性を指標にし
てマウスのｃＤＮＡライブラリーから目的の遺伝子のｃ
ＤＮＡを単離してクローン化し、ＴＩＥ−２と命名し
た。また、マウスＴＩＥ−２受容体遺伝子を特定し、同
遺伝子のコードするマウスＴＩＥ−２受容体を特定する
点につき鋭意研究を行った。

【０００７】即ち、本発明者らは、マウス造血幹細胞よ
り調製したＲＮＡに、チロシンキナーゼに特異的なプラ
イマーを適用してＲＴ−ＰＣＲを行い、キナーゼドメイ
ンを含むＤＮＡ断片のうちから、ヒトＴＩＥと相同性の
高いＤＮＡ断片を選び出し、これをプローブとして使用
してマウス白血病細胞株ＤＡ−１ｃＤＮＡライブラリー
を検索し、マウスＴＩＥ−２受容体の全長をコードする
ｃＤＮＡを得、その全塩基配列を決定し、マウスＴＩＥ
−２受容体の全アミノ酸配列を解明し本発明を完成し
た。本発明はこうした知見に基づくものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、配列表の配列
番号１の配列で表されるアミノ酸配列からなるポリペプ
チドをコードする塩基配列を含むことを特徴とする、Ｄ
ＮＡに関する。また、本発明は、配列表の配列番号２の
配列で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコ
ードする塩基配列を含むことを特徴とする、ＤＮＡにも
関する。更に、本発明は、配列表の配列番号１の配列で
表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ポリペ
プチドに関する。また、本発明は、配列表の配列番号２
の配列で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とす
る、ポリペプチドにも関する。

【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。ｃＤＮＡ
の作製、及びλファージを使用したｃＤＮＡライブラリ
ーの作製は、通常の実験書に記載の公知の方法によって
行うことができる。また、プラスミドを使用してｃＤＮ
Ａライブラリーを作製することもできるが、λファージ
を用いる方法の方が効率がよい。なお、プラスミドを使
用し、かつ効率を高める方法としては岡山−バーグの方
法（Mol. Cell. Biol. 2, 161-170, 1982 ）等がある。
前記の通常の実験書としては、例えば、Maniatis. T.ら
の編集した Molecular Cloning, A laboratory Manual,
1989, Eds., Sambrook, J. Fritsch, E. F., Maniati
s, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press を挙げ
ることができる。

【００１０】チロシンキナーゼ特異的プライマーは、Wi
lks らの方法（Proc. Natl. Acad.Sci. USA 86: 1603-1
607, 1989）に従い、合成ＤＮＡ法により、市販のＤＮ
Ａ合成機を使用してオリゴヌクレオチドを作製し、所定
の精製法で精製してから、ＰＣＲによる特定部位の増幅
工程に用いることができる。これらのプライマーを使用
したＰＣＲにより、キナーゼドメインの約２１０ｂｐを
増幅することができる。このＰＣＲ産物を電気泳動によ
り分離し、ゲルより切り出してＤＮＡ断片を回収する。
回収したＤＮＡ断片をプローブとして使用し、ｃＤＮＡ
ライブラリーの検索に用いる。

【００１１】プローブとして使用するＤＮＡ断片をアイ
ソトープで標識化することにより、高感度なスクリーニ
ングが可能になる。アイソトープ標識化としては、例え
ば、［³²Ｐ］γ-ATPとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを
用いて末端ラベルする方法や、他のニックトランスレー
ション法又はプライマー伸長法等による標識化でもよ
い。アイソトープを用いない発色法を利用した非アイソ
トープ標識化の方法は感度が若干低下するが使用可能で
ある。

【００１２】本発明のマウスＴＩＥ−２受容体のｃＤＮ
Ａクローニングに必要なｃＤＮＡの作製、ノーザンブロ
ットによる発現の検討、ハイブリダイゼイションによる
スクリーニング、組換えＤＮＡの作製、ＤＮＡの塩基配
列決定等の一連の分子生物学的な実験は、例えば前述の
Maniatis, T. 等の編集した実験書に示してある公知の
方法に従って行なうことができる。

【００１３】本発明者等が解明したマウスＴＩＥ−２受
容体のｃＤＮＡ塩基配列を、配列表の配列番号３に、Ｄ
ＮＡの２本鎖のうちコード鎖（ＲＮＡ-like ）で示し
た。配列表の配列番号３に示した塩基配列は、最初
（５’側）の１５１ｂｐの５’−非翻訳領域、それに続
く３３７２ｂｐのマウスＴＩＥ−２受容体コード領域、
及び更にそれに続く２３７ｂｐの３’−非翻訳領域から
なる。

【００１４】本発明のマウスＴＩＥ−２受容体ｃＤＮＡ
にコードされるマウスＴＩＥ−２受容体のアミノ酸配列
を、配列表の配列番号２に、アミノ酸の３文字表記によ
って示した。配列表の配列番号２に示したアミノ酸配列
（ペプチド）は、推定されるシグナルペプチド（−２０
番目のＭｅｔから−１番目のＶａｌまでの２０アミノ
酸）及び推定される成熟マウスＴＩＥ−２受容体（１番
目のＧｌｕから１１０３番目のＡｌａまで）からなる。
また、推定されるトランスメンブレン部位は、７２５番
目のＭｅｔから７５１番目のＬｅｕまでである。

【００１５】配列表の配列番号１に示す成熟体ポリペプ
チド（マウスＴＩＥ−２受容体）を、既に同定されてい
るヒトＴＩＥ受容体ｃＤＮＡと比較すると、アミノ酸レ
ベルでのホモロジーは４６％である。しかしながら、配
列表の配列番号１に示すポリペプチドには、細胞外イム
ノグロブリン様ドメイン、ＥＧＦホモロジードメイン、
フィブロネクチンタイプIII リピートドメイン、トラン
スメンブレンドメイン及びチロシンキナーゼドメインが
認められる。これらの各ドメインは、それぞれ前記のヒ
トＴＩＥ受容体でそれらの存在が報告されており、従っ
て、配列表の配列番号１に示す本発明によるポリペプチ
ド（マウスＴＩＥ−２受容体）は、ヒトＴＩＥ受容体と
類似の機能を有するものと考えられる。

【００１６】本発明のマウスＴＩＥ−２受容体のアミノ
酸配列（配列表の配列番号２のアミノ酸配列）と、既に
報告されているマウスｈｙｋ受容体（Horita et al, B.
B.R.C. 189:1747-1753, 1992）のアミノ酸配列とを比較
すると、前者が全体で２残基短いこと、また５カ所で３
９アミノ酸に差異が認められるので、両者はそれぞれ別
異のペプチドである。また、マウスｔｅｋチロシンキナ
ーゼ遺伝子（Dumont et al, Oncogene 7: 1471-1480, 1
992 ）のアミノ酸配列と比較すると、本発明のマウスＴ
ＩＥ−２受容体のアミノ酸配列はｔｅｋチロシンキナー
ゼのアミノ酸配列を完全に含み、更に細胞外ドメインを
含んでおり、両者はそれぞれ別異のペプチドである。即
ち、本発明のマウスＴＩＥ−２受容体は、マウスｈｙｋ
受容体及びマウスｔｅｋチロシンキナーゼとは異なる新
規ポリペプチドである。

【００１７】本発明でいう成熟マウスＴＩＥ−２受容体
とは、配列表の配列番号２で示すアミノ酸配列からなる
前駆体マウスＴＩＥ−２受容体からシグナルペプチドを
除去して得られる、配列表の配列番号１で示すアミノ酸
配列からなるポリペプチドである。本発明では、既に報
告されているマウスｈｙｋ受容体で推定されたシグナル
ペプチドのアミノ酸配列（前出のHorita et al, B.B.R.
C. 189:1747-1753, 1992）と、本発明のマウスＴＩＥ−
２受容体のＮ末端付近のアミノ酸配列とを比較し、マウ
スＴＩＥ−２受容体のシグナルペプチドを−２０番目の
Ｍｅｔから−１番目のＶａｌまでと推定した。

【００１８】配列表の配列番号１又は配列番号２で示す
アミノ酸配列からなる本発明のマウスＴＩＥ−２受容体
には、マウスＴＩＥ−２受容体としての機能を損なうこ
とがない限り、前記のアミノ酸配列において１個又は複
数個のアミノ酸の欠除、付加あるいは置換等の変異が認
められる変異ポリペプチド、即ち、自然界に発見される
変異ポリペプチドまたは人為的に改変した変異ポリペプ
チドが含まれる。また、前記のポリペプチドをコードす
る本発明によるＤＮＡには、目的のマウスＴＩＥ−２受
容体をコードするｃＤＮＡ、イントロン及びエクソンを
含む染色体ＤＮＡ、同染色体のイントロンを除去し、エ
クソンを連結したＤＮＡ、更には合成ＤＮＡ法で人為的
に作製したオリゴヌクレオチドを連結して得たＤＮＡが
含まれる。

【００１９】合成ＤＮＡ法で人為的にオリゴヌクレオチ
ドを作製し、それらを連結して合成ＤＮＡを調製する方
法によれば、遺伝子コードの縮重により、アミノ酸配列
を変化させることなく遺伝子の塩基配列を変化させるこ
とによって目的の組換えＤＮＡを調製することができ
る。本発明のＤＮＡは、目的のポリペプチドをコードす
る遺伝子の、遺伝子コードの縮重に基づく全ての塩基配
列を包含する。

【００２０】変異ポリペプチドをコードする組換えＤＮ
Ａ、例えば染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡは、自然界で生じ
る種内変異又はアレル変異に基づくアミノ酸レベルの変
異のある変異マウスＴＩＥ−２受容体をコードする染色
体ＤＮＡ又はｃＤＮＡとして、及び人為的に作製可能な
ポイントミューテーション法をほどこした変異のある変
異マウスＴＩＥ−２受容体をコードする染色体ＤＮＡ又
はｃＤＮＡ、また合成ＤＮＡ法で作製した変異マウスＴ
ＩＥ−２受容体をコードする組換えＤＮＡとして得られ
る。

【００２１】アミノ酸レベルでは変異がなくても、自然
界より分離した染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡにおいては、
遺伝子コードの縮重により、アミノ酸配列を変化させる
ことなしにＤＮＡ塩基配列が変異した例はしばしば認め
られ、また５’−非翻訳領域及び３’−非翻訳領域はポ
リペプチドのアミノ酸配列の規定に関与しないので、そ
れらの領域のＤＮＡ塩基配列は変異しやすい。従って、
これらの塩基配列の変異は本発明に包含される。

【００２２】ヒトＴＩＥ受容体ｃＤＮＡには、オルター
ナティブスプライシングに起因すると考えられる、３つ
存在するＥＧＦホモロジードメインの内の１つに欠損を
生じたアイソマーの存在が報告されている（Partanen e
t al. Mol. Cell. Biol., 12, 1698-1707, 1992 ）。本
発明のマウスＴＩＥ−２受容体のｃＤＮＡはＥＧＦホモ
ロジードメインを３つ持っており、完全長に相当するポ
リペプチドをコードするものであるが、ヒトＴＩＥ受容
体と同様に、ＥＧＦホモロジードメインに欠損を持つア
イソマーが存在するものと予想され、このアイソマー及
びそのアイソマーをコードするＤＮＡも本発明に含まれ
る。

【００２３】常法により、本発明のＤＮＡ塩基配列を適
当な発現ベクターに挿入し、微生物又は細胞（例えば、
昆虫細胞又は動物培養細胞）等を宿主とする形質転換体
を得、その形質転換体にマウスＴＩＥ−２受容体活性を
示すポリペプチドを産生させることができる。大腸菌、
枯草菌又は酵母等の微生物の菌体内で成熟マウスＴＩＥ
−２受容体を産生させる場合には、シグナルペプチドを
除去した成熟マウスＴＩＥ−２受容体のＮ末端にＭｅｔ
を付加させたポリペプチド（Ｍｅｔ−マウスＴＩＥ−２
受容体）として発現させると良い。Ｍｅｔは発現後に細
胞内又は細胞外で除去することができる場合もある。完
全なマウスＴＩＥ−２受容体を産生することを目的とす
る場合には、シグナルペプチドを含む全長の配列を使用
し、有核生物、特に動物培養細胞を宿主として発現させ
るのが好ましい。得られたマウスＴＩＥ−２受容体を発
現する形質転換細胞は、リガンドを含む、マウスＴＩＥ
−２受容体に対するアゴニスト又はアンタゴニストのス
クリーニング研究又はドラッグデザイン研究に使用する
ことができる。また、細胞内ドメインを除去するか、又
は細胞内ドメインとトランスメンブレン部位とを除去し
て調製した可溶型マウスＴＩＥ−２受容体は、アンタゴ
ニストとして作用し、造血抑制剤や或る種の抗ガン剤と
して有用である。

【００２４】宿主として使用する動物培養細胞として
は、容易に入手することができるマウスＬ、マウス３Ｔ
３、マウスＣ１２７、マウスミエローマ、ＣＨＯ、ＣＨ
Ｌ、HeLa、ＣＯＳ又はヒトミエローマ細胞等を挙げるこ
とができ、昆虫細胞としては、ヨトウガ由来のＳｆ９細
胞等を挙げることができる。発現ベクターとしては、各
々の宿主用に開発された公知のベクターを使用すること
ができる。例えば、ＣＯＳ細胞を宿主とする場合にはｐ
ｃＤＬ系のベクターやｐＣＤＭ８ベクターなどを使用す
ることができ、また、ＣＨＯ細胞を宿主とする場合には
ｐＳＶ２ｄｈｆｒ、ｐＭＴＶｄｈｆｒ、又はｐＭＤＳＧ
などのベクターを使用することができる。更に、ヨトウ
ガ由来のＳｆ９細胞を宿主とする場合にはバキュロウイ
ルスベクターを使用することができる。

【００２５】以下実施例によって本発明を更に具体的に
説明するが、これは本発明を限定するものではない。実施例 （１）全ＲＮＡの抽出 ８〜１５週令のＣ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨から、３
％ウシ胎児血清（以下ＦＣＳ）を含むリン酸緩衝液（以
下ＰＢＳ）でフラッシュして骨髄を採取し、メッシュを
通して、単細胞浮遊液を調製した。その後、塩化アンモ
ニウム液で赤血球を破壊した。ＡＣＫ−２（ c -ｋｉｔ
抗体）−ＡＰＣ〔熊本大学西川伸一教授より供与〕、Ｓ
ｃａ−１（Ｌｙ−６Ａ／Ｅ抗体：ＢＲＬ社）−ＦＩＴ
Ｃ、ビオチン化した分化抗原Ｌｉｎ：Ｂ２２０（Ｂ細胞
抗体：Pharmingen社）、ＣＤ４、ＣＤ８（Ｔ細胞抗体：
ＢＲＬ社）、Ｇｒ−１（顆粒球抗体：生化学工業社）、
Ｍａｃ−１（マクロファージ抗体：ＢＭＡ社）、ＴＥＲ
１１９（赤芽球抗体）を加えて、氷上で２０分間放置
し、２回洗浄した後、ＰＥ−ストレプトアビジンを加
え、更に２０分間放置した。細胞を２回洗浄した後、ヨ
ウ化プロピジウム（１μｇ／ml）を含む３％ＦＣＳを含
有するＰＢＳに再浮遊させた。染色された細胞をフロー
サイトメーター（ＦＡＣ Starplus：Becton Dickinson
社製）で分析し、ＡＣＫ−２陽性及びＳｃａ−１陽性で
あってＬｉｎ陰性の細胞を分離して採集し、高度に純化
されたマウス造血幹細胞とし、その中の10,000個の細胞
より小規模酸グアニジウムチオシアネートフェノールク
ロロホルム法（small-scaled acid guanidium thiocyan
ate phenol-chloroform ：Belyavsky, et al, 1989. Nu
cl. Acid Res. 17; 2919-2932 ）により、全ＲＮＡを抽
出した。

【００２６】（２）ｃＤＮＡ合成 得られた全ＲＮＡをすべて使用してｃＤＮＡ合成を行っ
た。即ち、前述の全ＲＮＡを脱イオン水１２．３μｌに
溶解し、１０×緩衝液（500mM KCl,100mM Tris-HCl pH
8.3, 15mM MgCl₂, 0.01% ゼラチン）２μｌ、ｄＮＴＰ
（2.5 mM）４μｌ、オリゴｄＴプライマー（１８mer ）
100 pmol、アビアンミエロブラストシスウイルス逆転写
酵素（avian myeloblastosis virus reverse transcrip
tase：LifeScience社：３２Ｕ／μｌ）0.2 μｌ、及びR
Nase インヒビター（ Boehringer：４０Ｕ／μｌ）０．
５μｌを加えて３７℃で７５分間放置してから、６５℃
で１０分間放置した。

【００２７】（３）ＰＣＲによる特定ＤＮＡ断片の増幅 次に、前出の Wilksらの方法（Wilks, 1989. Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 86: 1603-1607 ）に従い、チロシン
キナーゼドメインのサブドメインVIとIXのアミノ酸に対
応し、かつ制限酵素の認識部位を連結した混合プライマ
ー、すなわちＰＴＫ Ｉ（２０mer ：Sal I 部位を付
加）及びＰＴＫ II（２５mer ：Eco RI部位を付加）を
合成した。ＰＴＫ Ｉの塩基配列は 5'-ATA CCG ATC CA
C (A/C)GNGA(T/C) (T/C)T-3' 、ＰＴＫ IIの塩基配列
は 5'-CAG GAA TTC CA(A/T) AGG ACC A(G/C)A C(G/A)T
C-3'であった。合成オリゴヌクレオチドは固相法を原理
とする全自動ＤＮＡ合成機を使用して作製した。全自動
ＤＮＡ合成機としてはアプライドバイオシステム社 391
PCR-Mate 型を使用した。ヌクレオチド、３’−ヌクレ
オチドを固定した担体、溶液、及び試薬は同社の指示に
従って使用した。所定のカップリング反応を終了し、ト
リクロル酢酸で５’−末端の保護基を除去したオリゴヌ
クレオチド担体を濃アンモニア中にて室温で１時間放置
することにより担体からオリゴヌクレオチドを遊離させ
た。次に、核酸上及びリン酸上の保護基を遊離させるた
め、核酸を含む反応液を、封をしたバイアル中で濃アン
モニア溶液で５５℃にて１４〜２４時間インキュベート
した。担体及び保護基を遊離した各々のオリゴヌクレオ
チドの精製をアプライドバイオシステム社のＯＰＣカー
トリッジを使用して行い、２％トリフルオロ酢酸で脱ト
リチル化した。精製の終了したＰＴＫ Ｉプライマー及
びＰＴＫ II プライマーをそれぞれ１μｇずつ用いてＰ
ＣＲによるｃＤＮＡの増幅を行った。

【００２８】ＰＣＲによる増幅は、以下のとおりに実施
した。即ち、得られたｃＤＮＡのうち 10 μl を使用
し、１０×緩衝液（500mM KCl, 100mM Tris-HCl pH8.3,
15 mMMgCl₂, 0.01％ゼラチン）５μｌ、dNTP（2.5 m
M）４μｌ、及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTa
q：５Ｕ／μｌ）０．２μｌを加え、最後に脱イオン滅
菌水を加えて全量を５０μｌとし、９４℃で１分間、３
７℃で２分間、及び７２℃で３分間からなる工程を１サ
イクルとして、この工程を４０サイクル行った。ＰＣＲ
産物の一部を２％アガロースゲルで分離し、約210 bpの
ｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。

【００２９】（４）２１０ｂｐ−ｃＤＮＡのクローニン
グ 前記のＰＣＲ工程で約210 bpのｃＤＮＡが増幅されてい
ることを確認した後、ＤＮＡ量を１．８ｎｇ／μｌと目
算した後に、ＰＣＲ反応液をそのまま pCR^TM1000ベクタ
ー（TA cloning kit：インヴィトロジェン社）にサブク
ローニングし、大腸菌ＤＨ５αに感染させ、生じたコロ
ニーのうちｃＤＮＡが組み込まれているものを５０クロ
ーン選択し、各ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。５０ク
ローン中の２クローンに新規の遺伝子が含まれ、１つは
セリン・スレオニンキナーゼに属するものと考えられ、
残り１つは受容体型チロシンキナーゼと考えられた。後
者はヒト受容体型チロシンキナーゼＴＩＥと相同性が高
いので、これをＴＩＥ−２と命名し、以下の工程で実施
するｃＤＮＡの全長クローニングにおいてプローブとし
て用いた。なお、この工程でクローニングされた約210
bpのｃＤＮＡは、配列表の配列番号３の塩基配列におい
て、３０２９番目〜３２２１番目の塩基配列に相当す
る。

【００３０】（５）全長マウスＴＩＥ−２遺伝子のクロ
ーニング 全長マウスＴＩＥ−２遺伝子のクローニングに際して
は、マウスＩＬ−３依存性白血病細胞株ＤＡ−１をｃＤ
ＮＡライブラリー源とし、上記ＴＩＥ−２遺伝子断片を
³²Ｐで標識してプローブとして用いた。プローブの調製
は以下のとおり実施した。即ち、上記（４）で得られた
ＴＩＥ−２遺伝子断片をSal I とEco RIとで消化してベ
クターより切り出し、低融点アガロースゲルから、ＤＮ
Ａ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片をＤＮＡラベル
化キット（Megaprime ＤＮＡ labeling system：Amersh
am社）を用いて、標識した。ＤＮＡ２５ｎｇにプライマ
ー液５μｌ及び脱イオン滅菌水を加えて全量を３３μｌ
としてボイルした。その後、反応緩衝液１０μｌ、α−
³²Ｐ−dCTP５μｌ、及びクレノー断片２μｌを加えて３
７℃で５分間インキュベートした後、セファデックスカ
ラム（Quick Spin Column Sephadex G-50 ：Boehringer
社）で精製し、5 分間ボイルしてから氷冷した。

【００３１】ｃＤＮＡライブラリーは以下のとおりに作
製した。即ち、酸グアニジニウムチオシアネートフェノ
ールクロロホルム法によりＤＡ−１細胞からＲＮＡを抽
出し、オリゴｄＴ付加ラテックス（Oligotex- dT30：宝
酒造）を用いてpoly（Ａ）RNA を純化した。ｃＤＮＡ合
成システム（ZAP −ｃＤＮＡ synthesiskit ：Stratage
ne社）に従い、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、大腸菌
XL1 - Blueのプレート上にプラークを出現させて、２×
１０⁵ 相当のプラークを以下に示したプラークハイブリ
ダイゼーション法により、候補組換えファージのスクリ
ーニングを行った。出現したプラークをナイロンフィル
ター（Hybond N⁺ ：Amersham社）に転写し、転写したナ
イロンフィルターをアルカリ処理（1.5M NaCl, 0.5M Na
OH溶液中で７分間振とう）し、中和（1.5M NaCl, 0.5M
Tris-HCl,pH 7.2, 1mM EDTA 溶液中で３分間２回振と
う）し、２×ＳＳＰＥ（0.36M NaCl, 0.02M リン酸ナト
リウム, pH 7.7, 2mM EDTA）で５分間洗浄し、風乾し
た。その後、0.4M NaOH 中で２０分間振とうし、５×Ｓ
ＳＰＥで５分間洗浄し、再度風乾した。フィルターを、
プレハイブリダイゼーション液（5 x SSPE，5 x Denhar
dt's reagent, 0.5%SDS,10mg/ml denatured salmon spe
rm ＤＮＡ）中で６５℃にて２時間インキュベートし、
プレハイブリダイゼーションを行った。プレハイブリダ
イゼーションが終了したフィルターに、³²Ｐ標識プロー
ブを含むプレハイブリダイゼーション液と同一組成の液
６０mlを加え、６５℃にて１６時間インキュベートし、
ハイブリダイゼーションを行った。

【００３２】次に、フィルターを、１×ＳＳＰＥ／0.1
％ＳＤＳ溶液で、６５℃にて１５分間２回洗浄し、更に
0.1 ×ＳＳＰＥ／0.1 ％ＳＤＳ溶液で、６５℃にて１５
分間２回洗浄した。洗浄の終了したフィルターを増感ス
クリーンを使用し、Ｘ線フィルムに露光した。オートラ
ジオグラフィーの結果、２つ陽性クローンを得た。両者
をそれぞれ EcoRIと Xho I消化により切り出し、Bluesc
riptベクターにサブクローニングした。c ＤＮＡの長さ
は 4.4 kb と 2.5 kb であり、キナーゼドメインの塩基
配列の検討より、共にＴＩＥ−２であることが確認され
た。

【００３３】（６）ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーショ
ン ノーザンブロット法により、発現の検討を行った。マウ
ス由来の細胞株ＤＡ−１、細胞株ＭＥＬ、及び細胞株Ｐ
Ａ−６より、poly (A)⁺ ＲＮＡを調製し、1.2％アガロ
ースゲルに２μｇ／レーンとなるようにのせて２０mMＭ
ＯＰＳ、１mMＥＤＴＡ、５mM酢酸ナトリウム、2.2 M ホ
ルムアルデヒド中で電気泳動した。泳動終了後、２０×
ＳＳＣを使用してキャピラリーブロティングを行い、ナ
イロンメンブレン（Zeta-probeメンブレン：Bio-Rad
社）に転写した。転写後のメンブレンを用いてハイブリ
ダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション液
は、５０％ホルムアミド、0.25M リン酸ナトリウム pH
7.2 、0.25M NaCl、7%(W/V)SDS、1 mM EDTA とした。プ
レハイブリダイゼーションは４３℃にて２時間、ハイブ
リダイゼーションは４３℃にて１６時間行った。また、
メンブレンの洗浄は、２×ＳＳＣ／0.1 ％ＳＤＳ、
０．５×ＳＳＣ／0.1 ％ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣ／0.
1 ％ＳＤＳの各溶液を、前記の〜の順に使用し、そ
れぞれ室温で１５分間ずつ行った。

【００３４】プローブは２．５ｋｂの長さのｃＤＮＡを
Eco RIとXho I とで消化してベクターより切り出し、目
的のｃＤＮＡ断片を低融点アガロースゲルより回収し、
ＤＮＡラベル化キット（Megaprime ＤＮＡlabelling sy
stem：Amersham社）により、ランダムプライマーでα−
³²ＰdCTPで標識したものを使用した。ＤＮＡ２５ngに対
し、プライマー液５μｌと脱イオン滅菌水を加えて全量
を３３μｌとしてボイルした。その後、反応緩衝液１０
μｌ、α−³²ＰdCTP５μｌ、クレノー断片２μｌを加え
て３７℃で５分間インキュベートし、続いて、セファデ
ックスカラム（Quick Spin Column Sephadex G - 50 ：
Boehringer社）で精製し、5 分間ボイルしてから氷冷
し、ハイブリダイゼーション液に加えた。その結果、前
述の３種の細胞株では、すべてに４．６kbのバンドを検
出した。中でも、細胞株ＤＡ−１に最も強く発現が認め
られた。最終的に４．４kbのｃＤＮＡについて、合成プ
ライマーを使用してダイデオキシ法でウオークしながら
塩基配列を調べ、全塩基配列を決定した。その結果を配
列表の配列番号３の塩基配列に示す。

【００３５】（７）塩基配列の解析 決定した塩基配列によりコードされるアミノ酸配列に
は、ヒトＴＩＥ受容体で報告されている細胞外イムノグ
ロブリン様ドメイン（２４番目のＣｙｓから８２番目の
Ｃｙｓ：及び３５０番目のＣｙｓから４０４番目のＣｙ
ｓ）、ＥＧＦホモロジードメイン（１９０番目のＡｒｇ
から２３３番目のＬｙｓ：２３４番目のＡｌａから２８
０番目のＧｌｕ：及び２８１番目のＡｌａから３０４番
目のＬｙｓ）、フィブロネクチンタイプIII リピートド
メイン、トランスメンブレンドメイン（７２５番目のＭ
ｅｔから７５１番目のＬｅｕ）、及びチロシンキナーゼ
ドメイン（８０１番目のＡｓｎから９０１番目のＴｈ
ｒ：及び９１６番目のＳｅｒから１０７１番目のＬｅ
ｕ）が存在することが認められる。

【００３６】

【発明の効果】本発明のマウスＴＩＥ−２受容体ｃＤＮ
Ａは、マウスＤＡ−１細胞に発現が認められたことによ
り造血にも関与することが示唆される。従って、マウス
ＴＩＥ−２受容体をコードする組換えＤＮＡ又はｃＤＮ
Ａ塩基配列を使用し、遺伝子組換え技術により受容体を
作製することや、造血機構の解明のために、マウスを実
験のモデル系として使用することが可能となる。更に、
マウスＴＩＥ−２受容体を用いて造血などに関与する因
子のスクリーニング系を構築すること、及びリガンドを
含めた、マウスＴＩＥ−２受容体に対するアゴニスト若
しくはアンタゴニストの研究又はドラッグデザイン研究
も可能となる。

【００３７】

【配列表】

【００３８】配列番号：１ 配列の長さ：１１０３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：マウス 株名：ＤＡ−１細胞 配列 Glu Gly Ala Met Asp Leu Ile Leu Ile Asn Ser Leu Pro Leu Val Ser 1 5 10 15 Asp Ala Glu Thr Ser Leu Thr Cys Ile Ala Ser Gly Trp His Pro His 20 25 30 Glu Pro Ile Thr Ile Gly Arg Asp Phe Glu Ala Leu Met Asn Gln His 35 40 45 Gln Asp Pro Leu Glu Val Thr Gln Asp Val Thr Arg Glu Trp Ala Lys 50 55 60 Lys Val Val Trp Lys Arg Glu Lys Ala Ser Lys Ile Asn Gly Ala Tyr 65 70 75 80 Phe Cys Glu Gly Arg Val Arg Gly Gln Ala Ile Arg Ile Arg Thr Met 85 90 95 Lys Met Arg Gln Gln Ala Ser Phe Leu Pro Ala Thr Leu Thr Met Thr 100 105 110 Val Asp Arg Gly Asp Asn Val Asn Ile Ser Phe Lys Lys Val Leu Ile 115 120 125 Lys Glu Glu Asp Ala Val Ile Tyr Lys Asn Gly Ser Phe Ile His Ser 130 135 140 Val Pro Arg His Glu Val Pro Asp Ile Leu Glu Val His Leu Pro His 145 150 155 160 Ala Gln Pro Gln Asp Ala Gly Val Tyr Ser Ala Arg Tyr Ile Gly Gly 165 170 175 Asn Leu Phe Thr Ser Ala Phe Thr Arg Leu Ile Val Arg Arg Cys Glu 180 185 190 Ala Gln Lys Trp Gly Pro Asp Cys Ser Arg Pro Cys Thr Thr Cys Lys 195 200 205 Asn Asn Gly Val Cys His Glu Asp Thr Gly Glu Cys Ile Cys Pro Pro 210 215 220 Gly Phe Met Gly Arg Thr Cys Glu Lys Ala Cys Glu Pro His Thr Phe 225 230 235 240 Gly Arg Thr Cys Lys Glu Arg Cys Ser Gly Pro Glu Gly Cys Lys Ser 245 250 255 Tyr Val Phe Cys Leu Pro Asp Pro Tyr Gly Cys Ser Cys Ala Thr Gly 260 265 270 Trp Arg Gly Leu Gln Cys Asn Glu Ala Cys Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly 275 280 285 Pro Asp Cys Lys Leu Arg Cys His Cys Thr Asn Glu Glu Ile Cys Asp 290 295 300 Arg Phe Gln Gly Cys Leu Cys Ser Gln Gly Trp Gln Gly Leu Gln Cys 305 310 315 320 Glu Lys Glu Gly Arg Pro Arg Met Thr Pro Gln Ile Glu Asp Leu Pro 325 330 335 Asp His Ile Glu Val Asn Ser Gly Lys Phe Asn Pro Ile Cys Lys Ala 340 345 350 Ser Gly Trp Pro Leu Pro Thr Ser Glu Glu Met Thr Leu Val Lys Pro 355 360 365 Asp Gly Thr Val Leu Gln Pro Asn Asp Phe Asn Tyr Thr Asp Arg Phe 370 375 380 Ser Val Ala Ile Phe Thr Val Asn Arg Val Leu Pro Pro Asp Ser Gly 385 390 395 400 Val Trp Val Cys Ser Val Asn Thr Val Ala Gly Met Val Glu Lys Pro 405 410 415 Phe Asn Ile Ser Val Lys Val Leu Pro Glu Pro Leu His Ala Pro Asn 420 425 430 Val Ile Asp Thr Gly His Asn Phe Ala Ile Ile Asn Ile Ser Ser Glu 435 440 445 Pro Tyr Phe Gly Asp Gly Pro Ile Lys Ser Lys Lys Leu Phe Tyr Lys 450 455 460 Pro Val Asn Gln Ala Trp Lys Tyr Ile Glu Val Thr Asn Glu Ile Phe 465 470 475 480 Thr Leu Asn Tyr Leu Glu Pro Arg Thr Asp Tyr Glu Leu Cys Val Gln 485 490 495 Leu Ala Arg Pro Gly Glu Gly Gly Glu Gly His Pro Gly Pro Val Arg 500 505 510 Arg Phe Thr Thr Ala Ser Ile Gly Leu Pro Pro Pro Arg Gly Leu Ser 515 520 525 Leu Leu Pro Lys Ser Gln Thr Ala Leu Asn Leu Thr Trp Gln Pro Ile 530 535 540 Phe Thr Asn Ser Glu Asp Glu Phe Tyr Val Glu Val Glu Arg Arg Ser 545 550 555 560 Leu Gln Thr Thr Ser Asp Gln Gln Asn Ile Lys Val Pro Gly Asn Leu 565 570 575 Thr Ser Val Leu Leu Ser Asn Leu Val Pro Arg Glu Gln Tyr Thr Val 580 585 590 Arg Ala Arg Val Asn Thr Lys Ala Gln Gly Glu Trp Ser Glu Glu Leu 595 600 605 Arg Ala Trp Thr Leu Ser Asp Ile Leu Pro Pro Gln Pro Glu Asn Ile 610 615 620 Lys Ile Ser Asn Ile Thr Asp Ser Thr Ala Met Val Ser Trp Thr Ile 625 630 635 640 Val Asp Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Ile Ile Ile Arg Tyr Lys Val Gln 645 650 655 Gly Lys Asn Glu Asp Gln His Ile Asp Val Lys Ile Lys Asn Ala Thr 660 665 670 Val Thr Gln Tyr Gln Leu Lys Gly Leu Glu Pro Glu Thr Thr Tyr His 675 680 685 Val Asp Ile Phe Ala Glu Asn Asn Ile Gly Ser Ser Asn Pro Ala Phe 690 695 700 Ser His Glu Leu Arg Thr Leu Pro His Ser Pro Ala Ser Ala Asp Leu 705 710 715 720 Gly Gly Gly Lys Met Leu Leu Ile Ala Ile Leu Gly Ser Ala Gly Met 725 730 735 Thr Cys Ile Thr Val Leu Leu Ala Phe Leu Ile Met Leu Gln Leu Lys 740 745 750 Arg Ala Asn Val Gln Arg Arg Met Ala Gln Ala Phe Gln Asn Val Arg 755 760 765 Glu Glu Pro Ala Val Gln Phe Asn Ser Gly Thr Leu Ala Leu Asn Arg 770 775 780 Lys Ala Lys Asn Asn Pro Asp Pro Thr Ile Tyr Pro Val Leu Asp Trp 785 790 795 800 Asn Asp Ile Lys Phe Gln Asp Val Ile Gly Glu Gly Asn Phe Gly Gln 805 810 815 Val Leu Lys Ala Arg Ile Lys Lys Asp Gly Leu Arg Met Asp Ala Ala 820 825 830 Ile Lys Arg Met Lys Glu Tyr Ala Ser Lys Asp Asp His Arg Asp Phe 835 840 845 Ala Gly Glu Leu Glu Val Leu Cys Lys Leu Gly His His Pro Asn Ile 850 855 860 Ile Asn Leu Leu Gly Ala Cys Glu His Arg Gly Tyr Leu Tyr Leu Ala 865 870 875 880 Ile Glu Tyr Ala Pro His Gly Asn Leu Leu Asp Phe Leu Arg Lys Ser 885 890 895 Arg Val Leu Glu Thr Asp Pro Ala Phe Ala Ile Ala Asn Ser Thr Ala 900 905 910 Ser Thr Leu Ser Ser Gln Gln Leu Leu His Phe Ala Ala Asp Val Ala 915 920 925 Arg Gly Met Asp Tyr Leu Ser Gln Lys Gln Phe Ile His Arg Asp Leu 930 935 940 Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Gly Glu Asn Tyr Ile Ala Lys Ile Ala 945 950 955 960 Asp Phe Gly Leu Ser Arg Gly Gln Glu Val Tyr Val Lys Lys Thr Met 965 970 975 Gly Arg Leu Pro Val Arg Trp Met Ala Ile Glu Ser Leu Asn Tyr Ser 980 985 990 Val Tyr Thr Thr Asn Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Leu Leu Trp 995 1000 1005 Glu Ile Val Ser Leu Gly Gly Thr Pro Tyr Cys Gly Met Thr Cys Ala 1010 1015 1020 Glu Leu Tyr Glu Lys Leu Pro Gln Gly Tyr Arg Leu Glu Lys Pro Leu 1025 1030 1035 1040 Asn Cys Asp Asp Glu Val Tyr Asp Leu Met Arg Gln Cys Trp Arg Glu 1045 1050 1055 Lys Pro Tyr Glu Arg Pro Ser Phe Ala Gln Ile Leu Val Ser Leu Asn 1060 1065 1070 Arg Met Leu Glu Glu Arg Lys Thr Tyr Val Asn Thr Thr Leu Tyr Glu 1075 1080 1085 Lys Phe Thr Tyr Ala Gly Ile Asp Cys Ser Ala Glu Glu Ala Ala 1090 1095 1100

【００３９】配列番号：２ 配列の長さ：１１２３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：マウス 株名：ＤＡ−１細胞 配列 Met Asp Ser Leu Ala Gly Leu Val Leu Cys Gly Val Ser Leu Leu Leu -20 -15 -10 -5 Tyr Gly Val Val Glu Gly Ala Met Asp Leu Ile Leu Ile Asn Ser Leu -1 1 5 10 Pro Leu Val Ser Asp Ala Glu Thr Ser Leu Thr Cys Ile Ala Ser Gly 15 20 25 Trp His Pro His Glu Pro Ile Thr Ile Gly Arg Asp Phe Glu Ala Leu 30 35 40 Met Asn Gln His Gln Asp Pro Leu Glu Val Thr Gln Asp Val Thr Arg 45 50 55 60 Glu Trp Ala Lys Lys Val Val Trp Lys Arg Glu Lys Ala Ser Lys Ile 65 70 75 Asn Gly Ala Tyr Phe Cys Glu Gly Arg Val Arg Gly Gln Ala Ile Arg 80 85 90 Ile Arg Thr Met Lys Met Arg Gln Gln Ala Ser Phe Leu Pro Ala Thr 95 100 105 Leu Thr Met Thr Val Asp Arg Gly Asp Asn Val Asn Ile Ser Phe Lys 110 115 120 Lys Val Leu Ile Lys Glu Glu Asp Ala Val Ile Tyr Lys Asn Gly Ser 125 130 135 140 Phe Ile His Ser Val Pro Arg His Glu Val Pro Asp Ile Leu Glu Val 145 150 155 His Leu Pro His Ala Gln Pro Gln Asp Ala Gly Val Tyr Ser Ala Arg 160 165 170 Tyr Ile Gly Gly Asn Leu Phe Thr Ser Ala Phe Thr Arg Leu Ile Val 175 180 185 Arg Arg Cys Glu Ala Gln Lys Trp Gly Pro Asp Cys Ser Arg Pro Cys 190 195 200 Thr Thr Cys Lys Asn Asn Gly Val Cys His Glu Asp Thr Gly Glu Cys 205 210 215 220 Ile Cys Pro Pro Gly Phe Met Gly Arg Thr Cys Glu Lys Ala Cys Glu 225 230 235 Pro His Thr Phe Gly Arg Thr Cys Lys Glu Arg Cys Ser Gly Pro Glu 240 245 250 Gly Cys Lys Ser Tyr Val Phe Cys Leu Pro Asp Pro Tyr Gly Cys Ser 255 260 265 Cys Ala Thr Gly Trp Arg Gly Leu Gln Cys Asn Glu Ala Cys Pro Ser 270 275 280 Gly Tyr Tyr Gly Pro Asp Cys Lys Leu Arg Cys His Cys Thr Asn Glu 285 290 295 300 Glu Ile Cys Asp Arg Phe Gln Gly Cys Leu Cys Ser Gln Gly Trp Gln 305 310 315 Gly Leu Gln Cys Glu Lys Glu Gly Arg Pro Arg Met Thr Pro Gln Ile 320 325 330 Glu Asp Leu Pro Asp His Ile Glu Val Asn Ser Gly Lys Phe Asn Pro 335 340 345 Ile Cys Lys Ala Ser Gly Trp Pro Leu Pro Thr Ser Glu Glu Met Thr 350 355 360 Leu Val Lys Pro Asp Gly Thr Val Leu Gln Pro Asn Asp Phe Asn Tyr 365 370 375 380 Thr Asp Arg Phe Ser Val Ala Ile Phe Thr Val Asn Arg Val Leu Pro 385 390 395 Pro Asp Ser Gly Val Trp Val Cys Ser Val Asn Thr Val Ala Gly Met 400 405 410 Val Glu Lys Pro Phe Asn Ile Ser Val Lys Val Leu Pro Glu Pro Leu 415 420 425 His Ala Pro Asn Val Ile Asp Thr Gly His Asn Phe Ala Ile Ile Asn 430 435 440 Ile Ser Ser Glu Pro Tyr Phe Gly Asp Gly Pro Ile Lys Ser Lys Lys 445 450 455 460 Leu Phe Tyr Lys Pro Val Asn Gln Ala Trp Lys Tyr Ile Glu Val Thr 465 470 475 Asn Glu Ile Phe Thr Leu Asn Tyr Leu Glu Pro Arg Thr Asp Tyr Glu 480 485 490 Leu Cys Val Gln Leu Ala Arg Pro Gly Glu Gly Gly Glu Gly His Pro 495 500 505 Gly Pro Val Arg Arg Phe Thr Thr Ala Ser Ile Gly Leu Pro Pro Pro 510 515 520 Arg Gly Leu Ser Leu Leu Pro Lys Ser Gln Thr Ala Leu Asn Leu Thr 525 530 535 540 Trp Gln Pro Ile Phe Thr Asn Ser Glu Asp Glu Phe Tyr Val Glu Val 545 550 555 Glu Arg Arg Ser Leu Gln Thr Thr Ser Asp Gln Gln Asn Ile Lys Val 560 565 570 Pro Gly Asn Leu Thr Ser Val Leu Leu Ser Asn Leu Val Pro Arg Glu 575 580 585 Gln Tyr Thr Val Arg Ala Arg Val Asn Thr Lys Ala Gln Gly Glu Trp 590 595 600 Ser Glu Glu Leu Arg Ala Trp Thr Leu Ser Asp Ile Leu Pro Pro Gln 605 610 615 620 Pro Glu Asn Ile Lys Ile Ser Asn Ile Thr Asp Ser Thr Ala Met Val 625 630 635 Ser Trp Thr Ile Val Asp Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Ile Ile Ile Arg 640 645 650 Tyr Lys Val Gln Gly Lys Asn Glu Asp Gln His Ile Asp Val Lys Ile 655 660 665 Lys Asn Ala Thr Val Thr Gln Tyr Gln Leu Lys Gly Leu Glu Pro Glu 670 675 680 Thr Thr Tyr His Val Asp Ile Phe Ala Glu Asn Asn Ile Gly Ser Ser 685 690 695 700 Asn Pro Ala Phe Ser His Glu Leu Arg Thr Leu Pro His Ser Pro Ala 705 710 715 Ser Ala Asp Leu Gly Gly Gly Lys Met Leu Leu Ile Ala Ile Leu Gly 720 725 730 Ser Ala Gly Met Thr Cys Ile Thr Val Leu Leu Ala Phe Leu Ile Met 735 740 745 Leu Gln Leu Lys Arg Ala Asn Val Gln Arg Arg Met Ala Gln Ala Phe 750 755 760 Gln Asn Val Arg Glu Glu Pro Ala Val Gln Phe Asn Ser Gly Thr Leu 765 770 775 780 Ala Leu Asn Arg Lys Ala Lys Asn Asn Pro Asp Pro Thr Ile Tyr Pro 785 790 795 Val Leu Asp Trp Asn Asp Ile Lys Phe Gln Asp Val Ile Gly Glu Gly 800 805 810 Asn Phe Gly Gln Val Leu Lys Ala Arg Ile Lys Lys Asp Gly Leu Arg 815 820 825 Met Asp Ala Ala Ile Lys Arg Met Lys Glu Tyr Ala Ser Lys Asp Asp 830 835 840 His Arg Asp Phe Ala Gly Glu Leu Glu Val Leu Cys Lys Leu Gly His 845 850 855 860 His Pro Asn Ile Ile Asn Leu Leu Gly Ala Cys Glu His Arg Gly Tyr 865 870 875 Leu Tyr Leu Ala Ile Glu Tyr Ala Pro His Gly Asn Leu Leu Asp Phe 880 885 890 Leu Arg Lys Ser Arg Val Leu Glu Thr Asp Pro Ala Phe Ala Ile Ala 895 900 905 Asn Ser Thr Ala Ser Thr Leu Ser Ser Gln Gln Leu Leu His Phe Ala 910 915 920 Ala Asp Val Ala Arg Gly Met Asp Tyr Leu Ser Gln Lys Gln Phe Ile 925 930 935 940 His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Gly Glu Asn Tyr Ile 945 950 955 Ala Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ser Arg Gly Gln Glu Val Tyr Val 960 965 970 Lys Lys Thr Met Gly Arg Leu Pro Val Arg Trp Met Ala Ile Glu Ser 975 980 985 Leu Asn Tyr Ser Val Tyr Thr Thr Asn Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly 990 995 1000 Val Leu Leu Trp Glu Ile Val Ser Leu Gly Gly Thr Pro Tyr Cys Gly 1005 1010 1015 1020 Met Thr Cys Ala Glu Leu Tyr Glu Lys Leu Pro Gln Gly Tyr Arg Leu 1025 1030 1035 Glu Lys Pro Leu Asn Cys Asp Asp Glu Val Tyr Asp Leu Met Arg Gln 1040 1045 1050 Cys Trp Arg Glu Lys Pro Tyr Glu Arg Pro Ser Phe Ala Gln Ile Leu 1055 1060 1065 Val Ser Leu Asn Arg Met Leu Glu Glu Arg Lys Thr Tyr Val Asn Thr 1070 1075 1080 Thr Leu Tyr Glu Lys Phe Thr Tyr Ala Gly Ile Asp Cys Ser Ala Glu 1085 1090 1095 1100 Glu Ala Ala

【００４０】配列番号：３ 配列の長さ：３７６０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：マウス 株名：ＤＡ−１細胞 配列の特徴 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：152..211 特徴を決定した方法：S 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：212..3523 特徴を決定した方法：S 配列 GCCTGCTTCT GTGGTGTTTC TCCTTGCCGC CAACTTGTAA ACAAGAGCGA GTGGACCATG 60 CGAGCGGGAA GTCGCAAAGT TGTGAGTTGT TGAAAGCTTC CCAGGGACTC ATGCTCATCT 120 GTGGACGCTG GATGGGGAGA TCTGGGGAAG T ATG GAC TCT TTA GCC GGC TTA GTT 175 Met Asp Ser Leu Ala Gly Leu Val -20 -15 CTC TGT GGA GTC AGC TTG CTC CTT TAT GGA GTA GTA GAA GGT GCC ATG 223 Leu Cys Gly Val Ser Leu Leu Leu Tyr Gly Val Val Glu Gly Ala Met -10 -5 -1 1 GAC CTG ATC TTG ATC AAT TCC CTA CCT CTT GTG TCT GAT GCC GAA ACA 271 Asp Leu Ile Leu Ile Asn Ser Leu Pro Leu Val Ser Asp Ala Glu Thr 5 10 15 20 TCC CTC ACC TGC ATT GCC TCT GGG TGG CAC CCC CAT GAG CCC ATC ACC 319 Ser Leu Thr Cys Ile Ala Ser Gly Trp His Pro His Glu Pro Ile Thr 25 30 35 ATA GGA AGG GAC TTT GAA GCC TTA ATG AAC CAG CAC CAA GAT CCA CTG 367 Ile Gly Arg Asp Phe Glu Ala Leu Met Asn Gln His Gln Asp Pro Leu 40 45 50 GAG GTT ACT CAA GAT GTG ACC AGA GAA TGG GCG AAA AAA GTT GTG TGG 415 Glu Val Thr Gln Asp Val Thr Arg Glu Trp Ala Lys Lys Val Val Trp 55 60 65 AAG AGA GAA AAG GCC AGT AAG ATT AAT GGT GCT TAT TTC TGT GAA GGT 463 Lys Arg Glu Lys Ala Ser Lys Ile Asn Gly Ala Tyr Phe Cys Glu Gly 70 75 80 CGA GTT CGA GGA CAG GCT ATA AGG ATA CGG ACC ATG AAG ATG CGT CAA 511 Arg Val Arg Gly Gln Ala Ile Arg Ile Arg Thr Met Lys Met Arg Gln 85 90 95 100 CAA GCG TCC TTC CTA CCT GCT ACT TTA ACT ATG ACC GTG GAC AGG GGA 559 Gln Ala Ser Phe Leu Pro Ala Thr Leu Thr Met Thr Val Asp Arg Gly 105 110 115 GAT AAT GTG AAC ATA TCT TTC AAA AAG GTG TTA ATT AAA GAA GAA GAT 607 Asp Asn Val Asn Ile Ser Phe Lys Lys Val Leu Ile Lys Glu Glu Asp 120 125 130 GCA GTG ATT TAC AAA AAT GGC TCC TTC ATC CAC TCA GTG CCC CGG CAT 655 Ala Val Ile Tyr Lys Asn Gly Ser Phe Ile His Ser Val Pro Arg His 135 140 145 GAA GTA CCT GAT ATT TTA GAA GTT CAC TTG CCG CAT GCT CAG CCC CAG 703 Glu Val Pro Asp Ile Leu Glu Val His Leu Pro His Ala Gln Pro Gln 150 155 160 GAT GCT GGT GTG TAC TCG GCC AGG TAC ATA GGA GGA AAC CTG TTC ACC 751 Asp Ala Gly Val Tyr Ser Ala Arg Tyr Ile Gly Gly Asn Leu Phe Thr 165 170 175 180 TCA GCC TTC ACC AGG CTG ATT GTT CGG AGA TGT GAA GCT CAG AAG TGG 799 Ser Ala Phe Thr Arg Leu Ile Val Arg Arg Cys Glu Ala Gln Lys Trp 185 190 195 GGG CCC GAC TGT AGC CGT CCT TGT ACT ACT TGC AAG AAC AAT GGA GTC 847 Gly Pro Asp Cys Ser Arg Pro Cys Thr Thr Cys Lys Asn Asn Gly Val 200 205 210 TGC CAT GAA GAT ACC GGG GAA TGC ATT TGC CCT CCT GGG TTT ATG GGG 895 Cys His Glu Asp Thr Gly Glu Cys Ile Cys Pro Pro Gly Phe Met Gly 215 220 225 AGA ACA TGT GAG AAA GCT TGT GAG CCG CAC ACA TTT GGC AGG ACC TGT 943 Arg Thr Cys Glu Lys Ala Cys Glu Pro His Thr Phe Gly Arg Thr Cys 230 235 240 AAA GAA AGG TGT AGT GGA CCA GAA GGA TGC AAG TCT TAT GTG TTC TGT 991 Lys Glu Arg Cys Ser Gly Pro Glu Gly Cys Lys Ser Tyr Val Phe Cys 245 250 255 260 CTC CCA GAC CCT TAC GGG TGT TCC TGT GCC ACA GGC TGG AGG GGG TTG 1039 Leu Pro Asp Pro Tyr Gly Cys Ser Cys Ala Thr Gly Trp Arg Gly Leu 265 270 275 CAG TGC AAT GAA GCA TGC CCA TCT GGT TAC TAC GGA CCA GAC TGT AAG 1087 Gln Cys Asn Glu Ala Cys Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly Pro Asp Cys Lys 280 285 290 CTC AGG TGC CAC TGT ACC AAT GAA GAG ATA TGT GAT CGG TTC CAA GGA 1135 Leu Arg Cys His Cys Thr Asn Glu Glu Ile Cys Asp Arg Phe Gln Gly 295 300 305 TGC CTC TGC TCT CAA GGA TGG CAA GGG CTG CAG TGT GAG AAA GAA GGC 1183 Cys Leu Cys Ser Gln Gly Trp Gln Gly Leu Gln Cys Glu Lys Glu Gly 310 315 320 AGG CCA AGG ATG ACT CCA CAG ATA GAG GAT TTG CCA GAT CAC ATT GAA 1231 Arg Pro Arg Met Thr Pro Gln Ile Glu Asp Leu Pro Asp His Ile Glu 325 330 335 340 GTA AAC AGT GGA AAA TTT AAC CCC ATC TGC AAA GCC TCT GGG TGG CCA 1279 Val Asn Ser Gly Lys Phe Asn Pro Ile Cys Lys Ala Ser Gly Trp Pro 345 350 355 CTA CCT ACT AGT GAA GAA ATG ACC CTA GTG AAG CCA GAT GGG ACA GTG 1327 Leu Pro Thr Ser Glu Glu Met Thr Leu Val Lys Pro Asp Gly Thr Val 360 365 370 CTC CAA CCA AAT GAC TTC AAC TAT ACA GAT CGT TTC TCA GTG GCC ATA 1375 Leu Gln Pro Asn Asp Phe Asn Tyr Thr Asp Arg Phe Ser Val Ala Ile 375 380 385 TTC ACT GTC AAC CGA GTC TTA CCT CCT GAC TCA GGA GTC TGG GTC TGC 1423 Phe Thr Val Asn Arg Val Leu Pro Pro Asp Ser Gly Val Trp Val Cys 390 395 400 AGT GTG AAC ACA GTG GCT GGG ATG GTG GAA AAG CCT TTC AAC ATT TCC 1471 Ser Val Asn Thr Val Ala Gly Met Val Glu Lys Pro Phe Asn Ile Ser 405 410 415 420 GTC AAA GTT CTT CCA GAG CCC CTG CAC GCC CCA AAT GTG ATT GAC ACT 1519 Val Lys Val Leu Pro Glu Pro Leu His Ala Pro Asn Val Ile Asp Thr 425 430 435 GGA CAT AAC TTT GCT ATC ATC AAT ATC AGC TCT GAG CCT TAC TTT GGG 1567 Gly His Asn Phe Ala Ile Ile Asn Ile Ser Ser Glu Pro Tyr Phe Gly 440 445 450 GAT GGA CCC ATC AAA TCC AAG AAG CTT TTC TAT AAA CCT GTC AAT CAG 1615 Asp Gly Pro Ile Lys Ser Lys Lys Leu Phe Tyr Lys Pro Val Asn Gln 455 460 465 GCC TGG AAA TAC ATT GAA GTG ACG AAT GAG ATT TTC ACT CTC AAC TAC 1663 Ala Trp Lys Tyr Ile Glu Val Thr Asn Glu Ile Phe Thr Leu Asn Tyr 470 475 480 TTG GAG CCG CGG ACT GAC TAC GAG CTG TGT GTG CAG CTG GCC CGT CCT 1711 Leu Glu Pro Arg Thr Asp Tyr Glu Leu Cys Val Gln Leu Ala Arg Pro 485 490 495 500 GGA GAG GGT GGA GAA GGG CAT CCT GGG CCT GTG AGA CGA TTT ACA ACA 1759 Gly Glu Gly Gly Glu Gly His Pro Gly Pro Val Arg Arg Phe Thr Thr 505 510 515 GCG TCT ATC GGA CTC CCT CCT CCA AGA GGT CTC AGT CTC CTG CCA AAA 1807 Ala Ser Ile Gly Leu Pro Pro Pro Arg Gly Leu Ser Leu Leu Pro Lys 520 525 530 AGC CAG ACA GCT CTA AAT TTG ACT TGG CAA CCG ATA TTT ACA AAC TCA 1855 Ser Gln Thr Ala Leu Asn Leu Thr Trp Gln Pro Ile Phe Thr Asn Ser 535 540 545 GAA GAT GAA TTT TAT GTG GAA GTC GAG AGG CGA TCC CTG CAA ACA ACA 1903 Glu Asp Glu Phe Tyr Val Glu Val Glu Arg Arg Ser Leu Gln Thr Thr 550 555 560 AGT GAT CAG CAG AAC ATC AAA GTG CCT GGG AAC CTG ACC TCG GTG CTA 1951 Ser Asp Gln Gln Asn Ile Lys Val Pro Gly Asn Leu Thr Ser Val Leu 565 570 575 580 CTG AGC AAC TTA GTC CCC AGG GAG CAG TAC ACA GTC CGA GCT AGA GTC 1999 Leu Ser Asn Leu Val Pro Arg Glu Gln Tyr Thr Val Arg Ala Arg Val 585 590 595 AAC ACC AAG GCG CAG GGG GAG TGG AGT GAA GAA CTC AGG GCC TGG ACC 2047 Asn Thr Lys Ala Gln Gly Glu Trp Ser Glu Glu Leu Arg Ala Trp Thr 600 605 610 CTT AGT GAC ATT CTC CCT CCT CAA CCA GAA AAC ATC AAG ATC TCC AAC 2095 Leu Ser Asp Ile Leu Pro Pro Gln Pro Glu Asn Ile Lys Ile Ser Asn 615 620 625 ATC ACT GAC TCC ACA GCT ATG GTT TCT TGG ACA ATA GTG GAT GGC TAT 2143 Ile Thr Asp Ser Thr Ala Met Val Ser Trp Thr Ile Val Asp Gly Tyr 630 635 640 TCG ATT TCT TCC ATC ATC ATC CGG TAT AAG GTT CAG GGC AAA AAT GAA 2191 Ser Ile Ser Ser Ile Ile Ile Arg Tyr Lys Val Gln Gly Lys Asn Glu 645 650 655 660 GAC CAG CAC ATT GAT GTG AAG ATC AAG AAT GCT ACC GTT ACT CAG TAC 2239 Asp Gln His Ile Asp Val Lys Ile Lys Asn Ala Thr Val Thr Gln Tyr 665 670 675 CAG CTC AAG GGC CTA GAG CCA GAG ACT ACA TAC CAT GTG GAT ATT TTT 2287 Gln Leu Lys Gly Leu Glu Pro Glu Thr Thr Tyr His Val Asp Ile Phe 680 685 690 GCT GAG AAC AAC ATA GGA TCA AGC AAC CCA GCC TTT TCT CAT GAA CTG 2335 Ala Glu Asn Asn Ile Gly Ser Ser Asn Pro Ala Phe Ser His Glu Leu 695 700 705 AGG ACG CTT CCA CAT TCC 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AAG GAT GGG TTA CGG ATG GAT GCC GCC ATC AAG AGG ATG 2719 Arg Ile Lys Lys Asp Gly Leu Arg Met Asp Ala Ala Ile Lys Arg Met 825 830 835 AAA GAG TAT GCC TCC AAA GAT GAT CAC AGG GAC TTC GCA GGA GAA CTG 2767 Lys Glu Tyr Ala Ser Lys Asp Asp His Arg Asp Phe Ala Gly Glu Leu 840 845 850 GAG GTT CTT TGT AAA CTT GGA CAC CAT CCA AAC ATC ATC AAT CTC TTG 2815 Glu Val Leu Cys Lys Leu Gly His His Pro Asn Ile Ile Asn Leu Leu 855 860 865 GGA GCA TGT GAA CAC CGA GGC TAT TTG TAC CTA GCT ATT GAG TAT GCC 2863 Gly Ala Cys Glu His Arg Gly Tyr Leu Tyr Leu Ala Ile Glu Tyr Ala 870 875 880 CCG CAT GGA AAC CTC CTG GAC TTC CTG CGT AAG AGC AGA GTG CTA GAG 2911 Pro His Gly Asn Leu Leu Asp Phe Leu Arg Lys Ser Arg Val Leu Glu 885 890 895 900 ACA GAC CCT GCT TTT GCC ATC GCC AAC AGT ACA GCT TCC ACA CTG TCC 2959 Thr Asp Pro Ala Phe Ala Ile Ala Asn Ser Thr Ala Ser Thr Leu Ser 905 910 915 TCC CAA CAG CTT CTT CAT TTT GCT GCA GAT GTG GCC CGG GGG ATG GAC 3007 Ser Gln Gln Leu Leu His Phe Ala Ala Asp Val Ala Arg Gly Met Asp 920 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Leu Asn Cys Asp Asp 1030 1035 1040 GAG GTG TAT GAT CTA ATG AGA CAG TGC TGG AGG GAG AAG CCT TAT GAG 3391 Glu Val Tyr Asp Leu Met Arg Gln Cys Trp Arg Glu Lys Pro Tyr Glu 1045 1050 1055 1060 AGA CCA TCA TTT GCC CAG ATA TTG GTG TCC TTA AAC AGG ATG CTG GAA 3439 Arg Pro Ser Phe Ala Gln Ile Leu Val Ser Leu Asn Arg Met Leu Glu 1065 1070 1075 GAA CGG AAG ACA TAC GTG AAC ACC ACA CTG TAT GAG AAG TTT ACC TAT 3487 Glu Arg Lys Thr Tyr Val Asn Thr Thr Leu Tyr Glu Lys Phe Thr Tyr 1080 1085 1090 GCA GGA ATT GAC TGC TCT GCG GAA GAA GCA GCC 3520 Ala Gly Ile Asp Cys Ser Ala Glu Glu Ala Ala 1095 1100 TAGAGCAGAA CTCTTCATGT ACAACGGCCA TTTCTCCTCA CTGGCGCGAG AGCGCCTTGA 3580 CACCTGTACC AAGCAAGCCA CCCACTGCCA AGAGATGTGA TATATAAGTG TATATATTGT 3640 GCTGTGTTTG GGACCCTCCT CATACAGCTC GTGCGGATCT GCAGTGTGTT CTGACTCTAA 3700 TGTGACTGTA TATACTGCTC GGAGTAAGAA TGTGCTAAGA TCAGAATGCC TGTTCGCGGG 3760

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岩間 厚志 熊本県熊本市近見町1262−１−702 (72)発明者 安永 邦夫 埼玉県志木市館１−１−１−501 (72)発明者 増保 安彦 東京都杉並区荻窪２−17−１

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１の配列で表されるア
   ミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列
   を含むことを特徴とする、ＤＮＡ。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号２の配列で表されるア
   ミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列
   を含むことを特徴とする、ＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号１の配列で表されるア
   ミノ酸配列を含むことを特徴とする、ポリペプチド。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号２の配列で表されるア
   ミノ酸配列を含むことを特徴とする、ポリペプチド。