JP2003245085A - 癌の診断に有用な新規遺伝子及びその用途 - Google Patents
癌の診断に有用な新規遺伝子及びその用途Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】機能未知の遺伝子を同定し、同遺伝子の利用に
関する技術を提供する。 【解決手段】下記（Ａ）又は（Ｂ）に示す新規蛋白質
（DEDD2）をコードするＤＮＡ、又はその部分配列を含
むＰＣＲ用プライマー又はハイブリダイゼーション用プ
ローブを用いて、DEDD2遺伝子の発現を調べることによ
り、腎臓癌、大腸癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、又
は慢性骨髄性白血病の診断を行う。（Ａ）特定の配列に
示すアミノ酸配列を有する蛋白質。（Ｂ）特定の配列に
示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸
の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を含
み、かつ、細胞死を誘導する活性を有する蛋白質。
関する技術を提供する。 【解決手段】下記（Ａ）又は（Ｂ）に示す新規蛋白質
（DEDD2）をコードするＤＮＡ、又はその部分配列を含
むＰＣＲ用プライマー又はハイブリダイゼーション用プ
ローブを用いて、DEDD2遺伝子の発現を調べることによ
り、腎臓癌、大腸癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、又
は慢性骨髄性白血病の診断を行う。（Ａ）特定の配列に
示すアミノ酸配列を有する蛋白質。（Ｂ）特定の配列に
示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸
の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を含
み、かつ、細胞死を誘導する活性を有する蛋白質。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞死を誘導する
活性を有すると推定される蛋白質をコードする遺伝子、
並びにそれらの蛋白質及び遺伝子の利用に関する。本発
明の蛋白質及び遺伝子は、医薬・診断分野で有用であ
る。
活性を有すると推定される蛋白質をコードする遺伝子、
並びにそれらの蛋白質及び遺伝子の利用に関する。本発
明の蛋白質及び遺伝子は、医薬・診断分野で有用であ
る。
【０００２】
【従来の技術】現在、ヒトゲノムの解析が大きく進み遺
伝子の全容が解明されつつある。しかし、ゲノム配列の
みからは、その遺伝子がどのような機能を有しているか
は判らず、どのようなアミノ酸配列をコードしているか
さえ容易には解析できない。したがって、遺伝子の発現
産物の構造、及び、その遺伝子の組織又は細胞特異的な
発現パターンを調べることは重要である。
伝子の全容が解明されつつある。しかし、ゲノム配列の
みからは、その遺伝子がどのような機能を有しているか
は判らず、どのようなアミノ酸配列をコードしているか
さえ容易には解析できない。したがって、遺伝子の発現
産物の構造、及び、その遺伝子の組織又は細胞特異的な
発現パターンを調べることは重要である。
【０００３】ところで、細胞死を誘導する蛋白質をコー
ドする蛋白質として、DEDD［DED-containing DNA-bindi
ng protein］が知られている（Stegh AH, Schickling
O, Ehret A, Scaffidi C, Peterhansel C, Hofmann TG,
Grummt I, Krammer PH, Peter ME. DEDD, a novel dea
th effector domain-containing protein, targeted to
the nucleolus. The EMBO Journal, 17(20)5974-5986,
1998）。N末端側から、death effector領域［DED(deat
h effector domains)］、核移行シグナル、及びDNAに結
合すると考えられる領域の３つの領域を有している。こ
れらの領域のうち、DEDは、細胞の死に関わる蛋白質に
よく見られる特徴的な配列を有している。
ドする蛋白質として、DEDD［DED-containing DNA-bindi
ng protein］が知られている（Stegh AH, Schickling
O, Ehret A, Scaffidi C, Peterhansel C, Hofmann TG,
Grummt I, Krammer PH, Peter ME. DEDD, a novel dea
th effector domain-containing protein, targeted to
the nucleolus. The EMBO Journal, 17(20)5974-5986,
1998）。N末端側から、death effector領域［DED(deat
h effector domains)］、核移行シグナル、及びDNAに結
合すると考えられる領域の３つの領域を有している。こ
れらの領域のうち、DEDは、細胞の死に関わる蛋白質に
よく見られる特徴的な配列を有している。
【０００４】また、DEDDと構造が類似する蛋白質として
DEDD2が報告されている（Roth W.,Stenner-Liewen F.,
Pawlowski, K., Godzik A and Reed JC. Identificatio
n and Characterization of DEDD2, a Death Effector
Domain-containing Protein. The Journal of Biologic
al Chemistry, 277(9) 7501-7508, (2002)）。DEDD2もD
EDDと同様にdeath effector領域を有し、アポトーシス
経路を介した核内事象の調節に関与していることが示唆
されており、その構造も明らかにされている（前記Roth
W.ら）。
DEDD2が報告されている（Roth W.,Stenner-Liewen F.,
Pawlowski, K., Godzik A and Reed JC. Identificatio
n and Characterization of DEDD2, a Death Effector
Domain-containing Protein. The Journal of Biologic
al Chemistry, 277(9) 7501-7508, (2002)）。DEDD2もD
EDDと同様にdeath effector領域を有し、アポトーシス
経路を介した核内事象の調節に関与していることが示唆
されており、その構造も明らかにされている（前記Roth
W.ら）。
【０００５】しかし、DEDDに類似の構造を有する蛋白質
をコードする遺伝子の発現が、腎臓癌、大腸癌および前
立腺癌の組織、並びに急性骨髄性白血病及び慢性骨髄性
白血病の末梢血画分において、正常細胞に比べて低いこ
とがあることは知られていない。
をコードする遺伝子の発現が、腎臓癌、大腸癌および前
立腺癌の組織、並びに急性骨髄性白血病及び慢性骨髄性
白血病の末梢血画分において、正常細胞に比べて低いこ
とがあることは知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、機能未知の
遺伝子を同定し、同遺伝子の利用に関する技術を提供す
ることを課題とする。
遺伝子を同定し、同遺伝子の利用に関する技術を提供す
ることを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒトcDNA
ライブラリーからDEDDに類似の構造を有する蛋白質をコ
ードする新規cDNAを見出し、同cDNAに対応する遺伝子の
各種癌組織、及び白血病の末梢血画分における発現を調
べた結果、腎臓癌、大腸癌、前立腺癌、急性骨髄性白血
病、又は慢性骨髄性白血病で正常細胞よりも発現が低い
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
ライブラリーからDEDDに類似の構造を有する蛋白質をコ
ードする新規cDNAを見出し、同cDNAに対応する遺伝子の
各種癌組織、及び白血病の末梢血画分における発現を調
べた結果、腎臓癌、大腸癌、前立腺癌、急性骨髄性白血
病、又は慢性骨髄性白血病で正常細胞よりも発現が低い
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示す蛋白質をコードする
ＤＮＡ。 （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質。 （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若し
くは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含む
アミノ酸配列を含み、かつ、細胞死を誘導する活性を有
する蛋白質。 （２）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（１）
記載のＤＮＡ。 （ａ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞
死を誘導する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。 （３）配列番号１に記載の塩基配列又はその部分配列を
含み、配列番号１に記載の塩基配列に対応する遺伝子の
存在又は発現を調べるためのＰＣＲ用プライマー又はハ
イブリダイゼーション用プローブとして使用されるＤＮ
Ａ。 （４）腎臓癌、大腸癌、又は前立腺癌の診断に用いられ
る（３）記載のＤＮＡ。 （５）腎臓癌、大腸癌、又は前立腺癌の診断に用いられ
る（３）記載のＤＮＡ。 （６）配列番号７に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、及
び配列番号８に記載の塩基配列を有するＤＮＡのセット
からなる、（３）又は（４）に記載のＤＮＡ。 （７）配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａを含み、腎臓癌、大腸癌、又は前立腺癌の治療に用い
られる遺伝子治療用医薬。 （８）配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａを含み、急性骨髄性白血病又は慢性骨髄性白血病の治
療に用いられる遺伝子治療用医薬。 （９）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示す蛋白質またはその塩
を含有する医薬。 （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質。 （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若し
くは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含む
アミノ酸配列を含み、かつ、細胞死を誘導する活性を有
する蛋白質。 （１０）腎臓癌、大腸癌、又は前立腺癌の治療に用いら
れる（９）記載の医薬。 （１１）急性骨髄性白血病又は慢性骨髄性白血病の治療
に用いられる（９）記載の医薬。 上記の本発明の蛋白質は、細胞死を誘導する公知の蛋白
質であるDEDDとの構造の類似性から、「DEDD2」と名付
けられた。
ＤＮＡ。 （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質。 （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若し
くは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含む
アミノ酸配列を含み、かつ、細胞死を誘導する活性を有
する蛋白質。 （２）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（１）
記載のＤＮＡ。 （ａ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞
死を誘導する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。 （３）配列番号１に記載の塩基配列又はその部分配列を
含み、配列番号１に記載の塩基配列に対応する遺伝子の
存在又は発現を調べるためのＰＣＲ用プライマー又はハ
イブリダイゼーション用プローブとして使用されるＤＮ
Ａ。 （４）腎臓癌、大腸癌、又は前立腺癌の診断に用いられ
る（３）記載のＤＮＡ。 （５）腎臓癌、大腸癌、又は前立腺癌の診断に用いられ
る（３）記載のＤＮＡ。 （６）配列番号７に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、及
び配列番号８に記載の塩基配列を有するＤＮＡのセット
からなる、（３）又は（４）に記載のＤＮＡ。 （７）配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａを含み、腎臓癌、大腸癌、又は前立腺癌の治療に用い
られる遺伝子治療用医薬。 （８）配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａを含み、急性骨髄性白血病又は慢性骨髄性白血病の治
療に用いられる遺伝子治療用医薬。 （９）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示す蛋白質またはその塩
を含有する医薬。 （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質。 （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若し
くは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含む
アミノ酸配列を含み、かつ、細胞死を誘導する活性を有
する蛋白質。 （１０）腎臓癌、大腸癌、又は前立腺癌の治療に用いら
れる（９）記載の医薬。 （１１）急性骨髄性白血病又は慢性骨髄性白血病の治療
に用いられる（９）記載の医薬。 上記の本発明の蛋白質は、細胞死を誘導する公知の蛋白
質であるDEDDとの構造の類似性から、「DEDD2」と名付
けられた。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明のＤＮＡは、下記（Ａ）又
は（Ｂ）に示す蛋白質をコードするＤＮＡである。 （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質。 （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若し
くは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含む
アミノ酸配列を含み、かつ、細胞死を誘導する活性を有
する蛋白質。
は（Ｂ）に示す蛋白質をコードするＤＮＡである。 （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質。 （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若し
くは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含む
アミノ酸配列を含み、かつ、細胞死を誘導する活性を有
する蛋白質。
【００１０】本発明のＤＮＡは、後述するように、ヒト
白血病細胞株であるTF-1細胞（ATCCNo.：CRL-2003）由
来のmRNAからポリメラーゼ・チェイン・リアクション
（ＰＣＲ、White,T.J. et al., Trends Genet., 5,185
(1989)）により増幅することによって得られる。また、
本発明により、DEDD2遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列が明
らかになったので、化学合成することによっても本発明
のＤＮＡ断片は得られる。さらに、ヒト染色体ＤＮＡを
鋳型としてＰＣＲを行なうことにより、DEDD2をコード
する染色体遺伝子が得られる。染色体由来のDEDD2遺伝
子は、コード領域にイントロンを含むことが予想される
が、そのようなイントロンで分断されているＤＮＡであ
っても、DEDD2をコードする限り、本発明のＤＮＡに含
まれる。
白血病細胞株であるTF-1細胞（ATCCNo.：CRL-2003）由
来のmRNAからポリメラーゼ・チェイン・リアクション
（ＰＣＲ、White,T.J. et al., Trends Genet., 5,185
(1989)）により増幅することによって得られる。また、
本発明により、DEDD2遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列が明
らかになったので、化学合成することによっても本発明
のＤＮＡ断片は得られる。さらに、ヒト染色体ＤＮＡを
鋳型としてＰＣＲを行なうことにより、DEDD2をコード
する染色体遺伝子が得られる。染色体由来のDEDD2遺伝
子は、コード領域にイントロンを含むことが予想される
が、そのようなイントロンで分断されているＤＮＡであ
っても、DEDD2をコードする限り、本発明のＤＮＡに含
まれる。
【００１１】DEDD2をコードするｃＤＮＡを取得するた
めの材料としては、DEDD2を産生するヒトの臓器、又は
株化した細胞であればすべて利用できるが、具体的には
脾臓（spleen）等の臓器、ヒト白血病細胞株等の細胞が
挙げられる。これらの組織の細胞から常法［J. Sambroo
kら著、モレキュラー・クローニング(Molecular Clonin
g) 、第３巻、第２版、コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Labora
tory Press) 、１９８９年］によりメッセンジャーＲＮ
Ａ（ｍＲＮＡ）を調製する。得られたｍＲＮＡを鋳型と
して逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを調製する。
めの材料としては、DEDD2を産生するヒトの臓器、又は
株化した細胞であればすべて利用できるが、具体的には
脾臓（spleen）等の臓器、ヒト白血病細胞株等の細胞が
挙げられる。これらの組織の細胞から常法［J. Sambroo
kら著、モレキュラー・クローニング(Molecular Clonin
g) 、第３巻、第２版、コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Labora
tory Press) 、１９８９年］によりメッセンジャーＲＮ
Ａ（ｍＲＮＡ）を調製する。得られたｍＲＮＡを鋳型と
して逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを調製する。
【００１２】DEDD2の５’側プライマーと３’側プライ
マーとして種々のオリゴヌクレオチドを化学合成して、
これらと一本鎖ｃＤＮＡを用いて、ＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼによりこのＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、アガロー
スゲル電気泳動により目的の大きさのＤＮＡ断片を調製
する。調製したＤＮＡ断片は、直接塩基配列を決定する
ことができる。ＰＣＲに用いるプライマーとしては、配
列番号７及び８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドが挙げられる。これらのプライマーを用いてヒト組
織又は細胞由来のmRNAまたはcDNAライブラリーを鋳型と
してＰＣＲを行うと、配列番号１に示す配列に加え、5'
末端に配列番号９に示す塩基配列を、3' 末端側に配列
番号１０に示す塩基配列が付加されたＤＮＡが得られ
る。
マーとして種々のオリゴヌクレオチドを化学合成して、
これらと一本鎖ｃＤＮＡを用いて、ＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼによりこのＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、アガロー
スゲル電気泳動により目的の大きさのＤＮＡ断片を調製
する。調製したＤＮＡ断片は、直接塩基配列を決定する
ことができる。ＰＣＲに用いるプライマーとしては、配
列番号７及び８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドが挙げられる。これらのプライマーを用いてヒト組
織又は細胞由来のmRNAまたはcDNAライブラリーを鋳型と
してＰＣＲを行うと、配列番号１に示す配列に加え、5'
末端に配列番号９に示す塩基配列を、3' 末端側に配列
番号１０に示す塩基配列が付加されたＤＮＡが得られ
る。
【００１３】また、増幅断片を適当な市販のプラスミド
ベクター、例えばpME18SFL3（東洋紡(株)）、pCR2.1、p
CRII（いずれもInvitrogen社）、pUC118（宝酒造社製）
等に挿入し、大腸菌、例えばDH5alpha、INValphaF'（In
vitrogen社）、HB101（宝酒造社製）を形質転換し、プ
ラスミドを精製し、のち塩基配列を決定することもでき
る。
ベクター、例えばpME18SFL3（東洋紡(株)）、pCR2.1、p
CRII（いずれもInvitrogen社）、pUC118（宝酒造社製）
等に挿入し、大腸菌、例えばDH5alpha、INValphaF'（In
vitrogen社）、HB101（宝酒造社製）を形質転換し、プ
ラスミドを精製し、のち塩基配列を決定することもでき
る。
【００１４】本発明のＤＮＡの塩基配列を、常法により
決定した結果を、配列番号１に示し、これがコードして
いるアミノ酸配列を配列番号２に示した。このアミノ酸
配列について、Steghら（The EMBO Journal, 17(20)597
4-5986, 1998）がDEDDについて示した結果と比較して解
析したところ、配列番号２において、アミノ酸番号２３
〜９９はDED（death effector領域）、アミノ酸番号１
０４〜１０８、１３１〜１３４、及び１６９〜１７３は
核移行シグナル、アミノ酸番号２９０〜３１０はDNAに
結合すると考えられる領域であると推定される。
決定した結果を、配列番号１に示し、これがコードして
いるアミノ酸配列を配列番号２に示した。このアミノ酸
配列について、Steghら（The EMBO Journal, 17(20)597
4-5986, 1998）がDEDDについて示した結果と比較して解
析したところ、配列番号２において、アミノ酸番号２３
〜９９はDED（death effector領域）、アミノ酸番号１
０４〜１０８、１３１〜１３４、及び１６９〜１７３は
核移行シグナル、アミノ酸番号２９０〜３１０はDNAに
結合すると考えられる領域であると推定される。
【００１５】本発明において、DEDD2は、DEDD2としての
活性、すなわち細胞死を誘導する活性を実質的に損なわ
ない限り、１又は２以上のアミノ酸残基の置換、欠失、
挿入又は付加を含んでいてもよい。これらのいずれのDE
DD2をコードするＤＮＡも本発明に含まれる。このよう
なＤＮＡ断片として具体的には、配列番号１に示す塩基
配列を含むＤＮＡ断片が挙げられる。さらに、同一のア
ミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、各アミノ酸
に対するコドンを同等のコドンに置換した配列も本発明
に含まれる。
活性、すなわち細胞死を誘導する活性を実質的に損なわ
ない限り、１又は２以上のアミノ酸残基の置換、欠失、
挿入又は付加を含んでいてもよい。これらのいずれのDE
DD2をコードするＤＮＡも本発明に含まれる。このよう
なＤＮＡ断片として具体的には、配列番号１に示す塩基
配列を含むＤＮＡ断片が挙げられる。さらに、同一のア
ミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、各アミノ酸
に対するコドンを同等のコドンに置換した配列も本発明
に含まれる。
【００１６】上記のようなDEDD2と実質的に同一のタン
パク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法
によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変するこ
とによって得られる。また、DEDD2をコードするＤＮＡ
を変異剤等で処理することによって、ランダムに変異を
導入することによっても得ることができる。このように
して変異が導入されたＤＮＡを適当な細胞で発現させ、
発現産物の細胞死を誘導する活性を調べることにより、
DEDD2と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡ
が得られる。また、変異を有する、DEDD2をコードする
ＤＮＡを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号１
に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな
条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞死を誘導する活
性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離するこ
とによっても、DEDD2と実質的に同一のタンパク質をコ
ードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェ
ントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形
成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を
いう。例えば２０％以上、好ましくは５０％以上、より
好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハ
イブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハ
イブリダイズしない条件、具体的には、４２℃、０．２
×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは６８℃、０．
１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度でハイ
ブリダイズする条件が挙げられる。
パク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法
によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変するこ
とによって得られる。また、DEDD2をコードするＤＮＡ
を変異剤等で処理することによって、ランダムに変異を
導入することによっても得ることができる。このように
して変異が導入されたＤＮＡを適当な細胞で発現させ、
発現産物の細胞死を誘導する活性を調べることにより、
DEDD2と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡ
が得られる。また、変異を有する、DEDD2をコードする
ＤＮＡを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号１
に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな
条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞死を誘導する活
性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離するこ
とによっても、DEDD2と実質的に同一のタンパク質をコ
ードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェ
ントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形
成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を
いう。例えば２０％以上、好ましくは５０％以上、より
好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハ
イブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハ
イブリダイズしない条件、具体的には、４２℃、０．２
×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは６８℃、０．
１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度でハイ
ブリダイズする条件が挙げられる。
【００１７】次に、DEDD2の製造法について説明する。D
EDD2は、例えば、上記ＤＮＡを通常の方法により、プロ
モーター配列、マーカー遺伝子、複製起点等を有する適
当な発現ベクターに挿入して、微生物、培養細胞又は動
植物に導入して発現させることにより、大量に調製する
ことが可能である。このような発現ベクターは、種々の
ものが市販されており、本発明に使用することができ
る。発現されたDEDD2が、顆粒体として菌体内に蓄積さ
れる場合は、これを８Ｍ尿素溶液、６Ｍグアニジン塩酸
溶液等で可溶化し、カラムクロマトグラフィーにより精
製し、リフォールディングして天然と同一又は近似の構
造を有するDEDD2を製造することができる。
EDD2は、例えば、上記ＤＮＡを通常の方法により、プロ
モーター配列、マーカー遺伝子、複製起点等を有する適
当な発現ベクターに挿入して、微生物、培養細胞又は動
植物に導入して発現させることにより、大量に調製する
ことが可能である。このような発現ベクターは、種々の
ものが市販されており、本発明に使用することができ
る。発現されたDEDD2が、顆粒体として菌体内に蓄積さ
れる場合は、これを８Ｍ尿素溶液、６Ｍグアニジン塩酸
溶液等で可溶化し、カラムクロマトグラフィーにより精
製し、リフォールディングして天然と同一又は近似の構
造を有するDEDD2を製造することができる。
【００１８】また、例えば、アデノウイルスプロモータ
ー、ＤＨＦＲ（デヒドロ葉酸還元酵素）遺伝子、ＳＶ４
０ポリＡ配列及び複製起点を有するプラスミドに、DEDD
2をコードするＤＮＡを結合して挿入し、これをリン酸
カルシウム法等によりＤＨＦＲを欠損しているＣＨＯ細
胞（チャイニーズ・ハムスター由来細胞）に遺伝子導入
し、ＭＴＸ（メトトレキセート）培地中で細胞培養する
ことによりDEDD2が発現する。
ー、ＤＨＦＲ（デヒドロ葉酸還元酵素）遺伝子、ＳＶ４
０ポリＡ配列及び複製起点を有するプラスミドに、DEDD
2をコードするＤＮＡを結合して挿入し、これをリン酸
カルシウム法等によりＤＨＦＲを欠損しているＣＨＯ細
胞（チャイニーズ・ハムスター由来細胞）に遺伝子導入
し、ＭＴＸ（メトトレキセート）培地中で細胞培養する
ことによりDEDD2が発現する。
【００１９】本発明のＤＮＡによりコードされるDEDD2
の活性は、同ＤＮＡを前記と同様に動物細胞に遺伝子導
入して発現させ、対照細胞と比較し、DEDD2による細胞
死を観察することによって、確認することができる（St
egh AH et al., The EMBO Journal, 17(20)5974-5986,
1998）。
の活性は、同ＤＮＡを前記と同様に動物細胞に遺伝子導
入して発現させ、対照細胞と比較し、DEDD2による細胞
死を観察することによって、確認することができる（St
egh AH et al., The EMBO Journal, 17(20)5974-5986,
1998）。
【００２０】後記実施例に示すように、DEDD2をコード
する遺伝子の発現は、腎臓癌、大腸癌および前立腺癌の
組織、並びに急性骨髄性白血病及び慢性骨髄性白血病の
末梢血画分において、正常細胞に比べて低い。従って、
DEDD2遺伝子は、これらの癌又は白血病の診断に有用と
考えられる。例えば、配列番号１に記載の塩基配列又は
その部分配列を含むＰＣＲ用プライマー又はハイブリダ
イゼーション用プローブを用いて、DEDD2遺伝子の発現
を調べることによって、上記癌又は白血病を診断するこ
とができる。具体的には、被検者の組織から抽出したmR
NAを鋳型として、前記プライマーを用いたＰＣＲ、又は
前記プローブを用いたハイブリダイゼーションにより、
DEDD2遺伝子の発現を調べることができる。
する遺伝子の発現は、腎臓癌、大腸癌および前立腺癌の
組織、並びに急性骨髄性白血病及び慢性骨髄性白血病の
末梢血画分において、正常細胞に比べて低い。従って、
DEDD2遺伝子は、これらの癌又は白血病の診断に有用と
考えられる。例えば、配列番号１に記載の塩基配列又は
その部分配列を含むＰＣＲ用プライマー又はハイブリダ
イゼーション用プローブを用いて、DEDD2遺伝子の発現
を調べることによって、上記癌又は白血病を診断するこ
とができる。具体的には、被検者の組織から抽出したmR
NAを鋳型として、前記プライマーを用いたＰＣＲ、又は
前記プローブを用いたハイブリダイゼーションにより、
DEDD2遺伝子の発現を調べることができる。
【００２１】上記プライマーとしては、例えば配列番号
７及び８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げ
られる。これ以外にも、配列番号１に示す配列の任意の
部分より、作製することができる。
７及び８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げ
られる。これ以外にも、配列番号１に示す配列の任意の
部分より、作製することができる。
【００２２】また、DEDD2は、細胞死を誘導する蛋白質
として知られているDEDD（Stegh AH,Schickling O, Ehr
et A, Scaffidi C, Peterhansel C, Hofmann TG, Grumm
t I,Krammer PH, Peter ME. DEDD, a novel death effe
ctor domain-containing protein, targeted to the nu
cleolus. The EMBO Journal, 17(20)5974-5986, 1998）
と構造の類似性が見出されたことから、同様に細胞死を
誘導する活性を有することが強く示唆される。したがっ
て、DEDD2又はそれをコードするＤＮＡは、上記癌又は
白血病の治療においても、同ＤＮＡ又は同ＤＮＡを組み
込んだベクターを含む遺伝子治療薬として、有用である
可能性がある。さらに、DEDD2蛋白質自体も、上記癌又
は白血病の治療に用いられ得る。
として知られているDEDD（Stegh AH,Schickling O, Ehr
et A, Scaffidi C, Peterhansel C, Hofmann TG, Grumm
t I,Krammer PH, Peter ME. DEDD, a novel death effe
ctor domain-containing protein, targeted to the nu
cleolus. The EMBO Journal, 17(20)5974-5986, 1998）
と構造の類似性が見出されたことから、同様に細胞死を
誘導する活性を有することが強く示唆される。したがっ
て、DEDD2又はそれをコードするＤＮＡは、上記癌又は
白血病の治療においても、同ＤＮＡ又は同ＤＮＡを組み
込んだベクターを含む遺伝子治療薬として、有用である
可能性がある。さらに、DEDD2蛋白質自体も、上記癌又
は白血病の治療に用いられ得る。
【００２３】また、本発明により、DEDD2のアミノ酸配
列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列が明らかにな
ったので、それらの情報に基づいて他の動物のDEDD2遺
伝子ホモログを容易に取得することができる。本発明の
DEDD2遺伝子又はそのホモログを用いて、DEDD2遺伝子を
欠損したモデル動物を作製することができる。
列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列が明らかにな
ったので、それらの情報に基づいて他の動物のDEDD2遺
伝子ホモログを容易に取得することができる。本発明の
DEDD2遺伝子又はそのホモログを用いて、DEDD2遺伝子を
欠損したモデル動物を作製することができる。
【００２４】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
説明する。
【００２５】＜１＞cDNAライブラリーの作製
ヒト白血病細胞株であるTF-1細胞（ATCC No.：CRL-200
3）よりmRNAを抽出し、オリゴキャッピング法（Maruyam
a K, Sugano S. Oligo-capping: a simple method to r
eplace the cap structure of eucaryotic mRNAs with
oligoribonucleotides. Gene, 138, 171-174, 1994; Su
zuki Y, Yoshimoto K, Maruyama K, Suyama A, Sugano
S. Construction and characterization of a full len
gth-enriched and a 5’-end-enriched cDNA library.
Gene, 200, 149-156, 1997）によりcDNAライブラリーを
作製した。具体的には、鈴木穣ら、実験医学別冊 新訂
新遺伝子工学ハンドブック改訂第３版、「完全長cDNAラ
イブラリーの作製」の項（285〜292頁）に従って行なっ
た。
3）よりmRNAを抽出し、オリゴキャッピング法（Maruyam
a K, Sugano S. Oligo-capping: a simple method to r
eplace the cap structure of eucaryotic mRNAs with
oligoribonucleotides. Gene, 138, 171-174, 1994; Su
zuki Y, Yoshimoto K, Maruyama K, Suyama A, Sugano
S. Construction and characterization of a full len
gth-enriched and a 5’-end-enriched cDNA library.
Gene, 200, 149-156, 1997）によりcDNAライブラリーを
作製した。具体的には、鈴木穣ら、実験医学別冊 新訂
新遺伝子工学ハンドブック改訂第３版、「完全長cDNAラ
イブラリーの作製」の項（285〜292頁）に従って行なっ
た。
【００２６】得られたcDNAはベクターpME18SFL3（東洋
紡(株)）に挿入し、大腸菌株DH5alphaを用い、常法によ
りクローン化した。プラスミドDNAはQIAGEN社Plasmid M
ini Kitを用い、同社プロトコールに従って調製した。
紡(株)）に挿入し、大腸菌株DH5alphaを用い、常法によ
りクローン化した。プラスミドDNAはQIAGEN社Plasmid M
ini Kitを用い、同社プロトコールに従って調製した。
【００２７】得られたプラスミドDNAの配列は、Applied
Biosystems社のBigDye TerminatorCycle Sequencing F
S Ready Reaction Kitを用いて、添付のプロトコールに
従い、ベクターの配列に由来するプライマー（配列番号
３、４）を用いて反応を行い、その後、同社373S DNA s
equencerにて電気泳動を行なって決定した。
Biosystems社のBigDye TerminatorCycle Sequencing F
S Ready Reaction Kitを用いて、添付のプロトコールに
従い、ベクターの配列に由来するプライマー（配列番号
３、４）を用いて反応を行い、その後、同社373S DNA s
equencerにて電気泳動を行なって決定した。
【００２８】＜２＞新規遺伝子の探索と同定
上記cDNAライブラリーより無作為に選択したcDNAクロー
ンの塩基配列を上述の方法により決定し、その中に、こ
れまでに報告の無い塩基配列を持つcDNA（クローン#tf5
9）を見出した。上記のプライマーを用いて3'末端側お
よび5'末端側の配列を決定し、この配列を元に、配列番
号５及び６に示す塩基配列を有するプライマーを作製
し、更に内部の塩基配列を決定することで、前記クロー
ンの全塩基配列を決定した。こうして単離された遺伝子
の塩基配列を配列番号１に示す。この塩基配列によりコ
ードされると予想されるアミノ酸配列を配列番号２に示
す。
ンの塩基配列を上述の方法により決定し、その中に、こ
れまでに報告の無い塩基配列を持つcDNA（クローン#tf5
9）を見出した。上記のプライマーを用いて3'末端側お
よび5'末端側の配列を決定し、この配列を元に、配列番
号５及び６に示す塩基配列を有するプライマーを作製
し、更に内部の塩基配列を決定することで、前記クロー
ンの全塩基配列を決定した。こうして単離された遺伝子
の塩基配列を配列番号１に示す。この塩基配列によりコ
ードされると予想されるアミノ酸配列を配列番号２に示
す。
【００２９】上記アミノ酸配列と相同性を示す既知の蛋
白質をデータベースから検索した。データベースは、米
国バイオテクノロジー情報センター（National Center
forBiotechnology Information）（http://www.ncbi.nl
m.nih.gov/BLAST/）の既知蛋白質データベースであり、
相同性検索のプログラムにはblastp（Altschul SF,Madd
en TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Li
pman DJ., GappedBLAST and PSI-BLAST: a new generat
ion of protein database search programs. Nucleic A
cids Research, 25(17):3389-3402, 1997）を用いた。
その結果、アミノ酸レベルでの相同性が最も高い蛋白質
として、DEDD（Stegh AH, Schickling O, Ehret A, Sca
ffidi C, Peterhansel C, Hofmann TG, Grummt I, Kram
merPH, Peter ME. DEDD, a novel death effector doma
in-containing protein, targeted to the nucleolus.
The EMBO Journal, 17(20)5974-5986, 1998）が見出さ
れた。単離されたcDNAがコードする蛋白質（DEDD2）とD
EDDとの相同性は、アミノ酸レベルで約45％であった。
同cDNAがコードするアミノ酸配列は、上記文献中でSteg
hらが指摘しているDEDDの特徴的な構造を全て有してい
る。即ち、蛋白質のN末端側から、death effector領
域、核移行シグナル、及びDNAに結合すると考えられる
領域を備えている。これらの領域の内、death effector
領域は、細胞の死に関わる蛋白質によく見られる特徴的
な配列である（上記Steghら）。したがって、DEDDと類
似の構造を持つ上記cDNAがコードする蛋白質も、DEDDと
同様に細胞死を誘導する分子であることが強く示唆され
る。そこで、上記cDNAがコードする蛋白質を、DEDD2と
名付けた。尚、塩基配列レベルの検索では、本発明のＤ
ＮＡと有意な相同性を有するものは見い出されなかった
（１０％以下）。
白質をデータベースから検索した。データベースは、米
国バイオテクノロジー情報センター（National Center
forBiotechnology Information）（http://www.ncbi.nl
m.nih.gov/BLAST/）の既知蛋白質データベースであり、
相同性検索のプログラムにはblastp（Altschul SF,Madd
en TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Li
pman DJ., GappedBLAST and PSI-BLAST: a new generat
ion of protein database search programs. Nucleic A
cids Research, 25(17):3389-3402, 1997）を用いた。
その結果、アミノ酸レベルでの相同性が最も高い蛋白質
として、DEDD（Stegh AH, Schickling O, Ehret A, Sca
ffidi C, Peterhansel C, Hofmann TG, Grummt I, Kram
merPH, Peter ME. DEDD, a novel death effector doma
in-containing protein, targeted to the nucleolus.
The EMBO Journal, 17(20)5974-5986, 1998）が見出さ
れた。単離されたcDNAがコードする蛋白質（DEDD2）とD
EDDとの相同性は、アミノ酸レベルで約45％であった。
同cDNAがコードするアミノ酸配列は、上記文献中でSteg
hらが指摘しているDEDDの特徴的な構造を全て有してい
る。即ち、蛋白質のN末端側から、death effector領
域、核移行シグナル、及びDNAに結合すると考えられる
領域を備えている。これらの領域の内、death effector
領域は、細胞の死に関わる蛋白質によく見られる特徴的
な配列である（上記Steghら）。したがって、DEDDと類
似の構造を持つ上記cDNAがコードする蛋白質も、DEDDと
同様に細胞死を誘導する分子であることが強く示唆され
る。そこで、上記cDNAがコードする蛋白質を、DEDD2と
名付けた。尚、塩基配列レベルの検索では、本発明のＤ
ＮＡと有意な相同性を有するものは見い出されなかった
（１０％以下）。
【００３０】＜３＞DEDD2遺伝子の発現解析
上述した通り、DEDD2は細胞の死を誘導する機能がある
と考えられる。細胞死はアポトーシス（プログラムされ
た細胞死）に代表されるように、正常な細胞であれば必
ず一定の確率で起きている現象であることは広く知られ
ている。癌細胞では、これら細胞死がしばしば、正常に
起きていないことも広く知られている。そこで、上記DE
DD2遺伝子が癌化と関連があるかの検索を試みた。
と考えられる。細胞死はアポトーシス（プログラムされ
た細胞死）に代表されるように、正常な細胞であれば必
ず一定の確率で起きている現象であることは広く知られ
ている。癌細胞では、これら細胞死がしばしば、正常に
起きていないことも広く知られている。そこで、上記DE
DD2遺伝子が癌化と関連があるかの検索を試みた。
【００３１】具体的には、DEDD2の遺伝子発現が癌患者
の腫瘍組織とそれに対応する正常組織で異なるか否か
を、Clontech社のMatched Tumor/Normal Expression Ar
ray（#7840-1）を用いてサザン・ハイブリダイゼーショ
ン法により検討した。同Arrayは、癌患者由来の腫瘍組
織（腎臓、乳房、前立腺、子宮、卵巣、子宮頸、大腸、
肺、胃、直腸）とその患者の腫瘍組織に対応する正常組
織よりRNAを抽出した後、そのRNAよりcDNAを作製し、同
一のメンブレン上にスポットしてあるものである。同様
に、Clontech社のBlood Disease Profiling Array (#78
42-1)を用いて、血液腫瘍（急性骨髄性白血病、慢性骨
髄性白血病、ホジキン病、非ホジキン病、von Willebra
nd病）患者の末梢血画分におけるDEDD2遺伝子の発現を
正常ドナーと比較した。方法は、購入した同Arrayに添
付のプロトコールに従って行なったが、概要は以下の通
りである。
の腫瘍組織とそれに対応する正常組織で異なるか否か
を、Clontech社のMatched Tumor/Normal Expression Ar
ray（#7840-1）を用いてサザン・ハイブリダイゼーショ
ン法により検討した。同Arrayは、癌患者由来の腫瘍組
織（腎臓、乳房、前立腺、子宮、卵巣、子宮頸、大腸、
肺、胃、直腸）とその患者の腫瘍組織に対応する正常組
織よりRNAを抽出した後、そのRNAよりcDNAを作製し、同
一のメンブレン上にスポットしてあるものである。同様
に、Clontech社のBlood Disease Profiling Array (#78
42-1)を用いて、血液腫瘍（急性骨髄性白血病、慢性骨
髄性白血病、ホジキン病、非ホジキン病、von Willebra
nd病）患者の末梢血画分におけるDEDD2遺伝子の発現を
正常ドナーと比較した。方法は、購入した同Arrayに添
付のプロトコールに従って行なったが、概要は以下の通
りである。
【００３２】先ず、DEDD2遺伝子cDNAのコード領域を全
て含むcDNAプローブを作製した。このために、配列番号
７及び８に示すプライマーを作製した。このプライマー
を用い、前記で得られたDEDD2遺伝子をコードするクロ
ーン（#tf59）のプラスミドDNAを鋳型とするPCRによ
り、DEDD2のcDNA断片を増幅した。PCRは、Clontech Adv
antage 2 PCR Kit（#K1910）を用い、添付のプロトコー
ルに従い、PCR Thermal Cycler MP（宝酒造）を用いて
常法により行なった。得られるcDNAは、配列番号１に示
す配列に加え、5'末端に配列番号９に示す塩基配列を、
3'末端側に配列番号１０に示す塩基配列を持つものであ
る。このcDNAの塩基配列は、検索の結果（http://www.n
cbi.nlm.nih.gov/BLAST/、プログラムはblastn (Altsch
ul SF, Madden TL, Scaffer AA, Zhang J, Miller W, L
ipman DJ. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new genera
tion of protein database search programs. Nucleic
AcidsResearch. 25(17)3389-3402, 1997参照)）、DEDD
の塩基配列とは有意な相同性は認められなかった。従っ
て、上記cDNAを標識して得られるプローブでは、DEDDを
検出しないことが明らかである。
て含むcDNAプローブを作製した。このために、配列番号
７及び８に示すプライマーを作製した。このプライマー
を用い、前記で得られたDEDD2遺伝子をコードするクロ
ーン（#tf59）のプラスミドDNAを鋳型とするPCRによ
り、DEDD2のcDNA断片を増幅した。PCRは、Clontech Adv
antage 2 PCR Kit（#K1910）を用い、添付のプロトコー
ルに従い、PCR Thermal Cycler MP（宝酒造）を用いて
常法により行なった。得られるcDNAは、配列番号１に示
す配列に加え、5'末端に配列番号９に示す塩基配列を、
3'末端側に配列番号１０に示す塩基配列を持つものであ
る。このcDNAの塩基配列は、検索の結果（http://www.n
cbi.nlm.nih.gov/BLAST/、プログラムはblastn (Altsch
ul SF, Madden TL, Scaffer AA, Zhang J, Miller W, L
ipman DJ. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new genera
tion of protein database search programs. Nucleic
AcidsResearch. 25(17)3389-3402, 1997参照)）、DEDD
の塩基配列とは有意な相同性は認められなかった。従っ
て、上記cDNAを標識して得られるプローブでは、DEDDを
検出しないことが明らかである。
【００３３】上記cDNAを、32Pで標識されたdCTP（Amers
ham Pharmacia Biotech社、#PB10205）および同社MegaP
rime DNA Labelling System（#RPN1606）を用い、同社
プロトコールに従って標識した。この標識プローブと、
Matched Tumor/Normal Expression Array及びBlood Dis
ease Profiling Arrayを用い、サザン・ハイブリダイゼ
ーションを行なった。ハイブリダイゼーションはClonte
ch社ExpressHyb Hybridization Solution（#8015）を用
い、65℃で一晩行なった。洗浄は1% SDSを含む2×SSC溶
液にて65℃、30分間を４回繰り返し行ない、その後、0.
5% SDSを含む0.1×SSC溶液にて65℃、30分間、最後に2
×SSC溶液にて室温で５分間、行なった。
ham Pharmacia Biotech社、#PB10205）および同社MegaP
rime DNA Labelling System（#RPN1606）を用い、同社
プロトコールに従って標識した。この標識プローブと、
Matched Tumor/Normal Expression Array及びBlood Dis
ease Profiling Arrayを用い、サザン・ハイブリダイゼ
ーションを行なった。ハイブリダイゼーションはClonte
ch社ExpressHyb Hybridization Solution（#8015）を用
い、65℃で一晩行なった。洗浄は1% SDSを含む2×SSC溶
液にて65℃、30分間を４回繰り返し行ない、その後、0.
5% SDSを含む0.1×SSC溶液にて65℃、30分間、最後に2
×SSC溶液にて室温で５分間、行なった。
【００３４】上記の実験の結果を図１に示す。また、こ
れらの結果のうち、腎臓、大腸、及び前立腺の結果を抽
出して図２に示す。これらの図に示されるように、特に
腎臓癌および大腸癌患者の大多数において、癌組織にお
けるDEDD2遺伝子の発現が正常組織における発現より低
いことが明らかである。詳細には、腎臓癌の症例１４例
中２例を除き、また、大腸癌の症例１１例中１例を除
き、この差が認められた。その他、少数の症例ではある
が、前立腺癌においても同様の差が認められた。また、
血液腫瘍患者検体についての結果を図３に示す。この図
に示されるように、急性骨髄性白血病及び慢性骨髄性白
血病患者の大多数において、特に、白血球全体を正常ド
ナーと比較した場合、著しくDEDD2遺伝子の発現が低い
ことが明らかである。癌組織と正常組織での発現の差が
あるとする報告は、DEDD2と類似の構造を持つDEDDでは
これまでに無いものである。
れらの結果のうち、腎臓、大腸、及び前立腺の結果を抽
出して図２に示す。これらの図に示されるように、特に
腎臓癌および大腸癌患者の大多数において、癌組織にお
けるDEDD2遺伝子の発現が正常組織における発現より低
いことが明らかである。詳細には、腎臓癌の症例１４例
中２例を除き、また、大腸癌の症例１１例中１例を除
き、この差が認められた。その他、少数の症例ではある
が、前立腺癌においても同様の差が認められた。また、
血液腫瘍患者検体についての結果を図３に示す。この図
に示されるように、急性骨髄性白血病及び慢性骨髄性白
血病患者の大多数において、特に、白血球全体を正常ド
ナーと比較した場合、著しくDEDD2遺伝子の発現が低い
ことが明らかである。癌組織と正常組織での発現の差が
あるとする報告は、DEDD2と類似の構造を持つDEDDでは
これまでに無いものである。
【００３５】上記の実験結果より、DEDD2遺伝子は癌、
特に腎臓癌、大腸癌および前立腺癌、又は白血病、特に
急性骨髄性白血病及び慢性骨髄性白血病の診断に有用と
考えられる。また、DEDD2遺伝子は、これら癌の治療に
おいても、その遺伝子配列を組み込んだベクターによる
遺伝子治療を行なう上で有用であると考えられる。
特に腎臓癌、大腸癌および前立腺癌、又は白血病、特に
急性骨髄性白血病及び慢性骨髄性白血病の診断に有用と
考えられる。また、DEDD2遺伝子は、これら癌の治療に
おいても、その遺伝子配列を組み込んだベクターによる
遺伝子治療を行なう上で有用であると考えられる。
【００３６】
【発明の効果】本発明により、細胞死を誘導する活性を
有する新規蛋白質DEDD2、及びそれをコードするＤＮＡ
が提供される。DEDD2及びそれをコードするＤＮＡは、
腎臓癌、大腸癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病又は慢性
骨髄性白血病の治療及び診断に有用である。
有する新規蛋白質DEDD2、及びそれをコードするＤＮＡ
が提供される。DEDD2及びそれをコードするＤＮＡは、
腎臓癌、大腸癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病又は慢性
骨髄性白血病の治療及び診断に有用である。
【００３７】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
【００３８】
<110> Morinaga Milk Industry Co., Ltd.
<120> A novel gene useful for diagnosis of cancers and its use
<130> P-B0014
<140>
<141> 2002-07-18
<150> JP 2001-387854
<151> 2001-12-20
<160> 10
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 981
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(981)
<400> 1
atg gcg cta tcc ggg tcg acc ccg gcc ccg tgc tgg gag gag gat gag 48
Met Ala Leu Ser Gly Ser Thr Pro Ala Pro Cys Trp Glu Glu Asp Glu
1 5 10 15
tgc ctg gac tac tac ggg atg ctg tcg ctt cac cgt atg ttc gag gtg 96
Cys Leu Asp Tyr Tyr Gly Met Leu Ser Leu His Arg Met Phe Glu Val
20 25 30
gtg ggc ggg caa ctg acc gag tgc gag ctg gag ctc ctg gcc ttt ctg 144
Val Gly Gly Gln Leu Thr Glu Cys Glu Leu Glu Leu Leu Ala Phe Leu
35 40 45
ctg gat gag gct cct ggc gcc gcc gga ggc tta gcc cgg gcc cgc agc 192
Leu Asp Glu Ala Pro Gly Ala Ala Gly Gly Leu Ala Arg Ala Arg Ser
50 55 60
ggc cta gag ctc ctg ctg gag ctg gag cgc cgc ggg cag tgc gac gag 240
Gly Leu Glu Leu Leu Leu Glu Leu Glu Arg Arg Gly Gln Cys Asp Glu
65 70 75 80
agc aac ctg cgg ctg ctg ggg caa ctc ctg cgc gtg ctg gcc cgc cac 288
Ser Asn Leu Arg Leu Leu Gly Gln Leu Leu Arg Val Leu Ala Arg His
85 90 95
gac ctg ctg ccg cac ctg gcg cgc aag cgg cgc cgg cca gtg tct cca 336
Asp Leu Leu Pro His Leu Ala Arg Lys Arg Arg Arg Pro Val Ser Pro
100 105 110
gaa cgc tat agc tat ggc acc tcc agc tct tca aag agg aca gag ggt 384
Glu Arg Tyr Ser Tyr Gly Thr Ser Ser Ser Ser Lys Arg Thr Glu Gly
115 120 125
agc tgc cgt cgc cgt cgg cag tca agc agt tct gca aat tct cag cag 432
Ser Cys Arg Arg Arg Arg Gln Ser Ser Ser Ser Ala Asn Ser Gln Gln
130 135 140
ggt cag tgg gag aca ggc tcc ccc cca acc aag cgg cag cgg cgg agt 480
Gly Gln Trp Glu Thr Gly Ser Pro Pro Thr Lys Arg Gln Arg Arg Ser
145 150 155 160
cgg ggc cgg ccc agt ggt ggt gcc aga cgg cgg cgg aga ggg gcc cca 528
Arg Gly Arg Pro Ser Gly Gly Ala Arg Arg Arg Arg Arg Gly Ala Pro
165 170 175
gcc gca ccc cag cag cag tca gag ccc gcc aga cct tcc tct gaa ggc 576
Ala Ala Pro Gln Gln Gln Ser Glu Pro Ala Arg Pro Ser Ser Glu Gly
180 185 190
aaa gtg acc tgt gac atc cgg ctc cgg gtt cga gca gag tac tgc gag 624
Lys Val Thr Cys Asp Ile Arg Leu Arg Val Arg Ala Glu Tyr Cys Glu
195 200 205
cat ggg cca gcc ttg gag cag ggc gtg gca tcc cgg cgg ccc cag gcg 672
His Gly Pro Ala Leu Glu Gln Gly Val Ala Ser Arg Arg Pro Gln Ala
210 215 220
ctg gcg cgg cag ctg gac gtg ttt ggg cag gcc acc gca gtg ctg cgc 720
Leu Ala Arg Gln Leu Asp Val Phe Gly Gln Ala Thr Ala Val Leu Arg
225 230 235 240
tca agg gac ctg ggc tct gtg gtt tgt gac atc aag ttc tca gag ctc 768
Ser Arg Asp Leu Gly Ser Val Val Cys Asp Ile Lys Phe Ser Glu Leu
245 250 255
tcc tat ctg gac gcc ttc tgg ggc gac tac ctg agt ggc gcc ctg ctg 816
Ser Tyr Leu Asp Ala Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Ser Gly Ala Leu Leu
260 265 270
cag gcc ctg cgg ggc gtg ttc ctg act gag gcc ctg cga gag gct gtg 864
Gln Ala Leu Arg Gly Val Phe Leu Thr Glu Ala Leu Arg Glu Ala Val
275 280 285
ggc cgg gag gct gtt cgc ctg ctg gtc agt gtg gat gag gct gac tat 912
Gly Arg Glu Ala Val Arg Leu Leu Val Ser Val Asp Glu Ala Asp Tyr
290 295 300
gag gct ggc cgg cgc cgc ctg ttg ctg atg gag gag gaa ggg ggg cgg 960
Glu Ala Gly Arg Arg Arg Leu Leu Leu Met Glu Glu Glu Gly Gly Arg
305 310 315 320
cgc ccg aca gag gcc tcc tga 981
Arg Pro Thr Glu Ala Ser
325
<210> 2
<211> 326
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Ala Leu Ser Gly Ser Thr Pro Ala Pro Cys Trp Glu Glu Asp Glu
1 5 10 15
Cys Leu Asp Tyr Tyr Gly Met Leu Ser Leu His Arg Met Phe Glu Val
20 25 30
Val Gly Gly Gln Leu Thr Glu Cys Glu Leu Glu Leu Leu Ala Phe Leu
35 40 45
Leu Asp Glu Ala Pro Gly Ala Ala Gly Gly Leu Ala Arg Ala Arg Ser
50 55 60
Gly Leu Glu Leu Leu Leu Glu Leu Glu Arg Arg Gly Gln Cys Asp Glu
65 70 75 80
Ser Asn Leu Arg Leu Leu Gly Gln Leu Leu Arg Val Leu Ala Arg His
85 90 95
Asp Leu Leu Pro His Leu Ala Arg Lys Arg Arg Arg Pro Val Ser Pro
100 105 110
Glu Arg Tyr Ser Tyr Gly Thr Ser Ser Ser Ser Lys Arg Thr Glu Gly
115 120 125
Ser Cys Arg Arg Arg Arg Gln Ser Ser Ser Ser Ala Asn Ser Gln Gln
130 135 140
Gly Gln Trp Glu Thr Gly Ser Pro Pro Thr Lys Arg Gln Arg Arg Ser
145 150 155 160
Arg Gly Arg Pro Ser Gly Gly Ala Arg Arg Arg Arg Arg Gly Ala Pro
165 170 175
Ala Ala Pro Gln Gln Gln Ser Glu Pro Ala Arg Pro Ser Ser Glu Gly
180 185 190
Lys Val Thr Cys Asp Ile Arg Leu Arg Val Arg Ala Glu Tyr Cys Glu
195 200 205
His Gly Pro Ala Leu Glu Gln Gly Val Ala Ser Arg Arg Pro Gln Ala
210 215 220
Leu Ala Arg Gln Leu Asp Val Phe Gly Gln Ala Thr Ala Val Leu Arg
225 230 235 240
Ser Arg Asp Leu Gly Ser Val Val Cys Asp Ile Lys Phe Ser Glu Leu
245 250 255
Ser Tyr Leu Asp Ala Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Ser Gly Ala Leu Leu
260 265 270
Gln Ala Leu Arg Gly Val Phe Leu Thr Glu Ala Leu Arg Glu Ala Val
275 280 285
Gly Arg Glu Ala Val Arg Leu Leu Val Ser Val Asp Glu Ala Asp Tyr
290 295 300
Glu Ala Gly Arg Arg Arg Leu Leu Leu Met Glu Glu Glu Gly Gly Arg
305 310 315 320
Arg Pro Thr Glu Ala Ser
325
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : an artificially synthesized
primer sequence
<400> 3
gcctgtacgg aagtgttact 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : an artificially synthesized
primer sequence
<400> 4
tgtgggaggt tttttctcta 20
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : an artificially synthesized
primer sequence
<400> 5
ccggccagtg tctccagaac gctat 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : an artificially synthesized
primer sequence
<400> 6
cagtgtgagc atgagcgagt gtgtg 25
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : an artificially synthesized
primer sequence
<400> 7
gcttgttccg cctccctccc ccg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : an artificially synthesized
primer sequence
<400> 8
gtggcccgga gacttggagg tgg 23
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : an artificially synthesized
primer sequence
<400> 9
gcttgttccg cctccctccc ccggga 25
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : an artificially synthesized
primer sequence
<400> 10
tccaggactg gcaggattga tcccacctcc aagtctccgg gccac 45
【図１】 DNAアレイを用いた癌組織におけるDEDD2の発
現の結果を示すオートラジオグラフ（写真）。normal：
正常、tumor：腫瘍、kidney：腎臓、breast：乳房、pro
state：前立腺、uterus：子宮、ovary：卵巣、cervix：
子宮頸、colon：大腸、lung：肺、stomach：胃、rectu
m：直腸
現の結果を示すオートラジオグラフ（写真）。normal：
正常、tumor：腫瘍、kidney：腎臓、breast：乳房、pro
state：前立腺、uterus：子宮、ovary：卵巣、cervix：
子宮頸、colon：大腸、lung：肺、stomach：胃、rectu
m：直腸
【図２】 図１に示す結果のうち、腎臓、大腸、及び前
立腺の結果のみを示すオートラジオグラフ（写真）。
立腺の結果のみを示すオートラジオグラフ（写真）。
【図３】 DNAアレイを用いた血液腫瘍患者由来血液細
胞画分におけるDEDD2の発現の結果を示すオートラジオ
グラフ（写真）。Normal donor：正常ドナー、von Will
ebrand disease：von Willebrand病、AML：急性骨髄性
白血病、CML：慢性骨髄性白血病、Hodgkin's disease：
ホジキン病、non-Hodgkin's disease：非ホジキン病。C
D14-positive cells：CD14抗原発現細胞、CD19-positiv
e cells：CD19抗原発現細胞、CD3-positive cells：CD3
抗原発現細胞、mononuclear cells：単核細胞、polymor
phonuclear cells：多形核細胞、total leukocytes：白
血球全体。XはcDNAがスポットされていない箇所を示
す。
胞画分におけるDEDD2の発現の結果を示すオートラジオ
グラフ（写真）。Normal donor：正常ドナー、von Will
ebrand disease：von Willebrand病、AML：急性骨髄性
白血病、CML：慢性骨髄性白血病、Hodgkin's disease：
ホジキン病、non-Hodgkin's disease：非ホジキン病。C
D14-positive cells：CD14抗原発現細胞、CD19-positiv
e cells：CD19抗原発現細胞、CD3-positive cells：CD3
抗原発現細胞、mononuclear cells：単核細胞、polymor
phonuclear cells：多形核細胞、total leukocytes：白
血球全体。XはcDNAがスポットされていない箇所を示
す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 野間口 光治
神奈川県座間市東原五丁目１番83号 森永
乳業株式会社生物科学研究所内
(72)発明者 山田 宗夫
神奈川県座間市東原五丁目１番83号 森永
乳業株式会社生物科学研究所内
(72)発明者 早澤 宏紀
神奈川県座間市東原五丁目１番83号 森永
乳業株式会社生物科学研究所内
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA06
EA04 GA11 HA01 HA14
4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA22
CA53 DC50 ZB262 ZB272
Claims (11)
- 【請求項１】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示す蛋白質をコ
ードするＤＮＡ。 （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質。 （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若し
くは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含む
アミノ酸配列を含み、かつ、細胞死を誘導する活性を有
する蛋白質。 - 【請求項２】 下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであ
る請求項１記載のＤＮＡ。 （ａ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞
死を誘導する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。 - 【請求項３】 配列番号１に記載の塩基配列又はその部
分配列を含み、配列番号１に記載の塩基配列に対応する
遺伝子の存在又は発現を調べるためのＰＣＲ用プライマ
ー又はハイブリダイゼーション用プローブとして使用さ
れるＤＮＡ。 - 【請求項４】 腎臓癌、大腸癌、又は前立腺癌の診断に
用いられる請求項３記載のＤＮＡ。 - 【請求項５】 急性骨髄性白血病又は慢性骨髄性白血病
の診断に用いられる請求項３記載のＤＮＡ。 - 【請求項６】 配列番号７に記載の塩基配列を有するＤ
ＮＡ、及び配列番号８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
のセットからなる、請求項３又は４に記載のＤＮＡ。 - 【請求項７】 配列番号１に示すアミノ酸配列をコード
するＤＮＡを含み、腎臓癌、大腸癌、又は前立腺癌の治
療に用いられる遺伝子治療用医薬。 - 【請求項８】 配列番号１に示すアミノ酸配列をコード
するＤＮＡを含み、急性骨髄性白血病又は慢性骨髄性白
血病の治療に用いられる遺伝子治療用医薬。 - 【請求項９】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示す蛋白質また
はその塩を含有する医薬。 （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質。 （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若し
くは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含む
アミノ酸配列を含み、かつ、細胞死を誘導する活性を有
する蛋白質。 - 【請求項１０】 腎臓癌、大腸癌、又は前立腺癌の治療
に用いられる請求項９記載の医薬。 - 【請求項１１】 急性骨髄性白血病又は慢性骨髄性白血
病の治療に用いられる請求項９記載の医薬。
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|---|---|---|---|
| JP2002209458A JP3877653B2 (ja) | 2001-12-20 | 2002-07-18 | 癌の診断に有用な新規遺伝子及びその用途 |
| PCT/JP2002/013371 WO2003054195A1 (fr) | 2001-12-20 | 2002-12-20 | Nouveau gene utile dans le diagnostic du cancer, et utilisation du gene |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001387854 | 2001-12-20 | ||
| JP2001-387854 | 2001-12-20 | ||
| JP2002209458A JP3877653B2 (ja) | 2001-12-20 | 2002-07-18 | 癌の診断に有用な新規遺伝子及びその用途 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003245085A true JP2003245085A (ja) | 2003-09-02 |
| JP2003245085A5 JP2003245085A5 (ja) | 2005-04-07 |
| JP3877653B2 JP3877653B2 (ja) | 2007-02-07 |
Family
ID=26625183
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2002209458A Expired - Fee Related JP3877653B2 (ja) | 2001-12-20 | 2002-07-18 | 癌の診断に有用な新規遺伝子及びその用途 |
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| WO (1) | WO2003054195A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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Family Cites Families (3)
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|---|---|---|---|---|
| AU3528400A (en) * | 1999-03-24 | 2000-10-09 | Human Genome Sciences, Inc. | Apoptosis related genes |
| EP1197554A4 (en) * | 1999-07-08 | 2005-02-09 | Mochida Pharm Co Ltd | PROLIFERATION DIFFERENTIATION FACTOR |
| WO2001092527A2 (en) * | 2000-06-01 | 2001-12-06 | Incyte Genomics, Inc. | Regulators of apoptosis |
-
2002
- 2002-07-18 JP JP2002209458A patent/JP3877653B2/ja not_active Expired - Fee Related
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|---|---|
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