JP2023537858A

JP2023537858A - ５’ｓ／ｍａｒの適用

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Publication number: JP2023537858A
Application number: JP2023504459A
Authority: JP
Inventors: ハーボトル，リチャード; ボッツァ，マティアス
Original assignee: ドイチェスクレブスフォルシュンクスツェントルム
Priority date: 2020-07-22
Filing date: 2021-07-21
Publication date: 2023-09-06
Also published as: CA3186837A1; KR20230041741A; CN116209767A; US20230293690A1; IL300077A; EP4185692A1; MX2023000951A; WO2022018143A1; AU2021311027A1

Abstract

本発明は、プロモーター及び発現可能な配列を含むエピソームポリヌクレオチドを含む治療用細胞であって、前記エピソームポリヌクレオチドは、前記プロモーターの上流にS/MAR要素をさらに含む、治療用細胞に関する。本発明はさらに、それに関連する、発現構築物、ポリヌクレオチド、動物宿主細胞、発現構築物、ベクター、及び/又はカーゴ配列を含むポリヌクレオチドに関する。【選択図】なし

Description

本発明は、プロモーター及び発現可能な配列を含むエピソームポリヌクレオチドを含む治療用細胞であって、前記エピソームポリヌクレオチドは、前記プロモーターの上流にS/MAR要素をさらに含む、治療用細胞に関する。本発明はさらに、それに関連する、発現構築物、ポリヌクレオチド、動物宿主細胞、発現構築物、ベクター、及び/又はカーゴ配列を含むポリヌクレオチドに関する。

細胞の遺伝子改変は、科学的目的のために現代の細胞培養において日常的に使用される。しかし、遺伝子の突然変異によって引き起こされる遺伝性疾患の治療における対応する技術の使用は、非常に望ましいものではあるが、利用可能な方法が、通常、一過性トランスフェクションプロトコールなど、一過性の改変を提供するにすぎないのに対し、細胞の安定した改変を提供する方法が、通常、宿主細胞のゲノムへの導入遺伝子の組み込みに依存するという問題によって依然として妨げられている。しかし、導入遺伝子の組み込みは、特定の座位を標的としたとしても、有害な突然変異を誘発するリスクを負い、これは、治療の副作用として、例えばがんをもたらす可能性がある。

足場/マトリックス付着領域(S/MAR)は、足場付着領域(SAR)又はマトリックス結合領域(MAR)としても知られているが、核マトリックスの付着を媒介する真核生物のゲノム中の配列として知られている。さらに、S/MAR配列は、凝縮クロマチンドメインの転写活性領域への拡張、及び遠位エンハンサーのプロモーターとの相互作用を防止する、インスレーター特性を有することが見出された(Yusufzai & Felsenfeld (2004), PNAS 101(23), 8620)。S/MARは、ATリッチな配列であり、いくつかのATリッチなモチーフは、さらに濃縮されることが見出された(Liebeich et al. (2002), NAR 30(15): 3433)。植物では、S/MAR要素は、隣接遺伝子の発現と関連があることが見出された(Geest et al. (2004), Plant Biotech J 2:13)。

例えばUS 6,410,314 B1及びHaase et al. (2010), BMC Biotechnology 10:20において、様々なベクターが、S/MARモチーフに基づき、細胞における安定した維持のために提案されている。S/MAR要素への転写は、対応するベクターの安定した維持に不可欠であることが見出された(Rupprecht et al. (2010), Gene 466(1-2):36)。例えばWO 2019/057773 A1、WO 2019/057774 A1、及びWO 2019/060253 A1において、転写単位の一部としてのS/MAR配列、すなわち、プロモーターの下流のS/MAR配列が提案された。S/MARベクターの複製に影響を与えるエピジェネティック効果が特定された(Haase et al.(2013), PLOS One 8(11):e79262)。

US 6,410,314 B1 WO 2019/057773 A1 WO 2019/057774 A1 WO 2019/060253 A1

Yusufzai & Felsenfeld (2004), PNAS 101(23), 8620 Liebeich et al. (2002), NAR 30(15): 3433 Geest et al. (2004), Plant Biotech J 2:13 Haase et al. (2010), BMC Biotechnology 10:20 Rupprecht et al. (2010), Gene 466(1-2):36 Haase et al.(2013), PLOS One 8(11):e79262

それにもかかわらず、細胞の安定した改変に使用するために、例えば、遺伝子療法のために十分に安定した、改善されたS/MARベースのベクターは、依然として望ましい。

したがって、本発明は、プロモーター及び発現可能な配列を含むエピソームポリヌクレオチドを含む治療用細胞であって、前記エピソームポリヌクレオチドは、前記プロモーターの上流にS/MAR要素をさらに含む、治療用細胞に関する。

S/MAR構築物を用いたコロニー形成アッセイ; 1=GFP-β-インターフェロンMAR、2=Mar1(配列番号5)-GFP、3=Mar2(配列番号3)-GFP、4=Mar3(配列番号6)-GFP、5=Mar4(配列番号7)-GFP; y軸: 耐性コロニーの数。導入遺伝子発現(GFP+)細胞の数、及び様々な構築物を保有する細胞集団の中間蛍光強度(MFI); 1=非改変細胞、2=GFP-β-インターフェロンMAR、3=Mar2-GFP。サザンブロットによるエピソーム複製の検出; a=Mar2-GFP対照ベクター、b=Mar2-GFPを用いて樹立されたHek293Tから抽出された全DNA; GFP遺伝子が検出された。 Mar2のnt220～382(1、配列番号1)、Mar2のnt40～110(2、配列番号2)、及びMar2(3、配列番号3)の核酸配列。

一般に、本明細書で使用される用語は、当業者にとってそれらの通常の及び慣習的な意味を与えられるべきであり、他に指示がない限り、特別な又はカスタマイズされた意味に限定されるべきではない。以下に使用される場合、用語「有する」、「含む(comprise)」若しくは「含む(include)」、又はそれらの任意の文法上の変形は、非排他的様式で使用される。したがって、これらの用語は、これらの用語によって導入される特徴以外に、この文脈で記載される実在物にさらなる特徴が存在しない状況、及び1つ以上のさらなる特徴が存在する状況の両方を指し得る。例として、表現「AはBを有する」、「AはBを含む(comprise)」及び「AはBを含む(include)」は、B以外に、Aに他の要素が存在しない状況(すなわち、Aが唯一及び排他的にBからなる状況)、及びB以外に、1つ以上のさらなる要素、例えば要素C、要素CとD、又はさらなる要素が実在物Aに存在する状況の両方を指し得る。また、当業者によって理解されるように、表現「～を含む(comprising a)」及び「～を含む(comprising an)」は、好ましくは、「1つ以上の～を含む(comprising one or more)」を指し、すなわち、「少なくとも1つの～を含む(comprising at least one)」と同等である。

さらに、以下に使用される場合、用語「好ましくは」、「より好ましくは」、「最も好ましくは」、「特に」、「より特に」、「具体的に」、「より具体的に」又は同様の用語は、さらなる可能性を制限することなしに、任意選択の特徴とともに使用される。したがって、これらの用語によって導入される特徴は、任意選択の特徴であり、決して特許請求の範囲を制限することを意図するものではない。本発明は、当業者が認識するように、代替の特徴を使用することによって実施してもよい。同様に、「一実施形態において」又は同様の表現によって導入される特徴は、本発明のさらなる実施形態に関するいずれの制限もなしに、本発明の範囲に関するいずれの制限もなしに、及びこの方法で導入される特徴を本発明の他の任意選択の又は非任意選択の特徴と組み合わせる可能性に関するいずれの制限もなしに、任意選択の特徴であることが意図される。

本明細書で使用される場合、用語「標準条件」は、他に記載がない場合、IUPAC標準周囲温度及び圧力(SATP)条件、すなわち、好ましくは25℃の温度及び100kPaの絶対圧力に関する; また好ましくは、標準条件は、pH7を含む。さらに、他に指示がない場合、用語「約」は、関連分野で一般に受け入れられている技術的な正確さを有する、示される値に関し、好ましくは示される値±20%、より好ましくは±10%、最も好ましくは±5%に関する。さらに、用語「本質的に」は、示される結果又は使用に影響を与える逸脱がないこと、すなわち、可能性のある逸脱が、示される結果を±20%、より好ましくは±10%、最も好ましくは±5%を超えて逸脱させないことを示す。したがって、「～から本質的になる」は、特定される成分を含むが、不純物として存在する物質、成分を提供するために使用されたプロセスの結果として存在する避けられない物質、及び本発明の技術的効果を達成すること以外の目的で添加された成分、以外の他の成分を含まないことを意味する。例えば、句「～から本質的になる」を用いて定義される組成物は、任意の公知の許容可能な添加剤、賦形剤、希釈剤、担体などを包含する。好ましくは、一組の成分から本質的になる組成物は、5重量%未満、より好ましくは3重量%未満、さらにより好ましくは1重量%未満、最も好ましくは0.1重量%未満の不特定成分(複数可)を含む。

2つの生物学的配列、好ましくはDNA、RNA、又はアミノ酸配列間の同一性の程度(例えば、「同一性%」として表される)は、当技術分野において周知のアルゴリズムによって決定することができる。好ましくは、同一性の程度は、比較ウィンドウにわたって2つの最適にアライメントされた配列を比較することによって決定され、比較ウィンドウ中の配列の断片は、最適なアライメントのためにそれが比較された配列と比較して、付加又は欠失(例えば、ギャップ又はオーバーハング)を含み得る。パーセンテージは、好ましくはポリヌクレオチド又はポリペプチドの全長にわたって、両配列で同一の残基が生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の合計数で割り、その結果に100を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。比較のための配列の最適なアライメントは、Smith and Waterman (1981)のローカルホモロジーアルゴリズムによって、Needleman and Wunsch (1970)のホモロジーアライメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman (1988)の類似性探索法(search for similarity method)によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ式実施法(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WIにおけるGAP、BESTFIT、BLAST、PASTA、及びTFASTA)によって、又は目視検査によって実施してもよい。比較のために2つの配列が同定されたら、それらの最適なアライメント、及びしたがって同一性の程度を決定するために、GAP及びBESTFITを用いるのが好ましい。好ましくは、ギャップウェイトについて5.00及びギャップウェイト長について0.30のデフォルト値が使用される。本明細書で言及される生物学的配列の文脈において、用語「本質的に同一」は、少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性%の値を示す。理解されるように、本質的に同一という用語は、100%の同一性を含む。前述のことは、必要な変更を加えて、用語「本質的に相補的」に適用される。同様に理解されるように、少なくとも98%という表現は、98%から100%まで(100%を含む)の全範囲を含む。

生体高分子の、好ましくはポリヌクレオチド又はポリペプチドの「断片」という用語は、示される配列、構造及び/又は機能を含むそれぞれの生体高分子の任意のサブパート、好ましくはサブドメインに関連する広い意味で本明細書では使用される。したがって、この用語は、生体高分子の実際の断片化によって生成されるサブパートだけでなく、抽象的な方法で、例えばインシリコ(in silico)でそれぞれの生体高分子から導出されるサブパートも含む。したがって、本明細書で使用される場合、Fc又はFab断片だけでなく、例えば単鎖抗体、二重特異性抗体、及びナノボディも、免疫グロブリンの断片と呼ばれ得る。

本明細書で他に具体的に指示がない限り、特定される化合物は、より大きな構造に含まれてもよく、例えば、担体分子、遅延剤、及び他の賦形剤に共有結合又は非共有結合していてもよい。特に、ポリヌクレオチド又は発現構築物は、さらなる配列、例えば、好ましくは、(さらなる)選択可能なマーカー、例えば抗生物質耐性遺伝子、及び/又は前記配列を含むポリヌクレオチドの存在を検出可能にするマーカーポリペプチドをコードする配列、及び/又は細菌細胞での増殖を確実にする配列、例えば原核生物の複製起点、を含むポリヌクレオチドに含まれてもよい。したがって、ポリヌクレオチド又は発現構築物は、特にベクターに含まれてもよい。また、特定されるポリペプチドは、例えば精製及び/又は検出のためのペプチドタグとして、リンカーとして、又は化合物のインビボ(in vivo)半減期を延長するために役立ち得る、さらなるペプチドを含む融合ポリペプチドに含まれてもよい。用語「ペプチドタグ」は、ポリペプチドに付加又は導入される一続きのアミノ酸を指す; 好ましくは、タグは、本発明のポリペプチドのC末端又はN末端に付加される。前記一続きのアミノ酸は、好ましくは、タグを特異的に認識する抗体による融合ポリペプチドの検出を可能にする; 又はそれは、好ましくは、機能的コンフォメーションの形成を可能にする(例えばキレート剤); 又はそれは、好ましくは、可視化を可能にする(例えば蛍光タグの場合)。好ましい検出可能なタグは、Mycタグ、FLAGタグ、6-Hisタグ、HAタグ、GSTタグ又は蛍光タンパク質タグ、例えばGFPタグである。これらのタグはすべて当技術分野において周知である。融合ポリペプチドに含まれることが好ましい他のさらなるペプチドは、分泌のメディエーターとして、血液脳関門通過のメディエーターとして、細胞透過性ペプチドとして、及び/又は免疫刺激物質として役立ち得るさらなるアミノ酸又は他の改変を含む。ポリペプチドが融合され得るさらなるポリペプチド又はペプチドは、シグナル及び/又は輸送配列である。

用語「治療用細胞」は、本明細書で使用される場合、本明細書で以下に特定される発現構築物を含み、且つ疾患の治療及び/又は予防に適した生物学的活性を有する、すなわち、好ましくは前記疾患に罹患している対象に有効用量で投与された場合に疾患を改善及び/又は予防する生物学的活性を有する、本明細書で以下に特定される宿主細胞に関する。治療用細胞は、エピソームポリヌクレオチドを受け取り、安定にエピソームとして複製すること、及びエピソームポリヌクレオチド上に含まれる発現構築物を発現することが可能である、任意の細胞であってよい。治療用細胞は、原則として、そのレシピエントに対して異種、同種異系、同系、又は自己であってもよく、好ましくは同種異系、同系、又は自己であり、より好ましくはそのレシピエントに対して同種異系又は自己である。より好ましくは、治療用細胞は、そのレシピエントに対して同種異系であり、最も好ましくはそのレシピエントに対して自己である。好ましくは、治療用細胞は、本明細書の他の箇所で特定される対象の細胞であり、より好ましくは哺乳動物細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。治療用細胞は、原則として、意図された目的のために当業者によって適切であると考えられる任意の細胞、好ましくは体細胞であってもよい。したがって、治療用細胞は、血液細胞、ニューロン又はグリア細胞、皮膚細胞、筋肉細胞、粘膜細胞、臓器の細胞、例えば、肝細胞、膵臓細胞、肺細胞、腎細胞、網膜細胞、腸細胞など、結合組織細胞、又は骨細胞であってもよい。好ましくは、治療用細胞は、特に治療されるべき疾患が遺伝性疾患である場合、治療されるべき組織及び/又は臓器由来の細胞である; したがって、例えばコロイデレミア(Choroideremia)では、治療用細胞は、網膜細胞であってもよい。好ましくは、治療用細胞は、生殖系列細胞ではなく、特に卵母細胞又は精子又はそれらの前駆細胞ではない。好ましくは、治療用細胞は、好ましくは胚の破壊によって産生されない、幹細胞である; したがって、幹細胞は、好ましくは、樹立された幹細胞株又は体性幹細胞(成体幹細胞)由来の細胞である。好ましくは、治療用細胞は、全能性幹細胞ではない。好ましくは、治療用細胞は、多能性幹細胞(pluripotent stem cell)、マルチポテント幹細胞(multipotent stem cell)、又はオリゴポテント幹細胞(oligopotent stem cell)である。また好ましくは、治療用細胞は、血液細胞、特に免疫細胞、より好ましくはT細胞、B細胞、樹状細胞、単球、顆粒球、又は形質細胞、又は前述のいずれかの前駆細胞である。好ましくは、治療用細胞は、CD34+前駆細胞; CD61+血小板; CD19+Bリンパ球; CD14+単球; CD15+顆粒球; 好ましくはCD8及びCD45に対しても陽性の、CD3+細胞傷害性Tリンパ球; 好ましくはCD4及びCD45に対しても陽性の、CD3+ヘルパーTリンパ球; 好ましくはCD25及びCD45に対しても陽性の、CD3+活性化Tリンパ球、腫瘍浸潤リンパ球、又はナチュラルキラー(NK)細胞である。好ましくは、治療用細胞は、対象に投与するための細胞である。

用語「宿主細胞」は、本明細書で使用される場合、本明細書で特定されるエピソームポリヌクレオチド、発現構築物、ポリヌクレオチド、又はベクターを安定に染色体外で維持することが可能である任意の細胞に関する。したがって、エピソームポリヌクレオチド、発現構築物、ポリヌクレオチド、又はベクターは、真核細胞ではエピソームとして、及び/又は原核細胞ではプラスミドとして維持され得る。したがって、宿主細胞は、好ましくは細菌細胞であり、より好ましくは細菌の実験室株の細胞であり、より好ましくは大腸菌(Escherichia coli)細胞である。より好ましくは、宿主細胞は、真核細胞、好ましくは植物又は酵母細胞、例えばパン酵母の株の細胞であるか、又は動物細胞である。なおより好ましくは、宿主細胞は、動物細胞、好ましくは昆虫細胞又は哺乳動物細胞、特に家畜又はコンパニオンアニマル細胞、例えばニワトリ細胞、ガチョウ細胞、アヒル細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、ウシ細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、又はモルモット細胞である。さらにより好ましくは、宿主細胞は、ヒト細胞である。

用語「エピソームポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、特定される成分を有し、且つ宿主細胞中で、好ましくは治療用細胞中でエピソームとして複製する、より好ましくは安定にエピソームとして複製する、ポリヌクレオチドに関する。用語「エピソーム」複製は、原則として、細胞ゲノムに組み込まれることのない、すなわち細胞ゲノムに共有結合するようになることのない、ポリヌクレオチドの複製に関することが当業者に公知である。したがって、好ましくは、ポリヌクレオチドのエピソーム複製は、自律複製単位としての前記ポリヌクレオチドの複製である。好ましくは、エピソーム複製は、環状に閉じた二本鎖DNA分子の形態での宿主細胞中のポリヌクレオチドの維持である。当業者によって理解されるように、前記ポリヌクレオチドの実際の複製は、例えばローリングサークル複製において、他の形態を含み得る。環状DNAのエピソーム維持は、好ましくは、当業者に公知のプラスミドレスキュー処置によって、すなわち、好ましくは、宿主細胞の溶解物を調製し、それに含まれるDNAを適切な細菌細胞、例えば大腸菌(E. coli)細胞に形質転換することによって検証される; 前記方法によって入手可能な適切な数の細菌コロニーが、元の環状DNAと同じ制限パターン及び/又は配列を有するプラスミドとして環状DNAを含む場合、好ましくは、環状DNAが宿主細胞中でエピソームとして維持されたと想定される。エピソーム維持を検証するさらなる方法は、また当業者に公知であるが、DNA/DNAブロッティング(「サザンブロット」法)である; したがって、好ましくは、宿主細胞の全DNAを調製し、1種以上の制限酵素で消化する; 元のプラスミドをプローブとして使用するサザンブロットで、元のポリヌクレオチドDNAに対応するバンドのみが見える場合、好ましくは、プラスミドがエピソームとして維持されると結論付けられる。したがって、用語「エピソームとして複製する」は、本明細書で使用される場合、自律的に複製する実在物として細胞中にポリヌクレオチドが存在しながら、細胞複製サイクル中に宿主細胞中で前記ポリヌクレオチドの少なくとも2つのレプリカの産生を誘導する、ポリヌクレオチドの活性に関する; 安定なエピソーム複製は、少なくとも50回の細胞分裂後、好ましくは少なくとも100回の細胞分裂後、より好ましくは少なくとも250回の細胞分裂後、最も好ましくは少なくとも500回の細胞分裂後に、ポリヌクレオチドが宿主細胞中に依然として検出可能である程度までのエピソーム複製である。好ましくは、前述の細胞分裂数は、細胞の集団についての平均細胞分裂数である。好ましくは、エピソームポリヌクレオチドから、発現可能な配列と、プロモーターの配列及び/又はS/MAR要素の配列とを同時に含む転写産物は産生されない。

エピソームポリヌクレオチドは、5'-プロモーター-発現可能な配列-3'の順序で、少なくともプロモーター及び発現可能な配列、並びに前記プロモーターの上流にS/MAR要素を含む。したがって、順序は、5'-S/MAR要素-プロモーター-発現可能な配列-3'である。エピソームポリヌクレオチドのプロモーターは、発現可能な配列の発現を指示する; したがって、プロモーターの最後のヌクレオチドと発現可能な配列の最初のヌクレオチドとの間の距離は、好ましくは最大1kbp、より好ましくは最大500bp、さらにより好ましくは最大250bp、最も好ましくは最大100bpである。好ましくは、S/MAR要素の最後のヌクレオチドとプロモーターの最初のヌクレオチドとの間の距離は、最大5kbp、より好ましくは最大2kbp、さらにより好ましくは最大1kbp、なおより好ましくは最大500bp、最も好ましくは最大250bpである。好ましくは、(i)プロモーターと発現可能な配列との間、及び/又は(ii)S/MAR要素とプロモーターとの間に、(さらなる)発現可能な配列が介在しない。好ましくは、エピソームポリヌクレオチド上で、プロモーター及び発現可能な配列は、一緒になって真核生物発現構築物を形成する。エピソームポリヌクレオチドは、任意選択で、さらなる核酸配列、特に真核宿主細胞中での発現可能な配列の発現を調節する発現制御配列、さらなる発現可能な配列又は遺伝子、例えばマーカー遺伝子、追加のS/MAR配列、選択可能なマーカー遺伝子などを含んでもよい。発現可能な配列の発現は、好ましくは翻訳可能なmRNA又はノンコーディングRNAへの、発現可能な配列の転写を含む。真核細胞、好ましくは宿主細胞中での発現を確実にする調節要素は、当技術分野において周知である。それらは、好ましくは、転写の開始を確実にする調節配列、並びに任意選択で、転写の終結及び転写産物の安定化を確実にするポリAシグナルを含む。追加の調節要素は、転写エンハンサー及び翻訳エンハンサーを含み得る。真核宿主細胞中での発現を可能にする調節要素の例は、本明細書で以下に特定されるプロモーターに加えて、CMVエンハンサー、SV40エンハンサー、又は哺乳動物及び他の動物細胞におけるグロビンイントロンである。miRNA又はsiRNAの発現のために好ましい調節配列も当技術分野において公知である。さらに、誘導性又は細胞型特異的発現制御配列が、エピソームポリヌクレオチドに含まれてもよい。誘導性発現制御配列は、tet又はlacオペレーター配列、あるいは熱ショック又は他の環境因子若しくは宿主因子(好ましくはホルモン又はサイトカインである)によって誘導可能な配列を含んでもよい。適切な発現制御配列は、当技術分野において周知である。転写の開始を担う要素に加えて、調節要素はまた、ポリヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、例えばSV40-ポリA部位又はtk-ポリA部位を含んでもよい。本発明のエピソームポリヌクレオチドは、好ましくは、シミアンウイルス40(SV40)複製起点、ウシパピローマウイルス(BPV)複製起点、及びエプスタイン-バーウイルス(EBV)複製起点を欠いており、好ましくはポリオーマウイルス複製起点、パピローマウイルス複製起点、及びヘルペスウイルス複製起点を欠いており、より好ましくは真核生物感染性ウイルスの複製起点を欠いている。より好ましくは、エピソームポリヌクレオチドは、任意の公知の真核生物複製起点を欠いている。しかし、好ましくは、エピソームポリヌクレオチドは、原核生物、好ましくは細菌の複製起点、特に大腸菌(E. coli)複製起点をさらに含む。好ましくは、原核生物複製起点は、エピソームポリヌクレオチドに含まれる唯一の複製起点である。

用語「プロモーター」は、原則として、遺伝子の転写のレベルを、任意選択でさらなる調節要素と協調して、指示する遺伝的要素として当業者に公知である。プロモーターは、構成的であってもよく、すなわち、宿主細胞の状態とは本質的に独立した一定レベルの転写を提供してもよく、又は調節されてもよく、すなわち、宿主細胞の状態に依存して転写のレベルを提供してもよい。さらに、プロモーターは、細胞型及び/又は組織特異的であってもよく、すなわち、少数又は1つの細胞型のみにおいて検出可能なレベルの転写を提供してもよい。好ましくは、本発明によるプロモーターは、本明細書で上に特定される宿主細胞中で、より好ましくは本明細書で上に特定される治療用細胞中で活性である。当業者によって理解されるように、プロモーターの選択は、標的としようとする宿主細胞又は治療用細胞のタイプに依存し得る; 特定の細胞型に適したプロモーター及び構成的プロモーターは、当技術分野において公知である。好ましくは、プロモーターは、真核生物プロモーター、より好ましくは構成的真核生物プロモーター、さらにより好ましくは強力な真核生物プロモーターである。より好ましくは、プロモーターは、哺乳動物プロモーター、なおより好ましくはヒトプロモーターである。好ましくは、プロモーターは、EF1アルファ(伸長因子1アルファ)プロモーター、UbiC(ユビキチンC)プロモーター、ROSA26プロモーター、PGK(ホスホグリセリン酸キナーゼ)プロモーター、及び/又はCAG(ニワトリアルファ-アクチン)プロモーターであり、より好ましくはEF1アルファプロモーターである。また好ましくは、プロモーターは、細胞及び/又は組織特異的な真核生物プロモーターである。本明細書で使用される場合、プロモーターという用語は、上に特定されるプロモーターについて使用されるのに対し、発現構築物、ポリヌクレオチド、又はベクター上に潜在的にさらに存在する任意の他のプロモーターは、「二次プロモーター」と呼ばれる。したがって、好ましくは、プロモーターは、宿主細胞中でS/MAR配列から離れて転写を指示するプロモーターである; また好ましくは、S/MAR配列と発現可能な配列との間に介在しないプロモーター(例えば原核生物プロモーターである)、3'S/MAR配列のみを有し、且つ/又はS/MAR配列への転写を指示するプロモーターであるプロモーターは、二次プロモーターである。

用語「発現可能な配列」は、用語「発現可能な核酸配列」についての略称表現であり、宿主細胞によって、好ましくは治療用細胞によってそこから遺伝子産物を産生することができるそれぞれの任意の核酸配列に関することが当業者によって理解される。前記遺伝子産物は、好ましくはRNA又はポリペプチドであり、より好ましくはポリペプチドである。したがって、発現可能な配列は、好ましくはコード配列(より好ましくはオープンリーディングフレームを含む)である。好ましくは、発現可能な配列は、治療用遺伝子産物、すなわち治療用RNA又は治療用ポリペプチド、より好ましくは治療用ポリペプチドをコードする。

用語「治療用」は、治療用遺伝子産物、すなわち治療用RNA又は治療用ポリペプチドの文脈において本明細書で使用される場合、本明細書で以下に特定される疾患の治療及び/又は予防に寄与する遺伝子産物に関する。したがって、疾患の治療及び/又は予防に「寄与する」は、好ましくは有効用量で投与された場合に、統計的に有意な改善効果及び/又は予防効果をもたらすことに関することが好ましい。

好ましくは、治療用遺伝子産物は、治療用RNAであり、用語「治療用RNA」は、前記治療用RNAを含む宿主細胞の生理学的状態及び/又は代謝状態の変化を媒介する任意のRNAに関する。好ましくは、治療用RNAは、前記治療用RNAを含む宿主細胞の生理学的状態及び/又は代謝状態の変化を媒介し、それにより、好ましくは本明細書の他の箇所で特定される、疾患又は障害の改善又は治療に寄与する。治療用RNAは、本明細書で以下に特定される治療用ポリペプチドをコードするmRNA、又はそのサブユニット若しくは活性断片であってもよい。より好ましくは、治療用RNAは、ノンコーディングRNAである; ノンコーディングRNAは、当技術分野において広く知られており、特に、目的の遺伝子の発現を低減又は消失させるために使用される。したがって、好ましくは、治療用RNAは、干渉性のノンコーディングRNA、特にsiRNA、miRNA、アンチセンスRNA、又はリボザイムである。例えば遺伝子サイレンシングにおいて、使用するための干渉性核酸を設計するための手段及び方法は、当業者に公知である。標的遺伝子の発現を阻害するのに有効であると記載されるRNAについての要件も、当技術分野において公知である。治療用遺伝子産物はまた、ガイドRNA、すなわちCRISPR/Casヌクレアーゼを目的の標的遺伝子に導くために使用されるRNAであってもよい。治療用遺伝子産物はまた、標的遺伝子の発現を調節する調節ポリペプチドに対する追加の結合部位を提供することによって前記標的遺伝子の発現を調節する、デコイRNAであってもよい。さらに、治療用遺伝子産物はまた、miRNAであってもよく、これは、全体的な遺伝子調節を提供することが当技術分野において公知である。したがって、治療用RNAは、好ましくはsiRNA、shRNA、アンチセンスRNA、gRNA、リボザイム、デコイRNA、又はmiRNAであり、より好ましくはsiRNA、shRNA、又はアンチセンスRNAである。

より好ましくは、治療用遺伝子産物は、治療用ポリペプチドである。本明細書で使用される場合、用語「治療用ポリペプチド」は、前記治療用ポリペプチドを含む宿主細胞、及び/又は当該宿主細胞と直接若しくは流体接触している細胞(好ましくは体液を介して、より好ましくは血液、リンパ液、唾液、脳脊髄液、及び/又は間質液を介して)の生理学的状態及び/又は代謝状態の変化を媒介する任意のポリペプチドに関する。より好ましくは、治療用ポリペプチドは、宿主細胞及び/又は当該宿主細胞と直接若しくは流体接触している細胞の生理学的状態及び/又は代謝状態の変化を媒介し、それにより、好ましくは本明細書の他の箇所で特定される、疾患又は障害の改善又は治療に寄与するポリペプチドである。好ましくは、治療用ポリペプチドは、好ましくは本明細書で以下に特定される、抗体である。また好ましくは、治療用ポリペプチドは、T細胞受容体(TCR)、より好ましくはヒト又はキメラT細胞受容体、キメラ抗原受容体(CAR)、好ましくはMART1 TCR、サイトカイン、及び/又は本明細書の他の箇所で特定される遺伝性疾患により影響を受けた細胞中で欠けているポリペプチドである。好ましくは、CAR及び/又はT細胞受容体は、腫瘍抗原特異的である。したがって、例えば好ましくは、ポリヌクレオチドは、フェニルケトン尿症を治療するためのフェニルアラニン-ヒドロキシラーゼ活性(EC 1.14.16.1)を提供するポリペプチドをコードするか、又はコロイデレミアを治療するためのREP1遺伝子をコードするか、又はレーバー先天性黒内障を治療するためのRPE65遺伝子をコードするか、又は血友病を治療するための第VIII因子、第IX因子及び/若しくは第X因子をコードするか、又はアッシャー病(Ushers disease)を治療するためのUSH2a遺伝子をコードする、少なくとも1つの発現可能な構築物を含む。

用語「抗体」は、本明細書では最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体、少なくとも2つの無傷の抗体から形成される多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、単鎖抗体、単一ドメイン抗体(VHH)(ナノボディとしても知られている)、及び抗体断片(それらが所望の結合活性を示す限り)を包含する。好ましくは、抗体は、単鎖抗体又はVHH(ナノボディ)である。好ましくは、抗体は、治療用抗体であり、すなわち、疾患関連分子、好ましくは治療に関連するポリペプチドに対する結合活性を有し、前記疾患関連分子によって引き起こされるか又は悪化する疾患又は障害の治療に寄与する。「抗体断片」は、本明細書で関連する場合、その抗原結合領域を含む無傷の抗体の一部を含む。抗体断片の例としては、Fab、Fab'、F(ab')2、及びFv断片; ダイアボディ(diabody); 直鎖状抗体; 単鎖抗体分子; 及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化は、それぞれが単一の抗原結合部位を有する、「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗原結合断片、及び残りの「Fc」断片(その名称は容易に結晶化するその能力を反映する)を生成する。ペプシン処理は、2つの抗原結合部位を有し、且つ依然として抗原を交差結合することが可能である、F(ab')2断片を生じる。「Fv」は、完全な抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。好ましくは、二本鎖Fv種は、緊密な非共有結合での1つの重鎖可変ドメイン及び1つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。単鎖Fv(scFv)種では、1つの重鎖可変ドメイン及び1つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖及び重鎖が二本鎖Fv種のものに類似する「二量体」構造で結合することができるように、柔軟なペプチドリンカーによって共有結合することができる。この配置において、各可変ドメインの3つの超可変領域(HVR、相補性決定領域(CDR)とも呼ばれる)が相互作用して、抗原結合部位を規定する。集合的に、6つのHVRが、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に特異的なHVRを3つのみ含むFvの半分)でさえ、結合部位全体より低親和性ではあるが、抗原を認識し結合する能力を有する。用語「ダイアボディ」は、2つの抗原結合部位を有する抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖(VH-VL)中に軽鎖可変ドメイン(VL)に連結された重鎖可変ドメイン(VH)を含む。同じ鎖上の2つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは、強制的に別の鎖の相補的ドメインと対合し、2つの抗原結合部位を作り出す。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る。好ましくは、抗体は、抗腫瘍抗原抗体、より好ましくは抗腫瘍特異的抗原抗体、さらにより好ましくは抗がん胎児性抗原(CEA)抗体、なおより好ましくは単鎖抗CEA抗体である。

用語「治療する」及び「治療」は、本明細書で言及される疾患若しくは障害、又はそれに随伴する症状の有意な程度までの改善を指す。前記治療はまた、本明細書で使用される場合、本明細書で言及される疾患又は障害に関する健康の完全な回復を含む。治療することは、この用語が本明細書で使用される場合、治療されるべきすべての対象において有効であるわけではない可能性があることを理解されたい。しかし、この用語は、好ましくは、本明細書で言及される疾患又は障害に罹患している対象の統計的に有意な一部が、首尾よく治療され得ることを必要とするものである。一部が統計的に有意であるかどうかは、様々な周知の統計評価ツール、例えば、信頼区間の決定、p値の決定、スチューデントのt検定、マン-ホイットニー検定などを使用して、当業者によって、さらなる面倒なしに決定することができる。好ましい信頼区間は、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%である。p値は、好ましくは、0.1、0.05、0.01、0.005、又は0.0001である。好ましくは、治療は、所与のコホート又は集団の対象の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、又は少なくとも90%に対して有効であるものとする。当業者によって理解されるように、疾患、例えばがんの治療の有効性は、例えば病期及び病型を含む、様々な因子に依存している。好ましくは、がんを治療することは、対象において腫瘍負荷を低減させること、又は腫瘍負荷を一定に保つことである。したがって、好ましくは、治療することは、腫瘍の増殖を停止させる効果、より好ましくは腫瘍の退行を引き起こす効果、より好ましくは腫瘍を消散させる効果を有する。

用語「予防する」は、対象において一定期間、本明細書で言及される疾患又は障害に関して健康を維持することを指す。前記期間は、投与された薬物化合物の量、及び本明細書の他の箇所で論じられる対象の個々の因子に依存し得ることが理解される。予防は、本発明による化合物で治療されるすべての対象において有効であるわけではない可能性があることを理解されたい。しかし、この用語は、好ましくは、コホート又は集団の対象の統計的に有意な一部が、本明細書で言及される疾患若しくは障害又はその随伴症状に罹患することから効果的に防止されることを必要とする。好ましくは、通常なら、すなわち本発明による予防措置がなかったら、本明細書で言及される疾患又は障害を発症するであろう対象のコホート又は集団が、この文脈において想定される。一部が統計的に有意であるかどうかは、本明細書の他の箇所で論じられる様々な周知の統計評価ツールを使用して、当業者によって、さらなる面倒なしに決定することができる。

用語「S/MAR要素」は、名称「足場/マトリックス付着領域」でも知られているが、原則として、DNAへの真核細胞の核マトリックスの付着を媒介する前記DNAの配列に関することが当業者に公知である。S/MAR配列は、典型的には、真核生物染色体のDNA中の配列に由来する。様々なS/MAR配列が利用可能であり、配列は公開データベース、例えば、Liebich et al. (2002), Nucleic Acids Res. 30, 312-374に記載されるものから利用可能である。本発明によれば、前記S/MAR要素の核酸配列(「S/MAR配列」と呼ばれる)は、好ましくは、配列番号1と少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、なおより好ましくは少なくとも93%、なおより好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%同一である核酸配列を含み、且つ/又は配列番号2と少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、なおより好ましくは少なくとも93%、なおより好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%同一である核酸配列を含み、より好ましくは、配列番号1と少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、なおより好ましくは少なくとも93%、なおより好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%同一である核酸配列を含む。好ましくは、S/MAR要素は、配列番号3と少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、なおより好ましくは少なくとも93%、なおより好ましくは少なくとも95%、さらにより好ましくは少なくとも97%、さらにより好ましくは少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%同一である配列を含む。また好ましくは、S/MAR要素は、Genbank Acc番号AY220727.1(配列番号4)と少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、なおより好ましくは少なくとも93%、なおより好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%同一である配列を含む。

好ましくは、エピソームポリヌクレオチドは、特に選択可能なマーカーポリペプチドをコードする、選択可能なマーカー遺伝子を含むか、又はさらに含む。本明細書で使用される場合、用語「選択可能なマーカー遺伝子」は、表現「選択可能なマーカーポリペプチドをコードする発現可能なコード配列」の略称として使用される。用語「選択可能なマーカー」は、原則として当業者によって理解されており、宿主細胞中で発現された場合、適用された際に宿主細胞への選択圧を媒介する少なくとも1つの条件に対する耐性を付与する核酸配列に関する。選択可能なマーカーは、原核細胞及び真核細胞について当技術分野において公知である。好ましくは、選択可能なマーカーは、真核細胞の選択可能なマーカーである。好ましくは、選択可能なマーカーは、選択可能なマーカーポリペプチド、より好ましくは、宿主細胞から選択化合物を取り除くか、又はそれを不活性にするように前記選択化合物を改変する、トランスポーター活性及び/又は酵素活性を有する選択可能なマーカーポリペプチドである。好ましくは、選択可能なマーカーは、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ネオマイシン、及び/又はゼオシンに対する、より好ましくはピューロマイシンに対する耐性を媒介するマーカーである。したがって、好ましくは、エピソームポリヌクレオチドは、二次プロモーター及び選択可能なマーカーを含み、これらは一緒になって、例えばピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、又はゼオシン耐性遺伝子、より好ましくはピューロマイシン耐性遺伝子を構成する。しかし、選択可能なマーカー配列はまた、上に特定される発現可能な配列の一部であってもよく、選択可能なマーカー配列は、発現可能な配列であるか、発現可能な配列によってコードされる融合ポリペプチドの一部であるか、又は例えばリボソーム再エントリー部位によって、別個のポリペプチドとして発現される。好ましくは、選択可能なマーカーは、増殖条件の特定のセット、好ましくは増殖シグナルの存在及び/又は非存在、に対する耐性を提供するポリペプチドである。したがって、好ましい実施形態では、選択可能なマーカーは、T細胞受容体(TCR)又はキメラ抗原受容体(CAR)であり、これらはいずれも原則として当技術分野において公知であり、好ましくは本明細書の他の箇所で特定されるものである。好ましくは、TCR及び/又はCARは、好ましくはT細胞シグナル伝達が前記TCR及び/又はCARを含む宿主細胞中で誘導され得るような、既知の特異性を有する。好ましくは、この場合、宿主細胞は、T細胞又はNK細胞である。したがって、本明細書の他の箇所で特定されるプロモーター及び発現可能な配列は、一緒になって選択可能なマーカー遺伝子を構成してもよい。

有利なことに、本発明の基礎をなす研究において、プロモーター及び発現可能な配列を含むポリヌクレオチド(前記ポリヌクレオチドは、前記プロモーターの上流にS/MAR要素をさらに含む)は、真核細胞中でエピソームとして維持される、すなわち、宿主細胞のゲノムに組み込まれないことが見出された。したがって、本発明のエピソームポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、発現構築物の組み込まれたコピーを含む同等の宿主細胞よりも、遺伝的により明確に定義され、且つ/又は遺伝的により安定であり、このことは、意図しない遺伝子改変のリスクが低減されるため、本明細書に記載のこれらの宿主細胞を治療用細胞として特に好適なものにする。

上記の定義は、必要な変更を加えて、以下に適用される。以下でさらに行われる追加の定義及び説明も、必要な変更を加えて、本明細書に記載されるすべての実施形態に適用される。

本発明はまた、特に対象において免疫療法及び/又は遺伝性疾患の治療に使用するための、医薬として使用するための、本明細書で特定される治療用細胞に関する。

好ましくは、前述の使用は、有効用量の、本明細書で特定される治療用細胞及び/又は動物宿主細胞の対象への投与を含む; より好ましくは、免疫療法及び/又は遺伝性疾患の治療は、少なくとも10⁵個、好ましくは少なくとも10⁶個、より好ましくは少なくとも10⁷個の前記治療用細胞又は動物宿主細胞の対象への投与を含む。理解されるように、治療用細胞は、好ましくは前述の用量で、複数回、例えば好ましくは少なくとも2回、より好ましくは少なくとも3回、さらにより好ましくは少なくとも5回、最も好ましくは少なくとも10回投与してもよい。また好ましくは、前述の使用は、好ましくは前記対象の体内における、少なくとも1ヶ月、好ましくは少なくとも6ヶ月、より好ましくは少なくとも1年間の前記治療用細胞の維持を含み、用語「維持」は、検出可能な状態及び数における持続した存在に関する。

用語「対象」は、本明細書で使用される場合、動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物に、特にウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、及びヤギのような家畜に、又はラット、マウス、及びモルモットのような実験動物に関する。最も好ましくは、対象は、ヒトである。好ましくは、対象は、本明細書で関連のある疾患、好ましくはがん、自己免疫疾患、及び/又は遺伝性疾患に罹患するリスクがあるか、罹患することが予測されるか、又は罹患している。

用語「がん」は、本明細書で言及される場合、一群の体細胞(「がん細胞」)による制御されない増殖によって特徴付けられる、ヒトを含む動物の疾患を指す。この制御されない増殖は、がん細胞の塊(「腫瘍」)を形成する可能性があり、これは、周囲組織への侵入及び周囲組織の破壊(「浸潤」)、並びにことによると体内の他の場所へのがん細胞の拡散(「転移」)を伴う可能性がある。さらに、がんは、対象からがん細胞を見かけ上取り除く最初の処置の後に、がん細胞の再出現を伴い得る(「再発」)。本明細書で使用される場合、がん細胞という用語は、好ましくはがん幹細胞を含む。好ましくは、がんは、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質がん、エイズ関連リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星細胞腫、非定型奇形腫、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、脳幹神経膠腫、乳がん、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、小脳星細胞腫、子宮頸がん、脊索腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、子宮内膜がん、上衣芽細胞腫、上衣腫、食道がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、胆嚢がん、胃がん、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、有毛細胞性白血病、頭頸部がん、肝細胞がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、視床下部及び視路神経膠腫、眼内黒色腫、カポジ肉腫、喉頭がん、髄芽腫、髄上皮腫、黒色腫、メルケル細胞がん、中皮腫、口腔がん(mouth cancer)、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、鼻腔及び副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん(oral cancer)、口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、乳頭腫症、副鼻腔及び鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、セザリー症候群、皮膚がん、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮がん、扁平上皮性頸部がん(squamous neck cancer)、精巣がん、喉がん、胸腺がん、胸腺腫、甲状腺がん、尿道がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍からなるリストから選択される。

用語「自己免疫疾患」は、本明細書で使用される場合、対象の体内に通常存在する物質及び組織に対する前記対象の免疫系の異常な免疫応答から生じる疾患を指す。自己免疫は、生物全体に影響を与え得るか、特定の臓器に限定され得るか、又はことによると体の様々な場所において、特定の組織タイプに影響を与え得る。自己免疫疾患の診断は、個体の症状、身体検査の所見、及び実験室検査の結果に基づく。自己免疫疾患の典型的な検査は、当技術分野において公知であり、血液検査、尿検査、スワブ、診断検査、実験室検査、及び病理検査を含む。しかし、いくつかの自己免疫疾患は、特に疾患の初期段階では、診断が難しい可能性がある。好ましくは、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス(SLE)、サルコイドーシス、強皮症、関節リウマチ、1型真性糖尿病、自己免疫性甲状腺炎(例えば、橋本甲状腺炎)、アジソン病、及び多発性硬化症である。

用語「遺伝性疾患」は、本明細書で使用される場合、対象のゲノム中の1つ以上の改変、好ましくは突然変異と因果関係がある疾患に関する。したがって、好ましくは、遺伝性疾患は、1つ以上のエピジェネティックな変化と因果関係があり、より好ましくは、1つ以上の遺伝子突然変異と因果関係がある。理解されるように、遺伝性疾患の症状は、1つ以上の特定の組織及び/又は細胞型における、突然変異した遺伝子の発現によって、及び/又は遺伝子産物の正常な機能を提供する遺伝子の発現の欠如によって引き起こされることが多い。したがって、突然変異が疾患の一因となっている細胞のみで遺伝性疾患を治療することが好ましいかもしれない。好ましくは、遺伝性疾患は、一遺伝子性疾患であり、すなわち、1つの遺伝子における遺伝的変化によって引き起こされる。より好ましくは、遺伝性疾患は、一遺伝子性劣性疾患であり、すなわち、遺伝子の両アレルにおける遺伝的変化によって引き起こされる; したがって、好ましくは、症状の改善は、影響を受けた遺伝子の少なくとも1つの変化していないコピーの提供によって期待される。最も好ましくは、遺伝性疾患は、フェニルケトン尿症、アルカプトン尿症、レーバー先天性黒内障、コロイデレミア、又はシュタルガルト病である。好ましい実施形態では、遺伝性疾患は、がんである。

用語「免疫療法」は、本明細書で使用される場合、対象の免疫応答の調節による、疾患の、好ましくはがん及び/又は自己免疫疾患の治療及び/又は予防に関する。前記調節は、好ましくは本明細書で特定される治療用細胞、エピソームポリヌクレオチド、又は発現構築物の投与によって、前記免疫応答を誘発、増強、又は抑制することであり得る。前記免疫療法は、例えば、少なくとも1つのサイトカインの、及び/又は、例えばがん細胞を特異的に認識する少なくとも1つの抗体の投与をさらに含んでもよい。用語「細胞ベースの免疫療法」は、免疫細胞、例えばT細胞、好ましくは腫瘍特異的NK細胞の対象への適用を含む療法に関する。好ましくは、前記免疫細胞は、本明細書で上に特定される治療用細胞、特に、T細胞受容体、好ましくはCARをコードする発現可能な配列を含む治療用細胞である。

本発明はさらに、S/MAR要素を含むポリヌクレオチドであって、前記S/MAR要素は、配列番号3と少なくとも93%、好ましくは少なくとも95%同一である核酸配列を含む、ポリヌクレオチドに関する。

ポリヌクレオチドにおいて、S/MAR要素は、配列番号3と少なくとも93%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、さらにより好ましくは少なくとも97%、なおより好ましくは少なくとも98%、なおより好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは100%同一である核酸配列を含む。より好ましくは、S/MAR要素は、配列番号3と少なくとも93%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、さらにより好ましくは少なくとも97%、なおより好ましくは少なくとも98%、なおより好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは100%同一である核酸配列からなる。

好ましくは、S/MAR要素を含むポリヌクレオチドは、カーゴ配列をさらに含む。本明細書で使用される場合、用語「カーゴ配列」は、宿主細胞に導入されることが当業者にとって望ましいと考えられる任意の配列に関する。したがって、カーゴ配列は、遺伝子又はその一部を、好ましくはその天然の配置で含む核酸配列であり得る。したがって、カーゴ配列は、調節配列、例えばプロモーター、転写因子結合部位、終結部位、エンハンサーなどを含み得る。カーゴ配列はまた、遺伝子の天然のイントロン/エクソン構造を含み得る。好ましくは、カーゴ配列は、本明細書で上に特定される少なくとも発現可能な配列を、より好ましくは上流のプロモーターとともに含む。

本発明はまた、発現可能な配列及びプロモーターを含む発現構築物であって、前記発現構築物は、前記プロモーターの上流にS/MAR要素をさらに含み、前記発現構築物は、哺乳動物細胞中でエピソームとして複製する、発現構築物に関する。

用語「プロモーター」、「発現可能な配列」、「S/MAR要素」、及び「エピソーム複製」は、本明細書で上に定義されている。

本発明のポリヌクレオチド及び発現構築物は、好ましくは、シミアンウイルス40(SV40)複製起点、ウシパピローマウイルス(BPV)複製起点、及びエプスタイン-バーウイルス(EBV)複製起点を欠いており、好ましくはポリオーマウイルス複製起点、パピローマウイルス複製起点、及びヘルペスウイルス複製起点を欠いており、より好ましくは真核生物感染性ウイルスの複製起点を欠いている。より好ましくは、ポリヌクレオチド及び発現構築物は、好ましくは、任意の公知の真核生物複製起点を欠いている。しかし、好ましくは、ポリヌクレオチド及び発現構築物は、原核生物、好ましくは細菌の複製起点、特に大腸菌(E. coli)複製起点をさらに含んでもよい。好ましくは、原核生物の複製起点は、ポリヌクレオチド及び/又は発現構築物に含まれる唯一の複製起点である。

本発明はまた、医薬として使用するための、並びに/又は対象において免疫療法及び/若しく遺伝性疾患の治療に使用するための、本明細書で上に特定されるポリヌクレオチド及び/又は本明細書で上に特定される発現構築物に関する。

本発明はさらに、本発明によるポリヌクレオチド及び/又は本発明による発現構築物を含むベクターに関する。

用語「ベクター」は、本明細書で使用される場合、宿主細胞、好ましくは非治療用宿主細胞中でのポリヌクレオチドの増殖、増幅、及び/又はパッケージングを可能にする少なくとも1つの核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。好ましくは、この用語は、ファージ、プラスミド、ウイルス若しくはレトロウイルスベクター、並びに人工染色体、例えば細菌人工染色体又は酵母人工染色体を包含する。したがって、ベクターは、細菌細胞中で増殖及び増幅することができるプラスミドベクターであってもよい; したがって、プラスミドベクターは、好ましくは細菌の複製起点を含む。ベクターはまた、ウイルスベクターであってもよく、これは、許容細胞又はパッケージング細胞株中で増殖、増幅及び/又はパッケージングされ得る。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの複製及び/又はパッケージングに必要な配列を含み得る。好ましくは、ウイルスベクターの複製を許容する細胞及び/又はパッケージング細胞株は、治療用細胞ではない。ベクターはまた、非治療用細胞の、例えば細菌細胞の、酵母細胞の、又は昆虫細胞の人工染色体であってもよい。適切な配列は、それぞれのベクターについて当技術分野において公知である。ベクターは、当技術分野において周知の様々な技術によって宿主細胞に導入してもよい。例えば、プラスミドベクターは、沈殿物、例えばリン酸カルシウム沈殿物若しくは塩化ルビジウム沈殿物中に、又は荷電脂質との複合体中に、又は炭素系クラスター、例えばフラーレン中に導入することができる。あるいは、プラスミドベクターは、熱ショック又はエレクトロポレーション技術によって導入してもよい。ベクターがウイルスである場合、それは、宿主細胞への適用前に、適切なパッケージング細胞株を使用してインビトロ(in vitro)でパッケージングしてもよい。好ましい実施形態では、ベクターは、好ましくはp15A複製起点を有し、且つ/又はカナマイシン耐性遺伝子を保有する、細菌ベクターである。当業者に周知の方法を使用して、組換えベクターを構築することができる; 例えば、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.及びAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)に記載される技術を参照のこと。

本発明はまた、カーゴ配列及びS/MAR要素を含むポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドは、哺乳動物宿主細胞中でエピソームとして維持され、前記S/MAR要素は、1細胞当たり最大10個の検出可能なコピー、好ましくは1細胞当たり最大1個の検出可能なコピー、なおより好ましくは1細胞当たり最大0.1個のコピーの頻度で、最も好ましくは検出不可能なレベルで転写される、ポリヌクレオチドに関する。

用語「カーゴ配列」は、本明細書で上に特定されている。カーゴ配列を含むポリヌクレオチドは、本明細書で上に特定される動物宿主細胞、好ましくは哺乳動物宿主細胞中でエピソームとして維持される。

カーゴ配列を含むポリヌクレオチドにおいて、S/MAR配列は、1細胞当たり最大10個の検出可能なコピー、好ましくは1細胞当たり最大1個の検出可能なコピー、なおより好ましくは1細胞当たり最大0.1個のコピーの頻度で、最も好ましくは検出不可能なレベルで転写される。1細胞当たりのRNAの検出可能なコピーの数を決定する手段及び方法は、当技術分野において公知である; 好ましくは、前記方法は、好ましくは1細胞当たり0.01個のコピーの検出限界を有する、qPCRであり、より好ましくはRT-qPCRである。好ましくは、カーゴ配列を含むポリヌクレオチド中のS/MAR要素は、カーゴ配列に含まれる任意のプロモーターが、S/MAR要素から離れて転写を指示するように配置される; したがって、S/MAR要素は、好ましくはカーゴ配列に含まれる任意のプロモーターの上流に配置される。

本発明はまた、S/MAR要素を含む動物宿主細胞であって、前記S/MAR要素は、配列番号1と少なくとも70%同一である核酸配列、及び/又は配列番号2と少なくとも70%同一である核酸配列を含む、動物宿主細胞に関する。

本発明はまた、対象において免疫療法及び/又は遺伝性疾患の治療に使用するための、医薬として使用するための、本発明の動物宿主細胞に関する。

本発明はまた、特に免疫療法及び/又は遺伝性疾患の治療に使用するための、医薬の製造に使用するための、本発明の治療用細胞、発現構築物、ポリヌクレオチド、動物宿主細胞、発現構築物、ベクター、及び/又はカーゴ配列を含むポリヌクレオチドに関する。

本発明はまた、本明細書で特定される疾患、好ましくはがん、自己免疫疾患、及び/又は遺伝性疾患に罹患している対象を治療する方法であって、前記対象を、本発明の治療用細胞、発現構築物、ポリヌクレオチド、動物宿主細胞、発現構築物、ベクター、及び/又はカーゴ配列を含むポリヌクレオチドと接触させ、それにより前記疾患を治療することを含む、方法に関する。

上記を考慮して、以下の実施形態が特に想定される:

1. プロモーター及び発現可能な配列を含むエピソームポリヌクレオチドを含む治療用細胞であって、前記エピソームポリヌクレオチドは、前記プロモーターの上流にS/MAR要素をさらに含む、治療用細胞。
2. 前記発現可能な配列が、治療用遺伝子産物、好ましくは治療用ポリペプチドをコードする、請求項1に記載の治療用細胞。
3. 前記治療用ポリペプチドが、抗体、T細胞受容体(TCR)、キメラ抗原受容体(CAR)、サイトカイン、及び/又は遺伝性疾患により影響を受けた細胞中で欠けているポリペプチドである、請求項1又は2に記載の治療用細胞。
4. 前記CAR及び/又は前記T細胞受容体が、腫瘍抗原特異的である、請求項1～3のいずれか一項に記載の治療用細胞。
5. 前記エピソームポリヌクレオチドが、選択可能なマーカー遺伝子を含む、請求項1～4のいずれか一項に記載の治療用細胞。
6. 前記S/MAR要素が、配列番号1と少なくとも70%同一である核酸配列、及び/又は配列番号2と少なくとも70%同一である核酸配列、好ましくは配列番号3と少なくとも70%同一である核酸配列を含む、請求項1～5のいずれか一項に記載の治療用細胞。
7. S/MAR要素を含む動物宿主細胞であって、前記S/MAR要素は、配列番号1と少なくとも70%同一である核酸配列、及び/又は配列番号2と少なくとも70%同一である核酸配列を含む、動物宿主細胞。
8. 前記宿主細胞が、治療用細胞である、請求項7に記載の動物宿主細胞。
9. 前記S/MAR要素が、エピソームポリヌクレオチドに含まれる、請求項7又は8に記載の動物宿主細胞。
10. 前記エピソームポリヌクレオチドが、請求項1～6のいずれか一項に特定される少なくとも1つの特徴を含む、請求項9に記載の動物宿主細胞。
11. 特に対象において免疫療法及び/又は遺伝性疾患の治療に使用するための、医薬として使用するための、請求項1～6のいずれか一項に記載の治療用細胞、又は請求項7～10のいずれか一項に記載の動物宿主細胞。
12. 前記免疫療法が、がん及び/又は自己免疫疾患の治療及び/又は予防である、請求項11に記載の使用のための治療用細胞、又は使用のための動物宿主細胞。
13. 免疫療法及び/又は遺伝性疾患の治療が、少なくとも10⁵個、好ましくは少なくとも10⁶個、より好ましくは少なくとも10⁷個の前記治療用細胞又は動物宿主細胞の対象への投与を含む、請求項11又は12に記載の使用のための治療用細胞、又は使用のための動物宿主細胞。
14. 前記免疫療法及び/又は遺伝性疾患の治療が、少なくとも1ヶ月、好ましくは少なくとも6ケ月、より好ましくは少なくとも1年間の前記治療用細胞又は動物宿主細胞の維持を含む、請求項11～13のいずれか一項に記載の使用のための治療用細胞、又は使用のための動物宿主細胞。
15. 前記治療が、前記治療用細胞又は宿主細胞の反復投与を含む、請求項11～14のいずれか一項に記載の使用のための治療用細胞、又は使用のための宿主細胞。
16. 前記治療用細胞又は宿主細胞が、前記対象の同系細胞、好ましくは自己細胞である、請求項11～15のいずれか一項に記載の使用のための治療用細胞、又は使用のための動物宿主細胞。
17. 前記治療用細胞又は宿主細胞が、レシピエントの免疫系によって拒絶されない、請求項11～16のいずれか一項に記載の使用のための治療用細胞、又は使用のための動物宿主細胞。
18. 前記S/MAR要素が、配列番号2と少なくとも70%同一である核酸配列を含む、先行する請求項のいずれかに記載の主題。
19. 前記S/MAR要素が、配列番号3と少なくとも70%同一である核酸配列を含む、先行する請求項のいずれかに記載の主題。
20. 前記S/MAR要素が、前記治療用細胞又は宿主細胞中でエピソームとして維持される、先行する請求項のいずれかに記載の主題。
21. 前記治療用細胞又は宿主細胞が、脊椎動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞である、先行する請求項のいずれかに記載の主題。
22. 前記治療用細胞又は宿主細胞が、免疫細胞、好ましくはCD34+前駆細胞; CD61+血小板; CD19+Bリンパ球; CD14+単球; CD15+顆粒球; 好ましくはCD8及びCD45に対しても陽性の、CD3+細胞傷害性Tリンパ球; 好ましくはCD4及びCD45に対しても陽性の、CD3+ヘルパーTリンパ球; 好ましくはCD25及びCD45に対しても陽性の、CD3+活性化Tリンパ球、腫瘍浸潤リンパ球、又はナチュラルキラー(NK)細胞である、先行する請求項のいずれかに記載の主題。
23. S/MAR要素を含むポリヌクレオチドであって、前記S/MAR要素は、配列番号3と少なくとも93%、好ましくは少なくとも95%同一である核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
24. 発現可能な配列及びプロモーター、好ましくは哺乳動物プロモーターをさらに含む、請求項23に記載のポリヌクレオチドであって、前記S/MAR配列は、前記プロモーターの上流に位置する、ポリヌクレオチド。
25. 前記発現可能な配列が、治療用遺伝子産物、好ましくは治療用ポリペプチドをコードする、請求項23又は24に記載のポリヌクレオチド。
26. 選択可能なマーカー遺伝子をさらに含む、請求項23～25のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
27. 特に対象において免疫療法及び/又は遺伝性疾患の治療に使用するための、医薬として使用するための、請求項23～26のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、及び/又は請求項27に記載のベクター。
28. 発現可能な配列及びプロモーターを含む発現構築物であって、前記発現構築物は、前記プロモーターの上流にS/MAR要素をさらに含み、前記発現構築物は、哺乳動物細胞中でエピソームとして複製する、発現構築物。
29. 前記発現構築物が、シミアンウイルス40(SV40)複製起点、ウシパピローマウイルス(BPV)複製起点、及びエプスタイン-バーウイルス(EBV)複製起点を欠いており、好ましくはポリオーマウイルス複製起点、パピローマウイルス複製起点、及びヘルペスウイルス複製起点を欠いており、より好ましくは真核生物感染性ウイルス、好ましくは哺乳動物感染性ウイルスの複製起点を欠いている、請求項28に記載の発現構築物。
30. 前記発現可能な配列が、治療用ポリペプチドをコードする、請求項28又は29に記載の発現構築物。
31. 前記治療用ポリペプチドが、抗体、T細胞受容体(TCR)、キメラ抗原受容体(CAR)、サイトカイン、及び/又は遺伝性疾患により影響を受けた細胞中で欠けているポリペプチドである、請求項28～30のいずれか一項に記載の発現構築物。
32. 前記CAR及び/又は前記T細胞受容体が、腫瘍抗原特異的である、請求項31に記載の発現構築物。
33. 請求項24～25のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、好ましくは請求項24～25のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドからなる、請求項28～32のいずれか一項に記載の発現構築物。
34. 請求項23～26のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド及び/又は請求項28～33のいずれか一項に記載の発現構築物を含む、ベクター。
35. カーゴ配列及びS/MAR要素を含むポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドは、動物宿主細胞中でエピソームとして維持され、前記S/MAR要素は、1細胞当たり最大10個の検出可能なコピー、好ましくは1細胞当たり最大1個の検出可能なコピー、なおより好ましくは1細胞当たり最大0.1個のコピーの頻度で、最も好ましくは検出不可能なレベル(qPCR)で転写される、ポリヌクレオチド。
36. 前記S/MAR要素が、異種S/MAR要素である、先行する請求項のいずれかに記載の主題。
37. 前記免疫療法が、対象の免疫応答の調節による、がん及び/又は自己免疫疾患の治療及び/又は予防である、免疫療法に使用するための実施形態27に記載の主題。
38. 遺伝性疾患が、一遺伝子性劣性疾患であり、好ましくはフェニルケトン尿症、アルカプトン尿症、レーバー先天性黒内障、コロイデレミア、又はシュタルガルト病である、遺伝性疾患の治療に使用するための実施形態27に記載の主題。

本明細書で引用されたすべての参考文献は、それらの開示内容全体及び本明細書で具体的に言及された開示内容に関して、参照により本明細書に組み込まれる。

以下の実施例は、単に本発明を説明するにすぎないものとする。それらは、本発明の範囲を限定するものと一切解釈されないものとする。

実施例1: コロニー形成
安定して発現する細胞を生成する効率を、コロニー形成アッセイによって評価した(図1)。GFPレポーター遺伝子及びピューロマイシン耐性遺伝子を含むベクターをHek293Tに送達した後、GFP導入遺伝子発現について陽性の細胞をFACSソーティング(FACS Aria II)によって単離し、6cm細胞培養皿にプレーティングした。次いで、それらを、1μg/mlピューロマイシンの存在下で3週間培養した。3週間後、細胞をPFAで固定し、クリスタルバイオレットで染色し、計数した。コロニーの数は、ベクター樹立の効率とみなされる。GFP遺伝子の5'にS/MAR配列2(Mar2、配列番号3)を含有するベクター第3番は、GFP遺伝子の3'にβ-インターフェロンS/MARを保有する対照ベクターと同等のいくつかの耐性コロニーを生成したのに対し、ベクター2、4、及び5は、耐性細胞をもたらさなかった。

実施例2: 発現レベル
実施例1の導入遺伝子細胞を、GFPを発現する細胞(GFP+)の相対数について、及び樹立された集団の中間蛍光強度(MFI)について、FACSによって分析した(図2)。GFP遺伝子の3'にβ-インターフェロンS/MARを保有する対照ベクター(2)、及びGFP遺伝子の5'にS/MAR配列2を含有するベクターは、両方とも、細胞の大部分(>95%)が導入遺伝子を同等の強度で発現する細胞株を生成した。

実施例3: エピソーム維持
全DNAを、DNA送達の35日後にGFP遺伝子の5'にS/MAR配列2を含有するベクターを保有するHek293T細胞から抽出し、制限酵素BamHIを用いた37度での12時間の消化に供した。DNA断片を、0.8%アガロースゲル上で分離し、ナイロンメンブレン上に転写した。同時に、樹立前の細胞をトランスフェクトするために使用されたマキシ調製物からのプラスミドDNAを、同じアプローチで処理した。レポーター遺伝子GFPを使用して、対照(a)、及び細胞集団中のベクター(b)を試験するための放射性プローブを生成した。プラスミドは、対応する参照ベクターと比較した場合に同じサイズを有し、そのエピソーム維持を実証する。

文献：

Claims

プロモーター及び発現可能な配列を含むエピソームポリヌクレオチドを含む治療用細胞であって、前記エピソームポリヌクレオチドは、前記プロモーターの上流にS/MAR要素をさらに含む、治療用細胞。
前記発現可能な配列が、治療用遺伝子産物、好ましくは治療用ポリペプチドをコードする、請求項１に記載の治療用細胞。
前記発現可能な配列が、治療用ポリペプチドをコードし、前記治療用ポリペプチドが、抗体、T細胞受容体(TCR)、キメラ抗原受容体(CAR)、サイトカイン、及び/又は遺伝性疾患により影響を受けた細胞中で欠けているポリペプチドである、請求項１又は２に記載の治療用細胞。
前記治療用ポリペプチドが、TCRである、請求項１～３のいずれか一項に記載の治療用細胞。
前記治療用ポリペプチドが、CARである、請求項１～３のいずれか一項に記載の治療用細胞。
前記治療用ポリペプチドが、遺伝性疾患により影響を受けた細胞中で欠けているポリペプチドである、請求項１～３のいずれか一項に記載の治療用細胞。
前記エピソームポリヌクレオチドが、選択可能なマーカー遺伝子をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の治療用細胞。
前記S/MAR要素が、配列番号1と少なくとも70%同一である核酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の治療用細胞。
前記S/MAR要素が、配列番号2と少なくとも70%同一である核酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の治療用細胞。
前記S/MAR要素が、配列番号3と少なくとも70%同一である核酸配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の治療用細胞。
前記治療用細胞又は宿主細胞が、脊椎動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の治療用細胞。
発現可能な配列及びプロモーターを含む発現構築物であって、前記発現構築物は、前記プロモーターの上流にS/MAR要素をさらに含み、前記発現構築物は、哺乳動物細胞中でエピソームとして複製する、発現構築物。
S/MAR要素を含むポリヌクレオチドであって、前記S/MAR要素は、配列番号3と少なくとも93%、好ましくは少なくとも95%同一である核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
発現可能な配列及びプロモーター、好ましくは哺乳動物プロモーターをさらに含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチドであって、前記S/MAR配列は、前記プロモーターの上流に位置する、ポリヌクレオチド。
S/MAR要素を含む動物宿主細胞であって、前記S/MAR要素は、配列番号1と少なくとも70%同一である核酸配列、及び/又は配列番号2と少なくとも70%同一である核酸配列を含む、動物宿主細胞。
請求項１～８のいずれか一項に記載の治療用細胞である、請求項１５に記載の動物宿主細胞。
医薬として使用するための、請求項１～１６のいずれか一項に記載の主題。
対象において免疫療法及び/又は遺伝性疾患の治療に使用するための、請求項１～１６のいずれか一項に記載の主題。
前記免疫療法が、対象の免疫応答の調節による、がん及び/又は自己免疫疾患の治療及び/又は予防である、免疫療法に使用するための請求項１８に記載の主題。
遺伝性疾患が、一遺伝子性劣性疾患であり、好ましくはフェニルケトン尿症、アルカプトン尿症、レーバー先天性黒内障、コロイデレミア、又はシュタルガルト病である、遺伝性疾患の治療に使用するための請求項１８に記載の主題。