KR20230041741A - 5' s/mar 응용 - Google Patents

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KR20230041741A
KR20230041741A KR1020237005396A KR20237005396A KR20230041741A KR 20230041741 A KR20230041741 A KR 20230041741A KR 1020237005396 A KR1020237005396 A KR 1020237005396A KR 20237005396 A KR20237005396 A KR 20237005396A KR 20230041741 A KR20230041741 A KR 20230041741A
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KR1020237005396A
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리하르트 하르보틀레
마티아스 보차
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도이체스 크렙스포르슝스첸트룸
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Abstract

본 발명은 프로모터 및 발현 가능한 서열을 포함하는 에피솜 폴리뉴클레오티드를 포함하는 치료용 세포에 관한 것으로서, 상기 에피솜 폴리뉴클레오티드는 상기 프로모터의 상류에 S/MAR 요소를 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 발현 작제물, 폴리뉴클레오티드, 동물 숙주 세포, 발현 작제물, 벡터 및/또는 이와 연관된 카고 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

Description

5' S/MAR 응용
본 발명은 프로모터 및 발현 가능한 서열을 포함하는 에피솜 폴리뉴클레오티드를 포함하는 치료용 세포에 관한 것으로서, 상기 에피솜 폴리뉴클레오티드는 상기 프로모터의 상류에 S/MAR 요소를 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 발현 작제물, 폴리뉴클레오티드, 동물 숙주 세포, 발현 작제물, 벡터 및/또는 이와 연관된 카고 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
세포들의 유전자 변형은 과학적 목적을 위해 현대 세포 배양에서 일상적으로 사용된다. 그러나, 유전자의 돌연변이에 의해 야기되는 유전 질환의 치료에 있어서 상응하는 기술의 사용은 매우 바람직한 한편으로, 여전히 일반적으로 획득가능한 방법이 단지 일시적인 형질감염 프로토콜과 같은 일시적인 변형만을 제공하는 반면, 세포의 안정한 변형을 제공하는 방법이 일반적으로 숙주 세포의 게놈 내로의 전이유전자의 통합에 의존한다는 문제에 의해 여전히 방해받는다. 그러나, 심지어 특정한 유전자좌를 표적으로 하는 경우에서조차도, 전이유전자의 통합은 예를 들어 치료의 부작용으로서 암으로 이어질 수 있는 해로운 돌연변이를 유도할 위험이 있다.
스캐폴드-부착 영역(SARs) 또는 매트릭스-연합 영역(MARs)으로도 공지되어 있는 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(S/MARs)은 핵 매트릭스의 부착을 매개하는 진핵생물 유기체의 게놈 내의 서열로서 공지되어 있다. 더욱이, S/MAR 서열은 농축염색질 도메인의 전사적으로 활성인 영역으로의 연장 및 원위 인핸서와 프로모터의 상호작용을 방지하는 절연체 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다(Yusufzai & Felsenfeld (2004), PNAS 101(23), 8620). S/MARS는 AT-풍부 서열이고, 일부 AT-풍부 모티프는 더욱 풍부한 것으로 밝혀졌다(Liebeich et al. (2002), NAR 30(15): 3433). 식물들에서, S/MAR 요소는 인접하는 유전자의 발현이 확인되었다(gest et al(2004), plant biotech j2: 13).
예를 들어 US 6,410,314 B1에서 그리고 Haase et al. (2010), BMC Biotechnology 10:20에서 S/MAR 모티프에 기반하는 세포에서 안정한 유지를 위해 다양한 벡터가 제안되었다. S/MAR 요소로의 전사는 상응하는 벡터의 안정한 유지를 위해 필수적인 것으로 밝혀졌다(Rupprecht et al. (2010), Gene 466(1-2):36). 전사 단위의 일부로서의 S/MAR 서열, 즉 프로모터의 하류의 S/MAR 서열이 예를 들어 WO 2019/057773 A1, WO 2019/057774 A1 및 WO 2019/060253 A1에서 제안되었다. S/MAR 벡터의 복제에 대해 영향을 미치는 후생유전 영향이 확인되었다(Haase et al.(2013), PLOS One 8(11):e79262).
그럼에도 불구하고, 예를 들어 유전자 요법을 위한 세포의 안정한 변형을 사용하기에 충분히 안정한 개선된 S/MAR-기반 벡터가 여전히 바람직하다.
따라서, 본 발명은 프로모터 및 발현 가능한 서열을 포함하는 에피솜 폴리뉴클레오티드를 포함하는 치료용 세포에 관한 것으로서, 상기 에피솜 폴리뉴클레오티드는 상기 프로모터의 상류에 S/MAR 요소를 추가로 포함한다.
일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 용어는 당해 기술분야에서 통상의 기술자에게 용어들의 일반적이고 통상적인 의미를 부여하고, 달리 지시되지 않는 한, 특별한 또는 맞춤화된 의미로 한정되지 않는다. 다음에서 사용되는 바와 같이, 용어 "갖는다", "포함한다" 또는 "함유한다" 또는 이들의 임의의 문법적인 변형은 비-배타적인 방식으로 사용된다. 따라서, 이러한 용어는, 이러한 용어에 의해 도입되는 특징 외에, 이러한 맥락에서 기술되는 실체에서 추가의 특징이 존재하지 않는 상황 및 하나 이상의 추가의 특징이 존재하는 상황 둘 모두를 의미할 수 있다. 하나의 예로서, 표현 "A는 B를 갖는다", "A는 B를 포함한다" 및 "A는 B를 함유한다"는, B 외에, A에 다른 요소가 존재하지 않는 상황(즉 A가 오로지 그리고 배타적으로 B로 이루어지는 상황) 및, B 외에, 실체 A에 요소 C, 요소 C 및 D들 또는 심지어 추가의 요소와 같은 하나 이상의 추가의 요소가 존재하는 상황 둘 모두를 의미할 수 있다. 또한, 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 표현 "~를 포함하여"는 바람직하게는 "하나 이상을 포함하여"를 의미하며, 즉 "적어도 하나를 포함하여"와 등가이다.
추가로, 다음에서 사용되는 바와 같이, 용어 "바람직하게는", "보다 바람직하게는", "가장 바람직하게는", "특히", "보다 구체적으로", "특히", "보다 특히", "구체적으로", "보다 구체적으로" 또는 유사한 용어는 추가의 가능성을 제한함이 없이 선택적 특징과 함께 사용된다. 따라서, 용어에 의해 도입되는 특징은 선택적 특징이고 어떠한 방법으로도 특허청구범위의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다. 본 발명은, 통상의 기술자가 인식할 수 있는 바와 같이, 대안의 특징을 사용하여 수행될 수 있다. 유사하게, "하나의 구현예에서" 또는 유사한 표현에 의해 도입되는 특징은 본 발명의 추가의 구현예를 고려하는 임의의 제한 없이, 본 발명의 범주를 고려하는 임의의 제한 없이 그리고 본 발명의 다른 선택적 또는 비-선택적 특징과 같은 방식으로 도입되는 특징의 결합 가능성을 고려하는 임의의 제한 없이 선택적인 특징인 것으로 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표준 조건"은, 달리 언급되지 않는 경우, IUPAC 표준 주변 온도 및 압력(SATP) 조건, 즉, 바람직하게는, 25℃의 온도 및 100 kPa의 절대 압력과 관련되고, 또한 바람직하게는, 표준 조건은 7의 pH를 포함한다. 더욱이, 달리 지시되지 않는 한, 용어 "약"은 관련 분야에서 통상적으로 허용되는 기술적인 정밀도를 갖는 지시된 값과 관련되고, 바람직하게는 지시된 값 ± 20%, 보다 바람직하게는 ± 10%, 가장 바람직하게는 ± 5%와 연관된다. 더욱이, 용어 "필수적으로"는 지시된 결과 또는 용도에 영향을 미치는 편차가 존재하지 않는다는 것을 나타내며, 즉 잠재적인 편차는 지시된 결과가 ± 20%, 보다 바람직하게는 ± 10%, 가장 바람직하게는 ± 5% 초과로 벗어나게 하지 않는다. 따라서, "필수적으로 이루어지는"은 명시된 성분들을 포함하나 성분을 제공하는 데 사용되는 방법의 결과로서 존재하는 불순물, 피할 수 없는 물질로서 존재하는 물질들 및 본 발명의 기술적인 효과를 달성하는 것 이외의 목적을 위해 첨가되는 성분을 제외하고는 다른 성분을 배제하는 것을 의미한다. 예를 들어, 문구 "필수적으로 이루어지는"을 사용하여 정의되는 조성물은 임의의 공지된 수용가능한 첨가제, 부형제, 희석제, 담체 등을 포함한다. 바람직하게는, 한 세트의 조성물로 필수적으로 이루어지는 조성물은 5중량% 미만, 보다 바람직하게는 3중량% 미만, 보다 더 바람직하게는 1중량% 미만, 가장 바람직하게는 0.1중량% 미만의 비-특정 성분(들)을 포함할 수 있다.
2개의 생물학적 서열, 바람직하게는 DNA, RNA 또는 아미노산 서열들 간의 동일성의 정도(예를 들어 "%동일성"으로 표현됨)는 당해 기술분야에서 잘 알려진 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 바람직하게는, 동일성의 정도는 비교창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되고, 여기에서 비교창 내의 서열의 단편은 최적 정렬과 비교되는 서열과 비교하여 부가 또는 결실(예를 들어, 갭 또는 오버행)을 포함할 수 있다. 백분율은 바람직하게는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전장에 걸쳐 일치되는 위치의 수를 수득하기 위해 동일한 잔기가 두 서열에서 발생하는 위치의 수를 결정하고, 일치되는 위치의 수를 비교창 내의 위치의 총 수로 나누고 그 결과를 100으로 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득함으로써 산출된다. 비교를 위한 최적의 정렬은 Smith and Waterman (1981)의 로컬 상동성 알고리즘에 의해, Needleman and Wunsch (1970)의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, Pearson and Lipman (1988)의 유사도법을 위한 연구에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 구현에 의해(GAP, BESTFIT, BLAST, PASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI) 또는 시각적 검사에 의해 수행될 수 있다. 비교를 위해 2개의 서열이 식별되었다는 것을 고려하면, GAP 및 BESTFIT들은 바람직하게는 이들의 최적화된 정렬 및 그에 따라 동일성의 정도를 결정하는 데 채용된다. 바람직하게는, 갭 중량에 대한 5.00 및 갭 길이에 대한 0.30의 디폴트 값이 사용된다. 본 명세서에서 언급되는 생물학적 서열의 맥락에서, 용어 "본질적으로 동일한"은 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99%의 %동일성 값을 나타낸다. 이해될 수 있는 바와 같이, 용어 본질적으로 동일한은 100% 동일성을 포함한다. 상기 내용은 용어 "근본적으로 상보적인"에 준용하여 적용된다. 마찬가지로 이해될 수 있는 바와 같이, 적어도 98%라는 표현은 100%를 포함하여 98% 내지 100%의 전체 범위를 포함한다.
용어 생물학적 거대분자, 바람직하게는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 "단편"은 본 명세서에서 지시된 서열, 구조 및/또는 기능을 포함하는 임의의 개개 생물학적 거대분자의 임의의 서브-파트, 바람직하게는 서브도메인과 관련하여 넓은 의미로 사용된다. 따라서, 용어는 생물학적 거대분자의 실제 단편화에 의해 생성된 서브-파트 뿐만 아니라 추상적인 방식으로, 예를 들어 인실리코(in silico)에서 개개 생물학적 거대분자로부터 파생되는 서브-파트를 포함한다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, Fc 또는 Fab 단편 뿐만 아니라 예를 들어 단일쇄 항체, 이중특이적 항체 및 나노바디가 면역글로불린의 단편으로 언급될 수 있다.
본 명세서에서 달리 구체적으로 지시되지 않는 한, 특정된 화합물은 더 큰 구조 내에 포함될 수 있고, 예를 들어 담체 분자, 지연제 및 다른 부형제에 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결될 수 있다. 특히, 폴리뉴클레오티드 또는 발현 작제물은 서열, 예를 들어, 바람직하게는, 항생제 내성 유전자와 같은 (추가의) 선별 마커 및/또는 상기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출가능하게 하는 마커 폴리펩티드를 인코딩하는 서열 및/또는 박테리아 세포, 예를 들어 복제의 원핵생물 기원에서의 전파를 보장하는 서열을 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드에 포함될 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오티드 또는 발현 작제물은 특히 벡터에 포함될 수 있다. 또한, 특정된 바와 같은 폴리펩티드는 예를 들어 정제 및/또는 검출을 위한 펩티드 태그로서, 링커로서 또는 화합물의 생체 내 반감기를 연장시키는 역할을 할 수 있는 추가의 펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드에 포함될 수 있다. 용어 "폴리펩티드 태그"는 폴리펩티드 내로 첨가되거나 도입되는 아미노산의 스트레치를 의미하며; 바람직하게는 태그는 본 발명의 폴리펩티드에 C-말단으로 또는 N-말단으로 첨가된다. 상기 아미노산의 스트레치는 바람직하게는 태그를 특이적으로 인식하는 항체에 의한 융합 폴리펩티드의 검출을 가능하게 하거나; 또는 바람직하게는 킬레이터와 같은 기능적인 형태를 형성하는 것을 가능하게 하거나; 또는 바람직하게는 예를 들어 형광 태그의 경우, 가시화를 가능하게 한다. 바람직한 검출 태그는 Myc-태그, FLAG-태그, 6-His-태그, HA-태그, GST-태그 또는 형광 단백질 태그, 예를 들어 GFP-태그이다. 이러한 태그는 모두 당해 기술분야에서 충분히 공지되어 있다. 바람직하게는 융합 폴리펩티드에 포함되는 다른 추가의 펩티드는, 분비의 매개자로서, 혈-뇌-장벽 통로의 매개자로서, 세포-투과 펩티드로서 및/또는 면역 자극제로서 작용할 수 있는 추가의 아미노산 또는 다른 변형을 포함한다. 폴리펩티드가 융합될 수 있는 추가의 폴리펩티드 또는 펩티드는 신호 서열 및/또는 수송 서열이다.
용어 "치료용 세포"는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 아래에서 특정된 바와 같은 발현 작제물을 포함하고 질환으로 고통받는 대상체에 유효한 투여량으로 투여되는 경우 상기 질환의 치료 및/또는 예방하기에 적절한 생물학적 활성을 갖고, 즉 바람직하게는 상기 질환을 개선하고/하거나 예방하는 생물학적 특성을 갖는 아래에 특정된 바와 같은 숙주 세포에 관한 것이다. 치료용 세포는 에피솜 폴리뉴클레오티드를 수령하고 안정적으로 에피솜적으로 복제할 수 있고, 그리고 에피솜 폴리뉴클레오티드에 포함되는 발현 작제물을 발현할 수 있는 임의의 세포일 수 있다. 치료용 세포는 원칙적으로 그 수령자에 대해 이종성, 동종이계, 동계 또는 자가유래일 수 있고, 바람직하게는 동종이계, 동계 또는 자가유래이고, 보다 바람직하게는 그 수령자에 대해 동종이계 또는 자가유래이다. 보다 바람직하게는, 치료용 세포는 그 수령자에 대해 동종이계이고, 가장 바람직하게는 그 수령자에게 자가유래이다. 바람직하게는, 치료용 세포는 본 명세서의 다른 곳에서 특정된 바와 같은 대상체의 세포이고, 보다 바람직하게는 포유동물 세포, 가장 바람직하게는 인간 세포이다. 치료용 세포는, 원칙적으로, 의도된 목적을 위해 당업자에 의해 적절한 것으로 간주되는 임의의 세포, 바람직하게는 체세포일 수 있다. 따라서, 치료용 세포는 혈액 세포, 신경 세포 또는 교세포, 피부 세포, 근육 세포, 점막 세포, 기관의 세포, 예컨대 간 세포, 췌장 세포, 폐 세포, 신장 세포, 망막 세포, 장 세포 등, 결합조직 세포 또는 골 세포일 수 있다. 바람직하게는, 치료용 세포는, 특히 치료되어야 할 질환이 유전 질환인 경우, 치료되어야 할 조직 및/또는 기관으로부터의 세포이고; 따라서, 예를 들어 맥락막결손증에서, 치료용 세포는 망막 세포일 수 있다. 바람직하게는, 치료용 세포는 생식계열 세포가 아니고, 특히 난모 세포 또는 정자 또는 이들의 전구 세포가 아니다. 바람직하게는, 치료용 세포는 줄기 세포이고, 바람직하게는 배아의 파괴에 의해 생성되지 않고; 따라서 줄기 세포는 바람직하게는 확립된 줄기 세포주 또는 체세포 줄기 세포(성체 줄기 세포)로부터의 세포이다. 바람직하게는, 치료용 세포는 전능성 줄기 세포가 아니다. 바람직하게는, 치료용 세포는 만능, 다능 또는 협능 줄기 세포이다. 또한 바람직하게는, 치료용 세포는 혈액 세포, 특히 면역 세포, 보다 바람직하게는 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 단핵구, 과립구 또는 형질 세포 또는 앞서 언급된 것들 중의 임의의 것의 전구체이다. 바람직하게는, 치료용 세포는 CD34+ 전구 세포; CD61+ 혈소판; CD19+ B-림프구; CD14+ 단핵구; CD15+ 과립구; 또한 바람직하게는 CD8 및 CD45에 대해 양성인, CD3+ 세포독성 T-림프구; 바람직하게는 또한 CD4 및 CD45에 대해 양성인, CD3+ 헬퍼 T-림프구; 바람직하게는 또한 CD25 및 CD45에 대해 양성인, CD3+ 활성화 T-림프구, 종양 침윤성 림프구 또는 자연 살해(NK) 세포이다. 바람직하게는, 치료용 세포는 대상체에 투여하기 위한 세포이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는, 본 명세서에서 특정된 바와 같은 에피솜 폴리뉴클레오티드, 발현 작제물, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 안정적으로 염색체외적으로 유지할 수 있는 임의의 세포에 관한 것이다. 따라서, 에피솜 폴리뉴클레오티드, 발현 작제물, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 진핵생물 세포에서 에피솜적으로 및/또는 원핵생물 세포에서 플라스미드로서 유지될 수 있다. 따라서, 숙주 세포는 바람직하게는 박테리아 세포, 보다 바람직하게는 박테리아의 실험실 균주의 세포, 보다 바람직하게는 대장균(Escherichia coli) 세포이다. 보다 바람직하게는, 숙주 세포는 진핵생물 세포, 바람직하게는 식물 또는 효모 세포, 예를 들어 빵 효모의 균주의 세포, 또는 동물 세포이다. 보다 더 바람직하게는, 숙주 세포는 동물 세포, 바람직하게는 곤충 세포 또는 포유동물 세포, 특히 닭 세포, 거위 세포, 오리 세포, 염소 세포, 양 세포, 소 세포, 돼지 세포, 말 세포, 개 세포, 고양이 세포, 햄스터 세포, 랫트 세포, 마우스 세포, 햄스터 세포, 기니피그 세포와 같은 가축 또는 반려동물 세포이다. 보다 더 바람직하게는, 숙주 세포는 인간 세포이다.
용어 "에피솜 폴리뉴클레오티드"는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 숙주 세포에서 바람직하게는 치료용 세포에서 특정된 바와 같은 성분을 갖고 에피솜적으로 복제되는, 보다 바람직하게는 에피솜적으로 안정하게 복제되는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 용어 "에피솜" 복제는, 원칙적으로, 세포 게놈 내로 통합됨이 없이, 즉 세포 게놈에 공유적으로 부착됨이 없이 폴리뉴클레오티드의 복제에 관하여 당업자에게 공지되어 있다. 따라서, 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드의 에피솜 복제는 자율 복제 유닛으로서 상기 폴리뉴클레오티드의 복제이다. 바람직하게는, 에피솜 복제는 원형으로 폐쇄된 이중-가닥 DNA 분자의 형태로 숙주 세포에서의 폴리뉴클레오티드의 유지이다. 통상의 기술자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 상기 폴리뉴클레오티드의 실제 복제는 다른 형태, 예를 들어 롤링 서클 복제를 포함할 수 있다. 원형 DNA의 에피솜 유지는 바람직하게 통상의 기술자에게 공지된 플라스미드 회수 절차에 의해 검증되며; 즉 바람직하게는, 숙주 세포의 용해물을 준비하는 단계 및 이에 포함되는 DNA로 적절한 박테리아 세포, 예를 들어 대장균 세포를 형질전환시키는 단계에 의해 검증되며; 상기 방법에 의해 수득될 수 있는 적합한 수의 박테리아 콜로니가 원래의 원형 DNA와 동일한 제한 패턴 및/또는 서열을 갖는 플라스미드로서 원형 DNA를 포함하는 경우, 바람직하게는, 원형 DNA가 숙주 세포 내에 에피솜적으로 유지되었다고 추정된다. 또한 통상의 기술자에게 공지된, 에피솜 유지를 검증하는 추가 방법은 DNA/DNA 블롯팅("사우던 블롯" 방법)이고; 따라서, 바람직하게는, 숙주 세포의 전체 DNA를 준비하고 하나 이상의 제한 효소(들)로 소화시키고; 프로브로 원래의 플라스미드를 사용하는 사우던 블롯에서, 원래의 폴리뉴클레오티드 DNA에 해당하는 밴드만이 가시적인 경우, 바람직하게는, 플라스미드가 에피솜적으로 유지된다고 결론지어진다. 따라서, 용어 "에피솜적으로 복제되는"은, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 상기 폴리뉴클레오티드는 자율적으로 복제하는 독립체로서 상기 세포에 존재하면서 세포 복제 주기 동안 숙주 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개의 복제물의 생산을 유도하는 폴리뉴클레오티드의 활성에 관한 것이며; 및 안정한 에피솜 복제는 폴리뉴클레오티드가 적어도 50회 세포 분열 이후, 바람직하게는 적어도 100회 세포 분열 이후, 보다 바람직하게는, 적어도 250회 세포 분열 이후, 가장 바람직하게는, 적어도 500회 세포 분열 이후에 숙주 세포에서 여전히 검출가능한 정도로의 에피솜 복제이다. 바람직하게는, 앞서 언급된 세포 분열의 수는 세포의 집단에 대한 세포 분열의 평균 수이다. 바람직하게는, 에피솜 폴리뉴클레오티드로부터, 발현 가능한 서열 및 프로모터 및/또는 S/MAR 요소의 서열을 동시에 포함하는 전사체는 생성되지 않는다.
에피솜 폴리뉴클레오티드는 5'-프로모터-발현 서열-3'의 순서로 적어도 프로모터 및 발현 서열, 및 상기 프로모터의 상류에 S/MAR 요소를 포함한다. 따라서, 순서는 5'-S/MAR 요소-프로모터-발현 가능한 서열-3'이다. 에피솜 폴리뉴클레오티드의 프로모터는 발현 가능한 서열의 발현을 지향하고; 따라서, 프로모터의 마지막 뉴클레오티드와 발현 가능한 서열의 첫 번째 뉴클레오티드 간의 거리는 최대 1 kbp, 보다 바람직하게는 최대 500 bp, 보다 더 바람직하게는 최대 250 bp, 가장 바람직하게는 최대 100 bp이다. 바람직하게는, S/MAR 요소의 마지막 뉴클레오티드와 프로모터의 첫 번째 뉴클레오티드 간의 거리는 최대 5 kbp, 보다 바람직하게는 최대 2 kbp, 보다 더 바람직하게는 최대 1 kbp, 보다 더 바람직하게는 최대 500 bp, 가장 바람직하게는 최대 250 bp이다. 바람직하게는, (i) 프로모터 및 발현 가능한 서열 및/또는 (ii) S/MAR 요소 및 프로모터는 (추가의) 발현 가능한 서열에 의해 개재되지 않는다. 바람직하게는, 에피솜 폴리뉴클레오티드 상에서 프로모터와 발현 가능한 서열은 함께 진핵생물 발현 작제물을 형성한다. 에피솜 폴리뉴클레오티드는 선택적으로 추가의 핵산 서열, 특히 진핵생물 숙주 세포에서 발현 가능한 서열의 발현을 조절하는 발현 제어 서열, 추가의 발현 가능한 서열 또는 유전자, 예를 들어 마커 유전자, 추가의 S/MAR 서열, 선별 마커 유전자 등등을 포함할 수 있다. 발현 가능한 서열의 발현은 바람직하게는 번역 mRNA로 또는 비-코딩 RNA로 발현 가능한 서열의 전사를 포함한다. 진핵생물 세포, 바람직하게는 숙주 세포에서의 발현을 보장하는 조절 요소는 당해 기술분야에서 충분히 공지되어 있다. 이들은, 바람직하게는, 전사의 개시를 보장하는 조절 서열 및, 선택적으로, 전사체의 전사 및 안정화의 종결을 보장하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가의 조절 요소는 전사와 마찬가지로 번역 인핸서를 포함할 수 있다. 하기에 특정된 바와 같은 프로모터에 더해, 진핵생물 숙주 세포에서의 발현을 허용하는 조절 요소에 대한 예는 포유동물 및 다른 동물 세포에서의 CMV-인핸서, SV40-인핸서 또는 글로빈 인트론이다. miRNA 또는 siRNA의 발현에 바람직한 조절 서열 또한 당해 기술분야에서 공지되어 있다. 더욱이, 유도성 또는 세포 유형-특이적 발현 제어 서열이 에피솜 폴리뉴클레오티드에 포함될 수 있다. 유도성 발현 제어 서열은 tet 또는 lac 오퍼레이터 서열 또는 열충격 또는, 바람직하게는 호르몬이나 사이토카인인 다른 환경 또는 개체 요인에 의해 유도 서열을 포함할 수 있다. 적합한 발현 제어 서열은 당해 기술분야에서 충분히 공지되어 있다. 전사의 개시를 담당하는 요소 이외에도, 조절 요소는 또한 폴리뉴클레오티드의 하류(downstream)에 SV40-폴리-A 부위 또는 tk-폴리-A 부위와 같은 전사 종결 신호를 포함할 수 있다. 본 발명의 에피솜 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 원숭이 바이러스 40(SV40) 복제 기원, 소 유두종 바이러스(BPV) 복제 기원 및 엡스타인-바 바이러스(EBV) 복제 기원이 없고, 바람직하게는 폴리오마바이러스 복제 기원, 파필로마바이러스 복제 기원 및 헤르페스바이러스 복제 기원이 없고; 보다 바람직하게는 진핵생물-감염 바이러스의 복제 기원이 없다. 보다 바람직하게는, 에피솜 폴리뉴클레오티드는 임의의 공지된 진핵생물 복제 기원이 없다. 그러나, 바람직하게는 에피솜 폴리뉴클레오티드는 원핵생물, 바람직하게는 박테리아 복제 기원, 특히 대장균 복제 기원을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 원핵생물 복제 기원은 에피솜 폴리뉴클레오티드에 포함되는 유일한 복제 기원이다.
용어 "프로모터"는, 원칙적으로, 임의적으로 추가의 조절 요소와 연합하여, 유전자의 전사 수준을 지정하는 유전적 요소로서 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 프로모터는 구성적일 수 있으며, 즉 숙주 세포의 상태와 본질적으로 비의존적인 일정한 전사 수준을 제공하거나, 또는 조절될 수 있으며, 즉 숙주 세포의 상태에 의존적인 전사 수준을 제공할 수 있다. 더욱이, 프로모터는 세포 유형 및/또는 조직 특이적일 수 있고, 즉 소수 또는 오직 하나의 세포 유형(들)에서만 검출가능한 전사 수준을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 프로모터는 위에서 특정된 바와 같은 숙주 세포에서, 보다 바람직하게는 위에서 특정된 바와 같은 치료용 세포에서 활성이다. 통상의 기술자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 프로모터의 선택은 표적화를 위해 의도된 숙주 세포 또는 치료용 세포의 유형에 의존적일 수 있고; 구성적 프로모터 뿐만 아니라 특정한 세포 유형에 적합한 프로모터는 당해 기술분야에서 공지되어 있다. 바람직하게는, 프로모터는 진핵생물 프로모터, 보다 바람직하게는 구성적 진핵생물 프로모터, 보다 더 바람직하게는 강력한 진핵생물 프로모터이다. 보다 바람직하게는, 프로모터는 포유동물 프로모터, 보다 더 바람직하게는 인간 프로모터이다. 바람직하게는, 프로모터는 EF1알파(연장 인자 1 알파) 프로모터, UbiC(유비퀴틴 C) 프로모터, ROSA 26 프로모터, PGK(포스포글리세레이트 키나아제) 프로모터 및/또는 CAG(닭 알파-액틴) 프로모터이고, 보다 바람직하게는 EF1알파 프로모터이다. 또한 바람직하게는, 프로모터는 세포-특이적 및/또는 조직-특이적 진핵생물 프로모터이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 프로모터는 위에서 특정된 바와 같은 프로모터에 대해 사용되는 반면, 추가로 발현 작제물, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터에 잠재적으로 존재하는 임의의 다른 프로모터는 "2차 프로모터"로 언급된다. 따라서, 바람직하게는, 프로모터는 숙주 세포에서 S/MAR 서열에서 멀어져서 전사를 유도하는 프로모터이고; 또한 바람직하게는, S/MAR 서열 및 발현 가능한 서열을 방해하지 않는 프로모터, 예를 들어 원핵생물 프로모터, 3' S/MAR 서열만을 갖는 프로모터 및/또는 S/MAR 서열로의 전사를 지정하는 프로모터는 2차 프로모터이다.
용어 "발현 가능한 서열"은 용어 "발현 가능한 핵산 서열"에 대한 약칭 표현인 것으로 통상의 기술자에게 이해되고, 그로부터 유전자 산물이 숙주 세포에 의해, 바람직하게는 치료용 세포에 의해 생성될 수 있는 각각의 그리고 임의의 핵산 서열에 관한 것이다. 상기 유전자 산물은 바람직하게는 RNA 또는 폴리펩티드이고, 보다 바람직하게는 폴리펩티드이다. 따라서, 발현 가능한 서열은, 바람직하게는, 코딩 서열이고, 보다 바람직하게는 개방형 해독틀(open reading frame)을 포함한다. 바람직하게는, 발현 가능한 서열은 치료용 유전자 산물, 즉 치료 RNA 또는 치료용 폴리펩티드, 보다 바람직하게는 치료용 폴리펩티드를 인코딩한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 치료용 유전자 산물, 즉 치료 RNA 또는 치료용 폴리펩티드의 맥락에서, 용어 "치료"는 아래에서 특정된 바와 같은 치료 및/또는 예방에 기여하는 유전자 산물에 관한 것이다. 따라서, 바람직하게는, 질환의 치료 및/또는 예방에 "기여하는"은, 바람직하게는 유효 투여량으로 적용되는 경우, 통계학적으로 유의미한 개선 및/또는 예방하는 효과를 야기하는 것과 연관된다.
바람직하게는, 치료용 유전자 산물은 치료용 RNA이고, 용어 "치료용 RNA"는 상기 치료용 RNA를 포함하는 숙주 세포의 생리학적 및/또는 대사 상태의 변화를 매개하는 임의의 RNA에 연관된다. 바람직하게는, 치료용 RNA는 상기 치료용 RNA를 포함하는 숙주 세포의 생리학적 및/또는 대사 상태의 변화를 매개하고, 그에 의해 바람직하게는 본 명세서의 다른 곳에서 특정된 바와 같은 질환 또는 장애의 개선 또는 치료에 기여한다. 치료용 RNA는 아래에서 특정된 바와 같은 치료용 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA 또는 그의 서브유닛 또는 활성 단편일 수 있다. 보다 바람직하게는, 치료 RNA는 비-코딩 RNA이고; 비-코딩 RNA들은 당해 기술분야에서 널리 알려진 것이고 특히 대상의 유전자의 발현을 감소 또는 폐지하는 데 사용된다. 따라서, 바람직하게는, 치료 RNA는 간섭하는, 비-코딩 RNA, 특히 siRNA, miRNA, 안티센스 RNA 또는 리보자임이다. 예를 들어 유전자 침묵에 사용하기 위한 간섭 핵산들을 디자인하기 위한 수단들 및 방법들은 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 표적 유전자의 발현을 억제하는 데 유효한 것으로 기술되는 바와 같은 RNA에 대한 요건 또한 당해 기술분야에 공지되어 있다. 치료용 유전자 산물은 또한 가이드 RNA, 즉 CRISPR/Cas 뉴클레아제를 대상의 표적 유전자로 안내하는 데 사용되는 RNA일 수 있다. 치료용 유전자 산물은 또한 상기 표적 유전자의 발현을 조절하는 조절 폴리펩티드를 위한 추가의 결합 부위들을 제공함으로써 표적 유전자의 발현을 조절하는 유인 RNA일 수 있다. 더욱이, 치료용 유전자 산물은 또한 전체적 유전자 조절을 제공하기 위해 당해 기술분야에서 공지된 miRNA일 수 있다. 따라서, 치료용 RNA는 바람직하게는 siRNA, shRNA, 안티센스 RNA, gRNA, 리보자임, 유인 RNA 또는 miRNA이고, 보다 바람직하게는 siRNA, shRNA 또는 안티센스 RNA이다.
보다 바람직하게는, 치료용 유전자 산물은 치료용 폴리펩티드이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료용 폴리펩티드"는 상기 치료용 폴리펩티드를 포함하는 숙주 세포 및/또는 이러한 숙주 세포와 직접적으로 또는 바람직하게는 체액을 경유하여, 보다 바람직하게는 혈액, 림프, 타액, 뇌척수액 및/또는 간질액을 경유하여 유체접촉되는 세포의 생리학적 및/또는 대사 상태에서의 변화를 매개하는 임의의 폴리펩티드에 관한 것이다. 보다 바람직하게는, 치료용 폴리펩티드는 숙주 세포 및/또는 이러한 숙주 세포와 직접 또는 유체 접촉하는 세포의 생리학적 및/또는 대사 상태의 변화를 매개하고, 그에 의해 바람직하게는 본 명세서의 다른 곳에서 특정된 바와 같은 질환 또는 장애의 개선 또는 치료에 기여하는 폴리펩티드이다. 바람직하게는, 치료용 폴리펩티드는 바람직하게는 아래에 특정된 바와 같은 항체이다. 또한 바람직하게는, 치료용 폴리펩티드는 T 세포 수용체(TCR), 보다 바람직하게는 인간 또는 키메라 T 세포 수용체, 키메라 항원 수용체(CAR), 바람직하게는 MART1 TCR, 사이토카인 및/또는 본 명세서의 다른 곳에서 특정된 바와 같은 유전 질환으로 영향을 받는 세포에서 결여되는 폴리펩티드이다. 바람직하게는, CAR 및/또는 T-세포 수용체는 종양 항원 특이적이다. 따라서, 예를 들어 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 페닐케톤뇨증의 치료를 위한 페닐알라닌-하이드록실라아제 활성(EC 1.14.16.1)을 제공하는 폴리펩티드를 인코딩하거나, 맥락막결손증을 치료하기 위한 REP1 유전자를 인코딩하거나, 레베르 선천성 흑암시를 치료하기 위한 RPE65 유전자를 인코딩하거나, 혈우병을 치료하기 위한 인자들 VIII, IX 및/또는 X를 인코딩하거나, 어셔 질환(Ushers disease)을 치료하기 위한 USH2a 유전자를 인코딩하는 적어도 하나의 발현 가능한 작제물을 포함한다.
용어 "항체"는 본 명세서에서 가장 넓은 의미로 사용되며 특히 단클론 항체들, 적어도 2개의 온전한 항체(intact antibody)로부터 형성되는 다중특이적 항체(예를 들어 이중특이적 항체), 단일쇄 항체, 또한 나노바디로도 알려진 단일-도메인-항체(VHH) 및 소정의 결합 활성을 나타내는한 항체 단편을 포함한다. 바람직하게는, 항체는 단일쇄 항체 또는 VHH(나노바디)이다. 바람직하게는, 항체는 치료용 항체이고, 즉 질환-연관 분자, 바람직하게는 치료 연관의 폴리펩티드에 대한 결합 활성을 갖고, 상기 질환-연관 분자에 의해 야기되거나 악화되는 질환 또는 장애의 치료에 기여한다. 본 명세서에서 관련되는 바와 같이, "항체 단편"은 그의 항원-결합 영역을 포함하는 온전한 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 다이어바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성되는 다중특이적 항체가 포함된다. 항체의 파파인 소화는, "Fab" 단편으로 불리우며, 각각이 단일 항원-결합 부위를 수반하는 2개의 동일한 항원-결합 단편 및 그 명칭이 용이하게 결정화할 수 있는 능력을 반영하는, 잔여 "Fc" 단편을 생성한다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위들을 갖고 여전히 항원을 가교결합시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다. "Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 바람직하게는, 2-쇄 Fv 종은 긴밀한 비-공유의 연합으로 하나의 중쇄 가변 도메인 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 단일쇄 Fv(scFv) 종에서, 하나의 중쇄 가변 도메인 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 2-쇄 Fv 종에서와 유사한 "이량체성" 구조로 연합할 수 있도록 가요성의 펩티드 링커에 의해 공유적으로 연결될 수 있다. 이러한 구성에서 각 가변 도메인의 3개의 초가변 영역(HVRs, 또한 상보적 결정 영역(CDRs)으로도 언급됨)이 상호작용하여 항원-결합 부위를 정의한다. 집합적으로, 6개의 HVR이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 비록 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도에서도, 심지어 단일 가변 도메인(또는 항원에 대해 특이적인 3개의 HVR들 만을 포함하는 Fv의 절반)도 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다. 용어 "다이어바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 의미하고, 이 단편은 동일 폴리펩티드쇄(VH-VL)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결되는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 페어링을 허용하기에 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 강제로 페어링하고 2개의 항원-결합 영역을 생성한다. 다이어바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 항-종양 항원 항체, 보다 바람직하게는 항-종양 특이적 항원 항체, 보다 더 바람직하게는 항-암배아 항원(CEA) 항체, 보다 더 바람직하게는 단쇄 항-CEA 항체이다.
용어 "치료하는" 및 "치료"는 본 명세서에서 언급되는 질환 또는 장애 또는 이에 수반되는 증상의 유의미한 정도까지의 개선을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 상기 치료는 또한 본 명세서에서 언급되는 질환 또는 장애에 대한 건강의 전체 회복을 포함한다. 그 용어가 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 치료는 치료되어야 하는 모든 대상체들에서 효과적이지 않을 수 있다는 것은 이해되어야 한다. 그러나, 용어는, 바람직하게는, 본 명세서에서 언급되는 질환 또는 장애로 고통받는 대상체의 통계학적으로 유의미한 부분이 성공적으로 치료될 수 있는 것을 필요로 할 것이다. 부분이 통계학적으로 유의미한 지의 여부는 다양한 충분히 공지된 통계학적 평가 도구, 예를 들어, 신뢰 구간들의 결정, p-값 결정, Student's t-test, Mann-Whitney test 등을 사용하여 당해 기술분야에서 통상의 기술자에 의해 추가의 상당한 노력을 수반함이 없이 결정될 수 있다. 바람직한 신뢰 구간들은 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이다. p-값은, 바람직하게는, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 또는 0.0001이다. 바람직하게는, 치료는 주어진 코호트 또는 집단의 대상체의 적어도 10%, 적어도 20% 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%에 대하여 유효할 수 있다. 통상의 기술자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 질환, 예를 들어 암의 치료의 유효성은 예를 들어 질환 단계 및 질환 형태를 포함하여 다양한 인자에 의존적이다. 바람직하게는, 암을 치료하는 것은 대상체에서 종양 부담을 감소시키거나 종양 부담을 일정하게 유지하는 것이다. 따라서, 바람직하게는 치료는 종양이 성장하는 것을 중단시키고, 보다 바람직하게는 종양의 퇴행을 야기하고, 보다 바람직하게는 종양을 해결하는 효과를 갖는다.
용어 "예방"은 대상체에서 특정한 기간 동안 본 명세서에서 언급되는 질환 또는 장애에 대해 건강을 유지하는 것을 의미한다. 상기 기간은 투여되는 약물 화합물의 양 및 본 상세한 설명의 다른 곳에서 논의되는 대상체의 개별 요인에 의존적일 수 있다는 것은 이해될 것이다. 예방이 본 발명에 따른 화합물로 처리되는 모든 대상체에서 유효하지 않을 수 있다는 것은 이해되어야 한다. 그러나, 용어는, 바람직하게는, 코호트 또는 집단의 대상체의 통계적으로 유의미한 부분이 본 명세서에서 언급되는 질환 또는 장애 또는 이에 수반되는 증상로부터의 고통이 효과적으로 예방되는 것을 요구한다. 바람직하게는, 대상체의 코호트 또는 집단은 이러한 맥락에서 정상적으로, 즉 본 발명에 따른 예방 조치들을 수반함이 없이 본 명세서에서 언급되는 바와 같은 질환 또는 장애가 발달할 수 있다는 것이 예상된다. 부분이 통계학적으로 유의미한 지의 여부는 본 상세한 설명의 다른 곳에서 논의된 다양한 충분히 공지된 통계학적 평가 도구를 사용하여 당해 기술분야에서 통상의 기술자에 의해 추가의 상당한 노력을 수반함이 없이 결정될 수 있다.
"스캐폴드/매트릭스 부착 영역"이라는 명칭으로도 공지된, 용어 "S/MAR 요소"는, 원칙적으로, 상기 DNA에 진핵생물 세포의 핵 매트릭스의 부착을 매개하는 DNA 서열과 연관된 것으로 통상의 기술자에게 공지되어 있다. S/MAR 서열은 전형적으로 진핵생물 염색체들의 DNA 내 서열로부터 유래된다. 다양한 S/MAR 서열이 이용가능하고 서열은 예를 들어 Liebich et al. (2002), Nucleic Acids Res. 30, 312-374에 기술된 바와 같이 공공 데이터베이스로부터 이용가능하다. 본 발명에 따르면, 상기 S/MAR 요소의 핵산 서열("S/MAR 서열"로 언급됨)는 바람직하게는 서열번호 1과 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 93%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 포함하고/하거나 서열번호 2와 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 93%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 포함하고 보다 바람직하게는 서열번호 1과 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 93%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 바람직하게는, S/MAR 요소는 서열번호 3과 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 93%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 보다 더 바람직하게는 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 또한 바람직하게는, S/MAR 요소는 Genbank 수탁 번호 AY220727.1(서열번호 4)에 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 93%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다.
바람직하게는, 에피솜 폴리뉴클레오티드는 특히 선별 마커 폴리펩티드를 코딩하는 선별 마커 유전자를 포함하거나 추가로 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "선별 마커 유전자"는 표현 "선별 마커 폴리펩티드를 인코딩하는 발현 가능한 코딩 서열"에 대한 약칭으로서 사용된다. 용어 "선별 마커"는 원칙적으로 통상의 기술자에 의해 이해되고, 숙주 세포에서 발현되는 경우, 숙주 세포에 적용될 때 숙주 세포에 대한 선택적 압력을 매개하는 적어도 하나의 조건에 대하여 내성을 부여하는 핵산 서열에 관한 것이다. 원핵생물 및 진핵생물 세포들에 대한 선별 마커는 당해 기술분야에서 공지되어 있다. 바람직하게는, 선별 마커는 진핵생물 세포의 선별 마커이다. 바람직하게는, 선별 마커는 선별 마커 폴리펩티드, 보다 바람직하게는 숙주 세포로부터 선택적 화합물을 제거하거나 또는 이를 불활성으로 만들기 위해 상기 선택적 화합물을 변형하는 수송체 및/또는 효소 활성을 갖는 선별 마커 폴리펩티드이다. 바람직하게는, 선별 마커는 퓨로마이신, 블라스티시딘, 네오마이신 및/또는 제오신, 보다 바람직하게는 퓨로마이신에 대한 내성을 매개하는 마커이다. 따라서, 바람직하게는, 에피솜 폴리뉴클레오티드는 2차 프로모터 및 선별 마커를 포함하고, 이들은 함께 예를 들어 퓨로마이신 내성 유전자, 블라스티시딘 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자 또는 제오신 내성 유전자, 보다 바람직하게는 퓨로마이신 내성 유전자를 구성한다. 그러나, 선별 마커 서열은 또한 위에서 특정된 바와 같은 발현 가능한 서열의 일부일 수 있고, 선별 마커 서열은 발현 가능한 서열이거나, 발현 가능한 서열에 의해 인코딩된 융합 폴리펩티드의 일부이거나, 예컨대 리보솜 재진입 부위를 통해 별개의 폴리펩티드로서 발현될 수 있다. 바람직하게는, 선별 마커는 특정 세트의 성장 조건, 바람직하게는 증식 신호의 존재 및/또는 부재에 대해 내성을 제공하는 폴리펩티드이다. 따라서, 하나의 바람직한 구현예에서, 선별 마커는 T-세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)이고, 이 둘 모두는 원칙적으로 당해 기술분야에서 공지되어 있고, 바람직하게는 본 명세서의 다른 곳에서 특정된 바와 같다. 바람직하게는, TCR 및/또는 CAR은, 바람직하게는, T 세포 신호가 상기 TCR 및/또는 CAR을 포함하는 숙주 세포에서 유도될 수 있도록 공지된 특이성을 갖는다. 바람직하게는, 이러한 경우, 숙주 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다. 따라서, 본 명세서의 다른 곳에서 특정된 바와 같은 프로모터 및 발현 가능한 서열은 함께 선별 마커 유전자를 구성할 수 있다.
유리하게는, 프로모터 및 발현 가능한 서열을 포함하고, 상기 프로모터의 상류에 S/MAR 요소를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드가 진핵생물 세포에서 에피솜적으로 유지되며, 즉 숙주 세포의 유전자 내로 통합되지 않는다는 것을 본 발명의 기초가 되는 연구에서 발견하였다. 따라서, 의도하지 않는 유전적 변형의 위험이 감소되기 때문에, 본 발명의 에피솜 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포는 발현 작제물의 통합된 카피를 포함하는 숙주 세포 보다 더 명확하게 정의되고/되거나 유전적으로 안정하여 본 명세서에서 기술되는 이러한 숙주 세포가 치료용 세포로서 특히 적합하게 한다.
위에서 이루어지는 정의는 또한 준용하여 하기에 적용된다. 아래에서 이루어지는 추가의 정의 및 설명은 또한 본 상세한 설명에서 기술되는 모든 구현예들에 대하여도 준용하여 적용된다.
본 발명은 또한 약제로서 사용하기 위한, 특히 대상체에서 유전 질환의 면역요법 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 명세서에 명시된 치료용 세포에 관한 것이다.
바람직하게는, 앞서 언급된 사용은 본 명세서에서 특정된 바와 같은 치료용 세포 및/또는 동물 숙주 세포의 유효한 투여량의 대상체로의 투여를 포함하고; 보다 바람직하게는, 유전 질환의 면역요법 및/또는 치료는 상기 치료용 세포 또는 동물 숙주 세포의 적어도 105개, 바람직하게는 적어도 106개, 보다 바람직하게는 적어도 107개의 대상체로의 투여를 포함한다. 이해될 수 있는 바와 같이, 치료용 세포은, 바람직하게는 앞서 언급된 투여량으로 1회 이상, 예를 들어 바람직하게는 적어도 2회, 보다 바람직하게는 적어도 3회, 보다 더 바람직하게는 적어도 5회, 가장 바람직하게는 적어도 10회 투여될 수 있다. 또한 바람직하게는, 앞서 언급된 사용들은 바람직하게는 상기 대상체의 체내에서 적어도 1개월, 바람직하게는 적어도 6개월, 보다 바람직하게는 적어도 1년 동안의 상기 치료용 세포들의 유지를 포함하며, 용어 "유지"는 검출가능한 상태 및 수에서의 지속되는 존재와 연관된다.
용어 "대상체"는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 동물, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 포유동물, 특히 소, 말, 돼지, 양 및 염소와 같은 가축 또는 랫트, 마우스 및 기니피그와 같은 실험실 동물과 연관된다. 가장 바람직하게는, 대상체는 인간이다. 바람직하게는, 대상체는 본 명세서에 연관되는 바와 같은 질환, 바람직하게는 암, 자가면역 질환 및/또는 유전 질환으로 고통받을 위험에 있거나, 고통받는 것으로 예상되거나, 고통받고 있다.
용어 "암"은, 본 명세서에서 언급되는 바와 같이, 일군의 신체 세포("암 세포")에 의한 제어되지 않는 성장으로 특정된, 사람을 포함하여 동물의 질환을 의미한다. 이러한 제어되지 않는 성장은 암 세포의 덩어리("종양")를 형성할 수 있으며, 이는 주변 조직 내로의 침입 및 파괴("침윤") 및 가능하게는 신체 내의 다른 위치로의 암 세포의 확산("전이")을 수반할 수 있다. 더욱이, 암은 대상체로부터의 암 세포를 명백하게 제거하는 초기 치료 이후 암 세포의 회귀("재발")을 수반할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 암 세포는 바람직하게는 암 줄기 세포를 포함한다. 바람직하게는, 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 부신피질암종(adrenocortical carcinoma), 에이즈-연관 림프종(aids-related lymphoma), 항문암(anal cancer), 충수암(appendix cancer), 성상세포종(astrocytoma), 비정형 유기형종양(atypical teratoid), 기저세포암종(basal cell carcinoma), 담관암(bile duct cancer), 방광암(bladder cancer), 뇌간 교종(brain stem glioma), 유방암(breast cancer), 버킷림프종(burkitt lymphoma), 카르시노이드 종양(carcinoid tumor), 소뇌성상세포종(cerebellar astrocytoma), 자궁경부암(cervical cancer), 척삭종(chordoma), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 결장암(colon cancer), 대장암(colorectal cancer), 두개인두종(craniopharyngioma), 자궁내막암(endometrial cancer), 뇌실막모세포종(ependymoblastoma), 상의세포종(ependymoma), 식도암(esophageal cancer), 두개 외 배세포종(extracranial germ cell tumor), 성선외생식세포종(extragonadal germ cell tumor), 간외담관암(extrahepatic bile duct cancer), 담낭암(gallbladder cancer), 위암(gastric cancer), 위장관 기질 종양(gastrointestinal stromal tumor), 융모상피성 종양(gestational trophoblastic tumor), 털세포백혈병(hairy cell leukemia), 두경부암(head and neck cancer), 간세포암(hepatocellular cancer), 호지킨 림프종(hodgkin lymphoma), 하인두암(hypopharyngeal cancer), 시상하부 및 시각 경로 신경교종(hypothalamic and visual pathway glioma), 안구내흑색종(intraocular melanoma), 카포시육종(kaposi sarcoma), 후두암(laryngeal cancer), 수모세포종(medulloblastoma), 수질피종(medulloepithelioma), 흑색종(melanoma), 머켈세포암종(merkel cell carcmoma), 중피종(mesothelioma), 구강암(mouth cancer), 다발성내분비선종 증후군(multiple endocrine neoplasia syndrome), 다발성 골수종(multiple myeloma), 균상식육종(mycosis fungoides), 비강 및 부비동 암(nasal cavity and paranasal sinus cancer), 비인두암(nasopharyngeal cancer), 신경모세포종(neuroblastoma), 비-호지킨 림프종(non-hodgkin lymphoma), 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 구강암(oral cancer), 구인두암(oropharyngeal cancer), 골육종(osteosarcoma), 난소암(ovarian cancer), 난소상피암(ovarian epithelial cancer), 생식세포종양(ovarian germ cell tumor), 난소 경계악성종양(ovarian low malignant potential tumor), 유두종증(papillomatosis), 부비동 및 비강암(paranasal sinus and nasal cavity cancer), 부갑상선암(parathyroid cancer), 음경암(penile cancer), 인두암(pharyngeal cancer), 크롬친화성세포종(pheochromocytoma), 뇌하수체 종양(pituitary tumor), 가슴막폐모세포종(pleuropulmonary blastoma), 원발 중추신경계 림프종(primary central nervous system lymphoma), 전립선암(prostate cancer), 직장암(rectal cancer), 신세포암(renal cell cancer), 망막모세포종(retinoblastoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 침샘암(salivary gland cancer), 세자리증후군(sezary syndrome), 피부암(skin cancer), 소세포폐암(small cell lung cancer), 소장암(small intestine cancer), 연부조직육종(soft tissue sarcoma), 편평세포암종(squamous cell carcmoma), 편평목암(squamous neck cancer), 고환암(testicular cancer), 인후암(throat cancer), 흉선암(thymic carcinoma), 흉선종(thymoma), 갑상선암(thyroid cancer), 요도암(urethral cancer), 자궁육종(uterine sarcoma), 질암(vaginal cancer), 외음부암(vulvar cancer), 발덴스트룀 거대글로불린혈증(waldenstrom macroglobulinemia) 및 빌름스 종양(wilms tumor)으로 이루어지는 목록으로부터 선택된다.
용어 "자가면역 질환"은, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 대상체의 신체에 정상적으로 존재하는 물질 및 조직에 대한 상기 대상체의 면역계의 비정상적인 면역 반응으로 일어나는 질환을 의미한다. 자가면역은 전체 유기체에 영향을 미칠 수 있거나, 특정한 기관들로 제한될 수 있거나, 가능하게는 신체의 상이한 위치에서 특정한 조직 유형을 포함할 수 있다. 자가면역 질환의 진단은 개체의 증상, 신체 검사로부터의 소견 및 실험실 테스트로부터의 결과에 기반한다. 자가면역 질환에 대한 전형적인 테스트에는 당해 기술분야에서 공지되어 있고 혈액 검사, 소변 검사, 면봉 검사, 진단 시험, 실험실 시험 및 병리학적 검사가 포함된다. 그러나, 일부 자가면역 질환은 특히 질환의 초기 단계에서 진단하기 어려울 수 있다. 바람직하게는, 자가면역 질환은 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE), 유육종증(sarcoidosis), 경피증(scleroderma), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 제1형 진성당뇨병(Diabetes mellitus type 1), 자가면역성갑상선염(autoimmune thyroiditis)(예를 들어 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis)), 에디슨병(Addison's disease) 및 다발성 경화증(multiple sclerosis)이다.
용어 "유전 질환"은, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 대상체의 유전자 내에서 하나 이상의 변형, 바람직하게는 돌연변이와 인과적으로 연관되는 질환과 연관된다. 따라서, 바람직하게는, 유전 질환은 하나 이상의 후생적 변화와 인과적으로 연관되며, 보다 바람직하게는 하나 이상의 유전적 돌연변이와 인과적으로 연관된다. 이해될 수 있는 바와 같이, 유전 질환의 증상은 종종 돌연변이된 유전자의 발현 및/또는 하나 이상의 특정한 조직(들) 및/또는 세포 유형(들)에서 유전자 생성물의 정상 기능을 제공하는 유전자의 발현의 결여에 의해 야기된다. 따라서, 돌연변이가 질환에 기여하는 세포에서만 유전 질환을 치료하는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하게는, 유전 질환은 단일유전자 질환이고, 즉 하나의 유전자 내에서의 유전적 변경에 의해 야기된다. 보다 바람직하게는, 유전 질환은 단일유전자 열성 질환이고, 즉 하나의 유전자의 양쪽 대립유전자 내에서의 유전적 변경에 의해 야기되며; 따라서, 바람직하게는, 증상의 개선은 영향받은 유전자의 적어도 하나의 변경되지 않은 카피의 제공에 의해 기대된다. 가장 바람직하게는, 유전 질환은 페닐케톤뇨증, 알캅톤뇨증, 레베르 선천적 흑암시, 맥락막결손증 또는 스타르가르트병이다. 하나의 바람직한 구현예에서, 유전 질환은 암이다.
용어 "면역요법"은, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 대상체의 면역 반응의 조절에 의해 질환, 바람직하게는 암 및/또는 자가면역 질환의 치료 및/또는 예방과 연관된다. 상기 조절은, 바람직하게는 본 명세서에서 특정된 바와 같은 치료용 세포, 에피솜 폴리뉴클레오티드 또는 발현 작제물의 투여에 의해 상기 면역 반응을 유도, 향상 또는 억제할 수 있다. 상기 면역요법은, 예를 들어 적어도 하나의 사이토카인 및/또는 예를 들어 암 세포를 특이적으로 인식하는 적어도 하나의 항체의 투여를 추가로 포함할 수 있다. 용어 "세포 기반 면역요법"은 면역 세포, 예를 들어 대상체에 T-세포, 바람직하게는 종양-특이적 NK 세포의 적용을 포함하는 요법과 연관된다. 바람직하게는, 상기 면역 세포는 위에서 특정된 바와 같은 치료용 세포들, 특히 T 세포 수용체, 바람직하게는 CAR을 인코딩하는 발현 가능한 서열을 포함하는 치료용 세포이다.
본 발명은 S/MAR 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 상기 S/MAR 요소는 서열번호 3과 적어도 93%, 바람직하게는 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
폴리뉴클레오티드에서, S/MAR 요소는 서열번호 3과 적어도 93%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 보다 더 바람직하게는 적어도 98%, 보다 더 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, S/MAR 요소는 서열번호 3과 적어도 93%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 보다 더 바람직하게는 적어도 98%, 보다 더 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100% 동일한 핵산 서열로 구성된다.
바람직하게는, S/MAR 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 카고(cargo) 서열을 추가로 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "카고 서열"은 숙주 세포 내로 도입되기 위한 것으로 통상의 기술자에게 바람직한 것으로 간주되는 임의의 서열에 관한 것이다. 따라서, 카고 서열은 바람직하게는 유전자의 자연적 구성에서 하나의 유전자 또는 그의 일부를 포함하는 핵산 서열일 수 있다. 따라서, 카고 서열은 프로모터, 전사 인자 결합 부위, 종결 부위, 인핸서 등과 같은 조절 서열을 포함할 수 있다. 카고 서열은 또한 유전자의 자연 인트론/엑손 구조를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 카고 서열은 위에서 특정된 바와 같은 적어도 하나의 발현 가능한 서열을 포함하며, 보다 바람직하게는 상류 프로모터(upstream promoter)를 함께 포함한다.
본 발명은 또한 하나의 발현 가능한 서열 및 하나의 프로모터를 포함하는 발현 작제물에 관한 것이고, 상기 발현 작제물은 상기 프로모터의 상류에 S/MAR 요소를 추가로 포함하고, 및 상기 발현 작제물은 포유동물 세포에서 에피솜적으로 복제된다.
용어 "프로모터", "발현 가능한 서열", "S/MAR 요소" 및 "에피솜 복제"는 위에서 정의되었다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 발현 작제물은 바람직하게는 원숭이 바이러스 40(SV40) 복제 기원, 소 유두종 바이러스(BPV) 복제 기원 및 엡스타인-바 바이러스(EBV) 복제 기원이 없고, 바람직하게는 폴리오마바이러스 복제 기원, 파필로마바이러스 복제 기원 및 헤르페스바이러스 복제 기원이 없고; 보다 바람직하게는 진핵생물-감염 바이러스의 복제 기원이 없다. 보다 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드 및 발현 작제물은 바람직하게는 임의의 공지된 진핵생물 복제 기원이 없다. 그러나, 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드 및 발현 작제물은 원핵생물, 바람직하게는 박테리아 복제 기원, 특히 대장균 복제 기원을 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 원핵생물 복제 기원은 폴리뉴클레오티드 및/또는 발현 작제물에 포함되는 유일한 복제 기원이다.
본 발명은 또한 약제로서 사용하기 위한, 및/또는 대상체에서의 유전 질환의 면역요법 및/또는 치료에서 사용하기 위한 위에서 특정된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 및/또는 위에서 특정된 바와 같은 발현 작제물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명에 따른 발현 작제물을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
용어 "벡터"는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 숙주 세포, 바람직하게는 비-치료 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드의 증식, 증폭 및/또는 패키징을 허용하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 바람직하게는, 용어는 파지, 플라스미드, 바이러스 또는 레트로바이러스와 마찬가지로 박테리아 또는 효모 인공 염색체들과 같은 인공 염색체들을 포함한다. 따라서, 벡터는 박테리아 세포에서 증식되고 증폭될 수 있는 플라스미드 벡터일 수 있고; 따라서, 플라스미드 벡터는 바람직하게는 박테리아 복제 기원을 포함한다. 벡터는 또한 허용 세포 또는 패키징 세포주에서 증식되고, 증폭되고/되거나 패키징될 수 있는 바이러스 벡터일 수 있다. 따라서, 바이러스 벡터는 바이러스 복제 및/또는 패키징에 필요한 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 바이러스 벡터 복제를 허용하는 세포 및/또는 패키징 세포주는 치료용 세포는 아니다. 벡터는 또한 비-치료용 세포, 예를 들어, 박테리아 세포, 효모 세포 또는 곤충 세포의 인공 염색체일 수 있다. 각각의 벡터에 대한 적절한 서열은 당해 기술분야에서 공지되어 있다. 벡터는 당해 기술분야에서 충분히 공지된 여러 기술에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 벡터는 인산칼슘 침전물 또는 염화루비듐 침전물과 같은 침전물로 또는 하전된 지질과 함께 복합체 또는 풀러렌과 같은 탄소-기반 클러스터에 도입될 수 있다. 대안으로, 플라스미드 벡터는 열충격 또는 전기천공 기술들에 의해 도입될 수 있다. 벡터가 바이러스인 경우, 숙주 세포에 적용하기 전에 벡터는 시험관 내(in vitro)에서 적절한 패키징 세포주를 사용하여 패키징될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 벡터는 박테리아 벡터이고, 바람직하게는 p15A 복제 기원을 갖고/갖거나 가나마이신 내성 유전자를 운반한다. 당해 기술분야에서 통상의 기술자에게 충분히 공지된 방법들이 재조합 벡터들을 구축하는 데 사용될 수 있다; 예를 들어, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. 및 Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)에 기재된 기술들 참조.
본 발명은 또한 카고 서열 및 S/MAR 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로, 상기 폴리뉴클레오티드가 포유동물 숙주 세포에서 에피솜적으로 유지되고 그리고 상기 S/MAR 요소가 세포 당 최대 10개의 검출가능한 카피, 바람직하게는 세포 당 최대 1개의 검출가능한 카피, 보다 더 바람직하게는 세포 당 최대 0.1개의 카피, 가장 바람직하게는 검출불가능한 수준의 빈도로 전사된다.
용어 "카고 서열"은 위에서 특정되었다. 카고 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 위에서 특정된 바와 같이, 동물 숙주 세포, 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에서 에피솜적으로 유지된다.
카고 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서, S/MAR 서열은 세포 당 최대 10개의 검출가능한 카피, 바람직하게는 세포 당 최대 1개의 검출가능한 카피, 보다 더 바람직하게는 세포 당 최대 0.1개의 카피, 가장 바람직하게는 검출불가능한 수준의 빈도로 전사된다. 세포 당 하나의 RNA의 검출가능한 카피의 수를 결정하기 위한 수단 및 방법은 당해 기술분야에서 공지되어 있고; 바람직하게는, 상기 방법은 바람직하게는 qPCR, 보다 바람직하게는 RT-qPCR이며, 바람직하게는 세포 당 0.01 카피의 검출 한계를 갖는다. 바람직하게는, 카고 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 내의 S/MAR 요소는 카고 서열에 포함되는 임의의 프로모터가 S/MAR 요소로부터 멀어져서 전사를 유도하도록 위치하고; 따라서, S/MAR 요소는 바람직하게는 카고 서열에 포함되는 임의의 프로모터의 상류에 위치한다.
본 발명은 또한 S/MAR 요소를 포함하는 동물 숙주 세포에 관한 것이며, 상기 S/MAR 요소는 서열번호 1과 적어도 70% 동일한 핵산 서열 및/또는 서열번호 2와 적어도 70% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 동물 숙주 세포에 관한 것으로, 대상체에서 유전 질환의 면역요법 및/또는 치료에 사용하기 위한 것이다.
또한 본 발명은 약물의 제조에서 사용하기 위한 본 발명의 카고 서열을 포함하는 치료용 세포, 발현 작제물, 폴리뉴클레오티드, 동물 숙주 세포, 발현 작제물, 벡터 및/또는 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로, 특히 유전 질환의 면역요법 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것이다.
또한 본 발명은 본 명세서에서 특정되는 바와 같은 질환, 바람직하게는 암, 자가면역 질환 및/또는 유전 질환으로 고통받는 대상체를 치료하기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 대상체를 본 발명의 카고 서열을 포함하는 치료용 세포, 발현 작제물, 폴리뉴클레오티드, 동물 숙주 세포, 발현 작제물, 벡터 및/또는 폴리뉴클레오티드와 접촉시키고, 그에 의해, 상기 질환을 치료하는 것을 포함한다.
위의 관점에서, 아래의 구현예들이 특히 예상된다:
1. 프로모터 및 발현 가능한 서열을 포함하는 에피솜 폴리뉴클레오티드를 포함하는 치료용 세포로서,
상기 에피솜 폴리뉴클레오티드가 상기 프로모터의 상류에 S/MAR 요소를 추가로 포함하는, 치료용 세포.
2. 제1항에 있어서, 상기 발현 가능한 서열이 치료용 유전자 산물, 바람직하게는 치료용 폴리펩티드를 인코딩하는, 치료용 세포.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 치료용 폴리펩티드가 항체, T 세포 수용체(TCR), 키메라 항원 수용체(CAR), 사이토카인 및/또는 유전 질환으로 영향을 받는 세포에서 결여되는 폴리펩티드인, 치료용 세포.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR 및/또는 상기 T-세포 수용체가 종양 항원 특이적인, 치료용 세포.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에피솜 폴리뉴클레오티드가 선별 마커 유전자를 포함하는, 치료용 세포.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 S/MAR 요소가 서열번호 l과 적어도 70% 동일한 핵산 서열 및/또는 서열번호 2와 적어도 70% 동일한 핵산 서열, 바람직하게는 서열번호 3과 적어도 70% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 치료용 세포.
7. S/MAR 요소를 포함하는 동물 숙주 세포로서, 상기 S/MAR 요소가 서열번호 l과 적어도 70% 동일한 핵산 서열 및/또는 서열번호 2와 적어도 70% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 동물 숙주 세포.
8. 제7항에 있어서, 상기 숙주 세포가 치료용 세포인, 동물 숙주 세포.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 S/MAR 요소가 에피솜 폴리뉴클레오티드에 포함되는, 동물 숙주 세포.
10. 제9항에 있어서, 상기 에피솜 폴리뉴클레오티드가 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에서 특정된 적어도 하나의 특징을 포함하는, 동물 숙주 세포.
11. 약제로서 사용하기 위한, 특히 대상체에서 유전 질환의 면역요법 및/또는 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 치료용 세포 또는 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 동물 숙주 세포.
12. 제11항에 있어서, 상기 면역요법이 암 및/또는 자가면역 질환의 치료 및/또는 예방인, 사용을 위한 치료용 세포 또는 사용을 위한 동물 숙주 세포.
13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 유전 질환의 면역요법 및/또는 치료가 대상체에 상기 치료용 세포 또는 동물 숙주 세포를 적어도 105개, 바람직하게는 적어도 106개, 보다 바람직하게는 적어도 107개의 투여를 포함하는, 사용을 위한 치료용 세포 또는 사용을 위한 동물 숙주 세포.
14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 질환의 면역요법 및/또는 치료가 적어도 1개월, 바람직하게는 적어도 6개월, 보다 바람직하게는 적어도 1년 동안 상기 치료용 세포 또는 동물 숙주 세포의 유지를 포함하는, 사용을 위한 치료용 세포 또는 사용을 위한 동물 숙주 세포.
15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 상기 치료용 세포 또는 숙주 세포의 반복되는 투여를 포함하는, 사용을 위한 치료용 세포 또는 사용을 위한 동물 숙주 세포.
16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료용 세포 또는 숙주 세포가 상기 대상체의 동계 세포, 바람직하게는 자가유래 세포인, 사용을 위한 치료용 세포 또는 사용을 위한 동물 숙주 세포.
17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료용 세포 또는 숙주 세포가 수령자의 면역계에 의해 거부되지 않는, 사용을 위한 치료용 세포 또는 사용을 위한 동물 숙주 세포.
18. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 S/MAR 요소가 서열번호 2와 적어도 70% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 대상물.
19. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 S/MAR 요소가 서열번호 3과 적어도 70% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 대상물.
20. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 S/MAR 요소가 상기 치료용 세포 또는 숙주 세포에서 에피솜적으로 유지되는, 대상물.
21. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료용 세포 또는 숙주 세포가 척추동물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 보다 바람직하게는 인간 세포인, 대상물.
22. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료용 세포 또는 숙주 세포가 면역 세포, 바람직하게는, CD34+ 전구 세포; CD61+ 혈소판; CD19+ B-림프구; CD14+ 단핵구; CD15+ 과립구; 바람직하게는 또한 CD8 및 CD45에 대해 양성인, CD3+ 세포독성 T-림프구; 바람직하게는 또한 CD4 및 CD45에 대해 양성인, CD3+ 헬퍼 T-림프구; 바람직하게는 또한 CD25 및 CD45에 대해 양성인, CD3+ 활성화 T-림프구, 종양 침윤성 림프구 또는 자연 살해(NK) 세포인, 대상물.
23. S/MAR 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서,
상기 S/MAR 요소가 서열번호 3과 적어도 93%, 바람직하게는 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
24. 제23항에 있어서, 발현 가능한 서열 및 프로모터, 바람직하게는 포유동물 프로모터를 추가로 포함하고, 상기 S/MAR 서열이 상기 프로모터의 상류에 위치하는, 폴리뉴클레오티드.
25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 발현 가능한 서열이 치료용 유전자 산물, 바람직하게는 치료용 폴리펩티드를 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 선별 마커 유전자를 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
27. 약제로서 사용하기 위한, 특히 대상체에서 유전 질환의 면역요법 및/또는 치료에 사용하기 위한, 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드 및/또는 제27항에 따른 벡터.
28. 발현 가능한 서열 및 프로모터를 포함하는 발현 작제물로서,
상기 발현 작제물이 상기 프로모터의 상류에 S/MAR 요소를 추가로 포함하고, 및
상기 발현 작제물이 포유동물 세포에서 에피솜적으로 복제하는, 발현 작제물.
29. 제28항에 있어서, 상기 발현 작제물이 원숭이 바이러스 40(SV40) 복제 기원, 소 유두종 바이러스(BPV) 복제 기원 및 엡스타인-바 바이러스(EBV) 복제 기원이 없고, 바람직하게는 폴리오마바이러스 복제 기원, 파필로마바이러스 복제 기원 및 헤르페스바이러스 복제 기원이 없고; 보다 바람직하게는 진핵생물-감염 바이러스, 바람직하게는 포유동물-감염 바이러스의 복제 기원이 없는, 발현 작제물.
30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 발현 가능한 서열이 치료용 폴리펩티드를 인코딩하는, 발현 작제물.
31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료용 폴리펩티드가 항체, T 세포 수용체(TCR), 키메라 항원 수용체(CAR), 사이토카인 및/또는 유전 질환으로 영향을 받는 세포에서 결여되는 폴리펩티드인, 발현 작제물.
32. 제31항에 있어서, 상기 CAR 및/또는 상기 T-세포 수용체가 종양 항원 특이적인, 발현 작제물.
33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 청구항 24항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 바람직하게는 이로 구성되는, 발현 작제물.
34. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드 및/또는 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 발현 작제물을 포함하는 벡터.
35. 카고 서열 및 S/MAR 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서,
상기 폴리뉴클레오티드가 동물 숙주 세포에서 에피솜적으로 유지되고, 및
상기 S/MAR 요소가 세포 당 최대 10개의 검출가능한 카피, 바람직하게는 세포 당 최대 1개의 검출가능한 카피, 보다 더 바람직하게는 세포 당 최대 0.1개의 카피, 가장 바람직하게는 검출불가능한 수준의 빈도로 전사되는, 폴리뉴클레오티드. (qPCR)
36. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 S/MAR 요소가 이종성 S/MAR 요소인, 대상물.
37. 면역요법에서 사용하기 위한 구현예 27의 대상물로서,
상기 면역요법이 대상체의 면역 반응의 조절에 의해 암 및/또는 자가면역 질환의 치료 및/또는 예방인, 대상물.
38. 유전 질환의 치료에서 사용하기 위한 구현예 27의 대상물로서,
유전 질환이 단일유전자 열성 질환(monogenic recessive disease)이고, 바람직하게는 페닐케톤뇨증(phenylketonuria, 알캅톤뇨증(alkaptonuria), 레베르 선천적 흑암시(Leber's Congenital Amaurosis), 맥락막결손증(Choroideremia) 또는 스타르가르트병(Stargardt disease)인, 대상물.
본 상세한 설명에서 언급된 모든 참고문헌들은 그들 전체 개시 내용 및 본 상세한 설명에서 구체적으로 언급되는 개시 내용에 대해 여기에 참고로 통합된다.
도 1: S/MAR 작제물에 대한 콜로니 형성 분석; 1 = GFP-β-인터페론 MAR, 2 = Mar1(서열번호 5)-GFP, 3 = Mar2(서열번호 3)-GFP, 4 = Mar3(서열번호 6)-GFP, 5 = Mar4(서열번호 7)-GFP; y-축: 내성 콜로니의 수.
도 2: 여러 작제물들을 운반하는 세포 집단의 전이유전자 발현(GFP+) 세포의 수 및 평균 형광 세기(MFI); 1 = 미변형 세포들, 2 = GFP-β-인터페론 MAR, 3 = Mar2-GFP.
도 3: 사우던 블롯(Southern blot)에 의한 에피솜 복제의 검출; a = Mar2-GFP 대조 벡터, b = Mar2-GFP로 확립된 Hek293T로부터 추출된 총 DNA; GFP 유전자가 검출됨.
도 4: Mar2(1, 서열번호 1)의 nt 220 내지 382, Mar2(2, 서열번호 2)의 nt 40 내지 110 및 Mar2(3, 서열번호 3)의 핵산 서열.
아래의 실시예들은 단지 본 발명을 예시할 것이다. 이들 실시예들은 어떤 이유로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지는 않을 것이다.
실시예 1: 콜로니 형성
콜로니 형성 분석으로 안정적으로 발현하는 세포의 생성 효율을 평가하였다(도 1). GFP 수용체 유전자 및 퓨로마이신 내성 유전자를 포함하는 벡터를 Hek293T 내로 전달한 후, GFP 전이유전자 발현에 대해 양성인 세포들을 FACS 분류(FACS Aria II)를 통해 단리하고 6 ㎝ 세포 배양 접시에 플레이팅하였다. 그런 다음 이들 세포를 1 ㎎/㎖ 퓨로마이신의 존재 하에서 3주 동안 배양시켰다. 3주 후 세포를 PFA로 고정시키고, 크리스털 바이올렛(Crystal Violet)으로 염색하고 계수하였다. 콜로니의 수를 벡터 확립의 효율로 간주한다. GFP 유전자의 S/MAR 서열 2(Mar2, 서열번호 3)를 포함하는 벡터 번호 3은 GFP 유전자의 β-인터페론 S/MAR 3'를 수반하는 대조 벡터에 필적하는 다수의 내성 콜로니를 생성하였지만, 벡터 2, 벡터 4 및 벡터 5는 어떠한 내성 세포도 산출하지 않았다.
실시예 2: 발현 수준
GFP를 발현하는 세포(GFP+)의 상대적인 수 및 확립된 집단의 평균 형광 세기(MFI)에 대해 실시예 1의 전이유전자 세포를 FACS로 분석하였다(도 2). GFP 유전자(2)의 β-인터페론 S/MAR 3'를 수반하는 대조 벡터 및 GFP 유전자의 S/MAR 2 5'를 포함하는 벡터 둘 모두 세포주를 생성하였고 여기에서 세포의 대부분(>95%)이 유사한 세기로 전이유전자를 발현하였다.
실시예 3: 에피솜 유지
DNA 전달 35일 후에 GFP의 S/MAR 서열 2 5'를 포함하는 벡터를 수반하는 Hek293T 세포로부터 총 DNA를 추출하고, 37℃에서 12시간 동안 제한 효소 BamHI로 소화시켰다. DNA 단편을 0.8% 아가로스 겔 상에서 분해하고 나일론 막 상으로 옮겼다. 동시에, 확립되기 전에 세포를 형질감염시키기 위해 사용된 맥시 프렙(maxi preparation)으로부터 플라스미드 DNA을 동일한 접근법으로 처리하였다. 리포터 유전자 GFP를 사용하여 대조군(a) 및 세포 집단 내의 벡터(b)를 시험하기 위한 방사성 프로브를 생성하였다. 플라스미드는 대응하는 대조 벡터와 비교할 때 동일한 크기를 가지며 이는 플라스미드의 에피솜 유지를 입증하고 있다.
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Claims (20)

  1. 프로모터 및 발현 가능한 서열을 포함하는 에피솜 폴리뉴클레오티드를 포함하는 치료용 세포로서,
    상기 에피솜 폴리뉴클레오티드가 상기 프로모터의 상류에 S/MAR 요소를 추가로 포함하는, 치료용 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 발현 가능한 서열이 치료용 유전자 산물, 바람직하게는 치료용 폴리펩티드를 인코딩하는, 치료용 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 발현 가능한 서열이 치료용 폴리펩티드를 인코딩하고,
    상기 치료용 폴리펩티드가 항체, T 세포 수용체(TCR), 키메라 항원 수용체(CAR), 사이토카인 및/또는 유전 질환으로 영향을 받는 세포에서 결여되는 폴리펩티드인, 치료용 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료용 폴리펩티드가 TCR인, 치료용 세포.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료용 폴리펩티드가 CAR인, 치료용 세포.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료용 폴리펩티드가 유전 질환으로 영향을 받는 세포에서 결여되는 폴리펩티드인, 치료용 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 에피솜 폴리뉴클레오티드가 선별 마커 유전자를 추가로 포함하는, 치료용 세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 S/MAR 요소가 서열번호 l과 적어도 70% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 치료용 세포.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 S/MAR 요소가 서열번호 2와 적어도 70% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 치료용 세포.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 S/MAR 요소가 서열번호 3과 적어도 70% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 치료용 세포.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료용 세포 또는 숙주 세포가 척추동물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 보다 바람직하게는 인간 세포인, 치료용 세포.
  12. 발현 가능한 서열 및 프로모터를 포함하는 발현 작제물로서,
    상기 발현 작제물이 상기 프로모터의 상류에 S/MAR 요소를 추가로 포함하고, 및
    상기 발현 작제물이 포유동물 세포에서 에피솜적으로 복제하는, 발현 작제물.
  13. S/MAR 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서,
    상기 S/MAR 요소가 서열번호 3과 적어도 93%, 바람직하게는 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  14. 제10항에 있어서,
    발현 가능한 서열 및 프로모터, 바람직하게는 포유동물 프로모터를 포함하고, 상기 S/MAR 서열이 상기 프로모터의 상류에 위치하는, 폴리뉴클레오티드.
  15. S/MAR 요소를 포함하는 동물 숙주 세포로서,
    상기 S/MAR 요소가 서열번호 1과 적어도 70% 동일한 핵산 서열 및/또는 서열번호 2와 적어도 70% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 동물 숙주 세포.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 치료용 세포인 제15항의 동물 숙주 세포.
  17. 약제로서 사용하기 위한 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 대상물.
  18. 대상체에서 유전 질환의 면역요법 및/또는 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따른 대상물.
  19. 면역요법에서 사용하기 위한 제18항의 대상물로서,
    상기 면역요법이 대상체의 면역 반응의 조절에 의해 암 및/또는 자가면역 질환의 치료 및/또는 예방인, 대상물.
  20. 유전 질환의 치료에 사용하기 위한 제18항의 대상물로서, 유전 질환이 단일유전자 열성 질환(monogenic recessive disease)이고, 바람직하게는 페닐케톤뇨증(phenylketonuria), 알캅톤뇨증(alkaptonuria), 레베르 선천적 흑암시(Leber's Congenital Amaurosis), 맥락막결손증(Choroideremia) 또는 스타르가르트병(Stargardt disease)인, 대상물.
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