CN102080101B

CN102080101B - 一种定点整合外源基因的方法

Info

Publication number: CN102080101B
Application number: CN 201010567663
Authority: CN
Inventors: 成功; 汤波; 李宁
Original assignee: BEIJING JIFULIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Beijing Kevland Biosciences Co ltd
Priority date: 2010-11-25
Filing date: 2010-11-25
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2030-11-25
Also published as: WO2012068769A1; CN102080101A

Abstract

本发明公开了一种定点整合外源基因的方法。以人溶菌酶为例，其是采用基因打靶的方法将人溶菌酶基因定点整合到牛as1-酪蛋白基因座上，使溶菌酶基因捕获完整的as1-酪蛋白调控序列以及酪蛋白基因座上的调控序列，来实现人溶菌酶在牛乳腺中的高效表达。利用这种新的方法可以将目的基因定点整合到有利于自身表达的基因座上，克服以往转基因外源基因随机整合存在的种种不足，提高转基因育种的成功率。

Description

一种定点整合外源基因的方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种定点整合外源基因的方法。

背景技术

溶菌酶是人乳中重要的抗菌因子，对大部分革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌均具有杀灭作用，对于增强婴幼儿免疫力有着重要的作用，同时溶菌酶在医疗保健，轻工业、食品业等方面也被广泛应用。2009年美国FDA批准了世界上首例乳腺生物反应器生产的抗凝血酶转基因药物上市，这标志着利用转基因动物生产重组蛋白真正迈入产业化阶段。

利用乳腺生物反应器生产重组蛋白具有广阔的市场应用前景，但是传统的转基因技术在乳腺生物反应器研究中仍存在一定的不足。传统的转基因研究中，由于外源基因在基因组中是一种随机插入，受到位置效应的影响以及载体自身大小限制，不能包含完整的调控元件往往使外源基因的表达量水平较低，甚至不表达或者异位表达(Clark，1994；Dobie 1996；Kim，2007)。同时，由于外源基因的多拷贝随机插入到宿主基因组中，这种整合对宿主自身来说可能也存在一定风险(Seggewis，2006；McCormack，2004)。这些不利因素大大降低了转基因动物育种的可靠性，提高了成本，不利于转基因育种的发展。食品规范委员会和美国FDA颁布的转基因动物规范条例中也明确提出需充分重视这个问题。因此需要我们寻找使外源基因表达量更高，同时具有较高育种安全性和可靠性的新方法去改变传统的转基因育种。

为了提高外源基因的表达量，克服转入基因受到位置效应的影响，人们尝试了多种方法，如在载体中加入了核基质附着元件(MAR)、位点控制元件(LCR)、绝缘子(Insulator)等元件来克服外源基因表达受到位置效应的影响，但是由于基因表达调控的复杂性，仍不能取得很好的效果，而且外源基因在基因组上仍是随机插入，降低了转基因的可控性和安全性，这仍是在传统转基因研究急待解决的问题。基因打靶技术的出现克服了传统转基因的弊端，大大提高了转基因的可控性。基因打靶是基因靶向操作的一门转基因技术，利用外源基因与基因组序列间的同源性进行同源重组(homologousrecombination)来实现定点对染色体进行修饰的一门技术，具有位点专一性强，可以稳定遗传以及外源基因不受位置效应影响，对邻近基因也没有影响等优点，将成为今后一种较理想的改造物种基因的操作方法。2000年K.J.McCreath利用基因打靶的方法将人抗胰蛋白酶基因(AAT)定点整合到羊原胶原基因座上(COL1A1)，羊乳中人抗胰蛋白酶表达量为650μg/ml(McCreath，2000)，远高于之前McClenaghan随机整合表达人抗胰蛋白酶的转基因羊乳中18μg/ml的表达量(McClenaghan，1991)，克服了传统转基因受位置效应影响使蛋白低水平表达的弊端。利用基因打靶进行转基因独有的优势使转基因研究具有了可控性，在转基因动物育种方面明显的提高了转基因的成功率，提高了转基因动物自身的安全性，降低了转基因育种的风险，同时便于规模化的育种。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效定点整合外源基因的方法，其可以大幅提高外源基因的表达量，提高育种成功率和安全可靠性。

本发明提供的定点整合外源基因的方法，其是采用基因打靶的方法将人溶菌酶基因或其它目的基因定点整合到牛、羊或兔等哺乳动物的乳腺特异表达蛋白的靶标基因座上，使溶菌酶基因或其它目的基因捕获完整的乳腺特异表达蛋白调控序列以及基因座上的调控序列，来实现人溶菌酶或其它目的蛋白在动物乳腺中的高效表达。这是首次尝试利用基因打靶的方法使外源基因捕获动物乳腺特异表达蛋白调控元件指导人溶菌酶的在乳腺中表达，同时我们用人溶菌酶的基因组序列代替cDNA序列，可使溶菌酶获得更高的表达量。利用这种新的方法可以克服以往转基因外源基因随机整合存在的种种不足，提高转基因育种的成功率。

根据本发明的一种优选实施例，采用基因打靶的方法将人溶菌酶基因定点整合到牛as1-酪蛋白基因座上，得到了一种根据上述方法构建的打靶载体，其具有如图15中所示的LYZ-K-in载体结构。其可以在牛乳腺中高效表达生产人溶菌酶或其它重组蛋白。

上述技术方案具有如下优点：

(1)人溶菌酶或其它目的基因在乳腺中转录非常活跃的酪蛋白基因座定点整合，克服位置效应，避免目的基因表达沉默，可以实现人溶菌酶或其它重组蛋白在乳腺中较高水平表达，提高了转基因育种的成功率，同时可以节约后期生产纯化重组蛋白成本；

(2)目的基因在染色体定点整合，避免了随机插入以及多拷贝插入对邻近重要基因表达的影响(如插入突变、多拷贝的插入引起染色体不稳定、邻近基因功能失活、激活原癌基因、失活抑癌基因等)，提高了转基因的安全性、可控性，消除部分人群对转基因食品安全性顾虑；

(3)利用基因完整的内源性启动子指导外源基因表达，可以实现人溶菌酶基因或其它目的基因较高水平的表达，同时减少了由于传统转基因研究中调控元件不完整造成的异位表达，提高转基因成功率；

(4)本方案中利用人溶菌酶基因组序列代替cDNA序列，能提高人溶菌酶的表达量。

附图说明

图1是本发明实施例1中同源左臂PCR扩增的结果，其中M：1kb marker；1-3：同源左臂PCR扩增产物；

图2是本发明实施例1中同源右臂PCR扩增的结果，其中1-5：同源右臂PCR扩增产物；M：1kb marker；

图3是本发明实施例1中人溶菌酶基因PCR扩增的结果，其中1-4：人溶菌酶基因PCR扩增检测；M：1kb marker；

图4是本发明实施例1中LYZ-k-in打靶载体酶切验证结果，其中1：SalI(5597bp+16278bp)；2：XhoI(6243bp+15632bp)；3：NotI/SalI(5597bp+5526bp+10752bp)；4：NotI/XhoI(2593bp+6243bp+13039bp)；5：HindIII(4474bp+17401bp)；6：NotI(linear，21875bp)；7：Plasmid as control；M：1kb marker；

图5是本发明实施例1中as1-酪蛋白和人溶菌酶基因融合示意图；其中F1，R1和F2，R2示RT-PCR检测引物位置；

图6是本发明实施例1中RT-PCR F1R1引物检测结果，其中M：1kb marker；1-4：阳性细胞检测结果；5-6：未转染C127对照；7-8：RNA模板；9：H₂O作为模板；10：cDNA检测；

图7是本发明实施例1中RT-PCR F2R2引物检测结果，其中M：1kb marker；1-4：F2R2引物检测结果；

图8是本发明实施例1中对RT-PCR引物F2R2PCR产物测序比对结果，DNAMAN1序列为PCR产物测序结果，DNAMAN2序列为NCBI公布序列as1-酪蛋白非翻译mRNA和人溶菌酶基因融合mRNA；方框标注序列分别为限制性内切酶XhoI位点、溶菌酶mRNA翻译起始(ATG)和翻译终止序列(TAA)；

图9是本发明实施例1中Western-blot检测溶菌酶在乳腺细胞中表达，其中1：未转染打靶载体C127细胞诱导；2：转染打靶载体细胞未诱导；3：转染打靶载体细胞诱导；

图10是本发明实施例1中妊娠期第42天的胎儿；

图11是本发明实施例1中同源重组示意图，其中A：酪蛋白基因座；B：as1-casein基因结构图；C：基因打靶载体；D：同源重组后人溶菌酶整合位点；3′HRF和3′HRR引物如上图所示；

图12是本发明实施例1中靶细胞PCR鉴定，其中1-2：发生同源重组的细胞；3：094基因组作为阴性对照；4：基因打靶载体作为对照；5：H₂O；M：1kb marker；

图13是本发明实施例1中对中靶细胞PCR产物测序结果，其中下划线部分为同源右臂下游引物，方框部分为同源右臂侧翼序列(as1-酪蛋白基因中同源右臂下游序列)；

图14是本发明实施例1载体构建流程图；

图15是本发明实施例2定点整合人乳铁蛋白基因的基因载体图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例所使用的载体、菌种、试剂及其来源：

Plox载体购于军事医学科学院，小鼠C127细胞购于中科院上海细胞所；催乳素、胰岛素、氢化可的松均为Sigma产品；Pyrobest高保真酶、LA-Taq长片段扩增酶、T4DNA连接酶、内切酶、PMD19-T载体均为Takara公司产品；MMLV反转录酶为Promega产品；TOPO-T、Lipo-2000载体购自Invitrogen公司；质粒纯化试剂盒为Omega公司产品；人溶菌酶标准品和兔抗人溶菌酶一抗均为CALBIOCHEM产品；HRP标记的羊抗兔二抗购于中杉金桥公司。酶切、连接、回收、转化、基因组提取、PCR扩增等常规分子生物学实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。

实施例1：as1-酪蛋白基因座定点整合其它目的基因打靶载体构建(以人溶菌酶基因为例)

1.基因打靶载体的构建

1.1同源臂的扩增、测序

根据GeneBank公布的牛as1-酪蛋白序列(Genebank号：X59856)设计了上游引物(见SEQ ID NO.1)5′-ATTTGCGGCCGCTAATGTTCCTGTCATACAACTGTGAAT-3′，引入NotI酶切位点；下游引物(见SEQ ID NO.2)5′-CCCTCGAGGTCAAGATCTATGTAAGAAAATAAAATAG-3′，引入XhoI酶切位点，用来扩增同源左臂(Left arm，9354-11939，2586bp)。同时设计了上游引物(见SEQ IDNO.3)5′-ACGCGTCGACAACCATGAAACTTCTCATCCTTAC-3′，引入SalI酶切位点；下游引物(见SEQ ID NO.4)5′-ACGCGTCG ACACATTCTTGGGTATGATAGCACTGC-3′，引入SalI酶切位点，用来扩增同源右臂(Right arm，11940-17530，5591bp)。利用上述合成的两对引物分别用Pyrobest和LA-Taq酶以094牛胎儿成纤维细胞基因组DNA为模板分别扩增得到了同源左臂(图1)和同源右臂(图2)。对扩增得到的同源左臂和右臂分别连接到了PMD19-T和TOPO-T载体进行测序，序列同源性均为99％以上，构建完成Left arm-T和Right arm-T载体。

1.2人溶菌酶基因序列扩增、测序

根据GeneBank公布的人溶菌酶序列(Genebank号：X14008)设计上游引物(见SEQ ID NO.5)5′-CCGCTCGAGAACATGAAGGCTCTCATTGTTC-3′，引入XhoI酶切位点；下游引物(见SEQ ID NO.6)5′-CCGCTCGAGTAGAAGTGTAATATGAGGCCAG-3′，引入XhoI酶切位点，以人基因组DNA为模板扩增得到了人溶菌酶基因序列，包括溶菌酶自身加尾信号(544-6780，6236bp)(图3)，并且连接到TOPO-T载体进行测序验证。测序结果显示扩增得到的人溶菌酶序列外显子以及剪切位点均未发生突变，构建完成了LYZ-T载体。

1.3基因打靶载体的构建

以Plox载体为骨架载体(7460bp)，用SalI酶切Plox载体和Rightarm-T回收并连接，完成载体R-PLOX的构建。将构建完成的R-PLOX载体用NotI、XhoI酶切回收，因为Left arm和PMD19-T载体大小接近，所以用NotI、XhoI、PvuI酶切后回收Left arm片段，然后连接到R-PLOX载体完成L-P-R载体的构建。最后用XhoI分别酶切LYZ-T和L-P-R载体将回收得到的LYZ序列链接到L-P-R载体XhoI位点，完成打靶载体的构建，命名为LYZ-K-in。对完成的打靶载体进行酶切(图4)和测序验证(构建流程见图14)。

2.打靶载体乳腺细胞表达验证

试验中，基因打靶载体左臂扩增区域为as1-酪蛋白promoter区、外显子I和部分外显子II区域，因此将打靶载体转染小鼠C127乳腺细胞可以检测同源左臂能否指导人溶菌酶的正确表达，验证载体的正确性。

2.1细胞转染

将LYZ-K-in打靶载体用NotI线性化后参照Lipo-2000转染试剂说明转染小鼠乳腺癌细胞C127。转染48h后细胞按1∶6传代同时加入800μg/ml G418进行筛选，每三天换一次液，7天左右有克隆点形成，继续筛选三天，收集细胞用于后期检测。

将筛选得到的细胞用含有催乳素、胰岛素、氢化可的松的DMEM诱导48h后，收集细胞上清并用超滤离心管(4ml，3KD)进行超滤浓缩50倍，细胞用于RNA提取和蛋白收集。

2.2RT-PCR检测

取诱导细胞收集的1μg总RNA进行反转录，将反转录得到的cDNA作为模板，以LYZ鉴定引物：F1(见SEQ ID NO.7)5′-TGCAAAGAGGGTTGTCCGTGAT-3′，R1(见SEQ ID NO.8)5′-CAATACTTGTAAGCTCATCTGCCTC-3′和LYZ融合鉴定引物：F2(见SEQ ID NO.9)5′-CTTGCTGCTTCTTCCCAGTC-3′，R2(见SEQ ID NO.10)5′-TGATAAGAACTGAATGTGGC-3′分别进行扩增检测到了1049bp的LYZ mRNA和1088bp的as1酪蛋白和LYZ的融合mRNA片段(图5、6、7)。对引物F2、R2扩增得到的1088bp序列回收、T-A克隆并进行测序，测序结果显示，as1-酪蛋白5′非翻译区mRNA和溶菌酶mRNA正确融合，并且编码区没有发生突变(图8)。结果表明经过mRNA剪切和拼接，as1-酪蛋白非翻译区mRNA和人溶菌酶mRNA正确融合。

2.3Western blot检测

超滤浓缩后的上清中蛋白用碧云天BCA蛋白浓度检测试剂盒测定浓度后，分别以未诱导阳性细胞上清和细胞裂解蛋白、诱导的阳性细胞上清和细胞裂解蛋白、C127诱导上清作为阴性对照，上样量为30μg。15％SDS-PAGE胶50V，1h；90V，2h进行电泳。电泳完毕后利用Bio-Rad湿转转膜仪350mA，转膜30min。转膜完成后用5％脱脂奶粉封闭过夜，然后兔抗人一抗(1∶3000稀释)进行孵育1h，TBST洗膜3×10min，然后HRP标记的羊抗兔二抗(1∶10000稀释)孵育1h，TBST洗膜3×10min，最后进行BCL显色。Western结果显示，经过诱导后，阳性细胞上清中有人溶菌酶的表达，而C127细胞上清中没有检测到。在未经诱导条件下，阳性细胞上清和裂解蛋白均没有检测到溶菌酶表达(图9)。上述结果表明同源左臂可以指导人溶菌酶正确表达且人溶菌酶自身信号肽可以引导溶菌酶的分泌。

2.4重组人溶菌酶活性检测

配置溶菌酶标准溶液，浓度分别为：100、150、200、250、300、350、400U/mL。取90ul溶壁微球菌悬浮液(OD₄₆₀＝0.9)置于96孔板中，迅速加入酶液10μL，利用TECAN酶标仪震荡混匀5S后，测定460nm下的光吸收值。从测定读数起计时，每隔1min记录一次，每组数据重复三次以上。以0到1分钟的OD₄₆₀的差值平均值为纵坐标，以标准酶浓度为横坐标制作标准曲线。根据标准曲线，我们可以得到回归方程：y＝0.0002x-0.004，R²＝0.9954。y表示OD₄₆₀差值，x代表酶活力(U/mL)。利用上述方法对阳性细胞进行抗菌能力检测，结果显示，细胞上清中溶菌酶的抗菌活力为140U/mL，而阴性对照C127细胞中基本检测不到抗菌活性。

3.牛成纤维细胞筛选

3.1牛胎儿成纤维细胞系建立

牛胎儿成纤维细胞建立采用胰酶消化法。具体方法如下：a.屠宰42day的母牛，取出胎盘放入DMEM培养基中，12h回到实验室(图10)。b.在含有5×DPBS的细胞培养皿中剔除胎儿头、四肢、内脏及软骨组织，将剩余组织放入一个新的10cm细胞培养皿中，用眼科剪尽量剪碎。c.加入1ml完全培养基，用剪头的1ml枪头将组织碎块及培养基转移到15ml的离心管中，加入7ml DPBS，用移液器吸打几下，待组织块沉下后，吸弃上清，重复洗涤一次。d.向15ml离心管中加入10ml 0.25％胰酶，然后37℃水浴中消化30min。e.小心吸取上清细胞悬液到另一15ml离心管中，室温1200rpm，离心5min收集细胞。重复d、e步骤各一次并收集细胞。f.将离心获得的细胞按照1×10⁶/瓶的浓度接种T25细胞培养瓶中，置于37.5℃、5％CO₂培养箱中培养，每隔两天换一次液，待细胞长满后冻存，并命名为094牛胎儿成纤维细胞。

3.2细胞转染

细胞转染采用amaxa nucleofector进行电转。具体流程如下：将消化并收集的两瓶T25细胞(约8×10⁶)、线性化的打靶载体12μg和400μl Nucleofector试剂混匀分装4个电击杯进行电击，然后分别在四瓶T-25培养皿中培养。48h后将培养的细胞消化并铺到60个10cm的皿中含有500μg/ml G418和2μM GANC的培养基进行细胞筛选，筛选约10天后挑取单克隆共15个到48孔板培养。待细胞90％汇合后扩繁至24孔板培养，有9个克隆点生长状态较好，然后将长满后的细胞一半冻存，一半用于基因组提取和PCR鉴定。

3.3同源重组鉴定

将得到的9个克隆点的细胞提取基因组，取50ng的基因组DNA用于PCR检测。PCR检测上游引物为3′HRF(见SEQ ID NO.11)：5′-GGTGGGATTAGATAAATGCCTGC-3′，设计在序列neo中，下游引物为3′HRR(见SEQ ID NO.12)：5′-GAGTTGAGTAAAAAGTATTGCGG-3′，设计到3′同源臂的外侧，只有发生同源重组的细胞才能扩增出目的条带(图11)。PCR检测结果显示，在得到的9个克隆点中有1个克隆点细胞发生同源重组，扩增检测到了6731bp的目的片段(图12)，对扩增得到的目的片段回收测序，结果显示，PCR产物5’端为新霉素基因序列，3’端为同源右臂侧翼序列(图13)，与同源重组后预期序列相一致，这表明该克隆点确实为中靶的阳性细胞，人溶菌酶基因定点整合到了牛as1-酪蛋白基因座上。然后将中靶细胞克隆用于核移植。结果表明打靶载体定点整合到了as1-酪蛋白基因座中，且HSV-TK负筛选基因经过同源重组而没有整合到基因组中。

实施例2：as1-酪蛋白基因座定点整合其它目的基因打靶载体构建(以人乳铁蛋白基因为例)

按照上述载体构建的方法，从人乳腺组织中提取总mRNA，反转录得到cDNA.参照NCBI公布人乳铁蛋白基因序列(Genebank号：NM_002343)分别设计上下游引物：hLF上游引物，TGCAAGCTTACCATGAAACTTGTCT(见SEQ ID NO.13)；hLF下游引物，ACGTCTAGAAGCTGGGCCATCTTCTTCG(见SEQ IDNO.14)。以反转录得到cDNA为模板，用高保真酶扩增得到2155bp的hLF编码区，利用HindIII和XbaI酶切位点亚克隆到PCDNA3.1载体，并进行测序。测序结果显示与公布的序列同源性100％。利用上游引物TGCCTCGAGACCATGAAACTTGTC(见SEQ ID NO.15)和下游引物GTACTCGAGTAGAGCCCCAGCTGGT(见SEQ IDNO.16)扩增得到2449bp的含有人乳铁蛋白编码框和牛生长激素基因加尾信号(bGH pA)的DNA序列，然后将扩增得到的序列XhoI酶切正向连接到实例1L-P-R载体XhoI位点，完成牛as1-酪蛋白基因座定点整合人乳铁蛋白基因的打靶载体的构建(图15)。利用此方法，可以通过细胞筛选将目的基因定点整合到牛as1-酪蛋白基因座，并通过核移植等方法得到乳腺特异高效表达外源基因的转基因牛，同样地，通过本发明所公布的方法，可以将血液蛋白、治疗性单克隆抗体等目的基因定点整合到牛、羊、兔等动物的as1-酪蛋白、β-酪蛋白、γ-酪蛋白、β乳球蛋白等能在乳腺高效特异表达的基因座上，并通过核移植等方法得到乳腺特异高效表达外源基因的转基因动物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种定点整合外源基因的方法，其特征在于，采用基因打靶的方法将外源基因定点整合到牛的乳腺特异表达蛋白的靶标基因座上；其中，所述外源基因为人溶菌酶基因，所述乳腺特异表达蛋白为as1-酪蛋白；

具体步骤为：

1）同源臂的扩增、测序

根据GenBank公布的牛as1-酪蛋白序列，Genbank号为X59856，设计上游引物5′-ATTTGCGGCCGCTAATGTTCCTGTCATACAACTGTGAAT-3′，引入NotI酶切位点；下游引物5′-CCCTCGAGGTCAAGATCTATGTAAGAAAATAAAATAG-3′，引入XhoI酶切位点，用来扩增同源左臂，该同源左臂Left arm位于9354-11939，共2586bp；同时设计上游引物5′-ACGCGTCGACAACCATGAAACTTCTCATCCTTAC-3′，引入SalI酶切位点；下游引物5′-ACGCGTCGACACATTCTTGGGTATGATAGCACTGC-3′，引入SalI酶切位点，用来扩增同源右臂，该同源右臂Right arm位于11940-17530，共5591bp；利用上述合成的两对引物分别用Pyrobest和LA-Taq酶以094牛胎儿成纤维细胞基因组DNA为模板分别扩增得到了同源左臂和同源右臂；将扩增得到的同源左臂和右臂分别连接到PMD19-T和TOPO-T载体上，构建完成Left arm-T和Right arm-T载体；

2）人溶菌酶基因序列扩增、测序

根据GenBank公布的人溶菌酶序列，Genebank号为X14008，设计上游引物5′-CCGCTCGAGAACATGAAGGCTCTCATTGTTC-3′，引入XhoI酶切位点；下游引物5′-CCGCTCGAGTAGAAGTGTAATATGAGGCCAG-3′，引入XhoI酶切位点，以人基因组DNA为模板扩增得到了人溶菌酶基因序列，包括溶菌酶自身加尾信号，第544-6780位核苷酸共6236bp，并连接到TOPO-T载体进行测序验证；测序结果显示扩增得到的人溶菌酶序列外显子以及剪切位点均未发生突变,构建完成了LYZ-T载体；

3）基因打靶载体的构建

以Plox载体为骨架载体，用SalI酶切Plox载体和Right arm-T回收并连接，完成载体R-PLOX的构建；将构建完成的R-PLOX载体用NotI、XhoI酶切回收，用NotI、XhoI、PvuI酶切Left arm-T后回收Leftarm片段，然后连接到R-PLOX载体完成L-P-R载体的构建；最后用XhoI分别酶切LYZ-T和L-P-R载体，将回收得到的LYZ序列链接到L-P-R载体XhoI位点，完成打靶载体的构建，命名为LYZ-K-in；

4）细胞转染、筛选及转基因牛的制备

将线性化后的LYZ-K-in打靶载体转染094牛胎儿成纤维细胞，通过细胞筛选将人溶菌酶基因定点整合到牛as1-酪蛋白基因座，并通过核移植的方法得到乳腺特异高效表达人溶菌酶基因的转基因牛。