CN105384804A

CN105384804A - 一种低致敏性鱼类过敏原小清蛋白、制备方法及其用途

Info

Publication number: CN105384804A
Application number: CN201510883944.2A
Authority: CN
Inventors: 蔡秋凤; 赵勇娟; 曹敏杰; 刘光明; 张凌晶
Original assignee: Jimei University
Current assignee: Jimei University
Priority date: 2015-12-04
Filing date: 2015-12-04
Publication date: 2016-03-09
Anticipated expiration: 2035-12-04
Also published as: CN105384804B

Abstract

本发明公开了低致敏性鱼类过敏原小清蛋白、制备方法及其用途。所述低致敏性鱼类过敏原小清蛋白有3个氨基酸残基的糖基化修饰，分别为第88位赖氨酸残基、第97位赖氨酸残基以及第108位赖氨酸残基的糖基化修饰。还进一步，还有第46位赖氨酸残基、第55位赖氨酸残基以及第84位赖氨酸残基的糖基化修饰。具有低致敏性的特点又保留了免疫原性。通过将小清蛋白与糖溶液混匀冷冻干燥，美拉德反应，复溶后进行脱糖处理即可制备得到。可用于制备预防过敏原致敏，特别是鱼类过敏原致敏的药物及其制备低致敏食品，特别是低致敏鱼类相关食品。

Description

一种低致敏性鱼类过敏原小清蛋白、制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及蛋白质领域，尤其涉及一种低致敏性鱼类过敏原小清蛋白、制备方法及其用途。

背景技术

食品过敏是指食物中的某些物质(通常是蛋白质)摄入体内被机体免疫系统识别为外来物而发生的免疫变态反应。近年来，国内外食物过敏发病率明显上升。据2015年的一项调查结果显示，我国城市儿童的食物过敏率约为3.2％。鱼类是八大类过敏食物之一，国内外学者对鱼类过敏原的研究表明，分子量为10-14kDa的小清蛋白(parvalbumin，PV)广泛存在于各类鱼中，是鱼类的主要过敏原。因此，降低鱼肉中小清蛋白的致敏性对于生产低致敏性鱼类食品以及预防鱼类食物过敏具有重要的意义。

目前对影响小清蛋白致敏性的因素研究很少，多数是探讨钙离子的影响，通过去除钙离子改变小清蛋白的构象，从而降低其致敏性。但这一作用被证实对天然小清蛋白的影响较小。国家发明专利“一种淡水鱼小清蛋白过敏原抑制剂”(专利号ZL201410139704.7)是采用人工合成的小RNA化合物，注入鱼肌肉局部，抑制小清蛋白的表达，从而降低鱼肌肉中小清蛋白的含量。但该方法由于使用的是化学合成的核酸分子，在使用方面存在局限性。

目前常用的降低食物致敏性的方法是高压处理或酶解，通过改变蛋白构象，掩藏或破坏抗原表位，但会损坏食品的质构和风味。

发明内容

本发明的目的在于提供一种低致敏性鱼类过敏原小清蛋白。

为实现上述目的，本发明提供一种低致敏性鱼类过敏原小清蛋白，其特征在于，有3个氨基酸残基的糖基化修饰，分别为第88位赖氨酸残基、第97位赖氨酸残基以及第108位赖氨酸残基的糖基化修饰。

进一步，还有第46位赖氨酸残基、第55位赖氨酸残基以及第84位赖氨酸残基的糖基化修饰；

任选的，所述的糖基化修饰为葡萄糖或丙酮醛或吡咯琳或羧甲基或咪唑琳酮。

进一步，第46位赖氨酸残基发生丙酮醛修饰；第55赖氨酸残基发生葡萄糖，丙酮醛，吡咯琳修饰；第84赖氨酸残基发生丙酮醛，吡咯琳，羧甲基，咪唑琳酮修饰；第88赖氨酸残基发生丙酮醛，吡咯琳，羧甲基，咪唑琳酮修饰；第97赖氨酸残基发生葡萄糖修饰；第108赖氨酸残基发生咪唑琳酮修饰。

进一步，所述低致敏性鱼类过敏原小清蛋白保留有免疫原性。

本发明另一方面，所述低致敏性鱼类过敏原小清蛋白的制备方法，其特征在于，步骤为，

(1)将小清蛋白与糖溶液混匀冷冻干燥，

(2)美拉德反应得到反应产物，

(3)反应产物复溶后进行脱糖处理即可。

进一步，所述步骤(1)中的小清蛋白通过重组表达获得或从鱼肉中分离得到；

任选的，所述步骤(1)为用含有1mmol/LNaHCO₃20mmol/L，pH7.0的PBS溶液与糖配制成糖溶液与小清蛋白混匀后，真空冷冻干燥24小时；

优选的，所述小清蛋白与糖的质量比为1:3-1:16；

优选的，所述糖为葡萄糖或木糖。

进一步，所述步骤(2)为60℃反应3天，或100℃反应60-100分钟得到反应产物。

进一步，步骤(3)为将反应产物复溶于20mmol/L，pH7.0的PBS缓冲液中透析24小时，进行脱糖处理。

本发明的另一方面，还保护低致敏性鱼类过敏原小清蛋白在制备用于预防过敏原致敏药物中的用途；优选的，在制备用于预防鱼类过敏原致敏药物中的用途。

本发明的另一方面，还保护低致敏性鱼类过敏原小清蛋白在制备低致敏食品中的用途；优选的，在制备低致敏鱼类食品中的用途。

美拉德反应是食品加工中广泛存在的非酶褐变反应，可促进食品的风味物质形成，且不影响食品质构，因此，本发明提供的低致敏性鱼类小清蛋白及其制备方法，安全可靠，不仅可用于过敏性疾病的诊断及预防，还可用于低致敏性鱼类食品的开发。

本发明具有以下有益效果：

1.提供了制备低致敏性鱼类小清蛋白的可靠制备技术，制备的低致敏性小清蛋白可用于过敏性疾病的预防，提供的技术可用于开发低致敏性鱼类食品；

2.提供了低致敏性鱼类小清蛋白的关键糖基化位点及糖基化类型；

3.制备的糖基化修饰小清蛋白具有低致敏性的特点又保留了免疫原性。

附图说明

图1是美拉德反应对重组小清蛋白免疫活性的影响图；

图2是天然小清蛋白美拉德反应对RBL-2H3细胞β-氨基己糖苷酶释放率的影响图；

图3是天然小清蛋白美拉德反应对RBL-2H3细胞组胺释放的影响图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：低致敏性鱼类过敏原小清蛋白的制备及免疫活性检测

将重组小清蛋白的表达菌株[E.coliBL21(DE3)](鲢小清蛋白的cDNA克隆及在大肠杆菌中的原核表达，中国水产科学，2014)，按500μL菌种接种于500mLLB液体培养基(含卡那霉素终质量浓度为25mg/L)的锥形瓶中,37℃培养。当OD600值达到0.6时,加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达4小时。收集菌体重悬于20mmol/LTris-HCl(pH7.5)，超声波破菌，8000g离心20分钟,收集上清。采用镍离子亲和层析柱(美国GE公司)纯化重组蛋白。通过SDS-PAGE分析，重组小清蛋白得到了高度的纯化。

称取0.3g葡萄糖溶解于100mL含有1mmol/LNaHCO₃的PBS(20mmol/L，pH7.0)，取8mL与1mg/mL的重组小清蛋白等体积混合，-30℃放置2小时，再置于真空冷冻干燥机24小时后，60℃条件反应3天，用4mLPBS(20mmol/L，pH7.0)复溶，并于该缓冲液(20mmol/L，pH7.0的PBS)中透析24小时脱糖。将脱糖处理后的样品置于3kD的超滤浓缩管中离心，得到的内液即低致敏性鱼类过敏原小清蛋白。

采用蒽酮硫酸法证明超滤浓缩的外液不含糖，表明获得的低致敏性鱼类过敏原小清蛋白脱糖完全，样品中不含游离的糖。对样品进行含糖量、褐变度、荧光强度和氨基含量变化的分析，结果显示低致敏性鱼类过敏原小清蛋白发生了明显的美拉德反应。

用PBS(20mmol/L，pH7.0)调整所制备得到的低致敏性鱼类过敏原小清蛋白浓度为0.5mg/mL，以4倍梯度稀释5个梯度，取1.5μL的样品点样于NC膜上，待样品干燥后，用5％的脱脂奶封闭1.5小时，用TBST(20mmol/LTris-HCl，pH8.0，0.145mol/LNaCl，0.05％Tween-20)清洗3次，每次5分钟。加入小鼠抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体(体积比1:5000)，室温孵育1小时，TBST清洗5次后，以兔抗小鼠IgG-HRP为二抗，室温下孵育1小时，TBST洗涤7次，每次7分钟，加入ECL底物孵育2分钟，在化学发光成像系统(FluorChemQ)上记录结果，显示制备得到的低致敏性鱼类过敏原小清蛋白与制备之前的原材料-重组小清蛋白相比，免疫活性明显下降(见图1)。图1中的1-4依次表示蛋白浓度为0.5、0.125、0.0313、0.00781μg/mL。对照即为重组小清蛋白组，美拉德反应即为低致敏性鱼类过敏原小清蛋白组。阴性对照为牛血清白蛋白(BSA)。

实施例2：低致敏性鱼类过敏原小清蛋白的制备及免疫活性检测

取20g鲢鱼白色肉于5倍体积20mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中组织捣碎，100℃加热10分钟，8000g离心20分钟后取上清即得到小清蛋白热粗提物。将0.3g葡萄糖溶解于100mL含有1mmol/LNaHCO₃的PBS(20mmol/L，pH7.0)中制备成糖溶液，调整小清蛋白热粗提物浓度为1mg/mL取8mL与糖溶液等体积混合，-30℃放置2小时，置于真空冷冻干燥机24小时后，60℃条件反应3天，4mLPBS(20mmol/L，pH7.0)复溶，并于该缓冲液中透析24小时脱糖。

将脱糖处理后的样品置于3kD的超滤浓缩管中离心，得到的内液即低致敏性鱼类过敏原小清蛋白。

采用蒽酮硫酸法证明超滤浓缩的外液不含糖，表明获得的低致敏性鱼类过敏原小清蛋白脱糖完全，样品中不含游离的糖。

对制备得到的低致敏性鱼类过敏原小清蛋白进行含糖量、褐变度、荧光强度和氨基含量变化的分析，结果显示低致敏性鱼类过敏原小清蛋白发生了明显的美拉德反应。

以4-6周龄SPF级雌性Babl/c小鼠为实验对象，将小鼠随机分为PBS阴性对照组，鱼类过敏原小清蛋白实验组，分别在第0、14天腹腔注射150μL样品(PBS阴性对照组注射PBS；实验组注射100μL1mg/mL鱼类过敏原小清蛋白溶液+50μL免疫佐剂(Thermo,货号77161)，在注射前、第7天及第15天进行尾静脉采血，检测特异性IgE，IgG1，IgG2a水平。于第16天眼球取血，3000转/分钟，离心10分钟，获得抗体血清，用于检测细胞脱颗粒。

将RBL-2H3细胞(AmericanTypeCultureCollection，美国模式培养物保藏所)传代培养后，取对数生长期细胞，以1×10⁶/mL细胞浓度接种于48孔板，200μL/孔，过夜培养，加入上述制备得到的抗体血清20μL/孔敏化12小时。设PBS组，天然小清蛋白组，低致敏性鱼类过敏原小清蛋白组，每组3个平行。分别添加500ng天然小清蛋白(即为未进行美拉德反应的小清蛋白热提取物)及低致敏性鱼类过敏原小清蛋白刺激6小时检测组胺及脱颗粒情况。

敏化的细胞(即上述得到的抗体血清20μL/孔孵育12小时后的细胞)刺激6小时后，分别取上清置于0.5mL的EP管中。台氏缓冲液(NaCl137mmol/L、KCl2.68mmol/L、NaHCO₃11.9mmol/L、NaH₂PO₄0.416mmol/L、MgCl₂·6H₂O1.0mmol/L、CaCl₂1.3mmol/L、葡萄糖555mmol/L)清洗细胞2次后，每孔加入100μL含0.1％TritonX-100的台氏缓冲液裂解细胞5分钟，吸取裂解液置于0.5mLEP管中，1000g离心15分钟。取50μL样品于96孔板中，分别加入50μL含1mmol/Lβ-氨基己糖苷的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4.5)，37℃孵育60分钟，加入150μL终止液(0.1mmol/LNa₂CO₃/NaHCO₃，pH10.0)终止反应，用酶标仪测405nm波长处吸光值。按公式计算各组的β-氨基己糖苷酶释放率。

其中A_上清为实验孔细胞上清酶活力，A_{上清空白孔}为未敏化孔细胞上清酶活力，A_{裂解液空白孔}为未敏化孔细胞裂解液上清酶活力，A_裂解液实验孔细胞裂解液酶活力。

使用市售的ELISA试剂盒(IBL,Hamburg,Germany)，根据制造商说明书测定组胺含量。

结果见图2-3。

图2为PBS组、对照(即天然小清蛋白)和美拉德反应(即低致敏性鱼类过敏原小清蛋白)的β-氨基己糖苷酶释放率比较图，β-氨基己糖苷酶为RBL-2H3细胞一种溶酶体酶，是标记肥大细胞脱颗粒的标记性蛋白，肥大细胞脱颗粒释放炎症因子从而引起Ⅰ型超敏反应。可以看出，低致敏性鱼类过敏原小清蛋白组β-氨基己糖苷酶释放率(20％)比天然小清蛋白组(51％)降低了30％，但仍比PBS组(13％)高7％。

图3为PBS组、对照(即天然小清蛋白)和美拉德反应(即低致敏性鱼类过敏原小清蛋白)的组胺含量的比较图。可以看出，低致敏性鱼类过敏原小清蛋白组比对照(即天然小清蛋白)大大降低了组胺的释放。表明本实施例制备得到的低致敏性鱼类过敏原小清蛋白具有具有低致敏性的特点又保留了免疫原性。

实施例3：低致敏性鱼类过敏原小清蛋白糖基化位点分析

吸取实施例1已制备好的低致敏性鱼类过敏原小清蛋白30μg，加入30μLSTD缓冲液，沸水浴5分钟，冷却至室温。加入200μLUA缓冲液(8MUrea，150mMTris-HClpH8.5)混匀，转入30kDa超滤管离心。加入200μLUA缓冲液离心，弃滤液。加入100μLIAA，振荡1分钟，避光室温孵育30分钟，离心。加入100μLUA缓冲液，离心，重复2次。加入100μL25mMNH₄HCO₃，离心，重复2次。加入40μL25mMNH₄HCO₃同时加入胰蛋白酶，酶切过夜后离心。再加入40μL25nMNH₄HCO₃，离心，酸化。

酶切后的样品采用Trap色谱柱进行分离。Trap色谱柱以95％的A液(0.1体积％甲酸的水溶液)平衡后，样品由自动进样器上样。色谱梯度：0-50分钟，B液(0.1体积％甲酸的乙腈水溶液)线性梯度从4％到50％；50分钟-54分钟，B液线性梯度从50％到100％；54分钟-60分钟，B液维持在100％。

分离后的样品用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析。根据胰蛋白酶酶切位点，预测蛋白酶解肽片段，根据氨基酸分子量进一步预测该酶切肽段理论分子量，将质谱分析获得的实际分子量与预测的理论分子量比对，结果显示低致敏性鱼类过敏原小清蛋白有6个氨基酸残基发生了修饰，分别是第46位赖氨酸残基发生了丙酮醛修饰；第55赖氨酸残基发生了葡萄糖、丙酮醛和吡咯琳修饰；第84赖氨酸残基发生了丙酮醛、吡咯琳、羧甲基和咪唑琳酮修饰；第88赖氨酸残基发生了丙酮醛、吡咯琳、羧甲基和咪唑琳酮修饰；第97赖氨酸残基发生了葡萄糖修饰；第108赖氨酸残基发生了咪唑琳酮修饰，具体见表1。通过比对糖基化位点与小清蛋白的IgE结合表位，发现第88位赖氨酸残基，第97位赖氨酸残基，第108位赖氨酸残基位于表位区域，通过美拉德反应连接在赖氨酸残基上的糖链可对这些表位产生直接的封闭作用，从而降低小清蛋白的致敏性；所以只要这三个地方的氨基酸氨基发生糖基化位点修饰，就能降低小清蛋白的致敏性。

第46位、第55位和第84位赖氨酸残基虽然不位于表位区域，但连接的糖链可能形成了空间位阻，从而影响IgE与抗原表位的结合。

表1低致敏性鱼类过敏原小清蛋白糖基化修饰位点表

$-丙酮醛；&-葡萄糖；～吡咯琳；％咪唑啉酮；-羧甲基

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCELISTING

<110>集美大学

<120>一种低致敏性鱼类过敏原小清蛋白、制备方法及其用途

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Claims

1.一种低致敏性鱼类过敏原小清蛋白，其特征在于，有3个氨基酸残基的糖基化修饰，分别为第88位赖氨酸残基、第97位赖氨酸残基以及第108位赖氨酸残基的糖基化修饰。

2.权利要求1所述低致敏性鱼类过敏原小清蛋白，其特征在于，还有第46位赖氨酸残基、第55位赖氨酸残基以及第84位赖氨酸残基的糖基化修饰；

3.权利要求1或2所述低致敏性鱼类过敏原小清蛋白，其特征在于，第46位赖氨酸残基发生了丙酮醛修饰；第55赖氨酸残基发生了葡萄糖，丙酮醛，吡咯琳修饰；第84赖氨酸残基发生了丙酮醛，吡咯琳，羧甲基，咪唑琳酮修饰；第88赖氨酸残基发生了丙酮醛，吡咯琳，羧甲基，咪唑琳酮修饰；第97赖氨酸残基发生了葡萄糖修饰；第108赖氨酸残基咪唑琳酮修饰。

4.权利要求1-3任一项所述低致敏性鱼类过敏原小清蛋白，其特征在于，所述低致敏性鱼类过敏原小清蛋白保留有免疫原性。

5.一种权利要求1-4任一项所述低致敏性鱼类过敏原小清蛋白的制备方法，其特征在于，步骤为，

(1)将小清蛋白与糖溶液混匀冷冻干燥；

(2)美拉德反应得到反应产物；

(3)反应产物复溶后进行脱糖处理即可。

6.权利要求5所述低致敏性鱼类过敏原小清蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的小清蛋白通过重组表达获得或从鱼肉中分离得到；

优选的，所述小清蛋白与糖的质量比为1:3-1:16；

优选的，所述糖为葡萄糖或木糖。

7.权利要求5所述低致敏性鱼类过敏原小清蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)为60℃反应3天，或100℃反应60-100分钟得到反应产物。

8.权利要求5所述低致敏性鱼类过敏原小清蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(3)为将反应产物复溶于20mmol/L，pH7.0的PBS缓冲液中透析24小时，进行脱糖处理。

9.权利要求1-8任一项所述制备方法制备得到的低致敏性鱼类过敏原小清蛋白在制备用于预防过敏原致敏药物中的用途；优选的，在制备用于预防鱼类过敏原致敏药物中的用途。

10.权利要求1-8任一项所述制备方法制备得到的低致敏性鱼类过敏原小清蛋白在制备低致敏食品中的用途；优选的，在制备低致敏鱼类食品中的用途。