CN116790663A - 一种增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法,其中,包括:在非人动物的受精卵中注射含有荧光素的基因编辑显微注射液,然后在所述受精卵卵裂至二细胞时期,进行荧光观察,挑取携带荧光的二细胞移植到待孕非人动物的子宫培育成非人动物。本申请避免了因为基因编辑显微注射液未注入受精卵或在受精卵中所在位置不正确而导致受精卵基因编辑失败的情况,进而增强对非人动物受精卵进行基因编辑的效率。同时可以在受精卵培育至二细胞时期,选取携带荧光的二细胞进行培育或裂解检测,大大缩短了非人动物基因编辑检测的检测周期。
Description
技术领域
本发明涉及动物基因编辑领域,涉及一种增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法。
背景技术
受精卵基因编辑技术是构建基因编辑模型非人动物的主要技术手段,CRISPR/Cas9技术是继人工锌指蛋白核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术,近几年CRISPR/Cas9已成为现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的技术之一,成为当今最主流的基因编辑系统。
CRISPR/Cas9基因编辑技术就是通过人工设计的sgRNA来识别目的基因组序列,并引导Cas9蛋白有效切割DNA双链,形成双链断裂,损伤后修复会造成基因敲除或敲入等,最终达到对基因组DNA进行修饰的目的。常用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除、基因敲入、基因抑制、基因激活、多重编辑、功能基因组筛选。
目前显微注射技术作为将基因编辑内容物转移至受精卵内的主要技术手段之一,显微注射法(microinjection)是利用管尖极细(0.1至0.5μm)的玻璃微量注射针,将外源基因片段直接注射到原核期胚或培养的细胞中,然后根据宿主基因组序列可能发生的重组(rearrangement)、缺失(deletion)、复制(duplication)或易位(translocation)等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内。这种显微注射术的程序,需有相当精密的显微操作设备,制造长管尖时,需用微量吸管拉长器(micropipettepuller),注射时需有固定管尖位置的微量操作器。这种技术的优点为任何DNA在原则上均可传入任何种类的细胞内。此法已成功运用于包括小鼠、鱼、大鼠、兔子及许多大型家畜,如牛、羊、猪等转基因工程培育的动物。
发明内容
现有技术中,无法直观地判断显微注射液是否注入到受精卵内,即使显微注射液注入受精卵内,也存在因显微注射液在受精卵中所在位置不正确而导致对受精卵的基因编辑失败的情况,同时现有技术通常在经过基因编辑的非人动物出生后再对其进行基因检测以确定基因编辑是否成功,检测周期较长。针对上述技术问题,本申请提供一种增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法。相比于现有技术中显微注射的方法,通过在显微注射液中加入荧光素钠,可以在激发光下确定基因编辑显微注射液是否注射到受精卵内,并且可以可视化基因编辑显微注射液在受精卵中的位置,避免基因编辑显微注射液未注入受精卵或在受精卵中所在位置不正确而导致受精卵基因编辑失败的情况。同时可以在受精卵培育至二细胞时期,选取携带荧光的二细胞进行培育,大大缩短了对经过基因编辑的非人动物进行基因检测的检测周期。
本申请的具体技术方案如下:
1.一种增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法,其包括:
对非人动物的受精卵注射含有荧光素的基因编辑显微注射液,然后在所述受精卵卵裂至二细胞时期,进行荧光观察,挑取携带荧光的二细胞移植到待孕非人动物的子宫培育成非人动物,所述非人动物优选为小鼠;
所述基因编辑为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas9基因编辑技术;
2.根据项1所述的一种增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法,其中,所述注射方法为显微注射。
3.根据项1所述的一种增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法,其中,所述荧光素为荧光素钠。
4.根据项3所述的一种增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法,其中,所述荧光素钠在基因编辑显微注射液中的浓度为0.5~2mg/mL。
5.根据项1所述的一种增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法,其中,所述基因编辑显微注射液含有Cas9 mRNA注射液与sgRNA注射液。
6.根据项3所述的一种增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法,其中,所述Cas9mRNA注射液与sgRNA注射液的摩尔比为2~3:2~5。
7.根据项3所述一种增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法,其中,所述sgRNA注射液由sgRNA1注射液与sgRNA2注射液组成。
8.根据项7所述的一种增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法,其中,所述sgRNA1注射液与所述sgRNA2注射液的摩尔比为1~2:1~2。
9.根据项7所述的一种增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法,其中,所述sgRNA1的序列为GTACCTAGAGAAGGGTTACA;
所述sgRNA2的序列为GAAAGAAGTAGCCAAGAGAGC。
10根据项1所述的一种增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法,其中,基因编辑的靶点基因为非人动物IL2RG基因。
11.一种荧光素在基因编辑中的应用,所述荧光素选自荧光素钠。
12.一种根据项1~10中任一项所述的方法产生的非人动物或其后代在制备动物模型中的用途。
13.一种根据项1~10中任一项所述的方法产生的非人动物或其后代或非人动物模型在药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用。
发明的效果
相比于现有技术,本申请的增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法,利用含有荧光素的基因编辑注射液对非人动物受精卵进行微注射,并将经过显微注射的受精卵培养至二细胞时期,并挑取携带荧光的二细胞移植到待孕非人动物的子宫进一步培育成非人动物,避免了因为基因编辑显微注射液未注入受精卵或在受精卵中所在位置不正确而导致受精卵基因编辑失败的情况,进而增强对非人动物受精卵进行基因编辑的效率。同时可以在受精卵培育至二细胞时期,选取携带荧光的二细胞进行培育或裂解检测,大大缩短了对经过基因编辑的非人动物进行检测的检测周期。
附图说明
图1为基因编辑注射液单胚胎注射图。
图2为受精卵荧光图。
图3为二细胞荧光图,携带荧光表示基因编辑注射液注射成功。
图4为四细胞荧光图,携带荧光表示胚胎发育不会导致荧光消失。
图5为实施例1所述的单胚胎基因型鉴定电泳图,其中M为D2000Marker,条带分别为100bp,250bp,500bp,750bp,1000bp,2000bp。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本申请,应当理解,实施例仅用于进一步说明和阐释本申请,并非用于限制本申请。
除非另外定义,本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料,本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下,以本说明书包括其中定义为准,另外,材料、方法和例子仅供说明,而不具限制性。以下结合具体实施例对本申请作进一步的说明,但不用来限制本申请的范围。
定义
在本文中使用的术语“非人动物”例如实验室动物、家畜、牲畜等,例如诸如鼠、啮齿类、犬、猫、猪、马、牛、绵羊、非人灵长类等物种;例如小鼠、大鼠、家兔、仓鼠、豚鼠、牛、猪、绵羊、山羊、和其它转基因动物物种,特别是哺乳动物物种,如本领域中已知的。在某些实施方案中,用于基因编辑的动物是小鼠、大鼠或家兔。
在一个实施方案中,非人动物是哺乳动物。在一些此类实施方案中,非人动物是小型哺乳动物,例如跳鼠总科(Dipodoidea)或鼠总科(Muroidea)。在一个实施方案中,经遗传修饰的动物是啮齿类。在一个实施方案中,啮齿类选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方案中,啮齿类选自鼠总科。在一个实施方案中,经遗传修饰的动物选自下述的科:丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(Cricetidae)(例如仓鼠、新世界(NewWorld)大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、多刺小鼠(spiny mice)、鬃毛大鼠(crested rats))、马岛鼠科(Nesomyidae)(攀爬小鼠(climbing mice)、岩石小鼠(rockmice)、有尾大鼠(with-tailed rat)、马达加斯加(Malagasy)大鼠和小鼠)、刺山鼠科(Platacanthomyidae)(例如多刺睡鼠(spiny dormice))、和鼢鼠科(Spalacidae)(例如鼹鼠(mole rates)、竹鼠(bamboo rat)、和鼢鼠(zokors))。在一个具体的实施方案中,经遗传修饰的啮齿类选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、多刺小鼠、和鬃毛大鼠。在一个实施方案中,经遗传修饰的小鼠来自鼠科的成员。
在本文中使用的术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物的聚合形式。多核苷酸的实例包括但不限于基因或基因片段的编码区或非编码区、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、小分子RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、载体、任何序列分离的DNA、任何序列分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以经进一步修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸也可以在聚合之后修饰,例如通过与标记剂偶联。
在本文中使用的术语“CRISPR/Cas9”是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御,可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9基因编辑技术,则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。以CRISPR/Cas9基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景,例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。该技术成果已应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰。
在本文中使用的术语“sgRNA”通常是指人工CRISPR/Cas9系统中,单分子向导RNA或单链向导RNA,是指引导Cas9蛋白特异性结合靶标DNA序列的RNA,是CRISPR基因敲除/敲入系统中重要的组成部分。本申请的sgRNA包含靶向目标序列的指导序列。在优选实施方案中,本申请的sgRNA进一步包含tracr序列和tracr伴侣序列。
在本文中使用的术语“显微注射”是指将物质注射到生物体的器官、组织、细胞或细胞内的细胞器。上述物质可包含化学物质、多核苷酸或多肽。
本申请提供一种增强非人动物基因编辑效率的方法,包括:
对非人动物的受精卵注射含有荧光素的基因编辑显微注射液,然后在所述受精卵卵裂至二细胞时期,进行荧光观察,挑取携带荧光的二细胞移植到待孕非人动物的子宫培育成非人动物,所述非人动物优选为小鼠;
所述基因编辑为基于锌指核酸酶的基于编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas9基因编辑技术。
本领域技术人员可以用任何基因编辑的方法,例如基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术和CRISPR/Cas(如CRISPR/Cas9)基因编辑技术,以及今后发现的其它基因编辑方法对非人动物的受精卵进行基因编辑。因此,本申请涵盖在任何可利用的基因编辑方法所用到的基因编辑显微注射液中加入荧光素的技术方案。
在一个具体实施方式中,所述非人动物为小鼠,增强小鼠基因编辑效率的方法包括:对小鼠的受精卵注射含有荧光素的基因编辑显微注射液,然后在所述受精卵卵裂至二细胞时期,进行荧光观察,挑取携带荧光的二细胞移植到待孕小鼠的子宫培育成小鼠;
所述基因编辑为基于锌指核酸酶的基于编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas9基因编辑技术。
在一个具体实施方式中,所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9技术,通过在显微注射液中加入荧光素,对非人动物的受精卵注射含有荧光素的基因编辑显微注射液,然后在所述受精卵卵裂至二细胞时期,进行荧光观察,挑取携带荧光的二细胞移植到待孕非人动物的子宫培育成非人动物。
在一个具体实施方式中,所述注射方法为显微注射。显微注射的具体操作为本领域已知的操作方法。
在一个具体实施方式中,所述荧光素为荧光素钠。荧光素钠化学式为C20H10Na2O5,是一种荧光染料,常用于医学、生物学等领域的实验和临床应用中。荧光素钠在医学上被广泛用于眼科诊断,特别用于角膜病变的检测和手术过程中的可视化辅助;在生物学上通常用于蛋白质凝胶电泳等实验。
在一个具体实施方式中,所述荧光素钠在基因编辑显微注射液中的浓度为0.5mg/mL~2mg/mL,例如可为0.5mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1mg/mL、1.1mg/mL、1.2mg/mL、1.3mg/mL、1.4mg/mL、1.5mg/mL、1.6mg/mL、1.7mg/mL、1.8mg/mL、1.9mg/mL、2mg/mL。
在一个具体实施方式中,增强非人动物基因编辑效率的方法包括以下步骤:在基因编辑显微注射液中加入荧光素钠,以得到包含荧光素钠的基因编辑显微注射液;对非人动物的受精卵注射含有荧光素钠的基因编辑显微注射液;在注射后的受精卵卵裂至二细胞时期,进行荧光观察,挑取携带荧光的二细胞移植到待孕非人动物的子宫培育成非人动物。
在一个具体实施方式中,所述非人动物为小鼠,增强小鼠基因编辑效率的方法包括:在基因编辑显微注射液中加入荧光素钠,以得到包含荧光素钠的基因编辑显微注射液;对小鼠的受精卵注射含有荧光素钠的基因编辑显微注射液;在注射后的受精卵卵裂至二细胞时期,进行荧光观察,挑取携带荧光的二细胞移植到待孕小鼠的子宫培育成小鼠。
在一个具体实施方式中,所述基因编辑显微注射液含有Cas9 mRNA注射液和sgRNA注射液。
其中,基因编辑注射液的制备方法可以通过本领域的各种已知方法制备。
在一个具体实施方式中,增强非人动物基因编辑效率的方法包括以下步骤:制备包含Cas9 mRNA注射液和sgRNA注射液的基因编辑显微注射液;在所述基因编辑显微注射液中加入荧光素钠;将所述基因编辑显微注射液通过显微注射的方式注射到非人动物的受精卵内;在注射后的受精卵卵裂至二细胞时期,进行荧光观察,挑取携带荧光的二细胞移植到待孕非人动物的子宫培育成非人动物。
在一个具体实施方式中,所述非人动物为小鼠,增强小鼠基因编辑效率的方法包括:制备包含Cas9 mRNA注射液和sgRNA注射液的基因编辑显微注射液;在所述基因编辑显微注射液中加入荧光素钠;将所述基因编辑显微注射液通过显微注射的方式注射到小鼠的受精卵内;在注射后的受精卵卵裂至二细胞时期,进行荧光观察,挑取携带荧光的二细胞移植到待孕小鼠的子宫培育成小鼠。
在一个具体实施方式中,所述Cas9mRNA注射液和sgRNA注射液的摩尔比为2~3:2~5,例如可为2:2、2:3、2:4、2:5、3:2、3:3、3:4、3:5。
在一个具体实施方式中,所述sgRNA注射液由sgRNA1注射液和sgRNA2注射液组成。
在一个具体实施方式中,制备包含sgRNA注射液包括以下步骤:构建包含sgRNA1的载体和包含sgRNA2的载体,并将载体通过体外转录,以得到sgRNA1注射液和sgRNA2注射液;将sgRNA1注射液和sgRNA2注射液混合,以得到sgRNA注射液。
在一个具体实施方式中,制备包含Cas9 mRNA注射液和sgRNA注射液的基因编辑显微注射液包括以下步骤:构建包含Cas9的载体,并将载体通过体外转录,以得到Cas9 mRNA注射液;构建包含sgRNA1和sgRNA2的载体,并将载体通过体外转录,以得到sgRNA1注射液和sgRNA2注射液;将sgRNA1注射液和sgRNA2注射液混合,以得到sgRNA注射液;将所述Cas9mRNA注射液与所述sgRNA注射液混合,以得到基因编辑显微注射液。
其中,包含Cas9的载体以及包含sgRNA的载体的构建可以通过本领域已知的方法。
在一个具体实施方式中,所述sgRNA1注射液与所述sgRNA2注射液的摩尔比为1~2:1~2,例如可为:1:1、1:2、2:1。
在一个具体实施方式中,所述sgRNA1的序列为5’-GTACCTAGAGAAGGGTTACA-3’;
所述sgRNA2的序列为5’-GAAAGAAGTAGCCAAGAGAGC-3’。
在一个具体实施方式中,基因编辑的靶点基因为非人动物IL2RG基因,在一个具体实施方式中,所述非人动物是小鼠,基因编辑的靶点基因为小鼠的IL2RG基因。
在一个具体实施方式中,增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法还包括对挑取的携带荧光的二细胞进行基因检测的过程。其中,挑取1/2的携带荧光的二细胞移植到待孕非人动物的子宫培育成非人动物;挑取1/2的携带荧光的二细胞进行细胞裂解,以得到胚胎裂解产物;对所述胚胎裂解产物进行基因检测,以得到基因编辑成功的二细胞比例。
本领域技术人员可以用任何基因检测的方法对胚胎裂解产物进行基因检测,例如以裂解产物为模板进行巢式PCR,并将巢式PCR产物进行凝胶电泳分析或进行基因测序。
在一个具体实施方式中,增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法还包括对非人动物受精卵基因编辑效率的计算,所述计算包括:
C%=(A)/(B)×100%。
式中:
C-非人动物受精卵基因编辑效率;
A-进行基因检测中基因编辑成功的二细胞个数;
B-进行基因检测的二细胞个数个数。
在一个具体实施方式中,增强非人动物基因编辑效率的方法包括以下步骤:构建包含Cas9 mRNA的载体,并将载体通过体外转录,以得到Cas9mRNA注射液;构建包含sgRNA1和包含sgRNA2的载体,并将载体通过体外转录,以得到sgRNA1注射液和sgRNA2注射液;将sgRNA1注射液和sgRNA2注射液混合,以得到sgRNA注射液;将所述Cas9 mRNA注射液与所述sgRNA注射液混合,以得到基因编辑显微注射液;在所述基因编辑显微注射液中加入荧光素钠;将所述基因编辑显微注射液通过显微注射的方式注射到非人动物的受精卵内;在注射后的受精卵卵裂至二细胞时期,进行荧光观察,挑取携带荧光的二细胞;取1/2的携带荧光的二细胞移植到待孕非人动物的子宫培育成非人动物;取1/2的携带荧光的二细胞进行裂解,以得到细胞裂解产物;对上述细胞裂解产物进行基因检测,以得到基因编辑成功的二细胞个数;通过基因编辑成功的二细胞个数计算非人动物基因编辑效率。
在一个具体实施方式中,所述非人动物为小鼠,增强小鼠基因编辑效率的方法包括以下步骤:构建包含Cas9 mRNA的载体,并将载体通过体外转录,以得到Cas9 mRNA注射液;构建包含sgRNA1和包含sgRNA2的载体,并将载体通过体外转录,以得到sgRNA1注射液和sgRNA2注射液;将sgRNA1注射液和sgRNA2注射液混合,以得到sgRNA注射液;将所述Cas9mRNA注射液与所述sgRNA注射液混合,以得到基因编辑显微注射液;在所述基因编辑显微注射液中加入荧光素钠;将所述基因编辑显微注射液通过显微注射的方式注射到小鼠的受精卵内;在注射后的受精卵卵裂至二细胞时期,进行荧光观察,挑取携带荧光的二细胞;取1/2的携带荧光的二细胞移植到待孕小鼠的子宫培育成小鼠;取1/2的携带荧光的二细胞进行裂解,以得到细胞裂解产物;对上述细胞裂解产物进行基因检测,以得到基因编辑成功的二细胞个数;通过完成基因编辑的二细胞个数计算小鼠基因编辑效率。
本申请还提供一种荧光素在基因编辑中的应用,所述荧光素为荧光素钠。
本申请还提供一种根据上述方法产生的非人动物或其后代在制备动物模型中的应用。
本申请还提供一种根据上述方法产生的非人动物或其后代或非人动物模型在药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用。
本申请的增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法,利用含有荧光素的基因编辑注射液对非人动物受精卵进行显微注射,并将经过显微注射的受精卵培养至二细胞时期,并挑取携带荧光的二细胞移植到待孕非人动物的子宫进一步培育成非人动物,在对所述受精卵进一步培育成非人动物前去除了未成功注射的受精卵,避免了因为基因编辑显微注射液未注入受精卵或在受精卵中所在位置不正确而导致受精卵基因编辑失败的情况,进而增强对非人动物受精卵进行基因编辑的效率。同时可以在受精卵培育至二细胞时期,选取携带荧光的二细胞进行培育或裂解检测,大大缩短了对基因编辑成功的非人动物进行检测的检测周期。
实施例
实施例1经过显微注射的小鼠的获取
所用仪器:
体视镜(奥林巴斯,SZX7),37℃5%CO2培养箱(三洋,MCO-15A),微量注射仪(eppendorf,FemtoJet 4i),荧光倒置显微镜(奥林巴斯,IX73),微量操作装置(成茂,ON4),气动注射器(成茂,IM-12),持卵针(北京吉田生物),注射针(北京吉田生物),MicroloaderTM-微量上样针(eppendorf,5242956003),热台(THERMOPLATE),ProFlex PCRSystem(赛默飞,ProFlex 3×32well PCR system),凝胶成像仪(BiO-RAD,Universal HoodII),电泳仪(BiO-RAD,PowerPacTM Basic)。
所用试剂:
ECO31I(赛默飞,ER0291),MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN,2084),T4DNA Ligase kit(索莱宝,T1410),Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(诺唯赞,P505),MinElute PCR Purification Kit(德国凯杰,28004),MEGAshortscript T7Transcription Kit(赛默飞,AM1354),M5 HiPer RNAclean Mini Kit(聚合美,MF746-01),RNAsecure(赛默飞,AM7005),AgeI(西酶,SE1464S),mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit(赛默飞,AM1345),QIANGEN RNeasy Mini Kits(德国凯杰,74904),透明质酸酶(南京爱贝,M2215),M2培养液(Sigma,M7167),M16培养液(Sigma,R-010),组织培养油(SAGE,ARF-4008P-5P),孕马血清激素PMSG(宁波三生生物),人绒毛促性腺激素hCG(宁波三生生物),PBS溶液(索莱宝,P1010),荧光素钠(sigma,F6377),TSINGKE TSE030 T3 Super PCR Mix(TSINGKE,TSE030),小提中量试剂盒(TIANGEN,DP118),琼脂糖快速胶回收试剂盒(Generay,GK7045-200),PCR产物纯化试剂盒(Generay,GK2052-100),5min TA/Blunt-ZeroCloning Kit(诺唯赞,C601)。
1.1基因编辑显微注射液的配制
1.1.1sgRNA注射液获取
利用PCR扩增pUC57-T7-sgRNA(包括sgRNA1和sgRNA2)表达载体上的T7启动子及sgRNA序列作为体外转录模板进行体外转录,反应体系如表1所示,反应过程如表2所示,随后纯化体外转录产物获得sgRNA显微注射液。
表1sgRNA体外转录体系
体系 | 50μL |
2×buffer | 25μL |
IVT-F | 2μL |
IVT-R | 2μL |
sgRNA | 2μL(稀释至10ng/μl) |
dNTP | 1μL |
Enzyme | 0.5μL |
ddH20 | 17.5μL |
表2 sgRNA体外转录过程
1.1.2 Cas9mRNA注射液获取
线性化Pst1374-NLS-flag-linker-Cas9载体体系如表3,随后纯化回收线性化载体,以线性化的载体为模板体外转录获取Cas9 mRNA,给Cas9 mRNA加Poly(A)尾后,纯化转录后加尾产物获得Cas9 mRNA注射液。
表3 Cas9 mRNA体外转录体系
试剂 | 用量 |
Cas9质粒 | 10μg |
10×FastDigest Buffer | 10μl |
AgeI限制性内切酶 | 4μl |
ddH20 | 补齐至100μl |
1.1.3基因编辑注射液获取
取1μL的Cas9 mRNA注射液、1μL的sgRNA1注射液、1μL的sgRNA2注射液混合获得基因编辑注射液。取1μL的荧光素钠溶于1μL的TE缓冲液,并与基因编辑注射液混合得到基因编辑注射液。
1.2显微注射
1.2.1雌鼠超数排卵
将孕马血清促性腺激素PMSG和人绒毛促性腺激素hCG稀释到50IU/mL。于16:00对4周龄C57雌性小鼠腹腔注射10IU的PMSG。注射PMSG48小时后,腹腔注射10IU的hCG。注射后立即与雄鼠合笼,1只雄鼠可与1-2只雌鼠合笼。
1.2.2培养液准备
透明质酸酶消化滴:在35mm培养皿中制作200μL的透明质酸酶滴,在周围制作50μLM2培养滴5个,并用油覆盖,37℃培养箱预热过夜。
M2注射滴:在35mm培养皿中制作100μLM2培养滴并用油覆盖,37℃培养箱预热过夜。
1.2.3显微注射
合笼次日早检查阴道栓,取见栓雌鼠。脱颈处死雌鼠,剖开背部暴露子宫、输卵管及卵巢,取输卵管;在纸上去除脂肪和血液;在消化滴油内撕破输卵管膨大部,将带有卵丘细胞的卵子拉入透明质酸酶中,等待1-2min,顺时针晃动培养皿8-10次,。消化后捡卵至M2注射滴中准备显微注射。在MicroloaderTM-微量上样针加入1-5μL注射样品,排除气泡。固定并在镜下调节注射针和和持卵针,并在显微镜下碰断注射针。调节eppendorf微量注射仪参数,注射压力100-1000hPa,注射时间0.5-2.5s,补充压力5-20hPa。注射完成后,将注射完成的受精卵置于M2培养滴培养。
1.2.4筛选与鉴定
将注射完成的受精卵培养至二细胞时期,通过荧光筛选出携带荧光的二细胞,取1/2的携带荧光的二细胞移植入待孕小鼠的输卵管,培育成经过基因编辑的小鼠。
取1/2的携带荧光的二细胞使用5-7μL单细胞裂解液裂解形成裂解产物;以裂解产物为模板进行PCR,PCR反应体系如表3,得到20μL的PCR产物,以此PCR产物为模板进行巢式PCR并将巢式PCR产物使用凝胶电泳分析基因编辑条带并进行测序验证基因编辑结果。
表4 PCR反应体系
体系 | 20μL |
2×buffer | 10μL |
I2G-SNP-F | 1μL |
I2G-SNP-R | 1μL |
胚胎裂解液 | 7.4μL |
dNTP | 0.4μL |
Enzyme | 0.2μL |
表5巢式PCR反应体系
体系 | 50μL |
2×buffer | 25μL |
I2G-SNP-F | 2μL |
I2G-SNP-R | 2μL |
pcr模板 | 1μL |
dNTP | 1μL |
Enzyme | 0.5μL |
ddH20 | 18.5μL |
1.2.5基因编辑效率计算
本实施例对50个小鼠受精卵注射含有荧光素钠的基因编辑显微注射液;其中挑取携带荧光的二细胞为30个;取1/2的携带荧光的二细胞进行裂解,并将裂解产物进行基因检测得到完成基因编辑的个数为12个,即对非人动物受精卵完成基因编辑的个数为24个;
C%=24/30×100%=80%。
式中:
C-小鼠受精卵基因编辑效率。
原基因编辑效率=24/50×100%=48%。
本申请利用含有荧光素的基因编辑注射液对非人动物受精卵进行显微注射,并将经过显微注射的受精卵培养至二细胞时期,并挑取携带荧光的二细胞移植到待孕非人动物的子宫进一步培育成非人动物,在对所述受精卵进一步培育成非人动物前去除了未成功注射的受精卵,将原本仅48%的基因编辑效率提高至80%,大大提高了对非人动物受精卵基因编辑的效率,同时可以在受精卵培育至二细胞时期,选取携带荧光的二细胞进行培育或裂解检测,大大缩短了对经过基因编辑的非人动物进行检测的检测周期。
以上所述,仅是本申请的较佳实施例而已,并非是对本申请作其它形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容,依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型,仍属于本申请技术方案的保护范围。
Claims (14)
1.一种增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法,其中,包括:
对非人动物的受精卵注射含有荧光素的基因编辑显微注射液,然后在所述受精卵卵裂至二细胞时期,进行荧光观察,挑取携带荧光的二细胞移植到待孕非人动物的子宫培育成非人动物,所述非人动物优选为小鼠;
所述基因编辑为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas9基因编辑技术。
2.根据权利要求1所述的一种增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法,其中,所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9基因编辑技术。
3.根据权利要求1所述的一种增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法,其中,所述注射方法为显微注射。
4.根据权利要求1所述的一种增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法,其中,所述荧光素为荧光素钠。
5.根据权利要求4所述的一种增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法,其中,所述荧光素钠在基因编辑显微注射液中的浓度为0.5-2mg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法,其中,所述基因编辑显微注射液含有Cas9 mRNA注射液和sgRNA注射液。
7.根据权利要求6所述的一种增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法,其中,所述Cas9mRNA注射液与sgRNA注射液的摩尔比为2~3:2~5。
8.根据权利要求6所述一种增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法,其中,所述sgRNA注射液由sgRNA1注射液与sgRNA2注射液组成。
9.根据权利要求8所述的一种增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法,其中,所述sgRNA1注射液与所述sgRNA2注射液的摩尔比为1~2:1~2。
10.根据权利要求8所述的一种增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法,其中,所述sgRNA1的序列为GTACCTAGAGAAGGGTTACA;
所述sgRNA2的序列为GAAAGAAGTAGCCAAGAGAGC。
11.根据权利要求1所述的一种增强非人动物受精卵基因编辑效率的方法,其中,基因编辑的靶点基因为非人动物IL2RG基因。
12.一种荧光素在基因编辑中的应用,所述荧光素选自荧光素钠。
13.一种根据权利要求1~11中任一项所述的方法产生的非人动物或其后代在制备动物模型中的应用。
14.一种根据权利要求1~11中任一项所述的方法产生的非人动物或其后代以及非人动物模型在药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用。
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