JPH0928384A - 糖尿病発生トランスジェニックマウス - Google Patents
糖尿病発生トランスジェニックマウスInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 糖尿病トランスジェニックマウスに関し、ヒ
トインスリン遺伝子プロモーターに熱衝撃蛋白質遺伝子
が融合された糖尿病発生遺伝子をマウスに移植して糖尿
病発生トランスジェニックマウスを提供する。 【解決手段】 遺伝子のプロモーターと、遺伝子のプロ
モーター下部に付着される熱衝撃蛋白質７０遺伝子を含
む、トランスジェニック動物製造用組換え遺伝子と、ト
ランスジェニック動物製造用組換え遺伝子を持ち、所望
の形質が発現されたトランスジェニックマウスとを開示
する。また、遺伝子のプロモーターと、遺伝子のプロモ
ーターの下部に付着される熱衝撃蛋白質７０遺伝子を含
む組換え遺伝子を受精卵に挿入し、受精卵を代理母マウ
スに移し、代理母マウスを飼育出産して所望の形質が発
現された子マウスである始祖マウスを得る工程を含むト
ランスジェニックマウスの製造方法を開示する。
トインスリン遺伝子プロモーターに熱衝撃蛋白質遺伝子
が融合された糖尿病発生遺伝子をマウスに移植して糖尿
病発生トランスジェニックマウスを提供する。 【解決手段】 遺伝子のプロモーターと、遺伝子のプロ
モーター下部に付着される熱衝撃蛋白質７０遺伝子を含
む、トランスジェニック動物製造用組換え遺伝子と、ト
ランスジェニック動物製造用組換え遺伝子を持ち、所望
の形質が発現されたトランスジェニックマウスとを開示
する。また、遺伝子のプロモーターと、遺伝子のプロモ
ーターの下部に付着される熱衝撃蛋白質７０遺伝子を含
む組換え遺伝子を受精卵に挿入し、受精卵を代理母マウ
スに移し、代理母マウスを飼育出産して所望の形質が発
現された子マウスである始祖マウスを得る工程を含むト
ランスジェニックマウスの製造方法を開示する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、糖尿病発生トラン
スジェニックマウスに関し、より詳しくは、熱衝撃蛋白
質（Ｈｓｐ）がインスリン・プロモーターの調節下で発
現されるようにする遺伝子をマウスに導入して生産され
る糖尿病トランスジェニックマウスに関する。
スジェニックマウスに関し、より詳しくは、熱衝撃蛋白
質（Ｈｓｐ）がインスリン・プロモーターの調節下で発
現されるようにする遺伝子をマウスに導入して生産され
る糖尿病トランスジェニックマウスに関する。
【０００２】
【従来の技術】一般的に、トランスジェニックマウス
は、特定遺伝子の切片をマウスの受精卵にマイクロイン
ジェクションし、これを他のネズミの子宮に着床させて
出産させた後、生後３週ほどのマウスの尾ＤＮＡを検査
して、外部から与えられた遺伝子がマウス細胞内ＤＮＡ
に正しく挿入されたかを確認する過程を経て誕生され
る。
は、特定遺伝子の切片をマウスの受精卵にマイクロイン
ジェクションし、これを他のネズミの子宮に着床させて
出産させた後、生後３週ほどのマウスの尾ＤＮＡを検査
して、外部から与えられた遺伝子がマウス細胞内ＤＮＡ
に正しく挿入されたかを確認する過程を経て誕生され
る。
【０００３】トランスジェニックマウスは遺伝子の機能
を生体内で見出せる方法として、人体内の各種疾患のモ
デル開発とこれによる各種治療剤の開発およびマウスの
体を生体工場にて作る遺伝子農場(bio-reactor) などが
期待される分野である。
を生体内で見出せる方法として、人体内の各種疾患のモ
デル開発とこれによる各種治療剤の開発およびマウスの
体を生体工場にて作る遺伝子農場(bio-reactor) などが
期待される分野である。
【０００４】現在癌のような遺伝的問題に対するアプロ
ーチとして、トランスジェニックマウス技術による新し
いモデルが開発されており、既に米国のハーバード大学
のP.Leder 教授によるｃ−ｍｙｓ癌遺伝子が挿入された
トランスジェニックマウスの開発成功は人体白血病のモ
デルであるという点で非常に注目されており、生きる生
命に対して世界で最初に特許を受けた（米国特許第5,08
7,571 号）。
ーチとして、トランスジェニックマウス技術による新し
いモデルが開発されており、既に米国のハーバード大学
のP.Leder 教授によるｃ−ｍｙｓ癌遺伝子が挿入された
トランスジェニックマウスの開発成功は人体白血病のモ
デルであるという点で非常に注目されており、生きる生
命に対して世界で最初に特許を受けた（米国特許第5,08
7,571 号）。
【０００５】その後、Philip Lederらが発明した前立腺
が肥大された雄マウス（米国特許第5,175,383 号）、Pa
ulus J.K.Krimpenfortらが発明した成熟Ｔ−細胞が生成
されていないマウス（米国特許第5,175,384 号）、およ
び、Thomas E.Wagner らが発明したヒトβ型インターフ
ェロンを生産するマウス（米国特許第5,175,385 号）な
どが紹介されている。
が肥大された雄マウス（米国特許第5,175,383 号）、Pa
ulus J.K.Krimpenfortらが発明した成熟Ｔ−細胞が生成
されていないマウス（米国特許第5,175,384 号）、およ
び、Thomas E.Wagner らが発明したヒトβ型インターフ
ェロンを生産するマウス（米国特許第5,175,385 号）な
どが紹介されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】インスリンは膵臓ラン
ゲルハンス島のβ細胞で分泌されて血液中のブドウ糖量
の制御の役割をするホルモンである。糖尿病は、効果的
なインスリンの不適切な供給により炭水化物、脂肪及び
蛋白質の代謝に障害を起こす代謝性疾患であり、遺伝の
確率が非常に高い病気である。糖尿とその合併症による
死亡は、米国の３大死亡原因中の一つであり、米国人の
５％が糖尿患者である程、糖尿病は世界で一番希でない
病気中の一つであり、今も続いて増加しつつある。
ゲルハンス島のβ細胞で分泌されて血液中のブドウ糖量
の制御の役割をするホルモンである。糖尿病は、効果的
なインスリンの不適切な供給により炭水化物、脂肪及び
蛋白質の代謝に障害を起こす代謝性疾患であり、遺伝の
確率が非常に高い病気である。糖尿とその合併症による
死亡は、米国の３大死亡原因中の一つであり、米国人の
５％が糖尿患者である程、糖尿病は世界で一番希でない
病気中の一つであり、今も続いて増加しつつある。
【０００７】糖尿病は、インスリン依存性糖尿病（ｔｙ
ｐｅ Ｉ）と、インスリン非依存性糖尿病（ｔｙｐｅ
II）に大きく分かれるが、インスリン依存性糖尿病は自
己免疫疾患( 組織障害または機能障害) により、また
は、損傷されたβ細胞の再生ができないことにより体内
で生産されるインスリンの量が非常に少なくなるため、
必ず外部で生産されたインスリンの供給が必要になり、
大体若い人達に発生する。反面、インスリン非依存性糖
尿病は、体内で適正または過剰のインスリンが分泌され
るが、インスリン受容体の不足と組織内におけるインス
リン結合の減少により発生し、その速度は非常に遅く、
その症状は比較的に軽微な方である。
ｐｅ Ｉ）と、インスリン非依存性糖尿病（ｔｙｐｅ
II）に大きく分かれるが、インスリン依存性糖尿病は自
己免疫疾患( 組織障害または機能障害) により、また
は、損傷されたβ細胞の再生ができないことにより体内
で生産されるインスリンの量が非常に少なくなるため、
必ず外部で生産されたインスリンの供給が必要になり、
大体若い人達に発生する。反面、インスリン非依存性糖
尿病は、体内で適正または過剰のインスリンが分泌され
るが、インスリン受容体の不足と組織内におけるインス
リン結合の減少により発生し、その速度は非常に遅く、
その症状は比較的に軽微な方である。
【０００８】また、患者数の比率においては、インスリ
ン依存性糖尿病は全体の糖尿病患者中５〜１０％位に過
ぎず、その残りはインスリン非依存性糖尿病に該当す
る。
ン依存性糖尿病は全体の糖尿病患者中５〜１０％位に過
ぎず、その残りはインスリン非依存性糖尿病に該当す
る。
【０００９】一方、熱衝撃蛋白質（熱ショック蛋白質）
（Ｈｓｐ）は細胞の損傷を回復させるに重要な蛋白質で
あり、熱衝撃またはストレス状態で発現され、胚形成
時、細胞分化および細胞サイクルの特定段階で発現され
る。
（Ｈｓｐ）は細胞の損傷を回復させるに重要な蛋白質で
あり、熱衝撃またはストレス状態で発現され、胚形成
時、細胞分化および細胞サイクルの特定段階で発現され
る。
【００１０】本発明の目的は、ヒトインスリン遺伝子プ
ロモーターにヒト熱衝撃蛋白質遺伝子が融合された糖尿
病発生遺伝子をマウスに導入して糖尿病発生トランスジ
ェニックマウスを提供することにある。
ロモーターにヒト熱衝撃蛋白質遺伝子が融合された糖尿
病発生遺伝子をマウスに導入して糖尿病発生トランスジ
ェニックマウスを提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】上述のような目的を達成
するため、本発明の発明者らは、膵臓ランゲルハンス島
のβ細胞の分化に熱衝撃蛋白質の発現が及ぼす影響を研
究している中に、ヒトインスリン遺伝子プロモーターに
ヒト熱衝撃蛋白質の遺伝子が組換えされた遺伝子をマウ
スに導入させる場合、糖尿病が発生されるという点に着
案して、本発明を完成するに至った。
するため、本発明の発明者らは、膵臓ランゲルハンス島
のβ細胞の分化に熱衝撃蛋白質の発現が及ぼす影響を研
究している中に、ヒトインスリン遺伝子プロモーターに
ヒト熱衝撃蛋白質の遺伝子が組換えされた遺伝子をマウ
スに導入させる場合、糖尿病が発生されるという点に着
案して、本発明を完成するに至った。
【００１２】すなわち、本発明は、遺伝子のプロモータ
ー(promoter)と、前記遺伝子のプロモーター下部に付着
される熱衝撃蛋白質７０遺伝子を含む、トランスジェニ
ック動物製造用組換え遺伝子と、前記トランスジェニッ
ク動物製造用組換え遺伝子を持ち、所望の形質が発現さ
れたトランスジェニックマウスとを提供する。
ー(promoter)と、前記遺伝子のプロモーター下部に付着
される熱衝撃蛋白質７０遺伝子を含む、トランスジェニ
ック動物製造用組換え遺伝子と、前記トランスジェニッ
ク動物製造用組換え遺伝子を持ち、所望の形質が発現さ
れたトランスジェニックマウスとを提供する。
【００１３】また、遺伝子のプロモーターと、前記遺伝
子のプロモーターの下部に付着される熱衝撃蛋白質７０
遺伝子を含む組換え遺伝子を受精卵に挿入し、前記受精
卵を代理母マウスに移し、前記代理母マウスを飼育出産
して所望の形質が発現された子マウスである始祖マウス
を得る工程を含むトランスジェニックマウスの製造方法
と、この製造方法により製造されたトランスジェニック
マウスとを提供する。
子のプロモーターの下部に付着される熱衝撃蛋白質７０
遺伝子を含む組換え遺伝子を受精卵に挿入し、前記受精
卵を代理母マウスに移し、前記代理母マウスを飼育出産
して所望の形質が発現された子マウスである始祖マウス
を得る工程を含むトランスジェニックマウスの製造方法
と、この製造方法により製造されたトランスジェニック
マウスとを提供する。
【００１４】また、本発明において、前記動物はマウ
ス、豚、鶏からなる群から選択されることが好ましい。
ス、豚、鶏からなる群から選択されることが好ましい。
【００１５】また、本発明において、前記遺伝子は、イ
ンスリン遺伝子を使用し、特にヒトインスリン遺伝子を
使用する。
ンスリン遺伝子を使用し、特にヒトインスリン遺伝子を
使用する。
【００１６】また、本発明において、前記熱衝撃蛋白質
７０遺伝子は、ヒト熱衝撃蛋白質７０遺伝子を使用す
る。
７０遺伝子は、ヒト熱衝撃蛋白質７０遺伝子を使用す
る。
【００１７】また、本発明において、前記遺伝子のプロ
モーターは、ヒトのインスリン遺伝子プロモーターをＥ
ｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断したものを使用し、前記熱
衝撃蛋白質７０遺伝子はヒト熱衝撃蛋白質７０遺伝子を
ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIII で切断したものを使用し、前
記切断されたヒトのインスリン・プロモーターのＢａｍ
ＨＩ部位と前記切断されたヒトの熱衝撃蛋白質７０遺伝
子のＢａｍＨＩとを結合させた組換え遺伝子を使用す
る。
モーターは、ヒトのインスリン遺伝子プロモーターをＥ
ｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断したものを使用し、前記熱
衝撃蛋白質７０遺伝子はヒト熱衝撃蛋白質７０遺伝子を
ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIII で切断したものを使用し、前
記切断されたヒトのインスリン・プロモーターのＢａｍ
ＨＩ部位と前記切断されたヒトの熱衝撃蛋白質７０遺伝
子のＢａｍＨＩとを結合させた組換え遺伝子を使用す
る。
【００１８】また、本発明において、前記組換え遺伝子
は前記マウス受精卵の胚発生期に挿入する。
は前記マウス受精卵の胚発生期に挿入する。
【００１９】また、本発明において、前記製造方法は、
前記始祖マウスと正常マウスとを交配させてＦ１マウス
らを得て、前記Ｆ１マウスら中の形質が発現されたトラ
ンスジェニックマウスらを交配させて同形集合体Ｆ２を
得る工程をさらに含む。
前記始祖マウスと正常マウスとを交配させてＦ１マウス
らを得て、前記Ｆ１マウスら中の形質が発現されたトラ
ンスジェニックマウスらを交配させて同形集合体Ｆ２を
得る工程をさらに含む。
【００２０】
段階１：ヒト熱衝撃蛋白質（Ｈｓｐ）遺伝子発現ベクタ
ーの構築 ヒト熱衝撃蛋白質（Ｈｓｐ）を得るため、pH2.3(Hunt,
C. & Morimoto, R.I.,1985,Proc, Natl. Acad. Sci. 8
2)をＢａｍＨＩと ＨｉｎｄIII 制限酵素で切って2.3K
b のＤＮＡ切片を得た。
ーの構築 ヒト熱衝撃蛋白質（Ｈｓｐ）を得るため、pH2.3(Hunt,
C. & Morimoto, R.I.,1985,Proc, Natl. Acad. Sci. 8
2)をＢａｍＨＩと ＨｉｎｄIII 制限酵素で切って2.3K
b のＤＮＡ切片を得た。
【００２１】Promega 社から購入したpSP65 に1.8Kb の
ヒトインスリン・プロモーターを挿入したpSP651INS
(N.Sarvetnick et al.,1983,Cell vol.52,773-7882) を
ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで処理し、前記2.3Kb の切片を
ライゲーションさせてpINS/HSPを製造し（図２参照）、
ＨＢ１０１ Ｅ．ｃｏｌｉに形質変換して保管した。pI
NS/HSPには図１のような4.1Kb の遺伝子切片が形成され
ている。
ヒトインスリン・プロモーターを挿入したpSP651INS
(N.Sarvetnick et al.,1983,Cell vol.52,773-7882) を
ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで処理し、前記2.3Kb の切片を
ライゲーションさせてpINS/HSPを製造し（図２参照）、
ＨＢ１０１ Ｅ．ｃｏｌｉに形質変換して保管した。pI
NS/HSPには図１のような4.1Kb の遺伝子切片が形成され
ている。
【００２２】マイクロインジェクション用ＤＮＡ溶液を
製造するため、まず、上述の保管中のＥ．ｃｏｌｉをア
ンピシリン(ampicilline) を含有したＬＢ培地(1% Bact
otrypton, 0.5%酵母エキス(Yeast Extract), 1% NaCl)
に接種し、一晩中３７℃で培養した後、培養された菌を
2,000 ｇで１０分間遠心沈殿して集めて、これを50mMブ
ドウ糖（glucose)、10mM トリス−Ｃｌ(Tris-Cl) 、1m
M EDTA、4mg/ml リゾチーム溶液に溶かした後、氷の上
で５分間放置した。
製造するため、まず、上述の保管中のＥ．ｃｏｌｉをア
ンピシリン(ampicilline) を含有したＬＢ培地(1% Bact
otrypton, 0.5%酵母エキス(Yeast Extract), 1% NaCl)
に接種し、一晩中３７℃で培養した後、培養された菌を
2,000 ｇで１０分間遠心沈殿して集めて、これを50mMブ
ドウ糖（glucose)、10mM トリス−Ｃｌ(Tris-Cl) 、1m
M EDTA、4mg/ml リゾチーム溶液に溶かした後、氷の上
で５分間放置した。
【００２３】また、0.2N NaOH 、1% SDS溶液を２容量入
れて注意しながら混ぜた後、５分間常温で放置した後、
この反応液に5Mの酢酸カリウム溶液を０．５容量入れ、
氷に５分間置いた後、12,000g で１０分間遠心沈殿して
上層液を得た。
れて注意しながら混ぜた後、５分間常温で放置した後、
この反応液に5Mの酢酸カリウム溶液を０．５容量入れ、
氷に５分間置いた後、12,000g で１０分間遠心沈殿して
上層液を得た。
【００２４】次に、前記上層液をフェノールとフェノー
ル／クロロフォルム／イソアミルアルコール(25:24:1)
で２〜３回抽出し、０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムと
２容量のエタノールを入れてプラスミドＤＮＡを沈殿さ
せ、この沈殿されたＤＮＡを再びＴＥ緩衝液(10mM トリ
ス-Cl, pH8.0/1mM ETDA 、pH8.0)で溶かしてCsClを1g/m
l になるように入れた。また、この溶液をベックマン
ＴＬ１００ ローター（Beckman TL100 roter)を利用し
て、100,000rpmで１２時間遠心分離してプラスミドＤＮ
Ａを精製した。プラスミドＤＮＡを含むバンドを注射器
で分離し、これをｎ−ブタノールで抽出した後、ＴＥ緩
衝液で２４時間透析した。
ル／クロロフォルム／イソアミルアルコール(25:24:1)
で２〜３回抽出し、０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムと
２容量のエタノールを入れてプラスミドＤＮＡを沈殿さ
せ、この沈殿されたＤＮＡを再びＴＥ緩衝液(10mM トリ
ス-Cl, pH8.0/1mM ETDA 、pH8.0)で溶かしてCsClを1g/m
l になるように入れた。また、この溶液をベックマン
ＴＬ１００ ローター（Beckman TL100 roter)を利用し
て、100,000rpmで１２時間遠心分離してプラスミドＤＮ
Ａを精製した。プラスミドＤＮＡを含むバンドを注射器
で分離し、これをｎ−ブタノールで抽出した後、ＴＥ緩
衝液で２４時間透析した。
【００２５】次に、プラスミドＤＮＡを抽出した後、Ｈ
ｉｎｄIII 制限酵素で切断して０．８％のアガロースゲ
ル(agarose gel) で電気泳動(electrophoresis) して4.
1Kbの糖尿病発生遺伝子ＤＮＡを含むアガロースゲル切
片を切断してＤＮＡを精製した。そして、ＤＮＡの濃度
を定量した後、10mM トリス-Cl 、pH7.5/0.2mM ETDA、
pH8.0 の緩衝液で、ＤＮＡ濃度が4ng/μl になるよう希
釈して−２０℃で保管してマイクロインジェクションに
使用する。
ｉｎｄIII 制限酵素で切断して０．８％のアガロースゲ
ル(agarose gel) で電気泳動(electrophoresis) して4.
1Kbの糖尿病発生遺伝子ＤＮＡを含むアガロースゲル切
片を切断してＤＮＡを精製した。そして、ＤＮＡの濃度
を定量した後、10mM トリス-Cl 、pH7.5/0.2mM ETDA、
pH8.0 の緩衝液で、ＤＮＡ濃度が4ng/μl になるよう希
釈して−２０℃で保管してマイクロインジェクションに
使用する。
【００２６】段階２：糖尿病遺伝子のマイクロインジェ
クション まず、韓国生命工学研究所から購入したＦ１ハイブリッ
ド株(C57BL X CBA) 、または、英国のＢ＆Ｋ社から購入
したＦＶＢ純系マウスの中、６週以上の雌を選んで過排
卵(superovulation)をして少数の供与者マウス(donor m
ouse) から多数の受精卵を得た。
クション まず、韓国生命工学研究所から購入したＦ１ハイブリッ
ド株(C57BL X CBA) 、または、英国のＢ＆Ｋ社から購入
したＦＶＢ純系マウスの中、６週以上の雌を選んで過排
卵(superovulation)をして少数の供与者マウス(donor m
ouse) から多数の受精卵を得た。
【００２７】つぎに、前記受精された卵子の雄性前核(m
ale pronucleus) にＤＮＡをマイクロインジェクション
することにおいて一番いい時期は、ねずみ受精卵の１細
胞期であり、供与者の系(strain)と動物室の明暗周期
（light-dark cycle) により差がある。Ｆ１ハイブリッ
ドを使用して動物室の明暗周期を午後７時にオフされ、
午前６時にオンされるように調整して、マイクロインジ
ェクションを普通午前10時30分から開始した。
ale pronucleus) にＤＮＡをマイクロインジェクション
することにおいて一番いい時期は、ねずみ受精卵の１細
胞期であり、供与者の系(strain)と動物室の明暗周期
（light-dark cycle) により差がある。Ｆ１ハイブリッ
ドを使用して動物室の明暗周期を午後７時にオフされ、
午前６時にオンされるように調整して、マイクロインジ
ェクションを普通午前10時30分から開始した。
【００２８】また、前記受精された卵の一つを雄性前核
がよく見える位置で固定して注射用ピペットで雄性前核
に１〜２pl程度のＤＮＡを注入した。
がよく見える位置で固定して注射用ピペットで雄性前核
に１〜２pl程度のＤＮＡを注入した。
【００２９】段階３：マイクロインジェクションされた
受精卵の代理母マウス受卵管内に挿入 ＤＮＡを挿入（インジェクション）した受精卵を、健康
の卵と溶解された卵を分類して、溶解されたものは捨て
て、健康のものはその日のうちに代理母マウス(foster
mother mouse) に移す、または、Ｍ１６培地に入れて、
３７℃でインキューベータの中で培養した。
受精卵の代理母マウス受卵管内に挿入 ＤＮＡを挿入（インジェクション）した受精卵を、健康
の卵と溶解された卵を分類して、溶解されたものは捨て
て、健康のものはその日のうちに代理母マウス(foster
mother mouse) に移す、または、Ｍ１６培地に入れて、
３７℃でインキューベータの中で培養した。
【００３０】次に、代理母マウスと交配させる雄マウス
はＩＣＲ近交(inbred)系を使用するが、これを精管手術
した後、他の雌マウスと交配させた時、膣栓(vaginal p
lug)が有っても子マウスが生まれていないことを確認し
て使用した。排卵期に近いＩＣＲ雌マウスを精管手術済
みの雄マウスと交配させて膣栓が有れば、代理母として
使用した。
はＩＣＲ近交(inbred)系を使用するが、これを精管手術
した後、他の雌マウスと交配させた時、膣栓(vaginal p
lug)が有っても子マウスが生まれていないことを確認し
て使用した。排卵期に近いＩＣＲ雌マウスを精管手術済
みの雄マウスと交配させて膣栓が有れば、代理母として
使用した。
【００３１】このとき、手術はソムノペンチル［somnop
entyl;ピットマン−ムール(Pitman-Moore)社製品、64.8
mg ペントバルビタールナトリウム（sodium pentobarb
ital)/ml］をPBS で１０倍希釈した麻酔薬０．２ｍｌを
腹腔内注射し、ＤＮＡがマイクロインジェクションされ
た受精卵２０〜２５個を両方の受卵管(oviduct) 内に挿
入した後、手術部位を縫合した。
entyl;ピットマン−ムール(Pitman-Moore)社製品、64.8
mg ペントバルビタールナトリウム（sodium pentobarb
ital)/ml］をPBS で１０倍希釈した麻酔薬０．２ｍｌを
腹腔内注射し、ＤＮＡがマイクロインジェクションされ
た受精卵２０〜２５個を両方の受卵管(oviduct) 内に挿
入した後、手術部位を縫合した。
【００３２】段階４：トランスジェニックマウスの飼育 尾ＤＮＡのＰＣＲにより糖尿病発生遺伝子が挿入された
ことが確認されたトランスジェニック始祖マウスを、生
後６週以上の正常ハイブリッド(C57BL X CBA)マウス、
または、ＦＶＢ純系マウスと交配させた。その後、毎
朝、膣栓を検査して受精されたかどうかを測定し、もし
正常的な交配が出来ない場合、正常マウスを交換して続
いて受精可否を検査した。
ことが確認されたトランスジェニック始祖マウスを、生
後６週以上の正常ハイブリッド(C57BL X CBA)マウス、
または、ＦＶＢ純系マウスと交配させた。その後、毎
朝、膣栓を検査して受精されたかどうかを測定し、もし
正常的な交配が出来ない場合、正常マウスを交換して続
いて受精可否を検査した。
【００３３】そして、子マウス( Ｆ１) が生まれると、
３〜４週後に尾ＤＮＡでＰＣＲを施行して始祖マウスの
糖尿病発生遺伝子が伝達されたかどうかを検査した。も
し、糖尿病発生遺伝子の伝達されたことが確認される場
合、これをトランスジェニックマウス系(transgenic mi
ce line)と命名した。Ｆ１トランスジェニックマウス
は、再び生後６週後に正常ハイブリッド(C57BL X CBA)
マウスまたはＦＶＢ純系マウスと交配させた。
３〜４週後に尾ＤＮＡでＰＣＲを施行して始祖マウスの
糖尿病発生遺伝子が伝達されたかどうかを検査した。も
し、糖尿病発生遺伝子の伝達されたことが確認される場
合、これをトランスジェニックマウス系(transgenic mi
ce line)と命名した。Ｆ１トランスジェニックマウス
は、再び生後６週後に正常ハイブリッド(C57BL X CBA)
マウスまたはＦＶＢ純系マウスと交配させた。
【００３４】一方、同型接合体(homozygote)トランスジ
ェニックマウスを作るため、Ｆ１トランスジェニックマ
ウス中で同一な始祖マウスから出た子どうしの間で交配
を実施した。これらの間で生まれたＦ２トランスジェニ
ックマウス中の同型接合体マウスを探すため、これらを
再度正常ハイブリッド(C57BL X CBA) マウスまたはＦＶ
Ｂ純系マウスと交配させてＦ３マウスを得た後、糖尿病
遺伝子の存在有無を検査した。
ェニックマウスを作るため、Ｆ１トランスジェニックマ
ウス中で同一な始祖マウスから出た子どうしの間で交配
を実施した。これらの間で生まれたＦ２トランスジェニ
ックマウス中の同型接合体マウスを探すため、これらを
再度正常ハイブリッド(C57BL X CBA) マウスまたはＦＶ
Ｂ純系マウスと交配させてＦ３マウスを得た後、糖尿病
遺伝子の存在有無を検査した。
【００３５】〈糖尿病トランスジェニックマウスの性状
分析〉 １）尾ＤＮＡ抽出 マウスの尾から高分子ＤＮＡを抽出し、これをＰＣＲ方
法により分析することにより形質転換遺伝子の可否を判
別することができた。
分析〉 １）尾ＤＮＡ抽出 マウスの尾から高分子ＤＮＡを抽出し、これをＰＣＲ方
法により分析することにより形質転換遺伝子の可否を判
別することができた。
【００３６】まず、生後３〜４週頃のマウスの尾の端部
分を１．５〜２．０ｃｍ位切断した後、それをさらに短
く切断して、50mM トリス-Cl, pH8.0/50mM ETDA, pH8.
0/0.5%のＳＤＳ緩衝液500 μｌに入れてプロテイナーゼ
Ｋを200 μg/mlになるように加えた後、55℃で９時間
反応させた。そして、これを同量のフェノールおよびフ
ェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール(25:2
4:1) で３回抽出した後、10mM トリス-Cl, pH8.0/1mM
ETDA, pH8.0の溶液で３６時間（１２時間×３回）透析
した。その後、ＤＮＡの濃度を分光光度計で測定した
後、このＤＮＡ溶液を４℃で保管した。
分を１．５〜２．０ｃｍ位切断した後、それをさらに短
く切断して、50mM トリス-Cl, pH8.0/50mM ETDA, pH8.
0/0.5%のＳＤＳ緩衝液500 μｌに入れてプロテイナーゼ
Ｋを200 μg/mlになるように加えた後、55℃で９時間
反応させた。そして、これを同量のフェノールおよびフ
ェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール(25:2
4:1) で３回抽出した後、10mM トリス-Cl, pH8.0/1mM
ETDA, pH8.0の溶液で３６時間（１２時間×３回）透析
した。その後、ＤＮＡの濃度を分光光度計で測定した
後、このＤＮＡ溶液を４℃で保管した。
【００３７】２）ＰＣＲ分析 マイクロフューズ・チューブの中に77.5μl ＤＷ、試料
ＤＮＡ2 μl 、dATP,dGTP,dCTP,dTTP を各々2 μl ず
つ、また、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ緩衝液10μl(100m
M トリス(pH 8.3),500mM KCl, 15mM MgCl 2 , 0.1%ゼラ
チン) 、プライマー2 μl を入れて混合した。この時、
プライマーは、図１に矢印で図示した地域に存在し、プ
ライマーの塩基序列はアンダーラインを引いた部分であ
る。
ＤＮＡ2 μl 、dATP,dGTP,dCTP,dTTP を各々2 μl ず
つ、また、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ緩衝液10μl(100m
M トリス(pH 8.3),500mM KCl, 15mM MgCl 2 , 0.1%ゼラ
チン) 、プライマー2 μl を入れて混合した。この時、
プライマーは、図１に矢印で図示した地域に存在し、プ
ライマーの塩基序列はアンダーラインを引いた部分であ
る。
【００３８】混合液の上層部に鉱油を添加して９５℃で
５分間熱処理してＤＮＡ抽出時残存するプロテアーゼを
非活性化させ、一方ではＤＮＡが十分に変性されるよう
にした後、７２℃に温度変化させた。
５分間熱処理してＤＮＡ抽出時残存するプロテアーゼを
非活性化させ、一方ではＤＮＡが十分に変性されるよう
にした後、７２℃に温度変化させた。
【００３９】各チューブに0.15μl のＴａｑＤＮＡポリ
マラーゼ(2.5U)を鉱油層を通過させて反応混合液に入
れ、混合した後、９４℃で０．５〜１分間変性(denatur
ation)し、５５℃で０．５〜１分間アニーリング(annea
ling) し、７２℃で１分間増幅(extending) するＰＣＲ
サイクルを３０回随行した。
マラーゼ(2.5U)を鉱油層を通過させて反応混合液に入
れ、混合した後、９４℃で０．５〜１分間変性(denatur
ation)し、５５℃で０．５〜１分間アニーリング(annea
ling) し、７２℃で１分間増幅(extending) するＰＣＲ
サイクルを３０回随行した。
【００４０】適正なＰＣＲサイクルが完了された反応混
合液は最後の過程を５分間延長して増幅されたＤＮＡ切
片が十分に二重螺旋を形成するよう誘導した後、チュー
ブ上層部の鉱油を除去し、同量のクロロホルムを入れて
混合した後、15,000rpm で５分間遠心分離した。
合液は最後の過程を５分間延長して増幅されたＤＮＡ切
片が十分に二重螺旋を形成するよう誘導した後、チュー
ブ上層部の鉱油を除去し、同量のクロロホルムを入れて
混合した後、15,000rpm で５分間遠心分離した。
【００４１】上層液を新しいチューブに移し、０．１倍
の3M NaOAc(pH5.2) と2.5 倍の95%エタノールを入れて
混合して、−７０℃で１５分間冷却させた後、４℃、1
5,000rpm で１５分間遠心沈殿させた。
の3M NaOAc(pH5.2) と2.5 倍の95%エタノールを入れて
混合して、−７０℃で１５分間冷却させた後、４℃、1
5,000rpm で１５分間遠心沈殿させた。
【００４２】沈殿物は７０% エタノールに入れて洗浄し
た後、５分間遠心分離し、最終ＰＣＲ増幅ＤＮＡは真空
乾燥し、20μl のＴＥ緩衝液または蒸留水で溶かした
後、そのうちの１〜２μl を電気泳動して、その結果を
判定した。
た後、５分間遠心分離し、最終ＰＣＲ増幅ＤＮＡは真空
乾燥し、20μl のＴＥ緩衝液または蒸留水で溶かした
後、そのうちの１〜２μl を電気泳動して、その結果を
判定した。
【００４３】図３は、この実験結果として、Ｍは１００
塩基対のバンドであり、Ｎは陰性対照群、Ｐは陽性対照
群を示し、4,5,9,24,33,58,60 番のトランスジェニック
マウスにおいて陽性対照群のようなバンドを示している
ので、前記マウスに糖尿病発生遺伝子が移植されたこと
が解った。
塩基対のバンドであり、Ｎは陰性対照群、Ｐは陽性対照
群を示し、4,5,9,24,33,58,60 番のトランスジェニック
マウスにおいて陽性対照群のようなバンドを示している
ので、前記マウスに糖尿病発生遺伝子が移植されたこと
が解った。
【００４４】３）ブドウ糖耐性検査(gulucose toleranc
e test) 遺伝子が移植されたマウスが糖尿病を示すかどうかを調
べるため、正常マウスと遺伝子が移植されたマウスに５
mgの砂糖を摂取させた後、０分、60分、90分、120 分の
間隔で血中ブドウ糖濃度を測定し、これによる検査結果
を図４に図示した。
e test) 遺伝子が移植されたマウスが糖尿病を示すかどうかを調
べるため、正常マウスと遺伝子が移植されたマウスに５
mgの砂糖を摂取させた後、０分、60分、90分、120 分の
間隔で血中ブドウ糖濃度を測定し、これによる検査結果
を図４に図示した。
【００４５】正常マウスは時間が経過しても100mg/dl以
下の血中ブドウ糖濃度を維持したが、遺伝子が移植され
たマウスは時間により高い増加を示し、その水準が300m
g/dlまで上がって遺伝子が移植されたマウスに糖尿病が
発生されたことが解った。
下の血中ブドウ糖濃度を維持したが、遺伝子が移植され
たマウスは時間により高い増加を示し、その水準が300m
g/dlまで上がって遺伝子が移植されたマウスに糖尿病が
発生されたことが解った。
【００４６】４）膵臓の病理組織学的検査 膵臓の標準５μｍセクション（standard 5- μm sectio
n ）を、４％パラホルムアルデヒド(paraformaldehide)
に固定し、パラフィンに包埋(embedding) した後、通常
の過程を経てヘマトキシリン(hematoxylin) 染色した。
n ）を、４％パラホルムアルデヒド(paraformaldehide)
に固定し、パラフィンに包埋(embedding) した後、通常
の過程を経てヘマトキシリン(hematoxylin) 染色した。
【００４７】図５および図６は、染色後の膵臓組織の写
真撮影（図５：２００倍、図６：２００倍）の結果であ
る。
真撮影（図５：２００倍、図６：２００倍）の結果であ
る。
【００４８】図５および図６から、正常膵臓のランゲル
ハンス島（図５参照）の大きさに比べて、糖尿病発生ト
ランスジェニックマウスの膵臓のランゲルハンス島（図
６参照）が過増殖されていることが観察できる。このよ
うに、膵臓のランゲルハンス島が過増殖されていること
から見て、遺伝子移植マウスでは、インスリン非依存性
（ｔｙｐｅII）糖尿病が発生されたことが解った。
ハンス島（図５参照）の大きさに比べて、糖尿病発生ト
ランスジェニックマウスの膵臓のランゲルハンス島（図
６参照）が過増殖されていることが観察できる。このよ
うに、膵臓のランゲルハンス島が過増殖されていること
から見て、遺伝子移植マウスでは、インスリン非依存性
（ｔｙｐｅII）糖尿病が発生されたことが解った。
【００４９】
【発明の効果】上記説明した通りの技術的操作を行うこ
とにより、血中ブドウ糖の濃度が300mg/dl以上のインス
リン非依存性の糖尿病発生遺伝子マウス系を得ることが
でき、これは糖尿病疾患のモデル開発と糖尿病発生メカ
ニズムの究明、治療剤の開発および新しい薬の検定シス
テムなどの研究分野で有用に利用できる。
とにより、血中ブドウ糖の濃度が300mg/dl以上のインス
リン非依存性の糖尿病発生遺伝子マウス系を得ることが
でき、これは糖尿病疾患のモデル開発と糖尿病発生メカ
ニズムの究明、治療剤の開発および新しい薬の検定シス
テムなどの研究分野で有用に利用できる。
【図１】インスリン・プロモーターの調節下で、ヒト熱
衝撃蛋白質７０が発現されるように構築された遺伝子の
概略図。
衝撃蛋白質７０が発現されるように構築された遺伝子の
概略図。
【図２】ヒト熱衝撃蛋白質７０遺伝子発現ベクター(pIN
S/HSP)の構築方法に関する概略図。
S/HSP)の構築方法に関する概略図。
【図３】トランスジェニックマウスの尾ＤＮＡをＰＣＲ
により分析した結果を示す電気泳動像を表す写真。
により分析した結果を示す電気泳動像を表す写真。
【図４】トランスジェニックマウスのブドウ糖耐性実験
の結果を示す特性図。
の結果を示す特性図。
【図５】正常マウスの膵臓組織を示す生物の形態を表す
写真。
写真。
【図６】トランスジェニックマウスの膵臓組織を示す生
物の形態を表す写真。
物の形態を表す写真。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ 33/50 Ａ６１Ｋ 48/00 // Ａ６１Ｋ 48/00 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (15)
- 【請求項１】 遺伝子のプロモーターと、前記遺伝子の
プロモーターの下部に付着される熱衝撃蛋白質７０遺伝
子を含むトランスジェニック動物製造用組換え遺伝子。 - 【請求項２】 前記遺伝子はインスリン遺伝子である請
求項１記載の組換え遺伝子。 - 【請求項３】 前記遺伝子はヒトのインスリン遺伝子で
ある請求項１記載の組換え遺伝子。 - 【請求項４】 前記熱衝撃蛋白質遺伝子はヒトの熱衝撃
蛋白質７０遺伝子である請求項１記載の組換え遺伝子。 - 【請求項５】 前記遺伝子のプロモーターはヒトのイン
スリン遺伝子プロモーターをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで
切断したものを使用し、前記熱衝撃蛋白質７０遺伝子は
ヒト熱衝撃蛋白質７０遺伝子をＢａｍＨＩとＨｉｎｄII
I で切断したものを使用し、前記切断されたヒトのイン
スリン遺伝子プロモーターのＢａｍＨＩ部位と前記切断
されたヒトの熱衝撃蛋白質７０遺伝子のＢａｍＨＩとを
結合させた請求項１記載の組換え遺伝子。 - 【請求項６】 前記動物はマウス、豚、鶏からなる群か
ら選択されることである請求項１記載の組換え遺伝子。 - 【請求項７】 前記請求項１記載のトランスジェニック
動物製造用組換え遺伝子を持ち、所望の形質が発現され
た組換え遺伝子。 - 【請求項８】 遺伝子のプロモーターと、前記遺伝子の
プロモーターの下部に付着される熱衝撃蛋白質７０遺伝
子を含む組換え遺伝子を受精卵に挿入し、前記受精卵を
代理母マウスに移し、前記代理母マウスを飼育出産して
所望の形質が発現された子マウスである始祖マウスを得
る工程を含むトランスジェニックマウスの製造方法。 - 【請求項９】 前記遺伝子はインスリン遺伝子である請
求項８記載のトランスジェニックマウスの製造方法。 - 【請求項１０】 前記遺伝子はヒトのインスリン遺伝子
である請求項８記載のトランスジェニックマウスの製造
方法。 - 【請求項１１】 前記熱衝撃蛋白質７０遺伝子はヒトの
熱衝撃蛋白質７０遺伝子である請求項８記載のトランス
ジェニックマウスの製造方法。 - 【請求項１２】 前記遺伝子のプロモーターはヒトのイ
ンスリン遺伝子プロモーターをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ
で切断したものを使用し、前記熱衝撃蛋白質遺伝子はヒ
ト熱衝撃蛋白質７０遺伝子をＢａｍＨＩとＨｉｎｄIII
で切断したものを使用し、前記切断されたヒトのインス
リン遺伝子プロモーターのＢａｍＨＩ部位と前記切断さ
れたヒトの熱衝撃蛋白質７０遺伝子のＢａｍＨＩとを結
合させた請求項８記載のトランスジェニックマウスの製
造方法。 - 【請求項１３】 前記組換え遺伝子は前記マウスの受精
卵の胚発生期に挿入される請求項８記載のトランスジェ
ニックマウスの製造方法。 - 【請求項１４】 前記始祖マウスと正常マウスとを交配
させてＦ１マウスらを得て、前記Ｆ１マウスらのうち形
質が発現されたトランスジェニックマウスらを交配させ
て同形集合体Ｆ２を得る工程をさらに含む請求項８記載
のトランスジェニックマウスの製造方法。 - 【請求項１５】 請求項８記載のトランスジェニックマ
ウスの製造方法により製造されたトランスジェニックマ
ウス。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019940030676A KR100268714B1 (ko) | 1994-11-21 | 1994-11-21 | 당뇨병 발생 유전자 이식 마우스 |
| KR1994-30676 | 1994-11-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0928384A true JPH0928384A (ja) | 1997-02-04 |
| JP2771493B2 JP2771493B2 (ja) | 1998-07-02 |
Family
ID=19398574
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7303098A Expired - Lifetime JP2771493B2 (ja) | 1994-11-21 | 1995-11-21 | 糖尿病発生トランスジェニックマウス |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5824840A (ja) |
| EP (1) | EP0712930A3 (ja) |
| JP (1) | JP2771493B2 (ja) |
| KR (1) | KR100268714B1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08289791A (ja) * | 1994-11-21 | 1996-11-05 | Jeong-Sun Seo | Ｔ−細胞が欠乏した遺伝子導入マウス |
| JP2003520047A (ja) * | 2000-01-19 | 2003-07-02 | ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ヨーク | 評価方法 |
| JP2007082454A (ja) * | 2005-09-21 | 2007-04-05 | Bios Ikagaku Kenkyusho:Kk | 糖尿病発症トランスジェニックブタ及びその作出方法 |
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| JP2013051960A (ja) * | 2000-01-19 | 2013-03-21 | Novocellus Ltd | 評価方法 |
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|---|---|---|---|---|
| AU6730096A (en) * | 1995-08-30 | 1997-03-19 | University Technologies International Inc. | Transgenic animals expressing diabetogenic t-cell receptor transgenes |
| FR2761576B1 (fr) * | 1997-04-04 | 2002-08-30 | Inst Nat Sante Rech Med | Animal transgenique non humain dans lequel l'expression du gene codant pour l'insuline est supprimee |
| CN1312275A (zh) * | 2000-03-07 | 2001-09-12 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——人热休克蛋白15和编码这种多肽的多核苷酸 |
| JP5030792B2 (ja) * | 2005-01-31 | 2012-09-19 | 国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 | 糖尿病モデル動物 |
| EP3626832A3 (en) | 2014-11-25 | 2020-05-13 | The Brigham and Women's Hospital, Inc. | Method of identifying and treating a person having a predisposition to or afflicted with a cardiometabolic disease |
| US10683552B2 (en) | 2014-11-25 | 2020-06-16 | Presidents And Fellows Of Harvard College | Clonal haematopoiesis |
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|---|---|---|---|---|
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Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5087571A (en) * | 1984-06-22 | 1992-02-11 | President And Fellows Of Harvard College | Method for providing a cell culture from a transgenic non-human mammal |
| US5175385A (en) * | 1987-09-03 | 1992-12-29 | Ohio University/Edison Animal Biotechnolgy Center | Virus-resistant transgenic mice |
| US5175384A (en) * | 1988-12-05 | 1992-12-29 | Genpharm International | Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice |
| US5175383A (en) * | 1989-02-17 | 1992-12-29 | President And Fellows Of Harvard College | Animal model for benign prostatic disease |
-
1994
- 1994-11-21 KR KR1019940030676A patent/KR100268714B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-11-16 US US08/558,719 patent/US5824840A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-21 EP EP95118320A patent/EP0712930A3/en not_active Withdrawn
- 1995-11-21 JP JP7303098A patent/JP2771493B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
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| JPH08289791A (ja) * | 1994-11-21 | 1996-11-05 | Jeong-Sun Seo | Ｔ−細胞が欠乏した遺伝子導入マウス |
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