JP3258024B2 - Ｉｉ型真性糖尿病のトランスジェニック動物モデル - Google Patents
Ｉｉ型真性糖尿病のトランスジェニック動物モデルInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、哺乳動物細胞株と動物とを、それらがヒト
膵島アミロイドポリペプチド（IAPP）遺伝子によってコ
ードされるタンパク質を発現するように、遺伝的に変化
させる方法に関する。以前にはアミリンとして知られた
IAPPは、非インスリン依存性真性糖尿病（NIDDM）患者
の膵臓において形成される膵島アミロイドの主要タンパ
ク質成分である。IAPP構造的及び機能的特徴についての
最近の研究は、インスリン及び他のホルモンと共にIAPP
が炭水化物代謝に主要な役割を果たすことを示唆してい
る。IAPPは膵島における膵臓β細胞によって産生され、
貯蔵され、分泌される。これは筋肉及び肝臓組織におけ
るグルコース摂取及びグリコーゲン合成を阻害すること
によって、NIDDMに見られるインスリン耐性の現象を模
倣することができる。ヒトにおけるアミロイド沈着の発
生はこのペプチドの中心部分（アミノ酸20〜29）の、β
プリーツシート構造を形成する能力によると考えられ
る。齧歯類IAPPはヒトIAPPとは、アミノ酸20〜29のさも
なくば高度に保存されるタンパク質の配列が保存され
ず、アミロイド沈着は齧歯類膵臓では形成されない点で
異なる。実際的な仮説は、ヒトIAPPの過剰発現が末梢組
織におけるインスリン耐性を招来し、アミロイド沈着の
形成を生じるということである。
膵島アミロイドポリペプチド（IAPP）遺伝子によってコ
ードされるタンパク質を発現するように、遺伝的に変化
させる方法に関する。以前にはアミリンとして知られた
IAPPは、非インスリン依存性真性糖尿病（NIDDM）患者
の膵臓において形成される膵島アミロイドの主要タンパ
ク質成分である。IAPP構造的及び機能的特徴についての
最近の研究は、インスリン及び他のホルモンと共にIAPP
が炭水化物代謝に主要な役割を果たすことを示唆してい
る。IAPPは膵島における膵臓β細胞によって産生され、
貯蔵され、分泌される。これは筋肉及び肝臓組織におけ
るグルコース摂取及びグリコーゲン合成を阻害すること
によって、NIDDMに見られるインスリン耐性の現象を模
倣することができる。ヒトにおけるアミロイド沈着の発
生はこのペプチドの中心部分（アミノ酸20〜29）の、β
プリーツシート構造を形成する能力によると考えられ
る。齧歯類IAPPはヒトIAPPとは、アミノ酸20〜29のさも
なくば高度に保存されるタンパク質の配列が保存され
ず、アミロイド沈着は齧歯類膵臓では形成されない点で
異なる。実際的な仮説は、ヒトIAPPの過剰発現が末梢組
織におけるインスリン耐性を招来し、アミロイド沈着の
形成を生じるということである。
トランスジェニック動物、特にマウスは複雑な系を詳
細に分析して、ヒトの疾患についての新しい情報を得る
ために非常に有用であることが判明している。このよう
なマウスにおけるヒト遺伝子の選択的な発現は、特に遺
伝子の過剰発現が疾患状態を生じるときに、疾患を研究
するための新規なモデル系を形成している。このような
トランスジェニックマウスによって、（１）発明の組織
特異性；（２）特定の遺伝子の過剰発現が疾患を生じる
という仮説の検討；（３）この過剰発現によって影響さ
れる組織／器官の数と同定；及び（４）疾患表現型の進
行又は寛解に対する、薬物を含めた、種々な治療の効果
に関する問題に対処することができる。
細に分析して、ヒトの疾患についての新しい情報を得る
ために非常に有用であることが判明している。このよう
なマウスにおけるヒト遺伝子の選択的な発現は、特に遺
伝子の過剰発現が疾患状態を生じるときに、疾患を研究
するための新規なモデル系を形成している。このような
トランスジェニックマウスによって、（１）発明の組織
特異性；（２）特定の遺伝子の過剰発現が疾患を生じる
という仮説の検討；（３）この過剰発現によって影響さ
れる組織／器官の数と同定；及び（４）疾患表現型の進
行又は寛解に対する、薬物を含めた、種々な治療の効果
に関する問題に対処することができる。
これらの動物のいずれも糖尿病表現型を発現していな
いが、ヒトIAPPを発現するトランスジェニックマウスの
形成が文献において報告されている。Niles,Fox等（FEB
S Letters,323:40〜44［1993］）はラットインスリン
プロモーター配列を、全ヒトIAPP遺伝子（エクソン１〜
３と、イントロン１と２）を含有するゲノムDNAフラグ
メントに融合した導入遺伝子（transgene）を構築し
た。膵臓、下垂体前葉及び脳において導入遺伝子RNA発
現が検出されている。血漿IAPPレベルは非トランスジェ
ニックの同腹仔に比べて５倍に上昇したが、この上昇の
代謝結果は観察されていない。C.B.Verchere等（Diabet
ologia,37:725〜729［194］）は、全ヒトproIAPP配列を
コードする600bpフラグメントを用いた。これらのトラ
ンスジェニック動物は非トランスジェニック同腹仔対照
に比べて、IAPPとインスリンの両方とも多い膵臓含量を
示した。両方のホルモンの分泌の上昇も膵臓の灌流試験
で検出されている。この貯蔵と分泌の増大の臨床的発現
は観察されていない。Hoppener等（Diabetologia,36,12
58〜1265（1993））は、マウス内分泌膵臓中にヒトIAPP
又はラットIAPPのいずれかを発現する複数のトランスジ
ェニック系統の作成を述べている。Hoppenerのグループ
は、ゲノムDNAフラグメントからヒト又はラットのIAPP
の発現を促進するために703bpラットインスリンIIプロ
モーターフラグメントを用いていた。血漿IAPPレベルは
15倍まで上昇したが、高血糖症も高インスリン血症も観
察されなかった。その後の研究では、iv vivoでアミロ
イド斑が蓄積するのが見られなかったが、高血糖症を模
倣する条件下でこれらのトランスジェニックからの膵島
を培養したときに細胞内アミロイドフィブリルと細胞外
アミロイドフィブリルとが形成された（De Koning等、
Proc.Natl.Acad.Sci.91,8467〜8471［1994］）。
いが、ヒトIAPPを発現するトランスジェニックマウスの
形成が文献において報告されている。Niles,Fox等（FEB
S Letters,323:40〜44［1993］）はラットインスリン
プロモーター配列を、全ヒトIAPP遺伝子（エクソン１〜
３と、イントロン１と２）を含有するゲノムDNAフラグ
メントに融合した導入遺伝子（transgene）を構築し
た。膵臓、下垂体前葉及び脳において導入遺伝子RNA発
現が検出されている。血漿IAPPレベルは非トランスジェ
ニックの同腹仔に比べて５倍に上昇したが、この上昇の
代謝結果は観察されていない。C.B.Verchere等（Diabet
ologia,37:725〜729［194］）は、全ヒトproIAPP配列を
コードする600bpフラグメントを用いた。これらのトラ
ンスジェニック動物は非トランスジェニック同腹仔対照
に比べて、IAPPとインスリンの両方とも多い膵臓含量を
示した。両方のホルモンの分泌の上昇も膵臓の灌流試験
で検出されている。この貯蔵と分泌の増大の臨床的発現
は観察されていない。Hoppener等（Diabetologia,36,12
58〜1265（1993））は、マウス内分泌膵臓中にヒトIAPP
又はラットIAPPのいずれかを発現する複数のトランスジ
ェニック系統の作成を述べている。Hoppenerのグループ
は、ゲノムDNAフラグメントからヒト又はラットのIAPP
の発現を促進するために703bpラットインスリンIIプロ
モーターフラグメントを用いていた。血漿IAPPレベルは
15倍まで上昇したが、高血糖症も高インスリン血症も観
察されなかった。その後の研究では、iv vivoでアミロ
イド斑が蓄積するのが見られなかったが、高血糖症を模
倣する条件下でこれらのトランスジェニックからの膵島
を培養したときに細胞内アミロイドフィブリルと細胞外
アミロイドフィブリルとが形成された（De Koning等、
Proc.Natl.Acad.Sci.91,8467〜8471［1994］）。
発明の概要 １実施態様では、本発明は非IAPPプロモーターと、ヒ
トアルブミンイントロン１コーディング配列に機能的に
結合したヒトIAPPをコードする配列又はその活性フラグ
メントと、ヒトGAPDH停止コーディング配列と、ヒトGAP
DHポリアデニル化コーディング配列とを含み、適当な宿
主に組み込まれたときに糖尿病表現型の発現を生じる組
換えDNAに関する。
トアルブミンイントロン１コーディング配列に機能的に
結合したヒトIAPPをコードする配列又はその活性フラグ
メントと、ヒトGAPDH停止コーディング配列と、ヒトGAP
DHポリアデニル化コーディング配列とを含み、適当な宿
主に組み込まれたときに糖尿病表現型の発現を生じる組
換えDNAに関する。
非IAPPプロモーターがラットインスリンＩ、ラットイ
ンスリンII、ヒトインスリン、マウスIAPP、ラットＢ細
胞特異的グルコキナーゼ、グルコーストランスポーター
２、ヒトチロシンアミノトランスフェラーゼ、ヒトアル
ブミン、マウスアルブミン、ラット肝臓特異的グルコキ
ナーゼ及びマウスメタロチオネインの遺伝子のプロモー
ターから成る群から選択される組換えDNAが特に好まし
い。
ンスリンII、ヒトインスリン、マウスIAPP、ラットＢ細
胞特異的グルコキナーゼ、グルコーストランスポーター
２、ヒトチロシンアミノトランスフェラーゼ、ヒトアル
ブミン、マウスアルブミン、ラット肝臓特異的グルコキ
ナーゼ及びマウスメタロチオネインの遺伝子のプロモー
ターから成る群から選択される組換えDNAが特に好まし
い。
前記プロモーターがラットインスリンIIプロモーター
である組換えDNAも好ましい。
である組換えDNAも好ましい。
ヒトIAPPをコードする前記配列又はその活性なフラグ
メントがcDNAの特徴を有する組換えDNAも特に好まし
い。
メントがcDNAの特徴を有する組換えDNAも特に好まし
い。
ヒトIAPPをコードする前記配列又はその活性なフラグ
メントがゲノムDNAの特徴を有する組換えDNAがさらに好
ましい。
メントがゲノムDNAの特徴を有する組換えDNAがさらに好
ましい。
前記配列が配列番号:4の配列である組換えDNAもさら
に好ましい。
に好ましい。
cDNAの前記配列が配列番号:5の配列である組換えDNA
も特にさらに好ましい。
も特にさらに好ましい。
他の実施態様では、ヒトIAPPをコードするDNA配列
を、マウスIAPPをコードするDNA配列又はその活性なフ
ラグメントによって置換し、前記マウスDNAが好ましく
はcDNAの特徴を有する。
を、マウスIAPPをコードするDNA配列又はその活性なフ
ラグメントによって置換し、前記マウスDNAが好ましく
はcDNAの特徴を有する。
本発明は本発明の組換えDNA（配列番号:1）を含むベ
クターにも関する。
クターにも関する。
本発明は本発明の組換えDNAを含む真核細胞株にも関
し、好ましい細胞株はラットインスリノーマ（rat insu
linoma）（RIT）細胞、ラットインスリノーマ（HIT）細
胞及びβ−TC3マウスインスリノーマ細胞から成る群か
ら選択される。
し、好ましい細胞株はラットインスリノーマ（rat insu
linoma）（RIT）細胞、ラットインスリノーマ（HIT）細
胞及びβ−TC3マウスインスリノーマ細胞から成る群か
ら選択される。
本発明は本発明の組換えDNAを含むトランスジェニッ
ク非ヒト哺乳動物にも関し、糖尿病表現型を示す、特に
好ましいトランスジェニック哺乳動物はマウスとラット
である。
ク非ヒト哺乳動物にも関し、糖尿病表現型を示す、特に
好ましいトランスジェニック哺乳動物はマウスとラット
である。
他の実施態様では、本発明は、IAPP遺伝子産物の過剰
発現を特徴とする疾患を有する動物の治療方法であっ
て、前記IAPP遺伝子産物の過剰発現の阻害剤の治療有効
量を前記動物に投与することを含む上記方法に関する。
発現を特徴とする疾患を有する動物の治療方法であっ
て、前記IAPP遺伝子産物の過剰発現の阻害剤の治療有効
量を前記動物に投与することを含む上記方法に関する。
さらに他の実施態様では、本発明は、前記治療剤（tr
eatment）を投与し、IAPPをコードする遺伝子の過剰発
現の産物に対する前記治療剤の効果を評価することを含
む方法に関する。
eatment）を投与し、IAPPをコードする遺伝子の過剰発
現の産物に対する前記治療剤の効果を評価することを含
む方法に関する。
前記治療剤を動物に投与する方法が好ましく、特に好
ましい動物はヒトである。
ましい動物はヒトである。
本発明は、対象が糖尿病又は肥満の危険状態にあるか
どうかを判定する方法であって、前記対象を、危険状態
を示唆するIAPP遺伝子産物の過剰発現に関して検査する
ことを含む上記方法にも関する。
どうかを判定する方法であって、前記対象を、危険状態
を示唆するIAPP遺伝子産物の過剰発現に関して検査する
ことを含む上記方法にも関する。
さらに他の実施態様では、本発明は、阻害又は疾患状
態に関して動物モデルを評価する方法であって、前記動
物モデルにおいてIAPP遺伝子が所定レベルで発現される
かどうかを判定することを含む上記方法に関し、好まし
い方法では、前記レベルが野生型又は正常な動物におけ
るレベルよりも高い。
態に関して動物モデルを評価する方法であって、前記動
物モデルにおいてIAPP遺伝子が所定レベルで発現される
かどうかを判定することを含む上記方法に関し、好まし
い方法では、前記レベルが野生型又は正常な動物におけ
るレベルよりも高い。
図面の簡単な説明 図1aはRIPHAT導入遺伝子の線形マップである。ヒトIA
PPcDNA配列は黒色で示される；ラットインスリンIIプロ
モーターは白色ボックスで示され、ヒトアルブミンイン
トロンは暗く陰影を付けたボックスであり、ヒトGAPDH
ポリアデニル化領域（ポリＡと標識）は明るく陰影を付
けたボックスである。
PPcDNA配列は黒色で示される；ラットインスリンIIプロ
モーターは白色ボックスで示され、ヒトアルブミンイン
トロンは暗く陰影を付けたボックスであり、ヒトGAPDH
ポリアデニル化領域（ポリＡと標識）は明るく陰影を付
けたボックスである。
図1bはコーディング領域の両端部の拡大であり、ヒト
IAPPを他のcDNAに置換するために用いることができる制
限酵素部位を示す。
IAPPを他のcDNAに置換するために用いることができる制
限酵素部位を示す。
図1cはプロモーター領域の両端部の拡大であり、RIPH
AT導入遺伝子におけるRIPIIを他の適切なプロモーター
に置換するために用いることができる制限酵素部位を示
す。
AT導入遺伝子におけるRIPIIを他の適切なプロモーター
に置換するために用いることができる制限酵素部位を示
す。
図２はプラスミドpSV2Dog1の環状マップである。pSVD
og1はPCR修飾CAT遺伝子（BspM I/BamH Iフラグメント）
をSV40プロモーター（pLuxF3からのBamH I/Nco I部分的
フラグメント）の下流に挿入することによって構築し
た。得られたプラスミドはその5'末端において最適の哺
乳動物翻訳配列と融合し、その3'末端においてホタルル
シフェラーゼ3'非翻訳領域及びポリＡ付加部位と融合し
たCAT遺伝子コーディング配列を含有する。修飾CAT遺伝
子の発現はSV40プロモーターによって駆動される。
og1はPCR修飾CAT遺伝子（BspM I/BamH Iフラグメント）
をSV40プロモーター（pLuxF3からのBamH I/Nco I部分的
フラグメント）の下流に挿入することによって構築し
た。得られたプラスミドはその5'末端において最適の哺
乳動物翻訳配列と融合し、その3'末端においてホタルル
シフェラーゼ3'非翻訳領域及びポリＡ付加部位と融合し
たCAT遺伝子コーディング配列を含有する。修飾CAT遺伝
子の発現はSV40プロモーターによって駆動される。
図３はプラスミドpDog15の構築に用いられるヒトグリ
セルアルデヒド３ホスフェートデヒドロゲナーゼポリア
デニル化領域を含有するプラスミドpSV2Dog11の環状マ
ップである。pSV2Dog11はPCR増幅ヒトグリセルアルデヒ
ド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ3'−非翻訳領域
をSpe I/BamH I消化pSV2Dog1中に挿入することによって
構築した。これはGAPDH3'非コーディグ配列をCATコーデ
ィング領域の下流に配置する。
セルアルデヒド３ホスフェートデヒドロゲナーゼポリア
デニル化領域を含有するプラスミドpSV2Dog11の環状マ
ップである。pSV2Dog11はPCR増幅ヒトグリセルアルデヒ
ド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ3'−非翻訳領域
をSpe I/BamH I消化pSV2Dog1中に挿入することによって
構築した。これはGAPDH3'非コーディグ配列をCATコーデ
ィング領域の下流に配置する。
図３は、プラスミドpDog15によって開始して、pRIPHA
T1を構築するために用いられるクローニング方法の概略
図である。
T1を構築するために用いられるクローニング方法の概略
図である。
図４は、制限エンドヌクレアーゼEcoR Iによって消化
され、RIPHAT導入遺伝子DNA内の32P標識ヒトGAPDHフラ
グメントにハンブリダイズした６種の尾のDNAのゲノムD
NAサザンブロットのオートラジオグラムである。６レー
ンはRIPHATトランスジェニック系統RG雄とFVB/N野生型
雌との交配から生じた動物の同腹仔（litter）を表す。
され、RIPHAT導入遺伝子DNA内の32P標識ヒトGAPDHフラ
グメントにハンブリダイズした６種の尾のDNAのゲノムD
NAサザンブロットのオートラジオグラムである。６レー
ンはRIPHATトランスジェニック系統RG雄とFVB/N野生型
雌との交配から生じた動物の同腹仔（litter）を表す。
図５は、ヒト膵臓と非トランスジェニックマウスとか
らの膵臓RNAの他にトランシジェニック系統RHA、RHF及
びRHGから単離された総膵臓RNAのノーザンブロットのオ
ートラジオグラムである。このブロットを［α32P］dCT
Pで標識されたヒトIAPPcDNAフラグメントにハイブリダ
イズさせた。
らの膵臓RNAの他にトランシジェニック系統RHA、RHF及
びRHGから単離された総膵臓RNAのノーザンブロットのオ
ートラジオグラムである。このブロットを［α32P］dCT
Pで標識されたヒトIAPPcDNAフラグメントにハイブリダ
イズさせた。
図６は、膵臓β細胞の電子顕微鏡写真である。矢印は
細胞内アミロイド斑沈着を表示する。
細胞内アミロイド斑沈着を表示する。
図７は、ウサギ抗ヒトIAPP抗体による細胞内アミロイ
ド斑のイムノゴールド（immunogold）染色の37,000倍拡
大を示す電子顕微鏡写真である。
ド斑のイムノゴールド（immunogold）染色の37,000倍拡
大を示す電子顕微鏡写真である。
図８は、３頭の非トランスジェニック（FVB/N系統）
雄マウスに比較した３頭の雄RHFホモ接合体マウスにお
ける高血糖生の発生を示すグラフである。
雄マウスに比較した３頭の雄RHFホモ接合体マウスにお
ける高血糖生の発生を示すグラフである。
図９は、生後５週間のRHFホモ接合体トランスジェニ
ック雄（同腹仔＃RHF11,n＝５）と雌（同腹仔＃RHF11,n
＝３）に対して、年齢が一致した非トランスジェニック
FVB/Nマウスと比較して、おこなった経口グルコース耐
性（glucose tolerance）試験の結果を示す。
ック雄（同腹仔＃RHF11,n＝５）と雌（同腹仔＃RHF11,n
＝３）に対して、年齢が一致した非トランスジェニック
FVB/Nマウスと比較して、おこなった経口グルコース耐
性（glucose tolerance）試験の結果を示す。
発明の詳細な説明 プラスミド プラスミドpRIPHAT（ラットインスリンプロモーター
ヒトIAPP導入遺伝子）（配列番号:1）は５種類の異なる
ソース（３種類はヒト遺伝子、４種類目はラットから、
５種類目は商業的に入手可能なプラスミドベクターであ
る）のDNAフラグメントを含有する。これらはラットイ
ンスリンIIプロモーター（876bp）、（配列番号:2）ヒ
トIAPPコーディグ配列（278bp）（配列番号:3）、ヒト
アルブミンイントロン１（720bp）（配列番号:4）及び
ヒトグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ（GAPDH）遺伝子ポリアデニル化部位とRNA停止領
域（546bp）（配列番号:5）である。商業的に入手可能
なプラスミドはBluescriptSK（−）（Stratagene,La J
olla,CA）（配列番号:6）である。ライゲーション、制
限エンドヌクレアーゼ消化、DNA合成反応及びE.coliの
形質転換を包含する、組換えDNAの酵素処理を、Sambroo
k,J.,Fritsch,E.F.及びManiatis,T.,Molecular Clonin
g:A Laboratory Manual,第２版,Cold Spring Harbo
r Laboratory Press,New York 1989に述べられてい
るような充分に確立された方法によっておこなった。
ヒトIAPP導入遺伝子）（配列番号:1）は５種類の異なる
ソース（３種類はヒト遺伝子、４種類目はラットから、
５種類目は商業的に入手可能なプラスミドベクターであ
る）のDNAフラグメントを含有する。これらはラットイ
ンスリンIIプロモーター（876bp）、（配列番号:2）ヒ
トIAPPコーディグ配列（278bp）（配列番号:3）、ヒト
アルブミンイントロン１（720bp）（配列番号:4）及び
ヒトグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ（GAPDH）遺伝子ポリアデニル化部位とRNA停止領
域（546bp）（配列番号:5）である。商業的に入手可能
なプラスミドはBluescriptSK（−）（Stratagene,La J
olla,CA）（配列番号:6）である。ライゲーション、制
限エンドヌクレアーゼ消化、DNA合成反応及びE.coliの
形質転換を包含する、組換えDNAの酵素処理を、Sambroo
k,J.,Fritsch,E.F.及びManiatis,T.,Molecular Clonin
g:A Laboratory Manual,第２版,Cold Spring Harbo
r Laboratory Press,New York 1989に述べられてい
るような充分に確立された方法によっておこなった。
ヒトアルブミンイントロン１（配列番号:4）とGAPDH
遺伝子フラグメント（配列番号:5）とはプラスミドpSV2
Dog15からBamH IとApaL Iとによるこのプラシミドの消
化と、これらの２領域を含有する1262bpフラグメントの
単離とによって得られた。pSV2Dog15はPfizer社のDavid
LloydとJohn Thompsonとによって構築された。かれ
らはヒトアルブミンイントロン１配列を、ヒトゲノムDN
A（Clontech,Palo Alto,CAから入手）と、DNAオリゴマ
ー18505.022（配列5'CCCTCTAGAAGCTTGTCTGGGCAAGGGAAGA
AAA3'）（配列番号:8）と、18505.024（配列5'GGGAAGCT
TCTAGACTTTCGTCGAGGTGCACGTAAGAA3'）（配列番号:9）と
を用いて、アルブミン遺伝子のこの部分のポリメラーゼ
連鎖反応（PCR）増幅（Innis,M.A.等編集,PCR Protoco
ls,Academic Press,New York 1990）によって形成し
た。これらのオリゴマーはそれらの末端に外因的Xba I
部位を包含するので、得られたPCR生成物をXba Iによっ
て消化させて、pSV2Dog11中の適合性Spe I部位に挿入し
た。David Lloydによって構築された、このプラスミド
は既にヒトGAPDHポリアデニル化領域を含有していた。
これは鋳型としてのヒトゲノムDNAと、PCRプライマーと
してのオリゴマー18970.246（配列5'−CAAACCGGATCCGCC
CTGACTTCCTCCACCTGTCAGC−3'）（配列番号:10）と、189
70.244（配列5'CACAACACTAGTGACCCCTGGACCACCAGCCCCAGC
3'）（配列番号:11）とを用いてPCRクローニングによっ
ても形成された。このようにして得られたPCR生成物をS
pe IとBamH Iとによって消化させて、Spe I/BamH I消化
pSV2Dog1中に挿入した（図２参照）。
遺伝子フラグメント（配列番号:5）とはプラスミドpSV2
Dog15からBamH IとApaL Iとによるこのプラシミドの消
化と、これらの２領域を含有する1262bpフラグメントの
単離とによって得られた。pSV2Dog15はPfizer社のDavid
LloydとJohn Thompsonとによって構築された。かれ
らはヒトアルブミンイントロン１配列を、ヒトゲノムDN
A（Clontech,Palo Alto,CAから入手）と、DNAオリゴマ
ー18505.022（配列5'CCCTCTAGAAGCTTGTCTGGGCAAGGGAAGA
AAA3'）（配列番号:8）と、18505.024（配列5'GGGAAGCT
TCTAGACTTTCGTCGAGGTGCACGTAAGAA3'）（配列番号:9）と
を用いて、アルブミン遺伝子のこの部分のポリメラーゼ
連鎖反応（PCR）増幅（Innis,M.A.等編集,PCR Protoco
ls,Academic Press,New York 1990）によって形成し
た。これらのオリゴマーはそれらの末端に外因的Xba I
部位を包含するので、得られたPCR生成物をXba Iによっ
て消化させて、pSV2Dog11中の適合性Spe I部位に挿入し
た。David Lloydによって構築された、このプラスミド
は既にヒトGAPDHポリアデニル化領域を含有していた。
これは鋳型としてのヒトゲノムDNAと、PCRプライマーと
してのオリゴマー18970.246（配列5'−CAAACCGGATCCGCC
CTGACTTCCTCCACCTGTCAGC−3'）（配列番号:10）と、189
70.244（配列5'CACAACACTAGTGACCCCTGGACCACCAGCCCCAGC
3'）（配列番号:11）とを用いてPCRクローニングによっ
ても形成された。このようにして得られたPCR生成物をS
pe IとBamH Iとによって消化させて、Spe I/BamH I消化
pSV2Dog1中に挿入した（図２参照）。
1262bp,ApaL I/BamH IアルブミンイントロンＩ−GAPD
HポリＡ領域ハイブリッドフラグメントを、preprolAPP
タンパク質産物のコーディング領域を含有する278bpPCR
増幅DNAフラグメントにライゲーションした。このフラ
グメントを鋳型としてのIAPP cDNA（λファージ DNA
hIAPP−c1、Sietse Mosselman,Rijksuniversiteit
te utrecht,オランダから入手、Mosselman,S.等,Febs
Lett.247,154〜158（1989）中に記載）と、PCRプライ
マーとしてのオリゴマー19383.288（配列5'GTCATGTGCAC
CTAAAGGGGCAAGTAATTCA3'）（配列番号:12）と、19987.1
16（配列5'GAAGCCATGGGCATCCTGAAGCTGCAAGTA3'）（配列
番号:13）とを用いて増幅した。得られた1523bpフラグ
メントをpSuperLuc（pSL）にライゲーションさせて、プ
ラスミドpSLA10を得た。pSLはルシフェラーゼレポータ
ー遺伝子（Mosselman,S.等,FEBS Lett.271,33〜36（19
90））を含有するDNAプラスミドである。この場合に、
プラスミドは好都合なNco IとBamH I制限部位の存在に
関してのみ用いられた。
HポリＡ領域ハイブリッドフラグメントを、preprolAPP
タンパク質産物のコーディング領域を含有する278bpPCR
増幅DNAフラグメントにライゲーションした。このフラ
グメントを鋳型としてのIAPP cDNA（λファージ DNA
hIAPP−c1、Sietse Mosselman,Rijksuniversiteit
te utrecht,オランダから入手、Mosselman,S.等,Febs
Lett.247,154〜158（1989）中に記載）と、PCRプライ
マーとしてのオリゴマー19383.288（配列5'GTCATGTGCAC
CTAAAGGGGCAAGTAATTCA3'）（配列番号:12）と、19987.1
16（配列5'GAAGCCATGGGCATCCTGAAGCTGCAAGTA3'）（配列
番号:13）とを用いて増幅した。得られた1523bpフラグ
メントをpSuperLuc（pSL）にライゲーションさせて、プ
ラスミドpSLA10を得た。pSLはルシフェラーゼレポータ
ー遺伝子（Mosselman,S.等,FEBS Lett.271,33〜36（19
90））を含有するDNAプラスミドである。この場合に、
プラスミドは好都合なNco IとBamH I制限部位の存在に
関してのみ用いられた。
ラットインスリンIIプロモーター（配列番号:2）と5'
非翻訳リーダー領域は、オリゴマー19383.284（配列5'G
TCAGGAATTCGGATCCCCCAACCACTCCAA−GT3'）（配列番号:1
4）と19383.292（配列5'ACAGGGCCATGGTGGAACAATGA−CCT
GGAAGATA3'）（配列番号:15）とを用いてラットゲノムD
NA（Clontechから入手,cat＃6750−１）のPCR増幅によ
って形成した。オリゴマー19383.292が点変異を含有す
る；これは開始コドンの２残基5'側を１ヌクレオチド
（ＡからＣ）変えることによって、フラグメントの3'末
端にNco I部位を導入するように設計された。883bpPCR
生成物をNco Iによって切断して、175bpブラント末端/N
co Iフラグメントと、２つのNco I末端を有する708bpフ
ラグメントとを得た。プラスミドpSLA10をXba Iによっ
て消化させた。得られた5'オーバーハングをクレノウポ
リメラーゼとdNTPとによってうめこみ、ブラント末端を
得た。次いで、プラスミドをNco Iによって消化させ
て、175bpブラント末端/Nco IラットインスリンIIフラ
グメントにライゲーションして、pSLA11を得た（図３参
照）。
非翻訳リーダー領域は、オリゴマー19383.284（配列5'G
TCAGGAATTCGGATCCCCCAACCACTCCAA−GT3'）（配列番号:1
4）と19383.292（配列5'ACAGGGCCATGGTGGAACAATGA−CCT
GGAAGATA3'）（配列番号:15）とを用いてラットゲノムD
NA（Clontechから入手,cat＃6750−１）のPCR増幅によ
って形成した。オリゴマー19383.292が点変異を含有す
る；これは開始コドンの２残基5'側を１ヌクレオチド
（ＡからＣ）変えることによって、フラグメントの3'末
端にNco I部位を導入するように設計された。883bpPCR
生成物をNco Iによって切断して、175bpブラント末端/N
co Iフラグメントと、２つのNco I末端を有する708bpフ
ラグメントとを得た。プラスミドpSLA10をXba Iによっ
て消化させた。得られた5'オーバーハングをクレノウポ
リメラーゼとdNTPとによってうめこみ、ブラント末端を
得た。次いで、プラスミドをNco Iによって消化させ
て、175bpブラント末端/Nco IラットインスリンIIフラ
グメントにライゲーションして、pSLA11を得た（図３参
照）。
pSLA11をNco Iによって消化させて、708bp Nco Iラ
ットインスリンIIフラグメントにライゲーションして、
プラスミドpSLA12を得た。このプラスミドをEcoR IとBa
mH Iとによって消化させて、708bp Nco Iフラグメント
の適当な配向を確認した。キメラ導入遺伝子（ラットイ
ンスリンIIプロモーターと5'非翻訳リーダー、IAPPコー
ディング領域、アルブミンイントロン１、AGPDHポリア
デニル化領域）（配列番号:7）をpSLA12の部分的BamH I
消化によってpSLバックボーンからBamH I線形化Bluescr
iptSK（−）に移して、pRIPHATI（配列番号:1）を得
た。ラットインスリンIIプロモーターと、5'非翻訳リー
ダー領域と、IAPPコーディング領域とをSangerのジデオ
キシ連鎖停止方法によって配列決定して、突然変異が導
入されていないことを確認した。
ットインスリンIIフラグメントにライゲーションして、
プラスミドpSLA12を得た。このプラスミドをEcoR IとBa
mH Iとによって消化させて、708bp Nco Iフラグメント
の適当な配向を確認した。キメラ導入遺伝子（ラットイ
ンスリンIIプロモーターと5'非翻訳リーダー、IAPPコー
ディング領域、アルブミンイントロン１、AGPDHポリア
デニル化領域）（配列番号:7）をpSLA12の部分的BamH I
消化によってpSLバックボーンからBamH I線形化Bluescr
iptSK（−）に移して、pRIPHATI（配列番号:1）を得
た。ラットインスリンIIプロモーターと、5'非翻訳リー
ダー領域と、IAPPコーディング領域とをSangerのジデオ
キシ連鎖停止方法によって配列決定して、突然変異が導
入されていないことを確認した。
導入遺伝子がマウス細胞中に発現されることを確認す
るために、pRIPHAT1（配列番号:1）をMosselman等が述
べているように（FEBS Lett.271.33〜36,1990）エレク
トロポレーションによってβTC細胞中に一過性にトラン
スフェクトした。24時間後、総RNAを確立された方法（C
homczynskiとSachi,Ahal.Biochem.162,156〜159）によ
って単離した。導入遺伝子特異的RNAをこの総RNAから逆
転写によって誘導されたcDNAのPCR増幅によって検出し
た（Innis,M.A.等編集、PCR Protocols,Academic Pre
ss,New York 1990）。PCR生成物のサイズと豊富さ（a
bundance）は、導入遺伝子が発現されたことと、導入遺
伝子のヒトアルブミンイントロン部分がこれらの細胞中
に効果的に接合された（spliced out）ことを実証し
た。
るために、pRIPHAT1（配列番号:1）をMosselman等が述
べているように（FEBS Lett.271.33〜36,1990）エレク
トロポレーションによってβTC細胞中に一過性にトラン
スフェクトした。24時間後、総RNAを確立された方法（C
homczynskiとSachi,Ahal.Biochem.162,156〜159）によ
って単離した。導入遺伝子特異的RNAをこの総RNAから逆
転写によって誘導されたcDNAのPCR増幅によって検出し
た（Innis,M.A.等編集、PCR Protocols,Academic Pre
ss,New York 1990）。PCR生成物のサイズと豊富さ（a
bundance）は、導入遺伝子が発現されたことと、導入遺
伝子のヒトアルブミンイントロン部分がこれらの細胞中
に効果的に接合された（spliced out）ことを実証し
た。
安定にトランスフェクトされた細胞株 上記プラスミドは、レシピエント細胞にゲネチシン
（G418）耐性を与えるプラスミドと共に、RIN細胞とβT
C3細胞とにエレクトロポレーションによって安定に導入
された。βTC3細胞はShimon Efrat and Cold Sprin
g Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.）
から入手されたものであり、Efrat,S.等,Proc.Natl.Aca
d.Sci.85,9037〜9041（1988）に説明されている。細胞
は、半集密的単層のトリプシン処理、２回ペレット化、
無血清RPMI 1640培地中での１回洗浄及びこの培地中で
の2x107細胞/mlの濃度での再懸濁によって用意した。日
常的には、50μｇの適当なプラスミドを3.3μｇの選択
プラスミドpHA2.3neo（G418耐性を与える;Dr.Peter Ho
bart,Pfizer社）と共に、エレクトロポレーションキュ
ベット（Bethesda Research Labs［BRL］,Gaithersbu
rg,MD）中の0.5mlの細胞に加え、BRL Cell−Poratorエ
レクトロポレーション・ユニット上で250v/cm電界に、8
00μＦと低抵抗設定において暴露させた。細胞を２分間
静置させた。これらを次ぎに２倍量のRPMI 1640 10％
ウシ胎児血清によって希釈し、T25フラスコに移した。3
6時間後に、生存能力ある細胞を６孔クラスターディシ
ュに移し、選択培地（500μg/mlの活性ゲネチシンを含
み、上記と同じ）中で2x105細胞の濃度で増殖させた。
３週間後に、コロニーが出現し、これらのコロニーを確
立された方法によって、トリプシンとグリース被覆磁器
クローニングリング（cloning ring）を用いて単離し
た。この処置に耐えたクローンを大量培養まで増殖さ
せ、凍結し、液体窒素中で貯蔵した。クローンの総RNA
から誘導されるcDNAのPCR増幅によって導入遺伝子発現
を確認した。さらに、ラジオイムノアッセイ（Peninsul
a labs kit＃RIK−7321,Belmont,CA）を総細胞タンパ
ク質と周囲培地の両方におこなって、IAPP含量と分泌と
の両方の増加を確認した。
（G418）耐性を与えるプラスミドと共に、RIN細胞とβT
C3細胞とにエレクトロポレーションによって安定に導入
された。βTC3細胞はShimon Efrat and Cold Sprin
g Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.）
から入手されたものであり、Efrat,S.等,Proc.Natl.Aca
d.Sci.85,9037〜9041（1988）に説明されている。細胞
は、半集密的単層のトリプシン処理、２回ペレット化、
無血清RPMI 1640培地中での１回洗浄及びこの培地中で
の2x107細胞/mlの濃度での再懸濁によって用意した。日
常的には、50μｇの適当なプラスミドを3.3μｇの選択
プラスミドpHA2.3neo（G418耐性を与える;Dr.Peter Ho
bart,Pfizer社）と共に、エレクトロポレーションキュ
ベット（Bethesda Research Labs［BRL］,Gaithersbu
rg,MD）中の0.5mlの細胞に加え、BRL Cell−Poratorエ
レクトロポレーション・ユニット上で250v/cm電界に、8
00μＦと低抵抗設定において暴露させた。細胞を２分間
静置させた。これらを次ぎに２倍量のRPMI 1640 10％
ウシ胎児血清によって希釈し、T25フラスコに移した。3
6時間後に、生存能力ある細胞を６孔クラスターディシ
ュに移し、選択培地（500μg/mlの活性ゲネチシンを含
み、上記と同じ）中で2x105細胞の濃度で増殖させた。
３週間後に、コロニーが出現し、これらのコロニーを確
立された方法によって、トリプシンとグリース被覆磁器
クローニングリング（cloning ring）を用いて単離し
た。この処置に耐えたクローンを大量培養まで増殖さ
せ、凍結し、液体窒素中で貯蔵した。クローンの総RNA
から誘導されるcDNAのPCR増幅によって導入遺伝子発現
を確認した。さらに、ラジオイムノアッセイ（Peninsul
a labs kit＃RIK−7321,Belmont,CA）を総細胞タンパ
ク質と周囲培地の両方におこなって、IAPP含量と分泌と
の両方の増加を確認した。
トランスジェニックマウス マウス系統FVB/N（Taketo,M.等,Proc.Natl.Acad.Sci.
88,2065〜2069（1991））からの胚を、上記プラスミド
から単離した線状DNAフラグメントと共に注入した。そ
のプラスミドから、Xba IとXho I制限エンドヌクレアー
ゼによる切断によって2395bp RIPHAT DNAフラグメン
トを取り出した。反応消化物（digest）の２ラウンドの
アガロース（0.9％GTGアガロース、FMC Bioproducts,R
ockland,Me）ゲル電気泳動後に、2395bp導入遺伝子フラ
グメントをエレクトロエリューション（65V,3時間）に
よって単離した。このフラグメントを胚に注入する前に
SchleicherとSchuell Elutip−ｄカラム上で製造者のD
NA精製に関するElutip−ｄ基本プロトコールに従ってさ
らに精製した。胚の注入は、Hogan,B等,Manipulating
the Mouse Embryo Cold Spring Harbor Laborato
ries,New York,1986に略述されているような、発表さ
れた方法に従っておこなった。
88,2065〜2069（1991））からの胚を、上記プラスミド
から単離した線状DNAフラグメントと共に注入した。そ
のプラスミドから、Xba IとXho I制限エンドヌクレアー
ゼによる切断によって2395bp RIPHAT DNAフラグメン
トを取り出した。反応消化物（digest）の２ラウンドの
アガロース（0.9％GTGアガロース、FMC Bioproducts,R
ockland,Me）ゲル電気泳動後に、2395bp導入遺伝子フラ
グメントをエレクトロエリューション（65V,3時間）に
よって単離した。このフラグメントを胚に注入する前に
SchleicherとSchuell Elutip−ｄカラム上で製造者のD
NA精製に関するElutip−ｄ基本プロトコールに従ってさ
らに精製した。胚の注入は、Hogan,B等,Manipulating
the Mouse Embryo Cold Spring Harbor Laborato
ries,New York,1986に略述されているような、発表さ
れた方法に従っておこなった。
最適発現と好ましい実施態様 上記プラスミドは、例えば種々な挿入、欠失及び／又
は単一若しくは複数の塩基対置換のように、導入遺伝子
の発現を最適にするように変えることができる。これは
翻訳効率を最適にするためにルシフェラーゼの開始コド
ンの前の領域における単一塩基対変化を包含する。pRIP
HAT １内のプロモーター領域を例えばヒトIAPP、ラッ
トインスリンＩ、マウスインスリン、マウスIAPP、ラッ
トグルコキナーゼ（肝臓及び／又はβ細胞特異的）ヒト
ガストリン、ヒト又はマウスアルブミン、マウスメタロ
チオネイン及びヒトチロシンアミノトランスフェラーゼ
のような他のプロモーターと置換することができる（図
1b）。ラットインスリンIIプロモーターは暗く陰影を付
けたボックスとして示され、コーディング領域は黒色ボ
ックスとして示され、ヒトアルブミンイントロンは白色
ボックスとして示され、ヒトGAPDHポリアデニル化領域
はストリップ状ボックスとして示される。例えばマウス
のような他の種のIAPP cDNA、又はアミロイドジェニッ
ク（amyloidogenic）部分若しくはインスリン耐性を誘
導する部分のいずれかを保持するヒトIAPPの突然変異機
能形（mutated functional form）をpRIPHAT1内のヒトI
APP cDNA領域と置換することができる（図1c）。導入
遺伝子DNAを他の系統のマウス胚に又は、C57BL/6J若し
くはC57BL/Ksバックグラウンド上のdb/＋、Ob/＋、AUY
若しくはAuを包含するその突然変異体に注入することが
できる。或いは、これらのトランスジェニックマウスを
これらの遺伝的特徴を有する系統と交配させることがで
きる。
は単一若しくは複数の塩基対置換のように、導入遺伝子
の発現を最適にするように変えることができる。これは
翻訳効率を最適にするためにルシフェラーゼの開始コド
ンの前の領域における単一塩基対変化を包含する。pRIP
HAT １内のプロモーター領域を例えばヒトIAPP、ラッ
トインスリンＩ、マウスインスリン、マウスIAPP、ラッ
トグルコキナーゼ（肝臓及び／又はβ細胞特異的）ヒト
ガストリン、ヒト又はマウスアルブミン、マウスメタロ
チオネイン及びヒトチロシンアミノトランスフェラーゼ
のような他のプロモーターと置換することができる（図
1b）。ラットインスリンIIプロモーターは暗く陰影を付
けたボックスとして示され、コーディング領域は黒色ボ
ックスとして示され、ヒトアルブミンイントロンは白色
ボックスとして示され、ヒトGAPDHポリアデニル化領域
はストリップ状ボックスとして示される。例えばマウス
のような他の種のIAPP cDNA、又はアミロイドジェニッ
ク（amyloidogenic）部分若しくはインスリン耐性を誘
導する部分のいずれかを保持するヒトIAPPの突然変異機
能形（mutated functional form）をpRIPHAT1内のヒトI
APP cDNA領域と置換することができる（図1c）。導入
遺伝子DNAを他の系統のマウス胚に又は、C57BL/6J若し
くはC57BL/Ksバックグラウンド上のdb/＋、Ob/＋、AUY
若しくはAuを包含するその突然変異体に注入することが
できる。或いは、これらのトランスジェニックマウスを
これらの遺伝的特徴を有する系統と交配させることがで
きる。
好ましい細胞株はβTC3（Cold Spring Harbor Lab
oratories）、RINm5f（Gazdar,A.F.等,PNAS,77,3519〜3
523［1980］,W.Chick.U.Mass.,Worcester,Massachusett
sから入手）及びHIT（Santerre,R.F.等,PNAS,78,4339〜
4343［1981］,ACTT Rockville,MDから入手）を包含す
る。
oratories）、RINm5f（Gazdar,A.F.等,PNAS,77,3519〜3
523［1980］,W.Chick.U.Mass.,Worcester,Massachusett
sから入手）及びHIT（Santerre,R.F.等,PNAS,78,4339〜
4343［1981］,ACTT Rockville,MDから入手）を包含す
る。
有用性 安定にトランスフェクトされた細胞株を用いて、薬物
をそれらがヒトIAPPの転写、mRNAレベル、翻訳、蓄積又
は分泌を変えることができる能力に関してスクリーニン
グすることができる。特に、導入遺伝子mRNAの定常状態
レベルをPCR検出方法を用いて高いスループットでスク
リーニングすることができる。これらの細胞を上記プロ
セスを変化させることが分かっている候補薬物の作用機
序を知るために用いることができる。
をそれらがヒトIAPPの転写、mRNAレベル、翻訳、蓄積又
は分泌を変えることができる能力に関してスクリーニン
グすることができる。特に、導入遺伝子mRNAの定常状態
レベルをPCR検出方法を用いて高いスループットでスク
リーニングすることができる。これらの細胞を上記プロ
セスを変化させることが分かっている候補薬物の作用機
序を知るために用いることができる。
トランスジェニック動物を用いて、薬物をそれらが細
胞、組織、器官及び／又は血漿中のヒトIAPPレベルを変
えることができる能力に関してスクリーニングすること
ができる。これらの細胞を用いて、全動物におけるヒト
IAPPの過剰発現の病理学的結果を研究することもでき
る。
胞、組織、器官及び／又は血漿中のヒトIAPPレベルを変
えることができる能力に関してスクリーニングすること
ができる。これらの細胞を用いて、全動物におけるヒト
IAPPの過剰発現の病理学的結果を研究することもでき
る。
実験 材料と方法 ApaL I、BamH I、Hind III、Nco、Not I、Xba I、Xho
IおよびEcoR Iを包含する制限酵素は、New England
Biolabsから入手した。T4DNAリガーゼとT4DNAキナーゼ
とを包含するDNA修飾酵素は同一の供給者から入手し
た。細菌性のアルカリフォスファターゼはBoehringer
Mannheimから入手した。商業的に入手した酵素は全て、
供給者が最適と表示している条件下で用いた。
IおよびEcoR Iを包含する制限酵素は、New England
Biolabsから入手した。T4DNAリガーゼとT4DNAキナーゼ
とを包含するDNA修飾酵素は同一の供給者から入手し
た。細菌性のアルカリフォスファターゼはBoehringer
Mannheimから入手した。商業的に入手した酵素は全て、
供給者が最適と表示している条件下で用いた。
培地 E.coliの増殖培地は10gのBacto−トリプトンと、5gの
Bacto−酵母抽出物と、5gのNaClとから構成された。全
ての成分を添加した後に、10N NaOHによってpHを7.5に
調節した。
Bacto−酵母抽出物と、5gのNaClとから構成された。全
ての成分を添加した後に、10N NaOHによってpHを7.5に
調節した。
DNAのエタノール沈殿 3M,pH5.2ストック溶液からの酢酸ナトリウム（NaOA
c）をDNAサンプルに加えて、最終NaOAc濃度を200mMにし
た。2.5倍量の冷（−20℃）無水エタノールを１倍量の
水性DNAサンプルに加えて、サンプルを−70℃に15分間
又は−20℃に一晩放置した。
c）をDNAサンプルに加えて、最終NaOAc濃度を200mMにし
た。2.5倍量の冷（−20℃）無水エタノールを１倍量の
水性DNAサンプルに加えて、サンプルを−70℃に15分間
又は−20℃に一晩放置した。
DNAの電気泳動 10mM Tris−HCl,pH7.6（又はHepes,pH7.6）、1mA E
DTA中のDNAを1/5倍量の負荷緩衝液（loading buffer）
と混合した。負荷緩衝液は30％グリセロールと、10mM
Tris−HCl,pH7.6と、20mMエチレンジアミン四酢酸（EDT
A）と、ブロムフェノールブルー,0.25％（w/v）と、キ
シレンシアノール,0.25％（w/v）とから構成された。DN
Aを1X Tris−Borate EDTA（TBE）緩衝液（89mM Tri
s,pH8.3,89mM Borate,2mM EDTA）中で電極間の距離1c
mにつき５〜10ボルトにおいて0.8〜1.2％（w/v）GTGア
ガロース（FMC ioproducts,Rockland,ME）に通して電
気泳動した。
DTA中のDNAを1/5倍量の負荷緩衝液（loading buffer）
と混合した。負荷緩衝液は30％グリセロールと、10mM
Tris−HCl,pH7.6と、20mMエチレンジアミン四酢酸（EDT
A）と、ブロムフェノールブルー,0.25％（w/v）と、キ
シレンシアノール,0.25％（w/v）とから構成された。DN
Aを1X Tris−Borate EDTA（TBE）緩衝液（89mM Tri
s,pH8.3,89mM Borate,2mM EDTA）中で電極間の距離1c
mにつき５〜10ボルトにおいて0.8〜1.2％（w/v）GTGア
ガロース（FMC ioproducts,Rockland,ME）に通して電
気泳動した。
DNAのエレクトロエリューション 清潔な片刃レーザーブレードによって問題の帯を含有
するゲルスライスを切断することによって、DNA帯をゲ
ルから取り出し、このゲルスライスを、0.5x TBE緩衝
液を充填した0.25インチ直径透析管（BRL Life Techn
ologies社,Gaithersburg,MD）（長さはゲルスライスの
サイズによって変化）に入れた後に、透析管クリップに
よって両端部をシールした。充填した管を、0.5x TBE
緩衝液を充填した標準電気泳動ゲルボックスに入れ、透
析管の内側で電極間の距離1cmにつき10ボルトの電圧を
かけることによってゲルスライスからDNAを１〜３時間
溶離させた。この時間の終了時に、DNAを含む緩衝液を
エッペンドルフ管に移し、Speed−Vac装置（Savant In
struments社,Famingdale,N.Y.）中で濃縮し、量を最小
量の100μｌに減じた。この量をプレパックト（prepack
ed）Ｇ−50Sephadex（Pharmacia,Piscataway,N.J.）ス
ピンカラムに供給して、IEC卓上型臨床遠心分離器（Int
ernational Equipment Company,Needham HTS,MA）
中、600G力で３分間遠心分離した。これはDNAサンプル
からのホウ酸塩の除去を可能にした。次ぎに、サンプル
をエタノール沈殿させ、10mM Tris,pH7.6と1mM EDTA
中に再懸濁させた。
するゲルスライスを切断することによって、DNA帯をゲ
ルから取り出し、このゲルスライスを、0.5x TBE緩衝
液を充填した0.25インチ直径透析管（BRL Life Techn
ologies社,Gaithersburg,MD）（長さはゲルスライスの
サイズによって変化）に入れた後に、透析管クリップに
よって両端部をシールした。充填した管を、0.5x TBE
緩衝液を充填した標準電気泳動ゲルボックスに入れ、透
析管の内側で電極間の距離1cmにつき10ボルトの電圧を
かけることによってゲルスライスからDNAを１〜３時間
溶離させた。この時間の終了時に、DNAを含む緩衝液を
エッペンドルフ管に移し、Speed−Vac装置（Savant In
struments社,Famingdale,N.Y.）中で濃縮し、量を最小
量の100μｌに減じた。この量をプレパックト（prepack
ed）Ｇ−50Sephadex（Pharmacia,Piscataway,N.J.）ス
ピンカラムに供給して、IEC卓上型臨床遠心分離器（Int
ernational Equipment Company,Needham HTS,MA）
中、600G力で３分間遠心分離した。これはDNAサンプル
からのホウ酸塩の除去を可能にした。次ぎに、サンプル
をエタノール沈殿させ、10mM Tris,pH7.6と1mM EDTA
中に再懸濁させた。
ゲル中のDNA帯の可視化 アガロースゲルに通して電気泳動すべきDNAに関し
て、1/10量の1mg/mlの臭化エチジウム（EtBr）をサンプ
ルに加えた。電気泳動後に、320nmの波長でUV光線を放
出するUVトランスイルミネーター上にゲルを載せること
によって、DNA帯を可視化した。この方法では、脱色操
作（destaining procedure）は不必要であった。分取の
ために単離したゲルスライス中のDNA帯を上述したよう
にエレクトロエリュートした（electroeluted）。DNAに
結合したEtBrはエタノール沈殿法によって除去した。
て、1/10量の1mg/mlの臭化エチジウム（EtBr）をサンプ
ルに加えた。電気泳動後に、320nmの波長でUV光線を放
出するUVトランスイルミネーター上にゲルを載せること
によって、DNA帯を可視化した。この方法では、脱色操
作（destaining procedure）は不必要であった。分取の
ために単離したゲルスライス中のDNA帯を上述したよう
にエレクトロエリュートした（electroeluted）。DNAに
結合したEtBrはエタノール沈殿法によって除去した。
細菌プラスミドDNAの調製 Maxiprep方法（100〜2000μｇ収量のプラスミドDNA） Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manua
lに述べられているような、アルカリ溶解（alkaline ly
sis）方法によって、このDNAを調製した。“培地”の項
で述べられているLuriaブロス（0.5リットル）に適当な
E.coli菌株の固定相培養物（0.1ml量）を接種した。125
μｇの乾燥アンピシリン粉末を接種済み培地に加えた後
に、細菌を一晩振とうしながら37℃においてインキュベ
ートした。翌朝、Sorvall GS3ローター（Dupont Inst
rument Products,Biomedical Division,Newton,CT）
中での４℃における5,000rpmによる10分間の遠心分離に
よって、細菌をペレット化した。50mMグルコースと、25
Mm Tris−HCl,pH8.0と、10mM EDTAと5mg/mlのリゾチ
ームとから成る溶液（20ml）中でペレット化細菌を再懸
濁した。細菌を室温において10分間放置し、この時間後
に、40mlの0.2M NaOH/1％SDSを加えた。溶解した細菌
をさらに10分間室温で放置し、この時間後に、20mlの氷
冷3M酢酸ナトリウム（pH5.2）を加え、混合物を氷上で1
0分間インキュベートした。白色沈殿を最初の管に入
れ、GS3ローター中での5,000rpmによる10分間の遠心分
離によって、ペレット化した。上清を回収し、量を測定
した。等しい１倍量のイソプロパノールを加えて、DNA
を沈殿させ、Sorvall HSAローター中で４℃において7,
500rpmによって15分間遠心分離することによって、ペレ
ット化した。ペレットを2mlの10mM Tris−HCl中に溶解
し、3.10gのCsClを含有する5mlポリスチレン管に加え
た。このサンプルをEtBrの10mg/ml溶液（50μｌ）を含
む3.9mlBeckmanヒートシール管に移し、水を充填し、Be
ckman TLN 100ローターに入れ、Optima TLX Beckma
n卓上型Ultracentrifuge（Beckman Instruments,Palo
Alto,CA）中で100,000rpmにおいて４時間遠心分離し
た。プラスミドDNAの帯は裸眼に目視可能であり、20G針
と1ccツベルクリン注射器とによって抽出した。プラス
ミド溶液を3M NaCl飽和イソプロパノールによって抽出
することによって、EtBrを除去した。次いで、DNAをエ
タノール沈殿させ、−20℃において貯蔵した。
lに述べられているような、アルカリ溶解（alkaline ly
sis）方法によって、このDNAを調製した。“培地”の項
で述べられているLuriaブロス（0.5リットル）に適当な
E.coli菌株の固定相培養物（0.1ml量）を接種した。125
μｇの乾燥アンピシリン粉末を接種済み培地に加えた後
に、細菌を一晩振とうしながら37℃においてインキュベ
ートした。翌朝、Sorvall GS3ローター（Dupont Inst
rument Products,Biomedical Division,Newton,CT）
中での４℃における5,000rpmによる10分間の遠心分離に
よって、細菌をペレット化した。50mMグルコースと、25
Mm Tris−HCl,pH8.0と、10mM EDTAと5mg/mlのリゾチ
ームとから成る溶液（20ml）中でペレット化細菌を再懸
濁した。細菌を室温において10分間放置し、この時間後
に、40mlの0.2M NaOH/1％SDSを加えた。溶解した細菌
をさらに10分間室温で放置し、この時間後に、20mlの氷
冷3M酢酸ナトリウム（pH5.2）を加え、混合物を氷上で1
0分間インキュベートした。白色沈殿を最初の管に入
れ、GS3ローター中での5,000rpmによる10分間の遠心分
離によって、ペレット化した。上清を回収し、量を測定
した。等しい１倍量のイソプロパノールを加えて、DNA
を沈殿させ、Sorvall HSAローター中で４℃において7,
500rpmによって15分間遠心分離することによって、ペレ
ット化した。ペレットを2mlの10mM Tris−HCl中に溶解
し、3.10gのCsClを含有する5mlポリスチレン管に加え
た。このサンプルをEtBrの10mg/ml溶液（50μｌ）を含
む3.9mlBeckmanヒートシール管に移し、水を充填し、Be
ckman TLN 100ローターに入れ、Optima TLX Beckma
n卓上型Ultracentrifuge（Beckman Instruments,Palo
Alto,CA）中で100,000rpmにおいて４時間遠心分離し
た。プラスミドDNAの帯は裸眼に目視可能であり、20G針
と1ccツベルクリン注射器とによって抽出した。プラス
ミド溶液を3M NaCl飽和イソプロパノールによって抽出
することによって、EtBrを除去した。次いで、DNAをエ
タノール沈殿させ、−20℃において貯蔵した。
Miniprep方法（１〜20μｇ収量のプラスミドDNA） Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manua
lに述べられている沸騰水方法によって、このDNAを調製
した。E.coli菌の静置培養物（1.5ml）を1.5mlエッペン
ドルフ管に注入した。培養物の残りは４℃に貯蔵した。
管をEppendorfマイクロフュージ（microfuge）中で室温
において15秒間、12,000Gで遠心分離した。上清を吸引
によって除去し、ペレットを0.4mlのSTET緩衝剤:8％ス
クロース、0.5％TritonX100界面活性剤、50mM EDTA、5
0mM Tris−HCl,pH8.0中に再懸濁させた。35μｌの10mg
/mlのリゾチームを再懸濁した細胞に加えた。直ちに、
この管を100℃の水中に１分間入れた。管を沸騰水から
取り出し、12,000Gにおいて15分間遠心分離した。200μ
ｌの上清を新しい管に移し、200μｌのイソプロパノー
ルと混合した。サンプルを−70℃において15分間貯蔵し
た後に、沈殿したDNAを４℃において12,000Gで10分間遠
心分離することによって回収した。DNAペレットを70％
エタノールによってすすぎ洗いし、風乾させた。ペレッ
トを50μｌの10mM Tris−HCl,pH7.6、1mM EDTA中に再
懸濁させ、４℃において貯蔵した。
lに述べられている沸騰水方法によって、このDNAを調製
した。E.coli菌の静置培養物（1.5ml）を1.5mlエッペン
ドルフ管に注入した。培養物の残りは４℃に貯蔵した。
管をEppendorfマイクロフュージ（microfuge）中で室温
において15秒間、12,000Gで遠心分離した。上清を吸引
によって除去し、ペレットを0.4mlのSTET緩衝剤:8％ス
クロース、0.5％TritonX100界面活性剤、50mM EDTA、5
0mM Tris−HCl,pH8.0中に再懸濁させた。35μｌの10mg
/mlのリゾチームを再懸濁した細胞に加えた。直ちに、
この管を100℃の水中に１分間入れた。管を沸騰水から
取り出し、12,000Gにおいて15分間遠心分離した。200μ
ｌの上清を新しい管に移し、200μｌのイソプロパノー
ルと混合した。サンプルを−70℃において15分間貯蔵し
た後に、沈殿したDNAを４℃において12,000Gで10分間遠
心分離することによって回収した。DNAペレットを70％
エタノールによってすすぎ洗いし、風乾させた。ペレッ
トを50μｌの10mM Tris−HCl,pH7.6、1mM EDTA中に再
懸濁させ、４℃において貯蔵した。
経口糖耐性試験 試験すべきマウスを＞12時間絶食させ；血液サンプル
を眼窩後方眼出血から採取し；“ワンタッチ”グルコメ
ーター（glucometer）（Lifescan社、Milpitas CA）を
用いて血糖を測定した。血液採取は、グルコース負荷の
投与前（ｔ＝０）と、グルコース負荷後の30分間、75分
間及び120分間に実施した。グルコース負荷は200mg/ml
のデキストロース溶液を1mg/g（体重）の濃度で1cc注射
器とネズミ経口投与針とを用いて経口投与することから
構成された。
を眼窩後方眼出血から採取し；“ワンタッチ”グルコメ
ーター（glucometer）（Lifescan社、Milpitas CA）を
用いて血糖を測定した。血液採取は、グルコース負荷の
投与前（ｔ＝０）と、グルコース負荷後の30分間、75分
間及び120分間に実施した。グルコース負荷は200mg/ml
のデキストロース溶液を1mg/g（体重）の濃度で1cc注射
器とネズミ経口投与針とを用いて経口投与することから
構成された。
細菌プラスミドDNAは、Maniatis,Molecular Clonin
g:A Laboratory Manualに述べられているアルカリ溶
解方法によって調製した。
g:A Laboratory Manualに述べられているアルカリ溶
解方法によって調製した。
E.coli形質転換 細菌菌株は、Stratagene社から入手されたSURE細胞又
はBesthesda research Labs.Gaithersburg,MDからのD
H5細胞を含む。コンピテント細胞はCaCl2法（Maniatis
等,Molecular Cloning,Cold Spring laboratories,
第２版,1989）に従って調製し、液体窒素中で急速に凍
結し、−70℃において貯蔵した。問題のプラスミドによ
る、これらの菌株の形質転換は、10μｌのライゲーショ
ンミックスを80μｌのコピテント細胞と共にインキュベ
ーションした後に、37℃において２分間熱ショックを与
え、0.8mlのLuriaブロスを添加した後に37℃において１
時間さらにインキュベーションすることによって実施し
た。典型的に、100μｌのこの混合物を、選択剤として5
0μg/mlのアンピシリンを含むLBプレート上で培養し
た。このプレートを37℃において一晩インキュベーショ
ンした後にコロニーを採取した。
はBesthesda research Labs.Gaithersburg,MDからのD
H5細胞を含む。コンピテント細胞はCaCl2法（Maniatis
等,Molecular Cloning,Cold Spring laboratories,
第２版,1989）に従って調製し、液体窒素中で急速に凍
結し、−70℃において貯蔵した。問題のプラスミドによ
る、これらの菌株の形質転換は、10μｌのライゲーショ
ンミックスを80μｌのコピテント細胞と共にインキュベ
ーションした後に、37℃において２分間熱ショックを与
え、0.8mlのLuriaブロスを添加した後に37℃において１
時間さらにインキュベーションすることによって実施し
た。典型的に、100μｌのこの混合物を、選択剤として5
0μg/mlのアンピシリンを含むLBプレート上で培養し
た。このプレートを37℃において一晩インキュベーショ
ンした後にコロニーを採取した。
実施例1:pRIPHATの構築 pSV2Dog15の構築 ヒト グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒド
ロゲナーゼポリアデニル化／転写停止領域（配列番号:
5）を含有するDNAフラグメントを、ポリメラーゼ連鎖反
応（PCR）増幅によって形成した。オリゴヌクレオチド1
8970.244（配列番号:11）と18970.246（配列番号:10）
を３μｇのヒトゲノムDNA（Clontech,SanCarlos,CA）と
共に、標準のPCR条件（１μＭプライマー、３μｇター
ゲットDNA、200μＭ dNTPs、2.5単位のAmplitaq DNA
ポリメラーゼ、10mM Tris−HCl、pH8.3、50mM KCl、
1.5mM MgCl2）下でインキュベートした。増幅条件は25
サイクル、96℃において１分間、58℃において２分間、
72℃において３分間に設定した。得られた545bpフラグ
メントを10単位のSpe Iと10単位のBam H Iとによって
消化させ（37℃/30分間）、１μｇのホスファターゼ処
理した（phosphatased）Spe I/Bam消化ベクターDNA pS
V2dog1にライゲーションさせて、プラスミドpSV2dog11
を形成した。次に、pSV2dog11自体をSpe Iによって消化
させ、アルカリホスファターゼによって処理した（Boeh
ringer Mannheimからの0.25単位、50mM TrisHCl pH
8.5中、55℃において２時間）。上記標準条件下でオリ
ゴヌクレオチド18505.022と18505.024を用いて３μｇの
ヒトゲノムDNA（Clontech）のPCR増幅によって、ヒトア
ルブミンイントロンＩ（配列番号:3）を含有するDNAフ
ラグメントを形成した。生成した740bpフラグメントをS
pe Iで消化し、標準ライゲーション条件下でSpe I−線
状化pSV2 Dog11にライゲーションさせて、プラスミドp
SV2 Dog15を生成した。イントロンフラグメントの方向
（orientation）は、制限エンドヌクレアーゼAat Ｉに
よるpSV2 Dog15の消化によって確認した。20μｇのpSV
2Dog15を60単位のBam H I及び22.5単位のNco Iによっ
て消化させて、エレクトロエリューションによってNco
I/BamH Iフラグメントを単離した。３μｇのこのフラグ
メントを次に37℃において４時間、20単位のApaL Iによ
って消化させた。生じた消化生成物を0.8％GTGアガロー
ス（FMC Bioproducts,Rockland,ME）ゲル上で分離し
た。1265bpのBam H I/Apa L Iフラグメントをエレク
トロエルーション（標準状態：透析バック中のゲルスラ
イスを有する0.5X TBE（トリス−ボレート−EDTA pH
8.3）中60V/60分によって）によって回収した。溶離し
たDNAを、G50樹脂を用いるスピンカラムクロマトグラフ
ィーによって精製し、次にエタノール沈殿させた。この
フラグメントは、その3'末端においてヒトGAPDHポリア
デニル化領域に融合したヒトアルブミンイントロンを含
有した。
ロゲナーゼポリアデニル化／転写停止領域（配列番号:
5）を含有するDNAフラグメントを、ポリメラーゼ連鎖反
応（PCR）増幅によって形成した。オリゴヌクレオチド1
8970.244（配列番号:11）と18970.246（配列番号:10）
を３μｇのヒトゲノムDNA（Clontech,SanCarlos,CA）と
共に、標準のPCR条件（１μＭプライマー、３μｇター
ゲットDNA、200μＭ dNTPs、2.5単位のAmplitaq DNA
ポリメラーゼ、10mM Tris−HCl、pH8.3、50mM KCl、
1.5mM MgCl2）下でインキュベートした。増幅条件は25
サイクル、96℃において１分間、58℃において２分間、
72℃において３分間に設定した。得られた545bpフラグ
メントを10単位のSpe Iと10単位のBam H Iとによって
消化させ（37℃/30分間）、１μｇのホスファターゼ処
理した（phosphatased）Spe I/Bam消化ベクターDNA pS
V2dog1にライゲーションさせて、プラスミドpSV2dog11
を形成した。次に、pSV2dog11自体をSpe Iによって消化
させ、アルカリホスファターゼによって処理した（Boeh
ringer Mannheimからの0.25単位、50mM TrisHCl pH
8.5中、55℃において２時間）。上記標準条件下でオリ
ゴヌクレオチド18505.022と18505.024を用いて３μｇの
ヒトゲノムDNA（Clontech）のPCR増幅によって、ヒトア
ルブミンイントロンＩ（配列番号:3）を含有するDNAフ
ラグメントを形成した。生成した740bpフラグメントをS
pe Iで消化し、標準ライゲーション条件下でSpe I−線
状化pSV2 Dog11にライゲーションさせて、プラスミドp
SV2 Dog15を生成した。イントロンフラグメントの方向
（orientation）は、制限エンドヌクレアーゼAat Ｉに
よるpSV2 Dog15の消化によって確認した。20μｇのpSV
2Dog15を60単位のBam H I及び22.5単位のNco Iによっ
て消化させて、エレクトロエリューションによってNco
I/BamH Iフラグメントを単離した。３μｇのこのフラグ
メントを次に37℃において４時間、20単位のApaL Iによ
って消化させた。生じた消化生成物を0.8％GTGアガロー
ス（FMC Bioproducts,Rockland,ME）ゲル上で分離し
た。1265bpのBam H I/Apa L Iフラグメントをエレク
トロエルーション（標準状態：透析バック中のゲルスラ
イスを有する0.5X TBE（トリス−ボレート−EDTA pH
8.3）中60V/60分によって）によって回収した。溶離し
たDNAを、G50樹脂を用いるスピンカラムクロマトグラフ
ィーによって精製し、次にエタノール沈殿させた。この
フラグメントは、その3'末端においてヒトGAPDHポリア
デニル化領域に融合したヒトアルブミンイントロンを含
有した。
pSLA10の構築 IAPPメッセージのタンパク質コード領域のみを含有す
るヒトIAPPcDNAの一部（配列番号:2）を、PCRによって
形成した。１μＭの濃度のオリゴヌクレオチド19383.28
8（配列番号:12）及び19383.292（配列番号:15）を、鋳
型として0.1ngのクローン化したIAPP cDNA Hsiapp1
（Mosselman等）と共にインキュベートした。上記した
ような標準緩衝液及びPCRサイクル条件を用いた。反応
生成物をクロロホルムによって抽出して、残りの鉱油を
除去し、そしてエタノール沈殿し、沈殿したDNAを、20
μｌの1X NEB ４制限エンドヌクレアーゼ緩衝液及び1
0単位の制限エンドヌクレアーゼApaL I中に再懸濁させ
た。消化生成物を１％GTGアガロースゲル中で電気泳動
して、臭化エチジウム染色によって可視化して、エレク
トロエリューションによって回収して、1.1μｇの収量
を得た。このフラグメントを、1xBRLライゲーション緩
衝液プラス数単位のT4 DNAリガーゼの総量20μｌにお
いて、Bam H I/Apa L I（pSV2 Dog15からの1265bpフ
ラグメント）にライゲーションさせた。この反応を16℃
において３日間インキュベートした。このインキュベー
ション後に、この反応物中に存在する残りのリガーゼ活
性を熱−不活化した（65℃/10分）。次に、このライゲ
ーション反応を高塩制限緩衝液（100mM NaCl、10mm T
ris、pH7.6、10mM MgCl2）の存在下で100μｌまでに希
釈し、５単位のNco Iによって37℃において２時間消化
させた。得られたフラグメント（1533bp）を電気泳動
と、その後のエレクトロエリューションとによって単離
した。
るヒトIAPPcDNAの一部（配列番号:2）を、PCRによって
形成した。１μＭの濃度のオリゴヌクレオチド19383.28
8（配列番号:12）及び19383.292（配列番号:15）を、鋳
型として0.1ngのクローン化したIAPP cDNA Hsiapp1
（Mosselman等）と共にインキュベートした。上記した
ような標準緩衝液及びPCRサイクル条件を用いた。反応
生成物をクロロホルムによって抽出して、残りの鉱油を
除去し、そしてエタノール沈殿し、沈殿したDNAを、20
μｌの1X NEB ４制限エンドヌクレアーゼ緩衝液及び1
0単位の制限エンドヌクレアーゼApaL I中に再懸濁させ
た。消化生成物を１％GTGアガロースゲル中で電気泳動
して、臭化エチジウム染色によって可視化して、エレク
トロエリューションによって回収して、1.1μｇの収量
を得た。このフラグメントを、1xBRLライゲーション緩
衝液プラス数単位のT4 DNAリガーゼの総量20μｌにお
いて、Bam H I/Apa L I（pSV2 Dog15からの1265bpフ
ラグメント）にライゲーションさせた。この反応を16℃
において３日間インキュベートした。このインキュベー
ション後に、この反応物中に存在する残りのリガーゼ活
性を熱−不活化した（65℃/10分）。次に、このライゲ
ーション反応を高塩制限緩衝液（100mM NaCl、10mm T
ris、pH7.6、10mM MgCl2）の存在下で100μｌまでに希
釈し、５単位のNco Iによって37℃において２時間消化
させた。得られたフラグメント（1533bp）を電気泳動
と、その後のエレクトロエリューションとによって単離
した。
20μｇのレポータープラスミドpSuperluc（pSL）を９
単位のNco Iと20単位のBam H Iとによって37℃におい
て100μｌの反応量で３時間消化させることによって、
このフラグメントをクローン化するためのシャトルベク
ターを製造した。この反応に、５μｌの1M Tris、pH8.
0及び22単位のアルカリホスファターゼを加えた。次
に、この反応を50℃において２時間進行させて、5'オー
バーハング（overhangs）におけるホスフェート基を除
去し、従って次ぎのライゲーション段階におけるベクタ
ーのみの再環状化を防止した。このホスファターゼ反応
を、フェノール／クロロホルム抽出と、その後のエタノ
ール沈殿によって停止させた。このDNAを0.2μg/μｌの
濃度で10mMHepes、pH7.6、1mM EDTA（HE）に再懸濁さ
せた。
単位のNco Iと20単位のBam H Iとによって37℃におい
て100μｌの反応量で３時間消化させることによって、
このフラグメントをクローン化するためのシャトルベク
ターを製造した。この反応に、５μｌの1M Tris、pH8.
0及び22単位のアルカリホスファターゼを加えた。次
に、この反応を50℃において２時間進行させて、5'オー
バーハング（overhangs）におけるホスフェート基を除
去し、従って次ぎのライゲーション段階におけるベクタ
ーのみの再環状化を防止した。このホスファターゼ反応
を、フェノール／クロロホルム抽出と、その後のエタノ
ール沈殿によって停止させた。このDNAを0.2μg/μｌの
濃度で10mMHepes、pH7.6、1mM EDTA（HE）に再懸濁さ
せた。
1xBRLライゲーション緩衝液及び400単位のT4 DNAリ
ガーゼの総量20μｌにおいて、1.1μｇのインサートを
0.2μｇのpSLベクターにライゲーションさせることによ
って、1533bp IAPP cDNA/アルブミン イントロン/GA
PDH ポリＡ フラグメントをNco I/Bam H I−切断pS
Lにクローン化した。この反応を16℃において一晩イン
キュベートした。次の朝に、コンピテントE.coli SURE
細胞（Stratagene、San diego,CA）を10μｌのライゲ
ーションミックスと共に０℃において20分間インキュベ
ートし、次ぎに37℃において２分間ヒートショックさせ
た。0.8mlのLuria Brothをこのミックスに加え、37℃
において60分間インキュベートした。100μｌのこのミ
ックスを、200μg/mlのアンピシリンを含有するLuria
Broth寒天プレート上に広げた。16個のアンピシリン耐
性コロニーを取り出し、液体ブロス中で培養した。これ
らの培養物の半分は、miniprepDNAの消化によって測定
したように（材料と方法に記載）適切なインサートを含
むプラスミドを含んだ。１つの培養物（miniprep ＃
３）をNDA maxiprep用のLuria Broth中で0.5リットル
まで成長し、そのプラスミドはpSLA10と表示された。
ガーゼの総量20μｌにおいて、1.1μｇのインサートを
0.2μｇのpSLベクターにライゲーションさせることによ
って、1533bp IAPP cDNA/アルブミン イントロン/GA
PDH ポリＡ フラグメントをNco I/Bam H I−切断pS
Lにクローン化した。この反応を16℃において一晩イン
キュベートした。次の朝に、コンピテントE.coli SURE
細胞（Stratagene、San diego,CA）を10μｌのライゲ
ーションミックスと共に０℃において20分間インキュベ
ートし、次ぎに37℃において２分間ヒートショックさせ
た。0.8mlのLuria Brothをこのミックスに加え、37℃
において60分間インキュベートした。100μｌのこのミ
ックスを、200μg/mlのアンピシリンを含有するLuria
Broth寒天プレート上に広げた。16個のアンピシリン耐
性コロニーを取り出し、液体ブロス中で培養した。これ
らの培養物の半分は、miniprepDNAの消化によって測定
したように（材料と方法に記載）適切なインサートを含
むプラスミドを含んだ。１つの培養物（miniprep ＃
３）をNDA maxiprep用のLuria Broth中で0.5リットル
まで成長し、そのプラスミドはpSLA10と表示された。
pSLA11の構築 次ぎの工程は、pSLA10へのラットインスリンIIプロモ
ーター（RIP）（配列番号:2）の挿入に関する。RIPは内
部Nco I部位を含有するので、このプロセスは２段階で
実施した。RIP DNAフラグメント自身（876bp:5'フラン
クの700bpプラス第１イントロンを包含する5'非翻訳リ
ーダーの176bp）を、１μＭの各オリゴヌクレオチド193
83.284（配列番号:14）及び19383.292（配列番号:15）
を用いる標準条件（上記）下でPCRによって合成した;3
μｇのラットゲノムDNA（Clontech）を鋳型として用い
た。オリゴヌクレオチド19383.292は、Nco I部位を有す
るRIPのIAPPコーディング領域へのライゲーションを可
能にするために、開始コドンから5'側に２ヌクレオチド
の単一塩基変化（ＡからＣ）を含有する。PCR生成物
は、クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。このDN
Aを、20μｌの1X NEB（New England Biolabs）４制
限緩衝液中に５単位のNco Ｉと共に再懸濁し、37℃に
おいて２時間インキュベートした。２種DNAフラグメン
トをこの消化から、1.0％GTGアガロースによって電気泳
動し、臭化エチジウム染色によって可視化し、ゲルスラ
イスからDNAのエレクトロエリューションすることによ
って回収した：転写開始部位及び5'リーダー領域を含有
する2Nco Ｉ末端を有する708bp DNA並びにラットイン
スリンIIプロモーターの5'に最も隣接する配列を含有す
る168bpブラント末端/Nco Ｉフラグメント。
ーター（RIP）（配列番号:2）の挿入に関する。RIPは内
部Nco I部位を含有するので、このプロセスは２段階で
実施した。RIP DNAフラグメント自身（876bp:5'フラン
クの700bpプラス第１イントロンを包含する5'非翻訳リ
ーダーの176bp）を、１μＭの各オリゴヌクレオチド193
83.284（配列番号:14）及び19383.292（配列番号:15）
を用いる標準条件（上記）下でPCRによって合成した;3
μｇのラットゲノムDNA（Clontech）を鋳型として用い
た。オリゴヌクレオチド19383.292は、Nco I部位を有す
るRIPのIAPPコーディング領域へのライゲーションを可
能にするために、開始コドンから5'側に２ヌクレオチド
の単一塩基変化（ＡからＣ）を含有する。PCR生成物
は、クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。このDN
Aを、20μｌの1X NEB（New England Biolabs）４制
限緩衝液中に５単位のNco Ｉと共に再懸濁し、37℃に
おいて２時間インキュベートした。２種DNAフラグメン
トをこの消化から、1.0％GTGアガロースによって電気泳
動し、臭化エチジウム染色によって可視化し、ゲルスラ
イスからDNAのエレクトロエリューションすることによ
って回収した：転写開始部位及び5'リーダー領域を含有
する2Nco Ｉ末端を有する708bp DNA並びにラットイン
スリンIIプロモーターの5'に最も隣接する配列を含有す
る168bpブラント末端/Nco Ｉフラグメント。
このプラスミドpSLA10を最初にXba Iによって切断し
た。10μｇのpSLA10を、100μｌの量の1X高塩制限緩衝
液（100mM NaCl、10mM Tris、pH7.6、10mM MgCl2）
中で20単位のXba Ｉによって37℃において２時間消化
した。この反応を、フェノール／クロロホルム抽出と、
その後のエタノール沈殿によって停止させた。5'一本鎖
DNAオーバーハングを次の重合工程によって埋め込ん
だ：このDNAを10μｌの10mM Hepes、pH7.6、1mM EDTA
の中で再懸濁し、10mM Tris、pH7.6、10mM MgCl2、50
mM NaCl、５単位のクレノウ酵素及び25μＭ dNTPsを
含有する最終反応量100μｌに加えた。この反応を室温
において一晩進行させた。次の朝に、埋め込み反応を65
℃において10分間加熱することによってクレノウ酵素を
不活性化した；後に、２μｌの5M NaCl及び５単位の制
限エンドヌクレアーゼNco Ｉを加え、この反応を37℃
において２時間進行させた。この切断反応は、30％グリ
セロール、10mM Tris−HCl、pH7.6、20mMエチレンジア
ミンテトラ酢酸（EDTA）、ブロモフェノールブルー（0.
25％w/v）及びキシレンシアノール（0.25％w/v）からな
るゲル負荷緩衝液の20μｌを加えることによって停止さ
せた；生じたミックスを0.8％GTGアガロースゲルによっ
て電気泳動した。この線状形の消化したpSLA10プラスミ
ドを、エレクトロエリューションと、その後のＧ−50ス
ピンカラムによる遠心及びエタノール沈殿とによって回
収した。沈殿したDNAを10μｌの10mM Hepes、pH7.6、1
mM EDTAの中で再懸濁した。２μｌ（１μｇ）のこの溶
液を、ラットインスリンプロモーターの174bpブラント
末端/Nco Ｉフラグメント（0.25μｇ）、５単位のNEB
T4 DNAリガーゼ及び1X BRL（Bethesda Research
Laboratories）ライゲーション緩衝液（20μｌの最終用
量）と共に、16℃において一晩インキュベートした。次
の朝に、10μｌのライゲーション反応を用いて、コンピ
テントE.coli SURE細胞を形質転換した。Miniprep DN
Aを16コロニーの培養物から（材料と方法に記載したよ
うに）調製した;2つは正しいサイズのBam H Iフラグメ
ントを示した。これらのクローンのうちの一つは、より
多いプラスミドDNA及び所定の名称pSLA11の調製のため
の材料及び方法に記載したように、DNA maxiprepとし
て増殖した。
た。10μｇのpSLA10を、100μｌの量の1X高塩制限緩衝
液（100mM NaCl、10mM Tris、pH7.6、10mM MgCl2）
中で20単位のXba Ｉによって37℃において２時間消化
した。この反応を、フェノール／クロロホルム抽出と、
その後のエタノール沈殿によって停止させた。5'一本鎖
DNAオーバーハングを次の重合工程によって埋め込ん
だ：このDNAを10μｌの10mM Hepes、pH7.6、1mM EDTA
の中で再懸濁し、10mM Tris、pH7.6、10mM MgCl2、50
mM NaCl、５単位のクレノウ酵素及び25μＭ dNTPsを
含有する最終反応量100μｌに加えた。この反応を室温
において一晩進行させた。次の朝に、埋め込み反応を65
℃において10分間加熱することによってクレノウ酵素を
不活性化した；後に、２μｌの5M NaCl及び５単位の制
限エンドヌクレアーゼNco Ｉを加え、この反応を37℃
において２時間進行させた。この切断反応は、30％グリ
セロール、10mM Tris−HCl、pH7.6、20mMエチレンジア
ミンテトラ酢酸（EDTA）、ブロモフェノールブルー（0.
25％w/v）及びキシレンシアノール（0.25％w/v）からな
るゲル負荷緩衝液の20μｌを加えることによって停止さ
せた；生じたミックスを0.8％GTGアガロースゲルによっ
て電気泳動した。この線状形の消化したpSLA10プラスミ
ドを、エレクトロエリューションと、その後のＧ−50ス
ピンカラムによる遠心及びエタノール沈殿とによって回
収した。沈殿したDNAを10μｌの10mM Hepes、pH7.6、1
mM EDTAの中で再懸濁した。２μｌ（１μｇ）のこの溶
液を、ラットインスリンプロモーターの174bpブラント
末端/Nco Ｉフラグメント（0.25μｇ）、５単位のNEB
T4 DNAリガーゼ及び1X BRL（Bethesda Research
Laboratories）ライゲーション緩衝液（20μｌの最終用
量）と共に、16℃において一晩インキュベートした。次
の朝に、10μｌのライゲーション反応を用いて、コンピ
テントE.coli SURE細胞を形質転換した。Miniprep DN
Aを16コロニーの培養物から（材料と方法に記載したよ
うに）調製した;2つは正しいサイズのBam H Iフラグメ
ントを示した。これらのクローンのうちの一つは、より
多いプラスミドDNA及び所定の名称pSLA11の調製のため
の材料及び方法に記載したように、DNA maxiprepとし
て増殖した。
pSLA11を200μｌの用量の1X NEB4緩衝液中で7.5単位
のNco Ｉと共に37℃において２時間インキュベート
し、次ぎに10μｌの1mM Tris pH8.0及び22単位のBoeh
ringer Mannheimアルカリフォスファターゼを添加し、
さらに50℃において２時間インキュベートした。次ぎ
に、３回連続してフェノール／クロロホルム抽出し、エ
タノール沈殿させた。0.32μｇのこの線状形のpSLA11
を、20単位のNEBT4 DNAリガーゼを含有する1X BRLラ
イゲーション緩衝液（20μｌの用量）中で0.5μｇの上
記した760bp Nco ＩラットインスリンIIプロモーター
フラグメントにライゲーションさせた；この反応は、16
℃において一晩インキュベートした。10μｌのこのライ
ゲーション反応を用いて、コンピテントE.coli SURE細
胞を（Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory M
anualに記載したように）形質転換した。この形質転換
イベントから生じた８コロニーのうち１つのminiprep
DNA調製物は、制限エンドヌクレアーゼEcoR Iによって
消化した場合にBethesda Research Laboratories、Be
thesda、MDによって供給されたDNA分子量マーカーとの
比較によって測定されたような正確なサイズのバンドを
示した。このプラスミドをBam H Iによって部分的に消
化して、導入遺伝子インサート（長さ2.4kb）をBam H
I−消化Bluescript SK（−）にライゲーションさせ
て、DNA配列決定を促進させるためにpRIPHAT（配列番
号:1）を生成した。５つの独立的に誘導されたクローン
の１つは、不適切な突然変異を全く示さず、これを用い
て微量注入法のための導入遺伝子インサートを調製し
た。
のNco Ｉと共に37℃において２時間インキュベート
し、次ぎに10μｌの1mM Tris pH8.0及び22単位のBoeh
ringer Mannheimアルカリフォスファターゼを添加し、
さらに50℃において２時間インキュベートした。次ぎ
に、３回連続してフェノール／クロロホルム抽出し、エ
タノール沈殿させた。0.32μｇのこの線状形のpSLA11
を、20単位のNEBT4 DNAリガーゼを含有する1X BRLラ
イゲーション緩衝液（20μｌの用量）中で0.5μｇの上
記した760bp Nco ＩラットインスリンIIプロモーター
フラグメントにライゲーションさせた；この反応は、16
℃において一晩インキュベートした。10μｌのこのライ
ゲーション反応を用いて、コンピテントE.coli SURE細
胞を（Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory M
anualに記載したように）形質転換した。この形質転換
イベントから生じた８コロニーのうち１つのminiprep
DNA調製物は、制限エンドヌクレアーゼEcoR Iによって
消化した場合にBethesda Research Laboratories、Be
thesda、MDによって供給されたDNA分子量マーカーとの
比較によって測定されたような正確なサイズのバンドを
示した。このプラスミドをBam H Iによって部分的に消
化して、導入遺伝子インサート（長さ2.4kb）をBam H
I−消化Bluescript SK（−）にライゲーションさせ
て、DNA配列決定を促進させるためにpRIPHAT（配列番
号:1）を生成した。５つの独立的に誘導されたクローン
の１つは、不適切な突然変異を全く示さず、これを用い
て微量注入法のための導入遺伝子インサートを調製し
た。
微量注入法のためのRIPHAT DNAの調製 300μｇのpRIPHAT（配列番号:1）を、600μｌの全反
応量において各300単位の各制限エンドヌクレアーゼXba
Ｉ及びXho Ｉによって37℃において２時間消化し
た。この反応を、21mMの濃度までのEDTA添加と、その後
の負荷緩衝液の添加及び0.5％GTGアガロースゲルによる
電気泳動の２ラウンドによって停止させた。2.4kbDNAフ
ラグメントを含有するゲルスライスを回収し、このDNA
をエレクトロエリューション（65V、３時間）によって
単離した。このRIPHAT導入遺伝子フラグメント（2.5kb
（配列番号:7））を、Schleicher及びSchuell Elutip
−ｄカラムを使用し、製造者のプロトコールに従って、
さらに精製した。収量は、5.6μｇの精製RIPHAフラグメ
ントであった。pRIPHAT1は、1995年４月27日にAmerican
Type Culture Collectionに寄託し、名称ATCC69794
を受けた。このDNAが微量注入のためにPfizerトランス
ジェニック施設に与えられた。
応量において各300単位の各制限エンドヌクレアーゼXba
Ｉ及びXho Ｉによって37℃において２時間消化し
た。この反応を、21mMの濃度までのEDTA添加と、その後
の負荷緩衝液の添加及び0.5％GTGアガロースゲルによる
電気泳動の２ラウンドによって停止させた。2.4kbDNAフ
ラグメントを含有するゲルスライスを回収し、このDNA
をエレクトロエリューション（65V、３時間）によって
単離した。このRIPHAT導入遺伝子フラグメント（2.5kb
（配列番号:7））を、Schleicher及びSchuell Elutip
−ｄカラムを使用し、製造者のプロトコールに従って、
さらに精製した。収量は、5.6μｇの精製RIPHAフラグメ
ントであった。pRIPHAT1は、1995年４月27日にAmerican
Type Culture Collectionに寄託し、名称ATCC69794
を受けた。このDNAが微量注入のためにPfizerトランス
ジェニック施設に与えられた。
マウス胚の微量注入とトランスジェニックマウスの作成 マウス胚の微量注入とトランスジェニックマウスの作
成とを発表されている方法によっておこなった。マウス
の用意、微量注入法、注入された胚の再移植、仮親の維
持、及びトランスジェニック系統の回収と維持を述べる
詳細な方法は、Gordon,JとRuddle,F.,Methods in Enz
ymology 101,411−433（1983）に見いだすことができ
る。胚はFVB/N系統の同系交配の雌F1子孫から単離し
た。Wagner,T.等PNAS78,6376−6380（1981）が述べてい
るように、但し、培養管中で５日間インキュベーション
する代わりに、注入済み卵を直ちにドナーの雌に移し
て、実施した。再移植イベントから得られたマウスを尾
のバオプシーから単離したDNAのスロット／サザンブロ
ッティングによってそれらのゲノムDNA中の導入遺伝子
の存在に関して試験した。これらの試験の陽性動物を反
対の性の非トランスジェニックFVB/Nマウスに交配し
た。これらの交配の子孫を、尾のバイオプシーを得て、
それらからゲノムDNAを単離し、プライマー22018.134−
１（5'CGAGTGGGCTATGGGTTTGT3'）（配列番号:16）と220
18.134−２（5'GTCATGTGCACCTAAAGGGGCAAGTAATTCA3'）
（配列番号:17）とを用いて導入遺伝子配列をPCR増幅し
て、診断用883bpPCR DNA生成物を得ることによって、
導入遺伝子の伝達に関して試験した。
成とを発表されている方法によっておこなった。マウス
の用意、微量注入法、注入された胚の再移植、仮親の維
持、及びトランスジェニック系統の回収と維持を述べる
詳細な方法は、Gordon,JとRuddle,F.,Methods in Enz
ymology 101,411−433（1983）に見いだすことができ
る。胚はFVB/N系統の同系交配の雌F1子孫から単離し
た。Wagner,T.等PNAS78,6376−6380（1981）が述べてい
るように、但し、培養管中で５日間インキュベーション
する代わりに、注入済み卵を直ちにドナーの雌に移し
て、実施した。再移植イベントから得られたマウスを尾
のバオプシーから単離したDNAのスロット／サザンブロ
ッティングによってそれらのゲノムDNA中の導入遺伝子
の存在に関して試験した。これらの試験の陽性動物を反
対の性の非トランスジェニックFVB/Nマウスに交配し
た。これらの交配の子孫を、尾のバイオプシーを得て、
それらからゲノムDNAを単離し、プライマー22018.134−
１（5'CGAGTGGGCTATGGGTTTGT3'）（配列番号:16）と220
18.134−２（5'GTCATGTGCACCTAAAGGGGCAAGTAATTCA3'）
（配列番号:17）とを用いて導入遺伝子配列をPCR増幅し
て、診断用883bpPCR DNA生成物を得ることによって、
導入遺伝子の伝達に関して試験した。
トランスジェニック系統の確立 導入遺伝子の存在に関して陽性と試験された子孫をト
ランスジェニック系統の確立のためにFVB/Nマウスに検
定交配した（backcrossed）。280個のFVB/N胚の注入は1
0匹のRIPHATの始祖となる動物を作成することができ
た。これらの始祖動物の中の６匹は、子孫の尾のバイオ
プシーから単離したゲノムDNAからの導入遺伝子配列のP
CR増幅によって測定すると、導入遺伝子をそれらの子孫
に移すことができた。
ランスジェニック系統の確立のためにFVB/Nマウスに検
定交配した（backcrossed）。280個のFVB/N胚の注入は1
0匹のRIPHATの始祖となる動物を作成することができ
た。これらの始祖動物の中の６匹は、子孫の尾のバイオ
プシーから単離したゲノムDNAからの導入遺伝子配列のP
CR増幅によって測定すると、導入遺伝子をそれらの子孫
に移すことができた。
導入遺伝子を発現する系統の同定 ６系統からの子孫の種々の組織（膵臓、肝臓及び腎臓
を包含する）から総RNAを調製した。RNAは、2mlのTRISO
LVTM（Biotecx Laboratories,Houston,TX）変性剤中で
60秒間各組織をポリトロン（Brinkmann Instruments,W
estbury,N.Y.）によってホモジナイズしたものから、単
離した。4mlのクロロホルムを添加して、ホモジネート
を上部水性相と下部フェノール／クロロホルム相とに分
離させた。各ホモジネートの水相に等量のイソプロパノ
ールを添加することによって、RNAを沈殿させた。イソ
プロパノール沈殿物を12,000Gで４℃において10分間遠
心分離し、75％エタノールによって１回洗浄して、風乾
させた。RNAサンプルを200μｌの1mM EDTA中に再懸濁
させ、それらの濃度をUV分光測光法によって測定した。
Maniatisが述べているように、1.0％GTGホルムアルデヒ
ドアガロースゲルを用いて、ナイロン膜上にブロッティ
ングし、ブロットを、RIPHAT導入遺伝子内のヒトGAPDH
ポリアデニル化領域に相当する32P標識DNAフラグメント
にハイブリダイズさせることによって、ノーザン分析を
実施した。系統RHA、RHF及びRHCにおいてRIPHAT特異的R
NAが検出され、RHAとRHFの系統はRHC系統よりも10倍高
い膵臓発現を示した。RHF系統をコロニー拡大のために
選択した。
を包含する）から総RNAを調製した。RNAは、2mlのTRISO
LVTM（Biotecx Laboratories,Houston,TX）変性剤中で
60秒間各組織をポリトロン（Brinkmann Instruments,W
estbury,N.Y.）によってホモジナイズしたものから、単
離した。4mlのクロロホルムを添加して、ホモジネート
を上部水性相と下部フェノール／クロロホルム相とに分
離させた。各ホモジネートの水相に等量のイソプロパノ
ールを添加することによって、RNAを沈殿させた。イソ
プロパノール沈殿物を12,000Gで４℃において10分間遠
心分離し、75％エタノールによって１回洗浄して、風乾
させた。RNAサンプルを200μｌの1mM EDTA中に再懸濁
させ、それらの濃度をUV分光測光法によって測定した。
Maniatisが述べているように、1.0％GTGホルムアルデヒ
ドアガロースゲルを用いて、ナイロン膜上にブロッティ
ングし、ブロットを、RIPHAT導入遺伝子内のヒトGAPDH
ポリアデニル化領域に相当する32P標識DNAフラグメント
にハイブリダイズさせることによって、ノーザン分析を
実施した。系統RHA、RHF及びRHCにおいてRIPHAT特異的R
NAが検出され、RHAとRHFの系統はRHC系統よりも10倍高
い膵臓発現を示した。RHF系統をコロニー拡大のために
選択した。
系統RHFホモ接合体の発生 トランスジェニック半接合体RHF子孫に兄弟−姉妹交
配をおこなって、1:2:1の比の非トランスジェニック：
半接合体：ホモ接合体子孫を得た。トランスジェニック
子孫は尾のバイオプシーのPCR分析によって同定し；こ
のグループ内のホモ接合体は、トランスジェニック体を
野生型FVB/Nメイト（mate）に試験交配して、非トラン
スジェニック子孫を発生させないような動物を同定する
ことによって同定した（推定ホモ接合体につき＞20子
孫）。この方法で同定されたホモ接合体間で交配させ
て、RHFホモ接合体のコロニーを得た。
配をおこなって、1:2:1の比の非トランスジェニック：
半接合体：ホモ接合体子孫を得た。トランスジェニック
子孫は尾のバイオプシーのPCR分析によって同定し；こ
のグループ内のホモ接合体は、トランスジェニック体を
野生型FVB/Nメイト（mate）に試験交配して、非トラン
スジェニック子孫を発生させないような動物を同定する
ことによって同定した（推定ホモ接合体につき＞20子
孫）。この方法で同定されたホモ接合体間で交配させ
て、RHFホモ接合体のコロニーを得た。
血漿IAPPレベルとインスリンレベルの測定 代表的な非トランスジェニック同腹仔、半接合体及び
ホモ接合体動物をCO2窒息によって殺した。20G針と1ml
ツベルクリン注射器とによって、窒息した動物の大静脈
穿刺から全血を回収した。この全血を凝血を防止するた
めに1.0ml Microtainer血漿分離管（Becton Dickinso
n,Rutherford,NJ）に移し、2000Gで２分間遠心させて、
血漿を単離させた。この血漿をドライアイス中で迅速冷
凍させ、−70℃において分析まで貯蔵した。
ホモ接合体動物をCO2窒息によって殺した。20G針と1ml
ツベルクリン注射器とによって、窒息した動物の大静脈
穿刺から全血を回収した。この全血を凝血を防止するた
めに1.0ml Microtainer血漿分離管（Becton Dickinso
n,Rutherford,NJ）に移し、2000Gで２分間遠心させて、
血漿を単離させた。この血漿をドライアイス中で迅速冷
凍させ、−70℃において分析まで貯蔵した。
薬物スクリーニングのためのRHF系統ホモ接合体の使用 典型的に、動物を一定試験化合物の各投与量に対して
10匹ずつの群に分割した。１日目、投与前に、眼窩後方
眼出血によってこれらの血漿グルコースレベルを測定す
る。投与は１日目〜４日目まで、１日あたり、例えば0.
1、1.0及び10mg/kgのようにおこなう。５日目に、動物
から採血し、血糖降下効果を知るために、それらの空腹
時血糖レベルを測定する。或いは、動物に経口糖耐性試
験（OGTT）をおこない、糖耐性の改良を実証する。次ぎ
に、血漿インスリンレベルを測定するために動物を貧血
させ、インスリン濃度の低下を実証する。
10匹ずつの群に分割した。１日目、投与前に、眼窩後方
眼出血によってこれらの血漿グルコースレベルを測定す
る。投与は１日目〜４日目まで、１日あたり、例えば0.
1、1.0及び10mg/kgのようにおこなう。５日目に、動物
から採血し、血糖降下効果を知るために、それらの空腹
時血糖レベルを測定する。或いは、動物に経口糖耐性試
験（OGTT）をおこない、糖耐性の改良を実証する。次ぎ
に、血漿インスリンレベルを測定するために動物を貧血
させ、インスリン濃度の低下を実証する。
配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人:Soeller,Walter C. Carty,Maynard D. Kreutter,David K. （アメリカ合衆国に関してのみの出願人） Pfizer Inc. （他の全ての国に関する出願人） （ii）発明の名称:II型真性糖尿病のトランスジェニッ
ク動物モデル （iii）配列数:17 （iv）通信先住所： （Ａ）受信人:Pfizer inc. （Ｂ）街:235 East 42nd Street,20th Floor （Ｃ）市：ニューヨーク （Ｄ）州：ニューヨーク （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号:10017−5755 （ｖ）コンピューター読み取り形式： （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PCコンパーティブル （Ｃ）オペレーティング・システム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウウェア:PatentIn Release＃1.0,バー
ジョン＃1.25 （vi）本出願データ： （Ａ）出願番号:US N/A （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （viii）代理人／エージェント情報： （Ａ）名称:Sheyka,Robert F. （Ｂ）登録番号:31,304 （Ｃ）参照／ドケット番号:PC8153 （ix）遠距離通信情報： （Ａ）電話：（212）573−1189 （Ｂ）テレファックス：（212）573−1939 （Ｃ）テレックス:N/A （２）配列番号:1に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:5356塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：環状 （ii）分子種類:DNA（ゲノム） （xi）配列：配列番号:1: （２）配列番号:2に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:876塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子種類:DNA（ゲノム） （xi）配列：配列番号:2: （２）配列番号:3に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:278塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子種類:cDNA （xi）配列：配列番号:3: （２）配列番号:4に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:720塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子種類:DNA（ゲノム） （xi）配列：配列番号:4: （２）配列番号:5に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:545塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子種類:DNA（ゲノム） （xi）配列：配列番号:5: （２）配列番号:6に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:2961塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：環状 （ii）分子種類:DNA（ゲノム） （xi）配列：配列番号:6: （２）配列番号:7に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:2395塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子種類:DNA（ゲノム） （xi）配列：配列番号:7: （２）配列番号:8に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:34塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子種類:DNA（ゲノム） （xi）配列：配列番号:8: （２）配列番号:9に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:38塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子種類:DNA（ゲノム） （xi）配列：配列番号:9: （２）配列番号:10に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:37塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子種類:DNA（ゲノム） （xi）配列：配列番号:10: （２）配列番号:11に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:36塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子種類:DNA（ゲノム） （xi）配列：配列番号:11: （２）配列番号:12に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:31塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子種類:DNA（ゲノム） （xi）配列：配列番号:12: （２）配列番号:13に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:30塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子種類:DNA（ゲノム） （xi）配列：配列番号:13: （２）配列番号:14に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:33塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子種類:DNA（ゲノム） （xi）配列：配列番号:14: （２）配列番号:15に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:34塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子種類:DNA（ゲノム） （xi）配列：配列番号:15: （２）配列番号:16に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:20塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子種類:DNA（ゲノム） （xi）配列：配列番号:16: （２）配列番号:17に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:31塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子種類:DNA（ゲノム） （xi）配列：配列番号:17:
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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ソーラー，ウォルター・シー アメリカ合衆国コネチカット州06355, ミスティック，リッジウッド・ドライブ 322 (56)参考文献 特表 平４−500688（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 A01K 67/027 C12N 5/10 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (24)
- 【請求項１】非IAPPプロモーターと、ヒトアルブミンイ
ントロンＩコーディング配列に機能的に結合したヒトIA
PPをコードする配列又はその活性はフラグメントと、ヒ
トGAPDH停止コーディング配列と、ヒトGAPDHポリアデニ
ル化コーディング配列とを含む組換えDNAであって、適
当な宿主に組み込まれたときに糖尿病表現型を発現させ
る組換えDNA。 - 【請求項２】非IAPPプロモーターがラットインスリン
Ｉ、ラットインスリンII、ヒトインスリン、マウスIAP
P、ラットＢ細胞特異的グルコキナーゼ、グルコースト
ランスポーター２ヒトチロシンアミノトランスフェラー
ゼ、ヒトアルブミン、マウスアルブミン、ラット肝臓特
異的グルコキナーゼ及びマウスメタロチオネインの遺伝
子のプロモーターから成る群から選択される、請求項１
記載の組換えDNA。 - 【請求項３】前記プロモーターがラットインスリンプロ
モーターIIである、請求項２記載の組換えDNA。 - 【請求項４】ヒトIAPPをコードする前記配列又はその活
性なフラグメントがゲノムDNAの特徴を有する、請求項
１記載の組換えDNA。 - 【請求項５】ヒトIAPPをコードする前記配列又はその活
性なフラグメントがcDNAの特徴を有する、請求項１記載
の組換えDNA。 - 【請求項６】前記配列が配列番号:1の配列である、請求
項１記載の組換えDNA。 - 【請求項７】cDNAの前記配列が配列番号:3の配列であ
る、請求項５記載の組換えDNA。 - 【請求項８】ヒトIAPPをコードする配列をマウスIAPPを
コードする配列又はその活性なフラグメントによって置
換する、請求項１記載の組換えDNA。 - 【請求項９】前記DNAがcDNAである、請求項８記載の組
換えDNA。 - 【請求項１０】請求項１記載の組換えDNAを含むベクタ
ー。 - 【請求項１１】請求項４記載の組換えDNAを含むベクタ
ー。 - 【請求項１２】請求項５記載の組換えDNAを含むベクタ
ー。 - 【請求項１３】請求項１記載の組換えDNAを含む真核細
胞株。 - 【請求項１４】請求項４記載の組換えDNAを含む真核細
胞株。 - 【請求項１５】請求項５記載の組換えDNAを含む真核細
胞株。 - 【請求項１６】細胞がラットインスリノーマ（RIT）細
胞、ラットインスリノーマ（HIT）細胞及びβ−TC3マウ
スインスリノーマ細胞から成る群から選択される、請求
項13記載の細胞株。 - 【請求項１７】細胞がラットインスリノーマ（RIT）細
胞、ラットインスリノーマ（HIT）細胞及びβ−TC3マウ
スインスリノーマ細胞から成る群から選択される、請求
項14記載の細胞株。 - 【請求項１８】細胞がラットインスリノーマ（RIT）細
胞、ラットインスリノーマ（HIT）細胞及びβ−TC3マウ
スインスリノーマ細胞から成る群から選択される、請求
項13記載の細胞株。 - 【請求項１９】請求項１記載の組換えDNAを含むトラン
スジェニック非ヒト哺乳動物。 - 【請求項２０】請求項４記載の組換えDNAを含むトラン
スジェニック非ヒト哺乳動物。 - 【請求項２１】請求項５記載の組換えDNAを含むトラン
スジェニック非ヒト哺乳動物。 - 【請求項２２】前記動物がマウスである、請求項19記載
のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 - 【請求項２３】前記動物がマウスである、請求項20記載
のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 - 【請求項２４】前記動物がマウスである、請求項21記載
のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
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