CN104711265A - 一种绿盲蝽卵黄原蛋白、其特异性肽链、载体、菌株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于编码绿盲蝽卵黄原蛋白的DNA序列。本发明还公开了一种可利用Western-blot检测AlVg蛋白表达量的特异性多肽序列，利用此多肽特异性的分析绿盲蝽体内AlVg在蛋白水平上的差异表达。本发明还构建了雌成虫羽化后日龄与AlVg表达趋势的图谱。通过调查各种寄主植物持续饲养后，雌成虫体内AlVg基因、蛋白的表达量及单雌产卵量的相关性，构建相关预测模型对于预测绿盲蝽产卵潜力具有很大的意义。本发明明确了羽化后7天绿盲蝽雌成虫AlVg的表达量与单雌产卵量呈现正相关的关系，此发明可以用于田间对于绿盲蝽种群动态的测报工作，同时可为利用Vg为绿盲蝽田间种群监控新技术的研发提供基础。

Description

一种绿盲蝽卵黄原蛋白、其特异性肽链、载体、菌株及应用

技术领域

本发明涉及农业科学技术领域，具体涉及一种绿盲蝽卵黄原蛋白、其特异性肽链、载体、菌株及应用。

背景技术

昆虫卵黄原蛋白(Vg蛋白)是存在于昆虫雌成虫体液中的一种重要蛋白，是昆虫卵黄蛋白的前体，对于昆虫卵的发育具有重要作用，其在雌性昆虫体内的含量高低决定雌成虫产卵潜力大小。绿盲蝽Apolygus lucorum(Hemiptera:Miridae)属半翅目盲蝽科，是我国目前包括Bt棉在内的多种经济作物上的主要害虫。由于绿盲蝽具有多食性、移动快、取食隐蔽等特点，导致目前农业生产上对于绿盲蝽种群数量精确测报技术的研发面临严峻挑战。而对绿盲蝽产卵量的准确测报是其田间种群测报过程中重要一环，并对其防治具有重要的指导意义，因此急待开拓绿盲蝽种群测报的新技术。运用Vg含量开发害虫种群测报工作是一种绿盲蝽种群测报的新兴方法，然而对于编码绿盲蝽卵黄原蛋白(Apolygus lucorum Vitellogenein，AlVg)蛋白表达量的检测方法相对匮乏，同时针对AlVg基因、蛋白相对表达量与其产卵量的关系，国内外尚未见相关报道。因此分离纯化AlVg基因特异性肽链的氨基酸序列，制备其抗体，研究其AlVg基因、蛋白相对表达量与其产卵量的相关性，这对于利用AlVg基因、蛋白相对表达量进一步开发绿盲蝽种群测报新技术有着重要的理论意义和指导作用。

发明内容

发明目的：本发明的第一个目的是提供一种用于编码绿盲蝽卵黄原蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的另一个目的在于提供一种绿盲蝽卵黄原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的又一个目的是提供一种用于编码绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的DNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明的又一个目的是提供一种绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明的又一个目的是提供含有所述的用于编码绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。

本发明的又一个目的是提供一种转基因重组菌，所述重组菌是将所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。

本发明的又一目的是提供一种绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的制备方法。

技术方案：为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供一种用于编码绿盲蝽卵黄原蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

一种绿盲蝽卵黄原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

一种用于编码绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的DNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

一种绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

含有所述的用于编码绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。

将所述的DNA序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的重组表达载体。

其中，上述大肠杆菌表达载体为pCzn1。

一种转基因重组菌，所述重组菌是将所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。

本发明所述的大肠杆菌为BL21(DE3)。

本发明所述的AlVg蛋白的特异性肽链DNA序列、所述的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产AlVg蛋白特异性肽链抗体中的应用。

一种AlVg蛋白特异性肽链的制备方法，是培养所述的转基因重组菌得到的AlVg蛋白特异性肽链。

一种AlVg蛋白特异性肽链抗体的制备方法，是经过抗原亲和纯化法获得针对AlVg蛋白特异性肽链多克隆抗体。

一种AlVg蛋白特异性肽链的制备方法，包括以下步骤：

1)、绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链cDNA片段的PCR扩增，所述绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链cDNA序列如SEQ ID NO：3所示；

2)、绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链cDNA片段的原核表达载体构建；

3)、绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的变性和复性；

4)、绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的纯化即得。

然后将上述得到的AlVg蛋白特异性肽链采用抗原亲和纯化法获得针对AlVg蛋白特异性肽链多克隆抗体；

最后Western杂交验证AlVg蛋白特异性肽链抗体的效果，并分析绿盲蝽取食不同寄主植物后，雌成虫AlVg蛋白表达量差异。

有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：

1.本发明的AlVg蛋白由1991个氨基酸组成，在昆虫体内是相对比较大的蛋白，很难全长表达，进而合成特异性抗体较难。因此本发明在获得AlVg蛋白cDNA全长的基础上，经过国际权威基因数据库National Center for Biotechnology Information(NCBI)分析后，分析获得AlVg蛋白258个氨基酸的特异性肽链序列，利用此序列制作的抗体可以用于AlVg蛋白的相对表达量检测。纯化出的AlVg蛋白特异性肽链抗体不同田间寄主采集AlVg蛋白含量比较，同时可为绿盲蝽田间种群测报新技术的研发提供基础。

2.本发明的AlVg蛋白在其雌成虫羽化后1-7天其表达量逐渐升高，并在雌成虫羽化后7天达到峰值，并且其表达量在绿盲蝽取食不同寄主过程中与绿盲蝽单雌产卵量存在显著相关性(P<0.01)。由于绿盲蝽在田间存在严重的世代重叠现象，因此可以采集绿盲蝽雌成虫，分析其AlVg蛋白含量的方式与室内数据对比预测绿盲蝽田间爆发潜力。

附图说明

图1：AlVg基因开放阅读框PCR扩增电泳图；泳道1：为10000bp的DNA maker；泳道2：AlVg基因；

图2：AlVg蛋白氨基酸序列特征示意图；AlVg氨基酸序列特征区域分析，其中氨基酸序列数字编码在图的右侧，AlVg氨基酸序列在NCBI保守区预测后呈现三个保守区域，即1)两个vitellogenin-N结构域(黑框部分)；2)DUF1943结构域(黑色加粗的下划线)；c)von Willebrand factor(VWF)结构域(氨基酸英文字体加深部分)；此外，保守的连续氨基酸序列RXXR，DGXR及GL/ICG以加粗的双下划线呈现在图中；前17个氨基酸序列为信号肽序列，并以向下的加粗箭头标注；*表示为终止氨基酸；

图3：AlVg蛋白特异性肽链DNA序列的PCR扩增电泳图；泳道1：为2000bp的DNA maker；泳道2：AlVg蛋白特异性肽链DNA序列；

图4AlVg特异性肽链cDNA序列连接pCzn1表达载体后NdeI和XbaI双酶切图谱；泳道1：为10000bp的DNA maker；泳道2：AlVg蛋白特异性肽链基因及pCzn1载体片段；

图5pCzn1-AlVg特异性肽链基因序列利用诱导表达的经10％SDS-PAGE分析电泳图；泳道M：为蛋白maker；泳道1：未经诱导菌株的总蛋白；泳道2：空载体诱导菌株的总蛋白；泳道3：经0.5mM IPTG在37℃诱导靶标载体表达的总蛋白上清液；泳道4：经0.5mM IPTG在37℃诱导靶标载体表达的总蛋白包涵体；

图6AlVg特异性肽链诱导表达，纯化后经10％SDS-PAGE电泳分析图谱；泳道M：为蛋白maker；泳道1：经0.5mM IPTG在37℃诱导靶标载体表达的总蛋白包涵体；泳道2：纯化后的靶标蛋白；

图7AlVg蛋白特异性肽链抗体纯化、电泳分离后，考马斯亮蓝染色图谱；

图8利用特异性肽链抗体Western杂交AlVg蛋白图谱；泳道1：为250kd蛋白maker。泳道2：AlVg蛋白Western杂交图谱；

图9整个生育期绿盲蝽AlVg基因表达量变化图谱；N1-N5，为1-5龄若虫；F1-F9，为1-9日龄雌成虫；M1-M9，为1-9日龄雄成虫；

图10不同寄主后饲养后绿盲蝽AlVg蛋白表达量分析图谱。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

实施例1：AlVg全长基因的获得

采用TRIzol法提取绿盲蝽总RNA，选择电泳图谱良好并且OD260/OD280值在1.8～2.0之间的总RNA样品合并进行mRNA的纯化，反转录合成第一链cDNA，PCR反应体系为：0.5μg总RNA，0.5μlOligo-dT18，2μl 5×反应缓冲液，2μl 10mM dNTP，40U RNasin，200U SuperscriptⅡ，加ddH₂O至10μl；PCR反应参数为：42℃30min，75℃30min，4℃5min。根据已知昆虫Vg基因的保守序列设计适用于PCR扩增引物AlVg-1F(5′-CGTTGGTAGCCGCATGAAC-3′)及AlVg-1R(5′-GAACTGCTGCTGGAACTGCTG-3′)，获得AlVg基因保守序列，该保守序列参见序列表中的SEQ ID NO：19，PCR反应体系为：2.5μl 10×反应缓冲液，2μl25mM Mg²⁺，2μl 10mM dNTP，0.5μl Taq plus DNA聚合酶，1μl 10μM上游引物AlVg-1-F，1μl 10μM下游引物AlVg-1-R，cDNA模板1μl，加ddH₂O至25μl；PCR反应参数为：94℃5min；94℃30s，59℃30s，72℃120s，40个循环；72℃继续延伸10min；在根据获得的AlVg基因的保守序列设计RACE引物AlVg-race-5′R1(5′-ACTACTGCTGCTGCTGCTGCTGGAGCT-3′)、AlVg-race-5′R2(5′-GAACTGCTGCTGGAACTGCTGGAGCTATC-3′)，AlVg-race-5′F1(5′-CGTTGGTAGCCGCATGAACCTCACTCT-3′)、AlVg-race-5′F2(5′-GCAGCTCCAACAGTGCTTCCAACTCAAC-3′)，扩增方法具体参见Clontech公司的cDNA末端的快速扩增(RACE)试剂盒的方法进行，PCR反应参数为：94℃30s，70℃180s，5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃180s，5个循环；94℃30s，68℃30s,72℃180s，72℃继续延伸10min。电泳结果显示PCR扩增拼接后，利用AlVg开放阅读框引物AlVg-2F(5′-ATGAAGTTGACACCGTTTCTCT-3′)及AlVg-2R(5′-TCAAGCTTTGCAGCGAGA-3′)，得到与预期大小5976bp相符的条带(图1)。将PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收纯化目的DNA，与pGEM-TEasy载体进行连接，转入大肠杆菌DH5α，挑选单菌落培养，经菌落PCR鉴定为阳性的菌液及序列测定正确的进行下一步AlVg蛋白特异性肽链表达载体构建。

结论：AlVg基因ORF框包含5976个碱基，编码1991个氨基酸，预测分子量218.32kDa。

实施例2：AlVg蛋白特异性肽链cDNA克隆

根据AlVg基因全长序列在国际权威基因数据库National Center for Biotechnology Information(NCBI)预测AlVg蛋白特异性肽链cDNA序列，碱基如SEQ ID NO：3所示、氨基酸序列见SEQ IDNO：4，并设计PCR扩增引物AlVg-3F(5′-CATATGCAAATCCAATCTCAACGT-3′)及AlVg-3R(5′-TCTAGATCAAGCTTTGCAGCGAG-3′)，获得AlVg蛋白特异性肽链基因序列，PCR反应体系为：2.5μl 10×反应缓冲液，2μl 25mM Mg²⁺，2μl 10mM dNTP，0.5μl Taq plus DNA聚合酶，1μl 10μM上游引物AlVg-1-F，1μl 10μM下游引物AlVg-1-R，cDNA模板1μl，加ddH₂O至25μl；PCR反应参数为：94℃5min；94℃30s，60.5℃30s，72℃60s，40个循环；72℃继续延伸10min。电泳结果显示PCR扩增拼接后，得到与预期大小789bp相符的条带(图2)。将PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收纯化目的DNA，与pGEM-TEasy载体进行连接，转入大肠杆菌DH5α，挑选单菌落培养，经菌落PCR鉴定为阳性的菌液及序列测定正确的进行下一步表达载体构建。

结论：PCR结果包含789个碱基，其中包含AlVg蛋白特异性肽链774个碱基，编码258个氨基酸和一个氨基酸终止密码子；此外，PCR结果在AlVg蛋白特异性肽链的基础上，在两端外接NdeI、XbaI单酶切位点，并在起始端外加氨基酸起始密码子ATG；此段特异性肽链序列最大特点是沿用了AlVg尾端碱基终止序列TGA，并以昆虫Vg蛋白保守的von Willebrand factor(VWF)结构域及保守的连续氨基酸序列DGXR及GL/ICG为基础设计，加强后续Vg蛋白抗体的特异性，预测分子量28.70kDa。

实施例3：AlVg蛋白特异性肽链DNA原核表达载体的构建

含有AlVg蛋白特异性肽链基因T载体的原核表达载体构建方法为：将上述测序正确连入pGEM-TEasy的载体及pCzn1均用限制性内切酶NdeI和XbaI双酶切，进行连接。酶切体系为：2种限制性内切酶各1.0μl，10×Buffer缓冲液2.0μl，带有合适酶切位点的基因片段10.0μl，用ddH₂O补足至20μl，37℃水浴3h。连接体系为：酶切回收后的载体5.0μl，基因片段10.0μl，T4DNA连接酶1.0μl，10×Buffer缓冲液2.0μl，用ddH₂O补足至20μl，16℃反应12～16h，连接成功后的酶切图谱见图4。连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)后采用PCR筛选阳性克隆。将鉴定正确的重组质粒命名为pCzn1-AlVg1转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后涂布到含卡那霉素(50μg/mL)的平板上，37℃，220rpm/min培养过夜；从转化后培养过夜的平板上挑单克隆到10ml含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床中振荡培养过夜；次日将菌液按1％的比例接种到LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃摇床中培养2-3h，使菌液的OD₆₀₀达到0.6-0.8之间。取出1ml培养物，10000g室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃220rpm振摇12h，诱导靶标载体融合蛋白表达；取出1ml培养物，12000g室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀，进行10％SDS-PAGE电泳检测(图5)。

结论：经37℃，0.5mM IPTG诱导12h后AlVg特异性肽链基因可在pCzn1载体中进行高效表达，主要以包涵体形式存在。

实施例4：AlVg蛋白特异性肽链变性和复性及蛋白的纯化

靶标融合蛋白的提取及纯化：大量培养经SDS-PAGE电泳检测后含有靶标载体表达的BL21(DE3)菌体。将诱导表达后的培养菌液低温4℃离心6000g，10min，菌体沉淀重悬与20ml裂解buffer(包含20mM Tris-HCl、1mM PMSF和细菌蛋白酶抑制剂cocktail混合液，pH 8.0)，超声破碎(功率400W，工作4s，间歇8s，共20min)；将超声破碎的细胞裂解液4℃10000g离心20min，收集沉淀；使用包涵体洗涤液(20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH8.0)洗涤包涵体3次；用溶解缓冲液(20mM Tris，5mM DTT，8M尿素pH8.0)，按一定比例溶解包涵体，4度放置过夜。室温，15000rpm离心15min，将包涵体溶解液滴加到20mM Tris，pH8.0缓冲液逐步成倍梯度稀释，缓慢搅拌；至尿素浓度达到0.5M时，将蛋白溶液装入透析袋于4℃在20mM PBS，pH 7.4中透析过夜，进行10％SDS-PAGE电泳检测(图6)。

结论:通过变复性的方式，重溶，纯化获得靶标蛋白，电泳检测为目的蛋白，并呈现单一条带。

实施例5：AlVg蛋白特异性肽链抗体制作

动物免疫：将上一步骤纯化的靶标蛋白进行BCA蛋白浓度测定，免疫2只新西兰白兔(2-2.5KG)，皮下免疫400μg/次，2-3周免疫一次，免疫4次。采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对蛋白的效价，待效价大于1:50000进行，最终采血制备抗血清，并准备纯化。抗体纯化：将蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将所得抗血清与PBS等量混合后缓慢上样，待抗原抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4℃透析过夜，隔日进行纯度，浓度和效价测定。抗体鉴定：通过ELISA检测纯化抗体的效价，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒对所得抗体进行浓度测定，并通过SDS-PAGE电泳，纯化后抗体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察纯化抗体的纯度(图7)。

结论：获得高质量的AlVg蛋白特异性肽链抗体，其效价大于512,000，抗体的浓度0.46mg/ml，抗体纯化后纯度在95％以上。

实施例6：Western杂交验证

绿盲蝽饲养：绿盲蝽虫源采自江苏省大丰市豌豆田，在室内用四季豆(Phaseolus vulgaris L.)豆荚继代饲养，成虫期补充10％蜂蜜水，饲养条件为温度(25±1)℃，相对湿度70％±5％，光周期L∶D＝12∶12。取绿盲蝽7日龄成虫，提取蛋白开展Western杂交实验。

Western杂交样品使用30头雌成虫所提取的蛋白样品，总蛋白提取使用南京钟鼎生物技术有限公司的总蛋白提取试剂盒。总蛋白的浓度测定参考Bicinchoninic acid(BCA)法，并稍加改进。Western杂交流程根据Towbin等人的实验方法做了稍许的改动。蛋白样品在10％的SDS凝胶中电泳分离，在Tris-HCl缓冲液，100mA的电流中转膜3h，将蛋白质转移到NC膜上。NC膜在含有5％的脱脂奶粉的TBS-T缓冲液中37℃封闭1h。AlVg蛋白特异性肽链抗体1∶1000稀释，37℃孵育NC膜1h，TBS-T缓冲液洗3次，每次5min。羊抗兔的酶标二抗1∶5000稀释，37℃孵育NC膜1h，TBS-T缓冲液洗3次，每次5min。最后通过化学发光试剂盒(GE Healthcare)进行显色，结果见图8。

结论：AlVg蛋白特异性肽链抗体可以用于Western杂交分析AlVg蛋白的表达情况，其杂交出的单一条带在210-220kDa之间，与AlVg蛋白预测分子量一致。

实施例7：绿盲蝽生育期AlVg基因表达谱构建

绿盲蝽处理：绿盲蝽饲养方法参照实施例6，其整个生育期取样为，1-5龄若虫、1-9日龄雌、雄成虫，每个样品取5头绿盲蝽样品，重复5次，共计25头，RNA提取方法及反转录方法参照实施例1。

本研究所用荧光定量引物，分别为AlVg基因引物AlVg-4F(5′-AGACCGTCATGCTCGGAGAT-3′)及AlVg-4R(5′-CTGGGATTGGGAGGGACA-3′)，和绿盲蝽内标持家基因β-actin引物Al-β-actin-1F(5′-ACCTGTACGCCAACACCGT-3′)及Al-β-actin-1R(5′-TGGAGAGAGAGGCGAGGAT-3′)。荧光定量PCR试验所用试剂采用SYBR PremixEx Taq Kit(TaKaRa公司，东京，日本)，仪器为iCycler iQ(Bio-Rad)，分析软件为version 3.0a(Bio-Rad)。荧光定量PCR反应以RNase-free水(TaKaRa,Tokyo,Japan)为阴性对照，每个样品5次重复，反应条件为3步法。PCR反应参数为：94℃5min；94℃20s，50-60℃20s，72℃30s，40个循环；72℃继续延伸10min；PCR反应体系为：SYBR Premix 12.5μl，1.25μl 10μM上游引物，1.25μl 10μM下游引物，起始cDNA上样量均为80ng，加ddH2O至25μl。AlVg基因不同生育期相对表达量变化以2^-ΔΔCt法计算，相对表达量差异显著性分析采用统计软件SAS(SAS v8.0)中的Tukey氏新复极差法。

结论：绿盲蝽7日龄雌成虫体内AlVg基因的表达量显著高于其它生理时期(P<0.01)(图9)，可以利用此结果深入研究，绿盲蝽取食不同寄主后的表达量差异，以及与单雌产卵量的相关性。

实施例8：不同寄主饲养下绿盲蝽AlVg蛋白表达量差异及其与产卵量的相关性

绿盲蝽处理：绿盲蝽饲养方法参照实施例6，设定5种寄主，分别为四季豆、茼蒿、国抗19Bt棉，泗棉3号及常规棉，从卵始养殖绿盲蝽至7日龄雌成虫采样分析AlVg蛋白表达量差异，剩下的雌成虫分别统计每种寄主下的单雌产卵量。

Western杂交步骤相见实施例6，AlVg蛋白Western杂交抗体利用本专利发明的AlVg蛋白特异性肽链抗体，而绿盲蝽内标β-actin蛋白的Western杂交抗体使用的老鼠β-actin蛋白抗体购于南京钟鼎生物技术有限公司，免疫杂交后的光密度分析通过desktop scanner(Hanwang E60)和Image Jfree software。AlVg蛋白水平的表达量变化程度，根据Quantity One软件通过计算Western杂交后AlVg蛋白条带的光密度值与β-actin蛋白条带的光密度值的比值比较鉴定，本发明的Western杂交实验重复3次。盲蝽取食不同寄主植物后，AlVg蛋白相对表达量，即AlVg蛋白/β-actin蛋白后的差异以及单雌产卵量差异显著性分析采用统计软件SAS(SAS v8.0)中的Tukey氏新复极差法。具体结果见图10，表1，2。

表1不同寄主饲养绿盲蝽后的单雌产卵量

表2不同寄主饲养绿盲蝽后的单雌产卵量与AlVg蛋白相对表达量的相关性

结论：AlVg蛋白特异性肽链抗体及Western杂交技术可用于分析绿盲蝽在不同处理下的表达量差异，不同寄主植物养殖条件下，绿盲蝽AlVg蛋白相对表达量与单雌产卵量存在显著相关性(P<0.01)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于编码绿盲蝽卵黄原蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种绿盲蝽卵黄原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种用于编码绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的DNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

4.一种绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

5.含有权利要求3所述的用于编码绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。

6.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，将权利要求3所述的DNA序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的重组表达载体。

7.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述大肠杆菌表达载体为pCzn1。

8.一种转基因重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求5或6所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。

9.权利要求3所述的DNA序列、权利要求5所述的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链抗体中的应用。

10.一种绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链cDNA片段的PCR扩增，所述绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链cDNA序列如SEQ ID NO：3所示；

2)、绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链cDNA片段的原核表达载体构建；

3)、绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的变性和复性；

4)、绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的纯化即得。