CN104151407B - 一种制备人妊娠特异性糖蛋白9的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备人妊娠特异性糖蛋白9的方法。该方法包括如下步骤：(1)构建重组菌：将人PSG9蛋白的编码基因导入宿主大肠杆菌中，得到重组菌；(2)重组菌诱导培养：将重组菌用IPTG进行诱导培养，IPTG在菌液中的浓度为3uM，诱导培养的温度为30℃，得到诱导后菌体；(3)蛋白纯化：将诱导后菌体破碎，取上清；将上清用镍柱进行纯化，纯化过程中使用的洗脱液是含有40nM咪唑的洗脱缓冲液，收集洗脱液，即得到人PSG9蛋白。实验结果表明，本发明方法制备得到的人PSG9蛋白的纯度高，可达27.3mg/L，为后续PSG9在癌症中作用机制研究以及获得高纯度的单克隆抗体奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体为一种制备人妊娠特异性糖蛋白9的方法。
背景技术
妊娠特异性糖蛋白(Pregnancy specific glycoprotein，PSG)是一种糖基化蛋白，具有复杂的蛋白质三级结构，是癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)家族的成员。但是，目前对PSG家族研究较少。PSGs共包含11个成员，各成员间蛋白质序列保守性较强，同CEA家族蛋白一样，都含有免疫球蛋白样结构域(domain)，且是该蛋白的主要结构域。通过研究也发现，PSG1可能参与胚胎期血管生成。另外，还发现PSG蛋白另一项重要的功能是可以通过转化生长因子(Transfer growth factor，TGF)-beta，参与免疫反应，且能够抑制结肠炎症的发生。
PSG9是PSG蛋白的一种异构体，该基因也称为PSG7或PSG11，在蛋白质序列的N-端含有血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)样结构域。PSG9蛋白是制备抗PSG9单克隆抗体的必备材料，同时，也是后期建立检测人血液或组织中PSG9蛋白酶联免疫吸附试剂盒的标准品。Salahshor等通过基因芯片技术发现：PSG9在结直肠癌组织中高表达。对已经公布的表达谱芯片数据分析也发现，在肺癌中，PSG9 mRNA表达上调。多种肿瘤细胞系中也发现了PSG9蛋白的表达。PSG9是一种分泌型蛋白，在血浆中可以检测到。有研究报道在肝细胞癌中，PSG9血浆含量显著高于健康人群。据此，推测PSG9可能促进肿瘤发生发展。但是，对于PSG9在肿瘤发生中的作用仍不清楚。
目前，还未见有研究者表达全长的人PSG9蛋白，用于研究其功能。对于PSG9功能的挖掘很大程度受限于：没有一种稳定、特异性强的抗体，来分析PSG9在肿瘤组织的表达，构建酶联免疫吸附反应(ELISA)试剂盒，相互作用蛋白等。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种制备人PSG9蛋白的方法。
本发明所提供的制备人PSG9蛋白的方法包括如下步骤：
(1)构建重组菌：将人PSG9蛋白的编码基因导入宿主大肠杆菌中，得到重组菌；
(2)重组菌诱导培养：将重组菌用IPTG进行诱导培养，IPTG在菌液中的浓度为3uM，诱导培养的温度为30℃，得到诱导后菌体；
(3)蛋白纯化：将诱导后菌体破碎，取上清；将上清用镍柱进行纯化，纯化过程中使用的洗脱液是含有40nM咪唑的洗脱缓冲液，收集洗脱液，即得到人PSG9蛋白。
上述所述人PSG9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2中自N端起第1-426位氨基酸所示。
上述所述的宿主大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。
上述所述人PSG9蛋白的编码基因如SEQ ID NO.1中第1-1278位核苷酸的DNA分子所示。
上述所述将人PSG9蛋白的编码基因导入宿主大肠杆菌中的方法为：将所述人PSG9蛋白的编码基因插入载体pET-21α-His的多克隆位点，得到重组载体；再将重组载体导入所述宿主大肠杆菌中。
本发明的另一个目的是提供一种用于制备人PSG9蛋白的重组菌。
本发明所提供的制备人PSG9蛋白的重组菌的具体步骤：将人PSG9蛋白的编码基因导入宿主大肠杆菌中获得的。
上述所述的宿主大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。
上述所述人PSG9蛋白的编码基因如SEQ ID NO.1中第1-1278位核苷酸的DNA分子所示。
上述所述将人PSG9蛋白的编码基因导入宿主大肠杆菌中的方法为：将所述人PSG9蛋白的编码基因插入载体pET-21α-His的多克隆位点，得到重组载体；再将重组载体导入所述宿主大肠杆菌中。
实验结果表明，本发明方法制备得到的人PSG9蛋白的纯度高，可达27.3mg/L，为后续PSG9在癌症中作用机制研究以及获得高纯度的单克隆抗体奠定了基础。
附图说明
图1为PSG9基因克隆双酶切(NheI、HindIII)鉴定。共挑取4个单克隆；M为DNA分子量Marker(bp)。
图2为SDS-PAGE鉴定IPTG诱导E.coli BL21(DE3)-PSG9-6×His菌株PSG9蛋白的表达。A为经过不同IPTG浓度(1：0μM，2：0.5μM，3：1μM，4：2μM，5：3μM，6：5μM)诱导后，检测PSG9-6×His蛋白的表达量；B为不同温度(1：未加入IPTG诱导，2：20℃，3：25℃，4：30℃，5：37℃)条件下，IPTG诱导PSG9-6×His蛋白的表达量；M为蛋白质分子里Marker(kDa)。
图3为SDS-PAGE检测PSG9-6×His蛋白的可溶性表达和纯化。A为PSG9蛋白在破碎后沉淀和上清中的分布(1：沉淀，2：上清)；B为PSG9蛋白的纯化，用不同浓度的咪唑进行洗脱(1：纯化前；咪唑浓度，2：20nM，3：40nM，4：100nM，5：200nM，6：1000nM)；M为蛋白质分子量Marker(kDa)。
图4为Western-blot分析E.coli BL21(DE3)的表达。1为未用IPTG诱导；2为IPTG诱导后。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、人PSG9基因工程菌株的构建
1、聚合酶链式反应克隆人PSG9的全长基因
采用上游和下游引物序列，以pcDNA3.1-PSG9质粒载体为模板克隆人全长的PSG9编码基因序列。引物序列如下：
上游引物序列：5’-CTAGCTAGCACAGGCAGCAGAGACCATGGG-3’，下划线代表Nhe I酶切位点；
下游引物序列：5’-CCAAGCTTTACAGTCTCAGAGTCAGTCATGA-3’，下划线代表Hind III酶切位点，同时将下游的终止密码子换为CAT。
也可人工合成SEQ ID NO.1中第1-1278位核苷酸所示基因，并在其上下游添加Nhe I酶切位点和Hind III酶切位点。
2、双酶切、连接
用NheI酶和HindIII酶对PCR扩增产物进行酶切，回收目的基因片段；将目的基因片段用T4 DNA连接酶连接到pET-21α-His质粒(购自Novagen公司，目录号为：69770-3)上，得到重组质粒，记作pET-21α-PSG9-His。对重组质粒进行测序验证，结果表明连入pET-21α-His的外源基因的序列如SEQ ID NO.1中第1-1278位核苷酸所示，表明载体构建正确。SEQ ID NO.1中第1-1278位核苷酸所示基因编码的蛋白如SEQID NO.2中自N端1-426氨基酸所示。
3、转化
将构建好的pET-21α-PSG9-His质粒载体按转化E.coli BL21(DE3)，得到重组菌。将重组菌进行单克隆培养，挑取单克隆后，进行双酶切鉴定，结果如图1所示。表明构建的重组菌正确，将其记作E.coli BL21(DE3)-PSG9-6×His。该重组菌表达的蛋白是带有His标签的，即为SEQ ID NO.2所示融合蛋白(PSG9-6×His)。
实施例2、PSG9蛋白的表达及纯化
1、PSG9-6×His蛋白的表达条件的摸索
将E.coli BL21(DE3)-PSG9-6×His培养至菌液OD值为0.6时，用诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG)诱导目的蛋白PSG9-6×His的表达。为获得高产量的PSG9-6×His蛋白，我们对IPTG的浓度及诱导温度进行了优化。
用不同浓度(0μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、5μM)的IPTG诱导目的蛋白PSG9-6×His的表达。结果表明，当IPTG的浓度为3μM时，目的蛋白的浓度达到最大值(图2A)。
在不同温度(20℃、25℃、30℃、37℃)下用IPTG诱导目的蛋白PSG9-6×His的表达，IPTG在菌液中的浓度为3μM。结果表明，在30℃的情况下，PSG9-6×His蛋白占总蛋白的含量最高(图2B)。
2、PSG9-6×His蛋白的表达
将E.coli BL21(DE3)-PSG9-6×His培养至菌液OD值为0.6时，用诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG)诱导目的蛋白PSG9-6×His表达，IPTG在菌液中的浓度为3μM，温度为30℃，诱导培养时间为5h。
3、PSG9-6×His蛋白的纯化
将诱导表达后菌体破碎，分别取沉淀和上清。用含有强变性剂6M尿素的溶液溶解破碎诱导表达后细菌中不溶解的沉淀，并用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白在沉淀和上清中的分布(图3A)。结果表明，PSG9-6×His蛋白主要包含于上清中，分子量约为50 KDa。
用全是金公司的ProteinIsoTM Ni-IDA琼脂糖凝胶柱进行纯化。将上清上柱后分别用含有20nM、40nM、100nM、200nM、1000nM咪唑的洗脱缓冲液进行洗脱，并用10％的SDS-PAGE进行检测。结果表明，用含有40nM咪唑的洗脱缓冲液洗脱时，大部分的PSG9-6×His蛋白被洗脱下来，如图3B所示，收集40nM咪唑的洗脱产物。
对洗脱获得的PSG9-6×His蛋白的纯度和产率进行检测。结果表明：洗脱产物中蛋白的浓度为910ug/ml，蛋白的产率为27.3mg/L(每100ml菌液可得目的蛋白2.73mg)。
4、鉴定
我们采用Western blot对表达的PSG9-6×His蛋白进行鉴定。用多克隆兔抗人抗体检测表达的蛋白，实验结果如图4所示，经IPTG诱导后表达的PSG9-6×His蛋白，可见明显条带，分子量同预期大小一致，结果表明我们所表达的蛋白为人PSG9蛋白。
Claims (2)
1.一种制备人PSG9蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)构建重组菌：将人PSG9蛋白的编码基因导入宿主大肠杆菌中，得到重组菌；
(2)重组菌诱导培养：将重组菌用IPTG进行诱导培养，IPTG在菌液中的浓度为3μM，诱导培养的温度为30℃，得到诱导后菌体；
(3)蛋白纯化：将诱导后菌体破碎，取上清；将上清用镍柱进行纯化，纯化过程中使用的洗脱液是含有40nM咪唑的洗脱缓冲液，收集洗脱液，即得到人PSG9蛋白；
所述人PSG9蛋白的编码基因如SEQ ID NO.1中第1-1278位核苷酸的DNA分子所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述宿主大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。
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