BR122017019426B1 - Dna genômico de algodão compreendendo um evento elite produzido a partir de uma planta de algodão, célula de planta ou semente, molécula de ácido nucleico isolada, e fragmento de ácido nucleico isolado - Google Patents
Dna genômico de algodão compreendendo um evento elite produzido a partir de uma planta de algodão, célula de planta ou semente, molécula de ácido nucleico isolada, e fragmento de ácido nucleico isolado Download PDFInfo
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Abstract
A presente invenção refere-se a um DNA genômico de algodão compreendendo um evento elite produzido a partir de uma planta de algodão, a uma célula de planta ou semente, a uma molécula de ácido nucleico isolada, e a um fragmento de ácido nucleico isolado compreendendo o referido evento elite.
Description
[001] Dividido do PI0810786-6, depositado em 31.03.2008.
[002] A presente invenção refere-se a plantas de algodão trans- gênicas, material de planta e semente caracterizados por abrigarem um evento de transformação-específica, particularmente pela presença de um gene que codifica uma proteína que confere resistência a inseto, em um local específico no genoma do algodão. As plantas de algodão da invenção combinam o fenótipo de resistência a inseto com um desempenho agronômico, estabilidade genética e adaptabilidade a diferentes bases genéticas equivalentes à linhagem de algodão não- transformada na ausência de insetos. A presente invenção ainda proporciona métodos e kits para a identificação da presença de material de planta compreendendo especificamente o evento de transformação EE-GH5 em amostras biológicas.
[003] A expressão fenotípica de um transgene em uma planta é determinada pela estrutura do gene em si e por sua localização no ge- noma da planta. Ao mesmo tempo, a presença do transgene (em um DNA exógeno) em diferentes locais no genoma influenciará o fenótipo global da planta de diferentes formas. A introdução agronômica ou industrialmente com sucesso de um traço comercialmente interessante em uma planta através de manipulação genética pode ser um procedimento extenso dependente de diferentes fatores. A transformação e regeneração reais de plantas geneticamente transformadas é apenas a primeira em uma série de etapas de seleção, a qual inclui caracteri- zação genética extensiva, produção e avaliação em experimentos no campo, eventualmente levando à seleção de um evento elite.
[004] Fibra de algodão é o têxtil simples mais importante do mundo. Cerca de 80 milhões de acres de algodão são colhidos anualmente por todo o mundo. O algodão é a quinta maior safra nos E.U. em termos de produção por acre, com mais de 15 milhões de acres plantados em 2000.
[005] As espécies de inseto mais prejudiciais que se alimentam do algodão são Helicoverpa zea (broca-grande do milho ou lagarta rosada do algodão), Helicoverpa armigera (lagarta rosada Americana) Heliothis virescens (lagarta-da-maçã em tabaco) e Helicoverpa puncti- gera.
[006] A identificação inequívoca de um evento elite se torna crescentemente importante em vista de discussões sobre Novos Alimen- tos/Ração, segregação de produtos GMO e não-GMO e a identificação de material proprietário. Idealmente, tal método de identificação é muito rápido e simples, sem a necessidade de um ambiente de laboratório caro. Além disso, o método deverá proporcionar resultados que permitem a determinação inequívoca do evento elite sem interpretação de um perito, mas o qual se apoiará sobre a supervisão de um perito se necessário. Ferramentas específicas para uso na identificação do evento elite EE-GH5 em amostras biológicas são descritas aqui.
[007] O EE-GH5 foi identificado como um evento elite a partir de uma população de plantas de algodão transgênicas no desenvolvimento de algodão resistente a insetos (Gossypium hirsutum) compreendendo um gene que codifica uma proteína de cristal inseticida de Baci-llus thuringiensis. As plantas de algodão transgênicas contêm um gene quimérico que codifica uma proteína de cristal inseticida de Bt (conforme descrito na WO03/093484) sob o controle de um promotor ex- pressível em planta.
[008] Plantas de algodão compreendendo um gene de resistência a inseto foram descritas na técnica. Contudo, nenhuma das divulgações da técnica anterior ensina ou sugere a presente invenção.
[009] A presente invenção se refere a uma planta de algodão transgênica ou sementes, células ou tecidos da mesma compreendendo, estavelmente integrado em seu genoma, um cassete de expressão o qual compreende um gene de resistência a inseto compreendendo a sequência de codificação do gene cry1Ab (conforme descrito no exemplo 1.1 aqui), a qual é resistente a inseto e, na ausência de pressão pelo inseto, tem um desempenho agronômico o qual é substancialmente equivalente à linhagem isogênica não-transgênica. Sob pressão pelo inseto, a planta terá um fenótipo agronômico superior comparado com a planta não-transgênica.
[0010] De acordo com a presente invenção, a planta de algodão ou semente, células ou tecidos da mesma compreendem o evento elite EE-GH5.
[0011] Mais especificamente, a presente invenção se refere a uma planta de algodão transgênica, semente, células ou tecidos da mesma, o DNA genômico da qual é caracterizado pelo fato de que, quando analisado em um protocolo de identificação por PCR conforme descrito aqui usando dois iniciadores dirigidos à região de flanqueamento 5' ou 3' de EE-GH5 e o DNA exógeno, respectivamente, proporciona um fragmento o qual é específico para EE-GH5. Os iniciadores podem ser dirigidos contra a região de flanqueamento 5' dentro de SEQ ID N°: 1 e ao DNA exógeno, respectivamente, tal como os iniciadores compreendendo ou consistindo da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 7 e SEQ ID N°: 8, respectivamente e proporcionar um fragmento de DNA de entre 100 e 700 bp, de preferência de cerca de 129 bp. Os iniciadores também podem ser dirigidos contra a região de flanqueamento 3' dentro de SEQ ID N°: 2 e ao DNA exógeno, respectivamente, tal como os iniciadores compreendendo ou consistindo da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 6, respectivamente e proporcionar um fragmento de DNA de entre 300 e 700 bp, de preferência de cerca de 369 bp.
[0012] Semente de referência compreendendo o evento elite da invenção, foi depositada na ATCC sob o número de acesso PTA-8171. Uma modalidade da invenção é a semente compreendendo o evento elite EE-GH5 depositada como número de acesso ATCC PTA-8171, a qual crescerá em uma planta de algodão resistente a insetos, particularmente Helicoverpa sp. ou Heliothis sp. A semente com número de depósito ATCC PTA-8171 é um lote de semente consistindo de pelo menos cerca de 95% de grãos transgênicos homozigóticos para o transgene, compreendendo o evento elite da invenção, a qual cresce-rá em plantas resistentes a inseto, pelo que as plantas são também plantas tolerantes ao glufosinato compreendendo o evento elite da invenção. A invenção ainda se refere à células, tecidos, prole e descendentes de uma planta compreendendo o evento elite da invenção crescidos a partir da semente depositada na ATCC tendo número de acesso PTA-8171. A invenção ainda se refere à plantas obteníveis através de propagação de e/ou produção de uma planta de algodão compreendendo o evento elite da invenção crescida a partir da semente depositada na ATCC tendo número de acesso PTA-8171. A invenção também se refere à plantas de algodão compreendendo o evento elite EE-GH5.
[0013] A invenção ainda se refere a um método para a identificação de uma planta transgênica ou células ou tecidos da mesma compreendendo o evento elite EE-GH5, método o qual é baseado na identificação da presença de sequências de DNA de caracterização ou aminoácidos codificados por tais sequências de DNA na planta trans- gênica, células ou tecidos. De acordo com uma modalidade preferida da invenção, tais sequências de DNA de caracterização são sequências de 15 bp, de preferência 20 bp, mais preferivelmente 30 bp ou mais as quais compreendem o sítio de inserção do evento, isto é, uma parte de DNA exógeno e uma parte do genoma do algodão (a região de flanqueamento 5' ou 3') contínuas com o mesmo, permitindo a identificação específica do evento elite.
[0014] A presente invenção ainda se refere a métodos para identificação do evento elite EE-GH5 em amostras biológicas, métodos os quais são baseados em iniciadores ou sondas os quais reconhecem especificamente a sequência de flanqueamento 5' e/ou 3' de EE-GH5.
[0015] Mais especificamente, a invenção se refere a um método compreendendo amplificação de uma sequência de um ácido nucleico presente em amostras biológicas usando uma reação em cadeia de polimerase com pelo menos dois iniciadores, um dos quais reconhece a região de flanqueamento 5' ou 3' de EE-GH5, a outra das quais re-conhece uma sequência dentro do DNA exógeno, de preferência para obter um fragmento de DNA de entre 100 e 500 bp. Os iniciadores podem reconhecer uma sequência dentro da região de flanqueamento 5' (complemento de SEQ ID N°: 1, da posição 1 à posição 98 ou SEQ ID N°: 16, da posição 1 a 563) ou dentro da região de flanqueamento 3' de EE-GH5 (complemento de SEQ ID N°: 2, da posição 1 à posição 40), respectivamente. O iniciador que reconhece a região de flanque- amento 5' pode compreender a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 7 ou SEQ ID N°: 17 e o iniciador que reconhece uma sequência dentro do DNA exógeno pode compreender a sequência de nucleotí- deo de SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 18 ou SEQ ID N°: 19 descritas aqui. O iniciador que reconhece a região de flanqueamento 3' pode compreender a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 6 e o iniciador que reconhece uma sequência dentro do DNA exógeno pode compreender a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 3 descrita aqui.
[0016] A presente invenção se refere, mais especificamente, a um método para identificação do evento elite EE-GH5 em amostras biológicas, método no qual compreende amplificação de uma sequência de um ácido nucleico presente em uma amostra biológica, usando uma reação em cadeia de polimerase com dois iniciadores tendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 6 respectivamente, para obter um fragmento de DNA de cerca de 369 bp.
[0017] O presente evento elite compreende uma sequência de DNA estranha em que uma ligeira re-estruturação ocorreu quando comparado com o DNA inicialmente usado para o procedimento de transformação, a re-estruturação sendo única para o evento elite EE- GH5. Consequentemente, a invenção também se refere a um método para identificação do evento elite EE-GH5 em amostras biológicas, método o qual compreende amplificação de uma sequência de um ácido nucleico presente em uma amostra biológica, usando uma reação em cadeia de polimerase com dois iniciadores que flanqueiam a re-estruturação única de DNA exógeno em EE-GH5, tais como os iniciadores compreendendo ou tendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 10 e SEQ ID N° 11, para obter um fragmento de DNA de cerca de 262 bp.
[0018] A presente invenção ainda se refere à sequências de flan- queamento específicas de EE-GH5 descritas aqui, as quais podem ser usadas para desenvolver métodos de identificação específicos para EE-GH5 em amostras biológicas. Tais sequências de flanqueamento específicas podem também ser usadas como material de controle de referência em ensaios de identificação. Mais particularmente, a invenção se refere à regiões de flanqueamento 5' e/ou 3' de EE-GH5 as quais podem ser usadas para o desenvolvimento de iniciadores e sondas específicas, conforme ainda descrito aqui. A invenção também se refere à moléculas de ácido nucleico abrangendo as re-estruturações específicas dentro do DNA exógeno de EE-GH5, tal como uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 12, da posição de nucleotídeo 52 à posição de nucleotídeo 88 ou compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 12. Também adequadas como material de referência são moléculas de ácido nucleico, de preferência de cerca de 369 bp, compreendendo a sequência a qual pode ser amplificada por iniciadores tendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 6
[0019] A invenção ainda se refere a métodos de identificação da presença de EE-GH5 em amostras biológicas baseado no uso de tais iniciadores ou sondas específicas. Iniciadores podem consistir de uma sequência de nucleotídeo de 17 a cerca de 200 nucleotídeos consecutivos selecionada da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 1 do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 98 da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 16 do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 563 ou o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID 2 do nucleotídeo 41 ao nucleotídeo 452) combinado com iniciadores consistindo de uma se-quência de nucleotídeo de 17 a cerca de 200 nucleotídeos consecutivos selecionada do complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 1 do nucleotídeo 99 ao nucleotídeo 334 ou a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 40. Iniciadores também podem compreender essas sequências de nucleotí- deo localizadas em sua extremidade 3' e, ainda compreender sequências não-relacionadas ou sequências derivadas das sequências de nucleotídeo mencionadas, mas compreendendo combinações errôneas.
[0020] A invenção ainda se refere a kits para a identificação do evento elite EE-GH5 em amostras biológicas, os referidos kits compreendendo pelo menos um iniciador ou sonda a qual reconhece especificamente a região de flanqueamento 5' ou 3' de EE-GH5 ou a re- estruturação específica dentro da sequência de DNA estranha em EE-GH5.
[0021] O kit da invenção pode compreender, além de um iniciador o qual reconhece especificamente a região de flanqueamento 5' ou 3' de EE-GH5, um segundo iniciador o qual reconhece especificamente uma sequência dentro do DNA exógeno de EE-GH5, para uso em um protocolo de identificação por PCR. Os kits da invenção podem compreender pelo menos dois iniciadores específicos, um dos quais reconhece uma sequência dentro da região de flanqueamento 5' de EE- GH5 e o outro dos quais reconhece uma sequência dentro do DNA exógeno. O iniciador que reconhece a região de flanqueamento 5' pode compreender a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 3 e o iniciador que reconhece o transgene pode compreender a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 6 ou qualquer outro iniciador, conforme descrito aqui.
[0022] A invenção ainda se refere a um kit para a identificação de evento elite EE-GH5 em amostras biológicas, o referido kit compreendendo os iniciadores de PCR tendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 6 para uso no protocolo de identificação de EE-GH5 por PCR descrito aqui. A invenção ainda se refere a um kit para a identificação de evento elite EE-GH5 em amostras biológicas, o referido kit compreendendo os iniciadores de PCR tendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 10 e SEQ ID N°: 11.
[0023] A invenção também se refere a um kit para a identificação de evento elite EE-GH5 em amostras biológicas, kit o qual compreende uma sonda específica tendo uma sequência a qual corresponde (ou é complementar a) uma sequência tendo entre 80% e 100% de identidade de sequência com uma região específica de EE-GH5. De preferência, a sequência da sonda corresponde a uma região específica compreendendo parte da região de flanqueamento 5' ou 3' de EE-GH5 ou a uma região correspondendo à re-estruturação de DNA exógeno específico para EE-GH5. Mais preferivelmente, a sonda específica tem (ou é complementar a) uma sequência tendo entre 80% e 100% de identidade de sequência à sequência entre os nucleotídeos 78 a 119 de SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N°: 2, do nucleotídeo 20 a 61 ou SEQ ID 12, do nucleotídeo 52 ao nucleotídeo 88.
[0024] De acordo com outro aspecto da invenção, são descritas sequências de DNA compreendendo o sítio de inserção do evento e polinucleotídeos de comprimento suficiente do DNA genômico de algodão e do DNA exógeno (transgene), de modo a serem úteis como iniciador ou sonda para a detecção de EE-GH5. Tais sequências podem compreender pelo menos 9 nucleotídeos do DNA genômico de algodão e um número similar de nucleotídeos do DNA exógeno (transgene) de EE-GH5 com o mesmo em cada lado do sítio de inserção, respectivamente. Mais preferivelmente, tais sequências de DNA compreendem pelo menos 9 nucleotídeos do DNA genômico de algodão e um número similar de nucleotídeos do DNA exógeno contínuos com o sítio de inserção em SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID N°: 2.
[0025] Os métodos e kits abrangidos pela presente invenção podem ser usados para diferentes finalidades tais como, mas não limitado ao seguinte: identificar a presença ou ausência de EE-GH5 em plantas, material ou produtos de planta tais como, mas não limitado a, ração ou produtos alimentícios (frescos ou processados) compreendendo ou derivados de material de planta; adicional ou alternativamente, os métodos e kits da presente invenção podem ser usados para identificar material de planta transgênica para fins de segregação entre material transgênico e não-transgênico; adicional ou alternativamente, os métodos e kits da presente invenção podem ser usados para de-terminar a qualidade (isto é, percentual de material puro) do material de planta compreendendo EE-GH5.
[0026] A invenção ainda se refere à regiões de flanqueamento 5' e/ou 3' de EE-GH5, bem como a iniciadores e sondas específicos desenvolvidos a partir de sequências de flanqueamento 5' e/ou 3' de EE- GH5. A invenção também se refere à região de re-estruturação específica de EE-GH5, bem como a iniciadores ou sondas específicos de-senvolvidos a partir dessa região.
[0027] A invenção também se refere a um DNA genômico obtido a partir de plantas compreendendo o evento elite EE-GH5. Tal DNA ge- nômico pode ser usado como material de controle de referência nos ensaios de identificação descritos aqui.
[0028] Os exemplos a seguir não se destinam a limitar a invenção às modalidades específicas descritas, mas devem ser entendidos em conjunto com as figuras em anexo, incorporadas aqui por referência, nas quais:
[0029] Figura 1: representa esquematicamente a relação entre as sequências de nucleotídeo e iniciadores citados. Barra preta: DNA exógeno; barra preta riscada: re-estruturação do DNA exógeno específico para EE-GH5; barra clara: DNA originário de planta; barra clara riscada: pré-inserção por deleção alvo; setas: iniciadores de oligonu- cleotídeo, as figuras sob as barras representam posições de nucleotí- deo; (c) se refere ao complemento da sequência de nucleotídeo indicada.
[0030] Figura 2: representa os resultados obtidos através do protocolo de identificação por PCR desenvolvido para EE-GH5. Sequência de carregamento do gel: fileira 1: padrão de peso molecular (padrão de PM de 100 bp); fileiras 2 a 3: amostras de DNA de plantas de algodão compreendendo o evento transgênico EE-GH5; fileiras 4 a 10: amostras de DNA de plantas de algodão de controle não compreendendo o evento elite EE-GH5, mas compreendendo um gene de resis- tência a inseto similar; fileira 11: nenhum controle de DNA-padrão; fileira 12: padrão de peso molecular.
[0031] Figura 3: representa os resultados obtidos através do protocolo de PCR de classificação de zigosidade desenvolvido para EE- GH5. Sequência de carregamento do gel: Fileira 1: padrão de peso molecular (padrão de PM de 100 bp); fileiras 2 e 3: amostras de DNA de plantas de algodão compreendendo o evento transgênico EE-GH5 na forma heterozigótica; fileira 4: falha; fileira 5: Amostra de DNA de controle de planta de algodão do tipo silvestre; fileiras 6-7: amostra de DNA de plantas de algodão compreendendo o evento transgênico EE- GH5 na forma homozigótica; fileira 8: nenhum controle de DNA- padrão; fileira 9: padrão de peso molecular.
[0032] A incorporação de uma molécula de DNA recombinante no genoma da planta resulta, tipicamente, da transformação de uma célula ou tecido. O sítio de incorporação em particular é usualmente em virtude de integração "aleatória".
[0033] O DNA introduzido no genoma da planta como um resultado de transformação de uma célula ou tecido de planta com um DNA recombinante ou "DNA de transformação" e originário de tal DNA de transformação é aqui depois referido como "DNA exógeno" compreendendo um ou mais "transgenes". "DNA de planta", no contexto da presente invenção, se refere ao DNA originário da planta a qual é transformada. DNA de planta usualmente será encontrado no mesmo locus genético na planta do tipo silvestre correspondente. O DNA exógeno pode ser caracterizado pela localização e a configuração no sítio de incorporação da molécula de DNA recombinante no genoma da planta. O sítio no genoma da planta onde um DNA recombinante foi inserido é também referido como o "sítio de inserção" ou "sítio-alvo". Inserção do DNA recombinante na região do genoma da planta referido como "pré- inserção de DNA de planta" pode estar associada a uma deleção de DNA de planta, referida como "deleção de sítio-alvo". Uma "região de flanqueamento" ou "sequência de flanqueamento", conforme usado aqui, se refere a uma sequência com pelo menos 20 bp, de preferência pelo menos 50 bp e até 5000 bp de DNA diferente do DNA introduzido, de preferência DNA do genoma da planta o qual está imediatamente a montante de e contínuo com ou imediatamente a jusante de e contínuo com o DNA exógeno. Procedimentos de transformação que levam à integração aleatória do DNA exógeno resultarão em transfor- mantes com diferentes regiões de flanqueamento as quais são características e únicas para cada transformante. Quando o DNA combinado é introduzido em uma planta através de cruzamento tradicional, seu sítio de inserção no genoma da planta ou suas regiões de flanquea- mento geralmente não serão alteradas. Uma "região de inserção", conforme usado aqui, se refere à região correspondendo à região de pelo menos 40 bp, de preferência pelo menos 100 bp e até 10000 bp, abrangida pela sequência a qual compreende a região de flanquea- mento a montante e/ou a jusante do DNA exógeno no genoma da planta. Levando-se em conta diferenças mínimas em virtude de mutações dentro de uma espécie, uma região de inserção reterá, quando de cruzamento em uma planta da mesma espécie, pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% e, ainda mais preferivelmente, 100% de identidade de sequência com a sequência compreendendo as regiões de flanqueamento a montante e a jusante do DNA exógeno na planta originalmente obtida a partir de transformação.
[0034] Um evento é definido como um locus genético (artificial) que, como um resultado de engenharia genética, traz um transgene compreendendo pelo menos uma cópia de um gene de interesse. Os estados alélicos típicos de um evento são a ausência ou presença do DNA exógeno. Um evento é caracterizado fenotipicamente pela expressão do transgene. A nível genético, um evento é parte da composição genética de uma planta. A nível molecular, um evento pode ser caracterizado pelo mapa de restrição (por exemplo, conforme determinado através de Southern blotting), pelas sequências de flanqueamen- to a montante e a jusante do transgene, a localização de marcadores moleculares e/ou a configuração molecular do transgene. Usualmente, transformação de uma planta com DNA de transformação compreendendo pelo menos um gene de interesse leva a uma população de transformantes compreendendo uma multiplicidade de eventos distintos, cada um dos quais é único.
[0035] Um evento elite, conforme usado aqui, é um evento o qual é selecionado de um grupo de eventos obtido através de transformação com o mesmo DNA de transformação ou através de recruzamento com plantas obtidas através de tal transformação, baseado na expressão e estabilidade do(s) transgene(s) e sua compatibilidade com características agronômicas ótimas da planta que o compreende. Assim, os critérios para a seleção do evento elite são um ou mais, de preferência dois ou mais, vantajosamente todos os seguintes:
[0036] Que a presença do DNA exógeno não comprometa outras características desejadas da planta, tais como aquelas referentes ao desempenho agronômico ou valor comercial;
[0037] Que o evento seja caracterizado por uma configuração molecular bem definida a qual é estavelmente herdada e para a qual ferramentas apropriadas para controle de identidade possam ser desenvolvidas;
[0038] Que o(s) gene(s) de interesse mostre(m) uma expressão fenotípica espacial e temporal correta, apropriada e estável em condição heterozigótica (ou hemizigótica) e homozigótica do evento, em um nível comercialmente aceitável em uma faixa de condições ambientais nas quais a planta que traz o evento provavelmente será exposta em uso agronômico normal.
[0039] É preferido que o DNA exógeno esteja associado a uma posição, no genoma da planta, que permite introgressão fácil nas bases genéticas comerciais desejadas.
[0040] O estado de um evento como um evento elite é confirmado através de introgressão do evento elite em diferentes bases genéticas relevantes e observando a conformidade com um, dois ou todos os critérios, por exemplo, a), b) e c) acima.
[0041] Um "evento elite", assim, se refere a um locus genético compreendendo um DNA exógeno o qual responde aos critérios acima descritos. Uma planta, material de planta ou prole, tais como sementes, pode compreender um ou mais eventos de elite em seu genoma.
[0042] As ferramentas desenvolvidas para identificar um evento elite ou a planta, material de planta compreendendo um evento elite ou produtos os quais compreendem material de planta compreendendo o evento elite são baseadas nas características genômicas específicas do evento elite, tais como um mapa de restrição específico da região genômica compreendendo o DNA exógeno, marcadores moleculares ou a sequência da(s) região(ões) de flanqueamento do DNA exógeno.
[0043] Uma ou ambas as regiões de flanqueamento do DNA exógeno foram sequenciadas, iniciadores e sondas podem ser desenvolvidos os quais reconhecem especificamente essa(s) sequência(s) no ácido nucleico (DNA ou RNA) de uma amostra por meio de uma técnica biológica molecular. Por exemplo, um método de PCR pode ser desenvolvido para identificar o evento elite em amostras biológicas (tais como amostras de plantas, material de planta ou produtos compreendendo material de planta). Tal PCR é baseada em pelo menos dois "iniciadores" específicos, um reconhecendo uma sequência dentro da região de flanqueamento 5' ou 3' do evento elite e o outro reconhecen- do uma sequência dentro do DNA exógeno. Os iniciadores têm, de preferência, uma sequência de entre 15 e 35 nucleotídeos a qual, sob condições de PCR otimizadas, "reconhecem especificamente" uma sequência dentro da região de flanqueamento 5' ou 3' do evento elite e o DNA exógeno do evento elite respectivamente, de modo que um fra-gmento específico ("fragmento de integração" ou amplicon discriminatório) é amplificado a partir da amostra de ácido nucleico compreendendo o evento elite. Isso significa que apenas o fragmento de integração objetivado e nenhuma outra sequência no genoma da planta ou DNA exógeno é amplificado sob condições de PCR otimizadas.
[0044] Iniciadores adequados para a invenção podem ser os seguintes: - oligonucleotídeos oscilando, quanto ao comprimento, de 17 nt a cerca de 100 nt, compreendendo uma sequência de nucleotí- deo de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, de preferência 20 nucleotídeos consecutivos selecionados da sequência de flanquea- mento 5' (SEQ ID N° 1 do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 98 ou SEQ ID N° 16 do nucleotídeo 1 a 563) em sua extremidade 3' (iniciadores que reconhecem sequências de flanqueamento 5'); ou - oligonucleotídeos oscilando, quanto ao comprimento, de 17 nt a cerca de 200 nt, compreendendo uma sequência de nucleotí- deo de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, de preferência 20 nucleotídeos consecutivos, selecionados da sequência de flanquea- mento 3' (complemento de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 41 ao nucleo- tídeo 452) em sua extremidade 3' (iniciadores que reconhecem sequências de flanqueamento 3'); ou - oligonucleotídeos oscilando, quanto ao comprimento, de 17 nt a cerca de 200 nt, compreendendo uma sequência de nucleotí- deo de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, de preferência 20 nucleotídeos selecionados das sequências de DNA inseridas (com- plemento de SEQ ID N° 1 do nucleotídeo 99 ao nucleotídeo 334) em sua extremidade 3' (iniciadores que reconhecem DNA exógeno); ou - oligonucleotídeos oscilando, quanto ao comprimento, de 17 nt a cerca de 40 nt, compreendendo uma sequência de nucleotídeo de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, de preferência 20 nucle- otídeos selecionados das sequências de DNA inseridas (SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 40).
[0045] Os iniciadores podem, naturalmente, ser mais longos do que os 17 nucleotídeos consecutivos mencionados e podem, por exemplo, ter 20, 21, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 nt de comprimento ou mesmo mais. Os iniciadores podem consistir inteiramente da se-quência de nucleotídeo selecionada a partir das sequências de nucleo- tídeo, sequências de flanqueamento e sequências de DNA exógeno mencionadas. Contudo, a sequência de nucleotídeo dos iniciadores, em sua extremidade 5' (isto é, fora dos 17 nucleotídeos consecutivos 3-localizados) é menos crítica. Assim, a sequência 5' dos iniciadores pode consistir de uma sequência de nucleotídeo selecionada das sequências de flanqueamento ou DNA exógeno, conforme apropriado, mas podem conter várias (por exemplo, 1, 2, 5, 10) combinações errôneas. A sequência dos iniciadores 5' pode mesmo consistir inteiramente de uma sequência de nucleotídeo não-relacionada às sequências de flanqueamento ou DNA exógeno tais como, por exemplo, uma sequência de nucleotídeo que representa sítios de reconhecimento de enzima de restrição. Tais sequências não-relacionadas ou sequências de DNA de flanqueamento com combinações errôneas, de preferência, não serão mais longas do que 100, mais preferivelmente não mais longas do que 50 ou mesmo 25 nucleotídeos.
[0046] Além disso, iniciadores adequados podem compreender ou consistir de uma sequência de nucleotídeo, em sua extremidade 3', abrangendo a região de união entre as sequências derivadas de DNA de planta e as sequências de DNA estranhas (localizadas nos nucleo- tídeos 98-99 em SEQ ID N°: 1 e nucleotídeos 40-41 em SEQ ID N°: 2), contando que os 17 nucleotídeos consecutivos 3'-localizados mencionados não sejam exclusivamente derivados do DNA exógeno ou sequências derivadas de planta e SEQ ID N°: 1 ou 2.
[0047] Também será imediatamente evidente para aqueles versados na técnica que pares de iniciador de PCR apropriadamente selecionados não compreenderão também sequências complementares umas às outras.
[0048] Para fins da invenção, o "complemento de uma sequência de nucleotídeo representada em SEQ ID N°: X" é a sequência de nu- cleotídeo a qual pode ser derivada da sequência de nucleotídeo representada através de substituição dos nucleotídeos por seu nucleotídeo complementar de acordo com as regras de Chargaff (A«T; G:: C) e lendo a sequência na direção 5' para 3', isto é, na direção oposta da sequência de nucleotídeo representada.
[0049] Exemplos de iniciadores adequados são as sequências de oligonucleotídeo de SEQ ID N° 7 ou SEQ ID N° 17 (iniciadores que reconhecem a sequência de flanqueamento 5'), SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 18 ou SEQ ID N° 19 (iniciadores que reconhecem o DNA exógeno para uso com iniciadores que reconhecem a sequência de flanqueamen- to 5'), SEQ ID N° 3 (iniciadores que reconhecem o DNA exógeno para uso com iniciadores que reconhecem a sequência de flanqueamento 3'), SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6 (iniciadores que reconhecem a sequência de flanqueamento 3') e SEQ ID N°s 10 e 11 (iniciadores que reconhecem a re-estruturação de DNA exógeno específica em EE-GH5).
[0050] Outros exemplos de iniciadores de oligonucleotídeo adequados compreendem, em sua extremidade 3', as seguintes sequências ou consistem de tais sequências:
[0051] a. iniciadores que reconhecem a sequência de flanquea- mento 5': - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 1 do nucleotí- deo 58 ao nucleotídeo 77 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 16 do nucleotí- deo 85 ao nucleotídeo 104 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 16 do nucleotí- deo 150 ao nucleotídeo 166 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 16 do nucleotí- deo 150 ao nucleotídeo 171 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 16 do nucleotí- deo 154 ao nucleotídeo 171 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 16 do nucleotí- deo 87 ao nucleotídeo 104 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 16 do nucleotí- deo 189 ao nucleotídeo 206
[0052] b. Iniciadores que reconhecem a sequência de DNA estranha para uso com iniciadores que reconhecem a sequência de flan- queamento 5': - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 1 do nucleotídeo 149 ao nucleotídeo 170 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 1 do nucleotídeo 169 ao nucleotídeo 186 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 1 do nucleotídeo 193 ao nucleotídeo 212 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 1 do nucleotídeo 161 ao nucleotídeo 178 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 1 do nucleotídeo 194 ao nucleotídeo 211 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 1 do nucleotídeo 193 ao nucleotídeo 211 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 1 do nucleotídeo 163 ao nucleotídeo 185 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 1 do nucleotídeo 194 ao nucleotídeo 210 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 1 do nucleotídeo 193 ao nucleotídeo 210 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 1 do nucleotídeo 193 ao nucleotídeo 209
[0053] c. iniciadores que reconhecem a sequência de flanquea- mento 3': - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 149 ao nucleotídeo 168 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 154 ao nucleotídeo 173 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 140 ao nucleotídeo 159 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 141 ao nucleotídeo 160 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 147 ao nucleotídeo 166 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 148 ao nucleotídeo 167 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 149 ao nucleotídeo 167 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 153 ao nucleotídeo 172 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 154 ao nucleotídeo 174 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 160 ao nucleotídeo 177 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 232 ao nucleotídeo 251 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 140 ao nucleotídeo 160 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 141 ao nucleotídeo 161 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 147 ao nucleotídeo 165 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 149 ao nucleotídeo 166 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 148 ao nucleotídeo 166 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 147 ao nucleotídeo 167 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 148 ao nucleotídeo 168 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 153 ao nucleotídeo 173 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 154 ao nucleotídeo 175 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 156 ao nucleotídeo 175 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 232 ao nucleotídeo 250 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 140 ao nucleotídeo 157 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 140 ao nucleotídeo 161 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 141 ao nucleotídeo 162 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 148 ao nucleotídeo 165 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 149 ao nucleotídeo 165 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 147 ao nucleotídeo 168 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 148 ao nucleotídeo 169 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 156 ao nucleotídeo 174 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 153 ao nucleotídeo 174 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 232 ao nucleotídeo 249 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 234 ao nucleotídeo 251 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 141 ao nucleotídeo 163 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 148 ao nucleotídeo 164 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 147 ao nucleotídeo 169 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 153 ao nucleotídeo 175 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 156 ao nucleotídeo 177 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 181 ao nucleotídeo 198 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 181 ao nucleotídeo 202 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 234 ao nucleotídeo 250 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 140 ao nucleotídeo 162 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 181 ao nucleotídeo 203
[0054] d. Iniciadores que reconhecem a sequência de DNA estra- nha para uso com iniciadores que reconhecem a sequência de flan- queamento 3': - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotí- deo 30 ao nucleotídeo 49 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotí- deo 30 ao nucleotídeo 48 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotí- deo 32 ao nucleotídeo 48 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotí- deo 32 ao nucleotídeo 49 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotí- deo 31 ao nucleotídeo 49 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotí- deo 31 ao nucleotídeo 48 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotí- deo 30 ao nucleotídeo 46.
[0055] Conforme usado aqui, "a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: Z da posição X à posição Y" indica a sequência de nucleotídeo incluindo ambos os pontos terminais de nucleotídeo.
[0056] De preferência, o fragmento amplificado tem um comprimento de entre 50 e 500 nucleotídeos, mais preferivelmente de entre 100 e 350 nucleotídeos. Os iniciadores específicos podem ter uma se quência a qual é entre 80 e 100% idêntica a uma sequência dentro da região de flanqueamento 5' ou 3' do evento elite e do DNA exógeno do evento elite, respectivamente, contanto que as combinações errôneas ainda permitam identificação específica do evento elite com esses iniciadores sob condições de PCR otimizadas. A faixa de combinações errôneas permissíveis, contudo, pode ser facilmente determinada experimentalmente e é conhecida por aqueles versados na técnica.
[0057] A tabela a seguir exemplifica os tamanhos dos amplicons de DNA esperados (ou fragmentos de integração) com pares selecionados de iniciadores de PCR.
[0058] A detecção de fragmentos de integração pode ocorrer de várias formas, por exemplo, via estimativa de tamanho após análise de gel. Os fragmentos de integração podem também ser diretamente se- quenciados. Outros métodos sequência-específicos para detecção de fragmentos de DNA amplificados são também conhecidos na técnica.
[0059] Uma vez que a sequência dos iniciadores e sua localização relativa no genoma são únicas para o evento elite, amplificação do fragmento de integração ocorrerá apenas em amostras biológicas compreendendo (o ácido nucleico de) o evento elite. De preferência, quando de realização de uma PCR para identificar a presença de EE-GH5 em amostras desconhecidas, como um controle é incluído um conjunto de iniciadores com os quais um fragmento dentro de um "gene house keeping" da espécie de planta do evento pode ser amplificado. Genes "housekeeping" são genes que são expressos na maioria dos tipos de célula e os quais se referem à atividades metabólicas básicas comuns a todas as células. De preferência, o fragmento amplificado do gene "housekeeping" é um fragmento o qual é maior do que o fragmento de integração amplificado. Dependendo das amostras a serem analisadas, outros controles podem ser incluídos.
[0060] Protocolos de PCR padrões são descritos na técnica, tal como em "PCR Applications Manual" (Roche Molecular Biochemicals, 2a Edição, 1999) e outras referências. As condições ótimas para a PCR, incluindo a sequência dos iniciadores específicos, são definidas em um "protocolo de identificação por PCR" para cada evento elite. Contudo, deve ser entendido que uma série de parâmetros no protocolo de identificação por PCR podem precisar ser ajustados às condições específicas do laboratório e podem ser ligeiramente modificados para obter resultados similares. Por exemplo, uso de um método diferente para preparo de DNA pode requerer ajuste, por exemplo, da quantidade de iniciadores, polimerase e condições de anelamento usadas. Similarmente, a seleção de outros iniciadores pode orientar outras condições ótimas para o protocolo de identificação por PCR. Esses ajustes, contudo, serão evidentes para aqueles versados na técnica e são, além disso, detalhados em manuais de aplicação de PCR atuais, tais como aquele citado acima.
[0061] Alternativamente, iniciadores específicos podem ser usados para amplificar um fragmento de integração que pode ser usado como uma "sonda específica" para a identificação de EE-GH5 em amostras biológicas. Contato do ácido nucleico de uma amostra biológica com a sonda sob condições as quais permitem hibridização da sonda com seu fragmento correspondente no ácido nucleico resulta na formação de um híbrido de ácido nucleico/sonda. A formação desse híbrido pode ser detectada (por exemplo, rotulação do ácido nucleico ou sonda), pelo que a formação desse híbrido indica a presença de EE-GH5. Tais métodos de identificação baseados em hibridização com uma sonda específica (seja sobre um veículo em fase sólida ou em solução) foram descritos na técnica. A sonda específica é, de preferência, uma sequência a qual, sob condições otimizadas, se hibridiza especificamente a uma região dentro da região de flanqueamento 5' ou 3' do evento elite e, de preferência, também compreendendo parte do DNA exógeno contínuo com a mesma (aqui depois referida como "região específica"). De preferência, a sonda específica compreende uma sequência de entre 50 e 500 bp, de preferência de 100 a 350 bp, a qual é pelo menos 80%, de preferência entre 80 e 85%, mais preferivelmente entre 85 e 90%, especialmente de preferência entre 90 e 95%, mais preferivelmente entre 95% e 100% idêntica (ou complementar) a uma sequência de nucleotídeo de uma região específica. De preferência, a sonda específica compreenderá uma sequência de cerca de 15 a cerca de 100 nucleotídeos idênticos contínuos (ou complementares) a uma região específica do evento elite.
[0062] Oligonucleotídeos adequados como iniciadores de PCR para a detecção do evento elite EE-GH5 também podem ser usados para desenvolver um protocolo baseado em PCR para determinar o estado de zigosidade do evento elite. Para essa finalidade, dois iniciadores que reconhecem o locus do tipo silvestre são criados de uma forma tal que eles são dirigidos um ao outro e têm o sítio de inserção localizado entre os iniciadores. Esses iniciadores podem ser iniciadores que reconhecem especificamente as sequências de flanqueamento 5' e 3' contidas dentro de SEQ ID N°: 1 ou 2, respectivamente. Esses inicia-dores podem também ser iniciadores que reconhecem especificamente a sequência de flanqueamento 5' ou 3' (tal como um iniciador tendo as sequências de nucleotídeo de SEQ ID N°: 7 ou SEQ ID N°s: 4-6), bem como um iniciador que reconhece a região deletada durante inserção de EE-GH5 dentro do DNA de planta pré-inserção. Esse conjunto de iniciadores, junto com um terceiro iniciador complementar às sequências de DNA de transformação (tal como um iniciador tendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 3) permitem amplificação por PCR diagnóstica do locus EE-GH5-específico, bem como do locus do tipo silvestre. Se a planta é homozigótica para o locus transgênico ou o locus do tipo silvestre correspondente, a PCR diagnóstica dará origem a um único produto de PCR típico, de preferência típico quanto ao comprimento, para o locus transgênico ou do tipo silvestre. Se a planta é hemizigótica para o locus transgênico, dois produtos de PCR locus- específicos aparecerão, refletindo a amplificação do locus transgênico e do tipo silvestre.
[0063] Além disso, métodos de detecção específicos para o evento elite EE-GH5 os quais diferem dos métodos de amplificação baseados em PCR também podem ser desenvolvidos usando a informação de sequência evento elite-específica fornecida aqui. Tais métodos de detecção alternativos incluem métodos de detecção por amplificação de sinal linear baseados em clivagem invasiva de estruturas de ácido nu- cleico particulares, também conhecido como tecnologia Invader® (conforme descrito, por exemplo, nas Patentes U.S. 5.985.557 "Invasive Cleavage of Nucleic Acids", 6.001.567 "Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage, incorporada por referência). Para essa finalidade, a sequência-alvo pode ser hibridizada com um primeiro oligonucleotídeo de ácido nucleico rotulado compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 1 do nucleotídeo 99 ao nucle- otídeo 116 ou seu complemento ou a referida sonda de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucle- otídeo 23 ao nucleotídeo 40 ou seu complemento e é ainda hibridizada com um segundo oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 1 do nucleotídeo 81 ao nucle- otídeo 98 ou seu complemento ou a referida sonda de ácido nucleico marcada compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo 41 ao nucleotídeo 58 ou seu complemento, em que os primeiro e segundo oligonucleotídeos se sobrepõem em pelo menos um nucleotídeo. A estrutura dupla ou tripla a qual é produzida através dessa hibridização permite clivagem sonda-específica com uma enzima (Cleavase®), deixando a sequência-alvo intacta. A sonda marcada clivada é subsequentemente detectada, potencialmente via uma etapa intermediária que resulta em amplificação adicional de sinal.
[0064] Um "kit", conforme usado aqui, se refere a um conjunto de reagentes para fins de realização do método da invenção, mais particularmente a identificação do evento elite EE-GH5 em amostras biológicas ou a determinação do estado de zigosidade de material de planta contendo EE-GH5. Mais particularmente, uma modalidade preferida do kit da invenção compreende pelo menos um ou dois iniciadores específicos, conforme descrito acima, para identificação do evento elite ou três iniciadores específicos para a determinação do estado de zigo- sidade. Opcionalmente, o kit pode ainda compreender qualquer outro reagente descrito aqui no protocolo de identificação por PCR. Alterna-tivamente, de acordo com outra modalidade da presente invenção, o kit pode compreender uma sonda específica, conforme descrito acima, a qual hibridiza especificamente com o ácido nucleico de amostras biológicas a fim de identificar a presença de EE-GH5 nas mesmas. Opcionalmente, o kit pode compreender qualquer outro reagente (tal como, mas não limitado a, tampão de hibridização, rótulo) para a identificação de EE-GH5 em amostras biológicas usando a sonda específica.
[0065] O kit da invenção pode ser usado e seus componentes podem ser especificamente ajustados para fins de controle de qualidade (por exemplo, pureza de lotes de semente), detecção da presença ou ausência do evento elite no material da planta ou material compreendendo ou derivado de material da planta tal como, mas não limitado a, ração ou produtos alimentícios.
[0066] Conforme usado aqui, "identidade de sequência", com relação à sequências de nucleotídeo (DNA ou RNA), se refere ao número de posições com nucleotídeos idênticos dividido pelo número de nu- cleotídeos na mais curta das duas sequências. O alinhamento das duas sequências de nucleotídeo é realizado através do algoritmo de Wilbur e Lipmann (Wilbur e Lipmann, 1983, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80: 726) usando um tamanho de janela de 20 nucleotídeos, um comprimento de palavra de 4 nucleotídeo e uma penalidade por gap de 4. Análise computador-assistida e interpretação de dados de sequência, incluindo alinhamento de sequência conforme descrito acima podem, por exemplo, ser convenientemente realizadas usando o pacote de software de análise de sequência do Genetics Computer Group (GCG, University of Wisconsin Biotechnology Center). Sequências são indicadas como "essencialmente similares" quando tais sequências têm uma identidade de sequência de pelo menos cerca de 75%, particularmente pelo menos cerca de 80%, mais particularmente pelo menos cerca de 85%, muito particularmente cerca de 90%, especialmente cerca de 95%, mais especialmente cerca de 100%. É claro que, quando sequências de RNA são ditas como sendo essencialmente similares ou têm um determinado grau de identidade de sequência com sequências de DNA, timidina (T) na sequência de DNA é considerada igual à uracila (U) na sequência de RNA.
[0067] O termo "iniciador", conforme usado aqui, abrange qualquer ácido nucleico que é capaz de produzir a síntese de um ácido nucleico nascente em um processo padrão-dependente, tal como PCR. Tipicamente, iniciadores são oligonucleotídeos de 10 a 30 nucleotídeos, mas sequências mais longas podem ser empregadas. Iniciadores podem ser proporcionados na forma fita dupla, embora a forma fita simples seja preferida. Sondas podem ser usadas como iniciadores, mas são criadas para se ligar ao DNA e RNA alvo e não precisam ser usadas em um processo de amplificação.
[0068] O termo "reconhece", conforme usado aqui quando de referência a iniciadores específicos, se refere ao fato de que os iniciadores específicos se hibridizam especificamente a uma sequência de ácido nucleico no evento elite sob as condições apresentadas no método (tais como as condições do protocolo de identificação por PCR), pelo que a especificidade é determinada pela presença de controles positivos e negativos.
[0069] O termo "hibridização", conforme usado aqui quando de referência à sondas específicas, se refere ao fato de que a sonda se liga a uma região específica na sequência de ácido nucleico do evento elite sob condições de estringência padrão. Condições de estringência padrão, conforme usado aqui, se refere às condições para hibridização descritas aqui ou às condições de hibridização convencionais, conforme descrito por Sambrook e colaboradores, 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY) as quais, por exemplo, podem compreender as seguintes etapas: 1) imobilização de fragmentos de DNA genômico sobre um filtro, 2) pré-hibridização do filtro durante uma a duas horas a 42°C em formamida a 50%, 5 X SSPE, 2 X reagente de Denhardt e SDS a 0,1% ou durante 1 a 2 horas a 68°C em 6 X SSC, 2 X reage nte de Denhardt e SDS a 0,1%, 3) adição da sonda de hibridização a qual tenha sido marcada, 4) incubação durante 16 a 24 horas, 5) lavagem do filtro du-rante 20 min. em temperatura ambiente em 1X SSC, SDS a 0,1%, 6) lavagem do filtro três vezes durante 20 min., cada uma a 68°C em 0,2 X SSC, SDS a 0,1% e 7) exposição do filtro, durante 24 a 48 horas, a um filme de raio X a -70°C com uma tela de intensif icação.
[0070] Conforme usado aqui, uma amostra biológica é uma amostra de uma planta, material de planta ou produtos compreendendo material de planta. O termo "planta" se destina a abranger tecidos de planta de algodão (Gossypium hirsutum) em qualquer estágio de maturidade, bem como quaisquer células, tecidos ou órgãos tomados de ou derivados de qualquer uma de tais plantas incluindo, sem limitação, quaisquer sementes, folhas, caules, flores, raízes, células simples, gametas, culturas de célula, culturas teciduais ou protoplastas. "Material de planta", conforme usado aqui, se refere a um material o qual é obtido ou derivado de uma planta. Produtos compreendendo material de planta se refere a alimento, ração ou outros produtos os quais são produzidos usando material de planta ou podem estar contaminados pelo material de planta. Deve ser entendido que, no contexto da presente invenção, tais amostras biológicas são testadas quanto à presença de ácidos nucleicos específicos para EE-GH5, implicando na presença de ácidos nucleicos nas amostras. Assim, os métodos mencionados aqui para a identificação do evento elite EE-GH5 em amostras biológicas se referem à identificação, em amostras biológicas, de ácidos nucleicos os quais compreendem o evento elite.
[0071] Conforme usado aqui, "compreendendo" deve ser interpretado como especificando a presença das características, inteiros, etapas, reagentes ou componentes estabelecidos conforme mencionado, mas não exclui a presença ou adição de uma ou mais características, inteiros, etapas ou componentes ou grupos dos mesmos. Assim, por exemplo, um ácido nucleico ou proteína compreendendo uma sequência de nucleotídeo ou aminoácido pode compreender mais nucleotídeos ou aminoácidos do que aqueles realmente citados, isto é, estar incrustada em um ácido nucleico ou proteína maior. Um gene quimérico compreendendo uma sequência de DNA a qual é funcional ou estruturalmente definida pode compreender sequências de DNA adicionais, etc.
[0072] A presente invenção também se refere ao desenvolvimento de um evento elite EE-GH5 em algodão em plantas compreendendo esse evento, à prole obtida a partir dessas plantas e à células de planta ou material de planta derivado desse evento. Plantas compreendendo o evento elite EE-GH5 foram obtidas conforme descrito no Exemplo 1.
[0073] Plantas de algodão ou material de planta compreendendo EE-GH5 podem ser identificadas de acordo com o protocolo de identificação por PCR para EE-GH5 no Exemplo 2. Resumidamente, DNA genômico de algodão presente na amostra biológica é amplificado através de PCR usando um iniciador o qual reconhece especificamente uma sequência dentro da sequência de flanqueamento 5' ou 3' de EE-GH5, tal como o iniciador com a sequência de SEQ ID N°: 6 e um iniciador o qual reconhece uma sequência no DNA exógeno, tal como o iniciador com a sequência de SEQ ID N°: 3. Iniciadores de DNA os quais amplificam parte de uma sequência de algodão endógena são usados como controle positivo para a amplificação por PCR. Se, quando de amplificação por PCR, o material proporciona um fragmento de tamanho esperado, o material contém material de planta de uma planta de algodão trazendo o evento elite EE-GH5.
[0074] Plantas trazendo EE-GH5 são caracterizadas por sua resistência a insetos, bem como por sua tolerância ao glufosinato. Plantas trazendo EE-GH5 são também caracterizadas por terem características agronômicas que são comparáveis com as variedades comercialmente disponíveis de algodão nos EU, na ausência de pressão por inseto. Foi observado que a presença de um DNA exógeno na região de inserção do genoma da planta de algodão descrita aqui confere características moleculares e fenotípicas particularmente interessantes às plantas compreendendo esse evento.
[0075] Os exemplos a seguir descrevem a identificação do evento elite EE-GH5 e o desenvolvimento de ferramentas para a identificação específica do evento elite EE-GH5 em amostras biológicas.
[0076] A menos que de outro modo estabelecido nos exemplos, todas as técnicas recombinantes são realizadas de acordo com protocolos padrões, conforme descrito em "Sambrook J e Russell DW (eds.) (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York" e em "Ausubel FA, Brent R, King-ston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA e Struhl K (eds.) (2006) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York".
[0077] Os materiais padrões e referências são descritos em "Croy RDD (ed.) (1993) Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publishers Ltda., Oxford and Blackwell Scientific Publications, Oxford" e em "Brown TA, (1998) Molecular Biology LabFax, 2a Edição, Academic Press, San Diego". Materiais padrões e métodos para reações em cadeia de polimerase (PCR) podem ser encontrados em "McPherson MJ e M0ller SG (2000) PCR (The Basics), BIOS Scientific Publishers Ltda., Oxford" e em "PCR Applications Manual, 3a Edição (2006), Roche Diagnostics GmbH, Mannheim ou www.roche-applied- science.com"
[0078] Na descrição e exemplos, referência é feita às seguintes sequências:
[0079] Sequência de nucleotídeo compreendendo uma região de flanqueamento 5' de EE-GH5
[0080] SEQ ID N°: 2: Sequência de nucleotídeo compreendendo uma região de flanqueamento 3' de EE-GH5
[0081] SEQ ID N°: 3: iniciador GHI057
[0082] SEQ ID N°: 4: iniciador MAE115
[0083] SEQ ID N°: 5: iniciador HVH022
[0084] SEQ ID N°: 6: iniciador GHI065
[0085] SEQ ID N°: 7: iniciador HVH024
[0086] SEQ ID N°: 8: iniciador DPA312
[0087] SEQ ID N°: 9: iniciador GHI066
[0088] SEQ ID N°: 10: iniciador GHI047
[0089] SEQ ID N°: 11: iniciador GHI048
[0090] SEQ ID N°: 12: Sequência de nucleotídeo do fragmento amplificado a partir de DNA de algodão compreendendo EE-GH5 usando GHI047 e GHI048
[0091] SEQ ID N°: 13: iniciador 1 para amplificação de fragmento de controle
[0092] SEQ ID N°: 14: iniciador 2 para amplificação do fragmento de controle
[0093] SEQ ID N°: 15: Sequência de nucleotídeo compreendendo uma região de flanqueamento 5' de EE-GH5 (longa)
[0094] SEQ ID N°: 17: iniciador HVH036
[0095] SEQ ID N°: 18: iniciador SHA028
[0096] SEQ ID N°: 19: iniciador MAE067
[0097] Algodão resistente a inseto foi desenvolvido através de transformação de algodão com um vetor compreendendo a sequência de codificação de um gene cry1ab modificado sob o controle de um promotor S7 do vírus do retardamento do crescimento do Trevo Sub-terrâneo.
[0098] O evento elite EE-GH5 foi selecionado baseado em um procedimento de seleção extensivo baseado em boa expressão e estabilidade do gene de resistência a inseto e sua compatibilidade com características agronômicas ótimas, tais como altura da planta, altura do nódulo, retenção de botão floral, capacidade de sustentação, vigor, comprimento da fibra, resistência da fibra e rendimento de fio, foi avaliada.
[0099] O evento selecionado foi introduzido em diferentes bases genéticas comerciais e os resultados de experimentos no campo em diferentes locais foram comparados. As plantas foram estimuladas com pestes de inseto usando diferentes tratamentos. As plantas exibi-ram bom controle de insetos.
[00100] Além disso, o evento tinha folha, flor e morfologia de botão floral normais, excelente fertilidade e não mostrou suscetibilidade à doença ou inseto anormal em múltiplas bases genéticas. Durante in- trogressão em múltiplas bases genéticas, nenhum problema anormal ou anormalidade foi observada.
[00101] A sequência das regiões de flanqueamento do DNA exógeno no evento elite EE-GH5 foi determinada usando o método de PCR integrada assimétrica térmica (TAIL) descrito por Liu e colaboradores (1995, Plant J. 8(3): 457-463) onde possível. Esse método utiliza três iniciadores agrupados em reações sucessivas junto com um iniciador degenerado mais curto arbitrário, de modo que as eficiências relativas de amplificação de produtos específicos e não específicos podem ser termica- mente controladas. Os iniciadores específicos foram selecionados para anelamento à borda do DNA exógeno e baseado em suas condições de anelamento. Uma pequena quantidade (5 μ l) de produtos de PCR não- purificado, secundário e terciário foi analisada sobre um gel de agarose a 1%. O produto de PCR terciário foi purificado e sequenciado.
[00102] O fragmento identificado como compreendendo a região de flanqueamento 5' foi sequenciado (SEQ ID N°: 1). A sequência entre o nucleotídeo 1 e 98 corresponde ao DNA da planta, enquanto que a sequência entre o nucleotídeo 99 e 334 corresponde ao DNA exógeno. Um fragmento mais longo compreendendo a região de flan- queamento 5' também foi sequenciado (SEQ ID N°: 16). A sequência entre o nucleotídeo 1 e 563 corresponde ao DNA da planta, enquanto que a sequência entre o nucleotídeo 564 e 799 corresponde ao DNA exógeno.
[00103] O fragmento identificado como compreendendo a região de flanqueamento 3' obtido através do método de TAIL-PCR foi sequenci- ado (SEQ ID N°: 2). A sequência entre o nucleotídeo 1 e 40 corresponde ao DNA exógeno, enquanto que a sequência entre o nucleotí- deo 41 e 452 corresponde ao DNA da planta.
[00104] A sequência de nucleotídeo da região compreendendo a reestruturação EE-GH5-específica no DNA exógeno foi identificada (SEQ ID N°: 12). A região entre as posições de nucleotídeo 52 e 88 era identifica àquela que está sendo reestruturada quando comparado com o DNA exógeno usado para obter transformantes a partir dos quais o evento elite EE-GH5 foi selecionado.
[00105] Iniciadores específicos foram desenvolvidos, os quais reconhecem sequências dentro do evento elite.
[00106] Mais particularmente, dois iniciadores foram desenvolvidos os quais reconhecem sequências de flanqueamento da re-estruturação EE-GH5-específica no DNA exógeno. Os iniciadores abrangem uma sequência de cerca de 262 bp. Descobriu-se que os seguintes iniciadores proporcionam resultados particularmente claros e reproduzíveis em uma reação de PCR sobre DNA de EE-GH5: GHI047: 5'-TgC.CTC.TTg.AAC.TgT.AgC-3‘ (SEQ ID N°: 10) GHI048: 5'-ACT.TgC.AgT.TgC.TgA.TgA.Tg-3'(SEQ ID N°: 11)
[00107] Alternativamente, um iniciador foi desenvolvido o qual reconhece uma sequência dentro da região de flanqueamento 5' de EE- GH5. Um segundo iniciador foi, então, selecionado dentro da sequência do DNA exógeno, de modo que os iniciadores abrangem uma sequência de cerca de 369 nucleotídeos. Descobriu-se que os seguintes iniciadores proporcionam resultados particularmente claros e reproduzíveis em uma reação de PCR sobre DNA de EE-GH5: GHI065: 5'- ggg.CCg.gAT.AAA.ATT.AgC.CT-3' (SEQ ID N°: 6) (alvo: DNA de planta) GHI057: 5' - ATA.gCg.CgC.AAA.CTA.ggA-3' (SEQ ID N°: 3) (alvo: inserto de DNA)
[00108] Iniciadores que objetivam uma sequência endógena são, de preferência, incluídos no coquetel de PCR. Esses iniciadores servem como um controle interno em amostras desconhecidas e no controle de DNA positivo. Um resultado positivo com o par de iniciador endógeno demonstra que há DNA de amostra de qualidade adequada no preparado de DNA genômico para que um produto de PCR seja gerado. Os iniciadores endógenos foram selecionados para reconhecer um gene "housekeeping" em algodão: GHI001:5'-AAC.CTA.ggC.TgC.TgA.Agg.AgC-3' (SEQ ID N°: 13) GHI002: 5'-CAA.CTC.CTC.CAg.TCA.TCT.CCg-3' (SEQ ID N°: 14)
[00109] Os fragmentos amplificados esperados na reação de PCR são:
[00110] Para o par de iniciador GHI001-GHI002: 445 bp (contro le endógeno)
[00111] Para o par de iniciador GHI047-GHI048: 262 bp (evento elite EE-GH5)
[00112] Para o par de iniciador GHI057-GHI065: 369 bp (evento elite EE-GH5) DNA-padrão
[00113] DNA-padrão foi preparado a partir de um macerado de folhas de acordo com Edwards e colaboradores (Nucleic Acid Research, 19, página 1349, 1991). Quando usando DNA preparado com outros métodos, um teste realizado utilizando diferentes quantidades de padrão deverá ser feito. Usualmente, 50 ng de DNA genômico padrão proporciona os melhores resultados.
[00114] Para evitar falsos positivos ou negativos, é aconselhável que os seguintes controles positivos e negativos sejam incluídos em uma operação de PCR: - Controle de Mistura Mestre (controle negativo de DNA). Essa é uma PCR na qual nenhum DNA é adicionado à reação. Quando o esperado resulta, nenhum produto de PCR é observado, isso indicando que o coquetel de PCR não foi contaminado com DNA-alvo. - Um controle de DNA positivo (amostra de DNA genômico conhecida por conter as sequências transgênicas). Amplificação com sucesso desse controle positivo demonstra que a PCR foi realizada sob condições as quais permitem a amplificação de sequências-alvo. - Um controle de DNA do tipo silvestre. Essa é uma PCR na qual o DNA-padrão fornecido é DNA genômico preparado a partir de uma planta não-transgênica. Quando o esperado resulta, nenhuma amplificação de um produto de PCR transgênico, mas amplificação do produto de PCR endógeno é observada, isso indica que não há ampli-ficação de base do transgene detectável em uma amostra de DNA ge- nômico.
[00115] Resultados ótimos foram obtidos sob as seguintes condições:
[00116] - a mistura de PCR para reações de 25 μ l contém: x μ l de DNA-padrão (150 ng) 2,5 μ l de 10x Tampão de amplificação (fornecido pelo fabricante com a Taq polimerase) 0,5 μl de dNTP's a 10 mM 0,4 μl de GHI001 (10 pmoles/μ l) 0,4 μl de GHI002 (10 pmoles/μ l) 0,7 μl de GHI047 (10 pmoles/μ l) ou GHI057 (protocolo de PCR 2) 0,7 μl de GHI048 (10 pmoles/μ l) ou GHI065 (protocolo de PCR 2) 0,1 μ l de Taq DNA polimerase (5 unidades/μ l) água até 25 μ l
[00117] - o perfil de termociclização a ser seguido para resultados ótimos é o seguinte: 4 min. a 95°C
[00118] Seguido por: 1 min. a 95°C 1 min. a 57°C 2 min. a 72°C Durante 5 ciclos
[00119] Seguido por: 30 seg. a 92°C 30 seg. a 57°C 1 min. a 72°C Durante 25 ciclos
[00120] Seguido por: 10 minutos a 72°C
[00121] Para visualizar otimamente os resultados da PCR, foi determinado que entre 10 e 20 μ l das amostras de PCR deverão ser aplicados sobre um gel de agarose a 1,5% (tampão de Tris-borato) com um padrão de peso molecular apropriado (por exemplo, padrão de PM de 100 bp, PHARMACIA).
[00122] Foi determinado que dados de amostras de DNA de planta transgênica dentro de uma única operação de PCR e um único coquetel de PCR não serão aceitáveis, a menos que: 1) o controle de DNA positivo mostre os produtos de PCR esperados (fragmentos transgêni- co e endógeno), 2) o controle de DNA negativo seja negativo para amplificação por PCR (sem fragmentos) e 3) o controle de DNA do tipo silvestre mostre o resultado esperado (amplificação de fragmento endógeno).
[00123] Quando seguindo o protocolo de identificação de EE-GH5 por PCR conforme descrito acima, fileiras mostrando quantidades visíveis dos produtos de PCR transgênico e endógeno dos tamanhos esperados indicam que a planta correspondente da qual o DNA genômi- co padrão foi preparado herdou o evento elite EE-GH5. Fileiras não mostrando quantidades visíveis dos produtos de PCR transgênicos e mostrando quantidades visíveis do produto de PCR endógeno indicam que a planta correspondente da qual o DNA genômico padrão foi preparado não compreende o evento elite. Fileiras não mostrando quantidades visíveis dos produtos de PCR endógeno e transgênico indicam que a qualidade e/ou quantidade do DNA genômico não permite que um produto de PCR seja gerado. Essas plantas não podem ser classificadas. O preparo de DNA genômico deverá ser repetido e uma nova operação de PCR, com os controles apropriados, tem de ser feita.
[00124] Antes de tentar selecionar desconhecidos, uma operação de teste, com todos os controles apropriados, tem de ser realizada. O protocolo desenvolvido poderia requerer otimização de componentes que podem diferir entre laboratórios (preparo de DNA-padrão, Taq DNA polimerase, qualidade dos iniciadores, dNTP's, termociclizador, etc.).
[00125] Amplificação da sequência endógena exerce um papel- chave no protocolo. Deve-se tentar obter condições de PCR e termoci- clização que amplificam quantidades equimolares da sequência endógena e transgênica em um DNA genômico padrão transgênico conhecido. Toda vez que o fragmento endógeno não é amplificado ou toda vez que as sequências-alvo não são amplificadas com as mesmas intensidades de coloração com brometo de etídio, conforme julgado através de eletroforese em gel de agarose, otimização das condições de PCR pode ser requerida.
[00126] Material de folha de uma série de plantas de algodão, algumas das quais compreendendo EE-GH5, foi testado de acordo com o protocolo descrito acima. Amostras do evento elite EE-GH5 e do algodão do tipo silvestre foram tomadas como controles positivo e negativo, respectivamente.
[00127] A Figura 2 ilustra o resultado obtido com o protocolo de identificação de evento elite por PCR para EE-GH5 sobre uma série de amostras de planta de algodão. Descobriu-se que as amostras nas fileiras 2 a 3 contêm o evento elite, uma vez que a banda de 305 bp é detectada, enquanto que as amostras nas fileiras 4 a 10 não compreendem EE-GH5. As fileiras 4 e 10 compreendem outros eventos de elite de algodão (incluindo plantas compreendendo diferentes genes quiméricos de tolerância a inseto); a fileira 11 representa a amostra de controle negativo (água) e as fileiras 1 e 12 representam o Padrão de Peso Molecular (padrão de PMde 100 bp).
[00128] Uso de um fragmento de integração específica como uma sonda para detecção de material compreendendo EE-GH5
[00129] Um fragmento de integração específico de EE-GH5 é obtido através de amplificação por PCR usando iniciadores específicos GHI047 (SEQ ID N°: 10) e GHI048 (SEQ ID N°: 11) ou através de síntese química e é rotulado. Esse fragmento de integração é usado co- mo uma sonda específica para a detecção de EE-GH5 em amostras biológicas. Ácido nucleico é extraído das amostras de acordo com procedimentos padrões. Esse ácido nucleico é, então, contato com a sonda específica sob condições de hibridização as quais são otimizadas para permitir a formação de um híbrido. A formação do híbrido é, então, detectada para indicar a presença de ácido nucleico de EE-GH5 na amostra. Opcionalmente, o ácido nucleico nas amostras é amplificado usando os iniciadores específicos antes de contato com a sonda específica. Alternativamente, o ácido nucleico é rotulado antes de contato com a sonda específica ao invés do fragmento de integração. Opcionalmente, a sonda específica é presa a um veículo sólido (tal como, mas não limitado a, um filtro, tira ou glóbulos) antes de contato com as amostras.
[00130] Dois iniciadores que reconhecem as sequências de nucleo- tídeo do locus do tipo silvestre antes de inserção do evento elite foram criados de uma forma tal que eles são dirigidos um ao outro e têm um sítio de inserção entre si. Esse conjunto de iniciadores, junto com um terceiro iniciador complementar à sequências de DNA exógeno e dirigido contra o DNA de flanqueamento permite amplificação por PCR simultânea do locus de EE-GH5, bem como do locus do tipo silvestre.
[00131] Descobriu-se que os seguintes iniciadores proporcionam resultados particularmente claros e reproduzíveis em uma reação de PCR para classificação de zigosidade sobre DNA de EE-GH5: GHI066 5'- AgA.TAA.AAT.CgT.CAg.TgC.Tg-3' (SEQ ID N°: 9)
[00132] (alvo: DNA de planta a montante da sequência de flanque- amento 5') GHI057 5' - ATA.gCg.CgC.AAA.CTA.ggA-3' (SEQ ID N°: 3)
[00133] (alvo: inserto de DNA) GHI065 5'- ggg.CCg.gAT.AAA.ATT.AgC.CT-3' (SEQ ID N°: 6)
[00134] (alvo: DNA de planta da sequência de flanqueamento 3')
[00135] Os fragmentos amplificados esperados na reação de PCR são:
[00136] Para o par de iniciador GHI065 - GHI066: 517 bp (locus do tipo silvestre)
[00137] Para o par de iniciador GHI057 - GHI065: 369 bp (locus de EE-GH5)
[00138] DNA-padrão foi preparado a partir de um macerado de folhas de acordo com Edwards e colaboradores (Nucleic Acid Research, 19, página 1349, 1991). Quando usando DNA preparado com outros métodos, um teste realizado utilizando diferentes quantidades de padrão deverá ser feito. Usualmente, 50 ng de DNA genômico padrão proporciona os melhores resultados.
[00139] Para evitar falsos positivos ou negativos, é aconselhável que os seguintes controles positivos e negativos sejam incluídos em uma operação de PCR: - Controle de Mistura Mestre (controle negativo de DNA). Essa é uma PCR na qual nenhum DNA é adicionado à reação. Quando o esperado resulta, nenhum produto de PCR é observado, isso indicando que o coquetel de PCR não foi contaminado com DNA-alvo. - Um controle de DNA positivo (amostra de DNA genômi- co conhecida por conter as sequências transgênicas). Amplificação com sucesso desse controle positivo demonstra que a PCR foi realizada sob condições as quais permitem a amplificação de sequências-alvo. - Um controle de DNA do tipo silvestre. Essa é uma PCR na qual o DNA-padrão fornecido é DNA genômico preparado a partir de uma planta não-transgênica. Quando o esperado resulta, nenhuma amplificação de um produto de PCR transgênico, mas amplificação do produto de PCR endógeno é observada, isso indica que não há ampli-ficação de base do transgene detectável em uma amostra de DNA ge- nômico.
[00140] Resultados ótimos foram obtidos sob as seguintes condições:
[00141] - a mistura de PCR para reações de 25 μ l contém: x μ l de DNA-padrão (150 ng) 2,5 μ l de 10x Tampão de amplificação (fornecido pelo fabricante com a Taq polimerase) 0,5 μl de dNTP's a 10 mM 1,5 μl de GHI053 (10 pmoles/μ l) 1,0 μl de GHI054 (10 pmoles/μ l) 0,5 μl de GHI041 (10 pmoles/μ l) 0,1 μ l de Taq DNA polimerase (5 unidades/μ l) água até 25 μ l
[00142] - o perfil de termociclização a ser seguido para resultados ótimos é o seguinte: 4 min. a 95°C
[00143] Seguido por: 1 min. a 95°C 1 min. a 57°C 2 min. a 72°C Durante 5 ciclos
[00144] Seguido por: 30 seg. a 92°C 30 seg. a 57°C 1 min. a 72°C Durante 25 ciclos
[00145] Seguido por: 10 minutos a 72°C
[00146] Para visualizar otimamente os resultados da PCR, foi determinado que entre 10 e 20 μ l das amostras de PCR deverão ser aplicados sobre um gel de agarose a 1,5% (tampão de Tris-borato) com um padrão de peso molecular apropriado (por exemplo, padrão de PM de 100 bp, PHARMACIA).
[00147] Dados de amostras de DNA da planta transgênica dentro de uma única operação de PCR e uma única Mistura Mestre para PCR não serão aceitáveis, a menos que: - o controle positivo mostre os produtos de PCR esperados (amplificação de alvo transgênico) - o controle de DNA positivo do tipo silvestre mostre o resultado esperado (amplificação de alvo do tipo silvestre) - o controle negativo seja negativo para amplificação por PCR (sem fragmentos).
[00148] Fileiras mostrando quantidades visíveis do produto de PCR transgênico do tamanho esperado e não mostrando quantidades visíveis do produto de PCR do tipo silvestre indicam que a planta correspondente a partir da qual o DNA genômico padrão foi preparado é ho- mozigótica para o cassete do gene transgênico.
[00149] Fileiras mostrando quantidades visíveis dos produtos de PCR transgênico e do tipo silvestre dos tamanhos esperados indicam que a planta correspondente a partir da qual o DNA genômico padrão foi preparado é hemizigótico para o cassete do gene transgênico. Fileiras não mostrando quantidades visíveis do produto de PCR transgêni- co e mostrando quantidades visíveis do produto de PCR do tipo silvestre indicam que a planta correspondente a partir da qual o DNA genô- mico padrão foi preparado não herdou a sequência transgênica ensaiada e, assim, é homozigótica para o locus do tipo silvestre.
[00150] Fileiras não mostrando quantidades visíveis de produtos de PCR transgênico e do tipo silvestre indicam que a quantidade e/ou qualidade do DNA genômico não permite que um produto de PCR seja gerado. Essas plantas não podem ser classificadas. O preparo de DNA genômico deverá ser repetido e uma nova operação de PCR, com os controles apropriados, tem de ser realizada.
[00151] Uso do protocolo de classificação de zigosidade para a identificação do estado de zigosidade em plantas contendo EE-GH5
[00152] A figura 3 ilustra o resultado obtido com a PCR de classificação de zigosidade para EE-GH5 sobre uma série de amostras de planta de algodão. Descobriu-se que as amostras nas fileiras 2-3 e 6-7 contêm o fragmento de PCR (369 bp) característico para o evento elite EE-GH5, enquanto que as amostras nas fileiras 2, 3 e 5 continham o fragmento característico da presença do locus do tipo silvestre. As fileiras 6 e 7, portanto, contêm EE-GH5 na forma homozigótica, as fileiras 2 e 3 contêm EE-GH5 na forma hemizigótica e a fileira 5 contém o locus do tipo silvestre na forma homozigótica (azigótica para EE-GH5). A fileira 8 representa a amostra de controle negativo (água) e as fileiras 1 e 9 representam o Padrão de Peso Molecular (padrão de PM de 100 bp).
[00153] O evento elite EE-GH5 é introduzido através de recruza- mento repetido em cultivares comerciais tais como, mas não limitado a, FM5013, FM5015, FM5017, FM989, FM832, FM966 e FM958, FM989, FM958, FM832, FM991, FM819, FM800, FM960, FM966, FM981, FM5035, FM5044, FM5045, FM5013, FM5015, FM5017 ou FM5024.
[00154] É observado que a introgressão do evento elite nesses cul- tivares não influência significativamente qualquer uma das características fenotípicas ou agronômicas desejáveis desses cultivares (nenhum obstáculo à ligação), ao mesmo tempo em que expressão do transgene, conforme determinado pela tolerância ao glufosinato, vai de encontro a níveis comercialmente aceitáveis. Isso confirma o estado do evento EE-GH5 como um evento elite.
[00155] O evento elite pode ser, vantajosamente, combinado com outros eventos de elite disponíveis no mercado, particularmente outro evento elite de gene de resistência a inseto, para fins de gerenciamento de resistência a inseto tais como, mas não limitado a, o evento 3006-210-23; (USDA aphis petition 03-036-02p), evento 281-24-236 (USDA aphis petition 03-036-01p); evento MON158985 (USDA aphis petition 00-342-01p); evento MON531 (USDA aphis petition 94-30801p) ou evento COT102 (=Syngenta vip3A) USDA aphis petition 03155-01p. O evento elite EE_GH5 também pode ser combinado com eventos de tolerância a herbicida, tais como o evento MON1445 (USDA aphis petition 95-045-01p) ou evento MON88913 (USDA aphis petittion 04-086-01p).
[00156] Semente de referência compreendendo o evento elite EE- GH5 foi depositada como EE-GH5 na ATCC (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209) em 22 de Janeiro de 2007 sob número de acesso ATCC PTA-8171. Um nome alternativo para EE-GH5 é T304- 40.
[00157] Conforme usado nas reivindicações abaixo, a menos que de outro modo indicado, o termo "planta" se destina a abranger tecidos de planta, em qualquer estágio de maturidade, bem como quaisquer células, tecidos ou órgãos tomados de ou derivados de qualquer uma de tais plantas incluindo, sem limitação, quaisquer sementes, folhas, caules, flores, raízes, células simples, gametas, culturas de célula, culturas teciduais ou protoplastas.
[00158] A descrição acima da invenção se destina a ser ilustrativa e não limitativa.
[00159] Várias alterações e modificações nas modalidades descritas podem ocorrer para aqueles versados na técnica. Essas podem ser feitas sem se desviar do espírito ou escopo da invenção. TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICRO-ORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE PATENTES FORMULÁRIO INTERNACIONAL RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO ORIGINAL EMITIDO POR FORÇA DA REGRA 7.1 E DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE EMITIDA POR FORÇA DA REGRA 10.2 To: (Nome e endereço do Depositante ou Procurador) Bayer BioScience ATTN: Jan Desomer Technologiepark 38-BE-9050 Gent, Belgium Depositado em nome de: Bayer BioScience N.V. Referência de Identificação do Depositante: Vetor: derivado de E. coli: EE-GH5 Designação de Depósito de Patente: PTA-8171 O depósito foi acompanhado pelo: X descrição científica uma des crição taxonômica proposta indicada acima. O depósito foi recebido em 22 de JANEIRO de 2007, através desta Autoridade Internacional Depositária e foi aceito. A seu pedido: X Nós vamos informá-lo sobre o pedido para a linhagem durante 30 anos. A linhagem será disponibilizada se um escritório de patente signatário do Tratado de Budapeste certificar o direito do solicitante, ou se uma patente americana concedida citar a linhagem, e ATCC® for instruído pelo Escritório Americano de Marcas e Patentes (UPTO) ou pelo depositante a liberar a dita linhagem. Se o material depositado morrer ou for destruído durante a vigência efetiva da patente, deverá ser sua responsabilidade substituir o mesmo por material viável. A linhagem será mantida por um período de no mínimo 30 anos a contar da data do depósito, ou 5 anos subsequentes ao pedido mais recente para depósito, o que for mais longo. Os estados Unidos e muitos outros países são signatários do Tratado de Budapest. A viabilidade da cultura citada acima foi testada em 12 de fevereiro de 2007. Nesta data, a cultura foi considerada viável. Autoridade Internacional Depositária: American Type Culture Collection, Manassas, VA 20110-2209, USA Assinatura da pessoa responsável para representar o ATCC®: _____________________ Data: 20 de Fevereiro de 2007 Dee Bishop, Depositório de Patente ATCC (Ref: Docket ou Case#: BCS 06-2011)
Claims (4)
1. DNA genômico de algodão, caracterizado pelo fato de que compreende um evento elite, o referido evento elite compreendendo: (a) DNA exógeno compreendendo a sequência de SEQ ID No. 20, o referido DNA exógeno compreendendo a sequência codificante de um gene cry1Ab modificado sob o controle de um promotor S7 do vírus do retardamento do crescimento do Trevo Subterrâneo; (b) SEQ ID NO: 12 no DNA exógeno; (c) SEQ ID NO: 16, nucleotídeos 1-563 estando imediatamente a montante de e contíguos ao referido DNA exógeno, e nucleotídeos 564-700 de SEQ ID NO: 16 sendo DNA exógeno; e (d) SEQ ID NO: 2, nucleotídeos 41-452 estando imediatamente a jusante de e contíguos ao referido DNA exógeno, e nucleotídeos 1-40 de SEQ ID NO: 2 sendo DNA exógeno; em que o referido evento elite é compreendido na semente de referência que foi depositada no ATCC sob número de depósito PTA-8171.
2. DNA genômico, caracterizado pelo fato de que é produzido a partir de uma planta de algodão, célula de planta ou semente, que compreende o evento elite, como definido na reivindicação 1.
3. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que compreende um evento elite, o referido evento elite compreendendo: (a) DNA exógeno compreendendo a sequência da SEQ ID No. 20, o referido DNA exógeno compreendendo a sequência codificante de um gene cry1Ab modificado sob o controle de um promotor S7 do vírus do retardamento do crescimento do Trevo Subterrâneo; (b) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12 no DNA exógeno; (c) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 16, nucleotídeos 1-563 estando imediatamente a montante de e contíguos ao referido DNA exógeno, e nucleotídeos 564-700 de SEQ ID NO: 16 sendo DNA exógeno; e (d) a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 1-98 estando imediatamente a montante de e contíguos ao referido DNA exógeno, e nucleotídeos 99-334 de SEQ ID NO: 1 sendo DNA exógeno; e (e) a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2, nucleotídeos 41-452 estando imediatamente a jusante de e contíguos ao referido DNA exógeno, e nucleotídeos 1-40 de SEQ ID NO: 2 sendo DNA exógeno; em que o referido evento elite pode ser obtido a partir de sementes de algodão que foram depositadas no ATCC sob número de depósito PTA-8171.
4. Fragmento de ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende um evento elite, o referido evento elite compreendendo: (a) DNA exógeno compreendendo a sequência da SEQ ID No. 20, o referido DNA exógeno compreendendo a sequência codificante de um gene cry1Ab modificado sob o controle de um promotor S7 do vírus do retardamento do crescimento do Trevo Subterrâneo; (b) a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 12 no DNA exógeno; (c) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 16, nucleotídeos 1-563 estando imediatamente a montante de e contíguos ao referido DNA exógeno, e nucleotídeos 564-700 de SEQ ID NO: 16 sendo DNA exógeno; e (d) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 1-98 estando imediatamente a montante de e contíguos ao referido DNA exógeno, e nucleotídeos 99-334 de SEQ ID NO: 1 sendo DNA exógeno; e (e) a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2, nucleotídeos 41-452 estando imediatamente a jusante de e contíguos ao referido DNA exógeno, e nucleotídeos 1-40 de SEQ ID NO: 2 sendo DNA exógeno; em que o referido evento elite pode ser obtido a partir de sementes de algodão que foram depositadas no ATCC sob número de depósito PTA-8171.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP07075263.9 | 2007-04-05 | ||
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