CN103403185A - 测定整装样品中的接合性的方法 - Google Patents

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Abstract

测定核酸中特定插入位点处插入的核苷酸序列的存在或缺乏的方法包括：从整装组织样品分离核酸；使所述核酸与正向引物、第一反向引物和第二反向引物接触，所述正向引物能够结合所述插入位点上游的核酸，所述第一反向引物对插入的核苷酸序列是特异性的，所述第二反向引物能够结合插入位点下游的核酸。可以使用所述引物以再生所述引物间的核酸。可以分析再生的核酸以测定插入的核苷酸序列在所述样品中存在与否。

Description

测定整装样品中的接合性的方法
优先权要求
本申请要求2010年12月29日提交的关于“Methods to Determine Zygosityin a Bulked Sample”的美国临时专利申请流水号No.61/428,142的提交日(filing date)权益。
发明背景
完成系(finished line)中任何污染的质量控制测试对于成功的杂种种子生产及与客户维持和建立良好的商业关系是非常重要的。完成系的种子增加期间的污染可以来自生产位置附近或种子加工期间种植的非有意转基因或非转基因植物的传粉，且更重要地，由于自不育植物的花粉泄漏所致的污染。为了确保完成系是完全纯合的且没有任何半合子的、空的或非有意的转基因系，目前遵循测试者行(tester-row)法。测试者行法利用ELISA技术，基于以个体植物为基础的蛋白质水平评估接合性状态。由于该测定法基于单一植物基础，它是非常费时及昂贵的。另外，在田间实施测试者行法有额外的成本。ELISA方法可用于通过检测蛋白质水平检测转基因表达的沉默。它对于检测完成种子批次中的任何半合子的、空的或任何其它非有意的污染是不灵敏且强力的。另外，在使用ELISA法时，需要分开的组织取样来进行偶发存在测试。
发明概述
本发明的具体实施方案包括测定核酸中特定插入位点处插入的核苷酸序列的存在或缺乏的方法，实施方案可以包括：从整装样品(bulked sample)分离核酸；使所述核酸与正向引物和反向引物接触，所述正向引物能够结合所述插入位点上游的核酸，所述反向引物能够结合所述插入位点下游的核酸。可以使用所述引物以再生所述引物间的核酸。可以分析再生的核酸以测定插入的核苷酸序列在整装样品中存在与否。
实施方案可以包括：从所述样品分离核酸；使核酸与正向引物和反向引物接触，所述正向引物能够结合所述插入位点上游的核酸，所述反向引物能够结合所述插入位点下游的核酸。可以使用所述引物以再生所述核酸的第一部分和第二部分中的引物间的核酸。可以分析再生的结果以测定插入的核苷酸序列在所述样品中存在与否。可以使用检测内源基因或序列的正向引物和反向引物实施与上述反应形成多重或作为单重的第二反应。此第二反应可以作为内部对照使用以测定使用的DNA和/或PCR条件的质量和数量。
附图简述
图1A是依照本发明的一个实施方案的供测定特定插入位点处插入的核苷酸序列的存在或缺乏的方法用的元件的示意图。其中，可能插入的核苷酸序列(110)以黑色块表示，而周围的基因组(120)以空心区段指示。还描绘了正向引物(130)、第一反向引物(140)、和第二反向引物(150)。进一步呈现了任选的插入物特异性探针(160)和野生型特异性探针(170)。
图1B显示了一种修改的测定法，其包括将标准的接合性方案转变为两个分开的反应：反应1，其包含共同引物、和野生型特异性引物、和野生型特异性探针(FAM)；和反应2，其包含内源对照(转化酶1基因)及VIC探针。
图2A是依照本发明的一个实施方案的第一复制产物(200)的示意图。还描绘了正向引物(130)、第一反向引物(140)、和任选的插入物特异性探针(160)。
图2B是依照本发明的一个实施方案的第一复制产物(200)的示意图。还描绘了正向引物(130)、第二反向引物(150)、和任选的野生型特异性探针(170)。
图3是依照本发明的一个实施方案的供测定特定插入位点处插入的核苷酸序列的存在或缺乏的方法用的元件的示意图。第一反应(400)牵涉以黑色块表示的可能插入的核苷酸序列(110)，而周围的基因组(120)以空心区段指示。还描绘了正向引物(130)、第一反向引物(140)、和任选的插入物特异性探针(160)。
第二反应(500)牵涉以黑色块表示的可能插入的核苷酸序列(110)，而周围的基因组(120)以空心区段指示。还描绘了正向引物(130)、第二反向引物(150)、和任选的野生型特异性探针(170)。
图4是来自Roche LightCycler480的FAM荧光结果的图示。
图5是来自Roche LightCycler480的VIC荧光结果的图示。
发明详述
本发明的实施方案包括测定核酸样品中特定插入位点处插入的核苷酸序列的存在或缺乏的方法。在一些实施方案中，可以从单一来源或来源群体分离和/或纯化核酸，所述群体可以包括一个或多个个体，该个体可以或不可以各自具有不同核酸。在其它实施方案中，核酸来源可以是，但不限于动物、植物、细菌、古细菌(archea)、原生生物、真菌、原生动物、色藻界(chromistae)、真核、原核、体内、体外、细胞、种子、配子、玉米、大豆、小麦、油菜、稻、和生成来源(generated source)。
在特定的实施方案中，所述方法可以包括获得、分离、纯化、和/或部分纯化核酸。参考图1，可以使分离的核酸与能够结合插入位点上游的核酸(120)的正向引物(130)和能够特异性结合插入的核苷酸序列(110)(若存在的话)内的序列的第一反向引物(140)、和能够特异性结合插入位点下游的序列(120)且容许引物与分离的核酸退火的第二反向引物(150)接触。然后，若可能的话，可以经由本领域中公知的技术，诸如但不限于聚合酶链式反应(PCR)，使用引物引发复制，再生引物间的居间序列。对于存在插入的核苷酸序列(110)且其大于通过标准方法可再生的片段(例如大于5kb)的插入位点，再生产物可以包含第一复制产物(图2A(200))，但是一般可以缺乏从第二反向引物(150)引发的第二复制产物(图2B(300))，所述第一复制产物包含那些在正向引物(130)和第一反向引物(140)之间的序列。对于不存在插入的核苷酸序列的插入位点，再生产物可以包含第二复制产物(图2B(300))，其包含那些在正向引物(130)和第二反向引物(150)之间的序列。在插入的核苷酸序列(110)存在于核酸中的一些，但不是所有插入位点的情况中，会产生两种产物的混合物。然后，分析再生产物以测定第一复制产物(200)和/或第二复制产物(300)的存在和/或相对水平。
对于存在插入的核苷酸序列的插入位点，核酸的再生产物可以包含第一复制产物(图2A(200))，其包含那些在正向引物(130)和第一反向引物(150)之间的序列。对于不存在于插入的核苷酸序列的插入位点，再生产物可以包含第二复制产物(图2B(300))，其包含那些在正向引物(130)和第二反向引物(150)之间的序列。在插入的核苷酸序列(110)存在于核酸中的一些，但不是所有插入位点的情况中，会产生两种产物的混合物。然后，分析再生产物以测定第一复制产物(200)和/或第二复制产物(300)的存在和/或相对水平。
在其它实施方案中，在存在插入位点处插入的核苷酸序列的情况中，正向引物和第一反向引物会相隔小于约5kb，而正向引物和第二反向引物会相隔超过约5kb。在别的实施方案(其中插入位点缺乏插入的核苷酸序列)中，正向引物和第二反向引物会相隔小于约5kb。
在特定的实施方案中，参考图3，可以将分离的核酸分成几个部分。可以使核酸的第一部分与正向引物(130)和第一反向引物(140)接触，所述正向引物(130)能够结合插入位点上游的核酸(120)，所述第一反向引物(140)能够特异性结合插入的核苷酸序列(110)(若存在的话)内的序列，且容许引物与分离的核酸退火。然后，若可能的话，可以经由本领域中公知的技术，诸如但不限于PCR，使用引物引发复制，再生引物间的居间序列。对于存在插入的核苷酸序列(110)的插入位点，再生产物可以包含第一复制产物(图2A(200))，其包含那些在正向引物(130)和第一反向引物(140)之间的序列。
可以使核酸的第二部分与正向引物(130)和第二反向引物(150)接触，所述正向引物(130)能够结合插入位点上游的核酸(120)，所述第二反向引物(150)能够特异性结合插入位点下游的序列(120)，并且容许引物与分离的核酸退火。然后，若可能的话，可以经由本领域中公知的技术，诸如但不限于PCR，使用引物引发复制，再生引物间的居间序列。对于不存在插入的核苷酸序列的插入位点，再生产物可以包含第二复制产物(图2B(300))，其包含那些在正向引物(130)和第二反向引物(150)之间的序列。
对于存在插入的核苷酸序列的插入位点，核酸的第一部分的再生产物可以包含第一复制产物(图2A(200))，其包含那些在正向引物(130)和第一反向引物(150)之间的序列。对于不存在插入的核苷酸序列的插入位点，核酸的第二部分的再生产物可以包含第二复制产物(图2B(300))，其包含那些在正向引物(130)和第二反向引物(150)之间的序列。
在其它实施方案中，可以使用所述方法来检测核酸中插入物的存在，其中插入物存在于核酸中小于10%,9%,8%,7%,6%,5%,4%,3%,2%,或1%的插入位点中。在实施方案中，可以使用所述方法来检测核酸中插入物的缺乏，其中插入物在核酸中小于10%,9%,8%,7%,6%,5%,4%,3%,2%,或1%的插入位点中是缺乏的。
在一些实施方案中，含有插入位点的核酸可以是任何种类的核酸，包括但不限于DNA、RNA、PNA、或核酸的其它经修饰形式。
在别的实施方案中，可以分别通过本领域中已知的任何手段，诸如但不限于插入物特异性探针(160)和野生型特异性探针(170)检测第一和/或第二复制产物的存在和/或量。在特定的实施方案中，探针可以是能够在第一和/或第二复制产物中的特定位点处结合的核苷酸序列。探针的退火可以在复制期间或之后发生。
作为非限制性例子，可以经由使用层析、凝胶、标记物、模块、Southern印迹、和Northern印迹检测第一和/或第二复制产物的存在和/或量。
在某些实施方案中，可以将荧光团附接于一种或多种探针以便于检测。另外，也可以将荧光团淬灭分子附接于探针。含有荧光团和荧光团淬灭分子的此类探针的例子包括
Figure BDA0000373978380000051
系统和可购自Roche Molecular Diagnostics和/或Applied Biosystems的试剂。在其它实施方案中，可以实时监测第一和/或第二再生产物的生成和水平。
在一些实施方案中，可以使用本文中所描述的方法来测定特定插入位点处的核酸(例如基因组)的接合性。存在第一复制产物(200)且缺乏第二复制产物(300)的测定法结果指示核酸在插入物的存在方面是纯合的。缺乏第一复制产物(200)且存在第二复制产物(300)的测定法结果指示核酸在插入物的缺乏方面是纯合的。存在第一复制产物(200)和第二复制产物(300)两者的此类测定法结果指示核酸在插入物方面是杂合的(例如，至少一个插入位点含有插入物，而至少一个插入位点不含插入物)。
在特定的实施方案中，可以将引物和/或探针组与一个或多个其它引物和探针组组合，从而容许检测样品的核酸中一个或多个特定插入位点内的一个或多个插入物的存在或缺乏。如本文中所使用的，“引物和/或探针组”包括至少一种能够结合特定插入位点上游的位点的正向引物和至少一种能够结合特定插入位点下游或特定插入内的位点的反向引物。在其它实施方案中，可以使用多个引物和/或探针组来检测一个或多个特定插入位点处的特定插入物和/或多个特定插入位点处的多个插入物。
在某些实施方案中，可以使用本文中所描述的方法来对群体筛选特定插入位点处的插入的存在或缺乏。在其它实施方案中，可以对群体的每个成员测定特定插入位点的存在。
如本文中所使用的，“特定插入位点”意指核酸内可以可再现地插入插入物的已知位置或保守序列。在某些实施方案中，可以对样品中的每种核酸测定特定插入位点的存在，作为非限制性例子，其经由通过本文中所描述的方法生成第一(200)或第二(300)复制产物来进行。在其它实施方案中，在特定插入位点侧翼的序列或插入物内的序列可以是保守的。在其它实施方案中，特定插入位点侧翼或插入物内的序列的此类保守可以限于引物和/或探针的结合位点。如在本上下文中使用的，“保守的”意指特异性引物和/或探针能够特异性结合“保守的”区域。在特定的实施方案中，特异性引物和/或探针在高度严格的条件下会保持与“保守”区域结合。
如本文中所使用的，“上游”和“下游”是相对术语，并且指明核酸中插入位点的相反侧。位于插入位点“上游”和“下游”的方向不以所述术语表示，除非它们位于插入位点的相反侧上。
如本文中所使用的，“正向引物”和“反向引物”是相对术语，表示结合核酸上的不同位置，从而通过本领域中可用的方法，诸如但不限于PCR实现其间的核酸再生的引物。在特定引物与核酸序列位点结合的地方不以术语“正向”和“反向”表示，除非它们位于要再生的序列的相反侧，并且作用可以为再生中聚合酶的引物。
如本文中所使用的，“包含”、“包括”、“含有”、“特征在于”及其语法等同物是包括端点的或开放末端的/无终止的术语，其不排除别的、未叙述的要素或方法步骤，而且还包括更为限制性的术语“由…组成”和“基本上由…组成”。
本发明在以下实施例中进一步描述，所述实施例作为例示提供，而并不意图以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1：植物材料：
亲本系筛选：为了测定转基因插入位点的边界序列是否是高度保守的以及是否可以在各种遗传背景间使用事件特异性引物，筛选总共92种多种多样的近交系，其代表不同杂种优势群(heterotic group)和位置(诸如北美洲、南美洲、欧洲)、硬柄(Stiff stalk)、非硬柄(non-Stiff stalk)、公共和专有来源(表1)。
表1：用于筛选转基因插入位点的边界序列的一批材料。
Figure BDA0000373978380000071
Figure BDA0000373978380000091
整装种子筛选：为了演示对整装种子样品应用基于DNA的测试以及为了测定检测的灵敏性，使用已知的纯的纯合子DAS-59122、杂合子DAS-59122、和空的(null)(常规的)种子创建下文提及的种子集合。将这些计数入6个不同的50mL Falcone管中：
1.100个纯合子DAS-59122种子，重复-1
2.100个纯合子DAS-59122种子，重复-2
3.99个纯合子DAS-59122种子、和1个半合子DAS59122种子，重复-1
4.99个纯合子DAS-59122种子、和1个半合子DAS59122种子，重复-2
5.99个纯合子DAS59122种子和1个空的(常规的)种子，重复-1
6.99个纯合子DAS59122种子和1个空的(常规的)种子，重复-2
实施例2：种子研磨和DNA提取
将种子细致研磨，并使用Qiagen DNEasy试剂盒(Valencia,CA)分离基因组DNA。从每个种子批次完成5次分开的基因组DNA提取。将纯化的基因组DNA使用QuantIt Picogreen DNA试剂盒定量，并稀释至标准化的浓度。
实施例3：基于TaqMan的接合性测定法：
使用由不同引物和探针序列构成的不同试剂组实施接合性分析。方法和试剂针对DAS-59122事件特异性设计。图1中提供了接合性测定法设计的示意图。在两种探针外，所述方法利用基因特异性引物、野生型引物和基因特异性/野生型(共同)引物。探针由野生型特异性和转基因特异性探针组成。第一种方法在同一反应(“单一反应方法”)内掺入所有引物和探针。为了提高接合性检测的灵敏性，还测试一种别的方法，其中实施两个分开的独立反应(图3)(“多重反应方法”)。一组孔含有野生型特异性引物、共同引物、和野生型特异性探针。另一组孔含有转基因特异性引物、共同引物、和转基因特异性探针。例如，在此方法中，在384孔板形式中仅使用两种引物和一种探针，其中一个四分之一含有野生型特异性引物+共同引物+野生型特异性探针，另一个四分之一含有转基因特异性引物+共同引物+转基因特异性探针。
经修改的端点Taqman：制备含有下列组分的主混合物(master mix)：水，15.35μl；10X PCR缓冲液，2.50μl；25mM MgCl2，1.50μl；10mM dNTP(各2.5mM)，2.0μl；20μM共同正向引物(SEQ ID NO:1)，0.25μl；20μM野生型反向引物(SEQ ID NO:2)，0.25μl；10μM在3’端用VIC且在5’端用BHQ2标记的经双重标记的野生型探针(SEQ ID NO:3)，0.20μl；HotStar Taq(5U/μl),0.20μl；和10ng/μl基因组DNA，3.0μl。
制备含有下列组分的第二主混合物：水，15.35μl；10X PCR缓冲液，2.50μl；25mM MgCl2，1.50μl；10mM dNTP(各2.5mM)，2.0μl；20μM共同正向引物(SEQ ID NO:1)，0.25μl；20μM591227反向引物(SEQ ID NO:4)，0.25μl；10μM在3’端用FAM且在5’端用BHQ1标记的经双重标记的591227探针(SEQID NO:5)，0.20μl；HotStar Taq(5U/μl)，0.20μl；和10ng/μl基因组DNA，3.0μl。
将这两种混合物移液到各单孔中，并使用GenAmp PCR系统9700在以下条件扩增：95℃持续15分钟(1个循环)；95℃持续15秒，60℃持续60秒(35个循环)。分析荧光读数，并通过激发VIC或FAM荧光团测定接合性。
结果：在测定引物结合位点的边界序列的保守性质后，设计引物，并使用标准的Taqman接合性测定法对整装种子集合测试。结果指示单一反应方法对于以1%检测灵敏性在纯的纯合子整装种子中检测空的种子污染是灵敏的。然而，单一反应方法在检测1%存在水平的任何半合子种子污染中是不一致的。不灵敏性可以是由于丰富的模板可用性由于重复-1的优先扩增所致(参见图1)。为了克服PCR扩增期间的此来源竞争，将单一反应方法修改为多个分开的反应(图3)。此修改导致仅意图的区域的选择性扩增，而没有任何来源竞争。对亲本“种子集合”使用多重反应方法(亲本种子接合性测试)证明了在以1%检测灵敏性检测纯的纯合子种子整体中的半合子及常规的(空的)种子两者中是一致的(表2)。还使用Roche的Light Cycler480经由实时PCR确认结果以确保PCR反应或设置没有人工因素(artifact)。
表2：通过各种接合性方法进行检测的灵敏性。
亲本系筛选：可以在各种遗传背景间使用事件特异性引物，使用92种多种多样的近交系(表1)来测试多重反应方法，所述近交系代表各位置诸如北美洲、南美洲、欧洲种植的不同杂种优势群。测试这些品系，并且使用上文所描述的方案确认没有转基因污染。
使用Roche480实时热循环仪(图4和5)及基于端点TaqMan的测定法的分析指示测试的所有近交系具有转基因插入侧翼的保守边界序列。它们用WT特异性引物/探针成功扩增，确认事件DAS59122-7测定法引物和探针可以遍及对完成系的亲本种子接合性测试的渐渗程序使用。
多重反应方法的一些优点包括DNA测试相对于ELISA测试的所有简单性和可靠性优点。更重要地，它实现使用整装种子集合的接合性测试，而不是仅能检测个体植物的ELISA测试。另外，此方法可以将测试者行和ELISA测试的操作成本削减10倍。此方法还可以提高测定法的灵敏性，而且会检测其它污染物。多重反应方法也可以作为下游偶发存在(AP)测试的“指示物”，其可以用于非有意事件的测试，而且还会显示整装样品的纯的纯合子状态。
证明了多重反应方法测试在检测纯的纯合子完成系的种子批次中的任何半合子或空的种子污染的存在方面是高度灵敏的。显示了多重反应方法可以检测1%污染水平(100个种子中的1个)的污染。此新方法导致建立新的高通量分子分析(HTMA)功能，即对完成系的更好纯度测试，而且还对田间操作提供10倍的成本节约。
虽然本发明已经在某些实施方案中进行了描述，但是本发明可以在本公开内容的精神和范围内进一步修改。因此，本申请意图覆盖使用其一般原则的本发明的任何变型、用途、或改编。此外，本发明意图覆盖本公开内容的此类偏离，其在本发明所属领域中的已知或惯用实践内且落入所附权利要求书的限制内。
Figure IDA0000373978430000011

Claims (20)

1.一种确定核酸中特定插入位点处插入的核苷酸序列的存在或缺乏的方法，该方法包括：
从所述样品分离核酸；
使所述核酸与正向引物和反向引物接触，所述正向引物能够结合所述插入位点上游的核酸；所述反向引物能够结合所述插入位点下游的核酸；
使用所述引物以再生所述引物间的核酸；并
分析再生的核酸以确定插入的核苷酸序列在所述样品中存在与否。
2.依照权利要求1的方法，进一步包括在再生期间或之后使所述核酸与探针接触，所述探针对于在存在所述插入的核苷酸序列的情况中扩增的片段是特异性的。
3.依照权利要求1的方法，进一步包括在再生期间或之后使所述核酸与探针接触，所述探针对于在缺乏所述插入的核苷酸序列的情况中扩增的片段是特异性的。
4.依照权利要求2的方法，进一步包括在再生期间或之后使所述核酸与探针接触，所述探针对于在缺乏所述插入的核苷酸序列的情况中扩增的片段是特异性的。
5.依照权利要求1的方法，其中所述样品包含所述特定插入位点的超过一次反复。
6.依照权利要求1的方法，其中所述样品包含来自多个生物体的核酸。
7.依照权利要求5的方法，其中所述插入的核苷酸序列存在于所述核酸中的小于1%的所述特定插入位点中。
8.依照权利要求5的方法，其中所述插入的核苷酸序列存在于所述核酸中的大于99%的所述特定插入位点中。
9.一种确定特定插入位点处插入的核苷酸序列的存在或缺乏的方法，该方法包括：
从所述样品分离核酸；
使核酸与正向引物和反向引物接触，所述正向引物能够结合所述插入位点上游的核酸，所述反向引物能够结合所述插入位点下游的核酸；
使用所述引物以再生所述核酸的第一部分和第二部分中的引物间的核酸；并
分析再生的结果以确定插入的核苷酸序列在所述样品中存在与否。
10.依照权利要求9的方法，进一步包括在再生期间或之后使所述核酸与探针接触，所述探针对于在存在所述插入的核苷酸序列的情况中扩增的片段是特异性的。
11.依照权利要求9的方法，进一步包括在再生期间或之后使所述核酸与探针接触，所述探针对于在缺乏所述插入的核苷酸序列的情况中扩增的片段是特异性的。
12.依照权利要求10的方法，进一步包括在再生期间或之后使所述核酸与探针接触，所述探针对于在缺乏所述插入的核苷酸序列的情况中扩增的片段是特异性的。
13.依照权利要求9的方法，其中所述样品包含所述特定插入位点的超过一次反复。
14.依照权利要求9的方法，其中所述样品包含来自多个不同生物体的核酸。
15.依照权利要求13的方法，其中所述插入的核苷酸序列存在于所述核酸中的小于1%的所述特定插入位点中。
16.依照权利要求13的方法，其中所述插入的核苷酸序列存在于所述核酸中的大于99%的所述特定插入位点中。
17.依照权利要求13的方法，其中所述方法用于使用整装组织样品(bulked tissue sample)确定接合性。
18.依照权利要求13的方法，其中所述方法用于确定任何非有意的转基因的污染。
19.依照权利要求13的方法，其中所述方法用于整装样品中偶发事件存在/缺乏的指示物。
20.依照权利要求13的方法，其中所述方法用于确定任何非转基因系的污染。
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