UA112977C2 - Спосіб визначення наявності або відсутності вставленої нуклеотидної послідовності в визначеному сайті вставки в об’ємному зразку нуклеїнової кислоти зі щонайменше 100 організмів - Google Patents
Спосіб визначення наявності або відсутності вставленої нуклеотидної послідовності в визначеному сайті вставки в об’ємному зразку нуклеїнової кислоти зі щонайменше 100 організмів Download PDFInfo
- Publication number
- UA112977C2 UA112977C2 UAA201309391A UAA201309391A UA112977C2 UA 112977 C2 UA112977 C2 UA 112977C2 UA A201309391 A UAA201309391 A UA A201309391A UA A201309391 A UAA201309391 A UA A201309391A UA 112977 C2 UA112977 C2 UA 112977C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- nucleic acid
- nucleotide sequence
- inserted nucleotide
- personal
- insertion site
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 72
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 43
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 87
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 86
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 86
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 68
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 68
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 42
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 32
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 72
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 21
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 21
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 8
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 claims 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 15
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 10
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- -1 but not limited to Chemical class 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229910016006 MoSi Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000012297 crystallization seed Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- VGTPKLINSHNZRD-UHFFFAOYSA-N oxoborinic acid Chemical compound OB=O VGTPKLINSHNZRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Спосіб визначення наявності або відсутності вставленої нуклеотидної послідовності в визначеному сайті вставки в об’ємному зразку нуклеїнової кислоти зі щонайменше 100 організмів включає приведення зразка нуклеїнової кислоти в контакт з прямим праймером, здатним зв'язуватися з нуклеїновою кислотою вище сайту вставки, з першим зворотним праймером, здатним зв′язуватися з вставленою нуклеотидною послідовністю і другим зворотним праймером, здатним зв'язуватися з нуклеїновою кислотою нижче сайту вставки; праймери застосовують для ампліфікації нуклеїнових кислот між праймерами; здійснюють аналіз ампліфікованих нуклеїнових кислот для визначення присутності або відсутності вставленої нуклеотидної послідовності в зразку нуклеїнової кислоти. Спосіб може бути здійснено в межах однієї реакції або з розділенням досліджуваного зразка на щонайменше 2 частини.Спосіб використовують для визначення зиготності, для визначення домішки події вставки в зразку, як індикатор наявності/відсутності в об'ємному зразку додаткової події вставки.
Description
ДОМАГАННЯ НА ПРІОРИТЕТ
За даною заявкою вимагається пріоритет по даті подачі попередньої патентної заявки
Сполучених Штатів серії Мо 61/428142, поданій 29 грудня 2010 року, відносно "Способів визначення зиготності в об'ємній пробі".
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Проведення контролю якості відносно якої-небудь домішки в остаточній лінії надто важливе для успішної продукції гібридного насіння і збереження і зміцнення хороших ділових відносин з покупцями. Забруднення при сходженні насіння остаточної лінії може відбуватися через запилення не передбачених трансгенних або нетрансгенних рослин, що виросли поблизу ділянки продукції, або в процесі обробки насіння і, найважливіше, домішка може виникати внаслідок розсіювання пилка стерильних рослин. Для досягнення повної гомозиготності остаточної лінії і звільнення від будь-яких гемізиготних, нульових або непередбачених трансгенних ліній на сьогоднішній день пропонується спосіб їевіег-гом/. У способі їевіег-гом/ для оцінки статусу зиготності на основі рівнів білків окремої рослини використовується технологія
ЕГІ5А. Оскільки аналіз базується на основі однієї рослини, він займає дуже багато часу, а також є таким, що дорого коштує. Крім того, здійснення способу іевіег-гом в польових умовах створює додаткові витрати. Спосіб ЕГІ5А використовується для визначення сайленсингу експресії трансгена шляхом визначення рівня білка. Він є нечутливим і ненадійним для ідентифікації будь-якої гемізиготної, нульової або будь-якої іншої непередбаченої домішки в остаточній партії насіння. Крім того, при використанні способу ЕГІЗА для випробування на наявність малих домішок необхідна роздільна обробка тканин. опис
Конкретні варіанти здійснення винаходу включають способи визначення наявності або відсутності вставленої нуклеотидної послідовності в визначеному сайті вставки в нуклеїновій кислоті. Варіанти здійснення можуть містити: виділення нуклеїнової кислоти з об'ємної проби; приведення нуклеїнової кислоти в контакт з прямим праймером, здатним зв'язуватися з нуклеїновою кислотою вище сайту вставки, і зворотним праймером, здатним зв'язуватися з нуклеїновою кислотою нижче сайту вставки. Праймери можуть бути використані для реплікації нуклеїнових кислот між праймерами. Репліковані нуклеїнові кислоти можуть бути проаналізовані
Зо для ідентифікації наявності або відсутності в об'ємній пробі вставленої нуклеотидної послідовності.
Варіанти здійснення можуть містити: виділення нуклеїнової кислоти із зразка; приведення нуклеїнової кислоти в контакт з прямим праймером, здатним зв'язуватися з нуклеїновою кислотою вище сайту вставки, і зворотним праймером, здатним зв'язуватися з нуклеїновою кислотою нижче сайту вставки. Праймери можуть бути використані для реплікації нуклеїнових кислот між праймерами в першій порції і другій порції. Репліковані нуклеїнові кислоти можуть бути проаналізовані для ідентифікації наявності або відсутності в зразку вставленої нуклеотидної послідовності. Друга реакція, або об'єднана з вищезгаданою реакцією, або самостійна, може бути здійснена, використовуючи прямий праймер і зворотний праймер, ця реакція ідентифікує ендогенний ген або послідовність. Ця друга реакція може бути використана як внутрішній контроль для визначення якості і кількості використаних ДНК і/або умов проведення ПЛР.
КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ
На фіг. 1А представлене схематичне зображення компонентів способу визначення наявності або відсутності вставленої нуклеотидної послідовності в визначеному сайті вставки згідно з варіантом здійснення винаходу. На цій фігурі ймовірно вставлена нуклеотидна послідовність (110) показана темним блоком, в той час як оточуючий геном (120) вказаний відкритими сегментами. Також показані прямий праймер (130), перший зворотний праймер (140) і другий зворотний праймер (150). Додатково представлені необов'язкові специфічний зонд вставки (160) і специфічний зонд дикого типу (170).
На фіг. 18 ілюструється модифікований аналіз, який включає створення стандартного протоколу визначення зиготності в двох окремих реакціях: реакції 17, що включає загальний праймер і специфічний праймер дикого типу і специфічний зонд дикого типу (ЕАМ); і реакції 2, що включає внутрішній контроль (ген інвертази 1) із зондом МІС.
На фіг. 2А представлене схематичне зображення першого реплікованого продукту (200) згідно з варіантом здійснення винаходу. Також представлені прямий праймер (130), перший зворотний праймер (140) і необов'язковий специфічний зонд вставки (160).
На фіг. 28 представлене схематичне зображення першого реплікованого продукту (200) згідно з варіантом здійснення винаходу. Також представлені прямий праймер (130), другий бо зворотний праймер (150) і необов'язковий специфічний зонд дикого типу (170).
На фіг. 3 представлене схематичне зображення компонентів способу визначення наявності або відсутності вставленої нуклеотидної послідовності в визначеному сайті вставки згідно з варіантом здійснення винаходу. Перша реакція (400) включає ймовірно вставлену нуклеотидну послідовність (110), яка представлена темним блоком, в той час як оточуючий геном (120) вказаний відкритими сегментами. Також показані прямий праймер (130), перший зворотний праймер (140) і необов'язковий специфічний зонд вставки (160).
Друга реакція (500) включає ймовірно вставлену нуклеотидну послідовність (110), яка представлена темним блоком, в той час як оточуючий геном (120) вказаний відкритими сегментами. Також показані прямий праймер (130), другий зворотний праймер (150) і необов'язковий специфічний зонд дикого типу (170).
На фіг. 4 представлене графічне відображення результатів флуоресценції ЕАМ в системі
ПопСусіег 480 фірми Коспе.
На фіг. 5 представлене графічне відображення результатів флуоресценції МІС в системі
ПойіСусієг 480 фірми Коспе.
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Варіанти здійснення винаходу включають способи визначення наявності або відсутності вставленої нуклеотидної послідовності в визначеному сайті вставки в зразку нуклеїнових кислот. У деяких варіантах здійснення нуклеїнові кислоти можуть бути виділені і/або очищені з одного джерела або сукупності джерел, причому сукупність може включати одне або декілька окремих джерел, кожне з яких може або не може мати відмінні нуклеїнові кислоти. У інших варіантах здійснення джерело нуклеїнових кислот може являти собою, але ними не обмежуючись, тварину, рослину, бактерій, архебактерій, найпростіших, гриби, хромистів, еукаріот, прокаріот, іп мімо, іп міго, клітину, насіння, гамету, кукурудзу, сою, пшеницю, рапс, рис і створені джерела.
У визначених варіантах здійснення спосіб може містити отримання, виділення, очищення іабо часткове очищення нуклеїнової кислоти. Згідно фіг. 1, виділені нуклеїнові кислоти можуть бути приведені в контакт з прямим праймером (130), здатним зв'язуватися з нуклеїновою кислотою вище сайту вставки (120), і першим зворотним праймером (140), здатним специфічно зв'язуватися з послідовністю всередині вставленої нуклеотидної послідовності (110) (при
Зо наявності), і другим зворотним праймером (150), здатним специфічно зв'язуватися з послідовністю нижче (120) сайту вставки, залишаючи праймери для відпалу з виділеними нуклеїновими кислотами. Послідовності, що знаходяться між праймерами, потім по можливості можуть бути репліковані, використовуючи праймери для реплікації між праймерами за допомогою техніки, добре відомої в даній галузі, таких як, але нею не обмежуючись, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). Відносно сайтів вставки, де вставлена нуклеотидна послідовність (110) присутня і більша ніж фрагмент, що реплікується стандартними способами (наприклад, 25 т. н.), продукти реплікації можуть включати перший реплікований продукт (фіг. 2А (200)), що містить такі послідовності між прямим праймером (130) і першим зворотним праймером (140), але, як правило, може бути відсутнім другий реплікований продукт (фіг. 28 (300)), праймований з другого зворотного праймера (150). Відносно сайтів вставки, де вставлена нуклеотидна послідовність відсутня, продукти репродукції можуть включати другий реплікований продукт (фіг. 28 (300)), що містить такі послідовності між прямим праймером (130) і другим зворотним праймером (150). При наявності вставленої нуклеотидної послідовності (110) в деяких, але не у всіх сайтах вставки в нуклеїновій кислоті, буде виходити суміш двох продуктів. Результати реплікації потім аналізують для визначення наявності і/або відносних рівнів першого реплікованого продукту (200) і/або другого реплікованого продукту (300).
Відносно сайтів вставки при наявності вставленої нуклеотидної послідовності, продукти реплікації нуклеїнової кислоти можуть включати перший реплікований продукт (фіг. 2А (200)), що містить такі послідовності між прямим праймером (130) і першим зворотним праймером (150). Відносно сайтів вставки при відсутності вставленої нуклеотидної послідовності, продукти реплікації можуть включати другий реплікований продукт (фіг. 28 (300)), що містить такі послідовності між прямим праймером (130) і другим зворотним праймером (150). При наявності вставленої нуклеотидної послідовності (110) в деяких, але не у всіх сайтах вставки в нуклеїновій кислоті, буде виходити суміш двох продуктів. Результати реплікації потім аналізують для визначення наявності і/або відносних рівнів першого реплікованого продукту (200) і/або другого реплікованого продукту (300).
У деяких варіантах здійснення при наявності вставленої нуклеотидної послідовності в сайті вставки прямий праймер і перший зворотний праймер повинні відстояти один від одного менше ніж приблизно на 5 т. н., і прямий праймер і другий зворотний праймер повинні відстояти один 60 від одного більше ніж приблизно на 5 т. н. В додаткових варіантах здійснення, в яких в сайті вставки відсутня вставлена нуклеотидна послідовність, прямий праймер і другий зворотний праймер повинні відстояти один від одного менше ніж приблизно на 5 т. н.
У визначених варіантах здійснення згідно з фіг. З виділена нуклеїнова кислота може бути розділена на декілька порцій. Перша порція нуклеїнової кислоти може бути приведена в контакт з прямим праймером (130), здатним зв'язуватися з нуклеїновою кислотою вище сайту вставки (120), і першим зворотним праймером (140), здатним специфічно зв'язуватися з послідовністю всередині вставленої нуклеотидної послідовності (110) (при наявності), залишаючи праймери для відпалу з виділеними нуклетовими кислотами. Послідовності, розташовані між праймерами, потім по можливості можуть бути репліковані, використовуючи праймери для реплікації між праймерами за допомогою техніки, добре відомої в даній галузі, таких як, але нею не обмежуючись, ПЛР. Відносно сайтів вставки, коли вставлена нуклеотидна послідовність (110) присутня, продукти реплікації можуть включати перший реплікований продукт (фіг. 2А (200)), що містить такі послідовності між прямим праймером (130) і першим зворотним праймером (140).
Друга порція нуклеїнової кислоти може бути приведена в контакт з прямим праймером (130), здатним зв'язуватися з нуклеїновою кислотою вище сайту вставки (120), і другим зворотним праймером (150), здатним специфічно зв'язуватися з послідовністю нижче (120) сайту вставки, залишаючи праймери для відпалу з виділеною нуклеїновою кислотою. Послідовності, розташовані між праймерами, потім по можливості можуть бути репліковані, використовуючи праймери для реплікації між праймерами за допомогою техніки, добре відомої в даній галузі, таких як, але нею не обмежуючись, ПЛР. Відносно сайтів вставки, коли вставлена нуклеотидна послідовність (110) відсутня, продукти реплікації можуть включати другий реплікований продукт (фіг. 28 (300)), що містить такі послідовності між прямим праймером (130) і другим зворотним праймером (150).
Відносно сайтів вставки, коли вставлена нуклеотидна послідовність присутня, продукти реплікації першої порції нуклеїнової кислоти можуть включати перший реплікований продукт (фіг. 2А (200)), що містить такі послідовності між прямим праймером (130) і першим зворотним праймером (150). Відносно сайтів вставки, коли вставлена нуклеотидна послідовність (110) відсутня, продукти реплікації другої порції нуклеїнової кислоти можуть включати другий
Зо реплікований продукт (фіг. 28 (300)), що містить такі послідовності між прямим праймером (130) і другим зворотним праймером (150).
У інших варіантах здійснення способи можуть бути використані для визначення наявності вставки в нуклеїновій кислоті при наявності вставки менше, ніж в 10 95, 9 бо, 8 бо, 7 Уо, 6 о, 5 Фо, 4 ув, З Ус, 2 Уо або 1 95 сайтів вставки в нуклеїнових кислотах. У варіантах здійснення способи можуть бути використані для визначення відсутності вставки в нуклеїновій кислоті при відсутності вставки менше ніж в 10 95, 9 90, 8 о, 7 в, б в, 5 в, 4 90, З Зо, 2 У або 1 95 сайтів вставки в нуклеїнових кислотах.
У деяких варіантах здійснення нуклеїнова кислота, що містить сайт вставки, може являти собою будь-який вид нуклеїнової кислоти, до яких належать, але ними не обмежуючись, ДНК,
РНК, РМА або інші модифіковані форми нуклеїнових кислот.
У додаткових варіантах здійснення наявність і/або кількість першого і/або другого продукту реплікації може бути визначена будь-якими засобами, відомими в даній галузі, такими як, але ними не обмежуючись, специфічні зонди вставки (160) і специфічні зонди дикого типу (170), відповідно. У визначених варіантах здійснення зонд може являти собою нуклеотидну послідовність, здатну зв'язуватися в специфічному сайті в першому і/або другому продукті реплікації. Відпал зонда може відбуватися в процесі або після реплікації.
За допомогою прикладів, що не мають обмежувального характеру, наявність і/або кількість першого і/або другого продукту реплікації може бути визначена, використовуючи хроматографію, гелі, мітки, фрагменти, саузерн-блот і нозерн-блот.
У деяких варіантах здійснення для полегшення детекції до одного або декількох зондів може бути приєднаний флуорофор. Крім того, до зонда також може бути приєднана молекула, що гасить флуорофор. До прикладів таких зондів, що містять флуорофор і молекулу, що гасить флуорофор, належать система Тадмапг? і реагенти, доступні у фірм Боспе Моїіесшаг Ріадповііс5 і/або Арріїей Віозузіетв5. У інших варіантах здійснення продукція і рівні першого і/або другого продуктів реплікації можуть відстежуватися в режимі реального часу.
У деяких варіантах здійснення способи, описані в цьому документі, можуть бути використані для визначення зиготності нуклеїнових кислот (наприклад, генома(ів)) у визначеному сайті вставки. Результати аналізів при наявності першого реплікованого продукту (200) і відсутності другого реплікованого продукту (300) вказують на те, що нуклеїнові кислоти гомозиготні бо відносно наявності вставки. Результати аналізів з відсутністю першого реплікованого продукту
(200) ії наявністю другого реплікованого продукту (300) вказують на те, що нуклеїнові кислоти гомозиготні відносно відсутності вставки. Результати таких аналізів, в яких присутні і перший реплікований продукт (200) і другий реплікований продукт (300), вказують на те, що нуклеїнові кислоти гетерозиготні відносно вставки (наприклад, щонайменше один сайт вставки містить вставку і щонайменше один сайт вставки не містить вставку).
У визначених варіантах здійснення набори праймерів і/або зондів можуть бути об'єднані з одним або декількома іншими наборами праймерів і зондів таким чином, щоб можливо було визначити наявність або відсутність однієї або декількох вставок в одному або декількох визначених сайтах вставки в нуклеїновій кислоті зразка. Використовуваний в цьому документі вираз "набір праймерів і/або зондів" включає щонайменше один прямий праймер, здатний зв'язуватися з сайтом вище визначеного сайту вставки, і щонайменше один зворотний праймер, здатний зв'язуватися з сайтом нижче визначеного сайту вставки або всередині визначеної вставки. У інших варіантах здійснення для ідентифікації конкретної вставки в одному або декількох визначених сайтах вставки і/або більшого числа вставок у більшому числі визначених сайтів вставки може бути використане більше число наборів праймерів і/або зондів.
У деяких варіантах здійснення способи, описані в цьому документі, можуть бути використані для скринінгу популяції на наявність або відсутність вставки в визначеному сайті вставки. У додаткових варіантах здійснення наявність визначеного сайту вставки може бути визначена для кожного члена популяції.
Під виразом "визначений сайт вставки", що використовується в цьому документі, розуміють відоме розташування або консервативну послідовність в нуклеїновій кислоті, куди вставка може бути вставлена відтворюваним чином. У деяких варіантах здійснення наявність конкретного сайту вставки може бути визначена для кожної нуклеїнової кислоти в зразку, як приклад, що не має обмежувального характеру, шляхом продукції першого (200) або другого (300) реплікованого продукту способами, описаними в цьому документі. У інших варіантах здійснення послідовності, фланкуючі конкретний сайт вставки, або послідовності всередині вставки можуть бути консервативними. У додаткових варіантах здійснення такий консерватизм послідовностей, фланкуючих визначений сайт вставки, або послідовностей у вставці може бути обмежений сайтами зв'язування праймерів і/або зондів. Під терміном "консервативний", що
Зо використовується в даному контексті, розуміють, що специфічний праймер і/або зонд здатний специфічно зв'язуватися з областю, яка є "консервативною". У певних варіантах здійснення специфічний праймер і/або зонд залишиться пов'язаним з "консервативною" областю при умовах підвищеної жорсткості. Використовувані в цьому документі терміни "вище" і "нижче" є відносними і означають протилежні сторони сайту вставки в нуклеїновій кислоті. Терміни не означають, який з напрямків розташовується "вище" і "нижче" сайту вставки, а лише те, що вони лежать на протилежних сторонах сайту вставки.
Використовувані в цьому документі "прямий праймер" і "зворотний праймер" являють собою відносні терміни, що означають праймери, які зв'язуються з різними місцеположеннями на нуклеїновій кислоті таким чином, щоб дати можливість реплікації нуклеїнових кислот між ними способами, доступними в даній галузі, такими як, але нею не обмежуючись, ПЛР. Терміни "прямий" і "зворотний" не означають, де саме конкретний праймер зв'яжеться з сайтом послідовності нуклеїнової кислоти, а лише те, що вони лежать на протилежних сторонах реплікованої послідовності і можуть діяти при реплікації як праймери для полімерази.
Використовувані в цьому документі "що містить", "що включає", "що відрізняється" і їх граматичні еквіваленти являють собою охоплюючі і необмежуючі терміни, які не виключають додаткових, неперерахованих елементів або стадій способу, але також включають вужчі терміни "що складається з" і "що по суті складається 3".
Даний винахід додатково описується в наступних прикладах, які пропонуються як ілюстрація і не призначені для того, щоб яким-небудь чином обмежити винахід.
ПРИКЛАДИ
ПРИКЛАД 1: Матеріал рослин
Скринінг батьківських ліній: Для визначення, чи є крайова послідовність в сайті вставки трансгена високо консервативною і чи можуть трансформант-специфічні праймери бути використані для різного генетичного оточення, скринували в загальному 92 різні інбредні лінії, які представляли різні гетерозисні групи і мали різне походження, такі як північноамериканські, південноамериканські, європейські, 5ійї егаїК, відмінні від 5ійї 5їаіК, з публічних і особистих джерел (Таблиця 1).
Таблиця 1
Перелік матеріалів, використаних для скринінгу крайової послідовності в сайті вставки трансгена
Тип матеріалу Гетерозисна група Джерело
Особистий Ї апсавіег Північна Америка
Особистий Ніпі Європа
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий Змішана Південна Америка
Особистий Ї апсавіег Північна Америка
Особистий Ї апсавіег Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий Ї всдепі Північна Америка
Особистий Ї всдепі Північна Америка
Публічний ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий Ї всдепі Північна Америка
Особистий відмінна від БІЙ еаїк Північна Америка
Особистий Ї апсавіег Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Публічний Змішана Північна Америка
Особистий Ї всдепі Північна Америка
Особистий Ніїпі Південна Америка
Особистий Ї апсавіег Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий Змішана Південна Америка
Особистий Змішана Південна Америка
Особистий Змішана Південна Америка
Особистий Змішана Північна Америка
Особистий Змішана Південна Америка
Особистий Змішана Південна Америка
Публічний ЗІ еіаїК Північна Америка
Публічний ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий Ї всдепі Північна Америка
Особистий Ї всдепі Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий Ї всдепі Північна Америка
Особистий Ї всдепі Північна Америка
Особистий Тропічна Південна Америка
Особистий Тропічна Південна Америка
Особистий Тропічна Південна Америка
Особистий Тропічна Південна Америка
Особистий Ї апсавіег Північна Америка
Особистий Ї всдепі Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий відмінна від БІЙ еаїк Північна Америка
Особистий Ї всдепі Північна Америка
Особистий Ї апсавіег Північна Америка
Таблиця 1
Перелік матеріалів, використаних для скринінгу крайової послідовності в сайті вставки трансгена
Тип матеріалу Гетерозисна група Джерело
Особистий Ї апсавіег Північна Америка
Особистий Ї апсавіег Північна Америка
Особистий Ї апсавіег Північна Америка
Особистий Ї апсавіег Північна Америка
Особистий Ї апсавіег Північна Америка
Особистий Ї апсавіег Північна Америка
Особистий Ї апсавіег Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Публічний Ї апсавіег Північна Америка
Особистий Ї всдепі Північна Америка
Особистий Тропічна Південна Америка
Особистий відмінна від БІЙ еаїк Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий відмінна від БІЙ еаїк Північна Америка
Публічний відмінна від БІЙ еаїк Північна Америка
Особистий Ї апсавіег Північна Америка
Особистий Ї апсавіег Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий ЗІ еіаїК Північна Америка
Особистий Змішана Північна Америка
Особистий зимжап Південна Америка
Особистий Тропічна Південна Америка
Особистий Тропічна Південна Америка
Особистий відмінна від БІЙ еаїк Північна Америка
Особистий Змішана Північна Америка
Особистий Змішана Південна Америка
Особистий Змішана Південна Америка
Особистий Тропічна Південна Америка
Особистий Змішана Південна Америка
Особистий Змішана Північна Америка
Особистий Ї всдепі Північна Америка
Особистий Ї всдепі Північна Америка
Скринінг об'ємних проб насіння: Для демонстрації застосування тестування на основі ДНК на об'ємних пробах насіння і для визначення чутливості детекції пули насіння, вказані нижче, створювали, використовуючи відомі суворо гомозиготні ОА5-59122, гемізиготні ОА5-59122 і нульові (звичайні) насінини. Їх відлічували в шість різних пробірок типу фалькон об'ємом 50 мл: 1. 100 гомозиготних насінин ОА5-59122, реплікація-1; 2. 100 гомозиготних насінин ОА5-59122, реплікація-2; 3. 99 гомозиготних насінин ОА5-59122 і одна гемізиготна насінина ОА5-59122, реплікація-1; 4. 99 гомозиготних насінин ОА5-59122 і одна гемізиготна насінина ОА5-59122, реплікація-2; 5. 99 гомозиготних насінин ОА5-59122 і одна нульова (звичайна) насінина, реплікація-1; 6. 99 гомозиготних насінин ОА5-59122 і одна нульова (звичайна) насінина, реплікація-2.
ПРИКЛАД 2: Обмолот насіння і екстракція ДНК
Насіння дрібно подрібнювали і геномну ДНК виділяли, використовуючи набір ОМЕазу фірми
Оіадеп (МаїІепсіа, СА). З кожної партії насіння здійснювали п'ять окремих екстракцій геномної
ДНК. Очищену геномну ДНК кількісно оцінювали, використовуючи набір з барвником ДНК
Рісодгеєп фірми Оцчапіії, і розводили до стандартизованих концентрацій.
ПРИКЛАД 3: Аналізи зиготності на основі ТадМап
Аналіз зиготності здійснювали, використовуючи різні набори реагентів, які складалися з відмінних послідовностей праймерів і зондів. Спосіб і реагенти створювали конкретно для трансформанта ЮА5-59122. Схема аналізу зиготності запропонована на фіг. 1. У способі крім двох зондів використовувалися ген-специфічний праймер, праймер дикого типу і ген- специфічний/дикого типу (загальний) праймер. Зонди складалися з специфічного зонда дикого типу і трансгенного специфічного зонда. У першому способі всі праймери і зонди об'єднувалися в одній реакції ("спосіб в одну реакцію"). Для підвищення чутливості визначення зиготності також випробовували додатковий спосіб, в якому здійснювали дві окремі незалежні реакції (фіг. 3) ("спосіб з великим числом реакцій"). Один ряд ямок містив специфічний праймер дикого типу, загальний праймер і специфічний зонд дикого типу. Інший ряд ямок містив специфічний праймер трансгена, загальний праймер і специфічний зонд трансгена. Наприклад, в цьому способі використовували лише два праймера і один зонд в форматі 384-ямкового планшета, в якому один квадрат містив специфічний праймер дикого типу ж загальний праймер х- специфічний зонд дикого типу, інший квадрат містив специфічний праймер трансгена жк загальний праймер кт специфічний зонд трансгена.
Модифікований аналіз Тадітап з детекцією по кінцевій точці: Отримували реакційну суміш, що містила наступні компоненти: вода, 15,35 мкл; 10-кратний буфер для проведення ПЛР, 2,50 мкл; МоСі» в концентрації 25 мМ, 1,50 мкл; аМТР в концентрації 10 мМ (по 2,5 мМ кожні), 2,0 мкл; загальний прямий праймер в концентрації 20 мкМ (ЗЕО ІЮ МО:1), 0,25 мкл; зворотний праймер дикого типу в концентрації 20 мкМ (ЗЕО ІО МО:2), 0,25 мкл; двічі мічений зонд дикого типу (ЗЕО ІЮО МО:3) в концентрації 10 мкМ, на 3' кінці мічений за допомогою МІС і на 5' кінці мічений за допомогою ВНО2, 0,20 мкл; Тад-полімераза Ноїзіаг (5 Од/мкл), 0,20 мкл; геномна
ДНК в концентрації 10 нг/мкл, 3,0 мкл.
Отримували другу реакційну суміш, що містила наступні компоненти: вода, 15,35 мкл; 10-
Зо кратний буфер для проведення ПЛР, 2,50 мкл; МосСі» в концентрації 25 мМ, 1,50 мкл; аМТР в концентрації 10 мМ (по 2,5 мМ кожні), 2,0 мкл; загальний прямий праймер в концентрації 20 мкм (ЗЕО ІЮ МО:1), 0,25 мкл; зворотний праймер 591227 в концентрації 20 мкМ (5ЕО ІЮ МО:4), 0,25 мкл; двічі мічений зонд 591227 (З5ЕО ІЮ МО:5) в концентрації 10 мкМ, мічений на 3' кінці за допомогою ЕАМ і на 5' кінці за допомогою ВНОТ, 0,20 мкл; Тад-полімераза Ноїзіаг (5 Од/мкл), 0,20 мкл; геномна ДНК в концентрації 10 нг/мкл, 3,0 мкл.
Обидві суміші розкопували в окрему ямку і ампліфікували, використовуючи систему для проведення ПЛР СепАтр 9700 при наступних умовах: 95 "С протягом 15 хвилин (1 цикл); 9570 протягом 15 секунд, 60 "С протягом 60 секунд (35 циклів). Зчитування флуоресцентного сигналу аналізували і зиготність визначали, виходячи із збудження флуорофору МІС або ГАМ.
Результати: Після визначення консервативності крайових послідовностей в сайті зв'язування праймерів праймери створювали і випробовували на об'ємних пулах насіння, використовуючи стандартний аналіз визначення зиготності Тадтап. Результати указали на те, що спосіб з однією реакцією виявився чутливим при визначенні домішки нульової насінини серед суворо гомозиготних насінин, взятих у великій кількості, з чутливістю детекції 1 95. Проте, спосіб з однією реакцією виявився незадовільним у визначенні домішки якого-небудь гемізиготного насіння при рівні наявності 195. Низька чутливість могла бути наслідком переважної ампліфікації реакції-ї (див. фіг. 1) через надмірну доступність матриці. Для розв'язання цієї проблеми конкуренції за ресурси в процесі реакції ПЛР спосіб з однією реакцією модифікували у велике число окремих реакцій (фіг. 3). Ця модифікація привела до вибіркової ампліфікації лише націленого регіону за відсутності якої-небудь конкуренції за ресурси.
Застосування способу з великим числом реакцій (тестування на зиготність спорідненого насіння) на батьківських "пулах насіння" показало достовірність визначення домішки як гемізиготних, так і звичайного (нульових) насіння у великій кількості суворо гомозиготних насінин з чутливістю детекції 1 95 (Таблиця 2). Результати також підтверджували за допомогою
ПЛР в режимі реального часу, використовуючи прилад Гідні Сусіег 480 фірми Коспе, для забезпечення відсутності артефактів в реакції ПЛР або встановлення їх.
Таблиця 2
Чутливість визначення зиготності різними способами
Достовірність Достовірність й Достовірність й
Спосіб визначення при визначення при ! 6 визначення при ! те контамінації 0 95 домішці гемізиготної домішці нульової насінини насінини
Спосіб з однією й числом реакцій
Скринінг батьківських ліній: Оскільки трансформант-специфічні праймери можуть бути використані для різного генетичного оточення, для випробування способу з великим числом реакцій використовували 92 відмінні інбредні лінії (Таблиця 1), які представляють різні гетерозисні групи, що виростають в місцевостях, таких як Північна Америка, Південна Америка і
Європа. Ці лінії випробовували і підтверджували, що вони вільні від контамінації трансгеном, використовуючи протокол, описаний вище.
Аналіз, використовуючи термоциклер в режимі реального часу Коспе 480 (фіг. 4 і 5), а також аналізи на основі ТадМап по кінцевій точці показали, що всі протестовані інбредні лінії мають консервативну крайову послідовність, фланкуючу вставку трансгена. Їх успішно ампліфікували з участю специфічного праймера/зонд УМТ, підтверджуючи, що праймери і зонди для аналізу трансформанта СА5-59122 можуть бути використані для програм інтрогресії при випробуванні зиготності батьківського насіння на остаточних лініях.
До деяких з переваг способу з великим числом реакцій належать всі переваги простоти і надійності тестування ДНК над тестом ЕГІЗА. Найважливіше, це дозволяє тестувати зиготність, використовуючи об'ємні пули насіння, на відміну від тестування ЕГІЗА, яке може ідентифікувати лише окремі рослини. Крім того, цей спосіб може знизити вартість процедури іевіег-гом/ і ЕГІЗА в десять разів. Цей спосіб також може підвищити чутливість аналізу і буде ідентифікувати і інші домішки. Спосіб з великим числом реакцій також може бути використаний як "індикатор" при випробуванні на наявність малих домішок (АР), що може бути використано для тестування на присутність непередбаченого трансформанта, а також повинно показати статус суворої гомозиготності об'ємної проби.
Тестування способом з великим числом реакцій довело високу чутливість у визначенні наявності домішки якого-небудь гемізиготного або нульового насіння в партії насіння суворо гомозиготних остаточних ліній. Було показано, що спосіб з великим числом реакцій може ідентифікувати домішку при рівні контамінації 1 95 (1 в 100 насінинах). Ця нова методологія привела до встановлення нового напрямку застосування високопродуктивного молекулярного аналізу (НТМА), що краще тестує ступінь чистоти у остаточних ліній, а також може забезпечити десятиразову економію при проведенні процедур в польових умовах.
Незважаючи на те, що даний винахід був описаний в декількох варіантах здійснення, даний винахід може бути додатково модифікований в межах суті і об'єму даного опису. Ця заявка, тому, охоплює будь-які варіанти, застосування або адаптацію винаходу, що використовують його основні принципи. Крім того, дана заявка охоплює такі відхилення від даного опису, які узгоджуються з відомою або звичайною практикою в даній галузі, до якої даний винахід належить і яка знаходиться в рамках прикладеної формули винаходу.
СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 рожш аддгоб5сіепсев 11 С
Спаппабабзахагайпуа, Спапага-звнекага «1205 СпОСОБИ ВИЗНАЧЕННЯ ЗИГОТНОСТІ В ОБ'ЄМНІЙ ПРОБІ «1305 2971-РІ0О228.1рс «1605 5 «1705 ватептіп мегзіоп 3.5 к?10» ії «2131» 27 «212» днк «2135 штучна «220» «223» Загальний прямий праймер «005 1 здазавчасуо задааададі давдуаа 27 «210» 2 -2115.Д27 «212» ДНК «2132 штучна «20» «223» Мт Зворотний праймер «400» 2 сдаасссаста чдатсатаєла сассто 27 «210» З «211» 27 «2125» днк «213» Штучна «220» «2232 шт Зонд «400» 3 даодасалас заасоаддаєс асадйаад 27 «210» 4 «2115 24 «212» днк «213» Штучна «гейх й «2232 0А5-591227-7 Зворотний праймер «4005 4 ссстаастст ссоастсатоа сад 24 «2105 5 «21ї» 26 «212» ДНК «2132 Штучна «220» «223» 0А5-591227-7 Зонд «АОО» 5 тІтазастда адйдсодоааа содсаа 25
Claims (5)
1. Спосіб визначення наявності або відсутності вставленої нуклеотидної послідовності в визначеному сайті вставки в об'ємному зразку нуклеїнової кислоти зі щонайменше 100 організмів, причому спосіб містить: приведення зразка нуклеїнової кислоти в контакт 3: прямим праймером, здатним зв'язуватися з нуклеїновою кислотою вище сайта вставки; і першим зворотним праймером, здатним зв'язуватися зі вставленою нуклеотидною послідовністю, і другим зворотним праймером, здатним зв'язуватися з нуклесїновою кислотою нижче сайта вставки; застосування праймерів для ампліфікації нуклеїнових кислот між праймерами; і аналіз ампліфікованих нуклеїнових кислот для визначення, присутності або відсутності вставленої нуклеотидної послідовності в зразку нуклеїнової кислоти, де репродуковані нуклеїнові кислоти включають послідовність, яка відповідає послідовності між прямим праймером і першим зворотним праймером в разі присутності вставленої нуклеотидної послідовності, і де репродуковані нуклеїнові кислоти включають послідовність, яка відповідає послідовності між прямим праймером і другим зворотним праймером в разі відсутності вставленої нуклеотидної послідовності.
2. Спосіб за п. 1, який додатково містить приведення ампліфікованих нуклеїнових кислот в контакт під час або після амплікації із зондом, специфічним для фрагмента, ампліфікованого при наявності вставленої нуклеотидної послідовності.
З. Спосіб за п. 1, який додатково містить приведення ампліфікованих нуклеїнових кислот в контакт під час або після амплікації із зондом, специфічним для фрагмента, ампліфікованого за відсутності вставленої нуклеотидної послідовності.
4. Спосіб за п. 2, який додатково містить приведення ампліфікованих нуклеїнових кислот в контакт під час або після амплікації із зондом, специфічним для фрагмента, ампліфікованого за відсутності вставленої нуклеотидної послідовності. Зо 5. Спосіб за п. 1, в якому нуклеїнові кислоти зразка містять більше ніж один повтор визначеного сайта вставки.
б. Спосіб за п. 1, в якому вставлена нуклеотидна послідовність присутня менше ніж в 1 95 конкретних сайтів вставки в нуклеїновій кислоті.
7. Спосіб за п. 1, в якому вставлена нуклеотидна послідовність присутня більше ніж в 99 95 конкретних сайтів вставки в нуклеїновій кислоті.
8. Спосіб визначення наявності або відсутності вставленої нуклеотидної послідовності у визначеному сайті вставки, в об'ємному зразку нуклеїнової кислоти з множини щонайменше 100 організмів, причому спосіб включає: розділення зразка нуклеїнової кислоти на щонайменше дві частини; здійснення першого аналізу на основі реакції ампліфікації, що включає приведення першої частини зразка нуклеїнової кислоти в контакт з прямим праймером, здатним зв'язуватися з нуклеїнової кислотою вище сайта вставки, і першим зворотним праймером, здатним зв'язуватися з нуклеїновою кислотою в межі вставленої нуклеотидної послідовності; застосування прямого праймера і першого зворотного праймера для отримання першого продукту ампліфікації, і визначення кількості першого продукту ампліфікації; здійснення другого аналізу на основі реакції ампліфікації, що включає приведення другої частини зразка нуклеїнової кислоти в контакт з прямим праймером, здатним зв'язуватися з нуклесновою кислотою вище сайта вставки; і другим зворотним праймером, здатним зв'язуватися з нуклеїновою кислотою нижче сайта вставки; застосування прямого праймера і другого зворотного праймера для одержання другого продукту ампліфікації, і визначення кількості другого продукту ампліфікації; і порівняння кількості першого продукту ампліфікації з кількістю другого продукту ампліфікації в зразку нуклеїнової кислоти, де кількість першого продукту ампліфікації вказує на кількість вставленої нуклеотидної послідовності, що присутня в зразку нуклеїнової кислоти.
9. Спосіб за п. 8, де здійснення першої реакції ампліфікації додатково містить приведення першої частини зразка нуклеїнової кислоти в контакт під час або після ампліфікації із зондом, специфічним для першого продукту ампліфікації.
10. Спосіб за п. 8, де здійснення другої реакції ампліфікації додатково містить приведення другої частини зразка нуклеїнової кислоти в контакт під час або після ампліфікації із зондом, специфічним для другого продукту ампліфікації.
11. Спосіб за п. 8, в якому нуклеотидні кислоти зразка містять більше ніж один повтор визначеного сайта вставки.
12. Спосіб за п. 8, в якому вставлена нуклеотидна послідовність присутня менше ніж в 1 95 конкретних сайтів вставки в зразку нуклеїнової кислоти.
13. Спосіб за п. 8, в якому вставлена нуклеотидна послідовність присутня більше ніж в 99 95 конкретних сайтів в зразку нуклеїнової кислоти.
14. Спосіб за п. 11, в якому спосіб використовують для визначення зиготності.
15. Спосіб за п. 11, в якому спосіб використовують для визначення домішки події вставки в зразку.
16. Спосіб за п. 11, в якому спосіб використовують як індикатор наявності/відсутності в об'ємному зразку додаткової події вставки. тва чо т і то і ! Шк ай те І; шт ж заенеь. М сн ПОМ ї Е - І 7 КЯ / М К; Я чав Е, ! хо БО що Фіг А ЗАВ ЕНВ К ВК НИ ФКНОЕЕ: ПІДУ КЕКВ КІРА ТЕН НЕХВ Круз авт ВОМС ВЕГУКрНВ ве ДАХ. окремих резхкнях, позначене вже: Безкція 1: Звувжьновй лука бнну ет фенВ врхану наежингю УМІКУ оон нн ем; Яеевха таких СК Ревжція 2: Неутрневів конеель ен їнесвтаа з зондом УС Пряме праймерна Я фа Зона Бад, дівхя всувиюх Грансте среннфізний І І х дв ЖЕ як увиний ек е таз: і сн (мічовнй КАМ НУТ снрнаяу ДАК ж ШИ нн ш - ВрЕ НИК; помознусемості Бевнсцкн- ше Мк івоя трансінез есть сих хею НВ ОЖ ЕЖНІ) встик Тезжюнай. ВОНЦКМЖМНЙ стаз КЕНЕ ІНЗМеуУЮВ В ВИК ЗЕД ЖеукР ТІВ» Є ВЕК СВ КИЕВЕ ВНУ
Фіг.185 тво но 130 Ї у ж. і ї фежсюк о «й
Фіг. 2А зво 730 с к - у7о В: шо М ГУ й 120 о
Фіг. 28 тва 1 ' ,Е Е «лю | С 320 мо 1 . .
ЖК. КО те ріг. З
Зміва форс ТА Шен щ зав Б слова ра; Ше пе ЗА ти Ба що «й ві АВ «а и пав хг п нн
5. БО. інвест во винними мими ІННИ нен сто пси по БІ шен сон Во АН М еВ мав НН вра Ак меш НечНКАНИ пев иа І и о и ЖЕ ї ВХ З Псоріаз ди Му ПОД зінсвокь с звоіннноЗ рдіннс: НЕ інки такса же ин нини чин пн по п п по п: п з вн у пріііві зиин 18 4 ЕЕ 5 З З 13 Я а Ку й КЕз З Я Ківклв
Фіг. 4 Зміна вок пп пп п пп нин нт я ря ! п век и ж НМ Ка я чо : рон бої як 3 их ас їж Я Са Шен КЗ х й вай Но со З дин СОН хоч Аа жКТАККОККАААЛ,НААААМК КАК тт ти тенісі теки? сома они най 5 Е нях. Бека У Нас ПИ пи й я й м й Рой МКхлот ех яд й Но
8. зд и се В У В несе ЗНИК а Як Енн нн нн тн Енн дертрттр туди дод денне 1 є Б і: ЗЕ 13 15 та Та Ес Я М З кн У Врвеоте у
Фіг. 5
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201061428142P | 2010-12-29 | 2010-12-29 | |
| PCT/US2011/067503 WO2012092327A2 (en) | 2010-12-29 | 2011-12-28 | Methods to determine zygosity in a bulked sample |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA112977C2 true UA112977C2 (uk) | 2016-11-25 |
Family
ID=46383837
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201309391A UA112977C2 (uk) | 2010-12-29 | 2011-12-28 | Спосіб визначення наявності або відсутності вставленої нуклеотидної послідовності в визначеному сайті вставки в об’ємному зразку нуклеїнової кислоти зі щонайменше 100 організмів |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20140017684A1 (uk) |
| EP (1) | EP2659006A4 (uk) |
| CN (1) | CN103403185A (uk) |
| AR (1) | AR084630A1 (uk) |
| AU (2) | AU2011352159A1 (uk) |
| BR (1) | BRPI1105703A2 (uk) |
| CA (1) | CA2822967A1 (uk) |
| CL (1) | CL2013001893A1 (uk) |
| CO (1) | CO6731137A2 (uk) |
| MX (1) | MX2013007573A (uk) |
| NZ (1) | NZ611916A (uk) |
| RU (2) | RU2605324C2 (uk) |
| UA (1) | UA112977C2 (uk) |
| UY (1) | UY33843A (uk) |
| WO (1) | WO2012092327A2 (uk) |
| ZA (1) | ZA201304475B (uk) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018100466A1 (en) * | 2016-11-30 | 2018-06-07 | Semiconductor Energy Laboratory Co., Ltd. | Display device, display module, and electronic device |
| WO2020197558A1 (en) * | 2019-03-28 | 2020-10-01 | Bioceres Llc | Soybean transgenic event ind-øø41ø-5 |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5428147A (en) * | 1983-04-15 | 1995-06-27 | Mycogen Plant Science, Inc. | Octopine T-DNA promoters |
| US6346655B1 (en) * | 1999-03-31 | 2002-02-12 | Syngenta Participations Ag | Trichothecne-Resistant transgenic plants |
| FR2796963B1 (fr) * | 1999-07-28 | 2001-09-28 | Rhobio | Procede d'obtention de lignees isotransgeniques |
| EP1620571B1 (en) * | 2003-05-02 | 2015-07-01 | Dow AgroSciences LLC | Corn event tc1507 and methods for detection thereof |
| WO2005059103A2 (en) * | 2003-12-15 | 2005-06-30 | Monsanto Technology Llc | Corn plant mon88017 and compositions and methods for detection thereof |
| AU2005292090B2 (en) * | 2004-09-29 | 2011-02-03 | Corteva Agriscience Llc | Corn event DAS-59122-7 and methods for detection thereof |
| AP2693A (en) * | 2005-05-27 | 2013-07-16 | Monsanto Technology Llc | Soybean event MON89788 and methods for detection thereof |
| WO2007015945A2 (en) * | 2005-07-29 | 2007-02-08 | Monsanto Technology Llc | Development of novel germplasm using segregates from transgenic crosses |
| EP1922409B1 (en) * | 2005-08-08 | 2017-11-08 | Bayer CropScience NV | Herbicide tolerant cotton plants and methods for identifying same |
| JP2009529875A (ja) * | 2006-03-17 | 2009-08-27 | メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド | プラスミド高生産性大腸菌クローンの遺伝子選択方法。 |
| CN1873010B (zh) * | 2006-04-14 | 2010-04-07 | 中国科学院武汉植物园 | 利用花生Ara h3启动子转基因载体的制备方法及应用 |
| US7928295B2 (en) * | 2006-08-24 | 2011-04-19 | Bayer Bioscience N.V. | Herbicide tolerant rice plants and methods for identifying same |
| CN103773863A (zh) * | 2007-04-05 | 2014-05-07 | 拜尔作物科学公司 | 抗虫棉花植物及其鉴定方法 |
| US8999634B2 (en) * | 2007-04-27 | 2015-04-07 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Nucleic acid detection combining amplification with fragmentation |
| EP2615173B1 (en) * | 2007-06-11 | 2020-09-16 | Basf Agricultural Solutions Seed Us Llc | Insect resistant cotton plants and methods for identifying same |
| US8097412B2 (en) * | 2008-07-12 | 2012-01-17 | Biodiagnostics, Inc. | DNA-based test for detection of annual and intermediate ryegrass |
-
2011
- 2011-12-28 UY UY0001033843A patent/UY33843A/es not_active Application Discontinuation
- 2011-12-28 WO PCT/US2011/067503 patent/WO2012092327A2/en active Application Filing
- 2011-12-28 RU RU2013135397/10A patent/RU2605324C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2011-12-28 AU AU2011352159A patent/AU2011352159A1/en not_active Abandoned
- 2011-12-28 CA CA2822967A patent/CA2822967A1/en not_active Abandoned
- 2011-12-28 EP EP11854026.9A patent/EP2659006A4/en not_active Ceased
- 2011-12-28 UA UAA201309391A patent/UA112977C2/uk unknown
- 2011-12-28 US US13/977,432 patent/US20140017684A1/en not_active Abandoned
- 2011-12-28 MX MX2013007573A patent/MX2013007573A/es unknown
- 2011-12-28 NZ NZ611916A patent/NZ611916A/en not_active IP Right Cessation
- 2011-12-28 CN CN2011800687297A patent/CN103403185A/zh active Pending
- 2011-12-28 RU RU2016144372A patent/RU2016144372A/ru not_active Application Discontinuation
- 2011-12-28 AR ARP110104981A patent/AR084630A1/es unknown
- 2011-12-29 BR BRPI1105703-3A patent/BRPI1105703A2/pt not_active Application Discontinuation
-
2013
- 2013-06-18 ZA ZA2013/04475A patent/ZA201304475B/en unknown
- 2013-06-26 CL CL2013001893A patent/CL2013001893A1/es unknown
- 2013-07-29 CO CO13179010A patent/CO6731137A2/es unknown
-
2016
- 2016-11-21 AU AU2016262648A patent/AU2016262648A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2605324C2 (ru) | 2016-12-20 |
| WO2012092327A2 (en) | 2012-07-05 |
| WO2012092327A3 (en) | 2013-01-10 |
| AU2011352159A1 (en) | 2013-07-04 |
| AU2016262648A1 (en) | 2016-12-08 |
| NZ611916A (en) | 2015-12-24 |
| CN103403185A (zh) | 2013-11-20 |
| BRPI1105703A2 (pt) | 2015-08-04 |
| CL2013001893A1 (es) | 2013-12-06 |
| US20140017684A1 (en) | 2014-01-16 |
| UY33843A (es) | 2012-07-31 |
| AR084630A1 (es) | 2013-05-29 |
| CA2822967A1 (en) | 2012-07-05 |
| RU2013135397A (ru) | 2015-02-10 |
| CO6731137A2 (es) | 2013-08-15 |
| ZA201304475B (en) | 2014-09-25 |
| EP2659006A4 (en) | 2014-10-29 |
| MX2013007573A (es) | 2013-07-22 |
| EP2659006A2 (en) | 2013-11-06 |
| RU2016144372A (ru) | 2018-12-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101411890B1 (ko) | 초위성체 마커를 이용한 무 품종 식별 방법 | |
| Ellis et al. | Detection of rare paternal chloroplast inheritance in controlled crosses of the endangered sunflower Helianthus verticillatus | |
| CN110724758B (zh) | 一种基于snp标记鉴定京农科728玉米杂交种纯度的方法 | |
| CN109609671B (zh) | 一种检测芸薹种蔬菜叶缘裂刻性状的snp分子标记及其应用 | |
| CN109295179B (zh) | 一种筛选不同锌含量和铁含量小麦的方法及其专用试剂盒 | |
| CN110777216B (zh) | 一种基于snp标记鉴定京科糯2000玉米杂交种纯度的方法 | |
| US20220186289A1 (en) | Molecular marker related to wool yield of long-haired rabbit and use thereof | |
| CN117683927A (zh) | 水稻抗稻瘟病基因的功能性kasp分子标记及其应用 | |
| US20030027138A1 (en) | DNA markers for assessing seed purity and a method of using DNA sequences for assessing seed purity | |
| UA112977C2 (uk) | Спосіб визначення наявності або відсутності вставленої нуклеотидної послідовності в визначеному сайті вставки в об’ємному зразку нуклеїнової кислоти зі щонайменше 100 організмів | |
| CN102994643B (zh) | 用于检测鸡fmo3基因a1034t突变的引物和探针 | |
| CN111593135A (zh) | 一种鉴别转基因材料及其自交、杂交、回交后代中内、外源基因的检测引物和方法 | |
| CN116287387A (zh) | 一种辣椒PMMoV抗性基因L3紧密连锁的SNP位点、KASP分子标记及应用 | |
| WO2019035480A1 (ja) | ブラシカ・オレラセア植物の異型検出法 | |
| Vasile et al. | DNA-based methods used for varietal purity detection in wheat cultivars | |
| CN109913575B (zh) | 一种鉴定辣椒cms雄性不育恢复基因的kasp分子标记、试剂盒及其应用 | |
| CN114107555B (zh) | 一种检测小麦品种纯度的snp分子标记组合及其应用 | |
| Deshmukh et al. | A non-destructive seed sampling method for high throughput genotyping in groundnut | |
| CN116287373B (zh) | 小麦穗粒数主效qtl紧密连锁的kasp分子标记及其方法与应用 | |
| CN117604151B (zh) | 一种与甘蓝型油菜黑胫病基因BnRlm1紧密连锁的SNP分子标记及其应用 | |
| JP2011030567A (ja) | 短稈コシヒカリ型の水稲品種ヒカリ新世紀のｄｎａ識別法 | |
| CN107164514A (zh) | 转基因甜菜gtsb77品系特异性实时荧光pcr检测引物、探针、方法和试剂盒 | |
| US20230089175A1 (en) | Rice event GSX2-55 | |
| Gupta et al. | A non-PCR-based Invader® assay quantitatively detects single-copy genes in complex plant genomes | |
| CN116855631A (zh) | 一种鉴定待测小麦的黑胚病抗性的方法及分子标记 |