WO2022239824A1 - 新規べと病抵抗性遺伝子を有するホウレンソウ植物 - Google Patents

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WO2022239824A1
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downy mildew
chr4
resistant
gene
spinach plant
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雄一 杉原
遥 中村
亮 木村
陽介 森玉
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株式会社サカタのタネ
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Definitions

  • the present invention relates to spinach plants having genes that provide resistance to broad-spectrum downy mildew, and methods for producing the same.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2021-080911 filed in Japan on May 12, 2021, the content of which is incorporated herein.
  • Spinach (Spinacia oleracea L.) is an annual or perennial plant belonging to the family Amaranthaceae, genus Spinach.
  • the basal leaves (rosette-shaped) of spinach are mainly eaten, and the content of vitamins, iron, and calcium is particularly high among vegetables, and the nutritional value is extremely high.
  • the baby leaf market has expanded rapidly worldwide due to its nutritional value and convenience.
  • spinach is positioned as one of the important vegetables.
  • Plant varieties generally include fixed species and hybrid first-generation (hereinafter referred to as "F1") varieties, and F1 varieties are widespread in major crops.
  • the F1 variety grows vigorously due to hybrid vigor (heterosis).
  • hybrid vigor heterosis
  • the F1 variety has great advantages such as fast growth and high yield, and is expected to have improved environmental adaptability such as resistance to pests and cold and heat resistance.
  • the F1 cultivar exhibits extremely high phenotype uniformity because it has the same genotype even though it is heterozygous. This increases the marketability of the product.
  • useful traits controlled by dominant genes in the parents of the F1 variety can be accumulated, rapid breeding becomes possible.
  • Non-Patent Document 2 The search for new resistant materials is very important in spinach breeding in order to respond to the continuous emergence of new races.
  • a search for downy mildew-resistant genetic material is being conducted not only for cultivated species but also for wild species. For example, by the Center for Genetic Resources, the Netherlands (CGN), in 2008, Spinacia turkestanica, a wild spinach, and in 2011, Spinacia tetrandra, a wild spinach. A search for disease-resistant genetic material was carried out. Also, in 2011, Correll et al. announced that six types of genes called RPF control known downy mildew resistance (Non-Patent Document 2).
  • RPF1 to RPF10 RPF11 (Patent Document 1), RPF12 (Patent Document 2), RPF13 (Patent Document 3), RPF14 (Patent Document 4), RPF15 (Patent Document 5), R6 (Patent Document 6), R15 (Patent Document 7), etc.
  • Spinach with high downy mildew resistance can be produced by introducing a downy mildew-resistant gene derived from wild spinach into a cultivated spinach, Spinacia oleracea L. (Patent Document 8). .
  • the RPF gene is multiple alleles at one locus, called the RPF locus, or multiple closely linked genes, and in F1 breeds, having two alleles allows for a wide range of resistance.
  • Non-Patent Document 3 Patent Document 5
  • the RPF1 gene, RPF2 gene and RPF3 gene are located on chromosome 3
  • the RPF15 gene is also located on chromosome 3 (Patent Document 5).
  • the downy mildew-resistant gene described in Patent Document 8 is said to be located in linkage group 6, but according to sequence information, it is actually located on chromosome 3 (Patent Document 5).
  • a downy mildew-resistant locus is flanked by one or two WOLF genes, which are roughly divided into alpha WOLF gene and beta WOLF gene according to their structure (Patent Document 9).
  • the alpha and beta WOLF genes each contain multiple alleles conferring specific resistance profiles, and the LRR domain sequences of each WOLF gene and the resistance pattern to downy mildew races of each genotype are disclosed. .
  • conventional crossbreeding makes it virtually impossible to arbitrarily combine very tightly linked genes. For this reason, the RPF genes have been collectively treated as one gene so far.
  • GMO downy mildew-resistant genes
  • Gene Editing the creation of mutants that impart desired resistance patterns by modifying endogenous genes
  • the downy mildew resistance gene p10 is located on chromosome 1 and is located on Pfs1, Pfs2, Pfs3, Pfs4, Pfs5, Pfs6, Pfs7, Pfs8, Pfs9, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs13, Pfs14, Pfs15, and Pfs16. Reported to exhibit resistance.
  • the resistance conferred by the p10 gene is expressed only when homozygous, and the degree of resistance is intermediate (Patent Document 10). Therefore, it is presumed that the breeding of resistant cultivars using the p10 gene is not only more difficult than breeding using the dominant resistant gene, but also the degree of resistance is not practically sufficient. .
  • CGN25474: MGK 18: RNR120251 has a downy mildew resistance gene in chromosome 4, Pfs4, Pfs7, Pfs9, Pfs10, Pfs11, Pfs12 , Pfs13, Pfs14, Pfs15, Pfs16, and Pfs17 (Patent Document 11).
  • a resistance gene that exists on a chromosome other than chromosome 3 can be used, it can be expected to be highly effective in accumulating downy mildew resistance genes.
  • the diversification of the downy mildew resistance gene can be further promoted and the occurrence of a new race of downy mildew can be suppressed.
  • the present invention is not present on chromosome 3 and provides resistance to a wider range of races than known resistance genes.
  • it provides a novel downy mildew resistance gene that is different from the previously reported resistance genes on chromosome 4. That is, the present invention utilizes a spinach plant having a novel downy mildew-resistant gene that exhibits resistance to a wide range of races, a method for producing the spinach plant, and a strain imparted with downy mildew resistance resulting from the gene.
  • An object of the present invention is to provide an F1 plant of spinach and a method for producing its seeds.
  • CGN25466 MGK 01: RNR120234
  • CGN25466 MGK 01
  • interspecific crossing between the wild spinach having the downy mildew resistance gene and the cultivated spinach is performed to obtain an F1 individual having downy mildew resistance, and the F1 individual is further crossed with the cultivated spinach.
  • the present inventors have found that spinach plants having downy mildew resistance attributed to the downy mildew-resistant gene and traits close to those of cultivated species can be grown, and have completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • [1] Spinacia tetrandra line CGN25466: a spinach plant having the downy mildew-resistant RTM-1 gene located on chromosome 4 of MGK 01 (excluding Spinacia tetrandra), downy mildew Resistant spinach plants.
  • the SNP identified by chr4_8488603 is cytosine
  • the SNP identified by chr4_8494600 is thymine
  • the SNP identified by chr4_8510715 is guanine
  • the SNP identified by chr4_7962907 is guanine
  • the SNP identified by chr4_8152986 is cytosine
  • the SNP identified by chr4_8190990 is guanine
  • the SNP identified by chr4_8488603 is cytosine
  • the SNP identified by chr4_8494600 is thymine
  • the SNP identified by chr4_8510715 is guanine
  • the SNP identified by chr4_8617232 is guanine
  • the downy mildew-resistant spinach plant according to any one of the above [1] to [5].
  • a first crossing step of crossing a spinach plant having the RTM-1 gene with any spinach plant The F1 individual obtained in the first crossing step is selfed, backcrossed, or interspecific or intraspecific crossed with a spinach plant different from the parental line used in the first crossing step, and separated. a second crossing step to obtain a population; A selection step of selecting spinach plants having the RTM-1 gene from the segregating population; A method for producing a downy mildew-resistant spinach plant, comprising: [17] The downy mildew-resistant spinach plant of [16], wherein the spinach plant having the RTM-1 gene is Spinasia tetrandra or the downy mildew-resistant spinach plant of any one of [1] to [13]. A method for producing a spinach plant.
  • Any spinach plant, or a parent line used in interspecific or intraspecific crossing in the second crossing step, is a spinach plant having at least one downy mildew-resistant gene other than the RTM-1 gene.
  • One species selected from the group consisting of the SNP identified by chr4_8488603, the SNP identified by chr4_8494600, the SNP identified by chr4_8510715, and SNPs genetically strongly linked to these SNPs in spinach plants A DNA marker for selecting spinach plants having the RTM-1 gene comprising the above.
  • a primer set for identifying the genotype of the SNP identified by chr4_8488603 in spinach plants one or more primer sets selected from the group consisting of a primer set for identifying the genotype of the SNP identified by chr4_8494600 and a primer set for identifying the genotype of the SNP identified by chr4_8510715;
  • a kit used for selecting spinach plants having the RTM-1 gene A kit used for selecting spinach plants having the RTM-1 gene.
  • the primer set for identifying the genotype of the SNP identified by chr4_8488603 includes a primer having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13, a primer having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14, and a primer having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15. Consists of a primer consisting of a nucleotide sequence represented,
  • the primer set for identifying the genotype of the SNP identified by chr4_8494600 includes a primer having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16, a primer having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17, and a primer having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18.
  • the primer set for identifying the genotype of the SNP identified by chr4_8510715 includes a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 19, a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 20, and a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 21.
  • the present invention provides downy mildew resistant spinach plants that are resistant to a wide range of races. Moreover, by using the spinach plant according to the present invention as a parent line, it is also possible to develop novel spinach lines that exhibit resistance to a wide range of races.
  • Example 6 it is a linkage map near the RTM-1 gene locus on chromosome 4 of spinach.
  • a spinach plant is a plant classified into the genus Spinacia.
  • wild spinach include Spinasia tetrandra, Spinasia turquestanica, and the like.
  • Spinacia oleracea L. can be mentioned as a cultivar of spinach.
  • the term "cultivar” refers to a plant of a strain to be cultivated, and includes not only fixed species but also F1 varieties.
  • downy mildew is a disease caused by bacteria belonging to the family Peronosporaceae.
  • Spinach downy mildew is mainly caused by Pfs (Peronospora farinosa differentiated spinassiae), currently numbered from Pfs1 to Pfs19.
  • Pfs Peronospora farinosa differentiated spinassiae
  • chlorrX_Y (X and Y are integers) of a spinach plant is a reference genome published at "SpinachBase (http://spinachbase.org/)" among the genomes of the spinach plant.
  • a base corresponding to the Y-th base of chromosome number X (also referred to as chromosome X) in (Spinach genome sequence (v1)) is a reference genome published at "SpinachBase (http://spinachbase.org/)
  • the “base corresponding to the Y-th base of chromosome X on the SpinachBase reference genome” in a certain spinach plant means that the base sequence of the genomic DNA of the spinach plant and the base sequence of the SpinachBase reference genome are the most It can be determined by aligning to increase homology (sequence identity). Therefore, the X chromosome of a certain spinach plant is determined by aligning the base sequence of the genomic DNA of the spinach plant and the base sequence of the SpinachBase reference genome so that the homology (sequence identity) is maximized. It can be designated as the X chromosome of plants.
  • chromosome includes not only the entire chromosome but also a part thereof. In other words, a "part of a chromosome” may also be simply referred to as a "chromosome.”
  • X locus is "the site occupied by the X gene in the chromosome”. Therefore, in the present invention and the specification of the present application, "a spinach plant having an X locus” is a spinach plant having a site occupied by the X gene in the chromosome, and is synonymous with "a spinach plant having an X gene”. be.
  • the "manufacturing method” can also be called a “creation method”, a “cultivation method”, or a “production method”. That is, the terms “manufacturing”, “creation”, “cultivation”, and “production” are used interchangeably.
  • plant part includes cells or tissues of the plant, and specific examples include leaves, seeds, flowers, stems, roots, fruits, and the like. be done. In addition, protoplasts obtained from cells of the plant are also included.
  • the downy mildew-resistant spinach plant according to the present invention has the RTM-1 gene, which is a downy mildew-resistant gene located on chromosome 4 of Spinasia Tetrandra strain CGN25466: MGK01, which is a wild type spinach. spinach plants other than Spinathia tetrandra.
  • the RTM-1 gene is a gene located within the range from chr4_7962907 to chr4_8617232 of chromosome 4 of Spinathia tetrandra strain CGN25466:MGK01.
  • the RTM-1 gene is associated with at least the downy mildew races Pfs1, Pfs2, Pfs3, Pfs4, Pfs5, Pfs6, Pfs7, Pfs8, Pfs9, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs13, Pfs14, Pfs15, Pfs16, Pfs17, Pfs18, Pfs19 , and confers resistance to race exhibited by the UA1014 strain.
  • downy mildew resistance derived from the RTM-1 gene means at least downy mildew races Pfs1, Pfs2, Pfs3, Pfs4, Pfs5, Pfs6, Pfs7, Pfs8, Pfs9, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Denotes resistance to race exhibited by Pfs13, Pfs14, Pfs15, Pfs16, Pfs17, Pfs18, Pfs19, and UA1014 strains.
  • the ability of a single gene to confer resistance to such a wide range of races makes the RTM-1 gene an unprecedented and excellent downy mildew resistance gene.
  • the RTM-1 gene is a gene that is dominantly inherited to progeny. Therefore, the spinach plant according to the present invention may be a spinach plant in which the RTM-1 gene is homozygous, that is, a spinach plant having the RTM-1 gene homozygously, or a spinach plant having the RTM-1 gene heterozygously It may be a plant.
  • the spinach plant according to the present invention has a single dominant downy mildew resistance gene, the RTM-1 gene, which alone confers resistance to a very wide range of downy mildew races, so it is highly resistant to downy mildew. Excellent for
  • a downy mildew-resistant spinach plant according to the present invention can be produced by introducing the RTM-1 gene into the genomic DNA of a spinach plant other than Spinasia tetrandra.
  • Introduction of the RTM-1 gene into genomic DNA is performed by, for example, introducing a chromosomal fragment containing the RTM-1 gene locus (RTM-1 locus) in chromosome 4 of Spinasia tetrandra strain CGN25466: MGK01. It can be done by The site in the chromosome into which the chromosomal fragment containing the RTM-1 locus is introduced is not particularly limited, and may be extrachromosomal.
  • the downy mildew-resistant spinach plant according to the present invention includes a spinach plant in which a chromosome fragment containing the RTM-1 locus has replaced the region corresponding to the fragment in chromosome 4, a translocation, etc. spinach plants into which a chromosomal fragment containing the RTM-1 locus has been introduced outside the region corresponding to the RTM-1 locus in chromosome 4 of Spinathia tetrandra.
  • the chromosome fragment containing the RTM-1 locus may be a fragment containing the entire region from chr4_7962907 to chr4_8617232 of the 4th chromosome of Spinacia tetrandra strain CGN25466:MGK01, or the region from chr4_7962907 to chr4_8617232. It may be a fragment of the portion containing the RTM-1 locus.
  • the fragment containing the RTM-1 locus is preferably a fragment containing the region from chr4_8488603 to chr4_8510715 of chromosome 4 of Spinasia tetrandra strain CGN25466:MGK01.
  • the fragment is preferably a chromosomal fragment containing the region from chr4_8488603 to chr4_8510715 in the region from chr4_7962907 to chr4_8617232. That is, the downy mildew-resistant spinach plant according to the present invention includes a fragment containing a range from chr4_8488603 to chr4_8510715 on chromosome 4 of Spinasia tetrandra strain CGN25466: MGK01 in at least one allele of chromosome 4. Containing spinach plants are preferred.
  • the chromosomal fragment containing the RTM-1 locus includes a chromosomal fragment containing the region from chr4_7962907 to chr4_8617232 of the 4th chromosome of Spinasia tetrandra strain CGN25466: MGK01, and a chromosome containing the region from chr4_7421480 to chr4_10710358. It may be a fragment.
  • the introduction of the RTM-1 gene into the genomic DNA can be carried out by cross-breeding using Spinacia tetrandra as the parent strain, or by genetic modification methods such as genome editing.
  • the downy mildew-resistant spinach plant according to the present invention is an interspecific hybrid plant between Spinasia tetrandra and a spinach plant other than Spinasia tetrandra, and has downy mildew resistance derived from the RTM-1 gene.
  • derived from plants that have "Interspecific hybrid plants” include, in addition to plants produced by interspecies crossing of species belonging to the genus Spinasia, somatic cell hybrid plants resulting from cell fusion between different species of plants of the genus Spinasia, and plants of the genus Spinasia. Also included are grafted hybrid plants obtained by grafting between different species.
  • an interspecific hybrid plant between Spinasia tetrandra and a spinach plant other than Spinasia tetrandra includes not only the interspecific hybrid plant but also progeny of the interspecific hybrid plant.
  • progeny of a spinach plant means, in addition to progeny obtained by intraspecific crossing of the spinach plant, an individual obtained as a parent line of the spinach plant and its progeny, and the spinach plant. It includes somatic hybrid plants and their progeny obtained by cell fusion between cells and plant cells of other cultivars, and individuals obtained by grafting the spinach plant as a rootstock or scion and their progeny. "Progeny” includes both individuals resulting from intraspecific and interspecific hybrids.
  • individual obtained from a (plant) parental line means an individual obtained by intraspecific crossing, interspecific crossing, cell fusion, or grafting using the plant as a parental line.
  • the downy mildew-resistant spinach plant according to the present invention can be produced by crossing Spinacia tetrandra with a spinach plant other than Spinacia tetrandra.
  • An F1 individual obtained by interspecific crossing using Spinassia tetrandra as a parental strain has one allele of chromosome 4 on chromosome 4 having the RTM-1 gene derived from Spinasia tetrandra. Since the RTM-1 gene is a dominant gene, F1 individuals with chromosome 4 from Spinathia tetrandra have downy mildew resistance derived from the RTM-1 gene.
  • the spinach plant used as a material for producing downy mildew-resistant spinach plants according to the present invention is not particularly limited as long as it has the RTM-1 gene possessed by CGN25466:MGK01.
  • the strains of Spinacia tetrandra include progeny strains inheriting the RTM-1 gene from CGN25466:MGK01.
  • the parent line to be crossed with Spinacia tetrandra is not particularly limited as long as it is a spinach plant other than Spinacia tetrandra, but is cultivated as an agricultural crop. It is preferably a cultivar spinach plant.
  • Spinacia tetrandra is a wild species, and its traits such as germination, pollen quality, leaf color and leaf shape are inferior to cultivated spinach as an agricultural product.
  • a cultivar spinach plant as a parent line to be crossed with Spinassia tetrandra, traits other than downy mildew resistance of the resulting downy mildew-resistant spinach plant can be brought closer to desirable traits as agricultural crops.
  • Cultivated spinach plants include Spinacia oleracea L and interspecific hybrid spinach plants produced using Spinacia oleracea L as a parent line.
  • the downy mildew-resistant spinach plant according to the present invention may be the progeny of an F1 individual obtained by interspecific crossing between Spinasia tetrandra and a spinach plant other than Spinasia tetrandra.
  • a spinach plant other than Spinasia tetrandra For example, spinachia tetrandra and cultivar spinach plants are crossed to obtain F1 seeds, and plant individuals grown from the obtained F1 seeds are backcrossed or selfed with cultivar spinach plant individuals to obtain seeds. Then, individuals having the RTM-1 gene are selected from plant individuals grown from the obtained seeds.
  • Downy mildew-resistant spinach is obtained by repeatedly crossing the selected plant individual with a self-fertilized or cultivated spinach plant and selecting an individual having the RTM-1 gene from the progeny obtained by the crossing. A fixed seed of the plant can be obtained. Selfing, crossing with cultivar spinach plants, cultivation, and collection of seeds can be carried out according to conventional spinach cultivation methods.
  • Individuals having the RTM-1 gene from progeny obtained by crossing can be selected, for example, by examining downy mildew resistance. Specifically, Pfs of each race is inoculated to the leaves of test plant individuals to be examined for downy mildew resistance, and the presence or absence of downy mildew disease is examined. If the test plant does not develop downy mildew, it is evaluated as being resistant to the inoculated race.
  • Individuals having the RTM-1 gene can be selected from progeny obtained by crossing, for example, by examining whether the genomic DNA contains a chromosomal fragment containing the RTM-1 gene. Specifically, using DNA markers in the region from chr4_7962907 to chr4_8617232 and its vicinity in chromosome 4 of a spinach plant, it was determined whether these regions were a chromosomal fragment derived from the Spinacia tetrandra strain CGN25466:MGK01. , discriminates chromosome fragments derived from spinach plants other than Spinasia tetrandra.
  • a DNA marker is one that can detect differences in DNA sequences on chromosomes that can distinguish between chromosome fragments derived from different breeds.
  • DNA markers include SNP (Single Nucleotide Polymorphism) markers, SSR (Simple Sequence Repeats) markers, and RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) markers. be done.
  • DNA markers can be detected by a conventional method. For example, using DNA extracted from each plant as a template, a nucleic acid amplification reaction is performed using primers and a polymerase that can specifically hybridize with a specific SNP or SSR, and the presence or absence of an amplified product is determined using electrophoresis or the like. Each polymorphism can be detected and identified. In addition, each polymorphism can be identified by detecting the pattern of DNA fragments by electrophoresis or the like after treating the DNA extracted from each individual plant with a restriction enzyme.
  • Primers that can specifically hybridize with specific SNPs and SSRs are selected according to the nucleotide sequence of the genomic DNA of spinach and the nucleotide sequences of the SNPs and SSRs to be detected using commonly used primer design tools and the like. can be designed by conventional methods and synthesized by methods well known in the art.
  • DNA markers used for selecting individuals having the RTM-1 gene include, for example, the region from chr4_7962907 to chr4_8617232 and SNPs in the vicinity thereof. ⁇ SNP ⁇ chr4_7421480 ⁇ chr4_7962907 ⁇ chr4_8152986 ⁇ chr4_8190990 ⁇ chr4_8488603 ⁇ chr4_8494600 ⁇ chr4_8500200 ⁇ chr4_8502319 ⁇ chr4_8502334 ⁇ chr4_8502394 ⁇ chr4_8510715 ⁇ chr4_8617232 ⁇ chr4_10710358 ⁇ These SNP bases can be identified using, for example, KASP (Kompetitive Allele Specific PCR) genotyping assay (manufactured by LGC Genomics).
  • KASP Kompetitive Allele Specific PCR
  • Table 1 shows the genotypes of the Spinacia tetrandra strain CGN25466:MGK01 and the genotypes of the reference genome published in SpinachBase.
  • G means guanine
  • C means cytosine
  • A means adenine
  • T means thymine.
  • a spinach plant having a homozygous or heterozygous fragment containing a range from chr4_8488603 to chr4_8510715 of chromosome 4 of Spinacia tetrandra line CGN25466:MGK01 In at least one allele of chromosome 4, the SNP identified by chr4_8488603 is cytosine, the SNP identified by chr4_8494600 is thymine, and the SNP identified by chr4_8510715 is guanine.
  • Spinachia tetrandra strain CGN25466 As a spinach plant having a homozygous or heterozygous fragment containing a range from chr4_7962907 to chr4_8617232 of chromosome 4 of MGK01, chr4_7962907 is specified in at least one allele of chromosome 4.
  • the SNP identified by chr4_8152986 is cytosine
  • the SNP identified by chr4_8190990 is guanine
  • the SNP identified by chr4_8488603 is cytosine
  • the SNP identified by chr4_8494600 is thymine.
  • Spinacia tetrandra strain CGN25466 As a spinach plant having a homozygous or heterozygous fragment containing the range from chr4_7962907 to chr4_8617232 of chromosome 4 of MGK01, chr4_7962907 is specified in at least one allele of chromosome 4.
  • the SNP is guanine
  • the SNP identified by chr4_8152986 is cytosine
  • the SNP identified by chr4_8190990 is guanine
  • the SNP identified by chr4_8488603 is cytosine
  • the SNP identified by chr4_8494600 is thymine
  • the SNP identified by chr4_8500200 is thymine
  • the SNP identified by chr4_8502319 is cytosine
  • the SNP identified by chr4_8502334 is guanine
  • the SNP identified by chr4_8502394 is guanine
  • the SNP identified by chr4_8510715 is guanine and the SNP identified in chr4_8617232 is guanine.
  • the downy mildew-resistant spinach plant according to the present invention preferably has traits other than downy mildew resistance, particularly traits as an agricultural product, that are the same as or similar to cultivated spinach.
  • the traits of agricultural crops include taste, leaf shape, yield, ease of cultivation, and the like.
  • the "cultivated traits” means traits suitable for agricultural crops.
  • Downy mildew-resistant spinach plants according to the present invention include, for example, the TNKH-1 line (accession number FERM BP-22404) and the TNKH-2 line (accession number FERM BP-22405). These two lines cut the link between the poor trait of Spinacia tetrandra and the RTM-1 gene, and maintained the downy mildew resistance derived from the RTM-1 gene, while combining the traits as a cultivated species. there is In addition, downy mildew-resistant spinach plants derived from plants identified by these strains are also included in the downy mildew-resistant spinach plants according to the present invention.
  • Plant-derived downy mildew-resistant spinach plants identified by the TNKH-1 line include, in addition to the TNKH-1 line, hybrid plants obtained using the TNKH-1 line as a parent line, and their progeny. and spinach plants with downy mildew resistance derived from the RTM-1 gene. So are downy mildew-resistant plant-derived spinach plants identified in the TNKH-2 lineage.
  • the downy mildew-resistant spinach plant according to the present invention preferably has at least one downy mildew-resistant gene other than the RTM-1 gene.
  • the RTM-1 gene alone can confer resistance to a wider range of races than known resistance genes, but it also has other downy mildew resistance genes to break through resistance. It can also be expected to contribute to suppressing the appearance of
  • the downy mildew-resistant gene other than the RTM-1 gene is not particularly limited, and includes, for example, RPF1 to RPF15 genes, R6 gene, R15 gene, and the like.
  • the downy mildew-resistant spinach plant according to the present invention may be either the whole plant or a part of the plant. That is, the downy mildew-resistant spinach plant of the present invention includes all of the spinach plant having the RTM-1 gene, the above-ground part of the spinach plant, and the tissue of the spinach plant.
  • a downy mildew-resistant spinach plant according to the present invention also includes cells obtained from a tissue of a spinach plant carrying the RTM-1 gene. Tissues can include embryos, meristematic cells, callus, pollen, leaves, anthers, stems, petioles, roots, root tips, fruits, seeds, flowers, cotyledons, and hypocotyls.
  • the downy mildew resistance of the downy mildew-resistant spinach plants according to the present invention exhibits dominant expression. Therefore, by crossing interspecifically or intraspecifically with the downy mildew-resistant spinach plant according to the present invention as a parent line, a new spinach plant strain resistant to downy mildew derived from the RTM-1 gene is developed. becomes possible.
  • the method for screening a downy mildew-resistant spinach plant according to the present invention examines whether a test spinach plant has the RTM-1 gene, and if it is determined to have the RTM-1 gene, the test spinach plant. Select as downy mildew resistant spinach plants.
  • whether or not the test spinach plant has the RTM-1 gene is determined by determining whether or not the test spinach plant has the RTM-1 gene. A judgment is made based on the genotype of the DNA marker that is strongly linked to the DNA marker.
  • the genotype of the RTM-1 locus or DNA markers in the vicinity thereof and DNA markers strongly linked to these DNA markers are CGN25466: RTM-1 gene such as MGK 01 strain and having the same genotype as Spinatia tetrandra, which exhibits downy mildew resistance, the test spinach plant is selected as a downy mildew resistant spinach plant.
  • DNA markers for determining the presence or absence of the RTM-1 gene include the SNPs listed in Table 1. Among them, one species selected from the group consisting of the SNP identified by chr4_8488603, the SNP identified by chr4_8494600, the SNP identified by chr4_8510715, and SNPs genetically strongly linked to these SNPs in spinach plants The above is suitable as a DNA marker for determining the presence or absence of the RTM-1 gene.
  • the test spinach plant is and select as a disease-resistant spinach plant.
  • the presence or absence of the RTM-1 gene can be more easily determined by using the kit. Selection for downy mildew resistant spinach plants can be done at discretion.
  • a primer set for identifying the genotype of the SNP identified by chr4_8488603 of a spinach plant For example, a primer set for identifying the genotype of the SNP identified by chr4_8488603 of a spinach plant, a primer set for identifying the genotype of the SNP identified by chr4_8494600, and the genotype of the SNP identified by chr4_8510715
  • a kit containing one or more primer sets selected from the group consisting of primer sets for identification is useful for genotype identification of these SNPs for determining the presence or absence of the RTM-1 gene in test spinach plants. be.
  • the method for predicting downy mildew resistance of a spinach plant according to the present invention examines whether the test spinach plant has the RTM-1 gene, and if it is determined to have the RTM-1 gene, the test spinach plant are likely to be downy mildew resistant.
  • whether or not a test spinach plant has the RTM-1 gene is determined by determining whether or not the test spinach plant has the RTM-1 gene on chromosome 4 or a DNA marker at or near the RTM-1 locus, or these based on the genotype of DNA markers that are strongly linked to the DNA markers of .
  • the genotype of the RTM-1 locus or DNA markers in the vicinity thereof and DNA markers strongly linked to these DNA markers are CGN25466: RTM-1 gene such as MGK 01 strain and has the same genotype as Spinacia tetrandra that exhibits downy mildew resistance, it is determined that the test spinach plant has the RTM-1 gene, and CGN25466: RTM-1 such as MGK 01 strain If the genotype is different from that of Spinatia tetrandra, which carries the gene and exhibits downy mildew resistance, it is determined that the test spinach plant does not carry the RTM-1 gene.
  • DNA markers for determining the presence or absence of the RTM-1 gene include the SNPs listed in Table 1. Among them, one or more species selected from the group consisting of the SNP identified by chr4_8488603 of spinach plants, the SNP identified by chr4_8494600, the SNP identified by chr4_8510715, and SNPs that are genetically strongly linked to these SNPs is suitable as a DNA marker for predicting downy mildew resistance.
  • the test spinach plant is RTM It has the -1 gene and is predicted to be likely to be resistant to downy mildew.
  • the primer set for identifying the genotype of the DNA marker for determining the presence or absence of the RTM-1 gene and the kit thereof may be the same as those described above.
  • ⁇ Method for producing downy mildew-resistant spinach plant By crossing a spinach plant having the RTM-1 gene as a material, downy mildew resistance derived from the RTM-1 gene is introduced into the spinach plant not having the RTM-1 gene to create a novel downy mildew. Disease resistant spinach plants can be produced.
  • the RTM-1 gene which is a single dominant resistance gene, can be easily introduced into any line and can accelerate the breeding of spinach varieties.
  • the RTM-1 gene can coexist in the same haplotype with other single dominant resistance alleles. Therefore, by using a spinach plant having the RTM-1 gene as a parent line, it becomes easier to breed cultivars having resistance to a wider range of races.
  • the method for producing downy mildew-resistant spinach plants according to the present invention is a method that utilizes crossbreeding using a spinach plant having the RTM-1 gene as a parent line. Specifically, a first crossing step of crossing a spinach plant having the RTM-1 gene with any spinach plant, and the F1 individuals obtained by the first crossing step are selfed, backcrossed, or A second crossing step of obtaining a segregating population by performing interspecific crossing or intraspecific crossing with a spinach plant different from the parental line used in the first crossing step, and spinach plants having the RTM-1 gene from the segregating population. and a selection step of selecting. Selfing, backcrossing, interspecific crossing, intraspecific crossing, cultivation of spinach plants, and harvesting of seeds can be carried out by conventional spinach cultivation methods.
  • the spinach plant having the RTM-1 gene used as the parent line in the first crossing step Spinasia tetrandra can be used, and the downy mildew-resistant spinach plant according to the present invention can also be used.
  • the spinach plant having the RTM-1 gene to be used as a parent line is a downy mildew-resistant spinach plant that has the RTM-1 gene and also has the traits of a cultivated species. preferable.
  • Examples of such downy mildew-resistant spinach plants include the TNKH-1 line, the hybrid plant obtained using the TNKH-1 line as the parent line, the TNKH-2 line, and the hybrid plant obtained using the TNKH-2 line as the parent line. , and their progeny, spinach plants with downy mildew resistance derived from the RTM-1 gene.
  • An arbitrary spinach plant used as a parent line in the first crossing step and an arbitrary spinach plant used as a parent line for interspecific or intraspecific crossing in the second crossing step are not particularly limited, and RTM-1 Various spinach plants that do not have the gene can be used as appropriate.
  • a downy mildew-resistant spinach plant that has the RTM-1 gene and also has traits as a cultivated species and a cultivated spinach plant that does not have the RTM-1 gene are used as parent lines.
  • Any spinach plant used as a parent line in the first crossing step, or any spinach plant used as a parent line for interspecific or intraspecific cross in the second crossing step, downy mildew resistance other than the RTM-1 gene It is preferably a spinach plant having at least one gene, and more preferably a cultivar spinach plant having at least one downy mildew-resistant gene other than the RTM-1 gene.
  • the selection of spinach plants having the RTM-1 gene from the segregating population is performed, for example, by inoculating Pfs of each race to the leaves of test plant individuals and examining downy mildew resistance. can be done. From the segregating population, at least downy mildew races Pfs1, Pfs2, Pfs3, Pfs4, Pfs5, Pfs6, Pfs7, Pfs8, Pfs9, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs13, Pfs14, Pfs15, Pfs16, Pfs17, Pfs18, Pfs19, and UA1014 Plant individuals exhibiting resistance to the race exhibited by the strain are selected as those carrying the RTM-1 gene.
  • Individuals having the RTM-1 gene in the selection process can be selected using the RTM-1 locus in chromosome 4 of spinach plants and DNA markers in the vicinity thereof.
  • the DNA markers and specific methods to be used can be carried out in the same manner as in the aforementioned screening method according to the present invention.
  • the other downy mildew-resistant DNA marker along with the DNA marker used for selecting the individual having the RTM-1 gene
  • a DNA marker capable of identifying the presence or absence of the sex gene is used.
  • an SNP or the like present in the gene locus of the other downy mildew-resistant gene and its vicinity can be used.
  • the number of repetitions of self-breeding is not particularly limited as long as it is one or more times, and may be 2 to 3 times, or may be 3 times or more.
  • This tray was raised in a glass greenhouse for 2 weeks and inoculated with a Pfs spore suspension (5 ⁇ 10 4 /mL) by spraying at the true leaf 2-leaf stage. Immediately after inoculation, the tray was covered with a plastic cover and maintained under the conditions of a temperature of 15° C., a humidity of 100%, and a day length of 12 hours. 7 to 10 days after inoculation, after fully confirming the onset of the disease in the control group, resistance and susceptibility were determined for each individual. Strains in which hyphae and spores appeared on cotyledons or true leaves and the disease was observed were regarded as susceptible, and strains in which neither cotyledons nor true leaves were observed to develop the disease were regarded as resistant.
  • Downy mildew races were obtained in Japan from The University of Arkansas (Dr. Jim Correll) and Naktuinbouw. Also, for race discrimination of downy mildew, a known differential set of spinach cultivars showing different resistance patterns to each race can be used as discriminant cultivars. Differential cultivars used to determine downy mildew resistance of each race are available from USDA (United States Department of Agriculture) and Naktuinbouw (Non-Patent Document 4).
  • Tables 2 and 3 show the resistance reported for each discriminated variety.
  • "-" is resistant
  • “(-)” is moderately resistant
  • "+” is susceptible
  • “(+)” is downy mildew symptoms and spores. Formation is observed only on cotyledons and not on true leaves, respectively.
  • “*" means that resistance results differ depending on individual tests.
  • Example 1 A novel downy mildew-resistant line was created using the wild type Spinacia tetrandra line CGN25466:MGK 01 obtained from CGN in the Netherlands in 2013 as a parent line.
  • CGN25466: MGK 01 and CGN25474: MGK 18 of the wild Spinacia tetrandra strains obtained from CGN in the Netherlands were sown, respectively, and the germinated individuals were inoculated with Pfs6.
  • Spinacia tetrandra strain CGN25466:MGK01 showed resistance, while Spinacia tetrandra strain CGN25474:MGK18 was susceptible. Therefore, it was decided to use the Spinacia tetrandra line CGN25466:MGK01 as the parent line.
  • BC1F1S2 seeds Of the individuals showing resistance, 22 individuals were selfed to obtain BC1F1S2 seeds. When 7696 BC1F1S2 seeds thus obtained were sown, 3551 plants grew out of them. Seventy-six of the grown plants were selfed to obtain BC1F1S3 seeds. When 12,971 BC1F1S3 seeds obtained were sown, 9,815 plant bodies grew out of them. 115 plants out of the grown plants were selfed to obtain BC1F1S4 seeds. When 7377 BC1F1S4 seeds obtained from each of the 115 selfed individuals were sown, 4717 plants grew out of them.
  • RPF3 and RPF4 genes were examined using the RPF3 and RPF4 markers for the 5 strains in which all individuals showed resistance. Based on the results, a RPF3 homozygous strain was selected and named the TNKH-1 strain. A RPF4 homozygous strain was also selected and designated as the TNKH-2 strain. In addition, segregating strains of RPF3 and RPF4 were selected and named the TNKH-3 strain. The unknown downy mildew resistance gene and locus derived from Spinatia tetrandra in these lines was named RTM-1.
  • TNKH-1 and TNKH-2 strains were deposited at the National Institute of Technology and Evaluation Patent Organism Depositary Center (Room 120, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture). . Identification given by the depositor of the TNKH-1 strain: SSC-SPI-20-001, accession number is FERM BP-22404 (deposit date: December 25, 2020), TNKH-2 Identification given by the depositor of the strain: SSC-SPI-20-002, accession number is FERM BP-22405 (deposit date: December 25, 2020).
  • Example 2 A Viroflay strain that does not have resistance to any race was used as a seed parent, and the TNKH-3 strain produced in Example 1 was used as a pollen parent, and the obtained F1 individuals were crossed, and the resulting F1 individuals were treated with Pfs1, Pfs2, Pfs3, An inoculation test was performed using races of the Pfs4, Pfs5, Pfs6, Pfs7, Pfs8, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs13, Pfs14, Pfs15, Pfs16, Pfs17, and UA1014 strains to investigate their resistance. Table 4 shows the results.
  • P (Q) (both P and Q are integers) in the column “Resistant individuals” and “Vulnerable individuals” in the column “Viroflay ⁇ TNKH-3 F1" indicates that P , is the number of F1 individuals among the resistant or diseased individuals, and Q is the number of individuals obtained by selfing of Viroflay (self) among the resistant or diseased individuals. Also, “nt” means that no experiment was conducted and there is no data. Furthermore, in the column for each race among the "RPF3 strain”, “RPF4 strain”, and “Viroflay” strains, "-” means resistant, and "+” susceptibility. means.
  • RTM-1 is a resistant genotype derived from Spinasia tetrandra
  • rtm-1 is a susceptibility genotype derived from Viroflay.
  • RTM-1/RTM-1 is a resistant homozygous type
  • rtm-1/rtm-1 is a susceptible homozygous type
  • RTM-1/rtm-1 is a resistant and diseased type. heterozygous for each sex.
  • rpfV refers to the Viroflay-derived susceptibility genotype.
  • Viroflay selfed seeds may be included. Whether the Viroflay selfed seed or the F1 seed can be determined by examining the RPF genotype using the RPF3 marker and the RPF4 marker.
  • the RPF genotypes of susceptible individuals were examined and found to have neither the RPF3 gene nor the RPF4 gene (rpfV /rpfV), all of these susceptible individuals were confirmed to have been obtained from Viroflay selfing. That is, as shown in Table 4, the F1 individuals obtained by crossing the Viroflay strain with the TNKH-3 strain exhibited resistance to all races except Pfs9, and there were no diseased individuals.
  • the downy mildew resistance of the RPF3 and RPF4 genes indicated that the RTM-1 gene could confer dominant resistance to races represented by at least the Pfs6, Pfs7, Pfs10, Pfs13, Pfs17, and UA1014 strains.
  • RPF3/rpfV and RPF4/rpfV segregate approximately 1:1.
  • RPF3 is susceptible to Pfs2, Pfs4, and Pfs15
  • RPF4 is susceptible to Pfs5, Pfs8, Pfs11, Pfs12, Pfs14, and Pfs16, suggesting that the RTM-1 gene confers resistance to these races.
  • the population of resistant:susceptible individuals should appear at the expected value of 1:1.
  • practically all F1 individuals were resistant to these races. From this, it is clear that the RTM-1 gene can also confer dominant resistance to Pfs2, Pfs4, Pfs5, Pfs8, Pfs11, Pfs12, Pfs14, Pfs15, and Pfs16.
  • Example 3 The Viroflay strain is used as a seed parent, and the TNKH-1 strain produced in Example 1 is used as a pollen parent. An inoculation test using race was conducted to investigate the resistance to these. Table 5 shows the results.
  • P (Q) both P and Q are integers
  • P is the number of F1 individuals among the resistant or diseased individuals
  • Q is the number of individuals obtained by selfing of Viroflay (self) among the resistant or diseased individuals.
  • “nt” means that no experiment was conducted and there is no data.
  • RTM-1 is a resistant genotype derived from Spinasia tetrandra
  • rtm-1 is a susceptibility genotype derived from Viroflay.
  • RTM-1/RTM-1 is a resistant homozygous type
  • rtm-1/rtm-1 is a susceptible homozygous type
  • RTM-1/rtm-1 is a resistant and diseased type. heterozygous for each sex.
  • rpfV refers to the Viroflay-derived susceptibility genotype.
  • the F1 individuals obtained by crossing the Viroflay strain and the TNKH-1 strain exhibited resistance to the races exhibited by the Pfs2, Pfs4, Pfs10, Pfs15, Pfs17, Pfs18, and UA1014 strains. , there were no susceptible individuals. Examination of the RPF genotype confirmed that all susceptible individuals had been selfed from Viroflay. The mildew resistance of the RPF3 gene indicated that the RTM-1 gene was able to confer dominant resistance to the races exhibited by at least the Pfs2, Pfs4, Pfs10, Pfs15, Pfs17, Pfs18, and UA1014 strains.
  • Example 4 The Viroflay strain was used as a seed parent, and the TNKH-2 strain produced in Example 1 was used as a pollen parent. , Pfs18, Pfs19, and UA1014 strains were used to conduct an inoculation test using races to examine their resistance. Table 6 shows the results.
  • P (Q) both P and Q are integers
  • P is the number of F1 individuals among the resistant or diseased individuals
  • Q is the number of individuals obtained by selfing of Viroflay (self) among the resistant or diseased individuals.
  • RTM-1 is a resistant genotype derived from Spinasia tetrandra
  • rtm-1 is a susceptibility genotype derived from Viroflay.
  • RTM-1/RTM-1 is a resistant homozygous type
  • rtm-1/rtm-1 is a susceptible homozygous type
  • RTM-1/rtm-1 is a resistant and diseased type. heterozygous for each sex.
  • rpfV refers to the Viroflay-derived susceptibility genotype.
  • the F1 individuals obtained by crossing the Viroflay strain and the TNKH-2 strain are Pfs5, Pfs8, Pfs9, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs14, Pfs16, Pfs17, Pfs18, Pfs19, and UA1014 strains. showed resistance to the race shown by , and no individuals were susceptible. Examination of the RPF genotype confirmed that all susceptible individuals had been selfed from Viroflay.
  • the RTM-1 gene is dominant to the race represented by at least the Pfs5, Pfs8, Pfs9, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs14, Pfs16, Pfs17, Pfs18, Pfs19, and UA1014 strains. It was found that resistance can be imparted.
  • Example 5 F1 seeds obtained by crossing the Viroflay line as a seed parent and the TNKH-1 line produced in Example 1 as a pollen parent were selfed to prepare an F2 segregating population. This F2 population was subjected to an inoculation test using races represented by Pfs1, Pfs3, Pfs4, Pfs8, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs14, Pfs15, and UA1014 strains to examine their resistance. Table 7 shows the results. In the table, “nt” means no experiment and no data. Furthermore, in the column for each race in the "RPF3" and "Viroflay” strains, "-” means resistant and "+” means susceptible.
  • RTM-1 is a resistant genotype derived from Spinasia tetrandra
  • rtm-1 is a susceptibility genotype derived from Viroflay.
  • RTM-1/RTM-1 is a resistant homozygous type
  • rtm-1/rtm-1 is a susceptible homozygous type
  • RTM-1/rtm-1 is a resistant and diseased type. heterozygous for each sex.
  • rpfV refers to the Viroflay-derived susceptibility genotype.
  • the resistance to downy mildew of the TNKH-1 line is determined by the races represented by the Pfs4, Pfs10, Pfs15, and UA1014 strains that are susceptible to the RPF3 gene. separated to approximately 3:1. Therefore, the RTM-1 gene was assumed to be monodominant. This assumption was also supported by the results of the Chi - square test (p>0.05).
  • the downy mildew resistance of the TNKH-1 line is about 15: 1 for Pfs1, Pfs3, Pfs8, Pfs11, Pfs12, and Pfs14 to which the RPF3 gene is resistant. and separated. Therefore, the RTM-1 and RPF3 genes were assumed to be bi-dominant. This assumption was also supported by a chi - square test (p>0.05).
  • RTM-1 gene is located on a different chromosome than on alleles of the RPF gene, Pfs1, Pfs3, Pfs4, Pfs8, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs14, Pfs15, and UA1014 strains. It was found that monodominant resistance can be conferred on races.
  • the F1 strain obtained by crossing the Viroflay strain and the TNKH-1 strain produced in Example 1 was selfed to prepare an F2 segregating population.
  • 330 F2 isolates thus obtained were subjected to an inoculation test using races represented by the UA1014 strain to examine resistance thereto.
  • Genetic analysis was performed on these individuals, and regions in the genome were searched so that resistant individuals would be homozygous or heterozygous, and susceptible individuals would be homozygous.
  • Individuals subjected to the trait investigation were used as a population for linkage analysis, and genomic DNA was extracted from each individual. Genotyping was performed using the DNA of the population for linkage analysis and the SNP markers designed on the SpinachBase reference genome. Genotyping was performed using the KASP genotyping assay.
  • Tables 8 and 9 show the base sequences of the primers used in the KASP genotyping assay for identifying each SNP.
  • a allele indicates a TNKH-1 type (Spinacia tetrandra type) allele
  • B allele indicates a Viroflay type allele.
  • Each SNP is genotyped with three primer sets, allele specific primer — 1, allele specific primer — 2, and common primer. In the sequences of allele specific primer_1 and allele specific primer_2, one base at the 3' end is designed to hybridize with the SNP to be identified.
  • an amplification product is obtained by PCR using allele specific primer_1 and common primer as forward and reverse primers, respectively.
  • an amplified product is obtained by PCR using allele specific primer_2 and common primer as forward and reverse primers, respectively. The presence or absence of this amplified product identifies the SNP genotype.
  • the genotype of each SNP can be identified by performing the KASP assay using these three kinds of oligo-DNAs as one set of primers.
  • the TNKH-1 strain has a homozygous allele in which the genotype of the SNP specified by chr4_8510715 is G (guanine), and the Viroflay strain has a genotype of C (cytosine) at the SNP specified by chr4_8510715. ) is homozygous.
  • the genotype of the SNP specified by chr4_8510715 is G/C
  • the TNKH-1 type allele in which the SNP is G and the Viroflay type allele in which the SNP is C are heterozygous. have.
  • the KASP marker used for the linkage analysis was used for the purpose of identifying the locus of the RTM-1 gene, and as a DNA marker for selecting downy mildew-resistant spinach, these It is not necessary to use KASP markers.
  • KASP markers DNA polymorphisms other than the SNPs described in Tables 8 and 9 that are located within the range of the spinach genome specified from chr4_7962907 to chr4_8617232, A DNA polymorphism or the like that is highly correlated with the trait of resistance to mildew can be used as a DNA marker for selecting downy mildew-resistant spinach.
  • Table 10 shows seven individuals (sample numbers 112/143/322/294 /53/232/6) are extracted and written together with the phenotype.
  • "A” indicates the TNKH-1 type allele
  • "B” indicates the Viroflay type allele.
  • A/A it has a homozygous TNKH-1 type allele
  • B/B it has a homozygous Viroflay type allele.
  • A/B it indicates that the TNKH-1 allele and the Viroflay allele are heterozygous.
  • the SNP identified by chr4_8500200 is thymine
  • the SNP identified by chr4_8502319 is cytosine
  • chr4_8502334 The SNP identified was guanine and the SNP identified at chr4_8502394 was guanine (Table 1).
  • SNPs like the SNPs listed in Tables 8 and 9, can also be used as markers for identifying downy mildew-resistant plant individuals having the TNKH-1 type allele.

Abstract

本発明は、スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１の第４染色体に座上するべと病抵抗性ＲＴＭ－１遺伝子を有している、べと病抵抗性ホウレンソウ植物、前記ＲＴＭ－１遺伝子が、スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１の第４染色体上のｃｈｒ４＿７９６２９０７からｃｈｒ４＿８６１７２３２までの範囲内に存在している遺伝子である、前記記載のべと病抵抗性ホウレンソウ植物、少なくとも、べと病のレースＰｆｓ１、Ｐｆｓ２、Ｐｆｓ３、Ｐｆｓ４、Ｐｆｓ５、Ｐｆｓ６、Ｐｆｓ７、Ｐｆｓ８、Ｐｆｓ９、Ｐｆｓ１０、Ｐｆｓ１１、Ｐｆｓ１２、Ｐｆｓ１３、Ｐｆｓ１４、Ｐｆｓ１５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ１７、Ｐｆｓ１８、Ｐｆｓ１９、及びＵＡ１０１４菌株が示すレースに抵抗性である、前記いずれかのべと病抵抗性ホウレンソウ植物である。

Description

新規べと病抵抗性遺伝子を有するホウレンソウ植物
　本発明は、べと病の広範囲なレースに抵抗性を示す遺伝子を有するホウレンソウ植物、及びその製造方法に関する。
　本願は、２０２１年５月１２日に、日本に出願された特願２０２１－０８０９１１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ　ｏｌｅｒａｃｅａ　Ｌ．）は、ヒユ科ホウレンソウ属の一年草又は多年草であって、アジア西部原産で広く栽培され、日本には江戸時代に中国から伝えられたと考えられている。ホウレンソウは主に根生葉（ロゼット状）を食用とし、ビタミン類や鉄、カルシウム分の含有量は野菜の中でも特に高く、栄養価値はきわめて高い。近年は、栄養素と簡便性の面からベビーリーフの市場が世界的に急拡大している。このように、ホウレンソウは重要野菜の一つとして位置付けられている。
　植物品種には、一般的に、固定種と雑種第一代（以下、「Ｆ１」と記す）品種があり、主要作物においてはＦ１品種が普及している。Ｆ１品種は、雑種強勢（ヘテロシス）により生育が旺盛である。これにより、Ｆ１品種は、生育が速く、収量性が高まるなど大きな利点があり、さらに、病害虫への耐性や、耐寒・耐暑性などの環境適応性の向上も期待できる。また、Ｆ１品種は、ヘテロ性でありながら同一の遺伝子型であるため、表現型は極めて高い均一性を示す。このため、生産物の市場性が高まる。さらにＦ１品種の両親に優性遺伝子に支配されている有用形質を集積できるため、迅速な育種が可能となる。以上のような優位性があることから、Ｆ１品種は、主要作物において栽培品種の主流を占めるようになった。食用とされているホウレンソウにおいても、１９６０年代までは固定種が中心であったが、１９７０年代以降は急速にＦ１化が進み、現在ではそのほとんどがＦ１品種である。
　一方で、ホウレンソウに被害を与える病害の１つに、糸状菌であるＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ　ｆａｒｉｎｏｓａ　ｆ．　ｓｐ．　ｓｐｉｎａｃｉａｅ（ペロノスポラ・ファリノーサ・分化型・スピナシアエ:Ｐｆｓ）によって引き起こされるべと病がある。べと病は、発生すると急速に被害が拡大し、収量、品質に非常に深刻な被害を与える最重要病害である。べと病対策としては、耕種的、又は農薬などを用いた化学的な病原菌の防除も試みられているが、環境への影響、栽培労力やコスト等から、抵抗性品種の利用が最も効果的な方法である。
　べと病は、レース分化が早いことで知られ、抵抗性品種を侵す新しいレースが次々と出現し、それまで抵抗性をもつと思われていた品種が発病する事例が数多く認められている。The International Working Group on Peronospora in spinach ＩＷＧＰ）は、米国のアーカンソー大学とカリフォルニア大学のサポートを受けた種苗会社と、オランダのThe Netherlands Inspection Service for Horticulture（Ｎａｋｔｕｉｎｂｏｕｗ）によるコンソーシアムであり、新たなべと病のレースの出現と広がりを監視し、公式な命名を決定している。１８２４年に最初のべと病の発生が報告されて以降、今日までに１９レースが命名された（非特許文献１）。
　新レースの連続的な出現に対応するため、ホウレンソウの育種においては、新規抵抗性素材の探索は非常に重要である。栽培種のみならず野生種においても、べと病への抵抗性遺伝素材の探索が行われている。例えば、Center for Genetic Resources, the Netherlands（ＣＧＮ）によって、２００８年に野生種ホウレンソウであるスピナシア・トルケスタニカ（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａ）について、２０１１年に野生種ホウレンソウであるスピナシア・テトランドラ（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｔｅｔｒａｎｄｒａ）について、べと病への抵抗性遺伝素材の探索が行われた。また、２０１１年には、Correllらが、６種類のＲＰＦと呼ばれる遺伝子が既知のべと病抵抗性を制御していることを発表した（非特許文献２）。さらに、べと病抵抗性遺伝子として、ＲＰＦ１～ ＲＰＦ１０、ＲＰＦ１１（特許文献１）、ＲＰＦ１２（特許文献２）、ＲＰＦ１３（特許文献３）、ＲＰＦ１４（特許文献４）、ＲＰＦ１５（特許文献５）、Ｒ６（特許文献６）、Ｒ１５（特許文献７）等が報告されている。野生種ホウレンソウ由来のべと病抵抗性遺伝子を、栽培種ホウレンソウであるスピナシア・オレラシア　Ｌ（Ｓｐｉｎａｃｉａ　ｏｌｅｒａｃｅａ　Ｌ．）へ導入することにより、べと病抵抗性の高いホウレンソウが作出できる（特許文献８）。
　ＲＰＦ遺伝子は、ＲＰＦ遺伝子座と呼ばれている一つの遺伝子座にある複数の対立遺伝子、又は密に連鎖した複数の遺伝子であり、Ｆ１品種では、２つの対立遺伝子を持たせることにより、幅広い抵抗性を示してきた（非特許文献３、特許文献５）。例えば、ＲＰＦ１遺伝子、ＲＰＦ２遺伝子及びＲＰＦ３遺伝子は第３染色体に座上しており（非特許文献３）、ＲＰＦ１５遺伝子も第３染色体上に座上する（特許文献５）。また、特許文献８に記載されているべと病抵抗性遺伝子は、連鎖群６に座上するとされているが、シーケンス情報によると、実際は第３染色体に座上する（特許文献５）。
　べと病抵抗性遺伝子座には、その構造により、ａｌｐｈａ　ＷＯＬＦ遺伝子及びｂｅｔａ ＷＯＬＦ遺伝子に大別される1つ又は２つのＷＯＬＦ遺伝子が隣接して存在する（特許文献９）。ａｌｐｈａ及びｂｅｔａ ＷＯＬＦ遺伝子は、それぞれ特定の抵抗性プロファイルを付与する複数の対立遺伝子を含み、それぞれのＷＯＬＦ遺伝子のＬＲＲドメイン配列及びそれぞれの遺伝子型のべと病レースに対する抵抗性パターンが開示されている。理論上は、異なる抵抗性パターンを有するＷＯＬＦ遺伝子の組み合わせにより、所望の抵抗性パターンを設計することが可能である。しかし、従来の交雑育種では、非常に緊密に連鎖した遺伝子を任意に組み合わせるのは事実上不可能である。このため、これまでも、ＲＰＦ遺伝子は、まとめて一つの遺伝子として扱われてきた。
　その他にも、形質転換による外部からのべと病抵抗性遺伝子の導入（ＧＭＯ）や、内因性遺伝子を改変（Gene Editing）することにより、所望の抵抗性パターンを付与する変異体を作製することができる。しかし、ＧＭＯや遺伝子改変により作出された作物は、いまだ大衆に広く受け入れられていない、という問題がある。
　べと病抵抗性遺伝子ｐ１０は、第１染色体に座上し、Ｐｆｓ１、Ｐｆｓ２、Ｐｆｓ３、Ｐｆｓ４、Ｐｆｓ５、Ｐｆｓ６、Ｐｆｓ７、Ｐｆｓ８、Ｐｆｓ９、Ｐｆｓ１０、Ｐｆｓ１１、Ｐｆｓ１２、Ｐｆｓ１３、Ｐｆｓ１４、Ｐｆｓ１５、及びＰｆｓ１６に抵抗性を示すと報告されている。しかし、ｐ１０遺伝子により付与される抵抗性は、ホモ接合の時にのみ発現し、かつその抵抗性程度は中間である（特許文献１０）。このため、ｐ１０遺伝子を用いた抵抗性品種育成は、優性の抵抗性遺伝子を用いた育成よりも、困難なだけでなく、耐性の程度も実用上十分なものとは言えないことが推測される。また、スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４７４：ＭＧＫ　１８：ＲＮＲ１２０２５１（以下、ＣＧＮ２５４７４：ＭＧＫ　１８）は、第４染色体中にべと病抵抗性遺伝子を有しており、Ｐｆｓ４、Ｐｆｓ７、Ｐｆｓ９、Ｐｆｓ１０、Ｐｆｓ１１、Ｐｆｓ１２、Ｐｆｓ１３、Ｐｆｓ１４、Ｐｆｓ１５、Ｐｆｓ１６、及びＰｆｓ１７に抵抗性を示すことが報告された（特許文献１１）。
米国特許第１０２５８００１号明細書 米国特許第１０２５８００２号明細書 国際公開第２０１５／０３６３７８号 国際公開第２０１９／１４５４４６号 国際公開第２０１９／１４５４４７号 特許第６４５７２６９号公報 米国特許第９９７４２７６号明細書 特許第６６８４２０７号公報 国際公開第２０１８／０５９６５１号 米国特許出願公開第２０１９／０１０４７００号明細書 国際公開第２０２０／２３９２１５号
Ribera et al., Euphytica, 2020, 216:48. Correll et al., European Journal of Plant Pathology, 2011, vol.129, p.193-205. Feng et.al, Euphytica, 2018, 214:174. International Seed Federation, "Differential Sets　Peronospora farinosa f. sp. spinaciae (P. effusa)", 2021, <on line>  https://worldseed.org/wp-content/uploads/2021/11/20210608_DRTWG_Peronospora-effusa.pdf Iwata and Ninomiya, Breeding Science, 2006, vol.56(4), p.371-377.
　既存のべと病抵抗性系統は、主に第３染色体上のＲＰＦ遺伝子が利用されている。一方で、通常、ホウレンソウの育種において、Ｆ１品種の親系統は遺伝的に高度に固定する必要がある。この結果として、１つの親系統は、同一又は非常に近接した部位に一つの抵抗性遺伝子しか有することができない。つまり、異なる親系統同士を掛け合わせたＦ１品種は、第３染色体上の同一又は非常に近接した部位に２種のＲＰＦ遺伝子しか有することができない。命名されている全てのレースに抵抗性を示すＲＰＦ遺伝子は知られていないため、広範なレースに対して抵抗性を示すＦ１品種を作出するためには、互いの抵抗性を相補する組み合わせのＲＰＦ遺伝子を有する品種同士を交配しなければならない。このことが、親系統の選定に大きな制限要素となっていた。
　例えば、第３染色体以外の染色体上に存在する抵抗性遺伝子が利用できれば、べと病抵抗性遺伝子を集積する上で大きな効果が見込める。加えて、この第３染色体以外に存在する抵抗性遺伝子に多型があれば、さらに、べと病抵抗性遺伝子の多様化が促進され、べと病の新レースの発生を抑制し得る。
　そこで本発明は、前記したような既存のべと病抵抗性系統及びＦ１品種の問題点に鑑みて、第３染色体に存在せず、既知の抵抗性遺伝子よりもより広範囲なレースに抵抗性を示し、さらに既報の第４染色体上の抵抗性遺伝子と異なる新たなべと病抵抗性遺伝子を提供する。すなわち、本発明は、広範囲なレースに抵抗性を示す新規べと病抵抗性遺伝子を有するホウレンソウ植物、当該ホウレンソウ植物を製造する方法、当該遺伝子に起因するべと病抵抗性を付与した系統を利用したホウレンソウのＦ１植物やその種子の製造方法等を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく研究した結果、スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１：ＲＮＲ１２０２３４（以下、ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１）の第４染色体上に、広範なレースに対して抵抗性を示す優性のべと病抵抗性遺伝子が存在していることを見出した。さらに、当該べと病抵抗性遺伝子を有する野生種ホウレンソウと栽培種ホウレンソウとによる種間交雑を行い、べと病抵抗性を備えるＦ１個体を得、このＦ１個体に対してさらに栽培種ホウレンソウとの交雑を繰り返すことにより、当該べと病抵抗性遺伝子に起因するべと病抵抗性と、栽培種に近い形質を備えるホウレンソウ植物が育成できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、下記の通りである。
［１］　スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１の第４染色体に座上するべと病抵抗性ＲＴＭ－１遺伝子を有しているホウレンソウ植物である（但し、スピナシア・テトランドラを除く）、べと病抵抗性ホウレンソウ植物。
［２］　前記ＲＴＭ－１遺伝子が、スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１の第４染色体上のｃｈｒ４＿７９６２９０７からｃｈｒ４＿８６１７２３２までの範囲内に存在している遺伝子である、前記［１］のべと病抵抗性ホウレンソウ植物。
［３］　第４染色体の少なくとも一方のアレルに、スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１の第４染色体上のｃｈｒ４＿８４８８６０３からｃｈｒ４＿８５１０７１５までの範囲を含む断片を含有している、前記［１］又は［２］のべと病抵抗性ホウレンソウ植物。
［４］　前記ＲＴＭ－１遺伝子が、ホモ接合性又はヘテロ接合性である、前記［１］～［３］のいずれかのべと病抵抗性ホウレンソウ植物。
［５］　少なくとも、べと病のレースＰｆｓ１、Ｐｆｓ２、Ｐｆｓ３、Ｐｆｓ４、Ｐｆｓ５、Ｐｆｓ６、Ｐｆｓ７、Ｐｆｓ８、Ｐｆｓ９、Ｐｆｓ１０、Ｐｆｓ１１、Ｐｆｓ１２、Ｐｆｓ１３、Ｐｆｓ１４、Ｐｆｓ１５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ１７、Ｐｆｓ１８、Ｐｆｓ１９、及びＵＡ１０１４菌株が示すレースに抵抗性である、前記［１］～［４］のいずれかのべと病抵抗性ホウレンソウ植物。
［６］　第４染色体の少なくとも一方のアレルにおいて、
ｃｈｒ４＿８４８８６０３で特定されるＳＮＰがシトシンである、
ｃｈｒ４＿８４９４６００で特定されるＳＮＰがチミンである、又は
ｃｈｒ４＿８５１０７１５で特定されるＳＮＰがグアニンである、
前記［１］～［５］のいずれかのべと病抵抗性ホウレンソウ植物。
［７］　第４染色体の少なくとも一方のアレルにおいて、
ｃｈｒ４＿７９６２９０７で特定されるＳＮＰがグアニンである、
ｃｈｒ４＿８１５２９８６で特定されるＳＮＰがシトシンである、
ｃｈｒ４＿８１９０９９０で特定されるＳＮＰがグアニンである、
ｃｈｒ４＿８４８８６０３で特定されるＳＮＰがシトシンである、
ｃｈｒ４＿８４９４６００で特定されるＳＮＰがチミンである、
ｃｈｒ４＿８５１０７１５で特定されるＳＮＰがグアニンである、又は
ｃｈｒ４＿８６１７２３２で特定されるＳＮＰがグアニンである、
前記［１］～［５］のいずれかのべと病抵抗性ホウレンソウ植物。
［８］　前記べと病抵抗性ホウレンソウ植物が、スピナシア・テトランドラと栽培種ホウレンソウの種間雑種植物に由来するものである、前記［１］～［７］のいずれかのべと病抵抗性ホウレンソウ植物。
［９］　受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２４０４（ＴＮＫＨ－１系統）で特定される植物由来のべと病抵抗性を有する、前記［１］～［８］のいずれかのべと病抵抗性ホウレンソウ植物。
［１０］　受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２４０５（ＴＮＫＨ－２系統）で特定される植物由来のべと病抵抗性を有する、前記［１］～［８］のいずれかのべと病抵抗性ホウレンソウ植物。
［１１］　前記ＲＴＭ－１遺伝子以外のべと病抵抗性遺伝子を少なくとも１種以上有する、前記［１］～［１０］のいずれかのべと病抵抗性ホウレンソウ植物。
［１２］　受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２４０４（ＴＮＫＨ－１系統）で特定されるべと病抵抗性ホウレンソウ植物、前記べと病抵抗性ホウレンソウ植物を親系統として得られた雑種植物、又はそれらの後代である、べと病抵抗性ホウレンソウ植物。
［１３］　受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２４０５（ＴＮＫＨ－２系統）で特定されるべと病抵抗性ホウレンソウ植物、前記べと病抵抗性ホウレンソウ植物を親系統として得られた雑種植物、又はそれらの後代である、べと病抵抗性ホウレンソウ植物。
［１４］　被験ホウレンソウ植物の第４染色体のｃｈｒ４＿８４８８６０３～ｃｈｒ４＿８５１０７１５のＳＮＰの遺伝子型を調べ、少なくとも一方のアレルにおいて、
ｃｈｒ４＿８４８８６０３で特定されるＳＮＰがシトシンである、
ｃｈｒ４＿８４９４６００で特定されるＳＮＰがチミンである、又は
ｃｈｒ４＿８５１０７１５で特定されるＳＮＰがグアニンである場合に、
当該被験ホウレンソウ植物がべと病抵抗性である可能性が高いと予測する、ホウレンソウ植物のべと病抵抗性の予測方法。
［１５］　被験ホウレンソウ植物の第４染色体のｃｈｒ４＿８４８８６０３～ｃｈｒ４＿８５１０７１５のＳＮＰの遺伝子型を調べ、少なくとも一方のアレルにおいて、
ｃｈｒ４＿８４８８６０３で特定されるＳＮＰがシトシンである、
ｃｈｒ４＿８４９４６００で特定されるＳＮＰがチミンである、又は
ｃｈｒ４＿８５１０７１５で特定されるＳＮＰがグアニンである場合に、
当該被験ホウレンソウ植物を、べと病抵抗性ホウレンソウ植物として選抜する、べと病抵抗性ホウレンソウ植物のスクリーニング方法。
［１６］　ＲＴＭ－１遺伝子を有するホウレンソウ植物と任意のホウレンソウ植物とを交雑する第１交雑工程と、
　前記第１交雑工程により得られたＦ１個体に対して、自殖、戻し交雑、又は前記第１交雑工程において用いた親系統とは異なるホウレンソウ植物との種間交雑又は種内交雑を行い、分離集団を得る第２交雑工程と、
　前記分離集団から、ＲＴＭ－１遺伝子を有するホウレンソウ植物を選抜する選抜工程と、
を有する、べと病抵抗性ホウレンソウ植物の製造方法。
［１７］　前記ＲＴＭ－１遺伝子を有するホウレンソウ植物が、スピナシア・テトランドラ又は前記［１］～［１３］のいずれかのべと病抵抗性ホウレンソウ植物である、前記［１６］のべと病抵抗性ホウレンソウ植物の製造方法。
［１８］　前記任意のホウレンソウ植物、又は前記第２交雑工程における種間交雑又は種内交雑で用いる親系統が、前記ＲＴＭ－１遺伝子以外のべと病抵抗性遺伝子を少なくとも１種以上有するホウレンソウ植物である、前記［１６］又は［１７］のべと病抵抗性ホウレンソウ植物の製造方法。
［１９］　前記［１］～［１３］のいずれかのべと病抵抗性ホウレンソウ植物の植物体の一部。
［２０］　前記［１］～［１３］のいずれかのべと病抵抗性ホウレンソウ植物の葉。
［２１］　前記［１］～［１３］のいずれかのべと病抵抗性ホウレンソウ植物の種子。
［２２］　ホウレンソウ植物のｃｈｒ４＿８４８８６０３で特定されるＳＮＰ、ｃｈｒ４＿８４９４６００で特定されるＳＮＰ、ｃｈｒ４＿８５１０７１５で特定されるＳＮＰ、及びこれらのＳＮＰと遺伝的に強く連鎖しているＳＮＰからなる群より選択される１種以上からなる、ＲＴＭ－１遺伝子を有するホウレンソウ植物を選抜するためのＤＮＡマーカー。
［２３］　ホウレンソウ植物のｃｈｒ４＿８４８８６０３で特定されるＳＮＰの遺伝子型を識別するためのプライマーセット、
　ｃｈｒ４＿８４９４６００で特定されるＳＮＰの遺伝子型を識別するためのプライマーセット、及び
　ｃｈｒ４＿８５１０７１５で特定されるＳＮＰの遺伝子型を識別するためのプライマーセットからなる群より選択される１種以上のプライマーセットを含み、
　ＲＴＭ－１遺伝子を有するホウレンソウ植物を選抜するために用いられる、キット。
［２４］　
　前記ｃｈｒ４＿８４８８６０３で特定されるＳＮＰの遺伝子型を識別するためのプライマーセットが、配列番号１３で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号１４で表される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号１５で表される塩基配列からなるプライマーからなり、
　前記ｃｈｒ４＿８４９４６００で特定されるＳＮＰの遺伝子型を識別するためのプライマーセットが、配列番号１６で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号１７で表される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号１８で表される塩基配列からなるプライマーからなり、
　前記ｃｈｒ４＿８５１０７１５で特定されるＳＮＰの遺伝子型を識別するためのプライマーセットが、配列番号１９で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号２０で表される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号２１で表される塩基配列からなるプライマーからなる、前記［２３］のキット。
　本発明により、広範なレースに対して抵抗性を示すべと病抵抗性ホウレンソウ植物が提供される。
　また、本発明に係るホウレンソウ植物を親系統として利用することにより、広範なレースに対して抵抗性を示す新規ホウレンソウ系統を育成することもできる。
実施例６において、ホウレンソウの第４染色体のＲＴＭ－１遺伝子座近傍の連鎖地図である。
　本発明及び本願明細書において、ホウレンソウ植物はスピナシア属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）に分類される植物である。野生種ホウレンソウとして、スピナシア・テトランドラ、スピナシア・トルケスタニカ等がある。また、栽培種ホウレンソウとして、スピナシア・オレラシア　Ｌ（Ｓｐｉｎａｃｉａ　ｏｌｅｒａｃｅａ　Ｌ．）が挙げられる。なお、本発明及び本願明細書において、「栽培種」とは、栽培に供される系統の植物であって、固定種のみならず、Ｆ１品種も含む。
　本発明及び本願明細書において、べと病とは、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ科に属する菌による病害である。ホウレンソウべと病の主な病原菌は、Ｐｆｓ（ペロノスポラ・ファリノーサ・分化型・スピナシアエ）であり、現在、Ｐｆｓ１～Ｐｆｓ１９までが採番されている。 これら以外にもＵＡ１０１４菌株の病原性が示すレースの様に採番されていないものも多く存在する。
　本発明及び本願明細書において、ホウレンソウ植物の「ｃｈｒＸ＿Ｙ」（Ｘ及びＹは整数）は、当該ホウレンソウ植物のゲノムのうち、「ＳｐｉｎａｃｈＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｓｐｉｎａｃｈｂａｓｅ．ｏｒｇ／）において公開されているリファレンスゲノム（Ｓｐｉｎａｃｈ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｖ１））における染色体番号Ｘ（第Ｘ染色体ともいう）のＹ番目の塩基に相当する塩基」を意味する。なお、とあるホウレンソウ植物における「ＳｐｉｎａｃｈＢａｓｅのリファレンスゲノム上の第Ｘ染色体のＹ番目の塩基に相当する塩基」とは、当該ホウレンソウ植物のゲノムＤＮＡの塩基配列とＳｐｉｎａｃｈＢａｓｅのリファレンスゲノムの塩基配列を、最もホモロジー（配列同一性）が高くなるようにアラインメントすることにより決定することができる。
　よって、とあるホウレンソウ植物の第Ｘ染色体は、当該ホウレンソウ植物のゲノムＤＮＡの塩基配列とＳｐｉｎａｃｈＢａｓｅのリファレンスゲノムの塩基配列を、最もホモロジー（配列同一性）が高くなるようにアラインメントすることにより決定したホウレンソウ植物の第Ｘ染色体として示すことができる。
　本発明及び本願明細書においては、「染色体」には、染色体全体のみならず、その一部も含まれる。すなわち、「染色体の一部」も、単に「染色体」ということがある。
　「Ｘ遺伝子座」は、「染色体中のＸ遺伝子が占める部位」である。このため、本発明及び本願明細書においては、「Ｘ遺伝子座を有するホウレンソウ植物」とは、染色体中にＸ遺伝子が占める部位を有するホウレンソウ植物であり、「Ｘ遺伝子を有するホウレンソウ植物」と同意である。
　本発明及び本願明細書においては、「製造方法」は、「作出方法」、「育成方法」、又は「生産方法」とも言い換えることができる。すなわち、ここでいう「製造」と「作出」、「育成」、「生産」との用語は同等の意味で使用される。
　本発明及び本願明細書において、「植物体の一部」とは、当該植物体の細胞又は組織を含むものであり、具体的には、葉、種子、花、茎、根、果実等が挙げられる。その他、当該植物体の細胞から得られるプロトプラストも含まれる。
＜べと病抵抗性ホウレンソウ植物＞
　本発明に係るべと病抵抗性ホウレンソウ植物は、野生種ホウレンソウであるスピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１の第４染色体に座上するべと病抵抗性遺伝子であるＲＴＭ－１遺伝子を有している、スピナシア・テトランドラ以外のホウレンソウ植物である。ＲＴＭ－１遺伝子は、スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１の第４染色体のｃｈｒ４＿７９６２９０７からｃｈｒ４＿８６１７２３２までの範囲内に存在している遺伝子である。
　ＲＴＭ－１遺伝子は、少なくとも、べと病のレースＰｆｓ１、Ｐｆｓ２、Ｐｆｓ３、Ｐｆｓ４、Ｐｆｓ５、Ｐｆｓ６、Ｐｆｓ７、Ｐｆｓ８、Ｐｆｓ９、Ｐｆｓ１０、Ｐｆｓ１１、Ｐｆｓ１２、Ｐｆｓ１３、Ｐｆｓ１４、Ｐｆｓ１５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ１７、Ｐｆｓ１８、Ｐｆｓ１９、及びＵＡ１０１４菌株が示すレースに対する抵抗性を付与する。すなわち、「ＲＴＭ－１遺伝子に由来するべと病抵抗性」とは、少なくとも、べと病のレースＰｆｓ１、Ｐｆｓ２、Ｐｆｓ３、Ｐｆｓ４、Ｐｆｓ５、Ｐｆｓ６、Ｐｆｓ７、Ｐｆｓ８、Ｐｆｓ９、Ｐｆｓ１０、Ｐｆｓ１１、Ｐｆｓ１２、Ｐｆｓ１３、Ｐｆｓ１４、Ｐｆｓ１５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ１７、Ｐｆｓ１８、Ｐｆｓ１９、及びＵＡ１０１４菌株が示すレースに対する抵抗性を意味する。単一の遺伝子でこのように広範なレースに対する抵抗性を付与できるため、ＲＴＭ－１遺伝子は、従来になく非常に優れたべと病抵抗性遺伝子である。
　ＲＴＭ－１遺伝子は、優性に後代へ遺伝する遺伝子である。このため、本発明に係るホウレンソウ植物は、ＲＴＭ－１遺伝子がホモ接合性である、すなわちＲＴＭ－１遺伝子をホモ接合で有するホウレンソウ植物であってもよく、ＲＴＭ－１遺伝子をヘテロ接合で有するホウレンソウ植物であってもよい。本発明に係るホウレンソウ植物は、単独で非常に広範なべと病レースへ耐性を付与する単一優性のべと病抵抗性遺伝子であるＲＴＭ－１遺伝子を有するため、べと病抵抗性ホウレンソウとして非常に優れている。
　本発明に係るべと病抵抗性ホウレンソウ植物は、スピナシア・テトランドラ以外のホウレンソウ植物のゲノムＤＮＡに、ＲＴＭ－１遺伝子を導入することにより作出することができる。ゲノムＤＮＡへのＲＴＭ－１遺伝子の導入は、例えば、スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１の第４染色体中のＲＴＭ－１遺伝子の座上する部位（ＲＴＭ－１遺伝子座）を含む染色体断片を導入することにより行うことができる。ＲＴＭ－１遺伝子座を含む染色体断片が導入される染色体中の部位は、特に限定されるものではなく、染色体外であってもよい。例えば、本発明に係るべと病抵抗性ホウレンソウ植物には、ＲＴＭ－１遺伝子座を含む染色体断片によって、第４染色体中の当該断片に相当する領域が置換されているホウレンソウ植物や、転座等によりＲＴＭ－１遺伝子座を含む染色体断片が、スピナシア・テトランドラの第４染色体中のＲＴＭ－１遺伝子座に相当する領域以外に導入されたホウレンソウ植物が含まれる。
　ＲＴＭ－１遺伝子座を含む染色体断片としては、スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１の第４染色体のうち、ｃｈｒ４＿７９６２９０７からｃｈｒ４＿８６１７２３２までの全領域を含む断片であってもよく、ｃｈｒ４＿７９６２９０７からｃｈｒ４＿８６１７２３２までの領域のうちのＲＴＭ－１遺伝子座を含む部分の断片であってもよい。ＲＴＭ－１遺伝子座を含む部分の断片としては、スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１の第４染色体のうち、ｃｈｒ４＿８４８８６０３からｃｈｒ４＿８５１０７１５までの領域を含む断片であることが好ましい。当該断片としては、ｃｈｒ４＿７９６２９０７からｃｈｒ４＿８６１７２３２までの領域のうちのｃｈｒ４＿８４８８６０３からｃｈｒ４＿８５１０７１５までの領域を含む染色体断片が好ましい。すなわち、本発明に係るべと病抵抗性ホウレンソウ植物としては、第４染色体の少なくとも一方のアレルに、スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１の第４染色体上のｃｈｒ４＿８４８８６０３からｃｈｒ４＿８５１０７１５までの範囲を含む断片を含有しているホウレンソウ植物が好ましい。また、ＲＴＭ－１遺伝子座を含む染色体断片としては、スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１の第４染色体のうちのｃｈｒ４＿７９６２９０７からｃｈｒ４＿８６１７２３２までの領域を含む染色体断片や、ｃｈｒ４＿７４２１４８０からｃｈｒ４＿１０７１０３５８までの領域を含む染色体断片であってもよい。
　ＲＴＭ－１遺伝子のゲノムＤＮＡへの導入は、スピナシア・テトランドラを親系統として用いる交雑育種法や、ゲノム編集法等の遺伝子改変法などにより行うことができる。
　例えば、本発明に係るべと病抵抗性ホウレンソウ植物は、スピナシア・テトランドラと、スピナシア・テトランドラ以外のホウレンソウ植物との種間雑種植物であって、ＲＴＭ－１遺伝子に由来するべと病抵抗性を有する植物に由来する。なお、「種間雑種植物」には、スピナシア属に属する種における異種間での交雑によって生じる植物に加えて、スピナシア属植物の異種間での細胞融合による体細胞雑種植物や、スピナシア属植物の異種間での接ぎ木により得られる接ぎ木雑種植物も含まれる。また、「スピナシア・テトランドラと、スピナシア・テトランドラ以外のホウレンソウ植物との種間雑種植物」には、当該種間雑種植物に加えて、当該種間雑種植物の後代も含む。
　本発明及び本願明細書において、「ホウレンソウ植物の後代」とは、当該ホウレンソウ植物の種内交雑により得られる子孫に加えて、当該ホウレンソウ植物を親系統として得られる個体とその子孫、当該ホウレンソウ植物の細胞と他品種の植物細胞との細胞融合による体細胞雑種植物とその子孫、当該ホウレンソウ植物を台木又は穂木とした接ぎ木により得られた個体とその子孫が含まれる。「子孫」には、種内交雑により得られる個体と種間雑種により得られる個体の両方が含まれる。また、「（植物を）親系統として得られる個体」とは、当該植物を親系統とした種内交雑、種間交雑、又は細胞融合若しくは接ぎ木により得られる個体を意味する。
　例えば、本発明に係るべと病抵抗性ホウレンソウ植物は、スピナシア・テトランドラと、スピナシア・テトランドラ以外のホウレンソウ植物とを交雑することにより作出できる。スピナシア・テトランドラを親系統とした種間交雑により得られるＦ１個体は、第４染色体の一方のアレルが、スピナシア・テトランドラに由来するＲＴＭ－１遺伝子を有する第４染色体である。ＲＴＭ－１遺伝子は、優性遺伝子であるため、スピナシア・テトランドラに由来する第４染色体を備えるＦ１個体は、ＲＴＭ－１遺伝子に由来するべと病抵抗性を有する。
　本発明に係るべと病抵抗性ホウレンソウ植物の作出の素材として用いられるホウレンソウ植物としては、ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１が有しているＲＴＭ－１遺伝子を有するものであれば特に限定されるものではない。例えば、スピナシア・テトランドラの系統としては、ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１の他には、ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１からＲＴＭ－１遺伝子を受け継いだ後代系統等が挙げられる。
　本発明に係るべと病抵抗性ホウレンソウ植物を作出するために、スピナシア・テトランドラと交雑する親系統としては、スピナシア・テトランドラ以外のホウレンソウ植物であれば特に限定されるものではないが、農作物として栽培されている栽培種ホウレンソウ植物であることが好ましい。スピナシア・テトランドラは、野生種であり、発芽、花粉品質、葉色や葉型などの形質が、農作物としては栽培種ホウレンソウよりも劣る。スピナシア・テトランドラと交雑する親系統を栽培種ホウレンソウ植物とすることにより、得られるべと病抵抗性ホウレンソウ植物のべと病抵抗性以外の形質を、農作物として好ましい形質に近づけることができる。栽培種ホウレンソウ植物としては、スピナシア・オレラシア　Ｌや、スピナシア・オレラシア　Ｌを親系統として作出された種間雑種ホウレンソウ植物が挙げられる。
　本発明に係るべと病抵抗性ホウレンソウ植物は、スピナシア・テトランドラと、スピナシア・テトランドラ以外のホウレンソウ植物との種間交雑により得られるＦ１個体の後代であってもよい。例えば、スピナシア・テトランドラと栽培種ホウレンソウ植物を交雑してＦ１種子を得、得られたＦ１種子から生育させた植物個体に、栽培種ホウレンソウ植物個体を戻し交雑、又は自殖して種子を得る。次いで、得られた種子から生育させた植物個体からＲＴＭ－１遺伝子を有する個体を選抜する。選抜された植物個体に対して、自殖又は栽培種ホウレンソウ植物との交雑と、交雑により得られた後代からのＲＴＭ－１遺伝子を有する個体の選抜とを繰り返すことにより、べと病抵抗性ホウレンソウ植物の固定種を得ることができる。自殖、栽培種ホウレンソウ植物との交雑、栽培、及び種子の採種は、ホウレンソウ栽培の常法により行うことができる。
　交雑により得られた後代からのＲＴＭ－１遺伝子を有する個体の選抜は、例えば、べと病抵抗性を調べることにより行うことができる。具体的には、べと病抵抗性を調べる被験植物個体の葉に対して、各レースのＰｆｓを接種させ、べと病の発病の有無を調べる。べと病を発病しなかった場合に、当該被検植物個体は、接種したレースに対して抵抗性であると評価する。交雑により得られた後代から、少なくともべと病のレースＰｆｓ１、Ｐｆｓ２、Ｐｆｓ３、Ｐｆｓ４、Ｐｆｓ５、Ｐｆｓ６、Ｐｆｓ７、Ｐｆｓ８、Ｐｆｓ９、Ｐｆｓ１０、Ｐｆｓ１１、Ｐｆｓ１２、Ｐｆｓ１３、Ｐｆｓ１４、Ｐｆｓ１５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ１７、Ｐｆｓ１８、Ｐｆｓ１９、及びＵＡ１０１４菌株が示すレースに対して抵抗性を有する植物個体を、ＲＴＭ－１遺伝子を有する個体として選抜する。
　交雑により得られた後代からのＲＴＭ－１遺伝子を有する個体の選抜は、例えば、ゲノムＤＮＡ中にＲＴＭ－１遺伝子を含む染色体断片を含むかどうかを調べる方法により行うことができる。具体的には、ホウレンソウ植物の第４染色体中の、ｃｈｒ４＿７９６２９０７からｃｈｒ４＿８６１７２３２までの領域やその近傍のＤＮＡマーカーを利用して、これらの領域が、スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１に由来する染色体断片か、スピナシア・テトランドラ以外のホウレンソウ植物に由来する染色体断片かを識別する。
　本発明及び本願明細書において、ＤＮＡマーカーとは、異なる品種由来の染色体断片同士を識別し得る染色体上のＤＮＡ配列の差異を検出し得るものである。ＤＮＡマーカーとしては、例えば、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一塩基多型）マーカーやＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｒｅｐｅａｔｓ、単純反復配列）マーカー、ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、制限酵素断片長多型）マーカー等が挙げられる。
　ＤＮＡマーカーの検出は、常法により行うことができる。例えば、各植物個体から抽出したＤＮＡを鋳型とし、特定のＳＮＰやＳＳＲと特異的にハイブリダイズし得るプライマーとポリメラーゼを用いた核酸増幅反応を行い、電気泳動法等を用いて増幅産物の有無を検出し、各多型を識別することができる。また、各植物個体から抽出したＤＮＡを制限酵素処理した後、電気泳動法等を用いてＤＮＡ断片のパターンを検出し、各多型を識別することができる。なお、特定のＳＮＰやＳＳＲと特異的にハイブリダイズし得るプライマーは、ホウレンソウのゲノムＤＮＡの塩基配列や、検出対象のＳＮＰやＳＳＲの塩基配列に応じて、汎用されているプライマー設計ツール等を用いて常法により設計し、当該技術分野においてよく知られている方法により合成することができる。
　ＲＴＭ－１遺伝子を有する個体の選抜に用いるＤＮＡマーカーとしては、例えば、ｃｈｒ４＿７９６２９０７からｃｈｒ４＿８６１７２３２までの領域やその近傍のＳＮＰが挙げられる。当該ＳＮＰとしては、具体的には、ｃｈｒ４＿７４２１４８０、ｃｈｒ４＿７９６２９０７、ｃｈｒ４＿８１５２９８６、ｃｈｒ４＿８１９０９９０、ｃｈｒ４＿８４８８６０３、ｃｈｒ４＿８４９４６００、ｃｈｒ４＿８５００２００、ｃｈｒ４＿８５０２３１９、ｃｈｒ４＿８５０２３３４、ｃｈｒ４＿８５０２３９４、ｃｈｒ４＿８５１０７１５、ｃｈｒ４＿８６１７２３２、ｃｈｒ４＿１０７１０３５８が挙げられる。これらのＳＮＰの塩基の識別は、例えば、ＫＡＳＰ（Ｋｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　Ａｌｌｅｌｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＰＣＲ）ジェノタイピングアッセイ（ＬＧＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社製）を用いて行うことができる。これらのＳＮＰについて、スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１の遺伝子型と、ＳｐｉｎａｃｈＢａｓｅにおいて公開されているリファレンスゲノムの遺伝子型を表１に示す。表１中、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ａはアデニン、Ｔはチミンを意味する。
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　例えば、本発明に係るべと病抵抗性ホウレンソウ植物のうち、スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１の第４染色体のｃｈｒ４＿８４８８６０３からｃｈｒ４＿８５１０７１５までの範囲を含む断片をホモ接合又はヘテロ接合で有するホウレンソウ植物は、第４染色体の少なくとも一方のアレルにおいて、ｃｈｒ４＿８４８８６０３で特定されるＳＮＰがシトシンであり、ｃｈｒ４＿８４９４６００で特定されるＳＮＰがチミンであり、ｃｈｒ４＿８５１０７１５で特定されるＳＮＰがグアニンである。また、スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１の第４染色体のｃｈｒ４＿７９６２９０７からｃｈｒ４＿８６１７２３２までの範囲を含む断片をホモ接合又はヘテロ接合で有するホウレンソウ植物としては、第４染色体の少なくとも一方のアレルにおいて、ｃｈｒ４＿７９６２９０７で特定されるＳＮＰがグアニンであり、ｃｈｒ４＿８１５２９８６で特定されるＳＮＰがシトシンであり、ｃｈｒ４＿８１９０９９０で特定されるＳＮＰがグアニンであり、ｃｈｒ４＿８４８８６０３で特定されるＳＮＰがシトシンであり、ｃｈｒ４＿８４９４６００で特定されるＳＮＰがチミンであり、ｃｈｒ４＿８５１０７１５で特定されるＳＮＰがグアニンであり、ｃｈｒ４＿８６１７２３２で特定されるＳＮＰがグアニンであるホウレンソウ植物が好ましい。スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１の第４染色体のｃｈｒ４＿７９６２９０７からｃｈｒ４＿８６１７２３２までの範囲を含む断片をホモ接合又はヘテロ接合で有するホウレンソウ植物としては、第４染色体の少なくとも一方のアレルにおいて、ｃｈｒ４＿７９６２９０７で特定されるＳＮＰがグアニンであり、ｃｈｒ４＿８１５２９８６で特定されるＳＮＰがシトシンであり、ｃｈｒ４＿８１９０９９０で特定されるＳＮＰがグアニンであり、ｃｈｒ４＿８４８８６０３で特定されるＳＮＰがシトシンであり、ｃｈｒ４＿８４９４６００で特定されるＳＮＰがチミンであり、ｃｈｒ４＿８５００２００で特定されるＳＮＰはチミンであり、ｃｈｒ４＿８５０２３１９で特定されるＳＮＰはシトシンであり、ｃｈｒ４＿８５０２３３４で特定されるＳＮＰはグアニンであり、ｃｈｒ４＿８５０２３９４で特定されるＳＮＰはグアニンであり、ｃｈｒ４＿８５１０７１５で特定されるＳＮＰがグアニンであり、ｃｈｒ４＿８６１７２３２で特定されるＳＮＰがグアニンであるホウレンソウ植物も好ましい。
　本発明に係るべと病抵抗性ホウレンソウ植物は、べと病抵抗性以外の形質、特に農作物としての形質は、栽培種ホウレンソウと同じ又は近似しているものが好ましい。農作物としての形質とは、食味、葉の形状、収量、栽培の容易さ等が挙げられる。なお、「栽培種としての形質」とは、農作物としての形質が、農作物として適している形質であることを意味する。
　本発明に係るべと病抵抗性ホウレンソウ植物としては、例えば、ＴＮＫＨ－１系統（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２４０４）、ＴＮＫＨ－２系統（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２４０５）が挙げられる。これらの２系統は、スピナシア・テトランドラの持つ劣悪形質とＲＴＭ－１遺伝子との連鎖を断ち切り、ＲＴＭ－１遺伝子に由来するべと病抵抗性を保持しつつ、栽培種としての形質を兼ね合わせている。また、これらの系統で特定される植物由来のべと病抵抗性を有するホウレンソウ植物も、本発明に係るべと病抵抗性ホウレンソウ植物に含まれる。
　ＴＮＫＨ－１系統で特定される植物由来のべと病抵抗性を有するホウレンソウ植物としては、ＴＮＫＨ－１系統に加えて、ＴＮＫＨ－１系統を親系統として得られた雑種植物や、それらの後代であって、ＲＴＭ－１遺伝子に由来するべと病抵抗性を有するホウレンソウ植物が挙げられる。ＴＮＫＨ－２系統で特定される植物由来のべと病抵抗性を有するホウレンソウ植物も同様である。
　本発明に係るべと病抵抗性ホウレンソウ植物としては、ＲＴＭ－１遺伝子以外のべと病抵抗性遺伝子を少なくとも１種以上有することが好ましい。ＲＴＭ－１遺伝子は、単独で既知の抵抗性遺伝子よりも広範囲なレースに対する抵抗性を付与することができるが、その他のべと病抵抗性遺伝子をも有することにより、抵抗性を打破する新レースの出現を抑制することにも寄与することが期待できる。例えば、ＲＴＭ－１遺伝子以外のべと病抵抗性遺伝子としては、特に限定されるものではなく、例えば、ＲＰＦ１遺伝子～ＲＰＦ１５遺伝子、Ｒ６遺伝子、Ｒ１５遺伝子等が挙げられる。
　本発明に係るべと病抵抗性ホウレンソウ植物は、植物体の全部及び一部のいずれであってもよい。すなわち、本発明に係るべと病抵抗性ホウレンソウ植物は、ＲＴＭ－１遺伝子を有するホウレンソウ植物の植物体の全体、当該ホウレンソウ植物の地上部、及び当該ホウレンソウ植物の組織のいずれも包含する。また、本発明に係るべと病抵抗性ホウレンソウ植物は、ＲＴＭ－１遺伝子を有するホウレンソウ植物の一組織から得られる細胞も包含する。組織としては、胚、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、茎、葉柄、根、根端、果実、種子、花、子葉、及び胚軸を挙げることができる。
　本発明に係るべと病抵抗性ホウレンソウ植物のべと病抵抗性は、優性的な発現を示す。このため、本発明に係るべと病抵抗性ホウレンソウ植物を親系統として種間交雑又は種内交雑することにより、ＲＴＭ－１遺伝子に由来するべと病抵抗性を備えるホウレンソウ植物の新規系統の育成が可能となる。
＜べと病抵抗性ホウレンソウ植物のスクリーニング方法＞
　本発明に係るべと病抵抗性ホウレンソウ植物のスクリーニング方法は、被験ホウレンソウ植物がＲＴＭ－１遺伝子を有するか否かを調べ、ＲＴＭ－１遺伝子を有すると判断された場合に、当該被験ホウレンソウ植物をべと病抵抗性ホウレンソウ植物として選抜する。本発明に係るべと病抵抗性ホウレンソウ植物のスクリーニング方法では、被験ホウレンソウ植物がＲＴＭ－１遺伝子を有するか否かを、第４染色体のＲＴＭ－１遺伝子座又はその近傍のＤＮＡマーカーや、これらのＤＮＡマーカーと強く連鎖するＤＮＡマーカーの遺伝子型に基づいて判断する。第４染色体の少なくとも一方のアレルにおいて、ＲＴＭ－１遺伝子座又はその近傍のＤＮＡマーカーやこれらのＤＮＡマーカーと強く連鎖するＤＮＡマーカーの遺伝子型が、ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１株等のようなＲＴＭ－１遺伝子を有し、べと病抵抗性を示すスピナシア・テトランドラと同じ遺伝子型の場合には、当該被験ホウレンソウ植物をべと病抵抗性ホウレンソウ植物として選抜する。
　ＲＴＭ－１遺伝子の有無を判断するためのＤＮＡマーカーとしては、例えば、表１に記載のＳＮＰが挙げられる。中でも、ホウレンソウ植物の、ｃｈｒ４＿８４８８６０３で特定されるＳＮＰ、ｃｈｒ４＿８４９４６００で特定されるＳＮＰ、ｃｈｒ４＿８５１０７１５で特定されるＳＮＰ、及びこれらのＳＮＰと遺伝的に強く連鎖しているＳＮＰからなる群より選択される１種以上が、ＲＴＭ－１遺伝子の有無を判断するためのＤＮＡマーカーとして好適である。例えば、少なくとも一方のアレルにおいて、ｃｈｒ４＿８４８８６０３で特定されるＳＮＰがシトシンである、ｃｈｒ４＿８４９４６００で特定されるＳＮＰがチミンである、又はｃｈｒ４＿８５１０７１５で特定されるＳＮＰがグアニンである場合に、当該被験ホウレンソウ植物をべと病抵抗性ホウレンソウ植物として選抜する。
　ＲＴＭ－１遺伝子の有無を判断するためのＤＮＡマーカーの遺伝子型を識別するためのプライマーセットを、予めキット化しておくことにより、当該キットを用いることにより、より簡便にＲＴＭ－１遺伝子の有無を判断して、べと病抵抗性ホウレンソウ植物の選抜を行うことができる。例えば、ホウレンソウ植物のｃｈｒ４＿８４８８６０３で特定されるＳＮＰの遺伝子型を識別するためのプライマーセット、ｃｈｒ４＿８４９４６００で特定されるＳＮＰの遺伝子型を識別するためのプライマーセット、及びｃｈｒ４＿８５１０７１５で特定されるＳＮＰの遺伝子型を識別するためのプライマーセットからなる群より選択される１種以上のプライマーセットをまとめたキットは、被験ホウレンソウ植物のＲＴＭ－１遺伝子の有無を判断するためのこれらのＳＮＰの遺伝子型識別に有用である。
＜ホウレンソウ植物のべと病抵抗性の予測方法＞
　本発明に係るホウレンソウ植物のべと病抵抗性の予測方法は、被験ホウレンソウ植物がＲＴＭ－１遺伝子を有するか否かを調べ、ＲＴＭ－１遺伝子を有すると判断された場合に、当該被験ホウレンソウ植物がべと病抵抗性である可能性が高いと予測する。本発明に係るホウレンソウ植物のべと病抵抗性の予測方法では、被験ホウレンソウ植物がＲＴＭ－１遺伝子を有するか否かを、第４染色体のＲＴＭ－１遺伝子座又はその近傍のＤＮＡマーカーや、これらのＤＮＡマーカーと強く連鎖するＤＮＡマーカーの遺伝子型に基づいて判断する。第４染色体の少なくとも一方のアレルにおいて、ＲＴＭ－１遺伝子座又はその近傍のＤＮＡマーカーやこれらのＤＮＡマーカーと強く連鎖するＤＮＡマーカーの遺伝子型が、ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１株等のようなＲＴＭ－１遺伝子を有し、べと病抵抗性を示すスピナシア・テトランドラと同じ遺伝子型の場合には、当該被験ホウレンソウ植物がＲＴＭ－１遺伝子を有すると判断し、ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１株等のようなＲＴＭ－１遺伝子を有し、べと病抵抗性を示すスピナシア・テトランドラと異なる遺伝子型の場合には、当該被験ホウレンソウ植物がＲＴＭ－１遺伝子を有さないと判断する。
　ＲＴＭ－１遺伝子の有無を判断するためのＤＮＡマーカーとしては、表１に記載のＳＮＰが挙げられる。中でも、ホウレンソウ植物のｃｈｒ４＿８４８８６０３で特定されるＳＮＰ、ｃｈｒ４＿８４９４６００で特定されるＳＮＰ、ｃｈｒ４＿８５１０７１５で特定されるＳＮＰ、及びこれらのＳＮＰと遺伝的に強く連鎖しているＳＮＰからなる群より選択される１種以上が、べと病抵抗性を予測するためのＤＮＡマーカーとして好適である。例えば、少なくとも一方のアレルにおいて、ｃｈｒ４＿８４８８６０３で特定されるＳＮＰがシトシンである、ｃｈｒ４＿８４９４６００で特定されるＳＮＰがチミンである、又はｃｈｒ４＿８５１０７１５で特定されるＳＮＰがグアニンである場合に、当該被験ホウレンソウ植物はＲＴＭ－１遺伝子を有しており、べと病抵抗性である可能性が高いと予測する。ＲＴＭ－１遺伝子の有無を判断するためのＤＮＡマーカーの遺伝子型を識別するためのプライマーセット及びこれのキットは、前記と同様のものを用いることができる。
＜べと病抵抗性ホウレンソウ植物の製造方法＞
　ＲＴＭ－１遺伝子を有するホウレンソウ植物を材料として交雑を行うことによって、ＲＴＭ－１遺伝子を有していないホウレンソウ植物に、ＲＴＭ－１遺伝子に由来するべと病抵抗性を導入して新規のべと病抵抗性ホウレンソウ植物を製造することができる。単一優性の抵抗性遺伝子であるＲＴＭ－１遺伝子は、任意の系統へ導入することが容易であり、ホウレンソウの品種育成を加速させることができる。さらに、ＲＴＭ－１遺伝子は、その他の単一優性抵抗性対立遺伝子と同一のハプロタイプに併せ持つことが可能である。このため、ＲＴＭ－１遺伝子を有するホウレンソウ植物を親系統として用いることにより、より広範囲なレースに抵抗性を有する品種の育成が容易になる。
　本発明に係るべと病抵抗性ホウレンソウ植物の製造方法は、ＲＴＭ－１遺伝子を有するホウレンソウ植物を親系統として用いた交雑育種を利用する方法である。具体的には、ＲＴＭ－１遺伝子を有するホウレンソウ植物と任意のホウレンソウ植物とを交雑する第１交雑工程と、前記第１交雑工程により得られたＦ１個体に対して、自殖、戻し交雑、又は前記第１交雑工程において用いた親系統とは異なるホウレンソウ植物との種間交雑又は種内交雑を行い、分離集団を得る第２交雑工程と、前記分離集団から、ＲＴＭ－１遺伝子を有するホウレンソウ植物を選抜する選抜工程と、を有する。自殖、戻し交雑、種間交雑、種内交雑、ホウレンソウ植物の栽培、及び採種は、ホウレンソウ栽培の常法により行うことができる。
　第１交雑工程において親系統として用いるＲＴＭ－１遺伝子を有するホウレンソウ植物としては、スピナシア・テトランドラを用いることができ、前記の本発明に係るべと病抵抗性ホウレンソウ植物を用いることもできる。本発明においては、親系統として用いるＲＴＭ－１遺伝子を有するホウレンソウ植物としては、ＲＴＭ－１遺伝子を有しつつ、栽培種としての形質を兼ね合わせているべと病抵抗性ホウレンソウ植物であることが好ましい。このようなべと病抵抗性ホウレンソウ植物としては、ＴＮＫＨ－１系統、ＴＮＫＨ－１系統を親系統として得られた雑種植物、ＴＮＫＨ－２系統、及びＴＮＫＨ－２系統を親系統として得られた雑種植物、並びにそれらの後代であって、ＲＴＭ－１遺伝子に由来するべと病抵抗性を有するホウレンソウ植物が挙げられる。
　第１交雑工程において親系統として用いる任意のホウレンソウ植物や、第２交雑工程において種間交雑又は種内交雑の親系統として用いる任意のホウレンソウ植物としては、特に限定されるものではなく、ＲＴＭ－１遺伝子を有していない各種のホウレンソウ植物を適宜用いることができる。本発明においては、親系統としては、栽培種ホウレンソウ植物を用いることが好ましい。例えば、ＲＴＭ－１遺伝子を有しつつ、栽培種としての形質を兼ね合わせているべと病抵抗性ホウレンソウ植物と、ＲＴＭ－１遺伝子を有していない栽培種ホウレンソウ植物とを親系統として、両者を交雑させ、得られたＦ１個体に対して、自殖、戻し交雑、又は第１交雑工程において用いた親系統とは異なる栽培種ホウレンソウ植物との種間交雑又は種内交雑を行うことにより、ＲＴＭ－１遺伝子に由来するべと病抵抗性を備え、かつ栽培種としても好適な形質を備えた新規ホウレンソウ系統を、比較的容易に作出することができる。
　第１交雑工程において親系統として用いる任意のホウレンソウ植物や、第２交雑工程において種間交雑又は種内交雑の親系統として用いる任意のホウレンソウ植物としては、ＲＴＭ－１遺伝子以外のべと病抵抗性遺伝子を少なくとも１種以上有するホウレンソウ植物であることが好ましく、ＲＴＭ－１遺伝子以外のべと病抵抗性遺伝子を少なくとも１種以上有する栽培種ホウレンソウ植物であることがより好ましい。ＲＴＭ－１遺伝子以外のべと病抵抗性遺伝子を少なくとも１種以上有するホウレンソウ植物を親系統とすることにより、ＲＴＭ－１遺伝子とその他のべと病抵抗性遺伝子の両方を含む新規ホウレンソウ系統を、比較的容易に作出することができる。
　選抜工程における、分離集団からのＲＴＭ－１遺伝子を有するホウレンソウ植物の選抜は、例えば、被験植物個体の葉に対して各レースのＰｆｓを接種させて、べと病抵抗性を調べることにより行うことができる。分離集団から、少なくともべと病のレースＰｆｓ１、Ｐｆｓ２、Ｐｆｓ３、Ｐｆｓ４、Ｐｆｓ５、Ｐｆｓ６、Ｐｆｓ７、Ｐｆｓ８、Ｐｆｓ９、Ｐｆｓ１０、Ｐｆｓ１１、Ｐｆｓ１２、Ｐｆｓ１３、Ｐｆｓ１４、Ｐｆｓ１５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ１７、Ｐｆｓ１８、Ｐｆｓ１９、及びＵＡ１０１４菌株が示すレースに対して抵抗性を有する植物個体を、ＲＴＭ－１遺伝子を有する個体として選抜する。
　選抜工程におけるＲＴＭ－１遺伝子を有する個体の選抜は、ホウレンソウ植物の第４染色体中のＲＴＭ－１遺伝子座及びその近傍のＤＮＡマーカーを利用して、行うことができる。使用するＤＮＡマーカーや具体的な方法は、前記の本発明に係るスクリーニング方法と同様にして行うことができる。
　ＲＴＭ－１遺伝子とその他のべと病抵抗性遺伝子の両方を含む植物個体を選抜する場合には、前記のＲＴＭ－１遺伝子を有する個体の選抜に用いるＤＮＡマーカーと共に、当該他のべと病抵抗性遺伝子の有無を識別可能なＤＮＡマーカーを用いる。当該他のべと病抵抗性遺伝子の有無を識別可能なＤＮＡマーカーとしては、当該他のべと病抵抗性遺伝子の遺伝子座とその近傍に存在するＳＮＰ等を用いることができる。
　その後、選抜された後代個体から採種された種子の自殖を繰り返すことにより、より形質が安定し、発芽率、収穫量、採種量等が、農作物として安定して栽培可能な程度のべと病抵抗性ホウレンソウ植物が得られる。自殖の繰り返し回数は、１回以上であれば特に限定されるものではなく、２～３回であってもよく、３回以上であってもよい。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜べと病抵抗性を調べるレース接種試験＞
　ホウレンソウ植物に対するＰｆｓの接種試験は、下記の方法で行った。
　ホウレンソウ種子を培土「スーパーミックスＡ」（サカタのタネ社製）を詰めたトレイに播種し、培土「メトロミックス３５０」（ハイポネックスジャパン社製）を用いて覆土をした。播種する際、各トレイに、接種するレースに対して罹病性を示す系統の種子を播種し、発病の対照区を設けた。このトレイをガラス温室内で２週間育苗し、本葉２葉期に、Ｐｆｓの胞子懸濁液（５　×　１０４／ｍＬ）を噴霧接種した。接種後、ただちにトレイをプラスチックカバーで覆い、温度１５℃、湿度１００％、１２時間日長の条件下で管理した。
　接種から７～１０日後、対照区の発病を十分に確認した後に、個体ごとに抵抗性・罹病性の判定を行った。子葉又は本葉に菌糸及び胞子が出現して発病が認められた株を罹病性とし、子葉及び本葉ともに発病が認められなかった株を抵抗性とした。
　べと病の各レースは、日本国内、Ｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ａｒｋａｎｓａｓ（Dr. Jim Correll）及びＮａｋｔｕｉｎｂｏｕｗから入手した。また、べと病のレース判別には、各レースに異なる抵抗性パターンを示す既知のホウレンソウ品種（differential set）を判別品種として利用することができる。各レースのべと病抵抗性を判別するために用いられる判別品種は、ＵＳＤＡ（アメリカ合衆国農務省）及びＮａｋｔｕｉｎｂｏｕｗから入手可能である（非特許文献４）。
　各判別品種について報告されている抵抗性を表２及び表３に示す。表中、「－」が抵抗性であること、「（－）」が中程度の抵抗性であること、「＋」が罹病性であること、「（＋）」はべと病症状と胞子形成は子葉でのみで観察され、本葉では観察されないことを、それぞれ意味する。また、「＊」は、個々のテストによって抵抗性の結果が異なっていることを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［実施例１］
　２０１３年にオランダのＣＧＮより入手した野生種スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１を親系統として、新規なべと病抵抗性系統を作出した。
　まず、オランダのＣＧＮより入手した野生種スピナシア・テトランドラ系統のうち、ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１及びＣＧＮ２５４７４：ＭＧＫ　１８をそれぞれ播種し、発芽した個体に対して、Ｐｆｓ６を接種した。この結果、スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１は抵抗性を示したが、スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４７４：ＭＧＫ　１８は罹病性であった。そこで、スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１を親系統として用いることにした。
　まず、スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１を６０粒播種し、発芽した２５個体に対してＰｆｓ１０を接種した。この結果、２５個体全てが抵抗性を示した。
　次いで、この２５個体の中の４個体と、ＲＰＦ３系統（ＲＰＦ３遺伝子を有する優良親系統）を交配し、Ｆ１種子を得た。なお、優良親系統とは、栽培種として好適な形質を発現する系統を作出するための親系統として好適な系統を意味する。
　得られたＦ１種子４０粒を播種したところ、そのうち１０個体の植物体が生育した。生育した１０個体の中の２個体に、前記ＲＰＦ３系統を戻し交配し、ＢＣ１種子を得た。
　得られたＢＣ１種子２４粒を播種したところ、そのうち１０個体の植物体が生育した。生育した１０個体に対し、ＲＰＦ３が抵抗性を示さないＰｆｓ１０を接種したところ、７個体が抵抗性を示した。その中の１個体に、ＲＰＦ４系統（ＲＰＦ４遺伝子を有する優良親系統）を交配し、ＢＣ１Ｆ１種子を得た。
　得られたＢＣ１Ｆ１種子５０粒を播種したところ、そのうち４３個体の植物体が生育した。生育した４３個体に対し、ＲＰＦ３及びＲＰＦ４が共に抵抗性を示さないＰｆｓ１０を接種したところ、１５個体が抵抗性を示した。その中の１１個体を自殖し、ＢＣ１Ｆ１Ｓ１種子を得た。
　得られたＢＣ１Ｆ１Ｓ１種子８１７粒を播種したところ、そのうち６７６個体の植物体が生育した。生育した植物体全てに対してＰｆｓ１０を接種したところ、５００個体の植物体が抵抗性を示した。抵抗性を示した個体のうち、２２個体で自殖し、ＢＣ１Ｆ１Ｓ２種子を得た。
　得られたＢＣ１Ｆ１Ｓ２種子７６９６粒を播種したところ、そのうち３５５１個体の植物体が生育した。生育した植物体のうちの７６個体を自殖し、ＢＣ１Ｆ１Ｓ３種子を得た。
　得られたＢＣ１Ｆ１Ｓ３種子１２９７１粒を播種したところ、そのうち９８１５個体の植物体が生育した。生育した植物体のうちの１１５個体を自殖し、ＢＣ１Ｆ１Ｓ４種子を得た。
　自殖した１１５個体のそれぞれから得られたＢＣ１Ｆ１Ｓ４種子を７３７７粒播種したところ、そのうち４７１７個体の植物体が生育した。生育した植物体全てに対して、ＲＰＦ３及びＲＰＦ４が共に抵抗性を示さないＰｆｓ１０又はＵＡ１０１４菌株が示すレースを接種したところ、５系統においてすべての植物体がＰｆｓ１０及びＵＡ１０１４菌株が示すレースに対して抵抗性を示した。これは、前記５系統が、ＲＰＦ３及びＲＰＦ４とは異なる未知のべと病抵抗性遺伝子をホモ接合で有していること、及び、この未知のべと病抵抗性遺伝子は、ＲＰＦ３遺伝子及びＲＰＦ４遺伝子の対立遺伝子ではなく、異なる遺伝子座に存在する可能性を示唆している。抵抗性を示した５系統３４個体を自殖し、ＢＣ１Ｆ１Ｓ５種子を得た。
　全ての個体が抵抗性を示した５系統について、ＲＰＦ３マーカー及びＲＰＦ４マーカーを用いてＲＰＦ３遺伝子及びＲＰＦ４遺伝子の有無を調べた。結果に基づき、ＲＰＦ３ホモ系統を選択しＴＮＫＨ－１系統と命名した。また、ＲＰＦ４ホモ系統を選択し、ＴＮＫＨ－２系統と命名した。さらに、ＲＰＦ３及びＲＰＦ４の分離系統を選択し、これをＴＮＫＨ－３系統と命名した。これらの系統が有する、スピナシア・テトランドラに由来する未知のべと抵抗性遺伝子及び遺伝子座をＲＴＭ－１と命名した。
　なお、スピナシア・テトランドラ及びその遺伝的影響が強く表れる初期世代においては、複数の種子が固まり、また発芽も悪かった。そのため、種子の収穫、精選に多くの労力を要し、発芽率を上げるために播種後の発芽環境に留意した。さらに花粉が重たく、飛散しにくいため交雑が困難であった。さらに、各工程では、耐病性による選抜だけでなく、葉色、葉型、葉の大きさ等を吟味し、出来るだけ栽培型に近い形質を有する個体の選抜を合わせて行った。
　出願人は、ＴＮＫＨ－１系統及びＴＮＫＨ－２系統について、その種子を、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２０号室）に寄託した。ＴＮＫＨ－１系統の寄託者が付した識別のための表示：ＳＳＣ－ＳＰＩ－２０－００１、受託番号がＦＥＲＭ　ＢＰ－２２４０４（寄託日：令和２年１２月２５日）であり、ＴＮＫＨ－２系統の寄託者が付した識別のための表示：ＳＳＣ－ＳＰＩ－２０－００２、受託番号がＦＥＲＭ　ＢＰ－２２４０５（寄託日：令和２年１２月２５日）である。
［実施例２］
　いずれのレースにも抵抗性を有さないＶｉｒｏｆｌａｙ系統を種子親、実施例１で作出したＴＮＫＨ－３系統を花粉親として交雑を行い、得られたＦ１個体に対して、Ｐｆｓ１、Ｐｆｓ２、Ｐｆｓ３、Ｐｆｓ４、Ｐｆｓ５、Ｐｆｓ６、Ｐｆｓ７、Ｐｆｓ８、Ｐｆｓ１０、Ｐｆｓ１１、Ｐｆｓ１２、Ｐｆｓ１３、Ｐｆｓ１４、Ｐｆｓ１５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ１７、及びＵＡ１０１４菌株が示すレースを用いた接種試験を行い、これらに対する抵抗性を調べた。結果を表４に示す。表４中、「Ｖｉｒｏｆｌａｙ × ＴＮＫＨ－３ Ｆ１」の欄の「抵抗性個体」と「罹病性個体」の個体数欄の「Ｐ（Ｑ）」（ＰとＱはいずれも整数）は、Ｐが、抵抗性個体又は罹病性個体のうちのＦ１個体の個体数であり、Ｑが、抵抗性個体又は罹病性個体のうちのＶｉｒｏｆｌａｙの自殖で得られた個体（セルフ）の個体数である。また、「ｎｔ」は実験を行っておらず、データがないことを意味する。さらに、「ＲＰＦ３系統」、「ＲＰＦ４系統」、及び「Ｖｉｒｏｆｌａｙ」の系統のうちの各レースの欄において、「－」は抵抗性であることを意味し、「＋」は罹病性であることを意味する。なお、表４中に記載されたＲＴＭ-１遺伝子型のうち、「ＲＴＭ－１」はスピナシア・テトランドラ由来の抵抗性の遺伝子型、「ｒｔｍ－１」はＶｉｒｏｆｌａｙ由来の罹病性の遺伝子型をそれぞれ意味する。したがって、「ＲＴＭ－１/ＲＴＭ－１」は抵抗性のホモ接合型、「ｒｔｍ－１/ｒｔｍ－１」は罹病性のホモ接合型、「ＲＴＭ－１/ｒｔｍ－１」は抵抗性と罹病性のヘテロ接合型をそれぞれ意味する。同様にＲＰＦ遺伝子型のうち、「ｒｐｆＶ」はＶｉｒｏｆｌａｙ由来の罹病性の遺伝子型を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ホウレンソウは雌雄異株の作物であるが、その同一個体に雌ずいと雄ずいの両方の器官を生じる間性を示す系統も存在する。Ｖｉｒｏｆｌａｙを種子親にしたＦ１採種においては、Ｖｉｒｏｆｌａｙの自殖種子が含まれてしまうことがある。Ｖｉｒｏｆｌａｙの自殖種子か、Ｆ１種子かは、ＲＰＦ３マーカー及びＲＰＦ４マーカーを用いてＲＰＦ遺伝子型を調べることにより判別できる。
　Ｖｉｒｏｆｌａｙ系統とＴＮＫＨ－３系統を交雑して得られたＦ１集団のうち、罹病性個体であったものについてＲＰＦ遺伝子型を調べたところ、ＲＰＦ３遺伝子とＲＰＦ４遺伝子のどちらも有しておらず（ｒｐｆＶ／ｒｐｆＶ）、これらの罹病性個体は全て、Ｖｉｒｏｆｌａｙの自殖で得られた個体であったことが確認された。すなわち、表４に示すように、Ｖｉｒｏｆｌａｙ系統とＴＮＫＨ－３系統を交雑して得られたＦ１個体は、Ｐｆｓ９以外の全てのレースに対して抵抗性を示し、罹病性個体はなかった。ＲＰＦ３遺伝子とＲＰＦ４遺伝子のべと病抵抗性から、ＲＴＭ－１遺伝子は、少なくともＰｆｓ６、Ｐｆｓ７、Ｐｆｓ１０、Ｐｆｓ１３、Ｐｆｓ１７、及びＵＡ１０１４菌株が示すレースに対して優性の抵抗性を付与できることがわかった。
　Ｆ１集団においては、ＲＰＦ３／ｒｐｆＶとＲＰＦ４／ｒｐｆＶがおおよそ１：１に分離する。ＲＰＦ３はＰｆｓ２、Ｐｆｓ４、及びＰｆｓ１５に罹病性であり、ＲＰＦ４はＰｆｓ５、Ｐｆｓ８、Ｐｆｓ１１、Ｐｆｓ１２、Ｐｆｓ１４、及びＰｆｓ１６に罹病性であることから、ＲＴＭ－１遺伝子がこれらのレースに対して抵抗性を有さないと仮定すると、これらのレースについては、抵抗性個体：罹病性個体の個体数が期待値として１：１に出現するはずである。しかし、実際には、すべてのＦ１個体がこれらのレースに対して抵抗性であった。このことから、ＲＴＭ－１遺伝子は、Ｐｆｓ２、Ｐｆｓ４、Ｐｆｓ５、Ｐｆｓ８、Ｐｆｓ１１、Ｐｆｓ１２、Ｐｆｓ１４、Ｐｆｓ１５、及びＰｆｓ１６に対しても、優性の抵抗性を付与できることが明らかである。
［実施例３］
　Ｖｉｒｏｆｌａｙ系統を種子親、実施例１で作出したＴＮＫＨ－１系統を花粉親として交雑を行い、得られたＦ１個体に対して、Ｐｆｓ２、Ｐｆｓ４、Ｐｆｓ１０、Ｐｆｓ１５、Ｐｆｓ１７、Ｐｆｓ１８、及びＵＡ１０１４菌株が示すレースを用いた接種試験を行い、これらに対する抵抗性を調べた。結果を表５に示す。表中、「Ｖｉｒｏｆｌａｙ × ＴＮＫＨ－１ Ｆ１」の欄の「抵抗性個体」と「罹病性個体」の個体数欄の「Ｐ（Ｑ）」（ＰとＱはいずれも整数）は、Ｐが、抵抗性個体又は罹病性個体のうちのＦ１個体の個体数であり、Ｑが、抵抗性個体又は罹病性個体のうちのＶｉｒｏｆｌａｙの自殖で得られた個体（セルフ）の個体数である。また、「ｎｔ」は実験を行っておらず、データがないことを意味する。さらに、「ＲＰＦ３」及び「Ｖｉｒｏｆｌａｙ」の系統のうちの各レースの欄において、「－」は抵抗性であることを意味し、「＋」は罹病性であることを意味する。なお、表５中に記載されたＲＴＭ-１遺伝子型のうち、「ＲＴＭ－１」はスピナシア・テトランドラ由来の抵抗性の遺伝子型、「ｒｔｍ－１」はＶｉｒｏｆｌａｙ由来の罹病性の遺伝子型をそれぞれ意味する。したがって、「ＲＴＭ－１/ＲＴＭ－１」は抵抗性のホモ接合型、「ｒｔｍ－１/ｒｔｍ－１」は罹病性のホモ接合型、「ＲＴＭ－１/ｒｔｍ－１」は抵抗性と罹病性のヘテロ接合型をそれぞれ意味する。同様にＲＰＦ遺伝子型のうち、「ｒｐｆＶ」はＶｉｒｏｆｌａｙ由来の罹病性の遺伝子型を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５に示すように、Ｖｉｒｏｆｌａｙ系統とＴＮＫＨ－１系統を交雑して得られたＦ１個体は、Ｐｆｓ２、Ｐｆｓ４、Ｐｆｓ１０、Ｐｆｓ１５、Ｐｆｓ１７、Ｐｆｓ１８、及びＵＡ１０１４菌株が示すレースに対して抵抗性を示し、罹病性個体はなかった。ＲＰＦ遺伝子型を調べた結果、罹病性個体は全て、Ｖｉｒｏｆｌａｙの自殖で得られた個体であったことが確認された。ＲＰＦ３遺伝子のべと病抵抗性から、ＲＴＭ－１遺伝子は、少なくともＰｆｓ２、Ｐｆｓ４、Ｐｆｓ１０、Ｐｆｓ１５、Ｐｆｓ１７、Ｐｆｓ１８、及びＵＡ１０１４菌株が示すレースに対して優性の抵抗性を付与できることがわかった。
［実施例４］
　Ｖｉｒｏｆｌａｙ系統を種子親、実施例１で作出したＴＮＫＨ－２系統を花粉親として交雑を行い、得られたＦ１個体に対して、Ｐｆｓ５、Ｐｆｓ８、Ｐｆｓ９、Ｐｆｓ１０、Ｐｆｓ１１、Ｐｆｓ１２、Ｐｆｓ１４、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ１７、Ｐｆｓ１８、Ｐｆｓ１９、及びＵＡ１０１４菌株が示すレースを用いた接種試験を行い、これらに対する抵抗性を調べた。結果を表６に示す。表中、「Ｖｉｒｏｆｌａｙ × ＴＮＫＨ－２ Ｆ１」の欄の「抵抗性個体」と「罹病性個体」の個体数欄の「Ｐ（Ｑ）」（ＰとＱはいずれも整数）は、Ｐが、抵抗性個体又は罹病性個体のうちのＦ１個体の個体数であり、Ｑが、抵抗性個体又は罹病性個体のうちのＶｉｒｏｆｌａｙの自殖で得られた個体（セルフ）の個体数である。また、「ｎｔ」は実験を行っておらず、データがないことを意味する。さらに、「ＲＰＦ４」及び「Ｖｉｒｏｆｌａｙ」の系統のうちの各レースの欄において、「－」は抵抗性であることを意味し、「＋」は罹病性であることを意味する。なお、表６中に記載されたＲＴＭ-１遺伝子型のうち、「ＲＴＭ－１」はスピナシア・テトランドラ由来の抵抗性の遺伝子型、「ｒｔｍ－１」はＶｉｒｏｆｌａｙ由来の罹病性の遺伝子型をそれぞれ意味する。したがって、「ＲＴＭ－１/ＲＴＭ－１」は抵抗性のホモ接合型、「ｒｔｍ－１/ｒｔｍ－１」は罹病性のホモ接合型、「ＲＴＭ－１/ｒｔｍ－１」は抵抗性と罹病性のヘテロ接合型をそれぞれ意味する。同様にＲＰＦ遺伝子型のうち、「ｒｐｆＶ」はＶｉｒｏｆｌａｙ由来の罹病性の遺伝子型を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６に示すように、Ｖｉｒｏｆｌａｙ系統とＴＮＫＨ－２系統を交雑して得られたＦ１個体は、Ｐｆｓ５、Ｐｆｓ８、Ｐｆｓ９、Ｐｆｓ１０、Ｐｆｓ１１、Ｐｆｓ１２、Ｐｆｓ１４、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ１７、Ｐｆｓ１８、Ｐｆｓ１９、及びＵＡ１０１４菌株が示すレースに対して抵抗性を示し、罹病性個体はなかった。ＲＰＦ遺伝子型を調べた結果、罹病性個体は全て、Ｖｉｒｏｆｌａｙの自殖で得られた個体であったことが確認された。ＲＰＦ４遺伝子のべと病抵抗性から、ＲＴＭ－１遺伝子は、少なくともＰｆｓ５、Ｐｆｓ８、Ｐｆｓ９、Ｐｆｓ１０、Ｐｆｓ１１、Ｐｆｓ１２、Ｐｆｓ１４、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ１７、Ｐｆｓ１８、Ｐｆｓ１９、及びＵＡ１０１４菌株が示すレースに対して優性の抵抗性を付与できることがわかった。
［実施例５］
　Ｖｉｒｏｆｌａｙ系統を種子親、実施例１で作出したＴＮＫＨ－１系統を花粉親として交雑して得られたＦ１種子を自殖し、Ｆ２分離集団を作製した。このＦ２集団に対して、Ｐｆｓ１、Ｐｆｓ３、Ｐｆｓ４、Ｐｆｓ８、Ｐｆｓ１０、Ｐｆｓ１１、Ｐｆｓ１２、Ｐｆｓ１４、Ｐｆｓ１５、及びＵＡ１０１４菌株が示すレースを用いた接種試験を行い、これらに対する抵抗性を調べた。結果を表７に示す。表中、「ｎｔ」は実験を行っておらず、データがないことを意味する。さらに、「ＲＰＦ３」及び「Ｖｉｒｏｆｌａｙ」の系統のうちの各レースの欄において、「－」は抵抗性であることを意味し、「＋」は罹病性であることを意味する。なお、表７中に記載されたＲＴＭ-１遺伝子型のうち、「ＲＴＭ－１」はスピナシア・テトランドラ由来の抵抗性の遺伝子型、「ｒｔｍ－１」はＶｉｒｏｆｌａｙ由来の罹病性の遺伝子型をそれぞれ意味する。したがって、「ＲＴＭ－１/ＲＴＭ－１」は抵抗性のホモ接合型、「ｒｔｍ－１/ｒｔｍ－１」は罹病性のホモ接合型、「ＲＴＭ－１/ｒｔｍ－１」は抵抗性と罹病性のヘテロ接合型をそれぞれ意味する。同様にＲＰＦ遺伝子型のうち、「ｒｐｆＶ」はＶｉｒｏｆｌａｙ由来の罹病性の遺伝子型を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７に示すように、ＴＮＫＨ－１系統の有するべと病抵抗性は、ＲＰＦ３遺伝子が罹病性となるＰｆｓ４、Ｐｆｓ１０、Ｐｆｓ１５、及びＵＡ１０１４菌株が示すレースに対して、抵抗性個体：罹病性個体が３：１に近似して分離した。このため、ＲＴＭ－１遺伝子は、単一優性と想定された。この想定は、χ2乗検定（ｐ＞０．０５）の結果によっても支持された。
　ＴＮＫＨ－１系統の有するべと病抵抗性は、ＲＰＦ３遺伝子が抵抗性を示すＰｆｓ１、Ｐｆｓ３、Ｐｆｓ８、Ｐｆｓ１１、Ｐｆｓ１２、及びＰｆｓ１４に対しては、抵抗性個体：罹病性個体が１５：１に近似して分離した。このため、ＲＴＭ－１遺伝子とＲＰＦ３遺伝子は、二因子優性と想定された。この想定は、χ2乗検定（ｐ＞０．０５）によっても支持された。
　これらの結果から、ＲＴＭ－１遺伝子は、ＲＰＦ遺伝子の対立遺伝子ではなく、異なる染色体に座上すること、Ｐｆｓ１、Ｐｆｓ３、Ｐｆｓ４、Ｐｆｓ８、Ｐｆｓ１０、Ｐｆｓ１１、Ｐｆｓ１２、Ｐｆｓ１４、Ｐｆｓ１５、及びＵＡ１０１４菌株が示すレースに対して、単一優性の抵抗性を付与できることが明らかとなった。
［実施例６］
　ＲＴＭ－１遺伝子の染色体の座上領域を特定するための遺伝解析及び遺伝子マーカー作製を行った。
　まず、Ｖｉｒｏｆｌａｙ系統と実施例１で作出したＴＮＫＨ－１系統を交雑して得たＦ１を自殖し、Ｆ２分離集団を作製した。
　得られたＦ２分離集団３３０個体について、ＵＡ１０１４菌株が示すレースを用いた接種試験を行い、これに対する抵抗性を調べた。この結果、抵抗性個体が２３４個体、罹病性個体が９６個体であった。
　これらの個体の遺伝解析を行い、抵抗性個体では抵抗性ホモ型又はヘテロ型となり、罹病性個体では罹病性ホモ型となるような領域を、ゲノム中から探索した。
　形質調査を行った個体を連鎖解析用集団とし、各個体からゲノムＤＮＡを抽出した。連鎖解析用集団のＤＮＡと、ＳｐｉｎａｃｈＢａｓｅのリファレンスゲノム上に設計したＳＮＰマーカーを用いて、ジェノタイピングを行った。ジェノタイピングは、ＫＡＳＰジェノタイピングアッセイを用いて行った。
　表８及び９に、各ＳＮＰの識別のためのＫＡＳＰジェノタイピングアッセイに用いるプライマーの塩基配列を示す。表８、９中、「Ａ　ａｌｌｅｌｅ」はＴＮＫＨ－１型（スピナシア・テトランドラ型）のアレル、「Ｂ ａｌｌｅｌｅ」はＶｉｒｏｆｌａｙ型のアレルを、それぞれ示している。各ＳＮＰは、ａｌｌｅｌｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ＿１とａｌｌｅｌｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ＿２とｃｏｍｍｏｎ　ｐｒｉｍｅｒの３つのプライマーセットで遺伝子型を識別する。ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ＿１とａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ＿２の配列において、３’末端の１塩基が、識別対象のＳＮＰとハイブリダイズするように設計されている。
　ＴＮＫＨ－１型アレルを有する植物個体のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合、ａｌｌｅｌｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ＿１とｃｏｍｍｏｎ　ｐｒｉｍｅｒをそれぞれフォワードプライマーとリバースプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅産物が得られる。Ｖｉｒｏｆｌａｙ型アレルを有する植物個体のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合、ａｌｌｅｌｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ＿２とｃｏｍｍｏｎ　ｐｒｉｍｅｒをそれぞれフォワードプライマーとリバースプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅産物が得られる。この増幅産物の有無により、ＳＮＰの遺伝子型を識別する。このように、これら３種類のオリゴＤＮＡを１組のプライマーセットとして用いてＫＡＳＰアッセイを行うことにより、各ＳＮＰの遺伝子型を識別することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　例えば、ＴＮＫＨ－１系統は、ｃｈｒ４＿８５１０７１５で特定されるＳＮＰの遺伝子型がＧ（グアニン）であるアレルをホモで有しており、Ｖｉｒｏｆｌａｙ系統は、ｃｈｒ４＿８５１０７１５で特定されるＳＮＰの遺伝子型がＣ（シトシン）であるアレルをホモで有する。また、ＴＮＫＨ－１系統とＶｉｒｏｆｌａｙ系統のＦ１では、ｃｈｒ４＿８５１０７１５で特定されるＳＮＰの遺伝子型はＧ／Ｃであり、当該ＳＮＰがＧであるＴＮＫＨ－１型アレルとＣであるＶｉｒｏｆｌａｙ型アレルをヘテロで有する。
　なお、連鎖解析に使用したＫＡＳＰマーカーは、ＲＴＭ－１遺伝子の座上位置を特定する目的で使用されたものであり、べと病抵抗性を有するホウレンソウを選抜する際のＤＮＡマーカーとして、必ずしもこれらＫＡＳＰマーカーを用いる必要はない。例えば、ｃｈｒ４＿７９６２９０７からｃｈｒ４＿８６１７２３２で特定されるホウレンソウゲノムの範囲内に座上している、表８及び表９に記載のＳＮＰ以外のＤＮＡ多型や、ｃｈｒ４＿７９６２９０７からｃｈｒ４＿８６１７２３２に座上する遺伝子座に由来するべと病抵抗性形質に対して高い関連性を示すＤＮＡ多型等を、べと病抵抗性を有するホウレンソウを選抜する際のＤＮＡマーカーとして用いることができる。
　被験植物個体から抽出したゲノムＤＮＡと表８及び９に記載のＫＡＳＰマーカーを用いることにより、連鎖解析集団において、簡便に各ＳＮＰの遺伝子型を調査できた。ＫＡＳＰマーカーによるジェノタイピングデータの取得後、続けて、超高密度遺伝子連鎖地図作成ソフトウェアＡｎｔＭＡＰ Ｖｅｒ．１．１(http://lbm.ab.a.u-tokyo.ac.jp/~iwata/antmap/)(非特許文献５)を用いた連鎖解析を行った。なお、当該ソフトウェアの使用において、GroupingのCriterionをDistance(cM) / Haldane / Threshold 5に変更し、それ以外はデフォルト設定とした。
　表１０は、表８及び９で示したＫＡＳＰマーカーを用いたジェノタイピングの結果をもとに、ＲＴＭ－１遺伝子の周辺領域で組換えを起こした７個体(サンプル番号１１２／１４３／３２２／２９４／５３／２３２／６）の遺伝子型を抜粋し、表現型と併記したものである。表中において、「Ａ」はＴＮＫＨ－１型アレル、「Ｂ」はＶｉｒｏｆｌａｙ型アレルであることを示す。例えば、「Ａ／Ａ」と記載されている場合、ＴＮＫＨ－１型アレルをホモで有していることを、「Ｂ/Ｂ」と記載されている場合、Ｖｉｒｏｆｌａｙ型アレルをホモで有していることを、「Ａ/Ｂ」と記載されている場合、ＴＮＫＨ－１型アレルとＶｉｒｏｆｌａｙ型アレルをヘテロで有していることを、それぞれ示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表１０に示すように、ｃｈｒ４＿８４８８６０３、ｃｈｒ４＿８４９４６００、ｃｈｒ４＿８５１０７１５のＳＮＰにおいて、遺伝子型がＢ/Ｂであるサンプル２３２とサンプル６の２個体は、表現型がＳ（罹病性）であり、遺伝子型がＡ/Ｂであるサンプル１１２、サンプル１４３、サンプル３２２、サンプル２９４、及びサンプル５３は、表現型がＲ（抵抗性）であることから、これらのＳＮＰは表現型と高い相関があることがわかった。また、連鎖解析の結果、ＳｐｉｎａｃｈＢａｓｅのリファレンスゲノム上において、ｃｈｒ４＿７９６２９０７からｃｈｒ４＿８６１７２３２の範囲内に、べと病抵抗性を引き起こすＲＴＭ－１遺伝子が座上することが明らかとなった。また、ｃｈｒ４＿８４８８６０３、ｃｈｒ４＿８４９４６００、及びｃｈｒ４＿８５１０７１５のＳＮＰは、０ｃＭの遺伝距離でＲＴＭ－１遺伝子と連鎖していた（図１）。
　スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１、ＴＮＫＨ－１系統、及びＴＮＫＨ－２系統について、ＲＴＭ－１遺伝子が座上するｃｈｒ４＿７９６２９０７からｃｈｒ４＿８６１７２３２の範囲内で全塩基配列のシークエンス解析データからＳＮＰの探索を行った。この結果、表８及び表９に記載のＳＮＰ以外に複数のＳＮＰが確認された。その中で例えばｃｈｒ４＿８５００２００、ｃｈｒ４＿８５０２３１９、ｃｈｒ４＿８５０２３３４、及びｃｈｒ４＿８５０２３９４の４種のＳＮＰが、リファレンスゲノムとは異なっていた。具体的には、スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１、ＴＮＫＨ－１系統、及びＴＮＫＨ－２系統では、ｃｈｒ４＿８５００２００で特定されるＳＮＰはチミンであり、ｃｈｒ４＿８５０２３１９で特定されるＳＮＰはシトシンであり、ｃｈｒ４＿８５０２３３４で特定されるＳＮＰはグアニンであり、及びｃｈｒ４＿８５０２３９４で特定されるＳＮＰはグアニンであった（表１）。これら４種のＳＮＰも、表８及び表９に記載のＳＮＰと同様に、ＴＮＫＨ－１型アレルを有するべと病抵抗性の植物個体を識別するためのマーカーとして使用できる。
　ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２４０４
　ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２４０５

Claims (24)

  1. 　スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１の第４染色体に存在するべと病抵抗性ＲＴＭ－１遺伝子を有しているホウレンソウ植物である（但し、スピナシア・テトランドラを除く）、べと病抵抗性ホウレンソウ植物。
  2. 　前記ＲＴＭ－１遺伝子が、スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１の第４染色体上のｃｈｒ４＿７９６２９０７からｃｈｒ４＿８６１７２３２までの範囲内に存在している遺伝子である、請求項１に記載のべと病抵抗性ホウレンソウ植物。
  3. 　第４染色体の少なくとも一方のアレルに、スピナシア・テトランドラ系統ＣＧＮ２５４６６：ＭＧＫ　０１の第４染色体上のｃｈｒ４＿８４８８６０３からｃｈｒ４＿８５１０７１５までの範囲を含む断片を含有している、請求項１又は２に記載のべと病抵抗性ホウレンソウ植物。
  4. 　前記ＲＴＭ－１遺伝子が、ホモ接合性又はヘテロ接合性である、請求項１に記載のべと病抵抗性ホウレンソウ植物。
  5. 　少なくとも、べと病のレースＰｆｓ１、Ｐｆｓ２、Ｐｆｓ３、Ｐｆｓ４、Ｐｆｓ５、Ｐｆｓ６、Ｐｆｓ７、Ｐｆｓ８、Ｐｆｓ９、Ｐｆｓ１０、Ｐｆｓ１１、Ｐｆｓ１２、Ｐｆｓ１３、Ｐｆｓ１４、Ｐｆｓ１５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ１７、Ｐｆｓ１８、Ｐｆｓ１９、及びＵＡ１０１４菌株が示すレースに抵抗性である、請求項１に記載のべと病抵抗性ホウレンソウ植物。
  6. 　第４染色体の少なくとも一方のアレルにおいて、
    ｃｈｒ４＿８４８８６０３で特定されるＳＮＰがシトシンである、
    ｃｈｒ４＿８４９４６００で特定されるＳＮＰがチミンである、又は
    ｃｈｒ４＿８５１０７１５で特定されるＳＮＰがグアニンである、
    請求項１に記載のべと病抵抗性ホウレンソウ植物。
  7. 　第４染色体の少なくとも一方のアレルにおいて、
    ｃｈｒ４＿７９６２９０７で特定されるＳＮＰがグアニンである、
    ｃｈｒ４＿８１５２９８６で特定されるＳＮＰがシトシンである、
    ｃｈｒ４＿８１９０９９０で特定されるＳＮＰがグアニンである、
    ｃｈｒ４＿８４８８６０３で特定されるＳＮＰがシトシンである、
    ｃｈｒ４＿８４９４６００で特定されるＳＮＰがチミンである、
    ｃｈｒ４＿８５１０７１５で特定されるＳＮＰがグアニンである、又は
    ｃｈｒ４＿８６１７２３２で特定されるＳＮＰがグアニンである、
    請求項１に記載のべと病抵抗性ホウレンソウ植物。
  8. 　前記べと病抵抗性ホウレンソウ植物が、スピナシア・テトランドラと栽培種ホウレンソウの種間雑種植物に由来するものである、請求項１に記載のべと病抵抗性ホウレンソウ植物。
  9. 　受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２４０４（ＴＮＫＨ－１系統）で特定される植物由来のべと病抵抗性を有する、請求項１に記載のべと病抵抗性ホウレンソウ植物。
  10. 　受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２４０５（ＴＮＫＨ－２系統）で特定される植物由来のべと病抵抗性を有する、請求項１に記載のべと病抵抗性ホウレンソウ植物。
  11. 　前記ＲＴＭ－１遺伝子以外のべと病抵抗性遺伝子を少なくとも１種以上有する、請求項１に記載のべと病抵抗性ホウレンソウ植物。
  12. 　受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２４０４（ＴＮＫＨ－１系統）で特定されるべと病抵抗性ホウレンソウ植物、前記べと病抵抗性ホウレンソウ植物を親系統として得られた雑種植物、又はそれらの後代である、べと病抵抗性ホウレンソウ植物。
  13. 　受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２４０５（ＴＮＫＨ－２系統）で特定されるべと病抵抗性ホウレンソウ植物、前記べと病抵抗性ホウレンソウ植物を親系統として得られた雑種植物、又はそれらの後代である、べと病抵抗性ホウレンソウ植物。
  14. 　被験ホウレンソウ植物の第４染色体のｃｈｒ４＿８４８８６０３～ｃｈｒ４＿８５１０７１５のＳＮＰの遺伝子型を調べ、少なくとも一方のアレルにおいて、
    ｃｈｒ４＿８４８８６０３で特定されるＳＮＰがシトシンである、
    ｃｈｒ４＿８４９４６００で特定されるＳＮＰがチミンである、又は
    ｃｈｒ４＿８５１０７１５で特定されるＳＮＰがグアニンである場合に、
    当該被験ホウレンソウ植物がべと病抵抗性である可能性が高いと予測する、ホウレンソウ植物のべと病抵抗性の予測方法。
  15. 　被験ホウレンソウ植物の第４染色体のｃｈｒ４＿８４８８６０３～ｃｈｒ４＿８５１０７１５のＳＮＰの遺伝子型を調べ、少なくとも一方のアレルにおいて、
    ｃｈｒ４＿８４８８６０３で特定されるＳＮＰがシトシンである、
    ｃｈｒ４＿８４９４６００で特定されるＳＮＰがチミンである、又は
    ｃｈｒ４＿８５１０７１５で特定されるＳＮＰがグアニンである場合に、
    当該被験ホウレンソウ植物を、べと病抵抗性ホウレンソウ植物として選抜する、べと病抵抗性ホウレンソウ植物のスクリーニング方法。
  16. 　ＲＴＭ－１遺伝子を有するホウレンソウ植物と任意のホウレンソウ植物とを交雑する第１交雑工程と、
    　前記第１交雑工程により得られたＦ１個体に対して、自殖、戻し交雑、又は前記第１交雑工程において用いた親系統とは異なるホウレンソウ植物との種間交雑又は種内交雑を行い、分離集団を得る第２交雑工程と、
    　前記分離集団から、ＲＴＭ－１遺伝子を有するホウレンソウ植物を選抜する選抜工程と、
    を有する、べと病抵抗性ホウレンソウ植物の製造方法。
  17. 　前記ＲＴＭ－１遺伝子を有するホウレンソウ植物が、スピナシア・テトランドラ又は請求項１～１３のいずれか一項に記載のべと病抵抗性ホウレンソウ植物である、請求項１６に記載のべと病抵抗性ホウレンソウ植物の製造方法。
  18. 　前記任意のホウレンソウ植物、又は前記第２交雑工程における種間交雑又は種内交雑で用いる親系統が、前記ＲＴＭ－１遺伝子以外のべと病抵抗性遺伝子を少なくとも１種以上有するホウレンソウ植物である、請求項１６に記載のべと病抵抗性ホウレンソウ植物の製造方法。
  19. 　請求項１～１３のいずれか一項に記載のべと病抵抗性ホウレンソウ植物の植物体の一部。
  20. 　請求項１～１３のいずれか一項に記載のべと病抵抗性ホウレンソウ植物の葉。
  21. 　請求項１～１３のいずれか一項に記載のべと病抵抗性ホウレンソウ植物の種子。
  22. 　ホウレンソウ植物のｃｈｒ４＿８４８８６０３で特定されるＳＮＰ、ｃｈｒ４＿８４９４６００で特定されるＳＮＰ、ｃｈｒ４＿８５１０７１５で特定されるＳＮＰ、及びこれらのＳＮＰと遺伝的に強く連鎖しているＳＮＰからなる群より選択される１種以上からなる、ＲＴＭ－１遺伝子を有するホウレンソウ植物を選抜するためのＤＮＡマーカー。
  23. 　ｃｈｒ４＿８４８８６０３で特定されるＳＮＰの遺伝子型を識別するためのプライマーセット、
    　ｃｈｒ４＿８４９４６００で特定されるＳＮＰの遺伝子型を識別するためのプライマーセット、及び
    　ｃｈｒ４＿８５１０７１５で特定されるＳＮＰの遺伝子型を識別するためのプライマーセットからなる群より選択される１種以上のプライマーセットを含み、
    　ＲＴＭ－１遺伝子を有するホウレンソウ植物を選抜するために用いられる、キット。
  24. 　前記ｃｈｒ４＿８４８８６０３で特定されるＳＮＰの遺伝子型を識別するためのプライマーセットが、配列番号１３で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号１４で表される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号１５で表される塩基配列からなるプライマーからなり、
    　前記ｃｈｒ４＿８４９４６００で特定されるＳＮＰの遺伝子型を識別するためのプライマーセットが、配列番号１６で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号１７で表される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号１８で表される塩基配列からなるプライマーからなり、
    　前記ｃｈｒ４＿８５１０７１５で特定されるＳＮＰの遺伝子型を識別するためのプライマーセットが、配列番号１９で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号２０で表される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号２１で表される塩基配列からなるプライマーからなる、請求項２３に記載のキット。
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