KR20240005897A - 신규 노균병 저항성 유전자를 갖는 시금치 식물 - Google Patents

신규 노균병 저항성 유전자를 갖는 시금치 식물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01의 제4 염색체에 좌상하는 노균병 저항성 RTM-1 유전자를 가지고 있는 노균병 저항성 시금치 식물, 상기 RTM-1 유전자가 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01의 제4 염색체 상의 chr4_7962907부터 chr4_8617232까지의 범위 내에 존재하고 있는 유전자인 상기 기재된 노균병 저항성 시금치 식물, 적어도 노균병의 레이스 Pfs1, Pfs2, Pfs3, Pfs4, Pfs5, Pfs6, Pfs7, Pfs8, Pfs9, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs13, Pfs14, Pfs15, Pfs16, Pfs17, Pfs18, Pfs19, 및 UA1014 균주가 나타내는 레이스에 저항성인 상기 어느 하나의 노균병 저항성 시금치 식물이다.

Description

신규 노균병 저항성 유전자를 갖는 시금치 식물
본 발명은 노균병의 광범위한 레이스에 저항성을 나타내는 유전자를 갖는 시금치 식물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
본원은 2021년 5월 12일에 일본 출원된 특원 2021-080911호에 기초하여 우선권을 주장하고 그 내용을 여기에 원용한다.
시금치(Spinacia oleracea L.)는 비름과 시금치속의 일년초 또는 다년초로서, 아시아 서부 원산에서 널리 재배되며, 일본에는 에도시대에 중국으로부터 전해졌다고 생각되고 있다. 시금치는 주로 근생엽(로제트 형상)을 식용으로 하고 비타민류나 철, 칼슘분의 함유량은 야채 중에서도 특히 높아 영양 가치는 극히 높다. 최근에는 영양소와 간편성의 면에서 베이비 리프의 시장이 세계적으로 급확대되고 있다. 이와 같이 시금치는 중요 야채의 하나로서 자리매김하고 있다.
식물 품종에는 일반적으로 고정종과 잡종 제1대(이하, 「F1」이라고 함) 품종이 있고, 주요 작물에서는 F1 품종이 보급되어 있다. F1 품종은 잡종 강세(헤테로시스)에 의해 생육이 왕성하다. 이에 의해 F1 품종은 생육이 빨라 수량성이 높아지는 등 큰 이점이 있고, 나아가 병해충에의 내성이나 내한·내서성 등의 환경 적응성의 향상도 기대할 수 있다. 또한, F1 품종은 헤테로성이면서 동일한 유전자형이기 때문에 표현형은 극히 높은 균일성을 나타낸다. 이 때문에 생산물의 시장성이 높아진다. 나아가 F1 품종의 양친에 우성 유전자에 지배되고 있는 유용 형질을 집적할 수 있기 때문에 신속한 육종이 가능해진다. 이상과 같은 우위성이 있기 때문에 F1 품종은 주요 작물에서 재배 품종의 주류를 차지하게 되었다. 식용으로 되어 있는 시금치에서도 1960년대까지는 고정종이 중심이었지만 1970년대 이후는 급속히 F1화가 진행되어 현재로는 그 대부분이 F1 품종이다.
한편, 시금치에 피해를 주는 병해 중 하나로 사상균인 Peronospora farinosa f. sp. spinaciae(페로노스포라·파리노사·분화형·스피나시아에: Pfs)에 의해 야기되는 노균병이 있다. 노균병은 발생하면 급속히 피해가 확대되어 수량, 품질에 매우 심각한 피해를 주는 가장 중요한 병해이다. 노균병 대책으로서는 경종적 또는 농약 등을 이용한 화학적인 병원균의 방제도 시도되고 있지만, 환경에의 영향, 재배 노력이나 비용 등으로부터 저항성 품종의 이용이 가장 효과적인 방법이다.
노균병은 레이스 분화가 빠른 것으로 알려져 저항성 품종을 침범하는 새로운 레이스가 연달아 출현하여 지금까지 저항성을 가진다고 생각되었던 품종이 발병하는 사례가 수많이 인정되고 있다. The International Working Group on Peronospora in spinach(IWGP)는 미국의 아칸소 대학과 캘리포니아 대학의 서포트를 받은 종묘 회사와 네덜란드의 The Netherlands Inspection Service for Horticulture(Naktuinbouw)에 의한 컨소시엄이며, 새로운 노균병의 레이스의 출현과 확대를 감시하여 공식적인 명명을 결정하고 있다. 1824년에 최초 노균병의 발생이 보고된 이후 오늘까지 19레이스가 명명되었다(비특허문헌 1).
신레이스의 연속적인 출현에 대응하기 위해 시금치의 육종에서는 신규 저항성 소재의 탐색은 매우 중요하다. 재배종뿐만 아니라 야생종에서도 노균병에의 저항성 유전 소재의 탐색이 이루어지고 있다. 예를 들면 Center for Genetic Resources, the Netherlands(CGN)에 의해, 2008년에 야생종 시금치인 스피나시아·투루케스타니카(Spinacia turkestanica)에 대해, 2011년에 야생종 시금치인 스피나시아·테트란드라(Spinacia tetrandra)에 대해 노균병에의 저항성 유전 소재의 탐색이 이루어졌다. 또한, 2011년에는 Correll 등이 6종류의 RPF라고 불리는 유전자가 이미 알려진 노균병 저항성을 제어하고 있는 것을 발표하였다(비특허문헌 2). 나아가 노균병 저항성 유전자로서 RPF1~RPF10, RPF11(특허문헌 1), RPF12(특허문헌 2), RPF13(특허문헌 3), RPF14(특허문헌 4), RPF15(특허문헌 5), R6(특허문헌 6), R15(특허문헌 7) 등이 보고되어 있다. 야생종 시금치 유래의 노균병 저항성 유전자를 재배종 시금치인 스피나시아·올레라시아 L(Spinacia oleracea L.)에 도입함으로써 노균병 저항성이 높은 시금치를 작출할 수 있다(특허문헌 8).
RPF 유전자는 RPF 유전자좌라고 불리는 하나의 유전자좌에 있는 복수의 대립유전자, 또는 조밀하게 연쇄된 복수의 유전자이며, F1 품종에서는 2개의 대립유전자를 갖게 함으로써 폭넓은 저항성을 나타내었다(비특허문헌 3, 특허문헌 5). 예를 들면 RPF1 유전자, RPF2 유전자 및 RPF3 유전자는 제3 염색체에 좌상(座上)하고(비특허문헌 3), RPF15 유전자도 제3 염색체 상에 좌상한다(특허문헌 5). 또한, 특허문헌 8에 기재되어 있는 노균병 저항성 유전자는 연쇄군 6에 좌상한다고 되어 있지만, 시퀀스 정보에 의하면 실제는 제3 염색체에 좌상한다(특허문헌 5).
노균병 저항성 유전자좌에는 그 구조에 따라 alpha WOLF 유전자 및 beta WOLF 유전자로 크게 나누어지는 1개 또는 2개의 WOLF 유전자가 인접하여 존재한다(특허문헌 9). alpha 및 beta WOLF 유전자는 각각 특정의 저항성 프로파일을 부여하는 복수의 대립유전자를 포함하고, 각각의 WOLF 유전자의 LRR 도메인 서열 및 각각의 유전자형 노균병 레이스에 대한 저항성 패턴이 개시되어 있다. 이론상은 상이한 저항성 패턴을 갖는 WOLF 유전자의 조합에 의해 원하는 저항성 패턴을 설계하는 것이 가능하다. 그러나, 종래의 교잡 육종에서는 매우 긴밀히 연쇄된 유전자를 임의로 조합시키는 것은 사실상 불가능하다. 이 때문에 지금까지도 RPF 유전자는 모아서 하나의 유전자로서 취급되어 왔다.
그 밖에도 형질 전환에 의한 외부로부터의 노균병 저항성 유전자의 도입(GMO)이나 내인성 유전자를 개변(Gene Editing)함으로써 원하는 저항성 패턴을 부여하는 변이체를 제작할 수 있다. 그러나, GMO나 유전자 개변에 의해 작출한 작물은 아직 대중에게 널리 받아들여지지 않는다는 문제가 있다.
노균병 저항성 유전자 p10은 제1 염색체에 좌상하여 Pfs1, Pfs2, Pfs3, Pfs4, Pfs5, Pfs6, Pfs7, Pfs8, Pfs9, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs13, Pfs14, Pfs15, 및 Pfs16에 저항성을 나타낸다고 보고되어 있다. 그러나, p10 유전자에 의해 부여되는 저항성은 호모 접합시에만 발현하고, 또한 그 저항성 정도는 중간이다(특허문헌 10). 이 때문에 p10 유전자를 이용한 저항성 품종 육성은 우성의 저항성 유전자를 이용한 육성보다 곤란할 뿐만 아니라 내성의 정도도 실용상 충분한 것이라고는 할 수 없는 것이 추측된다. 또한, 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25474:MGK 18:RNR120251(이하, CGN25474:MGK 18)은 제4 염색체 중에 노균병 저항성 유전자를 가지고 있고, Pfs4, Pfs7, Pfs9, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs13, Pfs14, Pfs15, Pfs16, 및 Pfs17에 저항성을 나타내는 것이 보고되었다(특허문헌 11).
특허문헌 1: 미국특허 제10258001호 명세서 특허문헌 2: 미국특허 제10258002호 명세서 특허문헌 3: 국제공개 제2015/036378호 특허문헌 4: 국제공개 제2019/145446호 특허문헌 5: 국제공개 제2019/145447호 특허문헌 6: 일본특허 제6457269호 공보 특허문헌 7: 미국특허 제9974276호 명세서 특허문헌 8: 일본특허 제6684207호 공보 특허문헌 9: 국제공개 제2018/059651호 특허문헌 10: 미국특허출원공개 제2019/0104700호 명세서 특허문헌 11: 국제공개 제2020/239215호
비특허문헌 1: Ribera et al., Euphytica, 2020, 216:48. 비특허문헌 2: Correll et al., European Journal of Plant Pathology, 2011, vol.129, p.193-205. 비특허문헌 3: Feng et.al, Euphytica, 2018, 214:174. 비특허문헌 4: International Seed Federation, "Differential Sets Peronospora farinosa f. sp. spinaciae (P. effusa)", 2021, <on line> https://worldseed.org/wp-content/uploads/2021/11/20210608_DRTWG_Peronospora-effusa.pdf 비특허문헌 5: Iwata and Ninomiya, Breeding Science, 2006, vol.56(4), p.371-377.
기존의 노균병 저항성 계통은 주로 제3 염색체 상의 RPF 유전자가 이용되고 있다. 한편, 통상 시금치의 육종에서 F1 품종의 친계통은 유전적으로 고도로 고정할 필요가 있다. 이 결과, 하나의 친계통은 동일 또는 매우 근접한 부위에 하나의 저항성 유전자밖에 가질 수 없다. 즉, 다른 친계통끼리를 교배한 F1 품종은 제3 염색체 상의 동일 또는 매우 근접한 부위에 2종의 RPF 유전자밖에 가질 수 없다. 명명되어 있는 모든 레이스에 저항성을 나타내는 RPF 유전자는 알려지지 않았기 때문에 광범위한 레이스에 대해 저항성을 나타내는 F1 품종을 작출하기 위해서는 서로의 저항성을 상보하는 조합의 RPF 유전자를 갖는 품종끼리를 교배해야 한다. 이것이 친계통의 선정에 큰 제한 요소가 되었다.
예를 들어 제3 염색체 이외의 염색체 상에 존재하는 저항성 유전자를 이용할 수 있으면, 노균병 저항성 유전자를 집적함에 있어서 큰 효과를 기대할 수 있다. 덧붙여 이 제3 염색체 이외에 존재하는 저항성 유전자에 다형이 있으면 더욱 노균병 저항성 유전자의 다양화가 촉진되어 노균병의 신레이스의 발생을 억제할 수 있다.
그래서 본 발명은 상기한 바와 같은 기존의 노균병 저항성 계통 및 F1 품종의 문제점을 감안하여 제3 염색체에 존재하지 않고 이미 알려진 저항성 유전자보다도 보다 광범위한 레이스에 저항성을 나타내며 나아가 이미 보고된 제4 염색체 상의 저항성 유전자와 다른 새로운 노균병 저항성 유전자를 제공한다. 즉, 본 발명은 광범위한 레이스에 저항성을 나타내는 신규 노균병 저항성 유전자를 갖는 시금치 식물, 그 시금치 식물을 제조하는 방법, 상기 유전자에 기인하는 노균병 저항성을 부여한 계통을 이용한 시금치의 F1 식물이나 그 종자의 제조 방법 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 연구한 결과, 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01:RNR120234(이하, CGN25466:MGK 01)의 제4 염색체 상에 광범위한 레이스에 대해 저항성을 나타내는 우성의 노균병 저항성 유전자가 존재하고 있음을 발견하였다. 나아가 이러한 노균병 저항성 유전자를 갖는 야생종 시금치와 재배종 시금치에 의한 종간 교잡을 수행하여 노균병 저항성을 구비하는 F1 개체를 얻고, 이 F1 개체에 대해 추가로 재배종 시금치와의 교잡을 반복함으로써 상기 노균병 저항성 유전자에 기인하는 노균병 저항성과 재배종에 가까운 형질을 구비하는 시금치 식물을 육성할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 하기와 같다.
[1] 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01의 제4 염색체에 좌상하는 노균병 저항성 RTM-1 유전자를 가지고 있는 시금치 식물인(단, 스피나시아·테트란드라를 제외함), 노균병 저항성 시금치 식물.
[2] 상기 RTM-1 유전자가 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01의 제4 염색체 상의 chr4_7962907부터 chr4_8617232까지의 범위 내에 존재하고 있는 유전자인, 상기 [1]의 노균병 저항성 시금치 식물.
[3] 제4 염색체의 적어도 한쪽의 대립유전자에 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01의 제4 염색체 상의 chr4_8488603부터 chr4_8510715까지의 범위를 포함한 단편을 함유하고 있는, 상기 [1] 또는 [2]의 노균병 저항성 시금치 식물.
[4] 상기 RTM-1 유전자가 호모 접합성 또는 헤테로 접합성인, 상기 [1]~[3] 중 어느 하나의 노균병 저항성 시금치 식물.
[5] 적어도 노균병의 레이스 Pfs1, Pfs2, Pfs3, Pfs4, Pfs5, Pfs6, Pfs7, Pfs8, Pfs9, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs13, Pfs14, Pfs15, Pfs16, Pfs17, Pfs18, Pfs19, 및 UA1014 균주가 나타내는 레이스에 저항성인, 상기 [1]~[4] 중 어느 하나의 노균병 저항성 시금치 식물.
[6] 제4 염색체의 적어도 한쪽의 대립유전자에서
chr4_8488603으로 특정되는 SNP가 시토신이거나,
chr4_8494600으로 특정되는 SNP가 티민이거나, 또는
chr4_8510715로 특정되는 SNP가 구아닌인,
상기 [1]~[5] 중 어느 하나의 노균병 저항성 시금치 식물.
[7] 제4 염색체의 적어도 한쪽의 대립유전자에서
chr4_7962907로 특정되는 SNP가 구아닌이거나,
chr4_8152986으로 특정되는 SNP가 시토신이거나,
chr4_8190990으로 특정되는 SNP가 구아닌이거나,
chr4_8488603으로 특정되는 SNP가 시토신이거나,
chr4_8494600으로 특정되는 SNP가 티민이거나,
chr4_8510715로 특정되는 SNP가 구아닌이거나, 또는
chr4_8617232로 특정되는 SNP가 구아닌인,
상기 [1]~[5] 중 어느 하나의 노균병 저항성 시금치 식물.
[8] 상기 노균병 저항성 시금치 식물이 스피나시아·테트란드라와 재배종 시금치의 종간 잡종 식물에 유래하는 것인, 상기 [1]~[7] 중 어느 하나의 노균병 저항성 시금치 식물.
[9] 수탁번호 FERM BP-22404(TNKH-1 계통)로 특정되는 식물 유래의 노균병 저항성을 갖는, 상기 [1]~[8] 중 어느 하나의 노균병 저항성 시금치 식물.
[10] 수탁번호 FERM BP-22405(TNKH-2 계통)로 특정되는 식물 유래의 노균병 저항성을 갖는, 상기 [1]~[8] 중 어느 하나의 노균병 저항성 시금치 식물.
[11] 상기 RTM-1 유전자 이외의 노균병 저항성 유전자를 적어도 1종 이상 갖는, 상기 [1]~[10] 중 어느 하나의 노균병 저항성 시금치 식물.
[12] 수탁번호 FERM BP-22404(TNKH-1 계통)로 특정되는 노균병 저항성 시금치 식물, 상기 노균병 저항성 시금치 식물을 친계통으로 하여 얻어진 잡종 식물, 또는 이들의 후대인, 노균병 저항성 시금치 식물.
[13] 수탁번호 FERM BP-22405(TNKH-2 계통)로 특정되는 노균병 저항성 시금치 식물, 상기 노균병 저항성 시금치 식물을 친계통으로 하여 얻어진 잡종 식물, 또는 이들의 후대인, 노균병 저항성 시금치 식물.
[14] 피험 시금치 식물의 제4 염색체의 chr4_8488603~chr4_8510715의 SNP의 유전자형을 조사하여 적어도 한쪽의 대립유전자에서
chr4_8488603으로 특정되는 SNP가 시토신이거나,
chr4_8494600으로 특정되는 SNP가 티민이거나, 또는
chr4_8510715로 특정되는 SNP가 구아닌인 경우에
그 피험 시금치 식물이 노균병 저항성일 가능성이 높다고 예측하는, 시금치 식물의 노균병 저항성의 예측 방법.
[15] 피험 시금치 식물의 제4 염색체의 chr4_8488603~chr4_8510715의 SNP의 유전자형을 조사하여 적어도 한쪽의 대립유전자에서
chr4_8488603으로 특정되는 SNP가 시토신이거나,
chr4_8494600으로 특정되는 SNP가 티민이거나, 또는
chr4_8510715로 특정되는 SNP가 구아닌인 경우에
그 피험 시금치 식물을 노균병 저항성 시금치 식물로서 선발하는, 노균병 저항성 시금치 식물의 스크리닝 방법.
[16] RTM-1 유전자를 갖는 시금치 식물과 임의의 시금치 식물을 교잡하는 제1 교잡 공정과,
상기 제1 교잡 공정에 의해 얻어진 F1 개체에 대해 자식, 여교잡, 또는 상기 제1 교잡 공정에서 이용한 친계통과는 다른 시금치 식물과의 종간 교잡 또는 종내 교잡을 수행하여 분리 집단을 얻는 제2 교잡 공정과,
상기 분리 집단으로부터 RTM-1 유전자를 갖는 시금치 식물을 선발하는 선발 공정을 갖는, 노균병 저항성 시금치 식물의 제조 방법.
[17] 상기 RTM-1 유전자를 갖는 시금치 식물이 스피나시아·테트란드라 또는 상기 [1]~[13] 중 어느 하나의 노균병 저항성 시금치 식물인, 상기 [16]의 노균병 저항성 시금치 식물의 제조 방법.
[18] 상기 임의의 시금치 식물, 또는 상기 제2 교잡 공정에서의 종간 교잡 또는 종내 교잡에서 이용하는 친계통이 상기 RTM-1 유전자 이외의 노균병 저항성 유전자를 적어도 1종 이상 갖는 시금치 식물인, 상기 [16] 또는 [17]의 노균병 저항성 시금치 식물의 제조 방법.
[19] 상기 [1]~[13] 중 어느 하나의 노균병 저항성 시금치 식물의 식물체의 일부.
[20] 상기 [1]~[13] 중 어느 하나의 노균병 저항성 시금치 식물의 잎.
[21] 상기 [1]~[13] 중 어느 하나의 노균병 저항성 시금치 식물의 종자.
[22] 시금치 식물의 chr4_8488603으로 특정되는 SNP, chr4_8494600으로 특정되는 SNP, chr4_8510715로 특정되는 SNP, 및 이들 SNP와 유전적으로 강하게 연쇄되어 있는 SNP로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상으로 이루어진, RTM-1 유전자를 갖는 시금치 식물을 선발하기 위한 DNA 마커.
[23] chr4_8488603으로 특정되는 SNP의 유전자형을 식별하기 위한 프라이머 세트,
chr4_8494600으로 특정되는 SNP의 유전자형을 식별하기 위한 프라이머 세트, 및
chr4_8510715로 특정되는 SNP의 유전자형을 식별하기 위한 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하고,
RTM-1 유전자를 갖는 시금치 식물을 선발하기 위해 이용되는, 키트.
[24] 상기 chr4_8488603으로 특정되는 SNP의 유전자형을 식별하기 위한 프라이머 세트가 서열번호 13으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 14로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머, 및 서열번호 15로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머로 이루어지고,
상기 chr4_8494600으로 특정되는 SNP의 유전자형을 식별하기 위한 프라이머 세트가 서열번호 16으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 17로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머, 및 서열번호 18로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머로 이루어지고,
상기 chr4_8510715로 특정되는 SNP의 유전자형을 식별하기 위한 프라이머 세트가 서열번호 19로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 20으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머, 및 서열번호 21로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머로 이루어진, 상기 [23]의 키트.
본 발명에 의해 광범위한 레이스에 대해 저항성을 나타내는 노균병 저항성 시금치 식물이 제공된다.
또한, 본 발명에 관한 시금치 식물을 친계통으로서 이용함으로써 광범위한 레이스에 대해 저항성을 나타내는 신규 시금치 계통을 육성할 수도 있다.
도 1은 실시예 6에서 시금치의 제4 염색체의 RTM-1 유전자좌 근방의 연쇄 지도이다.
본 발명 및 본원 명세서에서 시금치 식물은 스피나시아속(Spinacia)으로 분류되는 식물이다. 야생종 시금치로서 스피나시아·테트란드라, 스피나시아·투루케스타니카 등이 있다. 또한, 재배종 시금치로서 스피나시아·올레라시아 L(Spinacia oleracea L.)을 들 수 있다. 또, 본 발명 및 본원 명세서에서 「재배종」이란 재배에 제공되는 계통의 식물로서, 고정종뿐만 아니라 F1 품종도 포함한다.
본 발명 및 본원 명세서에서 노균병이란 Peronosporaceae과에 속하는 균에 의한 병해이다. 시금치 노균병의 주요 병원균은 Pfs(페로노스포라·파리노사·분화형·스피나시아에)이며, 현재 Pfs1 ~ Pfs19까지가 채번되어 있다. 이들 이외에도 UA1014 균주의 병원성이 나타내는 레이스와 같이 채번되지 않은 것도 많이 존재한다.
본 발명 및 본원 명세서에서 시금치 식물의 「chrX_Y」(X 및 Y는 정수)는 그 시금치 식물의 게놈 중에서 「SpinachBase(http://spinachbase.org/)에서 공개되어 있는 레퍼런스 게놈(Spinach genome sequence (v1))에서의 염색체 번호 X(제X염색체라고도 함)의 Y번째 염기에 상당하는 염기」를 의미한다. 또, 어떤 시금치 식물에서의 「SpinachBase의 레퍼런스 게놈 상의 제X염색체의 Y번째 염기에 상당하는 염기」란 그 시금치 식물의 게놈 DNA의 염기 서열과 SpinachBase의 레퍼런스 게놈의 염기 서열을 가장 호몰로지(서열 동일성)가 높아지도록 얼라인먼트함으로써 결정할 수 있다.
따라서, 어떤 시금치 식물의 제X염색체는 그 시금치 식물의 게놈 DNA의 염기 서열과 SpinachBase의 레퍼런스 게놈의 염기 서열을 가장 호몰로지(서열 동일성)가 높아지도록 얼라인먼트함으로써 결정한 시금치 식물의 제X염색체로서 나타낼 수 있다.
본 발명 및 본원 명세서에서는 「염색체」에는 염색체 전체뿐만 아니라 그 일부도 포함된다. 즉, 「염색체의 일부」도 단지 「염색체」라고 하는 경우가 있다.
「X유전자좌」는 「염색체 중의 X유전자가 차지하는 부위」이다. 이 때문에 본 발명 및 본원 명세서에서는 「X유전자좌를 갖는 시금치 식물」이란 염색체 중에 X유전자가 차지하는 부위를 갖는 시금치 식물이며, 「X유전자를 갖는 시금치 식물」과 같은 의미이다.
본 발명 및 본원 명세서에서는 「제조 방법」은 「작출 방법」, 「육성 방법」 또는 「생산 방법」이라고도 바꾸어 말할 수 있다. 즉, 여기서 말하는 「제조」와 「작출」, 「육성」, 「생산」의 용어는 동등한 의미로 사용된다.
본 발명 및 본원 명세서에서 「식물체의 일부」란 그 식물체의 세포 또는 조직을 포함한 것이며, 구체적으로 잎, 종자, 꽃, 줄기, 뿌리, 과실 등을 들 수 있다. 그 밖에 해당 식물체의 세포로부터 얻어지는 프로토플라스트도 포함된다.
<노균병 저항성 시금치 식물>
본 발명에 관한 노균병 저항성 시금치 식물은 야생종 시금치인 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01의 제4 염색체에 좌상하는 노균병 저항성 유전자인 RTM-1 유전자를 가지고 있는 스피나시아·테트란드라 이외의 시금치 식물이다. RTM-1 유전자는 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01의 제4 염색체의 chr4_7962907부터 chr4_8617232까지의 범위 내에 존재하고 있는 유전자이다.
RTM-1 유전자는 적어도 노균병의 레이스 Pfs1, Pfs2, Pfs3, Pfs4, Pfs5, Pfs6, Pfs7, Pfs8, Pfs9, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs13, Pfs14, Pfs15, Pfs16, Pfs17, Pfs18, Pfs19, 및 UA1014 균주가 나타내는 레이스에 대한 저항성을 부여한다. 즉, 「RTM-1 유전자에 유래하는 노균병 저항성」이란 적어도 노균병의 레이스 Pfs1, Pfs2, Pfs3, Pfs4, Pfs5, Pfs6, Pfs7, Pfs8, Pfs9, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs13, Pfs14, Pfs15, Pfs16, Pfs17, Pfs18, Pfs19, 및 UA1014 균주가 나타내는 레이스에 대한 저항성을 의미한다. 단일 유전자로 이와 같이 광범위한 레이스에 대한 저항성을 부여할 수 있기 때문에 RTM-1 유전자는 종래에 없고 매우 우수한 노균병 저항성 유전자이다.
RTM-1 유전자는 우성으로 후대에 유전되는 유전자이다. 이 때문에 본 발명에 관한 시금치 식물은 RTM-1 유전자가 호모 접합성인, 즉 RTM-1 유전자를 호모 접합으로 갖는 시금치 식물이어도 되고, RTM-1 유전자를 헤테로 접합으로 갖는 시금치 식물이어도 된다. 본 발명에 관한 시금치 식물은 단독으로 매우 광범위한 노균병 레이스에 내성을 부여하는 단일 우성의 노균병 저항성 유전자인 RTM-1 유전자를 가지기 때문에 노균병 저항성 시금치로서 매우 우수하다.
본 발명에 관한 노균병 저항성 시금치 식물은 스피나시아·테트란드라 이외의 시금치 식물의 게놈 DNA에 RTM-1 유전자를 도입함으로써 작출할 수 있다. 게놈 DNA로의 RTM-1 유전자의 도입은 예를 들면 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01의 제4 염색체 중의 RTM-1 유전자가 좌상하는 부위(RTM-1 유전자좌)를 포함한 염색체 단편을 도입함으로써 수행할 수 있다. RTM-1 유전자좌를 포함한 염색체 단편이 도입되는 염색체 중의 부위는 특별히 한정되는 것은 아니고, 염색체 밖이어도 된다. 예를 들면 본 발명에 관한 노균병 저항성 시금치 식물에는 RTM-1 유전자좌를 포함한 염색체 단편에 의해 제4 염색체 중의 해당 단편에 상당하는 영역이 치환되어 있는 시금치 식물이나, 전좌 등에 의해 RTM-1 유전자좌를 포함한 염색체 단편이 스피나시아·테트란드라의 제4 염색체 중의 RTM-1 유전자좌에 상당하는 영역 이외에 도입된 시금치 식물이 포함된다.
RTM-1 유전자좌를 포함한 염색체 단편으로서는 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01의 제4 염색체 중 chr4_7962907부터 chr4_8617232까지의 모든 영역을 포함한 단편이어도 되고, chr4_7962907부터 chr4_8617232까지의 영역 중 RTM-1 유전자좌를 포함한 부분의 단편이어도 된다. RTM-1 유전자좌를 포함한 부분의 단편으로서는 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01의 제4 염색체 중 chr4_8488603부터 chr4_8510715까지의 영역을 포함한 단편인 것이 바람직하다. 이러한 단편으로서는 chr4_7962907부터 chr4_8617232까지의 영역 중 chr4_8488603부터 chr4_8510715까지의 영역을 포함한 염색체 단편이 바람직하다. 즉, 본 발명에 관한 노균병 저항성 시금치 식물로서는 제4 염색체의 적어도 한쪽의 대립유전자에 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01의 제4 염색체 상의 chr4_8488603부터 chr4_8510715까지의 범위를 포함한 단편을 함유하고 있는 시금치 식물이 바람직하다. 또한, RTM-1 유전자좌를 포함한 염색체 단편으로서는 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01의 제4 염색체 중 chr4_7962907부터 chr4_8617232까지의 영역을 포함한 염색체 단편이나, chr4_7421480부터 chr4_10710358까지의 영역을 포함한 염색체 단편이어도 된다.
RTM-1 유전자의 게놈 DNA로의 도입은 스피나시아·테트란드라를 친계통으로서 이용하는 교잡 육종법이나 게놈 편집법 등의 유전자 개변법 등에 의해 수행할 수 있다.
예를 들면 본 발명에 관한 노균병 저항성 시금치 식물은 스피나시아·테트란드라와 스피나시아·테트란드라 이외의 시금치 식물의 종간 잡종 식물로서, RTM-1 유전자에 유래하는 노균병 저항성을 갖는 식물에 유래한다. 또, 「종간 잡종 식물」에는 스피나시아속에 속하는 종에서의 이종간 교잡에 의해 발생하는 식물에 추가하여 스피나시아속 식물의 이종간 세포 융합에 의한 체세포 잡종 식물이나 스피나시아속 식물의 이종간 접목에 의해 얻어지는 접목 잡종 식물도 포함된다. 또한, 「스피나시아·테트란드라와 스피나시아·테트란드라 이외의 시금치 식물의 종간 잡종 식물」에는 그 종간 잡종 식물에 추가하여 그 종간 잡종 식물의 후대도 포함한다.
본 발명 및 본원 명세서에서 「시금치 식물의 후대」란 그 시금치 식물의 종내 교잡에 의해 얻어지는 자손에 추가하여 그 시금치 식물을 친계통으로 하여 얻어지는 개체와 그 자손, 그 시금치 식물의 세포와 타품종의 식물 세포의 세포 융합에 의한 체세포 잡종 식물과 그 자손, 그 시금치 식물을 대목(root stock) 또는 접수(budwood)로 한 접목에 의해 얻어진 개체와 그 자손이 포함된다. 「자손」에는 종내 교잡에 의해 얻어지는 개체와 종간 잡종에 의해 얻어지는 개체 모두가 포함된다. 또한, 「(식물을) 친계통으로 하여 얻어지는 개체」란 그 식물을 친계통으로 한 종내 교잡, 종간 교잡, 또는 세포 융합 혹은 접목에 의해 얻어지는 개체를 의미한다.
예를 들면 본 발명에 관한 노균병 저항성 시금치 식물은 스피나시아·테트란드라와 스피나시아·테트란드라 이외의 시금치 식물을 교잡함으로써 작출할 수 있다. 스피나시아·테트란드라를 친계통으로 한 종간 교잡에 의해 얻어지는 F1 개체는 제4 염색체의 한쪽의 대립유전자가 스피나시아·테트란드라에 유래하는 RTM-1 유전자를 갖는 제4 염색체이다. RTM-1 유전자는 우성 유전자이기 때문에 스피나시아·테트란드라에 유래하는 제4 염색체를 구비하는 F1 개체는 RTM-1 유전자에 유래하는 노균병 저항성을 가진다.
본 발명에 관한 노균병 저항성 시금치 식물의 작출의 소재로서 이용되는 시금치 식물로서는 CGN25466:MGK 01이 가지고 있는 RTM-1 유전자를 갖는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면 스피나시아·테트란드라의 계통으로서는 CGN25466:MGK 01 외에는 CGN25466:MGK 01로부터 RTM-1 유전자를 계승한 후대 계통 등을 들 수 있다.
본 발명에 관한 노균병 저항성 시금치 식물을 작출하기 위해 스피나시아·테트란드라와 교잡하는 친계통으로서는 스피나시아·테트란드라 이외의 시금치 식물이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 농작물로서 재배되고 있는 재배종 시금치 식물인 것이 바람직하다. 스피나시아·테트란드라는 야생종으로 발아, 화분 품질, 잎 색이나 잎 모양 등의 형질이 농작물로서는 재배종 시금치보다 떨어진다. 스피나시아·테트란드라와 교잡하는 친계통을 재배종 시금치 식물로 함으로써 얻어지는 노균병 저항성 시금치 식물의 노균병 저항성 이외의 형질을 농작물로서 바람직한 형질에 가깝게 할 수 있다. 재배종 시금치 식물로서는 스피나시아·올레라시아 L이나 스피나시아·올레라시아 L을 친계통으로 하여 작출된 종간 잡종 시금치 식물을 들 수 있다.
본 발명에 관한 노균병 저항성 시금치 식물은 스피나시아·테트란드라와 스피나시아·테트란드라 이외의 시금치 식물의 종간 교잡에 의해 얻어지는 F1 개체의 후대이어도 된다. 예를 들면, 스피나시아·테트란드라와 재배종 시금치 식물을 교잡하여 F1 종자를 얻고, 얻어진 F1 종자로부터 생육시킨 식물 개체에 재배종 시금치 식물 개체를 여교잡 또는 자식하여 종자를 얻는다. 다음으로, 얻어진 종자로부터 생육시킨 식물 개체로부터 RTM-1 유전자를 갖는 개체를 선발한다. 선발된 식물 개체에 대해 자식 또는 재배종 시금치 식물과의 교잡과 교잡에 의해 얻어진 후대로부터의 RTM-1 유전자를 갖는 개체의 선발을 반복함으로써 노균병 저항성 시금치 식물의 고정종을 얻을 수 있다. 자식, 재배종 시금치 식물과의 교잡, 재배, 및 종자의 채종은 시금치 재배의 통상의 방법에 의해 수행할 수 있다.
교잡에 의해 얻어진 후대로부터의 RTM-1 유전자를 갖는 개체의 선발은 예를 들면 노균병 저항성을 조사함으로써 수행할 수 있다. 구체적으로 노균병 저항성을 조사하는 피험 식물 개체의 잎에 대해 각 레이스의 Pfs를 접종시켜 노균병의 발병의 유무를 조사한다. 노균병을 발병하지 않은 경우에 그 피험 식물 개체는 접종한 레이스에 대해 저항성이라고 평가한다. 교잡에 의해 얻어진 후대로부터 적어도 노균병의 레이스 Pfs1, Pfs2, Pfs3, Pfs4, Pfs5, Pfs6, Pfs7, Pfs8, Pfs9, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs13, Pfs14, Pfs15, Pfs16, Pfs17, Pfs18, Pfs19, 및 UA1014 균주가 나타내는 레이스에 대해 저항성을 갖는 식물 개체를 RTM-1 유전자를 갖는 개체로서 선발한다.
교잡에 의해 얻어진 후대로부터의 RTM-1 유전자를 갖는 개체의 선발은 예를 들면 게놈 DNA 중에 RTM-1 유전자를 포함한 염색체 단편을 포함하는지 어떤지를 조사하는 방법에 의해 수행할 수 있다. 구체적으로 시금치 식물의 제4 염색체 중의 chr4_7962907부터 chr4_8617232까지의 영역이나 그 근방의 DNA 마커를 이용하여 이들 영역이 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01에 유래하는 염색체 단편인지 스피나시아·테트란드라 이외의 시금치 식물에 유래하는 염색체 단편인지를 식별한다.
본 발명 및 본원 명세서에서 DNA 마커란 상이한 품종 유래의 염색체 단편끼리를 식별할 수 있는 염색체 상의 DNA 서열의 차이를 검출할 수 있는 것이다. DNA 마커로서는 예를 들면 SNP(Single Nucleotide Polymorphism, 일염기 다형) 마커나 SSR(Simple Sequence Repeats, 단순 반복 서열) 마커, RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism, 제한효소 단편 장다형) 마커 등을 들 수 있다.
DNA 마커의 검출은 통상의 방법에 의해 수행할 수 있다. 예를 들면, 각 식물 개체로부터 추출한 DNA를 주형으로 하고, 특정의 SNP나 SSR과 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 프라이머와 폴리메라아제를 이용한 핵산 증폭 반응을 수행하며, 전기영동법 등을 이용하여 증폭 산물의 유무를 검출하여 각 다형을 식별할 수 있다. 또한, 각 식물 개체로부터 추출한 DNA를 제한효소 처리한 후, 전기영동법 등을 이용하여 DNA 단편의 패턴을 검출하여 각 다형을 식별할 수 있다. 또, 특정의 SNP나 SSR과 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 프라이머는 시금치의 게놈 DNA의 염기 서열이나 검출 대상의 SNP나 SSR의 염기 서열에 따라 범용되고 있는 프라이머 설계 도구 등을 이용하여 통상의 방법에 의해 설계하고, 해당 기술분야에서 잘 알려져 있는 방법에 의해 합성할 수 있다.
RTM-1 유전자를 갖는 개체의 선발에 이용하는 DNA 마커로서는 예를 들면 chr4_7962907부터 chr4_8617232까지의 영역이나 그 근방의 SNP를 들 수 있다. 이러한 SNP로서는 구체적으로 chr4_7421480, chr4_7962907, chr4_8152986, chr4_8190990, chr4_8488603, chr4_8494600, chr4_8500200, chr4_8502319, chr4_8502334, chr4_8502394, chr4_8510715, chr4_8617232, chr4_10710358을 들 수 있다. 이들 SNP의 염기의 식별은 예를 들면 KASP(Kompetitive Allele Specific PCR) 제노타이핑 어세이(LGC Genomics사 제품)를 이용하여 수행할 수 있다. 이들 SNP에 대해 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01의 유전자형과 SpinachBase에서 공개되어 있는 레퍼런스 게놈의 유전자형을 표 1에 나타낸다. 표 1 중, G는 구아닌, C는 시토신, A는 아데닌, T는 티민을 의미한다.
예를 들면, 본 발명에 관한 노균병 저항성 시금치 식물 중에서, 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01의 제4 염색체의 chr4_8488603부터 chr4_8510715까지의 범위를 포함한 단편을 호모 접합 또는 헤테로 접합으로 갖는 시금치 식물은 제4 염색체의 적어도 한쪽의 대립유전자에서 chr4_8488603으로 특정되는 SNP가 시토신이고, chr4_8494600으로 특정되는 SNP가 티민이며, chr4_8510715로 특정되는 SNP가 구아닌이다. 또한, 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01의 제4 염색체의 chr4_7962907부터 chr4_8617232까지의 범위를 포함한 단편을 호모 접합 또는 헤테로 접합으로 갖는 시금치 식물로서는 제4 염색체의 적어도 한쪽의 대립유전자에서 chr4_7962907로 특정되는 SNP가 구아닌이고, chr4_8152986으로 특정되는 SNP가 시토신이며, chr4_8190990으로 특정되는 SNP가 구아닌이고, chr4_8488603으로 특정되는 SNP가 시토신이며, chr4_8494600으로 특정되는 SNP가 티민이고, chr4_8510715로 특정되는 SNP가 구아닌이며, chr4_8617232로 특정되는 SNP가 구아닌인 시금치 식물이 바람직하다. 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01의 제4 염색체의 chr4_7962907부터 chr4_8617232까지의 범위를 포함한 단편을 호모 접합 또는 헤테로 접합으로 갖는 시금치 식물로서는 제4 염색체의 적어도 한쪽의 대립유전자에서 chr4_7962907로 특정되는 SNP가 구아닌이고, chr4_8152986으로 특정되는 SNP가 시토신이며, chr4_8190990으로 특정되는 SNP가 구아닌이고, chr4_8488603으로 특정되는 SNP가 시토신이며, chr4_8494600으로 특정되는 SNP가 티민이고, chr4_8500200으로 특정되는 SNP는 티민이며, chr4_8502319로 특정되는 SNP는 시토신이고, chr4_8502334로 특정되는 SNP는 구아닌이며, chr4_8502394로 특정되는 SNP는 구아닌이고, chr4_8510715로 특정되는 SNP가 구아닌이며, chr4_8617232로 특정되는 SNP가 구아닌인 시금치 식물도 바람직하다.
본 발명에 관한 노균병 저항성 시금치 식물은 노균병 저항성 이외의 형질, 특히 농작물로서의 형질은 재배종 시금치와 동일하거나 또는 근사한 것이 바람직하다. 농작물로서의 형질이란 식미, 잎의 형상, 수량, 재배의 용이함 등을 들 수 있다. 또, 「재배종으로서의 형질」이란 농작물로서의 형질이 농작물로서 적합한 형질인 것을 의미한다.
본 발명에 관한 노균병 저항성 시금치 식물로서는 예를 들면 TNKH-1 계통(수탁번호 FERM BP-22404), TNKH-2 계통(수탁번호 FERM BP-22405)을 들 수 있다. 이들 2계통은 스피나시아·테트란드라가 갖는 열악 형질과 RTM-1 유전자의 연쇄를 절단하여 RTM-1 유전자에 유래하는 노균병 저항성을 유지하면서 재배종으로서의 형질을 겸하고 있다. 또한, 이들 계통으로 특정되는 식물 유래의 노균병 저항성을 갖는 시금치 식물도 본 발명에 관한 노균병 저항성 시금치 식물에 포함된다.
TNKH-1 계통으로 특정되는 식물 유래의 노균병 저항성을 갖는 시금치 식물로서는 TNKH-1 계통에 추가하여 TNKH-1 계통을 친계통으로 하여 얻어진 잡종 식물이나 이들의 후대로서, RTM-1 유전자에 유래하는 노균병 저항성을 갖는 시금치 식물을 들 수 있다. TNKH-2 계통으로 특정되는 식물 유래의 노균병 저항성을 갖는 시금치 식물도 동일하다.
본 발명에 관한 노균병 저항성 시금치 식물로서는 RTM-1 유전자 이외의 노균병 저항성 유전자를 적어도 1종 이상 갖는 것이 바람직하다. RTM-1 유전자는 단독으로 이미 알려진 저항성 유전자보다 광범위한 레이스에 대한 저항성을 부여할 수 있지만, 그 밖의 노균병 저항성 유전자도 가짐으로써 저항성을 타파하는 신레이스의 출현을 억제하는 것에도 기여하는 것을 기대할 수 있다. 예를 들면 RTM-1 유전자 이외의 노균병 저항성 유전자로서는 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 RPF1 유전자 ~ RPF15 유전자, R6 유전자, R15 유전자 등을 들 수 있다.
본 발명에 관한 노균병 저항성 시금치 식물은 식물체의 전부 및 일부 중 어느 것이어도 된다. 즉, 본 발명에 관한 노균병 저항성 시금치 식물은 RTM-1 유전자를 갖는 시금치 식물의 식물체의 전체, 그 시금치 식물의 지상부, 및 그 시금치 식물의 조직 모두 포함한다. 또한, 본 발명에 관한 노균병 저항성 시금치 식물은 RTM-1 유전자를 갖는 시금치 식물의 일 조직으로부터 얻어지는 세포도 포함한다. 조직으로서는 배아, 분열 조직 세포, 캘러스, 화분, 잎, 꽃밥, 줄기, 잎자루, 뿌리, 근단, 과실, 종자, 꽃, 자엽 및 배축을 들 수 있다.
본 발명에 관한 노균병 저항성 시금치 식물의 노균병 저항성은 우성적인 발현을 나타낸다. 이 때문에 본 발명에 관한 노균병 저항성 시금치 식물을 친계통으로 하여 종간 교잡 또는 종내 교잡함으로써 RTM-1 유전자에 유래하는 노균병 저항성을 구비하는 시금치 식물의 신규 계통의 육성이 가능해진다.
<노균병 저항성 시금치 식물의 스크리닝 방법>
본 발명에 관한 노균병 저항성 시금치 식물의 스크리닝 방법은 피험 시금치 식물이 RTM-1 유전자를 갖는지 여부를 조사하여 RTM-1 유전자를 가진다고 판단된 경우에 그 피험 시금치 식물을 노균병 저항성 시금치 식물로서 선발한다. 본 발명에 관한 노균병 저항성 시금치 식물의 스크리닝 방법에서는 피험 시금치 식물이 RTM-1 유전자를 갖는지 여부를 제4 염색체의 RTM-1 유전자좌 또는 그 근방의 DNA 마커나 이들 DNA 마커와 강하게 연쇄되는 DNA 마커의 유전자형에 기초하여 판단한다. 제4 염색체의 적어도 한쪽의 대립유전자에서 RTM-1 유전자좌 또는 그 근방의 DNA 마커나 이들 DNA 마커와 강하게 연쇄되는 DNA 마커의 유전자형이 CGN25466:MGK 01주 등과 같은 RTM-1 유전자를 가지며 노균병 저항성을 나타내는 스피나시아·테트란드라와 동일한 유전자형인 경우에는 해당 피험 시금치 식물을 노균병 저항성 시금치 식물로서 선발한다.
RTM-1 유전자의 유무를 판단하기 위한 DNA 마커로서는 예를 들면 표 1에 기재된 SNP를 들 수 있다. 그 중에서도 시금치 식물의 chr4_8488603으로 특정되는 SNP, chr4_8494600으로 특정되는 SNP, chr4_8510715로 특정되는 SNP, 및 이들 SNP와 유전적으로 강하게 연쇄되어 있는 SNP로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 RTM-1 유전자의 유무를 판단하기 위한 DNA 마커로서 적합하다. 예를 들면 적어도 한쪽의 대립유전자에서 chr4_8488603으로 특정되는 SNP가 시토신이거나, chr4_8494600으로 특정되는 SNP가 티민이거나, 또는 chr4_8510715로 특정되는 SNP가 구아닌인 경우에 해당 피험 시금치 식물을 노균병 저항성 시금치 식물로서 선발한다.
RTM-1 유전자의 유무를 판단하기 위한 DNA 마커의 유전자형을 식별하기 위한 프라이머 세트를 미리 키트화해 둠으로써 이러한 키트를 이용하는 것에 의해 보다 간편하게 RTM-1 유전자의 유무를 판단하여 노균병 저항성 시금치 식물의 선발을 수행할 수 있다. 예를 들면, 시금치 식물의 chr4_8488603으로 특정되는 SNP의 유전자형을 식별하기 위한 프라이머 세트, chr4_8494600으로 특정되는 SNP의 유전자형을 식별하기 위한 프라이머 세트, 및 chr4_8510715로 특정되는 SNP의 유전자형을 식별하기 위한 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프라이머 세트를 모은 키트는 피험 시금치 식물의 RTM-1 유전자의 유무를 판단하기 위한 이들 SNP의 유전자형 식별에 유용하다.
<시금치 식물의 노균병 저항성의 예측 방법>
본 발명에 관한 시금치 식물의 노균병 저항성의 예측 방법은 피험 시금치 식물이 RTM-1 유전자를 갖는지 여부를 조사하여 RTM-1 유전자를 가진다고 판단된 경우에 그 피험 시금치 식물이 노균병 저항성일 가능성이 높다고 예측한다. 본 발명에 관한 시금치 식물의 노균병 저항성의 예측 방법에서는 피험 시금치 식물이 RTM-1 유전자를 갖는지 여부를 제4 염색체의 RTM-1 유전자좌 또는 그 근방의 DNA 마커나 이들 DNA 마커와 강하게 연쇄되는 DNA 마커의 유전자형에 기초하여 판단한다. 제4 염색체의 적어도 한쪽의 대립유전자에서 RTM-1 유전자좌 또는 그 근방의 DNA 마커나 이들 DNA 마커와 강하게 연쇄되는 DNA 마커의 유전자형이 CGN25466:MGK 01주 등과 같은 RTM-1 유전자를 가지며 노균병 저항성을 나타내는 스피나시아·테트란드라와 동일한 유전자형인 경우에는 해당 피험 시금치 식물이 RTM-1 유전자를 가진다고 판단하고, CGN25466:MGK 01주 등과 같은 RTM-1 유전자를 가지며 노균병 저항성을 나타내는 스피나시아·테트란드라와 다른 유전자형인 경우에는 해당 피험 시금치 식물이 RTM-1 유전자를 가지지 않는다고 판단한다.
RTM-1 유전자의 유무를 판단하기 위한 DNA 마커로서는 표 1에 기재된 SNP를 들 수 있다. 그 중에서도 시금치 식물의 chr4_8488603으로 특정되는 SNP, chr4_8494600으로 특정되는 SNP, chr4_8510715로 특정되는 SNP, 및 이들 SNP와 유전적으로 강하게 연쇄되어 있는 SNP로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 노균병 저항성을 예측하기 위한 DNA 마커로서 적합하다. 예를 들면, 적어도 한쪽의 대립유전자에서 chr4_8488603으로 특정되는 SNP가 시토신이거나, chr4_8494600으로 특정되는 SNP가 티민이거나, 또는 chr4_8510715로 특정되는 SNP가 구아닌인 경우에 해당 피험 시금치 식물은 RTM-1 유전자를 가지고 있어 노균병 저항성일 가능성이 높다고 예측한다. RTM-1 유전자의 유무를 판단하기 위한 DNA 마커의 유전자형을 식별하기 위한 프라이머 세트 및 이의 키트는 상기와 동일한 것을 이용할 수 있다.
<노균병 저항성 시금치 식물의 제조 방법>
RTM-1 유전자를 갖는 시금치 식물을 재료로서 교잡을 수행함으로써 RTM-1 유전자를 가지지 않은 시금치 식물에 RTM-1 유전자에 유래하는 노균병 저항성을 도입하여 신규의 노균병 저항성 시금치 식물을 제조할 수 있다. 단일 우성의 저항성 유전자인 RTM-1 유전자는 임의의 계통에 도입하는 것이 용이하여 시금치의 품종 육성을 가속시킬 수 있다. 나아가 RTM-1 유전자는 그 밖의 단일 우성 저항성 대립유전자와 동일한 하플로타입으로 겸비하는 것이 가능하다. 이 때문에 RTM-1 유전자를 갖는 시금치 식물을 친계통으로서 이용함으로써 보다 광범위한 레이스에 저항성을 갖는 품종의 육성이 용이해진다.
본 발명에 관한 노균병 저항성 시금치 식물의 제조 방법은 RTM-1 유전자를 갖는 시금치 식물을 친계통으로서 이용한 교잡 육종을 이용하는 방법이다. 구체적으로 RTM-1 유전자를 갖는 시금치 식물과 임의의 시금치 식물을 교잡하는 제1 교잡 공정과, 상기 제1 교잡 공정에 의해 얻어진 F1 개체에 대해 자식, 여교잡, 또는 상기 제1 교잡 공정에서 이용한 친계통과는 상이한 시금치 식물과의 종간 교잡 또는 종내 교잡을 수행하여 분리 집단을 얻는 제2 교잡 공정과, 상기 분리 집단으로부터 RTM-1 유전자를 갖는 시금치 식물을 선발하는 선발 공정을 가진다. 자식, 여교잡, 종간 교잡, 종내 교잡, 시금치 식물의 재배, 및 채종은 시금치 재배의 통상의 방법에 의해 수행할 수 있다.
제1 교잡 공정에서 친계통으로서 이용하는 RTM-1 유전자를 갖는 시금치 식물로서는 스피나시아·테트란드라를 이용할 수 있고, 상기의 본 발명에 관한 노균병 저항성 시금치 식물을 이용할 수도 있다. 본 발명에서는 친계통으로서 이용하는 RTM-1 유전자를 갖는 시금치 식물로서는 RTM-1 유전자를 가지면서 재배종으로서의 형질을 겸하고 있는 노균병 저항성 시금치 식물인 것이 바람직하다. 이러한 노균병 저항성 시금치 식물로서는 TNKH-1 계통, TNKH-1 계통을 친계통으로 하여 얻어진 잡종 식물, TNKH-2 계통, 및 TNKH-2 계통을 친계통으로 하여 얻어진 잡종 식물과 이들의 후대로서 RTM-1 유전자에 유래하는 노균병 저항성을 갖는 시금치 식물을 들 수 있다.
제1 교잡 공정에서 친계통으로서 이용하는 임의의 시금치 식물이나, 제2 교잡 공정에서 종간 교잡 또는 종내 교잡의 친계통으로서 이용하는 임의의 시금치 식물로서는 특별히 한정되는 것은 아니고, RTM-1 유전자를 가지지 않은 각종 시금치 식물을 적절히 이용할 수 있다. 본 발명에서는 친계통으로서는 재배종 시금치 식물을 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, RTM-1 유전자를 가지면서 재배종으로서의 형질을 겸하고 있는 노균병 저항성 시금치 식물과 RTM-1 유전자를 가지지 않은 재배종 시금치 식물을 친계통으로 하여 양자를 교잡시켜 얻어진 F1 개체에 대해 자식, 여교잡, 또는 제1 교잡 공정에서 이용한 친계통과는 다른 재배종 시금치 식물과의 종간 교잡 또는 종내 교잡을 수행함으로써 RTM-1 유전자에 유래하는 노균병 저항성을 구비하고, 또한 재배종으로서도 적합한 형질을 구비한 신규 시금치 계통을 비교적 용이하게 작출할 수 있다.
제1 교잡 공정에서 친계통으로서 이용하는 임의의 시금치 식물이나, 제2 교잡 공정에서 종간 교잡 또는 종내 교잡의 친계통으로서 이용하는 임의의 시금치 식물로서는 RTM-1 유전자 이외의 노균병 저항성 유전자를 적어도 1종 이상 갖는 시금치 식물인 것이 바람직하고, RTM-1 유전자 이외의 노균병 저항성 유전자를 적어도 1종 이상 갖는 재배종 시금치 식물인 것이 보다 바람직하다. RTM-1 유전자 이외의 노균병 저항성 유전자를 적어도 1종 이상 갖는 시금치 식물을 친계통으로 함으로써 RTM-1 유전자와 그 밖의 노균병 저항성 유전자 모두를 포함한 신규 시금치 계통을 비교적 용이하게 작출할 수 있다.
선발 공정에서의 분리 집단으로부터의 RTM-1 유전자를 갖는 시금치 식물의 선발은 예를 들면 피험 식물 개체의 잎에 대해 각 레이스의 Pfs를 접종시켜 노균병 저항성을 조사함으로써 수행할 수 있다. 분리 집단으로부터 적어도 노균병의 레이스 Pfs1, Pfs2, Pfs3, Pfs4, Pfs5, Pfs6, Pfs7, Pfs8, Pfs9, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs13, Pfs14, Pfs15, Pfs16, Pfs17, Pfs18, Pfs19, 및 UA1014 균주가 나타내는 레이스에 대해 저항성을 갖는 식물 개체를 RTM-1 유전자를 갖는 개체로서 선발한다.
선발 공정에서의 RTM-1 유전자를 갖는 개체의 선발은 시금치 식물의 제4 염색체 중의 RTM-1 유전자좌 및 그 근방의 DNA 마커를 이용하여 수행할 수 있다. 사용하는 DNA 마커나 구체적인 방법은 상기의 본 발명에 관한 스크리닝 방법과 같이 하여 수행할 수 있다.
RTM-1 유전자와 그 밖의 노균병 저항성 유전자 모두를 포함한 식물 개체를 선발하는 경우에는 상기 RTM-1 유전자를 갖는 개체의 선발에 이용하는 DNA 마커와 함께 상기 다른 노균병 저항성 유전자의 유무를 식별 가능한 DNA 마커를 이용한다. 상기 다른 노균병 저항성 유전자의 유무를 식별 가능한 DNA 마커로서는 상기 다른 노균병 저항성 유전자의 유전자좌와 그 근방에 존재하는 SNP 등을 이용할 수 있다.
그 후, 선발된 후대 개체로부터 채종된 종자의 자식을 반복함으로써 보다 형질이 안정되고 발아율, 수확량, 채종량 등이 농작물로서 안정적으로 재배 가능한 정도의 노균병 저항성 시금치 식물을 얻을 수 있다. 자식의 반복 횟수는 1회 이상이면 특별히 한정되는 것은 아니고, 2 ~ 3회이어도 되고, 3회 이상이어도 된다.
실 시 예
다음에 실시예를 나타내어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<노균병 저항성을 조사하는 레이스 접종 시험>
시금치 식물에 대한 Pfs의 접종 시험은 하기의 방법으로 수행하였다.
시금치 종자를 배토 「슈퍼믹스 A」(사카타노타네사 제품)를 채운 트레이에 파종하고, 배토 「메트로믹스 350」(하이포넥스재팬사 제품)을 이용하여 복토를 하였다. 파종할 때, 각 트레이에 접종하는 레이스에 대해 이병성을 나타내는 계통의 종자를 파종하여 발병의 대조구를 마련하였다. 이 트레이를 유리 온실 내에서 2주간 육묘하여 본엽 2엽기에 Pfs의 포자 현탁액(5×104/mL)을 분무 접종하였다. 접종 후 바로 트레이를 플라스틱 커버로 덮어 온도 15℃, 습도 100%, 12시간 일장(日長) 의 조건하에서 관리하였다.
접종으로부터 7~10일 후, 대조구의 발병을 충분히 확인한 후에 개체마다 저항성·이병성의 판정을 수행하였다. 자엽 또는 본엽에 균사 및 포자가 출현하여 발병이 인정된 주를 이병성으로 하고, 자엽 및 본엽 모두 발병이 인정되지 않은 주를 저항성으로 하였다.
노균병의 각 레이스는 일본 내 The University of Arkansas(Dr. Jim Correll) 및 Naktuinbouw로부터 입수하였다. 또한, 노균병의 레이스 판별에는 각 레이스에 다른 저항성 패턴을 나타내는 이미 알려진 시금치 품종(differential set)을 판별 품종으로서 이용할 수 있다. 각 레이스의 노균병 저항성을 판별하기 위해 이용되는 판별 품종은 USDA(아메리카 합중국 농무성) 및 Naktuinbouw로부터 입수 가능하다(비특허문헌 4).
각 판별 품종에 대해 보고되어 있는 저항성을 표 2 및 표 3에 나타낸다. 표 중, 「-」가 저항성인 것, 「(-)」가 중간 정도의 저항성인 것, 「+」가 이병성인 것, 「(+)」는 노균병 증상과 포자 형성은 자엽에서만 관찰되고 본엽에서는 관찰되지 않은 것을 각각 의미한다. 또한, 「*」는 개개의 테스트에 따라 저항성의 결과가 다른 것을 의미한다.
[실시예 1]
2013년에 네덜란드의 CGN으로부터 입수한 야생종 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01을 친계통으로 하여 신규 노균병 저항성 계통을 작출하였다.
우선, 네덜란드의 CGN으로부터 입수한 야생종 스피나시아·테트란드라 계통 중 CGN25466:MGK 01 및 CGN25474:MGK 18을 각각 파종하여 발아한 개체에 대해 Pfs6을 접종하였다. 이 결과, 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01은 저항성을 나타내었지만, 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25474:MGK 18은 이병성이었다. 그래서, 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01을 친계통으로서 이용하기로 하였다.
우선, 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01을 60립 파종하여 발아한 25개체에 대해 Pfs10을 접종하였다. 이 결과, 25개체 모두가 저항성을 나타내었다.
다음으로, 이 25개체 중의 4개체와 RPF3 계통(RPF3 유전자를 갖는 우량 친계통)을 교배하여 F1 종자를 얻었다. 또, 우량 친계통이란 재배종으로서 적합한 형질을 발현하는 계통을 작출하기 위한 친계통으로서 적합한 계통을 의미한다.
얻어진 F1 종자 40립을 파종한 바, 그 중 10개체의 식물체가 생육되었다. 생육된 10개체 중의 2개체에 상기 RPF3 계통을 여교배하여 BC1 종자를 얻었다.
얻어진 BC1 종자 24립을 파종한 바, 그 중 10개체의 식물체가 생육되었다. 생육된 10개체에 대해 RPF3이 저항성을 나타내지 않는 Pfs10을 접종한 바, 7개체가 저항성을 나타내었다. 그 중의 1개체에 RPF4 계통(RPF4 유전자를 갖는 우량 친계통)을 교배하여 BC1F1 종자를 얻었다.
얻어진 BC1F1 종자 50립을 파종한 바, 그 중 43개체의 식물체가 생육되었다. 생육된 43개체에 대해 RPF3 및 RPF4가 모두 저항성을 나타내지 않는 Pfs10을 접종한 바, 15개체가 저항성을 나타내었다. 그 중의 11개체를 자식하여 BC1F1S1 종자를 얻었다.
얻어진 BC1F1S1 종자 817립을 파종한 바, 그 중 676개체의 식물체가 생육되었다. 생육된 식물체 모두에 대해 Pfs10을 접종한 바, 500개체의 식물체가 저항성을 나타내었다. 저항성을 나타낸 개체 중 22개체로 자식하여 BC1F1S2 종자를 얻었다.
얻어진 BC1F1S2 종자 7696립을 파종한 바, 그 중 3551개체의 식물체가 생육되었다. 생육된 식물체 중의 76개체를 자식하여 BC1F1S3 종자를 얻었다.
얻어진 BC1F1S3 종자 12971립을 파종한 바, 그 중 9815개체의 식물체가 생육되었다. 생육된 식물체 중의 115개체를 자식하여 BC1F1S4 종자를 얻었다.
자식한 115개체의 각각으로부터 얻어진 BC1F1S4 종자를 7377립 파종한 바, 그 중 4717개체의 식물체가 생육되었다. 생육된 식물체 전부에 대해 RPF3 및 RPF4가 공히 저항성을 나타내지 않는 Pfs10 또는 UA1014 균주가 나타내는 레이스를 접종한 바, 5계통에서 모든 식물체가 Pfs10 및 UA1014 균주가 나타내는 레이스에 대해 저항성을 나타내었다. 이는 상기 5계통이 RPF3 및 RPF4와는 상이한 미지의 노균병 저항성 유전자를 호모 접합으로 가지고 있는 것 및 이 미지의 노균병 저항성 유전자는 RPF3 유전자 및 RPF4 유전자의 대립유전자가 아니라 상이한 유전자좌에 존재할 가능성을 시사하고 있다. 저항성을 나타낸 5계통 34개체를 자식하여 BC1F1S5 종자를 얻었다.
모든 개체가 저항성을 나타낸 5계통에 대해 RPF3 마커 및 RPF4 마커를 이용하여 RPF3 유전자 및 RPF4 유전자의 유무를 조사하였다. 결과에 기초하여 RPF3 호모 계통을 선택하여 TNKH-1 계통이라고 명명하였다. 또한, RPF4 호모 계통을 선택하여 TNKH-2 계통이라고 명명하였다. 나아가 RPF3 및 RPF4의 분리 계통을 선택하여 이를 TNKH-3 계통이라고 명명하였다. 이들 계통이 갖는, 스피나시아·테트란드라에 유래하는 미지의 노균병 저항성 유전자 및 유전자좌를 RTM-1이라고 명명하였다.
또, 스피나시아·테트란드라 및 그 유전적 영향이 강하게 나타나는 초기 세대에서는 복수의 종자가 굳어지고 또한 발아도 나빴다. 그 때문에 종자의 수확, 정선(精選)에 많은 노력을 필요로 하며, 발아율을 올리기 위해 파종 후의 발아 환경에 유의하였다. 나아가 화분이 무거워 비산되기 어렵기 때문에 교잡이 곤란하였다. 나아가 각 공정에서는 내병성에 의한 선발뿐만 아니라 잎 색, 잎 형태, 잎의 크기 등을 음미하여 가능한 한 재배형에 가까운 형질을 갖는 개체의 선발을 함께 행하였다.
출원인은 TNKH-1 계통 및 TNKH-2 계통에 대해 그 종자를 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허생물기탁센터(치바현 키사라즈시 카즈사 카마타리 2-5-8 120호실)에 기탁하였다. TNKH-1 계통의 기탁자가 부여한 식별을 위한 표시: SSC-SPI-20-001, 수탁번호가 FERM BP-22404(기탁일: 2020년 12월 25일)이며, TNKH-2 계통의 기탁자가 부여한 식별을 위한 표시: SSC-SPI-20-002, 수탁번호가 FERM BP-22405(기탁일: 2020년 12월 25일)이다.
[실시예 2]
어떤 레이스에도 저항성을 가지지 않는 Viroflay 계통을 종자친, 실시예 1에서 작출한 TNKH-3 계통을 화분친으로 하여 교잡을 수행하여 얻어진 F1 개체에 대해 Pfs1, Pfs2, Pfs3, Pfs4, Pfs5, Pfs6, Pfs7, Pfs8, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs13, Pfs14, Pfs15, Pfs16, Pfs17, 및 UA1014 균주가 나타내는 레이스를 이용한 접종 시험을 수행하고 이들에 대한 저항성을 조사하였다. 결과를 표 4에 나타낸다. 표 4 중, 「Viroflay × TNKH-3 F1」의 란의 「저항성 개체」와 「이병성 개체」의 개체수란의 「P(Q)」(P와 Q는 모두 정수)는 P가 저항성 개체 또는 이병성 개체 중의 F1 개체의 개체수이며, Q가 저항성 개체 또는 이병성 개체 중의 Viroflay의 자식으로 얻어진 개체(셀프)의 개체수이다. 또한, 「nt」는 실험을 하지 않아 데이터가 없는 것을 의미한다. 나아가 「RPF3 계통」, 「RPF4 계통」 및 「Viroflay」의 계통 중의 각 레이스의 란에서 「-」은 저항성인 것을 의미하고 「+」은 이병성인 것을 의미한다. 또, 표 4 중에 기재된 RTM-1 유전자형 중 「RTM-1」은 스피나시아·테트란드라 유래의 저항성의 유전자형, 「rtm-1」은 Viroflay 유래의 이병성의 유전자형을 각각 의미한다. 따라서, 「RTM-1/RTM-1」은 저항성의 호모 접합형, 「rtm-1/rtm-1」은 이병성의 호모 접합형, 「RTM-1/rtm-1」은 저항성과 이병성의 헤테로 접합형을 각각 의미한다. 마찬가지로 RPF 유전자형 중 「rpfV」는 Viroflay 유래의 이병성의 유전자형을 의미한다.
시금치는 자웅이주의 작물이지만, 그 동일 개체에 암술과 수술 모두의 기관을 발생시키는 간성을 나타내는 계통도 존재한다. Viroflay를 종자친으로 한 F1 채종에서는 Viroflay의 자식 종자가 포함되어 버리는 경우가 있다. Viroflay의 자식 종자인지 F1 종자인지는 RPF3 마커 및 RPF4 마커를 이용하여 RPF 유전자형을 조사함으로써 판별할 수 있다.
Viroflay 계통과 TNKH-3 계통을 교잡하여 얻어진 F1 집단 중 이병성 개체였던 것에 대해 RPF 유전자형을 조사한 바, RPF3 유전자와 RPF4 유전자 모두 가지지 않았고(rpfV/rpfV), 이들 이병성 개체는 전부 Viroflay의 자식으로 얻어진 개체였던 것이 확인되었다. 즉, 표 4에 나타내는 바와 같이 Viroflay 계통과 TNKH-3 계통을 교잡하여 얻어진 F1 개체는 Pfs9 이외의 모든 레이스에 대해 저항성을 나타내고, 이병성 개체는 없었다. RPF3 유전자와 RPF4 유전자의 노균병 저항성으로부터 RTM-1 유전자는 적어도 Pfs6, Pfs7, Pfs10, Pfs13, Pfs17, 및 UA1014 균주가 나타내는 레이스에 대해 우성의 저항성을 부여할 수 있는 것을 알 수 있었다.
F1 집단에서는 RPF3/rpfV와 RPF4/rpfV가 대략 1:1로 분리한다. RPF3은 Pfs2, Pfs4 및 Pfs15에 이병성이며, RPF4는 Pfs5, Pfs8, Pfs11, Pfs12, Pfs14 및 Pfs16에 이병성인 것을오부터 RTM-1 유전자가 이들 레이스에 대해 저항성을 가지지 않는다고 가정하면 이들 레이스에 대해서는 저항성 개체:이병성 개체의 개체수가 기대치로서 1:1로 출현할 것이다. 그러나, 실제로는 모든 F1 개체가 이들 레이스에 대해 저항성이었다. 이로부터 RTM-1 유전자는 Pfs2, Pfs4, Pfs5, Pfs8, Pfs11, Pfs12, Pfs14, Pfs15 및 Pfs16에 대해서도 우성의 저항성을 부여할 수 있는 것이 명백하다.
[실시예 3]
Viroflay 계통을 종자친, 실시예 1에서 작출한 TNKH-1 계통을 화분친으로 하여 교잡을 수행하여 얻어진 F1 개체에 대해 Pfs2, Pfs4, Pfs10, Pfs15, Pfs17, Pfs18, 및 UA1014 균주가 나타내는 레이스를 이용한 접종 시험을 수행하고 이들에 대한 저항성을 조사하였다. 결과를 표 5에 나타낸다. 표 중, 「Viroflay × TNKH-1 F1」의 란의 「저항성 개체」와 「이병성 개체」의 개체수란의 「P(Q)」(P와 Q는 모두 정수)는 P가 저항성 개체 또는 이병성 개체 중의 F1 개체의 개체수이며, Q가 저항성 개체 또는 이병성 개체 중의 Viroflay의 자식으로 얻어진 개체(셀프)의 개체수이다. 또한, 「nt」는 실험을 하지 않아 데이터가 없는 것을 의미한다. 나아가 「RPF3」 및 「Viroflay」의 계통 중의 각 레이스의 란에서 「-」은 저항성인 것을 의미하고 「+」은 이병성인 것을 의미한다. 또, 표 5 중에 기재된 RTM-1 유전자형 중 「RTM-1」은 스피나시아·테트란드라 유래의 저항성의 유전자형, 「rtm-1」은 Viroflay 유래의 이병성의 유전자형을 각각 의미한다. 따라서, 「RTM-1/RTM-1」은 저항성의 호모 접합형, 「rtm-1/rtm-1」은 이병성의 호모 접합형, 「RTM-1/rtm-1」은 저항성과 이병성의 헤테로 접합형을 각각 의미한다. 마찬가지로 RPF 유전자형 중 「rpfV」는 Viroflay 유래의 이병성의 유전자형을 의미한다.
표 5에 나타내는 바와 같이, Viroflay 계통과 TNKH-1 계통을 교잡하여 얻어진 F1 개체는 Pfs2, Pfs4, Pfs10, Pfs15, Pfs17, Pfs18, 및 UA1014 균주가 나타내는 레이스에 대해 저항성을 나타내고, 이병성 개체는 없었다. RPF 유전자형을 조사한 결과, 이병성 개체는 모두 Viroflay의 자식으로 얻어진 개체였던 것이 확인되었다. RPF3 유전자의 노균병 저항성으로부터 RTM-1 유전자는 적어도 Pfs2, Pfs4, Pfs10, Pfs15, Pfs17, Pfs18, 및 UA1014 균주가 나타내는 레이스에 대해 우성의 저항성을 부여할 수 있는 것을 알 수 있었다.
[실시예 4]
Viroflay 계통을 종자친, 실시예 1에서 작출한 TNKH-2 계통을 화분친으로 하여 교잡을 수행하여 얻어진 F1 개체에 대해 Pfs5, Pfs8, Pfs9, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs14, Pfs16, Pfs17, Pfs18, Pfs19, 및 UA1014 균주가 나타내는 레이스를 이용한 접종 시험을 수행하고 이들에 대한 저항성을 조사하였다. 결과를 표 6에 나타낸다. 표 중, 「Viroflay × TNKH-2 F1」의 란의 「저항성 개체」와 「이병성 개체」의 개체수란의 「P(Q)」(P와 Q는 모두 정수)는 P가 저항성 개체 또는 이병성 개체 중의 F1 개체의 개체수이며, Q가 저항성 개체 또는 이병성 개체 중의 Viroflay의 자식으로 얻어진 개체(셀프)의 개체수이다. 또한, 「nt」는 실험을 하지 않아 데이터가 없는 것을 의미한다. 나아가 「RPF4」 및 「Viroflay」의 계통 중의 각 레이스의 란에서 「-」은 저항성인 것을 의미하고 「+」은 이병성인 것을 의미한다. 또, 표 6 중에 기재된 RTM-1 유전자형 중 「RTM-1」은 스피나시아·테트란드라 유래의 저항성의 유전자형, 「rtm-1」은 Viroflay 유래의 이병성의 유전자형을 각각 의미한다. 따라서, 「RTM-1/RTM-1」은 저항성의 호모 접합형, 「rtm-1/rtm-1」은 이병성의 호모 접합형, 「RTM-1/rtm-1」은 저항성과 이병성의 헤테로 접합형을 각각 의미한다. 마찬가지로 RPF 유전자형 중 「rpfV」는 Viroflay 유래의 이병성의 유전자형을 의미한다.
표 6에 나타내는 바와 같이, Viroflay 계통과 TNKH-2 계통을 교잡하여 얻어진 F1 개체는 Pfs5, Pfs8, Pfs9, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs14, Pfs16, Pfs17, Pfs18, Pfs19, 및 UA1014 균주가 나타내는 레이스에 대해 저항성을 나타내고, 이병성 개체는 없었다. RPF 유전자형을 조사한 결과, 이병성 개체는 모두 Viroflay의 자식으로 얻어진 개체였던 것이 확인되었다. RPF4 유전자의 노균병 저항성으로부터 RTM-1 유전자는 적어도 Pfs5, Pfs8, Pfs9, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs14, Pfs16, Pfs17, Pfs18, Pfs19, 및 UA1014 균주가 나타내는 레이스에 대해 우성의 저항성을 부여할 수 있는 것을 알 수 있었다.
[실시예 5]
Viroflay 계통을 종자친, 실시예 1에서 작출한 TNKH-1 계통을 화분친으로 하여 교잡하여 얻어진 F1 종자를 자식하여 F2 분리 집단을 제작하였다. 이 F2 집단에 대해 Pfs1, Pfs3, Pfs4, Pfs8, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs14, Pfs15, 및 UA1014 균주가 나타내는 레이스를 이용한 접종 시험을 수행하고 이들에 대한 저항성을 조사하였다. 결과를 표 7에 나타낸다. 표 중, 「nt」는 실험을 하지 않아 데이터가 없는 것을 의미한다. 나아가 「RPF3」 및 「Viroflay」의 계통 중의 각 레이스의 란에서 「-」은 저항성인 것을 의미하고 「+」은 이병성인 것을 의미한다. 또, 표 7 중에 기재된 RTM-1 유전자형 중 「RTM-1」은 스피나시아·테트란드라 유래의 저항성의 유전자형, 「rtm-1」은 Viroflay 유래의 이병성의 유전자형을 각각 의미한다. 따라서, 「RTM-1/RTM-1」은 저항성의 호모 접합형, 「rtm-1/rtm-1」은 이병성의 호모 접합형, 「RTM-1/rtm-1」은 저항성과 이병성의 헤테로 접합형을 각각 의미한다. 마찬가지로 RPF 유전자형 중 「rpfV」는 Viroflay 유래의 이병성의 유전자형을 의미한다.
표 7에 나타내는 바와 같이, TNKH-1 계통이 갖는 노균병 저항성은 RPF3 유전자가 이병성이 되는 Pfs4, Pfs10, Pfs15, 및 UA1014 균주가 나타내는 레이스에 대해 저항성 개체:이병성 개체가 3:1에 근사하여 분리하였다. 이 때문에, RTM-1 유전자는 단일 우성으로 상정되었다. 이러한 상정은 χ2승 검정(p>0.05)의 결과에 의해서도 지지되었다.
TNKH-1 계통이 갖는 노균병 저항성은 RPF3 유전자가 저항성을 나타내는 Pfs1, Pfs3, Pfs8, Pfs11, Pfs12, 및 Pfs14에 대해서는 저항성 개체:이병성 개체가 15:1에 근사하여 분리하였다. 이 때문에, RTM-1 유전자와 RPF3 유전자는 2인자 우성으로 상정되었다. 이러한 상정은 χ2승 검정(p>0.05)에 의해서도 지지되었다.
이들 결과로부터 RTM-1 유전자는 RPF 유전자의 대립유전자가 아니라 다른 염색체에 좌상하는 것, Pfs1, Pfs3, Pfs4, Pfs8, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs14, Pfs15, 및 UA1014 균주가 나타내는 레이스에 대해 단일 우성의 저항성을 부여할 수 있는 것이 명백해졌다.
[실시예 6]
RTM-1 유전자의 염색체의 좌상 영역을 특정하기 위한 유전 해석 및 유전자 마커 제작을 수행하였다.
우선, Viroflay 계통과 실시예 1에서 작출한 TNKH-1 계통을 교잡하여 얻은 F1을 자식하여 F2 분리 집단을 제작하였다.
얻어진 F2 분리 집단 330개체에 대해 UA1014 균주가 나타내는 레이스를 이용한 접종 시험을 수행하고, 이에 대한 저항성을 조사하였다. 이 결과, 저항성 개체가 234개체, 이병성 개체가 96개체이었다.
이들 개체의 유전 해석을 수행하여 저항성 개체에서는 저항성 호모형 또는 헤테로형이 되고 이병성 개체에서는 이병성 호모형이 되는 것과 같은 영역을 게놈 중에서 탐색하였다.
형질 조사를 수행한 개체를 연쇄 해석용 집단으로 하고, 각 개체로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 연쇄 해석용 집단의 DNA와 SpinachBase의 레퍼런스 게놈 상에 설계한 SNP 마커를 이용하여 제노타이핑을 수행하였다. 제노타이핑은 KASP 제노타이핑 어세이를 이용하여 수행하였다.
표 8 및 9에 각 SNP의 식별을 위한 KASP 제노타이핑 어세이에 이용하는 프라이머의 염기 서열을 나타낸다. 표 8, 9 중, 「A allele」는 TNKH-1형(스피나시아·테트란드라형)의 대립유전자, 「B allele」는 Viroflay형의 대립유전자를 각각 나타내고 있다. 각 SNP는 allele specific primer_1과 allele specific primer_2와 common primer의 3개의 프라이머 세트로 유전자형을 식별한다. allele specific primer_1과 allele specific primer_2의 서열에서 3'말단의 1염기가 식별 대상의 SNP와 하이브리다이즈하도록 설계되어 있다.
TNKH-1형 대립유전자를 갖는 식물 개체의 게놈 DNA를 주형으로 한 경우, allele specific primer_1과 common primer를 각각 포워드 프라이머와 리버스 프라이머로서 이용한 PCR에 의해 증폭 산물을 얻을 수 있다. Viroflay형 대립유전자를 갖는 식물 개체의 게놈 DNA를 주형으로 한 경우, allele specific primer_2와 common primer를 각각 포워드 프라이머와 리버스 프라이머로서 이용한 PCR에 의해 증폭 산물을 얻을 수 있다. 이 증폭 산물의 유무에 따라 SNP의 유전자형을 식별한다. 이와 같이 이들 3종류의 올리고 DNA를 1조의 프라이머 세트로서 이용하여 KASP 어세이를 수행함으로써 각 SNP의 유전자형을 식별할 수 있다.
예를 들면, TNKH-1 계통은 chr4_8510715로 특정되는 SNP의 유전자형이 G(구아닌)인 대립유전자를 호모로 가지며, Viroflay 계통은 chr4_8510715로 특정되는 SNP의 유전자형이 C(시토신)인 대립유전자를 호모로 가진다. 또한, TNKH-1 계통과 Viroflay 계통의 F1에서는 chr4_8510715로 특정되는 SNP의 유전자형은 G/C이며, 그 SNP가 G인 TNKH-1형 대립유전자와 C인 Viroflay형 대립유전자를 헤테로로 가진다.
또, 연쇄 해석에 사용한 KASP 마커는 RTM-1 유전자의 좌상 위치를 특정할 목적으로 사용된 것이며, 노균병 저항성을 갖는 시금치를 선발할 때의 DNA 마커로서 반드시 이들 KASP 마커를 이용할 필요는 없다. 예를 들면 chr4_7962907부터 chr4_8617232로 특정되는 시금치 게놈의 범위 내에 좌상하고 있는, 표 8 및 표 9에 기재된 SNP 이외의 DNA 다형이나, chr4_7962907부터 chr4_8617232에 좌상하는 유전자좌에 유래하는 노균병 저항성 형질에 대해 높은 관련성을 나타내는 DNA 다형 등을 노균병 저항성을 갖는 시금치를 선발할 때의 DNA 마커로서 이용할 수 있다.
피험 식물 개체로부터 추출한 게놈 DNA와 표 8 및 9에 기재된 KASP 마커를 이용함으로써 연쇄 해석 집단에서 간편하게 각 SNP의 유전자형을 조사할 수 있었다. KASP 마커에 의한 제노타이핑 데이터의 취득 후, 이어서 초고밀도 유전자 연쇄 지도 작성 소프트웨어 AntMAP Ver.1.1(http://lbm.ab.a.u-tokyo.ac.jp/~iwata/antmap/)(비특허문헌 5)을 이용한 연쇄 해석을 수행하였다. 또, 이러한 소프트웨어의 사용에서 Grouping의 Criterion을 Distance(cM) / Haldane / Threshold 5로 변경하고, 그 이외는 디폴트 설정으로 하였다.
표 10은 표 8 및 9에서 나타낸 KASP 마커를 이용한 제노타이핑의 결과를 기초로 RTM-1 유전자의 주변 영역에서 재조합을 일으킨 7개체(샘플 번호 112/143/322/294/53/232/6)의 유전자형을 발췌하여 표현형과 병기한 것이다. 표 중에서, 「A」는 TNKH-1형 대립유전자, 「B」는 Viroflay형 대립유전자인 것을 나타낸다. 예를 들면 「A/A」라고 기재되어 있는 경우 TNKH-1형 대립유전자를 호모로 가지고 있는 것을, 「B/B」라고 기재되어 있는 경우 Viroflay형 대립유전자를 호모로 가지고 있는 것을, 「A/B」라고 기재되어 있는 경우 TNKH-1형 대립유전자와 Viroflay형 대립유전자를 헤테로로 가지고 있는 것을 각각 나타내고 있다.
표 10에 나타내는 바와 같이, chr4_8488603, chr4_8494600, chr4_8510715의 SNP에서 유전자형이 B/B인 샘플 232와 샘플 6의 2개체는 표현형이 S(이병성)이며, 유전자형이 A/B인 샘플 112, 샘플 143, 샘플 322, 샘플 294 및 샘플 53은 표현형이 R(저항성)이기 때문에 이들 SNP는 표현형과 높은 상관이 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 연쇄 해석의 결과, SpinachBase의 레퍼런스 게놈 상에서 chr4_7962907부터 chr4_8617232의 범위 내에 노균병 저항성을 야기하는 RTM-1 유전자가 좌상하는 것이 명백해졌다. 또한, chr4_8488603, chr4_8494600 및 chr4_8510715의 SNP는 0cM의 유전 거리로 RTM-1 유전자와 연쇄되어 있었다(도 1).
스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01, TNKH-1 계통 및 TNKH-2 계통에 대해, RTM-1 유전자가 좌상하는 chr4_7962907부터 chr4_8617232의 범위 내에서 모든 염기 서열의 시퀀스 해석 데이터로부터 SNP의 탐색을 수행하였다. 이 결과, 표 8 및 표 9에 기재된 SNP 이외에 복수의 SNP가 확인되었다. 그 중에서 예를 들면 chr4_8500200, chr4_8502319, chr4_8502334 및 chr4_8502394의 4종의 SNP가 레퍼런스 게놈과는 달랐다. 구체적으로 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01, TNKH-1 계통 및 TNKH-2 계통에서는 chr4_8500200으로 특정되는 SNP는 티민이고, chr4_8502319로 특정되는 SNP는 시토신이며, chr4_8502334로 특정되는 SNP는 구아닌이고, 및 chr4_8502394로 특정되는 SNP는 구아닌이었다(표 1). 이들 4종의 SNP도 표 8 및 표 9에 기재된 SNP와 같이 TNKH-1형 대립유전자를 갖는 노균병 저항성의 식물 개체를 식별하기 위한 마커로서 사용할 수 있다.
International Patent Organism Depositary National Institute of Technology and Evaluation FERMBP-22404 20201225 International Patent Organism Depositary National Institute of Technology and Evaluation FERMBP-22405 20201225
SEQUENCE LISTING <110> Sakata Seed Corporation <120> SPINACH PLANT COMPRISING A NOVEL LOCUS FOR DOWNY MILDEW RESISTANCE <130> OSQ-11569 <160> 27 <210> 1 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized allele specific primer_1 for chr4_7421480. <400> 1 gaaggtgacc aagttcatgc tatccccggc tttcttatcc tg 42 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized allele specific primer_2 for chr4_7421480. <400> 2 gaaggtcgga gtcaacggat tatccccggc tttcttatcc tc 42 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized common primer for chr4_7421480. <400> 3 catgtgaagg aagggacacc a 21 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized allele specific primer_1 for chr4_7962907. <400> 4 gaaggtgacc aagttcatgc tatgctcgta tacgcaatgg c 41 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized allele specific primer_2 for chr4_7962907. <400> 5 gaaggtcgga gtcaacggat tcatgctcgt atacgcaatg gt 42 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized common primer for chr4_7962907. <400> 6 ccaattgacc agaattgtca cc 22 <210> 7 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized allele specific primer_1 for chr4_8152986. <400> 7 gaaggtgacc aagttcatgc tgggagcaac atttatgcaa gac 43 <210> 8 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized allele specific primer_2 for chr4_8152986. <400> 8 gaaggtcgga gtcaacggat tgggagcaac atttatgcaa gat 43 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized common primer for chr4_8152986. <400> 9 atgtatggtc tgacaacggc a 21 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized allele specific primer_1 for chr4_8190990. <400> 10 gaaggtgacc aagttcatgc tatcgggagg aaagctctaa cc 42 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized allele specific primer_2 for chr4_8190990. <400> 11 gaaggtcgga gtcaacggat tatcgggagg aaagctctaa ct 42 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized common primer for chr4_8190990. <400> 12 tgtgtaccca tattggccag a 21 <210> 13 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized allele specific primer_1 for chr4_8488603. <400> 13 gaaggtcgga gtcaacggat ttaatgggat ctgctgcctc g 41 <210> 14 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized allele specific primer_2 for chr4_8488603. <400> 14 gaaggtgacc aagttcatgc tctaatggga tctgctgcct ca 42 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized common primer for chr4_8488603. <400> 15 caaaggcttg acggtccagt a 21 <210> 16 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized allele specific primer_1 for chr4_8494600. <400> 16 gaaggtgacc aagttcatgc ttctcgcttg tcattgtcag ca 42 <210> 17 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized allele specific primer_2 for chr4_8494600. <400> 17 gaaggtcgga gtcaacggat tttcgcttgt cattgtcagc g 41 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized common primer for chr4_8494600. <400> 18 ctgtggagtc ggaagaacac a 21 <210> 19 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized allele specific primer_1 for chr4_8510715. <400> 19 gaaggtgacc aagttcatgc tctggtccat actcatactc aggg 44 <210> 20 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized allele specific primer_2 for chr4_8510715. <400> 20 gaaggtcgga gtcaacggat tctggtccat actcatactc aggc 44 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized common primer for chr4_8510715. <400> 21 agctaattct gagccaaggc c 21 <210> 22 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized allele specific primer_1 for chr4_8617232. <400> 22 gaaggtcgga gtcaacggat ttgagacagc gggataaaga gtaag 45 <210> 23 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized allele specific primer_2 for chr4_8617232. <400> 23 gaaggtgacc aagttcatgc ttgagacagc gggataaaga gtaaa 45 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized common primer for chr4_8617232. <400> 24 tcagttcgac aagctgccta g 21 <210> 25 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized allele specific primer_1 for chr4_10710358. <400> 25 gaaggtcgga gtcaacggat tcgagttgat cacctcgtcg 40 <210> 26 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized allele specific primer_2 for chr4_10710358. <400> 26 gaaggtgacc aagttcatgc tcgagttgat cacctcgtcc 40 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized common primer for chr4_10710358. <400> 27 tgtacccagt tgtcgagcc 19

Claims (24)

  1. 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01의 제4 염색체에 존재하는 노균병 저항성 RTM-1 유전자를 가지고 있는 시금치 식물인(단, 스피나시아·테트란드라를 제외함) 노균병 저항성 시금치 식물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 RTM-1 유전자가 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01의 제4 염색체 상의 chr4_7962907부터 chr4_8617232까지의 범위 내에 존재하고 있는 유전자인 노균병 저항성 시금치 식물.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    제4 염색체의 적어도 한쪽의 대립유전자에 스피나시아·테트란드라 계통 CGN25466:MGK 01의 제4 염색체 상의 chr4_8488603부터 chr4_8510715까지의 범위를 포함한 단편을 함유하고 있는, 노균병 저항성 시금치 식물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 RTM-1 유전자가 호모 접합성 또는 헤테로 접합성인 노균병 저항성 시금치 식물.
  5. 청구항 1에 있어서, 적어도 노균병의 레이스 Pfs1, Pfs2, Pfs3, Pfs4, Pfs5, Pfs6, Pfs7, Pfs8, Pfs9, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs13, Pfs14, Pfs15, Pfs16, Pfs17, Pfs18, Pfs19, 및 UA1014 균주가 나타내는 레이스에 저항성인 노균병 저항성 시금치 식물.
  6. 청구항 1에 있어서, 제4 염색체의 적어도 한쪽의 대립유전자에서
    chr4_8488603으로 특정되는 SNP가 시토신이거나,
    chr4_8494600으로 특정되는 SNP가 티민이거나, 또는
    chr4_8510715로 특정되는 SNP가 구아닌인 노균병 저항성 시금치 식물.
  7. 청구항 1에 있어서, 제4 염색체의 적어도 한쪽의 대립유전자에서
    chr4_7962907로 특정되는 SNP가 구아닌이거나,
    chr4_8152986으로 특정되는 SNP가 시토신이거나,
    chr4_8190990으로 특정되는 SNP가 구아닌이거나,
    chr4_8488603으로 특정되는 SNP가 시토신이거나,
    chr4_8494600으로 특정되는 SNP가 티민이거나,
    chr4_8510715로 특정되는 SNP가 구아닌이거나, 또는
    chr4_8617232로 특정되는 SNP가 구아닌인 노균병 저항성 시금치 식물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 노균병 저항성 시금치 식물이 스피나시아·테트란드라와 재배종 시금치의 종간 잡종 식물에 유래하는 것인 노균병 저항성 시금치 식물.
  9. 청구항 1에 있어서, 수탁번호 FERM BP-22404(TNKH-1 계통)로 특정되는 식물 유래의 노균병 저항성을 갖는 노균병 저항성 시금치 식물.
  10. 청구항 1에 있어서, 수탁번호 FERM BP-22405(TNKH-2 계통)로 특정되는 식물 유래의 노균병 저항성을 갖는 노균병 저항성 시금치 식물.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 RTM-1 유전자 이외의 노균병 저항성 유전자를 적어도 1종 이상 갖는 노균병 저항성 시금치 식물.
  12. 수탁번호 FERM BP-22404(TNKH-1 계통)로 특정되는 노균병 저항성 시금치 식물, 상기 노균병 저항성 시금치 식물을 친계통으로 하여 얻어진 잡종 식물, 또는 이들의 후대인 노균병 저항성 시금치 식물.
  13. 수탁번호 FERM BP-22405(TNKH-2 계통)로 특정되는 노균병 저항성 시금치 식물, 상기 노균병 저항성 시금치 식물을 친계통으로 하여 얻어진 잡종 식물, 또는 이들의 후대인 노균병 저항성 시금치 식물.
  14. 피험 시금치 식물의 제4 염색체의 chr4_8488603 ~ chr4_8510715의 SNP의 유전자형을 조사하여 적어도 한쪽의 대립유전자에서
    chr4_8488603으로 특정되는 SNP가 시토신이거나,
    chr4_8494600으로 특정되는 SNP가 티민이거나, 또는
    chr4_8510715로 특정되는 SNP가 구아닌인 경우에
    그 피험 시금치 식물이 노균병 저항성일 가능성이 높다고 예측하는 시금치 식물의 노균병 저항성의 예측 방법.
  15. 피험 시금치 식물의 제4 염색체의 chr4_8488603 ~ chr4_8510715의 SNP의 유전자형을 조사하여 적어도 한쪽의 대립유전자에서
    chr4_8488603으로 특정되는 SNP가 시토신이거나,
    chr4_8494600으로 특정되는 SNP가 티민이거나, 또는
    chr4_8510715로 특정되는 SNP가 구아닌인 경우에
    그 피험 시금치 식물을 노균병 저항성 시금치 식물로서 선발하는 노균병 저항성 시금치 식물의 스크리닝 방법.
  16. RTM-1 유전자를 갖는 시금치 식물과 임의의 시금치 식물을 교잡하는 제1 교잡 공정과,
    상기 제1 교잡 공정에 의해 얻어진 F1 개체에 대해 자식, 여교잡(back cross), 또는 상기 제1 교잡 공정에서 이용한 친계통과는 다른 시금치 식물과의 종간 교잡 또는 종내 교잡을 수행하여 분리 집단을 얻는 제2 교잡 공정과,
    상기 분리 집단으로부터 RTM-1 유전자를 갖는 시금치 식물을 선발하는 선발 공정을 갖는 노균병 저항성 시금치 식물의 제조 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 RTM-1 유전자를 갖는 시금치 식물이 스피나시아·테트란드라 또는 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 기재된 노균병 저항성 시금치 식물인 노균병 저항성 시금치 식물의 제조 방법.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 임의의 시금치 식물, 또는 상기 제2 교잡 공정에서의 종간 교잡 또는 종내 교잡에서 이용하는 친계통이 상기 RTM-1 유전자 이외의 노균병 저항성 유전자를 적어도 1종 이상 갖는 시금치 식물인 노균병 저항성 시금치 식물의 제조 방법.
  19. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 기재된 노균병 저항성 시금치 식물의 식물체의 일부.
  20. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 기재된 노균병 저항성 시금치 식물의 잎.
  21. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 기재된 노균병 저항성 시금치 식물의 종자.
  22. 시금치 식물의 chr4_8488603으로 특정되는 SNP, chr4_8494600으로 특정되는 SNP, chr4_8510715로 특정되는 SNP, 및 이들 SNP와 유전적으로 강하게 연쇄되어 있는 SNP로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상으로 이루어진, RTM-1 유전자를 갖는 시금치 식물을 선발하기 위한 DNA 마커.
  23. chr4_8488603으로 특정되는 SNP의 유전자형을 식별하기 위한 프라이머 세트,
    chr4_8494600으로 특정되는 SNP의 유전자형을 식별하기 위한 프라이머 세트, 및
    chr4_8510715로 특정되는 SNP의 유전자형을 식별하기 위한 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하고,
    RTM-1 유전자를 갖는 시금치 식물을 선발하기 위해 이용되는 키트.
  24. 청구항 23에 있어서,
    상기 chr4_8488603으로 특정되는 SNP의 유전자형을 식별하기 위한 프라이머 세트가 서열번호 13으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 14로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머, 및 서열번호 15로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머로 이루어지고,
    상기 chr4_8494600으로 특정되는 SNP의 유전자형을 식별하기 위한 프라이머 세트가 서열번호 16으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 17로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머, 및 서열번호 18로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머로 이루어지고,
    상기 chr4_8510715로 특정되는 SNP의 유전자형을 식별하기 위한 프라이머 세트가 서열번호 19로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 20으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머, 및 서열번호 21로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머로 이루어진, 키트.
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