CN117615647A - 具有新型霜霉病抗性基因的菠菜植物 - Google Patents

具有新型霜霉病抗性基因的菠菜植物 Download PDF

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Abstract

本发明为一种霜霉病抗性菠菜植物，其具有存在于四蕊菠菜品系CGN25466:MGK 01的4号染色体上的霜霉病抗性RTM‑1基因；以上记载的霜霉病抗性菠菜植物，其中，所述RTM‑1基因为存在于四蕊菠菜品系CGN25466:MGK 01的4号染色体上的chr4_7962907至chr4_8617232的范围内的基因；所述任一项的霜霉病抗性菠菜植物，其至少对霜霉病的小种Pfs1、Pfs2、Pfs3、Pfs4、Pfs5、Pfs6、Pfs7、Pfs8、Pfs9、Pfs10、Pfs11、Pfs12、Pfs13、Pfs14、Pfs15、Pfs16、Pfs17、Pfs18、Pfs19和UA1014菌株所表现的小种具有抗性。

Description

具有新型霜霉病抗性基因的菠菜植物
技术领域
本发明涉及一种具有对霜霉病的大范围的小种显示抗性的基因的菠菜植物及其制造方法。
本申请要求2021年5月12日在日本提交申请的特愿2021-080911号优先权，本文引用其内容。
背景技术
菠菜(Spinacia oleracea L.)是苋科菠菜属的一年生草本植物或多年生草本植物，原产于亚洲西部并广泛栽培，被认为于江户时代自中国传入日本。菠菜主要食用基生叶(莲座状(ロゼット状))，维生素类或铁、钙成分的含量在蔬菜中也是特别高的，营养价值极高。近年来，由于其营养素和简便性方面，嫩叶的市场在世界范围内迅速扩大。从而，菠菜被定位为重要蔬菜之一。
通常，植物品种有常规种和杂种第一代(以下，称为“F1”)品种，主要作物中普及F1品种。F1品种由于杂种优势(ヘテロシス)而生长旺盛。由此，F1品种具有生长快、产量能力提高等巨大的优势，进一步，亦能够期待抗病虫害的能力、耐寒性/耐暑性等适应环境的能力提高。另外，由于F1品种为杂合的且为相同的基因型，因而表型显示出极高的均一性。因此，农产品的可销售性提高。进一步，F1品种的双亲能够积累显性基因所支配的有用性状，因此能够进行快速的育种。由于具有如上所述的优势，使得F1品种在主要作物中占据了栽培品种的主流。被视为可食用的菠菜在二十世纪六十年代以前一直以常规种为中心，而在二十世纪七十年代以后迅速推进F1化，目前大部分为F1品种。
另一方面，使菠菜受损害的病害之一有由作为丝状菌的菠菜霜霉分化型病菌(Peronospora farinosa f.sp.spinaciae，Pfs)引起的霜霉病。霜霉病是最主要的病害，一旦发生则危害便会迅速扩大，使产量、品质蒙受非常严重的损害。作为霜霉病的对策，也尝试了耕种性的病原菌的防治或者使用农药等的化学性病原菌的防治，但从对于环境的影响、栽培劳动力或成本等方面出发，使用抗性品种是最有效的方法。
霜霉病因小种分化快而为人所知，侵袭抗性品种的新的小种不断出现，迄今为止也确认了很多被认为具有抗性的品种发病的事例。菠菜霜霉病国际工作组(IWGP)为由接受美国的阿肯色大学以及加利福尼亚大学的支援的种苗公司、和荷兰的荷兰园艺检验局(Naktuinbouw)组成的联合团体，监视新型的霜霉病的小种的出现与扩散，并决定正式的命名。自1824年报告了最初的霜霉病的出现以后，迄今为止已经命名了十九个小种(非专利文献1)。
为了应对新的小种的连续出现，在菠菜的育种方面，新型抗性材料的搜索是非常重要的。不仅是在栽培种方面，在野生种方面也进行对霜霉病具有抗性的遗传材料的搜索。例如，已由荷兰遗传资源中心(CGN)于2008年对野生种菠菜的突厥菠菜(Spinaciaturkestanica)、于2011年对野生种菠菜的四蕊菠菜(Spinacia tetrandra)进行了对霜霉病的抗性遗传材料的搜索。另外，Correll等人于2011年发表了六种被称为RPF的基因控制已知的霜霉病抗性的文章(非专利文献2)。进一步，作为霜霉病抗性基因，已报告有RPF1～RPF10、RPF11(专利文献1)、RPF12(专利文献2)、RPF13(专利文献3)、RPF14(专利文献4)、RPF15(专利文献5)、R6(专利文献6)、R15(专利文献7)等。通过将来源于野生种菠菜的霜霉病抗性基因导入至栽培种菠菜的波斯菠菜(Spinacia oleracea L.)中，能够培育霜霉病抗性高的菠菜(专利文献8)。
RPF基因为位于被称为RPF基因座的一个基因座上的多个等位基因、或者紧密连锁的多个基因，在F1品种中，通过具有两个等位基因而显示出广泛的抗性(非专利文献3、专利文献5)。例如，RPF1基因、RPF2基因以及RPF3基因位于3号染色体上(非专利文献3)、RPF15基因也位于3号染色体上(专利文献5)。另外，专利文献8中所记载的霜霉病抗性基因虽然被认为位于连锁群6上，但据序列信息显示，其实际上位于3号染色体上(专利文献5)。
在霜霉病抗性基因座中，根据其结构，大致分为alpha WOLF基因以及beta WOLF基因的一个或者两个WOLF基因邻接存在(专利文献9)。alpha WOLF基因以及beta WOLF基因包含赋予各自特定的抗性谱的多个等位基因，并且其各自的WOLF基因的LRR结构域序列以及各自的基因型对霜霉病小种的抗性模式已被公开。理论上，通过具有不同的抗性模式的WOLF基因的组合，能够设计期望的抗性模式。但是，在现有的杂交育种中，实际上不可能将非常紧密地连锁的基因进行任意组合。因此，迄今为止，一直将RPF基因归总为一个基因进行操作。
除此之外，通过转化自外部导入霜霉病抗性基因(GMO)、或者修饰内源性基因(基因编辑)，也能够制作赋予期望的抗性模式的突变体。但是，存在的问题是：通过GMO或者基因修饰培育的作物尚未被大众广泛接受。
已报告霜霉病抗性基因p10位于1号染色体上，并且对Pfs1、Pfs2、Pfs3、Pfs4、Pfs5、Pfs6、Pfs7、Pfs8、Pfs9、Pfs10、Pfs11、Pfs12、Pfs13、Pfs14、Pfs15和Pfs16显示抗性。但是，由p10基因赋予的抗性仅在为纯合时表达，并且其抗性程度为中等(专利文献10)。因此，推测使用p10基因的抗性品种育成不仅比使用显性的抗性基因的育成困难，而且耐性的程度在实用方面也称不上充分。另外，已报告四蕊菠菜品系CGN25474：MGK 18：RNR120251(以下为CGN25474：MGK 18)在4号染色体中具有霜霉病抗性基因，对Pfs4、Pfs7、Pfs9、Pfs10、Pfs11、Pfs12、Pfs13、Pfs14、Pfs15、Pfs16和Pfs17显示抗性(专利文献11)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利第10258001号说明书
专利文献2：美国专利第10258002号说明书
专利文献3：国际公开第2015/036378号
专利文献4：国际公开第2019/145446号
专利文献5：国际公开第2019/145447号
专利文献6：专利第6457269号公报
专利文献7：美国专利第9974276号说明书
专利文献8：专利第6684207号公报
专利文献9：国际公开第2018/059651号
专利文献10：美国专利申请公开第2019/0104700号说明书
专利文献11：国际公开第2020/239215号
非专利文献
非专利文献1：Ribera等，Euphytica，2020,216:48。
非专利文献2：Correll等，European Journal of Plant Pathology，2011，第129卷，第193-205页。
非专利文献3：Feng等，Euphytica，2018，214：174。
非专利文献4：International Seed Federation，“Differential SetsPeronospora farinosa f.sp.spinaciae(P.effusa)”，2021，<网页>http://worldseed.org/wp-content/uploads/2021/11/20210608_DRTWG_Peronospora-effusa.pdf
非专利文献5：Iwata and Ninomiya，Breeding Science，2006，第56(4)卷，第371-377页。
发明内容
发明要解决的技术问题
现存的霜霉病抗性品系主要利用的是3号染色体上的RPF基因。另一方面，一般情况下，在菠菜的育种中，F1品种的亲本需要在遗传学上高度固定。其结果是，一个亲本在相同或者非常接近的部位仅可以具有一个抗性基因。也就是说，使不同的亲本彼此之间杂交得到的F1品种在3号染色体上的相同或者非常接近的部位仅可以具有两种RPF基因。由于没有已知的对已命名的所有小种显示抗性的RPF基因，因此，为了培育对广泛的小种显示抗性的F1品种，必须使具有彼此抗性互补的组合RPF基因的品种彼此杂交。这一点是亲本选定方面较大的限制因素。
例如，如果能够利用存在于3号染色体以外的染色体上的抗性基因的话，则在积累霜霉病抗性基因方面能够预见较大的效果。此外，如果该存在于3号染色体以外的抗性基因具有多态性的话，则进一步地，能够促进霜霉病抗性基因的多样化，并且能够抑制霜霉病的新小种产生。
因此，鉴于如上所述的现有的霜霉病抗性品系以及F1品种的问题点，本发明提供一种新型的霜霉病抗性基因，其不存在于3号染色体上，相较于已知的抗性基因对更为广泛的小种显示抗性，进一步，与已报告的4号染色体上的抗性基因不同。也就是说，本发明的目的在于提供一种具有对广泛的小种显示抗性的新型霜霉病抗性基因的菠菜植物、制造该菠菜植物的方法、利用由于该基因而被赋予霜霉病抗性的品系的菠菜的F1植物及其种子的制造方法等。
用于解决技术问题的技术手段
本申请发明人们为了解决上述问题进行了研究，结果发现：在四蕊菠菜品系CGN25466:MGK 01：RNR120234(以下称为CGN25466:MGK 01)的4号染色体上存在对广泛的小种显示抗性的显性霜霉病抗性基因。进一步发现：通过进行具有该霜霉病抗性基因的野生种菠菜与栽培种菠菜的种间杂交获得具有霜霉病抗性的F1个体，对该F1个体进一步重复进行与栽培种菠菜的杂交，由此能够育成具备该霜霉病抗性基因带来的霜霉病抗性以及接近栽培种的性状的菠菜植物，从而完成了本发明。
也就是说，本发明如下所述。
[1]一种霜霉病抗性菠菜植物，其为具有位于四蕊菠菜品系CGN25466:MGK 01的4号染色体上的霜霉病抗性RTM-1基因的菠菜植物，其中，四蕊菠菜除外。
[2]所述[1]的霜霉病抗性菠菜植物，其中，所述RTM-1基因为存在于四蕊菠菜品系CGN25466:MGK 01的4号染色体上的chr4_7962907至chr4_8617232的范围内的基因。
[3]所述[1]或[2]的霜霉病抗性菠菜植物，其中，在4号染色体的至少一个等位基因中，含有包含四蕊菠菜品系CGN25466:MGK 01的4号染色体上的chr4_8488603至chr4_8510715的范围的片段。
[4]所述[1]至[3]中任一项的霜霉病抗性菠菜植物，其中，所述RTM-1基因为纯合的或者杂合的。
[5]所述[1]至[4]中任一项的霜霉病抗性菠菜植物，其至少对霜霉病的小种Pfs1、Pfs2、Pfs3、Pfs4、Pfs5、Pfs6、Pfs7、Pfs8、Pfs9、Pfs10、Pfs11、Pfs12、Pfs13、Pfs14、Pfs15、Pfs16、Pfs17、Pfs18、Pfs19和UA1014菌株所表现的小种具有抗性。
[6]所述[1]至[5]中任一项的霜霉病抗性菠菜植物，其中，在4号染色体的至少一个等位基因中，
在chr4_8488603上鉴定的SNP是胞嘧啶，
在chr4_8494600上鉴定的SNP是胸腺嘧啶，或者
在chr4_8510715上鉴定的SNP是鸟嘌呤。
[7]所述[1]至[5]中任一项的霜霉病抗性菠菜植物，其中，在4号染色体的至少一个等位基因中，
在chr4_7962907上鉴定的SNP是鸟嘌呤，
在chr4_8152986上鉴定的SNP是胞嘧啶，
在chr4_8190990上鉴定的SNP是鸟嘌呤，
在chr4_8488603上鉴定的SNP是胞嘧啶，
在chr4_8494600上鉴定的SNP是胸腺嘧啶，
在chr4_8510715上鉴定的SNP是鸟嘌呤，或者
在chr4_8617232上鉴定的SNP是鸟嘌呤。
[8]所述[1]至[7]中任一项的霜霉病抗性菠菜植物，其中，所述霜霉病抗性菠菜植物来源于四蕊菠菜和栽培种菠菜的种间杂种植物。
[9]所述[1]至[8]中任一项的霜霉病抗性菠菜植物，其具有来源于保藏号FERMBP-22404(TNKH-1品系)限定的植物的霜霉病抗性。
[10]所述[1]至[8]中任一项的霜霉病抗性菠菜植物，其具有来源于保藏号FERMBP-22405(TNKH-2品系)限定的植物的霜霉病抗性。
[11]所述[1]至[10]中任一项的霜霉病抗性菠菜植物，其具有至少一种以上的所述RTM-1基因以外的霜霉病抗性基因。
[12]一种霜霉病抗性菠菜植物，其为保藏号FERM BP-22404(TNKH-1品系)限定的霜霉病抗性菠菜植物、以所述霜霉病抗性菠菜植物为亲本获得的杂种植物、或其后代。
[13]一种霜霉病抗性菠菜植物，其为保藏号FERM BP-22405(TNKH-2品系)限定的霜霉病抗性菠菜植物、以所述霜霉病抗性菠菜植物为亲本获得的杂种植物、或其后代。
[14]一种菠菜植物的霜霉病抗性的预测方法，其中，调查受验菠菜植物的4号染色体的chr4_8488603至chr4_8510715的SNP的基因型，在至少一个等位基因中，
在chr4_8488603上鉴定的SNP是胞嘧啶，
在chr4_8494600上鉴定的SNP是胸腺嘧啶，或者
在chr4_8510715上鉴定的SNP是鸟嘌呤的情况下，
预测所述受验菠菜植物具有霜霉病抗性的可能性高。
[15]一种霜霉病抗性菠菜植物的筛选方法，其中，调查受验菠菜植物的4号染色体的chr4_8488603至chr4_8510715的SNP的基因型，在至少一个等位基因中，
在chr4_8488603上鉴定的SNP是胞嘧啶，
在chr4_8494600上鉴定的SNP是胸腺嘧啶，或者
在chr4_8510715上鉴定的SNP是鸟嘌呤的情况下，
选择该受验菠菜植物作为霜霉病抗性菠菜植物。
[16]一种霜霉病抗性菠菜植物的制造方法，其具有以下步骤：
第一杂交步骤，将具有RTM-1基因的菠菜植物和任意的菠菜植物进行杂交；
第二杂交步骤，针对通过所述第一杂交步骤获得的F1个体，进行自交、回交或者与不同于所述第一杂交步骤中使用的亲本的菠菜植物进行种间杂交或者种内杂交，获得分离族群；以及
选择步骤，从所述分离族群中选择具有RTM-1基因的菠菜植物。
[17]所述[16]的霜霉病抗性菠菜植物的制造方法，其中，所述具有RTM-1基因的菠菜植物为四蕊菠菜或者所述[1]至[13]中任一项的霜霉病抗性菠菜植物。
[18]所述[16]或[17]的霜霉病抗性菠菜植物的制造方法，其中，所述任意的菠菜植物、或者所述第二杂交步骤中的种间杂交或者种内杂交所使用的亲本为具有至少一种以上的所述RTM-1基因以外的霜霉病抗性基因的菠菜植物。
[19]所述[1]至[13]中任一项的霜霉病抗性菠菜植物的植物体的一部分。
[20]所述[1]至[13]中任一项的霜霉病抗性菠菜植物的叶。
[21]所述[1]至[13]中任一项的霜霉病抗性菠菜植物的种子。
[22]一种用于选择具有RTM-1基因的菠菜植物的DNA标志物，其由选自由菠菜植物的chr4_8488603上鉴定的SNP、chr4_8494600上鉴定的SNP、chr4_8510715上鉴定的SNP以及与这些SNP在遗传上强烈连锁的SNP所组成的组中的一种以上构成。
[23]一种用于选择具有RTM-1基因的菠菜植物的试剂盒，其包括选自由以下引物组所组成的组中的一种以上的引物组：
用于识别菠菜植物的chr4_8488603上鉴定的SNP的基因型的引物组，
用于识别chr4_8494600上鉴定的SNP的基因型的引物组，以及
用于识别chr4_8510715上鉴定的SNP的基因型的引物组。
[24]所述[23]的试剂盒，其中，
所述用于识别在chr4_8488603上鉴定的SNP的基因型的引物组由以下引物组成：由序列号13所表示的碱基序列构成的引物、由序列号14所表示的碱基序列构成的引物、以及由序列号15所表示的碱基序列构成的引物；
所述用于识别在chr4_8494600上鉴定的SNP的基因型的引物组由以下引物组成：由序列号16所表示的碱基序列构成的引物、由序列号17所表示的碱基序列构成的引物、以及由序列号18所表示的碱基序列构成的引物；
所述用于识别在chr4_8510715上鉴定的SNP的基因型的引物组由以下引物组成：由序列号19所表示的碱基序列构成的引物、由序列号20所表示的碱基序列构成的引物、以及由序列号21所表示的碱基序列构成的引物。
发明的效果
根据本发明，提供一种对广泛的小种显示抗性的霜霉病抗性菠菜植物。
另外，通过将本发明所涉及的菠菜植物作为亲本，能够育成对广泛的小种显示抗性的新型菠菜品系。
附图说明
[图1]在实施例6中，菠菜的4号染色体的RTM-1基因座附近的连锁图谱。
具体实施方式
在本发明以及本申请说明书中，菠菜植物为被分类为菠菜属(Spinacia)的植物。作为野生种菠菜，有四蕊菠菜(スピナシア·テトランドラ)、突厥菠菜(スピナシア·トルケスタニカ)等。另外，作为栽培种菠菜，可以举出波斯菠菜(Spinacia oleracea L.)。此外，在本发明以及本申请说明书中，所谓的“栽培种”为供于栽培的品系的植物，不仅包含常规种，也包含F1品种。
在本发明以及本申请说明书中，所谓的“霜霉病”是指属于霜霉科(Peronosporaceae)的菌引起的病害。菠菜霜霉病的主要病原菌为Pfs(菠菜霜霉分化型病菌)，目前编号为Pfs1～Pfs19。除此之外也有很多如UA1014菌株的病原性所表现的小种那样未被编号的小种。
在本发明以及本申请说明书中，菠菜植物的“chrX_Y”(X和Y为整数)是指，该菠菜植物的基因组中“相当于SpinachBase(http://spinachbase.org/)中公开的参考基因组(菠菜基因组序列(V1))中的染色体编号X(也称为X号染色体)的第Y个碱基的碱基”。此外，所谓的某菠菜植物中的“相当于SpinachBase的参考基因组上的X号染色体的第Y个碱基的碱基”，可以通过将该菠菜植物的基因组DNA的碱基序列与SpinachBase的参考基因组的碱基序列以同源性(序列同一性)达到最高的方式进行比对而决定。
由此，某菠菜植物的X号染色体能够表示为通过将该菠菜植物的基因组DNA的碱基序列与SpinachBase的参考基因组的碱基序列以同源性(序列同一性)达到最高的方式进行比对而决定的菠菜植物的X号染色体。
在本发明以及本申请说明书中，“染色体”不仅包括整个染色体，还包括其一部分。也就是说，“染色体的一部分”也可以简称为“染色体”。
“X基因座”为“染色体中的X基因所占据的部位”。因此，在本发明以及本申请说明书中，所谓的“具有X基因座的菠菜植物”为在染色体中具有X基因所占据的部位的菠菜植物，与“具有X基因的菠菜植物”意思相同。
此外，在本发明以及本申请说明书中，“制造方法”也可以替换为“选育方法”、“育成方法”或者“生产方法”。也就是说，此处的术语“制造”、“选育”、“育成”和“生产”以相同的意思使用。
在本发明以及本申请说明书中，所谓的“植物体的一部分”包括该植物体的细胞或者组织，具体而言，可举出叶、种子、花、茎、根、果实等。此外，还包括从该植物体的细胞中获得的原生质体。
<霜霉病抗性菠菜植物>
本发明所涉及的霜霉病抗性菠菜植物为具有RTM-1基因的四蕊菠菜以外的菠菜植物，所述RTM-1基因是位于作为野生种菠菜的四蕊菠菜品系CGN25466:MGK 01的4号染色体上的霜霉病抗性基因。RTM-1基因为存在于四蕊菠菜品系CGN25466:MGK 01的4号染色体的chr4_7962907至chr4_8617232的范围内的基因。
RTM-1基因至少对霜霉病的小种Pfs1、Pfs2、Pfs3、Pfs4、Pfs5、Pfs6、Pfs7、Pfs8、Pfs9、Pfs10、Pfs11、Pfs12、Pfs13、Pfs14、Pfs15、Pfs16、Pfs17、Pfs18、Pfs19和UA1014菌株所表现的小种赋予抗性。也就是说，所谓的“来源于RTM-1基因的霜霉病抗性”，意指至少对霜霉病的小种Pfs1、Pfs2、Pfs3、Pfs4、Pfs5、Pfs6、Pfs7、Pfs8、Pfs9、Pfs10、Pfs11、Pfs12、Pfs13、Pfs14、Pfs15、Pfs16、Pfs17、Pfs18、Pfs19和UA1014菌株所表现的小种具有抗性。由于能够以单一基因来对如此广泛的小种赋予抗性，因此，RTM-1基因为前所未有的非常优异的霜霉病抗性基因。
RTM-1基因为显性遗传给后代的基因。因此，本发明所涉及的菠菜植物既可以是RTM-1基因为纯合的(也就是说具有纯合的RTM-1基因)的菠菜植物，也可以是具有杂合的RTM-1基因的菠菜植物。本发明所涉及的菠菜植物由于具有RTM-1基因(其为单独对非常广泛的霜霉病小种赋予耐性的单显性的霜霉病抗性基因)，因此作为霜霉病抗性菠菜非常优异。
本发明所涉及的霜霉病抗性菠菜植物可以通过向四蕊菠菜以外的菠菜植物的基因组DNA导入RTM-1基因而培育。向基因组DNA导入RTM-1基因例如可以通过导入染色体片段来进行，所述染色体片段包含四蕊菠菜品系CGN25466:MGK 01的4号染色体中的RTM-1基因所在的部位(RTM-1基因座)。导入包含RTM-1基因座的染色体片段的染色体中的部位并无特别限定，也可以是染色体外。例如，在本发明所涉及的霜霉病抗性菠菜植物中，包含下述菠菜植物：通过包含RTM-1基因座的染色体片段置换相当于4号染色体中的该片段的区域的菠菜植物、或者通过易位等在相当于四蕊菠菜的4号染色体中的RTM-1基因座的区域以外导入包含RTM-1基因座的染色体片段的菠菜植物。
作为包含RTM-1基因座的染色体片段，既可以是包含四蕊菠菜品系CGN25466:MGK01的4号染色体中chr4_7962907至chr4_8617232的全部区域的片段，也可以是chr4_7962907至chr4_8617232的区域中的包括RTM-1基因座的部分的片段。作为包含RTM-1基因座的部分的片段，优选的是包含四蕊菠菜品系CGN25466:MGK 01的4号染色体中chr4_8488603至chr4_8510715的区域的片段。作为该片段，优选包含chr4_7962907至chr4_8617232的区域中的chr4_8488603至chr4_8510715的区域的染色体片段。也就是说，作为本发明所涉及的霜霉病抗性菠菜植物，优选的是4号染色体的至少一个等位基因含有包含四蕊菠菜品系CGN25466:MGK 01的4号染色体上的chr4_8488603至chr4_8510715的范围的片段的菠菜植物。另外，作为包含RTM-1基因座的染色体片段，也可以是包含四蕊菠菜品系CGN25466:MGK 01的4号染色体中chr4_7962907至chr4_8617232的区域的染色体片段、或者包含chr4_7421480至chr4_10710358的区域的染色体片段。
将RTM-1基因导入基因组DNA中可以通过将四蕊菠菜用作亲本的杂交育种方法、或基因组编辑方法等基因修饰方法等来进行。
例如，本发明所涉及的霜霉病抗性菠菜植物是四蕊菠菜和四蕊菠菜以外的菠菜植物的种间杂种植物，来源于具有来源于RTM-1基因的霜霉病抗性的植物。此外，在“种间杂种植物”中，除了通过属于菠菜属的种中的异种间的杂交获得的植物以外，还包括由菠菜属植物的异种间的细胞融合获得的体细胞杂种植物、或通过菠菜属植物的异种间的嫁接获得的嫁接杂种植物。另外，在“四蕊菠菜与四蕊菠菜以外的菠菜植物的种间杂种植物”中，除了该种间杂种植物之外，还包括该种间杂种植物的后代。
在本发明以及本申请说明书中，所谓的“菠菜植物的后代”，除了通过该菠菜植物的种内杂交获得的后代以外，还包括以该菠菜植物为亲本获得的个体及其后代、该菠菜植物的细胞与其他品种的植物细胞进行细胞融合获得的体细胞杂种植物及其后代、以及通过以该菠菜植物为砧木或者接穗的嫁接获得的个体及其后代。“后代”包括通过种内杂交获得的个体以及通过种间杂交获得的个体两者。另外，所谓的“(植物)为亲本获得的个体”是指以该植物为亲本通过种内杂交、种间杂交、或者细胞融合或者嫁接获得的个体。
例如，本发明所涉及的霜霉病抗性菠菜植物可以通过将四蕊菠菜和四蕊菠菜以外的菠菜植物杂交培育出来。通过以四蕊菠菜为亲本的种间杂交获得的F1个体中，4号染色体为4号染色体的一个等位基因具有来源于四蕊菠菜的RTM-1基因。由于RTM-1基因是显性基因，因此，具有来源于四蕊菠菜的4号染色体的F1个体具有来源于RTM-1基因的霜霉病抗性。
作为被用作本发明所涉及的霜霉病抗性菠菜植物的培育材料的菠菜植物，只要具有CGN25466:MGK 01所具有的RTM-1基因则没有特别限定。例如，作为四蕊菠菜的品系，除了CGN25466:MGK 01之外，还可以举出从CGN25466:MGK 01继承了RTM-1基因的后代品系等。
为了培育出本发明所涉及的霜霉病抗性菠菜植物，作为与四蕊菠菜杂交的亲本，只要是四蕊菠菜以外的菠菜植物则没有特别限定，优选作为农作物栽培的栽培种菠菜植物。四蕊菠菜为野生种，发芽、花粉品质、叶色和叶型等性状作为农作物而言逊色于栽培种菠菜。通过将栽培种菠菜植物作为与四蕊菠菜杂交的亲本，能够使获得的霜霉病抗性菠菜植物的霜霉病抗性以外的性状接近作为农作物优选的性状。作为栽培种菠菜植物，可以举出波斯菠菜、或者以波斯菠菜为亲本培育出的种间杂种菠菜植物。
本发明所涉及的霜霉病抗性菠菜植物也可以是通过四蕊菠菜与四蕊菠菜以外的菠菜植物的种间杂交而获得的F1个体的后代。例如，将四蕊菠菜和栽培种菠菜植物杂交获得F1种子，使栽培种菠菜植物个体与所获得的F1种子生长的植物个体进行回交或者自交而获得种子。然后，从获得的种子所生长的植物个体中选择具有RTM-1基因的个体。针对选择的植物个体，重复进行自交或者与栽培种菠菜植物的杂交，以及从通过杂交获得的后代中选择具有RTM-1基因的个体，由此能够获得霜霉病抗性稳定的菠菜植物品种。自交、与栽培种菠菜植物的杂交、栽培以及种子的采种可以通过菠菜栽培的常规方法进行。
从通过杂交获得的后代中选择具有RTM-1基因的个体，例如可以通过调查霜霉病抗性来进行。具体而言，针对待调查霜霉病抗性的受验植物个体的叶，接种各小种的Pfs，调查有无霜霉病的发病。在霜霉病没有发病的情况下，评价该受验植物个体对所接种的小种具有抗性。从通过杂交获得的后代中，选择至少对霜霉病的小种Pfs1、Pfs2、Pfs3、Pfs4、Pfs5、Pfs6、Pfs7、Pfs8、Pfs9、Pfs10、Pfs11、Pfs12、Pfs13、Pfs14、Pfs15、Pfs16、Pfs17、Pfs18、Pfs19和UA1014菌株所表现的小种具有抗性的植物个体，作为具有RTM-1基因的个体。
从通过杂交获得的后代中选择具有RTM-1基因的个体，例如可以通过调查基因组DNA中是否包含含有RTM-1基因的染色体片段的方法来进行。具体而言，利用菠菜植物的4号染色体中的chr4_7962907至chr4_8617232的区域或其附近的DNA标志物，识别这些区域是来源于四蕊菠菜品系CGN25466:MGK 01的染色体片段，还是来源于四蕊菠菜以外的菠菜植物的染色体片段。
在本发明以及本申请说明书中，所谓的DNA标志物能够检测出染色体上的DNA序列的差异，这能够区分来源于不同品种的染色体片段。作为DNA标志物，例如可以举出SNP(Single Nucleotide Polymorphism单碱基多态性)标志物、或者SSR(Simple SequenceRepeats，简单重复序列)标志物、RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性内切酶片段长度多态性)标志物等。
DNA标志物的检测可以通过常规方法进行。例如，可以将从各植物个体提取的DNA作为模板，使用能够与特定的SNP或SSR特异性杂交的引物和聚合酶进行核酸扩增反应，使用电泳法等检测有无扩增产物，从而能够识别各多态性。另外，可以对从各植物个体提取的DNA进行限制酶处理后，使用电泳法等检测DNA片段的模式，从而能够识别各多态性。此外，可以根据菠菜的基因组DNA的碱基序列、或者检测对象的SNP或SSR的碱基序列，使用通用的引物设计工具等通过常规方法设计能够与特定的SNP或者SSR特异性杂交的引物，并且通过该领域中公知的方法进行合成。
作为用于选择具有RTM-1基因的个体的DNA标志物，例如可以举出chr4_7962907至chr4_8617232的区域或其附近的SNP。作为该SNP，具体而言可以举出chr4_7421480、chr4_7962907、chr4_8152986、chr4_8190990、chr4_8488603、chr4_8494600、chr4_8500200、chr4_8502319、chr4_8502334、chr4_8502394、chr4_8510715、chr4_8617232、chr4_10710358。识别这些SNP的碱基例如可以使用KASP(Kompetitive Allele Specific PCR)基因分型测定(LGC Genomics公司制造)来进行。关于这些SNP，将四蕊菠菜品系CGN25466：MGK01的基因型与SpinachBase中公开的参考基因组的基因型在表1中示出。在表1中，G是指鸟嘌呤，C是指胞嘧啶，A是指腺嘌呤，T是指胸腺嘧啶。
【表1】
SNP 四蕊菠菜的基因型 参考基因组的基因型
chr4_7421480 C G
chr4_7962907 G A
chr4_8152986 C T
chr4_8190990 G A
chr4_8488603 C T
chr4_8494600 T C
chr4_8500200 T C
chr4_8502319 C A
chr4_8502334 G A
chr4_8502394 G A
chr4_8510715 G C
chr4_8617232 G A
chr4_10710358 G C
例如，在本发明所涉及的霜霉病抗性菠菜植物中，具有纯合或者杂合的包含四蕊菠菜品系CGN25466：MGK 01的4号染色体的chr4_8488603至chr4_8510715的范围的片段的菠菜植物，在4号染色体的至少一个等位基因中，在chr4_8488603上鉴定的SNP是胞嘧啶，在chr4_8494600上鉴定的SNP是胸腺嘧啶，在chr4_8510715上鉴定的SNP是鸟嘌呤。另外，作为具有纯合或者杂合的包含四蕊菠菜品系CGN25466：MGK 01的4号染色体的chr4_7962907至chr4_8617232的范围的片段的菠菜植物，优选为如下菠菜植物：在4号染色体的至少一个等位基因中，在chr4_7962907上鉴定的SNP是鸟嘌呤，在chr4_8152986上鉴定的SNP是胞嘧啶，在chr4_8190990上鉴定的SNP是鸟嘌呤，在chr4_8488603上鉴定的SNP是胞嘧啶，在chr4_8494600上鉴定的SNP是胸腺嘧啶，在chr4_8510715上鉴定的SNP是鸟嘌呤，在chr4_8617232上鉴定的SNP是鸟嘌呤。作为具有纯合或者杂合的包含四蕊菠菜品系CGN25466：MGK 01的4号染色体的chr4_7962907至chr4_8617232的范围的片段的菠菜植物，也优选为如下菠菜植物：在4号染色体的至少一个等位基因中，在chr4_7962907上鉴定的SNP是鸟嘌呤，在chr4_8152986上鉴定的SNP是胞嘧啶，在chr4_8190990上鉴定的SNP是鸟嘌呤，在chr4_8488603上鉴定的SNP是胞嘧啶，在chr4_8494600上鉴定的SNP是胸腺嘧啶，在chr4_8500200上鉴定的SNP是胸腺嘧啶，在chr4_8502319上鉴定的SNP是胞嘧啶，在chr4_8502334上鉴定的SNP是鸟嘌呤，在chr4_8502394上鉴定的SNP是鸟嘌呤，在chr4_8510715上鉴定的SNP是鸟嘌呤，在chr4_8617232上鉴定的SNP是鸟嘌呤。
本发明所涉及的霜霉病抗性菠菜植物，其优选霜霉病抗性以外的性状，特别是作为农作物的性状，与栽培种菠菜相同或近似的为佳。作为农作物的性状，可以举出味道、叶的形状、产量、栽培的容易度等。另外，所谓的“作为栽培种的性状”是指作为农作物的性状是适合作为农作物的性状。
作为本发明所涉及的霜霉病抗性菠菜植物，例如可以举出TNKH-1品系(保藏号FERM BP-22404)、TNKH-2品系(保藏号FERM BP-22405)。这两个品系切断了四蕊菠菜所具有的恶劣性状和RTM-1基因的连锁，保持了来源于RTM-1基因的霜霉病抗性，同时兼顾了作为栽培种的性状。另外，具有来源于这些品系所限定的植物的霜霉病抗性的菠菜植物也包含在本发明所涉及的霜霉病抗性菠菜植物中。
作为具有来源于TNKH-1品系所限定的植物的霜霉病抗性的菠菜植物，除了TNKH-1品系之外，还可以举出以TNKH-1品系为亲本获得的杂种植物、以及它们的后代(具有来源于RTM-1基因的霜霉病抗性的菠菜植物)。具有来源于TNKH-2品系所限定的植物的霜霉病抗性的菠菜植物也是如此。
作为本发明所涉及的霜霉病抗性菠菜植物，优选具有至少一种以上的RTM-1基因以外的霜霉病抗性基因的菠菜植物。虽然RTM-1基因与已知的抗性基因相比，能够单独对更为广泛的小种赋予抗性，但通过也具有其他的霜霉病抗性基因，能够期待有助于抑制破坏抗性的新小种的出现。例如，作为RTM-1基因以外的霜霉病抗性基因，没有特别限定，例如可以举出RPF1基因～RPF15基因、R6基因、R15基因等。
本发明所涉及的霜霉病抗性菠菜植物可以是植物体的全部以及一部分中的任一者。也就是说，本发明所涉及的霜霉病抗性菠菜植物也包括具有RTM-1基因的菠菜植物的整个植物体、该菠菜植物的地上部分以及该菠菜植物的组织中的任一者。另外，本发明所涉及的霜霉病抗性菠菜植物还包含由具有RTM-1基因的菠菜植物的一个组织获得的细胞。作为组织，可以举出胚、分裂组织细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、茎、叶柄、根、根尖、果实、种子、花、子叶以及胚轴。
本发明所涉及的霜霉病抗性菠菜植物的霜霉病抗性呈现出显性表达。因此，通过以本发明所涉及的霜霉病抗性菠菜植物为亲本进行种间杂交或者种内杂交，能够育成具有来源于RTM-1基因的霜霉病抗性的菠菜植物的新型品系。
<霜霉病抗性菠菜植物的筛选方法>
在本发明所涉及的霜霉病抗性菠菜植物的筛选方法中，调查受验菠菜植物是否具有RTM-1基因，在判断为具有RTM-1基因的情况下，选择该受验菠菜植物作为霜霉病抗性菠菜植物。在本发明所涉及的霜霉病抗性菠菜植物的筛选方法中，根据4号染色体的RTM-1基因座或其附近的DNA标志物、与这些DNA标志物强烈连锁的DNA标志物的基因型来判断受验菠菜植物是否具有RTM-1基因。在4号染色体的至少一个等位基因中，RTM-1基因座或其附近的DNA标志物或与这些DNA标志物强烈连锁的DNA标志物的基因型，与具有如CGN25466:MGK01株等的RTM-1基因，并且表现出霜霉病抗性的四蕊菠菜的基因型相同的情况下，选择该受验菠菜植物作为霜霉病抗性菠菜植物。
作为用于判断有无RTM-1基因的DNA标志物，例如可以举出表1中记载的SNP。其中，在菠菜植物的chr4_8488603上鉴定的SNP、在chr4_8494600上鉴定的SNP、在chr4_8510715上鉴定的SNP以及与这些SNP在遗传上强烈连锁的SNP所组成的组中选择一种以上，适合作为用于判断有无RTM-1基因的DNA标志物。例如，在至少一个等位基因中，在chr4_8488603上鉴定的SNP是胞嘧啶，在chr4_8494600上鉴定的SNP是胸腺嘧啶，或者在chr4_8510715上鉴定的SNP是鸟嘌呤的情况下，选择该受验菠菜植物作为霜霉病抗性菠菜植物。
通过将用于识别DNA标志物(该DNA标志物用于判断有无RTM-1基因)的基因型的引物组预先试剂盒化，并通过使用该试剂盒，能够更加简便地判断有无RTM-1基因，从而进行霜霉病抗性菠菜植物的选择。例如，汇总选自由用于识别在菠菜植物的chr4_8488603上鉴定的SNP的基因型的引物组、用于识别在chr4_8494600上鉴定的SNP的基因型的引物组以及用于识别在chr4_8510715上鉴定的SNP的基因型的引物组所组成的组中的一种以上的引物组的试剂盒，对用于判断受验菠菜植物有无RTM-1基因的这些SNP的基因型识别有用。
<菠菜植物的霜霉病抗性的预测方法>
本发明所涉及的菠菜植物的霜霉病抗性的预测方法是，调查受验菠菜植物是否具有RTM-1基因，在判断为具有RTM-1基因的情况下，预测该受验菠菜植物具有霜霉病抗性的可能性较高。在本发明所涉及的菠菜植物的霜霉病抗性的预测方法中，根据4号染色体的RTM-1基因座或其附近的DNA标志物、或者与这些DNA标志物强烈连锁的DNA标志物的基因型来判断受验菠菜植物是否具有RTM-1基因。在4号染色体的至少一个等位基因中，RTM-1基因座或其附近的DNA标志物或者与这些DNA标志物强烈连锁的DNA标志物的基因型，与具有如CGN25466:MGK 01株等的RTM-1基因，并显示霜霉病抗性的四蕊菠菜为相同的基因型的情况下，判断该受验菠菜植物具有RTM-1基因，与具有如CGN25466:MGK 01株等的RTM-1基因，并显示霜霉病抗性的四蕊菠菜的基因型不同的情况下，判断为该受验菠菜植物不具有RTM-1基因。
作为用于判断有无RTM-1基因的DNA标志物，可以举出表1所记载的SNP。其中，在菠菜植物的chr4_8488603上鉴定的SNP、在chr4_8494600上鉴定的SNP、在chr4_8510715上鉴定的SNP、以及与这些SNP在遗传上强烈连锁的SNP所组成的组中选择一种以上，适合作为用于预测霜霉病抗性的DNA标志物。例如，在至少一个等位基因中，在chr4_8488603上鉴定的SNP是胞嘧啶，在chr4_8494600上鉴定的SNP是胸腺嘧啶，或者在chr4_8510715上鉴定的SNP是鸟嘌呤的情况下，预测该受验菠菜植物具有RTM-1基因，具有霜霉病抗性的可能性较高。用于识别DNA标志物(所述DNA标志物用于判断有无RTM-1基因)的基因型的引物组及其试剂盒可以使用与前述相同的引物组以及试剂盒。
<霜霉病抗性菠菜植物的制造方法>
通过将具有RTM-1基因的菠菜植物作为材料进行杂交，可以向不具有RTM-1基因的菠菜植物中导入来源于RTM-1基因的霜霉病抗性来制造新型的霜霉病抗性菠菜植物。作为单显性的抗性基因的RTM-1基因，很容易导入到任何品系中，可以加速菠菜的品种育成。进一步，RTM-1基因可以与其他单显性抗性等位基因并存在相同的单倍型(ハプロタイプ)中。因此，通过将具有RTM-1基因的菠菜植物用作亲本，容易育成对更为广泛范围的小种具有抗性的品种。
本发明所涉及的霜霉病抗性菠菜植物的制造方法是利用杂交育种的方法，所述杂交育种使用具有RTM-1基因的菠菜植物作为亲本。具体而言，包括：第一杂交步骤，将具有RTM-1基因的菠菜植物和任意的菠菜植物进行杂交；第二杂交步骤，针对通过所述第一杂交步骤获得的F1个体进行自交、回交或者与不同于所述第一杂交步骤中使用的亲本的菠菜植物的种间杂交或者种内杂交，获得分离族群；以及选择步骤，从所述分离族群中选择具有RTM-1基因的菠菜植物。自交、回交、种间杂交、种内杂交、菠菜植物的栽培以及采种可以通过菠菜栽培的常规方法进行。
作为在第一杂交步骤中用作亲本的具有RTM-1基因的菠菜植物，可以使用四蕊菠菜，也可以使用所述的本发明所涉及的霜霉病抗性菠菜植物。在本发明中，作为用作亲本的具有RTM-1基因的菠菜植物，优选具有RTM-1基因并兼顾作为栽培种的性状的霜霉病抗性菠菜植物。作为这种霜霉病抗性菠菜植物，可以举出TNKH-1品系、以TNKH-1品系为亲本获得的杂种植物、TNKH-2品系以及以TNKH-2品系作为亲本获得的杂种植物、以及这些植物的后代，即具有来源于RTM-1基因的霜霉病抗性的菠菜植物。
作为第一杂交步骤中用作亲本的任意的菠菜植物、或者在第二杂交步骤中用作种间杂交或种内杂交的亲本的任意的菠菜植物，没有特别限定，可以适当使用不具有RTM-1基因的各种菠菜植物。在本发明中，优选使用栽培种菠菜植物作为亲本。例如，通过将具有RTM-1基因并且兼顾作为栽培种的性状的霜霉病抗性菠菜植物与不具有RTM-1基因的栽培种菠菜植物作为亲本，使两者杂交，针对所获得的F1个体进行自交、回交、或者与不同于第一杂交步骤中所使用的亲本的栽培种菠菜植物进行种间杂交或者种内杂交，而能够比较容易地培育出具有来源于RTM-1基因的霜霉病抗性并且具有也适合作为栽培种的性状的新型菠菜品系。
作为第一杂交步骤中用作亲本的任意的菠菜植物、或者第二杂交步骤中用作种间杂交或者种内杂交的亲本的任意的菠菜植物，优选具有至少一种以上的RTM-1基因以外的霜霉病抗性基因的菠菜植物，更优选具有至少一种以上的RTM-1基因以外的霜霉病抗性基因的栽培种菠菜植物。通过将具有至少一种以上的RTM-1基因以外的霜霉病抗性基因的菠菜植物作为亲本，可以比较容易地培育出包含RTM-1基因和其他霜霉病抗性基因两者的新型菠菜品系。
在选择步骤中，从分离族群中选择具有RTM-1基因的菠菜植物，例如可以通过对受验植物个体的叶接种各小种的Pfs，调查霜霉病抗性来进行。从分离群组中，选择至少对霜霉病的小种Pfs1、Pfs2、Pfs3、Pfs4、Pfs5、Pfs6、Pfs7、Pfs8、Pfs9、Pfs10、Pfs11、Pfs12、Pfs13、Pfs14、Pfs15、Pfs16、Pfs17、Pfs18、Pfs19和UA1014菌株所表现的小种具有抗性的植物个体，作为具有RTM-1基因的个体。
选择步骤中的具有RTM-1基因的个体的选择可以利用菠菜植物的4号染色体中的RTM-1基因座及其附近的DNA标志物来进行。关于所使用的DNA标志物或者具体方法可以与所述的本发明所涉及的筛选方法同样地进行。
在选择包含RTM-1基因和其他霜霉病抗性基因两者的植物个体的情况下，与前述用于选择具有RTM-1基因的个体的DNA标志物一起使用能够识别有无该其他霜霉病抗性基因的DNA标志物。作为能够识别有无该其他霜霉病抗性基因的DNA标志物，可以使用存在于该其他霜霉病抗性基因的基因座及其附近的SNP等。
然后，重复进行从所选择的后代个体采集的种子的自交，由此可以获得性状更稳定，发芽率、收获量、采种量等达到作为农作物能够稳定栽培的程度的霜霉病抗性菠菜植物。自交的重复次数只要为一次以上则没有特别限定，可以为2次～3次，还可以为3次以上。
实施例
下面，示出实施例对本发明进行更详细的说明。但本发明并不限定于以下的实施例。
<调查霜霉病抗性的小种接种试验>
对菠菜植物进行的Pfs的接种试验，通过下述方法进行。
将菠菜种子播种在装有培养土“スーパーミックスA”(サカタのタネ公司制造)的托盘中，使用培养土“メトロミックス350”(ハイポネックスジャパン公司制造)进行覆土。在播种时，在各托盘上播种对所接种的小种显示感病性的品系的种子，设置为发病的对照区。将该托盘在玻璃温室内育苗2周，并在第二真叶阶段，喷雾接种Pfs的孢子悬浮液(5×104/mL)。接种后，立即用塑料罩覆盖托盘，在温度15℃、湿度100％、日照12小时的条件下进行管理。
自接种起7天至10天后，充分确认对照区的发病，然后对个体分别进行抗性、感病性的判定。将在子叶或真叶出现菌丝及孢子而确认到发病的植株视为具有感病性，将在子叶及真叶均未确认到发病的植株视为具有抗性。
霜霉病的各小种为自日本国内、The University of Arkansas(Dr.Jim Correll)以及Naktuinbouw获取。另外，在霜霉病的小种判别中，可以利用对各小种显示不同抗性模式的已知的菠菜品种(differential set)作为判别品种。用于判别各小种的霜霉病抗性的判别品种可以从USDA(美利坚合众国农业部)以及Naktuinbouw获取(非专利文献4)。
关于各判别品种所报告的抗性示于表2以及表3。表中，分别以“-”意指抗性、“(-)”意指中等程度的抗性、“+”意指感病性、“(+)”意指仅在子叶观察到霜霉病症状和孢子形成，在真叶中未观察到。另外，“*”意指各个测试中抗性的结果不同。
【表2】
【表3】
[实施例1]
将于2013年从荷兰的CGN获取的野生种四蕊菠菜品系CGN25466:MGK 01作为亲本，培育出新型的霜霉病抗性品系。
首先，分别播种从荷兰的CGN获取的野生种四蕊菠菜品系中的CGN25466:MGK 01和CGN25474:MGK18，并对发芽的个体接种Pfs6。其结果是，四蕊菠菜品系CGN25466:MGK 01显示出抗性，而四蕊菠菜品系CGN25474:MGK18显示出感病性。因此，使用四蕊菠菜品系CGN25466:MGK 01作为亲本。
首先，播种60粒四蕊菠菜品系CGN25466:MGK 01，并对发芽的25个个体接种Pfs10。其结果是，25个个体全部显示出抗性。
然后，将该25个个体中的4个个体与RPF3品系(具有RPF3基因的优良亲本)杂交，获得F1种子。此外，所谓的优良亲本意指适合作为亲本品系，以用于培育作为栽培种表达适宜的性状的品系。
将获得的40粒F1种子播种，结果其中生长了10个个体的植物体。使生长出的10个个体中的2个个体与所述RPF3品系回交，获得BC1种子。
将获得的24粒BC1种子播种，结果其中生长了10个个体的植物体。对生长出的10个个体接种RPF3未显示抗性的Pfs10，结果7个个体显示抗性。使其中的1个个体与RPF4品系(具有RPF4基因的优良亲本)杂交，获得BC1F1种子。
将获得的50粒BC1F1种子播种，结果其中生长了43个个体的植物体。对生长出的43个个体接种RPF3和RPF4均未显示出抗性的Pfs10，结果15个个体显示出抗性。使其中的11个个体自交，获得BC1F1S1种子。
将获得的817粒BC1F1S1种子播种，结果其中生长了676个个体的植物体。对所有生长出的植物体接种Pfs10时，结果500个个体的植物体显示出抗性。在显示出抗性的个体中，22个个体自交，获得BC1F1S2种子。
将获得的7696粒BC1F1S2种子播种，结果其中生长了3551个个体的植物体。使生长出的植物体中的76个个体自交，获得BC1F1S3种子。
将获得的12971粒BC1F1S3种子播种，结果其中生长了9815个个体的植物体。使生长出的植物体中的115个个体自交，获得BC1F1S4种子。
将分别从自交的115个个体中获得的BC1F1S4种子的7377粒进行播种，结果其中生长了4717个个体的植物体。对所有生长出的植物体接种RPF3以及RPF4均未显示抗性的Pfs10或者UA1014菌株所表现的小种，结果五个品系中所有植物体对Pfs10和UA1014菌株所表现的小种显示出抗性。这一点给出了下述启示：所述五个品系可能具有纯合的与RPF3和RPF4不同的未知的霜霉病抗性基因、以及该未知的霜霉病抗性基因并非RPF3基因以及RPF4基因的等位基因，可能存在于不同的基因座。使显示出抗性的五个品系的34个个体自交，获得BC1F1S5种子。
对于所有个体都显示出抗性的五个品系，使用RPF3标志物和RPF4标志物来调查有无RPF3基因和RPF4基因。根据结果，选择RPF3同源品系并命名为TNKH-1品系。另外，选择RPF4同源品系并命名为TNKH-2品系。进一步，选择RPF3和RPF4的分离品系，并将其命名为TNKH-3品系。将这些品系所具有的来源于四蕊菠菜的未知的霜霉病抗性基因和基因座命名为RTM-1。
此外，在四蕊菠菜及强烈表现出该四蕊菠菜在遗传上影响的早期世代中，多个种子结成块，而且发芽也差。因此，种子的收获、精选需要大量的劳力，为了提高发芽率而需留意播种后的发芽环境。还有，花粉重而不易飞散，所以杂交很困难。还有，在各步骤中，不仅针对耐病性进行选择，而且还一并考虑叶色、叶型、叶的大小等而选择具有尽可能接近栽培型的性状的个体。
关于TNKH-1品系以及TNKH-2品系，申请人将其种子保藏在独立行政法人制品评价技术基础机构专利生物保藏中心(千叶县木更津市かずさ镰足2-5-8 120号室)。TNKH-1品系的保藏人附上的识别说明：SSC-SPI-20-001，保藏号为FERM BP-22404(保藏日期：令和2年12月25日)，TNKH-2品系的保藏人附上的识别说明：SSC-SPI-20-002，保藏号为FERM BP-22405(保藏日期：令和2年12月25日)。
[实施例2]
将对任一小种都不具有抗性的Viroflay品系作为留种株亲本，将实施例1中培育出的TNKH-3品系作为花粉亲本进行杂交，对获得的F1个体，进行使用Pfs1、Pfs2、Pfs3、Pfs4、Pfs5、Pfs6、Pfs7、Pfs8、Pfs10、Pfs11、Pfs12、Pfs13、Pfs14、Pfs15、Pfs16、Pfs17和UA1014菌株所表现的小种进行接种试验，调查对这些小种的抗性。结果示于表4。在表4中，关于“Viroflay×TNKH-3F1”一栏的“抗性个体”和“感病性个体”的个体数一栏的“P(Q)”(P和Q都是整数)，P是抗性个体或者感病性个体中的F1个体的个体数，Q是抗性个体或者感病性个体中的由Viroflay的自交获得的个体(自身)的个体数。另外，“nt”意指没有进行实验，没有数据。进一步，在“RPF3品系”、“RPF4品系”和“Viroflay”品系中的各小种的一栏中，“-”意指抗性，“+”意指感病性。此外，在表4所记载的RTM-1基因型中，分别以“RTM-1”意指来源于四蕊菠菜的抗性基因型，“rtm-1”意指来源于Viroflay的感病性基因型。因此，分别为，“RTM-1/RTM-1”意指抗性的纯合子，“rtm-1/rtm-1”意指感病性的纯合子，“RTM-1/rtm-1”意指抗性和感病性的杂合子。同样地，在RPF基因型中，“rpfV”意指来源于Viroflay的感病性基因型。
【表4】
菠菜为雌雄异株的作物，但也有显示间性(在其同一个体中产生雌蕊和雄蕊两种器官)的品系。在以Viroflay为留种株亲本的F1采种中，有时会包含Viroflay的自交种子。是Viroflay的自交种子，还是F1种子，可以通过使用RPF3标志物和RPF4标志物调查RPF基因型来判别。
在Viroflay品系和TNKH-3品系杂交获得的F1族群中，调查感病性个体的RPF基因型，结果确认到不具有RPF3基因和RPF4基因的任一个(rpfV/rpfV)，这些感病性个体全部为由Viroflay的自交获得的个体。也就是说，如表4所示，Viroflay品系和TNKH-3品系杂交而获得的F1个体对Pfs9以外的所有小种显示出抗性，并无感病性个体。从RPF3基因和RPF4基因的霜霉病抗性可知，RTM-1基因能够赋予至少对Pfs6、Pfs7、Pfs10、Pfs13、Pfs17和UA1014菌株所表现的小种显性的抗性。
在F1族群中，RPF3/rpfV和RPF4/rpfV大致以1∶1分离。RPF3对Pfs2、Pfs4和Pfs15为感病性，RPF4对Pfs5、Pfs8、Pfs11、Pfs12、Pfs14和Pfs16为感病性，假设RTM-1基因对这些小种都不具有，则对于这些小种，抗性个体：感病性个体的个体数应该会以1∶1的期望值出现。然而，实际上所有F1个体对这些小种都具有抗性。由此可知，RTM-1基因对Pfs2、Pfs4、Pfs5、Pfs8、Pfs11、Pfs12、Pfs14、Pfs15及Pfs16也能够赋予显性的抗性。
[实施例3]
将Viroflay品系作为留种株亲本，将实施例1中培育出的TNKH-1品系作为花粉亲本进行杂交，对获得的F1个体使用Pfs2、Pfs4、Pfs10、Pfs15、Pfs17、Pfs18和UA1014菌株所表现的小种进行接种试验，调查对这些小种的抗性。结果示于表5。表中，关于“Viroflay×TNKH-1F1”一栏的“抗性个体”和“感病性个体”的个体数一栏的“P(Q)”(P和Q都是整数)，P是抗性个体或感病性个体中的F1个体的个体数，Q是抗性个体或者感病性个体中的由Viroflay的自交获得的个体(自身)的个体数。另外，“nt”表示没有进行实验，没有数据。进一步，在“RPF3”和“Viroflay”的品系中的各小种一栏中，“-”意指抗性，“+”意指感病性。此外，在表5所记载的RTM-1基因型中，分别以“RTM-1”意指来源于四蕊菠菜的抗性基因型，“rtm-1”意指来源于Viroflay的感病性基因型。因此，分别为“RTM-1/RTM-1”意指抗性的纯合子，“rtm-1/rtm-1”意指感病性的纯合子，“RTM-1/rtm-1”意指抗性和感病性的杂合子。同样地，在RPF基因型中，“rpfV”意指来源于Viroflay的感病性基因型。
【表5】
如表5所示，Viroflay品系与TNKH-1品系杂交获得的F1个体对Pfs2、Pfs4、Pfs10、Pfs15、Pfs17、Pfs18和UA1014菌株所表现的小种显示抗性，并无感病性个体。调查RPF基因型的结果，确认了感病性个体全部是通过Viroflay的自交获得的个体。从RPF3基因的霜霉病抗性可知，RTM-1基因能够赋予至少对Pfs2、Pfs4、Pfs10、Pfs15、Pfs17、Pfs18和UA1014菌株所表现的小种显性的抗性。
[实施例4]
将Viroflay品系作为留种株亲本，将实施例1中培育出的TNKH-2品系作为花粉亲本进行杂交，对获得的F1个体使用Pfs5、Pfs8、Pfs 9、Pfs10、Pfs 11、Pfs 12、Pfs 14、Pfs16、Pfs17、Pfs18、Pfs19和UA1014菌株所表现的小种进行接种试验，调查对这些小种的抗性。结果示于表6。表中，关于“Viroflay×TNKH-2F1”一栏的“抗性个体”和“感病性个体”的个体数一栏的“P(Q)”(P和Q都是整数)，P是抗性个体或感病性个体中的F1个体的个体数，Q是抗性个体或者感病性个体中的由Viroflay的自交获得的个体(自身)的个体数。另外，“nt”表示没有进行实验，没有数据。进一步，在“RPF4”和“Viroflay”的品系中的各小种一栏中，“-”意指抗性，“+”意指感病性。此外，在表6所记载的RTM-1基因型中，分别以“RTM-1”意指来源于四蕊菠菜的抗性基因型，“rtm-1”意指来源于Viroflay的感病性基因型。因此，分别为“RTM-1/RTM-1”意指抗性的纯合子，“rtm-1/rtm-1”意指感病性的纯合子，“RTM-1/rtm-1”意指抗性和感病性的杂合子。同样地，在RPF基因型中，“rpfV”意指来源于Viroflay的感病性基因型。
【表6】
如表6所示，Viroflay品系与TNKH-2品系杂交获得的F1个体对Pfs5、Pfs8、Pfs9、Pfs10、Pfs11、Pfs12、Pfs14、Pfs16、Pfs17、Pfs18、Pfs19和UA1014菌株所表现的小种显示出抗性，并无感病性个体。调查RPF基因型的结果，确认了感病性个体全部是通过Viroflay的自交获得的个体。从RPF4基因的霜霉病抗性可知，RTM-1基因能够赋予至少对Pfs5、Pfs8、Pfs9、Pfs10、Pfs11、Pfs12、Pfs14、Pfs16、Pfs17、Pfs18、Pfs19和UA1014菌株所表现的小种显性的抗性。
[实施例5]
将Viroflay品系作为留种株亲本，将实施例1中培育出的TNKH-1品系作为花粉亲本进行杂交获得F1种子，使所述F1种子自交，制造出F2分离族群。对该F2族群使用Pfs1、Pfs3、Pfs 4、Pfs8、Pfs10、Pfs11、Pfs12、Pfs14、Pfs15和UA1014菌株所表现的小种进行接种试验，调查对这些小种的抗性。结果示于表7。表中，“nt”意指没有进行实验，没有数据。进一步，在“RPF3”和“Viroflay”的品系中的各小种一栏中，“-”意指抗性，“+”意指感病性。此外，在表7所记载的RTM-1基因型中，分别以“RTM-1”意指来源于四蕊菠菜的抗性基因型，“rtm-1”意指来源于Viroflay的感病性基因型。因此，分别为“RTM-1/RTM-1”意指抗性的纯合子，“rtm-1/rtm-1”意指感病性的纯合子，“RTM-1/rtm-1”意指抗性和感病性的杂合子。同样地，在RPF基因型中，“rpfV”意指来源于Viroflay的感病性基因型。
【表7】
如表7所示，就TNKH-1品系所具有的霜霉病抗性而言，针对RPF3基因成为感病性的Pfs4、Pfs10、Pfs15和UA1014菌株所表现的小种，抗性个体：感病性个体近似于3∶1分离。因此，假设RTM-1基因为单显性。这个设想也得到了卡方检验(p>0.05)的结果支持。
就TNKH-1品系所具有的霜霉病抗性而言，针对RPF3基因显示抗性的Pfs1、Pfs3、Pfs8、Pfs11、Pfs12和Pfs14，抗性个体:-感病性个体近似于15:1分离。因此，假设RTM-1基因和RPF3基因为双显性。这个设想也得到了卡方检验(p＞0.05)的结果支持。
这些结果表明，RTM-1基因并非RPF基因的等位基因，而是位于不同的染色体上，能够对Pfs1、Pfs3、Pfs4、Pfs8、Pfs10、Pfs11、Pfs12、Pfs14、Pfs15和UA1014菌株所表现的小种赋予单显性的抗性。
[实施例6]
为了鉴定RTM-1基因的染色体的座上区域，进行了遗传分析和基因标志物制作。
首先，使Viroflay品系与实施例1中培育出的TNKH-1品系杂交获得的F1自交，制作F2分离族群。
对获得的F2分离族群的330个个体进行使用UA1014菌株所表现的小种的接种试验，调查对其的抗性。其结果是，抗性个体为234个个体，感病性个体为96个个体。
对这些个体进行遗传分析，从基因组中搜索在抗性个体中成为抗性纯合子或者杂合子、在感病性个体中成为感病性纯合子的区域。
将进行了性状调查的个体作为连锁分析用族群，从各个体中提取基因组DNA。使用连锁分析用族群的DNA和SpinachBase的参考基因组上设计的SNP标志物进行基因分型。基因分型使用KASP基因分型测定进行。
在表8和表9中示出用于KASP基因分型测定的引物的碱基序列，所述KASP基因分型测定用于识别各SNP。在表8、表9中分别为，“等位基因A”表示TNKH-1型(四蕊菠菜型)的等位基因，“等位基因B”表示Viroflay型的等位基因。各SNP通过等位基因特异性引物_1、等位基因特异性引物_2和通用引物这三个引物组来识别基因型。在等位基因特异性引物_1和等位基因特异性引物_2的序列中，以3’末端的一个碱基设计为与识别对象的SNP杂交。
在以具有TNKH-1型等位基因的植物个体的基因组DNA作为模板的情况下，使用等位基因特异性引物_1和通用引物分别作为正向引物和反向引物，通过PCR获得扩增产物。在将具有Viroflay型等位基因的植物个体的基因组DNA作为模板的情况下，使用等位基因特异性引物_2和通用引物分别作为正向引物和反向引物，通过PCR获得扩增产物。根据有无该扩增产物来识别SNP的基因型。这样，通过将这三种寡聚DNA用作一组引物组进行KASP测定，能够识别各SNP的基因型。
【表8】
【表9】
例如，TNKH-1品系在chr4_8510715上鉴定的SNP的基因型为同源的等位基因G(鸟嘌呤)，Viroflay品系在chr4_8510715上鉴定的SNP的基因型为同源的等位基因C(胞嘧啶)。另外，在TNKH-1品系和Viroflay品系的F1中，在chr4_8510715上鉴定的SNP的基因型为G/C，该SNP具有TNKH-1型等位基因G和Viroflay型等位基因C。
此外，用于连锁分析的KASP标志物是为了鉴定RTM-1基因的座上位置而使用的，作为选择具有霜霉病抗性的菠菜时的DNA标志物，不一定需要使用这些KASP标志物。例如，位于chr4_7962907至chr4_8617232上鉴定的菠菜基因组的范围内、表8和表9所记载的SNP以外的DNA多态性、对位于chr4_7962907至chr4_8617232的基因座来源的霜霉病抗性性状显示高关联性的DNA多态性等，可以用作选择具有霜霉病抗性的菠菜时的DNA标志物。
通过使用从受验植物个体中提取的基因组DNA和表8及9中记载的KASP标志物，可以在连锁分析群体中简便地调查各SNP的基因型。在通过KASP标志物获取基因分型数据之后，继续使用超高密度基因连锁图谱生成软件AntMAP Ver.1.1(http：//lbm.ab.a.u-tokyo.ac.jp/～iwata/antmap/(非专利文献5)进行连锁分析。此外，在该软件的使用中，将Grouping的Criterion变更为Distance(cM)/Haldane/Threshold5，除此之外设为默认设置。
在表10中，根据使用表8和表9所示的KASP标志物的基因分型的结果，摘录在RTM-1基因的周边区域发生重组的7个个体(样品编号112/143/322/294/53/232/6)的基因型，与表型一并记载。在表中，“A”表示TNKH-1型等位基因，“B”表示Viroflay型等位基因。例如，在记载为“A/A”的情况下，表示具有同源TNKH-1型等位基因，在记载为“B/B”的情况下，表示具有同源Viroflay型等位基因，在记载为“A/B”的情况下，表示具有异源TNKH-1型等位基因和Viroflay型等位基因。
【表10】
如表10所示，在chr4_8488603、chr4_8494600、chr4_8510715的SNP中，基因型为B/B的样品232和样品6的2个个体具有表型S(感病性)、基因型为A/B的样品112、样品143、样品322、样品294和样品53的表型为R(抗性)，因此可知这些SNP与表型具有高相关性。另外，连锁分析的结果表明，在SpinachBase的参考基因组上，在chr4_7962907至chr4_8617232的范围内，存在引起霜霉病抗性的RTM-1基因。另外，chr4_8488603、chr4_8494600和chr4_8510715的SNP以0cM的遗传距离与RTM-1基因连锁(图1)。
对四蕊菠菜品系CGN25466：MGK 01、TNKH-1品系及TNKH-2品系，在RTM-1基因所位于的chr4_7962907至chr4_8617232的范围内，根据总碱基序列的测序分析数据进行SNP的搜索。其结果是，除了表8和表9中记载的SNP以外，还确认了多个SNP。其中，例如chr4_8500200、chr4_8502319、chr4_8502334和chr4_8502394这4种SNP与参考基因组不同。具体而言，在四蕊菠菜品系CGN25466：MGK 01、TNKH-1品系和TNKH-2品系中，在chr4_8500200上鉴定的SNP是胸腺嘧啶，在chr4_8502319上鉴定的SNP是胞嘧啶，在chr4_8502334上鉴定的SNP是鸟嘌呤，在chr4_8502394上鉴定的SNP是鸟嘌呤(表1)。与表8和表9所记载的SNP一样，这四种SNP也能够作为用于识别具有TNKH-1型等位基因的霜霉病抗性的植物个体的标志物使用。
保藏号：
FERM BP-22404
FERM BP-22405。
序列表
<110> 坂田种苗株式会社
<120> 具有新型霜霉病抗性基因的菠菜植物
<130> PC-34414
<160> 27
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_7421480的等位基因特异性引物_1。
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tatccccggc tttcttatcc tg 42
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_7421480的等位基因特异性引物_2。
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat tatccccggc tttcttatcc tc 42
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_7421480的通用引物。
<400> 3
catgtgaagg aagggacacc a 21
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_7962907的等位基因特异性引物_1。
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc tatgctcgta tacgcaatgg c 41
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_7962907的等位基因特异性引物_2。
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat tcatgctcgt atacgcaatg gt 42
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_7962907的通用引物。
<400> 6
ccaattgacc agaattgtca cc 22
<210> 7
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_8152986的等位基因特异性引物_1。
<400> 7
gaaggtgacc aagttcatgc tgggagcaac atttatgcaa gac 43
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_8152986的等位基因特异性引物_2。
<400> 8
gaaggtcgga gtcaacggat tgggagcaac atttatgcaa gat 43
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_8152986的通用引物。
<400> 9
atgtatggtc tgacaacggc a 21
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_8190990的等位基因特异性引物_1。
<400> 10
gaaggtgacc aagttcatgc tatcgggagg aaagctctaa cc 42
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_8190990的等位基因特异性引物_2。
<400> 11
gaaggtcgga gtcaacggat tatcgggagg aaagctctaa ct 42
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_8190990的通用引物。
<400> 12
tgtgtaccca tattggccag a 21
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_8488603的等位基因特异性引物_1。
<400> 13
gaaggtcgga gtcaacggat ttaatgggat ctgctgcctc g 41
<210> 14
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_8488603的等位基因特异性引物_2。
<400> 14
gaaggtgacc aagttcatgc tctaatggga tctgctgcct ca 42
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_8488603的通用引物。
<400> 15
caaaggcttg acggtccagt a 21
<210> 16
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_8494600的等位基因特异性引物_1。
<400> 16
gaaggtgacc aagttcatgc ttctcgcttg tcattgtcag ca 42
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_8494600的等位基因特异性引物_2。
<400> 17
gaaggtcgga gtcaacggat tttcgcttgt cattgtcagc g 41
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_8494600的通用引物。
<400> 18
ctgtggagtc ggaagaacac a 21
<210> 19
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_8510715的等位基因特异性引物_1。
<400> 19
gaaggtgacc aagttcatgc tctggtccat actcatactc aggg 44
<210> 20
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_8510715的等位基因特异性引物_2。
<400> 20
gaaggtcgga gtcaacggat tctggtccat actcatactc aggc 44
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_8510715的通用引物。
<400> 21
agctaattct gagccaaggc c 21
<210> 22
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_8617232的等位基因特异性引物_1。
<400> 22
gaaggtcgga gtcaacggat ttgagacagc gggataaaga gtaag 45
<210> 23
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_8617232的等位基因特异性引物_2。
<400> 23
gaaggtgacc aagttcatgc ttgagacagc gggataaaga gtaaa 45
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_8617232的通用引物。
<400> 24
tcagttcgac aagctgccta g 21
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_10710358的等位基因特异性引物_1。
<400> 25
gaaggtcgga gtcaacggat tcgagttgat cacctcgtcg 40
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_10710358的等位基因特异性引物_2。
<400> 26
gaaggtgacc aagttcatgc tcgagttgat cacctcgtcc 40
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的chr4_10710358的通用引物。
<400> 27
tgtacccagt tgtcgagcc 19

Claims (24)

1.一种霜霉病抗性菠菜植物，其为具有存在于四蕊菠菜品系CGN25466:MGK 01的4号染色体上的霜霉病抗性RTM-1基因的菠菜植物，其中，四蕊菠菜除外。
2.根据权利要求1所述的霜霉病抗性菠菜植物，其中，所述RTM-1基因为存在于四蕊菠菜品系CGN25466:MGK 01的4号染色体上的chr4_7962907至chr4_8617232的范围内的基因。
3.根据权利要求1或2所述的霜霉病抗性菠菜植物，其中，在4号染色体的至少一个等位基因中，含有包含四蕊菠菜品系CGN25466:MGK 01的4号染色体上的chr4_8488603至chr4_8510715的范围的片段。
4.根据权利要求1所述的霜霉病抗性菠菜植物，其中，所述RTM-1基因为纯合的或者杂合的。
5.根据权利要求1所述的霜霉病抗性菠菜植物，其至少对霜霉病的小种Pfs1、Pfs2、Pfs3、Pfs4、Pfs5、Pfs6、Pfs7、Pfs8、Pfs9、Pfs10、Pfs11、Pfs12、Pfs13、Pfs14、Pfs15、Pfs16、Pfs17、Pfs18、Pfs19和UA1014菌株所表现的小种具有抗性。
6.根据权利要求1所述的霜霉病抗性菠菜植物，其中，在4号染色体的至少一个等位基因中，
在chr4_8488603上鉴定的SNP是胞嘧啶，
在chr4_8494600上鉴定的SNP是胸腺嘧啶，或者
在chr4_8510715上鉴定的SNP是鸟嘌呤。
7.根据权利要求1所述的霜霉病抗性菠菜植物，其中，在4号染色体的至少一个等位基因中，
在chr4_7962907上鉴定的SNP是鸟嘌呤，
在chr4_8152986上鉴定的SNP是胞嘧啶，
在chr4_8190990上鉴定的SNP是鸟嘌呤，
在chr4_8488603上鉴定的SNP是胞嘧啶，
在chr4_8494600上鉴定的SNP是胸腺嘧啶，
在chr4_8510715上鉴定的SNP是鸟嘌呤，或者
在chr4_8617232上鉴定的SNP是鸟嘌呤。
8.根据权利要求1所述的霜霉病抗性菠菜植物，其中，所述霜霉病抗性菠菜植物来源于四蕊菠菜和栽培种菠菜的种间杂种植物。
9.根据权利要求1所述的霜霉病抗性菠菜植物，其具有来源于保藏号FERM BP-22404(TNKH-1品系)限定的植物的霜霉病抗性。
10.根据权利要求1所述的霜霉病抗性菠菜植物，其具有来源于保藏号FERM BP-22405(TNKH-2品系)限定的植物的霜霉病抗性。
11.根据权利要求1所述的霜霉病抗性菠菜植物，其具有至少一种以上的所述RTM-1基因以外的霜霉病抗性基因。
12.一种霜霉病抗性菠菜植物，其为保藏号FERM BP-22404(TNKH-1品系)限定的霜霉病抗性菠菜植物、以所述霜霉病抗性菠菜植物为亲本获得的杂种植物、或其后代。
13.一种霜霉病抗性菠菜植物，其为保藏号FERM BP-22405(TNKH-2品系)限定的霜霉病抗性菠菜植物、以所述霜霉病抗性菠菜植物为亲本获得的杂种植物、或其后代。
14.一种菠菜植物的霜霉病抗性的预测方法，其中，调查受验菠菜植物的4号染色体的chr4_8488603至chr4_8510715的SNP的基因型，在至少一个等位基因中，
在chr4_8488603上鉴定的SNP是胞嘧啶，
在chr4_8494600上鉴定的SNP是胸腺嘧啶，或者
在chr4_8510715上鉴定的SNP是鸟嘌呤的情况下，
预测所述受验菠菜植物具有霜霉病抗性的可能性高。
15.一种霜霉病抗性菠菜植物的筛选方法，其中，调查受验菠菜植物的4号染色体的chr4_8488603至chr4_8510715的SNP的基因型，在至少一个等位基因中，
在chr4_8488603上鉴定的SNP是胞嘧啶，
在chr4_8494600上鉴定的SNP是胸腺嘧啶，或者
在chr4_8510715上鉴定的SNP是鸟嘌呤的情况下，
选择该受验菠菜植物作为霜霉病抗性菠菜植物。
16.一种霜霉病抗性菠菜植物的制造方法，其具有以下步骤：
第一杂交步骤，将具有RTM-1基因的菠菜植物和任意的菠菜植物进行杂交；
第二杂交步骤，针对通过所述第一杂交步骤获得的F1个体，进行自交、回交或者与不同于所述第一杂交步骤中使用的亲本的菠菜植物进行种间杂交或者种内杂交，获得分离族群；以及
选择步骤，从所述分离族群中选择具有RTM-1基因的菠菜植物。
17.根据权利要求16所述的霜霉病抗性菠菜植物的制造方法，其中，所述具有RTM-1基因的菠菜植物为四蕊菠菜或者根据权利要求1至13中任一项所述的霜霉病抗性菠菜植物。
18.根据权利要求16所述的霜霉病抗性菠菜植物的制造方法，其中，所述任意的菠菜植物、或者所述第二杂交步骤中的种间杂交或者种内杂交所使用的亲本为具有至少一种以上的所述RTM-1基因以外的霜霉病抗性基因的菠菜植物。
19.根据权利要求1至13中任一项所述的霜霉病抗性菠菜植物的植物体的一部分。
20.根据权利要求1至13中任一项所述的霜霉病抗性菠菜植物的叶。
21.根据权利要求1至13中任一项所述的霜霉病抗性菠菜植物的种子。
22.一种用于选择具有RTM-1基因的菠菜植物的DNA标志物，其由选自由菠菜植物的chr4_8488603上鉴定的SNP、chr4_8494600上鉴定的SNP、chr4_8510715上鉴定的SNP以及与这些SNP在遗传上强烈连锁的SNP所组成的组中的一种以上构成。
23.一种用于选择具有RTM-1基因的菠菜植物的试剂盒，其包括选自由以下引物组所组成的组中的一种以上的引物组：
用于识别在chr4_8488603上鉴定的SNP的基因型的引物组，
用于识别在chr4_8494600上鉴定的SNP的基因型的引物组，以及
用于识别在chr4_8510715上鉴定的SNP的基因型的引物组。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中，
所述用于识别在chr4_8488603上鉴定的SNP的基因型的引物组由以下引物组成：由序列号13所表示的碱基序列构成的引物、由序列号14所表示的碱基序列构成的引物、以及由序列号15所表示的碱基序列构成的引物；
所述用于识别在chr4_8494600上鉴定的SNP的基因型的引物组由以下引物组成：由序列号16所表示的碱基序列构成的引物、由序列号17所表示的碱基序列构成的引物、以及由序列号18所表示的碱基序列构成的引物；
所述用于识别在chr4_8510715上鉴定的SNP的基因型的引物组由以下引物组成：由序列号19所表示的碱基序列构成的引物、由序列号20所表示的碱基序列构成的引物、以及由序列号21所表示的碱基序列构成的引物。
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