JP2008502335A - レタスおよびホウレンソウにおけるべと病などの病原体、特に卵菌に対して低減された感受性 - Google Patents

Abstract

本発明は、病原体、特に卵菌の感染に対する感受性が低減された植物を得る方法であって、修飾する植物種のＭ０種子を変異誘発剤で処理してＭ１種子を得る工程と、このように得たＭ１種子から植物を生長させてＭ１植物を得る工程と、このように得たＭ１＋ｎ植物に病原体を接種する工程と、その病原体の胞子形成が低減されているか存在しない植物を感受性が低減された表現型を有する植物として選択する工程とを含む方法に関する。本発明はさらに、卵菌に対する感受性が低減された植物、種子、花粉、細胞および組織に関する。

Description

本発明は、病原体との相互作用の様式が改変されている植物、特にレタス植物およびホウレンソウ植物に関する。より詳細には、本発明は、卵菌、特にレタスべと病およびホウレンソウべと病などのべと病との修飾された相互作用を示すレタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）およびホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．）に関し、これはこれらの作物植物種のこれらの病原体に対する低減した感受性につながる。

本発明はさらに、改変された遺伝子型を有するレタス植物およびホウレンソウ植物であって、病原体、特にそれぞれ卵菌のレタスべと病およびホウレンソウべと病に対して低減された感受性を示す植物を得る方法に関する。

レタスおよびホウレンソウなどの葉菜類の育種は、栽培者が高品質の農産物の生産性を最大にできる、その土地の栽培条件に最適に適合した商業的品種の産生を目指している。入力形質ならびに出力形質のいずれにも関連する多くの特性は、選択中に考慮される必要がある。この点に関し、最も重要な入力形質の１つは、病害抵抗性、特に卵菌、より詳しくはべと病に対する抵抗性に関する。
植物と病原体との相互作用の結果は、病原体ならびに植物の両方の多くの遺伝因子に依存する。植物にうまく感染するためには、病原体は多くの障壁を克服する必要がある。

第１の層は物理的性質にあり、強化された細胞壁またはクチクラ層の形態で現れ得ることである。
防御の第２の層として、植物は病原体が植物に感染するのを妨げ得る基本となる抵抗性を示し得ることである。非宿主抵抗性は、ほとんどの植物と病原体との相互作用に実際に有効な基本の防御の極めて成功した形態として考えることができる。

最初の２つの障壁を病原体が克服した場合、複雑な防御の第３の層は、病原体が開始した感染過程を積極的に阻害する因子の誘導の形態で迎え撃つことである。レタスまたはホウレンソウとべと病との相互作用など、多くの種々の植物病原体の相互作用系において、植物は、侵入している病原体を特異認識した後にのみこれらの事象を開始する。多くの場合、この認識は、病原体が相互作用の第１相を確立し、いわゆる病原性（または弱毒性）因子を植物細胞に伝達した後に起こる。
これらの病原性因子は、病原体が宿主に侵入し、それにより発病するのに好ましい状態を確立するために、宿主成分と相互作用する。植物が病原性因子により引き起こされた事象を認識できる場合、抵抗性応答を開始させることができる。

最近、機構的モデル、いわゆる保護モデルが提案されているこれらの事象の認識は、侵入された植物によって産生された耐性遺伝子（Ｒ遺伝子）産物によって直接的または間接的に起きる（Ｄａｎｇｌ Ｊ．Ｌ．およびＪｏｎｅｓ，Ｊ．Ｄ．Ｇ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１１、８２６−８３３）。認識すると、反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成を含む事象の多成分カスケードが起こり、病原体に感染された細胞のまわりでプログラムされた細胞死の厳密に調節された局所的誘発につながる。

加えて、防御応答の実行に寄与する、病原関連タンパク質またはＰＲタンパク質などの防御因子をコードする遺伝子が誘発される。カロース形成の増大も病原体の攻撃の認識によって誘発されることができる。
さらに、侵入された部位における病原体の局在化は、全身獲得抵抗性またはＳＡＲと呼ばれる防御応答の全身反応につながる。

植物と病原体の共進化は軍備競争につながり、抵抗性は代わりの宿主標的または同じ標的と異なる方法で相互作用し、それらを修飾する病原体の能力の結果として崩壊することがある。任意の場合、認識が失われ、感染の確立が成功し、病害につながる。植物において抵抗性を再確立するために、代わりの病原性因子の作用の様式を認識できる新規な耐性遺伝子を導入しなければならない。
伝統的に、植物育種家は、作物種の野生型細胞質に存在する耐性遺伝子を使用することによって、べと病抵抗性レタス品種およびホウレンソウ品種の産生に非常に成功してきた。

Ｒ遺伝子によって引き起こされた抵抗性は非常に有効なので、Ｒ遺伝子は大規模に商業的植物育種で利用されている。それらの作用様式の結果として、これらの抵抗性は永続的ではない。なぜなら病原体集団は新たに導入されたＲ遺伝子に絶えず適応しているからである。レタスでは、これは、市販品種にここ５０年間で２０種を超える異なるＲ遺伝子を導入することにつながっている。べと病に対する抵抗性は市販化する任意の栽培品種にとって必須なので、抵抗性育種には高い優先順位が与えられてきた。

特定のレタス品種またはホウレンソウ品種の商業的価値は栽培領域において優勢なべと病の病原型に対するその抵抗性によって主に決定するので、新規な品種の開発は、植物育種家が適切なべと病抵抗性を市販品種に遺伝子移入する能力と速度によって主に決定する。さらに、新規な抵抗性克服株の発生は一般に予測不能なので、ある品種の商業的価値は長く続くこともあれば急速に下落することもある。

したがって、レタスまたはホウレンソウ育種の商業的成功は、有効な耐性遺伝子、即ち優勢なべと病の病原型による感染を予防できる遺伝子の入手可能性、ならびに抵抗性育種の有効性によって主に決定される。よって、レタスおよびホウレンソウ育種における大きな努力は、作物栽培者にとって主に有益であり、生鮮農産物の消費者に有益な品質形質を犠牲にしてもよいべと病抵抗性に払われてきた。
Ｒ遺伝子媒介抵抗性の永続性が低いことにより、レタスおよびホウレンソウにおける育種の体内資源の大きな割合はべと病抵抗性の育種に配分されなければならない。したがって、Ｒ遺伝子媒介抵抗性よりもはるかに永続性のあるレタスおよびホウレンソウのべと病抵抗性の入手可能な供給源が当技術分野において求められていることは明らかである。
さらに、卵菌に対する植物の抵抗性に加えることができる、さらなる入手可能な対立遺伝子を得ることが望ましい。

本発明につながる研究において、本発明者らは、レタスおよびホウレンソウのべと病に対するより永続的な形態の抵抗性を達成するために、Ｒ遺伝子媒介認識およびそれに続く応答に基づくもの以外の機構を開発すべきであると考えた。言及した通り、病害を確立するために病原体が克服する必要がある数層の防御層が植物には存在する。したがって、互いに独立に、かつＲ遺伝子産物と病原性因子宿主複合体との特異的相互作用とは独立に作用するより永続的な形態の抵抗性は達成し得る。

例えば、構成的防御形態を示す植物に修飾することが実現可能であることは示されている。
これは、宿主のＲ遺伝子産物による病原体認識の成功から生じる誘導シグナルとは関わりなく防御系が働く状態になることを意味する。この応答を制御する因子を修飾することによって、構成的活性化を達成することができる。これは、リプレッサーのダウンレギュレーションを介して、または抵抗性応答の誘導因子の異所的活性化により行うことができる。当業者には、リプレッサーのそのようなダウンレギュレーションまたは誘導因子のそのような異所的活性化を達成するいくつかの方法がある。

しかし、多くの知られた事例では、防御応答の構成的活性化の結果として、植物生長のかなりの減少につながる防御因子に対して体内資源が再配分されている。商業的作物育種において、この収量の不利益は明らかに許容できない。さらに、一部の防御応答は、農産物の栄養価値を低下させることがあるか、消費者の健康に有害でさえあることがある二次的代謝産物の合成および蓄積の形態で現れ得る。
したがって本発明の第１の目的は、上記の欠点を有さないより永続的な形態のべと病抵抗性をレタスおよびホウレンソウにおいて発生させ、同定することである。
次いで、意外にも、レタスおよびホウレンソウにおいてＲ遺伝子媒介認識を回避し、防御応答の構成的形態として現れない代替アプローチが存在することが見い出された。

したがって、本発明は、病原体、特に卵菌の感染に対する感受性が低減された植物、特にレタスまたはホウレンソウを得る方法であって、
ａ）修飾する植物種のＭ０種子を変異誘発剤で処理してＭ１種子を得る工程と、
ｂ）このように得たＭ１種子から植物を生長させてＭ１植物を得る工程と、
ｃ）工程ｂ）およびｃ）をｎ回場合により繰り返してＭ１＋ｎ種子を得て、そこから植物を生長させる工程と、
ｄ）このように得たＭ１＋ｎ植物に病原体を接種する工程と、
ｅ）その病原体の胞子形成が低減されているか存在しない植物を感受性が低減された表現型を有する植物として選択する工程と、
ｆ）感受性が低減された表現型を選択しながら、１世代またはさらに数世代の子孫を場合により産生する工程と
を含む方法に関する。

変異は化学変異誘発によって適切に誘発され、それは種子を１種または複数の変異誘発剤、特にアルキル化変異誘発剤、例えばメタンスルホン酸エチル（ｅｍｓ）、硫酸ジエチル（ｄｅｓ）、エチレンイミン（ｅｉ）、プロパンスルトン、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ−ウレタン（ｍｎｕ）、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチル尿素（ＮＭＵ）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ｅｎｕ）、アジ化ナトリウムと接触させることによって実施することができる。
あるいは、変異は、例えば、Ｘ線、高速中性子、ＵＶ照射から選択される照射によって誘発される。

本発明の別の実施形態では、変異は遺伝子操作によって、例えばキメラオリゴヌクレオチドの使用、相同組換え、内因性産物と競合する修飾した標的遺伝子の導入、ＲＮＡ干渉によるダウンレギュレーションなどによって誘発される。
病原体の胞子形成が低減されているか存在しない植物を感受性が低減された表現型を有する植物として選択する工程は目視検査によって適切に実施される。
好ましくは、本発明の方法は、感受性が低減された複数の対立遺伝子を集積する工程をさらに含む。
Ｍ１種子およびＭ１＋ｎ種子の産生は自家受粉によって適切に実施される。

本発明は、病原体、特に卵菌の感染に対する感受性が低減され、特許請求した方法で得ることができる植物をさらに提供する。
そのような植物は、適切にはレタス植物（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）またはホウレンソウ植物（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．）である。
本発明は、そのゲノム中に卵菌に対する低減された感受性に関与する遺伝情報を有し、表６に挙げたレタス植物のゲノムに見られる通りであり、その種子はＮＣＩＭＢに２００５年６月９日付けで寄託され、表６に挙げた対応する受託番号を有する植物に関する。

本発明はまた、そのゲノム中に卵菌に対する低減された感受性に関与する遺伝情報を有し、その種子がＮＣＩＭＢに２００５年６月９日付けで受託番号４１３２４で寄託されたＭ２集団ＲＺ０３．６７５５１から誘導されたホウレンソウ植物のゲノムに見られる通りである植物に関する。
その特定の実施形態では、本発明は、その種子がＮＣＩＭＢに２００５年６月９日付けで表６に挙げた受託番号で寄託された、表６に挙げたレタス植物に関する。

本発明の別の実施形態は、ＮＣＩＭＢに２００５年６月９日付けでＮＣＩＭＢ受託番号４１３２４で寄託されたＲＺ受託番号ＲＺ０３．６７５５１を有する種子のＭ２集団から誘導されたホウレンソウ植物である。
特許請求した植物の子孫も本発明の一部である。本明細書で使用する「子孫」とは、本明細書で記載した初代植物として、およびそこから任意の方法、例えば異種交配、半数体培養、プロトプラスト融合またはその他の技術によって誘導した、病原体、特に卵菌の感染に対して同じか同様の低減された感受性を有する植物すべてを包含することを意図する。最初のものだけでなく、低減された感受性が保持されている限り、さらなる世代もすべてそのような子孫である。

実際に感受性の低減または欠如である、この形態の抵抗性は、病原体による感染を確立するのに必要な宿主因子の修飾を目的としている。このタイプのアプローチは、植物−卵菌の相互作用、特にレタス−レタスべと病ならびにホウレンソウ−ホウレンソウべと病の相互作用について可能であることが判明したが、その他の植物−病原体の組合せについても使用できる。

所望の修飾植物の同定は、出発植物材料が感受性を示す卵菌種との相互作用の確立を介して行うことができる。感受性の欠如または低減を示す変異体は、感受性に関与する修飾遺伝子を含有している可能性がある。実際には、感受性が低減した対立遺伝子を含有する植物の同定は、ｅｍｓ Ｍ２集団の個々の植物の接種、病原体が感染の成功を確立する能力がなかった結果としての病原体の胞子形成の不存在または低減についての接種した植物の目視検査を含むいくつかの手段によって行うことができる。そのような選別は、実生および生長した植物または開花している植物を含む植物生長の異なるレベルで実施できる。

さらに、感受性が低減された表現型のさらなる確立および特性決定は、蛍光画像化、転写プロファイリングおよび光学顕微鏡法など、多くの高度な技術を介して達成することができる。これらのパラメータについて異なる表現型は、感受性が低減された異なる遺伝子、または感受性が低減された同じ遺伝子の異なる対立遺伝子変種の発生を反映している可能性がある。対立性検定はこれらの２つの可能性を簡単に区別できる。

当業者は、いくつかの方法を使用して植物種の遺伝子を修飾できる。特定の実施形態では、メタンスルホン酸エチル（ｅｍｓ）、硫酸ジエチル（ｄｅｓ）、エチレンイミン（ｅｉ）、プロパンスルトン、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレタン（ｍｎｕ）、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチル尿素（ＮＭＵ）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ｅｎｕ）、アジ化ナトリウムなどのアルキル化剤での処理による化学変異誘発を使用する。
さらに、Ｘ線、高速中性子またはＵＶ照射による照射を使用して、遺伝子修飾を誘発できる。

あるいは、植物のゲノムに存在する遺伝子標的を特異的に修飾する遺伝子操作技術を使用することができる。特に適切なのは、特定の様式の作用を有する有効な突然変異誘発物質であるキメラオリゴヌクレオチドである。別のアプローチは、相同組換えまたは遺伝子ターゲッティングにより遺伝子標的を修飾するものである。そのようなアプローチを使用して、遺伝子の断片を所望の修飾を含有する導入したＤＮＡ断片と交換する。
内因性産物と競合する修飾した標的遺伝子を導入する遺伝子操作技術の使用も本発明の一部である。
特定遺伝子のダウンレギュレーションはＲＮＡ干渉によって達成できる。

変異誘発性オリゴヌクレオチド、遺伝子ターゲッティングまたは遺伝子操作技術を使用してレタス−レタスべと病またはホウレンソウ−ホウレンソウべと病相互作用に関与する感受性因子を修飾する場合、明らかに、遺伝子標的の一次構造が知られている必要がある。

病原体感受性の低減に関与する遺伝子の修飾、例えば変異誘発を介したランダムな修飾後、感受性低減対立遺伝子をマッピングするために、さらなる遺伝子研究を実施できる。これを達成するため、感受性を低減した変異体および感受性のある野生型を使用してＦ２集団を発生させてもよい。得られたＦ２植物の表現型解析および分子マーカー（遺伝子地図上の位置が知られているマーカー対立遺伝子）を使用する遺伝子型解析により、独立に発生させた感受性が低減した対立遺伝子の遺伝子地図上の位置を確立することができる。連鎖したマーカー対立遺伝子を使用して、異なる感受性対立遺伝子を子孫中に間接的に選択できる。

次の工程として、異種交配および連鎖した分子マーカーまたは際立った表現型特性に基づく選択により、異なる感受性対立遺伝子を単純に組み合わせることができる。いわゆる遺伝子集積または遺伝子多重化のこの形態も本発明の一部である。
さらに、標準の地図に基づくクローニング技術により、宿主機能は損なわずに残したまま病原体相互作用を取り除くように、感受性に関与する遺伝子ならびにこれらの遺伝子を修飾する方法を同定することができる。

宿主機能に影響を与えることなく植物と病原体との相互作用を減少させる感受性対立遺伝子を直接的または間接的手段で同定すること、ならびにこれらの対立遺伝子を組み合わせることは、レタスおよびホウレンソウなどの作物系におけるより永続的な形態のべと病抑制につながる。すべての場合、育種家は、新たに発見された感受性が低減した対立遺伝子を互いに組み合わせるか、伝統的に知られたもしくは新たに発見されたＲ遺伝子と組み合わせて多重化または集積することを決定できる。

本発明を以下の実施例でさらに説明する。以下の図を参照する。
（図面の簡単な記載）

図１は、接種６日後の葉の組織の顕微鏡画像を示し、感受性抑制品種Ｂａｃｃａｒｅｓに多くの明瞭な菌糸および吸器を示している。
図２は、抵抗性制御品種Ｈｉｌｌａｒｙに菌糸および吸器が存在しないことを示す葉の組織の顕微鏡画像を示す。

（実施例１）
メタンスルホン酸エチル（ｅｍｓ）によるレタスの遺伝子修飾
レタスべと病株Ｂｌ：１８、Ｂｌ：２０、Ｂｌ：２２、Ｂｌ：２４およびＢｌ：２５に対して高度に感受性のレタス品種Ｔｒｏｕｂａｄｏｕｒ、ＡｐａｃｈｅおよびＹｏｒｖｉｋの種子を１品種当たり種子約２０００個、０．０５％（ｗ／ｖ）または０．０７％（ｗ／ｖ）のいずれかのｅｍｓの気泡溶液に２４時間室温で浸漬させることによりｅｍｓで処理した。

ｅｍｓ用量毎１品種当たり約１５００個の処理種子を発芽させ、得られた植物をオランダの温室で５月から９月まで栽培して種子を産生した。

成熟後、Ｍ２種子を収穫し、処理毎１品種当たり１つのプールにまとめた。Ｍ２種子の得られた６つのプールを出発材料として使用して、感受性が減少した対立遺伝子を含有する個々のＭ２植物を同定した。

遺伝子修飾手順の有効性は、葉緑素の形成または蓄積に直接的または間接的に関与する遺伝子の修飾による葉緑素の欠如を示す白化植物の発生を判定することによって評価した。Ｍ２種子の６つのプールすべてにおいて、白化している個々の植物が認められ、それは適用した処理が遺伝子修飾につながったことを示している。

（実施例２）
感受性が減少した対立遺伝子が得られたレタス植物の同定
実施例１に記載したｅｍｓ処理の結果として感受性が減少した対立遺伝子を含有するＭ２植物の最初の同定は、Ｍ２植物に実生レベルでレタスべと病株Ｂｌ：１８の胞子懸濁液を以下の通り接種することによって実施した。

６つの使用できるＭ２プールのそれぞれの約２０００個の種子を密閉容器中の湿潤した濾紙上で発芽させ、高相対湿度環境を確立した。実生が確立した後（即ち、子葉は発生したが最初の葉はまだ見られない）、実生にレタスべと病の胞子懸濁液を噴霧した。接種した実生を、１５Ｃ、明１６時間、暗８時間の管理の制御条件下でインキュベートした。

この実生試験は、Ｂｏｎｎｉｅｒら（Ｎｅｗ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ｍａｊｏｒ ｇｅｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｌａｃｔｕｃａ ｔｏ Ｂｒｅｍｉａ ｌａｃｔｕｃａｅ．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ ６１：３、２０３−２１１（１９９２））に記載のプロトコルに大体従う。

８日後、ｅｍｓ処理に使用したレタス品種から誘導した感受性のある対照植物で感染が明らかに確立されており、それは胞子形成卵菌の菌糸体が子葉表面に発生したことにより現れ、そのまま容易に採点できる。胞子形成卵菌バイオマスの著しい減少または不存在を示す植物は、出発材料のｅｍｓ媒介遺伝子修飾の結果として感受性が減少した対立遺伝子を獲得したと考えられる。

表１は、レタスの異なるＭ２集団におけるレタスべと病株Ｂｌ：１８に対して減少した感受性の選別結果の要約である。

表１から認められる通り、レタスべと病株Ｂｌ：１８に対して減少した感受性を示す合計７１個の個々のＭ２実生が同定された。

減少した感受性を確認するため、個々のＭ２植物の１０葉段階で葉サンプルを採取した。１株当たり２つの葉ディスクを密閉容器中の湿潤した濾紙上でインキュベートして高相対湿度環境を確立し、レタスべと病株Ｂｌ：１８またはＢｌ：２２の胞子懸濁液を接種した。接種した葉ディスクを、１５Ｃ、明１６時間、暗８時間の管理の制御条件下でインキュベートした。この葉ディスク試験は、上掲のＢｏｎｎｉｅｒら（１９９２）に記載のプロトコルに大体従う。接種８、１１および１４日後、病害指数を手動検査で採点した。病害指数は感染レベルの尺度であり、明確な感染がないことを意味するカテゴリーＲ（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：抵抗性）と、感受性のある対照と比較して感染がかなり減少していることを意味するＲＳ（ｒｅｄｕｃｅｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ：減少した感受性）と、ひどく感染して、非常に胞子形成している卵菌バイオマスを意味するＳ（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ：感受性）とを区別する。

表２ではこの実験結果を要約し、表３ではより詳しく要約する。Ｒ遺伝子に基づく抵抗性を有する標準品種とは対照的に、両方の株に対して完全な抵抗性を示した個々のものはなかった。Ｒ遺伝子媒介抵抗性の場合、実生および葉ディスク試験が完全に交換可能とみなすことは一般的である（例えば、Ｂｏｎｎｉｅｒら、１９９２、上掲参照）。レタスべと病に対する既知の部分的抵抗性では、この交換可能性は当てはまらないが（Ｅｅｎｉｎｋ ＆ Ｄｅ Ｊｏｎｇ、Ｐａｒｔｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｌｅｔｔｕｃｅ ｔｏ ｄｏｗｎｙ ｍｉｌｄｅｗ（Ｂｒｅｍｉａ ｌａｃｔｕｃａｅ）．３．Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓ ａｎｄ ｌｅａｆ ｄｉｓｃｓ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｐｌａｎｔｓ．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ ３１：７６１−７７０（１９８２））、葉ディスク試験の結果間に良好な相関関係が見られ、かつ圃場抵抗性が認められ、実生試験の結果間に低い相関関係が見られ、かつ圃場抵抗性が認められることは驚くべきことである一方、この実施例では新たに見い出された減少した感受性は、実生試験の結果が葉ディスク試験の結果よりも圃場実験（実施例５）の結果のより良い予測であることを示す。

（実施例３）
実生試験において感受性が減少した対立遺伝子を含有するレタス植物の子孫の表現型特性決定
この実施例では、レタスべと病に対して減少した感受性を獲得したレタスのＭ２植物の同定を記載する。これらのＭ２植物は成熟まで温室で栽培し、自然な自家受精で種子を形成させた。個々の選択したＭ２植物それぞれについて、Ｍ３系種子を収穫した。いくつかの場合、このＭ３種子は、実施例２で記載の通り実生試験で植え付けた。感受性の少ないＭ３実生を試験から選択し、成熟植物まで栽培し、自家受精によってＭ４種子を産生した。続いて、Ｍ３種子またはＭ４種子を使用して、実生レベルならびに成熟植物レベルの両方でレタスべと病に対する減少した感受性を試験することによって感受性が減少した対立遺伝子の出現を確認した。実生試験は実施例２で記載の通りに実施する。

表３で認められる通り、Ｍ３系またはＭ４系を使用して、レタスべと病に対して減少した感受性を３２個のＭ３系またはＭ４系で確認した。これらの結果は、本発明で開示したアプローチにより、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）においてレタスべと病に対して感受性が減少した対立遺伝子を発生させ、同定できることを示している。

（実施例４）
感受性が減少した対立遺伝子を含有するレタス植物の子孫の細胞学的特性決定
実施例３に記載の試験に加えて、ｆｙｓｉｏ Ｂｌ：２４を使用して別の実生試験を実施する。実生試験を実施例２で記載の通りに実施する。元の品種Ａｐａｃｈｅ、ＴｒｏｕｂａｄｏｕｒおよびＹｏｒｖｉｋはこのｆｙｓｉｏに対して感受性である。別の感受性品種、Ｂａｃａｒｅｓを感受性標準として使用し、品種ＨｉｌｌａｒｙをＲ遺伝子媒介応答に基づく抵抗性標準として使用した。接種６日後、葉を採取し、葉におけるレタスべと病病原体の増殖を観察できるように以下の通りトリパンブルー染色を実施した（標準例として、図１および２参照）。３２個の確認したＭ３系またはそれらの感受性が減少した子孫は、感受性標準と比較して、葉におけるレタスべと病の発生の不存在または減少を示した。表４を参照されたい。実施例４のＢｌ：２４、実施例２および３のＢｌ：１８、実施例３のＢｌ：２２に対する減少した感受性はｆｙｓｉｏ特異性を示さず、これは非常にｆｙｓｉｏ特異的なＲ遺伝子媒介抵抗性とは対照的である（例えば、Ｂｏｎｎｉｅｒら、１９９２、上掲参照）。

植物におけるべと病に対するラクトフェノールトリパンブルー染色
レタスのレタスべと病に感染した葉を集め、マイクロチューブに入れる。ラクトフェノールトリパンブルー（１００ｍｌ当たり：乳酸２５ｍｌ、グリセロール２５ｍｌ、フェノール２５ｍｌ、水２５ｍｌ、トリパンブルー２５ｍｇ）を加えて、葉を完全に覆う。続いて、その混合物を１００Ｃに５分間加熱し、次いで室温まで冷却させる。トリパンブルーを除去し、同体積の抱水クロラール（１００ｍｌ当たり：抱水クロラール８０ｇ、水３０ｍｌ、グリセロール１０ｇ）を加え、葉サンプルを終夜、脱染する。サンプルをＳｐｅｅｄｖａｃで約５分間処理して葉サンプルから気泡を除去する。続いて、葉サンプルを顕微鏡検査するために顕微鏡用スライドガラス上に広げる。

（実施例５）
圃場試験において感受性が減少した対立遺伝子を含有するレタス植物の子孫の表現型特性決定
強いレタスべと病自然感染（株Ｂｌ：２４およびＢｌ：２５）について、成熟レタス植物を単独圃場試験で２００２年および２００３年に試験した。いずれの試験もオランダのＦｉｊｎａａｒｔで行った。７月に播種し、８月に若い植物を植え付け、９月後半および１０月の始めに成熟植物を判定した。Ｍ３系またはその感受性が減少した子孫はそれぞれ２４個の植物のプロットで表した。成熟段階では、病害の最終レベルを０〜５の段階的基準で採点した。ここで、０は病害症状の不存在を表し、５は重度に罹患していることを表す。Ｒ遺伝子抵抗性植物ならびに感受性の元の系を対照として含めた。結果を表３に示す。

（実施例６）
メタンスルホン酸エチル（ｅｍｓ）によるホウレンソウの遺伝子修飾
ホウレンソウべと病種Ｐｆ５、６および７に対して高度に感受性のホウレンソウ系Ｆ５（７５５＊２６５）＊ＢＬＬＴの種子を、種子約１００００個を０．３％（ｗ／ｖ）のｅｍｓの気泡溶液に２４時間室温で浸漬させることによりｅｍｓで処理した。処理した種子を発芽させ、温室で栽培して抽台および開花を誘発した。

成熟後、Ｍ２種子を収穫し、１つのプールにまとめた。Ｍ２種子の得られたプールを出発材料として使用して、感受性が減少した対立遺伝子を含有する個々のＭ２植物を同定した。このプールをＲＺ受託番号０３．６７５５１でＮＣＩＭＢに２００５年６月９日付けでＮＣＩＭＢ受託番号４１３２４で寄託する。

遺伝子修飾手順の有効性は、葉緑素の形成または蓄積に直接的または間接的に関与する遺伝子の修飾による葉緑素の欠如を示す白化植物の発生を判定することによって評価した。Ｍ２種子のプールにおいて、白化している個々の植物のが認められ、それは適用した処理が遺伝子修飾につながったことを示している。

（実施例７）
感受性が減少した対立遺伝子が得られたホウレンソウ植物の同定
実施例６に記載したｅｍｓ処理の結果として感受性が減少した対立遺伝子を含有するＭ２植物の最初の同定は、Ｍ２植物に実生レベルでホウレンソウべと病種Ｐｆ７の胞子懸濁液を接種することによって実施した。

使用できるＭ２プールの約１００００個の種子を密閉容器中の湿潤した濾紙上で発芽させ、高相対湿度環境を確立した。実生が確立した後（即ち、子葉は発生したが最初の葉はまだ見られない）、実生にホウレンソウべと病の胞子懸濁液を噴霧した。接種した実生を、１４Ｃ、明１４時間、暗１０時間の管理の制御条件下でインキュベートした。

約８日後、ｅｍｓ処理に使用したホウレンソウ系から誘導した感受性のある対照植物で感染が明らかに確立されており、それは胞子形成卵菌の菌糸体が子葉表面に発生したことにより現れ、そのまま容易に採点できる。胞子形成卵菌バイオマスの著しい減少または不存在を示す植物は、出発材料のｅｍｓ媒介遺伝子修飾の結果として感受性が減少した対立遺伝子を獲得したと考えられる。

全体で、ホウレンソウべと病種Ｐｆ７に対して減少した感受性を示す３６個の個々のＭ２実生が同定された。

（実施例８）
感受性が減少した対立遺伝子を含有するホウレンソウ植物の子孫の表現型特性決定
この実施例では、ホウレンソウべと病種Ｐｆ７に対して減少した感受性を獲得したホウレンソウのＭ２植物の同定を記載する。これらのＭ２植物は成熟まで温室で栽培し、種子を形成させた。３６個の個々の選択したＭ２植物のうち３２個からＭ３種子世代を収穫した。続いて、Ｍ３種子を使用して、実生レベルでホウレンソウべと病に対する減少した感受性を試験することによって感受性が減少した対立遺伝子の出現を確立した。実生試験は実施例７で記載の通りに実施する。

表５では、４つのＭ３集団においてホウレンソウべと病に対する減少した感受性が確認された。

この結果は、本発明で開示したアプローチにより、ホウレンソウにおいてホウレンソウべと病に対して感受性が減少した対立遺伝子を発生させ、同定できることを示している。

寄託情報
本発明の種々のレタス植物および１つのホウレンソウのＭ２集団の種子を２００５年６月９日付けでＡｂｅｒｄｅｅｎのＮＣＩＭＢ（ＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ、Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ Ｅｓｔａｔｅ、Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ、ＡＢ２１ ９ＹＡ、ＵＫ）に表６に挙げた受託番号で寄託した。ホウレンソウのＭ２集団は、それぞれ１つまたは複数の変異を含有し、したがって変異のプールを形成する可能性のある一群の種子である。本発明の減少した感受性を有する植物は、請求項１の工程ｄ）およびｅ）ならびに本明細書で記載した通りに植物集団を選別によってそこから選択できる。

接種６日後の葉の組織の顕微鏡画像を示し、感受性抑制品種Ｂａｃｃａｒｅｓに多くの明瞭な菌糸および吸器を示す図である。 抵抗性制御品種Ｈｉｌｌａｒｙに菌糸および吸器が存在しないことを示す葉の組織の顕微鏡画像を示す図である。

Claims (22)

1. 病原体、特に卵菌の感染に対する感受性が低減された植物を得る方法であって、
   ａ）修飾する植物種のＭ０種子を変異誘発剤で処理してＭ１種子を得る工程と、
   ｂ）このように得たＭ１種子から植物を生長させてＭ１植物を得る工程と、
   ｃ）工程ｂ）およびｃ）をｎ回繰り返してもよく、Ｍ１＋ｎ種子を得て、そこから植物を生長させる工程と、
   ｄ）このように得たＭ１＋ｎ植物に病原体を接種する工程と、
   ｅ）その病原体の胞子形成が低減されているか存在しない植物を感受性が低減された表現型を有する植物として選択する工程と、
   ｆ）感受性が低減された表現型を選択しながら、１世代またはさらに数世代の子孫を産生してもよい工程と
   を含む方法。
2. 変異が化学変異誘発によって誘発される、請求項１に記載の方法。
3. 化学変異誘発が、種子をメタンスルホン酸エチル（ｅｍｓ）、硫酸ジエチル（ｄｅｓ）、エチレンイミン（ｅｉ）、プロパンスルトン、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ−ウレタン（ｍｎｕ）、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチル尿素（ＮＭＵ）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ｅｎｕ）、アジ化ナトリウムからなる群から選択される１種または複数の変異誘発剤と接触させることによって実施される、請求項２に記載の方法。
4. 変異が照射によって誘発される、請求項１に記載の方法。
5. 照射が、Ｘ線、高速中性子、ＵＶ照射から選択される、請求項４に記載の方法。
6. 変異が遺伝子操作によって誘発される、請求項１に記載の方法。
7. 遺伝子操作が、キメラオリゴヌクレオチドの使用、相同組換え、内因性産物と競合する修飾した標的遺伝子の導入、ＲＮＡ干渉によるダウンレギュレーションから選択される、請求項６に記載の方法。
8. 病原体の胞子形成が低減されているか存在しない植物を感受性が低減された表現型を有する植物として選択する工程が目視検査によって実施される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 感受性が低減されたその他の対立遺伝子および／または古典的なＲ遺伝子と集積する工程をさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. Ｍ１種子およびＭ１＋ｎ種子の産生が自家受粉によって実施される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 病原体、特に卵菌の感染に対する感受性が低減され、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法で得ることができる植物。
12. レタス植物（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）またはホウレンソウ植物（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．）である、請求項１１に記載の植物。
13. そのゲノム中に卵菌に対する低減された感受性に関与する遺伝情報を有し、表６に挙げたレタス植物のゲノムに見られる通りであり、その種子はＮＣＩＭＢに２００５年６月９日付けで寄託され、表６に挙げた受託番号を有する、請求項１１または１２に記載の植物。
14. そのゲノム中に卵菌に対する低減された感受性に関与する遺伝情報を有し、ＮＣＩＭＢに２００５年６月９日付けで受託番号で寄託されたＲＺ０３．６７５５１から誘導されたホウレンソウ植物のゲノムに見られる通りである、請求項１１または１２に記載の植物。
15. その種子がＮＣＩＭＢに２００５年６月９日付けで表６に挙げた受託番号で寄託された、表６に記載のレタス植物。
16. ＮＣＩＭＢに２００５年６月９日付けで受託番号で寄託されたホウレンソウのＭ２種子集団ＲＺ０３．６７５５１。
17. 請求項１１から１６のいずれか一項に記載の植物の子孫。
18. 請求項１１から１６のいずれか一項に記載の植物の種子。
19. 請求項１１から１６のいずれか一項に記載の植物の花粉。
20. 請求項１１から１６のいずれか一項に記載の植物の細胞。
21. 請求項１１から１６のいずれか一項に記載の植物の組織。
22. 病原体、特に卵菌の感染に対する低減された感受性を植物、特にレタスまたはホウレンソウ植物に与え、表６に挙げた種子に存在し、ＮＣＩＭＢに２００５年６月９日付けで表６に挙げた受託番号で寄託された遺伝子。

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