CN101098965B - 莴苣和菠菜中对病原体特别是卵菌如霜霉降低的易感性 - Google Patents

莴苣和菠菜中对病原体特别是卵菌如霜霉降低的易感性 Download PDF

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Abstract

本发明涉及获得显示出对病原体尤其是卵菌感染易感性降低的植物的方法，包括用诱变剂处理待改良的植物种的M0种子来获得M1种子，并使从由此获得的M1种子形成的植物生长来获得M1植物，用病原体接种如此获得的M1+n植物并选择显示出病原体孢子形成减少或不存在的植物作为具有降低的易感性表型的植物。本发明进一步涉及对卵菌易感性降低的植物、种子、花粉、细胞和组织。

Description

莴苣和菠菜中对病原体特别是卵菌如霜霉降低的易感性
技术领域
本发明涉及就它们与病原体相互作用的方式而言改变的植物，尤其是莴苣和菠菜植物。更具体地，本发明涉及显示出与卵菌尤其是霜霉如莴苣盘梗霉(Bremia lactucae)和甜菜霜霉(Peronosporafarinosa)的相互作用改变的莴苣(Lactucasativa L.)和菠菜(Spinacia oleraceaL.)，这种改变的相互作用导致这些作物物种对这些病原体的易感性降低。 
本发明进一步涉及获得基因型改变的莴苣和菠菜植物的方法，该植物显示出对病原体，特别是卵菌莴苣盘梗霉和甜菜霜霉分别降低的易感性。 
背景技术
多叶蔬菜如莴苣和菠菜的育种目的在于产生最适于当地生长条件的商业品种，其允许种植者使高质量农产品的产量最大化。在选择过程中需要考虑许多与输入以及输出性状相关的特征。在这方面最重要的输入性状之一涉及抗病性，尤其是对卵菌的抗性，更特别的是对霜霉的抗性。 
植物与病原体相互作用的结果取决于病原体以及植物两者的许多遗传因素。为了成功地感染植物，病原体需要克服许多屏障。 
第一层是物理性的并可以以加强的细胞壁或表皮层的形式呈现。 
作为第二个防御层，植物可呈现出阻止病原体感染植物的基础形式的抗性。可以认为非宿主抗性是非常成功的基础防御形式，其实际上对于大部分病原体的相互作用是有效的。 
假如病原体已经克服了头两个屏障，可能遇到以下形式的第三个错综复杂的防御层：诱导有效抑制由病原体引发的感染过程的因子。 在许多不同的植物病原体相互作用系统如莴苣或菠菜与霜霉的相互作用中，植物只在入侵病原体的特异性识别后才启动这些事件。在许多情况中，这种识别发生在病原体已经建立第一阶段的相互作用并将所谓的致病性(或无致病力)因子转移至植物细胞中之后。 
为了建立适于病原体侵入宿主并因此导致疾病的条件，这些致病性因子与宿主组成部分相互作用。当植物能够识别由病原性因子引发的事件时，可以启动抗性反应。 
通过受到入侵的植物所产生的抗性基因(R-基因)产物来直接或间接地产生这些事件的识别，为此最近提出了机制模型，称为保护模型(Dangl J.L.和Jone sJ.D.G.(2001)Na ture411，826-833)。一旦识别，发生多元级联的事件，包括产生反应性氧物质(ROS)，导致严密调控的已经受到病原体感染的细胞周围程序化细胞死亡的局部诱导。 
此外，诱导了编码防御因子如致病机理相关的或PR蛋白的基因，其有助于执行防御反应。通过病原体攻击的识别也可以诱导胼胝质的形成增加。 
而且，病原体在试图侵入部位的定位导致对防御反应的系统诱导，其被称为系统获得抗性或SAR。 
植物和病原体的共同演化已经引起了竞赛，其中作为病原体与可变宿主靶或相同靶相互作用并以不同方式改变可变宿主靶或相同靶的能力的结果，可以破坏抗性。无论如何，丧失识别并可以成功地建立导致疾病的感染。为了在植物中重新建立抗性，不得不引入新的抗性基因，其能够识别可变致病性因子的作用方式。 
在传统上，植物育种者通过使用存在于野生作物物种种质中的抗性基因在产生霜霉病抗性莴苣和菠菜品种中已经非常成功。 
因为由R-基因引起的抗性是非常有效的，因此在商业植物育种中大规模地利用R-基因。由于它们的作用方式，这些抗性不是持久的，因为病原体群不断适应新引入的R-基因。对于莴苣，这已经导致在过去的50年中在商业品种中引入了超过20个的不同R-基因。因为对于 任何待商业化的栽培品种，对霜霉病的抗性是必要条件，所以抗性育种已经成为重要优先项目。 
因为特定莴苣或菠菜品种的商业价值主要是由其对生长地区盛行的霜霉致病型的抗性来决定的，所以新品种的开发很大程度上是由植物育种者将合适的霜霉病抗性基因渗入至商业品种中的能力和速度来决定的。此外，因为新抗性破坏菌株的产生很大程度上是不可预测的，所以品种的商业价值可以是长期持续的或快速减小的。 
因此莴苣或菠菜育种中的商业成功很大程度上由有效抗性基因，即能够阻止盛行的霜霉致病型感染的那些基因的有效性以及抗性育种的效率来决定。因此，莴苣和菠菜育种方面的巨大努力致力于霜霉病抗性，这主要是有益于作物种植者，并可以在损害有益于新鲜产品食用者的质量性状的情况下起作用。 
由于R-基因介导的抗性的低持久性，莴苣和菠菜中的大部分育种资源不得不分配给用于霜霉病抗性的育种。因此清楚的是本领域中存在这样的需要：具有莴苣和菠菜中霜霉病抗性的可用来源，其与R-基因介导的抗性相比较更加持久。此外，理想的是具有更多的可以增加植物对抗卵菌的抗性的可用等位基因。 
在导致本发明的研究中，本发明者考虑到为了获得对莴苣和菠菜中的霜霉病更持久形式的抗性，应当利用不同于基于R-基因介导的识别且随后的反应的那些机制。如所提及的，在植物中存在几个防御层为了建立疾病，病原体需要破坏它们。因此可以获得更持久形式的抗性，其彼此独立地以及与R-基因产物和致病性因子宿主复合物的特异性相互作用无关地起作用。 
例如，已经证明改良呈现组成形式的防御的植物是可行的。这意味着开启与来自宿主R-基因产物成功识别病原体的诱导信号无关的防御系统。通过改变控制此反应的因子，可以获得组成型激活。这可以通过阻遏物的下调或通过抗性反应诱导物的异位激活来进行。本领域技术人员可利用几种方法来获得这样的阻遏物下调或诱导物的异位激活。
然而，在许多已知情况中，由于防御反应的组成型激活，将资源重新分配给导致植物生长显著降低的防御因子。在商业作物育种中，这种产量代价显然是不能接受的。此外，部分防御反应可呈现为次级代谢产物的合成和累积，这可能降低农产品的营养价值或甚至可能对食用者的健康有害。 
发明内容
因此本发明的第一个目的是产生并鉴定莴苣和菠菜中不具有上述缺陷的更持久形式的霜霉病抗性。 
然后令人惊讶地发现存在可替换的方法，其绕过莴苣和菠菜中R-基因介导的识别且不呈现为组成型形式的防御反应。 
因此本发明涉及获得对病原体尤其是卵菌的感染显示出降低的易感性的植物，尤其是莴苣或菠菜的方法，包括： 
a)用诱变剂处理待改良的植物种的M0种子来获得M1种子； 
b)使从如此获得的M1种子形成的植物生长来获得M1植物； 
c)任选地重复步骤b)和c)n次来获得M1+n种子并使从其形成的植物生长； 
d)用病原体接种如此获得的M1+n植物； 
e)选择显示出病原体孢子形成减少或不存在的植物作为具有降低的易感性表型的植物； 
f)任选地产生一代或更多代的后代，与此同时选择降低的易感性表型。 
通过化合诱变的手段来合适地引入突变，化学诱变可以通过将种子接触一种或多种诱变剂来进行，尤其是烷基化诱变剂，如甲磺酸乙酯(ems)、硫酸二乙酯(des)、吖丙啶(ei)、丙磺酸内酯、N-甲基-N-亚硝基尿烷(mnu)、N-亚硝基-N-甲脲(NMU)、N-乙基-N-亚硝基脲(enu)、叠氮化钠。 
或者，通过照射的手段来诱导突变，例如照射选自x-射线、快中子、UV照射。
本发明的另一个实施方案中，通过遗传工程的手段来诱导突变，如通过使用嵌合寡核苷酸、同源重组、引入与内源产物竞争的修饰靶基因、通过RNA干扰的下调等。 
通过目测来合适地进行选择显示出病原体孢子形成减少或不存在的植物作为具有降低的易感性表型的植物的步骤。 
优选，本发明的方法进一步包括使多个易感性降低的等位基因渐增。 
通过自花授粉的手段来合适地实现M1和M1+n种子的产生。 
本发明进一步提供了显示出通过所述方法可获得的对病原菌，特别是卵菌感染的易感性降低的植物。 
这样的植物合适地是莴苣植物(Lactuca sativa L.)或菠菜植物(Spinacia oleracea L.)。 
本发明涉及植物，在其基因组中具有引起对卵菌易感性降低的遗传信息并与表6中所列的莴苣植物的基因组中发现的一样，这些莴苣植物的种子于2005年6月9日保藏于英国的国立工业和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)，并具有表6中所列的相应保藏号。 
本发明还涉及植物，在其基因组中具有引起对卵菌易感性降低的遗传信息并与源自RZ03.67551的菠菜植物的基因组中发现的一样，RZ03.67551的种子以保藏号41324于2005年6月9日保藏于NCIMB。 
其特定实施方案中，本发明涉及表6中所列的莴苣植物，其种子以表6中给出的保藏号于2005年6月9日保藏于NCIMB。 
本发明的另一个实施方案是源自RZ保藏号RZ03.67551的M2种子群的菠菜植物，RZ03.67551以保藏号41324于2005年6月9日保藏于NCIMB。 
所述植物的后代也是本发明的一部分。如在此所用的“后代”意欲包括具有相同或相似的对病原体，尤其是卵菌感染的易感性降低的所有植物，作为在此所述的原始植物并以任何方式从其衍生，如通过杂交、单倍体培养、原生质体融合或其他技术。这样的后代不仅是第一代而且包括所有更多的世代，只要保持降低的易感性。 
发明详述 
这种形式的抗性，其实际上是易感性的降低或缺乏，目的在于改变病原体建立感染所需要的宿主因子。发现这种类型的方法可以用于植物-卵菌的相互作用，尤其是用于莴苣-盘梗霉以及菠菜-霜霉的相互作用，而且也可以用于其他植物-病原体的组合。 
可以通过与起始植物材料对其显示出易感性的卵菌种相互作用的建立来进行所需改良植物的鉴定。显示出易感性丧失或降低的那些突变体可以含有涉及易感性的修饰基因。在实践中，可以通过几种方法来进行含有易感性降低等位基因的植物的鉴定，包括接种ems M2群的个体植物并目测由于病原体无建立成功感染的能力，接种植物中病原体孢子形成的不存在或减少。可以在不同的植物发育阶段进行这样的检查，包括幼苗和成熟的营养期植物或开花植物。 
此外，通过许多完善的技术如荧光成象、转录物特征剖析(transcript profiling)和光学显微镜方法，可以完成易感性降低表型的进一步建立和表征。关于这些参数的不同表型可以反映出不同易感性降低基因的产生或相同易感性降低基因的不同等位变体的产生。等位性测试可以简单地区分出这两种可能性。 
本领域技术人员可以利用几种方法来修饰植物种中的基因。特定实施方案中，利用化学诱变，用烷基化剂，如甲磺酸乙酯(ems)、硫酸二乙酯(des)、吖丙啶(ei)、丙磺酸内酯、N-甲基-N-亚硝基尿烷(mnu)、N-亚硝基-N-甲脲(NMU)、N-乙基-N-亚硝基脲(enu)、叠氮化钠进行处理。 
此外，用x-射线、快中子或UV照射进行的照射可以用于诱导基因修饰。 
或者，可以使用用于特异性修饰植物基因组中存在的基因靶的遗传工程技术。特别合适的是嵌合寡核苷酸，它们是具有特定作用方式的有效诱变剂。另一种方法是通过同源重组或基因靶向来修饰基因靶。使用这样的方法，将基因片段变换成引入的含有所需修饰的DNA片段。
其中引入与内源产物竞争的修饰靶基因的遗传工程技术的应用也是本发明的一部分。 
通过RNA干扰可以完成特定基因的下调。 
如果将诱变寡核苷酸，基因靶向或遗传工程技术用于修饰莴苣-盘梗霉或菠菜-霜霉相互作用中所涉及的易感性因子，显然，基因靶的主要结构需要是已知的。 
为了将降低易感性的等位基因作图，在参与病原体易感性降低的基因修饰，例如通过诱变的随机修饰后，可以进行进一步的遗传研究。为此，使用易感性降低的突变体和易感性野生型来产生F2群。对所得到的F2植物进行表型测定并使用分子标记(具有已知基因图谱位置的标记等位基因)进行基因型分析，可以用来建立独立产生的易感性降低等位基因的基图图谱位置。连接的标记等位基因可以用于间接选择后代中的不同易感性等位基因。 
接下来的步骤是，通过基于连接的分子标记或区别性表型特征的杂交和选择可以简单组合不同的易感性等位基因。这种形式的所谓基因渐增或基因堆积也是本发明的一部分。 
此外，基于标准图谱的克隆技术可以用来鉴定涉及易感性的基因以及修饰这些基因的方式，使得宿主功能保持完整而病原体相互作用被完全破坏。 
鉴定通过直接或间接方式降低植物与病原体相互作用而没有影响宿主功能的易感性等位基因以及组合这些等位基因将导致作物系统如莴苣和菠菜中更持久形式的霜霉病防治。在每种情况中，育种者都可以决定使新发现的易感性降低的等位基因相互结合或与传统上已知的或新发现的R-基因结合而堆积或渐增。 
附图说明
在以下的实施例中将进一步说明本发明。参照以下的附图： 
图1显示了接种后6天叶片组织的显微镜图象，显示出在易感对照品种Baccares中有许多清晰的菌丝和吸器。
图2显示了叶片组织的显微镜图像，显示出抗性对照品种Hillary中不存在菌丝和吸器。 
具体实施方式
实施例1 
用甲磺酸乙酯(ems)来进行莴苣的基因修饰
用ems处理对莴苣盘梗霉菌株B1：18，B1：20，B1：22，B1：24和B1：25高度易感的莴苣品种Troubadour，Apache和Yorvik的种子，将每个品种约2000粒种子浸入0.05％(w/v)或0.07％(w/v)ems的充气溶液中，室温下24小时。 
使每一ems剂量的每个品种约1500粒处理过的种子发芽，并使所形成的植物在荷兰的温室中从五月至九月生长来产生种子。 
成熟后，收获每种处理的每个品种的M2种子并将其堆积成一个集合体。将所得到的6个M2种子的集合体用作起始材料来鉴定含有易感性降低等位基因的个体M2植物。 
通过确定脱色植物的出现来评定基因修饰方法的效力，脱色植物的出现表明了由于对直接或间接参与叶绿素形成或累积的基因的修饰使叶绿素丧失。在所有6个M2种子集合体中观察到了脱色的个体植物，这证明了所应用的处理导致了基因修饰。 
实施例2 
鉴定已经获得易感性降低等位基因的莴苣植物
如下通过用莴苣盘梗霉菌株B1：18的孢子悬浮液接种幼苗阶段的M2植物来进行由于实施例1中所述的ems处理而含有易感性降低等位基因的M2植物的初步鉴定。 
6个可用的M2集合体中，使各自约2000粒种子在建立高相对湿度环境的密闭容器中的湿润滤纸上发芽。在形成幼苗后，即，出现了子叶但还没看见第一片叶子，将莴苣盘梗霉的孢子悬浮液喷施于幼苗上。将接种的幼苗在受控条件下培育，所述受控条件为15℃，16小时 光照，8小时黑暗的条件。该幼苗试验大致按照Bonnier等所述的实验方案进行(New sources of major gene resistance in Lactuca toBremia lactucae.(莴苣中主要莴苣盘梗霉抗性基因的新来源)Euphytica61：3，203-211(1992))。 
8天后，在源自用于ems处理的莴苣品种的易感对照植物上清楚地建立了感染，其通过子叶表面出现形成孢子的卵菌菌丝体来呈现，因此可以容易地评分。作为ems介导的起始材料的基因修饰的结果，认为显示出形成孢子的卵菌生物量强烈减少或不存在的植物已经获得了易感性降低的等位基因。 
表1是在不同的莴苣M2群中检测对莴苣盘梗霉菌株B1：18易感性降低结果的总结。 
表1 
  
处理 所测试的幼苗数(大约)     所测试的莴苣盘梗霉菌株       显示出莴苣盘梗霉感染强烈降低或不存在的幼苗数
Troubadour0.05％ems  2000 B1：18 3
Troubadour0.07％ems  2000 B1：18 11
Apache   0.05％ems 2000 B1：18 21
Apache   0.07％ems 2000 B1：18 25
Yorvik   0.05％ems 2000 B1：18 7
Yorvik   0.05％ems 2000 B1：18 4
从表1可观察到，总共鉴定出71个单独的M2幼苗，其显示出对莴苣盘梗霉菌株B1：18的易感性降低。 
为了证实降低的易感性，在10叶阶段从个体M2植物上摘取叶子 样本。将每株两个叶圆片在建立相对高湿度环境的密闭容器中的润湿滤纸上培育并用莴苣盘梗霉菌株B1：18或B1：22的孢子悬浮液来接种。将接种的叶圆片在受控条件下培育，即15℃，16小时光照，8小时黑暗的条件。该叶圆片试验大致按照Bonnier等所述的实验方案进行((1992)，见上文)。培育8、11和14天后，通过手工检查来评价疾病指数。疾病指数是对感染水平的量度并可区分出表示没有明显感染的R(抗性)类、表示与易感对照相比较感染显著降低的RS(易感性降低)类和表示严重感染和大量形成孢子的卵菌生物量的S(易感)类。 
表2总结了该实验的结果，更多的详细资料在表3中。没有一个个体显示出对抗两种菌株的完整抗性，与具有基于R-基因的抗性的标准品种大不相同。在R-基因介导的抗性的情况中，一般惯例是认为幼苗和叶圆片试验是完全可互换的(参见，例如，Bonnier等，1992，见上文)。对于已知的对抗盘梗霉的部分抗性，这种可互换性的情况并非如此(Eenink&De Jong，Partial resistance in lettuce todowny mildew(Bremia lactucae)(莴苣对霜霉(莴苣盘梗霉)的部分抗性)。3.Corres pondence between resistance levels ofcotyledons and leaf discs and resistance of adult plants(子叶和叶圆片的抗性水平与成熟植物抗性之间的对应性)Euphytica31：761-770(1982))，但令人惊讶地看到他们发现叶圆片试验的结果与观察到的田间抗性之间良好的相关性和幼苗试验的结果与观察到的田间抗性之间差的相关性，而在该实施例中，新发现的降低的易感性表明幼苗试验结果与叶圆片试验结果相比是对田间实验(实施例5)结果的更好的预测。
表2 
对幼苗检测中选定的M2植物的叶圆片试验结果的总结 
  
    B1：18        
    R NAV RS S 总计
B1：22 R 0 2 1 0 3
  NAV 0 11 0 2 13
  RS 3 0 11 8 22
  S 0 1 7 25 33
  总计 3 14 19 35 71
R＝抗性，RS＝降低的易感性；S＝易感，NAV＝试验中不存在 
实施例3 
幼苗试验中含有易感性降低等位基因的莴苣植物后代的表型的表征
该实施例描述了对莴苣M2植物的鉴定，其已经获得了对莴苣盘梗霉降低的易感性。使这些M2植物在温室中生长至成熟并使其通过天然的自花传粉产生种子。对于每个单独的选定的M2植物，收获M3-系种子。在几种情况中，在幼苗试验中播种该M3-种子，如实施例2中所述的。从试验中选择易感性较低的M3-幼苗并使它们生长成成熟植物，通过自花传粉来产生M4-种子。随后将M3-或M4-种子用于证实易感性降低等位基因的产生，其通过在幼苗以及成熟植物两个阶段测试对莴苣盘梗霉的易感性降低来证实。如实施例2中所述进行幼苗试验。 
如在表3中可观察到的，使用M3-或M4-系，证实了32个M3-或M4-系对莴苣盘梗霉的易感性降低。这些结果表明了本发明中所公开的方法可以产生并鉴定莴苣中对莴苣盘梗霉易感性降低的等位基因。
表3 
  
突变体编号   原始品种 ems水 平(％) M3-或M4-幼苗  试验B1：18(Y，T，A：+)       M3-或M4-田间     试验(标准        Y：4；T：4；A：3) M2-叶圆片试验 B1：18  M2-叶圆片试验 B1：22 
1 Y 0.05 (-) 0 S S
2 Y 0.05 (-) 3 RS S
3 Y 0.05 (-) 3 S S
4 T 0.07 (-) 1 S S
5 T 0.07 (-) 1 RS RS
6 T 0.07 (-) 2 RS S
7 T 0.07 (-) 1 RS RS
8 A 0.05 (-) 1 RS S
9 A 0.05 (+) 2 RS S
10 A 0.05 (-) 1 S S
11 A 0.05 (-) 1 R RS
12 A 0.05 (-) 1 RS S
15 A 0.05 (-) 1 RS RS
16 A 0.05 (-) 2 S S
17 A 0.05 (-) 2 S S
18 A 0.07 (-) 2 S RS
19 A 0.07 (-) 1 RS RS
20 A 0.07 (-) 2 S RS
22 A 0.07 (-) 2 RS RS
24 A 0.07 (-) 1 S RS
25 A 0.07 (-) 2 S RS
26 A 0.05 (-) 2 S S
27 A 0.07 (-) 1 S RS
28 Y 0.05 (+) 2 NAV NAV
29 T 0.05 (-) 2 S S
42 A 0.07 (+) 1 NAV NAV
44 A 0.07 (-) 2 S NAV
45 T 0.07   1 RS RS
46 A 0.07 (-) 1 S S
47 A 0.07 (+) 1 S RS
48 A 0.07 (+) 1 S S
49 A 0.07 (-) 1 S NAV
原始品种：A＝Apache，T＝Troubadour，Y＝Yorvik； 
幼苗试验：-＝无孢子形成，(-)＝具有少量孢子的孢子形成，(+)＝轻微的孢子形成，+＝完全的孢子形成； 
田间试验：0＝抗性，5＝非常易感； 
叶圆片试验：参见表2。
表头中包括了原始品种的幼苗和田间试验结果。田间试验数据基于2002年和2003年的综合结果。幼苗试验结果基于M3-系和可获得情况下的M4-系。这个表格中不包括易感性降低等位基因的分离。 
实施例4 
含有易感性降低等位基因的莴苣植物后代的细胞学表征
除了实施例3中所述的测试以外，使用fysio B1：24进行了另一个幼苗试验。如实施例2中所述进行该幼苗试验。原始品种Apache，Troubadour和Yorvik对该fysio是易感的。另一个易感品种，Bacares，用作易感标准，并将品种Hillary用作抗性标准，基于R-基因介导的反应。 
接种后六天，摘取叶子样品并如下所述进行锥虫蓝染色以能够观察盘梗霉病原体在叶子中的生长(对于标准实施例，参见图1和图2)。与易感标准相比较，32个证实的M3-系或其易感性降低的后代显示出叶子中无或减少的盘梗霉生长。参见表4。 
对实施例4中的B1：24，实施例2和3中的B1：18，和实施例3中的B1：22降低的易感性表明没有fysio-特异性，这与强fysio-特异性R-基因介导的抗性大不相同(例如参见Bonnier等，1992，见上文)。 
对植物中霜霉的乳酸酚锥虫蓝染色 
收集盘梗霉感染的莴苣叶并放入微管中。将乳酸酚锥虫蓝(每100ml：25ml乳酸，25ml甘油，25ml酚，25ml水，25mg锥虫蓝)加入以完全覆盖叶子。随后将混合物在100℃加热5分钟，然后使其冷却至室温。除去锥虫蓝并加入相同体积的水合氯醛(每100ml：80g水合氯醛，30ml水，10g甘油)使叶子样品脱色，将这进行过夜。将样品在Speedvac中处理约5分钟以从叶子样品中除去气泡。随后将叶子样品铺在显微镜载玻片上用于显微镜观察。
表4 
用fysioB1：24接种后6天，叶组织中盘梗霉生长的显微镜观察的总结。突变体编号表示易感性降低的原始M2-植物，从其所观察的植物是递减的。该编号与表3中的突变体编号相似。 
  
突变体编号 菌丝 吸器 孢子形成
1 0 0 0
2 0 0 0
3 0 0 0
4 0 0 0
5 0 0 0
6 2 1 0
7 3 3 0
8 0 0 0
9 3 2 0
10 1 1 0
11 0 0 0
12 0 0 0
15 0 0 0
16 0 0 0
17 0 0 0
18 2 1 0
19 0 0 0
20 1 0 0
22 0 0 0
24 0 0 0
25 0 0 0
26 0 0 0
27 0 0 0
28 2 2 0
29 0 0 0
42 2 1 0
44 1 0 0
45 0 0 0
46 0 0 0
47 1 1 0
48 2 1 0
49 0 0 0
Baccares(易感) 3 3 3
评分(菌丝，吸器，孢子形成)：0＝不存在，1＝大量减少，2＝减少，3＝与易感标准(Bacares)相似
实施例5 
田间试验中含有易感性降低等位基因的莴苣植物后代的表型的表征
在2002年和2003年进行的未重复的田间试验中使用强天然盘梗霉(菌株B1：24和B1：25)感染测试了成熟的莴苣植物。两次试验都位于荷兰的Fijnaart。7月播种，8月种植幼小植物，9月的下半月和十月初评价成熟的植物。用一块24株植物的试验区来表示每个M3-系或其易感性降低的后代。在成熟阶段，以0-5分的渐进等级来评价疾病的最终程度，其中0代表不存在疾病症状而5表示严重患病。包括R-基因抗性植物以及易感原始系作为对照。表3中显示了结果。 
实施例6 
用甲磺酸乙酯(ems)对菠菜的基因修饰
用ems处理对甜菜霜霉菌品种Pfs 5，6和7高度易感的菠菜系F5(755*265)*BLLT的种子，将约10,000粒种子浸入0.3％(w/v)ems的充气溶液中，室温下24小时。使处理过的种子发芽并在温室中生长来诱导抽苔和开花。 
成熟后，收获M2种子并堆积成一个集合体。将所得到的M2种子的集合体用作起始材料来鉴定含有易感性降低等位基因的个体M2植物。将该集合体以RZ保藏号03.67551于2005年6月9日保藏于NICMB，NCIMB保藏号为41324。 
通过确定脱色植物的出现来评定基因修饰方法的效力，脱色植物的出现表明由于对直接或间接参与叶绿素形成或累积的基因的修饰而使叶绿素丧失。在M2种子的集合体中，观察到脱色的个体植物，这证明了所应用的处理导致了基因修饰。 
实施例7 
已经获得了易感性降低等位基因的菠菜植物的鉴定
通过用甜菜霜霉菌品种Pf7的孢子悬浮液接种幼苗阶段的M2植物来进行作为实施例6中所述ems处理结果的含有易感性降低等位基因的M2植物的初步鉴定。 
使可用的M2集合体的约10,000粒种子在建立高相对湿度环境的密闭容器中的润湿滤纸上发芽。产生幼苗后，即子叶出现但第一片叶子尚未看见，将甜菜霜霉菌的孢子悬浮液喷施于幼苗上。将接种的幼苗在受控条件(14℃，14小时光照，10小时黑暗条件)下培育。 
约8天后，在源自用于ems处理的菠菜系的易感对照植物上清楚地形成了感染，其通过子叶表面出现形成孢子的卵菌菌丝体来呈现，这样可以容易地评分。作为ems介导的起始材料的基因修饰的结果，认为显示出形成孢子的卵菌生物量强烈减少或不存在的植物已经获得了易感性降低的等位基因。 
总地，鉴定出36株单独的M2幼苗，其显示出对甜菜霜霉菌品种Pfs：7降低的易感性。 
实施例8 
含有易感性降低等位基因的菠菜植物后代的表型的表征
该实施例描述了对已经获得了对甜菜霜霉菌品种Pfs：7降低的易感性的菠菜M2植物的鉴定。使这些M2植物在温室中生长至成熟并使其产生种子。在36株单独的选定的M2植物中，从其32株植物中收获M3种子世代。随后将M3种子用于确定易感性降低等位基因的产生，其通过在幼苗阶段测试对甜菜霜霉菌的易感性降低来确定。如实施例7中所述进行幼苗试验。 
表5中，在四个M3群中证实了对甜菜霜霉菌的易感性降低。该结果表明了本发明中所公开的方法可以产生并鉴定菠菜中对甜菜霜霉菌易感性降低的等位基因。 
保藏信息 
将本发明的各种莴苣植物和一个菠菜M2群的种子以表6中所列的保藏号于2005年6月9日保藏于亚伯丁的NCIMB(NCIMB Ltd.，Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucks burn，Aberdeen，AB219YA，UK)。菠菜的M2群是一批种子，其可各自含有一个或多个突变，从而形成一组突变。通过如权利要求1和本说明书中的步骤d)和e)所述的来筛选植物群，可以从其选择本发明的具有降低的易感性的植物。 
表5：用品种Pfs：7接种的32个M3系的霜霉检测的结果(S＝易感，Seg＝分离，R＝抗性) 
  
编号 种子编号 Pfs：7
1 05.88528 Seg
2 05.88529 S
3 05.88530 S
4 05.88531 S
5 05.88532 S
6 05.88533 S
7 05.88535 S
8 05.88536 S
9 05.88537 S
10 05.88539 S
11 05.88540 S
12 05.88541 S
13 05.88542 S
14 05.88543 S
15 05.88544 S
16 05.88545 S
17 05.88546 S
18 05.88547 S
19 05.88548 S
20 05.88549 S
21 05.88550 -
22 05.88551 S
23 05.88552 S
24 05.88553 S
25 05.88554 S
26 05.88555 S
27 05.88556 Seg
28 05.88557 S
29 05.88558 S
30 05.88559 R
31 05.88560 Seg
32 05.88561 S
[0125] 表6 
保藏信息 
突变体号    RZ保藏号    种子颜色    种    NCIMB编号 
1           05D855B01   黑色        莴苣  41294 
2           05D855B02   黑色        莴苣  41295 
3           05D855B03   黑色        莴苣  41296 
4           05D855B04   白色        莴苣  41297 
5           05D855B05   白色        莴苣  41298 
6           05D855B06   白色        莴苣  41299 
7           05D855B07   白色        莴苣  41300 
8           05D855B08   白色        莴苣  41301 
9           05D855B09   白色        莴苣  41302 
10          05D855B10   白色        莴苣  41303 
11          05D855B11   白色        莴苣  41304 
12          05D855B12   白色        莴苣  41305 
15          05D855B15   白色        莴苣  41306 
16          05D855B16   白色        莴苣  41307 
17          05D855B17   白色        莴苣  41308 
18          05D855B18   白色        莴苣  41309 
19          05D855B19   白色        莴苣  41310 
20          05D855B20   白色        莴苣  41311 
22          05D855B22   白色        莴苣  41312 
24          05D855B24   白色        莴苣  41313 
25          05D855B25   白色        莴苣  41314 
26          05D855B26   白色        莴苣  41315 
27          05D855B27   白色        莴苣  41316 
28          05D855B28   黑色        莴苣  41317 
42          05D855B42   白色        莴苣  41318 
44          05D855B44   白色        莴苣  41319 
45          05D855B45   白色        莴苣  41320 
47          05D855B47   白色        莴苣  41321 
48          05D855B48   白色        莴苣  41322 
49          05D855B49   白色        莴苣  41323 
-           03.67551    -           菠菜  41324 
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000191
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000201
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000211
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Ruie13bis) 
Figure S05825679920070131D000221
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000231
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000241
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000251
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000261
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000281
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000291
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000301
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000311
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000321
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000331
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000341
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000351
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000361
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000371
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000381
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000391
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000401
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000411
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000421
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000441
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000451
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000461
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000471
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000481
关于保藏的微生物或其他生物材料的说明 
(PCT Rule13bis) 
Figure S05825679920070131D000491

Claims (6)

1.显示出对卵菌感染易感性降低的莴苣植物(Lactuca sativa)的细胞，该细胞是其代表性种子于2005年6月9日保藏于NCIMB且具有下列保藏号之一的莴苣植物的细胞：41298、41300、41301、41304、41305、41307、41310、41312、41316或41320。
2.显示出对卵菌感染易感性降低的菠菜植物(Spinacia oleraceaL.)的细胞，该细胞是在其代表性种子于2005年6月9日保藏于NCIMB且具有保藏号41324的菠菜植物的细胞。
3.获得显示出对卵菌感染易感性降低的莴苣植物(Lactucasativa)的方法，包括由原始植物衍生植物，所述原始植物在其基因组中具有引起对卵菌易感性降低的遗传信息，该遗传信息与在其代表性种子于2005年6月9日保藏于NCIMB且具有下列保藏号之一的莴苣植物的基因组中发现的一样：41298、41300、41301、41304、41305、41307、41310、41312、41316或41320；以及鉴定含有降低的易感性等位基因的植物。
4.获得显示出对卵菌感染易感性降低的菠菜植物(Spinaciaoleracea L.)的方法，包括由原始植物衍生植物，所述原始植物在其基因组中具有引起对卵菌易感性降低的遗传信息，该遗传信息与在其代表性种子于2005年6月9日保藏于NCIMB且具有保藏号41324的菠菜植物的基因组中发现的一样；以及鉴定含有降低的易感性等位基因的植物。
5.如权利要求3或4所述的方法，其中所述植物通过杂交、单倍体培养或原生质体融合由所述原始植物衍生。
6.如权利要求3或4所述的方法，其中所述包含降低的易感性等位基因的植物通过检测接种幼苗上病原体孢子形成的不存在或减少来鉴定。
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