CN107075519A - 允许产生螨的番茄植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及修饰的Slmyc2基因，其与SEQ ID No.5的野生型序列相比包含至少一个修饰，所述修饰导致SlMYC2蛋白活性的降低或不存在，其中所述修饰的Slmyc2基因能够赋予番茄(Solanum lycopersicum)植物异常腺毛表型。修饰适当地选自，与SEQ ID No.5的野生型Slmyc2基因相比，降低Slmyc2基因的mRNA水平的修饰，降低SlMYC2蛋白水平的修饰和/或降低SlMYC2蛋白的活性的修饰。

Description

允许产生螨的番茄植物
发明领域
本发明涉及一种具有异常腺毛表型的番茄(Solanum lycopersicum)植物。本发明还涉及此类植物的种子和后代并且涉及用于获得此类植物的繁殖材料。此外，本发明涉及赋予番茄植物异常腺毛表型的植物、种子和繁殖材料的用途。本发明还涉及用于鉴定异常腺毛表型的序列以及序列的用途。
发明背景
番茄种植物(番茄(tomato))属于茄科(nightshade family，也称为Solanaceae)。在该科中，番茄如今被分组为茄属(Solanum)，茄属不仅包括番茄，还包括重要的粮食作物马铃薯和茄子。番茄是原产于南美洲的多年生草本开花植物。
在茄属植物中与番茄相关的其他种是例如醋栗番茄(Solanumpimpinellifolium)、智利番茄(Solanum chilense)、秘鲁番茄(Solanum peruvianum)和多毛番茄(Solanum habrochaites)。尽管已知杂交可能相当困难，这物种仍被用来获得在培育番茄植物中有价值的性状。在最近的历史中，番茄育种的进步已经使得番茄品种具有例如更高的产量、更高的抗病性和增加的保质期。
包括番茄生产在内的商业蔬菜生产受到许多条件的影响。种植者对于某个品种的选择是决定因素，并为可能实现的结果形成遗传基础。此外，还存在影响结果的许多外部因素。培育条件如气候、土壤和投入物(如化肥)的使用发挥着重要作用。种植番茄及其它作物的方式多种多样，其中最常见的是：露天田、温室和遮荫棚生产。尽管该种可以在各种气候条件下生长，但在干燥和温暖的条件下其生长最为成功。除此之外，害虫和疾病的存在也会影响其可能达到的总产量。
可以根据植物生长方式的不同以若干方式完成番茄和其它作物生产中的害虫和疾病的管理。一方面，育种重点在于为植物的性状组合添加对害虫和疾病的抗性。某些种的野生近缘种通常形成了这种抗性种质的有用来源。或者，可以通过选择温度、湿度水平或光强度的方式来修改培育条件以产生对疾病和害虫的发展不太有利的设置。通常，有利于成功生产植物和/或果实的温度也有利于重要害虫诸如粉虱。第三，除草剂或杀虫剂可分别用来根除杂草和害虫。然而，此类化学化合物的使用尚在讨论中，因为它可能在植物和果实上留下残余物，当所述植物和/或果实被消费时，这些残留物可能危及消费者的健康。
当蔬菜在温室中生长时，种植者可以获得被称为生物害虫防治的第四种害虫管理可选方案。通过释放发挥其捕食、寄生和/或食草能力的活生物体再加上积极的人工管理作用，天敌可用于防治某些害虫。已知在本领域中各种各样的昆虫被商业饲养用于温室之中。在这方面其中一个重要的昆虫家族由广泛用于生物防治粉虱、蜘蛛螨和蓟马的植绥螨科(Phytoseiidae)形成。
此外，WO06/057552描述了通过利用捕食性植绥螨斯氏钝绥螨(Amblyseiusswirskii)用于生物害虫防治的方法。然而，这些螨不能在番茄植物上自我产生，这意味着它们不能生存和繁殖。这使得它们不适于用作有效的生物害虫防治。因为针对昆虫、特别是对于粉虱的良好抗性尚未在番茄品种中出现，缺乏这样的生物害虫防治会给番茄种植者带来妨碍。如果温室被粉虱侵染，则一整批植物可能无法用于高产量和高质量的蔬菜生产，因为这些植物可能受到严重影响。这同样适用于捕食性植绥螨Amblydromalus limonicus，其也不能在番茄植物上产生。
对于捕食性螨智利小植绥螨(Phytoseiulus persimilis)而言，已知它可以用于抗击番茄上的二斑叶螨(Tetranychus urticae(红蜘蛛螨))，但该捕食性螨仅以叶螨(Tetranychus)种为食，因此不能用于抗击其他种的侵染。对于另一种捕食性螨加州新小绥螨(Neoseiulus californicus)而言，在对于叶螨种侵染的防治中显示出对番茄植物非常低的作用。
因此，对于番茄植物，存在允许通过适当产生螨(特别是捕食性螨斯氏钝绥螨和/或Amblydromalus limonicus)来应用生物害虫防治的需要。成功产生后，螨可以发挥它们预期的作用：在抗击粉虱和蓟马的侵染中起到生物害虫防治的功能。
在得到本发明的研究中，开发了新的番茄植物，其包含能够赋予异常腺毛表型的修饰的Slmyc2基因，并且允许螨的产生(特别是捕食性螨斯氏钝绥螨和/或Amblydromaluslimonicus)。更详细地，可以确定的是捕食性螨会被番茄植物的茎叶中特定类型的毛状体或腺毛的存在和/或出现和/或在腺毛细胞中产生的挥发物所妨碍。
番茄和其他作物的各种植物部分的表面都覆盖有毛状体，非腺毛状体和腺毛状体两种。非腺毛状体通常被认为是“毛”，并且不产生、储存或分泌特定的生化化合物。
腺毛状体通常由一个或多个细胞组成的茎和在形成腺体头部的茎的尖端处的一个或多个腺细胞组成。在番茄和相关茄种中鉴定出四种不同类型的腺毛状体，即I、IV、VI和VII型。这些类型在茎的尺寸和长度以及形成腺体头部的分泌细胞的数目方面都有所不同。在腺毛状体中产生了番茄中各式各样的生化化合物(McDowell等人，Plant PhysiologyVol.155,524-539(2011))。
由番茄中的各种腺毛状体产生的生化化合物包括萜烯、萜类、类黄酮、脂肪酸、生物碱类和酰基糖(诸如酰基葡萄糖和酰基蔗糖)。已知这些化合物在吸引和排斥各种昆虫和确定对某些疾病的易感性方面起重要作用。然而，这些代谢物的作用的许多方面仍不清楚，并且正在进行充分的研究以更精密地确定腺毛状体和它们分泌的物质的功能。
因此，本发明涉及修饰的Slmyc2基因，其与SEQ ID No.5的野生型基因组序列相比包含至少一个修饰，所述修饰导致SlMYC2蛋白活性的降低或不存在，其中所述修饰的Slmyc2基因能够赋予番茄植物异常腺毛表型。
修饰的slmyc2基因在本文中也称为“本发明的基因”或“本发明的修饰的slmyc2基因”。这些术语在本文中可互换使用。
在实施方案中，得到修饰的Slmyc2基因的修饰选自，与野生型Slmyc2基因相比，降低Slmyc2基因的mRNA水平的修饰；降低SlMYC2蛋白水平的修饰；和/或降低SlMYC2蛋白活性的修饰。
在进一步的实施方案中，得到修饰的Slmyc2基因的修饰导致编码序列内存在提前终止密码子。
在优选的实施方案中，得到修饰的Slmyc2基因的修饰导致在编码序列(CDS)内存在提前终止密码子，特别是包含作为编码序列的SEQ ID No.2的1477位置上单核苷酸多态性(SNP)的修饰。CDS是基因的由外显子组成的编码蛋白质的部分。SEQ ID No.2包含从核苷酸G(野生型)到T的SNP的存在。该SNP与其为相应基因组序列的SEQ ID No.1的4124位置上的SNP相同。该SNP在SEQ ID No.3的氨基酸位置493处产生终止密码子，而野生型氨基酸序列(SEQ ID No.7)在该位置包含甘氨酸残基。产生修饰的Slmyc2基因的该SNP可以在从种子培育的植物中发现，其中种子的代表性样品以登录号NCIMB 42222保藏于NCIMB。
在另一实施方案中，本发明的修饰的Slmyc2基因涉及在其为野生型CDS的SEQ IDNo.6中出现的任何SNP，其导致在该编码序列内存在提前终止密码子。这样的SNP被称为无义突变。任何这样的SNP将因此导致SEQ ID No.6中出现提前终止密码子。优选地，本发明的修饰的Slmyc2基因涉及在SEQ ID No.6的1477位置之前出现的导致编码序列中存在提前终止密码子的任何SNP。任何这样的SNP将因此导致在SEQ ID No.7的氨基酸493位置之前的提前终止密码子。
SNP也可以是编码不同氨基酸而不是终止密码子的突变。这种SNP称为错义突变。本发明还涉及得到本发明的修饰的Slmyc2基因的错义突变。
可能得到本发明的修饰的Slmyc2基因的除了SNP的修饰之外的在编码序列中的修饰包括插入和/或缺失。一个或多个核苷酸的插入可能影响适当的mRNA剪接或导致阅读框的移动。这些事件可能导致SlMYC2蛋白水平降低和/或SlMYC2蛋白活性水平降低。一个或多个核苷酸的缺失与插入一样可能会导致阅读框的移动。该事件可能导致SlMYC2蛋白水平降低和/或SlMYC2蛋白活性水平降低。
本发明还涉及由SEQ ID No.5表示的Slmyc2的非编码基因组序列中的修饰。非编码序列中的修饰包括内含子序列、上游和/或下游序列中的突变。上游序列(即本发明基因的起始密码子之前的序列)包含启动子和5'-非翻译区(5'-UTR)，也称为前导序列。由于这些区域参与mRNA基因转录和随后翻译的调节，因此在基因表达中，合适的修饰可能会通过Slmyc2mRNA水平和/或SlMYC2蛋白水平的降低而导致表达降低。
由本发明的基因引起的异常腺毛表型曾被深入研究。已确定的是针对VI型毛状体特别观察了异常腺毛表型，但也可能延伸到其它类型的腺毛。值得注意的是，本发明的植物上的VI型腺毛的异常腺毛表型以单萜和倍半萜特别是α-蒎烯、月桂烯、蒈烯、α-水芹烯、β-水芹烯、对伞花烃、柠烯、δ-榄香烯、β-石竹烯和/或α-葎草烯的减少以及优选不存在为特征，和/或所述异常腺毛表型以变形的腺毛为特征。本发明的异常腺毛表型还以单萜化合物特别是马鞭草烯的减少和优选不存在为特征。其它挥发物诸如醛被发现存在于本发明的植物异常VI型腺毛中以及非突变体背景植物中(参见实施例5)。
在本发明的植物上发现的VI型腺毛中，当与非突变的VI型腺毛的相同细胞相比时，茎细胞以及由四个腺细胞组成的头部显得萎缩、不发达和/或干燥。这些变形的VI型腺毛似乎也比非突变的VI型腺毛更小。这种尺寸减小可能是萎缩、不发达和/或干燥特征的直接结果(参见图5)。
异常腺毛表型不吸引捕食性螨，但它使得并有利于螨在植株上自由地漫游。本文所称的“捕食性螨”或“螨”属于植绥螨科。本发明涉及该完整的科，其包括种斯氏钝绥螨、Amblydromalus limonicus、智利小植绥螨和加州新小绥螨。
因此，本发明涉及修饰的Slmyc2基因，其与SEQ ID No.5的野生型基因组序列相比包含至少一个修饰，所述修饰导致Slmyc2蛋白活性的降低或不存在，其中所述修饰的Slmyc2基因能够赋予番茄植物异常腺毛表型，其中所述异常腺毛表型进一步以萜烯特别是α-蒎烯、月桂烯、蒈烯、α-水芹烯、β-水芹烯、对伞花烃、柠烯、δ-榄香烯、β-石竹烯和/或α-葎草烯的减少和优选不存在为特征，和/或所述异常腺毛表型以变形的腺毛为特征。异常腺毛表型或本发明的性状允许在番茄植物上产生捕食性螨(特别是捕食性螨斯氏钝绥螨和/或Amblydromalus limonicus)。异常腺毛表型或允许产生捕食性螨(特别是捕食性螨斯氏钝绥螨和/或Amblydromalus limonicus)的异常腺毛表型也在本文中称作“性状”或“本发明的性状”。这些术语在本文中可互换使用。
本发明所述的异常腺毛表型由修饰的Slmyc2基因赋予，该Slmyc2基因的遗传与单基因性状的遗传一致。优选地，所述遗传与单基因中间体性状的遗传一致。在本文中，术语“中间体”意味着异常腺毛表型在包含纯合以及杂合状态的修饰的Slmyc2基因的植物中是可观察到的。
修饰的Slmyc2基因的实例可以在从种子生长的植物中发现，其中所述种子的代表性样品以登录号NCIMB 42222保藏于NCIMB。
在实施方案中，本发明涉及包含本发明的修饰的Slmyc2基因的番茄植物。
本发明涉及包含修饰的Slmyc2基因的番茄植物，其中所述修饰的Slmyc2基因导致异常腺毛表型，其允许在所述番茄植物上产生捕食性螨(特别是捕食性螨斯氏钝绥螨和/或Amblydromalus limonicus)。该植物在本文中也称为本发明的植物。
在优选的实施方案中，本发明的植物包含纯合状态的修饰的Slmyc2基因。当植物包含处于纯合状态的修饰的Slmyc2基因时，本发明的性状以萜烯特别是α-蒎烯、月桂烯、蒈烯、α-水芹烯、β-水芹烯、对伞花烃、柠烯和/或δ-榄香烯的减少和优选不存在为特征，和/或所述性状以变形的腺毛为特征。
在实施方案中，本发明的植物包含处于杂合状态的修饰的Slmyc2基因。当植物包含处于杂合状态的修饰的Slmyc2基因时，本发明的性状以萜烯特别是α-蒎烯、月桂烯、蒈烯、α-水芹烯、β-水芹烯、对伞花烃、柠烯、δ-榄香烯、β-石竹烯和/或α-葎草烯的减少为特征，和/或所述性状以变形的腺毛为特征。在该上下文中，术语“萜烯的减少”是指当与包含野生型纯合Slmyc2基因的植物相比时，萜烯的水平降低但不是完全不存在。与包含野生型纯合Slmyc2基因的植物中的萜烯的水平相比较，萜烯的水平以优选递增顺序10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％减少。
本发明还涉及番茄植物，其中本发明的修饰的Slmyc2基因与由种子培育的番茄植物的基因组中发现或可获得的修饰的Slmyc2基因一样或等同，其中种子的代表性样品以登录号NCIMB 42222保藏于NCIMB。一样或等同是指在由作为本文所述的等位性测试的一部分的杂交产生的F2中没有观察到本发明的性状分离。一样或等同还指从番茄的野生近缘种获得并经修饰以赋予相同异常腺毛表型的myc2基因。在这方面，番茄的野生近缘种包括：S.arcanum、S.chmielewskii、S.neorickii、S.cheesmaniae、S.galapagense、S.pimpinellifolium、S.chilense、S.corneliomulleri、S.habrochaites、S.huaylasense、S.sisymbriifolium、S.peruvianum和S.pennellii。
本发明还涉及包含纯合或杂合的修饰的Slmyc2基因(其为异常腺毛表型起因)的番茄植物，与不携带所述修饰的Slmyc2基因的番茄植物相比，前者的番茄植物允许在番茄植物上产生螨，特别是捕食性螨斯氏钝绥螨和/或Amblydromalus limonicus。
在一个实施方案中，本发明提供了表现出本发明性状的番茄植物，所述性状由修饰的Slmyc2基因赋予，所述番茄植物可通过如下步骤得到：使包含所述修饰的Slmyc2基因的番茄植物(其种子的代表性样品以登录号NCIMB 42222保藏于NCIMB)与另一番茄植物杂交产生F1，随后使F1自交以获得F2，并选择本发明的番茄植物。
此外，在得到本发明的研究中发现，本发明的修饰的Slmyc2基因位于番茄的8号染色体上。
更特别地，在保藏物NCIMB 42222中，本发明的修饰的Slmyc2基因位于番茄的8号染色体上，其基因组序列由SEQ ID No.1表示。
本发明还涉及番茄植物，其包含本发明的修饰的Slmyc2基因，其中所述修饰的Slmyc2基因可通过从种子培育的番茄植物的渐渗得到，其中种子的代表性样品以登录号NCIMB 42222保藏于NCIMB，并且其中种子保藏号NCIMB 42222的种子中的所述修饰的Slmyc2基因(其基因组序列由SEQ ID No.1表示)位于番茄的8号染色体上。
通过由初始杂交和自交步骤后得到的种子培育F2植物，并且选择表达异常腺毛表型性状的植物，本发明的番茄植物可以适当地在不允许捕食性螨产生(特别是斯氏钝绥螨和/或Amblydromalus limonicus)的番茄植物与携带修饰的Slmyc2基因(优选纯合状态)的植物的杂交后代之中被鉴定出来。也可以通过基于如实施例2中所述的生物测定来确定表型或通过鉴定修饰的Slmyc2基因(例如通过与SEQ ID No.5或SEQ ID No.6的比较或使用本文公开的标记)来选择植物。
为了确定引起特定表型性状的遗传决定子的等价性，可以使用公知的等位性试验，更具体地称为互补试验。为了确定植物是否显示与本发明的植物相同的异常腺毛表型，可以进行等位性试验，其中使对于本发明的修饰的Slmyc2基因是纯合的测交植物与对于其遗传决定子也是纯合的待测试的材料杂交。当在杂交的F2中不存在异常腺毛表型性状的分离时，则已证明遗传决定子是等同或一样的，并且该植物也因此是本发明的植物。
测交植物适当地是保藏物NCIMB 42222的植物，或者是显示出允许在所述番茄植物上产生螨(特别是捕食性螨斯氏钝绥螨和/或Amblydromalus limonicus)的异常腺毛表型的保藏物的后代植物。
本发明的番茄植物可以来自以下的任何一种栽培番茄类型：樱桃、梅、混合型(cocktail)、束(truss)、牛排、圆形、葡萄等。
在另一实施方案中，本发明涉及包含本发明的修饰的Slmyc2基因的番茄种子。
该种子在本文中也称为本发明的种子。
在进一步的实施方案中，当修饰的Slmyc2基因处于杂合状态(优选纯合状态)时，由本发明的种子培育的植物允许螨的产生(特别是捕食性螨斯氏钝绥螨和/或Amblydromalus limonicus)。
本发明还涉及包含所述修饰的Slmyc2基因的番茄种子，所述种子能够培育成表现本发明的性状的植物。
本发明还涉及本发明的番茄的后代植物、细胞、组织和种子，其中所述后代植物、细胞、组织和种子包含修饰的Slmyc2基因。这样的后代本身可以是植物、细胞、组织或种子。
本文使用的术语“后代”意指与包含所述修饰的Slmyc2基因的本发明的植物的杂交后得到的第一后代和所有后续后代。“后代”还包括以纯合或杂合状态携带本发明的修饰的Slmyc2基因的植物和通过营养繁殖或增殖从本发明的其它植物或植物的后代中获得的植物。
本发明涉及以纯合或杂合状态包含本发明的修饰的Slmyc2基因的番茄植物的后代植物。
本发明还涉及本发明的番茄植物的后代植物，其表现出异常腺毛表型，并且允许在所述后代植物上产生螨(特别是捕食性螨斯氏钝绥螨和/或Amblydromalus limonicus)。因此，该后代植物包含处于杂合(优选纯合)状态的修饰的Slmyc2基因。
根据其另一方面，本发明涉及能够发育成和/或衍生自番茄植物的繁殖材料，其包含处于纯合或杂合状态的本发明的修饰的Slmyc2基因。
该繁殖材料在本文中也称为本发明的繁殖材料。
在一个实施方案中，这样的繁殖材料由本发明的番茄植物的种子形成，其中种子能够发育成包含处于纯合或杂合状态的本发明的修饰的Slmyc2基因的植物。
在进一步的实施方案中，本发明的繁殖材料选自由小孢子、花粉、子房、胚珠、胚、胚囊、卵细胞、插条、根、根尖、下胚轴、子叶、茎、叶、花、花药、种子、分生组织细胞、原生质体和细胞组成的组。
在另外的实施方案中，本发明涉及本发明的繁殖材料的组织培养物。
在另一实施方案中，由繁殖材料发育成的植物包含在从种子培育的番茄植物中发现的修饰的Slmyc2基因，其中种子的代表性种子以登录号NCIMB 42222保藏于NCIMB。
本发明还涉及包含本发明的修饰的Slmyc2基因的番茄植物的收获部分。
此外，本发明涉及包含一种或多种包含本发明的修饰的Slmyc2基因的番茄植物的收获部分的食品。收获部分或食品可以是或者包含番茄植物的果实。包含本发明番茄植物的果实或其部分的优选食品是沙拉，其中所述果实可任选地与例如莴苣、菠菜、苦苣、菊苣、甜菜、瑞士甜菜等的叶进行混合。食品或收获的部分可能已经历了一个或多个加工步骤。这样的加工步骤可包括但不限于以下处理中的任一种或其组合：切割、洗涤、烹调、蒸煮、烘焙、油炸、巴氏灭菌、冷冻、研磨、提取油、酸洗或发酵。所获得的加工形式也是本发明的一部分。
本发明的另一方面涉及本发明的修饰的Slmyc2基因用于开发番茄植物的用途，在所述番茄植物上可以产生捕食性螨，特别是斯氏钝绥螨和/或Amblydromalus limonicus。
在实施方案中，本发明涉及本发明的修饰的Slmyc2基因用于开发番茄植物的用途，在所述番茄植物上可以产生捕食性螨，特别是斯氏钝绥螨和/或Amblydromaluslimonicus，其中所述螨的产生是由异常腺毛表型允许的。
在另一实施方案中，本发明涉及本发明的修饰的Slmyc2基因用于开发番茄植物的用途，其中本发明的修饰的Slmyc2基因能够赋予所述番茄植物异常腺毛表型，其中所述异常腺毛表型以萜烯特别是α-蒎烯、月桂烯、蒈烯、α-水芹烯、β-水芹烯、对伞花烃、柠烯、δ-榄香烯、β-石竹烯和/或α-葎草烯的不存在为特征，和/或所述异常腺毛表型以变形的腺毛为特征。
在另一实施方案中，本发明涉及本发明的植物与捕食性螨斯氏钝绥螨组合来防治植物害虫(特别是番茄刺皮瘿螨(Aculops lycopersici)、烟粉虱(Bemisia tabaci)和/或西花蓟马(Frankliniella occidentalis))的用途。
在另一实施方案中，本发明涉及本发明的植物与Amblydromalus limonicus组合来防治植物害虫(特别是番茄刺皮瘿螨、烟粉虱和/或西花蓟马)的用途。
在另一实施方案中，本发明涉及本发明的植物与捕食性螨斯氏钝绥螨和Amblydromalus limonicus组合来防治植物害虫(特别是番茄刺皮瘿螨、烟粉虱和/或西花蓟马)的用途。
在另一实施方案中，本发明涉及本发明的植物与捕食性螨智利小植绥螨组合来防治植物害虫(特别是二斑叶螨)的用途。
在另一实施方案中，本发明涉及本发明的植物与捕食性螨加州新小绥螨组合来防治植物害虫(特别是二斑叶螨)的用途。
在另一实施方案中，本发明涉及本发明的植物与捕食性螨智利小植绥螨和加州新小绥螨组合来防治植物害虫(特别是二斑叶螨)的使用。
本发明的性状可以通过例如使用合适的标记来鉴定。
技术人员知道如何使用已知的基因、标记、QTL、等位基因或与某种性状相关的其它DNA分子及其序列开发与性状连锁的新标记。
本文使用的术语“遗传决定子”包括一个或多个QTL、基因或等位基因。这些术语可互换使用。遗传决定子可以通过遗传图谱上的位置或通过连锁群上位置或染色体上位置的指示来鉴定。当遗传决定子不再与特定分子标记物连锁时，但遗传图谱上定义的其在染色体上的位置未改变，该遗传决定子仍与当其与分子标记物连锁时相同。因此它赋予的性状也仍相同。
本发明进一步涉及本发明的番茄植物的细胞，所述细胞包含本发明的修饰的Slmyc2基因。因此，所述细胞包含编码所述异常腺毛表型的遗传信息，特别是与编码所述异常腺毛表型的遗传信息基本相同(优选完全相同)的遗传信息，其中所述遗传信息是与野生型序列SEQ ID No.5相比包含至少一个修饰的修饰的Slmyc2基因。优选地，本发明的细胞是植物或植物部分的一部分，但该细胞也可以是分离的形式。
本发明还涉及番茄植物的细胞，所述细胞包含本发明的修饰的Slmyc2基因，并且所述植物通过将本发明的性状转移到农学上有价值的番茄植物中获得或可以获得。本发明的性状是由在种子中发现的本发明的修饰的Slmyc2基因所引起的，其中种子的代表性样品以登录号NCIMB 42222保藏于NCIMB。
本发明还涉及包含本发明的修饰的Slmyc2基因的番茄植物的种子用于将修饰的Slmyc2基因转移到另一种农学上有价值的番茄植物中的用途。
本发明还涉及其中种子的代表性样品以登录号NCIMB 42222保藏于NCIMB的种子用于将本发明的修饰的Slmyc2基因转移到另一种农学上有价值的番茄植物中的用途。
本发明还涉及本发明的番茄植物用于培养和保存捕食性螨或来自其的集落的用途，目的是防治害虫。
本发明还涉及包含本发明的修饰的Slmyc2基因的番茄植物作为农作物的用途。
本发明还涉及包含本发明的修饰的Slmyc2基因的番茄植物作为种子来源的用途。
本发明还涉及包含本发明的修饰的Slmyc2基因的番茄植物作为繁殖材料来源的用途。
本发明还涉及包含修饰的Slmyc2基因的番茄植物用于消费的用途。
在除番茄之外的植物种中，Slmyc2的同源物可能影响腺毛表型。因此，本发明还涉及能够赋予植物异常腺毛表型的修饰的myc2基因，所述修饰导致MYC2蛋白活性降低或不存在，并且其中所述修饰选自，与未修饰的野生型myc2基因相比，降低myc2基因的mRNA水平的修饰；降低MYC2蛋白水平的修饰；和/或降低MYC2蛋白活性的修饰。
本发明还涉及导致植物中萜烯减少和/或不存在的修饰的myc2基因。修饰的myc2基因可以杂合或纯合状态存在。可以如本文中所述的与Slmyc2基因一样或等同的方式修饰myc2基因。
由修饰的myc2基因赋予的异常腺毛表型以萜烯特别是α-蒎烯、月桂烯、蒈烯、α-水芹烯、β-水芹烯、对伞花烃、柠烯、δ-榄香烯、β-石竹烯和/或α-葎草烯的不存在和/或减少为特征，和/或所述异常腺毛表型以变形的腺毛为特征。在这方面，萜烯的不存在是指通过目前可用的测量技术不可检测的萜烯的水平，和/或至少以优选递增顺序为95％、96％、97％、98％、99％或100％低于纯合包含野生型myc2基因的植物中的萜烯的水平。术语“萜烯的减少”在该上下文中是指当与包含野生型纯合myc2基因的植物相比时，萜烯的水平降低但不是完全不存在。与纯合包含野生型myc2基因的植物中的萜烯的水平相比较，萜烯的水平分别以优选递增顺序10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％减少。
在实施方案中，包含修饰的myc2基因的本发明的植物表现出本发明的异常腺毛表型，其允许在所述植物上产生捕食性螨，特别是斯氏钝绥螨和/或Amblydromaluslimonicus。
在优选的实施方案中，本发明的植物包含纯合状态的修饰的myc2基因。当植物包含处于纯合状态的修饰的myc2基因时，允许在所述植物上产生捕食性螨(特别是斯氏钝绥螨和/或Amblydromalus limonicus)的异常腺毛表型以萜烯特别是α-蒎烯、月桂烯、蒈烯、α-水芹烯、β-水芹烯、对伞花烃、柠烯、δ-榄香烯、β-石竹烯和/或α-葎草烯的不存在和/或减少为特征，和/或所述异常腺毛表型以变形的腺毛为特征。
在实施方案中，本发明的植物包含处于杂合状态的修饰的myc2基因。当植物包含处于杂合状态的修饰的myc2基因时，允许在所述植物上产生捕食性螨(特别是斯氏钝绥螨和/或Amblydromalus limonicus)的异常腺毛表型以萜烯特别是α-蒎烯、月桂烯、蒈烯、α-水芹烯、β-水芹烯、对伞花烃、柠烯、δ-榄香烯、β-石竹烯和/或α-葎草烯的减少为特征。术语“萜烯的减少”如上定义。
本发明进一步涉及此类修饰的myc2基因用于开发包含降低水平的萜烯的植物或显示不存在萜烯的植物的用途。
本发明进一步涉及此类修饰的myc2基因在开发表现出异常腺毛表型的植物中的用途，其中所述异常腺毛表型是由与未修饰的野生型MYC2蛋白活性相比MYC2蛋白活性的降低或不存在所引起的。
可以使用修饰的myc2基因的一种方式是通过减少其表达。减少的表达可以通过，与未修饰的野生型myc2基因的mRNA水平、蛋白水平或蛋白活性相比，myc2基因的mRNA水平的降低、MYC2蛋白水平的降低和/或MYC2蛋白活性降低来实现。
本发明的修饰的myc2基因可用于赋予植物异常腺毛表型，其中所述植物选自甜椒(Capsicum annuum)、甜瓜(Cucumis melo)、黄瓜(Cucumis sativus)和西瓜(Citrulluslanatus)中的任何种。此外，修饰的myc2基因可用于减少或消除那些植物种中的萜烯。甜椒的myc2的野生型基因组序列、野生型CDS和野生型氨基酸序列分别描述为SEQ ID No.9、10和11。黄瓜的myc2的野生型基因组序列、野生型CDS和野生型氨基酸序列分别描述为SEQ IDNo.12、13和14。甜瓜的myc2的野生型基因组序列、野生型CDS和野生型氨基酸序列分别描述为SEQ ID No.15、16和17。西瓜的myc2的野生型基因组序列、野生型CDS和野生型氨基酸序列分别描述为SEQ ID No.18、19和20。
Slmyc2和myc2基因都可以通过诱变进行修饰。诱变包括通过一种或多种化学化合物，诸如甲磺酸乙酯、亚硝基甲脲、羟胺、原黄素、N-甲基-N-亚硝基胍、N-乙基-N-亚硝基脲、N-甲基-N-硝基-亚硝基胍、硫酸二乙酯、乙烯亚胺、叠氮化钠、福尔马林、氨基甲酸乙酯、苯酚和环氧乙烷；和/或通过物理方法，诸如UV-辐照、快中子曝露、X-射线、γ辐照；和/或通过插入遗传元件，诸如转座子、T-DNA、逆转录病毒元件的方法随机引入至少一种修饰。
诱变还包括通过同源重组、基于寡核苷酸的突变诱导、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)或成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)系统更特异性地、靶向引入至少一种修饰。
或者，可以使用遗传修饰将本发明的修饰的Slmyc2或myc2基因导入植物中。遗传修饰包括使用来自不可杂交种或合成基因的基因的转基因修饰(transgenicmodification)或转基因作用(transgenesis)，以及使用来自作物本身或来自性兼容的供体植物的(编码(农业)性状的)天然基因的同源转基因修饰(cisgenic modification)或同源转基因作用(cisgenesis)。
在一个实施方案中，修饰的Slmyc2或myc2基因是外源Slmyc2或myc2基因，其可通过转基因方法或同源转基因方法引入植物中。
本发明还涉及修饰的重组Slmyc2或myc2基因，其中所述修饰的重组Slmyc2或myc2基因的表达由强启动子驱动，所述启动子与Slmyc2或myc2基因序列可操作地连接，所述基因序列包括5'-UTR、CDS和/或3'-UTR。强组成型启动子的许多实例是本领域已知的，其中一些最常用是例如花椰菜花叶病毒35S-启动子(pCaMV 35S)及其修饰形式、来自各种植物种的泛素启动子、来自各种植物种的肌动蛋白启动子和延伸因子1α(ElF1α)的启动子。
在一个实施方案中，本发明涉及基因构建体，所述基因构建体包含可选择标记、启动子序列、Slmyc2或myc2基因序列和终止子序列。
在一个方面，本发明涉及用于产生番茄植物的方法，所述植物包含能够赋予异常腺毛表型的允许产生螨(特别是捕食性螨斯氏钝绥螨和/或Amblydromalus limonicus)的修饰的Slmyc2基因，该方法包括：
a)使包含所述修饰的Slmyc2基因的植物与另一植物杂交；
b)自交所得F1植物以获得F2植物；
c)在F2中选择表现出异常腺毛表型和/或包含修饰的Slmyc2基因的植物；
d)任选地额外进行一轮或多轮自交或杂交，并且随后选择包含本发明的性状或修饰的基因的植物。
在本申请上下文中，词语“性状”指植物的表型。特别地，词语“性状”是指本发明的性状，更特别是指作为修饰的Slmyc2基因存在的结果的允许产生螨(特别是捕食性螨斯氏钝绥螨和/或Amblydromalus limonicus)的异常腺毛表型。术语“遗传决定子”用于赋予本发明的性状的植物基因组中的遗传信息，遗传信息是修饰的Slmyc2基因。当植物表现本发明的性状时，其基因组包含赋予本发明的性状的遗传决定子。因此，该植物具有本发明的遗传决定子。根据本发明，遗传决定子包含修饰的Slmyc2基因。
显然，提供本发明的性状的亲本植物不一定是直接从保藏的种子培育而来的植物。亲本植物还可以来自通过其它方式鉴定为包含本发明的性状的种子的后代植物。
在一个方面，本发明涉及用于产生番茄植物的方法，所述植物包含能够赋予异常表型腺毛的允许产生螨(特别是捕食性螨斯氏钝绥螨和/或Amblydromalus limonicus)的修饰的Slmyc2基因，该方法包括：
a)使包含所述修饰的Slmyc2基因的植物与另一植物杂交；
b)任选地使得到的F1植物与优选的亲本植物回交；
c)在F2中选择表现出异常表型腺毛和/或包含修饰的Slmyc2基因的植物；
d)任选地额外进行一轮或多轮自交或杂交，并且随后选择表现出异常腺毛表型的植物作为包含修饰的Slmyc2基因的植物。
本发明另外提供了将另一所需性状引入番茄植物中的方法，所述植物包含能够赋予异常腺毛表型的允许产生螨(特别是捕食性螨斯氏钝绥螨和/或Amblydromaluslimonicus)的修饰的Slmyc2基因，该方法包括：
a)使包含修饰的Slmyc2基因的番茄植物(其代表性种子以保藏号NCIMB 4222保藏)与展示所需性状的第二番茄植物杂交以产生F1后代；
b)选择表现所述异常腺毛表型和/或包含修饰的Slmyc2基因和所需性状的F1后代；
c)使选择的F1后代与任一亲本植物杂交，以产生回交后代；
d)选择表现出所需性状和异常腺毛表型和/或包含修饰的Slmyc2基因的回交后代；以及
e)任选地连续重复步骤c)和d)一次或多次以产生表现出所需性状和异常腺毛表型的所选第四或更高回交后代。本发明包括通过该方法产生的番茄植物。
在一个实施方案中，优选通过使用SEQ ID No.1或2在F1或任何其他代中进行表现出本发明的异常腺毛表型的植物的选择。在另一方面，本发明的性状的选择开始于杂交或备选地回交的F2。F2中植物的选择可以通过表型以及通过使用直接或间接检测性状内在遗传决定子的所述序列进行。
在一个实施方案中，对表现出异常腺毛表型的植物的选择开始于F3或更晚的代。
在一个实施方案中，包含遗传决定子的植物是近交系、杂种、双单倍体或分离群体的植物。
本发明还提供了通过使用双单倍体产生技术以产生包含修饰的Slmyc2基因的双单倍体系来产生包含本发明的修饰的Slmyc2基因的番茄植物的方法。
本发明还涉及可以培育成包含本发明的修饰的Slmyc2基因的番茄植物的杂交种子，以及用于生产此类杂交种子的方法，该方法包括使第一亲本植物与第二亲本植物杂交并收获所得杂交种子，其中所述第一亲本植物和/或所述第二亲本植物是本发明的植物。
在一个实施方案中，本发明涉及用于产生包含本发明的修饰的Slmyc2基因的杂交番茄植物的方法，该方法包括使包含本发明的修饰的Slmyc2基因的第一亲本番茄植物与第二亲本番茄植物杂交并收获所得的杂交种子，并将所述杂交种子培育成杂交植物。
本发明还涉及通过使用包含用于培育所述番茄植物的本发明的修饰的Slmyc2基因的种子来生产番茄植物的方法，所述植物包含能够赋予允许产生螨(特别是捕食性螨斯氏钝绥螨和/或Amblydromalus limonicus)的异常腺毛表型的修饰的Slmyc2基因。种子是合适的种子，其中种子的代表性样品以登录号NCIMB 42222保藏于NCIMB。
本发明还涉及用于获得表现出允许产生螨(特别是捕食性螨斯氏钝绥螨和/或Amblydromalus limonicus)的异常腺毛表型的番茄植物的方法，该方法包括通过植物的Slmyc2基因的突变来降低植物中SlMYC2蛋白的内源水平。
本发明还涉及用于种子生产的方法，该方法包括将其代表性样品以登录号NCIMB42222保藏于NCIMB的种子培育成番茄植物，允许植物产生种子并收获那些种子。种子的产生适当地通过杂交或自交来进行。
在一个实施方案中，本发明涉及通过使用组织培养物产生包含本发明的修饰的Slmyc2基因的番茄植物的方法。
本发明还涉及通过使用营养繁殖产生包含本发明的修饰的Slmyc2基因的番茄植物的方法。
在一个实施方案中，本发明涉及通过使用遗传修饰以将所述修饰的Slmyc2基因渐渗入番茄植物中来生产包含本发明的修饰的Slmyc2基因的番茄植物的方法。遗传修饰包括使用来自不可杂交种或合成基因的基因的转基因修饰或转基因作用，以及使用来自作物本身或来自性兼容的供体植物的(编码(农业)性状的)天然基因的同源转基因修饰或同源转基因作用。
本发明还涉及用于开发包含本发明的修饰的Slmyc2基因的番茄植物的育种方法，其中使用了包含本发明的所述修饰的Slmyc2基因的种质。包含本发明的修饰的Slmyc2基因并且是代表种质的所述植物的代表性种子以保藏号NCIMB 42222保藏于NCIMB。
在进一步的实施方案中，本发明涉及用于产生包含本发明的修饰的Slmyc2基因的番茄植物的方法，其中包含赋予本发明的性状的修饰的Slmyc2基因的植物的后代或繁殖材料被用作来源，以将所述性状基因渐渗入另一种番茄植物中。包含本发明的修饰的Slmyc2基因的植物的代表性种子以保藏号NCIMB 42222保藏于NCIMB。
本发明优选提供包含能够赋予允许产生螨(特别是捕食性螨斯氏钝绥螨和/或Amblydromalus limonicus)的异常腺毛表型的修饰的Slmyc2基因的番茄植物，该植物可通过任何本文所述的和/或技术人员熟悉的方法所得到。
由本发明的修饰的Slmyc2基因赋予的异常腺毛表型使得能够在植物上产生捕食性螨(其通常不产生在具有非异常腺毛表型的番茄植物上)，并且通过这些螨来允许生物害虫防治。
保藏
包含本发明的修饰的Slmyc2基因(其能够赋予异常腺毛表型，其允许产生螨，特别是捕食性螨斯氏钝绥螨和/或Amblydromalus limonicus)的代表性种子以登录号NCIMB42222于2014年2月24日保藏于英国国家工业、食品和海洋微生物保藏中心NCIMB Ltd.(Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen，AB21 9YA)。保藏的所有种子均纯合包含修饰的Slmyc2基因。由这些种子培育的植物因此允许产生螨，特别是捕食性螨斯氏钝绥螨和/或Amblydromalus limonicus。
保藏的种子不满足获得植物品种保护所需的DUS标准，因此不能被认为是植物品种。
本发明将在下列实施例中阐明。这些实施例仅用于说明性目的，而不应被解释为以任何方式限制本发明。
附图
图1：本发明的修饰的Slmyc2基因的序列。SEQ ID No.1描述了基因组DNA序列。在SEQ ID No.1中，起始密码子的第一个碱基对(bp)位于位置2648处。终止密码子的最后一个碱基对位于SEQ ID No.1的位置4540处。SEQ ID No.2反映了编码序列(CDS)。SEQ ID No.3描述了蛋白质序列。SEQ ID No.4描述了基因内标记物SL06992的突变序列。
图2：野生型Slmyc2基因的序列。SEQ ID No.5描述了基因组DNA序列。在SEQ IDNo.5中，起始密码子的第一个碱基对(bp)位于位置2648处。终止密码子的最后一个碱基对位于SEQ ID No.5的位置4540处。SEQ ID No.6反映了编码序列(CDS)。SEQ ID No.7描述了蛋白质序列。SEQ ID No.8描述了基因内标记物SL06992的野生型序列。
图3：几个番茄品种和甜椒对照的每周每片叶上的斯氏钝绥螨的平均密度(数目±SE)。
图4A：显示包含纯合突变(Mo14/001-006)的植物和包含杂合突变(Mo14/007-012)的植物以及野生型植物(Mo14/013-018)以任意单位(A.U.)的选定的挥发物的水平的表格。
醛：顺式-3-己烯醛
单萜烯：α-蒎烯、月桂烯、蒈烯、α-和β-水芹烯、对伞花烃、柠烯。倍半萜：δ-榄香烯、β-石竹烯、α-葎草烯。单萜类：马鞭草烯。
已针对柠烯校正
也称为α-石竹烯
图4B：显示包含杂合突变(Mo14/007-012)的植物和野生型植物(Mo14/013-018)以任意单位(A.U.)测量的选定的挥发物的平均水平的表格；P值用学生t检验计算，并且显示杂合和野生型植物之间的差异是否显著(P<0.05)。
图5：腺毛表型的图片。在图5A中，用圆圈表示在本发明的番茄植物上发现的VI型毛状体。在图5B中，用圆圈表示在非突变体背景番茄植物上发现的VI型毛状体。
图6：其他植物种的MYC2氨基酸序列。SEQ ID No.9至11分别描绘了甜椒的基因组DNA序列、编码DNA序列和氨基酸序列。在SEQ ID No.9中，起始密码子的第一个碱基对(bp)位于位置2387处。终止密码子的最后一个碱基对位于SEQ ID No.9的位置4459处。SEQ IDNo.12至14分别描绘了黄瓜的基因组DNA序列、编码DNA序列和氨基酸序列。在SEQ ID No.12中，起始密码子的第一个碱基对(bp)位于位置1578处。终止密码子的最后一个碱基对位于SEQ ID No.12的位置3563处。SEQ ID No.15至17分别描绘了甜瓜的基因组DNA序列、编码DNA序列和氨基酸序列。在SEQ ID No.15中，起始密码子的第一个碱基对(bp)位于位置2515处。终止密码子的最后一个碱基对位于SEQ ID No.15的位置4503处。SEQ ID No.18至20分别描绘了西瓜的基因组DNA序列、编码DNA序列和氨基酸序列。在SEQ ID No.18中，起始密码子的第一个碱基对(bp)位于位置2408处，终止密码子的最后一个碱基对位于SEQ ID No.18的位置4378处。
图7：萜烯合酶基因在本发明的纯合和杂合植物和非突变体背景植物中的表达。
图8：包含修饰的Slmyc2基因的植物(突变体)和Razymo植物上每周每小叶各自的番茄刺皮瘿螨的平均密度(数目±SE)。评估恰好在斯氏钝绥螨释放(第0周)之前开始，其在番茄刺皮瘿螨之后4周释放。具有相同字母的图例没有显著不同(GLMM，P>0.05)。
图9：实验过程中包含修饰的Slmyc2基因的植物的每片叶片的烟粉虱若虫的平均密度(数目±SE)。具有相同字母的图例没有显著不同(GLMM，P>0.05)。
图10A：夏季实验期间包含修饰的Slmyc2的植物的每片叶片的西花蓟马的平均密度(数目±SE)。具有相同字母的图例没有显著不同(GLMM，P>0.05)。
图10B：冬季实验期间包含修饰的Slmyc2的植物的每片叶片的西花蓟马的平均密度(数目±SE)。具有相同字母的图例没有显著不同(GLMM，P>0.05)。
实施例
实施例1
本发明的番茄植物的产生
用ems(甲基磺酸乙酯)通过将大约10,000个种子在室温下浸入0.5％(w/v)ems的充气溶液中24小时来处理两株番茄育种系(TR306和T029)的种子。
在温室中使处理的种子萌发并培育所得植物以产生M2种子。
成熟后，收获M2种子并将其混合在一个库中。将得到的M2种子库用作起始材料以鉴定显示异常腺毛表型的个体M2植株。
遗传修饰过程的效力通过确定变淡(bleached)植物的出现来评估，其指示由于直接或间接参与叶绿素形成或积累的基因的修饰所造成的叶绿素损失。VI型毛状体表型如图5所描述。
实施例2
允许产生捕食性螨斯氏钝绥螨的番茄植物的鉴定
将两株育种系(TR306和T029)、市售的杂种和来自实施例1所述实验的三种突变体用于生物测定，以研究捕食性螨斯氏钝绥螨是否能够在这些番茄植物上产生。作为阳性对照，在该实验中也包括甜椒品种Compas RZ。
在表1中，给出了所述系和品种的概述。生物测定发生在西班牙地中海生长条件下的多通道温室中。该温室被分成4个隔室，其中之一被分成40个5×3.5×4米(l×w×h)的步入式笼，其中5个被实验期间使用。在具有七个植物种的五个同样的植株(replicate)的完全随机区块设计中比较处理的情况，所述七个植物种为六个番茄品种(5个选择的+1个市售的[阴性对照])和1个甜椒(阳性对照)。
每个同样的植株由每个系或品种的两个盆栽植株组成，两个盆栽植株被使用盆上的粘性带和顶部螺纹用于训练植株以避免捕食性螨在相邻同样的植株之间移动而分开。在每个区块(笼)中分配每个植物种的一个同样的植株。这些植物的种子在2012年7月底播种，并且作为每个测试系/品种的一式两份的重复(duplicate)放入总共6个笼中。
通过以100只捕食性螨/植株的比例将包含螨的承载材料喷洒在所有植株上，将捕食性螨斯氏钝绥螨释放到6周龄植株上。每克承载材料上的螨数量用于估计释放量。
捕食性螨最初通过自由添加花粉给饲，并且在捕食性螨释放后开始添加，并且此后每周持续进行3周。在捕食性螨释放后1周开始，以每两周一次对植物采样6周。在每次采样中，在每个实验笼中随机选择5株植株，并从这5株随机选择的植株中的每株采样5片叶。叶沿植株随机进行选择。在每片叶上，对植绥螨的未成熟阶段(幼虫、第一若螨和第二若螨)和成虫进行计数。
结果显示在图3中。变得清楚的是，包含本发明的修饰的Slmyc2基因的系#6显示了最大数量的螨的产生。它显著多于在甜椒对照植物的叶上发现的数量。
表1
编号 描述 登录号
系#1 杂种 Mecano
系#2 育种系 TR306
系#3 EMS突变体 302
系#4 EMS突变体 304
系#5 育种系 T029
系#6 EMS突变体 305
甜椒 甜椒 Compas RZ
实施例3
QTL定位
将包含本发明的修饰的Slmyc2基因的番茄突变体与亲本系TR306杂交。从该杂交产生F2定位群体，其用于群体特异性遗传图构建和QTL定位。
总计有940个标记用于分析86个后代个体。其中，241个是多态的、多信息的(足够的分离)和有用的(不是很多U分数)。
F2个体被评分成两类：hl(具有本发明的性状)、wt(野生型表型，包括不清楚的表型)。
由于性状被认为是(单基因)隐性的，这应该导致性状的3:1分离。实际上，该翻译中的性状分布是wt:hl为61:25，其与预期的3:1的比例(卡方检验＝0.38)没有显著不同。
用MapQTL 6.0进行连锁分析。首先，进行区间作图以鉴定与性状连锁的区域或标记。第二，选择辅因子，之后(作为第三步)进行MQM定位。
多态性标记对8号染色体的覆盖度相当低，因为只有5个标记被鉴定。由于性状被作图的区段相当大(至少12cM)，具有更多标记的群体的分析对于性状的良好作图是必要的。然而，鉴于在该杂交中的8号染色体上的许多标记似乎是非多态性的，这在标记选择中可能最初需要付出额外的努力。
实施例4
本发明的修饰的Slmyc2基因的鉴定
除了如实施例3中所述进行定位的QTL之外，还研究了是否可以鉴定本发明的性状内在的基因。
进行本发明的植物和非突变体背景的植物的全基因组测序(WGS)。因为实施例3显示8号染色体包含本发明的修饰的Slmyc2基因，在该染色体上产生的所有25个纯合SNP标记都被列入考虑范围。在这25个标记中，发现4个标记无差别，因此在本发明的植物和非突变体背景之间没有观察到差异。
对来自多个F4群体的总共227株植物进行表型分型，80株个体显示出本发明的表型。值得注意的是，21个标记中的一个对于本发明的所有80株植物是具有100％预测性的。对于这些植物中的21株，标记SL06992给出了独特的阳性得分。称为SL06992(SEQ ID No.4)的该SNP标记被进行了序列比对(blast)，并发现其位于与如被注释的AUGUSTUS预测的基因SL2_40ch08.g6相同的8号染色体上的位置上。在该注释中，基因组序列的位置4124的核苷酸在本发明的植物中从G改变为T。这对应于代表野生型序列的SEQ ID No.8中的相同位置。所述核苷酸改变导致氨基酸的位置493处产生终止密码子，从而产生截短形式的蛋白质。
实施例5
测定本发明的植物中的萜烯水平
为了测量本发明的植物(即包含修饰的Slmyc2基因的植物)中的萜烯水平，使用已去头的番茄植物。从自植物顶部的第一、第二和第三叶采样。总共收集了0.71cm2的五片叶盘。将它们储存在10ml小瓶中，并且加入1.0ml溶剂二氯甲烷。
随后，轻轻振荡叶盘。45-90分钟后，将溶剂转移到另一小瓶中。直到分析之前，溶剂提取物储存于-20℃下。
在进行分析时，将200μl包含挥发物的溶剂与5μl内标乙酸壬酯混合。将1μl的该混合物注入气相色谱-质谱(GC-MS)仪器中。
为了显示本发明的植物和杂合以及野生型植物的挥发性量的比率，结果以任意单位显示。图4中给出的值已针对内标乙酸壬酯进行了标准化。
从结果清楚可见，在本发明的植物中不存在单萜和倍半萜，而在不包含本发明的修饰的Slmyc2的植物中，显示萜的存在是显著的(P<0.05)。
实施例6
测定本发明的植物中萜烯合酶(TPS)基因的表达水平
为了确定某些萜烯的不存在是否与TPS基因的表达相关，设计了qPCR实验。对本发明的植物的三片顶叶进行采样、合并，并且使用RNeasy试剂盒(Qiagen)、使用100mg植物组织分离RNA。使用Maxima cDNA合成试剂盒(Thermo Scientific)从总共1000ng RNA开始合成cDNA。检测番茄中TPS基因表达的引物组合来源于Falara等人(Plant.Phys.157,770-789(2011))。使用Rotor-Gene Q PCR循环仪(Qiagen)来执行qPCR的运行。
如图7所示，检测了含有纯合或杂合突变的本发明的植物和非突变体背景的12个TPS基因的倍数变化规律。三种类型的表达模式能够得到鉴定。在野生型植物中检测到基因TPS16、TPS17和TPS33的表达，而在本发明的纯合植物和杂合植物中均未检测到表达，因为其未达到荧光信号阈值水平。在本发明的纯合以及杂合突变体植物中检测到TPS21和TPS41的表达并且明显下调。在纯合突变体植物中没有检测到其他TPS基因的表达，因为其未达到荧光信号阈值水平。当与野生型表达模式相比时，观察到杂合植物的下调。
实施例7
对包含修饰的Slmyc2基因的植物对螨产生的影响和斯氏钝绥螨抗番茄刺皮瘿螨(Aculops lycopersici)的有效性的评估
实验在位于Vicar(Almeria，Andalusia，Spain)的多通道温室中进行。该实验在包括总计16个5×3.5×4m(l×w×h)的步入式(实验的)笼的温室中进行。
在具有四个同样的植株的分区(split plot)设计中，植物品种和捕食性螨两个因素得到了评估。存在两个植物种(包含修饰的Slmyc2基因和Razymo的植物)的四个主要区(四个笼子的组)，每个分成两个子区(实验笼)，每个随机指定用于以下处理中的每一个：0或75个斯氏钝绥螨/植株。
从含有混有捕食性螨和承载材料(SWIRSKI-MITETM)的50,000个不同阶段和卵的螨的瓶子中的科伯特生物系统(Koppert Biological System)中获得斯氏钝绥螨。从在实验开始之前从在番茄上保持几个月的饲养集落获得侵染植物的番茄刺皮瘿螨TRM(Aculopslycopersici)，并且最初收集于来自Murcia(Spain)的区域内不同地点的番茄植物上。
将番茄cv.Razymo和包含修饰的Slmyc2基因的植物的种子播种在泥炭藓根立方体中。当幼苗达到五叶期时，将它们以每笼10株幼苗移植到放置在指定的步入式笼内的25l可可泥炭纤维袋中。移植后两周，用约250个活动期的TRM接种每株番茄植株。在立体显微镜下计数螨，以选择含有约50个螨的小叶的片，并将其中的5片小叶放置在每株植物的不同叶上。同时收集所有侵染植物并来自植株的同一部分的螨，以确保龄期和性别比的均匀性。番茄刺皮瘿螨释放后4周，在指定的笼中立即释放捕食性螨。通过以75个捕食性螨/植株的比率将承载材料喷洒在所有植株上来分布斯氏钝绥螨。每克底物的螨数量用于计算释放量。
评估刚好在捕食性螨释放前开始，之后每周持续直到实验结束。为了评估TRM的密度，在每个采样中，在每个步入式笼中随机选择四株植株，并且从每株选择的植株的3片不同叶取3个叶盘(一个叶盘/叶)。一片叶随机选自植株的上部，一片叶随机选自植株的中部，并且第三片叶随机选自植株的底部。叶盘样品被带到实验室进入冷藏冷箱，然后使用立体显微镜计数TRM(活动期)的数目。通过计数存在于相同的上述叶中但在挑选叶盘以计数TRM数目之前的捕食性螨(活动形式)的数量，原位评估捕食性螨群体。
来自该实验的结果显示在图8中。除了含有包含修饰的Slmyc2基因并接受斯氏钝绥螨的植物的那些(其中TRM的平均值总是处于低于7.5个螨/小叶的值，为实验结束时的其它处理的1/20)，TRM的数目在整个实验期间逐渐增加并且在所有区中具有相似的平均数。因此，在包含修饰的Slmyc2基因的植物上，TRM的丰度对于斯氏钝绥螨的响应较低(F3,45＝17.640；P<0.001)。
实施例8
对包含修饰的Slmyc2基因的植物上斯氏钝绥螨和Amblydromalus limonicus抗烟粉虱(Bemisia tabaci)(粉虱)的有效性的评估
实验在位于Vicar(Almeria，Andalusia，Spain)的多通道温室中进行。该实验在包括总计16个5×3.5×4m(l×w×h)的步入式(实验的)笼的温室中进行。
在夏季和冬季实验期间，在具有每个实验中4个同样的植株的完全随机区块设计中比较三种处理。处理为：1)烟粉虱；2)烟粉虱+斯氏钝绥螨；3)烟粉虱+A.limonicus。
在两个实验中，均从保持在烟草植物上的群体饲养集落中收集侵染植物的烟粉虱成虫。从含有混有捕食性螨和承载材料(SWIRSKI-MITETM)的50,000个不同阶段和卵的捕食性螨的瓶子中的科伯特生物系统中获得斯氏钝绥螨。从含有混有捕食性螨和承载材料(LIMONICATM)的10,000个不同阶段和卵的螨的瓶子中的科伯特生物系统中获得A.limonicus。
将包含修饰的Slmyc2基因的番茄植物的种子播种在泥炭藓根立方体中。当幼苗达到五叶期时，将它们以每笼10株幼苗移植到放置在指定的步入式笼内的25l可可泥炭纤维袋中。将成虫在8℃的冷室中短暂冷却以计数，然后连续三周以每周10个成虫/植株和5个雌虫/植株的比率释放到所有笼中，总共30个粉虱成虫/植株。在移植后即释放第一只粉虱成虫。这个释放时间表用来模拟害虫逐步但巨大的迁移进入温室。对于所有笼子每周的侵染，从大规模饲养中同时收集成年粉虱并属于同一组群以确保龄期和性别比的均匀性。在第一次成年害虫释放后一周，通过以75个捕食性螨/植株的比率将承载材料喷洒在所有植株上释放斯氏钝绥螨和A.limonicus。每克底物的螨数量用于计算释放量。
在实验中，在每个周采样中，在每个实验笼中随机选择四株植株，并从四株随机选择的植株中的每一株中采样三片叶。一片叶随机选自植株的上部，一片叶随机选自植株的中部，并且第三片叶随机选自植株的底部。在每片叶上，对烟粉虱若虫和成虫以及植绥螨的未成熟阶段(幼虫、第一若虫和第二若虫)和成虫进行计数。
粉虱侵染实验的结果显示在图9中。粉虱若虫的群体类似地被斯氏钝绥螨和A.limonicus所抑制。而且，在接受捕食性螨的区的整个实验过程中，每叶的粉虱若虫数几乎保持不变，并且从未超过每叶15个。
实施例9
在夏季和冬季条件下，对在包含修饰的Slmyc2基因的植物上斯氏钝绥螨和Amblydromalus limonicus抗西花蓟马(Frankliniella occidentalis)(蓟马)的有效性的评估
实验在位于Vicar(Almeria，Andalusia，Spain)的多通道温室中进行。该实验在包括总计16个5×3.5×4m(l×w×h)的步入式(实验的)笼的温室中进行。
在夏季和冬季实验期间，在具有每个实验中4个同样的植株的完全随机区块设计中比较三种处理。处理为：1)西花蓟马；2)西花蓟马+斯氏钝绥螨；3)F.西花蓟马+A.limonicus。
在两个实验中，均从在绿豆荚上保持科伯特生物系统的饲养集落中获得侵染植物的西花蓟马成虫。由含有混有捕食性螨和承载材料(SWIRSKI-MITETM)的50,000个不同阶段和卵的捕食性螨的瓶子中的科伯特生物系统提供斯氏钝绥螨。从含有混有捕食性螨和承载材料(LIMONICATM)的10,000个不同阶段和卵的螨的瓶子中的科伯特生物系统中获得A.limonicus。
夏季和冬季实验的程序相同。将包含修饰的Slmyc2基因的番茄植物种子播种在泥炭藓根立方体中(夏季：1/7/2014；冬季：22/09/2014)。当幼苗达到五叶期时，将它们以每笼10株幼苗移植到放置在指定的步入式笼内的25l可可泥炭纤维袋中(夏季：5/8/2014；冬季：28/10/2014)。将成虫在8℃的冷室中短暂冷却以计数，然后连续三周以每周10个成虫/植株和5个雌虫/植株的比率释放到所有笼中，总共15只雌性蓟马/植株。在移植后即释放第一只蓟马成虫。这个释放时间表用来模拟两种害虫逐步但巨大的迁移进入温室。新出现的成年蓟马用于实验，其于每个组群在每周的释放之前收集，以确保龄期的均匀性。雌性蓟马与未知数量的雄性蓟马混合。在第一次成年害虫释放后一周(夏季：12/8/2014；冬季：4/11/2014)，通过以75个捕食性螨/植株的比率将承载材料喷洒在所有植物上释放斯氏钝绥螨和A.limonicus。每克底物的螨数量用于计算释放量。
在夏季和冬季实验中，在每个周采样中，在每个实验笼中随机选择四株植株，并从四株随机选择的植株中的每一株中采样三片叶。一片叶随机选自植株的上部，一片叶随机选自植株的中部，并且第三片叶随机选自植株的底部。在每片叶上，对蓟马成虫和活动形式的蓟马和植绥螨的成虫进行计数。
蓟马侵染实验的结果显示在图10中。A.limonicus和斯氏钝绥螨能够在夏季或冬季显著减少蓟马群体，虽然在冬天A.limonicus比斯氏钝绥螨更有效(夏季：F2,31＝21.632；P<0.001；冬季：F2,45＝48.789；P<0.001；图10)。在夏季，在接受捕食性螨的笼子中，每片叶的蓟马捕食者数量在整个实验期间逐渐减少，在结束时几乎没有记录到蓟马(图10A)。在冬季，两种捕食性螨在第一周期间都类似地减少害虫群体，但在实验中途(大约当平均每日温度低于20℃时)，由斯氏钝绥螨处理的区的蓟马密度迅速增加，达到和实验结束时未处理笼子相比的类似密度，这反映了害虫不受捕食性螨的控制(图10B)。已知斯氏钝绥螨在低于20℃的温度下活性较低。相反，在接受A.limonicus的笼子中，蓟马密度仍然保持恒定，并且平均总在3个以下，约为接受斯氏钝绥螨的笼子的1/6。因此，A.limonicus仍然可以在斯氏钝绥螨活性较低的温度下成功使用。

Claims (16)

1.修饰的Slmyc2基因，其与SEQ ID No.5的野生型序列相比包含至少一个修饰，所述修饰导致SlMYC2蛋白活性的降低或不存在，其中所述修饰的Slmyc2基因能够赋予番茄(Solanum lycopersicum)植物异常腺毛表型。
2.权利要求1所述的修饰的Slmyc2基因，其中所述修饰选自，与SEQ ID No.5的野生型Slmyc2基因相比，降低Slmyc2基因的mRNA水平的修饰、降低SlMYC2蛋白水平的修饰和/或降低SlMYC2蛋白活性的修饰。
3.权利要求1或2所述的修饰的Slmyc2基因，其中所述修饰导致编码序列内存在提前终止密码子。
4.权利要求3所述的修饰的Slmyc2基因，其中所述修饰包含SEQ ID No.2的位置1477上的SNP，特别是从核苷酸G(野生型)到T。
5.权利要求1至4中任一项所述的修饰的Slmyc2基因，其中所述异常腺毛表型以萜烯特别是α-蒎烯、月桂烯、蒈烯、α-水芹烯、β-水芹烯、对伞花烃、柠烯、δ-榄香烯、β-石竹烯和/或α-葎草烯的减少和优选不存在为特征，和/或所述异常腺毛表型以变形的腺毛为特征。
6.番茄植物，其包含权利要求1至5中任一项所述的修饰的Slmyc2基因。
7.权利要求6所述的番茄植物，其中所述植物表现出异常腺毛表型，其允许在所述番茄植物上产生捕食性螨，特别是斯氏钝绥螨(Amblyseius swirskii)和/或Amblydromaluslimonicus。
8.番茄种子，其包含权利要求1至5中任一项所述的修饰的Slmyc2基因，其中可由该种子培育的植物显示异常腺毛表型。
9.权利要求6或7所述的番茄植物的后代植物，其中所述后代植物包含如权利要求1至5中任一项所述的修饰的Slmyc2基因。
10.繁殖材料，其能够发育成如权利要求6或7所述的番茄植物和/或衍生自如权利要求6或7所述的番茄植物，其中所述繁殖材料包含如权利要求1至5中任一项所述的修饰的Slmyc2基因，并且其中所述繁殖材料选自由小孢子、花粉、子房、胚珠、胚、胚囊、卵细胞、插条、根、根尖、下胚轴、子叶、茎、叶、花、花药、种子、分生组织细胞、原生质体和细胞、或其组织培养物组成的组。
11.权利要求1至5中任一项所述的修饰的Slmyc2基因用于开发番茄植物的用途，在所述番茄植物上可以产生捕食性螨，特别是斯氏钝绥螨和/或Amblydromalus limonicus。
12.权利要求11所述的用途，其中异常腺毛表型允许产生捕食性螨，特别是斯氏钝绥螨和/或Amblydromalus limonicus。
13.权利要求12所述的用途，其中异常腺毛表型以萜烯特别是α-蒎烯、月桂烯、蒈烯、α-水芹烯、β-水芹烯、对伞花烃、柠烯、δ-榄香烯、β-石竹烯和/或α-葎草烯的减少和优选不存在为特征，和/或所述异常腺毛表型以变形的腺毛为特征。
14.如权利要求6或权利要求7所述的番茄植物用于培养和保存捕食性螨或来自其的集落的用途。
15.获得表现出异常腺毛表型的番茄植物的方法，所述异常腺毛表型允许产生螨，特别是捕食性螨斯氏钝绥螨和/或Amblydromalus limonicus，包括通过所述植物中Slmyc2基因的突变来降低所述植物中SlMYC2蛋白的内源水平。
16.修饰的myc2基因，其在植物中表达时导致所述植物中萜烯的减少和优选不存在萜烯，和/或优选其能够赋予所述植物异常腺毛表型，所述基因包含导致MYC2蛋白活性降低或不存在的修饰，并且其中所述修饰选自，与未修饰的野生型myc2基因相比，降低myc2基因的mRNA水平的修饰、降低MYC2蛋白水平的修饰和/或降低MYC2蛋白活性的修饰。
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