ES2929409T3

ES2929409T3 - Plantas de tomate que permiten el establecimiento de ácaros

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Publication number: ES2929409T3
Application number: ES15763211T
Authority: ES
Inventors: Herwijnen Zeger Otto Van; Dörthe Bettina Dräger; Karel Bolckmans; Joode Jasper De; Houten Yvonne Van
Original assignee: Rijk Zwaan Zaadteelt en Zaadhandel BV
Current assignee: Rijk Zwaan Zaadteelt en Zaadhandel BV
Priority date: 2014-08-18
Filing date: 2015-08-17
Publication date: 2022-11-29
Anticipated expiration: 2035-08-17
Also published as: EP3182820A1; CA2955716A1; MX2017001927A; EP4147569A1; US20210317164A1; IL250214B2; IL250214A0; CA2955716C; US11091513B2; IL250214B; CN107075519A; WO2016026816A1; EP3182820B1; US20170164570A1

Abstract

La presente invención se refiere a un gen Slmyc2 modificado, que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de tipo salvaje de SEQ ID No. 5, modificación que conduce a la reducción o ausencia de la actividad de la proteína SlMYC2, donde el gen Slmyc2 modificado es capaz de confiriendo un fenotipo de pelo glandular aberrante a una planta de Solanum lycopersicum. La modificación se selecciona adecuadamente de una modificación que disminuye el nivel de ARNm del gen Slmyc2, una modificación que disminuye el nivel de la proteína Sl MYC2 y/o una modificación que disminuye la actividad de la proteína SlMYC2, en comparación con el tipo salvaje Gen Slmyc2 de SEQ ID No. 5. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Plantas de tomate que permiten el establecimiento de ácaros

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a una planta de Solanum lycopersicum que tiene un fenotipo de pelo glandular aberrante. La invención también se refiere a las semillas y la progenie de tales plantas y al material de propagación para obtener tales plantas. Además, la invención se refiere al gen Slmyc2 modificado que es capaz de conferir un fenotipo de pelo glandular aberrante a una planta de Solanum lycopersicum. La invención también se refiere al uso del gen Slmyc2 modificado para el desarrollo de una planta de Solanum lycopersicum en la que pueden establecerse ácaros depredadores, en particular Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus.

Antecedentes de la invención

Las plantas de la especie Solanum lycopersicum (tomate) pertenecen a la familia de las solanáceas, también conocidas como Solanaceae. Dentro de esta familia se agrupa actualmente en el género Solanum, que no sólo alberga al tomate, sino también los importantes cultivos alimentarios patata y berenjena. Es una especie de planta perenne, herbácea, floreciente, originaria de América del Sur.

Otras especies que se relacionan con el tomate dentro del género Solanum son por ejemplo Solanum pimpinellifolium, Solanum chilense, Solanum peruvianum y Solanum habrochaites. Aunque se sabe que el cruce puede ser considerablemente difícil, estas especies se usan para obtener rasgos valiosos en el cultivo de plantas de tomate. En la historia reciente, avances en el cultivo del tomate condujeron a variedades de tomate que tienen, por ejemplo, mayor rendimiento, mayor resistencia a enfermedades y mayor vida útil.

La producción comercial de hortalizas, que incluye la producción de tomate, se afecta por muchas condiciones. La elección del cultivador por una determinada variedad es un factor determinante, y constituye la base genética del resultado que puede conseguirse. En adición, hay muchos factores externos que influyen en el resultado. Las condiciones de crecimiento como el clima, suelo y uso de insumos como fertilizantes desempeñan una función importante. Existen diversas maneras de cultivar tomates y otros cultivos, entre los cuales, los más comunes son: producción a campo abierto, invernadero y casa de sombra. Aunque la especie puede cultivarse en una amplia gama de condiciones climáticas, se desempeña con mayor éxito en condiciones secas y cálidas. En adición a esto, la presencia de plagas y enfermedades también afecta el rendimiento total que puede alcanzarse.

El manejo de plagas y enfermedades en la producción de tomate y otros cultivos puede, en dependencia de la forma en que se cultiven las plantas, hacerse de varias maneras. Por un lado, el mejoramiento se enfoca en adicionar resistencias a plagas y enfermedades a la cartera de rasgos de las plantas. Los parientes silvestres de determinadas especies a menudo constituyen una fuente útil de tal germoplasma de resistencia. Alternativamente, las condiciones de crecimiento pueden modificarse de tal manera que la temperatura, niveles de humedad o intensidad de la luz se seleccionen para crear entornos menos favorables para el desarrollo de enfermedades y plagas. A menudo las temperaturas que son favorables para la producción exitosa de plantas y/o frutos, también son favorables para plagas importantes tales como la mosca blanca. En tercer lugar, pueden usarse herbicidas o pesticidas para erradicar malas hierbas y plagas, respectivamente. Sin embargo, el uso de tales compuestos químicos está en discusión ya que podría dejar residuos en las plantas y frutas que podrían comprometer la salud de los consumidores cuando dichas plantas y/o frutas se consuman.

Cuando las hortalizas se cultivan en invernaderos, los productores disponen de una cuarta alternativa de control de plagas, que se conoce como control biológico de plagas. Mediante la liberación de organismos vivos que ejercen su capacidad depredadora, parasitaria y/o herbívora junto con una función activa de manejo humano, los enemigos naturales pueden usarse para controlar determinadas plagas. Existen diversos insectos conocidos en la técnica que se crían comercialmente para su uso en invernaderos. Una de las familias de insectos importantes en este sentido se compone por Phytoseiidae que es ampliamente usada en el control biológico de la mosca blanca, araña roja y trips.

Además, el documento núm. WO06/057552 describe un método para el control biológico de plagas mediante el uso del ácaro depredador fitoseido Amblyseius swirskii. Sin embargo, estos ácaros no pueden establecerse por ellos mismos en las plantas de tomate, lo que significa que no pueden vivir y reproducirse. Esto los hace inadecuados para su uso como control biológico eficiente de plagas. Los productores de tomate pueden bloquearse por la ausencia de tales controles biológicos de plagas, porque las variedades de tomate aún no presentan buenas resistencias dirigidas a los insectos, especialmente a la mosca blanca. Si un invernadero se infesta de moscas blancas, un lote completo de plantas podría volverse inútil para la producción de hortalizas de alto rendimiento y alta calidad ya que las plantas podrían verse gravemente afectadas. Lo mismo se aplica al ácaro depredador fitoseido Amblydromalus limonicus, que tampoco es capaz de establecerse en las plantas de tomate.

Para el ácaro depredador Phytoseiulus persimilis, se sabe que puede usarse para combatir a Tetranychus urticae (araña roja) en plantas de tomate, pero este depredador se alimenta exclusivamente de especies de Tetranychus y, por lo tanto, no puede usarse para combatir infestaciones de otras especies. Para otro ácaro depredador, Neoseiulus californicus, se demostró un desempeño muy bajo en las plantas de tomate en el control de una infestación por especies de Tetranychus.

Por lo tanto, existe la necesidad de plantas de tomate que permitan la aplicación del control biológico de plagas mediante el establecimiento adecuado de ácaros, en particular los ácaros depredadores Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus. Tras un establecimiento exitoso, los ácaros pueden desempeñar su función deseada: funcionar como control biológico de plagas en la lucha contra la infestación de la mosca blanca así como también de trips.

En la investigación que condujo a la presente invención se desarrollaron plantas de tomate novedosas que comprenden un gen Slmyc2 modificado que es capaz de conferir un fenotipo de pelo glandular aberrante, lo que permite el establecimiento de ácaros, en particular de los ácaros depredadores Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus. Más en detalle, se determinó que los ácaros depredadores se obstaculizan por la presencia y/o aparición de un tipo específico de tricomas o pelos glandulares que están presentes en los tallos y hojas de las plantas de tomate y/o por los volátiles que se producen en las células de los pelos glandulares.

La superficie de las diversas partes de la planta del tomate y otros cultivos está cubierta de tricomas, tanto glandulares como no glandulares. Los tricomas no glandulares generalmente se consideran “pelos” y no producen, almacenan, ni secretan compuestos bioquímicos específicos.

Un tricoma glandular típicamente consta de un tallo, formado por una o más células, y una o más células glandulares en la punta del tallo que forman la cabeza glandular. Se identifican cuatro tipos diferentes de tricomas glandulares en tomate y especies de Solanum relacionadas, a saber, los tipos I, IV, VI, y VII. Estos tipos difieren en el tamaño y la longitud de los tallos y en el número de células secretoras que forman la cabeza glandular. Una variedad de compuestos bioquímicos del tomate se produce en los tricomas glandulares. (McDowell y otros, Plant Physiology vol.

155, 524-539 (2011)).

Los compuestos bioquímicos producidos por los diversos tricomas glandulares del tomate comprenden terpenos, terpenoides, flavonoides, ácidos grasos, alcaloides, y acil azúcares tales como acil glucosas y acil sacarosas. Se sabe que estos compuestos desempeñan una función importante en la atracción y repulsión de diversos insectos y en la determinación de la susceptibilidad a determinadas enfermedades. Sin embargo, muchos aspectos de las funciones de estos metabolitos aún no están claros, y se realizan amplias investigaciones para determinar con mayor precisión la funcionalidad de los tricomas glandulares y las sustancias que excretan.

Por tanto, la invención se refiere a un gen Slmyc2 modificado, que comprende al menos una modificación, en donde la modificación comprende un SNP en o antes de la posición 1477 de la SEQ ID NO. 6 que resulta en la presencia de un codón de parada prematuro dentro de la secuencia codificante o un cambio en el marco de lectura o comprende una mutación en la secuencia codificante que codifica un aminoácido diferente, y cuya modificación conduce a la reducción o ausencia de actividad de la proteína Slmyc2, en donde el gen Slmyc2 modificado es capaz de conferir un fenotipo de pelo glandular aberrante a una planta de Solanum lycopersicum.

El gen slmyc2 modificado también se denomina en la presente descripción “el gen de la invención” o “el gen slmyc2 modificado de la invención”. Estos términos se usan indistintamente en la presente descripción.

También se describe en la presente descripción que la modificación que conduce al gen Slmyc2 modificado se selecciona de una modificación que disminuye el nivel de ARNm del gen Slmyc2; una modificación que disminuye el nivel de la proteína Slmyc2; y/o una modificación que disminuye la actividad de la proteína Slmyc2, en comparación con el gen Slmyc2 de tipo salvaje.

Además, en la presente descripción se describe que la modificación que conduce al gen Slmyc2 modificado da como resultado la presencia de un codón de parada prematuro dentro de la secuencia codificante, en particular la modificación que comprende un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 1477 de SEQ ID NO. 2, que es la secuencia codificante (CDS). La CDS es esa porción de un gen, compuesta de exones, que codifica para la proteína. La SEQ ID NO.2 comprende la presencia de un SNP del nucleótido G (tipo salvaje) a T. Este SNP es el mismo que el SNP en la posición 4124 de la SEQ ID NO. 1, que es la secuencia genómica correspondiente. Este SNP da como resultado un codón de terminación en la posición de aminoácido 493 de la SEQ ID NO. 3, mientras que la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje (SEQ ID NO. 7) comprende un residuo de Glicina en esta posición. Este SNP, que da como resultado un gen Slmyc2 modificado, puede encontrarse en plantas cultivadas a partir de semillas de las cuales se depositó una muestra representativa en el NCIMB con el número de acceso NCIMB 42222. También se describe en la presente descripción que el gen Slmyc2 modificado se relaciona con cualquier SNP que aparezca en la SEQ ID NO. 6, que es la CDS de tipo salvaje, que da como resultado la presencia de un codón de terminación prematuro dentro de esa secuencia codificante. Tal SNP se denomina mutación sin sentido. Cualquier SNP de este tipo dará como resultado un codón de parada prematuro en la SEQ ID NO. 6. Además, se describe en la presente descripción que el gen Slmyc2 modificado se relaciona con cualquier SNP que ocurra antes de la posición 1477 de la SEQ ID NO. 6 que resulte en la presencia de un codón de terminación prematuro dentro de esa secuencia codificante. Cualquier SNP de este tipo dará como resultado un codón de terminación prematuro antes de la posición de aminoácido 493 de la SEQ ID NO. 7.

Un SNP también podría ser una mutación en la secuencia codificante que codifica un aminoácido diferente, en lugar de un codón de parada. Tal SNP se denomina mutación con cambio de sentido. También se describen en la presente descripción mutaciones con cambio de sentido que dan como resultado un gen Slmyc2 modificado de la invención.

Las modificaciones en la secuencia codificante distintas de los SNP que podrían dar como resultado el gen Slmyc2 modificado de la invención incluyen inserciones y/o deleciones. La inserción de uno o más nucleótidos puede afectar el corte y empalme correcto del ARNm o provocar un cambio en el marco de lectura. Estos eventos pueden dar como resultado una disminución del nivel de proteína S1MYC2 y/o una disminución del nivel de actividad de la proteína S1MYC2. La eliminación de uno o más nucleótidos podría, como las inserciones, dar como resultado un cambio en el marco de lectura. Este evento puede dar como resultado una disminución del nivel de proteína S1MYC2 y/o una disminución del nivel de actividad de la proteína S1MYC2.

También se describen en la presente descripción modificaciones en la secuencia genómica no codificante de Slmyc2, representada por la s Eq ID NO. 5. Las modificaciones en la secuencia no codificante incluyen mutaciones en la secuencia del intrón, la secuencia aguas arriba y/o aguas abajo. La secuencia aguas arriba, la secuencia anterior al codón de inicio del gen de la invención comprende el promotor y la región 5' no traducida (5'-UTR), también denominada secuencia líder. Dado que estas regiones participan en la regulación de la transcripción génica a ARNm y la posterior traducción y, por lo tanto, en la expresión génica, la modificación adecuada puede conducir a una disminución de la expresión a través de una disminución del nivel de ARNm de Slmyc2 y/o una disminución del nivel de la proteína S1mYc2.

El fenotipo de pelo glandular aberrante provocado por el gen de la invención se estudió intensamente. Se determinó que el fenotipo de pelo glandular aberrante se observa particularmente en los tricomas tipo VI, pero también podría extenderse a otros tipos de pelo glandular. Sorprendentemente, el fenotipo de pelo glandular aberrante para los pelos glandulares de tipo VI en las plantas de la invención se caracteriza por la reducción y, preferentemente, la ausencia tanto de mono como de sesquiterpenos, en particular a-pineno, mirceno, careno, a-felandreno, pfelandreno, p-cimeno, limoneno, 5-elemeno, p-cariofileno y/o a-humuleno, y/o se caracteriza por pelos glandulares deformados. El fenotipo de pelo glandular aberrante de la invención se caracteriza además por la reducción y, preferentemente, ausencia de compuestos monoterpenoides, en particular verbeneno. Se encontró que otros volátiles, tal como un aldehído, estaban presentes en los pelos glandulares aberrantes de tipo VI en las plantas de la invención, así como también en las plantas de fondo no mutante (ver Ejemplo 5).

De los pelos glandulares de tipo VI que se encuentran en las plantas de la invención, tanto la célula del tallo como la cabeza que consta de cuatro células glandulares aparecen encogidas, menos desarrolladas y/o secas en comparación con las mismas células de pelos glandulares de tipo VI no mutados. Estos pelos glandulares tipo VI deformados también parecen ser más pequeños que los pelos glandulares tipo VI no mutados. Esta reducción de tamaño podría ser el resultado directo del carácter encogido, menos desarrollado y/o seco (ver Figura 5).

El fenotipo de pelo glandular aberrante no atrae a los ácaros depredadores, pero permite y facilita que los ácaros deambulen libremente por las plantas. Los “ácaros depredadores” o “ácaros” como se hace referencia en la presente descripción, pertenecen a la familia Phytoseiidae. También se describe a en la presente descripción esta familia completa, que comprende las especies Amblyseius swirskii, Amblydromalus limonicus, Phytoseiulus persimilis y Neoseiulus californicus.

Por tanto, la invención se refiere a un gen Slmyc2 modificado, que comprende al menos una modificación, en donde la modificación comprende un SNP en o antes de la posición 1477 de la SEQ ID NO. 6 que resulta en la presencia de un codón de parada prematuro dentro de la secuencia codificante o un cambio en el marco de lectura o comprende una mutación en la secuencia codificante que codifica un aminoácido diferente, y cuya modificación conduce a la reducción o ausencia de actividad de la proteína Slmyc2, en donde el gen Slmyc2 modificado es capaz de conferir un fenotipo de pelo glandular aberrante a una planta de Solanum lycopersicum, en donde el fenotipo de pelo glandular aberrante se caracteriza, además, por la reducción y, preferentemente, ausencia de terpenos, en particular a-pineno, mirceno, careno, a- felandreno, p-felandreno, p-cimeno, limoneno, 5-elemeno, p-cariofileno y/o a-humuleno, y/o se caracteriza por pelos glandulares deformados. El fenotipo de pelo glandular aberrante, o el rasgo de la invención, permite el establecimiento de ácaros depredadores, en particular Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus, en una planta de Solanum lycopersicum. El fenotipo de pelo glandular aberrante, o el fenotipo de pelo glandular aberrante que permite el establecimiento de ácaros depredadores, en particular Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus, también se denomina en la presente descripción como “el rasgo” o “el rasgo de la invención”. Estos términos se usan indistintamente en la presente descripción.

Dicho fenotipo de pelo glandular aberrante de la invención es conferido por un gen Slmyc2 modificado, cuya herencia es consistente con la de un rasgo monogénico. Preferentemente, dicha herencia es consistente con la de un rasgo intermedio monogénico. En este contexto, el término “intermedio” significa que el fenotipo de pelo glandular aberrante es observable en plantas que comprenden el gen Slmyc2 modificado en estado homocigoto así como también heterocigoto.

Un ejemplo del gen Slmyc2 modificado puede encontrarse en plantas cultivadas a partir de semillas de las cuales se depositó una muestra representativa en NCIMB con el número de registro NCIMB 42222.

En una modalidad, la invención se refiere a una planta de Solanum lycopersicum que comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención.

La invención se refiere a una planta de Solanum lycopersicum que comprende un gen Slmyc2 modificado, en donde dicho gen Slmyc2 modificado da como resultado un fenotipo de pelo glandular aberrante que permite el establecimiento de ácaros depredadores, en particular Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus, sobre dicha planta de tomate. Esta planta también se denomina en la presente descripción como una planta de la invención.

También se describe en la presente descripción una planta que comprende el gen Slmyc2 modificado en estado homocigoto. Cuando una planta comprende el gen Slmyc2 modificado en estado homocigoto, el rasgo de la invención se caracteriza por la reducción y, preferentemente, ausencia de terpenos, en particular a-pineno, mirceno, careno, a-felandreno, p-felandreno, p-cimeno, limoneno, 5-elemeno, p-cariofileno y/o a-humuleno, y/o se caracteriza por pelos glandulares deformados.

Además, en la presente descripción se describe una planta como se describe en la presente descripción que comprende el gen Slmyc2 modificado en estado heterocigoto. Cuando una planta comprende el gen Slmyc2 modificado en estado heterocigoto, el rasgo de la invención se caracteriza por la reducción de terpenos, en particular a-pineno, mirceno, careno, a-felandreno, p-felandreno, p-cimeno, limoneno y/o 5-elemeno, y/o se caracteriza por pelos glandulares deformados. En este contexto, el término “reducción de terpenos” significa que el nivel de terpenos se reduce pero no está completamente ausente en comparación con las plantas que comprenden el gen Slmyc2 de tipo salvaje homocigóticamente. El nivel de terpenos, en orden creciente de preferencia, se reduce en 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % en comparación con el nivel de terpenos en una planta que comprende el gen Slmyc2 de tipo salvaje homocigóticamente.

Además, en la presente descripción se describe una planta de Solanum lycopersicum, en donde el gen Slmyc2 modificado de la invención es el mismo o equivalente al gen Slmyc2 modificado que se encuentra en o puede obtenerse del genoma de plantas de Solanum lycopersicum cultivadas a partir de semillas de las que se depositó una muestra representativa en el NCIMB con el número de acceso NCIMB 42222. Con igual o equivalente, se quiere decir que no se observa segregación para el rasgo de la invención en la F2 resultante de un cruce que es parte de una prueba de alelismo como se describe en la presente descripción. Con igual o equivalente, también se hace referencia a un gen myc2 que se obtiene de un pariente salvaje de Solanum lycopersicum y se modifica para conferir el mismo fenotipo de pelo glandular aberrante. En este sentido, los parientes silvestres de Solanum lycopersicum incluyen: S. arcanum, S. chmielewskii, S. neorickii, S. cheesmaniae, S. galapagense, S. pimpinellifolium, S. chilense, S. corneliomulleri, S. habrochaites, S. huaylasense, S. sisymbriifolium, S. peruvianum, y S. pennellii.

También en la presente descripción se describe una planta de Solanum lycopersicum que comprende el gen Slmyc2 modificado homocigota o heterocigóticamente, y que es causante de un fenotipo de pelo glandular aberrante, que permite el establecimiento de ácaros, en particular de los ácaros depredadores Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus en dicha planta de tomate, en comparación con una planta de Solanum lycopersicum que no lleva dicho gen Slmyc2 modificado.

Además, en la presente descripción se describe una planta de Solanum lycopersicum que presenta el rasgo de la invención, conferido por un gen Slmyc2 modificado, cuya planta de Solanum lycopersicum puede obtenerse mediante el cruce de una planta de Solanum lycopersicum que comprende dicho gen Slmyc2 modificado de la cual se depositó una muestra representativa de semilla con el número de registro de NCIMB 42222 con otra planta de Solanum lycopersicum para producir una F1, autofecundar posteriormente dicha F1 para obtener una F2, y seleccionar una planta de Solanum lycopersicum de la invención.

Además, se encontró durante la investigación que condujo a la presente invención que el gen Slmyc2 modificado de la invención se ubica en el cromosoma 8 de Solanum lycopersicum.

Más en particular, en el depósito NCIMB 42222 el gen Slmyc2 modificado de la invención, cuya secuencia genómica se representa por la SEQ ID NO. 1, se localiza en el cromosoma 8 de Solanum lycopersicum.

También se describe en la presente descripción una planta de Solanum lycopersicum, que comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención, en donde dicho gen Slmyc2 modificado puede obtenerse por introgresión de una planta de Solanum lycopersicum cultivada a partir de semillas de las cuales se depositó una muestra representativa con el número de acceso de NCIMB 42222, y en donde dicho gen Slmyc2 modificado, cuya secuencia genómica se representa por la SEQ ID NO. 1, en las semillas del depósito de semillas número NCIMB 42222 se posiciona en el cromosoma 8 de Solanum lycopersicum.

Una planta de Solanum lycopersicum de la invención puede identificarse adecuadamente entre los descendientes de un cruce entre una planta de Solanum lycopersicum que no permite el establecimiento de ácaros depredadores, en particular de Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus, y una planta que porta el gen Slmyc2 modificado, preferentemente, en el estado homocigoto, mediante el cultivo de plantas F2 a partir de semillas que son el resultado del cruce inicial y una etapa de autofecundación, y mediante la selección de plantas que expresan el fenotipo de pelo glandular aberrante. Las plantas pueden seleccionarse sobre la base de la determinación del fenotipo a través de un bioensayo como se describe en el Ejemplo 2, o a través de la identificación del gen Slmyc2 modificado, por ejemplo, por comparación con la SEQ ID NO. 5 o SEQ ID NO. 6 o mediante el uso de marcadores que se describen en la presente descripción.

Para determinar la equivalencia de determinantes genéticos que provocan un determinado rasgo fenotípico puede usarse la bien conocida prueba de alelismo, más específicamente denominada prueba de complementación. Para determinar si una planta muestra el mismo fenotipo de pelo glandular aberrante que las plantas de la invención, puede realizarse una prueba de alelismo en la que una planta de prueba que es homocigota para el gen Slmyc2 modificado de la invención se cruza con material a probar que también es homocigoto para su determinante genético. Cuando no hay segregación para el fenotipo de pelo glandular aberrante en la F2 del cruce, se demostró que los determinantes genéticos son equivalentes o iguales y la planta es, por tanto, una planta de la invención. La planta de prueba es adecuadamente una planta del depósito NCIMB 42222, o una planta descendiente del depósito que muestra un fenotipo de pelo glandular aberrante que permite el establecimiento de ácaros, en particular los ácaros depredadores Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus en dicha planta de Solanum lycopersicum.

La planta de Solanum lycopersicum como se describe en la presente descripción puede ser uno cualquiera de los tipos de tomate cultivado del siguiente grupo: cereza, ciruela, cóctel, racimo, bistec, redondo, uva, etc.

En otra modalidad, la invención se refiere a una semilla de Solanum lycopersicum que comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención, en donde la planta que puede crecer a partir de la semilla muestra el fenotipo de pelo glandular aberrante.

Esta semilla también se denomina en la presente descripción semilla de la invención.

También se describe en la presente descripción que la planta cultivada a partir de la semilla de la invención permite el establecimiento de ácaros, en particular de los ácaros depredadores Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus, cuando el gen Slmyc2 modificado está presente en estado heterocigoto, preferentemente, homocigoto. Además, en la presente descripción se describe una semilla de Solanum lycopersicum que comprende dicho gen Slmyc2 modificado, cuya semilla es capaz de convertirse en una planta que presenta el rasgo de la invención.

Además, en la presente descripción se describe la progenie de las plantas, células, tejidos, y semillas de Solanum lycopersicum de la invención, en donde las plantas, células, tejidos, y semillas de la progenie comprenden el gen Slmyc2 modificado. Tal progenie puede ser en sí misma plantas, células, tejidos, o semillas.

El término “progenie” como se usa en la presente descripción pretende significar el primer y todos los descendientes posteriores de un cruce con una planta de la invención que comprende dicho gen Slmyc2 modificado. “Progenie” también abarca plantas que portan el gen Slmyc2 modificado de la invención en estado homocigoto o heterocigoto y que se obtienen de otras plantas o progenie de plantas de la invención por propagación o multiplicación vegetativa. La invención se refiere a una planta progenie de una planta de Solanum lycopersicum que comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención en estado homocigoto o heterocigoto.

También se describe en la presente descripción una planta progenie de la planta de Solanum lycopersicum que presenta el fenotipo de pelo glandular aberrante, lo que permite el establecimiento de ácaros, en particular de los ácaros depredadores Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus, en dicha planta descendiente. Esta planta descendiente comprende así el gen Slmyc2 modificado en estado heterocigoto, preferentemente, homocigoto. De acuerdo con otro aspecto de esta, la invención se refiere a material de propagación capaz de desarrollarse a y/o derivarse de una planta de Solanum lycopersicum que comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención en estado homocigoto o heterocigoto.

Este material de propagación también se denomina en la presente descripción material de propagación de la invención.

En una modalidad, tal material de propagación se compone por una semilla de la planta de Solanum lycopersicum de la invención, en donde la semilla es capaz de convertirse en una planta que comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención en estado homocigoto o heterocigoto.

En una modalidad adicional, el material de propagación de la invención se selecciona del grupo que consiste en microesporas, polen, ovarios, óvulos, embriones, sacos embrionarios, células embrionarias, esquejes, raíces, puntas de las raíces, hipocótilos, cotiledones, tallos, hojas, flores, anteras, semillas, células meristemáticas, protoplastos y células.

En una modalidad adicional, la invención se refiere al cultivo de tejidos de material de propagación de la invención. Además, en la presente descripción se describe la planta desarrollada a partir del material de propagación que comprende un gen Slmyc2 modificado que se encuentra en plantas de Solanum lycopersicum cultivadas a partir de semillas cuyas semillas representativas se depositaron con el número de acceso de NCIMB 42222.

También en la presente descripción se describe la parte cosechada de la planta de Solanum lycopersicum que comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención.

Además, en la presente descripción se describe un producto alimenticio que comprende una o más partes cosechadas de una planta de Solanum lycopersicum que comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención. El producto alimenticio o parte cosechada puede ser, o comprende los frutos de una planta de Solanum lycopersicum. Un producto alimenticio preferido que comprende frutas - o partes de estas - de la planta de Solanum lycopersicum de la invención es una ensalada, en donde las frutas pueden mezclarse opcionalmente con hojas de, por ejemplo, lechuga, espinaca, escarola, achicoria, remolacha, acelga, etc. El producto alimenticio o parte cosechada puede haber pasado por una o más etapas de procesamiento. Tal etapa de procesamiento podría comprender, pero no se limita a uno cualquiera de los siguientes tratamientos o combinaciones de estos: cortar, lavar, cocinar, cocer al vapor, hornear, freír, pasteurizar, congelar, moler, extraer aceite, encurtir, o fermentar. La forma procesada que se obtiene también se describe en la presente descripción.

Otro aspecto más de la invención se refiere al uso del gen Slmyc2 modificado de la invención para el desarrollo de una planta de Solanum lycopersicum sobre la que pueden establecerse los ácaros depredadores, en particular Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus, en donde el desarrollo de la planta de Solanum lycopersicum comprende la introducción del gen Slmyc2 modificado en la planta de Solanum lycopersicum, mediante modificación genética.

En una modalidad, la invención se refiere al uso del gen Slmyc2 modificado de la invención para el desarrollo de una planta de Solanum lycopersicum sobre la que pueden establecerse ácaros depredadores, en particular Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus, en donde el establecimiento de dichos ácaros es permitido por un fenotipo de pelo glandular aberrante.

Aún en otra modalidad, la invención se relaciona con el uso del gen Slmyc2 modificado de la invención para el desarrollo de una planta de Solanum lycopersicum, en donde el gen Slmyc2 modificado de la invención es capaz de conferir un fenotipo de pelo glandular aberrante a dicha planta de Solanum lycopersicum, en donde el fenotipo de pelo glandular aberrante se caracteriza por la ausencia de terpenos, en particular a-pineno, mirceno, careno, afelandreno, p-felandreno, p-cimeno, limoneno, 8-elemeno, p-cariofileno y/o a -humuleno, y/o se caracteriza por pelos glandulares deformados.

Adicionalmente en la presente descripción se describe el uso de una planta de la invención en combinación con el ácaro depredador Amblyseius swirskii para el control de una plaga de plantas, en particular Aculops lycopersici, Bemisia tabaci y/o Frankliniella occidentalis.

Además, en la presente descripción se describe el uso de una planta de la invención en combinación con el ácaro depredador Amblydromalus limonicus para el control de una plaga de plantas, en particular Aculops lycopersici, Bemisia tabaci y/o Frankliniella occidentalis.

Además, en la presente descripción se describe el uso de una planta de la invención en combinación con los ácaros depredadores Amblyseius swirskii y Amblyseius swirskii para el control de plagas de plantas, en particular Aculops lycopersici, Bemisia tabaci y/o Frankliniella occidentalis.

También en la presente descripción se describe el uso de una planta de la invención en combinación con el ácaro depredador Phytoseiulus persimilis para el control de una plaga de plantas, en particular Tetranychus urticae.

Adicionalmente en la presente descripción se describe el uso de una planta de la invención en combinación con el ácaro depredador Neoseiulus califomicus para el control de una plaga de plantas, en particular Tetranychus urticae. También en la presente descripción se describe el uso de una planta de la invención en combinación con el ácaro depredador Phytoseiulus persimilis y Neoseiulus califomicus para el control de una plaga de plantas, en particular Tetranychus urticae.

El rasgo de la invención puede identificarse, por ejemplo, mediante el uso de marcadores adecuados.

El experto en la técnica sabe cómo desarrollar nuevos marcadores ligados a un rasgo mediante el uso de genes, marcadores, QTLS, alelos u otras moléculas de ADN ya conocidos que ese asocian con un determinado rasgo, y secuencias de estos.

El término “determinante genético”, como se usa en la presente descripción, abarca uno o más QTL, genes, o alelos. Estos términos se usan indistintamente. Un determinante genético puede identificarse por la posición en un mapa genético, o por indicación de la ubicación en un grupo de ligamiento o cromosoma. Cuando un determinante genético ya no está ligado a un marcador molecular específico, pero su posición en un cromosoma tal como se define en un mapa genético no se altera, este determinante genético todavía es el mismo que cuando estaba ligado al marcador molecular. Por lo tanto, el rasgo que confiere todavía es el mismo.

Además, en la presente descripción se describe una célula de una planta de Solanum lycopersicum de la invención, cuya célula comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención. Dicha célula comprende así la información genética que codifica dicho fenotipo de pelo glandular aberrante, en particular información genética que es sustancialmente idéntica, preferentemente, completamente idéntica a la información genética que codifica dicho fenotipo de pelo glandular aberrante, en donde dicha información genética es el gen Slmyc2 modificado, que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de tipo salvaje de la SEQ ID NO. 5. Preferentemente, la célula como se describe en la presente descripción es parte de una planta o parte de una planta, pero la célula también puede estar en forma aislada.

También en la presente descripción se describe una célula de una planta de Solanum lycopersicum, cuya célula comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención, y cuya planta se obtiene o es obtenible mediante la transferencia del rasgo de la invención a una planta de Solanum lycopersicum agronómicamente valiosa. El rasgo de la invención se provoca por el gen Slmyc2 modificado de la invención que se encuentra en las semillas de las cuales se depositó una muestra representativa con el número de acceso de NCIMB 42222.

Adicionalmente en la presente descripción se describe el uso de semillas de una planta de Solanum lycopersicum, cuya semilla comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención para transferir el gen Slmyc2 modificado a otra planta de Solanum lycopersicum agronómicamente valiosa.

Además, en la presente descripción se describe el uso de semillas de las cuales se depositó una muestra representativa con el número de acceso de NCIMB 42222 para transferir el gen Slmyc2 modificado de la invención a otra planta de Solanum lycopersicum agronómicamente valiosa.

También en la presente descripción se describe el uso de una planta de Solanum lycopersicum de la invención para el cultivo y conservación de ácaros depredadores o una colonia de los mismos, con el objetivo de controlar una plaga de insectos.

Además, en la presente descripción se describe el uso de una planta de Solanum lycopersicum que comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención, como un cultivo.

Además, en la presente descripción se describe el uso de una planta de Solanum lycopersicum que comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención como fuente de semillas.

También en la presente descripción se describe el uso de una planta de Solanum lycopersicum que comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención como fuente de material de propagación.

Adicionalmente en la presente descripción se describe el uso de una planta de Solanum lycopersicum que comprende el gen Slmyc2 modificado para el consumo.

En especies de plantas distintas de Solanum lycopersicum, el homólogo de Slmyc2 podría influir en el fenotipo de pelo glandular. Por lo tanto, también en la presente descripción se describe un gen myc2 modificado capaz de conferir un fenotipo de pelo glandular aberrante a una planta, modificación que conduce a la reducción o ausencia de la actividad de la proteína MYC2, y en donde la modificación se selecciona de una modificación que disminuye el nivel de ARNm del gen myc2; una modificación que disminuye el nivel de la proteína MYC2; y/o una modificación que disminuye la actividad de la proteína MYC2, en comparación con un gen myc2 de tipo salvaje no modificado.

Además, en la presente descripción se describe un gen myc2 modificado que conduce a la reducción y/o ausencia de terpenos en una planta. El gen myc2 modificado puede estar presente en estado heterocigoto u homocigoto. El gen myc2 puede modificarse de la misma manera o de manera equivalente que el gen Slmyc2, como se describe en la presente descripción.

El fenotipo de pelo glandular aberrante conferido por el gen myc2 modificado se caracteriza por la ausencia y/o reducción de terpenos, en particular a-pineno, mirceno, careno, a-felandreno, p-felandreno, p-cimeno, limoneno, 8-elemeno, p-cariofileno y/o a-humuleno, y/o se caracteriza por pelos glandulares deformados. En este sentido, la ausencia de terpenos es un nivel de terpenos que no es detectable por las técnicas de medición actualmente disponibles y/o es al menos, en orden creciente de preferencia, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % más bajo que el nivel de terpenos en una planta que comprende el gen myc2 de tipo salvaje homocigóticamente. El término “reducción de terpenos” significa en este contexto que el nivel de terpenos se reduce pero no está completamente ausente en comparación con las plantas que comprenden el gen myc2 de tipo salvaje homocigóticamente. El nivel de terpenos, en orden creciente de preferencia, se reduce en 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % en comparación con el nivel de terpenos en una planta que comprende el gen myc2 de tipo salvaje homocigóticamente.

También en la presente descripción se describe una planta que comprende el gen myc2 modificado que presenta el fenotipo de pelo glandular aberrante de la invención, lo que permite el establecimiento de ácaros depredadores, en particular Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus en dicha planta.

Además, en la presente descripción se describe una planta que comprende el gen myc2 modificado en estado homocigoto. Cuando una planta comprende el gen myc2 modificado en estado homocigoto, el fenotipo de pelo glandular aberrante que permite el establecimiento de ácaros depredadores, en particular de Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus sobre dicha planta, se caracteriza por la ausencia y/o reducción de terpenos, en particular a-pineno, mirceno, careno, a-felandreno, p-felandreno, p-cimeno, limoneno, 8-elemeno, p-cariofileno y/o ahumuleno, y/o se caracteriza por pelos glandulares deformados.

También en la presente descripción se describe una planta que comprende el gen myc2 modificado en estado heterocigoto. Cuando una planta comprende el gen myc2 modificado en estado heterocigoto, el fenotipo de pelo glandular aberrante que permite el establecimiento de ácaros depredadores, en particular de Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus sobre dicha planta, se caracteriza por la reducción de terpenos, en particular a- pineno, mirceno, careno, a-felandreno, p-felandreno, p-cimeno, limoneno, 8-elemeno, p-cariofileno y/o a-humuleno. El término “reducción de terpenos” se define anteriormente.

Además, en la presente descripción se describe el uso de tal gen myc2 modificado para el desarrollo de una planta que comprende un nivel reducido de terpenos o una planta que muestra ausencia de terpenos.

Adicionalmente en la presente descripción se describe el uso de tal gen myc2 modificado para el desarrollo de una planta que presenta un fenotipo de pelo glandular aberrante, en donde dicho fenotipo glandular aberrante es resultado de la reducción o ausencia de la actividad de la proteína MYC2 en comparación con la actividad de la proteína MYC2 de tipo salvaje no modificada.

Una manera en la que puede usarse el gen myc2 modificado es mediante la reducción de su expresión. La expresión reducida puede lograrse mediante una disminución en el nivel de ARNm del gen myc2; una disminución en el nivel de proteína MYC2; y/o una disminución en la actividad de la proteína MYC2, en comparación con el nivel de ARNm, nivel de proteína o actividad de la proteína de un gen myc2 de tipo salvaje no modificado.

El gen myc2 modificado como se describe en la presente descripción puede usarse para conferir un fenotipo glandular aberrante a una planta, en donde la planta se selecciona de cualquiera de las especies Capsicum anuum, Cucumis melo, Cucumis sativus y Citrullus lanatus. También el gen myc2 modificado puede usarse para reducir o eliminar terpenos en esas especies de plantas. La secuencia genómica de tipo salvaje, la CDS de tipo salvaje y la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje para myc2 de Capsicum annuum se representan con las SEQ ID NO. 9, 10 y 11 respectivamente. La secuencia genómica de tipo salvaje, la CDS de tipo salvaje y la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje para myc2 de Cucumis sativus se representan con las SEQ ID NO. 12, 13 y 14 respectivamente. La secuencia genómica de tipo salvaje, la CDS de tipo salvaje y la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje para myc2 de Cucumis melo se representan con las SEQ ID NO. 15, 16 y 17 respectivamente. La secuencia genómica de tipo salvaje, la CDS de tipo salvaje y la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje para myc2 de Citrillus lanatus se representan con las SEQ ID NO. 18, 19 y 20 respectivamente.

Tanto el gen Slmyc2 como el myc2 pueden modificarse mediante mutagénesis. La mutagénesis comprende la introducción aleatoria de al menos una modificación mediante uno o más compuestos químicos, tales como metanosulfonato de etilo, nitrosometilurea, hidroxilamina, proflavina, N-metil-N-nitrosoguanidina, N-etil-N-nitrosourea, N-metil-N-nitro-nitrosoguanidina, sulfato de dietilo, etilenimina, azida de sodio, formalina, uretano, fenol y óxido de etileno, y/o por medios físicos, tales como radiación ultravioleta, exposición rápida a neutrones, rayos X, radiación gamma, y /o por inserción de elementos genéticos, tales como transposones, a DN-T, elementos retrovirales.

La mutagénesis también comprende la introducción más específica y dirigida de al menos una modificación por medio de recombinación homóloga, inducción de mutación basada en oligonucleótidos, nucleasas con dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN) o sistemas de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR).

Un gen myc2 o Slmyc2 de la invención modificado como se describe en la presente descripción puede introducirse alternativamente en una planta mediante el uso de modificación genética. La modificación genética comprende la modificación transgénica o transgénesis, mediante el uso de un gen de una especie no cruzable o un gen sintético, y la modificación cisgénica o cisgénesis, mediante el uso de un gen natural, que codifica un rasgo (agrícola), de la planta de cultivo en sí o de una planta donante sexualmente compatible.

En una modalidad, el gen Slmyc2 o myc2 modificado como se describe en la presente descripción es un gen Slmyc2 o myc2 exógeno que puede introducirse en una planta mediante un método transgénico o un método cisgénico. Además, en la presente descripción se describe un gen Slmyc2 o myc2 recombinante modificado, en donde la expresión de dicho gen Slmyc2 o myc2 recombinante modificado se controla por un promotor fuerte, cuyo promotor se une operativamente a una secuencia del gen Slmyc2 o myc2, cuya secuencia génica incluye el 5'-UTR, la CDS, y/o el 3'-UTR. En la técnica se conocen muchos ejemplos de promotores constitutivos fuertes; algunos de los más usados son, por ejemplo, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (pCaMV 35S) y versiones modificadas de este, promotores de ubiquitina de diversas especies de plantas, promotores de actina de diversas especies de plantas, y el promotor del factor de elongación 1 alfa (ElF1a).

También en la presente descripción se describe una construcción génica, cuya construcción génica comprende un marcador seleccionable, una secuencia promotora, una secuencia génica Slmyc2 o myc2, y una secuencia terminadora.

Además, en la presente descripción se describe un método para producir una planta de Solanum lycopersicum que comprende un gen Slmyc2 modificado, capaz de conferir un fenotipo de pelo glandular aberrante, que permite el establecimiento de ácaros, en particular los ácaros depredadores Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus, que comprende

a) cruzar una planta que comprende el gen Slmyc2 modificado con otra planta;

b) autofecundar las plantas F1 resultantes para obtener plantas F2;

c) seleccionar plantas que presenten el fenotipo de pelo glandular aberrante y/o comprendan el gen Slmyc2 modificado en la F2;

d) realizar opcionalmente una o más rondas adicionales de autofecundación o cruce y, posteriormente, seleccionar una planta que comprenda el rasgo o gen modificado de la invención.

La palabra “rasgo” en el contexto de esta solicitud se refiere al fenotipo de la planta. En particular, la palabra “rasgo” se refiere al rasgo de la invención, más en particular al fenotipo de pelo glandular aberrante que permite el establecimiento de ácaros, en particular los ácaros depredadores Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus como resultado de la presencia de un gen Slmyc2 modificado. El término “determinante genético” se usa para la información genética en el genoma de la planta que confiere el rasgo de la invención, la información genética es el gen Slmyc2 modificado. Cuando una planta presenta el rasgo de la invención, su genoma comprende el determinante genético que confiere el rasgo de la invención. Por lo tanto, la planta tiene el determinante genético como se describe en la presente descripción. Además, en la presente descripción se describe que el determinante genético comprende el gen Slmyc2 modificado.

Está claro que la planta progenitora que proporciona el rasgo de la invención no es necesariamente una planta cultivada directamente a partir de las semillas depositadas. La planta progenitora también puede ser una planta descendiente de una semilla que se identifique que comprende el rasgo de la invención por otros medios.

También en la presente descripción se describe un método para producir una planta de Solanum lycopersicum que comprende un gen Slmyc2 modificado, capaz de conferir un fenotipo de pelo glandular aberrante, que permite el establecimiento de ácaros, en particular los ácaros depredadores Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus, que comprende

a) cruzar una planta que comprende el gen Slmyc2 modificado con otra planta;

b) retrocruzar opcionalmente las plantas F1 resultantes con la planta progenitora preferida;

c) seleccionar plantas que presenten un fenotipo de pelo glandular aberrante y/o comprendan el gen Slmyc2 modificado en la F2;

d) realizar opcionalmente una o más rondas adicionales de autofecundación o cruzamiento y, posteriormente seleccionar una planta que presente un fenotipo de pelo glandular aberrante como una planta que comprende el gen Slmyc2 modificado.

Además, en la presente descripción se describe un método para introducir otro rasgo deseado en una planta de Solanum lycopersicum que comprende un gen Slmyc2 modificado, capaz de conferir un fenotipo de pelo glandular aberrante, que permite el establecimiento de ácaros, en particular los ácaros depredadores Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus, que comprende:

a) cruzar una planta de Solanum lycopersicum que comprende un gen Slmyc2 modificado, cuyas semillas representativas se depositaron con el número de depósito NCIMB 4222, con una segunda planta de Solanum lycopersicum que presenta un rasgo deseado para producir una progenie F1;

b) seleccionar una progenie F1 que presente dicho fenotipo de pelo glandular aberrante y/o comprenda el gen Slmyc2 modificado y el rasgo deseado;

c) cruzar la progenie F1 seleccionada con cualquiera de las plantas progenitoras, para producir una progenie de retrocruce;

d) seleccionar la progenie de retrocruce que presente el rasgo deseado y un fenotipo de pelo glandular aberrante y/o que comprenda el gen Slmyc2 modificado; y

e) repetir opcionalmente las etapas c) y d) una o más veces en sucesión para producir una cuarta o más alta progenie de retrocruce seleccionada que presente el rasgo deseado y el fenotipo de pelo glandular aberrante. Además, en la presente descripción se describe una planta de Solanum lycopersicum producida por este método.

En una modalidad, la selección de plantas que presentan el fenotipo de pelo glandular aberrante de la invención se realiza en la F1 o en cualquier otra generación, preferentemente, mediante el uso de la SEQ ID NO. 1 o 2. En otro aspecto, la selección del rasgo de la invención se inicia en la F2 de un cruce o alternativamente de un retrocruce. La selección de plantas en la F2 puede realizarse fenotípicamente así como también mediante el uso de dichas secuencias las cuales detectan directa o indirectamente el determinante genético subyacente al rasgo.

En una modalidad la selección de plantas que presentan el fenotipo de pelo glandular aberrante se inicia en la generación F3 o posterior.

En una modalidad, la planta que comprende el determinante genético es una planta de una línea endogámica, un híbrido, un haploide doble, o de una población de segregación.

También en la presente descripción se describe un método para la producción de una planta de Solanum lycopersicum que comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención mediante el uso de una técnica de generación de doble haploide para generar una línea de doble haploide que comprende el gen Slmyc2 modificado. Además, en la presente descripción se describe una semilla híbrida que puede cultivarse como una planta de Solanum lycopersicum que comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención, y un método para producir tal semilla híbrida que comprende cruzar una primera planta progenitora con una segunda planta progenitora y cosechar la semilla híbrida resultante, en donde dicha primera planta progenitora y/o dicha segunda planta progenitora es una planta de la invención.

Adicionalmente en la presente descripción se describe un método para producir una planta de Solanum lycopersicum híbrida que comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención, que comprende cruzar una primera planta de Solanum lycopersicum progenitora con una segunda planta de Solanum lycopersicum progenitora y cosechar la semilla híbrida resultante, de las cuales la primera planta progenitora y/o la segunda planta progenitora comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención, y cultivar dichas semillas híbridas como plantas híbridas. Además, en la presente descripción se describe un método para la producción de una planta de Solanum lycopersicum que comprende un gen Slmyc2 modificado, capaz de conferir un fenotipo de pelo glandular aberrante, que permite el establecimiento de ácaros, en particular los ácaros depredadores Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus mediante el uso de una semilla que comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención para el cultivo de dicha planta de Solanum lycopersicum. Las semillas son adecuadamente semillas de las cuales se depositó una muestra representativa en la NCIMb con el número de depósito NCIMB 42222.

Además, en la presente descripción se describe un método para obtener una planta de Solanum lycopersicum que presenta un fenotipo de pelo glandular aberrante, que permite el establecimiento de ácaros, en particular los ácaros depredadores Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus, que comprende reducir el nivel endógeno de proteína S1MYC2 en la planta por mutación del gen Slmyc2 de la planta.

También en la presente descripción se describe un método para la producción de semillas que comprende cultivar plantas de Solanum lycopersicum a partir de semillas de las cuales se depositó una muestra representativa en el NCIMB bajo el número de depósito NCIMB 42222, lo que permite que las plantas produzcan semillas, y cosechar dichas semillas. La producción de semillas se realiza adecuadamente mediante cruce o autofecundación.

Adicionalmente en la presente descripción se describe un método para producir una planta de Solanum lycopersicum que comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención mediante el uso de cultivo de tejidos.

También en la presente descripción se describe un método para producir una planta de Solanum lycopersicum que comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención mediante el uso de reproducción vegetativa.

Además, en la presente descripción se describe un método para producir una planta de Solanum lycopersicum que comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención mediante el uso de un método de modificación genética para introducir dicho gen Slmyc2 modificado en la planta de Solanum lycopersicum. La modificación genética comprende la modificación transgénica o transgénesis, mediante el uso de un gen de una especie no cruzable o un gen sintético, y la modificación cisgénica o cisgénesis, mediante el uso de un gen natural, que codifica un rasgo (agrícola), de la planta de cultivo en sí o de una planta donante sexualmente compatible.

Adicionalmente en la presente descripción se describe un método de cultivo para desarrollar plantas de Solanum lycopersicum que comprenden el gen Slmyc2 modificado de la invención, en donde se usa germoplasma que comprende dicho gen Slmyc2 modificado de la invención. La semilla representativa de dicha planta que comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención y que es representativa del germoplasma se depositó en la NCIMB con el número de depósito NCIMB 42222.

Además, en la presente descripción se describe un método para producir una planta de Solanum lycopersicum que comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención, en donde la progenie o el material de propagación de una planta que comprende el gen Slmyc2 modificado que confiere el rasgo de la invención se usa como fuente para introducir dicho rasgo en otra planta de Solanum lycopersicum. Se depositó la semilla representativa de una planta que comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención en el NCIMB con el número de depósito NCIMB 42222. También en la presente descripción se describe una planta de Solanum lycopersicum que comprende un gen Slmyc2 modificado, capaz de conferir un fenotipo de pelo glandular aberrante, lo que permite el establecimiento de ácaros, en particular los ácaros depredadores Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus, cuya planta es obtenible por cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción y/o familiares para el experto en la técnica.

El fenotipo de pelo glandular aberrante conferido por el gen Slmyc2 modificado de la invención permite el establecimiento en la planta de ácaros depredadores que normalmente no se establecen en plantas de tomate con fenotipo de pelo glandular no aberrante y permite así el control biológico de plagas mediante estos ácaros.

Depósito

Semillas representativas de Solanum lycopersicum que comprenden el gen Slmyc2 modificado de la invención, capaces de conferir un fenotipo de pelo glandular aberrante, que permite el establecimiento de ácaros, en particular los ácaros depredadores Amblyseius swirskii y / o Amblydromalus limonicus, se depositaron con el número de acceso NCI^mB 42222 el 24 de febrero de 2014 con NCIMB Ltd. (Edificio Ferguson, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA). Todas las semillas del depósito comprenden el gen Slmyc2 modificado homocigóticamente. Las plantas cultivadas a partir de estas semillas permiten así el establecimiento de ácaros, en particular de los ácaros depredadores Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus.

Las semillas depositadas no cumplen los criterios DUS los cuales se requieren para obtener la protección de las variedades de plantas y, por lo tanto, no pueden considerarse que son una variedad de planta.

La presente invención se aclarará en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son solo para fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitantes de la presente invención de ninguna manera.

Figuras

Figura 1: Secuencias del gen Slmyc2 modificado de la invención. SEQ ID NO. 1 representa la secuencia de ADN genómico. En la SEQ ID NO. 1, el primer par de bases (pb) del codón de inicio se ubica en la posición 2648. El último pb del codón de parada se ubica en la posición 4540 de la SEQ ID NO. 1. La SEQ ID NO. 2 refleja la secuencia codificante (CDS). La SEQ ID NO. 3 representa la secuencia de la proteína. La SEQ ID NO. 4 representa la secuencia mutante del marcador en el gen SL06992.

Figura 2: Secuencias del gen Slmyc2 de tipo salvaje. La SEQ ID NO. 5 representa la secuencia de ADN genómico. En SEQ ID NO. 5, el primer par de bases (pb) del codón de inicio se ubica en la posición 2648. El último pb del codón de parada se ubica en la posición 4540 de la SEQ ID NO. 5. La SEQ ID NO. 6 refleja la secuencia codificante (CDS). La SEQ ID NO. 7 representa la secuencia de la proteína. La SEQ ID NO. 8 representa la secuencia de tipo salvaje del marcador en el gen SL06992.

Figura 3: Densidad promedio (número ± SE) de Amblyseius swirskii por hoja por semana para numerosas variedades de tomate y para el control de pimiento dulce.

Figura 4A: Tabla que muestra el nivel de volátiles seleccionados en unidades arbitrarias (A.U.) para plantas que comprenden la mutación homocigóticamente (Mo14/001-006), plantas que comprenden la mutación heterocigóticamente (Mo14/007-012) y plantas de tipo salvaje (Mo14/ 013-018).

Aldehido: cis-3-hexenal

Monos: a-pineno, micreno, careno, a- y p-felandreno, p-cimeno, limoneno. Sesquiterpenos: 8-elemeno, pcariofileno, a-humuleno. Monoterpenoide: verbeneno

f: corregido por limoneno

f: también conocido como a-cariofileno

Figura 4B: Tabla que muestra los niveles promedio de volátiles seleccionados medidos en unidades arbitrarias (A.U.) para plantas que comprenden la mutación heterocigóticamente (Mo14/007-012) y para plantas de tipo salvaje (Mo14/013-018); los valores de P se calcularon con una prueba t de Student e indican si la diferencia entre las plantas heterocigotas y de tipo salvaje es significativa (P<0,05).

Figura 5: Imágenes de fenotipos de pelo glandular. En la Figura 5A, se indica con el círculo un tricoma de tipo VI que se encuentra en las plantas de tomate de la invención. En la Figura 5B, se indica con un círculo un tricoma de tipo VI que se encuentra en plantas de tomate de fondo no mutante.

Figura 6: Secuencias de aminoácidos de MYC2 de otras especies de plantas. Las SEQ ID NO. 9 a 11 representan respectivamente la secuencia de ADN genómico, la secuencia de ADN codificante y la secuencia de aminoácidos de Capsicum annuum. En la SEQ ID NO. 9, el primer par de bases (pb) del codón de inicio se ubica en la posición 2387. El último pb del codón de parada se ubica en la posición 4459 de la SEQ ID NO. 9. Las SEQ ID NO. 12 a 14 representan respectivamente la secuencia de ADN genómico, la secuencia de ADN codificante y la secuencia de aminoácidos de Cucumis sativus. En la SEQ ID NO. 12, el primer par de bases (pb) del codón de inicio se ubica en la posición 1578. El último pb del codón de parada se ubica en la posición 3563 de la SEQ ID NO. 12. Las SEQ ID NO. 15 a 17 representan respectivamente la secuencia de ADN genómico, la secuencia de ADN codificante y la secuencia de aminoácidos de Cucumis melo. En la SEQ ID NO. 15, el primer par de bases (pb) del codón de inicio se ubica en la posición 2515. El último pb del codón de parada se ubica en la posición 4503 de la SEQ ID NO. 15. Las S^eQ ID NO. 18 a 20 representan respectivamente la secuencia de ADN genómico, la secuencia de ADN codificante y la secuencia de aminoácidos de Citrillus lanatus. En la SEQ ID NO.

18, el primer par de bases (pb) del codón de inicio se ubica en la posición 2408. El último pb del codón de terminación se ubica en la posición 4378 de la SEQ ID NO. 18

Figura 7: Expresión de genes de terpeno sintasa en las plantas homo y heterocigotas de la invención y las plantas de fondo no mutante.

Figura 8: Densidad promedio (número ± SE) de Aculops lycopersici por folíolo de 3,5 cm 0 por semana en plantas que comprenden el gen Slmyc2 modificado (Mutante) y Razymo, respectivamente. Las evaluaciones comenzaron justo antes de la liberación de A. swirskii (semana 0), que se liberó cuatro semanas después de A. lycopersici. Leyendas con la misma letra no son significativamente diferentes (GLMM, P > 0,05)

Figura 9: Densidad promedio (número ± SE) de ninfas de Bemisia tabaci por hoja de plantas que comprenden el gen Slmyc2 modificado durante el experimento. Leyendas con la misma letra no son significativamente diferentes (GLMM, P > 0,05)

Figura 10A: Densidad promedio (número ± SE) de Frankliniella occidentalis por hoja de plantas que comprenden el Slmyc2 modificado durante el experimento de verano. Leyendas con la misma letra no son significativamente diferentes (GLMM, P > 0,05).

Figura 10B: Densidad promedio (número ± SE) de Frankliniella occidentalis por hoja de plantas que comprenden el Slmyc2 modificado durante el experimento de invierno. Leyendas con la misma letra no son significativamente diferentes (GLMM, P > 0,05).

Ejemplos

Ejemplo 1

Creación de plantas de Solanum lycopersicum de la invención.

Semillas de dos líneas de cultivo de Solanum lycopersicum, TR306 y T029, se trataron con ems (etil metano sulfonato) mediante la inmersión de aproximadamente 10000 semillas en una solución aireada de ems al 0,5 % (p/v) durante 24 horas a temperatura ambiente.

Las semillas tratadas germinaron y las plantas resultantes se cultivaron en un invernadero para producir semillas M2.

Después de la maduración, las semillas M2 se cosecharon y se agruparon en un conjunto. El conjunto resultante de semillas M2 se usó como material de partida para identificar plantas M2 individuales que mostraban un fenotipo de pelo glandular aberrante.

La eficacia del procedimiento de modificación genética se evaluó mediante la determinación de la ocurrencia de plantas blanqueadas, lo que es indicativo de pérdida de clorofila debido a modificaciones en genes involucrados directa o indirectamente en la formación o acumulación de clorofila. El fenotipo del tricoma tipo VI se muestra en la Figura 5.

Ejemplo 2

Identificación de una planta de Solanum lycopersicum que permite el establecimiento del ácaro depredador Amblyseius swirskii

Dos líneas de cultivo (TR306 y T029), un híbrido comercialmente disponible y tres mutantes resultantes del experimento descrito en el Ejemplo 1 se usaron en un bioensayo para investigar si el ácaro depredador Amblyseius swirskii es capaz de establecerse en estas plantas de Solanum lycopersicum. Como control positivo también se incluyó en este experimento Capsicum annuum variedad Compas RZ.

En la Tabla 1, se da una descripción general de las líneas y variedades. El bioensayo se llevó a cabo en un invernadero multitúnel en España bajo condiciones de cultivo mediterráneas. Este invernadero se dividió en 4 compartimentos y uno de ellos se dividió en 40 jaulas de 5 x 3,5 x 4 metros (1 x ancho x alto), de las cuales cinco se usaron durante el experimento. Los tratamientos se compararon en un diseño de bloques completos al azar con cinco repeticiones de siete especies de plantas: seis variedades de tomate (5 seleccionadas 1 comercial [control negativo]) y 1 pimiento dulce (control positivo).

Cada réplica constaba de dos plantas en macetas de cada línea o variedad que se aislaron mediante el uso de bandas adhesivas en la maceta y el hilo superior se usó para entrenar las plantas para evitar el movimiento de ácaros depredadores entre réplicas adyacentes. En cada bloque (jaula) se asignó una réplica de cada especie de planta. Las semillas de estas plantas se sembraron a fines de julio de 2012 y se colocaron como duplicados de cada línea/variedad probada en un total de 6 jaulas.

Los ácaros depredadores A. swirskii se liberaron en plantas de 6 semanas de edad, mediante el rociado del material portador que comprendía los ácaros sobre todas las plantas a razón de 100 ácaros depredadores/planta. Se usó la cantidad de ácaros por gramo de material portador para estimar la cantidad a liberar.

Los ácaros depredadores se alimentaron inicialmente mediante la adición de polen ad libitum y las adiciones comenzaron después de la liberación del depredador y continuaron semanalmente durante las tres semanas siguientes. Se tomaron muestras de las plantas cada dos semanas durante 6 semanas, con inicio una semana después de la liberación de los ácaros depredadores. En cada toma de muestras, se seleccionaron al azar cinco plantas en cada jaula experimental y se tomaron muestras de cinco hojas de cada una de estas cinco plantas seleccionadas al azar. Las hojas se seleccionaron al azar a lo largo de la planta. En cada hoja se contaron los estados inmaduros (larvas, protoninfas, y deutoninfas) y adultos de los ácaros fitoseidos.

Los resultados se muestran en la Figura 3. Queda claro que la línea núm. 6, que comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención, mostró el establecimiento del mayor número de ácaros. Este es significativamente mayor que el número que se encuentra en las hojas de la planta de control de Capsicum annuum.

Tabla 1

Ejemplo 3

Mapeo QTL

El mutante de Solanum lycopersicum que comprende el gen Slmyc2 modificado de la invención se cruzó con la línea progenitora TR306. A partir de este cruce, se generó una población de mapeo F2, que se usó para la construcción de mapas genéticos específicos de la población y el mapeo QTL.

En total, se usaron 940 marcadores para analizar los 86 individuos descendientes. De estos, 241 eran polimórficos, informativos (suficiente segregación) y útiles (no muchas puntuaciones U).

Los individuos F2 se puntuaron en dos clases: h1 (que tienen el rasgo de la invención), wt (fenotipo de tipo salvaje, que incluye los fenotipos poco claros).

Como el rasgo se consideraba recesivo (monogénico), esto debería dar como resultado una segregación de 3:1 del rasgo. De hecho, la distribución de rasgos en esta traducción es wt:hl 61:25, que no es significativamente diferente de la proporción esperada de 3:1 (prueba chi2 = 0,38).

El análisis de ligamiento se realizó con MapQTL 6.0. Primero, se realizó un mapeo de intervalos para identificar regiones o marcadores vinculados al rasgo. En segundo lugar, se seleccionaron los cofactores, después de lo cual (como tercera etapa) se realizó el mapeo MQM.

La cobertura del cromosoma 8 por marcadores polimórficos es bastante baja, ya que solo se identificaron cinco marcadores. Como el intervalo en el que se mapea el rasgo es considerablemente grande (al menos 12 cM), fue necesario el análisis de la población con más marcadores para el mapeo fino del rasgo. Sin embargo, dado el hecho de que muchos marcadores parecían no ser polimórficos en el cromosoma 8 en este cruce, eso podría requerir un esfuerzo inicial adicional en la selección de marcadores.

Ejemplo 4

Elucidación del gen Slmyc2 modificado de la invención

Además del QTL que se mapeó como se describió en el Ejemplo 3, se investigó si podía identificarse el gen subyacente al rasgo de la invención.

Se realizó la secuenciación del genoma completo (WGS) de la planta de la invención y del antecedente no mutante. Como en el Ejemplo 3 se mostró que el cromosoma 8 comprendía el gen Slmyc2 modificado de la invención, se tuvieron en cuenta los 25 marcadores SNP homocigotos generados en este cromosoma. De estos 25 marcadores, 4 marcadores resultaron no discriminatorios, por lo que no se observaron diferencias entre la planta de la invención y el fondo no mutante.

Se fenotiparon un total de 227 plantas de múltiples poblaciones F4 y 80 individuos mostraron el fenotipo de la invención. Sorprendentemente, uno de los 21 marcadores fue 100 % predictivo para las 80 plantas de la invención. Para 21 de estas plantas, el marcador SL06992 dio una puntuación positiva única. Este marcador de SNP, denominado SL06992 (SEQ ID NO. 4) se eliminó y se encontró que se localizaba en el mismo lugar en el cromosoma 8 en el que se anotó el gen SL2_40ch08.g6 predicho por AUGUSTUS. En esta anotación, el nucleótido en la posición 4124 de la secuencia genómica se cambia de G a T en las plantas de la invención. Esto se corresponde con la misma posición en la SEQ ID NO. 8, que representa la secuencia de tipo salvaje. Dicho cambio de nucleótido da como resultado un codón de parada en la posición 493 del aminoácido, lo que crea por consiguiente una versión truncada de la proteína.

Ejemplo 5

Determinación de los niveles de terpenos en plantas de la invención

Para medir los niveles de terpenos en plantas de la invención, es decir, plantas que comprenden el gen Slmyc2 modificado, se usaron plantas de Solanum lycopersicum ya podadas. Se tomaron muestras de la primera, segunda y tercera hoja de la parte superior de la planta. Se recolectaron un total de cinco discos foliares de 0,71 cm2. Se almacenaron en un vial de 10 mL y se adicionó 1,0 mL del solvente diclorometano.

Posteriormente, los discos de hojas se agitaron suavemente. Después de 45-90 minutos, el solvente se transfirió a otro vial. Los extractos de solventes se almacenaron a -20 °C hasta su análisis.

Al realizar el análisis, se mezclaron 200 pL del solvente que comprende los volátiles con 5 pL del estándar interno nonilacetato. De esta mezcla, se inyectó 1 pL en el instrumento de cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS).

Para mostrar la proporción de cantidades de volátiles para plantas de la invención y plantas heterocigotas y de tipo salvaje, los resultados se muestran en unidades arbitrarias. Los valores dados en la Figura 4 se normalizaron para el patrón interno, nonilacetato.

A partir de los resultados, queda claro que tanto los mono como los sesquiterpenos están ausentes en la planta de la invención, mientras que en las plantas que no comprenden el Slmyc2 modificado de la invención, la presencia de terpenos demostró ser significativa (P<0,05).

Ejemplo 6

Determinación de los niveles de expresión de los genes de la terpeno sintasa (TPS) en la planta de la invención Para determinar si la ausencia de determinados terpenos se relaciona con la expresión de genes de TPS, se diseñó un experimento de qPCR. Se tomaron muestras de las tres hojas superiores de las plantas de la invención, se agruparon y se aisló el ARN mediante el uso del kit RNeasy (Qiagen), mediante el uso de 100 mg de tejido de la planta. El ADNc se sintetizó mediante el uso de un kit de síntesis de ADNc Maxima (Thermo Scientific) a partir de un total de 1000 ng de ARN. Las combinaciones de cebadores para detectar la expresión de genes de TPS en tomate se derivaron de Falara y otros (Plant.Phys. 157, 770-789 (2011). Se ejecutó una corrida de qPCR mediante el uso del termociclador Rotor-Gene Q PCR (Qiagen).

Para 12 genes de TPS, se detectó la regulación del cambio en veces en plantas de la invención que contenían la mutación de forma homocigótica o heterocigótica y el fondo no mutante, lo que se muestra en la Figura 7. Pueden identificarse tres tipos de patrones de expresión. Para los genes TPS16, TPS17 y TPS33 se detectó expresión en las plantas de tipo salvaje mientras que no se detectó expresión ni en las plantas homocigotas ni en las heterocigotas de la invención, ya que no se alcanzó el nivel umbral de la señal de fluorescencia. La expresión de TPS21 y TPS41 se detectó y claramente se reguló negativamente tanto en plantas mutantes homocigotas como heterocigotas de la invención. Para los otros genes de TPS no se detectó expresión en las plantas mutantes homocigotas, ya que no se alcanzó el nivel umbral de la señal de fluorescencia. Para las plantas heterocigotas se observó una regulación negativa en comparación con el patrón de expresión de tipo salvaje.

Ejemplo 7

Evaluación de los efectos de plantas que comprenden el gen Slmyc2 modificado en el establecimiento y efectividad de Amblyseius swirskii contra Aculops lycopersici,

El experimento se llevó a cabo en un invernadero multitúnel ubicado en Vicar (Almería, Andalucía, España). Este experimento se realizó en un invernadero que comprendía un total de 16 jaulas transitables (experimentales) de 5 x 3,5 x 4 m (largo x ancho x altura).

Se evaluaron dos factores, variedad de planta y depredador, en un diseño de parcela dividida con cuatro repeticiones. Había cuatro parcelas principales (grupo de cuatro jaulas) de ambas variedades de plantas (plantas que comprenden el gen Slmyc2 modificado y Razymo), cada una dividida en dos subparcelas (jaulas experimentales), cada una designada al azar para cada uno de los siguientes tratamientos: 0 o 75 A. swirskii/planta. Amblyseius swirskii se obtuvo de Koppert Biological Systems en frascos que contenían 50000 ácaros de diferentes etapas y huevos mezclados con un ácaro presa y un material portador (SWIRSKI-MITE™). Aculops lycopersici (ácaro rojo del tomate, TRM) para infestar las plantas se obtuvo de una colonia de cultivo mantenida en tomate durante varios meses antes del inicio del experimento y originalmente recolectada en plantas de tomate de diferentes lugares dentro de la región de Murcia (España)

Semillas de tomate cv. Razymo y plantas que comprenden el gen Slmyc2 modificado se sembraron en cubos de raíces de turba. Cuando las plántulas alcanzaron la etapa de cinco hojas, se trasplantaron a 25 bolsas de 1 fibra de turba de coco colocadas dentro de la jaula designada, a razón de 10 plántulas por jaula. Cada planta de tomate se inoculó con ca. 250 etapas móviles de TRM dos semanas después del trasplante. Los ácaros se contaron bajo un microscopio estereoscópico para seleccionar piezas de folíolo que contenían ca. 50 ácaros y cinco de estas piezas se depositaron en una hoja diferente de cada planta. Todos los ácaros que infestaron las plantas se recolectaron simultáneamente y de la misma parte de la planta para asegurar la homogeneidad en la proporción de edad y sexo. Los depredadores se liberaron inmediatamente en las jaulas designadas cuatro semanas después de la liberación del ácaro rojizo del tomate. A. swirskii se distribuyó mediante el rociado del material portador sobre todas las plantas a razón de 75 ácaros depredadores/planta. Se usó la cantidad de ácaros por gramo de sustrato para calcular la cantidad a liberar.

Las evaluaciones comenzaron justo antes de la liberación del depredador y continuaron semanalmente hasta el final del experimento. Para evaluar la densidad de TRM, en cada toma de muestras, se seleccionaron al azar cuatro plantas en cada jaula y se tomaron 3 discos de hojas (3,5 cm 0) de 3 hojas diferentes (un disco por hoja) de cada planta seleccionada. Se seleccionó al azar una hoja de la parte superior, otra del medio, y otra del tercio inferior de las plantas. Las muestras de discos de hojas se llevaron al laboratorio en una caja fría refrigerada y después se contó el número de TRM (etapas móviles) mediante el uso de un microscopio estereoscópico. Las poblaciones de depredadores se evaluaron in situ mediante el conteo del número de ácaros depredadores (formas móviles) presentes en las mismas hojas antes mencionadas, pero antes de recoger los discos foliares para contar el número de TRM.

Los resultados de este experimento se visualizan en la Figura 8. Los números de TRM aumentaron progresivamente durante todo el período experimental y promediaron números similares en todas las parcelas con la excepción de aquellas que contenían las plantas que comprenden el gen Slmyc2 modificado y recibieron A. swirskii, donde TRM promedió siempre valores por debajo de 7,5 ácaros por 3,5 cm 0 de folíolo, casi 20 veces menor que en los otros tratamientos al final del experimento. Por lo tanto, la abundancia de TRM fue menor en respuesta a A. swirskii en plantas que comprenden el gen Slmyc2 modificado (F3,45 = 17,640; P<0,001).

Ejemplo 8

Evaluación de la efectividad de Ambleyseius swirskii y Amblydromalus limonicus contra Bemisia tabaci (mosca blanca) en plantas que comprenden el gen Slmyc2 modificado.

Los experimentos se llevaron a cabo en un invernadero multitúnel ubicado en Vicar (Almería, Andalucía, España). Este experimento se realizó en un invernadero que comprendía un total de 16 jaulas transitables (experimentales) de 5 x 3,5 x 4 m (largo x ancho x alto).

Durante los experimentos de verano e invierno, se compararon tres tratamientos en un diseño de bloques completos al azar con 4 repeticiones en cada experimento. Los tratamientos fueron: 1) B. tabaci; 2) B. tabaci + A. swirskii y 3) B. tabaci + A. limonicus.

En ambos experimentos, se recolectaron adultos de B. tabaci para infestar las plantas de una colonia de cría en masa mantenida en plantas de tabaco. Koppert Biological Systems proporcionó A. swirskii en frascos que contenían 50 000 ácaros depredadores de diferentes etapas y huevos mezclados con un ácaro presa y un material portador (SWIRSKI-MITE™). A. limonicus se obtuvo de Koppert Biological Systems en frascos que contenían 10000 ácaros de diferentes etapas y huevos mezclados con un ácaro presa y un material portador (LIMONICA™).

Se sembraron semillas de plantas de tomate que comprendían el gen Slmyc2 modificado en cubos de raíces de turba. Cuando las plántulas alcanzaron la etapa de cinco hojas, se trasplantaron a 25 bolsas de 1 fibra de turba de coco colocadas dentro de las jaulas designadas, a razón de 10 plántulas por jaula. Las plagas adultas se enfriaron brevemente en una cámara frigorífica a 8 °C para contarlas y después se liberaron en todas las jaulas a razón de 10 adultos/planta y 5 hembras/planta por semana durante tres semanas consecutivas para un total de 30 adultos de mosca blanca/planta. Los primeros adultos de mosca blanca se liberaron justo después del trasplante. Este programa de liberación se usó para simular una inmigración gradual pero intensa de la plaga al invernadero. Para las infestaciones semanales de todas las jaulas, se recolectaron simultáneamente moscas blancas adultas de la crianza en masa y que pertenecían a la misma cohorte para asegurar la homogeneidad en la proporción de edad y sexo. A. swirskii y A. limonicus se liberaron una semana después de la liberación de las primeras plagas adultas mediante el rociado del material portador sobre todas las plantas a razón de 75 ácaros depredadores/planta. Se usó la cantidad de ácaros por gramo de sustrato para calcular la cantidad a liberar.

En los experimentos, en cada toma de muestras semanal se seleccionaron al azar cuatro plantas en cada jaula experimental y se muestrearon tres hojas de cada una de las cuatro plantas seleccionadas al azar. Se seleccionó al azar una hoja del tercio superior, una del medio, y otra del tercio inferior de la planta. En cada hoja se contaron ninfas y adultos de mosca blanca y los estados inmaduros (larvas, protoninfas, y deutoninfas) y adultos de los ácaros fitoseidos.

Los resultados de los experimentos de infestación de mosca blanca se muestran en la Figura 9. La población de ninfas de mosca blanca se suprimió de manera similar por A. swirskii y A. limonicus. Además, el número de ninfas de mosca blanca por hoja se mantuvo casi constante y nunca superó las 15 ninfas por hoja durante todo el experimento en las parcelas que recibieron a los depredadores.

Ejemplo 9

Evaluación de la efectividad de Ambleyseius swirskii y Amblydromalus limonicus contra Frankliniella occidentalis (trips) en condiciones de verano e invierno en plantas que comprenden el gen Slmyc2 modificado.

Durante los experimentos de verano e invierno, se compararon tres tratamientos en un diseño de bloques completos al azar con 4 repeticiones en cada experimento. Los tratamientos fueron: 1) F. occidentalis; 2) F. occidentalis + A. swirskii y 3) F. occidentalis + A. limonicus.

En ambos experimentos, se obtuvieron adultos de F. occidentalis para infestar las plantas de una colonia de cría mantenida en Koppert Biological Systems en vainas de judías verdes. Koppert Biological Systems proporcionó A. swirskii en frascos que contenían 50 000 ácaros depredadores de diferentes etapas y huevos mezclados con un ácaro presa y un material portador (SWIRSKI-MITE™). A. limonicus se obtuvo de Koppert Biological Systems en frascos que contenían 10 000 ácaros de diferentes etapas y huevos mezclados con un ácaro presa y un material portador (LIMONICA™).

Los procedimientos fueron los mismos para los experimentos de verano e invierno. Se sembraron semillas de plantas de tomate que comprendían el gen Slmyc2 modificado en cubos de raíces de turba (verano: 1/7/2014; invierno: 22/09/2014). Cuando las plántulas alcanzaron la etapa de cinco hojas, se trasplantaron a 25 bolsas de 1 fibra de turba de coco colocadas dentro de las jaulas designadas, a razón de 10 plántulas por jaula (verano: 8/5/2014; invierno: 28/10/2014). Las plagas adultas se enfriaron brevemente en una cámara frigorífica a 8 °C para el recuento, después se liberaron en todas las jaulas a razón de 10 adultos/planta y 5 hembras/planta por semana durante tres semanas consecutivas para un total de 15 hembras de trips/planta. Los primeros adultos de trips se liberaron justo después del trasplante. Este programa de liberación se usó para simular una inmigración gradual pero intensa de ambas plagas al invernadero. Para el experimento se usaron trips adultos recién emergidos, que se recolectaron antes de cada liberación semanal de una única cohorte, para asegurar la homogeneidad en la edad. Las hembras de trips se mezclaron con un número desconocido de machos. A. swirskii y A. limonicus se liberaron una semana después de la liberación de las primeras plagas adultas (verano: 8/12/2014; invierno: 11/4/2014) mediante el rociado del material portador sobre todas las plantas a razón de 75 ácaros depredadores/planta. Se usó la cantidad de ácaros por gramo de sustrato para calcular la cantidad a liberar.

En los experimentos de verano e invierno, en cada toma de muestras semanal se seleccionaron al azar cuatro plantas en cada jaula experimental y se muestrearon tres hojas de cada una de las cuatro plantas seleccionadas al azar. Se seleccionó al azar una hoja del tercio superior, una del medio, y otra del tercio inferior de la planta. En cada hoja se contaron adultos y formas móviles de trips y adultos de ácaros fitoseidos.

Los resultados de los experimentos de infestación de trips se muestran en la Figura 10. A. limonicus y A. swirskii fueron capaces de reducir significativamente las poblaciones de trips tanto en verano como en invierno, aunque A. limonicus resultó más efectivo en invierno en comparación con A. swirskii (verano: F2,31= 21,632; P < 0,001; invierno: F2,45= 48,789; P<0,001; Figura 10). Durante el verano, en las jaulas que recibieron a los depredadores, el número de trips por hoja disminuyó progresivamente a lo largo del período experimental y casi no se registraron trips al final (Figura 10A). Durante el invierno, ambos depredadores redujeron de manera similar las poblaciones de plagas durante las primeras semanas, pero a la mitad del experimento (aproximadamente cuando las temperaturas diarias promedio estaban por debajo de los 20 °C) la densidad de trips aumentó rápidamente en las parcelas tratadas con A. swirskii y alcanzaron densidades similares a las de las jaulas no tratadas en al final del experimento, lo que refleja la falta de control de la plaga por parte del depredador (Figura 10B). Se sabe que A. swirskii es menos activo a temperaturas inferiores a 20 °C. Por el contrario, en las jaulas que recibieron A. limonicus, la densidad de trips se mantuvo nuevamente constante y siempre promedió por debajo de 3, aproximadamente 6 veces menor en comparación con las jaulas que recibieron A. swirskii. Por lo tanto, A. limonicus aún puede usarse con éxito a temperaturas en las que A. swirskii es menos activo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Gen Slmyc2 modificado, que comprende al menos una modificación, en donde la modificación comprende un SNP en o antes de la posición 1477 de la SEQ ID NO. 6 que da como resultado la presencia de un codón de terminación prematuro dentro de la secuencia codificante o un cambio en el marco de lectura o comprende una mutación en la secuencia codificante que codifica para un aminoácido diferente, y cuya modificación conduce a la reducción o ausencia de la actividad de la proteína S1MYC2, en donde el gen Slmyc2 modificado se localiza en el cromosoma 8 y es capaz de conferir un fenotipo de pelo glandular aberrante a una planta de Solanum lycopersicum.

2. Gen Slmyc2 modificado como se reivindica en la reivindicación 1, en donde la modificación se selecciona de una modificación que disminuye el nivel de ARNm del gen Slmyc2, una modificación que disminuye el nivel de la proteína S1MYC2 y/o una modificación que disminuye la actividad de la proteína S1MYC2, en comparación con el gen Slmyc2 de tipo salvaje de la SEQ ID NO. 5.

3. Gen Slmyc2 modificado como se reivindica en la reivindicación 1 o 2, en donde la modificación comprende un SNP en la posición 1477 de la SEQ ID NO. 2, en particular del nucleótido G (tipo salvaje) a T.

4. Gen Slmyc2 modificado como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el fenotipo de pelo glandular aberrante se caracteriza por la reducción y, preferentemente, ausencia de terpenos, en particular a-pineno, mirceno, careno, a-felandreno, p-felandreno, p-cimeno, limoneno, 8-elemeno, p-cariofileno y/o a-humuleno, y/o se caracteriza por pelos glandulares deformados.

5. Uso de un gen Slmyc2 modificado como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para el desarrollo de una planta de Solanum lycopersicum en la que pueden establecerse ácaros depredadores, en particular Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus, en donde el desarrollo de la planta de Solanum lycopersicum comprende la introducción del gen Slmyc2 modificado en la planta de Solanum lycopersicum, mediante modificación genética.

6. Uso como se reivindica en la reivindicación 5, en donde el establecimiento de ácaros depredadores, en particular Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus, se permite por un fenotipo de pelo glandular aberrante.

7. Uso como se reivindica en la reivindicación 6, en donde el fenotipo de pelo glandular aberrante se caracteriza por la reducción y, preferentemente, ausencia de terpenos, en particular a-pineno, mirceno, careno, afelandreno, p-felandreno, p-cimeno, limoneno, 8- elemeno, p-cariofileno y/o a-humuleno, y/o se caracteriza por pelos glandulares deformados.

8. Uso de una planta de Solanum lycopersicum que comprende un gen Slmyc2 modificado como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en particular en donde la planta presenta un fenotipo de pelo glandular aberrante que permite el establecimiento de ácaros depredadores, en particular Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus, sobre dicha planta de Solanum lycopersicum, para el cultivo y conservación de ácaros depredadores, o de una colonia a partir de los mismos.

9. Método para la obtención de una planta de Solanum lycopersicum que presenta un fenotipo de pelo glandular aberrante, que permite el establecimiento de ácaros, en particular de los ácaros depredadores Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus, que comprende reducir el nivel endógeno de proteína S1MYC2 en la planta mediante la mutación del gen Slmyc2 de la planta.

10. Gen myc2 modificado que comprende una modificación en las secuencias codificantes de tipo salvaje como se muestra en las SEQ iD NO. 10, SEQ ID NO. 13 o SEQ ID NO. 16, que cuando se expresa en una planta conduce a la reducción y, preferentemente, a la ausencia de terpenos en dicha planta, y/o que es, preferentemente, capaz de conferir un fenotipo de pelo glandular aberrante a dicha planta, cuyo gen comprende una modificación que conduce a la reducción o ausencia de actividad de la proteína MYC2, y en donde la modificación se selecciona de una modificación que disminuye el nivel de ARNm del gen myc2, una modificación que disminuye el nivel de la proteína MYC2 y/o una modificación que disminuye la actividad de la proteína MYC2, en comparación con un gen myc2 de tipo salvaje no modificado.

11. Una planta de Solanum lycopersicum que comprende un gen Slmyc2 modificado como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

12. Una planta de Solanum lycopersicum como se reivindica en la reivindicación 11, en donde la planta presenta un fenotipo de pelo glandular aberrante que permite el establecimiento de ácaros depredadores, en particular Amblyseius swirskii y/o Amblydromalus limonicus, en dicha planta de Solanum lycopersicum.

13. Una semilla de Solanum lycopersicum que comprende el gen Slmyc2 modificado como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la planta que puede cultivarse a partir de la semilla muestra el fenotipo de pelo glandular aberrante.

14. La planta progenie de una planta de Solanum lycopersicum como se reivindica en la reivindicación 11 o 12, en donde la planta progenie comprende el gen Slmyc2 modificado, como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

15. El material de propagación capaz de desarrollarse y/o derivarse de una planta de Solanum lycopersicum como se reivindica en la reivindicación 11 o 12, en donde el material de propagación comprende el gen Slmyc2 modificado como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y en donde el material de propagación se selecciona de un grupo que consiste en microsporas, polen, ovarios, óvulos, embriones, sacos embrionarios, células embrionarias, esquejes, raíces, puntas de raíces, hipocótilos, cotiledones, tallos, hojas, flores, anteras, semillas, células meristemáticas, protoplastos y células, o un cultivo de tejido de este.