CN101400252B - 莴苣中抗生理学病症的抗性 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于就个体在其中的存在而筛选植物群体的方法，所述个体与对照植物相比，显示减少的对乙烯和生理病症特别是锈斑病和黄化的易感性，其中在黑暗处和在乙烯存在的情况下萌发种子群体以获得幼苗，所述幼苗，当在乙烯下与原始的对乙烯敏感的对照相比，具有更长的下胚轴时，被选择作为显示减少的对乙烯和生理病症特别是锈斑病和黄化的易感性的植物。本发明还涉及所选择的植物。

Description

莴苣中抗生理学病症的抗性

发明领域

本发明涉及用于就个体在其中的存在而筛选植物的群体的方法，所述个体在它们的乙烯反应模式方面发生了改变。本发明还涉及所鉴定的植物和植物部分，特别是叶类蔬菜。更特别地，本发明涉及显示改变的对乙烯的反应的莴苣(Lactuca sativa L.)，所述改变的反应导致该作物物种对生理病症例如锈斑病(Russet Spotting)和黄化(Yellowing)的减少的易感性。本发明还涉及这些植物和植物部分的种子和后代。

发明背景

叶类蔬菜如莴苣的育种目的在于产生最适合于产生销路好的产品的商业品种。在选择过程中需要考虑与输入和输出性状都相关的许多特征。在该方面最重要的性状中的一个性状涉及收获后质量特别是贮藏期。生理病症，更特别地锈斑病和黄化的避免是可延长莴苣作物或其部分的贮藏期的重要因子。

乙烯是公知的刺激与衰老相关的生理过程的植物激素。在莴苣中，该刺激通过症状例如锈斑病和黄化的形成表现出来。

锈斑病症的特征在于褐斑沿着叶的中脉的出现，而黄化是在作为叶绿素分解的结果在老化过程中发生的叶子的整体性变白。

尽管已知莴苣的成熟的叶球(head)产生仅仅微量的乙烯，但植物对该植物激素高度敏感。因此，与乙烯敏感性相关的生理病症(所述生理病症可降低莴苣的收获后质量)主要由外源乙烯引起的。对此类外源乙烯的暴露可在收获过程中、产品的加工和贮藏过程中发生。

例如，当将莴苣与乙烯产生性水果例如苹果、梨或桃相邻运输或相邻贮藏时，可发生严重的变质。此外，当加工莴苣并将其用于包装的鲜切混合物中时，可能由于一种或多种成分导致乙烯释放的原因而对可使用的成分存在限制。

锈斑病是表现在沿着叶的中脉出现许多褐斑的生理病症。褐变病症可在病症的渐进阶段扩展至整个叶片。已知锈斑病特别地在成熟莴苣叶球于低浓度(ppm水平)的乙烯存在的情况下在较低的温度(5℃)下贮藏时易于发生。

可通过使用植物激素生长素或钙来拮抗症状的形成。此外，包含低氧水平的改变的气氛减少了症状发展的速度

在生物化学水平上，锈斑病表现为作为木质素生物合成的局部刺激结果而发生的，所述木质素的生物合成引起木质化和围绕将出现可见症状的叶子区域的细胞壁增厚。

褐色变色由酚类代谢的刺激引起。已显示由乙烯诱导的苯丙氨酸氨解酶(PAL)催化苯基丙酸类路径的第一关键步骤。形成的酚类化合物主要包括咖啡酸衍生物和许多黄酮类例如(+)儿茶素和(-)表儿茶素(epicatechin)。多酚氧化酶(PPO)对这些化合物的随后氧化导致通常在锈斑病中观察到的褐色变色。最后，由于组织的塌陷和细胞死亡，病症可变得更加严重。

衰老是在植物或植物器官的生命周期结束时天然发生的发育过程，在该过程中代谢被重新编程以将资源重新动员入生殖结构如种子。尽管衰老是由内源因子如生理年龄引起的发育过程，但存在许多可调控衰老的外源因子。

叶子的黄化是最明显的衰老症状，是叶绿素在衰老的相对晚期中分解的结果，一旦叶子接受乙烯，乙烯可增强所述衰老。衰老的众所周知的其他因子是损伤、黑暗和营养物的缺乏。尽管乙烯是已知刺激衰老的最重要的植物激素，但其他激素如茉莉酮酸酯也促进该过程。

从莴苣作物收获时刻直至消费时刻，产品可能暴露于促进衰老的不同外源因子。这些因子可以是收获和加工过程中的损伤、贮藏过程中的黑暗和营养物的缺乏以及加工和贮藏期间的乙烯。这些因子强烈地刺激可表现为锈斑病和黄化的收获后病症。尽管这些效应主要是表面性的，但产品的吸引力大大减少，从而导致没有销路。

为了抵抗变质效应，可采取可减少这些效应的许多收获后措施。例如，可在低温下贮藏收获的莴苣以延缓衰老。尽管这可减少黄化的速度，但可增加锈斑病。此外，可执行减少从田间至消费者所需的运输时间或防止莴苣贮藏在乙烯源的附近的物流措施。此外，可应用防止收获后变质的化学处理，尽管食品安全和消费的接受明显地成问题。

许多收获后措施在一定程度上是成功的，但存在一定的提高空间。此外，有关的成本可以是很重要的，这是探寻减少对使用收获后处理的需要的另外的选择的另一个原因。优选，发现减少或消除对采用目前用于保持高水平的收获后质量的昂贵的、预防性措施的需要的遗传解决方法。

本发明的目的是提供允许鉴定对乙烯不敏感的植物的筛选方法。本发明的进一步目的是提供可通过所述方法获得的植物。

按照本发明通过如下方法实现该目的，所述方法用于就个体(所述个体与对照植物相比显示减少的对乙烯和生理病症特别是锈斑病和黄化的易感性)在其中的存在筛选植物的群体，所述方法包括：

a)提供种子的群体；

b)在黑暗处和在乙烯存在的情况下萌发种子以获得幼苗；

c)选择显示比对乙烯敏感的对照的下胚轴更长的下胚轴的幼苗；

d)将选择的幼苗自交以产生种子；

e)在黑暗处和在乙烯存在的情况下，萌发一部分从各选择的幼苗产生的种子，在黑暗处和在空气中萌发另一部分来自各选择的幼苗的种子；和

f)测量在乙烯下萌发的幼苗的下胚轴对在空气中萌发的幼苗的下胚轴的相对生长以将在乙烯和空气中与原始的对乙烯敏感的对照相比，都具有更长的下胚轴的植物与只在乙烯下与原始的对乙烯敏感的对照相比，具有更长的下胚轴的植物区分开来，

其中只在乙烯下与原始的对乙烯敏感的对照相比具有更长的下胚轴的植物被鉴定为显示减少的对乙烯和生理病症特别是锈斑病或黄化敏感的植物。

本发明基于这样的假设，即对乙烯不敏感的植物特别是莴苣将对收获后生理病症例如锈斑病或黄化具有抗性。

在优选实施方案中，本发明的方法包括就它们的对锈斑病和/或黄化的抗性检测已在之前的步骤中鉴定为显示减少的对乙烯的敏感性的植物的进一步步骤。

可通过与标准比较和进行从1(该评分表示等于在乙烯下的对乙烯敏感的标准品种)至3(该评分表示等于在空气下的对乙烯敏感的标准品种)的评分来观察下胚轴长度和根长度。如果希望，可进行精确至毫米的测量。通过使用这些测量中的一种，可进行对于本领域技术人员来说是熟知的简单统计分析如t检验来确定植物或植物群体对乙烯的敏感性是否比对乙烯敏感的标准如对′Troubadour′(RijkZwaan，De Lier，NL)显著更低。所使用的单侧检验的显著性水平是0.001。

对于突变体，优选进行原始品种的(所述原始品种被用于诱变处理，其为最佳的可得的标准)的下胚轴长度和任选地根长与个体突变体和/或它们的后代的下胚轴和根的长度之间的统计比较。

为了发现现有植物材料中的对乙烯不敏感的植物，选择品种、繁殖系和/或基因库目录号的的一个或多个代表性样品。然后合适地进行处于研究中的个体与群体的其余部分的下胚轴和根的长度之间的统计比较。当就显著更长的下胚轴和/或根统计检测个体时，可能需要多重试验以保持适当的总体显著性水平(Dunnett，CW，J.Amer.Statist.Assoc.50：1096-1121(1955))，例如使用一个标准的Dunnett多重比较。

待筛选的植物通常是多叶植物，特别地属于莴苣属和特别地属于莴苣种(Lactuca sativa)的植物。

植物群体优选是突变体植物的群体，因为在该变异体群体中发现本发明的植物的概率更高。然而，可按照本发明筛选在它们的遗传组成方面不同的任何其他植物群体。

优选通过使用化学物质和/或辐射的诱变处理获得突变体植物的群体。诱变处理是众所周知的且在下文中进一步描述。

步骤b)中的乙烯的浓度是至少10μg/升，优选11至25μg/升。步骤d)中的乙烯的浓度是大约4至5μg/升。

本发明的筛选方法中的选择步骤基于下胚轴的延长。黑暗中生长萌发的幼苗对乙烯的暴露引起下胚轴的径向膨大以及根和下胚轴生长的抑制。该现象通常称为三重反应(参见例如Guzman，P & Ecker，J，Plant Cell 2：513-523(1990))。该反应的重现性允许筛选在乙烯存在或不存在的情况下显示改变的三重反应的突变体。除了测量下胚轴的延长外或代替测量下胚轴的延长，本发明的选择可基于三重检验的一个或多个其他因素。

根据其的其他方面，本发明提供了与对照植物相比显示减少的对乙烯和生理病症特别锈斑病和黄化的易感性的植物，可通过将植物种子的群体经历本发明的筛选方法和从群体选择与对乙烯敏感的对照植物相比，显示更长的下胚轴作为显示减少的对乙烯和物理病症特别是锈斑病或黄化的易感性的植物来获得所述植物。

本发明的植物优选是叶类蔬菜植物，特别地属于莴苣属和特别地属于莴苣种的植物。

通过使用本发明的筛选方法，鉴定和筛选对乙烯不敏感的突变体。2007年1月3日将这些突变体的种子保藏在NCIMB Ltd，FergusonBuilding，Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen，AB21 9YA UK，并且如表1所示将目录号赋予所述种子。在实施例3和实施例4中提供了关于保藏物的种子后代的详细描述。制备这些保藏物，因为它们具有显著减少的对乙烯的敏感性的单个特异性特征。未就品种注册的DUS标准即关于所有注册特征的可区别性、均一性、稳定性对它们进行检测，并且不预期它们以任何方式满足这些标准。

表1

植物编号	内部参照(＝NCIMB参照)	NCIMB目录号
			00D.7856	07D.826509	41449
00D.6876	07D.826514	41450
			00D.7871	07D.826502	41448
00D.6883	07D.826522	41451
			00D.6896	07D.826540	41452
00D.7845	07D.826542	41453

本发明还涉及显示减少的对乙烯和生理病症特别是锈斑病或黄化的易感性的植物，所述植物可通过将本发明的植物与相同种的另一个植物杂交来获得。因此可将特征“减少的对乙烯和生理病症特别是锈斑病或黄化的易感性”引入原先不具有该特征的其他植物。可通过将这些植物经历本发明的筛选方法来检测由这样的杂交产生的植物是否确实是本发明的植物。

本发明还涉及显示减少的对乙烯和生理病症特别是锈斑病或黄化的易感性的本发明的亲本植物的后代。这样的后代可以远离亲本许多代。只要特征“对乙烯和生理病症特别是锈斑病或黄化的易感性”存在，后代植物就是本发明的植物。

本发明还涉及本发明的植物的部分。植物部分是例如莴苣的叶球或叶子，例如嫩叶(baby leave)、经加工的叶球或经切割的叶子。

本发明的植物部分可用于组织培养以再生具有在植物(用于组织培养的组织所来源的植物)中发现的减少的对乙烯和生理病症特别是锈斑病或黄化的易感性的植物。此类再生的植物也是本发明的部分。

本发明还涉及本发明的植物的种子。可从所述种子生长出也具有特征“减少的对乙烯和生理病症特别是锈斑病或黄化的易感性”的植物。可在本发明的筛选方法中检测种子和因此从其生长的植物是否保持该特征。本发明还涉及保留在原始种子中发现的减少的对乙烯和生理病症特别是锈斑病或黄化的易感性的下一代的种子。

根据其的其他方面，本发明涉及蔬菜植物，包括本发明的植物或其部分。优选，蔬菜是叶类蔬菜，更特别地蔬菜是莴苣。

当在本发明的方法中筛选时，蔬菜产品显示减少的对乙烯和生理病症特别是锈斑病或黄化的易感性。

应当指出，本发明的筛选方法是相对简单的方法。可在足够大的任何变异体群体中鉴定具有减少的对乙烯和生理病症特别是锈斑病或黄化的易感性的本发明的植物。不需要过多的实验实施来再现本发明，因此本发明的植物一定不能解释为限定于被保藏的植物。

因为它们的对乙烯的不敏感，本发明的莴苣植物材料和从其来源的种子显示了在它们的收获后质量(特别与衰老相关现象(所述衰老相关现象例如为锈斑病和黄化)相关的收获后质量)方面具有强烈的增加。

发明详述

因为乙烯是刺激衰老的最重要的植物激素和因为锈斑病和黄化与衰老相关，因而采用其中产生遗传变异体和就乙烯的不敏感性选择遗传变异体的遗传方法。发现该方法间接导致在它们的收获后衰老反应中受到影响的突变体的鉴定。

使用植物模式种例如拟南芥以及作物种的详细研究已提供了关于参与乙烯的生物合成和感知的生物化学途径的信息。已就它们在该方面的作用表征了基因的许多等位基因形式，提供乙烯在植物中的功能的复杂状况。乙烯，和其他植物激素一样，在复杂的相互作用的调节网络中包括的许多生理过程中起着重要作用。

尤其地，在乙烯生物合成、乙烯的感知、信号转导以及下游效应蛋白的激活的背后的基因表达的水平上确定激素的空间和时间活性。

以不同水平牵涉的基因的等位变异体可确定反应的强度和与其他信号转导途径的交叉对话的水平。由于莴苣中乙烯的生物合成和感知未得到良好的表征以及为了允许鉴定不同的反应强度和它们背后的等位基因变异体，可推论出，无偏方法在该方面与被靶向的基因修饰方法相比会更成功。

这样的无偏方法优选包括与有效率的表型筛选和基于变白的幼苗对乙烯的反应的选择方法相结合的化学或物理随机诱变方法。这样的基于幼苗的选择系统在每人小时可被评估的植物数目方面与使用成熟莴苣叶球相比要有效得多。此外，在幼苗的情况下，产生用于筛选的植物材料的时间与成熟的叶球相比明显减少得多。

该方法的其他有利方面是，一旦已鉴定出成功的事件，幼苗阶段的选择条件在用作连续代中的收获后性状的预测性表型标记。明显的风险存在于这样的事实中，即幼苗阶段的选择可能不导致以成熟的、收获后的水平表达选择的性状的遗传变异体。此外，公认植物激素如乙烯参与许多可导致多效性作用的生理过程。取决于作物和其栽培条件，这些作用可以是正的或负的。因此采用的方法优选包括下列步骤：

1.通过用诱变剂例如甲磺酸乙酯(ems)或γ辐射处理种子或植物组织来产生突变体群体。

2.有效率的表型筛选的建立，在所述筛选中，选择基于植物特别是莴苣的变白的幼苗对乙烯的反应，所述反应的特征在于下胚轴延长的强烈减少、缩短的、增厚的根以及夸张的顶部钩曲率(apical hookcurvature)。该反应称为三重反应，所述三重反应通常用于变白的幼苗，且发现在许多植物种(当暴露于包含乙烯的气氛中时)中不同程度地发生(参见例如Ecker J，Science 268(5211)：667-675(1995))。

3.在它们的三重反应中的至少一个试验中在收获后变质(所述变质包括锈斑病和黄化)方面发生改变的突变体的表征。任选地，改变的多效性不包括可影响植物的价值的负面多效性的确定。

因此在本发明的筛选方法中，待检测的植物种子的群体优选是可通过如下方法获得的突变种子的群体，所述方法包括：

a)用诱变剂处理待改变的植物种的M0种子以获得M1种子；

b)从所获得的M1种子生长植物以获得M1植物；

c)通过M1植物的自体受精产生M2种子；和

d)任选地重复步骤b)和c)n次以获得M1+n种子。

然后在黑暗处和在高乙烯浓度存在的情况下萌发所获得的M1+n种子以获得幼苗。然后，选择不显示对乙烯的反应的幼苗。待测量的反应是与对乙烯敏感的幼苗的下胚轴相比延长的下胚轴的发育。

然后，将各选择的植物的后代分组并且在黑暗中生长：一半的后代在乙烯下，一半的后代在空气下。在两种条件下测量各后代的乙烯下对空气下的下胚轴的相对生长。这些观察用于区别后代(所述后代在乙烯下和在空气下都具有比原始的对乙烯敏感的对照更长的下胚轴，从而可得出是对乙烯敏感的和不希望的)与真正具有减少的对乙烯的易感性的后代。

熟知的诱变剂的实例是ems。Ems主要烷基化：DNA链的G残基，这在DNA复制期间引起与T而不是C的配对。因此，GC配对以由ems的有效剂量和植物的错配修复系统的活性确定的频率改变成AT配对。Ems的有效剂量取决于所使用的浓度、种子的大小和其他物理性质以及种子在ems溶液中的温育时间。已用ems处理的种子通常称为M1种子。作为处理的结果，M1种子的组织在它们的细胞的基因组中包含随机点突变，存在于将形成种系组织(生殖细胞)细胞的亚群中的这些点突变将被传递至称为M2的下一代。为单倍不足(haplo-insufficient)从而引起不育或诱导胚胎致死现象的突变或其组合将不被传递至M2代。

上述使用ems的相似方法同样可用于其他诱变剂。M2群体可用于目的在于减少的变白的幼苗的三重反应的筛选方法。

其他诱变剂，特别地烷基化诱变剂，是硫酸二乙酯(des)、乙烯亚胺(ei)、丙磺酸内酯、N-甲基-N-亚硝基乌拉坦(nitrosourethane)(mnu)、N-亚硝基-N-甲脲(NMU)、N-乙基-N-亚硝基脲(enu)、叠氮化纳。

可选择地，通过辐射诱导突变，所述辐射选自例如X射线、快中子、紫外线照射。

在本发明的另一个实施方案中，通过基因工程例如通过使用嵌合寡核苷酸、同源重组、与内源产物竞争的经修饰的靶基因的导入、通过RNA干扰进行的下调等来诱导突变。

允许以特定的方式改变存在于植物的基因组中的基因靶的技术对于本领域技术人员来说是已知的。例如已证明嵌合寡核苷酸是具有特定作用模式的有效诱变剂。另一个方法是通过同源重组或基因打靶改变基因靶。通过使用该方法，通过导入的包含希望的变化的DNA片段交换基因的片段。转基因方法也是可行的，在所述方法中导入与内源产物竞争的已改变的靶基因。这可导致显性负效应。此外，通过RNA干扰特异性下调基因的表达是可行的。

在诱变寡核苷酸的情况下，基因打靶或转基因方法用于改变参与乙烯功能的遗传因子，很明显，相关基因的一级结构应当是已知的。然而目前，对于莴苣，关于这样的基因的知识是有限的。

优选，本发明还包括叠加(pyramiding)对乙烯的减少的易感性的等位基因。

合适地通过自花受粉实现M1和M1+n种子的产生。

本发明还涉及在它们的基因组中具有负责减少的对生理病症例如锈斑病和黄化的易感性的和在表1中所列的在莴苣植物的基因组中发现的遗传信息的植物或植物部分。

所述的植物的后代也是本发明的部分。此处所用的“后代”意欲包括具有与此处描述的原始植物相同的或相似的减少的对乙烯和生理病症特别是锈斑病或黄化的易感性的和以任何方式(例如通过有性繁殖如自体受精或与相同属的另一种植物异体受精或营养繁殖例如扦插、组织培养、单倍体培养、原生质体培养、原生质体融合或其他技术)从所述原始植物产生的所有植物。因此这样的后代是按照本发明鉴定的植物的第一代，和是通过一种或多种这些技术产生的植物的第一代，也是通过一种或多种这些技术产生的每一个下一代，只要产生的植物具有减少的易感性。

为了确定变白的莴苣幼苗对乙烯的反应，使用特别设计的容器，在所述容器中，在其中乙烯水平可发生改变的气氛下将莴苣幼苗在滤纸上生长。确实发现，莴苣幼苗通过下胚轴的减少的延长对乙烯的存在作出反应，这在原理上允许选择对乙烯不敏感的突变体(如果此类突变体存在于所述可获得的群体中且如果不敏感性在所使用的实验条件下在幼苗水平上通过表型表达出来)。

通过在包含乙烯的气氛下生长大量来自包含随机诱导的突变的群体的变白的莴苣幼苗，发现可获得和选择与起始群体的乙烯敏感性相比，显示减少的乙烯敏感性的幼苗。选择显示下胚轴延长至可与其中气氛是由不含乙烯的空气组成的情况下相比的程度的幼苗。证明以该方式鉴定的幼苗对乙烯不敏感。

为了确认对乙烯不敏感的突变体具有对褐斑和黄化的抗性，就它们对褐斑和/或黄化的抗性检测筛选中鉴定的突变体。

褐斑检测合适地包括在8℃的温度下在黑暗处，在密闭的容器中贮藏收获的成熟叶球，将它们暴露于6至7vpm(每百万分之一体积部分)的浓度的乙烯气体，在7天后，优选9天后评估褐斑病症的存在。合适地，将对乙烯敏感的对照叶球与待检测的植物一起温育，将待检测的植物的锈斑病与之比较。

黄化检测包括将待检测的莴苣植物的成熟叶球在8℃下贮藏在不含乙烯的贮藏室中，在10天后，优选14天后评估基叶(base leaves)的黄化。抗黄化的植物是在14天后不显示基叶黄化的植物。合适地将对乙烯敏感的对照叶球与待检测的植物一起温育，将待检测的植物的黄化反应与之比较。

如实施例中所举例说明的，第一次证明对乙烯不敏感导致对不是由乙烯诱导的锈斑病和黄化的抗性。

令人吃惊地，也发现显示与对照条件相比减少的延长反应但与敏感对照相比更长的幼苗，所述幼苗也被认为是对乙烷不敏感的，虽然是部分不敏感。

观察到的乙烯不敏感性的可变水平可反映影响该性状的不同突变基因座或相同基因座的不同等位基因形式在原始群体中的存在。

在隐性突变的情况下，可通过进行等位性测定来容易地区分这两种可能性，所述测定包括将两个突变事件杂交，确定杂种的表型。在突变的等位性的情况下，乙烯不敏感性将在F1中表现出来，然而如果突变体中的表型由不同的隐性基因座决定时，情况将不是这样。

当随机诱变用作产生起始群体的优选方法时，遗传背景中的突变也可在实验条件下促成幼苗表型的变化。为了区分不同强度的单个突变与遗传背景中的突变的组合效应，应当进行回交以产生不同的对乙烯不敏感的事件的一致的遗传背景。为了确定特定基因座上参与乙烯敏感性的突变是否异展示多效性，该方法也是适用的。

使用基于减少的对乙烯的反应所选择的M2植物生长M3种子。在一些情况下，在三重反应检测中就减少的乙烯敏感性选择从M3种子长出的M3植物，将所述M3植物自交，从而产生M4种子。在少数情况下这被重复至M5。

在一个情况下，在三重反应检测中就减少的乙烯敏感性选择从M3种子生长的M3植物，然后将该M3植物与对乙烯和褐斑敏感的亲本杂交，从而获得F1种子。将从F1种子生长的F1植物自交从而产生F2种子。在三重反应检测中就减少的乙烯敏感性选择从这些F2种子生长的F2植物，将该F2植物自交，从而产生F3种子。将该F3系加入至成M3和M4近交系的组。随后，就它们对乙烯的反应重新评估来自对乙烯不敏感的事件的近交系。基于在包含乙烯的气氛对空气的气氛下幼苗的相对生长对各近交系的不敏感性的水平进行评分。基于该标准，早期被评分为对乙烯不敏感的54个系中的12个系现分类为敏感的系。在M2水平上进行的最初的筛选中的这些假阳性可在下一代的事件的重新评估中容易地除去。

在常规的莴苣生产条件下在温室中播种和栽培在乙烯检测中显示确定的和显著的对乙烯的不敏感性的近交系，从而产生就锈斑病和黄化进行评估的成熟叶球(也参见实施例)。

作为阴性对照，栽培源于用于选择对乙烯不敏感的事件的群体的对乙烯敏感的植物。令人吃惊地，当在盆栽土中种植时，所有对乙烯不敏感的突变体的种子正常萌发，即可与近等基因(near-isogenic)乙烯敏感型对照植物的种子相当。

这与其他植物种例如拟南芥(当在盆栽土中栽培时显示萌发能力的急剧减少)(Harpham，N.J.V.等人(1991)Annals of Botany68，55-61)中的情况形成鲜明的对比。对于莴苣，很明显可能按照正常的栽培实践栽培对乙烯不敏感的突变体，所述栽培实践在许多情况下包括在盆栽土块或盆栽土塞(potting soil plug)中播种。

在栽培后，收获成熟的叶球，将其暴露于乙烯。在包含乙烯的气氛下在8℃下收获后温育叶球一周导致对乙烯敏感的对照植物的叶头的锈斑病的强诱导。然而，被评估的37件对乙烯不敏感的事件中有29件显示根本无锈斑病的迹象，这令人吃惊地证明在幼苗水平上选择的乙烯抗性可在成熟植物水平甚至收获后阶段减少生理病症。

可就在亚适温下在不含乙烯的贮藏条件下就对许多乙烯不敏感的事件证明黄化抗性。这是令人吃惊的，因为到现在为止黄化抗性只在乙烯存在的情况下报导过(Saltveit等人，Postharvest Biologyand Technology 27：277-283(2003))。

将在下列的且不以任何方式限定本发明的实施例中举例说明本发明。特别地，对莴苣进行实施例中的实验，但本发明更广泛地用于当与乙烯接触时遭遇相似的收获后困境的其他植物种。

在实施例中参考下列附图。

图：在8℃下在黑暗中，在暴露于乙烯9天的时间后，莴苣的成熟叶头的表型。左图显示品种Troubadour的抗乙烯(乙烯.R)和对乙烯敏感的对照(-对照)叶头的代表性样品。右图显示来源于品种Apache的突变体的相似的图。

实施例

实施例1

通过甲磺酸乙酯(ems)对莴苣进行的遗传修饰

通过将每品种大约2000粒种子在室温下浸入0.05％(w/v)或0.07％(w/v)的ems的充气溶液中进行24小时来用ems处理Troubadour、Apache和Yorvik(所有三个品种来自Rijk Zwaan，DeLier，the Netherlands)。

萌发大约每ems剂量每品种大约1500粒处理的种子，将所得的植物从5月至9月栽培在荷兰(Netherland)的温室中以产生种子。

在成熟后，收获M2种子，以每处理每品种将种子聚集成一群。将所得的6群M2种子用作起始材料以鉴定包含减少的易感性的等位基因的M2植物个体。

通过确定变白的植物的发生率来评估遗传修饰的功效，所述变白表示由于直接或间接地参与叶绿素的形成或积累的基因的修饰而导致叶绿素的丢失。在所有6群M2种子中，观察到变白的个体植物，这证明所用的处理导致遗传修饰。

实施例2

已获得减少的对乙烯的易感性的等位基因的莴苣植物的鉴定

在16℃下在黑暗中，在具有1020vpm(每百万分之一体积部分)的乙烯浓度的小塑料容器中的纸上萌发M2莴苣种子。1vpm包含0.41μmol/升或1.14μg/升。将对乙烯不敏感的突变体与对乙烯敏感的对照进行比较，基于延长的下胚轴和/或根(即三重反应检测)选择对乙烯不敏感的突变体。将这些对乙烯不敏感的突变体生长至通过自体受精产生M3系。使用三重反应检测以这些M3系进行重新检测，从而验证对乙烯的不敏感性。

当就乙烯的不敏感性发生系分离时，选择植物，然后进行一个或两个额外的近交循环，最后进行三重反应检测，如果可能的话，选择纯合的对乙烯不敏感的系。

在一个情况下，在三重反应检测中就减少的对乙烯的敏感性选择从M3种子生长的M3植物，将M3植物与对乙烯和褐斑敏感的亲本Troubadour杂交，从而获得F1种子。将从F1种子生长而来的F1植物自交从而产生F2种子。在三重反应检测中就减少的对乙烯的敏感性选择从这些F2种子生长而来的F2植物，将所述F2植物自交从而产生F3种子。将所得的F3系加入至53个M3、M4和M5近交系的组。在该情况下，F3系只是原始M2突变体植物的代表，因为不存在从这些植物留下的自交种子。

在密闭的容器中在4至4.5vpm的乙烯的浓度下，在黑暗中在泥炭块上(peat block)萌发来自实施例1的54个M3和M4系的组。通过它们更长的下胚轴(与敏感型对照品种(Troubadour，Apache，Yorvik，

)相比)鉴定对乙烯不敏感的突变体。结果显示于表1中。通过三重反应检测鉴定的54个系中的42个系至少在乙烯检测中显示为至少部分对乙烯不敏感。这些系代表40株M2植物，因为2株M2植物代表了2次。

表2显示结果。

表2

密闭容器检测和三重反应检测(trt)中的突变系的乙烯反应。当显示没有相同的反应时，分别显示对下胚轴和根的观察。中间反应表示为partial。R＝对乙烯不敏感的；S＝对乙烯敏感的；R/S＝分离(segregating)；T＝Troubadour；A＝Apache；Y＝Yorvik；hypo＝下胚轴。

实施例3

具有获得的对褐斑的减少的易感性的等位基因的莴苣植物的鉴定

将来自在实施例2中发现的42个系的37个对乙烯不敏感的系播种在温室中以在常规的莴苣生产条件下产生成熟的叶球(位置：Maasdijk，the Netherlands；播种：1月10日；移植：2月17日；收获：4月18日)。将收获的成熟叶球在8℃下于黑暗处贮藏在密闭的容器中。将它们暴露于6至7vpm(每百万分之一体积部分)的浓度的乙烯气体。1vpm包含0.41mol/升或1.14μg/升。在9天后，鉴定展示锈斑病的植物。所有对照植物，除了Yorvik外，都展示锈斑病。受试的37个系中的29个系与原始品种相比显示不存在锈斑病或存在较少的锈斑病(表3)。

选择6个系以进行繁殖和保藏在NCIMB Ltd，Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen AB21 9YA，UK。第一系编号为02D.91445。其为来源于对乙烯不敏感的Troubadour-M2-植物00D.7856的M4系。对乙烯不敏感的M4植物选自实施例2中的密闭的容器检测中的02D.91445，将所述M4植物自产以产生M5种子。从这些种子生长出16株M5植物以通过自交产生M6种子批。该种子批编号为07D.826509，并且以NCIMB号41449(第一性)将其保藏。

第二系编号02D.90047。其是来源于对乙烯不敏感的Troubadour-M2-植物00D.6876的M4系。对乙烯不敏感的M4植物选自实施例2中的密闭容器检测中的02D.90047，将所述M4植物自交以产生M5种子。从这些种子生长出16株M5植物以通过自交产生M6种子批。该种子批编号为07D.826514，并且以NCIMB编号41450(第二系)将其保藏。通过检测来源于02D.90047的M4植物的M5系03D.90323来确定该来源不存在锈斑病。

第三系编号为00D.88578。其是来源于对乙烯不敏感的Troubadour-M2-植物00D.7871的M3系。从00D.88578生长出16株M3植物以通过自交产生M4种子批。该种子批编号为07D.826502，并且以NCIMB编号41448(第三系)保藏其。

第四系编号为03D.90452。其是来源于对乙烯不敏感的Apache-M2-植物00D.6883的M5系。对乙烯不敏感的M5植物选自实施例2中的密闭容器检测中的03D.90542，将所述M5植物自交以产生M6种子。从这些种子生长出16株M6植物以通过自交产生M7种子批。该种子批编号为07D.826522，并且NCIMB编号41451(第四系)保藏其。

第五系编号为01D.85780。其是来源于对乙烯不敏感的Apache-M2-植物00D.6896的M3系。对乙烯不敏感的M3植物选自实施例2中的密闭容器检测中的01D.85780，将所述M3植物自交以产生M4种子。从这些种子生长出16株M4植物以通过自交产生M5种子批。该种子批编号为07D.826540，并且以NCIMB编号41452(第五系)保藏其。

第六系编号为04D.801660。其是来源于对乙烯不敏感的Yorvik-M3-植物02D.8484与对乙烯敏感的品种Troubadour的植物之间的杂交的F3系。M3植物02D.8484来源于对乙烯不敏感的Yorvik-M2-植物00D.7845。对乙烯不敏感的F3植物选自实施例2中的密闭容器检测中的04D.801660，将所述F3植物自交以产生F4种子。从这些种子生长出16株F4植物以通过自交产生F5种子批。该种子批编号为07D.826542，并且以NCIMB编号41453(第六系)保藏其

图1显示抗性和对照植物。

实施例4

显示较少的收获后黄化的莴苣植物的鉴定

收获如实施例3中所述在温室条件下栽培的对乙烯不敏感的系，将成熟的修剪的叶球在8℃下贮藏在不含乙烯的贮藏室中。2周后，绿色对照品种Yorvik和Troubadour的基叶开始变黄。在该时刻和甚至在1周后，3个系表现出具有比它们的原始品种(所述品种是用于该试验的对照)更少的黄色基叶。这3个系编号为04D.800900、03D.90323、04D.801660。

尽管报导了叶子黄化和乙烯存在之间的关系(Saltveit等人(2003)Postharvest Biology and Technology 27：277283)，但令人吃惊的是，在甚至无乙烯的条件中，对乙烯不敏感的系中的一些系表达较少的黄化表型。

表3

在乙烯条件中贮藏9天后，成熟的叶球上的锈斑病的观察。0＝症状不存在；1＝较弱的症状；2＝强症状；NA＝不可获得。

种子号     乙烯        trt      褐斑    种子号      乙烯      trt        褐斑

01D.85762  partial R   R hypo； 2       00D.88565   R         R          0

                       S根

03D.90452  R           R        0       02D.91445   R         R          0.5

01D.85764  R/S         R hypo； 1       00D.88577   R/S       R hypo；   0

           partial R   S根                                    S根

02D.90070  R           R        0       02D.91446   R         R          0

03D.90457  R           R        0       02D.91447   R         R          0

01D.85768  R           R        0       01D.85754   S？       R/S        0

02D.90128  R           R        2       01D.85756   R         R          0

02D.90129  R           R        2       02D.90047   R         R          NA

02D.90130  R           R        2       01D.85758   R         R          0

03D.90462  R           R        2       02D.91442   R         R          0

Apache     S           S        2       Troubadour  S         S          1

03D.90464  R           R        0       00D.88569   R         R          0

02D.90133  R           R        2       00D.88573   R         R          0

02D.90134  R           R        2       00D.88578   R         R          0

00D.88600  R/S         R        NA      00D.88582   R         R          0

02D.91479  R           R        0       01D.85748   R/S       R/S        01

01D.85772  R           S hypo； 0

                       R根

04D.800957 R           S hypo； 0       02D.90036   partial R S hypo；   NA

                       R根                                    R根

02D.90091  R           R        0       01D.85755   R/S       R/S        NA

04D.800960 R           S hypo； 0       04D.800900  R         S hypo；   0.5

                       R根                                    R根

04D.800963 R           R        2       03D.90323   R         R          0

01D.85780  R           R        0       4D.801660   partial R R/S hypo； 0 2

                                                              S根

Apache     S           S        2       Yorvik      S         S          0

Claims (15)

1.有效鉴定对锈斑病和/或黄化具有抗性的莴苣植物的方法，其包括：在包含乙烯的气氛下生长大量来自包含随机诱导的突变的群体的变白的莴苣幼苗，通过鉴定具有与其中气氛是由不含乙烯的空气组成的情况下相比的下胚轴延长的幼苗来选择与起始群体相比具有减少的乙烯敏感性的幼苗，和就针对锈斑病和/或黄化的抗性筛选对乙烯不敏感的幼苗。

2.权利要求1的方法，其中鉴定具有与其中气氛是由不含乙烯的空气组成的情况下相比的下胚轴延长包括：

测量在乙烯下萌发的幼苗的下胚轴对在空气中萌发的幼苗的下胚轴的相对生长以将在乙烯和空气中与原始的对乙烯敏感的对照相比，都具有更长的下胚轴的植物与只在乙烯下与原始的对乙烯敏感的对照相比，具有更长的下胚轴的植物区分开来，

其中只在乙烯下与原始的对乙烯敏感的对照相比具有更长的下胚轴的植物被鉴定为显示减少的对乙烯敏感的植物。

3.权利要求1或2中所述的方法，其中植物是叶用蔬菜植物。

4.权利要求3中所述的方法，其中植物属于莴苣属。

5.权利要求4中所述的方法，其中植物属于Lactuca sativa种。

6.权利要求1至5任一项中所述的方法，其中包含随机诱导的突变的群体是突变体植物的群体、种质集合体或转基因植物的群体。

7.权利要求6中所述的方法，其中通过使用化学物质和/或辐射的诱变处理获得突变体植物的群体。

8.权利要求1至7任一项中所述的方法，其中乙烯的浓度为11至25μg/L。

9.生产显示与对照植物相比减少的对乙烯和锈斑病和/或黄化的易感性的植物的方法，该方法通过将其代表性种子在2007年1月3日在NCIMB保藏并具有41449、41450、41448、41451、41452或41453的保藏目录号的植物与另一莴苣植物杂交来获得后代和从具有减少的对乙烯和锈斑病和/或黄化的易感性的后代植物来进行选择。

10.权利要求9的方法，其中选择是通过权利要求1-8中任一项所述的方法来进行的。

11.莴苣植物在生产后代中的用途，其中所述的莴苣植物的代表性种子在2007年1月3日在NCIMB保藏并具有41449、41450、41448、41451、41452或41453的保藏目录号。

12.莴苣植物在生产种子中的用途，其中所述的莴苣植物的代表性种子在2007年1月3日在NCIMB保藏并具有41449、41450、41448、41451、41452或41453的保藏目录号。

13.莴苣植物在生产蔬菜产品中的用途，其中所述的莴苣植物的代表性种子在2007年1月3日在NCIMB保藏并具有41449、41450、41448、41451、41452或41453的保藏目录号。

14.权利要求13的用途，其中所述蔬菜产品是莴苣叶球或其部分，所述部分选自叶子或经加工的叶球。

15.权利要求13的用途，其中所述蔬菜产品是经切割的叶子或嫩叶。

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