MXPA06014640A - Susceptibilidad reducida hacia los patogenos, en particular oomicetes, tales como mildiu en lechuga y espinacas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona a obtener una planta la cual muestra una susceptibilidad reducida hacia infeccion con un patogeno, en particular un oomiceto, el cual comprende tratar semillas MO de una especie de planta a ser modificada con un agente mutagenico para obtener las semillas M1 y hacer crecer las plantas a partir de las mismas, las semillas M1 obtenidas de esta forma para obtener las plantas M1, la inoculacion de las plantas M1+n obtenidas de esta forma con el patogeno y seleccionar plantas que muestran una reduccion o ausencia de esporulacion del patogeno como plantas que tienen un fenotipo de susceptibilidad reducida. La invencion ademas se relaciona a plantas, semillas, polen, celulas y tejidos que tienen la susceptibilidad reducida hacia oomicetos.

Description

SUSCEPTIBILIDAD REDUCIDA HACIA LOS PATÓGENOS, EN PARTICULAR OOMICETES, TALES COMO MILDIU EN LECHUGA Y ESPINACAS Campo de la Invención La invención se relaciona a plantas, en particular plantas de lechuga y espinacas, las cuales se alteran con respecto a su modo de interacción con los patógenos. Más en particular, esta invención se relaciona a lechuga (Lactuca sativa L . ) y espinacas { Spinaca olerácea L . ) que muestran una interacción modificada con oomicetos, en particular mildiú tales como Bre ia lactucae y Peronospora farinosa , que lleva a una susceptibilidad reducida de estas especies vegetales de cultivos hacia estos patógenos. La invención además se relaciona a métodos para obtener plantas de lechuga y espinacas con genotipos alterados, las plantas que muestran una susceptibilidad reducida hacia los patógenos, en particular los oomicetos Bremia lactucae y Peronospora farinosa, respectivamente. Antecedentes de la Invención La reproducción de vegetales de hojas como lechuga y espinacas tiene como meta la producción de variedades comerciales adaptadas óptimamente a condiciones de crecimiento locales lo cual permite más crecimiento para maximizar la productividad de producción de alta calidad. Muchas características necesitan ser tomadas en cuenta REF.: 178387 durante la selección la cual se relaciona tanto a rasgos de entrada así como también de salida. Uno de los rasgos de entrada más importantes en este aspecto se relaciona a resistencia a enfermedades, en particular a resistencia hacia oomicetos y más en particular hacia mildiú. El resultado de la interacción de una planta con un patógeno depende de muchos factores genéticos tanto del patógeno así como también de la planta. Con el fin de infectar una planta exitosamente, un patógeno necesita solucionar un número de barreras. La primera capa es de una naturaleza física y puede ser manifestada en la forma de una pared celular reforzada o capa de cutícula. Como una segunda capa de defensa, una planta puede exhibir una forma basal de resistencia la cual puede prevenir al patógeno de infectar la planta. La resistencia no huésped puede ser considerada como una forma extremadamente exitosa de defensa basal la cual de hecho es efectiva para la mayoría de las interacciones de patógenos vegetales. En el caso que las primeras dos barreras han sido la pasadas por el patógeno, una tercera capa de defensa intrincada puede ser encontrada en la forma de la inducción de factores los cuales inhiben activamente el proceso de infección iniciado por el patógeno. En muchos sistemas de interacción de patógenos vegetales diferentes tales como la interacción de lechuga o espinaca con mildiú, la planta inicia estos eventos solamente después del reconocimiento específico del patógeno invasor. En muchos casos este reconocimiento ocurre después de que el patógeno ha establecido las primeras fases de interacción y transferido el así llamado factor de patogenicidad (o avirulencia) en la célula vegetal. Estos factores de patogenicidad interactúan con componentes del huésped con el fin de establecer las condiciones las cuales son favorables para que el patógeno invada el huésped y por lo mismo provoque la enfermedad. Cuando una planta es capaz de reconocer los eventos accionados por los factores de patogenicidad puede ser iniciada una respuesta de resistencia. El reconocimiento de estos eventos ocurre directa o indirectamente por productos gens de resistencia (R-gen por sus siglas en inglés) producidos por la planta invadida para la cual se ha propuesto recientemente un modelo mecánico, el así llamado modelo de protección (Dangl J. L. and Jones, J.D.G. (2001) Nature 411, 826-833) . Ante el reconocimiento toma lugar una cascada multicomponente de eventos incluyendo la genración de especies reactivas a oxígeno (ROS por sus siglas en inglés) llevando a una inducción local altamente regulada de muerte celular programada alrededor de las células las cuales han sido infectadas por el patógeno.

Adicionalmente, los gens que codifican factores de defensa tales como patogénesis relacionada o proteínas PR son inducidos lo cual contribuye a la ejecución de la respuesta de defensa. También puede ser inducida la formación callosa incrementada por reconocimiento de ataque de patógenos . Adicionalmente, la localización de un patógeno en sitios de intento de invasión lleva a una inducción sistémica de la respuesta de defensa la cual es llamada resistencia adquirida sistémica o SAR (por sus siglas en inglés) . La co-evolución de la planta y el patógeno ha llevado a una competencia de extremidades en la cual la resistencia puede ser rota como una consecuencia de la capacidad del patógeno para interactuar con y modificar los objetivos de huésped alternativos o los mismos objetivos en una forma diferente. En cualquier caso, se pierde el reconocimiento y la infección puede ser establecida en forma exitosa lo cual resulta en enfermedad. Con el fin de reestablecer la resistencia en una planta, un gen de resistencia novedosa tiene que ser introducido el cual es capaz de reconocer el modo de acción de un factor de patogenicidad alternativa. Tradicionalmente, los reproductores de plantas han tenido mucho éxito en genrar variedades de lechuga y espinacas resistentes a mildiú por hacer uso de gens de resistencia que residen en el plasma de germen silvestre de la especie de cultivo. Ya que la resistencia evocada por R-gen es altamente efectiva, son explotados los R-gen en gran escala en reproducción de plantas comerciales. Como una consecuencia de su modo de acción estas resistencias no son durables ya que la población de patógenos se adapta constantemente al R-gen introducido recientemente. Para la lechuga, esto ha resultado en la introducción de más de 20 diferentes R-gen en variedades comerciales sobre los últimos 50 años. Ya que la resistencia hacia mildiú es un pre-requisito para cualquier cultivo a ser comercializado, el cultivo con resistencia se le ha dado alta prioridad. Ya que el valor comercial de una variedad de lechuga o espinacas particular es principalmente determinado por su resistencia hacia los patotipos prevalecientes de mildiú en el área de crecimiento, el desarrollo de variedades novedosas es determinado por mucho por la capacidad y la velocidad de un reproductor de plantas para revirar las resistencias de mildiú apropiadas en las variedades comerciales. Adicionalmente, ya que la ocurrencia de cepas rompedoras de resistencia novedosas es bastante impredecible, el valor comercial de una variedad puede ya sea durar más o disminuir rápidamente. El éxito comercial en cultivo de lechuga o espinacas es por lo tanto determinado bastante por la disponibilidad de gens de resistencia efectiva es decir aquellos gens capaces de prevenir la infección por el patotipo de mildiú prevaleciente, así como también la eficiencia del cultivo de resistencia. De esta forma, un gran esfuerzo en cultivo de lechuga y espinacas es dedicado hacia resistencia de mildiú lo cual principalmente beneficia el mayor crecimiento de cultivo y lo cual puede llevar a gastos de rasgos de calidad benéficos para el consumidor de producción fresca. Debido a la baja durabilidad de la resistencia mediada por R-gen, una gran proporción de los recursos de reproducción en lechuga y espinaca han sido ubicados hacia reproducción para resistencia a mildiú. Es por lo tanto claro que existe una necesidad en la técnica para tener fuentes disponibles de resistencia a mildiú en lechuga y espinacas las cuales son mucho más durables como se compara con la resistencia mediada por el R-gen. Por otra parte, es deseable tener más alelos disponibles que puedan ser agregados a la resistencia de plantas contra oomicetos . En la investigación que lleva a la presente invención, los inventores contemplaron que con el fin de lograr una forma más durable de resistencia hacia mildiú en lechuga y espinacas, otros mecanismos diferentes a aquellos basados en el R-gen mediados por reconocimiento y subsecuente respuesta deben ser explotados. Como se menciona, existen varias capas de defensa en una planta las cuales necesitan ser rotas por un patógeno con el fin de establecer la enfermedad. Formas más durables de resistencia pueden por lo tanto ser logradas las cuales actúan independientemente entre sí y de la interacción específica de un producto de R-gen y el complejo de huésped de factor de patogenicidad. Por ejemplo, se ha demostrado ser factible modificar una planta la cual exhibe una forma constitutiva de defensa. Esto significa que el sistema de defensa es conmutado independientemente de señales inductivas que vienen a formar un reconocimiento exitoso de un patógeno por un producto de R-gen huésped. Por factores de modificación que controlan esta respuesta, la activación constitutiva puede ser lograda. Esto puede ser hecho a través de la regulación descendente de represores o por activación ectópica de inductores de la respuesta de resistencia. Varios métodos son disponibles para la persona experta en la técnica para lograr tal regulación descendente de represores o activación ectópica de inductores. En muchos casos conocidos, sin embargo, como una consecuencia de la activación constitutiva de la respuesta de defensa, los recursos son reubicados hacia factores de defensa lo cual lleva a una reducción significativa de crecimiento vegetal. En reproducción de cultivo comercial esta penalidad de rendimiento es obviamente no aceptable. Adicionalmente, parte de la respuesta de defensa puede ser manifestada en la forma de la síntesis y acumulación de metabolitos secundarios los cuales pueden disminuir el valor nutricional de producción o pueden incluso ser peligrosos para la salud del consumidor. Sumario de la Invención Es de esta forma un primer objeto de la invención genrar e identificar formas más durables de resistencia a mildiú en lechuga y espinacas que no tienen las desventajas establecidas anteriormente. Se ha encontrado sorpresivamente entonces que existe un procedimiento alternativo el cual desvía el reconocimiento mediado por el R-gen en lechuga y espinacas y el cual no se manifiesta como una forma constitutiva de respuesta de defensa. La invención de esta forma se relaciona a un método para obtener una planta, en particular lechuga o espinacas, que muestra una susceptibilidad reducida hacia infección con un patógeno, en particular un oomiceto, el cual comprende: a) tratar semillas MO de una especie vegetal a ser modificada con un agente mutagénico para obtener semillas Ml; b) hacer crecer plantas a partir de las semillas Ml obtenidas de esta forma para obtener plantas Ml ; c) opcionalmente repetir la etapa b) y e) n veces para obtener semillas Ml+n y hacer crecer plantas a partir de las mismas; d) inoculación de las plantas Ml+n obtenidas de esta forma con el patógeno; e) seleccionar plantas que muestran una reducción o ausencia de esporulación del patógeno como plantas que tienen un fenotipo de susceptibilidad reducida; f) opcionalmente producir una o más genraciones adicionales de progenie mientras se selecciona el fenotipo de susceptibilidad reducida. Las mutaciones son inducidas adecuadamente por medio de mutagénesis química, lo cual puede ser realizado por poner en contacto las semillas con uno o más agentes mutagénicos, en particular agentes mutagénicos alquilantes, tales como metansulfonato de etilo (ems por sus siglas en inglés) , sulfato de dietilo (des por sus siglas en inglés) , etilenimina (ei por sus siglas en inglés) , propansultona, N-metil-N-nitrosouretano (mnu por sus siglas en inglés) , N-nitroso-N-metilurea (NMU por sus siglas en inglés) , N-etil-N-nitrosourea (enu por sus siglas en inglés), azida de sodio. Alternativamente, las mutaciones son inducidas por medio de irradiación, la cual es por ejemplo seleccionada de rayos X, neutrones rápidos, irradiación UV.

En otra modalidad de la invención las mutaciones son inducidas por medio de modificación genética, tal como por medio de uso de oligonucleótidos quiméricos, recombinación homologa, introducción de gens objetivo modificados los cuales compiten con el producto endógeno, regulación descendente a través de interferencia de ARN, etc. La etapa de seleccionar las plantas que muestran una reducción o ausencia de esporulación del patógeno como plantas que tienen un fenotipo de susceptibilidad reducida es adecuadamente realizada por inspección visual. Preferentemente el método de la invención además comprende piramidar alelos de susceptibilidad reducida múltiple . La producción de semillas Ml y Ml+n es adecuadamente efectuada por medio de autopolinación. La invención además proporciona plantas que muestran una susceptibiidad reducida hacia infección con un patógeno, en particular un oomiceto, obtenible por un método como se reclama. Tal planta es adecuadamente una planta de lechuga {Lactuca sativa L . ) o una planta de espinacas { Spinacia olerácea L . ) . La invención se relaciona a plantas, las cuales tienen en su genoma información genética la cual es responsable para la susceptibilidad reducida para oomicetos y es ya sea encontrada en el genoma de una planta de lechuga como se enlista en la Tabla 6 de la cual la semilla se deposita con la NCIMB el 9 de Junio de 2005, la semilla que tienen el número de acceso correspondiente como se enlista en la Tabla 6. La invención también se relaciona a plantas, las cuales tienen en su genoma la información genética la cual es responsable para la susceptibilidad reducida hacia oomicetos y es como se encuentra en el genoma de plantas de espinacas derivadas de la población M2 RZ03.67551, de la cual la semilla es depositada en el NCIMB el 9 de Junio de 2005 bajo el número de acceso... En una modalidad particular de la misma, la invención se relaciona a plantas de lechuga como se enlista en la Tabla 6, de la cual se deposita la semilla en NCIMB el 9 de Junio de 2005 bajo los números de acceso dados en la Tabla 6. Otra modalidad de la invención es una planta de espinacas la cual es derivada de la población M2 de semilla con el número de acceso RZ RZ03.67551 como se deposita en NCIMB el 9 de Junio de 2005 bajo el número de acceso NCIMB... La progenie de las plantas como se reclaman son también parte de esta invención. "Progenie" como se usa en la presente es propuesta para comprender todas las plantas que tienen la misma o reducida susceptibilidad similar hacia infección con un patógeno, en particular un oomiceto, como las plantas originales descritas en la presente y que son derivadas a partir de las mismas en alguna forma, tal como por reticulación, cultivo haploide, fusión de protoplasma u otras técnicas. Tal progenie no es solamente la primera sino también todas las futuras genraciones siempre y cuando sea retenida la susceptibilidad reducida. Esta forma de resistencia, la cual es de hecho una reducción en o carece de susceptibilidad, tiene por meta la modificación de factores huéspedes requeridos para establecer la infección por el patógeno. Este tipo de procedimiento es encontrado posible para interacciones de oomicetos vegetales especialmente para lechuga -Breiriia así como también interacciones de espinacas -Peronospora, pero puede también ser usada para otras combinaciones de patógenos vegetales. La identificación de las plantas modificadas deseadas puede ocurrir a través del establecimiento de una interacción con una especie de oomiceto para la cual el material vegetal de partida muestra susceptibilidad. Aquellos mutantes los cuales muestran pérdida o reducción de susceptibilidad pueden contener gens modificados los cuales están implicados en susceptibilidad. En la práctica, la identificación de una planta que contiene alelos de susceptibilidad reducida puede ser hecha por varios medios que incluyen la inoculación de plantas individuales de una población M2 con ems e inspección visual de las plantas inoculadas para ausencia o reducción de esporulación del patógeno como una consecuencia de la incapacidad del patógeno para establecer una infección exitosa. Tal tamiz puede ser realizado en diferentes niveles de desarrollo de plantas incluyendo plantas de semillero y plantas vegetativas adultas o florales. Por otra parte el establecimiento adicional y caracterización del fenotipo de susceptibilidad reducida puede ser logrado a través de muchas tecnologías sofisticadas como imagen de fluorescencia, perfil de transcripción y microscopía de luz. Diferentes fenotipos con respecto a estos parámetros pueden reflejar la genración de diferentes gens de susceptibilidad reducida diferentes o diferentes variantes alélicas del mismo gen de susceptibilidad reducida. Las pruebas de alelismo pueden simplemente distinguirse entre estas dos posibilidades. Varios métodos son disponibles para la persona experta en la técnica para modificar gens en una especie de plantas. En una modalidad particular se hace uso de la mutagénesis química a través del tratamiento con agentes alquilantes tales como metansulfonato de etilo (ems) , sulfato de dietilo (des) , etilenimina (ei) , propansultona, N-metil-N-nitrosouretano ( nu) , N-nrtroso-N-metilurea (NMU) , N-etil-N-nitrosourea (enu) , azida de sodio.

Adicionalmente, la irradiación por rayos X, neutrones rápidos o irradiación UV puede ser usada para inducir modificación de gens. Alternativamente, las tecnologías de modificación genética para modificar específicamente objetivos de gens que residen en el genoma de una planta pueden ser usadas. Son particularmente adecuados los oligonucleótidos quiméricos que son mutágenos efectivos con un modo específico de acción. Otro procedimiento es modificar objetivos de gens a través de la recombinación de homólogos u objetivación de gens. Usando tal procedimiento, un fragmento de un gen es intercambiado por un fragmento de ADN introducido el cual contiene una modificación deseada. El uso de tecnologías de modificación genética en las cuales los gens objetivos modificados son introducidos los cuales compiten con el producto endógeno es también parte de esta invención. La regulación descendente de gens específicos puede ser lograda a través de la interferencia de ARN. En el caso de los oligonucleótidos mutagénicos, las tecnologías del objetivo de gens o modificación genética son usados para modificar factores de susceptibilidad implicados en interacción de lechuga- Bremia o espinacas- Peronospora, obviamente, la estructura primaria de los objetivos de gens necesita ser conocida.

Después de la modificación, por ejemplo la modificación aleatoria a través de la mutagénesis, de los gens que están implicados en la reducción de la susceptibilidad de patógenos, estudios genéticos adicionales pueden ser realizados con el fin de mapear los alelos de susceptibilidad reducida. Con el fin de lograr esto, las poblaciones F2 pueden ser genradas usando el mutante de susceptibilidad reducida y el tipo silvestre susceptible. Fenotipificar las plantas F2 resultantes y análisis genotípicos usando marcadores moleculares (alelos marcadores con posiciones de mapas genéticos conocidos) permite establecer las ubicaciones de mapa genéticos de alelos de susceptibilidad reducida genrados independientemente. Los alelos marcadores enlazados pueden ser usados- para seleccionar indirectamente los diferentes alelos de susceptibilidad en la progenie. Como una siguiente etapa, los alelos de susceptibilidad diferentes pueden ser simplemente combinados a través del cruzamiento y selección en la base de marcadores moleculares enlazados o características distinguidas fenotípicas. Esta forma de así llamado piramidado de gens o apilamiento de gens es también parte de esta invención. Por otra parte, las técnicas de clonación basadas en mapas estándar permiten identificar el gen implicado en susceptibilidad así como también las formas para modificar estos gens de tal forma que la función huésped permanece intacta mientras se abate la interacción de patógenos. La identificación de alelos de susceptibilidad lo cual reduce la interacción de una planta con un patógeno sin afectar la función huésped por medio directo o indirecto así como también combinar estos alelos llevará a una forma incluso más durable de control de mildiú en sistemas de cultivo como lechuga y espinacas. En cada caso, el reproductor puede decir apilar o piramidar los alelos de susceptibilidad reducida recientemente descubiertos ya sea en combinación entre sí o con las R-gen tradicionalmente conocidos o recientemente descubiertos. Breve descripción de las figuras La invención será además ilustrada en los Ejemplos que siguen. Se hace la referencia a las siguientes figuras: Figura 1: muestra una imagen de microscopio de tejido de hoja 6 días después de la inoculación, que muestra muchas hifas claras y haustorias en una variedad de control susceptible Baccares . La Figura 2 : muestra una imagen de microscopio de tejido de hoja que muestra la ausencia de hifas y haustorias de variedad de control resistente Hillary.

Descripción detallada de la invención EJEMPLOS EJEMPLO 1 Modificación genética de lechuga por metansulfonato de etilo (ems) Las semillas de las variedades de lechuga Troubadour, Apache y Yorvik las cuales son altamente susceptibles hacia las cepas Bremia lactucae Bl:18, Bl:20, Bl:22, Bl:24 y Bl:25 son tratadas con ems por submergencia de aproximadamente 2000 semillas por variedad en una solución aireada de ya sea 0.05% (p/v) o 0.07% (p/v) de ems durante 24 horas en temperatura ambiente. Aproximadamente 1500 semillas tratadas por variedad por dosis con ems son germinadas y las plantas resultantes son crecidas en un invernadero en Holanda a partir de Mayo a Septiembre para producir semillas. Después de la maduración, las semillas M2 son cosechadas y almacenadas a granel en un grupo por variedad por tratamiento. Las 6 agrupaciones resultantes de semillas M2 son usadas como material de partida para identificar las plantas M2 individuales que contienen alelos de susceptibilidad reducida. La eficacia del procedimiento de modificación genética es evaluada por determinar la ocurrencia de plantas blanqueadas, lo cual es indicativo para pérdida de clorofila debido a modificaciones en gens directa o indirectamente implicados en la formación o acumulación de clorofila. En todas las 6 agrupaciones de semillas M2 plantas individuales, las cuales son blanqueadas, son observadas lo cual demuestra que los tratamientos aplicados resultan en modificaciones genéticas . EJEMPLO 2 Identificación de plantas de lechuga las cuales han obtenido alelos de susceptibilidad reducida La identificación inicial de plantas M2 que contienen alelos de susceptibilidad reducida como un resultado del tratamiento ems descrito en el Ejemplo 1 se lleva a cabo por inocular plantas M2 en el nivel de siembra con una suspensión de esporas de cepas Bremia lactucae Bl:18 como sigue De cada una de las 6 agrupaciones M2 disponibles, aproximadamente 2000 semillas son germinadas en papel de filtro humedecido en un recipiente cerrado para establecer un ambiente de humedad relativa alta. Después de que se establecen las plantas de semillero es decir emergencia de los cotiledones pero la primera hoja no es aún visible, son dispersadas con la suspensión de esporas de Bremia lactucae . Las plantas de semillero inoculadas son incubadas bajo condiciones controladas que son 15°C en régimen de 16 horas de luz, 8 horas de oscuridad. Esta prueba de planta de smillero que sigue más o menos el protocolo descrito por Bonnier et al. (New Sources of major gen resistencie in Lactuca to Bremia Lactucae. Euphytica 61:3, 203-211 (1992) ) . Después de 8 días, la infección es establecida claramente en plantas de control susceptibles derivadas de variedades de lechuga usadas para el tratamiento ems, lo cual se manifiesta por la ocurrencia de micelio de oomicetos esporulantes en la superficie del cotiledón y los cuales como tales pueden ser fácilmente clasificados. Las plantas que muestran una reducción o ausencia fuerte de biomasa de oomicetos esporulantes son consideradas para tener alelos de susceptibilidad reducida adquirida como una consecuencia de la modificación genética mediada por ems del material de partida . La Tabla 1 es un sumario de los resultados del tamiz para susceptibilidad reducida hacia cepas de Bremi a l ac t u cae Bl:18 en diferentes poblaciones M2 de lechuga .

Tabla 1: Como puede ser observado a partir de la Tabla 1, un total de 71 plantas de semillero M2 individuales son identificadas las cuales muestran susceptibilidad reducida hacia la cepa de Bremia lactucae Bl:18. Con el fin de confirmar la susceptibilidad reducida, las muestras de hojas son tomadas de las plantas M2 individuales en la etapa de 10 hojas. Dos discos de hojas por cepa son incubadas en papel filtro humedecido en un recipiente cerrado para establecer un ambiente de humedad relativa alta y se inoculan con suspensiones de esporas de cepas Bremia lactucae Bl:18 ó Bl:22. Los discos de hoja inoculados son incubados bajo condiciones controladas que son 15°C en un régimen de 16 horas de luz, 8 horas de oscuridad. Esta prueba de disco de hoja sigue más o menos el protocolo descrito por Bonnier et al. (1992), supra. Después de 8, 11 y 14 días de incubación, se clasifica el índice de enfermedad por inspección manual . El índice de enfermedad es una medición para el nivel de infección y discrimina entre las categorías R (resistencia) lo cual no significa infección obvia, RS (susceptibilidad reducida) lo cual significa una reducción significativa de la infección como se compara con un control susceptible y S (susceptible) lo cual significa biomasa de oomicetos pesadamente infectado y fuertemente esporulante. La Tabla 2 resume los resultados de este experimento, con más detalles en la Tabla 3. Ninguno de los individuos muestra resistencia total contra ambas cepas, en contraste a variedades estándar con resistencia basada en R-gen. En el caso de resistencia mediada por R-gen es práctica común asumir la planta de semillero y prueba de disco de hoja como totalmente intercambiable (ver, por ejemplo, Bonnier et al., 1992, Supra). Para resistencia parcial conocida contra Bremia este intercambio no es el caso (Eenink & De Jong, Partial resístanse in lettuce to downy mildew {Bremia lactucae) . 3. Correspondence between resístanse levéis of cotyledons and leaf discs and resístanse of adult plants . Euphytica 31: 761-770 (1982), pero es sorprendente ver que encuentran una buena correlación entre resultados de pruebas de disco de hoja y se observa resistencia de campo y pobre correlación entre resultados a partir de pruebas de planta de semillero y resistencia de campo observada, mientras que en este ejemplo la susceptibilidad reducida encontrada recientemente muestra que los resultados de prueba de planta de semillero son una mejor predicción para resultados de experimento de campo (Ejemplo 5) que los resultados de prueba de disco de hoja.

Tabla 2 Sumario de los resultados de pruebas de disco de hoja en plantas M2 , seleccionados en tamiz de planta de semillero R=resistente, RS=susceptibilidad reducidad; S=susceptible, NAV= no presente en la prueba EJEMPLO 3 Caracterización fenotípica de progenie de plantas de lechuga que contienen alelos de susceptibilidad reducida en pruebas de planta de semillero Este ejemplo describe la identificación de plantas M2 de lechuga, las cuales han adquirido una susceptibilidad reducida hacia JBre.tua lactucae . Estas plantas M2 son crecidas en el invernadero a madurez y se permite fijar la semilla por auto fertilización natural. Para cada planta M2 seleccionada individual, se cosecha la semilla línea M3. En varios casos esta semilla M3 es vista en una prueba de planta de semillero, como se describe en el Ejemplo 2. Se seleccionan las plantas de semillero M3 menos susceptibles a partir de la prueba y se hacen crecer para madurar plantas para producir la semilla M4 por auto fertilización. Las semillas M3 o M4 son usadas subsecuentemente para confirmar la ocurrencia de alelos de susceptibilidad reducida por probar la susceptibilidad reducida a Bremia lactucae tanto en la planta de semillero así como también nivel de planta madura. La prueba de planta de semillero es llevada a cabo como se describe en el Ejemplo 2. Como puede ser observado en la Tabla 3 , usando las líneas M3 o M4 la susceptibilidad reducida hacia Bremia lactucae es confirmada para 32 de las líneas M3 o M4. Estos resultados muestran que el procedimiento descrito en esta invención permite genrar e identificar alelos de susceptibilidad reducida hacia Bremia lactucae en Lactuca sativa .

Tabla 3 Sumario de los resultados para 32 lineas M3 o M4 confirmadas Variedades originales: A=apache, T=troubadour, Y=Yorvik; prueba de planta de semillero: -=sin esporulación, (-)= esporulación con pocas esporas, (+)= ligera esporulación, +=esporulación total; prueba de campo: 0=resistente, 5= muy susceptible; prueba de disco de hoja: ver la Tabla 2. Los valores para planta de semillero y prueba de campo para las variedades originales son incluidas en los cabezales de la tabla. Los datos de prueba de campo son basados en resultados combinados de 20002 y 2003. Los resultados de la prueba de planta de semillero son basados en las líneas M3 y, donde sea disponible, líneas M4. No es incluida en esta tabla la segregación de alelos de susceptibilidad reducida. EJEMPLO 4 Caracterización citológica de progenie de plantas de lechuga que contienen alelos de susceptibilidad reducida Además de la prueba descrita en el Ejemplo 3, otra prueba de planta de semillero es realizada usando fysio Bl:24. La prueba de planta de semillero es realizada como se describe en el Ejemplo 2. Las variedades originales, Apache, Troubadour y Yorvik son susceptibles para esta fysio. Otra variedad susceptible, Baccares, es usada como un estándar susceptible, y la variedad Hillary es usada como un estándar resistente, en base a la respuesta mediada por el R-gen. Seis días después de la inoculación, se muestrean las hojas y se realiza la tinción de azul de tripano como se describe posteriormente para ser capaz de observar el crecimiento del patógeno Bremia en la hoja (para ejemplos estándar, ver la Figura 1 y 2) . Las 32 líneas M3 confirmadas o su descendencia de susceptibilidad reducida no muestra o reduce el desarrollo de Bremia en la hoja, en comparación con el estándar susceptible. Ver la Tabla 4. La susceptibilidad reducida hacia Bl:24 en el Ejemplo 4, Bl:18 en el Ejemplo 2 y 3, y Bl: 22 en el Ejemplo 3, no muestra especificidad a fysio, lo cual está en contraste a la resistencia mediada por el R-gen específico a fysio (ver el ejemplo Bonnier et al., 1992, supra). Tinción con azul de tripano lactofenol para mildiú en plantas Las hojas infectadas con Bremia de lechuga son recolectadas y colocadas en microtúbulos . El azul de tripano lactofenol (por 100 ml : 25 ml de ácido láctico, 25 ml de glicerol, 25 ml de fenol., 25 ml de agua, 25 mg de azul de tripano) es agregado para cubrir las hojas completamente. Se calienta la mezcla subsecuentemente en 100°C por 5 minutos y después se permite enfriar a temperatura ambiente. El azul de tripano es removido y el mismo volumen de hidrato cloral (por 100 ml : 80 g de hidrato cloral, 30 ml de agua, 10 g de glicerol) se agrega para desteñir la muestra de hoja la cual es hecha durante la noche. La muestra es tratada en un Speedvac por aproximadamente 5 minutos para remover las burbujas de aire a partir de muestras de hojas. Subsecuentemente, las muestras de hojas son dispersadas en un portaobjetos de vidrio para microscopía. Tabla 4 Sumario de las observaciones microscópicas de desarrollo de Bremia en tejido de hoja 6 días después de la inoculación con fysio Bl:24. El número de mutante está indicando la planta M2 original con susceptibilidad reducida, a partir de la cual la planta observada es descendiente. Este número es comparable con los números de mutantes en la Tabla 3.

Clasificación (hifas, haustoria, esporulación): 0= ausente, 1= fuertemente reducido, 2= reducido, 3= similar como estándar susceptible (Bacares) EJEMPLO 5 Caracterización fenotípica de la progenie de plantas de lechuga que contienen alelos de susceptibilidad reducida en pruebas de campo Se pruenan las plantas de lechuga maduras en pruebas de campo no replicadas en 2002 y 2003 con una fuerte infección natural de Bremia (cepa Bl:24 y Bl:25). Ambas pruebas son ubicadas en Fijnaart, Holanda. Las semillas son sembradas en Julio, las plantas jóvenes son plantadas en Agosto. Y las plantas maduras son juzgadas en la segunda mitad de Septiembre y el inicio de Octubre. Cada línea M3 o su descendencia susceptible reducida es representada por una gráfica de 24 plantas. En la etapa madura, el nivel final de enfermedad es clasificada en una escala progresiva de 0-5 en la cual O está para ausencia de síntomas de enfermedad y 5 está para pesadamente enfermo. Las plantas resistentes R-gen así como también las líneas originales susceptibles son incluidas como controles. Los resultados son mostrados en la Tabla 3. Ejemplo 6 Modificación genética de espinaca por metansulfonato de etilo (ems) Las semillas de la línea F5 de espinaca (755*265)* BIT la cual es altamente susceptible hacia Peronospora farinosa RACE Pfs 5, 6, y 7 son tratadas con ems por subemergencia de aproximadamente 10.000 semillas en una solución aereada de 0.3% (p/v) ems durante 24 horas en temperatura ambiente. Las semillas tratadas son germinadas y crecidas en un invernadero para inducir los botones y florear. Después de la maduración, las semillas M2 son cosechadas y agrupadas a granel en una colección. La colección resultante de semillas M2 es usada como material de partida para identificar las plantas M2 individuales que contienen alelos de susceptibilidad reducida. Esta colección es depositada bajo el número de acceso RZ 03.67551 con el NICMB el 9 de Junio de 2005 bajo el número de acceso NCIMB.... La eficacia del procedimiento de modificación genética es evaluada por determinar la ocurrencia de plantas blanqueadas lo cual es indicativo para pérdida de clorofila debido a las modificaciones en gens directa o indirectamente implicadas en la formación o acumulación de clorofila. En la colección de semillas M2 las plantas individuales las cuales son blanqueadas son observadas lo cual demuestra que los tratamientos aplicados resultan en modificaciones genéticas. EJEMPLO 7 Identificación de plantas de espinacas las cuales tienen alelos de susceptibilidad reducida La identificación inicial de plantas M2 que contienen alelos de susceptibilidad reducida como un resultado del tratamiento con ems descrito en el Ejemplo 6 se realiza por inocular las plantas M2 en el nivel de planta de semillero con suspensiones de esporas de Peronospora farinosa contra Pf7. Aproximadamente 10,000 semillas de la agrupación M2 disponible es germinada en papel filtro húmedo en un recipiente cerrado para establecer un ambiente de humedad relativa alta. Después de que se establecen las plantas de semillero es decir emergencia de los cotiledones pero la primera hoja no es todavía visible, aún se dispersan con la suspensión de esporas de Peronospora farinosa . Las plantas de semillero inoculadas son incubadas bajo condiciones controladas que son 14°C en regímenes de 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad. Después de aproximadamente 8 días, la infección es claramente establecida en plantas de control susceptibles derivadas de la línea de espinaca usada para el tratamiento con ems, lo cual se manifiesta por la ocurrencia de micelios de oomicetes esporulantes en la superficie del cotiledón y lo cual como tal puede fácilmente ser clasificado. Las plantas que muestran una fuerte reducción o ausencia de biomasa de oomicetos esporulantes son considerados para tener alelos de susceptibilidad reducida adquirida como una consecuencia de la modificación genética mediada por ems del material de partida. En total, 36 plantas de semillero M2 individuales son identificadas las cuales muestran susceptibilidad reducida hacia Peronospora farinosa RACE Pfs:7. EJEMPLO 8 Caracterización fenotípica de la progenie de plantas de espinaca que contienen alelos de susceptibilidad reducida Este ejemplo describe la identificación de plantas M2 de espinacas las cuales han adquirido una susceptibilidad reducida hacia Peronospora farinosa RACE Pfs:7. Estas plantas M2 son crecidas en el invernadero para madurez y permiten fijar la semilla. A partir de las 36 plantas M2 individuales seleccionadas, se cosecha una genración de semilla M3 a partir de 32 de ellas. Las semillas M3 son usadas subsecuentemente para establecer la ocurrencia de alelos de susceptibilidad reducida por probar la susceptibilidad reducida a Peronospora farinosa en el nivel de planta de semillero. La prueba de planta de semillero es llevada a cabo como se describe en el Ejemplo 7. En la Tabla 5, la susceptibilidad reducida hacia Peronospora farinosa es confirmada en cuatro poblaciones M3. Estos resultados muestran que el procedimiento descrito en esta invención permite genrar e identificar los alelos de susceptibilidad reducida hacia Peronospora farinosa en espinacas . Información de depósito Las semillas de varias plantas de lechuga y una población M2 de espinacas de la invención son depositadas el 9 de Junio de 2005 con la NCIMB en Aberdeen (NCIMB Ltd., Ferguson Building, Craibstone Estáte, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, UK) bajo los números de acceso como se enlistan en la Tabla 6. La población M2 de espinacas es un lote de semillas que pueden cada una contener una o más mutaciones, formando de esta forma una agrupación de mutaciones. Las plantas que tienen la susceptibilidad reducida de la invención pueden ser seleccionadas a partir de las mismas por tamizar la población de plantas como se describe en las etapas d) y e) de la reivindicación 1 y en esta especificación.

Tabla 5. Resultados de tamiz de mildiú en 32 lineas M3 inoculadas RACE Pfs:7. (S= susceptible, Seg=Segregación, R=resistente) Tabla 6 Información de depósito Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un método para obtener una planta que muestra una susceptibilidad reducida hacia infección con un patógeno, en particular un oomiceto, caracterizado porque comprende: a) tratar semillas MO de una especie de planta a ser modificada con un agente mutagénico para obtener las semillas Ml; b) hacer crecer las plantas a partir de las semillas Ml de esta forma obtenidas para obtener plantas Ml; c) opcionalmente repetir la etapa b) y e) n veces para obtener las semillas Ml+n y hacer crecer las plantas a partir de las mismas; d) inocular las plantas Ml+n de esta forma obtenidas con el patógeno; e) seleccionar las plantas que muestran una reducción o ausencia de esporulación del patógeno como las plantas que tienen un fenotipo de susceptibilidad reducida: f) opcionalmente producir una o más genraciones adicionales de progenie mientras que se selecciona el fenotipo de susceptibilidad reducida.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las mutaciones son inducidas por medio de mutagénesis química.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2 , caracterizado porque la mutagénesis química se realiza por poner en contacto las semillas con uno o más agentes mutagénicos seleccionados del grupo que consiste de metansulfonato de etilo (ems) , sulfato de dietilo (des) , etilenimina (ei) , propansultona, N-metil-N-nitroso-uretano (mnu) , N-nitroso-N-metilurea (NMU) , N-etil-N-nitrosourea (enu) , azida de sodio.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las mutaciones son inducidas por medio de irradiación.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la irradiación se selecciona de rayos X, neutrones rápidos, irradiación UV.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las mutaciones son inducidas por medio de modificación genética.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la modificación genética es seleccionada del uso de oligonucleótidos quiméricos, recombinación homologa, introducción de gens objetivos modificados los cuales compiten con el producto endógeno, regulación descendente a través de la interferencia de ARN.
8. 8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque la etapa de seleccionar plantas que muestran una reducción o ausencia de esporulación del patógeno co o plantas que tienen un fenotipo de susceptibilidad reducida se realiza por inspección visual.
9. 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque además comprende piramidar con otros alelos de susceptibilidad reducida y/o R-gens clásicos.
10. 10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque la producción de semillas Ml y Ml+n se efectúa por medio de autopolinización.
11. 11. Una planta caracterizada porque que muestra una susceptibilidad reducida hacia infección con un patógeno, en particular un oomiceto, obtenible por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10. - -
12. 12. La planta de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque es una planta de lechuga {Lactuca sativa L. ) o una planta de espinacas {Spinacia olerácea L. ) .
13. 13. La planta de conformidad con la reivindicación 11 ó 12, caracterizada porque tiene en su genoma, información genética la cual es responsable para la susceptibilidad reducida para oomicetos y es como se encuentra en el genoma de una planta de lechuga como se enlista en la Tabla 6, de la cual se deposita la semilla con la NCI B el 9 de Junio de 2005 y que tiene un número de acceso como se enlista en la Tabla 6.
14. 14. La planta de conformidad con la reivindicación 11 ó 12, caracterizada porque tiene en su genoma la información genética la cual es responsable para la susceptibilidad reducida hacia oomicetos y es como se encuentra en el genoma de planta de espinacas como se deriva de RZ03.67551 como se deposita en la NCJ-MB el 9 de Junio de 2005 bajo el número de acceso...
15. 15. La planta de lechuga como se enlista en la Tabla 6, caracterizada porque su semilla se deposita en la NCTMB el 9 de Junio de 2005 bajo el número de acceso dado en la Tabla 6.
16. 16. La población de semilla M2 de espinaca RZ03.67551 caracterizada porque se deposita en la NCIMB el 9 de Junio de 2005 bajo el número de acceso....
17. 17. Una progenie de una planta caracterizada porque es de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-16.
18. 18. Una semilla de una planta caracterizada porque es de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-16.
19. 19. El polen de una planta caracterizado porque es de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-16.
20. 20. Una célula de una planta caracterizada porque es de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-16.
21. 21. El tejido de una planta caracterizado porque es de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-16.
22. 22. Un gen caracterizado porque confiere susceptibilidad reducida hacia infección con un patógeno, en particular un oomiceto, a una planta, en particular una lechuga o planta de espinaca, y que está presente en las semillas como se enlista en la Tabla 6 y se deposita con la NCIMB el 9 de Junio de 2005 bajo los números de acceso como se enlistan en la Tabla 6.